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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-15
(45)【発行日】2024-03-26
(54)【発明の名称】キットおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/44 20060101AFI20240318BHJP
C12Q 1/28 20060101ALI20240318BHJP
C12Q 1/60 20060101ALI20240318BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/44
C12Q1/28
C12Q1/60
【請求項の数】
14
(21)【出願番号】P 2020096095
(22)【出願日】2020-06-02
(65)【公開番号】P2021185858
(43)【公開日】2021-12-13
【審査請求日】2023-01-27
(73)【特許権者】
【識別番号】000003296
【氏名又は名称】デンカ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100110928
【弁理士】
【氏名又は名称】速水 進治
(72)【発明者】
【氏名】伊藤 康樹
【審査官】長谷川 強
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１４－０３０３９３（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／４４
Ｃ１２Ｑ １／２８
Ｃ１２Ｑ １／６０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるキットであって、測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールであり、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する１または２以上の酵素、ならびに、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む第１試薬組成物と、
測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物であって、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を第２試薬組成物の全組成に対して０．０５％（ｗ／ｖ）以上８．０％（ｗ／ｖ）以下の濃度で含む前記第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物において、
前記第１試薬組成物が前記コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素を含むとき、前記第１試薬組成物の前記コレステロールエステラーゼ活性が１０Ｕ／Ｌ以上１００００Ｕ／Ｌ以下であり、
前記第１試薬組成物が前記コレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素を含むとき、前記第１試薬組成物の前記コレステロールオキシダーゼ活性が１００Ｕ／Ｌ以上３５００Ｕ／Ｌ以下であり、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはＨＤＬ３であるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物およびポリオキシエチレンステアリルアミンからなる群から選択されるノニオン界面活性剤；アミドエーテルサルフェートおよびポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムからなる群から選択されるニオン界面活性剤；ヤシ油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタインおよびラウリルベタインからなる群から選択される両性界面活性剤；ならびに、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択されるカチオン界面活性剤の１種または２種以上であり、
測定対象のリポタンパク質がＬＤＬまたはapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体であり、
測定対象のリポタンパク質がレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ＨＬＢ値が１１以上１３以下のポリオキシエチレン誘導体であり、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ、ＬＤＬまたはレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤の濃度が、第１試薬組成物の全組成に対して０．２％（ｗ／ｖ）以上５％（ｗ／ｖ）以下であり、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ３であるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤の濃度が、第１試薬組成物の全組成に対して０．０５％（ｗ／ｖ）または０．２％（ｗ／ｖ）以上５％（ｗ／ｖ）以下であり、
測定対象のリポタンパク質がapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤の濃度が、第１試薬組成物の全組成に対して０．０３（ｗ／ｖ）以上１．２％（ｗ／ｖ）以下であり、
前記第２試薬組成物において、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４～３５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選択される１種または２種以上であり、
測定対象のリポタンパク質がＬＤＬまたはレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体を含み、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ３であるとき、測定対象のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルであり、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下であり、
前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、キット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む
【請求項2】
第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、請求項１に記載のキット。
【請求項3】
前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する１または２以上の酵素を含む、請求項１または２に記載のキット。
【請求項4】
第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、請求項１乃至３いずれか１項に記載のキット。
【請求項5】
前記第１試薬組成物が前記条件１を満たすとき、前記第１試薬組成物中の前記カップラーの濃度が０．５ｍＭ以上４ｍＭ以下であり、
前記第２試薬組成物が前記条件１を満たすとき、前記第２試薬組成物中の前記カップラーの濃度が１ｍＭ以上８ｍＭ以下である、請求項１乃至４いずれか１項に記載のキット。
【請求項6】
前記第１試薬組成物が前記条件２を満たすとき、前記第１試薬組成物中の前記鉄錯体の濃度が０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌであり、
前記第２試薬組成物が前記条件２を満たすとき、前記第２試薬組成物中の前記鉄錯体の濃度が０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１乃至５いずれか１項に記載のキット。
【請求項7】
前記第１試薬組成物が前記条件３を満たすとき、前記第１試薬組成物の前記コレステロールオキシダーゼ活性が４００Ｕ／Ｌ以上３０００Ｕ／Ｌ以下であり、
前記第２試薬組成物が前記条件３を満たすとき、前記第２試薬組成物の前記コレステロールオキシダーゼ活性が５００Ｕ／Ｌ以上２００００Ｕ／Ｌ以下である、請求項１乃至６いずれか１項に記載のキット。
【請求項8】
試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）を定量する方法であって、測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールであり、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する１または２以上の酵素、ならびに、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物であって、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を第２試薬組成物の全組成に対して０．０５％（ｗ／ｖ）以上８．０％（ｗ／ｖ）以下の濃度で含む前記第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物において、
前記第１試薬組成物が前記コレステロールエステラーゼ活性を有する酵素を含むとき、前記第１試薬組成物の前記コレステロールエステラーゼ活性が１０Ｕ／Ｌ以上１００００Ｕ／Ｌ以下であり、
前記第１試薬組成物が前記コレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素を含むとき、前記第１試薬組成物の前記コレステロールオキシダーゼ活性が１００Ｕ／Ｌ以上３５００Ｕ／Ｌ以下であり、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはＨＤＬ３であるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物およびポリオキシエチレンステアリルアミンからなる群から選択されるノニオン界面活性剤；アミドエーテルサルフェートおよびポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムからなる群から選択されるニオン界面活性剤；ヤシ油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタインおよびラウリルベタインからなる群から選択される両性界面活性剤；ならびに、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドからなる群から選択されるカチオン界面活性剤の１種または２種以上であり、
測定対象のリポタンパク質がＬＤＬまたはapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体であり、
測定対象のリポタンパク質がレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ＨＬＢ値が１１以上１３以下のポリオキシエチレン誘導体であり、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ、ＬＤＬまたはレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤の濃度が、第１試薬組成物の全組成に対して０．２％（ｗ／ｖ）以上５％（ｗ／ｖ）以下であり、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ３であるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤の濃度が、第１試薬組成物の全組成に対して０．０５％（ｗ／ｖ）または０．２％（ｗ／ｖ）以上５％（ｗ／ｖ）以下であり、
測定対象のリポタンパク質がapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤の濃度が、第１試薬組成物の全組成に対して０．０３（ｗ／ｖ）以上１．２％（ｗ／ｖ）以下であり、
前記第２試薬組成物において、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４～３５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選択される１種または２種以上であり、
測定対象のリポタンパク質がＬＤＬまたはレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン誘導体を含み、
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ３であるとき、測定対象のリポタンパク質に作用する前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルであり、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下であり、
前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含む
【請求項9】
第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する１または２以上の酵素を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項11】
第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、請求項８乃至１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記第１試薬組成物が前記条件１を満たすとき、前記第１試薬組成物中の前記カップラーの濃度が０．５ｍＭ以上４ｍＭ以下であり、
前記第２試薬組成物が前記条件１を満たすとき、前記第２試薬組成物中の前記カップラーの濃度が１ｍＭ以上８ｍＭ以下である、請求項８乃至１１いずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記第１試薬組成物が前記条件２を満たすとき、前記第１試薬組成物中の前記鉄錯体の濃度が０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌであり、
前記第２試薬組成物が前記条件２を満たすとき、前記第２試薬組成物中の前記鉄錯体の濃度が０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項８乃至１２いずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記第１試薬組成物が前記条件３を満たすとき、前記第１試薬組成物の前記コレステロールオキシダーゼ活性が４００Ｕ／Ｌ以上３０００Ｕ／Ｌ以下であり、
前記第２試薬組成物が前記条件３を満たすとき、前記第２試薬組成物の前記コレステロールオキシダーゼ活性が５００Ｕ／Ｌ以上２００００Ｕ／Ｌ以下である、請求項８乃至１３いずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キットおよび方法に関する。
【背景技術】
【0002】
コレステロールは細胞の主要な構成成分の１つである。過剰なコレステロールは血管の内皮細胞下でマクロファージに取り込まれることにより泡沫細胞が形成され、動脈硬化の初期病変を呈することから臨床的に重要な成分である。コレステロールはリポタンパク質の形で血液中に運搬される。リポタンパク質には異なる機能を持ったＶＬＤＬ（Very Low Density Lipoprotein）、ＨＤＬ（High Density Lipoprotein）、ＬＤＬ（Low Density Lipoprotein）などが存在する。また各種リポタンパク質はさらに亜分画に分類される。リポタンパク質亜分画として、ＨＤＬは粒子サイズが小さくより高密度なＨＤＬ３と粒子サイズが大きく低密度なＨＤＬ２に分類される。またＨＤＬはアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）の含有率の違いからapoE containing HDLとapoE deficient HDLに分けることができる。ＶＬＤＬには、通常のサイズに対し、リポプロテインリパーゼにより分解され、小型化したレムナントが存在する。
【0003】
これらの亜分画を含めたリポタンパク質中コレステロールは汎用の自動分析装置を用いて測定することができる。
具体的には、リポタンパク質中のコレステロールの測定技術として、特許文献１～５に記載のものがある。これらにおいては、リポタンパク質中のコレステロールの定量に際し、波長６００～７００ｎｍ程度の長波長側での吸光度測定が用いられていた。
具体的には、リポタンパク質中のコレステロールの測定技術として、特許文献１～５に記載のものがある。これらにおいては、リポタンパク質中のコレステロールの定量に際し、波長６００～７００ｎｍ程度の長波長側での吸光度測定が用いられていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】国際公開第９８／０２６０９０号
【文献】特開平１０－０３８８８８号公報
【文献】国際公開第２０１２／０１１５５４号
【文献】特開２０１２－１００５８１号公報
【文献】特開２０１３－２１５１６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
前述のリポタンパク質中のコレステロールの定量技術について本発明者らが検討したところ、高水準の測定精度を安定的に得るという点で、なお改善の余地があることがあきらかになった。
【0006】
本発明は、リポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）を高い精度で安定的に定量する技術を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、波長６００～７００ｎｍ程度の領域における吸光度測定を用いるリポタンパクＣの定量について、より微量の試料についても高い測定精度を得ることをめざして検討した。すると、定量に用いる試薬を保存した場合に試薬が劣化し、リポタンパクＣの定量における波長域よりも短波長側にピークを有する吸収が生じて、かかる吸収の影響が高波長側にわたって観測される場合があることが新たな課題として見出された。そして、こうした吸収が生じると、リポタンパクＣの定量時の吸光度に影響を及ぼすため、測定精度が低下する場合があることが明らかになった。また、短波長側の吸収ピークの出現の仕方は、たとえば測定に用いる試薬の成分や保存条件、保存日数により変化しうることがあわせて見出された。
【0008】
そこで、短波長領域で生じる吸収の影響を極力排除すべくさらに検討したところ、リポタンパクＣの分別に用いる試薬組成物について、リポタンパクＣの測定波長領域外の特定の波長において、加速試験後の吸光度の比を特定の範囲とすることにより、長波長側への吸収の影響を効果的に抑制し、高精度でのリポタンパクＣの定量が可能となることを新たに見出し、本発明を完成させるに至った。
【0009】
本発明によれば、以下のキットおよび方法が提供される。
［１］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物と、
測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、キット。
［２］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、［１］に記載のキット。
［３］ 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、［１］または［２］に記載のキット。
［４］ 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［３］いずれか１項に記載のキット。
［５］ 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［１］乃至［４］いずれか１項に記載のキット。
［６］ 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［５］いずれか１項に記載のキット。
［７］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［１］乃至［６］いずれか１項に記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［８］ 測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、［１］乃至［７］いずれか１項に記載のキット。
［９］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、方法。
［１０］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、［９］に記載の方法。
［１１］ 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性をさらに有する、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］ 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［９］乃至［１１］いずれか１項に記載の方法。
［１３］ 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［９］乃至［１２］いずれか１項に記載の方法。
［１４］ 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［９］乃至［１３］いずれか１項に記載の方法。
［１５］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［９］乃至［１４］いずれか１項に記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［１６］
測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、［９］乃至［１５］いずれか１項に記載の方法。
［１］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物と、
測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、キット。
［２］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、［１］に記載のキット。
［３］ 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、［１］または［２］に記載のキット。
［４］ 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［３］いずれか１項に記載のキット。
［５］ 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［１］乃至［４］いずれか１項に記載のキット。
［６］ 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［１］乃至［５］いずれか１項に記載のキット。
［７］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［１］乃至［６］いずれか１項に記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［８］ 測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、［１］乃至［７］いずれか１項に記載のキット。
［９］ 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、方法。
［１０］ 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、［９］に記載の方法。
［１１］ 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性をさらに有する、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］ 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［９］乃至［１１］いずれか１項に記載の方法。
［１３］ 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、［９］乃至［１２］いずれか１項に記載の方法。
［１４］ 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、［９］乃至［１３］いずれか１項に記載の方法。
［１５］ 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、［９］乃至［１４］いずれか１項に記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
［１６］
測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、［９］乃至［１５］いずれか１項に記載の方法。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、リポタンパク質中のコレステロールを高い精度で安定的に定量する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図2】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図3】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図4】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図5】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図6】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図7】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図8】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図9】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図10】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【図11】第１および第２試薬組成物の吸光度測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下、実施の形態について説明する。本実施形態において、測定試薬等の組成物は、各成分を単独でまたは２種以上を組み合わせて含むことができる。また、本明細書において、数値範囲の「ｘ～ｙ」は「ｘ以上ｙ以下」を表し、下限値ｘおよび上限値ｙをいずれも含む。
【0013】
はじめに、リポタンパク質およびリポタンパクＣについて説明する。
リポタンパク質は大きくカイロミクロン（ＣＭ）、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬに分けられ、各リポタンパク質はさらに亜分画に分けられる。これらの分画および亜分画のいくつかは、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＩＤＬ（intermediate density lipoprotein）を含めたＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（１９ｎｍ～３０ｎｍ）、ＨＤＬが直径７～１２ｎｍ、ＨＤＬ亜分画であるＨＤＬ３は直径７～８．５ｎｍ、ＨＤＬ２の直径が８．５～１０ｎｍである。比重についてはＶＬＤＬが１．００６以下であり、ＩＤＬが１．００６～１．０１９、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１、ＨＤＬ２が１．０６３～１．１２５、ＨＤＬ３が１．１２５－１．２１０である。粒子直径は、たとえばグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（JAMA, 260, p.1917-21, 1988）、ＮＭＲ（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、 Nader Rifai他編、AACC PRESS：The Fats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重はたとえば超遠心分離による分析（Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990）に基づいて決定できる。
ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）およびＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）は、たとえば自動分析装置にて測定できる。
リポタンパク質は大きくカイロミクロン（ＣＭ）、ＶＬＤＬ、ＬＤＬおよびＨＤＬに分けられ、各リポタンパク質はさらに亜分画に分けられる。これらの分画および亜分画のいくつかは、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがＶＬＤＬが３０ｎｍ～８０ｎｍ（３０ｎｍ～７５ｎｍ）であり、ＩＤＬ（intermediate density lipoprotein）を含めたＬＤＬが２２ｎｍ～２８ｎｍ（１９ｎｍ～３０ｎｍ）、ＨＤＬが直径７～１２ｎｍ、ＨＤＬ亜分画であるＨＤＬ３は直径７～８．５ｎｍ、ＨＤＬ２の直径が８．５～１０ｎｍである。比重についてはＶＬＤＬが１．００６以下であり、ＩＤＬが１．００６～１．０１９、ＬＤＬが１．０１９～１．０６３、ＨＤＬが１．０６３～１．２１、ＨＤＬ２が１．０６３～１．１２５、ＨＤＬ３が１．１２５－１．２１０である。粒子直径は、たとえばグラジエントゲル電気泳動（ＧＧＥ）（JAMA, 260, p.1917-21, 1988）、ＮＭＲ（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2ndEdition、 Nader Rifai他編、AACC PRESS：The Fats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重はたとえば超遠心分離による分析（Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990）に基づいて決定できる。
ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）およびＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）は、たとえば自動分析装置にて測定できる。
【0014】
また、ＨＤＬはＡｐｏＥの含量比率の違いからapoE containing HDLとapoE deficient HDLの亜分画に分類することができる。通常、apoE containing HDLはＨＤＬ中にＡｐｏＥを含有したものを示し、apoE deficient HDLはＡｐｏＥを含有しないものを示す。ＡｐｏＥが存在するか又は含有量が多いＨＤＬをapoE rich HDLと呼ぶことがあるが、これもApoE containing HDLに含まれる。ＨＤＬ内部に存在するＡｐｏＥ含有量の分布は連続しているので、リポタンパク質中のＡｐｏＥ含有比により、明確にapoE containing HDLとapoE deficient HDLを区別できるものではないが、たとえば、apoE containing HDL-C を含めた総ＨＤＬ－Ｃを測定できる１３％ＰＥＧ法（J Lipid Research 38, 1204-16: 1997）からapoE containing HDL-Cを測定せずにapoE deficient HDL-Cのみを測定できるリンタングステン酸－デキストラン硫酸－マグネシウム沈殿法（ＰＴ－ＤＳ－Ｍｇ法）（BIOCHEMICAL MEDICINE AND METABOLIC BIOLOGY 46, 329-343 (1991)）を差し引くことによりapoE containing HDL-Cを定量することができる。また界面活性剤の濃度による反応性の違いを利用してapoE containing HDL-Cを自動分析装置にて測定できる（Ann Clin Biochem 56, 123-132 (2019)）。
レムナントはメタボリックシンドロームなどで脂質代謝が滞った場合に発生する特殊リポタンパク質であり、ＣＭやＶＬＤＬがリポプロテインリパーゼの働きにより分解された代謝産物である。レムナントは特定のサイズや比重により定義されないが、リポタンパク質中の構成アポタンパク質に対する抗体の固定化ゲルや、リン脂質分解酵素または界面活性剤等を用いて定量することができる。またコレステロールエステラーゼの分子量による反応性の違いを利用してレムナント－コレステロール（レムナント－Ｃ）を自動分析装置にて測定できる（J Applied Laboratory Medicine 3,26-36 , (2018)）。
レムナントはメタボリックシンドロームなどで脂質代謝が滞った場合に発生する特殊リポタンパク質であり、ＣＭやＶＬＤＬがリポプロテインリパーゼの働きにより分解された代謝産物である。レムナントは特定のサイズや比重により定義されないが、リポタンパク質中の構成アポタンパク質に対する抗体の固定化ゲルや、リン脂質分解酵素または界面活性剤等を用いて定量することができる。またコレステロールエステラーゼの分子量による反応性の違いを利用してレムナント－コレステロール（レムナント－Ｃ）を自動分析装置にて測定できる（J Applied Laboratory Medicine 3,26-36 , (2018)）。
【0015】
本実施形態は、具体的には、ｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別または測定に関する。ｓｄＬＤＬは、一般的にはＬＤＬ画分のうち直径が約２２．０～約２５．５ｎｍの亜分画、または、比重１．０４０～１．０６３の亜分画を指す。ｓｄＬＤＬの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあり、別の報告では１．０４４～１．０６０に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。
【0016】
本明細書において、ｓｄＬＤＬという場合、具体的には、ＬＤＬのうち比重が大きいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のＬＤＬよりも大きいものをいう。また、ｓｄＬＤＬは、好ましくはＬＤＬの比重範囲のうち中央点より高い比重範囲に属するもの、より好ましくは比重１．０４４～１．０６３の範囲に属するＬＤＬをいう。
また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質という場合、具体的にはカイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、比重１．０４４～１．０６３の範囲外に属するＬＤＬ、ＨＤＬ、およびこれらの亜分画を指す。
また、ｓｄＬＤＬ以外のリポタンパク質という場合、具体的にはカイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、比重１．０４４～１．０６３の範囲外に属するＬＤＬ、ＨＤＬ、およびこれらの亜分画を指す。
【0017】
本実施形態において、測定対象のリポタンパクＣは、たとえばＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）、ＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）、ＨＤＬ３コレステロール（ＨＤＬ３－Ｃ）、レムナントコレステロール（レムナント－Ｃ）またはapoE containing HDLコレステロール（apoE containing HDL－Ｃ）である。
【0018】
（キット）
本実施形態において、キットは、試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるものであり、以下の第１試薬組成物および第２試薬組成物を含む。
（第１試薬組成物）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する試薬組成物である。第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９以上３．５０以下である。
（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、測定対象のリポタンパクＣを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である。
本実施形態において、キットは、試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ（ｓｄＬＤＬ－Ｃ）以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるものであり、以下の第１試薬組成物および第２試薬組成物を含む。
（第１試薬組成物）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する試薬組成物である。第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９以上３．５０以下である。
（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、測定対象のリポタンパクＣを定量するための試薬組成物である。第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である。
【0019】
本発明者らは、リポタンパクＣの測定波長領域外の特定の波長において、第１および第２試薬組成物の加速試験後の吸光度の比を特定の範囲とすることにより、リポタンパクＣの高精度での定量が可能となることを新たに見出した。具体的には、短波長側の吸収の存在の有無や程度の指標として、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０の比Ｒ１が好適であることを見出した。Ｒ１を上限値以下とすることにより、リポタンパクＣの測定波長域、たとえば波長６００～７００ｎｍの領域よりも低波長側にピークを有する吸収の波長６００～７００ｎｍの領域への緩衝を効果的に抑制することができるため、高精度でのリポタンパクＣの定量が可能となる。
ここで、リポタンパクＣの測定波長域自体において、緩衝の有無を判定するのは困難であったが、観測領域外の４００ｎｍｍおよび４５０ｎｍの吸光度を用いるとともに、第１および第２試薬組成物の加速試験後の吸光度比を指標とすることにより、低波長側にピークを有する吸収の存在や緩衝の影響を把握することができる。そして、Ｒ１が特定の範囲にある試薬組成物を用いることにより、測定精度を向上することができる。
ここで、リポタンパクＣの測定波長域自体において、緩衝の有無を判定するのは困難であったが、観測領域外の４００ｎｍｍおよび４５０ｎｍの吸光度を用いるとともに、第１および第２試薬組成物の加速試験後の吸光度比を指標とすることにより、低波長側にピークを有する吸収の存在や緩衝の影響を把握することができる。そして、Ｒ１が特定の範囲にある試薬組成物を用いることにより、測定精度を向上することができる。
【0020】
第１試薬組成物については、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、リポタンパクＣの測定精度を向上する観点から、３．５０以下であり、好ましくは３．２５以下、より好ましくは３．００以下、さらに好ましくは２．８０以下、さらにより好ましくは２．６０以下、よりいっそう好ましくは２．５０以下である。
また、リポタンパクＣを安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、リポタンパクＣを安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
【0021】
また、第２試薬組成物については、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、リポタンパクＣの測定精度を向上する観点から、９．００以下であり、好ましくは８．００以下、より好ましくは６．００以下、さらに好ましくは４．００以下、さらにより好ましくは３．００以下、よりいっそう好ましくは２．５０以下、さらにまた好ましくは２．００以下である。
また、リポタンパクＣを安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、リポタンパクＣを安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ１は、０．９０以上であり、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
【0022】
本実施形態においては、キットに含まれる第１および第２試薬組成物がいずれもＲ１について上述の条件を満たすため、リポタンパクＣを精度良く測定することができる。
【0023】
第１試薬組成物について、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、リポタンパクＣの測定精度をより安定的に向上する観点から、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２は、たとえば３．００以下であり、好ましくは２．５０以下、より好ましくは２．２０以下、さらに好ましくは２．００以下、さらにより好ましくは１．６８以下、よりいっそう好ましくは１．６０以下である。
また、リポタンパクＣをさらに安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、リポタンパクＣをさらに安定的に定量する観点から、第１試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
【0024】
また、第２試薬組成物について、３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、リポタンパクＣの測定精度をより安定的に向上する観点から、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２は、たとえば３．００以下であり、好ましくは２．５０以下、より好ましくは２．００以下、さらに好ましくは１．７０以下、さらにより好ましくは１．５０以下である。
また、リポタンパクＣをさらに安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
また、リポタンパクＣをさらに安定的に定量する観点から、第２試薬組成物のＲ２は、たとえば０．９０以上であってもよく、また、たとえば０．９５以上、または１．００以上であってもよい。
【0025】
リポタンパクＣの測定精度をさらに向上する観点から、より好ましくは第１および第２試薬組成物がいずれもＲ２について上述の条件を満たす。
【0026】
本実施形態において、キットは、リポタンパクＣの分別または定量に用いられ、好ましくはリポタンパクＣの分別および定量に用いられる。
また、キットは、具体的には２以上の工程を含むリポタンパクＣの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
以下、各試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。
また、キットは、具体的には２以上の工程を含むリポタンパクＣの定量方法に用いられる。このとき、第１および第２試薬組成物は、それぞれ異なる工程に用いられ、好ましくは第１および第２試薬組成物の順に用いられる。
以下、各試薬組成物の構成をさらに具体的に説明する。
【0027】
（第１試薬組成物）
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有する。
第１試薬組成物は、上記１または２以上の活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質を消去することができる。また、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に導くことができる。
第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性を有する。
第１試薬組成物は、上記１または２以上の活性を有する組成物であるため、試料に第１試薬組成物を添加したときに、たとえば、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質を消去することができる。また、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外に導くことができる。
【0028】
ここで、「界面活性剤が作用（反応）する」とは、界面活性剤がリポタンパク質を分解し、リポタンパク質中のコレステロールが遊離することをいう。たとえば、「測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用（反応）する界面活性剤」という場合、界面活性剤が測定対象のリポタンパク質に全く作用しないことは要求されず、主に測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用すればよい。「消去」とは、被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。すなわち、「測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去する」とは、被検体試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質を分解し、その分解産物であるこれらリポタンパク質中のコレステロールがその後の工程で検出されないようにすることをいう。
【0029】
「反応系外に導く」とは、測定対象外のリポタンパク質に含まれるコレステロールが、測定対象のリポタンパクＣの定量に影響を及ぼさないように、測定対象外のリポタンパク質に含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりすることをいう。
【0030】
また、「コレステロールエステラーゼ活性を有する」とは、具体的には、コレステロールエステラーゼが存在し、ペルオキシダーゼコレステロールエステラーゼが触媒する反応が起こり得ることをいう。コレステロールオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、カタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性等の他の酵素活性についても同様である。
【0031】
次に、第１試薬組成物に含まれる成分をさらに具体的に説明する。
第１試薬組成物に含まれる成分の具体例として、酵素、酵素作用を有しないタンパク質、界面活性剤、緩衝液、塩、水素供与体、カップラー、鉄錯体が挙げられる。
第１試薬組成物に含まれる成分の具体例として、酵素、酵素作用を有しないタンパク質、界面活性剤、緩衝液、塩、水素供与体、カップラー、鉄錯体が挙げられる。
【0032】
（酵素）
第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する１または２以上の酵素を含む組成物であり、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素およびコレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素を含む。
また、第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む組成物であり、好ましくはコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む。
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼとして、たとえば細菌や菌類由来のものを用いることができる。
第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する１または２以上の酵素を含む組成物であり、好ましくはコレステロールエステラーゼ活性を有する酵素およびコレステロールオキシダーゼ活性を有する酵素を含む。
また、第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む組成物であり、好ましくはコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを含む。
コレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼとして、たとえば細菌や菌類由来のものを用いることができる。
【0033】
第１試薬組成物のコレステロールエステラーゼ活性は、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは１０Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは３００Ｕ／Ｌ以上、さらに好ましくは６００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２５００Ｕ／ｍＬ以下、さらに好ましくは２０００Ｕ／Ｌ以下である。
【0034】
同様の観点から、第１試薬組成物のコレステロールオキシダーゼ活性は、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは２００Ｕ／Ｌ以上、さらに好ましくは３００Ｕ／ｍ以上であり、また、好ましくは３５００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下、さらに好ましくは２５００Ｕ／Ｌ以下である。
【0035】
第１試薬組成物は、上記活性以外の活性を有してもよく、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、たとえば、カタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有し、好ましくはペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する。
【0036】
さらに具体的には、第１試薬組成物は、上記活性以外の活性を有する酵素を含んでもよい。たとえば、第１試薬組成物は、上記活性以外の活性を有する酵素をさらに含み、好ましくはカタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性およびスフィンゴミエリナーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する酵素を含み、より好ましくはカタラーゼ活性およびペルオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する酵素を含む。
また、第１試薬組成物は、たとえば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含み、好ましくはカタラーゼおよびペルオキシダーゼの少なくとも１つを含む。
また、第１試薬組成物は、たとえば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼおよびスフィンゴミエリナーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含み、好ましくはカタラーゼおよびペルオキシダーゼの少なくとも１つを含む。
【0037】
第１試薬組成物のカタラーゼ活性は、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは４０Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは１００Ｕ／ｍＬ以上であり、また、好ましくは２５００Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは２０００Ｕ／ｍＬ以下である。
第１試薬組成物がカタラーゼ活性を有するとき、測定対象のリポタンパクＣがＨＤＬ－Ｃ、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃであることも好ましい。
第１試薬組成物がカタラーゼ活性を有するとき、測定対象のリポタンパクＣがＨＤＬ－Ｃ、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃであることも好ましい。
【0038】
第１試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは４００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは６００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは３０００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２０００Ｕ／Ｌ以下である。
【0039】
第１試薬組成物のスフィンゴミエリナーゼ活性は、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、より好ましくは２００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１０００００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは２００００Ｕ／Ｌ以下である。
第１試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するとき、測定対象のリポタンパクＣがＨＤＬ３－Ｃまたはレムナント－Ｃであることも好ましい。
一方、測定対象のリポタンパク質がｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬであるとき、第１試薬組成物は好ましくはスフィンゴミエリナーゼ活性を有さない。
スフィンゴミエリナーゼの具体例として、ＳＰＣ（旭化成社製）、Sphingomyelinase from bacillus cereus、Sphingomyelinase from staphylococcus aureus（ＳＩＧＭＡ社製）が挙げられる。
第１試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するとき、測定対象のリポタンパクＣがＨＤＬ３－Ｃまたはレムナント－Ｃであることも好ましい。
一方、測定対象のリポタンパク質がｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬであるとき、第１試薬組成物は好ましくはスフィンゴミエリナーゼ活性を有さない。
スフィンゴミエリナーゼの具体例として、ＳＰＣ（旭化成社製）、Sphingomyelinase from bacillus cereus、Sphingomyelinase from staphylococcus aureus（ＳＩＧＭＡ社製）が挙げられる。
【0040】
また、第１試薬組成物は、各種リポタンパク質に対する作用を好ましく調整する観点から、好ましくはリポタンパク質分解酵素を含んでもよい。
リポタンパク質分解酵素としては、たとえばリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。
リポタンパク質分解酵素としては、たとえばリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば限定されず、たとえば動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。
【0041】
第１試薬組成物がリポプロテインリパーゼを含むとき、第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、各種リポタンパク質に対する作用を好ましく調整する観点から、好ましくは１００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下であり、より好ましくは５０００Ｕ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以下である。
【0042】
ここで、第１試薬組成物および後述の第２試薬組成物の酵素活性の測定方法を説明する。
本実施形態において、試薬組成物のコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、リポプロテインリパーゼ活性は、それぞれ、たとえば以下の方法にて測定できる。
本実施形態において、試薬組成物のコレステロールエステラーゼ活性、コレステロールオキシダーゼ活性、カタラーゼ活性、ペルオキシダーゼ活性、スフィンゴミエリナーゼ活性、リポプロテインリパーゼ活性は、それぞれ、たとえば以下の方法にて測定できる。
【0043】
コレステロールエステラーゼ活性の測定では、基質（０．０４％リノレン酸コレステロール、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、０．６％コール酸ナトリウム溶液）、３００Ｕ／ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液、酵素希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．２％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｐＨ７．５）、反応液（０．０６％ ４－アミノアンチピリン、０．４％ フェノール、７．５ＫＵ／Ｌ ペルオキシダーゼ）を用いる。反応液１．７５ｍＬと基質液１．０ｍＬを混合後、３７℃で５分加温し、０．１ｍＬコレステロールオキシダーゼ溶液を加える。３７℃、２分加温後に希釈液で希釈した測定対象０．１ｍＬを加え、混合液を３７℃で反応させ、波長５００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、０分から３．５分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールエステラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が８Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールエステラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールエステラーゼが含まれているといえる。
【0044】
コレステロールオキシダーゼ活性の測定では、基質液として６ｍＭコレステロール溶液（イソプロパノールに溶解）を用いる。測定対象を２～４Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（０．１Ｍ リン酸緩衝液、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ７．０）を加え、希釈後の溶液３ｍＬを３７℃５分加温後に基質液０．０５ｍＬを加える。その後、混合液を３７℃で反応させ波長２４０ｎｍ吸光度変化量を測定する。３７℃にて反応後、２分から７分までの吸光度変化量を測定し、コレステロールオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はコレステロールオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、コレステロールオキシダーゼが含まれているといえる。
【0045】
カタラーゼ活性の測定では、基質（０．０６％ 過酸化水素、５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。基質溶液２．９ｍＬを２５℃で予備加温後、測定対象０．１ｍＬと混合し、２４０ｎｍにおける吸光度変化量を測定する。２５℃反応後、０分から３分までの吸光度変化量を測定しカタラーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１００Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はカタラーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、カタラーゼが含まれているといえる。
【0046】
ペルオキシダーゼ活性の測定では、反応液１（１．５ｍＭ ＨＤＡＯＳ、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、および、反応液２（５ｍＭ ４－アミノアンチピリン、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１％ 過酸化水素、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）、希釈液（５０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を用いる。０．３ｍＬの反応液１と希釈液で希釈した測定対象０．０８ｍＬを混合し、３７℃で５分加温する。その後０．１ｍＬの反応液２を加え、３７℃で反応させ、主波長６００ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定する。３７℃反応後、２分から５分までの吸光度変化量を測定しペルオキシダーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が１０Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はペルオキシダーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、ペルオキシダーゼが含まれているといえる。
【0047】
スフィンゴミエリナーゼ活性の測定では、反応液（０．００８％ スフィンゴミエリン、０．０５％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００溶液、１０Ｕ／ｍＬ アルカリ性フォスファターゼ、１０Ｕ／ｍＬ コレステロールオキシダーゼ、２Ｕ／ｍＬ ペルオキシダーゼ、０．０２％ ４－アミノアンチピリン、０．０２％ ＴＯＤＢ混合液）、反応停止液（１％ ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、希釈液（１０ｍＭ トリス緩衝液、０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、ｐＨ８．０）を用いる。反応液０．０８ｍＬと希釈液で希釈した測定対象０．００３ｍＬを混合し３７℃で５分加温後に反応停止液０．１６ｍＬを加える。反応停止後に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍの吸光度変化量を測定し、スフィンゴミエリナーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が２Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はスフィンゴミエリナーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、スフィンゴミエリナーゼが含まれているといえる。
【0048】
第１試薬組成物のリポプロテインリパーゼ活性は、たとえば以下の方法で測定される。すなわち、リポプロテインリパーゼ活性の測定では、基質液としてオリーブ油エマルジョン溶液（オリーブ油５ｇ、エタノール２ｍＬに５．０％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ５ｍＬを加え２０分間超音波処理し、その後４％ＢＳＡ ２５ｍＬ、０．１Ｍ リン酸緩衝液ｐＨ７．０ １５ｍＬを加え室温で１～２時間攪拌したもの）を用いる。３７℃、５分間予備加温した基質液に、０．９～１．６Ｕ／ｍＬとなるように希釈液（２０ｍＭリン酸緩衝液、２ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ－２Ｎａ、ｐＨ７．５）を加え、希釈した検体０．２ｍＬを加え、３７℃１５分加温後に反応停止液（０．２Ｍトリクロル酢酸）２．０ｍＬを加える。その後、濾過（東洋濾紙No. 131またはWhatman No. 42）を行い、濾液を回収する。濾液０．０５ｍＬに発色試薬（５０ｍＭ ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液２００ｍＬ、５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００ ４ｍＬ、Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ｍ－ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ ４０μＬ、４アミノアンチピリン４ｍｇ、ＡＴＰ・２Ｎａ・３Ｈ2Ｏ ２４．２ｍｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ４０．７ｍｇ、グリセロールキナーゼ ２００Ｕ、Ｌαグリセロリン酸オキシダーゼ ５００Ｕ、ペルオキシダーゼ ３００Ｕ）３．０ｍＬを加え、混合液を３７℃で１５分間反応させて、波長５４５ｎｍ吸光度を測定し、リポプロテインリパーゼ活性を算出する。たとえば、吸光度変化量が３Ｕ／Ｌ以上あれば、測定対象はリポプロテインリパーゼ活性が存在するといえ、さらに具体的には、リポプロテインリパーゼが含まれているといえる。
【0049】
また、第１および第２試薬組成物中の酵素は以下の方法でも同定できる。すなわち、まず、標的酵素を含む試料をトリプシンで分解することにより得られた断片ペプチドをハイブリッド型質量分析計で検出する。質量分析計により得られたペプチドの質量、および質量分析計内でアルゴンガスと衝突させることにより得られたフラグメントイオンのスペクトル（ＭＳ／ＭＳデータ）をデータベース検索（たとえば、Ｍａｓｃｏｔサーチ）することによりタンパク質を同定することができる。試薬組成物中のアミノ酸配列由来の断片ペプチドの配列がデータベースに登録されているアミノ酸配列とユニークな配列として一致する場合、対象酵素を含んでいるとみなせる。
【0050】
また、第１および第２試薬組成物中の酵素はたとえば以下の定量でも同定できる。すなわち、標的酵素をトリプシンで分解することにより得られる断片ペプチドのうち標的酵素に特異的で、かつ質量分析において強いシグナルが得られるペプチドを定量対象ペプチドとして選択する。定量対象ペプチドについて、非標識のペプチドおよび内部標準としての安定同位体で標識したペプチドを化学合成によって作製する。標的酵素を含む試料をトリプシンによって完全に消化し、既知量の安定同位体標識ペプチドを添加して、ＨＰＬＣに接続した三連四重極型質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によりＭＲＭモード（多重反応モニタリングモード）で測定する。定量対象ペプチドの非標識ペプチドと既知量の安定同位体標識ペプチドの混合液を同様に測定して内部標準の濃度比とピーク面積比の検量線を作成し、試料中の定量対象ペプチドの絶対量を計算することにより標的酵素を定量することができる。
【0051】
（酵素作用を有しないタンパク質）
酵素作用を有しないタンパク質の具体例として、ＢＳＡ等のアルブミンが挙げられる。
第１試薬組成物中のＢＳＡ濃度は、第１試薬組成物中の酵素を安定化させる観点、および、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
第１試薬組成物がＢＳＡを含むとき、測定対象のリポタンパクＣがＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃであることも好ましい。
酵素作用を有しないタンパク質の具体例として、ＢＳＡ等のアルブミンが挙げられる。
第１試薬組成物中のＢＳＡ濃度は、第１試薬組成物中の酵素を安定化させる観点、および、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中コレステロールを反応系外に導く観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは１ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは２ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２０ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは１０ｇ／Ｌ以下である。
第１試薬組成物がＢＳＡを含むとき、測定対象のリポタンパクＣがＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃであることも好ましい。
【0052】
（界面活性剤）
第１試薬組成物は、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは界面活性剤を含む。界面活性剤は、具体的には、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤からなる群から選択される１種または２種以上であり、好ましくはノニオン界面活性剤であり、より好ましくはポリオキシエチレン誘導体である。
第１試薬組成物は、試料中の測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールをより安定的に反応系外に導く観点から、好ましくは界面活性剤を含む。界面活性剤は、具体的には、ノニオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤および両性界面活性剤からなる群から選択される１種または２種以上であり、好ましくはノニオン界面活性剤であり、より好ましくはポリオキシエチレン誘導体である。
【0053】
界面活性剤として、たとえば測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤が挙げられ、より好ましくは測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用するとともに測定対象のリポタンパク質に作用しない界面活性剤が挙げられる。また、第１試薬組成物は、測定対象のリポタンパク質を安定的に分別する観点から、好ましくは測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含み、より好ましくは測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用するとともに測定対象のリポタンパク質に作用しない界面活性剤を含む。
【0054】
たとえば、測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはＨＤＬ３であるとき、第１試薬組成物中の界面活性剤は、具体的には、ポリオキシエチレンソルビタン誘導体、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物、ポリオキシエチレンステアリルアミン等のノニオン界面活性剤；アミドエーテルサルフェート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム等のアニオン界面活性剤；ヤシ油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタイン、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタイン、ラウリルベタイン等の両性界面活性剤；ならびに、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライド等のカチオン界面活性剤からなる群から選択される１種または２種以上とすることができる。
【0055】
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはＨＤＬ３であるとき、第１試薬組成物中の界面活性剤の市販品の具体例として、ノニオン界面活性剤については、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートであるノニオンＯＴ－２２１（日油社製）、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン縮合物であるプルロニックＦ６８（アデカ社製）、プルロニックＦ８８（アデカ社製）、プルロニックＦ１２７（アデカ社製）、プルロニックＰ１０３（アデカ社製）、プルロニックＰ１２３（アデカ社製）、ポリオキシエチレンステアリルアミンであるナイミーンＳ２１０（日油社製）、エマルゲンＡ５００（花王社製）が挙げられ；
アニオン界面活性剤の具体例として、アミドエーテルサルフェートであるサンアミドＣＦ－１０（日油社製）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムであるレベノールＷＸ（花王社製）が挙げられ；
両性界面活性剤の具体例として、ヤシ油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノン（登録商標）ＢＤＦ－ＳＦ（日油社製）、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノン（登録商標）ＢＦ（日油社製）、ラウリルベタインであるアンヒトール２４Ｂ（花王社製）が挙げられ；
カチオン界面活性剤の具体例として、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであるコータミン２４Ｐ（花王社製）が挙げられる。
アニオン界面活性剤の具体例として、アミドエーテルサルフェートであるサンアミドＣＦ－１０（日油社製）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウムであるレベノールＷＸ（花王社製）が挙げられ；
両性界面活性剤の具体例として、ヤシ油脂肪酸－アミドプロピルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノン（登録商標）ＢＤＦ－ＳＦ（日油社製）、アルキルジメチル－アミノ酢酸ベタインであるニッサンアノン（登録商標）ＢＦ（日油社製）、ラウリルベタインであるアンヒトール２４Ｂ（花王社製）が挙げられ；
カチオン界面活性剤の具体例として、ラウリルトリメチルアンモニウムクロライドであるコータミン２４Ｐ（花王社製）が挙げられる。
【0056】
測定対象のリポタンパク質がＬＤＬまたはapoE containing HDLであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤として、ノニオン界面活性剤が挙げられ、さらに具体的には、ポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。ポリオキシエチレン誘導体の例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選択される１または２以上のノニオン界面活性剤が挙げられる。
【0057】
このうち、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの好ましい例として、ポリオキシエチレンベンジルフェニル誘導体やポリオキシエチレンスチレン化フェニルエーテル誘導体、特殊フェノールエトキシレートが挙げられる。ポリオキシエチレン多環フェニルエーテルの具体例として、エマルゲンＡ－６０、エマルゲンＡ－５００、エマルゲンＢ－６６、エマルゲンＡ－９０（以上、花王社製）、ニューコール７０３、ニューコール７０４、ニューコール７０６、ニューコール７０７、ニューコール７０８、ニューコール７０９、ニューコール７１０、ニューコール７１１、ニューコール７１２、ニューコール７１４、ニューコール７１９、ニューコール７２３、ニューコール７２９、ニューコール７３３、ニューコール７４０、ニューコール７４７、ニューコール７８０、ニューコール６１０、ニューコール２６０４、ニューコール２６０７、ニューコール２６０９、ニューコール２６１４（以上、日本乳化剤社製）、ノイゲンＥＡ－８７、ノイゲンＥＡ－１３７、ノイゲンＥＡ－１５７、ノイゲンＥＡ－１６７、ノイゲンＥＡ－１７７、ノイゲンＥＡ－１９７Ｄ、ノイゲンＥＡ－２０７Ｄ（以上、第一工業製薬社製）、ブラウノンＤＳＰ－９、ブラウノンＤＳＰ－１２．５、ブラウノンＴＳＰ－７．５、ブラウノンＴＳＰ－１６、ブラウノンＴＳＰ－５０（以上、青木油脂社製）等が挙げられる。
【0058】
また、測定対象のリポタンパク質がレムナントであるとき、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤として、ＨＬＢ値が１１以上１３以下のポリオキシエチレン誘導体が挙げられ、さらに具体的には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選択される界面活性剤のうち、所望のＨＬＢ値を有するものが挙げられる。かかる界面活性剤の市販品の例として、エマルゲンＡ－６０、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９、エマルゲン９０９（以上、花王社製）、ブラウノンＤＳＰ－９、ブラウノンＤＳＰ－１２．５（以上、青木油脂社製）が挙げられる。
【0059】
第１試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第１試薬組成物の全組成に対して、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に安定的に作用させる観点から、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．３％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは３％（ｗ／ｖ）以下である。
【0060】
また、測定対象のリポタンパク質がapoE containing HDLであるとき、同様の観点から、第１試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第１試薬組成物の全組成に対して好ましくは０．０３％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは１．２％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１．０％（ｗ／ｖ）以下である。
【0061】
なお、第１および第２試薬組成物に含まれる界面活性剤は、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ－ＭＳ等を組み合わせて解析する方法によって同定できる。界面活性剤のイオン性（非イオン性、陰イオン性、陽イオン性）を確認する方法としては、酸性またはアルカリ性条件での有機溶媒による抽出法、固相抽出法が挙げられる。界面活性剤の構造を決定する方法としてはＬＣ－ＭＳＭＳ、ＮＭＲを用いて解析する方法が挙げられる。
【0062】
（緩衝液、塩）
緩衝液の種類は、たとえば第１試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。
緩衝液の種類は、たとえば第１試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。緩衝液の具体例として、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン－１，４－ビス（２－エタンスルホン酸））緩衝液、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸）緩衝液が挙げられる。
【0063】
第１試薬組成物における緩衝液の濃度は、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは５ｍＭ以上、さらに好ましくは１０ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下であり、好ましくは２００ｍＭ以下、さらに好ましくは１５０ｍＭ以下、さらにより好ましくは１００ｍＭ以下である。
【0064】
塩は、具体的には、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤として配合される。塩の具体例として、水酸化ナトリウム、硫酸ナトリウム等のナトリウム塩；水酸化カリウム等のカリウム塩；硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニウム塩等の塩基性物質が挙げられる。また、第１試薬組成物が１価の陽イオンおよび２価の陽イオンの少なくとも１つまたはそれらの塩を含むことにより、ｓｄＬＤＬ以外のＬＤＬの測定におけるＬＤＬの分別、たとえばｓｄＬＤＬとＬ ＬＤＬの分別がさらに容易となる。
第１試薬組成物中の塩濃度は、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤としてより安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは５ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下である。
第１試薬組成物中の塩濃度は、ｐＨ調整剤、または、イオン強度調整剤としてより安定的に作用させる観点から、第１試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．２ｇ／Ｌ以上であり、より好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上であり、また、好ましくは５ｇ／Ｌ以下であり、より好ましくは３ｇ／Ｌ以下である。
【0065】
また、第１試薬組成物がスフィンゴミエリナーゼ活性を有するとき、第１工程において、測定対象リポタンパク質とそれ以外のリポタンパク質に対するスフィンゴミエリナーゼの触媒活性を調整するためにポリアニオンを添加することもできる。
添加するポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。
第１試薬組成物中のポリアニオンの濃度は、ヘパリンの場合好ましくは１０～２５０Ｕ／ｍＬであり、リンタングステン酸の場合は好ましくは０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）であり、デキストラン硫酸の場合は好ましくは０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）である。
添加するポリアニオンとしてはヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸などを好適に用いることができる。
第１試薬組成物中のポリアニオンの濃度は、ヘパリンの場合好ましくは１０～２５０Ｕ／ｍＬであり、リンタングステン酸の場合は好ましくは０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）であり、デキストラン硫酸の場合は好ましくは０．０２～１．２５％（ｗ／ｖ）である。
【0066】
第１試薬組成物のｐＨは、組成物中の酵素活性を保持する観点、および、試薬の保存安定性向上の観点から、好ましくは６以上、より好ましくは６．５以上であり、また、好ましくは８以下であり、より好ましくは７．５以下である。
【0067】
（水素供与体、カップラー）
第１試薬組成物は、好ましくは水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む。水素供与体およびカップラーは、たとえばペルオキシダーゼ活性の存在下でカップリング反応する組み合わせで用いられる。また、水素供与体およびカップラーのいずれか一方は、第１工程で測定対象以外のリポタンパクＣを反応系外に導くために使用される。さらに具体的には、測定対象以外のリポタンパクＣにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼを作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼ活性の存在下で無色キノンに転化させるために、水素供与体かカップラーのいずれか一方が用いられる。
第１試薬組成物は、好ましくは水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含む。水素供与体およびカップラーは、たとえばペルオキシダーゼ活性の存在下でカップリング反応する組み合わせで用いられる。また、水素供与体およびカップラーのいずれか一方は、第１工程で測定対象以外のリポタンパクＣを反応系外に導くために使用される。さらに具体的には、測定対象以外のリポタンパクＣにコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼを作用させ、発生した過酸化水素をペルオキシダーゼ活性の存在下で無色キノンに転化させるために、水素供与体かカップラーのいずれか一方が用いられる。
【0068】
水素供与体の具体例として、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ－（３－スルホプロピル）－３－メトキシ－５－アニリン（ＨＭＭＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－４－フルオロ－３，５－ジメトキシアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（３－メチルフェニル）－Ｎ'－サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等のアニリン誘導体が挙げられる。
【0069】
第１試薬組成物中の水素供与体の濃度は、測定対象以外のリポタンパクＣを反応系外に導く観点から、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは３ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
【0070】
また、水素供与体が後述の第２試薬組成物に含まれるとき、好ましくはカップリング反応に用いるカップラーを第１試薬組成物中は含む。
カップラーは、具体的には、４－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンおよびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンからなる群から選択される少なくとも１種である。
カップラーは、具体的には、４－アミノアンチピリン、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンおよびスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾンからなる群から選択される少なくとも１種である。
【0071】
第１試薬組成物中のカップラーの濃度は、測定対象以外のリポタンパクＣを反応系外に導く観点から、好ましくは０．５ｍＭ以上であり、より好ましくは１．０ｍＭ以上であり、また、好ましくは４ｍＭ以下であり、より好ましくは３ｍＭ以下である。
【0072】
（鉄錯体）
鉄錯体として、たとえば第２の試薬組成物について後述するものが挙げられる。鉄錯体の濃度としては０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
鉄錯体として、たとえば第２の試薬組成物について後述するものが挙げられる。鉄錯体の濃度としては０．００１～０．０５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。
【0073】
第１試薬組成物は、たとえばコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールを分解する酵素、水素供与体またはカップラーのいずれか一方、ならびに、過酸化水素を消去するカタラーゼ等を含む構成とすることができる。
【0074】
（第２試薬組成物）
第２試薬組成物は、測定対象のリポタンパクＣを定量するための試薬である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、測定対象のリポタンパクＣを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。
第２試薬組成物は、測定対象のリポタンパクＣを定量するための試薬である。第２試薬組成物の成分は、第１試薬組成物の構成によって異なるが、測定対象のリポタンパクＣを定量できる配合組成であればよく、公知の物質を用いることができる。
【0075】
第２試薬組成物の成分としては、たとえば、酵素、界面活性剤、酵素作用を有しないタンパク質、緩衝液、塩、カップラー、水素供与体、鉄錯体、カタラーゼ阻害剤が挙げられる。
【0076】
（酵素）
第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する。また、第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含み、さらに具体的にはペルオキシダーゼを含む。
第２試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、測定対象のリポタンパクＣを正確に測定する観点から、好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上、より好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２００００Ｕ／Ｌ以下、より好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下である。
ただし、第１試薬組成がペルオキシダーゼ活性を有するときは、測定対象のリポタンパクＣの測定工程（後述の第２工程）にもペルオキシダーゼ活性が持ち越されるため、第２試薬中の濃度を減量する、あるいは含まなくすることもできる。
（界面活性剤）
第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する。また、第２試薬組成物は、たとえばペルオキシダーゼ活性を有する酵素を含み、さらに具体的にはペルオキシダーゼを含む。
第２試薬組成物のペルオキシダーゼ活性は、測定対象のリポタンパクＣを正確に測定する観点から、好ましくは５００Ｕ／Ｌ以上、より好ましくは１０００Ｕ／Ｌ以上であり、また、好ましくは２００００Ｕ／Ｌ以下、より好ましくは１００００Ｕ／Ｌ以下である。
ただし、第１試薬組成がペルオキシダーゼ活性を有するときは、測定対象のリポタンパクＣの測定工程（後述の第２工程）にもペルオキシダーゼ活性が持ち越されるため、第２試薬中の濃度を減量する、あるいは含まなくすることもできる。
（界面活性剤）
【0077】
界面活性剤は、測定対象のリポタンパク質に応じて適宜選択することができる。
界面活性剤として、たとえば測定対象のリポタンパク質に作用する界面活性剤が挙げられる。また、第２試薬組成物は、リポタンパクＣを安定的に定量する観点から、好ましくは測定対象のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む。
測定対象のリポタンパク質に作用する界面活性剤は、測定対象のリポタンパク質のみに作用する界面活性剤等の測定対象のリポタンパク質に選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。
測定対象のリポタンパクＣの測定工程において、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質が残存するとき、第２試薬組成物は、好ましくは測定対象のリポタンパク質に選択的に作用する界面活性剤を含む。
界面活性剤として、たとえば測定対象のリポタンパク質に作用する界面活性剤が挙げられる。また、第２試薬組成物は、リポタンパクＣを安定的に定量する観点から、好ましくは測定対象のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む。
測定対象のリポタンパク質に作用する界面活性剤は、測定対象のリポタンパク質のみに作用する界面活性剤等の測定対象のリポタンパク質に選択的に作用する界面活性剤であってもよいし、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質にも作用する界面活性剤またはすべてのリポタンパク質に作用する界面活性剤であってもよい。
測定対象のリポタンパクＣの測定工程において、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質が残存するとき、第２試薬組成物は、好ましくは測定対象のリポタンパク質に選択的に作用する界面活性剤を含む。
【0078】
たとえば、測定対象のリポタンパク質がＨＤＬまたはapoE containing HDLであるとき、界面活性剤は、たとえば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコール（炭素数４～３５）エーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテルおよびポリオキシエチレン多環フェニルエーテルからなる群から選択される１種または２種以上である。
【0079】
測定対象のリポタンパク質がＬＤＬまたはレムナントであるとき、界面活性剤は、たとえば、ポリオキシエチレン誘導体を含み、また、市販の総コレステロール測定用試薬等に用いられている界面活性剤を使用することができる。かかる界面活性剤として、たとえば、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル（たとえばエマルゲン９０９（花王社製）、ＴｒｉｔｏｎＸ１００）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（たとえばエマルゲン７０７、エマルゲン７０９（以上、花王社製））、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体（たとえば、プルロニック１７Ｒ－４、プルロニックＬ－６４、プルロニックＰＥ３１００、プルロニックＰ－８５、プルロニックＦ－８８、プルロニックＰ－１０３、プルロニックＦ－１２７等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（ＢＡＳＦ社、ＡＤＥＫＡ社））、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（たとえば、エマルゲンＢ６６、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＡ６０（以上、花王社製））からなる群から選択される１種または２種以上である。
【0080】
測定対象のリポタンパク質がＨＤＬ３であるとき、界面活性剤は、好ましくはＨＤＬ２に対してＨＤＬ３に選択的に作用するものであり、たとえば、ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル（たとえば、ニューコール６１０、ニューコール７１０（日本乳化剤社製）、アデカトールＰＣ－１０、ブラウノンＤＳＰ－１２．５、ブラウノンＴＳＰ－１６（青木油脂社製）、ノイゲンＥＡ－１３７（第一工業製薬社製））である。
【0081】
第２試薬組成物中の界面活性剤の濃度は、第２試薬組成物の全組成に対して、測定対象のリポタンパクＣに安定的に作用させる観点から、好ましくは０．０５％以上であり、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上、さらに好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは８．０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは５．０％（ｗ／ｖ）以下である。
【0082】
（酵素作用を有しないタンパク質、緩衝液、塩）
酵素作用を有しないタンパク質、緩衝液および塩の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。これらについての具体的な構成として、たとえば、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
酵素作用を有しないタンパク質、緩衝液および塩の種類は、たとえば第２試薬組成物に含まれる酵素の種類によって適宜選択することができる。これらについての具体的な構成として、たとえば、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
【0083】
（カップラー、水素供与体）
カップラーおよび水素供与体についての具体的な構成として、たとえば、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
第２試薬組成物中の水素供与体の濃度は、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
第２試薬組成物中のカップラーの濃度は、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは２ｍＭ以上であり、また、好ましくは８ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭ以下である。
カップラーおよび水素供与体についての具体的な構成として、たとえば、第１試薬組成物について前述したものが挙げられる。
第２試薬組成物中の水素供与体の濃度は、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、好ましくは１ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、より好ましくは１．５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは１０ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは８ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。
第２試薬組成物中のカップラーの濃度は、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、好ましくは１ｍＭ以上であり、より好ましくは２ｍＭ以上であり、また、好ましくは８ｍＭ以下であり、より好ましくは５ｍＭ以下である。
【0084】
（鉄錯体）
鉄錯体としては、たとえば、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、ポルフィリン鉄錯体、ＥＤＴＡ－鉄錯体が挙げられる。
第２試薬組成物中の鉄錯体の濃度は、第２試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、また、たとえば０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。
鉄錯体としては、たとえば、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム、ポルフィリン鉄錯体、ＥＤＴＡ－鉄錯体が挙げられる。
第２試薬組成物中の鉄錯体の濃度は、第２試薬組成物の全組成に対して、好ましくは０．００１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上であり、また、好ましくは０．３ｍｍｏｌ／Ｌ以下であり、また、たとえば０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ以下であってもよい。
【0085】
（カタラーゼ阻害剤）
第１試薬組成物がカタラーゼ活性を有するとき、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、第２試薬組成物は、好ましくはカタラーゼ阻害剤を含む。カタラーゼ阻害剤の具体例として、アジ化ナトリウムが挙げられる。
第２試薬組成物中のアジ化ナトリウムの濃度は、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下である。
第１試薬組成物がカタラーゼ活性を有するとき、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、第２試薬組成物は、好ましくはカタラーゼ阻害剤を含む。カタラーゼ阻害剤の具体例として、アジ化ナトリウムが挙げられる。
第２試薬組成物中のアジ化ナトリウムの濃度は、リポタンパクＣの測定をより安定的におこなう観点から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）以上であり、また、好ましくは０．２％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以下である。
【0086】
次に、キットとしての好ましい構成例をさらに挙げる。
キットにおいては、リポタンパクＣの定量をさらに安定的におこなう観点から、好ましくは、第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、第２試薬組成物が、水素供与体およびカップラーの上記一方を含まず他方を含む。すなわち、カップラーと水素供与体とを、別々の試薬組成物中に分離して存在させることが好ましい。
また、キットにおいて、第１または第２試薬組成物中に、カップラーと水素供与体とが共存していないことも好ましい。
キットにおいては、リポタンパクＣの定量をさらに安定的におこなう観点から、好ましくは、第１試薬組成物が、水素供与体およびカップラーのいずれか一方を含み他方を含まず、第２試薬組成物が、水素供与体およびカップラーの上記一方を含まず他方を含む。すなわち、カップラーと水素供与体とを、別々の試薬組成物中に分離して存在させることが好ましい。
また、キットにおいて、第１または第２試薬組成物中に、カップラーと水素供与体とが共存していないことも好ましい。
【0087】
また、キットにおいて、第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、第２試薬組成物が、以下の条件１～３のうち、第１試薬組成物が満たす１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たすことが好ましい。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
【0088】
リポタンパクＣの定量においては、たとえば水素供与体とカップラーをペルオキシダーゼ活性の存在下でカップリング反応させ、生成した色素により特定波長の吸光度を測定する。このとき、反応促進剤として鉄錯体を使用することができるが、カップラーとペルオキシダーゼ活性、鉄錯体が同一試薬中に存在すると、試薬が徐々に自然発色し、リポタンパクＣの定量に影響をおよぼす場合があった。この点、第１および第２試薬組成物を上述の構成とすることにより、第１または第２試薬組成物中にカップラー、ペルオキシダーゼ活性および鉄錯体が共存しないようにすることができるため、試薬組成物の自然発色を抑制することができる。このため、リポタンパクＣの定量をさらに安定的におこなうことができる。
【0089】
リポタンパクＣをより安定的に定量する観点から、より好ましくは第１試薬組成物が条件１および条件３を満たすとともに、第２試薬組成物が条件２を満たす。
【0090】
（方法）
本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のリポタンパクＣを定量する方法であり、具体的にはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパクＣを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。
かかる方法においては、吸光度の比Ｒ１が前述の条件を満たす第１および第２試薬組成物を用いることにより、測定対象のリポタンパクＣを高い精度で安定的に定量することができる。
本実施形態における方法は、前述の第１および第２試薬組成物を用いて試料中のリポタンパクＣを定量する方法であり、具体的にはｓｄＬＤＬ以外のリポタンパクＣを定量する方法である。本実施形態における定量方法は、以下の第１工程および第２工程を含む。
（第１工程）前述の第１試薬組成物を試料に作用させる工程
（第２工程）第１工程の後、前述の第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程
第１および第２試薬組成物の構成は前述のとおりである。
かかる方法においては、吸光度の比Ｒ１が前述の条件を満たす第１および第２試薬組成物を用いることにより、測定対象のリポタンパクＣを高い精度で安定的に定量することができる。
【0091】
また、リポタンパクＣの定量方法は、たとえば試料（被検体試料）に第１試薬組成物を添加し反応させ、次いで第２試薬組成物を添加し反応させ、吸光度を測定することによりおこなえばよい。
被検体試料は、たとえば血清または血漿等の血液由来試料であり、好ましくは血清である。
被検体試料は、たとえば血清または血漿等の血液由来試料であり、好ましくは血清である。
【0092】
第１および第２工程は、通常、自動分析装置内でおこなわれる。
自動分析装置として、たとえば、ＴＢＡ－１２０ＦＲ、ＴＢＡ－２００ＦＲ（以上、東芝社製）、ＪＣＡ－ＢＭ１２５０、ＪＣＡ－ＢＭ１６５０、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（以上、日本電子社製）、ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、ＨＩＴＡＣＨＩ７１７０（以上、日立社製）、ＡＵ２７００、ＡＵ５８００、ＡＵ６８０（以上、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ｃｏｂａｓ ｃ５０１、ｃｏｂａｓ ｃ７０１（以上、Ｒｏｃｈｅ社製）が挙げられる。
自動分析装置として、たとえば、ＴＢＡ－１２０ＦＲ、ＴＢＡ－２００ＦＲ（以上、東芝社製）、ＪＣＡ－ＢＭ１２５０、ＪＣＡ－ＢＭ１６５０、ＪＣＡ－ＢＭ２２５０（以上、日本電子社製）、ＨＩＴＡＣＨＩ７１８０、ＨＩＴＡＣＨＩ７１７０（以上、日立社製）、ＡＵ２７００、ＡＵ５８００、ＡＵ６８０（以上、ＯＬＹＭＰＵＳ社製）、ｃｏｂａｓ ｃ５０１、ｃｏｂａｓ ｃ７０１（以上、Ｒｏｃｈｅ社製）が挙げられる。
【0093】
試料の量、各試薬組成物の量は、たとえば各試薬組成物中の試薬の濃度等を考慮して適宜決定できるが、自動分析装置に適用可能な範囲で行う。たとえば、被検体試料１～１０μＬ、第１試薬５０～３００μＬ、第２試薬２５～２００μＬを用いればよい。
【0094】
本実施形態において、各工程における、反応温度は２℃～４５℃でおこなうことが好ましく、２５℃～４０℃でおこなうことがより好ましい。
反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。
以下、各工程をさらに具体的に説明する。
反応時間は各工程とも１～１０分間でおこなうことが好ましく、３～７分でおこなうことがさらに好ましい。
以下、各工程をさらに具体的に説明する。
【0095】
（第１工程）
第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質を消去し、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
さらに具体的には、第１工程では、好ましくは測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、コレステロールエステラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性の存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
第１工程では、試料に第１試薬組成物を作用させる。これにより、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質を消去し、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを遊離させて反応系外に導く。
さらに具体的には、第１工程では、好ましくは測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を、コレステロールエステラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性の存在下で試料に作用させる。そして、リポタンパク質からの遊離により生じたコレステロールをたとえばコレステロールオキシダーゼ等のコレステロールと反応する酵素と反応させて反応系外へ導く。第１工程においては、たとえば、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質中のコレステロールを消去し反応系外に導く、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質のコレステロールを凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の公知の技術を用いることができる。
【0096】
第１工程において、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質から生じたコレステロールを消去し反応系外に導く工程は、好ましくは以下のいずれかの方法でおこなうことができる。
（１）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質の中コレステロールから過酸化水素を生成し、カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を水と酸素に分解させる方法
（２）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびにカップラーもしくは水素供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
（３）カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を分解させ、かつ同時にカップラーまたは水素供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
（１）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質の中コレステロールから過酸化水素を生成し、カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を水と酸素に分解させる方法
（２）コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性により生じた過酸化水素、ならびにカップラーもしくは水素供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
（３）カタラーゼ活性の存在下で過酸化水素を分解させ、かつ同時にカップラーまたは水素供与体の存在下で無色キノンを形成させる方法
【0097】
上記（１）または（２）の方法では、コレステロールにコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを作用させて過酸化水素を発生させ、発生した過酸化水素は消去される。
【0098】
上記の方法において、第１試薬組成物は、コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有するとともに、たとえば以下の構成とする。
上記（１）の方法とする場合、第１試薬組成物はカタラーゼ活性をさらに有する。
上記（２）の方法とする場合、第１試薬組成物が少なくともカップラーおよび水素供与体の一方を含むとともに、第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性をさらに有する。
上記（３）の方法とする場合、第１試薬組成物がカタラーゼ活性およびペルオキシダーゼ活性を有するとともに、第１試薬組成物がカップラーもしくは水素供与体を含む。
上記（１）の方法とする場合、第１試薬組成物はカタラーゼ活性をさらに有する。
上記（２）の方法とする場合、第１試薬組成物が少なくともカップラーおよび水素供与体の一方を含むとともに、第１試薬組成物がペルオキシダーゼ活性をさらに有する。
上記（３）の方法とする場合、第１試薬組成物がカタラーゼ活性およびペルオキシダーゼ活性を有するとともに、第１試薬組成物がカップラーもしくは水素供与体を含む。
【0099】
第１工程では、測定対象外のリポタンパク質中のコレステロールを反応系外へ導くことにより、その後の工程においては、反応液中に好ましくはリポタンパク質として測定対象のリポタンパク質が選択的に、より好ましくは測定対象のリポタンパク質のみを残存させることができる。このように測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質を消去し、反応系外へ導き、その後の工程で測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク質のコレステロールを検出できないようにすることを、「測定対象とそれ以外のリポタンパク質を差別化する」ということがある。
また、第１工程では、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク中のコレステロールが完全に消去されていなくてもよいが、その場合は、好ましくは第２工程において、測定対象のリポタンパクＣが選択的に測定されるような界面活性剤を用いるとよい。
また、第１工程では、測定対象のリポタンパク質以外のリポタンパク中のコレステロールが完全に消去されていなくてもよいが、その場合は、好ましくは第２工程において、測定対象のリポタンパクＣが選択的に測定されるような界面活性剤を用いるとよい。
【0100】
（第２工程）
第２工程では、第１工程を経て残存したリポタンパクＣを定量する。第２工程には、リポタンパク質の種類に応じて、従来から用いられているリポタンパクＣの定量方法を用いることができる。
たとえば、凝集剤を添加して形成された特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。これらのうち、酵素を用い分解生成物を定量する方法が好ましい。
酵素を用い分解生成物を定量する方法においては、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される１または２以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてリポタンパクＣを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。
また、第２工程において、界面活性剤を含む第２試薬組成物を用いることも好ましい。
第２工程では、第１工程を経て残存したリポタンパクＣを定量する。第２工程には、リポタンパク質の種類に応じて、従来から用いられているリポタンパクＣの定量方法を用いることができる。
たとえば、凝集剤を添加して形成された特異的凝集物の含有量を比濁測定によって定量する方法、特異的な抗体による抗原抗体反応を用いる方法、酵素を用い分解生成物を定量する方法等がある。これらのうち、酵素を用い分解生成物を定量する方法が好ましい。
酵素を用い分解生成物を定量する方法においては、第１工程後の反応液に、たとえば、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレステロールデヒドロゲナーゼおよびペルオキシダーゼからなる群から選択される１または２以上のコレステロール測定用酵素を含む第２試薬組成物を加えてリポタンパクＣを遊離、分解し、その反応生成物を定量する。
また、第２工程において、界面活性剤を含む第２試薬組成物を用いることも好ましい。
【0101】
リポタンパクＣの定量は、たとえば５８０～７２０ｎｍの波長域、好ましくは６００～７００ｎｍの波長域の吸光度測定によりおこなう。
【0102】
以上、本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物と、
測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、キット。
２． 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、１．に記載のキット。
３． 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、１．または２．に記載のキット。
４． 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、１．乃至３．いずれか１つに記載のキット。
５． 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、１．乃至４．いずれか１つに記載のキット。
６． 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、１．乃至５．いずれか１つに記載のキット。
７． 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、１．乃至６．いずれか１つに記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
８． 測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、１．乃至７．いずれか１つに記載のキット。
９． 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、方法。
１０． 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、９．に記載の方法。
１１． 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性をさらに有する、９．または１０．に記載の方法。
１２． 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、９．乃至１１．いずれか１つに記載の方法。
１３． 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、９．乃至１２．いずれか１つに記載の方法。
１４． 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、９．乃至１３．いずれか１つに記載の方法。
１５． 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、９．乃至１４．いずれか１つに記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
１６． 測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、９．乃至１５．いずれか１つに記載の方法。
以下、参考形態の例を付記する。
１． 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）の分別に用いられるキットであって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物と、
測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、キット。
２． 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、１．に記載のキット。
３． 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、１．または２．に記載のキット。
４． 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、１．乃至３．いずれか１つに記載のキット。
５． 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、１．乃至４．いずれか１つに記載のキット。
６． 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、１．乃至５．いずれか１つに記載のキット。
７． 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、１．乃至６．いずれか１つに記載のキット。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
８． 測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、１．乃至７．いずれか１つに記載のキット。
９． 試料中のｓｍａｌｌ ｄｅｎｓｅ ＬＤＬ以外のリポタンパク質中のコレステロール（リポタンパクＣ）を定量する方法であって、
コレステロールエステラーゼ活性およびコレステロールオキシダーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する第１試薬組成物を前記試料に作用させる工程と、
第１試薬組成物を前記試料に作用させる前記工程の後、測定対象の前記リポタンパクＣを定量するための第２試薬組成物を作用させることにより、残存するリポタンパク質中のコレステロールを定量する工程と、
を含み、
前記第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上３．５０以下であり、
前記第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の吸収スペクトルにおいて、波長４００ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４００とし、４５０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ４５０としたとき、ＡＢＳ４００／ＡＢＳ４５０で表される比Ｒ１が、０．９０以上９．００以下である、方法。
１０． 第１試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上３．００以下である、９．に記載の方法。
１１． 前記第１試薬組成物が、ペルオキシダーゼ活性およびカタラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性をさらに有する、９．または１０．に記載の方法。
１２． 前記第１試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質以外のリポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、９．乃至１１．いずれか１つに記載の方法。
１３． 第２試薬組成物を３７℃にて２週間保存した後の前記吸収スペクトルにおいて、波長３６０ｎｍにおける吸光度をＡＢＳ３６０としたとき、ＡＢＳ３６０／ＡＢＳ４００で表される比Ｒ２が、０．９０以上２．５０以下である、９．乃至１２．いずれか１つに記載の方法。
１４． 前記第２試薬組成物が、測定対象の前記リポタンパク質に作用する界面活性剤を含む、９．乃至１３．いずれか１つに記載の方法。
１５． 前記第１試薬組成物が、以下の条件１～３の１つまたは２つの条件を満たすとともに、
前記第２試薬組成物が、前記条件１～３のうち、前記１つまたは２つの条件は満たさず、他のすべての条件を満たす、９．乃至１４．いずれか１つに記載の方法。
条件１：カップラーを含む
条件２：鉄錯体を含む
条件３：ペルオキシダーゼ活性を有する
１６． 測定対象の前記リポタンパクＣが、ＬＤＬコレステロール、ＨＤＬコレステロール、ＨＤＬ３コレステロール、レムナントコレステロールまたはapoE containing HDLコレステロールである、９．乃至１５．いずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【0103】
以下の各例において、吸収スペクトルの測定には、ＨＩＴＡＣＨＩ社製のＵ－３９００を用いた。
【0104】
まず、試薬組成物に用いた成分を説明する。
以下の例において、測定対象のリポタンパクＣの種類に応じて、各試薬組成物の基本配合を以下とした。
以下の例において、測定対象のリポタンパクＣの種類に応じて、各試薬組成物の基本配合を以下とした。
【0105】
（ＨＤＬ－Ｃ）
第１試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ８００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ １４００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー ０．１％
第２試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル １．０％
第１試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ８００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ １４００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー ０．１％
第２試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル １．０％
【0106】
（ＬＤＬ－Ｃ）
第１試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ５００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ０．２％
ＢＳＡ １．０％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
ポリオキシエチレンアルキルエーテル １．０％（ｗ／ｖ）
第１試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ６００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ５００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ０．２％
ＢＳＡ １．０％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ ５０ｍＭ
ポリオキシエチレンアルキルエーテル １．０％（ｗ／ｖ）
【0107】
（ＨＤＬ３－Ｃ）
第１試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ２０００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ３００Ｕ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ ５００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー ０．０５％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ １．０％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ２．０％（ｗ／ｖ）
第１試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ２０００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ３００Ｕ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ ５００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー ０．０５％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ １．０％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ２．０％（ｗ／ｖ）
【0108】
（レムナント－Ｃ）
第１試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ６．８ ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（高分子） ５０００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ２５００Ｕ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ ２５００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ０．１％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ １．０％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ６．８ ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（低分子） ４０００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレンアルキルエーテル ０．１％（ｗ／ｖ）
第１試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ６．８ ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（高分子） ５０００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ ２５００Ｕ／Ｌ
スフィンゴミエリナーゼ ２５００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ０．１％（ｗ／ｖ）
ＢＳＡ １．０％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＰＩＰＥＳ緩衝液，ｐＨ６．８ ５０ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（低分子） ４０００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレンアルキルエーテル ０．１％（ｗ／ｖ）
【0109】
（apoE containing HDL－Ｃ）
第１試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ８００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ １６００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ０．０６７％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル １．０％（ｗ／ｖ）
第１試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
コレステロールエステラーゼ ８００Ｕ／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ １６００Ｕ／Ｌ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル ０．０６７％（ｗ／ｖ）
第２試薬組成物
ＢＥＳ緩衝液，ｐＨ７．０ １００ｍＭ
ポリオキシエチレン多環フェニルエーテル １．０％（ｗ／ｖ）
【0110】
（調製例１ａ～１１ａ）
各例について、上述に記載の成分に加えて、以下の成分を含む第１試薬組成物を調製した。すなわち、各例について、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃの計５種の第１試薬組成物を調整した。
各例について、上述に記載の成分に加えて、以下の成分を含む第１試薬組成物を調製した。すなわち、各例について、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃの計５種の第１試薬組成物を調整した。
【0111】
（調製例１ａ）
カタラーゼ（Ｂ－Ｃａｔ） １２００Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ） １．３ｍＭ
カタラーゼ（Ｂ－Ｃａｔ） １２００Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ） １．３ｍＭ
【0112】
（調製例２ａ）
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １．７Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン １．３ｍＭ
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ） １．７Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン １．３ｍＭ
【0113】
（調製例３ａ）
４－アミノアンチピリン １．３ｍＭ
フェロシアン化カリウム（ＦｅＫ） ０．０３６ｍＭ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン １．３ｍＭ
フェロシアン化カリウム（ＦｅＫ） ０．０３６ｍＭ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
【0114】
（調製例４ａ）
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ｍＭ
【0115】
（調製例５ａ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
【0116】
（調製例６ａ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
【0117】
（調製例７ａ）
４－アミノアンチピリン １．３ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
４－アミノアンチピリン １．３ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
【0118】
（調製例８ａ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
【0119】
（調製例９ａ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
【0120】
（調製例１０ａ）
カップラー（４アミノアンチピリン） １．３ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
カップラー（４アミノアンチピリン） １．３ｍＭ
ペルオキシダーゼ １．７Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．０３６ｍＭ
【0121】
（調製例１１ａ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ０．７ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ２．０ ｍＭ
カタラーゼ １２００Ｕ／ｍＬ
【0122】
得られた第１試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について波長３２０ｎｍ～４８０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。表１に各例で得られた試薬組成物の保存後の吸光度および吸光度比を示す。
また、図１～図１１における各分図（ａ）は、それぞれ、実験例１ａ～１１ａで得られた第１試薬組成物の３７℃にて２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
また、図１～図１１における各分図（ａ）は、それぞれ、実験例１ａ～１１ａで得られた第１試薬組成物の３７℃にて２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
【0123】
【表1】
【0124】
（調製例１ｂ～１１ｂ）
各例について、上述に記載の成分に加えて、以下の成分を含む第２試薬組成物を調製した。すなわち、各例について、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃの計５種の第２試薬組成物を調整した。
各例について、上述に記載の成分に加えて、以下の成分を含む第２試薬組成物を調製した。すなわち、各例について、ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－ＣまたはapoE containing HDL－Ｃの計５種の第２試薬組成物を調整した。
【0125】
（調製例１ｂ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．１ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
アジ化ナトリウム（ＮａＮ3） ０．０５％（ｗ／ｖ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．１ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
アジ化ナトリウム（ＮａＮ3） ０．０５％（ｗ／ｖ）
【0126】
（調製例２ｂ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．２ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．２ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
【0127】
（調製例３ｂ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．３ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．３ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
【0128】
（調製例４ｂ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
【0129】
（調製例５ｂ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
【0130】
（調製例６ｂ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
４－アミノアンチピリン ４．０ｍｍｏｌ／Ｌ
【0131】
（調製例７ｂ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．３ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．３ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
【0132】
（調製例８ｂ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
【0133】
（調製例９ｂ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
４－アミノアンチピリン ４．０ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
【0134】
（調製例１０ｂ）
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．３ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
水素供与体
（ＨＤＡＯＳ：ＨＤＬ－Ｃ、apoE containing HDL－Ｃ） ２．３ｍＭ
（ＴＯＯＳ：ＬＤＬ－Ｃ、ＨＤＬ３－Ｃ、レムナント－Ｃ） ６．０ｍＭ
【0135】
（調製例１１ｂ）
カップラー（４－アミノアンチピリン） ４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
カップラー（４－アミノアンチピリン） ４．０ｍＭ
ペルオキシダーゼ ５．０Ｕ／ｍＬ
フェロシアン化カリウム ０．１０９ｍＭ
アジ化ナトリウム ０．０５％（ｗ／ｖ）
【0136】
得られた第２試薬組成物を３７℃にて１週間または２週間加速保存し、保存中の自然発色について波長３２０ｎｍ～４８０ｎｍの吸収スペクトルを測定した。表２に各例で得られた試薬組成物の保存後の吸光度および吸光度比を示す。
また、図１～図１１における各分図（ｂ）は、それぞれ、実験例１ｂ～１１ｂで得られた第２試薬組成物の３７℃にて２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
また、図１～図１１における各分図（ｂ）は、それぞれ、実験例１ｂ～１１ｂで得られた第２試薬組成物の３７℃にて２週間加速保存した後の吸収スペクトルを示す図である。
【0137】
【表2】
【0138】
（実施例３－１～３－７、比較例３－１～３－４）
ＬＤＬ－Ｃを代表項目として、各例において第１および第２の試薬組成物を３７℃、２週間の条件で保存し、加速試験をおこなった。保存後の第１および第２試薬組成物を表３に示した組み合わせで用い、リポタンパクＣの測定精度を評価した。評価結果を表３にあわせて示す。
ＬＤＬ－Ｃを代表項目として、各例において第１および第２の試薬組成物を３７℃、２週間の条件で保存し、加速試験をおこなった。保存後の第１および第２試薬組成物を表３に示した組み合わせで用い、リポタンパクＣの測定精度を評価した。評価結果を表３にあわせて示す。
【0139】
各測定系において、ＬＤＬ－Ｃ濃度が既知である標準物質およびＬＤＬ－Ｃが存在しないブランク物質である生理食塩水を用いて、検量線を作成した。その後低値検体の測定を行い、最小検出限界を測定した。
【0140】
具体的には、表３に記載の各例について、以下の手順でＬＤＬ－Ｃ濃度の評価をおこなった。
（ＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価方法）
１．上記標準物質および生理食塩水の試料２．０μＬに対し、各例の第１試薬組成物を１５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
２．各例の第２試薬組成物を５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
３．第２試薬組成物が入る直前、および第２試薬組成物添加５分後に波長６００ｎｍ（主波長）および７００ｎｍ（副波長）における吸光度を測定し、（第２試薬組成物添加５分後の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）－（第２試薬組成物が入る直前の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）よりキャリブレーション吸光度を算出し検量線を作成した。
４．次にＬＤＬ－Ｃ値が既知の低濃度（４．０ｍｇ／ｄＬ）試料を生理食塩水で希釈して１０段階希釈系列試料を作成し、生理食塩水および各希釈系列を上記各試薬で各５重測定した。
５．生理食塩水の平均値＋２．６ＳＤ＜希釈試料の平均値－２．６ＳＤを満たす最低濃度を検出限界とし、検出限界が２．０ｍｇ／ｄＬ以下である場合には「○」、２．０ｍｇ／ｄＬより高濃度である場合には「×」として各例の測定精度を評価した。
（ＬＤＬ－Ｃ濃度の測定および評価方法）
１．上記標準物質および生理食塩水の試料２．０μＬに対し、各例の第１試薬組成物を１５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
２．各例の第２試薬組成物を５０μＬ加え、３７℃、５分作用させた。
３．第２試薬組成物が入る直前、および第２試薬組成物添加５分後に波長６００ｎｍ（主波長）および７００ｎｍ（副波長）における吸光度を測定し、（第２試薬組成物添加５分後の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）－（第２試薬組成物が入る直前の６００ｎｍ吸光度－７００ｎｍ吸光度）よりキャリブレーション吸光度を算出し検量線を作成した。
４．次にＬＤＬ－Ｃ値が既知の低濃度（４．０ｍｇ／ｄＬ）試料を生理食塩水で希釈して１０段階希釈系列試料を作成し、生理食塩水および各希釈系列を上記各試薬で各５重測定した。
５．生理食塩水の平均値＋２．６ＳＤ＜希釈試料の平均値－２．６ＳＤを満たす最低濃度を検出限界とし、検出限界が２．０ｍｇ／ｄＬ以下である場合には「○」、２．０ｍｇ／ｄＬより高濃度である場合には「×」として各例の測定精度を評価した。
【0141】
【表3】
【0142】
第１および第２試薬組成物のＲ１、Ｒ２がいずれも特定の範囲にある実施例においては、ＬＤＬ－Ｃを正確に検出することができた。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】