(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-15
(45)【発行日】2024-03-26
(54)【発明の名称】虫刺され過敏症の治療
(51)【国際特許分類】
A61K 39/00 20060101AFI20240318BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240318BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20240318BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240318BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20240318BHJP
C07K 14/52 20060101ALN20240318BHJP
C12N 15/24 20060101ALN20240318BHJP
C12N 15/86 20060101ALN20240318BHJP
【ＦＩ】
A61K39/00 H ZNA
A61K35/76
A61P17/04
A61P17/00 171
C07K14/54
C07K14/52
C12N15/24
C12N15/86 Z
【請求項の数】
8
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2021138636
(22)【出願日】2021-08-27
(62)【分割の表示】P 2018512136の分割
【原出願日】2016-09-07
(65)【公開番号】P2021193098
(43)【公開日】2021-12-23
【審査請求日】2021-09-24
(31)【優先権主張番号】15184195.4
(32)【優先日】2015-09-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】16166342.2
(32)【優先日】2016-04-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】16175211.8
(32)【優先日】2016-06-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】515098691
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート チューリッヒ
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】フェッテルショッス， アントーニア
(72)【発明者】
【氏名】バッハマン， マルティン
【審査官】大島 彰公
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２００３／０４０１６４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】YU ZOU，COMBINED VACCINATION AGAINST IL-5 AND EOTAXIN BLOCKS EOSINOPHILIA IN MICE，VACCINE，2010年02月26日，VOL:28, NR:18,，PAGE(S):3192 - 3200，http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2010.02.048
【文献】Chun-Kwok WONG et al.，“Activation of Eosinophils Interacting with Dermal Fibroblasts by Pruritogenic Cytokine IL-31 and Alarmin IL-33: Implications in Atopic Dermatitis”，PLoS ONE，2012年01月17日，Vol. 7, No. 1，p.e29815，DOI: doi: 10.1371/journal.pone.0029815
【文献】Andrea J. GONZALES et al.，“Interleukin‐31: its role in canine pruritus and naturally occurring canine atopic dermatitis”，Veterinary Dermatology，2013年01月19日，Vol. 24, No. 1，p.48，DOI: 10.1111/j.1365-3164.2012.01098.x
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ０７Ｋ、Ｃ１２Ｎ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
馬科の哺乳動物の虫刺され過敏症の予防若しくは治療のための組成物であって、
（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子；ここで、前記コア粒子が、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰが、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰが、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドが、
（Ａ）ＣＭＶポリペプチド：ここで、前記ＣＭＶポリペプチドが、
（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか；若しくは
（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含み、変異されるアミノ酸配列が、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及びＣＭＶの前記コートタンパク質が、少なくとも９０％の配列同一性を示す；及び
（Ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープ：ここで、前記Ｔヘルパー細胞エピトープが、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域が、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する
を含み、並びに
（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原
を含み、前記少なくとも１つの抗原が、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含む馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、（ａ）及び（ｂ）が、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合している、組成物。
【請求項2】
前記ｅＩＬ－３１抗原が、配列番号１２、配列番号１４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記コア粒子が、組換えＶＬＰである、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項4】
前記ＣＭＶポリペプチドが、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が、配列番号１５若しくは配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列が配列番号３４を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項6】
前記改変ＣＭＶポリペプチドが、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列からなる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記馬科の哺乳動物が馬である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
（ａ）請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物；及び（ｂ）薬学的に許容される担体
を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症の予防若しくは治療のための組成物、免疫原性組成物又はワクチン組成物及び医薬組成物に関する。さらに、本発明は、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症を予防又は治療する方法を提供する。
【背景技術】
【0002】
「皮膚そう痒」又は「夏湿疹」としても知られている虫刺され過敏症（ＩＢＨ）は、馬科の哺乳動物、特に馬の最も一般的なアレルギー性皮膚疾患であり、世界の様々な地域で見られるヌカカ属の昆虫の咬傷によって引き起こされる慢性再発季節性アレルギー性皮膚炎として現れる。様々な研究から、ＩＢＨがヌカカの唾液腺タンパク質に対するＩｇＥ媒介反応に関係することが示唆されている。また、最近の研究から、ＩＢＨが、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）型免疫応答と制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）免疫応答の不均衡によって特徴付けられることが示唆されている（Ｓｃｈａｆｆａｒｔｚｉｋ Ａ．ら，Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１４７：１１３－１２６）。ここ十年の間に、いくつかの研究から、ヌカカの唾液腺タンパク質がＩＢＨ罹患馬のＩｇＥによって認識されることが実証された（Ｈｅｌｌｂｅｒｇ，Ｗ．ら，２００６，Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ １１３：９９－１１２）。最近までに、７００超のヌカカ種が同定されており、その中の１３０種は、吸血種である（Ｖａｎ Ｇｒｅｖｅｎｈｏｆ，Ｅ．Ｍ．ら，２００７，Ｅｑｕｉｎｅ Ｖｅｔ Ｊ ３６：６９－７３）。
【0003】
世界中で、馬の約５～１０％が、ＩＢＨによって影響をうける（Ｂｊｏｒｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｓ．ら，２００６，Ａｃｔａ Ｖｅｔ．Ｓｃａｎｄ．４８：３）。英国の有病率は約３％であり、ドイツでは約３８％であり、オーストラリアのクイーンズランドでは約６０％である（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．ら，１９９６，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．３３：４５８－４６６；Ｌｉｔｔｌｅｗｏｏｄ，Ｊ．Ｄ．ら，１９９８，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．１４２，６６－６７；及びそれらの中で引用される参考文献）。主に、全ての品種が影響を受け得るが、疾患は、クォーター馬、サラブレッド、アラビア馬、ウォームブラッド、ドラフト馬、フリージアン馬、シャイヤー馬、異なるポニー品種及びアイスランド馬について説明されている（Ｖａｎ Ｇｒｅｖｅｎｈｏｆ，Ｅ．Ｍ．ら，２００７，Ｅｑｕｉｎｅ Ｖｅｔ Ｊ ３６：６９－７３及びそれらの中で引用される参考文献）。
【0004】
ＩＢＨの臨床徴候は、吸血昆虫の咬傷に対する過敏性反応によって引き起こされる強烈な痒みから派生する。この疾患は、最初に多くの丘疹、タフテッドヘア（ｔｕｆｔｅｄ ｈａｉｒ）、知覚過敏、及び皮膚感作性、その後のひっかき及び擦れによって特徴付けられる。この自己外傷は、二次感染の永続化の一因となる局所脱毛及び掻破痕につながる。疾患が進行し、慢性になった場合、線維症、表皮組織の肥大、並びに顕著な角化症及び苔癬化、目に見える皮膚の肥厚、鱗屑、横方向リッジ及び折り畳みの形成につながり得る（Ｓｃｈａｆｆａｒｔｚｉｋ Ａ．ら，Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１４７：１１３－１２６）。また、罹患動物の皮膚におけるヌカカ抗原の存在は、炎症細胞の浸潤を誘導し、初期の好酸球の蓄積に続き、Ｔ細胞の動員が伴う。急性病変におけるインターロイキンＩＬ－４、ＩＬ－５及びＩＬ－１３のｍＲＮＡ発現の増加及び確立された病変におけるケモカインＣＣＬ１１（エオタキシン）及びＣＣＬ２のｍＲＮＡ発現の増加が報告されているが、ＩＢＨ病変におけるＴ細胞のサイトカインプロファイルは、大規模に研究されていない（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｆ．Ｍ．ら，２００８，Ｖｅｔ．Ｊ．１７７：３３４－３４４；Ｂｅｎａｒａｆａ，Ｃ．ら，２００２，Ｖｅｔ Ｒｅｃ １５１：６９１－６９３）。
【0005】
昆虫の好ましい摂食部位であるため、病変は、大部分が背側正中線に沿ってたてがみ及び尾の基部に位置し、かつ／又は腹側正中線に沿って、時折耳に位置する。ＩＢＨ罹患馬は、季節性の症状を示し、時間が経過するにつれて兆候の重症度が徐々に進行する。臨床徴候は、ヌカカが活動する春から秋の暖かい月に現れ、曝露のない冬の間に消失するが、重度の慢性症例では、臨床徴候はまた、冬の間応答を継続し得る（Ｓｃｈａｆｆａｒｔｚｉｋ Ａ．ら，Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１４７：１１３－１２６）。
【0006】
過去に、ＩＢＨの治療のための異なるアプローチが説明されたが、現在、唯一の安全かつ効果的な方法は、ヌカカアレルゲンの回避である。毛布による機械的保護によりアレルゲン曝露の回避又は低減が達成されるように試みられ、これがＩＢＨの最も一般的な処置である（Ｏｌｓｅｎ，Ｌ．ら，２０１０，Ｖｅｔ．Ｊ．１８７：３４７－３５１）。毛布の他に、馬は、昼下がりから午前中に防虫環境の厩舎に入れられるか、又はヌカカの発生が高度に低減される他の場所に移される。
【0007】
防虫剤も、吸血昆虫を馬から遠ざけるために適用される。また、グルココルチコステロイドが、さらにＩＢＨの対症療法のために使用される（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ａ．ら，２００９，Ｖｅｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０：６１５－６２２）。深刻な罹患馬、特に、顕著な痒みを有する馬は、全身ステロイドによる抗炎症治療が必要な場合がある。長期治療におけるグルココルチコステロイドの欠点は、毒性副作用、例えば、免疫抑制、筋萎縮症、骨粗しょう症及び蹄葉炎である（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｆ．Ｍ．ら，２００８，Ｖｅｔ．Ｊ．１７７：３３４－３４４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
アレルゲン特異的免疫療法（ＳＩＴ）、通常は、アレルゲン抽出物の皮下投与がヒト及び小動物の皮膚に効果的に使用され、長期的な利益を与える。馬におけるＳＩＴの実験的な適用を記述した報告はほとんどない。しかし、有効性の論争の結果は、ヌカカの全身抽出物（ＷＢＥ）によるＳＩＴについて報告されている。免疫療法試験において、ＩＢＨ罹患馬に、ＷＢＥを皮下注射した。最初の年の間は、毎週の注射により、ＩＢＨ罹患馬の９０％に臨床徴候を低下させた（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６）。これらの馬の３７．５％には、免疫療法の２年後に臨床徴候は全くなかったが、６２．５％は、臨床徴候が中程度から著しく低減した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９９６）。逆に、無作為化二重盲検プラセボ対照臨床試験では、６ヶ月の期間にわたるＳＩＴ後に、ＩＢＨ罹患馬の健康状態にいかなる改善も示されなかった（Ｂａｒｂｅｔら、１９９０）。結論として、ヒトのアレルギーとは対照的に、馬のＳＩＴはまだ確立されておらず、その他の長期根治治療は存在しない。
【0009】
その結果、現在、ＩＢＨの満足のいく治療は存在しない（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｆ．Ｍ．ら，２００８，Ｖｅｔ．Ｊ．１７７：３３４－３４４；Ｓｃｈａｆｆａｒｔｚｉｋ Ａ．ら，Ｖｅｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ，２０１２，１４７：１１３－１２６）。
【課題を解決するための手段】
【0010】
発明者らは、驚くべきことに、本発明の組成物が、馬科の哺乳動物、特に、馬の虫刺され過敏症（ＩＢＨ）の予防及び治療に有効であることを今回見出した。したがって、発明者らは、馬への本発明の組成物の投与が、ＩＢＨの疾患パラメータ及び症状の効率的な低減をもたらしたことを見出した。特に、発明者らは、馬への本発明の組成物の投与が、自己抗体の誘導及び馬の血液及び皮膚における好酸球レベルの低下につながるだけでなく、さらに好酸球レベルの前記低下が、ＩＢＨ疾患症状の低減と相関することを示した。また、発明者らは、馬への本発明の組成物の投与が、ＩＢＨ罹患馬の皮膚病変の重症度グレードの効率的な低下をもたらしたことを示した。
【発明の効果】
【0011】
したがって、第１の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原を含む組成物を提供し、前記少なくとも１つの抗原が、（ｉ）配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）；又は（ｉｉ）配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）；（ｉｉｉ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合している。
【0012】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0013】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であり、前記ｅエオタキシン抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0014】
別の好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１２、配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0015】
別の好ましい実施形態において、前記コア粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記組換えコートタンパク質は、配列番号３１を含むか、又は好ましくはそれからなる。
【0016】
さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくはそれらからなり、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及びＣＭＶの前記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する。好ましいＴｈ細胞エピトープはＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むか、好ましくはそれからなるか、又は前記Ｔｈ細胞エピトープは破傷風毒素に由来し、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくはそれからなる。したがって、非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０又は配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。
【0017】
さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明を含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供し、必要に応じて、前記免疫原性組成物又はワクチン組成物は、さらにアジュバントを含む。
【0018】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）本発明の組成物又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物；及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0019】
さらなる態様において、本発明は免疫の方法であって、馬科の哺乳動物、好ましくは馬に本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0020】
さらなる態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【0021】
さらなる態様において、本発明は、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症の予防又は治療の方法における使用のための、本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を提供し、有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物は、前記馬科の哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましくは、前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物の前記投与は、前記投与前の前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状と比較して、少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状を低減し、好ましくは、前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状は、皮膚病変のレベル又は重症度グレードであり、さらに好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、典型的かつ好ましくは、実施例１３に記載のように、症状病変スコアリング試験によって決定される。
【0022】
さらなる態様において、本発明の方法は、虫刺され過敏症の予防又は治療の方法であって、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬に有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0023】
別の態様において、本発明は、虫刺され過敏症の予防又は治療のための薬剤の製造のための前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物を提供し、典型的かつ好ましくは、有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物は、馬科の哺乳動物、好ましくは馬に投与される。
【0024】
さらなる態様において、本発明は、有効量の第１の組成物及び有効量の第２の組成物を含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供し、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質であり；前記第２の組成物は、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；並びに（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原は、馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であり、前記ｅエオタキシン抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合しており、（ｃ）及び（ｄ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合しており；必要に応じて、前記免疫原性組成物又はワクチン組成物は、さらにアジュバントを含む。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】ＮｉＮＴＡによるｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。封入体の調製及び精製の様々な段階からの試料を、４～１２％ビス－トリスゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にアプライし、還元条件下で泳動した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、可溶化液（試料Ａ）、レーン２、可溶性画分（試料Ｂ）、レーン３、可溶化封入体（試料Ｃ）、レーン４、フロースルー（未結合材料、試料Ｄ）、レーン５、プールしたＮｉ－ＮＴＡカラムからのｅＩＬ－５モノマー（ｅＩＬ－５、ｍ）溶出液（試料Ｅ）。
【図2】リフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－ＨｉｓのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。上記のように、タンパク質をリフォールディングし、濃縮した。アリコートを、４～１２％のビス－トリスゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離し、未変性条件（＋ＳＤＳ、ＤＴＴなし、加熱なし）下で泳動した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した：ｅＩＬ－５モノマー（ｅＩＬ－５、ｍ）、ｅＩＬ－５ダイマー（ｅＩＬ－５、ｄ）、レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、プールしたＮｉ－ＮＴＡカラムからの変性済み溶出液、レーン２、リフォールディングし、ホモダイマーに富むｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ。
【図3A】リフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの正しい構造。リフォールディングし、ホモダイマーに富むｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの、ＰＢＳ緩衝液（点線）と比較した円二色性（ＣＤ）分光法。遠ＵＶ（紫外線）ＣＤスペクトルにより測定したα－ヘリックス及びβ－シートを反映するＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの二次構造。
【図3B】リフォールディングした組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの正しい構造。ホモダイマーに富むｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、市販の抗ｅＩＬ－５抗体によって検出することができる。組換え発現させ、リフォールディングした、ホモダイマーに富むｅＩＬ－５と抗Ｈｉｓ抗体コーティングＥＬＩＳＡプレートをインキュベートし、市販の抗馬科ＩＬ－５抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ）により検出した。
【図4】リフォールディングした組換えｅエオタキシン－Ｃ－ＨｉｓのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。封入体の調製及び精製の様々な段階からの試料を、４～１２％のビス－トリスゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にアプライし、還元条件下で泳動した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、可溶化液（試料Ａ）、レーン２、可溶性画分（試料Ｂ）、レーン３、フロースルー（未結合材料、試料Ｄ）、レーン４、プールしたＮｉ－ＮＴＡカラムからの溶出液（試料Ｅ）。
【図5】リフォールディングした組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓの正しい構造。ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓは、市販の抗ｅエオタキシン抗体によって検出することができる。組換え発現させ、リフォールディングしたｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓと抗Ｈｉｓ抗体コーティングＥＬＩＳＡプレートをインキュベートし、馬科のエオタキシンを認識する市販の抗エオタキシン抗体によって検出した。
【図6】リフォールディングした組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－ＨｉｓのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。封入体の調製及び精製の様々な段階からの試料を、４～１２％のビス－トリスゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にアプライし、還元条件下で泳動した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、可溶化液（試料Ａ）、レーン２、可溶性画分（試料Ｂ）、レーン３、可溶化封入体（試料Ｃ）、レーン４、Ｎｉ－ＮＴＡカラムからのｅＩＬ－３１モノマー（ｅＩＬ－３１、ｍ）溶出液（試料Ｅ）。
【図7】リフォールディングした組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの正しい構造。上記のように、タンパク質をリフォールディングし、濃縮した。アリコートを、４～１２％のビス－トリスゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分離し、未変性条件（＋ＳＤＳ、ＤＴＴなし、加熱なし）下で泳動した。タンパク質をクーマシーブルーで染色した。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、プールしたＮｉ－ＮＴＡカラムからの溶出液、レーン２、リフォールディングしたｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ。
【図8】リフォールディングした組換え馬科ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの生物学的活性。注射部位のかゆみの数。バー１、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ対照、バー２、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ。
【図9】ｐＥＴ－ＣＭＶｗｔプラスミドマップ。全ての関連遺伝子及び制限酵素部位の相対的位置が示されている。
【図10A】精製したＣＭＶｗｔ ＶＬＰの動的光散乱。粒子のサイズを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、イギリス）を用いて検出した。
【図10B】精製したＣＭＶｗｔ ＶＬＰの電子顕微鏡分析。ＶＬＰの形態学的分析のために、ＪＥＭ－１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．、東京、日本）を使用した。
【図11】精製ＣＭＶ由来のＶＬＰの質量分析。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）－ＴＯＦ ＭＳ分析を、Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ、ドイツ）で行った。タンパク質の分子量（ＭＭ）較正標準ＩＩ（２２．３－６６．５ｋＤａ；Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）を、質量決定のために使用した。
【図11A】ＣＭＶ野生型（「ＷＴ」）；理論値ＭＭ＝２４０６９；実測値ＭＭ＝２４０５８。
【図11B】ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ；理論値ＭＭ＝２４１６１（最初のＭｅｔを含まない）；実測値ＭＭ＝２４１６０。
【図11C】ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０；理論値ＭＭ＝２４４８３（最初のＭｅｔを含まない）；実測値ＭＭ＝２４４７７。
【図12A】精製したＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの動的光散乱。粒子のサイズをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、イギリス）を用いて検出した。
【図12B】精製したＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの電子顕微鏡分析。ＶＬＰの形態学的分析のために、ＪＥＭ－１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．、東京、日本）を使用した。
【図13A】精製したＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの動的光散乱。粒子のサイズをＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、イギリス）を用いて検出した。
【図13B】精製したＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの電子顕微鏡分析。ＶＬＰの形態学的分析のために、ＪＥＭ－１２３０電子顕微鏡（Ｊｅｏｌ Ｌｔｄ．、東京、日本）を使用した。
【図14A】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応の分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる。タンパク質をクーマシーブルーで染色した；ｅＩＬ－５モノマー（ｅＩＬ－５、ｍ）、ｅＩＬ－５ダイマー（ｅＩＬ－５、ｄ）、Ｑβモノマー（Ｑβ、ｍ）のカップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＱβ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応。
【図14B】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応の分析。ウエスタンブロットによる。α－Ｈｉｓ抗体で染色した。：ｅＩＬ－５モノマー（ｅＩＬ－５、ｍ）、ｅＩＬ－５ダイマー（ｅＩＬ－５、ｄ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＱβ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応。
【図15A】ＶＬＰ、ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ及びＣＭＶｔｔ８３０へのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング反応の分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる。タンパク質をクーマシーブルーで染色した：ｅＩＬ－５モノマー（ｅＩＬ－５、ｍ）、ｅＩＬ－５ダイマー（ｅＩＬ－５、ｄ）、ＶＬＰ（ＶＬＰ、ｍ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒカップリング反応、レーン４、化学架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＣＭＶｔｔ８３０－ＶＬＰ、レーン５、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン６、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０カップリング反応。
【図15B】ＶＬＰ ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ及びＣＭＶｔｔ８３０へのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング反応の分析。ウエスタンブロットによる。α－Ｈｉｓ抗体で染色した：ｅＩＬ－５モノマー（ｅＩＬ－５、ｍ）、ｅＩＬ－５ダイマー（ｅＩＬ－５、ｄ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒカップリング反応、レーン４、化学架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＣＭＶｔｔ８３０－ＶＬＰ、レーン５、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン６、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０カップリング反応。
【図16A】マウスにおける抗体価のＥＬＩＳＡ。マウス由来の血清。免疫前血清（点線）及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでワクチン接種したマウスからの２１日目の血清を採取し、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓに対する抗体についてＥＬＩＳＡによって分析した。
【図16B】馬における抗体価のＥＬＩＳＡ。馬の血清。５頭の馬の免疫前血清及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβで免疫した５６日目の血清を採取し、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓに対する抗体についてＥＬＩＳＡにより分析した。０、２１、及び４２日目に馬を免疫した。データは、免疫前の値を差し引いた５６日目の血清を示す。
【図16C】馬における抗体価のＥＬＩＳＡ。馬の血清。単一馬の免疫前及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の１回目、２回目、及び３回目のワクチン接種後の血清を採取し、血清をｅＩＬ－５に対する抗体について分析した。０、２１及び４２日目に馬を免疫した。データは、免疫前の値を差し引いた１４、３５、及び５６日目の血清を示す。
【図16D】馬における抗体価のＥＬＩＳＡ。馬の血清。単一馬の免疫前及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の１回目、２回目、及び３回目のワクチン接種後の血清を採取し、血清をＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０に対する抗体について分析した。０、３３、及び５３日目に馬を免疫した。データは、免疫前の値を差し引いた１６、５１、及び６７日目の血清を示す。
【図16E】馬における抗体価のＥＬＩＳＡ。馬の血清。４頭の馬の免疫前及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の３回目のワクチン接種後（８４日目）の血清を採取し、血清をｅＩＬ－５に対する抗体について分析した。０、２８、及び５６日目に馬を免疫した。データは、免疫前の値を差し引いた８４日目の血清を示す。
【図17A】疾患症状と血中の好酸球レベルの相関。１２頭の皮膚そう痒罹患馬の血中好酸球レベルを測定し、シーズン中のＩＢＨ病変の疾患症状スコアリングに対してブロットした。相関精度は、Ｒ２＝０．９２２７、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２で示される。
【図17B】疾患症状と血中の好酸球レベルの相関。４８頭の皮膚そう痒罹患馬の血中好酸球レベルを測定し、シーズン中のＩＢＨ病変の疾患症状スコアリングに対してブロットした。相関精度は、Ｒ２＝０．３１１５、Ｐ＜０．０００１、ｎ＝４８で示される。
【図18A】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。抗体価の経時変化。血液試料を、注射後のいくつかの時点（矢印で示す）で採取し、血清を抗ｅＩＬ－５ ＩｇＧ自己抗体について分析した。
【図18B】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。血中の好酸球レベルの経時変化。血液試料を注射後のいくつかの時点（矢印で示す）で採取し、ＥＤＴＡ血液試料を分析した。
【図18C】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。疾患病変の経時変化。尾及びたてがみの病変の重症度グレードを経時的に記録した。
【図18D】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。好酸球レベルに対する抗体価の相関。ＩｇＧ抗ｅＩＬ－５抗体応答を好酸球レベルと相関させた。
【図18E】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０によるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。抗体価の経時変化。血液試料を抗ｅＩＬ－５（黒線）及び抗ＣＭＶｔｔ８３０ ＩｇＧ抗体（灰色の線）について分析した。血液試料を注射後のいくつかの時点（矢印で示す、０、３３、５３日目）で採取し、血清（０、１６、５１、６７日目）を抗ｅＩＬ－５ ＩｇＧ自己抗体及び抗ＣＭＶｔｔ８３０抗体について分析した。
【図18F】ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０によるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。血中の好酸球レベル（黒線）及び総病変重症度（灰色の線）の経時変化。血液試料を採取し、ＥＤＴＡ血液試料を分析した。０、３３、５３日目のワクチン注射を矢印で示す。
【図18G】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。抗体価の経時変化。血液試料を、注射（ワクチン注射は矢印で示されている）後のいくつかの時点で採取し、血清を抗Ｑβ ＩｇＧ抗体について分析した。ワクチン接種馬（黒線）及びプラセボ馬（灰色の線）からの血清のデータの時点１は２０１５年１月１日であり、時点２は２０１５年３月２０日であり、時点３は２０１５年４月３日であり、時点４は２０１５年４月３０日であり、時点５は２０１５年５月２８日であり、時点６は２０１５年６月２５日であり、時点７は２０１５年７月３０日であり、時点８は２０１５年８月２７日であり、時点９は２０１５年９月３０日である。
【図18H】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。抗体価の経時変化。血液試料を、注射（ワクチン注射を矢印で示す）後のいくつかの時点で採取し、血清を抗ｅＩＬ－５ ＩｇＧ自己抗体について分析した。ワクチン接種馬（黒線）及びプラセボ馬（灰色の線）からの血清のデータの時点１は２０１５年１月１日であり、時点２は２０１５年３月２０日であり、時点３は２０１５年４月３日であり、時点４は２０１５年４月３０日であり、時点５は２０１５年５月２８日であり、時点６は２０１５年６月２５日であり、時点７は２０１５年７月３０日であり、時点８は２０１５年８月２７日であり、時点９は２０１５年９月３０日である。
【図18I】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。治療前のシーズン（シーズン２０１４）中の、プラセボ馬（２、灰色バー）に対する活性馬（１、黒バー）の平均病変重症度。
【図18J】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。治療シーズン（シーズン２０１５）中の、プラセボ馬（２、灰色バー）に対する活性馬（１、黒バー）の平均病変重症度。
【図18K】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。治療前のシーズン（２０１４）及び治療シーズン（２０１５）の、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチン接種（黒線）及びプラセボワクチン接種（灰色の線）を行った個々の馬の病変重症度を示す。
【図18L】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。治療シーズン（第１、黒棒）中に改善したか、又は安定していたか、若しくは悪化した（第２、灰色バー）馬の数を示すｅＩＬ－５－Ｑβワクチン接種の治療効果。
【図18M】経過観察シーズン中のｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＱβによるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。同じシーズン中の１５頭のプラセボ馬（２、灰色バー）に対する経過観察シーズン中の１０頭の活性馬（１、黒バー）の平均病変重症度。ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定による統計解析。
【図18N】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０によるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。治療前のシーズン（シーズン２０１５、４～６月）中の活性馬（１、黒バー）及びプラセボ馬（２、灰色バー）の平均病変重症度。
【図18O】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０によるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。治療シーズン（シーズン２０１６、４～６月）中の活性馬（１、黒バー）及びプラセボ馬（２、灰色バー）の平均病変重症度。
【図18P】二重盲検プラセボ対照無作為化研究でのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０によるＩＢＨ疾患パラメータの効率的な減少。２０１６年の活性馬マイナス２０１５年の活性馬（１、黒バー）及び２０１６年のプラセボ馬マイナス２０１５年のプラセボ馬（２、灰色バー）の、４月～６月に測定した平均病変重症度の差分。ノンパラメトリックマン・ホイットニー検定による統計分析。
【図19A】ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応の分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる。タンパク質をクーマシーブルーで染色した：ｅエオタキシンモノマー（ｅエオタキシン、ｍ）、Ｑβモノマー（Ｑβ、ｍ）カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学的架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＱβ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβカップリング反応。
【図19B】ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応の分析。ウエスタンブロットによる。α－Ｈｉｓ抗体で染色した：ｅエオタキシンモノマー（ｅエオタキシン、ｍ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学的架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＱβ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβカップリング反応。
【図20A】ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応の分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる。タンパク質をクーマシーブルーで染色した：ｅＩＬ－３１モノマー（ｅＩＬ－３１、ｍ）、ｅＩＬ－３１ダイマー（ｅＩＬ－３１、ｄ）、Ｑβモノマー（Ｑβ、ｍ）カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学的架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＱβ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβカップリング反応。
【図20B】ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβのカップリング反応の分析。ウエスタンブロットによる。α－Ｈｉｓ抗体で染色した：ｅＩＬ－３１モノマー（ｅＩＬ－３１、ｍ）、ｅＩＬ－３１ダイマー（ｅＩＬ－３１、ｄ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、化学的架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＱβ－ＶＬＰ、レーン２、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン３、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβカップリング反応。
【図20C】ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０のカップリング反応の分析。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる。タンパク質をクーマシーブルーで染色した：ｅＩＬ－３１モノマー（ｅＩＬ－３１、ｍ）、ＣＭＶｔｔ８３０モノマー（ＣＭＶ、ｍ）、ＣＭＶｔｔ８３０ダイマー（ＣＭＶ、ｄ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン２、化学的架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＣＭＶｔｔ８３０－ＶＬＰ、レーン３、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０カップリング反応。
【図20D】ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０のカップリング反応の分析。ウエスタンブロットによる。α－Ｈｉｓ抗体で染色した：ｅＩＬ－３１モノマー（ｅＩＬ－３１、ｍ）、ｅＩＬ－３１ダイマー（ｅＩＬ－３１、ｄ）、カップリング（ｃ）。レーンＭ、サイズマーカー（Ｓｅｅ Ｂｌｕｅ、プレ染色、ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レーン１、ＴＣＥＰ活性化ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、レーン２、化学的架橋剤ＳＭＰＨでの誘導体化後のＣＭＶｔｔ８３０－ＶＬＰ、レーン３、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０カップリング反応。
【発明を実施するための形態】
【0026】
別段の定義がない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、一般に、本発明が属する当業者によって理解されるのと同じ意味を有する。
【0027】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する用語「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、非複製性若しくは非感染性、好ましくは、非複製性及び非感染性のウイルス粒子を指すか、又は非複製性若しくは非感染性、好ましくは、非複製性及び非感染性のウイルス粒子に似た構造体、好ましくは、ウイルスのキャプシドを指す。本明細書で使用する用語「非複製性」は、ＶＬＰによって含まれるゲノムを複製することができないことを指す。本明細書で使用する用語「非感染性」は、宿主細胞に入ることができないことを指す。ウイルスゲノム又はゲノム機能の全部又は一部を欠いているので、本発明によるウイルス様粒子は非複製性及び非感染性である。本発明によるウイルス様粒子は、それらのゲノムと異なる核酸を含有することができる。組換え生成ウイルス様粒子は、典型的には、宿主細胞由来のＲＮＡを含有する。本発明によるウイルス様粒子の典型的かつ好ましい実施形態は、本発明のポリペプチドで構成されるウイルスキャプシドである。ウイルス様粒子は、典型的には、ウイルス様粒子あたり６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、又は３６０超のタンパク質サブユニットを含む、典型的にはウイルスコートタンパク質で構成される巨大分子集合体である。典型的かつ好ましくは、これらのサブユニットの相互作用は、固有の反復組織を有するウイルスキャプシド又はウイルスキャプシド様構造の形成をもたらす。ウイルス様粒子の１つの特徴は、そのサブユニットのその非常に規則正しい反復配列である。
【0028】
ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子：本明細書で使用する用語「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、変異体又はその断片を含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又はそれからなるウイルス様粒子を指す。加えて、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージの構造に似ており、非複製性及び／又は非感染性であり、かつ少なくともＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする遺伝子若しくは複数の遺伝子を欠き、かつ典型的には、宿主へのウイルス接着若しくは宿主への侵入に関与するタンパク質若しくは複数のタンパク質をコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いている。前述の遺伝子又は複数の遺伝子は依然として存在するが不活性であり、したがって、ＲＮＡバクテリオファージの非複製性及び／又は非感染性ウイルス様粒子をもたらすＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子も含まれる。ＲＮＡバクテリオファージに由来する好ましいＶＬＰは、正二十面体対称を示し、１８０個のサブユニット（モノマー）からなる。ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子を非複製性及び／又は非感染性にさせる好ましい方法は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理などの物理化学的不活性化、典型的かつ好ましくは、遺伝子操作によるものである。
【0029】
ＣＭＶのウイルス様粒子：用語「ＣＭＶのウイルス様粒子」又はＣＭＶ ＶＬＰは、少なくとも１つのＣＭＶポリペプチドを含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又は好ましくはそれからなるウイルス様粒子を指す。好ましくは、ＣＭＶのウイルス様粒子は、主として、さらにより好ましくは、キャプシド構造の唯一のタンパク質成分として前記ＣＭＶポリペプチドを含む。典型的かつ好ましくは、ＣＭＶのウイルス様粒子は、ＣＭＶのキャプシド構造に似ている。ＣＭＶのウイルス様粒子は、非複製性及び／又は非感染性であり、少なくともＣＭＶの複製機構をコードする遺伝子又は複数の遺伝子を欠いており、典型的には、宿主へのウイルス接着若しくは宿主への侵入に関与するタンパク質若しくは複数のタンパク質をコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いている。この定義はまた、前述の遺伝子又は複数の遺伝子は依然として存在するが不活性であるウイルス様粒子も含む。ＣＭＶのウイルス様粒子を非複製性及び／又は非感染性にさせる好ましい方法は、ＵＶ照射、ホルムアルデヒド処理などの物理化学的不活性化によるものである。好ましくは、ＣＭＶのＶＬＰは、ＣＭＶの複製機構をコードする遺伝子又は複数の遺伝子を欠き、宿主へのウイルス接着若しくは宿主への侵入に関与するタンパク質若しくは複数のタンパク質をコードする遺伝子又は複数の遺伝子も欠いている。再び、より好ましくは、非複製性及び／又は非感染性ウイルス様粒子は、組換え遺伝子技術によって得られる。本発明によるＣＭＶの組換え生成ウイルス様粒子は、典型的かつ好ましくは、ウイルスゲノムを含まない。モザイクＶＬＰと呼ばれる場合が多いポリペプチドの２種以上を含むウイルス様粒子も、本発明に包含される。したがって、一実施形態において、本発明によるウイルス様粒子は、少なくとも２つの異なるポリペプチド種を含み、前記ポリペプチド種の少なくとも１つがＣＭＶポリペプチドである。好ましくは、ＣＭＶのＶＬＰは、典型的には、ＶＬＰあたり１８０個のコートタンパク質サブユニットを含むＣＭＶコートタンパク質で構成される巨大分子集合体である。典型的かつ好ましくは、本明細書で使用するＣＭＶのＶＬＰは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、若しくは好ましくはそれからなる少なくとも１つのＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【0030】
抗原：本明細書で使用する用語「抗原」は、ＭＨＣ分子によって提示される場合、抗体又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が結合することが可能な分子を指す。本明細書で使用する用語「抗原」はまた、Ｔ細胞エピトープを指す。抗原は、さらに免疫系によって認識されることが可能であり、かつ／又はＢリンパ球及び／若しくはＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答並びに／又は細胞性免疫応答を誘導することが可能である。しかしながら、これは、少なくとも特定の場合において、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有するか、又はＴｈ細胞エピトープに結合され、かつ／又はアジュバントで与えられることが必要である場合がある。抗原は、１以上のエピトープ（Ｂエピトープ及びＴエピトープ）を有し得る。上記で言及した特異的反応は、抗原が、好ましくは、その対応する抗体又はＴＣＲと、典型的には高度に選択的な様式で反応し、他の抗原によって誘発され得る多数の他の抗体又はＴＣＲと反応しないことを示すことを意味する。特に示さない場合、本明細書で使用する用語「抗原」は、本発明の組成物、免疫原性組成物若しくはワクチン組成物及び／又は医薬組成物に含有されるコア粒子又はウイルス様粒子を指すものではない。
【0031】
コートタンパク質：用語「コートタンパク質」は、ウイルスタンパク質、好ましくは、ウイルス、好ましくはＲＮＡバクテリオファージ又は植物ウイルスの天然キャプシドのサブユニットを指し、ウイルスキャプシド又はＶＬＰに組み込まれることが可能である。用語コートタンパク質は、天然のコートタンパク質、並びに組換え発現コートタンパク質を包含する。さらに、コートタンパク質の変異体及び断片が包含され、前記変異体及び断片はＶＬＰを形成する能力を保持する。
【0032】
ポリペプチド：本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合（アミド結合としても知られる）によって直鎖状に結合されているアミノ酸モノマーで構成されたポリマーを指す。用語ポリペプチドは、アミノ酸の連続鎖を指し、生成物の特定の長さを指すものではない。したがって、ペプチド、及びタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。
【0033】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド：本明細書で使用する用語「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）ポリペプチド」は、（ｉ）キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなるポリペプチドを指し、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列、すなわちＣＭＶの前記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。典型的かつ好ましくは、該ＣＭＶポリペプチドは、発現時に、自己集合によってＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。
【0034】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）：本明細書で使用する用語「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）」は、天然に存在するキュウリモザイクウイルスのコートタンパク質を指す。キュウリモザイクウイルスの非常に広い宿主範囲により、ＣＭＶの多くの異なる株及び単離株が知られており、また、前記株及び単離株のコートタンパク質の配列は、決定され、したがって、当業者に知られている。ＣＭＶの前記コートタンパク質（ＣＰ）の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ｗｗｗ．ｄｐｖｗｅｂ．ｎｅｔ、又はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｅｉｎ／などの既知のデータベースに記載されており、そこから検索可能である。例は、欧州特許出願第１４１８９８９７．３に記載されている。ＣＭＶコートタンパク質のさらなる例は、配列番号１５～１７に提供されている。これらの株及び単離株が、コートタンパク質のＮ末端を含む異なるタンパク質ドメインに非常に類似したコートタンパク質配列を有することは注目に値する。特に、全て完全に配列決定されたＣＭＶ単離株の９８．１％は、それらのコートタンパク質配列の最初の２８個のアミノ酸内に８５％超の配列同一性を共有し、さらに、全て完全に配列決定されたＣＭＶ単離株の７９．５％は、それらのコートタンパク質配列の最初の２８個のアミノ酸内に９０％超の配列同一性を共有している。
【0035】
典型的かつ好ましくは、本発明に使用されるＣＭＶのコートタンパク質は、発現時に、自己集合によってＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、本発明に使用されるＣＭＶのコートタンパク質は、大腸菌における発現時に、自己集合によってＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。
【0036】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）：本明細書で使用する用語「キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、又は好ましくは本質的にそれからなるか、又は好ましくはそれからなるように改変されたものであるＣＭＶのＶＬＰを指し、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶポリペプチド、及びＴヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくはそれからなる。典型的かつ好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、（ｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端と融合するか、（ｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドのＣ末端と融合するか、（ｉｉｉ）前記ＣＭＶポリペプチドの連続したアミノ酸の領域と置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの連続したアミノ酸の前記置換領域とＴヘルパー細胞エピトープとの間の配列同一性が、少なくとも１５％、好ましくは少なくとも２０％であるか、又は（ｉｖ）前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５～１５個の連続したアミノ酸からなる。好ましくは、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域と置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、５～１５個の連続アミノ酸、好ましくは９～１４個の連続アミノ酸、より好ましくは、１１～１３個の連続アミノ酸、及び最も好ましくは１１、１２又は１３個の連続アミノ酸からなる。好ましくは、本発明のＣＭＶの前記改変されたＶＬＰは、ＣＭＶの組み換え改変されたＶＬＰである。
【0037】
改変ＣＭＶポリペプチド：本明細書で使用する用語「改変ＣＭＶポリペプチド」は、本明細書で定義されるように改変されたＣＭＶポリペプチドを指し、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶポリペプチド及びＴヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくは、それらからなる。典型的には、改変ＣＭＶポリペプチドは、発現時に、自己集合によってＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。好ましくは、改変ＣＭＶポリペプチドは、組換え改変ＣＭＶポリペプチドであり、大腸菌における発現時に自己集合によってＣＭＶのウイルス様粒子を形成することができる。
【0038】
ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域：本明細書で使用する用語「ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域」は、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端、特に、ＣＭＶのコートタンパク質のＮ末端、又は前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端の領域、又はＣＭＶの前記コートタンパク質のいずれかを指すが、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、前記ＣＭＶポリペプチド又はＣＭＶの前記コートタンパク質のＮ末端の第２のアミノ酸から始まる。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記コートタンパク質が、Ｎ末端メチオニン残基を含む場合、実用的な観点から、開始コドンコードメチオニンは、通常、削除され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加される。さらに好ましくは、１個、２個又は３個の追加のアミノ酸、好ましくは１個のアミノ酸は、任意に、クローニング目的のために、開始メチオニンとＴｈ細胞エピトープの間に挿入することができる。本明細書で使用する用語「ＣＭＶポリペプチド又はＣＭＶコートタンパク質の変異アミノ酸配列のＮ末端領域」は、前記ＣＭＶポリペプチド若しくはＣＭＶの前記コートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端、又は前記ＣＭＶポリペプチド若しくはＣＭＶの前記コートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端領域のいずれかを指すが、前記変異アミノ酸配列がＮ末端メチオニン残基を含む場合、前記ＣＭＶポリペプチド若しくはＣＭＶの前記コートタンパク質の前記変異アミノ酸配列のＮ末端の２番目のアミノ酸から始まる。好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチド又は前記コートタンパク質がＮ末端メチオニン残基を含む場合、実用的な観点から、開始コドンコードメチオニンは、通常、削除され、Ｔｈ細胞エピトープのＮ末端に付加される。さらに好ましくは、１個、２個又は３個の追加のアミノ酸、好ましくは、１個のアミノ酸は、任意に、クローニング目的のために、開始メチオニンとＴｈ細胞エピトープの間に挿入することができる。
【0039】
組換えポリペプチド：本発明の文脈において、用語「組換えポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１工程を含む方法により得られるポリペプチドを指す。典型的かつ好ましくは、組換えポリペプチドは、原核生物発現系で生成される。大腸菌などの原核生物発現系で発現される組換え生成ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を含むことができることは、当業者には明らかである。Ｎ末端メチオニン残基は、典型的には、組換えポリペプチドの成熟中に、発現宿主における組換えポリペプチドから切断される。しかしながら、Ｎ末端メチオニンの切断は、不完全であってもよい。したがって、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらず、他の点では同一のポリペプチドの混合物を含んでよい。典型的かつ好ましくは、組換えポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する１０％未満、より好ましくは５％未満、及びさらにより好ましくは１％未満の組換えポリペプチドを含む。
【0040】
組換えＣＭＶポリペプチド：用語「組換えＣＭＶポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１工程を含む方法によって得られる、上記で定義したＣＭＶポリペプチドを指す。典型的かつ好ましくは、組換えＣＭＶポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する１０％未満、より好ましくは５％未満、及びさらにより好ましくは１％未満の組換えＣＭＶポリペプチドを含む。その結果、本発明の組換えウイルス様粒子は、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらず、他の点では同一の組換えポリペプチドを含んでよい。
【0041】
組換え改変ＣＭＶポリペプチド：用語「組換え改変ＣＭＶポリペプチド」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１工程を含む方法によって得られる、上記で定義された改変ＣＭＶポリペプチドを指す。典型的かつ好ましくは、組換え改変ＣＭＶポリペプチドの調製物は、Ｎ末端メチオニン残基を有する１０％未満、より好ましくは５％未満、及びさらにより好ましくは１％未満の組み換え改変ＣＭＶポリペプチドを含む。その結果、本発明の組換えウイルス様粒子は、Ｎ末端メチオニン残基の有無にかかわらず、他の点では同一の組換えポリペプチドを含んでよい。
【0042】
組換えウイルス様粒子：本発明の文脈において、用語「組換えウイルス様粒子」は、組換えＤＮＡ技術の少なくとも１工程を含む方法により得られるウイルス様粒子（ＶＬＰ）を指す。典型的かつ好ましくは、組換えＶＬＰは、宿主、好ましくは、細菌細胞における組換えウイルスコートタンパク質の発現により得られる。典型的かつ好ましくは、組換えウイルス様粒子は、少なくとも１つの組換えポリペプチド、好ましくは組換えＣＭＶポリペプチド又は組換え改変ＣＭＶポリペプチドを含む。最も好ましくは、組換えウイルス様粒子は、組換えＣＭＶポリペプチド又は組換え改変ＣＭＶポリペプチドで構成されるか、又はそれからなる。結果として、本発明の文脈において、本発明の組換えＶＬＰの定義が、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列を参照して行われる場合には、これらの本発明の組換えＶＬＰの範囲は、前記Ｎ末端メチオニン残基を含まない前記特定のアミノ酸配列によって形成されるＶＬＰを包含するが、同様に、本明細書に示されているように、典型的には少量ではあるが、前記Ｎ末端メチオニンを有する前記特定のアミノ酸配列によって形成されるＶＬＰを包含する。さらに、本発明の組換えＶＬＰの定義が、Ｎ末端メチオニン残基を含む特定のアミノ酸配列を参照して行われる場合、依然として前記Ｎ末端メチオニン残基を含むアミノ酸配列とＮ末端メチオニン残基を欠くアミノ酸配列の両方を含むＶＬＰが包含されることは本発明の範囲内である。
【0043】
変異アミノ酸配列：用語「変異アミノ酸配列」は、変異されるアミノ酸配列に定義されたセットの変異を導入することによって得られるアミノ酸配列を指す。本発明の文脈において、前記変異されるアミノ酸配列は、典型的かつ好ましくは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列である。したがって、変異アミノ酸配列は、少なくとも１つのアミノ酸残基がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列とは異なり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９０％の配列同一性を示す。典型的かつ好ましくは、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を示す。好ましくは、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、最大で１１、１０、９、８、７、６、４、３、２、又は１個のアミノ酸残基が異なり、さらに好ましくは、前記違いは、挿入、欠失及びアミノ酸交換から選択される。好ましくは、該変異アミノ酸配列は、少なくとも１個のアミノ酸がＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列と異なり、好ましくは、前記違いはアミノ酸交換である。
【0044】
…残基に対応する位置：別のアミノ酸配列の所与の残基に対応するアミノ酸配列上の位置は、配列アライメントによって、典型的かつ好ましくはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いることによって、最も好ましくは、標準的な設定を用いて特定することができる。典型的かつ好ましい標準設定は、期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、伸長１；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整である。
【0045】
配列同一性：２つの所定のアミノ酸配列の配列同一性は、両方の配列のアラインメントに基づいて決定される。配列同一性の決定のためのアルゴリズムは、当業者に利用可能である。好ましくは、２つのアミノ酸配列の配列同一性は、「ＢＬＡＳＴ」プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）又は「ＣＬＵＳＴＡＬＷ」（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／）などの公に利用可能なコンピューター相同性プログラムを用いて、かつ本明細書では、好ましくは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）のＮＣＢＩのホームページ上で提供される「ＢＬＡＳＴ」プログラムにより、その中で設けられたデフォルト設定を使用して決定される。典型的かつ好ましい標準設定は、期待閾値：１０；ワードサイズ：３；クエリ範囲の最大一致：０；マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：存在１１、伸長１；組成調整：条件付き組成スコアマトリックス調整である。
【0046】
アミノ酸交換：用語アミノ酸交換は、異なる化学構造を有する任意の他のアミノ酸残基による、好ましくは、別のタンパク質を構成するアミノ酸残基による、アミノ酸配列中の所定のアミノ酸残基の交換を指す。したがって、アミノ酸の挿入又は欠失とは対照的に、アミノ酸交換では、前記アミノ酸配列のアミノ酸の総数は変化しない。前記変異されるアミノ酸配列のアミノ酸残基とリジン残基又はシステイン残基との交換が、本発明の文脈において非常に好ましい。
【0047】
エピトープ：用語エピトープは、抗原、好ましくはポリペプチドの連続又は不連続部分を指し、前記部分は、抗体によって、又はＭＨＣ分子の文脈中ではＴ細胞受容体によって特異的に結合させることができる。抗体に関しては、特異的結合は、非特異的結合を排除するが、必ずしも交差反応性を排除するものではない。エピトープは、典型的には、抗原部位に固有の空間的立体構造に５～２０個のアミノ酸を含む。
【0048】
Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ：本明細書で使用する用語「Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ」は、ヘルパーＴｈ細胞によって認識することが可能であるエピトープを指す。別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープである。
【0049】
ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ：本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、少なくとも１つ、好ましくは２以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるＴｈ細胞エピトープを指す。ペプチド配列が、ユニバーサルＴｈ細胞エピトープであるかどうかを判断する最も簡単な方法は、個々のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチドの能力を測定することである。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子への公知のＴｈ細胞エピトープペプチドの結合と競合するペプチドの能力によって測定することができる。ＨＬＡ－ＤＲ分子の代表的な選択は、例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１に記載されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＴｈ細胞エピトープの親和性は、少なくとも１０－５Ｍであるべきである。Ｔｈ細胞エピトープの「普遍性」を決定する別のより面倒ではなく、より関連性の高い方法により、大部分の人々（＞３０％）において、免疫化及びＩＦＡに製剤化されたＴｈ細胞エピトープを含有するタンパク質による１ヶ月後の追加免疫の際に、測定可能なＴ細胞応答が生じることが実証されている。異なる個体中に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子の代表的なコレクションは、Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２の中で与えられている。結果として、本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、好ましくは、Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２に記載のように、選択された個体のグループの３０％超において、免疫化及び（ＩＦＡに製剤化されたＴｈ細胞エピトープを含有するタンパク質による１ヶ月後の）追加免疫の際に測定可能なＴ細胞応答をもたらすＴｈ細胞エピトープを指す。また、及び再びさらに好ましくは、本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ３、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲ５２ａ、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択され、かつ好ましくは、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、さらにより好ましくは少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子に、少なくとも５００ｎＭの親和性で結合することができるＴｈ細胞エピトープを好ましくは指し（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１及び本明細書で引用される参考文献に記載のように）、前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ Ａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５－４０に記載のものである。さらに再びより好ましい方法では、本明細書で使用する用語「ユニバーサルＴｈ細胞エピトープ」は、ＤＲ１、ＤＲ２ｗ２ｂ、ＤＲ４ｗ４、ＤＲ４ｗ１４、ＤＲ５、ＤＲ７、ＤＲｗ５３、ＤＲ２ｗ２ａから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、及びさらにより好ましくは少なくとも３つのＤＲ対立遺伝子に、少なくとも５００ｎＭの親和性で結合することができるＴｈ細胞エピトープを指し（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１及び本明細書で引用される参考文献に記載のように）、前記親和性を評価するための好ましい結合アッセイは、Ｓｅｔｔｅ Ａら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１４２：３５－４０に記載のものである。
【0050】
ユニバーサルＴｈ細胞エピトープは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９４）１：７５１－７６１，Ｐａｎｉｎａ－Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ Ｐら，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８９）１９：２２３７－２２４２，Ｃａｌｖｏ－Ｃａｌｌｅ ＪＭら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９７）１５９：１３６２－１３７３、及びＶａｌｍｏｒｉ Ｄら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）１４９：７１７－７２１などによって記載されており、当業者に公知である。
【0051】
アジュバント：本明細書で使用する用語「アジュバント」は、宿主において免疫応答の非特異的刺激因子又はデポーが生じるのを可能にする物質を指し、本発明のワクチン及び医薬組成物のそれぞれと組み合わせた時に、さらに増強された免疫応答を提供することができる。好ましいアジュバントは、完全及び不完全フロイントアジュバント、アルミニウム含有アジュバント、好ましくは水酸化アルミニウム、及び改変ムラミルジペプチドである。さらに好ましいアジュバントは、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウムパルブムなどのヒトアジュバントである。そのようなアジュバントも当技術分野で知られている。本発明の組成物と共に投与され得るさらなるアジュバントには、モノホスホリル脂質免疫調節物質、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ－２１、ＱＳ－１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩（ミョウバン）、ＭＦ－５９、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７、ＯＭ－２９４、及びビロソームアジュバント技術が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントはまた、これらの物質の混合物を含んでよい。ウイルス様粒子は、一般的にアジュバントとして記載されている。しかし、本出願の文脈内で使用する用語「アジュバント」は、本発明のウイルス様粒子ではないアジュバントを指す。むしろ、「アジュバント」は、本発明の組成物、ワクチン組成物又は医薬組成物の追加の別個の成分に関連する。
【0052】
有効量：本明細書で使用する用語「有効量」は、所望の生物学的効果を実現するのに必要又は十分な量を指す。組成物の有効量、あるいは医薬組成物は、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は当業者によって日常的な事柄として決定することができる。好ましくは、本明細書で使用する用語「有効量」は、少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状を低減するのに有効である必要又は十分な量を指し、好ましくは前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状が、皮膚病変レベル又は重症度グレードであり、さらに好ましくは、前記皮膚病変レベル又は重症度グレードの前記低下は、症状病変スコアリング試験によって決定される。有効量は、投与される特定の組成物及び対象のサイズに応じて変化し得る。当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【0053】
治療：本明細書で使用する用語「治療」、「治療する」、「治療される」又は「治療すること」は、予防及び／又は療法を指す。一実施形態において、用語「治療」、「治療する」、「治療される」又は「治療すること」は、治療的処置を指す。別の実施形態において、用語「治療」、「治療する」、「治療される」又は「治療すること」は、予防的処置を指す。
【0054】
第１の付着部位：本明細書で使用する語句「第１の付着部位」は、ウイルス様粒子と共に天然に生じるか、又はウイルス様粒子に人工的に付加され、かつ第２の付着部位が結合することができる要素を指す。第１の付着部位は、好ましくは、タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸、ペプチド、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基、若しくはこれらの組み合わせなどの化学反応基である。第１の付着部位である化学反応基の好ましい実施形態は、アミノ酸残基、好ましくはリジン残基のアミノ基である。第１の付着部位は、典型的には、表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上に位置する。複数の第１の付着部位が、表面上、好ましくはＶＬＰの外表面上、典型的には反復形状で存在する。好ましい実施形態において、第１の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介してＶＬＰと結合する。さらに好ましい実施形態において、第１の付着部位は、ＶＬＰと共に天然に存在する。あるいは、好ましい実施形態において、第１の付着部位は、人工的にＶＬＰに付加される。非常に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位は、前記ＶＬＰポリペプチドのアミノ酸配列のリジン残基のアミノ基である。
【0055】
第２の付着部位：本明細書で使用する語句「第２の付着部位」は、抗原と共に天然に生じるか、又は抗原に人工的に付加され、かつ第１の付着部位が結合することができる要素を指す。好ましくは、抗原の第２の付着部位は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、糖、ポリヌクレオチド、天然又は合成ポリマー、二次代謝産物又は化合物（ビオチン、フルオレセイン、レチノール、ジゴキシゲニン、金属イオン、フェニルメチルスルホニルフルオリド）、又はアミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基、グアニジニル基、ヒスチジニル基、若しくはこれらの組み合わせなどの化学反応基である。第２の付着部位である化学反応基の好ましい実施形態は、スルフヒドリル基、好ましくは、アミノ酸システインのスルフヒドリル基、最も好ましくは、システイン残基のスルフヒドリル基である。用語「少なくとも１つの第２の付着部位を有する抗原」は、したがって、抗原及び少なくとも１つの第２の付着部位を含む構築物を指す。しかしながら、特に、抗原内に天然に存在しない第２の付着部位については、そのような構築物は、典型的かつ好ましくは、さらに「リンカー」を含む。別の好ましい実施形態において、第２の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介して抗原と結合する。さらなる実施形態において、第２の付着部位は、抗原内に天然に存在する。別のさらに好ましい実施形態において、第２の付着部位は、リンカーを介して抗原に人工的に付加され、前記リンカーはシステインを含むか、あるいはシステインからなる。好ましくは、該リンカーは、ペプチド結合によって抗原に融合される。
【0056】
結合する：本明細書で使用する用語「結合する」又は「結合」は、少なくとも１つの第１の付着部位及び少なくとも１つの第２の付着部位が互いに結合することによる全ての可能な方法、好ましくは化学的相互作用を指す。化学的相互作用は、共有結合性及び非共有結合性相互作用を含む。非共有結合性相互作用の典型例は、イオン相互作用、疎水性相互作用又は水素結合であるが、共有結合性相互作用は、例えば、エステル、エーテル、リン酸エステル、炭素－リン結合、チオエーテルなどの炭素－硫黄結合又はイミド結合などの共有結合に基づく。特定の好ましい実施形態において、第１の付着部位及び第２の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つの非ペプチド結合を介して、さらにより好ましくは排他的に非ペプチド結合（複数可）を介して結合する。本明細書で使用する用語「結合する」は、しかしながら、少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも１つの第２の付着部位の直接的な結合を指すだけでなく、代替的かつ好ましくは、中間体分子（複数可）を介して、典型的かつ好ましくは、本明細書では、少なくとも１つの、好ましくは、１つのヘテロ二官能性架橋剤を使用することによる、少なくとも１つの第１の付着部位と少なくとも１つの第２の付着部位の間接的な結合も指す。他の好ましい実施形態において、第１の付着部位と第２の付着部位は、少なくとも１つの共有結合を介して、好ましくは少なくとも１つのペプチド結合を介して、さらにより好ましくは排他的にペプチド結合（複数可）を介して結合する。
【0057】
リンカー：本明細書で使用する「リンカー」は、抗原と第２の付着部位を結合するか、又は既に第２の付着部位を含むか、本質的にそれからなる、若しくはそれからなる。好ましくは、本明細書で使用する「リンカー」は、既に第２の付着部位を、典型的かつ好ましくは、必ずしもそうではないが、１個のアミノ酸残基として、好ましくはシステイン残基として含む。好ましいリンカーは、アミノ酸リンカー、すなわち、少なくとも１個のアミノ酸残基を含有するリンカーである。用語アミノ酸リンカーは、そのようなリンカーがもっぱらアミノ酸残基からなることを意味するものではない。しかしながら、もっぱらアミノ酸残基からなるリンカーは、本発明の好ましい実施形態である。リンカーのアミノ酸残基は、好ましくは、天然に存在するアミノ酸又は当技術分野で公知の非天然アミノ酸、全てＬ又は全てＤ又はそれらの混合物で構成されている。本発明によるリンカーのさらなる好ましい実施形態は、スルフヒドリル基又はシステイン残基を含む分子であり、したがって、そのような分子も本発明に包含される。抗原とリンカーの結合は、好ましくは、少なくとも１つの共有結合により、より好ましくは少なくとも１つのペプチド結合によるものである。
【0058】
馬科の哺乳動物：本明細書で使用する「馬科の哺乳動物」は、馬、ポニー、ロバ（ａｓｓ）（ロバ（ｄｏｎｋｅｙ））、及びシマ馬を含む馬科に含まれる哺乳動物である。好ましくは、本明細書で使用する用語「馬科の哺乳動物」は、馬、ポニー、ロバ（ａｓｓ）（ロバ（ｄｏｎｋｅｙ））、及びシマ馬を指す。再びより好ましくは、本明細書で使用する用語「馬科の哺乳動物」は馬を指す。
【0059】
したがって、第１の態様において、本発明は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有するコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの抗原を含む組成物を提供し、前記少なくとも１つの抗原が、（ｉ）配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であるか；又は（ｉｉ）配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であるか；（ｉｉｉ）配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり；
（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合している。
（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合している。
【0060】
一実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0061】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２及び配列番号５から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらなる好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。非常にさらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３７のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0062】
一実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であり、前記ｅエオタキシン抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0063】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であり、前記ｅエオタキシン抗原は、配列番号６、配列番号７、配列番号１０、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１及び配列番号４２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であり、前記ｅエオタキシン抗原は、配列番号６、配列番号７及び配列番号１０から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0064】
一実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0065】
好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１２、配列番号１４、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。さらに好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１２及び配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0066】
さらに好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくは組換えＶＬＰである。再びさらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、植物ウイルス又はバクテリオファージに由来し、好ましくは、前記バクテリオファージはＲＮＡバクテリオファージである。
【0067】
したがって、さらに好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージに由来する。
【0068】
本発明のコア粒子としてＲＮＡバクテリオファージの組換えＶＬＰがさらに好ましい。さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、好ましくは、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβ又はＲＮＡバクテリオファージＡＰ２０５の組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、さらに好ましくは、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
【0069】
さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、（ａ）配列番号３１；（ｂ）配列番号３１と配列番号３２の混合物：又は（ｃ）配列番号３３から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれらからなる組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなる。非常にさらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰである。さらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなる。再びさらに好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、配列番号３１を含むか、又は好ましくはそれからなる組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなる。
【0070】
別の好ましい実施形態において、前記コア粒子はウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰはＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージＱβの組換えコートタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記組換えコートタンパク質は、配列番号３１を含むか、又は好ましくはそれからなる。
【0071】
一実施形態において、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰではなく、好ましくは、前記ＶＬＰは、ＲＮＡバクテリオファージの組換えＶＬＰではない。一実施形態において、前記ウイルス様粒子は、ＲＮＡバクテリオファージＱβのウイルス様粒子ではない。
【0072】
さらに好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）であり、前記ＶＬＰは、植物ウイルスに由来する。別の好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは組換えＶＬＰであり、好ましくは前記組換えＶＬＰは、植物ウイルスに由来する。別の好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＶＬＰである。
【0073】
好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＶＬＰポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなる改変ＶＬＰであり、前記改変ＶＬＰポリペプチドが、（ａ）ＶＬＰポリペプチド及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくはそれからなり、前記ＶＬＰポリペプチドが、（ｉ）ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、好ましくは、植物ウイルスのコートタンパク質のアミノ酸配列、若しくは（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ウイルスの前記コートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及びウイルスの前記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【0074】
好ましい実施形態において、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくはそれらからなり、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及びＣＭＶの前記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。
【0075】
好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、変異アミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及びＣＭＶの前記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す。典型的かつ好ましくは、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも１個、最大で１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個のアミノ酸残基が異なり、好ましくは、これらの違いは、（ｉ）挿入、（ｉｉ）欠失、（ｉｉｉ）アミノ酸交換、及び（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせから選択される。
【0076】
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号１５を含むか、若しくは好ましくはそれからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、再びさらに好ましくは少なくとも９０％、再びより好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、再びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列；又は（ｉｉ）前記変異されるアミノ酸配列が、この項の（ｉ）で定義されるような前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
【0077】
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１５を含むか、若しくは好ましくはそれからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、再びさらに好ましくは少なくとも９０％、再びより好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、再びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなる。
【0078】
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号３４を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号３４と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、再びさらに好ましくは少なくとも９０％、再びより好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、再びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）前記変異されるアミノ酸配列が、この項の（ｉ）で定義されるような前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９８％、及びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
【0079】
さらに好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号３４を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号３４と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、再びさらに好ましくは少なくとも９０％、再びより好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含むＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなる。
【0080】
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）（ａ）配列番号１５を含むか、若しくは好ましくはそれからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、再びさらに好ましくは少なくとも９０％、再びより好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列（この項の（ａ）又は（ｂ）で定義されるような前記アミノ酸配列は配列番号３４を含むか、又は（ａ）又は（ｂ）で定義されるような前記アミノ酸配列は、配列番号３４と少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、再びさらに好ましくは少なくとも９０％、再びより好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びさらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む）；又は（ｉｉ）前記変異されるアミノ酸配列が、この項の（ｉ）で定義されるような前記アミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及び前記変異されるアミノ酸配列は、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示す変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれらからなる。
【0081】
別の好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）配列番号１５を含むか、若しくは好ましくはそれからなるＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列、又は（ｂ）配列番号１５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列（この項の（ａ）又は（ｂ）で定義されるような前記アミノ酸配列は配列番号３４を含むか、若しくは（ａ）又は（ｂ）で定義されるような前記アミノ酸配列は、配列番号３４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列領域を含む）を含むか、又は好ましくはそれからなる。
【0082】
別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換する。別の好ましい実施形態において、前記置換されるＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記Ｔヘルパー細胞エピトープがなるアミノ酸の数と等しいか、又はそれより少ない。
【0083】
さらに非常に好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記置換されるＮ末端領域のアミノ酸の数は、前記Ｔヘルパー細胞エピトープがなるアミノ酸の数と等しいか、又はそれより少ない。典型的かつ好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されるＮ末端領域は、５～１５個の連続アミノ酸、好ましくは９～１４個の連続アミノ酸、より好ましくは１１～１３個の連続アミノ酸からなる。
【0084】
さらに非常に好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する。
【0085】
別の非常に好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ユニバーサルＴヘルパー細胞エピトープである。別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、最大で２０個のアミノ酸からなる。
【0086】
非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ配列である。さらに非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。別の非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。
【0087】
別の好ましい実施形態において、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、ヒトワクチンに由来する。非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来する。さらに非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくはそれからなる。別の非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくはそれからなる。
【0088】
非常に好ましい実施形態において、前記Ｔｈ細胞エピトープは、ＰＡＤＲＥ配列であり、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１９のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなるか、又は前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風毒素に由来し、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号１８のアミノ酸配列を有し、好ましくはそれからなる。
【0089】
非常に好ましい実施形態において、前記ＣＭＶポリペプチドは、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、前記アミノ酸配列は、配列番号１５若しくは配列番号１５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、前記アミノ酸配列は配列番号３４を含み、前記Ｔヘルパー細胞エピトープは、前記ＣＭＶポリペプチドのＮ末端領域を置換し、前記ＣＭＶポリペプチドの前記置換されたＮ末端領域は、１１～１３個の連続したアミノ酸、好ましくは１１個の連続したアミノ酸からなり、さらに好ましくは、前記ＣＭＶポリペプチドの前記Ｎ末端領域は、配列番号１５のアミノ酸２～１２に対応する。
【0090】
別の非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。別の非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなる。
【0091】
非常に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位及び前記第２の付着部位は、少なくとも１つの共有の非ペプチド結合を介して結合する。別の非常に好ましい実施形態において、前記第１の付着部位は、アミノ基、好ましくは、リジンのアミノ基を含むか、又は好ましくはそのようなアミノ基である。さらに非常に好ましい実施形態において、前記第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステインのスルフヒドリル基を含むか、又は好ましくはそのようなスルフヒドリル基である。
【0092】
非常に好ましい実施形態において、少なくとも１つの第１の付着部位は、アミノ基、好ましくはリジン残基のアミノ基であり、少なくとも１つの第２の付着部位は、スルフヒドリル基、好ましくはシステイン残基のスルフヒドリル基、又は本発明の少なくとも１つの抗原に化学的に結合されているスルフヒドリル基である。さらに好ましい実施形態において、前記第２の付着部位のうちの１つのみが、少なくとも１つの非ペプチド共有結合を介して前記第１の付着部位と結合すると、前記改変されたウイルス様粒子への前記抗原の結合の単一かつ均一な形をもたらし、前記第１の付着部位と結合する前記１つのみの第２の付着部位がスルフヒドリル基であり、前記抗原及び前記改変ウイルス様粒子は、前記結合を介して相互作用し、規則的で反復性の抗原アレイを形成する。
【0093】
本発明の好ましい一実施形態において、該抗原は、化学的架橋により、典型的かつ好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤を用いて改変ＶＬＰに結合する。好ましい実施形態において、該ヘテロ二官能性架橋剤は、改変ＶＬＰの好ましい第１の付着部位と、好ましくはアミノ基と、より好ましく、リジン残基（複数可）のアミノ基と反応することができる官能基を含有し、好ましい第２の付着部位と、すなわち、好ましくは、該抗原に固有の又は該抗原に人工的に付加され、必要に応じて、還元による反応にも利用できるようにされたシステイン（複数可）残基のスルフヒドリル基と反応することができるさらなる官能基を含有する。いくつかのヘテロ二官能性架橋剤は、当技術分野で公知である。これらには、好ましい架橋剤ＳＭＰＨ（Ｐｉｅｒｃｅ）、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＰＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＫＭＵＳ ＳＶＳＢ、ＳＩＡ、並びに、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社から利用可能で、アミノ基に対して反応性のある１つの官能基及びスルフヒドリル基に対して反応性のある１つの官能基を有する他の架橋剤が含まれる。上述した架橋剤の全ては、アミノ基との反応及びスルフヒドリル基とのチオエーテル結合後にアミド結合を形成する。本発明の実施に適する別のクラスの架橋剤は、カップリングの際に、該抗原と改変ＶＬＰの間にジスルフィド結合を導入することによって特徴付けられる。このクラスに属する好ましい架橋剤には、例えば、ＳＰＤＰ及びスルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。
【0094】
上記の好ましい方法に従ってヘテロ二官能性架橋剤を用いて、改変ＶＬＰに抗原を結合すると、配向様式で改変ＶＬＰへの抗原のカップリングが可能になる。改変ＶＬＰへの抗原の結合の他の方法には、該抗原が、カルボジイミドＥＤＣ、及びＮＨＳを用いて改変ＶＬＰに架橋される方法が含まれる。該抗原はまた、例えば、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はイミノチオランとの反応を経て、最初にチオール化されてもよい。次いで、該抗原は、必要であれば脱保護の後に、以下のように改変ＶＬＰにカップリングさせてよい。過剰なチオール化試薬の分離後に、該抗原は、システイン反応性部分を含むヘテロ二官能性架橋剤で事前に活性化させた改変ＶＬＰと反応し、したがって、上記のように、チオール化抗原が反応することができるシステイン残基に対して反応性のある少なくとも１つ又はいくつかの官能基を提示する。必要に応じて、少量の還元剤が反応混合物に含まれる。さらなる方法において、該抗原は、グルタルアルデヒド、ＤＳＧ、ＢＭ［ＰＥＯ］４、ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ）などのホモ二官能性架橋剤又は改変ＶＬＰのアミノ基若しくはカルボキシル基に対して反応性のある官能基を有する他の公知のホモ二官能性架橋剤を用いて改変ＶＬＰに取り付けられる。
【0095】
本発明の非常に好ましい実施形態において、該抗原は、改変ウイルス様粒子のリジン残基に、抗原のＮ末端若しくはＣ末端のいずれかに付加されるシステイン残基、又は抗原内の天然システイン残基を介して結合する。好ましい実施形態において、本発明の組成物はさらにリンカーを含み、前記リンカーは、前記抗原と前記第２の付着部位を結合させ、好ましくは、前記リンカーは前記第２の付着部位を含むか、あるいはそれからなる。
【0096】
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、好ましくは組換えＶＬＰであり、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0097】
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子は、本発明に従って改変されたＶＬＰ、好ましくは組換え改変されたＶＬＰであり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0098】
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ＶＬＰ、好ましくは組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、（ａ）ＣＭＶポリペプチド、及び（ｂ）Ｔヘルパー細胞エピトープを含むか、又は好ましくはそれらからなり、前記ＣＭＶポリペプチドは、（ｉ）ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列；又は（ｉｉ）変異アミノ酸配列を含むか、又は好ましくはそれからなり、変異されるアミノ酸配列は、ＣＭＶのコートタンパク質のアミノ酸配列であり、前記変異アミノ酸配列及びＣＭＶの前記コートタンパク質は、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％及び再びより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を示し、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0099】
本発明のさらに非常に好ましい実施形態において、前記コア粒子は、ＶＬＰ、好ましくは組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0100】
前記コア粒子は、ＶＬＰ、好ましくは組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0101】
さらなる態様において、本発明は、有効量の本発明の組成物を含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供し、必要に応じて、前記免疫原性組成物又はワクチン組成物は、さらにアジュバントを含む。
【0102】
さらなる態様において、本発明は、（ａ）本発明の組成物又は本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0103】
さらなる態様において、本発明は、免疫の方法であって、馬科の哺乳動物、好ましくは馬に本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物又は本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0104】
さらなる態様において、本発明は、薬剤として使用するための本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を提供する。
【0105】
さらなる態様において、本発明は、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症の予防又は治療の方法における使用のための、本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を提供し、有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物は、前記馬科の哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましくは、前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物の前記投与は、前記投与前の前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状と比較して、少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状を低減し、好ましくは、前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状は、皮膚病変のレベル又は重症度グレードであり、さらに好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、典型的かつ好ましくは、実施例１３に記載のように、症状病変スコアリング試験によって決定される。好ましい実施形態において、前記馬科の哺乳動物、好ましくは前記馬の皮膚病変のレベル又は重症度の前記低下は、より低い陽性症状病変スコアリング試験（ｌｅｓｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｉｎｇ ｔｅｓｔ）によって表され、典型的かつ好ましくは、前記症状病変スコアリング試験は、実施例１３に記載したように行われる。
【0106】
さらなる態様において、本発明の方法は、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症の治療の方法における使用のための、本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を提供し、有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物は、前記馬科の哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましくは、前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物の前記投与は、前記投与前の前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状と比較して、少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状を低減し、好ましくは、前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状は、皮膚病変のレベル又は重症度グレードであり、さらに好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、典型的かつ好ましくは、実施例１３に記載のように、症状病変スコアリング試験によって決定される。好ましい実施形態において、前記馬科の哺乳動物、好ましくは前記馬の皮膚病変のレベル又は重症度の前記低下は、より低い陽性症状病変スコアリング試験によって表され、典型的かつ好ましくは、前記症状病変スコアリング試験は、実施例１３に記載したように行われる。
【0107】
さらなる態様において、本発明は、馬の虫刺され過敏症の治療の方法における使用のための、本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を提供し、有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物は、前記馬に投与され、前記コア粒子は、ＶＬＰ、好ましくは組換えＶＬＰであり、前記ＶＬＰは、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）の改変ＶＬＰであり、ＣＭＶの前記改変ＶＬＰは、少なくとも１つの改変ＣＭＶポリペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、あるいはそれからなり、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記少なくとも１つの抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９５％、及び好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１、配列番号２、配列番号５、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３８から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。本発明の再び非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。別の非常に好ましい実施形態において、前記改変ＣＭＶポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含み、好ましくはそれからなり、前記少なくとも１つの抗原は、馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質である。
【0108】
さらなる態様において、本発明の方法は、虫刺され過敏症の予防又は治療の方法であって、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬に有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0109】
さらなる態様において、本発明は、虫刺され過敏症の治療の方法であって、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬に有効量の前記本発明の組成物、前記本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は前記本発明の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0110】
さらなる態様において、本発明は、有効量の第１の組成物及び有効量の第２の組成物を含む免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供し、前記第１の組成物は、（ａ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第１のコア粒子；及び（ｂ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第１の抗原を含み、前記少なくとも１つの第１の抗原は馬科のインターロイキン－５抗原（ｅＩＬ－５抗原）であり、前記ｅＩＬ－５抗原は、配列番号１から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質であり；前記第２の組成物は、（ｃ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第２のコア粒子；及び（ｄ）少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第２の抗原を含み、前記少なくとも１つの第２の抗原は、馬科のエオタキシン抗原（ｅエオタキシン抗原）であり、前記ｅエオタキシン抗原は、配列番号６から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号６と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質であり；（ａ）及び（ｂ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合しており、（ｃ）及び（ｄ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合しており；必要に応じて、前記免疫原性組成物又はワクチン組成物は、さらにアジュバントを含む。
【0111】
好ましい実施形態において、前記免疫原性組成物又はワクチン組成物は、さらに第３の組成物を含み、前記第３の組成物は、（ｅ）少なくとも１つの第１の付着部位を有する第３コア粒子、及び（ｆ）前記少なくとも１つの第２の付着部位を有する少なくとも１つの第３の抗原を含み、前記少なくとも１つの第３の抗原は馬科のインターロイキン－３１抗原（ｅＩＬ－３１抗原）であり、前記ｅＩＬ－３１抗原は、配列番号１２から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、若しくは配列番号１２と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９２％、さらに好ましくは少なくとも９５％、及び再びさらに好ましくは少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は好ましくはそのようなタンパク質であり、（ｅ）及び（ｆ）は、少なくとも１つの非ペプチド共有結合により前記少なくとも１つの第１の付着部位及び前記少なくとも１つの第２の付着部位を介して結合している。
【0112】
さらなる態様において、本発明は、馬科の哺乳動物、好ましくは、馬の虫刺され過敏症の予防又は治療の方法における使用のための、本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物を提供し、有効量の前記組成物は、前記馬科の哺乳動物、好ましくは、前記馬に投与される。好ましい実施形態において、前記本発明の免疫原性組成物又はワクチン組成物の前記投与は、前記投与前の前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状と比較して、少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状を低減し、好ましくは、前記少なくとも１つのＩＢＨパラメータ又は症状は、皮膚病変のレベル又は重症度グレードであり、さらに好ましくは、皮膚病変の前記レベル又は重症度グレードの前記低下は、症状病変スコアリング試験によって決定される。
【0113】
さらなる態様において、本発明は、本発明の組成物、本発明の免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は本発明の医薬組成物を含む、虫刺され過敏症の予防又は治療のためのキット、並びに前記キットの使用のための取り扱い説明書を提供する。
【0114】
さらなる態様において、本発明は、ＩＢＨの治療の方法であって、馬科の哺乳動物、好ましくは馬に有効量の本発明の組成物、又は免疫原性組成物若しくはワクチン組成物、又は医薬組成物を投与することを含み、該有効量がＩＢＨの症状のうちの１以上を改善するのに十分である方法を提供する。
【0115】
実施例
実施例１
馬科のインターロイキン－５（ｅＩＬ－５）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌における封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－５（成熟インターロイキン－５、エクウス・カバルス；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ０２６９９）をコードするＤＮＡ配列及びその断片を、遺伝子合成により作製した。配列番号１、配列番号２及び配列番号３を作製した。配列番号１は、配列番号２に対応するが、配列番号２の最初のアミノ酸Ｌを欠き、配列番号３は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ０２６９９として同定された全長ｅＩＬ－５配列に対応する。
実施例１
馬科のインターロイキン－５（ｅＩＬ－５）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌における封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－５（成熟インターロイキン－５、エクウス・カバルス；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ０２６９９）をコードするＤＮＡ配列及びその断片を、遺伝子合成により作製した。配列番号１、配列番号２及び配列番号３を作製した。配列番号１は、配列番号２に対応するが、配列番号２の最初のアミノ酸Ｌを欠き、配列番号３は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ０２６９９として同定された全長ｅＩＬ－５配列に対応する。
【0116】
加えて、リンカー（ＧＧＣ）をＣ末端に加えた。このインサートは５’ＮｄｅＩ及び３’ＸｈｏＩに隣接しており、これを、インフレームで８個のＨｉｓ－タグ（精製を容易にする）及び終止コドンを含有するｐＥＴ４２ｂ（＋）に組み込んだ。この構築物を、ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－５（配列番号４）と名付けた。クローニング手順の忠実度を、ＤＮＡ配列決定により確認した。構築物ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－５（配列番号４）を大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換した。大腸菌で発現させた組換えタンパク質をｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号５）と呼ぶ。同様に、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７を調製し、これらの全てはシステイン残基を含むリンカー及びＨｉｓタグを含み、配列番号３５及び配列番号３６は、Ｃ末端にリンカー（ＧＧＣ）及びＨｉｓタグを含む。配列番号５、配列番号３５、配列番号３６及び配列番号３７は、本明細書では交換可能に「ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ」と命名する。さらに、この実施例の節及び記載する図の中でｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓについて言及する場合、これらのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ組換えタンパク質のうちの１つを様々な実施例で使用し、さらに２以上又は全てを繰り返し実験に使用した。配列番号５、配列番号３５及び配列番号３６は、非常に好ましく使用されるｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓである。ＢＬ２１－ＤＥ３細胞内でクローンｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ５－Ｃ－ＨｉｓからｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの大規模発現を行った。この目的のために、ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを保有するクローンＢＬ２１－ＤＥ３細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１８０ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。この培養液を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１０ＬのＬＢに接種した。この培養液を０．７の光学密度ＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１．０Ｍストックを１０ｍｌ添加することによって４時間発現を誘導した。組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、不溶性形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に位置づけた。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの発現を流動的に確認した。培養液を誘導後４時間の時点で採取し、４℃、４２００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘ（８００ｒｐｍ）を用いて、再懸濁緩衝液（４℃で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した（３ｍｌ／ｇの細胞）。再懸濁した細胞をファルコンチューブに収集し、液体窒素でショック凍結し、－２０℃で一晩保存した。再懸濁した細胞を室温で解凍し、細胞クラッカー又はダウンスホモジナイザー及び超音波処理器により細胞に穴をあけた（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ａ＝可溶化液、５０μｌ）。冷トリトン緩衝液（６０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、次いで６％（ｖ／ｖ）のトリトン－Ｘ－１００を添加した）の０．５容量を添加し、４℃で３０分間撹拌した。その後、可溶化液を４８００×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｂ＝可溶性画分、５０ｍｌ）。封入体をｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘで洗浄緩衝液（４℃で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４８０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。この洗浄工程を４回繰り返し、トリトン－ｘ １００を除去し、最後に封入体を－２０℃で保存した。封入体は、室温で解凍し、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘを使用して可溶化緩衝液（６ＭのＧｄｍＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、室温でｐＨ８の１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ）に再懸濁し、室温で１～２時間撹拌することにより可溶化した（２０ｍｌ／ｇの封入体）。可溶化した封入体を、平均で１０００００×ｇ、２０℃で２０分間、超遠心分離した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｃ＝可溶化ＩＢ、５０μｌ）。
【0117】
Ｂ．ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの精製及びリフォールディング
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用い、溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ４．５）により、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー（ＳＵｐｅｒｆｌｏｗ）、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグを介して精製した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｄ＝フロースルー ＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピーク ＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に対して、１０ｋＤａのカットオフ膜を用いて室温で２時間透析した。
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用い、溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ４．５）により、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー（ＳＵｐｅｒｆｌｏｗ）、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグを介して精製した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｄ＝フロースルー ＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピーク ＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に対して、１０ｋＤａのカットオフ膜を用いて室温で２時間透析した。
【0118】
不溶性ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、界面活性剤で洗浄した封入体から６Ｍのグアニジン塩酸塩で抽出した。異なる洗浄工程を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図１）：可溶化液（図１、レーン１）、可溶性画分（図１、レーン２）、可溶化封入体（図１、レーン３）。可溶化タンパク質を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図１、レーン４、フロースルー、レーン５、プールした溶出液の画分）。組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは、この手順によって高度に濃縮されることが分かった。天然タンパク質を、非還元条件下（ＳＤＳあり、ＤＴＴなし、試料の加熱なし）で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥ（図２）によって評価し（図２、レーン１）、主にモノマータンパク質が見つかった。変性タンパク質を、以下に記載のリフォールディング手順に供し、必要に応じてさらにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【0119】
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓをリフォールディングするために、該タンパク質を、以下の緩衝液により順次透析した：緩衝液１（２Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液２（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液３（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％グリセロール）、緩衝液４（ＰＢＳ）。必要に応じて、リフォールディングしたタンパク質を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液を用いてＨｉＬｏａｄ２６／６０スーパーデックス７５プレップグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９８９３－３４）上で精製した。溶出画分をプールし、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質濃度を、ＵＶ－ＶＩＳ又はブラッドフォードアッセイによって測定した。
【0120】
生物学的に活性のある天然のＩＬ－５はジスルフィド結合ホモダイマーであり、精製した組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓがリフォールディング後にダイマーを形成する能力を、非還元条件下で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した（図２、レーン２）。約２８ｋＤａの分子量によって判断されるように、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは、実質的にダイマーであることが実証され、天然の三次構造の保存が示された。
【0121】
Ｃ．組換えホモダイマーに富むｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの構造
正しい二次構造を確認するために、α－ヘリックス及びβ－シートを示す遠ＵＶによるＣＤ分光法により測定した（図３Ａ）。
正しい二次構造を確認するために、α－ヘリックス及びβ－シートを示す遠ＵＶによるＣＤ分光法により測定した（図３Ａ）。
【0122】
タンパク質の二次構造の他に、一次、三次及び四次構造を確認するために、質量分析（消化したｅＩＬ－５－Ｃ－ＨｉｓのＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳ、続いてＨＰＬＣ）を行った。典型的には、ＩＬ－５モノマーは、２つの分子間ジスルフィド結合によりホモダイマーとして結合し、２つのモノマーがヘッドトゥーテールで位置する。
【0123】
組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓへの市販の抗体結合能を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図３Ｂ）。マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、０．５ｍｇ／Ｌの抗Ｈｉｓ抗体５０μｌで一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％（ｖ／ｖ）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで３７℃で１時間、スーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、精製した組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（１０ｍｇ／Ｌ）を添加し、１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ｅＩＬ－５抗体（馬科ＩＬ－５アフィニティー精製ポリクローナル抗体、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＫ、カタログ番号ＡＦ２４７０）を１／３希釈で４μｇ／ｍｌからダウンタイトレーションし、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ（希釈１：２０００）と結合させた二次抗ヤギＩｇＧと、室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の２分後に、ウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。
【0124】
組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓの適切なリフォールディングを円偏光二色性（ＣＤ）分光法によって測定し、予想されるように、大部分はαヘリックスであるがβシートも見出し得た（図３Ａ）。２つの分子間ジスルフィド架橋による２つのモノマーの結合を、さらにＭＡＬＤＩ／ＭＳ／ＭＳによって確認した。質量２５０５、２６３３、及び２７６１ｍ／ｚのＭＳＭＳ画分は、典型的なジスルフィドフラグメントパターン３２／２／３２を示す。Ｃｙｓ４４は、Ｃｙｓ８６に分子間結合するので（スペクトルは図示せず）、２つのモノマーは２つのジスルフィド架橋を介して結合する。さらに、リフォールディングした馬科ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓは、ＥＬＩＳＡで市販の抗馬科ＩＬ－５抗体によって検出可能であった（図３Ｂ）。
【0125】
実施例２
馬科のエオタキシン（ｅエオタキシン）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌内での封入体としての発現
成熟ｅエオタキシンをコードするＤＮＡ配列（成熟エオタキシン、エクウス・カバルス；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＴＴＱ４）及びその断片を、遺伝子合成により作製した。配列番号６、配列番号７及び配列番号８を作製した。配列番号６は配列番号７に対応するが、配列番号７の最初のアミノ酸Ｑを欠き、配列番号８は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＴＴＱ４として同定された全長ｅエオタキシン配列に対応する。
馬科のエオタキシン（ｅエオタキシン）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌内での封入体としての発現
成熟ｅエオタキシンをコードするＤＮＡ配列（成熟エオタキシン、エクウス・カバルス；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＴＴＱ４）及びその断片を、遺伝子合成により作製した。配列番号６、配列番号７及び配列番号８を作製した。配列番号６は配列番号７に対応するが、配列番号７の最初のアミノ酸Ｑを欠き、配列番号８は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＴＴＱ４として同定された全長ｅエオタキシン配列に対応する。
【0126】
加えて、リンカー（ＧＧＣ）をＣ末端に加えた。このインサートは、５’ＮｄｅＩ及び３’ＸｈｏＩに隣接しており、これを、インフレームで８個のＨｉｓ－タグ（精製を容易にする）及び終止コドンを含有するｐＥＴ４２ｂ（＋）に組み込んだ。この構築物を、ｐＥＴ４２ｂ－ｅエオタキシン（配列番号９）と名付けた。クローニング手順の忠実度を、ＤＮＡ配列決定により確認した。構築物ｐＥＴ４２ｂ－ｅエオタキシン（配列番号９）を大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換した。大腸菌で発現させた組換えタンパク質をｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号１０）と呼ぶ。
【0127】
ＢＬ２１－ＤＥ３細胞内でクローンｐＥＴ４２ｂ－ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓからｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓの大規模発現を行った。この目的のために、ｐＥＴ４２ｂ－ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを保有するクローンＢＬ２１－ＤＥ３細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１８０ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。この培養液を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１０ＬのＬＢに接種した。この培養液を０．７の光学密度ＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１．０Ｍストックを１０ｍｌ添加することによって４時間発現を誘導した。組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、不溶性形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に位置づけた。ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓの発現を流動的に確認した。培養液を誘導後４時間の時点で採取し、４℃、４２００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘ（８００ｒｐｍ）を用いて、再懸濁緩衝液（４℃で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した（３ｍｌ／ｇの細胞）。再懸濁した細胞をファルコンチューブに収集し、液体窒素でショック凍結し、－２０℃で一晩保存した。再懸濁した細胞を室温で解凍し、細胞クラッカー又はダウンスホモジナイザー及び超音波処理器により細胞に穴をあけた（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ａ＝可溶化液、５０μｌ）。冷トリトン緩衝液の０．５容量（６０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、次いで６％（ｖ／ｖ）のトリトン－Ｘ－１００を添加した）を添加し、４℃で３０分間撹拌した。その後、可溶化液を４８００×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｂ＝可溶性画分、５０ｍｌ）。封入体をｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘで洗浄緩衝液（４℃の１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４８０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。この洗浄工程を４回繰り返し、トリトン－ｘ １００を除去し、最後に封入体を－２０℃で保存した。封入体は、室温で解凍し、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘを使用して可溶化緩衝液（６ＭのＧｄｍＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、室温でｐＨ８の１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ）に再懸濁し、室温で１～２時間撹拌することにより可溶化した（２０ｍｌ／ｇの封入体）。可溶化した封入体を、平均で１０００００×ｇ、２０℃で２０分間、超遠心分離した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｃ＝可溶化ＩＢ、５０μｌ）。
【0128】
Ｂ．ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓの精製及びリフォールディング
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用い、溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ４．５）により、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグを介して精製した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｄ＝フロースルー ＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピーク ＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に対して、１０ｋＤａのカットオフ膜を用いて室温で２時間透析した。タンパク質を、５０μｇ／ｍｌのリフォールディング緩衝液（０．１ＭのトリスＨＣｌ、４℃でｐＨ８．０、１ｍＭの酸化グルタチオン、０．１ｍＭの還元グルタチオン）で、４℃で１２時間、急速希釈によってリフォールディングした。リフォールディングしたタンパク質を、さらにクロスフローを用いて濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＶｉｖａＦｌｏｗ ２００、５ｋＤａカットオフ）。必要に応じて、リフォールディングしたタンパク質を遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、３ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液で、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０スーパーデックス７５プレップグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９８９３－３４）上で精製した。タンパク質濃度を、ＵＶ－ＶＩＳ又はブラッドフォードアッセイによって測定した。
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用い、溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ４．５）により、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグを介して精製した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｄ＝フロースルー ＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピーク ＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に対して、１０ｋＤａのカットオフ膜を用いて室温で２時間透析した。タンパク質を、５０μｇ／ｍｌのリフォールディング緩衝液（０．１ＭのトリスＨＣｌ、４℃でｐＨ８．０、１ｍＭの酸化グルタチオン、０．１ｍＭの還元グルタチオン）で、４℃で１２時間、急速希釈によってリフォールディングした。リフォールディングしたタンパク質を、さらにクロスフローを用いて濃縮し、緩衝液をＰＢＳに交換した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＶｉｖａＦｌｏｗ ２００、５ｋＤａカットオフ）。必要に応じて、リフォールディングしたタンパク質を遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、３ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液で、ＨｉＬｏａｄ ２６／６０スーパーデックス７５プレップグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９８９３－３４）上で精製した。タンパク質濃度を、ＵＶ－ＶＩＳ又はブラッドフォードアッセイによって測定した。
【0129】
不溶性ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、界面活性剤で洗浄した封入体から６Ｍのグアニジン塩酸塩で抽出した。異なる洗浄工程を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図４）：可溶化液（図４、レーン１）、可溶性画分（図４、レーン２）。封入体から可溶化タンパク質を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、リフォールディングして、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図４、レーン３、フロースルー、レーン４、リフォールディングしたカラム溶出液のプールした画分）。組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓは、この手順によって高度に濃縮されることが分かり、主にモノマー形態が見つかった。必要に応じて、さらにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【0130】
Ｃ．リフォールディングした組換え馬科のエオタキシンの構造
組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓへの市販の抗体結合能を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図５）。試験ウェル：マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１０ｍｇ／Ｌのｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ又は市販の馬科ＣＣＬ－１１タンパク質（組換え馬科ＣＣＬ－１１、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号ＲＰ００６６Ｅ）５０μｌで一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％（ｖ／ｖ）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、室温で２時間、スーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ＣＣＬ－１１抗体（馬科ＣＣＬ－１１に対する反応性を有する抗ＣＣＬ－１１ポリクローナル抗体、Ａｖｉｖａ、カタログ番号ＡＲＰ３０８６５＿Ｐ０５０）を１／３希釈で４μｇ／ｍｌからダウンタイトレーションし、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ（希釈１：２０００）と結合させた二次抗ウサギＩｇＧと、室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の２分後に、ウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。ｅエオタキシンの適切なリフォールディングを、ＥＬＩＳＡにより確認した。リフォールディングした馬科のｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓは、馬科ＣＣＬ１１に反応性を有する市販の抗ＣＣＬ－１１抗体により検出可能であった（図５）。
組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓへの市販の抗体結合能を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図５）。試験ウェル：マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１０ｍｇ／Ｌのｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ又は市販の馬科ＣＣＬ－１１タンパク質（組換え馬科ＣＣＬ－１１、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、カタログ番号ＲＰ００６６Ｅ）５０μｌで一晩コーティングした。プレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ０．１％（ｖ／ｖ）（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、次いで、室温で２時間、スーパーブロック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、抗ＣＣＬ－１１抗体（馬科ＣＣＬ－１１に対する反応性を有する抗ＣＣＬ－１１ポリクローナル抗体、Ａｖｉｖａ、カタログ番号ＡＲＰ３０８６５＿Ｐ０５０）を１／３希釈で４μｇ／ｍｌからダウンタイトレーションし、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ（希釈１：２０００）と結合させた二次抗ウサギＩｇＧと、室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を添加した。室温での反応の２分後に、ウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４でＥＬＩＳＡを停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。ｅエオタキシンの適切なリフォールディングを、ＥＬＩＳＡにより確認した。リフォールディングした馬科のｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓは、馬科ＣＣＬ１１に反応性を有する市販の抗ＣＣＬ－１１抗体により検出可能であった（図５）。
【0131】
実施例３
馬科ＩＬ－３１（ｅＩＬ－３１）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌内での封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－３１（成熟エオタキシン、エクウス・カバルス；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｆ７ＡＨＧ９）（配列番号１１）及びその断片（配列番号１２）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子合成により作製した。
馬科ＩＬ－３１（ｅＩＬ－３１）のクローニング、発現及び精製
Ａ．ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのクローニング及び大腸菌内での封入体としての発現
成熟ｅＩＬ－３１（成熟エオタキシン、エクウス・カバルス；ＵｎｉＰｒｏｔ Ｆ７ＡＨＧ９）（配列番号１１）及びその断片（配列番号１２）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子合成により作製した。
【0132】
加えて、リンカー（ＧＧＣ）をＣ末端に加えた。このインサートは、５’ＮｄｅＩ及び３’ＸｈｏＩに隣接しており、これを、インフレームで８個のＨｉｓ－タグ（精製を容易にする）及び終止コドンを含有するｐＥＴ４２ｂ（＋）に組み込んだ。この構築物を、ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－３１（配列番号１３）と名付けた。クローニング手順の忠実度を、ＤＮＡ配列決定により確認した。構築物ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ－３１（配列番号１３）を大腸菌株ＢＬ２１－ＤＥ３に形質転換した。大腸菌で発現させた組換えタンパク質をｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（配列番号１４）と呼ぶ。
【0133】
ＢＬ２１－ＤＥ３細胞内でクローンｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ３１－Ｃ－ＨｉｓからｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの大規模発現を行った。この目的のために、ｐＥＴ４２ｂ－ｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓを保有するクローンＢＬ２１－ＤＥ３細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１８０ｍｌのＬＢ中で一晩増殖させた。この培養液を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有する１０ＬのＬＢに接種した。この培養液を０．７の光学密度ＯＤ６００ｎｍまで増殖させ、イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の１．０Ｍストックを１０ｍｌ添加することによって４時間発現を誘導した。組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、不溶性形態で発現させ、誘導細胞の封入体画分に位置づけた。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの発現を流動的に確認した。培養液を誘導後４時間の時点で採取し、４℃、４２００×ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘ（８００ｒｐｍ）を用いて、再懸濁緩衝液（４℃で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁した（３ｍｌ／ｇの細胞）。再懸濁した細胞をファルコンチューブに収集し、液体窒素でショック凍結し、－２０℃で一晩保存した。再懸濁した細胞を室温で解凍し、細胞クラッカー又はダウンスホモジナイザー及び超音波処理器により細胞に穴をあけた（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ａ＝可溶化液、５０μｌ）。冷トリトン緩衝液の０．５容量（６０ｍＭのＥＤＴＡ、１．５ＭのＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整し、次いで６％（ｖ／ｖ）のトリトン－Ｘ－１００を添加した）を添加し、４℃で３０分間撹拌した。その後、可溶化液を４８００×ｇで、４℃で３０分間遠心分離した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｂ＝可溶性画分、５０ｍｌ）。封入体をｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘで洗浄緩衝液（４℃で１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ ｐＨ８．０、２０ｍＭのＥＤＴＡ）に再懸濁し、４８０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。この洗浄工程を４回繰り返し、トリトン－ｘ １００を除去し、最後に封入体を－２０℃で保存した。封入体は、室温で解凍し、ｕｌｔｒａｔｕｒｅｘを使用して可溶化緩衝液（６ＭのＧｄｍＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、室温でｐＨ８の１００ｍＭのトリス－ＨＣｌ）に再懸濁し、室温で１～２時間撹拌することにより可溶化した（２０ｍｌ／ｇの封入体）。可溶化した封入体を、平均で１０００００×ｇ、２０℃で２０分間、超遠心分離した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｃ＝可溶化ＩＢ、５０μｌ）。
【0134】
Ｂ．ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの精製及びリフォールディング
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用い、溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ４．５）により、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグを介して精製した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｄ＝フロースルー ＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピーク ＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に対して、８ｋＤａのカットオフ膜を用いて室温で２時間透析した。
該タンパク質を、結合緩衝液Ａとして可溶化緩衝液を用い、溶出には緩衝液Ｂ（６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ４．５）により、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ－ＮＴＡセファロース６ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ、カタログ番号１７－５３１８－０１又はＮｉ－ＮＴＡセファローススーパーフロー、Ｑｕｉａｇｅｎ、カタログ番号１０１８１４２）カラムによってＨｉｓタグを介して精製した（ゲル分析のための５０μｌ試料：試料Ｄ＝フロースルー ＮｉＮＴＡ；５０μｌ、試料Ｅ＝ピーク ＮｉＮＴＡ ５０μｌ）。精製をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを含有する溶出工程からの画分をプールし、６ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０に対して、８ｋＤａのカットオフ膜を用いて室温で２時間透析した。
【0135】
不溶性ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、界面活性剤で洗浄した封入体から６Ｍのグアニジン塩酸塩で抽出した。異なる洗浄工程を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図６）：可溶化液（図６、レーン１）、可溶性画分（図６、レーン２）、可溶化封入体（図６、レーン３）。可溶化タンパク質を金属キレートアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した（図６、レーン４、プールした溶出液の画分）。組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓは、この手順によって高度に濃縮されることが分かった。天然タンパク質を、非還元条件下で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価し（図７、レーン１）、主にモノマータンパク質が見つかった。変性タンパク質を、以下に記載のリフォールディング手順に供し、必要に応じてさらにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。
【0136】
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓをリフォールディングするために、該タンパク質を、以下の緩衝液により順次透析した：緩衝液１（２Ｍの尿素、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液２（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭの還元グルタチオン、０．５ｍＭの酸化グルタチオン、０．５Ｍのアルギニン、１０％グリセロール）、緩衝液３（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％グリセロール）、緩衝液４（ＰＢＳ）。必要に応じて、リフォールディングしたタンパク質を、遠心フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－１５ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、ＰＢＳ緩衝液を用いてＨｉＬｏａｄ２６／６０スーパーデックス７５プレップグレード（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２８－９８９３－３４）上で精製した。溶出画分をプールし、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳあり、ＤＴＴなし、試料の加熱なし）により分析した。タンパク質濃度を、ＵＶ－ＶＩＳ又はブラッドフォードアッセイによって測定した。
【0137】
精製した組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓがリフォールディング後にダイマーを形成する能力を、非還元条件下で行うＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した（図７、レーン２）。約３３ｋＤａの分子量によって判断されるように、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓは、部分的にダイマー構造で存在することが実証された。
【0138】
Ｃ．リフォールディングした組換え馬科ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの生物学的活性
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを馬の首に皮下注射した。かゆみを、注射部位（首）における５秒以上のかゆみとして定義した。毎時スクラッチ／かゆみの数を、注射の１時間後から開始して合計５時間計数した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの注射後のかゆみを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ対照の注射と比較した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓについて、対照よりも増加したかゆみの数を記録した（図８）。
ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを馬の首に皮下注射した。かゆみを、注射部位（首）における５秒以上のかゆみとして定義した。毎時スクラッチ／かゆみの数を、注射の１時間後から開始して合計５時間計数した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの注射後のかゆみを、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ対照の注射と比較した。ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓについて、対照よりも増加したかゆみの数を記録した（図８）。
【0139】
実施例４
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の単離及びクローニング
ＣＭＶが感染したユリの葉から総ＲＮＡを、メーカーの指示に従ってＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）を用いて単離した。ｃＤＮＡ合成のために、ワン工程ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヴェンロー、オランダ）を使用した。ＣＭＶ ＣＰ遺伝子の増幅のために、プライマー配列を、ＧｅｎＢａｎｋからのＣＭＶ配列の分析後に選択した：ＣＭｃｐＦ（ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴ）（配列番号２２）及びＣＭｃｐＲ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡ（配列番号２３）；ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いている。対応するＰＣＲ産物を、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ビリニュス、リトアニア）にクローニングした。大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を、クローニング及びプラスミド増幅のための宿主として使用した。ＰＣＲエラーを含有するクローンの選択を回避するために、いくつかのＣＰ遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンをＢｉｇＤｙｅサイクルシーケンシングキット及びＡＢＩプリズム３１００ジェネティックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カールズバッド、米国）を用いて配列決定した。次いで、配列決定後に、配列エラーのない、配列番号１５のＣＭＶコートタンパク質をコードするＣＭＶ ＣＰ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号２４）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、サンディエゴ、米国）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングして、発現プラスミドｐＥＴ－ＣＭＶｗｔを得た（図９）。
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のコートタンパク質（ＣＰ）の単離及びクローニング
ＣＭＶが感染したユリの葉から総ＲＮＡを、メーカーの指示に従ってＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）を用いて単離した。ｃＤＮＡ合成のために、ワン工程ＲＴ－ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヴェンロー、オランダ）を使用した。ＣＭＶ ＣＰ遺伝子の増幅のために、プライマー配列を、ＧｅｎＢａｎｋからのＣＭＶ配列の分析後に選択した：ＣＭｃｐＦ（ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＣＴＧＡＡＴＣＡＡＣＣＡＧＴＧＣＴＧＧＴ）（配列番号２２）及びＣＭｃｐＲ（ＣＡＡＡＧＣＴＴＡＴＣＡＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＣＣＣＡＧＡＴＧＴＧＧＧＡ（配列番号２３）；ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位に下線を引いている。対応するＰＣＲ産物を、ｐＴＺ５７Ｒ／Ｔベクター（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ビリニュス、リトアニア）にクローニングした。大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を、クローニング及びプラスミド増幅のための宿主として使用した。ＰＣＲエラーを含有するクローンの選択を回避するために、いくつかのＣＰ遺伝子含有ｐＴＺ５７プラスミドクローンをＢｉｇＤｙｅサイクルシーケンシングキット及びＡＢＩプリズム３１００ジェネティックアナライザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カールズバッド、米国）を用いて配列決定した。次いで、配列決定後に、配列エラーのない、配列番号１５のＣＭＶコートタンパク質をコードするＣＭＶ ＣＰ遺伝子のｃＤＮＡ（配列番号２４）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、サンディエゴ、米国）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングして、発現プラスミドｐＥＴ－ＣＭＶｗｔを得た（図９）。
【0140】
実施例５
ＣＭＶのＶＬＰをもたらす大腸菌内での配列番号１５のＣＰの発現
ＣＭＶ ＶＬＰを取得するために、大腸菌Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、米国）を、ＣＭＶ ＣＰ遺伝子含有プラスミドｐＥＴ－ＣＭＶｗｔで形質転換した。標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、大腸菌培養液を、３０℃でロータリーシェーカー（２００回転／分；Ｉｎｆｏｒｓ、ボットミンゲン、スイス）で、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２×ＴＹ培地中で、０．８～１．０のＯＤ６００まで増殖させた。次いで、細胞を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、培地に５ｍＭのＭｇＣｌ２を補充した。インキュベーションを、１８時間２０℃で、ロータリーシェーカー上で継続した。得られたバイオマスを、低速遠心分離によって収集し、－２０℃で凍結した。氷上で解凍した後、細胞を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのメルカプトエタノールを含有する緩衝液（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）に懸濁し、超音波処理により破砕した。不溶性タンパク質及び細胞破片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により除去した。清澄化可溶化液中の可溶性ＣＭＶ ＣＰタンパク質を、飽和硫酸アンモニウム（１：１、容量／容量）を用いて＋４℃で一晩ペレット化した。沈殿したタンパク質を、＋４℃で４時間、同じ緩衝液Ａ（メルカプトエタノールを含まない）で可溶化した。不溶性タンパク質を、低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）によって除去した。可溶性ＣＭＶ ＣＰ含有タンパク質溶液を、ショ糖勾配（メルカプトエタノールを含まず、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を補った緩衝液Ａ中２０～６０％のショ糖）で超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により細胞タンパク質から分離した。勾配の底部から始めて、勾配を６画分に分割し、それらの画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（データは示さず）。組換えＣＭＶ ＣＰを含有する画分２及び画分３を合わせ、緩衝液（５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）の２００容量に対して透析し、ショ糖及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を除去した。透析後、ＣＭＶ ＣＰ溶液を０．２μのフィルターを通して濾過滅菌した。次に、ＣＭＶ ＣＰを、無菌条件下で２０％ショ糖「クッション」を介してタイプ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国）超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ、４時間、＋５℃）を用いて濃縮した。精製ＣＭＶｗｔの濃度を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、米国）の推奨に従って、ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を用いて推定した。濃縮したＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、緩衝液（ｐＨ９．０）中で、＋４℃で保存した。ＶＬＰの発現及び精製に関わる全ての工程を、１２．５％のゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより監視した。
ＣＭＶのＶＬＰをもたらす大腸菌内での配列番号１５のＣＰの発現
ＣＭＶ ＶＬＰを取得するために、大腸菌Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、米国）を、ＣＭＶ ＣＰ遺伝子含有プラスミドｐＥＴ－ＣＭＶｗｔで形質転換した。標的タンパク質の発現レベルが最も高いクローンを選択した後、大腸菌培養液を、３０℃でロータリーシェーカー（２００回転／分；Ｉｎｆｏｒｓ、ボットミンゲン、スイス）で、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する２×ＴＹ培地中で、０．８～１．０のＯＤ６００まで増殖させた。次いで、細胞を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、培地に５ｍＭのＭｇＣｌ２を補充した。インキュベーションを、１８時間２０℃で、ロータリーシェーカー上で継続した。得られたバイオマスを、低速遠心分離によって収集し、－２０℃で凍結した。氷上で解凍した後、細胞を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのメルカプトエタノールを含有する緩衝液（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）に懸濁し、超音波処理により破砕した。不溶性タンパク質及び細胞破片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により除去した。清澄化可溶化液中の可溶性ＣＭＶ ＣＰタンパク質を、飽和硫酸アンモニウム（１：１、容量／容量）を用いて＋４℃で一晩ペレット化した。沈殿したタンパク質を、＋４℃で４時間、同じ緩衝液Ａ（メルカプトエタノールを含まない）で可溶化した。不溶性タンパク質を、低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）によって除去した。可溶性ＣＭＶ ＣＰ含有タンパク質溶液を、ショ糖勾配（メルカプトエタノールを含まず、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を補った緩衝液Ａ中２０～６０％のショ糖）で超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により細胞タンパク質から分離した。勾配の底部から始めて、勾配を６画分に分割し、それらの画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析した（データは示さず）。組換えＣＭＶ ＣＰを含有する画分２及び画分３を合わせ、緩衝液（５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ９．０）の２００容量に対して透析し、ショ糖及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を除去した。透析後、ＣＭＶ ＣＰ溶液を０．２μのフィルターを通して濾過滅菌した。次に、ＣＭＶ ＣＰを、無菌条件下で２０％ショ糖「クッション」を介してタイプ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国）超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ、４時間、＋５℃）を用いて濃縮した。精製ＣＭＶｗｔの濃度を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、米国）の推奨に従って、ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を用いて推定した。濃縮したＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、緩衝液（ｐＨ９．０）中で、＋４℃で保存した。ＶＬＰの発現及び精製に関わる全ての工程を、１２．５％のゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより監視した。
【0141】
ＣＭＶコートタンパク質は、首尾よく大腸菌細胞内で発現させることができ、得られた主要部分は、可溶性画分内に存在し得た。また、これらのタンパク質は、ショ糖勾配分析（図１０Ａ）、動的光散乱及び電子顕微鏡分析（図１０Ｂ）によって実証されるように、大腸菌細胞抽出物中で等尺ＶＬＰの形態で直接見られる。
【0142】
実施例６
破傷風トキソイドエピトープを含有するＣＭＶの改変コートタンパク質のクローニング（ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０）
破傷風トキソイドエピトープコード配列と配列番号１５のＣＭＶ ＣＰのＮ末端の元のアミノ酸を置換するために、ｐＥＴ－ＣＭＶｗｔプラスミドをＰＣＲ増幅及び変異誘発のために使用した。ＣＭＶｗｔ遺伝子（図９）内に位置するＳａｌＩ部位は、対応するＰＣＲ産物をクローニングするために使用した。
破傷風トキソイドエピトープを含有するＣＭＶの改変コートタンパク質のクローニング（ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０）
破傷風トキソイドエピトープコード配列と配列番号１５のＣＭＶ ＣＰのＮ末端の元のアミノ酸を置換するために、ｐＥＴ－ＣＭＶｗｔプラスミドをＰＣＲ増幅及び変異誘発のために使用した。ＣＭＶｗｔ遺伝子（図９）内に位置するＳａｌＩ部位は、対応するＰＣＲ産物をクローニングするために使用した。
【0143】
ＣＭＶｗｔ遺伝子に破傷風トキソイドエピトープコード配列を導入するために、２段階ＰＣＲ変異誘発を使用した。第１段階の増幅については、以下のプライマーを使用した：ｐＥＴ－２２０（配列番号２５）－ポリリンカーから上流、増幅領域は（ＢｇｌＩＩ部位）及びＣＭＶ－ｔｔ８３－１Ｒ（配列番号２６）を含む。第２ラウンドについては、第１の増幅からのＰＣＲ産物を１：５０希釈し、プライマーｐＥＴ－２２０（配列番号２５）及びＣＭＶ－ｔｔ８３Ｓａｌ－Ｒ２（配列番号２７）で再増幅した。得られたＰＣＲ産物（配列番号２０のＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０をコードする配列番号２８のｃＤＮＡ）を、ｐＥＴ－ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａＬＩ部位にサブクローニングした。正しいクローンを配列決定により同定し、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０と命名した。
【0144】
実施例７
ＣＭＶの改変ＶＬＰをもたらす大腸菌内でのＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の発現
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを得るために、大腸菌Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、米国）をＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子含有プラスミドｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０で形質転換した。最も高い発現レベルの標的タンパク質を有するクローンを選択した後、３０℃で、０．８～１．０のＯＤ６００まで、大腸菌培養液をロータリーシェーカー（２００回転／分；Ｉｎｆｏｒｓ、ボットミンゲン、スイス）で、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有２×ＴＹ培地中で増殖させた。次に、細胞を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、培地に５ｍＭのＭｇＣｌ２を補った。インキュベーションを、２０℃で１８時間、ロータリーシェーカー上で継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離によって収集し、－２０℃で凍結した。氷上で解凍した後、細胞を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのメルカプトエタノール（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）を含有する緩衝液に懸濁し、超音波処理により破砕した。不溶性タンパク質及び細胞破片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により除去した。清澄化可溶化液中の可溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を、飽和硫酸アンモニウム（１：１、容量／容量）を用いて＋４℃で一晩ペレット化した。沈殿したタンパク質を、＋４℃で４時間、（メルカプトエタノールを含まない）緩衝液Ａ中で可溶化した。不溶性タンパク質を、低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）によって除去した。可溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０含有タンパク質溶液を、ショ糖勾配（メルカプトエタノールを含まず、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を補った緩衝液Ａ中２０～６０％のショ糖）で、超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により細胞タンパク質から分離した。勾配は、勾配の底部から始めて、６分画に分けた。組換えＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含有する画分を合わせ、ショ糖及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を除去するために、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）の２００容量に対して透析した。透析後、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０溶液を０．２μフィルターで濾過滅菌した。次に、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を、無菌条件下で２０％ショ糖「クッション」を介してタイプ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国）超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ、４時間、＋５℃）を用いて濃縮した。精製されたＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の濃度を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、米国）の推奨に従って、ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を用いて推定した。濃縮ＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、緩衝液（ｐＨ９．０）中で＋４℃で保存した。ＶＬＰの発現及び精製に関わる全ての工程を、１２．５％のゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより監視した。ＣＭＶ ＶＬＰにおける破傷風トキソイドエピトープの存在を実証するために、精製したＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの質量分析を用いた。図１１Ｃに示すように、得られた主要なピークは、大腸菌細胞内でのタンパク質合成の間に生じる最初のメチオニンが除去された場合の、タンパク質の理論分子質量に対応する。動的光散乱及び電子顕微鏡により、ＣＭＶｗｔ ＶＬＰに似た等尺粒子形態が確認された（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
ＣＭＶの改変ＶＬＰをもたらす大腸菌内でのＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の発現
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを得るために、大腸菌Ｃ２５６６細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、イプスウィッチ、米国）をＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０遺伝子含有プラスミドｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０で形質転換した。最も高い発現レベルの標的タンパク質を有するクローンを選択した後、３０℃で、０．８～１．０のＯＤ６００まで、大腸菌培養液をロータリーシェーカー（２００回転／分；Ｉｎｆｏｒｓ、ボットミンゲン、スイス）で、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有２×ＴＹ培地中で増殖させた。次に、細胞を０．２ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、培地に５ｍＭのＭｇＣｌ２を補った。インキュベーションを、２０℃で１８時間、ロータリーシェーカー上で継続した。得られたバイオマスを低速遠心分離によって収集し、－２０℃で凍結した。氷上で解凍した後、細胞を、５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのメルカプトエタノール（ｐＨ９．０、緩衝液Ａ）を含有する緩衝液に懸濁し、超音波処理により破砕した。不溶性タンパク質及び細胞破片を遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、５℃で３０分間）により除去した。清澄化可溶化液中の可溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０タンパク質を、飽和硫酸アンモニウム（１：１、容量／容量）を用いて＋４℃で一晩ペレット化した。沈殿したタンパク質を、＋４℃で４時間、（メルカプトエタノールを含まない）緩衝液Ａ中で可溶化した。不溶性タンパク質を、低速遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間）によって除去した。可溶性ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０含有タンパク質溶液を、ショ糖勾配（メルカプトエタノールを含まず、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を補った緩衝液Ａ中２０～６０％のショ糖）で、超遠心分離（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国；２５，０００ｒｐｍ、６時間、５℃）により細胞タンパク質から分離した。勾配は、勾配の底部から始めて、６分画に分けた。組換えＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を含有する画分を合わせ、ショ糖及びＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を除去するために、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）の２００容量に対して透析した。透析後、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０溶液を０．２μフィルターで濾過滅菌した。次に、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０を、無菌条件下で２０％ショ糖「クッション」を介してタイプ７０ローター（Ｂｅｃｋｍａｎ、パロアルト、米国）超遠心分離（５０，０００ｒｐｍ、４時間、＋５℃）を用いて濃縮した。精製されたＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の濃度を、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ユージーン、米国）の推奨に従って、ＱｕＢｉｔ蛍光光度計を用いて推定した。濃縮ＶＬＰ溶液（約３ｍｇ／ｍｌ）を、５ｍＭのホウ酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、緩衝液（ｐＨ９．０）中で＋４℃で保存した。ＶＬＰの発現及び精製に関わる全ての工程を、１２．５％のゲルを用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥにより監視した。ＣＭＶ ＶＬＰにおける破傷風トキソイドエピトープの存在を実証するために、精製したＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰの質量分析を用いた。図１１Ｃに示すように、得られた主要なピークは、大腸菌細胞内でのタンパク質合成の間に生じる最初のメチオニンが除去された場合の、タンパク質の理論分子質量に対応する。動的光散乱及び電子顕微鏡により、ＣＭＶｗｔ ＶＬＰに似た等尺粒子形態が確認された（図１２Ａ及び１２Ｂ）。
【0145】
実施例８
ＰＡＤＲＥエピトープを含有するＣＭＶの改変コートタンパク質のクローニング（ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ）
ＣＭＶｗｔ遺伝子にＰＡＤＲＥエピトープコード配列を導入するために、ｐＥＴ－ＣＭＶｗｔプラスミドの増幅及びサブクローニングのための鋳型として用いてＰＣＲ変異誘発を行った（実施例５及び６も参照されたい）。増幅のために以下のプライマーを使用した：ｐＥＴ－２２０（配列番号２５）及びＣＭＶ－ｐａｄｒＳａｌ－Ｒ（配列番号２９）。得られたＰＣＲ産物（配列番号２１のＣＭＶ－Ｎｐａｄｒをコードする配列番号３０のｃＤＮＡ）を、再びｐＥＴ－ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位にサブクローニングした。正しいクローンを配列決定により同定し、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒと命名した。
ＰＡＤＲＥエピトープを含有するＣＭＶの改変コートタンパク質のクローニング（ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ）
ＣＭＶｗｔ遺伝子にＰＡＤＲＥエピトープコード配列を導入するために、ｐＥＴ－ＣＭＶｗｔプラスミドの増幅及びサブクローニングのための鋳型として用いてＰＣＲ変異誘発を行った（実施例５及び６も参照されたい）。増幅のために以下のプライマーを使用した：ｐＥＴ－２２０（配列番号２５）及びＣＭＶ－ｐａｄｒＳａｌ－Ｒ（配列番号２９）。得られたＰＣＲ産物（配列番号２１のＣＭＶ－Ｎｐａｄｒをコードする配列番号３０のｃＤＮＡ）を、再びｐＥＴ－ＣＭＶｗｔのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ部位にサブクローニングした。正しいクローンを配列決定により同定し、ｐＥＴ－ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒと命名した。
【0146】
実施例９
ＣＭＶの改変ＶＬＰをもたらす大腸菌内でのＣＭＶ－Ｎｐａｄｒの発現
ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒの発現及び精製のための手順は、基本的にＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０と同じであり、実施例７に記載されている。ＣＭＶ ＶＬＰにおけるＰＡＤＲＥエピトープの存在を実証するために、精製したＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの質量分析を用いた。図１１Ｂに示すように、得られた主要なピークは、最初のメチオニンが除去された場合の、大腸菌細胞内でのタンパク質合成中に生じるタンパク質の理論分子質量に対応する。動的光散乱及び電子顕微鏡分析により、等尺粒子形態が確認された（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
ＣＭＶの改変ＶＬＰをもたらす大腸菌内でのＣＭＶ－Ｎｐａｄｒの発現
ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒの発現及び精製のための手順は、基本的にＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０と同じであり、実施例７に記載されている。ＣＭＶ ＶＬＰにおけるＰＡＤＲＥエピトープの存在を実証するために、精製したＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰの質量分析を用いた。図１１Ｂに示すように、得られた主要なピークは、最初のメチオニンが除去された場合の、大腸菌細胞内でのタンパク質合成中に生じるタンパク質の理論分子質量に対応する。動的光散乱及び電子顕微鏡分析により、等尺粒子形態が確認された（図１３Ａ及び１３Ｂ）。
【0147】
実施例１０
異なるＶＬＰに対するｅＩＬ－５抗原のカップリング、馬の免疫化及びＩＢＨにかかりやすい馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号３１のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、１：２のＱβモノマー：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
異なるＶＬＰに対するｅＩＬ－５抗原のカップリング、馬の免疫化及びＩＢＨにかかりやすい馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号３１のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、１：２のＱβモノマー：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
【0148】
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色（図１４Ａ）：Ｑβ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクーマシー－ブルー（０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染剤（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱色した。
【0149】
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット染色（図１４Ｂ）：Ｑβ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ及びＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ粉末を用いて１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）粉末中の１：８００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（８個のＨｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、マウスモノクローナルＩｇＧ１、カタログ番号３４６６０）１０ｍｌとインキュベートした。膜を１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１：１０，０００希釈で、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）１０ｍｌと１時間インキュベートした。膜をＰＢＳで１５分間洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて発色させ、写真フィルムに感光した。
【0150】
ウイルス様粒子ＱβへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓの共有化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクーマシーブルー染色ゲルにより、Ｑβと共有結合した馬科ＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓについて予想されるものに対応する分子量バンドの出現が実証された（図１４Ａ）。さらに、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合に、ウエスタンブロット分析により、これらのバンドの共局在化が示された（図１４Ｂ）。
【0151】
Ｂ．ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、上述のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、１：２のＶＬＰモノマー：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、上述のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを、１：２のＶＬＰモノマー：ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ又はＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用して、ＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
【0152】
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色（図１５Ａ）：ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰ及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクーマシー－ブルー（０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染剤（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱染した。
【0153】
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット染色（図１５Ｂ）：ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰ及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ粉末を用いて１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）粉末中の１：１０００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（モノクローナル抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体ＨＲＰＯコンジュゲート、Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１８４０）１０ｍｌとインキュベートした。膜を１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて発色させ、写真フィルムに感光した。
【0154】
ＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ ＶＬＰ及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓの共有化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクーマシーブルー染色ゲルにより、それぞれＣＭＶ－Ｎｐａｄｒ及びＣＭＶ－ｔｔ８３０と共有結合した馬科ＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓについて予想されるものに対応する分子量バンドの出現が実証された（図１５Ａ）。さらに、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合に、ウエスタンブロット分析により、これらのバンドの共局在化が示された（図１５Ｂ）。
【0155】
Ｃ．免疫化プロトコル
マウス。マウスにおける馬科ＩＬ－５に対する抗体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中２５μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、皮下又は静脈内に０日目及び１４日目に注射した。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの２１日目に採血した。血清を、ＥＬＩＳＡにより分析した。
マウス。マウスにおける馬科ＩＬ－５に対する抗体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中２５μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、皮下又は静脈内に０日目及び１４日目に注射した。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの２１日目に採血した。血清を、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【0156】
馬（ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰ）。馬科ＩＬ－５に対する自己反応性抗体を作製するために、注射の３０分前に３００μｌのミョウバンと混合した１０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを０、２１及び４２日目に馬に皮下注射した。示した場合には、ブースターを１２４日目に与えた。あるいは、アジュバントを含めず、１０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを０、２８、５６、及び８４日目に馬に皮下注射した。２年目の治療の経過観察のために、アジュバントを含めず、１０００μｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、４週間隔で２回、馬に皮下追加免疫した。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４２日目、５６日目、及び５６日後の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
【0157】
馬（ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０）。馬科ＩＬ－５に対する自己反応性抗体を作製するために、１０００μｌのＰＢＳ中３００μｇ又は４００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰを０、３３、５３日目又は、０、２８、５６日目及び８４日目のいずれかに馬に皮下注射した。免疫前、及び免疫化プロトコルの少なくとも１６、５１、６７、又は５６、８４日目のいずれか、並びに８４日後の様々な追加の時点で馬から採血した。血清をＥＬＩＳＡによって分析した。血清をＥＬＩＳＡにより分析した。
【0158】
Ｄ．ＥＬＩＳＡによる血清分析
マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を５０μｌの精製ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、Ｑβ又は精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈物をＰＢＳ中２％ＢＳＡに添加し、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ又は抗馬科ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を加えた。室温での反応の約２分後に、ＥＬＩＳＡをウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。
マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を５０μｌの精製ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ、Ｑβ又は精製ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で２時間、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈物をＰＢＳ中２％ＢＳＡに添加し、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ又は抗馬科ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を加えた。室温での反応の約２分後に、ＥＬＩＳＡをウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。
【0159】
マウスの免疫前の血清及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰでワクチン接種したマウスからの２１日目の血清（図１６Ａ）並びに馬の免疫前の血清及びｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰでワクチン接種した馬からの５６日目の血清（図１６Ｂ）を収集し、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓに対する抗体についてＥＬＩＳＡによって分析した。単一馬の免疫前及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０の１回目、２回目、及び３回目のワクチン接種後の血清を収集し、血清をｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ（図１６Ｃ）及びＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０（図１６Ｄ）に対する抗体について分析した。加えて、馬の免疫前の血清及びｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ ＶＬＰワクチン接種馬からの８４日目の血清を、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ抗体について分析した（図１６Ｅ）。全ての馬の血清を、試料血清のＯＤから未処理血清のＯＤを差し引くことにより、各希釈について計算したデルタＯＤ（ΔＯＤ）値としてブロットした。馬でのワクチン接種の結果は、自己抗原ＩＬ－５に対する免疫寛容が克服されたことを示している。反応のピーク時の最大の半分の力価は１：１，０００～１：５０，０００の範囲であった。
【0160】
Ｅ．インビボでの有効性
馬。血液及びＩＢＨ疾患症状の好酸球レベルの相関
１２頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬からＥＤＴＡ血液を採取し、好酸球レベルを分析した。さらに、疾患症状スコアリングを、シーズン中、つまり、４月～１０月の間に評価した。血中の好酸球レベルを、病変症状スコアリングによる平均疾患症状尺度と相関した。病変症状スコアリングは、実施例１３に従って行った。実際に、病気の馬の血中好酸球数とＩＢＨ病変強度スコアの間に正の相関が見出され（Ｒ２＝０．９２２７、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２）（図１７Ａ）、ＩＢＨ罹患馬を免疫化する方法における本発明の組成物及びそれらの使用がＩＢＨの治療に有益であることが示された。合計４８頭のＩＢＨ罹患馬（図１７Ｂ）からのシーズン中の血液好酸球（％）対平均病変重症度のさらなる相関により（Ｒ２＝０．３１１５、ｐ＜０．０００１、ｎ＝４８）、疾患の重症度と血中好酸球の百分率との間の関係が確かめられる。
馬。血液及びＩＢＨ疾患症状の好酸球レベルの相関
１２頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬からＥＤＴＡ血液を採取し、好酸球レベルを分析した。さらに、疾患症状スコアリングを、シーズン中、つまり、４月～１０月の間に評価した。血中の好酸球レベルを、病変症状スコアリングによる平均疾患症状尺度と相関した。病変症状スコアリングは、実施例１３に従って行った。実際に、病気の馬の血中好酸球数とＩＢＨ病変強度スコアの間に正の相関が見出され（Ｒ２＝０．９２２７、ｐ＜０．０００１、ｎ＝１２）（図１７Ａ）、ＩＢＨ罹患馬を免疫化する方法における本発明の組成物及びそれらの使用がＩＢＨの治療に有益であることが示された。合計４８頭のＩＢＨ罹患馬（図１７Ｂ）からのシーズン中の血液好酸球（％）対平均病変重症度のさらなる相関により（Ｒ２＝０．３１１５、ｐ＜０．０００１、ｎ＝４８）、疾患の重症度と血中好酸球の百分率との間の関係が確かめられる。
【0161】
ケーススタディ：疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、ＩＢＨ罹患アイスランド馬にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを皮下にワクチン接種した。最初の馬に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを使用して３回皮下にワクチン接種した。ワクチン接種ごとに、１ｍｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを注射した。最初の２回の注射液はミョウバンを含まず、３回目の注射液を、新たに（注射の約３０分前に）０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）と事前に混合した。１．３ｍｌの最終容量を皮下注射した。馬に、４日目、３２日目及び５９日目に注射した。示した時点でのワクチン接種の直前及び直後に、血液を採取し、前記血中の好酸球数、特に、ｅＩＬ－５に対する抗体価を分析し、さらにＩＢＨ媒介性皮膚病変を、症状のスコアリングによって分類した。
【0162】
この実験では、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでのワクチン接種によって作製された抗ｅＩＬ５抗体の、内因性ｅＩＬ－５のインビボ作用を下方制御する能力を試験した。ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβで免疫すると、馬において抗馬科ＩＬ－５抗体価が誘発された（図１８Ａ）。抗ｅＩＬ－５抗体価の確立に伴い、血中の好酸球レベルは低下した（図１８Ｂ）。さらに、ＩＢＨの影響を受けた病変は、抗体価が確立され、好酸球細胞数が減少した時に治癒し始めた。病変の治癒を、実施例１３の病変スコアに従って、尾及びたてがみにおけるＩＢＨ病変症状スコアリングによって定量した（図１８Ｃ）。したがって、ＩＢＨの影響を受けた病変の疾患症状は、ワクチン接種の際に消失した。本明細書に拘束されないが、好酸球の減少は、非常に規則正しい免疫アレイとして提供されるｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでの免疫化によって作製される自己抗体が、内因性標的分子を認識し、それによって、ＩＢＨ罹患馬の疾患症状スコアを低減するという証拠であると思われる。好酸球レベルが、抗体価（Ｒ２＝０．８０９８）（図１８Ｄ）と相関し得ることは、抗体価の増加が好酸球の減少と相関することを示す。
【0163】
さらなるケーススタディにおいて、疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、ＩＢＨ罹患馬にｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを皮下にワクチン接種する。馬に、ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを用いて３回皮下にワクチン接種する。ワクチン接種ごとに、１ｍｌのＰＢＳ中３００μｇのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを注射する。最初の注射を、新たに（注射の約３０分前に）０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）と事前に混合してミョウバンの存在下で行い、以後２回の注射はミョウバンを含めずに行った。１．３ｍｌの最終容量を皮下に注射した。馬に、０日目、３３日目及び５３日目に注射した。示した時点でのワクチン接種の直前及び直後に、血液を採取し、前記血中の好酸球数、特に、ｅＩＬ－５に対する抗体価を分析し、さらにＩＢＨ媒介性皮膚病変を、症状のスコアリングによって分類した。
【0164】
ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０でのワクチン接種時に、馬におけるｅＩＬ－５及びＣＭＶｔｔ８３０に対する抗体価を確立した（図１８Ｅ）。好酸球レベル及び病変重症度を、経時的に調べた（図１８Ｆ）。ｅＩＬ－５に対する抗体価が確立されるとすぐに、血中の好酸球レベルが低下し、遅れて、病変重症度レベルもそれに応じて減少した。
【0165】
ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβの二重盲検プラセボ対照無作為化試験
疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、１０頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬を二重盲検プラセボ対照無作為化試験に含めた。ワクチン接種前のＩＢＨシーズン（４月～１０月）中に、隔週で症状スコアリングを全馬について評価し、血中好酸球増加を８月の初めに定量化した。次のＩＢＨシーズンが開始する前の０、２１及び４２日目（２月／３月）に、６頭のアイスランド馬に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβで免疫し、４頭のアイスランド馬にプラセボを与えた。ワクチンを１ｍｌのＰＢＳで投与した。全ての注射を、０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）を用いて、新たに（注射の約３０分前に）事前に混合したミョウバンの存在下で行った。全馬に、１２４日目に追加ワクチン接種を行い、抗体価及び好酸球数を、３月～１０月まで毎月測定した。さらに、病変分類を隔週で評価した。また、馬の健康状態だけでなく、寄生状況を３月及び１０月に分析した。
疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、１０頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬を二重盲検プラセボ対照無作為化試験に含めた。ワクチン接種前のＩＢＨシーズン（４月～１０月）中に、隔週で症状スコアリングを全馬について評価し、血中好酸球増加を８月の初めに定量化した。次のＩＢＨシーズンが開始する前の０、２１及び４２日目（２月／３月）に、６頭のアイスランド馬に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβで免疫し、４頭のアイスランド馬にプラセボを与えた。ワクチンを１ｍｌのＰＢＳで投与した。全ての注射を、０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）を用いて、新たに（注射の約３０分前に）事前に混合したミョウバンの存在下で行った。全馬に、１２４日目に追加ワクチン接種を行い、抗体価及び好酸球数を、３月～１０月まで毎月測定した。さらに、病変分類を隔週で評価した。また、馬の健康状態だけでなく、寄生状況を３月及び１０月に分析した。
【0166】
Ｑβ（図１８Ｇ）及びｅＩＬ－５（図１８Ｈ）に対する抗体価のタイムラインを、全シーズンにわたって追った。馬に、２月から始めて、３週間間隔で３回注射によるワクチン接種を行い、その後、最後の注射後約２ヶ月の時点で追加免疫を行った。しかし、開始時にかなり程度が異なっていた活性馬におけるｅＩＬ－５に対する確立された抗体価は、追加免疫後に上記の有効力価の点であまり変動がなかった（図１８Ｈ）。力価のほとんどは、追加免疫前に低下し、シーズンの中間では実質的にゼロであった。シーズンの中間で抗体価が低下したにもかかわらず、ワクチン接種馬は、全体的に、治療前の２０１４年（図１８Ｉ）と比較して、治療の年の２０１５年（図１８Ｊ）に平均病変重症度を向上させることができた。差は統計的に有意ではなかったが、馬の頭数の低さ、シーズン中の抗体価の低下及び評価前の２０１４年における平均病変重症度がプラセボ群よりも活性群においてすでにより高かったことを考慮すると、効果はまだ顕著であった。プラセボ馬の平均病変重症度は、安定であるか、又は最も可能性が高い２０１５年の早期の長く暖かい春、夏及び秋が原因で、２０１５年に２例（５０％）においてさらに悪化した。まとめると、シーズンを通して、様々な抗体価であっても、ワクチン群の全馬は治療の年に改善したが、プラセボ群の全ての馬は、安定であるか、又は前年と比較してさらに悪化した（１０％の差の増加又は減少は、季節変動の範囲内であると決定し、安定と判断した）（図１８Ｋ及び図１８Ｌ）。６頭中６頭の治療馬が改善し、４頭中４頭のプラセボ馬が安定であるか、又は悪化し、統計的に有意な治療効果をもたらした（図１８Ｌ）。
【0167】
ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβの経過観察研究
ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを用いた二重盲検プラセボ対照無作為化試験の１０頭の馬を、次のシーズン２０１６年に経過観察した。前の６頭の活性馬に、４週間間隔で２月及び３月に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを２回追加免疫した。前の４頭のプラセボ馬に、０、２８、５６、及び８４日目に、３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでの能動免疫化を受けた。全馬のワクチンに、アジュバントを含まない１ｍｌのＰＢＳで投与した。抗体価及び好酸球数を、１月及び３月から６月まで毎月測定し、１０月まで経過観察した。さらに、病変分類を２週～毎月評価した、かつ評価する。また、馬の健康状態だけでなく、寄生状況も１月及び１０月に分析した、かつ分析する。病変重症度を４月から６月まで経過観察し、１５頭の新しいプラセボ馬の病変重症度と比較した。病変重症度を１０月まで経過観察する。
ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを用いた二重盲検プラセボ対照無作為化試験の１０頭の馬を、次のシーズン２０１６年に経過観察した。前の６頭の活性馬に、４週間間隔で２月及び３月に３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβを２回追加免疫した。前の４頭のプラセボ馬に、０、２８、５６、及び８４日目に、３００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでの能動免疫化を受けた。全馬のワクチンに、アジュバントを含まない１ｍｌのＰＢＳで投与した。抗体価及び好酸球数を、１月及び３月から６月まで毎月測定し、１０月まで経過観察した。さらに、病変分類を２週～毎月評価した、かつ評価する。また、馬の健康状態だけでなく、寄生状況も１月及び１０月に分析した、かつ分析する。病変重症度を４月から６月まで経過観察し、１５頭の新しいプラセボ馬の病変重症度と比較した。病変重症度を１０月まで経過観察する。
【0168】
この研究は継続中であるが、「ＩＬ－５－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０の二重盲検プラセボ対照無作為化試験」からのこれらの１０頭の経過観察馬と１５頭のプラセボ馬の４月から６月までの病変重症度値を比較する中間解析（図１８Ｍ）から、プラセボと比較して、免疫化馬における病変重症度が統計的に有意であることが示される。
【0169】
ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０の二重盲検プラセボ対照無作為化試験
疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、３３頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬を二重盲検プラセボ対照無作為化試験に含めた。ワクチン接種前のＩＢＨシーズン（２０１５年の４月～１０月）中に、毎月、症状スコアリングを全馬について評価し、血中好酸球増加をシーズン中の１時点で定量化した。次のＩＢＨシーズンが開始する前の０、２８、５６及び８４日目（１月～４月）に、１８頭のアイスランド馬に４００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０で免疫し、１５頭のアイスランド馬にプラセボを与えた。ワクチンを、アジュバントを含まない１ｍｌのＰＢＳで投与した。全馬に、１２６日目に追加ワクチン接種を行い、抗体価及び好酸球数を、１月及び３月から６月まで毎月測定し、１０月まで経過観察する。また、馬の健康状態だけでなく、寄生状況を１月及び１０月に分析した、かつ分析する。病変重症度を４月から６月まで経過観察した。病変重症度を１０月まで経過観察する。
疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、３３頭のＩＢＨ罹患アイスランド馬を二重盲検プラセボ対照無作為化試験に含めた。ワクチン接種前のＩＢＨシーズン（２０１５年の４月～１０月）中に、毎月、症状スコアリングを全馬について評価し、血中好酸球増加をシーズン中の１時点で定量化した。次のＩＢＨシーズンが開始する前の０、２８、５６及び８４日目（１月～４月）に、１８頭のアイスランド馬に４００μｇのｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０で免疫し、１５頭のアイスランド馬にプラセボを与えた。ワクチンを、アジュバントを含まない１ｍｌのＰＢＳで投与した。全馬に、１２６日目に追加ワクチン接種を行い、抗体価及び好酸球数を、１月及び３月から６月まで毎月測定し、１０月まで経過観察する。また、馬の健康状態だけでなく、寄生状況を１月及び１０月に分析した、かつ分析する。病変重症度を４月から６月まで経過観察した。病変重症度を１０月まで経過観察する。
【0170】
この研究は継続中であるが、２０１５年（図１８Ｎ）及び２０１６年（図１８Ｏ）の４月から６月までの病変重症度値を比較する中間解析から、以前の未治療シーズン２０１５及びプラセボと比較して、治療の２０１６年の活性ワクチン群における病変重症度が低下したことが示されている。活性ワクチン群及びプラセボ群の２０１５年の４月から６月までの病変重症度を差し引いた２０１６年４月から６月までの病変重症度の差分は、活性ワクチン群においてより高い陽性（改善）値をもたらしたが、プラセボ群ではほとんど差はなかった（図１８Ｐ）。したがって、ＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶｔｔ８３０ワクチンは、病変重症度に対して有益な効果を有し、従って、疾患症状を治療的に改善した。
【0171】
実施例１１
ＶＬＰへのｅエオタキシン抗原のカップリング、馬の免疫化及びＩＢＨにかかりやすい馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへの馬科のエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号３１のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、２．３倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、２．４：２のＱβモノマー：ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
ＶＬＰへのｅエオタキシン抗原のカップリング、馬の免疫化及びＩＢＨにかかりやすい馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへの馬科のエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号３１のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、２．３倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、２．４：２のＱβモノマー：ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
【0172】
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色（図１９Ａ）：Ｑβ、ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクーマシー－ブルー（０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染剤（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱染した。
【0173】
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット染色（図１９Ｂ）：Ｑβ、ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ粉末を用いて１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）粉末中の１：８００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（８個のＨｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、マウスモノクローナルＩｇＧ１、カタログ番号３４６６０）１０ｍｌとインキュベートした。膜を、１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１：１０，０００希釈で、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）１０ｍｌと１時間インキュベートした。膜をＰＢＳで１５分間洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて発色させ、写真フィルムに感光した。
【0174】
ウイルス様粒子Ｑβへのｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓの共有化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクーマシーブルー染色ゲルにより、Ｑβと共有結合した馬科のエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓについて予想されるものに対応する分子量バンドの出現が実証された（図１９Ａ）。また、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合に、ウエスタンブロット分析により、これらのバンドの共局在化が示された（図１９Ｂ）。
【0175】
Ｂ．ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、上記のように生成し、２．３倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、２．４：２のＶＬＰモノマー：ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、２２℃で１時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、上記のように生成し、２．３倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓを、２．４：２のＶＬＰモノマー：ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、２２℃で１時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
【0176】
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色：ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０、及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクーマシー－ブルー（０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染剤（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱染した。
【0177】
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット染色：ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０、及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ粉末を用いて１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）粉末中の１：１０００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（モノクローナル抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体ＨＲＰＯコンジュゲート、Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１８４０）１０ｍｌとインキュベートした。膜を１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて発色させ、写真フィルムに感光した。
【0178】
Ｂ．免疫化プロトコル
マウス。マウスにおける馬科のエオタキシンに対する抗体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中２５μｇの馬科のエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、皮下又は静脈内に０日目及び１４日目に注射する。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの２１日目に採血する。血清を、ＥＬＩＳＡにより分析する。
マウス。マウスにおける馬科のエオタキシンに対する抗体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中２５μｇの馬科のエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、皮下又は静脈内に０日目及び１４日目に注射する。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの２１日目に採血する。血清を、ＥＬＩＳＡにより分析する。
【0179】
馬。馬科ＩＬ－５及び馬科のエオタキシンに対する自己反応性抗体を作製するために、注射の３０分前に３００μｌのミョウバンと混合した１０００μｌのＰＢＳ中３００μｇの各ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを０、２１及び４２日目に馬に皮下注射する。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４２日目、５６日目、及び５６日後の様々な追加の時点で馬から採血する。血清をＥＬＩＳＡによって分析する。
【0180】
Ｃ．ＥＬＩＳＡによる血清分析
マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を５０μｌの精製ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１．５時間、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングする。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈物をＰＢＳ中２％ＢＳＡに添加し、室温で２時間インキュベートする。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ又は抗馬科ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートする。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を加える。室温での反応の約２分後に、ＥＬＩＳＡをウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させる。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ）で、４５０ｎｍで測定する。
マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を５０μｌの精製ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングする。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１．５時間、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングする。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈物をＰＢＳ中２％ＢＳＡに添加し、室温で２時間インキュベートする。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ又は抗馬科ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートする。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を加える。室温での反応の約２分後に、ＥＬＩＳＡをウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させる。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ）で、４５０ｎｍで測定する。
【0181】
マウスの免疫前の血清及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでワクチン接種したマウスからの２１日目の血清並びに馬の免疫前の血清及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでワクチン接種した馬からの示した時点の血清を収集し、ＥＬＩＳＡによって分析する。
【0182】
Ｄ．インビボでの有効性
馬。ケーススタディ。疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、ＩＢＨ罹患アイスランド馬にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβからなる混合ワクチンでワクチン接種する。最初の馬に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ混合ワクチンを使用して３回皮下にワクチン接種する。ミョウバンを含むワクチン接種日ごとに、総容量１ｍｌのＰＢＳ中３００μｇの各ワクチンを注射する。ミョウバンを、０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）との事前の混合で、新たに添加する（注射の約３０分前に）。１．３ｍｌの最終容量を皮下注射する。馬に、０日目、２１日目及び４２日目に注射する。ワクチン接種の前後に、血中の好酸球数を分析し、ＩＢＨ媒介性皮膚病変を、実施例１３に記載のものに従って、症状のスコアによって分類する。
馬。ケーススタディ。疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、ＩＢＨ罹患アイスランド馬にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ及びｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβからなる混合ワクチンでワクチン接種する。最初の馬に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅエオタキシン－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ混合ワクチンを使用して３回皮下にワクチン接種する。ミョウバンを含むワクチン接種日ごとに、総容量１ｍｌのＰＢＳ中３００μｇの各ワクチンを注射する。ミョウバンを、０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）との事前の混合で、新たに添加する（注射の約３０分前に）。１．３ｍｌの最終容量を皮下注射する。馬に、０日目、２１日目及び４２日目に注射する。ワクチン接種の前後に、血中の好酸球数を分析し、ＩＢＨ媒介性皮膚病変を、実施例１３に記載のものに従って、症状のスコアによって分類する。
【0183】
実施例１２
ＶＬＰへのｅＩＬ－３１抗原のカップリング、馬の免疫化及びＩＢＨにかかりやすい馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへの馬科ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号３１のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、７．５倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、１：１のＱβモノマー：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
ＶＬＰへのｅＩＬ－３１抗原のカップリング、馬の免疫化及びＩＢＨにかかりやすい馬における有効性の実証
Ａ．ＱβのＶＬＰへの馬科ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
配列番号３１のコートタンパク質を含むＱβ ＶＬＰを、ＷＯ ０２／０５６９０５に記載のように生成し、７．５倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、１：１のＱβモノマー：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化Ｑβ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
【0184】
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色（図２０Ａ）：Ｑβ、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクーマシー－ブルー（０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染剤（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱染した。
【0185】
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット染色（図２０Ｂ）：Ｑβ、ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ粉末を用いて１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）粉末中の１：８００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（８個のＨｉｓ抗体、ＢＳＡ不含、マウスモノクローナルＩｇＧ１、カタログ番号３４６６０）１０ｍｌとインキュベートした。膜を１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、１：１０，０００希釈で、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＰＢＳＴ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ）１０ｍｌと１時間インキュベートした。膜をＰＢＳで１５分間洗浄し、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて発色させ、写真フィルムに感光した。
【0186】
ウイルス様粒子ＱβへのｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓの共有化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクーマシーブルー染色ゲルにより、Ｑβと共有結合した馬科ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓについて予想されるものに対応する分子量バンドの出現が実証された（図２０Ａ）。さらに、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合に、ウエスタンブロット分析により、これらのバンドの共局在化が示された（図２０Ｂ）。
【0187】
Ｂ．ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓのカップリング
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、上記のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、１：２のＶＬＰモノマー：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、上記のように生成し、１０倍モル過剰のヘテロ二官能性架橋剤スクシンイミジル－６（β－マレイミドプロピオンアミド）－ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させた。未反応の架橋剤を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通すことによって除去した。精製し、リフォールディングさせた組換えｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、リンカーに含まれるシステイン残基を還元するために、等モル過剰量のＰＢＳ中トリ（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）ｐＨ８．０で１時間還元した。次いで、還元したｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓを、１：２のＶＬＰモノマー：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓタンパク質のモル比で、誘導体化ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰと混合し、２２℃で４時間、同時インキュベートして、架橋させた。必要に応じて、この反応を、３００ｋＤａのカットオフ透析膜を使用してＰＢＳ ｐＨ７．４に対して１２時間透析するか、又はカップリングしていない遊離ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓを１００ｋＤａのＭＷＣＯを使用して接線流濾過により除去した。
【0188】
分析：ＳＤＳ－ＰＡＧＥのクーマシー染色（図２０Ｃ）：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０、及びｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離した。その後、ゲルをクーマシー－ブルー（０．０２５％クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０、４０％メタノール、１０％酢酸）で染色し、脱染剤（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱染した。
【0189】
抗Ｈｉｓ抗体を用いたウエスタンブロット染色（図２０Ｄ）：ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ、ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０、及びｅＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓ－ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜を、ＰＢＳＴ中５％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ粉末を用いて１時間ブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ中１％ＢＳＡ（ｗ／ｖ）粉末中の１：１０００希釈した抗Ｈｉｓ抗体（モノクローナル抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体ＨＲＰＯコンジュゲート、Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号７１８４０）１０ｍｌとインキュベートした。膜を１５分間ＰＢＳＴで洗浄し、次いで、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）を用いて発色させ、写真フィルムに感光した。
【0190】
ＣＭＶ－Ｎｔｔ８３０ ＶＬＰへのｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓの共有化学カップリングを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分析により評価した。カップリング反応のクーマシーブルー染色ゲルにより、ＣＭＶ－ｔｔ８３０と共有結合した馬科ＩＬ３１－Ｃ－Ｈｉｓについて予想されるものそれぞれに対応する分子量バンドの出現が実証された（図２０Ｃ）。さらに、抗Ｈｉｓ抗体で染色した場合に、ウエスタンブロット分析により、これらのバンドの共局在化が示された（図２０Ｄ）。
【0191】
Ｂ．免疫化プロトコル
マウス。マウスにおける馬科ＩＬ－３１に対する抗体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中２５μｇの馬科ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、皮下又は静脈内に０日目及び１４日目に注射する。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの２１日目に採血する。血清を、ＥＬＩＳＡにより分析する。
マウス。マウスにおける馬科ＩＬ－３１に対する抗体を作製するために、Ｃ５７ＢＬ／６又はＢＡＬＢ／ｃマウスに、１００μｌのＰＢＳ中２５μｇの馬科ＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを、皮下又は静脈内に０日目及び１４日目に注射する。マウスから、免疫前及び免疫化プロトコルの２１日目に採血する。血清を、ＥＬＩＳＡにより分析する。
【0192】
馬。馬科ＩＬ－５及び馬科ＩＬ－３１に対する自己反応性抗体を作製するために、注射の３０分前に３００μｌのミョウバンと混合した１０００μｌのＰＢＳ中３００μｇの各ｅＩＬ５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβワクチンを０、２１及び４２日目に馬に皮下注射する。免疫前、免疫化プロトコルの少なくとも４２日目、５６日目、及び５６日後の様々な追加の時点で馬から採血する。血清をＥＬＩＳＡによって分析する。
【0193】
Ｃ．ＥＬＩＳＡによる血清分析
マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を５０μｌの精製ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１．５時間、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈物をＰＢＳ中２％ＢＳＡに添加し、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ又は抗馬科ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を加えた。室温での反応の約２分後に、ＥＬＩＳＡをウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。
マキシソープ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を５０μｌの精製ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ（１０μｇ／ｍｌ）で一晩コーティングした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、室温で１．５時間、ＰＢＳ中２％ＢＳＡでブロッキングした。次いで、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、マウス又は馬の血清の３倍希釈物をＰＢＳ中２％ＢＳＡに添加し、室温で２時間インキュベートした。これらのプレートを、その後、ＰＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰと結合した抗マウスＩｇＧ又は抗馬科ＩｇＧ（希釈１：２０００）と室温で３０分間インキュベートした。プレートを再びＰＢＳで４回洗浄し、５０μｌ／ウェルの現像液（ＴＭＢ）を加えた。室温での反応の約２分後に、ＥＬＩＳＡをウェルあたり２５μｌの５％Ｈ２ＳＯ４で停止させた。吸光度をテカンＭ２００分光光度計（Ｔｅｃａｎ、オーストリア）で、４５０ｎｍで測定した。
【0194】
マウスの免疫前の血清及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでワクチン接種したマウスからの２１日目の血清並びに馬の免疫前の血清及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβでワクチン接種した馬からの示した時点の血清を収集し、ＥＬＩＳＡによって分析する。
【0195】
Ｄ．インビボでの有効性
ケーススタディ。疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、ＩＢＨ罹患アイスランド馬にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβからなる混合ワクチンでワクチン接種する。
ケーススタディ。疾患症状及び血中好酸球増加症に対するワクチン接種の効果を評価するために、ＩＢＨ罹患アイスランド馬にｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ及びｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβからなる混合ワクチンでワクチン接種する。
【0196】
最初の馬に、ｅＩＬ－５－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ／ｅＩＬ－３１－Ｃ－Ｈｉｓ－Ｑβ混合ワクチンを使用して３回皮下にワクチン接種する。ミョウバンを含むワクチン接種日ごとに、総容量１ｍｌのＰＢＳ中３００μｇの各ワクチンを注射する。ミョウバンを、０．３ｍｌのミョウバン（Ｉｍｊｅｃｔ Ａｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号７７１６１）との事前の混合で、新たに添加する（注射の約３０分前に）。１．３ｍｌの最終容量を皮下注射する。馬に、０日目、２１日目及び４２日目に注射する。ワクチン接種の前後に、血中の好酸球数を分析し、ＩＢＨ媒介性皮膚病変を、実施例１３に記載の症状のスコアによって分類する。
【0197】
実施例１３
ＩＢＨ症状病変スコアリング
ＩＢＨ症状スコアリングのために、ＩＢＨ病変が生じる場所（尾、たてがみ、腹、脇腹、顔、耳、足など）を記録する。各位置を、上、中央、下の３つの部分に分割する。さらに病変の数に応じて、各位置を軽度及び重度に分類する。罹患部位の数（上／中／下）及び見出された位置ごとの病変の数（軽度／重度）に応じて、１～４点にスコア化することができる（１ポイント＝罹患部位が１つ、軽度の病変；４点＝罹患部位が全３つ、重度の病変）。
ＩＢＨ症状病変スコアリング
ＩＢＨ症状スコアリングのために、ＩＢＨ病変が生じる場所（尾、たてがみ、腹、脇腹、顔、耳、足など）を記録する。各位置を、上、中央、下の３つの部分に分割する。さらに病変の数に応じて、各位置を軽度及び重度に分類する。罹患部位の数（上／中／下）及び見出された位置ごとの病変の数（軽度／重度）に応じて、１～４点にスコア化することができる（１ポイント＝罹患部位が１つ、軽度の病変；４点＝罹患部位が全３つ、重度の病変）。
【0198】
また、これらの位置を、６つのさらなる特性：サイズ（直径）、血液、脱毛、規模、痂皮、及び苔癬化／腫れについて分類する。全てのこれらの特性についても、１～４点にスコア化することができる。サイズを、＜０．５ｃｍ（１点）、０．５≧ｘ＞１ｃｍ（２点）、１≧ｘ＞２ｃｍ（３点）、及び≧２ｃｍ（４点）に分ける。血液を、無傷の表皮（１点）、軽度（２点）、中程度（３点）、及び重度（４点）に分類する。脱毛を、軽度（１点）、中等度（２点）、重度（３点）、及び無毛（４点）に分類する。規模を、なし（１点）、小さい、少数（２点）、中程度、中型（３点）、及び多数、大きい（４点）に分類する。痂皮を、なし（１点）、小さい（２点）、半分（３点）、及び全体（４点）に分類する。苔癬化及び／又は腫れを、なし（１点）、軽度（２点）、軽度（３点）、及び重度（４点）に分類する。
【0199】
さらに、シース又は乳房が肥大した場合、最小５又は最大２０点でスコア化することができる：グレード１（５点）、グレード２（１０ポイント）、グレード３（１５点）、及びグレード４（２０点）。
【0200】
最後に、全てのポイントを加算すると、ＩＢＨ症状スコアになる。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図18F】
【図18G】
【図18H】
【図18I】
【図18J】
【図18K】
【図18L】
【図18M】
【図18N】
【図18O】
【図18P】
【図19A】
【図19B】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【配列表】