▶ クイル ピュージェット サウンド バイオセラピューティクス コーポレーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-15
(45)【発行日】2024-03-26
(54)【発明の名称】抗ＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240318BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/863 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/869 20060101ALI20240318BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240318BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240318BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240318BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240318BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240318BHJP
A61K 35/761 20150101ALI20240318BHJP
A61K 35/763 20150101ALI20240318BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20240318BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240318BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240318BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240318BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240318BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240318BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240318BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240318BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/867 Z
C12N15/864 100Z
C12N15/861 Z
C12N15/863 Z
C12N15/869 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K35/761
A61K35/763
A61K35/768
A61K39/395 T
A61K39/395 U
A61K45/00
A61K48/00
A61P31/00
A61P35/00
A61K31/7088
C12N15/13
C12N5/071
【請求項の数】
26
(21)【出願番号】P 2022087695
(22)【出願日】2022-05-30
(62)【分割の表示】P 2019545717の分割
【原出願日】2017-11-06
(65)【公開番号】P2022119917
(43)【公開日】2022-08-17
【審査請求日】2022-06-28
(31)【優先権主張番号】62/419,157
(32)【優先日】2016-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】519155088
【氏名又は名称】クイル ピュージェット サウンド バイオセラピューティクス コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】リュウ，チ
(72)【発明者】
【氏名】ジョンファ，フー
(72)【発明者】
【氏名】ファンスロウ，ウィリアム シー．
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ウェイ
【審査官】西村 亜希子
(56)【参考文献】
【文献】米国特許第０６６８２７３６（ＵＳ，Ｂ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／
Ｃ０７Ｋ １６／
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
それぞれが相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（抗ｈＣＴＬＡ４）抗体であって、配列番号３、６５、２１、１６、９および６２のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、
ｈＣＴＬＡ４とヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７－１（ｈＢ７－１）および／またはヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７－２（ｈＢ７－２）との相互作用を抑制する、
抗ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（抗ｈＣＴＬＡ４）抗体。
【請求項2】
前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨが、配列番号６４のアミノ酸配列に対し４つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含み、および／または、前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＬが、配列番号６７のアミノ酸配列に対し４つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨが、配列番号６４のアミノ酸配列に対し２つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＬが、配列番号６７のアミノ酸配列に対し２つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨが、配列番号６４の配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＬが、配列番号６７の配列と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項5】
前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨおよびＶＬがそれぞれ、２つの配列を一緒に含むアミノ酸配列を含み、前記２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つの配列に対し４つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であり、前記２つの配列の内のもう一方が前記１対の配列の内のもう一方の配列に対し４つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であり、前記１対の配列が、配列番号６４（ＶＨ）および６７（ＶＬ）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項6】
前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨおよびＶＬがそれぞれ、２つの配列を一緒に含むアミノ酸配列を含み、前記２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つの配列に対し２つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であり、前記２つの配列の内のもう一方が前記１対の配列の内のもう一方の配列に対し２つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であり、前記１対の配列が、配列番号６４（ＶＨ）および６７（ＶＬ）である、請求項５に記載の抗体。
【請求項7】
前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨおよびＶＬがそれぞれ、２つの配列を一緒に含むアミノ酸配列を含み、前記２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つの配列を含む配列と同一であり、前記２つの配列の内のもう一方が前記１対の配列の内のもう一方の配列を含む配列と同一であり、前記１対の配列が、配列番号６４（ＶＨ）および６７（ＶＬ）である、請求項６に記載の抗体。
【請求項8】
前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨが、配列番号６４のアミノ酸配列に対し４つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＬが、配列番号６７のアミノ酸配列に対し４つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項７に記載の抗体。
【請求項9】
前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨが、配列番号６４のアミノ酸配列に対し２つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含み、前記抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＬが、配列番号６７のアミノ酸配列に対し２つ以下のアミノ酸変化を含む配列と同一であるアミノ酸配列を含む、
請求項８に記載の抗体。
【請求項10】
前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体が、ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項11】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、ＩｇＧ１抗体、４０９Ｒを含むＩｇＧ１抗体、またはＩｇＧ４抗体である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項12】
（ａ）前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）が、４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）；ならびに１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、からなる群より選択される１つまたは複数の電荷対を含み、および／または（ｂ）前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣおよびＬＣが、１２６Ｃ（ＨＣ）および１２１Ｃまたは１２４Ｃ（ＬＣ）；１２８Ｃ（ＨＣ）および１１８Ｃ（ＬＣ）；１３３Ｃ（ＨＣ）および１１７Ｃまたは２０９Ｃ（ＬＣ）；１３４Ｃまたは１４１Ｃ（ＨＣ）および１１６Ｃ（ＬＣ）；１６８Ｃ（ＨＣ）および１７４Ｃ（ＬＣ）；１７０Ｃ（ＨＣ）および１６２Ｃまたは１７６Ｃ（ＬＣ）；１７３Ｃ（ＨＣ）および１６０Ｃ（ＬＣ）；ならびに１８３Ｃ（ＨＣ）および１７６Ｃ（ＬＣ）からなる群より選択される１つまたは複数の接触システイン対を含む、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項13】
（ａ）請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体；および
（ｂ）それぞれがＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含むＶＨとＶＬを含む、抗ヒトプログラム細胞死１（抗ｈＰＤ１）抗体であって、
配列番号８８、８９、９０、９３、９４および９５；配列番号９８、８９、９９、１０２、９４および９５；配列番号１０５、８９、９０、９３、１０８および９５；配列番号１０５、１１１、１１２、１１５、９４および９５；配列番号１０５、１１１、９０、１２０、９４および９５；配列番号８８、８９、１１２、１０２、１０８および９５；配列番号８８、８９、１２７、１３０、１０８および１３１；配列番号８８、８９、１３４、１３７、９４および１３１；配列番号９８、８９、９０、１４２、９４および１３１；配列番号９８、１１１、１１２、１３０、９４および１３１；配列番号１４９、１５０、１１２、１３０、９４および１３１；配列番号１０５、１１１、９０、１４２、９４および１３１；配列番号１４９、８９、１２７、１１５、９４および９５；配列番号８８、８９、１１２、９３、９４および９５；または配列番号１０５、８９、１２７、１０２、１０８および９５のアミノ酸配列をそれぞれ含むＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、
ｈＰＤ１とヒトプログラム細胞死１リガンド１（ｈＰＤＬ１）との相互作用を抑制する、
抗ヒトプログラム細胞死１（抗ｈＰＤ１）抗体；
を含む抗体混合物。
【請求項14】
（ａ）ＩｇＧ１抗体である抗ｈＣＴＬＡ４抗体であって、（１）それぞれが配列番号３、６５、２１、１６、９および６２のアミノ酸配列を含む、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ ２、およびＶＬ ＣＤＲ３と、（２）配列番号６４のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号６７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含み、以下のアミノ酸変化：その重鎖（ＨＣ）中の１４７Ｄおよびその軽鎖中の１３１Ｋ；そのＨＣ中の位置１７０と１７３およびそのＬＣ中の位置１６０と１６２におけるシステイン置換；そのＨＣ中の２５５Ｋ；ならびにそのＨＣ中の３９９Ｒおよび４０９Ｅ；
を含む、抗ｈＣＴＬＡ４抗体；および
（ｂ）ＩｇＧ４抗体である抗ＰＤ１抗体であって、（１）それぞれが８８、８９、９０、９３、９４および９５を含む、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ ２、およびＶＬ ＣＤＲ３と、（２）配列番号８７のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号９２のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、抗ＰＤ１抗体；
を含む抗体混合物。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３もしくは１４に記載の抗体混合物をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチド。
【請求項16】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数のベクター。
【請求項17】
ウイルスベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項18】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、またはポックスウイルスベクターである、請求項１７に記載のベクター。
【請求項19】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３もしくは１４に記載の抗体混合物、請求項１５に記載のポリヌクレオチド、または請求項１６～１８のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【請求項20】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６に記載のベクターが導入されている、宿主細胞。
【請求項21】
ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項22】
請求項２０または２１に記載の宿主細胞を培養するステップ、および前記抗体または混合物を培地または細胞集団から回収するステップを含む、抗体または混合物の製造方法。
【請求項23】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３もしくは１４に記載の抗体混合物、請求項１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１９に記載の医薬組成物を含む、固形腫瘍または血液悪性腫瘍の患者の（１）免疫応答を誘導または高めるおよび／または（２）その患者を治療する方法における使用のための医薬組成物。
【請求項24】
前記患者が、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、腎明細胞癌、ホジキンリンパ腫、または頭頸部扁平上皮細胞癌を有する、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項25】
請求項２３または２４に記載の医薬組成物であって、前記方法が、前記医薬組成物の投与の前に、後に、および／またはそれと同時に、追加の療法剤を投与することをさらに含み、前記追加の療法剤が、免疫調節性分子、照射、化学療法剤、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択される、医薬組成物。
【請求項26】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の抗体または請求項１３もしくは１４に記載の抗体混合物、請求項１５に記載のポリヌクレオチド、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１９に記載の医薬組成物を含む、感染症の患者を治療する方法における使用のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書に記載の組成物および方法は、組換え抗体の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫チェックポイント阻害剤は、新しいクラスの癌治療薬である。例えば、Ｐａｒｄｏｌｌ（２０１２），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－２６４を参照されたい。Ｔ細胞応答は、活性化シグナルと抑制シグナルのバランスにより調節される。免疫チェックポイント、すなわち、阻害経路は、自己寛容の維持を支援し、および／または免疫応答の持続時間および／または強さを調節し、それにより、健康な組織に対する付随的な損傷を制限することができる。癌細胞は、これらの免疫チェックポイント経路を上方制御する複数の方法を創り出して、これらの方法がなければ癌細胞死滅させたはずの宿主の免疫応答を抑制することができる。多くの癌のタイプの治療における、免疫チェックポイント阻害剤または遮断薬、例えば、抗プログラム細胞死１（ＰＤ１）、抗プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤＬ１）、および抗細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）抗体の成功は、癌に対するＴ細胞応答の調節における免疫チェックポイントの重要性の証拠である。例えば、Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３７３（１）：２３－３４を参照されたい。
【0003】
この手法を改良して、患者応答の改善および毒性の制限を行うことは、進行中の課題である。したがって、改善された免疫チェックポイント阻害剤およびこのような阻害剤を用いて治療するための改善された方法が当該技術分野において求められている。このような改善された免疫チェックポイント阻害剤および治療のための改善された方法が本明細書で記載される。
【発明の概要】
【0004】
本明細書に記載されるのは、抗ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）抗体、抗ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）抗体、その混合物、これらの抗体および混合物をコードする核酸、これらの核酸を含む宿主細胞、これらの抗体、混合物、および核酸を含む医薬組成物、ならびにこれらの抗体、混合物、核酸、または医薬組成物を患者に投与することを含む治療方法である。下記の番号を付した項目は、これらの配合物および方法を記載する。
【0005】
１．重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）抗体であって、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下の変化を含むアミノ酸配列を含み、抗ｈＣＴＬＡ４抗体がｈＣＴＬＡ４とヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７－１（ｈＢ７－１）および／またはヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７－２（ｈＢ７－２）との相互作用を抑制する抗ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）抗体。
【0006】
２．ＶＨが、ＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、およびＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、これらがそれぞれ、配列番号３、４、および５、配列番号３、１３および５、配列番号３、２０、および２１、配列番号３、２４、および２５、配列番号３、３１、および５、配列番号３、３７、および５、配列番号３、４３、および５、配列番号３、４６、および４７、配列番号３、５９、および５、配列番号３、６５、および２１、または配列番号３、７０、および２１のアミノ酸配列を含む、項目１に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0007】
３．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１または２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0008】
４．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目３に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0009】
５．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目４に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0010】
６．アミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化（ｐａｒｔｎｅｒ ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）である、項目１～５のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0011】
７．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、および６９からなる群より選択される、項目５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0012】
８．それぞれ、配列番号３、７５、および７７のアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）をさらに含む、項目１～７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0013】
９．ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号８、９、および１０、配列番号１６、９および１７、配列番号２８、９、および１７、配列番号３４、９、および１７、配列番号４０、９、および１０、配列番号５０、９、および１７、配列番号５５、９、および５６、配列番号４０、９、および６２、配列番号１６、９、および６２、または配列番号７３、９、および６２のアミノ酸配列を含む、項目８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0014】
１０．配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含む、アミノ酸配列を含むＶＬをさらに含む、項目１～７のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0015】
１１．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１０に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0016】
１２．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１１に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0017】
１３．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0018】
１４．配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４または８５に対するアミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目１０～１３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0019】
１５．ＶＬが、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号８、９、および１０、配列番号１６、９および１７、配列番号２８、９、および１７、配列番号３４、９、および１７、配列番号４０、９、および１０、配列番号５０、９、および１７、配列番号５５、９、および５６、配列番号４０、９、および６２、配列番号１６、９、および６２、または配列番号７３、９、および６２のアミノ酸配列を含む、項目１０～１４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0020】
１６．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５からなる群より選択される、項目１５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0021】
１７．ＶＬを含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体であって、ＶＬが、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含み、ＶＬが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号８、９、および１０、配列番号１６、９および１７、配列番号２８、９、および１７、配列番号３４、９、および１７、配列番号４０、９、および１０、配列番号５０、９、および１７、配列番号５５、９、および５６、配列番号４０、９、および６２、配列番号１６、９、および６２、または配列番号７３、９、および６２のアミノ酸配列を含み、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制する、抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0022】
１８．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１７に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0023】
１９．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0024】
２０．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目１９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0025】
２１．アミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目１７～２０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0026】
２２．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択される、項目２０に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0027】
２３．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号７９、配列番号９、および配列番号８１のアミノ酸配列を含む、ＶＨをさらに含む、項目１７～２２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0028】
２４．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号３、４、および５、配列番号３、１３および５、配列番号３、２０、および２１、配列番号３、２４、および２５、配列番号３、３１、および５、配列番号３、３７、および５、配列番号３、４３、および５、配列番号３、４６、および４７、配列番号３、５９、および５、配列番号３、６５、および２１、または配列番号３、７０、および２１のアミノ酸配列を含む、項目２３に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0029】
２５．ＶＨをさらに含み、ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含む、アミノ酸配列を含む、項目１７～２２のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0030】
２６．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目２５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0031】
２７．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目２６に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0032】
２８．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目２７に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0033】
２９．アミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目２５～２８のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0034】
３０．ＶＨが、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号３、４、および５、配列番号３、１３および５、配列番号３、２０、および２１、配列番号３、２４、および２５、配列番号３、３１、および５、配列番号３、３７、および５、配列番号３、４３、および５、配列番号３、４６、および４７、配列番号３、５９、および５、配列番号３、６５、および２１、または配列番号３、７０、および２１のアミノ酸配列を含む、項目２５～２９のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0035】
３１．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３からなる群より選択される、項目２８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0036】
３２．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、アミノ酸配列：
（ａ）配列番号３、４、５、８、９、および１０；
（ｂ）配列番号３、１３、５、１６、９、および１７；
（ｃ）配列番号３、２０、２１、１６、９、および１７；
（ｄ）配列番号３、２４、２５、２８、９、および１７；
（ｅ）配列番号３、３１、５、３４、９、および１７；
（ｆ）配列番号３、３７、５、４０、９、および１０；
（ｇ）配列番号３、４３、５、２８、９、および１７；
（ｈ）配列番号３、４６、４７、５０、９、および１７；
（ｉ）配列番号３、３１、５、５５、９、および５６；
（ｊ）配列番号３、５９、５、４０、９、および６２；
（ｋ）配列番号３、６５、２１、１６、９、および６２；または
（ｌ）配列番号３、７０、２１、７３、９、および６２；
を含み、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制する、抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）配列番号３、４、５、８、９、および１０；
（ｂ）配列番号３、１３、５、１６、９、および１７；
（ｃ）配列番号３、２０、２１、１６、９、および１７；
（ｄ）配列番号３、２４、２５、２８、９、および１７；
（ｅ）配列番号３、３１、５、３４、９、および１７；
（ｆ）配列番号３、３７、５、４０、９、および１０；
（ｇ）配列番号３、４３、５、２８、９、および１７；
（ｈ）配列番号３、４６、４７、５０、９、および１７；
（ｉ）配列番号３、３１、５、５５、９、および５６；
（ｊ）配列番号３、５９、５、４０、９、および６２；
（ｋ）配列番号３、６５、２１、１６、９、および６２；または
（ｌ）配列番号３、７０、２１、７３、９、および６２；
を含み、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制する、抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0037】
３３．抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨおよびＶＬがそれぞれ、２つの配列を一緒に含むアミノ酸配列を含み、２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つの配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が１対の配列の内のもう一方の配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含み、１対の配列が、配列番号２（ＶＨ）および７（ＶＬ）；配列番号１２（ＶＨ）および１５（ＶＬ）；配列番号１９（ＶＨ）および１５（ＶＬ）；配列番号２３（ＶＨ）および２７（ＶＬ）；配列番号３０（ＶＨ）および３３（ＶＬ）；配列番号３６（ＶＨ）および３９（ＶＬ）；配列番号４２（ＶＨ）および２７（ＶＬ）；配列番号４５（ＶＨ）および４９（ＶＬ）；配列番号５２（ＶＨ）および５４（ＶＬ）；配列番号５８（ＶＨ）および６１（ＶＬ）；配列番号６４（ＶＨ）および６７（ＶＬ）；および配列番号６９（ＶＨ）および７２（ＶＬ）からなる群より選択される、項目３２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0038】
３４．２つの配列の内の１つが、１対の配列の１つに対し、３つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列のもう一方の配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目３３に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0039】
３５．２つの配列の内の１つが、１対の配列の１つに対し、２つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列のもう一方の配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目３４に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0040】
３６．２つの配列の内の１つが、１対の配列の１つに対し、１つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列のもう一方の配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目３５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0041】
３７．変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目３３～３６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0042】
３８．２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つを含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列の内のもう一方の配列を含む、項目３６に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0043】
３９．ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体である、項目１～３８のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0044】
４０．（１）ＩｇＧ４抗体または（２）変化Ｋ４０９Ｒを含むＩｇＧ１抗体である、項目３９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0045】
４１．ＩｇＧ１抗体である、項目３９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0046】
４２．重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）が、ＨＣ中の位置４４、１０５、１４７、１６８および１８１ならびにＬＣ中の位置４３、１００、１３１、１７４、および１７８からなる群より選択される１つまたは複数の位置に、第１の相手指向変化を含み、第１の相手指向変化が、荷電アミノ酸が別のアミノ酸を置換する置換であり、置換された第１の相手指向変化の荷電アミノ酸が抗体内の接触アミノ酸の電荷対の一部を形成し、電荷対の接触アミノ酸が、
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される、項目３９～４１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される、項目３９～４１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0047】
４３．第２の相手指向変化をさらに含み、第２の相手指向変化が、別のアミノ酸に対する荷電アミノ酸置換であり、置換された第１と第２の相手指向変化の荷電アミノ酸が接触アミノ酸の電荷対を形成する、項目４２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0048】
４４．抗ｈＣＴＬＡ４抗体がＩｇＧ１抗体であり、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置で第３の相手指向変化を含み、第３の相手指向変化がシステイン置換であり、第３の相手指向変化の置換システインが、（１）第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触し、それにより、接触システイン対を形成する、項目４２または４３に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0049】
４５．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４または１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０；および
（ｈ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６、
からなる群より選択される位置にある、項目４４に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４または１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０；および
（ｈ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６、
からなる群より選択される位置にある、項目４４に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0050】
４６．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；および
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０、
からなる群より選択される位置にある、項目４５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；および
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０、
からなる群より選択される位置にある、項目４５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0051】
４７．第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含むか、または第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含む、項目４４～４６のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0052】
４８．抗ｈＣＴＬＡ４抗体がＩｇＧ４抗体であり、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置で第３の相手指向変化を含み、第３の相手指向変化がシステイン置換であり、第３の相手指向変化の置換システインが、（１）第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触するか、または（２）第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触し、それにより、接触システイン対を形成する、項目４２または４３に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0053】
４９．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２７およびＬＣ中の位置１２１；
（ｃ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｄ）ＨＣ中の位置１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；および
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０または１７３およびＬＣ中の位置１６２、からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の位置にある、項目４８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２７およびＬＣ中の位置１２１；
（ｃ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｄ）ＨＣ中の位置１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；および
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０または１７３およびＬＣ中の位置１６２、からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の位置にある、項目４８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0054】
５０．第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含むか、または第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含む、項目４８または４９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0055】
５１．変化Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ／Ｒ４０９Ｅ／Ｄを含む、項目１～５０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0056】
５２．Ｆｃ部分を含む、ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体であり、抗体のＦｃ部分が抗体のインビボでのクリアランスを高める１つまたは複数の変化を含む、項目１～５１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0057】
５３．抗体のＦｃ部分が、次の変化：Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５ＫまたはＨ４３５Ｒの内の少なくとも１つを含む、項目５２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0058】
５４．配列番号１８９および１９１または配列番号１９３および１９５のアミノ酸配列を含む、抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0059】
５５．ＶＨを含む抗ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）抗体であって、ＶＨが、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含み、ｈＰＤ１とヒトＰＤＬ１（ｈＰＤＬ１）との相互作用を抑制する、抗ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）抗体。
【0060】
５６．ＶＨが、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号８８、８９、および９０、配列番号９８、８９および９９、配列番号１０５、８９、および９０、配列番号１０５、１１１、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号８８、８９、および１１２、配列番号８８、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１３４、配列番号９８、８９、および９０、配列番号９８、１１１、および１１２、配列番号１４９、１５０、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号１４９、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１１２、または配列番号１０５、８９、および１２７のアミノ酸配列を含む、項目５５に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0061】
５７．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目５５または５６に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0062】
５８．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目５７に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0063】
５９．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目５８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0064】
６０．アミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目５５～５９のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0065】
６１．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、および１６６からなる群より選択される、項目５９に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0066】
６２．ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬをさらに含み、これらのそれぞれが、配列番号１７６、１７７、および１７９のアミノ酸配列を含む、項目５５～６１のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0067】
６３．ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号９３、９４、および９５、配列番号１０２、９４、および９５、配列番号９３、１０８、および９５、配列番号１１５、９４、および９５、配列番号１２０、９４、および９５、配列番号１０２、１０８、および９５、配列番号１３０、１０８、および１３１、配列番号１３７、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、または配列番号１３０、９４、および１３１のアミノ酸配列を含む、項目６２に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0068】
６４．配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含むＶＬを含む、項目５５～６１のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0069】
６５．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目６４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0070】
６６．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目６５に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0071】
６７．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目６６に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0072】
６８．配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、または１８３に対するアミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目６４～６７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0073】
６９．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３からなる群より選択される、項目６７に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0074】
７０．ＶＬが、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらそれぞれが、配列番号９３、９４、および９５、配列番号１０２、９４、および９５、配列番号９３、１０８、および９５、配列番号１１５、９４、および９５、配列番号１２０、９４、および９５、配列番号１０２、１０８、および９５、配列番号１３０、１０８、および１３１、配列番号１３７、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、または配列番号１３０、９４、および１３１のアミノ酸配列を含む、項目６４～６９のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0075】
７１．ＶＬを含む抗ｈＰＤ１抗体であって、ＶＬが、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含み、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制する抗ｈＰＤ１抗体。
【0076】
７２．ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号９３、９４、および９５、配列番号１０２、９４、および９５、配列番号９３、１０８、および９５、配列番号１１５、９４、および９５、配列番号１２０、９４、および９５、配列番号１０２、１０８、および９５、配列番号１３０、１０８、および１３１、配列番号１３７、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、または配列番号１３０、９４、および１３１のアミノ酸配列を含む、項目７１に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0077】
７３．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目７１または７２に記載の抗ＰＤ１抗体。
【0078】
７４．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目７３に記載の抗ＰＤ１抗体。
【0079】
７５．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目７４に記載の抗ＰＤ１抗体。
【0080】
７６．アミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目７１～７５のいずれか１項に記載の抗ＰＤ１抗体。
【0081】
７７．ＶＬにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択される、項目７５に記載の抗ＰＤ１抗体。
【0082】
７８．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨをさらに含み、これらのそれぞれが、配列番号１７０、１７２、および１７４のアミノ酸配列を含む、項目７１～７７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0083】
７９．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３が、それぞれ、配列番号８８、８９、および９０、配列番号９８、８９および９９、配列番号１０５、８９、および９０、配列番号１０５、１１１、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号８８、８９、および１１２、配列番号８８、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１３４、配列番号９８、８９、および９０、配列番号９８、１１１、および１１２、配列番号１４９、１５０、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号１４９、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１１２、または配列番号１０５、８９、および１２７のアミノ酸配列を含む、項目７８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0084】
８０．配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含む、項目７１～７７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0085】
８１．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目８０に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0086】
８２．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目８１に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0087】
８３．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１からなる群より選択されるアミノ酸配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目８２に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0088】
８４．アミノ酸変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目８０～８３のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0089】
８５．ＶＨにより含まれるアミノ酸配列が、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１からなる群より選択される、項目８３に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0090】
８６．ＶＨが、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、配列番号８８、８９、および９０、配列番号９８、８９および９９、配列番号１０５、８９、および９０、配列番号１０５、１１１、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号８８、８９、および１１２、配列番号８８、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１３４、配列番号９８、８９、および９０、配列番号９８、１１１、および１１２、配列番号１４９、１５０、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号１４９、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１１２、または配列番号１０５、８９、および１２７のアミノ酸配列を含む、項目８０～８５のいずれか１項に記載の抗ＰＤ１抗体。
【0091】
８７．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、アミノ酸配列：
（ａ）配列番号８８、８９、９０、９３、９４、および９５；
（ｂ）配列番号９８、８９、９９、１０２、９４、および９５；
（ｃ）配列番号１０５、８９、９０、９３、１０８、および９５；
（ｄ）配列番号１０５、１１１、１１２、１１５、９４、および９５；
（ｅ）配列番号１０５、１１１、９０、１２０、９４、および９５；
（ｆ）配列番号８８、８９、１１２、１０２、１０８、および９５；
（ｇ）配列番号８８、８９、１２７、１３０、１０８、および１３１；
（ｈ）配列番号８８、８９、１３４、１３７、９４、および１３１；
（ｉ）配列番号９８、８９、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｊ）配列番号９８、１１１、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｋ）配列番号１４９、１５０、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｌ）配列番号１０５、１１１、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｍ）配列番号１４９、８９、１２７、１１５、９４、および９５；
（ｎ）配列番号８８、８９、１１２、９３、９４、および９５；または
（ｏ）配列番号１０５、８９、１２７、１０２、１０８、および９５；
を含み、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制する、抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）配列番号８８、８９、９０、９３、９４、および９５；
（ｂ）配列番号９８、８９、９９、１０２、９４、および９５；
（ｃ）配列番号１０５、８９、９０、９３、１０８、および９５；
（ｄ）配列番号１０５、１１１、１１２、１１５、９４、および９５；
（ｅ）配列番号１０５、１１１、９０、１２０、９４、および９５；
（ｆ）配列番号８８、８９、１１２、１０２、１０８、および９５；
（ｇ）配列番号８８、８９、１２７、１３０、１０８、および１３１；
（ｈ）配列番号８８、８９、１３４、１３７、９４、および１３１；
（ｉ）配列番号９８、８９、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｊ）配列番号９８、１１１、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｋ）配列番号１４９、１５０、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｌ）配列番号１０５、１１１、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｍ）配列番号１４９、８９、１２７、１１５、９４、および９５；
（ｎ）配列番号８８、８９、１１２、９３、９４、および９５；または
（ｏ）配列番号１０５、８９、１２７、１０２、１０８、および９５；
を含み、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制する、抗ｈＰＤ１抗体。
【0092】
８８．抗ｈＰＤ１抗体のＶＨおよびＶＬがそれぞれ、２つの配列を一緒に含むアミノ酸配列を含み、２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つの配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が１対の配列の内のもう一方の配列に対し、４つ以下のアミノ酸変化を含み、１対の配列が、配列番号８７（ＶＨ）および９２（ＶＬ）；配列番号９７（ＶＨ）および１０１（ＶＬ）；配列番号１０４（ＶＨ）および１０７（ＶＬ）；配列番号１１０（ＶＨ）および１１４（ＶＬ）；配列番号１１７（ＶＨ）および１１９（ＶＬ）；配列番号１２２（ＶＨ）および１２４（ＶＬ）；配列番号１２６（ＶＨ）および１２９（ＶＬ）；配列番号１３３（ＶＨ）および１３６（ＶＬ）；配列番号１３９（ＶＨ）および１４１（ＶＬ）；配列番号１４４（ＶＨ）および１４６（ＶＬ）；配列番号１４８（ＶＨ）および１５２（ＶＬ）；配列番号１５４（ＶＨ）および１５６（ＶＬ）；配列番号１５８（ＶＨ）および１６０（ＶＬ）；配列番号１６２（ＶＨ）および１６４（ＶＬ）；および配列番号１６６（ＶＨ）および１６８（ＶＬ）からなる群より選択される、項目８７に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0093】
８９．２つの配列の内の１つが、１対の配列の１つに対し、３つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列のもう一方の配列に対し、３つ以下のアミノ酸変化を含む、項目８８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0094】
９０．２つの配列の内の１つが、１対の配列の１つに対し、２つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列のもう一方の配列に対し、２つ以下のアミノ酸変化を含む、項目８９に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0095】
９１．２つの配列の内の１つが、１対の配列の１つに対し、１つ以下のアミノ酸変化を含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列のもう一方の配列に対し、１つ以下のアミノ酸変化を含む、項目９０に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0096】
９２．変化が置換であり、該置換が相手指向変化である、項目８８～９１のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0097】
９３．２つの配列の内の１つが、１対の配列の内の１つを含み、２つの配列の内のもう一方が、１対の配列の内のもう一方の配列を含む、項目９１に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0098】
９４．ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体である、項目５５～９３のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0099】
９５．（１）ＩｇＧ４抗体または（２）変化Ｋ４０９Ｒを含むＩｇＧ１抗体である、項目９４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0100】
９６．ＩｇＧ１抗体である、項目９４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0101】
９７．重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）が、ＨＣ中の位置４４、１０５、１４７、１６８および１８１ならびにＬＣ中の位置４３、１００、１３１、１７４、および１７８からなる群より選択される１つまたは複数の位置に、第１の相手指向変化を含み、相手指向変化が、荷電アミノ酸が別のアミノ酸を置換する置換であり、置換された相手指向変化の荷電アミノ酸が抗体内の接触アミノ酸の電荷対の一部を形成し、電荷対の接触アミノ酸が、
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、からなる群より選択される項目９４～９６のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、からなる群より選択される項目９４～９６のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0102】
９８．第２の相手指向変化をさらに含み、第２の相手指向変化が、別のアミノ酸に対する荷電アミノ酸置換であり、置換された第１と第２の相手指向変化の荷電アミノ酸が接触アミノ酸の電荷対を形成する、項目９７に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0103】
９９．抗ｈＰＤ１抗体がＩｇＧ１抗体であり、抗ｈＰＤ１抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置で第３の相手指向変化を含み、第３の相手指向変化がシステイン置換であり、第３の相手指向変化の置換システインが、（１）第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触し、それにより、接触システイン対を形成する、項目９７または９８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0104】
１００．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４または１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０；および
（ｈ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６、
からなる群より選択される位置にある、項目９９に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４または１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０；および
（ｈ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６、
からなる群より選択される位置にある、項目９９に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0105】
１０１．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；および
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０、
からなる群より選択される１対の位置にある、項目１００に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｃ）ＨＣ中の位置１３３およびＬＣ中の位置１１７または２０９；
（ｄ）ＨＣ中の位置１３４およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２または１７６；および
（ｇ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０、
からなる群より選択される１対の位置にある、項目１００に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0106】
１０２．第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含むか、または第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含む、項目９９～１０１のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0107】
１０３．抗ｈＰＤ１抗体がＩｇＧ４抗体であり、抗ｈＰＤ１抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置で第３の相手指向変化を含み、第３の相手指向変化がシステイン置換であり、第３の相手指向変化の置換システインが、（１）第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触し、それにより、接触システイン対を形成する、項目９７または９８に記載の抗ｈＰＤ１。
【0108】
１０４．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２７およびＬＣ中の位置１２１；
（ｃ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｄ）ＨＣ中の位置１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；および
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０または１７３およびＬＣ中の位置１６２、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の位置にある、項目１０３に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１または１２４；
（ｂ）ＨＣ中の位置１２７およびＬＣ中の位置１２１；
（ｃ）ＨＣ中の位置１２８およびＬＣ中の位置１１８；
（ｄ）ＨＣ中の位置１４１およびＬＣ中の位置１１６；
（ｅ）ＨＣ中の位置１６８およびＬＣ中の位置１７４；および
（ｆ）ＨＣ中の位置１７０または１７３およびＬＣ中の位置１６２、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の位置にある、項目１０３に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0109】
１０５．第３の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含むか、または第３の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第３の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第４の相手指向変化を含む、項目１０３または１０４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0110】
１０６．変化Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ／Ｒ４０９Ｅ／Ｄを含む、項目５５～１０５のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0111】
１０７．配列番号１８５および１８７のアミノ酸配列を含む、抗ｈＰＤ１抗体。
【0112】
１０８．項目１～５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体および項目５５～１０７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体を含む、抗体の混合物。
【0113】
１０９．項目８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体および項目６１に記載の抗ｈＰＤ１抗体を含む、項目１０８に記載の抗体の混合物。
【0114】
１１０．混合物が単一宿主細胞株中で産生される、項目１０８または１０９に記載の抗体の混合物。
【0115】
１１１．３種以下の抗体主要種を含む、項目１１０に記載の抗体の混合物。
【0116】
１１２．２種以下の抗体主要種を含む、項目１１１に記載の抗体の混合物。
【0117】
１１３．項目１～５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目５５～１０７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、または項目１０８～１１２のいずれか１項に記載の抗体の混合物をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチド。
【0118】
１１４．項目１０８～１１２のいずれか１項に記載の抗体の混合物をコードする、項目１１３に記載のポリヌクレオチド。
【0119】
１１５．項目１１３または１１４に記載のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数のベクター。
【0120】
１１６．ウイルスベクターである、項目１１５に記載のベクター。
【0121】
１１７．腫瘍溶解性ウイルスベクターである、項目１１６に記載のベクター。
【0122】
１１８．レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、またはポックスウイルスベクターである、項目１１６または１１７に記載のベクター。
【0123】
１１９．項目１～５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目５５～１０７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１０８～１１２のいずれか１項に記載の抗体の混合物、項目１１３または１１４に記載のポリヌクレオチド、または項目１１５～１１８のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【0124】
１２０．項目１１３もしくは１１４に記載のポリヌクレオチドまたは項目１１５もしくは１１６に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
【0125】
１２１．哺乳動物細胞である項目１２０に記載の宿主細胞。
【0126】
１２２．ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である項目１２１に記載の宿主細胞。
【0127】
１２３．項目１２０～１２２のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、抗体または抗体の混合物を培地または細胞集団から回収することを含む、抗体または抗体の混合物の製造方法。
【0128】
１２４．項目１～５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目５５～１０７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１０８～１１２のいずれか１項に記載の混合物、項目１１３または１１４に記載のポリヌクレオチド、項目１１５～１１８のいずれか１項に記載のベクター、または項目１１９に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、固形腫瘍または血液悪性腫瘍の患者を治療する方法。
【0129】
１２５．抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、または抗体の混合物を投与することを含む、項目１２４に記載の方法。
【0130】
１２６．患者が黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、腎明細胞癌、ホジキンリンパ腫、または頭頸部扁平上皮細胞癌である、項目１２４または１２５に記載の方法。
【0131】
１２７．抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、または抗体の混合物、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の前に、後に、および／またはそれと同時に、追加の療法剤を投与することをさらに含み、追加の療法剤が、免疫調節性分子、照射、化学療法剤、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択される、項目１２４～１２６のいずれか１項に記載の方法。
【0132】
１２８．追加の療法剤が、照射または化学療法剤である、項目１２７に記載の方法。
【0133】
１２９．追加の療法剤が、ＰＤＬ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＳＦＲ１ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、またはＣＤ７３のアンタゴニスト；ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＣＤ４０のアゴニスト；タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））などの腫瘍溶解性ウイルス；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）（ＢｉＴＥ）；インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤；ベバシズマブなどの抗血管新生薬；抗体－薬物複合体；およびチロシンキナーゼ阻害剤からなる群より選択される、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または免疫調節性分子である、項目１２７に記載の方法。
【0134】
１３０．項目１～５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目５５～１０７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１０８～１１２のいずれか１項に記載の混合物、項目１１３または１１４に記載のポリヌクレオチド、項目１１５～１１８のいずれか１項に記載のベクター、または項目１１９に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の免疫応答を誘導する、または免疫応答を高める方法。
【0135】
１３１．抗体の混合物、抗体の混合物をコードする１つまたは複数のベクター、または抗体の混合物もしくは抗体の混合物をコードするベクターを含む医薬組成物を投与することを含む、項目１３０に記載の方法。
【0136】
１３２．患者が黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、腎明細胞癌、ホジキンリンパ腫、または頭頸部扁平上皮細胞癌である、項目１３０または１３１に記載の方法。
【0137】
１３３．抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、抗体の混合物、ポリヌクレオチド、またはベクターの前に、後に、および／またはそれと同時に、追加の療法剤を投与することをさらに含み、追加の療法剤が、免疫調節性分子、照射、化学療法剤、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択される、項目１３０～１３２のいずれか１項に記載の方法。
【0138】
１３４．追加の療法剤が、照射または化学療法剤である、項目１３３に記載の方法。
【0139】
１３５．追加の療法剤が、ＰＤＬ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＳＦＲ１ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、またはＣＤ７３のアンタゴニスト；ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＣＤ４０のアゴニスト；タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））などの腫瘍溶解性ウイルス；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）；インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤；ベバシズマブなどの抗血管新生薬；抗体－薬物複合体；およびチロシンキナーゼ阻害剤からなる群より選択される、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または免疫調節性分子である、項目１３３に記載の方法。
【0140】
１３６．項目１～５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目５５～１０７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１０８～１１２のいずれか１項に記載の混合物、項目１１３または１１４に記載のポリヌクレオチド、項目１１５～１１８のいずれか１項に記載のベクター、または項目１１９に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、感染症の患者を治療する方法。
【0141】
１３７．それぞれ、配列番号３、４、および５、配列番号３、１３および５、配列番号３、２０、および２１、配列番号３、２４、および２５、配列番号３、３１、および５、配列番号３、３７、および５、配列番号３、４３、および５、配列番号３、４６、および４７、配列番号３、５９、および５、配列番号３、６５、および２１、または配列番号３、７０、および２１のアミノ酸配列を含む、ＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、およびＶＨ相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）抗体。
【0142】
１３８．ＶＨが、配列番号８２のアミノ酸配列を含む、項目１３７に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0143】
１３９．ＶＨが、配列番号８３のアミノ酸配列を含む、項目１３８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0144】
１４０．ＶＨが、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、および６９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１３９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0145】
１４１．それぞれ、配列番号８、９、および１０、配列番号１６、９および１７、配列番号２８、９、および１７、配列番号３４、９、および１７、配列番号４０、９、および１０、配列番号５０、９、および１７、配列番号５５、９、および５６、配列番号４０、９、および６２、配列番号１６、９、および６２、または配列番号７３、９、および６２のアミノ酸配列を含む、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0146】
１４２．ＶＬが、配列番号８４のアミノ酸配列を含む、項目１４１に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0147】
１４３．ＶＬが、配列番号８５のアミノ酸配列を含む、項目１４２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0148】
１４４．ＶＬが、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４３に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0149】
１４５．それぞれ、配列番号８、９、および１０、配列番号１６、９および１７、配列番号２８、９、および１７、配列番号３４、９、および１７、配列番号４０、９、および１０、配列番号５０、９、および１７、配列番号５５、９、および５６、配列番号４０、９、および６２、配列番号１６、９、および６２、または配列番号７３、９、および６２のアミノ酸配列を含む、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬをさらに含む、項目１３７～１４０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0150】
１４６．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、アミノ酸配列：
（ａ）配列番号３、４、５、８、９、および１０；
（ｂ）配列番号３、１３、５、１６、９、および１７；
（ｃ）配列番号３、２０、２１、１６、９、および１７；
（ｄ）配列番号３、２４、２５、２８、９、および１７；
（ｅ）配列番号３、３１、５、３４、９、および１７；
（ｆ）配列番号３、３７、５、４０、９、および１０；
（ｇ）配列番号３、４３、５、２８、９、および１７；
（ｈ）配列番号３、４６、４７、５０、９、および１７；
（ｉ）配列番号３、３１、５、５５、９、および５６；
（ｊ）配列番号３、５９、５、４０、９、および６２；
（ｋ）配列番号３、６５、２１、１６、９、および６２；または
（ｌ）配列番号３、７０、２１、７３、９、および６２、
を含む、項目１４５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）配列番号３、４、５、８、９、および１０；
（ｂ）配列番号３、１３、５、１６、９、および１７；
（ｃ）配列番号３、２０、２１、１６、９、および１７；
（ｄ）配列番号３、２４、２５、２８、９、および１７；
（ｅ）配列番号３、３１、５、３４、９、および１７；
（ｆ）配列番号３、３７、５、４０、９、および１０；
（ｇ）配列番号３、４３、５、２８、９、および１７；
（ｈ）配列番号３、４６、４７、５０、９、および１７；
（ｉ）配列番号３、３１、５、５５、９、および５６；
（ｊ）配列番号３、５９、５、４０、９、および６２；
（ｋ）配列番号３、６５、２１、１６、９、および６２；または
（ｌ）配列番号３、７０、２１、７３、９、および６２、
を含む、項目１４５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0151】
１４７．ＶＬが配列番号８４のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号８２のアミノ酸配列を含む、項目１４５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0152】
１４８．ＶＬが配列番号８５のアミノ酸配列を含み、ＶＨが配列番号８３のアミノ酸配列を含む、項目１４７に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0153】
１４９．ＶＬが、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0154】
１５０．ＶＨおよびＶＬが、それぞれ、配列番号２および７；配列番号１２および１５；配列番号１９および１５；配列番号２３および２７；配列番号３０および３３；配列番号３６および３９；配列番号４２および２７；配列番号４５および４９；配列番号５２および５４；配列番号５８および６１；配列番号６４および６７；および配列番号６９および７２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１４９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0155】
１５１．ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体である、項目１３７～１５０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0156】
１５２．ＩｇＧ４抗体、または変化Ｋ４０９Ｒを含むＩｇＧ１抗体である、項目１５１に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0157】
１５３．ＩｇＧ１抗体である、項目１５１に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0158】
１５４．重鎖（ＨＣ）および／または軽鎖（ＬＣ）が、ＨＣ中の位置４４、１０５、１４７、１６８および１８１ならびにＬＣ中の位置４３、１００、１３１、１７４、および１７８からなる群より選択される１つまたは複数の位置に、少なくとも１つの相手指向変化を含み、相手指向変化が、荷電アミノ酸が別のアミノ酸を置換する置換であり、置換された相手指向変化の荷電アミノ酸が抗体内の接触アミノ酸の電荷対の一部を形成し、電荷対を形成するアミノ酸の接触対が、
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される項目１５１～１５３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される項目１５１～１５３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0159】
１５５．抗ｈＣＴＬＡ４抗体がＩｇＧ１抗体であり、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置に第２の相手指向変化を含み、第２の相手指向変化が、システインが別のアミノ酸を置換する置換であり、第２の相手指向変化の置換システインが、（１）第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触する、項目１５１、１５２、または１５４に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0160】
１５６．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｃ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸；
（ｄ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０のアミノ酸；および
（ｅ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１５５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｃ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸；
（ｄ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０のアミノ酸；および
（ｅ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１５５に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0161】
１５７．第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含むか、または第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含む、項目１５５または１５６に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0162】
１５８．抗ｈＣＴＬＡ４抗体がＩｇＧ４抗体であり、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置に第２の相手指向変化を含み、第２の相手指向変化が、システインが別のアミノ酸を置換する置換であり、第２の相手指向変化の置換システインが、（１）第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触する、項目１５１、１５２、および１５４のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0163】
１５９．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；および
（ｃ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１５８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；および
（ｃ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１５８に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0164】
１６０．第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含むか、または第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含む、項目１５９に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0165】
１６１．変化Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含む、項目１５１～１６０のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0166】
１６２．抗体のＦｃ部分が抗体のインビボでのクリアランスを高める１つまたは複数の変化を含む、項目１５１～１６１のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0167】
１６３．抗体のＦｃ部分が、次の変化：Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５ＫまたはＨ４３５Ｒの内の少なくとも１つを含む、項目１６２に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体。
【0168】
１６４．それぞれ、配列番号８８、８９、および９０、配列番号９８、８９および９９、配列番号１０５、８９、および９０、配列番号１０５、１１１、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号８８、８９、および１１２、配列番号８８、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１３４、配列番号９８、８９、および９０、配列番号９８、１１１、および１１２、配列番号１４９、１５０、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号１４９、８９、および１２７、または配列番号１０５、８９、および１２７のアミノ酸配列を含む、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨを含む抗ｈＰＤ１抗体。
【0169】
１６５．ＶＨが、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む、項目１６４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0170】
１６６．ＶＨが、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、項目１６５に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0171】
１６７．ＶＨが、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、および１６６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１６６に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0172】
１６８．ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを含み、これらのそれぞれが、配列番号９３、９４、および９５、配列番号１０２、９４、および９５、配列番号９３、１０８、および９５、配列番号１１５、９４、および９５、配列番号１２０、９４、および９５、配列番号１０２、１０８、および９５、配列番号１３０、１０８、および１３１、配列番号１３７、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、または配列番号１３０、９４、および１３１のアミノ酸配列を含む、抗ｈＰＤ１抗体。
【0173】
１６９．ＶＬが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、項目１６８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0174】
１７０．ＶＬが、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、項目１６９に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0175】
１７１．ＶＬが、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１７０に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0176】
１７２．ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬをさらに含み、これらのそれぞれが、配列番号９３、９４、および９５、配列番号１０２、９４、および９５、配列番号９３、１０８、および９５、配列番号１１５、９４、および９５、配列番号１２０、９４、および９５、配列番号１０２、１０８、および９５、配列番号１３０、１０８、および１３１、配列番号１３７、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、または配列番号１３０、９４、および１３１のアミノ酸配列を含む、項目１６４～１６７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0177】
１７３．ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み、これらのそれぞれが、アミノ酸配列：
（ａ）配列番号８８、８９、９０、９３、９４、および９５；
（ｂ）配列番号９８、８９、９９、１０２、９４、および９５；
（ｃ）配列番号１０５、８９、９０、９３、１０８、および９５；
（ｄ）配列番号１０５、１１１、１１２、１１５、９４、および９５；
（ｅ）配列番号１０５、１１１、９０、１２０、９４、および９５；
（ｆ）配列番号８８、８９、１１２、１０２、１０８、および９５；
（ｇ）配列番号８８、８９、１２７、１３０、１０８、および１３１；
（ｈ）配列番号８８、８９、１３４、１３７、９４、および１３１；
（ｉ）配列番号９８、８９、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｊ）配列番号９８、１１１、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｋ）配列番号１４９、１５０、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｌ）配列番号１０５、１１１、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｍ）配列番号１４９、８９、１２７、１１５、９４、および９５；
（ｎ）配列番号８８、８９、１１２、９３、９４、および９５；または
（ｏ）配列番号１０５、８９、１２７、１０２、１０８、および９５、
を含む、項目１７２に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）配列番号８８、８９、９０、９３、９４、および９５；
（ｂ）配列番号９８、８９、９９、１０２、９４、および９５；
（ｃ）配列番号１０５、８９、９０、９３、１０８、および９５；
（ｄ）配列番号１０５、１１１、１１２、１１５、９４、および９５；
（ｅ）配列番号１０５、１１１、９０、１２０、９４、および９５；
（ｆ）配列番号８８、８９、１１２、１０２、１０８、および９５；
（ｇ）配列番号８８、８９、１２７、１３０、１０８、および１３１；
（ｈ）配列番号８８、８９、１３４、１３７、９４、および１３１；
（ｉ）配列番号９８、８９、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｊ）配列番号９８、１１１、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｋ）配列番号１４９、１５０、１１２、１３０、９４、および１３１；
（ｌ）配列番号１０５、１１１、９０、１４２、９４、および１３１；
（ｍ）配列番号１４９、８９、１２７、１１５、９４、および９５；
（ｎ）配列番号８８、８９、１１２、９３、９４、および９５；または
（ｏ）配列番号１０５、８９、１２７、１０２、１０８、および９５、
を含む、項目１７２に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0178】
１７４．ＶＬが、配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、項目１７２または１７３に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0179】
１７５．ＶＬが、配列番号１８３のアミノ酸配列を含む、項目１７４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0180】
１７６．ＶＬが、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１７５に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0181】
１７７．ＶＨおよびＶＬが、それぞれ、配列番号８７および９２；配列番号９７および１０１；配列番号１０４および１０７；配列番号１１０および１１４；配列番号１１７および１１９；配列番号１２２および１２４；配列番号１２６および１２９；配列番号１３３および１３６；配列番号１３９および１４１；配列番号１４４および１４６；配列番号１４８および１５２；配列番号１５４および１５６；配列番号１５８および１６０；配列番号１６２および１６４；および配列番号１６６および１６８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項目１７４に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0182】
１７８．ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体である、項目１６４～１７７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0183】
１７９．ＩｇＧ４抗体、または変化Ｋ４０９Ｒを含むＩｇＧ１抗体である、項目１７８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0184】
１８０．ＩｇＧ１抗体である、項目１７８に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0185】
１８１．ＨＣおよび／またはＬＣが、ＨＣ中の位置４４、１０５、１４７、１６８および１８１ならびにＬＣ中の位置４３、１００、１３１、１７４、および１７８からなる群より選択される１つまたは複数の位置に、少なくとも１つの相手指向変化を含み、相手指向変化が、荷電アミノ酸が別のアミノ酸を置換する置換であり、置換された相手指向変化の荷電アミノ酸が抗体内の電荷対の一部を形成し、電荷対を形成するアミノ酸の接触対が、
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される、項目１７８～１８０のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される、項目１７８～１８０のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0186】
１８２．抗ｈＰＤ１抗体がＩｇＧ１抗体であり、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置に第２の相手指向変化を含み、第２の相手指向変化が、システインが別のアミノ酸を置換する置換であり、第２の相手指向変化の置換システインが、（１）第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触する、項目１７８、１７９、または１８１に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0187】
１８３．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｃ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸；
（ｄ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０のアミノ酸；および
（ｅ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１８２に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｃ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸；
（ｄ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０のアミノ酸；および
（ｅ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１８２に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0188】
１８４．第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含むか、または第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含む、項目１８２または１８３に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0189】
１８５．抗ｈＰＤ１抗体がＩｇＧ４抗体であり、抗ｈＰＤ１抗体のＨＣまたはＬＣが、ＨＣまたはＬＣ中のアミノ酸の位置に第２の相手指向変化を含み、第２の相手指向変化が、システインが別のアミノ酸を置換する置換であり、第２の相手指向変化の置換システインが、（１）第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣ中のシステインと接触する、項目１７８、１７９、および１８１のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0190】
１８６．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；および
（ｃ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１８５に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
（ａ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；および
（ｃ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、
からなる群より選択されるＨＣおよびＬＣ内の対の位置にある、項目１８５に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0191】
１８７．第２の相手指向変化がＨＣ中にある場合、ＬＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含むか、または第２の相手指向変化がＬＣ中にある場合、ＨＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含む、項目１８６に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0192】
１８８．変化Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含む、項目１７８～１８７のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体。
【0193】
１８９．項目１３７～１６３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体および項目１６４～１８８のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体を含む、抗体の混合物。
【0194】
１９０．項目１５１に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体および項目１７８に記載の抗ｈＰＤ１抗体を含む、項目１８９に記載の抗体の混合物。
【0195】
１９１．抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＦｃ部分が、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のインビボでのクリアランスを高める１つまたは複数の変化を含む、項目１９０に記載の抗体の混合物。
【0196】
１９２．抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＦｃ部分が、次の変化：Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５ＫまたはＨ４３５Ｒの内の少なくとも１つを含む、項目１９１に記載の抗体の混合物。
【0197】
１９３．混合物が単一宿主細胞株中で産生される、項目１８９～１９２のいずれか１項に記載の抗体の混合物。
【0198】
１９４．３種以下の抗体主要種を含む、項目１９３に記載の抗体の混合物。
【0199】
１９５．抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体のいずれか１つまたは両方のＨＣおよび／またはＬＣが、ＨＣ中の位置４４、１０５、１４７、１６８および１８１ならびにＬＣ中の位置４３、１００、１３１、１７４、および１７８からなる群より選択される１つまたは複数の位置に、少なくとも１つの相手指向変化を含み、相手指向変化が、荷電アミノ酸がいずれか他のアミノ酸を置換する置換であり、置換された相手指向変化の荷電アミノ酸が、いずれかのまたは両方の同族ＨＣ／ＬＣ対内のアミノ酸の電荷対の一部を形成し、電荷対を形成するアミノ酸の接触対が、
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される、項目１９０～１９４のいずれか１項に記載の抗体の混合物。
（ａ）４４Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１００Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または４４Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１００Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｂ）１０５Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および４３Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１０５Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および４３Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｃ）１４７Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１３１Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１４７Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１３１Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；
（ｄ）１６８Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７４Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１６８Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７４Ｒ／Ｋ（ＬＣ）；および
（ｅ）１８１Ｒ／Ｋ（ＨＣ）および１７８Ｄ／Ｅ（ＬＣ）または１８１Ｄ／Ｅ（ＨＣ）および１７８Ｒ／Ｋ（ＬＣ）、
からなる群より選択される、項目１９０～１９４のいずれか１項に記載の抗体の混合物。
【0200】
１９６．抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体のいずれか１つまたは両方の重鎖および／または軽鎖が、ＨＣまたはＬＣ中に第２の相手指向変化を含み、第２の相手指向変化が起こる抗体がＩｇＧ１抗体であり、第２の相手指向変化が、システインが別のアミノ酸を置換する置換であり、第２の相手指向変化の置換システインが、（１）第２の相手指向変化が片方または両方の抗体のＬＣ中にある場合、同族ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第２の相手指向変化が片方または両方の抗体のＨＣ中にある場合、同族ＬＣ中のシステインと接触する、項目１９０～１９５のいずれか１項に記載の抗体の混合物。
【0201】
１９７．接触システイン対が、
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｃ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸；
（ｄ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０のアミノ酸；および
（ｅ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、からなる群より選択される、いずれかまたは両方の抗体の同族ＨＣ／ＬＣ対内の対の位置にある、項目１９６に記載の抗体の混合物。
（ａ）ＨＣ中の位置１２６およびＬＣ中の位置１２１のアミノ酸；
（ｂ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；
（ｃ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸；
（ｄ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６０のアミノ酸；および
（ｅ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、からなる群より選択される、いずれかまたは両方の抗体の同族ＨＣ／ＬＣ対内の対の位置にある、項目１９６に記載の抗体の混合物。
【0202】
１９８．第２の相手指向変化が片方または両方の抗体のＨＣ中にある場合、同族ＬＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含むか、または第２の相手指向変化が片方または両方の抗体のＬＣ中にある場合、同族ＨＣが第２の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第３の相手指向変化を含む、項目１９６または１９７に記載の抗体の混合物。
【0203】
１９９．抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体のいずれかまたは両方の重鎖および／または軽鎖が、ＨＣまたはＬＣ中に第４の相手指向変化を含み、第４の相手指向変化が起こる抗体（単一または複数）がＩｇＧ４抗体であり、第４の相手指向変化が、システインが別のアミノ酸を置換する置換であり、第４の相手指向変化の置換システインが、（１）第４の相手指向変化が片方または両方の抗体のＬＣ中にある場合、同族ＨＣ中のシステインと接触し、または（２）第４の相手指向変化が片方または両方の抗体のＨＣ中にある場合、同族ＬＣ中のシステインと接触する、項目１９０～１９５のいずれか１項に記載の抗体の混合物。
【0204】
２００．接触システイン対が、（ａ）ＨＣ中の位置１７０およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸；（ｂ）ＨＣ中の位置１７３およびＬＣ中の位置１６２のアミノ酸、および（ｃ）ＨＣ中の位置１８３およびＬＣ中の位置１７６のアミノ酸、からなる群より選択される同族ＨＣ／ＬＣ対内の対の位置にある、項目１９９に記載の抗体の混合物。
【0205】
２０１．第４の相手指向変化が片方または両方の抗体のＨＣ中にある場合、同族ＬＣが第４の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第５の相手指向変化を含むか、または第４の相手指向変化が片方または両方の抗体のＬＣ中にある場合、同族ＨＣが第４の相手指向変化のアミノ酸と接触するアミノ酸の位置でのシステイン置換である第５の相手指向変化を含む、項目２００に記載の抗体の混合物。
【0206】
２０２．混合物が、２種以下の抗体主要種を含む、項目１８９～２０１のいずれか１項に記載の抗体の混合物。
【0207】
２０３．（１）抗ｈＰＤ１抗体がＩｇＧ４抗体、または変化Ｋ４０９Ｒを含むＩｇＧ１抗体であり、（２）抗ｈＣＴＬＡ４抗体が変化Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含むＩｇＧ１抗体である、項目２０２に記載の抗体の混合物。
【0208】
２０４．項目１３７～１６３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１６４～１８８のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、または項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の抗体の混合物をコードする、１つまたは複数のポリヌクレオチド。
【0209】
２０５．項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の抗体の混合物をコードする、項目２０４に記載のポリヌクレオチド。
【0210】
２０６．項目２０４または２０５に記載のポリヌクレオチドを含む、１つまたは複数のベクター。
【0211】
２０７．ウイルスベクターである、項目２０６に記載のベクター。
【0212】
２０８．腫瘍溶解性ウイルスベクターである、項目２０７に記載のベクター。
【0213】
２０９．レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、またはポックスウイルスベクターである、項目２０７または２０８に記載のベクター。
【0214】
２１０．項目１３７～１６３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１６４～１８８のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の抗体の混合物、項目２０４または２０５に記載のポリヌクレオチド、または項目２０６～２０９のいずれか１項に記載のベクターを含む、医薬組成物。
【0215】
２１１．項目２０４もしくは２０５に記載のポリヌクレオチドまたは項目２０６もしくは２０７に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
【0216】
２１２．哺乳動物細胞である項目２１１に記載の宿主細胞。
【0217】
２１３．ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である項目２１２に記載の宿主細胞。
【0218】
２１４．項目２１１～２１３のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養し、抗体または抗体の混合物を培地または細胞集団から回収することを含む、抗体または抗体の混合物の製造方法。
【0219】
２１５．項目１３７～１６３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１６４～１８８のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の混合物、項目２０４または２０５に記載のポリヌクレオチド、項目２０６～２０９のいずれか１項に記載のベクター、または項目２１０に記載の医薬組成物を投与することを含む、固形腫瘍または血液悪性腫瘍の患者を治療する方法。
【0220】
２１６．項目１４６に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１７３に記載の抗ｈＰＤ１抗体、または項目１８９に記載の抗体の混合物を投与することを含む、項目２１５に記載の方法。
【0221】
２１７．患者が黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、腎明細胞癌、ホジキンリンパ腫、または頭頸部扁平上皮細胞癌である、項目２１５または２１６に記載の方法。
【0222】
２１８．抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、抗体の混合物、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の前に、後に、および／またはそれと同時に、追加の療法剤を投与することをさらに含み、追加の療法剤が、免疫調節性分子、照射、化学療法剤、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択される、項目２１６または２１７に記載の方法。
【0223】
２１９．追加の療法剤が、照射または化学療法剤である、項目２１８に記載の方法。
【0224】
２２０．追加の療法剤が、ＰＤＬ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＳＦＲ１ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、またはＣＤ７３のアンタゴニスト；ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＣＤ４０のアゴニスト；タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））などの腫瘍溶解性ウイルス；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）；インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤；ベバシズマブなどの抗血管新生薬；抗体－薬物複合体；またはチロシンキナーゼ阻害剤である、項目２１８に記載の方法。
【0225】
２２１．項目１３７～１６３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１６４～１８８のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の混合物、項目２０４または２０５に記載のポリヌクレオチド、項目２０６～２０９のいずれか１項に記載のベクター、または項目２１０に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、患者の免疫応答を誘導する、または高める方法。
【0226】
２２２．項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の抗体の混合物、または項目２０６に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを投与することを含む、項目２２１に記載の方法。
【0227】
２２３．患者が黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、腎明細胞癌、ホジキンリンパ腫、または頭頸部扁平上皮細胞癌である、項目２２１または２２２に記載の方法。
【0228】
２２４．抗体、抗体の混合物、ポリヌクレオチド、ベクター、または医薬組成物の前に、後に、および／またはそれと同時に、追加の療法剤を投与することをさらに含み、追加の療法剤が、免疫調節性分子、照射、化学療法剤、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択される、項目２２１～２２３のいずれか１項に記載の方法。
【0229】
２２５．追加の療法剤が、照射または化学療法剤である、項目２２４に記載の方法。
【0230】
２２６．追加の療法剤が、ＰＤＬ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＳＦＲ１ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、またはＣＤ７３のアンタゴニスト；ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＣＤ４０のアゴニスト；タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））などの腫瘍溶解性ウイルス；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）；インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤；ベバシズマブなどの抗血管新生薬；抗体－薬物複合体；またはチロシンキナーゼ阻害剤である、項目２２４に記載の方法。
【0231】
２２７．項目１３７～１６３のいずれか１項に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１６４～１８８のいずれか１項に記載の抗ｈＰＤ１抗体、または項目１８９～２０３のいずれか１項に記載の混合物を患者に投与することを含む、感染症の患者を治療する方法。
【0232】
２２８．項目１４６に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、項目１７３に記載の抗ｈＰＤ１抗体、または項目１９３に記載の混合物を投与することを含む、項目２２７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0233】
【図1】抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＶＨ ＣＤＲのアミノ酸配列。アミノ酸は、それらの１文字表記で特定される。左端の縦列は、本明細書で参照される各抗体の名称を示す。各抗体のＶＨのＣＤＲは、図に示すように、同じ行中の名称の右側に示される。抗体１Ｅ１のＣＤＲ中の同じ位置のアミノ酸と異なるアミノ酸は、太字のイタリック体で示される。１２個の抗体のＣＤＲの下にあるのは、プレーン太字体で示した各ＣＤＲのコンセンサス配列である。変えることができるコンセンサス配列の位置では、その位置で生じ得る別のアミノ酸が下に示され、最も高頻度アミノ酸（または他の全てより高い頻度の、２個の同等の高頻度のアミノ酸の内の１つ）が別のアミノ酸の上に、ＣＤＲの完全配列で示されている。
【図3】抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨのアミノ酸配列。各抗体の名称は、各配列の行の左側に示されている。１２個のＣＴＬＡ４抗体のＶＨの成熟アミノ酸配列が示されている。ＣＤＲには下線が引いてある。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，ＦＩＦＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１に従ったナンバリングを配列の上に２０アミノ酸間隔で示している。このナンバリングは、全ての場合に実際のアミノ酸の数に対応しない。理由は、このナンバリングシステムのカウントに入っていない、挿入アミノ酸（＃で示した）が配列全体にわたりいくつかの位置で発生するためである。１２個の配列中で変化するアミノ酸は、太字で示している。ヒトＶＨに適用した、このナンバリングシステムの例示は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号（この出願は、参照により本明細書に組み込まれる）の表５、および下記表２に示されている。
【図4】抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＬのアミノ酸配列。ＣＤＲおよび可変アミノ酸が、Ｋａｂａｔらの前出のナンバリングシステムを用いて、図３と同様に示されている。ＶＬに適用した、このナンバリングシステムの例示は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号（この出願は、参照により本明細書に組み込まれる）の表９、および下表６に示されている。これらの配列には挿入アミノ酸は存在しない。
【図9】抗ｈＣＴＬＡ４ Ｆａｂフラグメントを選択するための細胞選別。手順は、実施例１に詳細に記載されている。ｘ軸は、提示ＦａｂのフラグメントＣＨ１ドメイン（ＣＨ１）と細胞壁タンパク質凝集素との間でＨＡタグに特異的な標識抗体で検出した、酵母細胞上の提示Ｆａｂフラグメントの発現レベルを示す。ｙ軸は、上段のグラフでは、標識ネガティブコントロールタンパク質（標識ＰＤ１－Ｆｃ融合タンパク質）の細胞に対する結合量を示し、または、下段の２つのグラフでは、標識ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃ融合タンパク質の細胞に対する結合量を示す。「ＰＳ」と標識した多角形は、ソーティングウインドウを示す。下段の２つのパネルは、選択手順での第１（左側）および第２（右側）の選別からのデータを示す。
【図10】抗ｈＰＤ１ Ｆａｂフラグメントを選択するための細胞選別。手順は、実施例２に詳細に記載されている。表記は、図９で記載の通りである。図に示すように、上段右、下段左、および下段右パネルは、それぞれ、標識したｈＰＤ１タンパク質を用いて抗ｈＰＤ１抗体が検出された第１、第２、および第３ラウンドの選別由来のデータを含む。上段左のパネルは、検出用のネガティブコントロールタンパク質（ビオチン化ヒトＰＤＬ１タンパク質）を用いた選別由来のデータを含む。
【図11】抗体によるｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１／ｈＢ７－２との間の相互作用の抑制。遺伝子改変ジャーカットＴ細胞を用いて、ｈＣＴＬＡ４およびｈＢ７－１／ｈＢ７－２の抑制をアッセイする手順は、実施例４に記載され、アッセイの数値結果は、表１２で報告されている。試料を特定する記号の意味は、各パネルの上部左側コーナーに凡例により示されている。１０Ｄ１抗体は、ポジティブコントロール抗ＣＴＬＡ４抗体である。ｘ軸は、示した抗ｈＣＴＬＡ４抗体の使用濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は、相対発光単位（ＲＬＵ）を平均プラスまたはマイナス平均の標準誤差（±ＳＥＭ）として示す。
【図12】ブドウ状球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）Ｔ細胞活性化アッセイにおける抗ｈＣＴＬＡ４抗体の効力。手順は、実施例５に記載されている。試料名は、グラフの上段左側の凡例に示されている。１０Ｄ１抗体は、ポジティブコントロール抗ＣＴＬＡ４抗体である。ｘ軸は、アッセイに使用した抗体の濃度（ｎＭ）を示し、ｙ軸は、試料中で検出したインターロイキン－２（ＩＬ－２）（ｐｇ／ｍｌ）のレベルを示す。
【図13】抗ｈＰＤ１抗体によるｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１相互作用の抑制。手順は、実施例７に記載されている。抗体試料名は、各パネルの上部左側コーナーの凡例により示されている。ｘ軸は、各試料で用いた抗体濃度（ｎＭ）を示す。ｙ軸は、平均ＲＬＵ±ＳＥＭを示す。Ｎｉｖｏ Ｇ４は、ポジティブコントロール抗ｈＰＤ１抗体である。
【図14】抗ｈＰＤ１抗体によるＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用の抑制。手順、すなわち、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）アッセイは、実施例７に記載されている。抗体試料名は、グラフの上部右側コーナーの凡例により示されている。ｘ軸は、アッセイに使用した抗体の濃度（ｎＭ）を示す。ｙ軸は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）±ＳＥＭを示す。Ｎｉｖｏ－Ｇ４およびＰｅｍｂｒｏ－Ｇ４は、ポジティブコントロールＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体である。
【図15】混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける抗ｈＰＤ１抗体の活性。手順は、実施例８に記載されている。全てのパネルの抗体試料名は、上段パネルの上部左側コーナーの凡例により示されている。全てのパネルで、ｘ軸は、各試料における試験抗体の濃度を示す。上段パネルでは、ｙ軸は、試料中で検出されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の濃度を示す。中段パネルおよび下段パネルのｙ軸は、５－エチニル－２’－デオキシ（ｄｅｏｙ）ウリジン（ＥｄＵ）で染色した、ＣＤ４＋（中段パネル）またはＣＤ８＋（下段パネル）Ｔ細胞のパーセンテージを示す。これは、培養液中の増殖細胞のパーセンテージを表す。
【図16】サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リコール応答アッセイにおける抗ｈＰＤ１抗体の活性。手順は、実施例９に記載されている。抗体試料名は、パネルの上部左側コーナーの凡例により示されている。ｘ軸は、各試料における試験抗体の濃度（ｐＭ）を示す。ｙ軸は、試料中で検出されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）の濃度を示す。
【図17】ＨＣ／ＬＣ対形成を評価するためのチェインドロップアウト（Ｃｈａｉｎ ｄｒｏｐ－ｏｕｔ）一過性導入。実験は、実施例１１に記載されている。一緒に第１の抗体（抗ｈＰＤ１＃１）をコードする、第１の重鎖（ＨＣ１）と第１の軽鎖（ＬＣ１）、および一緒に第２の抗体（抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４または１１Ｆ４）をコードする、第２の重鎖（ＨＣ２）と第２の軽鎖（ＬＣ２）をコードするＤＮＡの種々の組み合わせを用いて、各セット５個の試料を遺伝子導入により得る。遺伝子導入に用いたＤＮＡの組み合わせは、次の鎖：レーン１および６、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、およびＬＣ２；レーン２および７、ＨＣ１およびＬＣ１；レーン３および８、ＨＣ１およびＬＣ２；レーン４および９、ＨＣ２およびＬＣ２；およびレーン５および１０、ＨＣ２およびＬＣ１、をコードした。使用した第１と第２の抗体は、改変抗ｈＰＤ１＃１および改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４（左パネル）または改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４（右パネル）であった。
【図18】抗体の質量分析。手順は、実施例１１に記載されている。ｘ軸は、デコンボリューションした質量を示し、ｙ軸は、所与の質量のタンパク質の量を表す、カウントを示す。パネルＡおよびＢは、実施例１１に記載の単一宿主細胞株中で調製した、改変抗ＰＤ１＃１および改変抗ＣＴＬＡ４ １０Ｄ４抗体の混合物由来のデータを示す。
【図19】抗体の質量分析。手順は、実施例１１に記載されている。ｘ軸は、デコンボリューションした質量を示し、ｙ軸は、所与の質量のタンパク質の量を表す、カウントを示す。パネルＡおよびＢは、実施例１１に記載の単一宿主細胞株中で調製した、改変抗ＰＤ１＃１および改変抗ＣＴＬＡ４ １１Ｆ４抗体の混合物由来のデータを示す。
【図20】改変および未改変抗ｈＣＴＬＡ４抗体単独ならびに抗体混合物の効力。手順は、実施例１２に記載されている。ｘ軸は、各アッセイで使用した抗体の濃度を示し、ｙ軸は、ＲＬＵ±ＳＥＭを示す。抗体試料を表す記号および線は次の通り：上段と下段の両方のパネルの、中実四角とこれを繋ぐ実線、抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ１、ポジティブコントロール；中空ダイアモンドとこれを繋ぐ実線、抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４（上段パネル）または１１Ｆ４（下段パネル）；中空下向き三角形とこれを繋ぐ実線、抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４（上段パネル）または１１Ｆ４（下段パネル）、実施例１１に記載のように両方とも改変；中空上向き三角形とこれを繋ぐ点線、改変抗ＰＤ１＃１および改変抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４（上段パネル）または改変抗ｈＣＴＬＡ４抗体１１Ｆ４（下段パネル）の混合物、この場合、実施例１１に記載のように、混合物は単一細胞株中で作製された；および各パネルの下部右コーナーのエラーバー付きの中実円（四角に見える）、数値はネガティブコントロールに対し得られた値で、これは無関係のヒトＩｇＧ１抗体であった。
【図21】改変および未改変抗ｈＰＤ１抗体単独および抗体混合物の効力。手順は、実施例１２に記載されている。ｘ軸は、各アッセイで使用した抗体の濃度を示し、ｙ軸は、ＲＬＵ±ＳＥＭを示す。抗体試料を表す記号および線は次の通り：中実四角とこれを繋ぐ実線、ニボルバムのＶＨとＶＬを有する抗ｈＰＤ１抗体、ポジティブコントロール（上段と下段の両方のパネル）；中実ダイアモンドとこれを繋ぐ実線、改変なしの抗ｈＰＤ１抗体＃１（上段と下段の両方のパネル）；中空下向き三角形とこれを繋ぐ実線、実施例１１に記載のように改変した抗ｈＰＤ１抗体＃１（上段と下段の両方のパネル）；中空上向き三角形とこれを繋ぐ点線、改変抗ｈＰＤ１抗体＃１および改変抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４（下段パネル）または改変抗ｈＣＴＬＡ４抗体１１Ｆ４（上段パネル）の混合物、この場合、実施例１１に記載のように、混合物は単一細胞株中で作製された；および中実円とこれを繋ぐ実線、無関係のヒトＩｇＧ４抗体、ネガティブコントロール（上段と下段の両方のパネル）。
【図22】抗ｈＰＤ１、抗ｈＣＴＬＡ４抗体、またはこれらの組み合わせによるＩＬ－２発現の誘導。手順は、実施例１３に記載されている。種々の試料に添加された抗体は、パネルＡおよびＢのそれぞれの上部左コーナーの凡例に示されている。表記「ａ－ＰＤ１（＃１）」は、抗ｈＰＤ１抗体１を示し、表記「ａ－ＣＴＬＡ４（＃１０Ｄ４）」および「ａ－ＣＴＬＡ４（＃１１Ｆ４）」は、それぞれ、抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４および１１Ｆ４を示す。図に示すように、ｘ軸は、試料中のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）のナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）単位の濃度を示し、ｙ軸は、試料の細胞上清中で検出されたＩＬ－２の濃度（ピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍＬ））を示す。
【発明を実施するための形態】
【0234】
配列表への参照
本出願は、２０１７年９月２０日に作成され、１８５キロバイト（ＫＢ）のサイズのＳＢ００２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして電子申請された配列表を含む。この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年９月２０日に作成され、１８５キロバイト（ＫＢ）のサイズのＳＢ００２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルとして電子申請された配列表を含む。この配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0235】
詳細な説明
本明細書で記載されるのは、ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）に結合する抗体、ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）に結合する抗体、これらの抗体の混合物、これらの抗体および混合物をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞、ならびにこれらの抗体、混合物、およびポリヌクレオチドを用いて治療する方法である。本明細書でさらに記載されるのは、これらの抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体の混合物を産生するための単一宿主細胞株の利用による、該混合物の製造方法である。本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４の両方に結合でき、ｈＣＴＬＡ４リガンドｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２のｈＣＴＬＡ４への結合を抑制でき、また、１種または複数のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２のＴ細胞による分泌を高めることができる。本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、ｈＰＤＬ１および／またはｈＰＤＬ２のｈＰＤ１への結合を抑制でき、ヒトおよびカニクイザルＰＤ１の両方に結合でき、また、同種抗原に対する１次応答および／またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するリコール応答において、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン分泌を高めることができる。抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体の混合は、Ｔ細胞活性化に対し、いずれかの抗体単独よりも大きな効果を示し得る。
本明細書で記載されるのは、ヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）に結合する抗体、ヒトＰＤ１（ｈＰＤ１）に結合する抗体、これらの抗体の混合物、これらの抗体および混合物をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む宿主細胞、ならびにこれらの抗体、混合物、およびポリヌクレオチドを用いて治療する方法である。本明細書でさらに記載されるのは、これらの抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体の混合物を産生するための単一宿主細胞株の利用による、該混合物の製造方法である。本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４の両方に結合でき、ｈＣＴＬＡ４リガンドｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２のｈＣＴＬＡ４への結合を抑制でき、また、１種または複数のサイトカイン、例えば、ＩＬ－２のＴ細胞による分泌を高めることができる。本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、ｈＰＤＬ１および／またはｈＰＤＬ２のｈＰＤ１への結合を抑制でき、ヒトおよびカニクイザルＰＤ１の両方に結合でき、また、同種抗原に対する１次応答および／またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に対するリコール応答において、Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン分泌を高めることができる。抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体の混合は、Ｔ細胞活性化に対し、いずれかの抗体単独よりも大きな効果を示し得る。
【0236】
定義
本明細書で意図される「アゴニスト」は、特定の生物学的に活性な分子の活性を模倣または強化する分子である。例えば、細胞表面上に発現したタンパク質は、それに結合するサイトカインとの相互作用により、既知の下流の効果を媒介する可能性がある。タンパク質のアゴニストは、そのタンパク質と相互作用する場合、それはサイトカインのそのタンパク質への結合を遮断または抑制する場合も、しない場合もあるが、類似の、あるいはさらに大きい下流効果を誘発し得る。
本明細書で意図される「アゴニスト」は、特定の生物学的に活性な分子の活性を模倣または強化する分子である。例えば、細胞表面上に発現したタンパク質は、それに結合するサイトカインとの相互作用により、既知の下流の効果を媒介する可能性がある。タンパク質のアゴニストは、そのタンパク質と相互作用する場合、それはサイトカインのそのタンパク質への結合を遮断または抑制する場合も、しない場合もあるが、類似の、あるいはさらに大きい下流効果を誘発し得る。
【0237】
本明細書で意図される「変化」は、アミノ酸配列の変更である。変化は、挿入、欠失、または置換であり得る。「変化」は、単一アミノ酸の挿入、欠失、または置換である。例えば、欠失がアミノ酸配列から３個のアミノ酸を除去する場合、３つの変化（この場合、欠失）が生じた。置換である変化は、元の配列中に存在するアミノ酸、それに続く元の配列中のそのアミノ酸の位置、それに続く元のアミノ酸を置換するアミノ酸を明記することにより、参照できる。例えば、Ｇ１３３Ｍは、元の配列中の位置１３３のグリシンがメチオニンにより置換されることを意味する。さらに、１３３Ｍは、位置１３３のアミノ酸はメチオニンであることを意味するが、元のアミノ酸の素性を明記せず、このアミノ酸は、メチオニンを含む任意のアミノ酸であり得る。最後に、Ｇ１３３は、グリシンが元の配列中の位置１３３のアミノ酸であることを意味する。
【0238】
本明細書で意図される「ヘテロダイマーに適さない変化」は、第３の重鎖定常ドメイン（ＣＨ３）アミノ酸配列、場合により、ヒトまたは霊長類ＣＨ３アミノ酸配列内の単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失であり、この置換、挿入、または欠失は、抗体の混合物においては、ヘテロダイマーの形成に適さない。抗体は、ヘテロダイマーに適さない２つ以上の変化を含み得、また、ヘテロダイマーに適さない複数の変化が、抗体の混合物中の１つまたは複数の抗体の複数の位置で生じ得る。いくつかの事例では、ヘテロダイマーに適さない変化は、単独では、ほとんどまたは全く効果がない場合があるが、１つまたは複数のその他のヘテロダイマー形成に適さない変化が同じ抗体中または抗体混合物中の異なる抗体中に存在する場合には、ヘテロダイマー形成を抑制し得る。野生型配列中に存在する、荷電または荷電でない残基の、荷電残基による置換は、変化に含まれ得る。あるいは、置換は、「突出部」の別の「突出部」に対する突き合わせ、または「孔」の別の「孔」に対する突き合わせ、などの適切な重鎖／重鎖（ＨＣ／ＨＣ）対形成を妨害する立体障害を生成し得る。突出部またはノブおよび孔は、米国特許第８，６７９，７８５号の第１２欄１２行～第１３欄２行中に記載されている。この特許は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0239】
１つまたは複数の変化がＨＣ／ＨＣヘテロダイマー形成に対し影響を与えるかどうかは、２量体化すると識別可能な大きさのダイマーを形成する２つの異なるＦｃフラグメントをコードするＤＮＡを宿主細胞中に導入することにより判定できる。例えば、１つは、Ｆｃフラグメントを含む完全長ＩｇＧ ＨＣであり得、もう一方は、Ｆｃフラグメントのみを含むフラグメントであり得る。生成されたホモおよびヘテロダイマーの量は、ウェスタンブロッティングにより検出した、これらのタンパク質の大きさにより決定し得る。このような量は、Ｆｃ領域が変化を含むまたは含まない細胞由来の試料で比較し得る。
【0240】
ヘテロダイマーに適さない変化は、「ドメイン界面残基」で生じる。ドメイン界面残基は、米国特許第８，５９２，５６２号の表１および付随する本文で考察されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。このようなドメイン界面残基は、それらが物理的に近接している、すなわち、既知の構造モデルに従って、２つのアミノ酸のアルファ炭素（Ｃα、すなわち、アミノ酸のアミノ部分とカルボキシル部分の間の炭素）の間が最大で１２オングストローム（Å）または１つのアミノ酸の側鎖重原子（水素以外の任意の原子）と、その他のアミノ酸の任意の重原子との間が最大で５．５Åであることが予測される場合、「接触」残基といわれる、または相互に「接触している」といわれる。このような構造は、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／ｈｏｍｅ／ｈｏｍｅ．ｄｏで利用可能）から、またはＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＩＭＭＵＮＯＧＥＮＥＴＩＣＳ ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（ＩＭＧＴ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能）から、オンラインで利用可能である。下表１には、ヒトＩｇＧ抗体中のＣＨ３／ＣＨ３境界の接触残基の例が記載されている。
＊ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：７８－８５による。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【表1】
【0241】
ヘテロダイマーに適さない変化の例には、例えば、４０９Ｒを含む別のＩｇＧ抗体を含む抗体混合物の場合、霊長類ＩｇＧ ＨＣ中のＫ／Ｒ４０９ＤプラスＤ３９９Ｋ／Ｒが挙げられる。
【0242】
本明細書で意図される「アンタゴニスト」は、特定の生物学的に活性な分子の活性を遮断または抑制する薬剤である。例えば、特定のタンパク質は、その結合相手と相互作用する場合、既知の下流効果により生物学的経路を活性化し得る。そのタンパク質のアンタゴニストまたは阻害剤は、場合により、結合タンパク質との相互作用を遮断または抑制することにより、これらの下流効果を小さくし得るまたは取り除き得る。
【0243】
本明細書で意図される「抗体」は、少なくとも１つのＶＨまたはＶＬを含むタンパク質である。抗体は多くの場合、ＶＨとＶＬの両方を含む。ＶＨおよびＶＬは、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ，ＦＩＦＴＨ ＥＤＩＴＩＯＮ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１、ｐｐ．ｘｖｉ－ｘｉｘ ａｎｄ ｐｐ．１０３－５３３（参照により本明細書に組み込まれる）に、十分詳細に記載されている。「抗体」は、多くの可能なフォーマットの内で、単鎖Ｆｖ抗体（ＶＨおよびＶＬがリンカーで結合された、ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ：Ｆｃ抗体（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｃｈ．９ ｉｎ ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．，Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．２８４－２８６（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）に記載のような）、および以下で定義されるＩｇＧ抗体などの異なるフォーマットを有する分子を含む。
【0244】
本明細書で意図される「抗体－薬物複合体」は、化学リンカーを介して薬物または毒素に結合した上記で定義の抗体である。リンカーは、特定の状態下では不安定であり、細胞内の環境中で薬物または毒素を抗体から放出するように機能し得る。薬物または毒素は、細胞傷害性であり得、また、例えば、マイタンシノイド、ドラスタチン、オーリスタチン薬物類似体、クリプトフィシン、ＣＣ－１０６５類似体およびデュオカルマイシンなどのデュオカルマイシン誘導体、エスペラマイシンおよびカリチアマイシンを含むエンジイン抗生物質、ならびにピロロベノジアゼピン（ｐｙｒｏｌｏｂｅｎｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ）を含む多岐にわたる細胞毒素の１つであり得る。抗体－薬物複合体は、癌治療薬として使用される。このような治療薬の例には、ブレンツキシマブベドチン（アドセトリス（登録商標）；Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ／Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびアドトラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【0245】
本明細書で意図される「荷電」アミノ酸は、生理的ｐＨ近傍で電荷を有し得る酸性または塩基性アミノ酸である。これらには、生理的ｐＨで負に帯電している酸性アミノ酸：グルタミン酸（Ｅ）およびアスパラギン酸（Ｄ）、および生理的ｐＨで正に帯電している塩基性アミノ酸：アルギニン（Ｒ）およびリシン（Ｋ）が挙げられる。生理的ｐＨ近傍で部分的に帯電し得る弱塩基性アミノ酸のヒスチジンは、本明細書の「荷電」アミノ酸の定義内に入っていない。混乱を避けるために、本明細書で意図される正電荷は、負電荷に「正反対の電荷」と見なされる。したがって、例えば、アミノ酸残基ＥとＲは、電荷が逆である。
【0246】
本明細書で意図される、「電荷対」は、１対の逆に帯電した、２つの異なるポリペプチド鎖のそれぞれ鎖上の１つの、「接触」アミノ酸である。したがって、電荷対は、多量体タンパク質の異なるポリペプチド鎖上の１対の逆に帯電した接触（本明細書で定義の）アミノ酸である。
【0247】
抗体のインビボでの「クリアランス」は、抗体の除去を意味し、これは、哺乳動物の血流中またはその他の組織中の抗体の除去または抗体の量の減少として検出できる。通常、クリアランス速度を測定するために、抗体が哺乳動物に投与され、その後、哺乳動物の血液または組織が定期的にサンプリングされ、抗体の存在が定量的に検査される。このような検査から、インビボ半減期（Ｔ１／２）および／または曲線下面積（ＡＵＣ）値を得ることができる。Ｔ１／２またはＡＵＣの低減は、本明細書で意図されるクリアランスの増大を示す。マウスにおける改変ヒトＩｇＧ抗体のクリアランスが、未改変抗体に比べて、増大したかまたは低減したかを決定するための例示的方法は、以下のステップを含む。未改変および改変抗体をそれぞれ、別々のマウスの皮下に、例えば、肩の上の皮膚の下に注射できる。後眼窩洞穿刺により各時点で、約０．１ｍＬの全血試料を収集できる。血液を凝固させ、処理して血清を得ることができる。ヒトＦｃに特異的な抗体、例えば、Ｇｙｒｏｓ Ｕ．Ｓ．，Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡから入手可能なものの内の１つなどの市販のイムノアッセイ系を用いて、血清試料中のヒト抗体の存在をアッセイできる。血液試料は、例えば、注射の０、０．５、２、８、２４、７２、１２０、１６８、２４０、３１２、３８４、および４８０時間後に収集できる。薬物動態学的パラメーターは、血清濃度から、例えば、Ｐｈｏｅｎｉｘ．ＲＴＭ．６．３ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて推定できる。
【0248】
「化学療法剤」は、分裂細胞を標的とし、細胞分裂に関係するプロセス、例えば、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、紡錘体の構築、分解、または機能、および／またはこれらのプロセスに関与するヌクレオチドまたはアミノ酸などの分子の合成または安定性を妨害する。したがって、化学療法剤は、癌細胞およびその他の分裂細胞の両方を死滅させ得る。化学療法剤は、当該技術分野で周知である。これらには、例えば、次の薬剤が挙げられる：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、メチルロムスチン、ｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金、チオテパ、およびアジリジニルベンゾキノン）；無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ナイトロジェンマスタード（例えば、メルファラン塩酸塩、クロラムブシル、イホスファミド、およびメクロレタミンＨＣｌ）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））；抗新生物薬抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、ミトラマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、およびブレオマイシン）；植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＶＰ－１６、およびＶＭ－２６）；代謝拮抗物質（例えば、ロイコボリン含有または非含有メトトレキセート、ロイコボリン含有または非含有５－フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ゲムシタビン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、およびフルダラビン）；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）；ならびにアクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、およびミトキサントロン。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）を参照されたい。この文献の関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0249】
その他の化学療法剤には、上記のものと同じ一般的機序により作用するものが挙げられる。例えば、アルキル化剤およびナイトロジェンマスタードなどの作用と同様に、ＤＮＡのアルキル化により作用する試薬は、化学療法剤と見なされる。例えば、メトトレキセート、シタラビン、６－メルカプトプリン、５－フルオロウラシル、およびゲムシタビンと同様に、ヌクレオチド合成を妨害する試薬は、化学療法剤であると見なされる。例えば、パクリタキセルおよびビンブラスチンと同様に、紡錘体毒は、化学療法剤と見なされる。ＤＮＡ複製を妨害するトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ポドフィロトキシン）は、化学療法剤と見なされる。例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシンおよびマイトマイシンにより例示される種々の機序によりＤＮＡ合成を妨害する抗生物質は、化学療法剤と見なされる。アミノ酸をカルバモイル化する試薬（例えば、ロムスチン、カルムスチン）またはアスパラギンプールを枯渇させる試薬（例えば、アスパラギナーゼ）はまた、化学療法剤と見なされる。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １１，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４４．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔａｂｌｅ １４４－２（１９９９）。上記化学療法剤により影響を受ける同じ細胞プロセスに直接影響を与える試薬は、特に、化学療法剤に含まれる。
【0250】
抗体の混合物の場合、本明細書で意図される「同族」ＨＣは、特定のＬＣが対を形成して、特定の抗原に対する結合部位を形成することが分かっているＨＣである。例えば、既知の完全長ＩｇＧ抗体Ｘが抗原Ｘに結合する場合、抗体ＸのＨＣは、抗体ＸのＬＣの同族ＨＣであり、また、逆もまた同じである。さらに、混合物がまた、抗原Ｙに結合する抗体Ｙを含む場合、抗体ＹのＨＣは、抗体ＸのＬＣに対して「非同族」であり、逆も同じであり、および抗体ＹのＬＣは、抗体ＸのＨＣに対して「非同族」であり、逆も同じである。
【0251】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、ＶＨまたはＶＬ内の高頻度可変領域である。各ＶＨおよびＶＬは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲは、抗体の表面上でループを形成し、抗体の結合特異性の決定に主に関与する。ＣＤＲは、４つのより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれる）の間に、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のように散在する。ＣＤＲの位置は、例えば、図３および７（ＶＨについて）および図４および８（ＶＬについて）に示されている。ＫａｂａｔらのＶＨ ＣＤＲの位置は次の通り：ＣＤＲ１は、位置３１～３５にあり（可能な挿入位置は３５Ａおよび３５Ｂとナンバリング）；ＣＤＲ２は、位置５０～６５にあり（可能な挿入位置は５２Ａ～５２Ｃとナンバリング）；ＣＤＲ３は位置９５～１０２にある（可能な挿入位置は１００Ａ～１００Ｋとナンバリング）。Ｋａｂａｔら、前出、ページ：ｘｖｉｉ。ＫａｂａｔらのＶＬ ＣＤＲの位置は次の通り：ＣＤＲ１は、位置２４～３４にあり（可能な挿入位置は２７Ａ～２７Ｆとナンバリング）；ＣＤＲ２は、位置５０～５６にあり；ＣＤＲ３は位置８９～９７にある（可能な挿入位置は９５Ａ～９５Ｆとナンバリング）。Ｋａｂａｔら、前出、ページ：ｘｖｉｉ（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。
【0252】
２つの治療／薬物が同じ小さい時間枠内に、例えば、同じ日に、または同じより長い時間枠内に投与される場合、治療または薬物は、別の治療または薬物と「同時に」投与されると見なされる。このようなより長い時間枠には、例えば、１つの治療／薬物が週１回投与され、もう一方が４日毎に投与される状況が含まれる。この２つの治療／薬物は、決してまたは希にしか同じ日には投与されないであろうが、２つの治療／薬物は、週、月、またはそれ以上の共通の期間にわたり継続的に投与される。同様に、１つの薬物は年１回投与され、もう一方が毎週投与される場合、毎週投与される薬物が、年１回投与される薬物の投与の前および／またはその後にその１年の間に投与されるなら、それらは「同時に」投与されると見なされる。したがって、本明細書で意図される２つの治療／薬物の「同時」投与には、共通の時間中に生ずる２つの異なる治療／薬物による進行中の治療が含まれる。
【0253】
本明細書で意図される「保存的」アミノ酸置換は、類似の特性、例えば、類似の極性、疎水性、または体積を有する異なるアミノ酸によるアミノ酸の置換である。保存的置換には、同じグループ内の別のアミノ酸によるアミノ酸の置換が含まれ、アミノ酸のグループには、次記が含まれる：（１）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含む疎水性アミノ酸；（２）グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンを含む非荷電極性アミノ酸；（３）アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む塩基性アミノ酸；および（４）アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む酸性アミノ酸。保存的置換には、（１）ＡのＶ、Ｌ、またはＩによる、（２）ＲのＫ、Ｑ、またはＮによる、（３）ＮのＱ、Ｈ、Ｋ、Ｒによる、（４）ＤのＥによる、（５）ＣのＳまたはＡによる、（６）ＱのＮによる、（７）ＥのＤによる、（８）、ＧのＰまたはＡによる、（９）ＨのＮ、Ｑ、Ｋ、またはＲによる、（１０）ＩのＬ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦによる、（１１）ＬのＩ、Ｖ、Ｍ、Ａ、またはＦによる、（１２）ＫのＲ、Ｑ、またはＮによる、（１３）ＭのＬ、Ｆ、またはＩによる、（１４）ＦのＬ、Ｖ、Ｉ、Ａ、またはＹによる、（１５）ＰのＡによる、（１６）ＳのＴ、Ａ、またはＧによる、（１７）ＴのＳによる、（１８）ＷのＹまたはＦによる、（１９）ＹのＷ、Ｆ、Ｔ、またはＳによる、および（２０）ＶのＩ、Ｍ、Ｌ、Ｆ、またはＡによる置換も含まれる。
【0254】
本明細書で意図される「システイン置換」は、システインが別のアミノ酸を置換するアミノ酸置換である。
【0255】
抗体に含まれる全てのポリペプチド鎖のアミノ酸配列が、本明細書で意図される「同じ」ではない場合、２つ以上の抗体は「異なる」ことが本明細書で意図される。
【0256】
アミノ酸配列は、それらが相互に対し１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、または挿入を有する場合、「異なる」ことが本明細書で意図されるが、但し、差異が翻訳後修飾のみに起因する場合、すなわち、アミノ配列が同じＤＮＡ配列によりコードされ得る場合には、このような「異なる」アミノ酸配列は、異なるとは見なされない。
【0257】
本明細書で意図される「Ｆｃフラグメント」、「Ｆｃ領域」、または「Ｆｃ部分」は、ヒンジドメイン（ヒンジ）、第２の重鎖定常ドメイン（ＣＨ２）、およびＨＣ由来のＣＨ３から本質的になるが、ＩｇＡまたはＩｇＭなどのいくつかのアイソタイプでは、ＣＨ３から下流の領域をさらに含み得る。
【0258】
本明細書で意図される「重鎖（ＨＣ）」は、少なくともＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。これらの全てのドメインを含むＨＣは、「完全長ＨＣ」または「ＩｇＧ ＨＣ」とも呼ばれ得る。ＩｇＡまたはＩｇＭなどのいくつかのアイソタイプは、ＩｇＭ ＣＨ４ドメインなどの追加の配列を含み得る。Ｋａｂａｔら、前出のナンバリングシステムがＶＨに使用され（図３および７を参照）、ＥＵシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：７８－８５；その全体が本明細書に組み込まれる）がＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３に使用される。これらのよく知られたナンバリングシステムの使用は、本明細書で開示の配列の実際のアミノ酸位置と、ＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎナンバリングシステムを用いてその位置に割り付けた番号との間で差異を生ずる場合がある。しかし、当業者なら、ＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎの番号を、ＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎの番号がどのように割り付けられたかを示す本明細書の下記で開示の表を参照して、開示配列中の位置を特定できる抗体配列の保存された特徴に基づき、開示抗体配列中の任意の特定の位置に割り付けできる。下表２～５は、一般化されたＨＣ配列に対するこのナンバリングを例示する。
表２：この表は、Ｋａｂａｔら（前出）のヒトＶＨアミノ酸配列（Ｉ－ＩＩＩ）に基づく保存アミノ酸を示す。ナンバリングは、Ｋａｂａｔら（前出）による。ＣＤＲ内の位置番号は、太字のイタリック体で書かれている。位置番号とその後ろの文字、例えば、１００Ａは、８２Ａ～８２Ｃを除いて、ＣＤＲの可変長さの理由で、アミノ酸で満たされてもそうでなくてもよい。フレームワーク領域にある位置８２Ａ～８２Ｃは、ヒトＶＨではアミノ酸により常に満たされていることが本明細書で意図されている。特定の位置での単一の太字のアミノ酸は、Ｋａｂａｔら（前出）により記載の、ヒトＶＨの全ての３つのクラス中で、「不変の」アミノ酸を示す。所定の位置のアミノ酸が最も高頻度に１つのアミノ酸または２つのアミノ酸のいずれかである当該位置のこれらのアミノ酸は、プレーン文字で示されている。下線付き太字体の位置番号は、本明細書または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号の実施例で改変されているとして記載されている位置を示す。アミノ酸が指定されていない位置は、上記の基準に適合しなかった。
【表2】
【0259】
表２は、上に示されているように間隔を置いて配置された保存アミノ酸を有する任意のＶＨ配列の目視によるアライメントを可能とする、保存された間隔を有する多数の保存されたアミノ酸が存在することを示す。あるいは、新規配列は、アライメントソフトウェア、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）で利用可能なアライメントソフトウェア（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能なＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ）またはＣＬＵＳＴＡＬ Ｏｍｅｇａ（Ｓｉｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７（１）：５３９）を用いて、既知のＶＨ配列と位置合わせし得る。
【0260】
下表３は、ＣＨ１のコンセンサスアミノ酸配列を示す。
表３：ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎら（前出）による。番号の下に太字で示す単一アミノ酸は、種々の種からのＣＨ１のアライメントに由来するＫａｂａｔら（前出）による「不変」残基である。本明細書に記載または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号で変化のために選択された位置（１３１、１３３、１４７、１６８、１７０、１７３、１７６、１８１、および１８３）は、下線太字体で示されている。これらの位置で、Ｋａｂａｔら（前出）で報告された６３の霊長類ＣＨ１配列中の最も高頻度の１つまたは２つのアミノ酸は、プレーン文字で示されている。アミノ酸が指定されていない位置は、「不変」ではなく、変化用としては選択しなかった。
【表3】
【0261】
下表４は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４アイソタイプのヒトＣＨ１のアライメントを示す。このアライメントは、これらの密接に関係したＣＨ１中の配列の非常に強力な保存を強調する。
表４：ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体の代表的ＣＨ１のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴウェブページから、それぞれ受入番号Ｊ００２２８、Ｊ００２３０、Ｘ０３６０４、およびＫ０１３１６で入手し、ＣＬＵＳＴＡＬＷソフトウェアで位置合わせした。残基は、Ｅｄｅｌｍａｎら（前述）、のＥＵシステムに従ってナンバリングした。Ｋａｂａｔら（前出）による「不変の」残基を太字で示している。これらの残基は高度に保存されているが、完全に不変ではない。下線を付け、太字イタリック体の残基は、置換がなされ、下記実施例または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号で報告されたように試験した位置である。
【表4】
【0262】
下表５は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の４つのヒトＩｇＧサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のアライメントを示す。このアライメントは、これらのサブクラス間の差異、および高い配列保存を示す。
【表5】
【0263】
「ヒト」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、タンパク質、または抗体は、ヒトで天然に生じるものまたは以下で説明する少数の変化を除いて、このような配列またはタンパク質と同一のものである。多くのヒトヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｋａｂａｔら（前出）で報告されており、当該技術分野における用語「ヒト」の使用が示されている。本明細書で意図される「ヒト」アミノ酸配列または抗体は、天然の配列に対して、１つまたは複数の挿入、欠失、または置換を含み得るが、但し、「ヒト」アミノ酸配列が、１００個毎のアミノ酸あたり、１０個を超える単一アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含まないことが前提である。同様に、ヒトヌクレオチド配列は、３００個毎のヌクレオチドあたり、３０個を超える一ヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含まない。ＶＨまたはＶＬ配列の特定の事例では、ＣＤＲが極端に可変であると予測され、特定のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が「ヒト」配列であるかどうかを判定する目的のために、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド）が配列の一部であると見なされない。
【0264】
本明細書で意図される「ヒト化」抗体は、抗体は非ヒト起源であるが、可能な限りヒトのものであるように遺伝子改変され、それにより、ヒトにおいて免疫原性を低減するが同時に抗体の安定性および結合特性を維持すると期待されている抗体である。通常、これは、ほとんどまたは全ての定常ドメインおよび可変ドメインのフレームワーク領域がヒト、またはほぼヒト配列であり、同時にＣＤＲが異なる生物起源であることを意味する。しかし、例えば、マウス抗体からヒトフレームワークへのＣＤＲの移植のみでは、望ましい特性を有する抗体は産生され得ず、さらに改変が必要となり得る。近年では、ヒト化を簡略化し、ヒト化の結果を改善する種々の手法が開発されている。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５），ｍＡｂｓ ７（６）：１０４５－１０５７およびこれに引用されている文献を参照されたい。
【0265】
本明細書で意図される「ＩｇＧ抗体」は、（１）ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジドメイン、ＣＨ２、およびＣＨ３をそれぞれ含む２つのＨＣ、および（２）ＶＬおよびＬＣ定常ドメイン（ＣＬ）をそれぞれ含む２つの軽鎖（ＬＣ）を含む。ＩｇＧ抗体の重鎖は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の重鎖である。これらのドメインは、例えば、Ｋａｂａｔら、前出、ページｘｖ～ｘｉｘおよび６４７～６９９に記載されている。これらのページは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｋａｂａｔら、前出のナンバリングシステムがＶＨおよびＶＬに使用され（図３、４、７、および８を参照）、ＥＵシステム（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：７８－８５；その全体が本明細書に組み込まれる）がＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３に使用される。
【0266】
本明細書で意図される「免疫調節性分子」は、免疫系の活性を媒介でき、それにより、免疫系の活性を調節する成分、例えば、タンパク質と相互作用する分子である。免疫系の活性は、下記実施例８で記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで評価でき、免疫調節性分子は、免疫系の活性を高めるまたは低減することができる。一例として、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、この定義による免疫調節性分子である。
【0267】
本明細書で意図される、ｈＣＴＬＡ４と、ヒトＣＤ８０（ｈＣＤ８０、ヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７－１（ｈＢ７－１）としても知られる）および／またはヒトＣＤ８６（ｈＣＤ８６、ヒトＢリンパ球活性化抗原Ｂ７－２（ｈＢ７－２）としても知られる）との間の相互作用の抗体による「抑制」は、実施例４に記載のように、Ｂ７－１およびＢ７－２を発現するラージ細胞を用いたＣＴＬＡ４ルシフェラーゼレポーターアッセイを使って測定できる。抗体がこのアッセイで、抗ＣＴＬＡ４抗体７Ａ４のＩＣ５０より２０、１５、１０、または５倍以下のＩＣ５０を有する場合、抗体は、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１／ｈＢ７－２との相互作用を「抑制する」。
【0268】
同様に、ｈＰＤ１と、ｈＰＤＬ１の間の相互作用の抗ｈＰＤ１抗体による「抑制」は、実施例７に記載のＣＨＯ－Ｋ１細胞およびジャーカットＴ細胞を用いたＰＤ１二重レポーターアッセイにより測定できる。抗体がこのアッセイで、抗ｈＰＤ１抗体＃９のＩＣ５０より２０、１５、１０、または５倍以下のＩＣ５０を有する場合、抗体は、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との間の相互作用を「抑制する」。
【0269】
本明細書で意図される「阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、「阻害剤」が小分子（タンパク質またはポリヌクレオチドとは対照的に）を意味し、一方で「アンタゴニスト」が任意の種類の分子を指すより一般的な用語であることを除いて、上記で定義の「アンタゴニスト」に類似している。例えば、「チロシンキナーゼ阻害剤」は、チロシンキナーゼをアンタゴナイズする小分子を意味する。起こり得る混乱を避けるために、用語の「阻害剤」の小分子への関連付けを、動詞の「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または名詞の「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」に拡張しない。例えば、抗体などの大きな分子は、例えば、ＰＤ１とＰＤＬ１の相互作用を抑制できる。さらに、相互作用の「抑制」は、小分子により媒介される「抑制」であることを必要としないことが本明細書で意図される。
【0270】
本明細書で意図される「軽鎖（ＬＣ）」は、ＶＬおよびＣＬを含み、これは、カッパ（ＣＬκ）またはラムダ（ＣＬλ）ドメインであり得る。これらのドメインは、その例示的アミノ酸配列を含めて、例えば、Ｋａｂａｔら、前出、ページｘｉｉｉ～ｌｉｘ、１０３～３０９、および６４７～６６０に記載されている。これらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＶＬに対して本明細書で使われるナンバリングシステムは、Ｋａｂａｔら（前出）に記載のものであり、また、ＣＬに対し使われるＥＵナンバリングシステムは、Ｅｄｅｌｍａｎら（前出）に記載のものである。下表６および７は、これらのシステムの種々の軽鎖配列への適用を例示する。当業者なら、このような情報を使って、ＫａｂａｔまたはＥｄｅｌｍａｎの番号を本明細書で開示の配列中の特定の位置に割り付けることができる。
表６：ナンバリングは、Ｋａｂａｔら（前出）による。太字でイタリック体の数字は、ＣＤＲの位置を示す。位置番号とその後ろの文字、例えば、２７Ａは、ＣＤＲの可変長さの理由で、アミノ酸で満たされてもそうでなくてもよい。Ｋａｂａｔら（前出）における全てのヒト軽鎖の不変残基は、その位置で見つかったアミノ酸を示す太字文字で示されている。選択位置で、その位置で見つかった１つから３つの最も高頻度アミノ酸は、プレーン文字で示されている。さらに、多くの他のアミノ酸は、いくつかのカッパまたはラムダＶＬサブグループ内で不変であるかまたは高度に保存されており、これらは、特定のアミノ酸配列をＶＬとして分類するのに役立ち得る。下記実施例または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号で報告のような、本明細書での変化のために選択された位置は、下線太字体で示されている。アミノ酸が指定されていないおよび／または番号が下線太字体で示されていない位置は、上記の基準に適合しなかった。
表７：ナンバリングは、Ｅｄｅｌｍａｎら（前出）による。これは、ＣＬに関しては、Ｋａｂａｔら（前出）のナンバリングと同じである。番号の下に太字で示すアミノ酸は、種々の種からのカッパおよびラムダＣＬの両方のアライメントに由来するＫａｂａｔら（前出）による「不変」残基である。選択位置（１３１、１６０、１６２、１７４、１７６、および１７８）に示すように、Ｋａｂａｔら（前出）で報告された１０個のヒトカッパ鎖（上段）および２８個のヒトラムダ鎖（下段）で保存されたアミノ酸はプレーン文字で示されている。２つの異なるアミノ酸のいずれかがこれらの位置の１つで見つかる場合には、より高頻度アミノ酸がより頻度の少ないアミノ酸の前に示される（例えば、Ａ／Ｍ）。下線太字番号は、下記実施例または国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号で報告のように改変された位置を示す。さらに、多くの他のアミノ酸は、いくつかのＣＬκまたはＣＬλドメインのサブグループ内で不変であるかまたは高度に保存されており、これらは、特定のアミノ酸配列をＣＬとして分類するのに役立ち得る。アミノ酸が指定されていないおよび／または番号が下線太字体で示されていない位置は、上記の基準に適合しなかった。
【表6】
【表7】
【0271】
本明細書で意図される「相手指向変化」は、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、またはＣＬアミノ酸配列内のＨＣ／ＬＣ境界での単一アミノ酸の置換、挿入、または欠失で、場合により、荷電アミノ酸またはシステインによる天然アミノ酸の置換であり、ＨＣおよびＬＣを、場合により、ヒトおよび／または霊長類のＨＣおよびＬＣをより強く結合させる。より具体的には、「ＨＣ相手指向変化」は、ＶＨまたはＣＨ１中の「接触」残基で「ＬＣ相手指向変化」が存在する場合にしか起きないこともある、ＨＣおよびＬＣをより強く結合させることができる、ＶＬまたはＣＬ中の変化である。同様に、「ＬＣ相手指向変化」は、ＶＬまたはＣＬ中の「接触」残基で「ＨＣ相手指向変化」が存在する場合にしか起きないこともある、ＨＣおよびＬＣをより強く結合させることができる、ＶＨまたはＣＨ１中の変化である。いくつかの実施形態では、ＨＣおよびＬＣ相手指向変化の接触対は、反対電荷を有する荷電アミノ酸の置換のものであり得る。他の実施形態では、荷電アミノ酸がＨＣまたはＬＣの接触位置の１つに既に存在し、それにより、同族ＨＣ／ＬＣ対、すなわち、電荷対中の接触位置で一対の逆に帯電した残基を生成するためには、ただ１つの鎖の変化が必要なだけである。他の実施形態では、システイン残基は、接触位置に導入でき、それにより、同族ＨＣ／ＬＣ対中にジスルフィド架橋を形成できる。さらなる実施形態では、ＨＣおよびＬＣ相手指向変化は、米国特許第８，６７９，７８５号に記載の接触残基でのノブと孔（または突出部と窪み部）を生成する置換または既存のアミノ酸であり得る。この特許の当該部分は、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＣは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＭ、またはＩｇＥアイソタイプ、場合により、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であり得る。ＨＣおよびＬＣ相手指向変化は、ＨＣ／ＬＣ境界の一部を形成する接触アミノ酸位置で起こる。ＣＬおよびＣＨ１中の界面残基には、米国特許第８，５９２，５６２号、表４および５ならびに第１０欄および１１欄中の付随する本文の説明のように、４．５Å内のものが含まれる。これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。ヒトＣＨ１およびＣＬ中のこれらの位置は、下表８に整理されている。
【表8】
【0272】
ＶＨおよびＶＬの間の境界上の接触残基の特定の場合では、変化に好適する、１つはＶＨ中に、１つはＶＬ中にある残基対は、次の基準を使用して選択できる：（１）残基が埋め込まれている、または部分的に埋め込まれている、すなわち、完全長抗体の三次構造中で接近し難い残基、（２）残基が空間的に近接している、すなわち、既知の構造に従って、２つのアミノ酸のＣαが約１２Å内にある場合、または１つのアミノ酸の側鎖重原子（水素以外の任意の原子）と、その他のアミノ酸の任意の重原子との間が最大５．５Åの場合、（３）全体として不変である必要はないが、残基が高度に保存されている、および（４）残基がＣＤＲ内にない、またはＣＤＲと相互作用しない。このような接触残基の例には、限定されないが、次記が含まれる：位置４４（ＶＨ）と位置１００（ＶＬ）；位置３９（ＶＨ）と位置３８（ＶＬ）；および位置１０５（ＶＨ）と位置４３（ＶＬ）。
【0273】
１次近似としては、ＨＣおよび／またはＬＣ相手指向変化によるＨＣ／ＬＣ結合の強度の変化は、実施例１１に記載の「チェインドロップアウト」実験により測定できる。
【0274】
チェインドロップアウト実験からの結果を確認するために、またはいくつかの事例では、その結果を明確にするために、第１の抗体（Ｍａｂ１）のＨＣおよびＬＣならびに第２の抗体（Ｍａｂ２）のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを含む形質移入体で生じているＦａｂフラグメントの大きさを、本明細書の実施例１１、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１４），ｍＡｂｓ ６：１，１９７－２０３（その全体が本明細書に組み込まれる）、および米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号（参照により本明細書に組み込まれる）の図１５および実施例５に記載のように、質量分析により測定できる。ほとんどの場合、同族および非同族対は、このような技術を用いて質量により区別できる。未改変Ｍａｂ１ ＨＣおよびＬＣならびに未改変Ｍａｂ２ ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞中で非同族対が主要種であり、また、Ｍａｂ１ ＨＣおよびＬＣならびにＭａｂ２ ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞中で非同族対が主要種でない場合で、これらの抗体の少なくとも１つが相手指向変化を含む場合、本明細書では、少なくとも１つの変化が好ましい相手指向変化であると考えられる。
【0275】
相手指向変化の例には、次のいずれかの電荷対を部分的にまたは完全に生成する変位が含まれる：４４Ｄ／Ｅ（ＶＨ）および１００Ｒ／Ｋ（ＶＬ）；４４Ｒ／Ｋ（ＶＨ）および１００Ｄ／Ｅ（ＶＬ）；１０５Ｒ／Ｋ（ＶＨ）および４３Ｄ／Ｅ（ＶＬ）；１０５Ｄ／Ｅ（ＶＨ）および４３Ｒ／Ｋ（ＶＬ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＣＨ１）および１３１Ｒ／Ｋ（ＣＬ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＣＨ１）および１３１Ｄ／Ｅ（ＣＬ）；１６８Ｄ／Ｅ（ＣＨ１）および１７４Ｒ／Ｋ（ＣＬ）；１６８Ｒ／Ｋ（ＣＨ１）および１７４Ｄ／Ｅ（ＣＬ）；１８１Ｒ／Ｋ（ＣＨ１）および１７８Ｅ／Ｄ（ＣＬ）；ならびに１８１Ｅ／Ｄ（ＣＨ１）および１７８Ｒ／Ｋ（ＣＬ）。さらに、相手指向変化には、接触システイン対が抗体のＨＣおよびＬＣ中に存在するように、システインが別のアミノ酸を置換する置換、例えば、いずれかの次記の対が含まれる：１２６Ｃ（ＣＨ１）および１２１Ｃ（ＣＬ）；１２６Ｃ（ＣＨ１）および１２４Ｃ（ＣＬ）；１２７Ｃ（ＣＨ１）および１２１Ｃ（ＣＬ）；１２８Ｃ（ＣＨ１）および１１８Ｃ（ＣＬ）；１３３Ｃ（ＣＨ１）および１１７Ｃ（ＣＬ）；１３３Ｃ（ＣＨ１）および２０９Ｃ（ＣＬ）；１２３Ｃ（ＣＨ１）および１１６Ｃ（ＣＬ）；１４１Ｃ（ＣＨ１）および１１６Ｃ（ＣＬ）；１６８Ｃ（ＣＨ１）および１７４Ｃ（ＣＬ）；１７０Ｃ（ＣＨ１）および１６２Ｃ（ＣＬ）；１８３Ｃ（ＣＨ１）および１７６Ｃ（ＣＬ）；１７３Ｃ（ＣＨ１）および１６０Ｃ（ＣＬ）；１７０Ｃ（ＣＨ１）および１７６Ｃ（ＣＬ）；ならびに１７３Ｃ（ＣＨ１）および１６２Ｃ（ＣＬ）。
【0276】
本明細書で意図される、抗体の混合物の場合の抗体の「主要種」は、混合物中の抗体の合計量の少なくとも１０％を占める特定の抗体である。どのくらいの量の主要種が抗体の混合物中に存在するかを決定するために、実施例５に記載のおよび米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号（米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号のこの部分は参照により本明細書に組み込まれる）の図１４に示す低ｐＨ ＣＥＸクロマトグラフィーを実施できる。この方法は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９：１１９１－１２０４に記載されており、この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。手短に説明すると、これは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ ２６９５高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使って、５０ｍｍガードカラム（ＰＲＯＰＡＣ（商標）ＷＣＸ－１０Ｇ）に続けて、Ｔｈｅｒｍｏ ＰＲＯＰＡＣ（商標）ＷＣＸ－１０ ｗｅａｋ ＣＥＸカラム、４ｘ２５０ｍｍを採用している。クロマトグラフィーは、１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）～１００％緩衝液Ｂ（２５０ｍＭ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２）の直線勾配を用いて３０分間にわたり稼動できる。カラムは、高塩（１Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄し、緩衝液Ａの開始条件に再平衡化できる。抗体は、２１４ｎｍの吸光度により、カラム流出物中で検出できる。検出ピークの相対量をＥＭＰＯＷＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて決定できる。低ｐＨ ＣＥＸは、種々の完全長抗体種を区別でき、混合物中の特定の抗体種の相対量を定量するのに使用できる。
【0277】
本明細書で意図される、抗体の混合物中の「微量種」の抗体は、混合物中の抗体の合計量の１０％未満を含む。これは、「主要種」の定義で記載の低ｐＨ ＣＥＸクロマトグラフィーにより決定できる。
【0278】
用語の「核酸」および「ポリヌクレオチド」は本明細書において同義に用いられる。
【0279】
「霊長類」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列またはタンパク質は、霊長類で認められる核酸またはタンパク質の天然に生じるもの、または以下で説明する少数の変化を除いて、このような配列またはタンパク質と同一のものである。霊長類には、限定されないが、原猿類（キツネザルを含む）、新世界ザル、チンパンジー、ヒト、ゴリラ、オランウータン、テナガザル、および旧世界ザルを含む多くのファミリー由来の動物が含まれる。特定の霊長類種には、限定されないが、特に、ホモサピエンス、赤毛猿（アカゲザル）、マカクザル（カニクイザル）、およびナミチンパンジー（チンパンジー）が含まれる。多くの霊長類ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、例えば、Ｋａｂａｔら（前出）に報告されているものなど、当技術分野において既知である。一般に、本明細書で意図される「霊長類」アミノ酸配列は、天然の霊長類配列に対して、１つまたは複数の挿入、欠失、または置換を含み得るが、但し、「霊長類」アミノ酸配列が、１００個毎のアミノ酸あたり、１０個を超える単一アミノ酸の挿入、欠失、および／または置換を含まないことが前提である。同様に、霊長類ヌクレオチド配列は、３００個毎のヌクレオチドあたり、天然の霊長類配列に対して、３０個を超える一ヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を含まない。ＶＨまたはＶＬ配列の特定の事例では、ＣＤＲが極端に可変であると予測され、特定のＶＨまたはＶＬアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が「霊長類」配列であるかどうかを判定する目的のために、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド）が配列の一部であると見なされない。
【0280】
２つの配列が同じＤＮＡ配列によりコードされ得る場合、２つのアミノ酸配列は「同じ」であることが本明細書で意図される。すなわち、翻訳後修飾の結果としてのみ、例えば、カルボキシル末端リシンの除去またはＮ末端グルタミン酸またはグルタミン残基の環化でのみ異なるアミノ酸配列は、「同じ」であることが本明細書で意図される。
【0281】
本明細書で意図される「標的化生物製剤」は、別の特定の分子（これはタンパク質であってもよい）との相互作用を介して、細胞の生物学的状態の側面に影響を与えることができるタンパク質である。例えば、「標的化生物製剤」は、生存する、増殖する、特定のサイトカインまたはタンパク質を産生するなどのための細胞の能力に影響を与え得る。一例として、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、それらはＰＤ１と相互作用し、Ｔ細胞中で、増殖の増大およびＩＦＮγ産生の増大などの多くの生物学的効果を生ずるので、「標的化生物製剤」である。
【0282】
同様に、本明細書で意図される「標的化阻害剤」は、特定の細胞性分子（これはタンパク質であってもよい）との相互作用を介して、細胞の生物学的状態の側面に影響を与えることができる小分子である。例えば、「チロシンキナーゼ阻害剤」は、チロシンキナーゼとの相互作用を介してチロシンキナーゼ（これは様々な細胞機能に影響を与える）の活性に影響を与える小分子である。
【0283】
本明細書で意図される特定の疾患または状態に対する「治療」は、作用の過程を意味し、「治療」は、１つまたは複数の抗体または１つまたは複数の抗体をコードするポリヌクレオチドの投与を含むことができ、ヒト患者、疾患または状態を反映すると見なされる動物モデル系、または疾患または状態を反映すると見なされるインビトロ細胞ベースアッセイにおける１つまたは複数の症状を低減または予測される疾患または状態の進行の遅延または中断をもたらす。これは、ヒトまたは動物の症状の客観的尺度により、または細胞ベースアッセイにおける、例えば、１種または複数のサイトカイン、例えば、ＩＦＮγの産生、細胞増殖、細胞死などの種々のパラメーターの測定により、確認できる。例えば、癌「治療」に関しては、治療は、腫瘍体積の減少、ヒトまたは動物モデル系における予測腫瘍転移の非存在、生存時間の増大、または癌に罹患しているヒトまたは動物における無増悪生存期間もしくは無病生存期間の増加をもたらし得る。癌治療はまた、細胞ベースアッセイにおける免疫系の活性化、例えば、Ｔ細胞の増殖および／またはサイトカイン、例えば、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－２のＴ細胞による産生の増大、を示す指数の上昇をもたらし得る。
【0284】
抗ｈＣＴＬＡ４抗体の可変ドメイン
一態様では、特有であるが密接に関係したアミノ酸配列を有する抗ｈＣＴＬＡ４抗体の可変ドメインが本明細書で提供される。これらの抗体は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＣＴＬＡ４に結合でき、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制できる。一態様では、これらの抗体は、ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体であり得、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。いくつかの実施形態では、それらは、抗体のインビボクリアランスを高める変化を含み得る。このような変化には、例えば、Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５ＫまたはＨ４３５Ｒが含まれる。
一態様では、特有であるが密接に関係したアミノ酸配列を有する抗ｈＣＴＬＡ４抗体の可変ドメインが本明細書で提供される。これらの抗体は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＣＴＬＡ４に結合でき、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制できる。一態様では、これらの抗体は、ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体であり得、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。いくつかの実施形態では、それらは、抗体のインビボクリアランスを高める変化を含み得る。このような変化には、例えば、Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５ＫまたはＨ４３５Ｒが含まれる。
【0285】
図１および２は、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアライメントを示す。抗ｈＣＴＬＡ４抗体の選択に関しては、実施例１に記載されている。図３および４は、選択抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨおよびＶＬのアライメントを示す。ＶＨの全長に対し８つの位置のみが変化し、ＶＬの全長に対し５つの位置のみが変化する。したがって、これらの選択抗体の配列は密接に関係している。これらの抗ｈＣＴＬＡ４ ＶＨおよびＶＬのコンセンサス配列は、配列番号８２および８３（ＶＨ）ならびに配列番号８４および８５（ＶＬ）に提供されている。
【0286】
一態様では、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、これらは、配列番号３（ＣＤＲ１）、配列番号７４または７５（ＣＤＲ２）、および配列番号７６または７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。配列番号７４、７５、７６および７７は、コンセンサス配列であり（図１参照）、いくつかのアミノ酸は限られた範囲のアミノ酸内で変化し得る。さらに、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３、４、および５、配列番号３、１３および５、配列番号３、２０、および２１、配列番号３、２４、および２５、配列番号３、３１、および５、配列番号３、３７、および５、配列番号３、４３、および５、配列番号３、４６、および４７、配列番号３、５９、および５、配列番号３、６５、および２１、または配列番号３、７０、および２１のアミノ酸配列を含み得る。これらのＣＤＲ配列セットのいずれか１つを含むＶＨを含む抗体は、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１／ｈＢ７－２の相互作用を抑制できる。
【0287】
さらに、ＶＨは、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、または８３の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、またはこれらの配列のわずかに変化した種類を含み得る。例えば、ＶＨは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３の内のいずれか１つに対するアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２、１２、１９、２３、３０、３６、４２、４５、５２、５８、６４、６９、８２、および８３の内のいずれか１つに対し、６、５、４、３、２、または１つ以下のアミノ酸変化を含み得る。これらのアミノ酸変化は、置換であり得および／または相手指向変化であり得る。このような改変配列を含むＶＨは、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制できる抗体の一部であり得る。
【0288】
同様に、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含み得、これらは、配列番号７８または７９（ＣＤＲ１）、配列番号９（ＣＤＲ２）、および配列番号８０または８１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。配列番号７８、７９、８０および８１（図２参照）は、コンセンサス配列であり、これらのそれぞれは、限られた範囲のアミノ酸内の２つのアミノ酸位置で変化する。さらに、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８、９、および１０、配列番号１６、９および１７、配列番号２８、９、および１７、配列番号３４、９、および１７、配列番号４０、９、および１０、配列番号５０、９、および１７、配列番号５５、９、および５６、配列番号４０、９、および６２、配列番号１６、９、および６２、または配列番号７３、９、および６２のアミノ酸配列を含み得る。これらのＣＤＲ配列セットのいずれか１つを含むＶＬを含む抗体は、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１／ｈＢ７－２の相互作用を抑制できる。
【0289】
さらに、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶＬは、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、またはこれらの配列のわずかに変化した種類を含み得る。例えば、ＶＬは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５の内のいずれか１つに対するアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号７、１５、２７、３３、３９、４９、５４、６１、６７、７２、８４、および８５の内のいずれか１つに対し、６、５、４、３、２、または１つ以下のアミノ酸変化を含み得る。これらのアミノ酸変化は、置換であり得および／または相手指向変化であり得る。このような改変配列を含むＶＬは、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制できる抗体の一部であり得る。
【0290】
別の態様では、抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み得、これらは、配列番号３、４、５、８、９、および１０、配列番号３、１３、５、１６、９、および１７、配列番号３、２０、２１、１６、９、および１７、配列番号３、２４、２５、２８、９、および１７、配列番号３、３１、５、３４、９、および１７、配列番号３、３７、５、４０、９、および１０、配列番号３、４３、５、２８、９、および１７、配列番号３、４６、４７、５０、９、および１７、配列番号３、３１、５、５５、９、および５６、配列番号３、５９、５、４０、９、および６２、配列番号３、６５、２１、１６、９、および６２、または配列番号３、７０、２１、７３、９、および６２のアミノ酸配列を有する。このようなＣＤＲ配列セットを含む抗体は、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１／ｈＢ７－２の相互作用を抑制できる。
【0291】
さらなる態様では、ＶＨおよびＶＬは、それぞれ、次の２つのアミノ酸配列群の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る：配列番号２（ＶＨ）および７（ＶＬ）；配列番号１２（ＶＨ）および１５（ＶＬ）；配列番号１９（ＶＨ）および１５（ＶＬ）；配列番号２３（ＶＨ）および２７（ＶＬ）；配列番号３０（ＶＨ）および３３（ＶＬ）；配列番号３６（ＶＨ）および３９（ＶＬ）；配列番号４２（ＶＨ）および２７（ＶＬ）；配列番号４５（ＶＨ）および４９（ＶＬ）；配列番号５２（ＶＨ）および５４（ＶＬ）；配列番号５８（ＶＨ）および６１（ＶＬ）；配列番号６４（ＶＨ）および６７（ＶＬ）；配列番号６９（ＶＨ）および７２（ＶＬ）；ならびに配列番号８３（ＶＨ）および８５（ＶＬ）。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、これらの２つの配列群の内の１つのわずかに変化した種類を含み得る。例えば、ＶＨは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、２つの配列群の内の１つ中の１つの配列に対するアミノ酸置換であり得、また、ＶＬは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、２つの配列の同じ群の内の他の配列に対するアミノ酸置換であり得る。抗体またはその一部分を形成するＶＨおよびＶＬは、２つの配列群の第１（ＶＨ）および第２（ＶＬ）アミノ酸配列に対して、それぞれ、６、５、４、３、２、または１つ以下のアミノ酸変化、場合により置換を含むアミノ酸配列を含み得る。これらの変化は、相手指向変化であり得る。このような改変配列を含むＶＨおよびＶＬは、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制できる抗体の一部であり得る。
【0292】
抗ｈＰＤ１抗体の可変ドメイン
一態様では、特有であるが密接に関係したアミノ酸配列を有する抗ｈＰＤ１抗体の可変ドメインが本明細書で提供される。これらの抗体は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＰＤ１に結合でき、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制できる。一態様では、これらの抗体は、ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体であり得、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。
一態様では、特有であるが密接に関係したアミノ酸配列を有する抗ｈＰＤ１抗体の可変ドメインが本明細書で提供される。これらの抗体は、ヒトおよびカニクイザルの両方のＰＤ１に結合でき、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制できる。一態様では、これらの抗体は、ヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体であり得、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。
【0293】
図５および６は、抗ｈＰＤ１抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアライメントを示す。抗ｈＰＤ１抗体の選択に関しては、実施例２に記載されている。図７および８は、選択抗ｈＰＤ１抗体の、それぞれＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列のアライメントを示す。ＶＨおよびＶＬは両方とも、１０個の位置で変化する。したがって、これらの選択抗体の配列は密接に関係している。これらのＶＨおよびＶＬのコンセンサス配列は、配列番号１８０および１８１（ＶＨ）ならびに配列番号１８２および１８３（ＶＬ）で提供される。
【0294】
一態様では、抗ｈＰＤ１抗体のＶＨは、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３を含み、これらは、配列番号１６９または１７０（ＣＤＲ１）、配列番号１７１または１７２（ＣＤＲ２）、および配列番号１７３または１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。これらはコンセンサス配列（図５）であり、各ＣＤＲ中の少なくとも１つのアミノ酸が、限られた範囲のアミノ酸内で変化し得る。さらに、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、およびＶＨ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号８８、８９、および９０、配列番号９８、８９および９９、配列番号１０５、８９、および９０、配列番号１０５、１１１、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号８８、８９、および１１２、配列番号８８、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１３４、配列番号９８、８９、および９０、配列番号９８、１１１、および１１２、配列番号１４９、１５０、および１１２、配列番号１０５、１１１、および９０、配列番号１４９、８９、および１２７、配列番号８８、８９、および１１２、または配列番号１０５、８９、および１２７のアミノ酸配列を含み得る。これらのＣＤＲ配列セットのいずれか１つを含むＶＨを含む抗体は、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１の相互作用を抑制できる。
【0295】
さらに、ＶＨは、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、またはこれらの配列のわずかに変化した種類を含み得る。例えば、ＶＨは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１の内のいずれか１つに対するアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８７、９７、１０４、１１０、１１７、１２２、１２６、１３３、１３９、１４４、１４８、１５４、１５８、１６２、１６６、１８０、および１８１の内のいずれか１つに対し、６、５、４、３、２、または１つ以下の、置換であり得るアミノ酸変化を含み得る。これらの変化は、相手指向変化であり得る。このような改変配列を含むＶＨは、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制できる抗体の一部であり得る。
【0296】
同様に、抗ｈＰＤ１抗体のＶＬは、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２およびＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬを有し得、これらは、配列番号１７５または１７６（ＣＤＲ１）、配列番号１７７（ＣＤＲ２）、および配列番号１７８または１７９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む。これらはコンセンサス配列（図６参照）であり、各ＣＤＲ中の少なくとも１つのアミノ酸が、限られた範囲のアミノ酸内で変化し得る。さらに、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９３、９４、および９５、配列番号１０２、９４、および９５、配列番号９３、１０８、および９５、配列番号１１５、９４、および９５、配列番号１２０、９４、および９５、配列番号１０２、１０８、および９５、配列番号１３０、１０８、および１３１、配列番号１３７、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、配列番号１３０、９４、および１３１、配列番号１４２、９４、および１３１、配列番号１１５、９４、および９５、または配列番号１０２、１０８、および９５のアミノ酸配列を含み得る。これらのＣＤＲ配列セットのいずれか１つを含むＶＬを含む抗体は、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１の相互作用を抑制できる。
【0297】
ＶＬは、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得るか、またはこれらの配列のわずかに変化した種類を含み得る。例えば、ＶＬは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３の内のいずれか１つに対するアミノ酸置換であり得る。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号９２、１０１、１０７、１１４、１１９、１２４、１２９、１３６、１４１、１４６、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１８２、および１８３の内のいずれか１つに対し、６、５、４、３、２、または１つ以下の、置換であり得るアミノ酸変化を含み得る。これらの変化は、相手指向変化であり得る。このような改変配列を含むＶＬは、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制できる抗体の一部であり得る。
【0298】
別の態様では、抗ｈＰＤ１抗体は、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、およびＶＬ ＣＤＲ３を含み得、これらは、配列番号８８、８９、９０、９３、９４、および９５、配列番号９８、８９、９９、１０２、９４、および９５、配列番号１０５、８９、９０、９３、１０８、および９５、配列番号１０５、１１１、１１２、１１５、９４、および９５、配列番号１０５、１１１、９０、１２０、９４、および９５、配列番号８８、８９、１１２、１０２、１０８、および９５、配列番号８８、８９、１２７、１３０、１０８、および１３１、配列番号８８、８９、１３４、１３７、９４、および１３１、配列番号９８、８９、９０、１４２、９４、および１３１、配列番号９８、１１１、１１２、１３０、９４、および１３１、配列番号１４９、１５０、１１２、１３０、９４、および１３１、配列番号１０５、１１１、９０、１４２、９４、および１３１、配列番号１４９、８９、１２７、１１５、９４、および９５、配列番号８８、８９、１１２、９３、９４、および９５、または配列番号１０５、８９、１２７、１０２、１０８、および９５のアミノ酸配列を有する。このようなＣＤＲ配列セットを含む抗体は、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１の相互作用を抑制できる。
【0299】
さらなる態様では、抗ｈＰＤ１抗体のＶＨおよびＶＬは、それぞれ、次の２つのアミノ酸配列群の内のいずれか１つのアミノ酸配列を含み得る：配列番号８７（ＶＨ）および９２（ＶＬ）；配列番号９７（ＶＨ）および１０１（ＶＬ）；配列番号１０４（ＶＨ）および１０７（ＶＬ）；配列番号１１０（ＶＨ）および１１４（ＶＬ）；配列番号１１７（ＶＨ）および１１９（ＶＬ）；配列番号１２２（ＶＨ）および１２４（ＶＬ）；配列番号１２６（ＶＨ）および１２９（ＶＬ）；配列番号１３３（ＶＨ）および１３６（ＶＬ）；配列番号１３９（ＶＨ）および１４１（ＶＬ）；配列番号１４４（ＶＨ）および１４６（ＶＬ）；配列番号１４８（ＶＨ）および１５２（ＶＬ）；配列番号１５４（ＶＨ）および１５６（ＶＬ）；配列番号１５８（ＶＨ）および１６０（ＶＬ）；配列番号１６２（ＶＨ）および１６４（ＶＬ）；配列番号１６６（ＶＨ）および１６８（ＶＬ）；配列番号１８０（ＶＨ）および１８２（ＶＬ）；ならびに配列番号１８１（ＶＨ）および１８３（ＶＬ）。いくつかの実施形態では、ＶＨおよびＶＬは、これらの２つの配列群の内の１つのわずかに変化した種類を含み得る。例えば、ＶＨは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、２つの配列群の内の１つ中の１つの配列に対するアミノ酸置換であり得、また、ＶＬは、１つまたは複数の相手指向変化を含み得、これは、２つの配列の同じ群の内の他の配列に対するアミノ酸置換であり得る。抗体またはその一部分を形成するＶＨおよびＶＬは、２つの配列群の第１（ＶＨ）および第２（ＶＬ）アミノ酸配列に対して、それぞれ、６、５、４、３、２、または１つ以下の、置換であり得るアミノ酸変化を含むアミノ酸配列を含み得る。これらの変化は、相手指向変化であり得る。このような改変配列を含むＶＨおよびＶＬは、ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１との相互作用を抑制できる抗体の一部であり得る。
【0300】
抗ｈＰＤ１および／または抗ｈＣＴＬＡ４抗体のさらなる態様
本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体は、ヒト、ヒト化、または霊長類抗体および／またはＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。このようなＩｇＧ抗体は、相手指向変化、例えば、ＨＣおよび／またはＬＣ相手指向変化を含み得る。さらに、このようなＩｇＧ抗体は、ヘテロダイマーに適さない１つまたは複数の変化を含み得る。このような変化は、少なくとも２種の異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡが導入されている単一宿主細胞株が２つまたは３つ以下の異なる主要種の抗体を産生することになる確率を改善し得る。
本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体は、ヒト、ヒト化、または霊長類抗体および／またはＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得る。このようなＩｇＧ抗体は、相手指向変化、例えば、ＨＣおよび／またはＬＣ相手指向変化を含み得る。さらに、このようなＩｇＧ抗体は、ヘテロダイマーに適さない１つまたは複数の変化を含み得る。このような変化は、少なくとも２種の異なるＩｇＧ抗体をコードするＤＮＡが導入されている単一宿主細胞株が２つまたは３つ以下の異なる主要種の抗体を産生することになる確率を改善し得る。
【0301】
相手指向変化は、本明細書に記載のＩｇＧ抗ｈＣＴＬＡ４および／または抗ｈＰＤ１抗体内、場合により、ヒトまたは霊長類ＩｇＧ抗体内の電荷対または接触システイン対の一部を形成できる。例えば、相手指向変化は、次の電荷対の内のいずれか１つを、部分的にまたは全体的に、生ずる変化（アミノ酸置換を含む）を含む：４４Ｄ／Ｅ（ＶＨ）および１００Ｒ／Ｋ（ＶＬ）；４４Ｒ／Ｋ（ＶＨ）および１００Ｄ／Ｅ（ＶＬ）；１０５Ｒ／Ｋ（ＶＨ）および４３Ｄ／Ｅ（ＶＬ）；１０５Ｄ／Ｅ（ＶＨ）および４３Ｒ／Ｋ（ＶＬ）；１４７Ｄ／Ｅ（ＣＨ１）および１３１Ｒ／Ｋ（ＣＬ）；１４７Ｒ／Ｋ（ＣＨ１）および１３１Ｄ／Ｅ（ＣＬ）；１６８Ｄ／Ｅ（ＣＨ１）および１７４Ｒ／Ｋ（ＣＬ）；１６８Ｒ／Ｋ（ＣＨ１）および１７４Ｄ／Ｅ（ＣＬ）；１８１Ｒ／Ｋ（ＣＨ１）および１７８Ｅ／Ｄ（ＣＬ）；ならびに１８１Ｅ／Ｄ（ＣＨ１）および１７８Ｒ／Ｋ（ＣＬ）。荷電アミノ酸がこれらの位置の１つに既に存在する場合、電荷対を形成するためには、１個のみの相手指向変化でよい。その他の状況では、電荷対を形成するためには、１つはＨＣ中、もう１つはＬＣ中の２つの相手指向変化が必要である。さらに、相手指向変化には、接触システイン対が生成され、ジスルフィド架橋を形成できるように、システインが別のアミノ酸を置換する置換が含まれる。ヒトＩｇＧ１抗体では、これらには、次の対が含まれ得る：１２６（ＣＨ１）および１２１（ＣＬ）、１７０Ｃ（ＣＨ１）および１６２Ｃ（ＣＬ）、１７０（ＣＨ１）および１７６（ＣＬ）、１７３（ＣＨ１）および１６０（ＣＬ）、ならびに１８３（ＣＨ１）および１７６（ＣＬ）。ヒトＩｇＧ４抗体では、これらには、次の対を含むことができる：１７０Ｃ（ＣＨ１）および１６２Ｃ（ＣＬ）、１７３Ｃ（ＣＨ１）および１６２Ｃ（ＣＬ）、ならびに１８３（ＣＨ１）および１７６（ＣＬ）。抗体の混合物中の１つの抗体の同族ＣＨ１／ＣＬ対中の接触システイン対は、混合物中の別の抗体中の位置とは異なる位置に配置でき、これにより、同族ＨＣ／ＬＣ対の形成における選択性を高めることができる。米国特許仮出願第６２／３４２，２６７号の相手指向変化を記載する部分、すなわち、参照されている図を含むページ３３～３６ならびに実施例１～３および５は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0302】
周知の方法を用いて、相手指向変化を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードするＤＮＡを生成することができる。このような方法は、下記実施例１および２に記載されており、さらに、ＤＮＡ配列の人工合成（例えば、数ある中でも特に、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡまたはＧｅｎｅｗｉｚ，Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ，ＵＳＡなどの市販品納入業者により）および、例えば、Ｇｉｂｓｏｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．（ＮＥＢ），Ｖｅｒｓｉｏｎ ３．３，ＮＥＢ ｃａｔａｌｏｇ ｎｏ．＃Ｅ２６１１Ｓ／Ｌ，ＮＥＢ Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ、に記載のギブソン反応（すなわち、オーバーラップＰＣＲ）によるＤＮＡセグメントの結合などを含む。相手指向変化の設計、作製、および試験は、米国特許仮出願第６２／３４２，２６７号に詳細に記載されている。米国特許仮出願第６２／３４２，２６７号の実施例１～３および５ならびに図４～７および１２～１５は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体をコードするＤＮＡが作製されると、抗体は、例えば、下記実施例１で記載のように、遺伝子導入宿主細胞中で作製できる。
【0303】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４および／または抗ｈＰＤ１抗体は、ＨＣ／ＨＣヘテロダイマー形成に適さない１つまたは複数の変化を含み得る。米国特許仮出願第６２／３４２，２６７号では、１つの抗体がＩｇＧ４抗体またはＩｇＧ１抗体で、そのＨＣ中に置換Ｋ４０９Ｒを含み、もう１つの抗体が置換Ｄ３９９Ｋ／ＲおよびＫ４０９Ｄ／Ｅを含むＩｇＧ１抗体である、２つの異なるＩｇＧ抗体を遺伝子導入した細胞中で、ヘテロダイマーが容易には検出できなかったことが示されている。米国特許仮出願第６２／３４２，２６７号の実施例４および図８～１１は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0304】
抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体の混合物
別の態様では、抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体の混合物が本明細書で記載される。いくつかの状態の治療では、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１の両方の遮断または抑制が有益であり得る。例えば、Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７３（１）：２３－３４を参照されたい。抗体混合物は、本明細書に記載の特定の抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４抗体を含み得る。
別の態様では、抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体の混合物が本明細書で記載される。いくつかの状態の治療では、ＣＴＬＡ４およびＰＤ１の両方の遮断または抑制が有益であり得る。例えば、Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７３（１）：２３－３４を参照されたい。抗体混合物は、本明細書に記載の特定の抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４抗体を含み得る。
【0305】
いくつかの実施形態では、抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の混合物は、両方の抗体をコードするＤＮＡが導入されている単一宿主細胞株中で作製できる。このような方法は、米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号に詳細に記載されている。米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０３０６７６号のこのような方法を記載する部分は、参照により本明細書に組み込まれる。抗体混合物を単一宿主細胞株中で産生する方法は、２つの別々の細胞株中での産生に比べて、この方法がただ１つの商業上のプロセスを開発および稼動するのみであるため、遙かに効率的であり、費用対効果が大きい。単一宿主細胞株中で産生された混合物中の抗体は、１つまたは複数のＨＣおよび／またはＬＣ相手指向変化および／またはヘテロダイマーに適さない１つまたは複数の変化を含み得る。このような変化は、２つの異なるＨＣおよびＬＣおよび／またはＨＣ／ＨＣヘテロダイマー形成のプロミスキャス対形成により、宿主細胞株中で形成される抗体種の数を制限できる。例えば、米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号の図３（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これにより、最大で３種または最大で２種の異なる抗体を含む混合物を、２つの異なるＨＣおよび２つの異なるＬＣをコードするＤＮＡを含む単一宿主細胞株から産生するために必要な精製ステップの数を減らすことができる。
【0306】
下表９に、例示的ＨＣおよびＬＣ相手指向変化が記載されており、この内の１つまたは複数を、抗体混合物中の抗ｈＣＴＬＡ４および／または抗ｈＰＤ１抗体中に含めることができる。
＊抗体１および２は異なる抗体である。本表では、それらは交換可能である。
＃単一の第１の抗体の重鎖および軽鎖（例えば、ＨＣ１およびＬＣ１）に対する単一行に記載の変化は、記載のように一緒に起こり得る。しかし、混合物中の第２の抗体は、同じ行中に記載の抗体２の変化を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、２つ以上の行に記載の変化、例えば、１０５Ｒ／Ｋおよび１４７Ｒ／Ｋを重鎖中に含むことができ、４３Ｅ／Ｄおよび１３１Ｅ／Ｄを軽鎖中に含むことができる。
＠全ての変化が全てのＩｇＧサブタイプに好適するとは限らない。
【表9】
＃単一の第１の抗体の重鎖および軽鎖（例えば、ＨＣ１およびＬＣ１）に対する単一行に記載の変化は、記載のように一緒に起こり得る。しかし、混合物中の第２の抗体は、同じ行中に記載の抗体２の変化を含んでも含まなくてもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、２つ以上の行に記載の変化、例えば、１０５Ｒ／Ｋおよび１４７Ｒ／Ｋを重鎖中に含むことができ、４３Ｅ／Ｄおよび１３１Ｅ／Ｄを軽鎖中に含むことができる。
＠全ての変化が全てのＩｇＧサブタイプに好適するとは限らない。
【0307】
抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体が抗体混合物の一部である場合、両方の抗体がＩｇＧ抗体であると仮定して、ヘテロダイマーに適さない変化を、抗ｈＣＴＬＡ４および／または抗ｈＰＤ１抗体中に含めることもできる。一実施形態では、１つの抗体は、ＩｇＧ４抗体（４０９の位置に天然のアルギニンを有する）または位置４０９にアルギニンを有するように、すなわち、変化Ｋ４０９Ｒを有するように変化したＩｇＧ１抗体であり得、他方の抗体は、変化３９９Ｋ／Ｒおよび４０９Ｄ／Ｅを有する。
【0308】
いくつかの実施形態では、抗体混合物中の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、抗体のインビボでのクリアランスを高める１つまたは複数の変化を含み得る。このような変化には、例えば、１つまたは複数の次記を含めることができる：Ｍ２５２Ａ、Ｍ２５２Ｌ、Ｍ２５２Ｓ、Ｍ２５２Ｒ、Ｒ２５５Ｋ、およびＨ４３５Ｒ。このような効果を有する他の変化も同様に使用できる。抗体のＩｇＧ定常ドメイン内の特定の変化が、例えば、特定のヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体のインビボクリアランスを増大させる（本明細書の上記で定義した）効果を有する場合、それは、本明細書で、このような改変定常ドメインを含む、任意のヒト、ヒト化、または霊長類ＩｇＧ抗体のインビボクリアランスを高める変化であると定義される。
【0309】
抗体および抗体の混合物の製造方法
一般に、個別の抗体は、抗体をコードするＤＮＡを宿主細胞中に導入し、細胞による抗体の産生に好適する条件下で宿主細胞を培養して、細胞集団または細胞上清から抗体を回収することにより、製造できる。ＤＮＡは、遺伝子導入、形質転換、電気穿孔、微粒子銃、微量注入、リポフェクション、などにより導入できる。その後、抗体を精製して、目的の抗体以外の成分、例えば、宿主細胞タンパク質、培地成分、および／または望ましくない抗体種、例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖を含まないＩｇＧ抗体種を除去できる。このような精製ステップには、例えば、選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、透析、などを含めることができる。
一般に、個別の抗体は、抗体をコードするＤＮＡを宿主細胞中に導入し、細胞による抗体の産生に好適する条件下で宿主細胞を培養して、細胞集団または細胞上清から抗体を回収することにより、製造できる。ＤＮＡは、遺伝子導入、形質転換、電気穿孔、微粒子銃、微量注入、リポフェクション、などにより導入できる。その後、抗体を精製して、目的の抗体以外の成分、例えば、宿主細胞タンパク質、培地成分、および／または望ましくない抗体種、例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖を含まないＩｇＧ抗体種を除去できる。このような精製ステップには、例えば、選択的沈殿、カラムクロマトグラフィー、透析、などを含めることができる。
【0310】
すぐ前に記載した方法で個別に産生した抗体を混合して混合物を生成できる。あるいは、抗体の混合物は、両方の抗体をコードするＤＮＡが宿主細胞中に同時にまたは順次に導入されること以外は、類似の方法で産生できる。２つの異なるＩｇＧ抗体、すなわち、２つの異なる重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡを含む宿主細胞は、可能性としては、プロミスキャスＨＣ／ＨＣおよびＨＣ／ＬＣ対形成により、１０個までの異なるＩｇＧ抗体種を産生できる。この種の数を制限するために、抗体は、ＨＣおよびＬＣ相手指向変化および／またはヘテロダイマーに適さない変化を含み得る。このような変化は、宿主細胞により産生される主要な抗体種の数を制限できる。このような混合物は、上述のように、精製できる。
【0311】
当業者なら、２つの宿主細胞株ではなく、単一宿主細胞株中での抗体の混合物の製造は、２つの商業製造プロセスの開発と稼動の場合に比べて、製造の容易さおよび効率の大きな増大を意味することを理解するであろう。いずれか１つの抗体の商業製造プロセスの開発は、例えば、発現系、宿主細胞株（発現に細胞株が用いられる場合）、細胞培養プロセス（攪拌タンク対灌流対多くの他の培養方法の使用などの物理的変数、ならびに宿主細胞株を増殖させるのに使用する培地および供給戦略）、および抗体精製および配合を含む無数の因子の最適化が必要である。さらに、プロセスが開発されると、プロセスの特性を明らかにし、確認して、現在の優良医薬品製造基準（ｃＧＭＰ）製造のための製造設備へ移行する必要がある。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０），ｍＡｂｓ ２（５）：４６６－４７７、を参照されたい。したがって、単一プロセスでの抗体混合物の製造は、２つのプロセスでの製造に対して、コストの大きな削減に加えて、製造の容易さおよび効率の顕著な増大を意味することが明らかである。
【0312】
ポリヌクレオチドおよびベクター
本明細書に記載の抗体および抗体の混合物をコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはその他の核酸が提供される。本明細書で提供されるガイダンスを用いて、当業者なら、抗体をコードする既知または新規核酸配列を組み合わせて、既知の方法によりそれらを改変し、本明細書に記載のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の抗体および抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを生成し得るであろう。このようなＶＨおよびＶＬ配列は、例えば、図３、４、７、および８で、および本明細書を通して開示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、図３、４、７、および８で開示のアミノ酸配列に比較して、相手指向変化などの変化を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードできる。このような変化はアミノ酸置換であり得る。さらに、このようなポリヌクレオチドは、可変ドメインの外側に１つまたは複数の相手指向変化および／またはヘテロダイマーに適さない１つまたは複数の変化を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードできる。本明細書に記載のＶＨまたはＶＬをコードする例示的核酸配列には、配列番号１、６、１１、１４、１８、２２、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４８、５１、５３、５７、６０、６３、６６、６８、７１、８６、９１、９６、１００、１０３、１０６、１０９、１１３、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２８、１３２、１３５、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、および１９４が含まれる。ヒト、哺乳動物、および霊長類免疫グロブリン定常ドメイン、例えば、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３をコードする多数の核酸配列が当技術分野において既知である。例えば、Ｋａｂａｔら（前出）を参照されたい。場合により、本明細書に記載の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、このような定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列と組み合わせて、種々のフォーマット、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、二重特異性フォーマット、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、ＢｉＴＥ（ｓｃＦｃ－リンカー－ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖのいずれかで抗体を生成することができる。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、相手指向変化および／またはヘテロダイマーに適さない変化を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、哺乳動物抗体、場合により、ヒト、ヒト化、または霊長類抗体であり得る。
本明細書に記載の抗体および抗体の混合物をコードするポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはその他の核酸が提供される。本明細書で提供されるガイダンスを用いて、当業者なら、抗体をコードする既知または新規核酸配列を組み合わせて、既知の方法によりそれらを改変し、本明細書に記載のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の抗体および抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを生成し得るであろう。このようなＶＨおよびＶＬ配列は、例えば、図３、４、７、および８で、および本明細書を通して開示される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、図３、４、７、および８で開示のアミノ酸配列に比較して、相手指向変化などの変化を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードできる。このような変化はアミノ酸置換であり得る。さらに、このようなポリヌクレオチドは、可変ドメインの外側に１つまたは複数の相手指向変化および／またはヘテロダイマーに適さない１つまたは複数の変化を含むＨＣおよび／またはＬＣをコードできる。本明細書に記載のＶＨまたはＶＬをコードする例示的核酸配列には、配列番号１、６、１１、１４、１８、２２、２６、２９、３２、３５、３８、４１、４４、４８、５１、５３、５７、６０、６３、６６、６８、７１、８６、９１、９６、１００、１０３、１０６、１０９、１１３、１１６、１１８、１２１、１２３、１２５、１２８、１３２、１３５、１３８、１４０、１４３、１４５、１４７、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、および１９４が含まれる。ヒト、哺乳動物、および霊長類免疫グロブリン定常ドメイン、例えば、ＣＬ、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３をコードする多数の核酸配列が当技術分野において既知である。例えば、Ｋａｂａｔら（前出）を参照されたい。場合により、本明細書に記載の可変ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、このような定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列と組み合わせて、種々のフォーマット、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、二重特異性フォーマット、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、Ｆａｂ、ＢｉＴＥ（ｓｃＦｃ－リンカー－ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖのいずれかで抗体を生成することができる。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、相手指向変化および／またはヘテロダイマーに適さない変化を含み得る。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、哺乳動物抗体、場合により、ヒト、ヒト化、または霊長類抗体であり得る。
【0313】
ポリヌクレオチドを改変する方法は、当該技術分野で周知である。おそらく、改変ポリヌクレオチドの生成のための最も直接的な方法は、目的の配列を有するポリヌクレオチドを合成することである。多くの会社、例えば、ＤＮＡ ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ（Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）、Ｇｅｎｅｗｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ｇｅｎ９（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）がこのサービスを提供している。その他の変異を導入する既知の方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた部位特異的変異誘発も、用いることができる。例えば、Ｚｏｌｌｅｒ（１９９１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（４）：５２６－５３１；Ｒｅｉｋｏｆｓｋｉ ａｎｄ Ｔａｏ（１９９２），Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．１０（４）：５３５－５４７、を参照されたい。
【0314】
本明細書に記載の抗体およびそれらの混合物をコードするポリヌクレオチド、場合によりＤＮＡを含むベクターは、選択した宿主細胞中での抗体の発現に好適ないずれのベクターでもよい。ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択のために、および／または宿主細胞中のベクターの維持および／または増幅のために、選択可能マーカーを含めることができる。このようなマーカーには、例えば、（１）抗生物質またはその他の毒素、例えば、原核生物宿主細胞に対するアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン、に対する耐性を付与する遺伝子、（２）細胞の栄養素要求性欠陥を補完する遺伝子、または（３）複合培地または限定培地からは利用できない重要な栄養素を供給する働きをする遺伝子、が含まれる。特定の選択可能マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子であり得る。ゼオシン耐性またはネオマイシン耐性遺伝子はまた、原核生物および真核生物両方の宿主細胞における選択のために使用し得る。当技術分野において知られているように、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および／またはプロモーターのないチミジンキナーゼ遺伝子を哺乳動物細胞で用いることができる。例えば、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００２，ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＵＳＩＮＧ ＣＨＯ ＣＥＬＬ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＶＥＣＴＯＲＳ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１６，Ｕｎｉｔ １６．２３，Ｗｉｌｅｙ ２００２を参照。
【0315】
さらに、ベクターは、ベクターの維持および／または本明細書に記載の抗体または抗体混合物をコードする挿入配列の発現のために必要な１つまたは複数のその他の配列要素を含み得る。このような要素には、例えば、複製起点、プロモーター、１つまたは複数のエンハンサー、転写ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、外来性配列のためのポリリンカー挿入部位（例えば、本明細書に記載の抗体または抗体の混合物をコードするＤＮＡ）、および２つの挿入配列、例えば、ＨＣおよびＬＣコードＤＮＡの間の介在配列が含まれる。これらの配列要素は、ベクターの複製および／または増幅ならびにベクターに挿入された異種配列の発現を促進するように目的の宿主細胞中で機能するように選択できる。このような配列要素は当該技術分野において周知であり、多数の市販のベクターで利用可能である。
【0316】
１つまたは複数の抗体をコードするＤＮＡは、例えば、遺伝子導入、形質導入、リポフェクション、形質転換、微粒子銃、微量注入、または電気穿孔を含む任意の適切な方法を用いて宿主細胞に導入できる。いくつかの実施形態では、２つの完全長抗体をコードするＤＮＡを、宿主細胞中に導入できる。このような方法は、当技術分野において既知であり、例えば、Ｋａｅｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２５：１１７１－１１７６に記載されている。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【0317】
いくつかの実施形態では、抗体または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数のウイルスベクター、場合により、腫瘍溶解性ウイルスベクターに保持され得る。このようなウイルスベクターの例には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、修正ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、およびポックスウイルスベクターが挙げられる。このような実施形態では、これらの本明細書に記載の抗体または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、疾患を治療するために患者に投与できる。例えば、癌患者では、このような抗体または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、多くの可能性の内で特に、患者の腫瘍または癌細胞の主要部位に直接投与でき、例えば、注射、吸入投与（肺癌に対し）、局所投与（皮膚癌に対し）でき、および／または粘膜（この膜を通して核酸を吸収できる）に投与できる。あるいは、このようなウイルスベクターは、例えば、本明細書に記載のように、経口、局所、粘膜経由、または皮下、静脈内、動脈内、筋肉内、または腹膜注射により全身投与できる。同様に、本明細書に記載の抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドは、リポソーム中に包み込むことができ、疾患に罹患している患者に投与できる。
【0318】
医薬組成物および投与方法
本明細書に記載の抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、およびベクターは、薬学的に許容可能な製剤として投与できる。多数の医薬製剤が当技術分野において既知である。多くのこのような製剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５に記さされており、この文献の当該部分は、参照により本明細書に組み込まれる。このような薬学的に許容可能な製剤は、例えば、溶液または懸濁液などの液体、丸薬、カプセル剤、ペースト、またはゲルなどの固体であり得る。液体製剤は、例えば、１つまたは複数の次記成分を含むことができる：緩衝液、賦形剤、塩、糖、界面活性剤、およびキレート化剤。製剤は、抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、またはベクターの機能を保護するように、および患者により耐容性良好であるように設計され得る。
本明細書に記載の抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、およびベクターは、薬学的に許容可能な製剤として投与できる。多数の医薬製剤が当技術分野において既知である。多くのこのような製剤は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ，２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５に記さされており、この文献の当該部分は、参照により本明細書に組み込まれる。このような薬学的に許容可能な製剤は、例えば、溶液または懸濁液などの液体、丸薬、カプセル剤、ペースト、またはゲルなどの固体であり得る。液体製剤は、例えば、１つまたは複数の次記成分を含むことができる：緩衝液、賦形剤、塩、糖、界面活性剤、およびキレート化剤。製剤は、抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、またはベクターの機能を保護するように、および患者により耐容性良好であるように設計され得る。
【0319】
ポリヌクレオチドおよび抗体などのタンパク質は通常、経口ではなく、非経口的に投与される。製剤に応じて、経口投与は、タンパク質またはポリヌクレオチドを胃の酸性環境にさらす可能性があり、そのタンパク質またはポリヌクレオチドを不活化し得る。いくつかの実施形態では、特定の製剤は、タンパク質またはポリヌクレオチドが胃酸に非感受性であるか、または酸性環境から、例えば、丸薬上の特殊コーティングまたはカプセルにより、適切に保護されている場合には、特定のタンパク質またはポリヌクレオチドの経口投与が可能となり得る。製剤はまた、例えば、鼻腔内、腟、直腸、または経口投与、または吸入剤としての投与を含む、粘膜経由で投与し得る。製剤はまた、いくつかの実施形態では、局所に投与され得る。一般に、抗体およびポリヌクレオチドは、液体製剤の注射により投与される。注射は、例えば、皮下、静脈内、動脈内、病巣内（例えば、腫瘍内）、筋肉内または腹膜注射であり得る。
【0320】
抗体または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞
１つまたは複数の抗体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、組換えタンパク質の発現に好適する種々の細胞のいずれかであり得る。これらには、例えば、グラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば、大腸菌、枯草菌、またはネズミチフス菌などの細菌が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は、出芽酵母、分裂酵母、などの種を含む真核細胞、またはクリベロマイセス属、カンジダ属、スポドテラ（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ）属の真核生物、または異種ポリペプチドを発現できる任意の細胞であり得る。さらなる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。異種ポリペプチドの発現に好適する多くの哺乳動物細胞株が当技術分野において既知であり、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）を含む種々の購入業者から取得できる。好適な哺乳動物宿主細胞株には、例えば、ＣＯＳ－７系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのそれらの誘導体および関連細胞株、（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１）、ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ ｐｒｏ－３細胞株およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性を欠く、ＤＵＫＸ－Ｘ１１およびＤＧ４４細胞株などのこれらの誘導体、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）、ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２／３Ｂ細胞、ＫＢ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｓ４９細胞、およびＮＳ０およびＳｐ２／０細胞を含むマウス骨髄腫細胞が挙げられる。異種ポリペプチドを発現できるその他の原核生物、真核生物、または哺乳動物細胞型も使用し得る。
１つまたは複数の抗体をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、組換えタンパク質の発現に好適する種々の細胞のいずれかであり得る。これらには、例えば、グラム陰性またはグラム陽性原核生物、例えば、大腸菌、枯草菌、またはネズミチフス菌などの細菌が挙げられる。他の実施形態では、宿主細胞は、出芽酵母、分裂酵母、などの種を含む真核細胞、またはクリベロマイセス属、カンジダ属、スポドテラ（Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ）属の真核生物、または異種ポリペプチドを発現できる任意の細胞であり得る。さらなる実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。異種ポリペプチドの発現に好適する多くの哺乳動物細胞株が当技術分野において既知であり、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）を含む種々の購入業者から取得できる。好適な哺乳動物宿主細胞株には、例えば、ＣＯＳ－７系統（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ ２３：１７５）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯなどのそれらの誘導体および関連細胞株、（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８：３１）、ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯ ｐｒｏ－３細胞株およびジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性を欠く、ＤＵＫＸ－Ｘ１１およびＤＧ４４細胞株などのこれらの誘導体、ＨｅＬａ細胞、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）、ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯ Ｊ．１０：２８２１に記載のアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）由来のＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３などのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２／３Ｂ細胞、ＫＢ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、Ｓ４９細胞、およびＮＳ０およびＳｐ２／０細胞を含むマウス骨髄腫細胞が挙げられる。異種ポリペプチドを発現できるその他の原核生物、真核生物、または哺乳動物細胞型も使用し得る。
【0321】
治療方法
場合により、１つまたは複数のベクター、例えば、腫瘍溶解性ウイルスベクター中に収容された、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、それらの混合物、および／またはこのような抗体または混合物をコードするポリヌクレオチドを使って、免疫応答を高め、および／または、例えば、感染症、免疫不全疾患および黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、明細胞腎臓肉腫、およびホジキンリンパ腫などの種々の癌を含む、種々の状態を治療できる。本明細書で意図される、免疫応答が高められているかどうかは、下記実施例８に記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにより評価できる。
場合により、１つまたは複数のベクター、例えば、腫瘍溶解性ウイルスベクター中に収容された、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、それらの混合物、および／またはこのような抗体または混合物をコードするポリヌクレオチドを使って、免疫応答を高め、および／または、例えば、感染症、免疫不全疾患および黒色腫、非小細胞肺癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、胃癌、膀胱癌、明細胞腎臓肉腫、およびホジキンリンパ腫などの種々の癌を含む、種々の状態を治療できる。本明細書で意図される、免疫応答が高められているかどうかは、下記実施例８に記載の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにより評価できる。
【0322】
抗ｈＣＴＬＡ４抗体、抗ｈＰＤ１抗体、それらの混合物、および／またはこのような抗体または混合物をコードするポリヌクレオチドは、追加の療法剤と共に投与でき、これは、抗体、抗体の混合物、またはポリヌクレオチドの前に、後に、および／またはそれと同時に投与される。追加の療法剤は、免疫調節性分子、照射、化学療法剤、標的化生物製剤、標的化阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群より選択できる。
【0323】
いくつかの実施形態では、追加の療法剤は、ＰＤＬ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＳＦＲ１ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、またはＣＤ７３のアンタゴニスト；ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＣＤ４０のアゴニスト；タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））などの腫瘍溶解性ウイルス；ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）；インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤；ベバシズマブなどの抗血管新生薬；抗体－薬物複合体；またはチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。
【0324】
追加の療法剤が化学療法的剤の場合、それは、例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、メチルロムスチン、ｃｉｓ－ジアンミンジクロロ白金、チオテパ、アジリジニルベンゾキノン、シスプラチン、カルボプラチン、メルファラン塩酸塩、クロラムブシル、イホスファミド、メクロレタミンＨＣｌ、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、ミトラマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＶＰ－１６、ＶＭ－２６、ロイコボリン含有または非含有メトトレキセート、ロイコボリン含有または非含有５－フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ゲムシタビン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシ尿素、デオキシコホルマイシン、フルダラビン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、アクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ミトキサントロンであり得る。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）を参照されたい。この文献の当該部分は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0325】
抗体またはこれらの混合物については、これらは、治療有効量を適切な間隔で患者に投与できる。例えば、単一抗体または抗体混合物の単回用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｇ／ｋｇ）～約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇであり得る。単回用量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇの用量であり得る。同様に、抗体または抗体混合物の単回用量は、約０．３７ｍｇ／皮膚表面積ｍ２（ｍｇ／ｍ２）～約１８５０ｍｇ／ｍ２、約０．５ｍｇ／ｍ２～約３７０ｍｇ／ｍ２、約３．７ｍｇ／ｍ２～約３７０ｍｇ／ｍ２、または約１８．５ｍｇ／ｍ２～約２５９ｍｇ／ｍ２であり得る。単回用量は、約１０ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、３７ｍｇ／ｍ２、７４ｍｇ／ｍ２、１１１ｍｇ／ｍ２、１４８ｍｇ／ｍ２、１８５ｍｇ／ｍ２、２２２ｍｇ／ｍ２、２５９ｍｇ／ｍ２、２９６ｍｇ／ｍ２、３３３、ｍｇ／ｍ２、または３７０ｍｇ／ｍ２であり得る。同様に、抗体または抗体混合物の単回用量は、約０．６２ｍｇ～約３１００ｍｇ、約１ｍｇ～約６２０ｍｇ、約６．２ｍｇ～約６２０ｍｇ、または約１０ｍｇ～約４３４ｍｇの用量で投与できる。単回用量は、約０．５１、３、６、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｍｇであり得る。
【0326】
抗体、抗体の混合物、またはそれらをコードするポリヌクレオチドの投与量は、一定の期間にわたり１回または２回または間隔をあけて投与できる。例えば、投与量は、毎日、１日おき、週２回、週１回、１０日おきに１回、２週おきに１回、３週おきに１回、月１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月おきに１回投与できる。例えば、投与は、約１～４週間、約１～６ヶ月間、約６ヶ月～１年間、約１～２年間、または最大５年間、継続できる。いくつかの事例では、投与は中断し、再開できる。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＴＬＡ４および抗ｈＰＤ１抗体を含む混合物は、両方の抗体が同時の投与できるように投与し得る。混合物の１回または複数回の投与の後で、抗ｈＰＤ１抗体を単独で投与できる。いくつかの実施形態では、抗ｈＰＤ１抗体の投与は、一定期間にわたり継続できる。いくつかの実施形態では、抗体または抗体の混合物の投与は、１回または複数回の中断および再開ができる。
【0327】
本明細書に記載の抗体または抗体の混合物をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドの場合には、投与量は、例えば、約５ｘ１０９ポリヌクレオチドのコピー／ｋｇ体重（コピー／ｋｇ）～約１０１５コピー／ｋｇ、約１０１０コピー／ｋｇ～約１０１４コピー／ｋｇ、または約５ｘ１０１０コピー／ｋｇ～約５ｘ１０１３コピー／ｋｇであり得る。あるいは、投与量は、約１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、５ｘ１０１３、１０１４、２ｘ１０１４、３ｘ１０１４、４ｘ１０１４、５ｘ１０１４、６ｘ１０１４、７ｘ１０１４、８ｘ１０１４、９ｘ１０１４、または１０１５コピーのポリヌクレオチドであり得る。投与頻度は、必要に応じ調節でき、また、上述のように、または、例えば、毎日、１日おき、週２回、週１回、１０日おきに１回、２週おきに１回、３週おきに１回、月１回、または２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２ヶ月おきに１回投与のように調節できる。
【0328】
上記で本発明を一般的用語で記載してきたが、以下の具体的実施例は、本発明を、その範囲を限定することなく、例示するために提供される。本明細書に記載の本発明の趣旨に即して、本発明に対し種々の変更および修正がなされ得ることは理解され、また、当業者には明らかであろう。このような変更および修正は、添付の特許請求の範囲におけるものを含む本明細書に記載の本発明の範囲に入る。
【0329】
実施例
実施例１：抗ｈＣＴＬＡ４抗体の作製
選択位置でランダム化された種々の抗ｈＣＴＬＡ４ ＦａｂフラグメントをコードするＤＮＡライブラリーを下記のように生成した。ライブラリーは、ヒト生殖系列ＶＨ（ＩＧＨＶ３－３３＊０１－ＩＧＨＪ４＊０１）およびＶＬ（ＩＧＫＶ３－２０＊０１－ＩＧＫＪ３＊０１）フレームワーク領域をベースにした。オーバーラッピング一本鎖オリゴヌクレオチド、６９～９９塩基長、を用いて、重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを構築した。合成縮重オリゴヌクレオチドを用いて、８個または５個の保存的にランダム化したコドンを、それぞれ、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ中に導入した。コドンの保存的ランダム化は、ランダム化により保存的アミノ酸置換のみが得られることが予測されるようにランダム化した。例えば、グリシンをコードするＧ－Ｇ－Ｃコドンは、グリシン、アラニン、セリンまたはトレオニンをコードするように、Ａ／Ｇ－Ｃ／Ｇ－Ｃを用いて保存的にランダム化し得る。オリゴヌクレオチドを混合し、ポリヌクレオチド連鎖反応（ＰＣＲ）によりＶＨおよびＶＬライブラリーに別々に組み込んだ。ＣＬカッパ（Ｃκ）フラグメント、続けて、自己切断２Ａペプチド（Ｐｅｐ２Ａ；例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１），ＰＬＯＳ ＯＮＥ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８５５６を参照）および下流のＶＨ用のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）をＰＣＲ用のテンプレートとして用いて、増幅した。全てのオリゴヌクレオチドはＩＤＴにより合成された。全ての増幅は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。
実施例１：抗ｈＣＴＬＡ４抗体の作製
選択位置でランダム化された種々の抗ｈＣＴＬＡ４ ＦａｂフラグメントをコードするＤＮＡライブラリーを下記のように生成した。ライブラリーは、ヒト生殖系列ＶＨ（ＩＧＨＶ３－３３＊０１－ＩＧＨＪ４＊０１）およびＶＬ（ＩＧＫＶ３－２０＊０１－ＩＧＫＪ３＊０１）フレームワーク領域をベースにした。オーバーラッピング一本鎖オリゴヌクレオチド、６９～９９塩基長、を用いて、重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを構築した。合成縮重オリゴヌクレオチドを用いて、８個または５個の保存的にランダム化したコドンを、それぞれ、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡ中に導入した。コドンの保存的ランダム化は、ランダム化により保存的アミノ酸置換のみが得られることが予測されるようにランダム化した。例えば、グリシンをコードするＧ－Ｇ－Ｃコドンは、グリシン、アラニン、セリンまたはトレオニンをコードするように、Ａ／Ｇ－Ｃ／Ｇ－Ｃを用いて保存的にランダム化し得る。オリゴヌクレオチドを混合し、ポリヌクレオチド連鎖反応（ＰＣＲ）によりＶＨおよびＶＬライブラリーに別々に組み込んだ。ＣＬカッパ（Ｃκ）フラグメント、続けて、自己切断２Ａペプチド（Ｐｅｐ２Ａ；例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０１１），ＰＬＯＳ ＯＮＥ，ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００１８５５６を参照）および下流のＶＨ用のシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ），Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ，ＵＳＡ）をＰＣＲ用のテンプレートとして用いて、増幅した。全てのオリゴヌクレオチドはＩＤＴにより合成された。全ての増幅は、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した。
【0330】
酵母においてランダム化Ｆａｂフラグメントのライブラリーを提示するために、１つの末端にシグナルペプチドＳＰ１（この前にガラクトース誘導性プロモーターがある）をコードする配列ならびにもう一方の端部にＣＨ１（この後ろに、凝集素をコードする配列が続く）をコードする配列を有する直鎖状化されたベクターと、（１）ＳＰ１－ＶＬ－Ｃκ（一部）、（２）Ｃκ－Ｒ６－Ｐｅｐ２Ａ－ＳＰ２、および（３）ＳＰ２－ＶＨ－ＣＨ１（一部）をコードする３つの上記ＰＣＲフラグメントとを用いて出芽酵母細胞を電気穿孔処理した。この場合、ＶＬおよびＶＨは選択位置で保存的にランダム化された。ＰＣＲフラグメント（１）は、ベクターのＳＰ１末端およびＰＣＲフラグメント２のＣκ末端と重なり合う。ＰＣＲフラグメント（２）のＳＰ２末端は、ＰＣＲフラグメント３とそのＳＰ２末端上で重なり合い、ＰＣＲフラグメント３のＣＨ１末端は、ベクターとそのＣＨ１末端上で重なり合う。全てのこれらのオーバーラップは、３０～６０塩基対の範囲内であるので、酵母中の相同組換えにより、フラグメントを次の順の配列要素：ＳＰ１－ＶＬ－Ｃκ－Ｒ６－Ｐｅｐ２Ａ－ＳＰ２－ＶＨ－ＣＨ１－ＨＡ－凝集素、を有するインサートを含む単一ベクター中に組み込むことが可能となる。ここで、Ｒ６は、６つの連続したアルギニン残基をコードし、ＨＡはＨＡタグ、すなわち、タンパク質タグとして広く使用されているヒトインフルエンザ赤血球凝集素由来の小さいペプチドである。これらの配列の発現は、ＳＰ１の上流のガラクトース誘導性プロモーターにより推進される。デキストロースを含みウラシルを欠く酵母培地を用いて作製した選択的寒天プレート上で形質転換体を増殖した。ベクターは、宿主酵母菌株がウラシルを作製できないことを補完する遺伝子を含む。ライブラリーサイズ、すなわち、形質転換体の総数は、約２ｘ１０８～３ｘ１０８個の形質転換体の範囲である。ライブラリーの推定複雑度は、約１０７未満であり、Ｆａｂフラグメントをコードするヌクレオチド配列の約１０７未満の異なる組み合わせが各ライブラリー内に存在したことを意味する。これらの推定は、変動させた位置での保存的ランダム化を前提として生じ得る可能な組み合わせ数を基準にした。
【0331】
実際のライブラリーの多様性および品質を評価するために、５０個のランダムに採取した酵母クローン由来のＦａｂフラグメントをコードするＤＮＡセグメントを調査した。これらのクローンのＶＨおよびＶＬ ＤＮＡフラグメントを酵母コロニーＰＣＲにより増幅し、Ｇｅｎｅｗｉｚ Ｉｎｃ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡにより配列を決定した。例えば、Ｄｕｄａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｄｉｒｅｃｔ ＰＣＲ ｆｒｏｍ Ｙｅａｓｔ Ｃｅｌｌｓ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏｔｅ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃを参照されたい。ＤＮＡ配列解析により、７０％の配列がインフレームＶＨおよびＣＨ１ならびにインフレームＶＬおよびＣＬをコードし、ＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡが設計、予測した多様性を標的位置で含んでいることが明らかになった。
【0332】
ライブラリーを選別するために、ウラシルを欠き、デキストロースを含む培地中で出芽酵母細胞を増殖し、細胞を遠心沈降させ、ウラシルを欠き、ガラクトースを含む培地中に再懸濁してＦａｂ発現を誘導した。酵母細胞を、ＨＡタグに特異的なＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４８８標識抗体ならびにストレプトアビジン－アロフィコシアニン（ストレプトアビジン－ＡＰＣ）およびビオチン化ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃ融合タンパク質、すなわち、ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合したｈＣＴＬＡ４の細胞外の領域の複合体で標識して、細胞により提示されたＦａｂのレベル、および提示されたＦａｂフラグメントにより結合されたｈＣＴＬＡ４のレベルを同時に検出した。ネガティブコントロールを、抗ＨＡタグ抗体およびストレプトアビジン－ＡＰＣおよび無関係のビオチン化タンパク質（ビオチン化ＰＤ１）の複合体で標識した。試料を、図９に示すソーティングウインドウでＦＡＣＳＡＲＩＡ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて選別し、４，０００細胞／秒のイベントレートで収集した。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）の第１ラウンド中に合計１ｘ１０８個の細胞を選別し、集団の０．５％を収集した。収集細胞をデキストロースを含みウラシルを欠く酵母培地を用いて作製した寒天プレート上、３０℃で増殖した。これらのプレートからの酵母細胞をデキストロースを含みウラシルを欠く液体培地中にかき集め、３０℃で培養後、ガラクトースを含みウラシルを欠く液体培地中で次の選別ラウンドのために誘導した。２つのラウンドの選別を実施した。第１の選別は、標識用の５００ｎＭのストレプトアビジン－ＡＰＣおよびビオチン化ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃの複合体を用いて濃縮モード、すなわち、高速選別速度を用いて実施し、多くの細胞の選別を可能とし、また、第２の選別は、精製モード、すなわち、遅い選別速度を用い、標識用の０．６ｎＭのストレプトアビジン－ＡＰＣおよびビオチン化ｈＣＴＬＡ４の複合体を使用して実施した。図９は、ネガティブコントロールおよび第１と第２ラウンドの細胞選別のＦＡＣＳ分析を示す。図９の「ＰＳ」と標識した多角形は、ゲート制御ソーティングウインドウを示す。
【0333】
真のポジティブを得る確率を高めるために、収集細胞の３回目の再選別を行い、デキストロースを含みウラシルを欠く培地で作製した寒天プレートに播種し、個別のコロニーを得た。第３の選別から得られた酵母細胞上に発現したＦａｂフラグメントがｈＣＴＬＡ４に結合し得ることを確認するために、９６個のこれらの酵母コロニーをランダムに採取し、誘導し、ストレプトアビジン－ＡＰＣおよびビオチン化ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃの複合体ならびにＨＡタグに特異的なＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）標識抗体を用いて、ＦＡＣＳ分析に供した。これらの酵母クローンの内で、９５％がｈＣＴＬＡ４：ＦｃおよびＨＡタグ特異的抗体の両方に結合した。ＤＮＡ塩基配列決定は、４０％のこれらの酵母クローンが特有の配列を有するＦａｂフラグメントを発現したことを明らかにした。最強のｈＣＴＬＡ４結合物質を特定するために、ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃに対し強い結合を示し、また、特有のＶＨ／ＶＬ配列を有するＦａｂフラグメントを発現した３２個の酵母クローンを、種々の濃度のビオチン化ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃを用いて、追加のＦＡＣＳ分析に供し、最も低い濃度でｈＣＴＬＡ４：Ｆｃに結合し得るものを特定した。
【0334】
ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃに対し最強の結合を示した１２個の酵母クローン由来のＦａｂフラグメントを、単一クローン由来のＶＨをコードするＤＮＡをシグナルペプチドＶκ１Ｏ２／Ｏ１２およびヒトＩｇＧ１ ＨＣの残りの部分をコードする哺乳動物発現ベクターに挿入し、同じクローン由来のＶＬをコードするＤＮＡをシグナルペプチドＶκ１Ｏ２／Ｏ１２およびＣκドメインをコードする別の哺乳動物発現ベクターに挿入することにより、ヒトＩｇＧ１フォーマットに変換した。大腸菌細胞を連結した混合物で形質転換し、適切な重鎖および軽鎖配列を含む細菌クローンをＤＮＡ塩基配列決定法により特定した。適切な重鎖および軽鎖配列をコードする哺乳動物発現構築物を、ＥＸＰＩ２９３（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）中に同時遺伝子導入し、得られた形質移入体を発現させる条件下で培養した。得られた細胞上清中の抗体をプロテインＡカラムを用いて精製した。ＩｇＧ１フォーマットに変換された１２個のＦａｂフラグメントのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を図３および４に示す。これらの図に示すように、これらの抗体は、本明細書では１Ｅ１、２Ｆ１、３Ｇ１、４Ｈ１、５Ｂ２、６Ｅ３、７Ａ４、８Ｂ４、９Ｃ４、１０Ｄ４、１１Ｆ４、および１２Ｇ４抗体と命名された。ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を、それぞれ図１および２に示す。
【0335】
実施例２：抗ｈＰＤ１抗体の作製
抗ｈＰＤ１抗体を選択するために、９個および７個の保存的にランダム化したコドンをＶＨおよびＶＬをそれぞれコードするＤＮＡ中に導入したことを除いて、上記で抗ｈＣＴＬＡ４抗体のために記載した方法と実質的に同じ方法で、ライブラリーを構築し、選別し、試験した。
抗ｈＰＤ１抗体を選択するために、９個および７個の保存的にランダム化したコドンをＶＨおよびＶＬをそれぞれコードするＤＮＡ中に導入したことを除いて、上記で抗ｈＣＴＬＡ４抗体のために記載した方法と実質的に同じ方法で、ライブラリーを構築し、選別し、試験した。
【0336】
ＦＡＣＳを使用して、２，３の例外があるが、上記で抗ｈＣＴＬＡ４抗体に対して記載したように、ｈＰＤ１に結合するＦａｂフラグメントを発現する酵母細胞を選択した。ｈＰＤ１の細胞外の領域をコードするＤＮＡをヘキサヒスチジンタグおよびＡＶＩＴＡＧ（商標）（Ａｖｉｄｉｔｙ Ｌ．Ｌ．Ｃ．，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）に融合することにより、ビオチン化一価ｈＰＤ１を作製した。ｈＰＤ１－Ｈｉｓ６－ＡＶＩＴＡＧ（商標）融合タンパク質を、ＢｉｒＡビオチン－タンパク質リガーゼおよびｈＰＤ１－Ｈｉｓ６－ＡＶＩＴＡＧ（商標）融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを同時遺伝子導入して、増殖培地にビオチンを加えることにより、インビボでビオチン化した。ビオチン化ｈＰＤ１－Ｈｉｓ６－ＡＶＩＴＡＧ（商標）融合タンパク質を、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）アガロースカラムを通して精製した。このビオチン化ｈＰＤ１タンパク質をビオチン化ｈＣＴＬＡ４：Ｆｃの代わりに用いた。第１、第２および第３ラウンドにおける標識のために、５００ｎＭ、５ｎＭ、および０．０５ｎＭのビオチン化ｈＰＤ１を用いて、合計３ラウンドの選別を続けて実施した。抗ｈＣＴＬＡ４選択の場合のように、無関係のビオチン化タンパク質を用いて、ネガティブコントロールの標識を実施した。これらのＦＡＣＳ分析の結果を図１０に示す。最初の２つの選別は、濃縮モード、すなわち、高速選別速度で実施し、最後の選別は、精製モード、すなわち、遅い選別速度で実施した。
【0337】
第３の選別後、収集細胞を再選別し、デキストロースを含みウラシルを欠く酵母培地を用いて作製した寒天プレート上に播種した。３００コロニーをランダムに採取し、デキストロースを含みウラシルを欠く培地中で培養し、ガラクトースを含みウラシルを欠く培地中で誘導し、上述のように、ＦＡＣＳで分析した。各個別クローンのＶＬおよびＶＨをコードするＤＮＡをＰＣＲ反応により増幅し、配列を決定した。ＦＡＣＳで測定して、３００コロニー中の９５％がｈＰＤ１に結合するＦａｂフラグメントを産生し、５０％が特有のＦａｂフラグメントをコードするＤＮＡを含んでいた。
【0338】
Ｆａｂフラグメントの特性をさらに明らかにするために、特有の抗ｈＰＤ１ Ｆａｂフラグメントを発現している酵母細胞をガラクトースを含みウラシルを欠く培地中で増殖させた。細胞を７５℃で５分間加熱した後、ビオチン化ｈＰＤ１、続けて、ストレプトアビジン－ＡＰＣで染色した。その後、細胞を、ＦＡＣＳ分析に供した。最強のｈＰＤ１結合を有するＦａｂフラグメントを産生した１００個の酵母クローンを、ＦＡＣＳ分析の前に細胞に加えたｈＰＤ１の量を滴定することにより、特定した。低いｈＰＤ１濃度でｈＰＤ１結合の強いシグナルを生成したクローンは、強力な結合物質と見なされた。
【0339】
良好な温度安定性と強力なｈＰＤ１への結合の両方を示した１５個のＦａｂフラグメントを、ヒトＩｇＧ４フォーマットへの変換のために選択した。これらのＦａｂフラグメントのＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を、図７および８に示す。これらの図に示すように、これらの抗体は、本明細書では１～１５の番号で指定される。ＶＨおよびＶＬ ＣＤＲのアミノ酸配列を、それぞれ図５および６に示す。
【0340】
抗ｈＰＤ１抗体は、ＶＨをコードするＤＮＡが、ヒトＩｇＧ１抗体ではなく、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３をコードするベクターに挿入されたことを除いて、基本的には、抗ｈＣＴＬＡ４抗体に対して上記の通り産生された。
【0341】
実施例３：抗ｈＣＴＬＡ４抗体の細胞表面発現ｈＣＴＬＡ４への結合
次の実験は、実施例１に記載のように選択された抗ｈＣＴＬＡ４抗体が、細胞表面に発現されたｈＣＴＬＡ４に結合し得るかどうかを判定するために実施された。約１ｘ１０５個のｈＣＴＬＡ４を発現しているジャーカットＴ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１８６９０７）を、種々の濃度の選択抗ｈＣＴＬＡ４抗体を含むマイクロタイタープレートのウエルの、ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、これは、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、および１．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含む）中０．１％のＮａＮ３および２％ＢＳＡ）中、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、表面結合抗ｈＣＴＬＡ４抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したポリクローナル抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（抗ｈＩｇＧ－ＦＩＴＣ）で検出した。抗ｈＣＴＬＡ４抗体の結合をフローサイトメトリー分析により検出した。結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ，Ｌ．Ｌ．Ｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）で報告した。これらのデータから、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＥＣ５０値を計算し、下表１０に示す。
次の実験は、実施例１に記載のように選択された抗ｈＣＴＬＡ４抗体が、細胞表面に発現されたｈＣＴＬＡ４に結合し得るかどうかを判定するために実施された。約１ｘ１０５個のｈＣＴＬＡ４を発現しているジャーカットＴ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１８６９０７）を、種々の濃度の選択抗ｈＣＴＬＡ４抗体を含むマイクロタイタープレートのウエルの、ＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、これは、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、および１．８ｍＭのＫ２ＨＰＯ４を含む）中０．１％のＮａＮ３および２％ＢＳＡ）中、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、表面結合抗ｈＣＴＬＡ４抗体を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したポリクローナル抗ｈＩｇＧ（Ｆｃ特異的）抗体（抗ｈＩｇＧ－ＦＩＴＣ）で検出した。抗ｈＣＴＬＡ４抗体の結合をフローサイトメトリー分析により検出した。結果をＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦＬＯＷＪＯ，Ｌ．Ｌ．Ｃ．，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ，ＵＳＡ）を用いて幾何平均蛍光強度（ＭＦＩ）で報告した。これらのデータから、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いてＥＣ５０値を計算し、下表１０に示す。
【表10】
【0342】
これらのデータは、このアッセイで測定された抗体の結合強度にはバラツキがあったが、１２個すべての抗体は、細胞表面発現ＣＴＬＡ４に結合できることを示した。
【0343】
実施例４：抗ｈＣＴＬＡ４抗体によるｈＣＴＬＡ４のｈＢ７－１／ｈＢ７－２に対する結合の抑制
ｈＣＴＬＡ４のそのリガンドｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用の抗ｈＣＴＬＡ４抗体による遮断または抑制を２つの異なるアッセイ系で評価した。
ｈＣＴＬＡ４のそのリガンドｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用の抗ｈＣＴＬＡ４抗体による遮断または抑制を２つの異なるアッセイ系で評価した。
【0344】
第１のアッセイでは、ｈＣＴＬＡ４のラージ細胞の表面上に発現したｈＢ７－１およびｈＢ７－２への結合の抑制を評価した。ヒト細胞であるラージ細胞は、高レベルのｈＢ７－１およびｈＢ７－２を発現する。Ｆｃフラグメントに融合したｈＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む可溶性型のｈＣＴＬＡ４（ＣＴＬＡ４－ＥＣＤ＿Ｆｃ）をマイクロタイタープレートのＦＡＣＳ緩衝液中で種々の濃度の選択抗ｈＣＴＬＡ４抗体と共に室温（ＲＴ）でプレインキュベートした。３０分後、１ｘ１０５個のラージ細胞を各ウエルに加え、さらに３０分間インキュベートした。ラージ細胞に結合したＣＴＬＡ４－ＥＣＤ＿Ｆｃを、非ブロッキング抗ＣＴＬＡ４抗体（ＰｅｒＣＰ－ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７１０で標識した抗ヒトＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）（クローン１４Ｄ３）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号４６－１５２９）で検出した。結合ＣＴＬＡ４－ＥＣＤ＿Ｆｃのレベルをフローサイトメトリー分析により検出し、ＣＴＬＡ４－ＥＣＤ＿Ｆｃの結合をＭＦＩとして報告した。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて計算した。
【表11】
【0345】
第２の抑制アッセイでは、ＣＴＬＡ４二重細胞レポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＣＳ１８６９０７）を用いて、抗ＣＴＬＡ４抗体のＣＴＬＡ４活性に対する機能的効果を評価した。このアッセイでは、ＩＬ－２プロモーターにより促進されるルシフェラーゼレポーターを発現しているヒト細胞であるジャーカット細胞の抗ＣＤ３活性化によりルシフェラーゼ産生が誘導され、これは、同じジャーカット細胞上に発現したｈＣＴＬＡ４のｈＢ７－１またはｈＢ７－２（添加ラージ細胞由来）結合により抑制できる。ｈＣＴＬＡ４に結合し、ｈＢ７－１またはｈＢ７－２結合を抑制または遮断する抗ＣＴＬＡ４抗体が、ＩＬ－２経路を遮断する抑制シグナルを除去し、それにより、二重細胞レポーター系におけるルシフェラーゼシグナルを回復する。
【0346】
このアッセイは、以下で手短に記載のように、基本的に製造業者の説明書に従って実施された。アッセイ培地（ＲＰＭＩ １６４０培地（例えば、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００１（商標）を参照）中のＣＴＬＡ４を発現している遺伝子改変ジャーカットＴ細胞を、ウエルあたり１５μＬ中の５ｘ１０４個の細胞として、ハーフエリア９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６８８）に分配した。別々のマイクロタイタープレート中に、系列希釈のそれぞれの試験抗体を作製した。その後、ジャーカットＴ細胞を含む各ウエルは、２種の１５μＬの追加物を受け入れた。その内の１つは試験抗体希釈物を含有し、残りの１つは、５ｘ１０４個のラージ細胞（ｈＢ７－１およびｈＢ７－２を発現している）および抗ＣＤ３抗体を含有した。マイクロプレートを５％ＣＯ２中、３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、製造業者の説明書に従い、４０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７９４１）を各ウエルに加えた。ルシフェラーゼ活性をＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて検出した。データを相対発光強度（ＲＬＵ）としてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析し、ＩＣ５０値を決定した。図１１および下表１２は、ＣＴＬＡ４に結合しなかったネガティブコントロール抗体（アイソタイプ適合対照）に比べて、１２個全ての抗ｈＣＴＬＡ４抗体が増大したルシフェラーゼ発現を生じさせたことを示す。これらのデータは、試験した抗ｈＣＴＬＡ４抗体が、ｈＣＴＬＡ４とｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２との相互作用を抑制し、それにより、ＩＬ－２経路の機能的抑制を低減したことを強く示唆する。抗体１０Ｄ１は、ポジティブコントロールとして使用した抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）である。
【表12】
【0347】
実施例５：抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＴ細胞活性化に与える効果
選択抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＴ細胞活性化を高める能力を、インビトロブドウ状球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。３人の異なるドナーからのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を０．５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｔ細胞を活性化できる抗ＣＤ３抗体）を用いて、完全ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＰＭＩ－１６４０プラス５％ＦＢＳ）中で３日間プレ活性化した。ＰＢＭＣ（３日目には、ほぼ活性化Ｔ細胞からなる）を採取し、温かい培地で３回洗浄し、２日間静置した。その後、静置したプレ活性化ＰＢＭＣを９６ウエルマイクロタイタープレートのウエル中に３ｘ１０４個／ウエルで分配した。その後、各ウエルに次の添加を行った：１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＳＥＢ、予め自己ＣＤ３＋Ｔ細胞を枯渇させた１ｘ１０４個のＰＢＭＣ、および種々の濃度の各試験抗体。２日後に培養上清を採取し、ＩＬ－２のレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
選択抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＴ細胞活性化を高める能力を、インビトロブドウ状球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）Ｔ細胞活性化アッセイで試験した。３人の異なるドナーからのヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を０．５μｇ／ｍｌのＯＫＴ３（Ｔ細胞を活性化できる抗ＣＤ３抗体）を用いて、完全ＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＲＰＭＩ－１６４０プラス５％ＦＢＳ）中で３日間プレ活性化した。ＰＢＭＣ（３日目には、ほぼ活性化Ｔ細胞からなる）を採取し、温かい培地で３回洗浄し、２日間静置した。その後、静置したプレ活性化ＰＢＭＣを９６ウエルマイクロタイタープレートのウエル中に３ｘ１０４個／ウエルで分配した。その後、各ウエルに次の添加を行った：１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＳＥＢ、予め自己ＣＤ３＋Ｔ細胞を枯渇させた１ｘ１０４個のＰＢＭＣ、および種々の濃度の各試験抗体。２日後に培養上清を採取し、ＩＬ－２のレベルを酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
【0348】
図１２および下表１３は、単一ドナー由来の二通りの試料（これは、その他のドナーで実施した実験を代表するものであった）からの結果を示す。これらの結果は、試験した抗ｈＣＴＬＡ４抗体すべてがＩＬ－２の産生を増大させることができることを示す。試験した抗体の中で、１０Ｄ４が最も強力であった。１０Ｄ１という名称の抗体は、ポジティブコントロールとして使用した抗ｈＣＴＬＡ４ヒトＩｇＧ１カッパ抗体（イピリムマブ）である。
【表13】
【0349】
実施例６：抗ｈＰＤ１抗体の細胞表面に発現したｈＰＤ１への結合
次の実験は、選択抗ｈＰＤ１抗体が、活性化されたＴ細胞の表面上に発現した未変性のＰＤ１に結合できるか否かを試験した。ヒトＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌの濃度のＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）でプレ活性化した。３日後、この時点でほぼ活性化されたＴ細胞であったＰＢＭＣを、９６ウエルマイクロタイタープレートに０．１ｘ１０６細胞／ウエルで分配した。種々の濃度の選択抗ｈＰＤ１抗体をウエルに添加し、プレートをＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で３０分間インキュベートした（実施例３に記載のように）。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４－Ｔ細胞（主にＣＤ８＋Ｔ細胞）に結合した抗体を、抗ｈＩｇＧ－ＦＩＴＣおよびアロフィコシアニン標識抗ＣＤ４抗体（抗ＣＤ４－ＡＰＣ）を用いて検出した。
次の実験は、選択抗ｈＰＤ１抗体が、活性化されたＴ細胞の表面上に発現した未変性のＰＤ１に結合できるか否かを試験した。ヒトＰＢＭＣを１μｇ／ｍｌの濃度のＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）でプレ活性化した。３日後、この時点でほぼ活性化されたＴ細胞であったＰＢＭＣを、９６ウエルマイクロタイタープレートに０．１ｘ１０６細胞／ウエルで分配した。種々の濃度の選択抗ｈＰＤ１抗体をウエルに添加し、プレートをＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で３０分間インキュベートした（実施例３に記載のように）。ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ４－Ｔ細胞（主にＣＤ８＋Ｔ細胞）に結合した抗体を、抗ｈＩｇＧ－ＦＩＴＣおよびアロフィコシアニン標識抗ＣＤ４抗体（抗ＣＤ４－ＡＰＣ）を用いて検出した。
【0350】
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ）により試料を分析し、結合をＭＦＩとして報告した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使って、結合に対するＥＣ５０を計算した。データを下表１４で報告する。
【表14】
【0351】
これらのデータは、このアッセイで観察されたＥＣ５０にはバラツキがあったが、全ての試験抗ｈＰＤ１抗体が、Ｔ細胞上に発現したｈＰＤ１に結合し得ることを示す。
【0352】
実施例７：抗ｈＰＤ１抗体によるｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１相互作用の抑制
２つの異なるアッセイを使用して、抗ｈＰＤ１抗体のｈＰＤ１とそのリガンドのｈＰＤＬ１との相互作用を抑制する能力を評価した。二重細胞レポーターアッセイにより、選択抗ｈＰＤ１抗体のｈＰＤＬ１（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｊ１２５０、以前のカタログ番号ＣＳ１８７１０６）との相互作用により媒介されるｈＰＤ１機能を抑制する能力が試験された。選択抗ｈＰＤ１抗体が、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１への結合を抑制する能力を、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
２つの異なるアッセイを使用して、抗ｈＰＤ１抗体のｈＰＤ１とそのリガンドのｈＰＤＬ１との相互作用を抑制する能力を評価した。二重細胞レポーターアッセイにより、選択抗ｈＰＤ１抗体のｈＰＤＬ１（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｊ１２５０、以前のカタログ番号ＣＳ１８７１０６）との相互作用により媒介されるｈＰＤ１機能を抑制する能力が試験された。選択抗ｈＰＤ１抗体が、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１への結合を抑制する能力を、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。
【0353】
ＰＤ１二重レポーターアッセイ系は、ＰＤＬ１とＴ細胞上に発現したＰＤ１との相互作用は、抗ＣＤ３抗体活性化により誘導されたＴ細胞中の活性化Ｔ細胞の核内転写因子（ＮＦＡＴ）遺伝子のプロモーターからの転写を抑制するという事実に依存している。このアッセイで使用されるＴ細胞は、それらの細胞表面上にｈＰＤ１を発現し、また、発現がＮＦＡＴプロモーターにより促進されるルシフェラーゼ遺伝子を含む。細胞表面上のｈＰＤ１がｈＰＤＬ１により結合されると、ルシフェラーゼ産生は抑制されることになる。抗ｈＰＤ１抗体がｈＰＤＬ１のｈＰＤ１への結合が妨げられる場合、この抑制は逆転する。
【0354】
アッセイは次のように実施した。ｈＰＤＬ１および抗ＣＤ３を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標）参照）（５０μＬの１０％ＦＢＳ含有Ｆ－１２培地（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００４（商標）参照）中の４ｘ１０４個の細胞／ウエル）を、ハーフエリア９６ウエルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、３６８８）に分配し、一晩インキュベートした。翌日、別のプレートで、それぞれの試験抗体のアッセイ培地（２％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ １６４０）中の６８ｎＭの濃度から出発する２倍系列希釈を二通りに作製した。その後、ＣＨＯ－Ｋ１細胞を含有する各ウエルから培地を取り出し、希釈試験抗体含有プレートのウエル由来の２０μＬおよびｈＰＤ１を発現し、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む２０μＬのジャーカットＴ細胞（４ｘ１０４）で置換した。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション後、製造業者の説明書に従い、３８μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７９４１）を各ウエルに加えた。ルシフェラーゼ活性をＥｎＶｉｓｉｏｎ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。データをＲＬＵとしてプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて解析し、ＩＣ５０値を決定した。
【0355】
データを図１３および下表１５に示す。アイソタイプ対照１０Ｄ１ ＩｇＧ４（これは、抗ＣＴＬＡ４抗体である）に比較して、１０個全ての試験した抗ｈＰＤ１抗体がＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用を抑制した。試験抗体は、ニボルバムの可変ドメインを有する１つのポジティブコントロール抗体、すなわち、ＰＤ１／ＰＤＬ１相互作用を抑制するＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体のＮｉｖｏ Ｇ４よりも強力であった。
【表15】
【0356】
また、ＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、選択抗ｈＰＤ１抗体によるｈＰＤ１とそのリガンドｈＰＤＬ１との相互作用の抑制も試験した。手短に説明すると、可溶性ビオチン化タイプのＰＤ１タンパク質（これは、インビボでビオチン化し（例えば、Ａｓｈｒａｆ ｅｔ ａｌ．（２００４），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３３（２）：２３８－２４５を参照）、細胞外領域のみを含んでいた）含有１０μＬおよびＡＬＰＨＡＬＩＳＡ（登録商標）イムノアッセイ緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＬ０００）中の種々の濃度の抗ｈＰＤ１抗体含有１０μＬを９６ウエルハーフエリアプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）のウエル中で混合し、室温で１時間インキュベートした。その後、可溶性のグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ付きヒトＰＤＬ１（細胞外ドメインのみを含む；１ｎＭの濃度の１０μＬ）を加え、混合物を室温でさらに１時間インキュベートした。次に、１０μＬのＧＳＴアクセプタービーズ（これはＧＳＴタグ付きＰＤＬ１に結合できる）を１６μｇ／ｍＬの最終濃度で加え、プレートを室温で１時間振盪した。最後に、１０μＬのストレプトアビジンドナービーズ（これはビオチン化ｈＰＤ１に結合できる）を加えて、ドナービーズを１６μｇ／ｍＬの最終濃度にし、プレートを室温下、暗所で１時間インキュベートした。ｈＰＤ１とｈＰＤＬ１が結合または相互作用する場合、ドナーおよびアクセプタービーズは、相互に近接し、それによりシグナルが検出されるはずである。この相互作用または結合を抑制する抗体は、その抑制抗体がドナーおよびアクセプタービーズの物理的近接を妨げるために、このシグナルを低下させるであろう。
【0357】
６８０ｎＭの波長の照射および約６１５ｍＭの波長の読み出し発光を用いて、プレートをＥｎＶｉｓｉｏｎ ２１０３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。結果をプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使って、ＩＣ５０値を計算した。結果を図１４および下表１６に示す。
【表16】
【0358】
これらのデータは、試験抗体が、ｈＰＤＬ１のｈＰＤ１に対する結合を、ポジティブコントロールとして用いた２つの抗ｈＰＤ１抗体、Ｎｉｖｏ－Ｇ４およびＰｅｍｂｒｏ－Ｇ４よりも強力に抑制できたことを示す。
【0359】
実施例８：混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおける抗ｈＰＤ１抗体の試験
選択抗ｈＰＤ１抗体のＴ細胞活性化を高める効力を、ＭＬＲアッセイで試験した。手短に説明すると、単球由来未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を刺激剤として使用した。ｉＤＣを調製するために、ヒト単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単球をＰＢＭＣから単離し、８００Ｕ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）および５００Ｕ／ｍＬのインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む完全ＲＰＭＩ培地中で６日間培養した。その後、培養単球（現時点では主にｉＤＣ）由来の２ｘ１０４個の細胞を１ｘ１０５の同種ＣＤ３＋Ｔ細胞を用いて、選択抗ｈＰＤ１抗体の存在下、９６ウエル平底プレート中、３７℃で培養した。ｉＤＣがＴ細胞を活性化すること、およびネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＰＤ１経路が、Ｔ細胞表面上に発現した、リガンド結合ｈＰＤ１を介して活性化されない場合には、その活性化はより大きくなるであろうことが予測される。したがって、抗ＰＤ１抗体がｈＰＤ１とそのリガンドとの相互作用を抑制する場合には、抗ｈＰＤ１抗体はＴ細胞活性化を高め得ることが予測される。
選択抗ｈＰＤ１抗体のＴ細胞活性化を高める効力を、ＭＬＲアッセイで試験した。手短に説明すると、単球由来未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）を刺激剤として使用した。ｉＤＣを調製するために、ヒト単球単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて単球をＰＢＭＣから単離し、８００Ｕ／ｍＬの顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）および５００Ｕ／ｍＬのインターロイキン－４（ＩＬ－４）を含む完全ＲＰＭＩ培地中で６日間培養した。その後、培養単球（現時点では主にｉＤＣ）由来の２ｘ１０４個の細胞を１ｘ１０５の同種ＣＤ３＋Ｔ細胞を用いて、選択抗ｈＰＤ１抗体の存在下、９６ウエル平底プレート中、３７℃で培養した。ｉＤＣがＴ細胞を活性化すること、およびネガティブ（ｎｅｇａｔｉｖｅ）ＰＤ１経路が、Ｔ細胞表面上に発現した、リガンド結合ｈＰＤ１を介して活性化されない場合には、その活性化はより大きくなるであろうことが予測される。したがって、抗ＰＤ１抗体がｈＰＤ１とそのリガンドとの相互作用を抑制する場合には、抗ｈＰＤ１抗体はＴ細胞活性化を高め得ることが予測される。
【0360】
５日後に、培養上清を収集した。ＩＦＮガンマＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＩＦＮγレベルを測定した。ＣＬＩＣＫ－ＩＴ（登録商標）Ｐｌｕｓ ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａｓｓａｙキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、この会社は現在、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部である）を用いて、製造業者の説明書に従って、Ｔ細胞増殖を測定した。手短に説明すると、１５μＭの最終濃度のＥｄＵを、５日目、採取の２４時間前に加えた。Ｔ細胞サブセットの増殖は、ＣＤ４＋またはＣＤ４－（主にＣＤ８＋）Ｔ細胞サブセット中のＥｄＵ＋細胞のパーセンテージとして示される。ＣＤ４＋およびＣＤ４－細胞を標識した抗ＣＤ４抗体で識別した。
【0361】
図１５に示すように、選択抗ｈＰＤ１抗体は、ＩＦＮγ産生およびＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を促進した。これらの抗体のＥＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて計算し、下表１７に示す。示した結果は、３つのＨＬＡ不適合ドナー対由来のＭＬＲ分析結果を代表するものである。対照ＩｇＧは、無添加で観察されたものに比べて、ＩＦＮγ産生を高めなかった（図１５参照）。
【表17】
【0362】
実施例９：抗ｈＰＤ１抗体のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リコール応答のアッセイ
選択抗ｈＰＤ１抗体の抗原特異的Ｔ細胞記憶応答に対する効果を試験するために、ＣＭＶ血清陽性ドナー由来の１ｘ１０５個のＰＢＭＣ（Ｂｅｎｔｅｃｈ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を９６ウエル丸底マイクロタイタープレートの完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中の種々の抗体濃度の存在下、３７℃で１．５μｇ／ｍｌのＣＭＶライセート（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を用いて刺激した。５日後に、培養上清を収集し、ＩＦＮγレベルを測定した。ＥＣ５０値を上述のように計算した。
選択抗ｈＰＤ１抗体の抗原特異的Ｔ細胞記憶応答に対する効果を試験するために、ＣＭＶ血清陽性ドナー由来の１ｘ１０５個のＰＢＭＣ（Ｂｅｎｔｅｃｈ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を９６ウエル丸底マイクロタイタープレートの完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中の種々の抗体濃度の存在下、３７℃で１．５μｇ／ｍｌのＣＭＶライセート（Ａｓｔａｒｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）を用いて刺激した。５日後に、培養上清を収集し、ＩＦＮγレベルを測定した。ＥＣ５０値を上述のように計算した。
【0363】
結果を図１６および下表１８に示す。抗ｈＰＤ１抗体は、ＣＭＶライセートに応答して、ＰＭＢＣによる抗原特異的ＩＦＮγ産生を高めた。結果は、異なるＣＭＶ血清陽性ドナーを用いた２つの実験を代表するものである。対照ＩｇＧ抗体は、同一濃度で、抗ｈＰＤ１抗体ほどは、ＣＭＶライセートに対する応答によるＩＦＮγの産生を高めなかった。すなわち、対照ＩｇＧのＥＣ５０は１０，０００ｐＭ超であった。データは示していない。
【表18】
【0364】
実施例１０：抗ｈＰＤ１抗体の結合特性
５つの異なる抗ｈＰＤ１抗体（＃１、＃３、＃４、＃７および＃１０）の組換えヒト（ｒｈｕ）ＰＤ１（細胞外ドメインのみ）に対する結合の、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を下記のように測定した。これらの抗ｈＰＤ１抗体（＃１および＃７）の内の２つの、組換えカニクイザル（ｒｃｙｎｏ）ＰＤ１の細胞外ドメインに対する結合について、同じ値を測定した。
５つの異なる抗ｈＰＤ１抗体（＃１、＃３、＃４、＃７および＃１０）の組換えヒト（ｒｈｕ）ＰＤ１（細胞外ドメインのみ）に対する結合の、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）を下記のように測定した。これらの抗ｈＰＤ１抗体（＃１および＃７）の内の２つの、組換えカニクイザル（ｒｃｙｎｏ）ＰＤ１の細胞外ドメインに対する結合について、同じ値を測定した。
【0365】
ＨＢＳ－ＥＰ緩衝液（１０ｍＭヘペス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のポリソルベート２０、０．１％のウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中で、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ ３０００光学バイオセンサーを用いて、製造業者の一般プロトコルに従って、バイオセンサー分析を２５℃で実施した。オートサンプラーを周囲温度で維持した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；１０９－００５－０９８）を標準的アミンカップリング化学を使ってセンサーチップのフローセル３および４に固定した。この抗体の約８０００共鳴単位（ＲＵ）をこれらのチップに固定した。フローセル４を使って、捕捉抗ｈＰＤ１抗体を分析し（フローセル４で約１００～２００ＲＵを捕捉した）、一方、フローセル３を基準フローセルとして使用した。両方の分析物、すなわち、組換えヒトＰＤ１および組換えカニクイザルＰＤ１を、各試験抗体に対し、５種の濃度で調製した。試験した分析物濃度は、１．２～３００ｎＭの範囲であった。全ての分析物の希釈物をＨＰＳ－ＥＰ緩衝液中で調製した。結合の再現性の評価手段および注入の順番に対する系統的バイアスの軽減手段として、それぞれ５種の分析物試料濃度を二通りに、および混合順に実験した。複数のブランク（ランニングバッファー）注入も実験し、システムアーチファクトを評価し、これを差し引くのに使用した。全ての分析物濃度に対する結合領域および解離領域を、５０μＬ／分の流速で、それぞれ、３００秒および１５００秒間モニターした。抗体試料間で、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を用い、５０μＬ／分の流速で３０秒間、フローセルの表面を再生した。
【0366】
データを整列させ、二重基準とし、ＳＣＲＵＢＢＥＲ ２（商標）ソフトウェア（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｐｔｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてカーブフィッティングを行った。ＳＣＲＵＢＢＥＲ ２（商標）ソフトウェアは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）データ処理および非線形最小２乗回帰フィッティングプログラムである。解離速度定数（ｋｄ）は、最初の１５００秒の解離領域データから決定した。その後、一次結合モデルを用いて結合速度定数（ｋａ）および表面の分析物結合能力（Ｒｍａｘ）を決定するために、解離速度定数を結合領域データのグローバルフィットにおける固定パラメーターとして適用した。
【0367】
結果を下表１９に示す。試験した抗体の中で、抗ｈＰＤ１抗体＃７は、ヒトおよびカニクイザル両方のＰＤ１に結合するための最小のＫＤを有する。
【表19】
【0368】
実施例１１：単一宿主細胞株中における１対の抗体の産生のための抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４の設計
次の実験の目的は、２つの主要な抗体種、抗ｈＰＤ１抗体と抗ｈＣＴＬＡ４抗体のみを発現する宿主細胞株を得ることであった。非同族ＨＣ／ＬＣ対形成および／またはＨＣ／ＨＣヘテロダイマーの形成は、おそらく、２つの異なるＨＣおよび２つの異なるＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞で、１０種もの異なる抗体種の産生に繋がるであろう。我々は、抗ｈＰＤ１抗体由来のＨＣおよび抗ｈＣＴＬＡ４抗体由来のＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞（逆もまた同じ）、すなわち、非同族ＨＣ／ＬＣ対は、ＩｇＧ抗体を産生できる、プロミスキャスＨＣ／ＬＣが生じることを示すことを観察した。データは示していない。
次の実験の目的は、２つの主要な抗体種、抗ｈＰＤ１抗体と抗ｈＣＴＬＡ４抗体のみを発現する宿主細胞株を得ることであった。非同族ＨＣ／ＬＣ対形成および／またはＨＣ／ＨＣヘテロダイマーの形成は、おそらく、２つの異なるＨＣおよび２つの異なるＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞で、１０種もの異なる抗体種の産生に繋がるであろう。我々は、抗ｈＰＤ１抗体由来のＨＣおよび抗ｈＣＴＬＡ４抗体由来のＬＣをコードするＤＮＡを遺伝子導入した細胞（逆もまた同じ）、すなわち、非同族ＨＣ／ＬＣ対は、ＩｇＧ抗体を産生できる、プロミスキャスＨＣ／ＬＣが生じることを示すことを観察した。データは示していない。
【0369】
次の実験では、抗体は、同族ＨＣ／ＬＣ対を強化し、非同族ＨＣ／ＬＣ対を弱め、さらにＨＣ／ＨＣヘテロダイマーを弱めるように改変された。米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号の実施例３（参照により本明細書に組み込まれる）には、改変タイプの抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４抗体が記載されている。変種対１８Ｃは、改変ＩｇＧ４抗ＰＤ１抗体（ＨＣ１およびＬＣ１を含む）および改変ＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４抗体（ＨＣ２およびＬＣ２を含む）を含む。これらのＨＣおよびＬＣは、次の変化を含む：ＨＣ１、Ｇ４４Ｄ、Ｑ１０５Ｒ、Ｋ１４７Ｒ、Ｈ１６８Ｒ、およびＶ１７３Ｃ；ＬＣ１、Ｖ４３Ｄ、Ｇ１００Ｒ、Ｓ１３１Ｄ、Ｓ１７４Ｄ、およびＳ１６２Ｃ；ＨＣ２、Ｇ４４Ｒ、Ｑ１０５Ｄ、Ｖ１７３Ｃ、Ｋ１４７Ｄ、Ｈ１６８Ｄ、Ｄ３９９Ｒ、およびＫ４０９Ｅ；およびＬＣ２、Ａ４３Ｒ、Ｐ１００Ｄ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１３１Ｒ、およびＳ１７４Ｒ。米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号の表１８（参照により本明細書に組み込まれる）。これらの変化は、ＨＣ１／ＬＣ１中の次の電荷対を生成する：Ｇ４４Ｄ／Ｇ１００Ｒ、Ｑ１０５Ｒ／Ｖ４３Ｄ、Ｋ１４７Ｒ／Ｓ１３１Ｄ、およびＨ１６８Ｒ／Ｓ１７４Ｄ。次の類似の一連の電荷対がＨＣ２／ＬＣ２中で生成される：Ｇ４４Ｒ／Ｐ１００Ｄ、Ｑ１０５Ｄ／Ａ４３Ｒ、Ｋ１４７Ｄ／Ｓ１３１Ｒ、およびＨ１６８Ｄ／Ｓ１７４Ｒ。これらの変化はまた、非同族ＨＣ／ＬＣ対を弱める可能性がある。理由は、それらは、非同族ＨＣ／ＬＣ対、例えば、Ｇ４４Ｄ（ＨＣ１）／Ｐ１００Ｄ（ＬＣ２）中で、同じ電荷を有する接触残基を生成するためである。接触システイン対残基もまた、ＨＣ１／ＬＣ１（Ｖ１７３Ｃ／Ｓ１６２Ｃ）およびＨＣ２／ＬＣ２（Ｖ１７３Ｃ／Ｑ１６０Ｃ）中に生成された。さらに、抗ＣＴＬＡ４ ＨＣ中の変化Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅは、ＨＣ／ＨＣヘテロダイマー、すなわち、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣと対形成した抗ｈＰＤ１抗体のＨＣの形成に敵さない。理由は、それは、ヘテロダイマー中に同じ電荷を有する接触残基、例えば、Ｄ３９９Ｒ（ＨＣ２）／４０９Ｒ（ＨＣ１）を生成するためである。抗体の１８Ｃ変種対中の変化は、抗ｈＰＤ１抗体＃１のＨＣおよびＬＣ（それぞれ、配列番号１８５および１８７；本明細書では、改変抗ｈＰＤ１抗体＃１と呼ばれる）および２つの異なる抗ｈＣＴＬＡ４抗体、１０Ｄ４（それぞれ、配列番号１８９および１９１；本明細書では、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４と呼ばれる）、および１１Ｆ４（それぞれ、配列番号１９３および１９５；本明細書では、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４と呼ばれる）のＨＣおよびＬＣ中に組み込まれた。さらに、２つの改変抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、それらのＨＣ中に追加の変化Ｒ２５５Ｋを含み、これは、抗体のインビボクリアランスを高める。
【0370】
位置のナンバリングについてのいくつかの起こり得る混乱を明確にするために、出願者らは、本明細書に添付した配列表中に開示のいくつかの配列における、上記選択変化の実際の位置を以下に示す。例えば、変化Ｇ４４Ｄ、Ｑ１０５Ｒ、Ｋ１４７Ｒ、Ｈ１６８Ｒ、およびＶ１７３Ｃは、それぞれ、配列番号１８５中の位置４４、１１１、１４９、１７０、および１７５である。同様に、変化Ｖ４３Ｄ、Ｇ１００Ｒ、Ｓ１３１Ｄ、Ｓ１６２Ｃ、およびＳ１７４Ｄは、それぞれ、配列番号１８７中の位置４９、１０６、１３７、１６８、および１８０である。
【0371】
これらの改変抗体をコードするＤＮＡは、米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号の実施例３で説明されている「チェインドロップアウト」実験で試験された。この特許仮出願は、参照により本明細書に組み込まれる。手短に説明すると、改変抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４抗体のそれぞれの対、すなわち、（１）改変抗ｈＰＤ１＃１／改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４および（２）改変抗ｈＰＤ１＃１／改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４、に対する一連の５種の遺伝子導入において、５つの異なるＤＮＡの組み合わせを使用した。各対の抗体に対し、次のＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡを、５種の別々の遺伝子導入：１）ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、およびＬＣ２；２）ＨＣ１およびＬＣ１；３）ＨＣ１およびＬＣ２；４）ＨＣ２およびＬＣ２；ならびに５）ＨＣ２およびＬＣ１、によりＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に遺伝子導入した。形質移入体を培養し、培養上清を採取して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで分析した。抗体をＨＲＰ標識ポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）を用いて検出した。
【0372】
図１７からわかるように、ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、およびＬＣ２をコードするＤＮＡをＥＸＰＩ２９３（商標）細胞に同時遺伝子導入した場合、上清中で約１５０キロダルトン（Ｋｄａ）のＩｇＧ抗体が検出された（図１７、レーン１および６）。ＨＣ１およびＬＣ１またはＨＣ２およびＬＣ２をコードするＤＮＡを同時遺伝子導入した場合、約１５０Ｋｄａ完全長抗体も検出され（図１７、レーン２、４、７、および９）、同族ＨＣ／ＬＣ対を形成し得ることを示す。しかし、非同族ＨＣ１／ＬＣ２対およびＨＣ２／ＬＣ１対をコードするＤＮＡを同時遺伝子導入した場合、抗体は検出されず（図１７、レーン３、５、８、および１０）、非同族ＨＣ／ＬＣ対は、簡単には形成されないことを示唆する。したがって、これらのデータは、これらの抗体中の変化が、変化の非存在下で観察される非同族ＨＣ／ＬＣ対形成を低減または排除したことを示唆する。
【0373】
これらの結果を確認するために、質量分析を実施した。分析用の十分な材料を得るために、改変抗体、すなわち、改変抗ｈＰＤ１＃１／改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４および改変抗ｈＰＤ１＃１／改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４のＨＣおよびＬＣ（ＨＣ１、ＬＣ１、ＨＣ２、およびＬＣ２）の各対をコードするＤＮＡを用いて、細胞に大規模に遺伝子導入した。培養上清中の抗体をプロテインＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。これらの抗体を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ６２２４精密質量飛行時間（ＴＯＦ）質量分析計による質量分析に供した。
【0374】
図１８のパネルＡおよびＢは、改変抗ｈＰＤ１＃１／改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４対の結果を示す。パネルＡは、広範囲のサイズにわたる結果を示し、パネルＢは完全長ＩｇＧ抗体のサイズ範囲、すなわち、１５０Ｋｄａのすぐ下の領域を拡大したものである。パネルＡは、完全長ＩｇＧ抗体のサイズ範囲内に２つの主ピークおよび約７５ＫｄａにおそらくＨＣおよびＬＣを含むハーフ抗体と思われる微小ピークを示す。パネルＢは、１４５，４７３．１６ダルトンに主要ピークを示し、これは、完全長改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４の予測質量（１４５４７７．８０ダルトン）と１００万分の３２（３２ｐｐｍ）の誤差で一致する。１４７，０６５．８９ダルトンのより短いピークは、改変抗ｈＰＤ１＃１の予測質量（１４７０６８．８６ダルトン）と２０ｐｐｍの誤差で一致する。ピーク下面積の計算により、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４および改変抗ｈＰＤ１＃１抗体は、図１８、パネルＢに示すように、混合物中の抗体の質量の、それぞれ７２．８％および２７．２％を占める。
【0375】
図１９のパネルＡおよびＢは、改変抗ｈＰＤ１＃１／改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４対の結果を示す。パネルＡは、広範囲のサイズにわたる結果を示し、パネルＢは完全長ＩｇＧ抗体のサイズ範囲の領域を拡大したものである。パネルＡは、完全長ＩｇＧ抗体のサイズ範囲内に２つの主ピークおよび約７５Ｋｄａの微小ピークを示す。パネルＢは、１４５，４３０．５９ダルトンに主要ピークを示し、これは、完全長改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４の予測質量（１４５，４２７．６８ダルトン）と２０ｐｐｍの誤差で一致する。１４７，０７６．８８ダルトンのより短いピークは、改変抗ｈＰＤ１＃１の予測質量（１４７，０６８．８６ダルトン）と５４．５ｐｐｍの誤差で一致する。改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４および改変抗ｈＰＤ１＃１抗体は、図１９、パネルＢに示すように、混合物中の抗体の質量の、それぞれ７０．９％および２９．１％を占める。
【0376】
下表２０および２１は、同族または非同族ＨＣ／ＬＣ対形成および／またはＨＣのホモまたはヘテロダイマー形成に起因し得る全ての可能なＩｇＧ種の予測質量を示す。表２０および２１中の、ＨＣ１およびＬＣ１は、改変抗ｈＰＤ１＃１のＨＣおよびＬＣである。ＨＣ２およびＬＣ２は、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４（表２０）および１１Ｆ４（表２１）のＨＣおよびＬＣである。
【表20】
【表21】
【0377】
上記チェインドロップアウト実験からの結果と合わせて、質量分析データは、２つの主要な抗体種のみを含む混合物を単一宿主細胞株中で産生できることを強く示唆する。
【0378】
実施例１２：改変抗体の効力を評価するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ
次の実験は、改変（実施例１１で記載のように）および未改変型の抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４または１１Ｆ４ならびに改変および未改変型の抗ｈＰＤ１抗体＃１、単独または単一宿主細胞株により産生した（上記実施例１１で記載のように）改変抗ＰＤ１＃１および改変ＣＴＬＡ４抗体（１０Ｄ４または１１Ｆ４）を含む混合物の、効力を試験した。
次の実験は、改変（実施例１１で記載のように）および未改変型の抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４または１１Ｆ４ならびに改変および未改変型の抗ｈＰＤ１抗体＃１、単独または単一宿主細胞株により産生した（上記実施例１１で記載のように）改変抗ＰＤ１＃１および改変ＣＴＬＡ４抗体（１０Ｄ４または１１Ｆ４）を含む混合物の、効力を試験した。
【0379】
抗ｈＣＴＬＡ４効力に関するこのアッセイは、米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号の実施例８（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。手短に説明すると、ＣＴＬＡ４およびルシフェラーゼを安定に発現しているジャーカット細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手）をマイクロタイタープレートに播種した。１日間のインキュベーション後、ｈＣＤ８０（ｈＢ７－１とも呼ばれる）およびｈＣＤ８６（ｈＢ７－２とも呼ばれる）を発現するラージ細胞を、抗ｈＣＴＬＡ４抗体（改変または未改変１０Ｄ４または１１Ｆ４または対照抗体１０Ｄ１）または改変抗ｈＰＤ１＃１および改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４または改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４を含む混合物の１種と共に、各ウエルに添加した。抗体の混合物が使用される場合、抗ｈＣＴＬＡ４抗体の量は、混合物中の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のパーセンテージを基準にして決定した。実施例１１を参照されたい。ラージ細胞上に発現したｈＣＤ８０およびｈＣＤ８６は、ジャーカット細胞上のｈＣＴＬＡ４と結合でき、ルシフェラーゼの発現を抑制する細胞内のシグナル伝達経路を活性化する。抗ｈＣＴＬＡ４抗体がｈＣＴＬＡ４のｈＣＤ８０および／またはｈＣＤ８６との結合を妨げる場合、ルシフェラーゼ発現は増大する。異なるウエルが異なる濃度の抗体または抗体混合物を有するように、抗体または混合物の系列希釈を実施した。プレートを３７℃でインキュベートし、その後、ＢＩＯ－ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７９４１）を加えた。プレートを、ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。イピリムマブと同じＶＨおよびＶＬを有する、抗ｈＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ１をポジティブコントロールとして用いた。無関係のヒトＩｇＧ１抗体（ＨｕＩｇＧ１）をネガティブコントロールとして使用した。結果を図２０ならびに下表２２および２３に示す。
【表22】
【表23】
【0380】
これらの結果は、抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １０Ｄ４と改変抗ｈＰＤ１＃１との混合物のＩＣ５０は同等であり、また、抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４、改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４、および改変抗ｈＣＴＬＡ４ １１Ｆ４と改変抗ｈＰＤ１＃１との混合物のＩＣ５０も同じく同等であったことを示す。したがって、このアッセイでは、抗ＣＴＬＡ４抗体１０Ｄ４および１１Ｆ４中の変化は、それらの効力にほとんど影響を与えなかった。
【0381】
抗ｈＰＤ１の効力に関するアッセイは、米国特許仮出願第６２／３４２，１６７号の実施例７（参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。手短に説明すると、ｈＰＤ１およびルシフェラーゼを安定に発現しているジャーカット細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手）を９６ウエルプレートに播種した（２０μｌ中の４ｘ１０４細胞／ウエル）。１日のインキュベーション後、ｈＰＤＬ１を安定に発現しているＣＨＯ細胞（２０μｌ中の５ｘ１０４細胞／ウエル）を、種々の希釈度の試験抗体または抗体混合物（２０μｌ）と共に加えた。ＣＨＯ細胞上に発現したｈＰＤＬ１は、ジャーカット細胞上のｈＰＤ１と結合でき、ルシフェラーゼの発現を抑制する細胞内のシグナル伝達経路を活性化する。抗体がｈＰＤ１／ｈＰＤＬ１の結合を妨げる場合、ルシフェラーゼ発現は増大する。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で６時間インキュベートした。ＢＩＯ－ＧＬＯ（商標）ルシフェラーゼ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７９４１）を加え（４０μｌ／ウエル）、細胞を溶解し、プレートをＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）プレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で読み取った。ニボルバム（Ｎｉｖｏ－Ｇ４）と同じＶＨおよびＶＬを含む、ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体をポジティブコントロールとして用い、無関係のＩｇＧ４抗体をネガティブコントロールとして用いた。結果を図２１ならびに下表２４および２５に示す。
【表24】
【表25】
【0382】
これらの結果は、改変抗ｈＰＤ１抗体＃１中の変化は、その効力にほとんど影響を与えなかったことを示す。さらに、実施例１１に記載のように、単一細胞株中で産生された改変抗ｈＰＤ１＃１および改変抗ｈＣＴＬＡ １０Ｄ４または１１Ｆ４を含む混合物のＩＣ５０は、改変抗ＰＤ１＃１単独の値と同等であった。
【0383】
実施例１３：抗ｈＰＤ１もしくは抗ｈＣＴＬＡ４抗体またはそれらの混合物のＴ細胞活性化に与える効果
次の実験は、ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体、２つの内のいずれかのＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４抗体、または抗ｈＰＤ１抗体といずれかの抗ｈＣＴＬＡ４抗体との混合物の、Ｔ細胞活性化に与える効果を試験する。
次の実験は、ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体、２つの内のいずれかのＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４抗体、または抗ｈＰＤ１抗体といずれかの抗ｈＣＴＬＡ４抗体との混合物の、Ｔ細胞活性化に与える効果を試験する。
【0384】
健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣを９６ウエルＵ底マイクロタイタープレート中に、３ｘ１０５細胞／ウエルで分配した。抗体（または抗体を欠く対照溶液）を各ウエルに加えた。次の、６種の異なる抗体、それらの組み合わせ、または抗体を欠く対照溶液を使用した：１）２．５μｇ／ｍｌのＩｇＧ４抗ｈＰＤ１＃１抗体；２）１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４＃１０Ｄ４抗体；３）１０μｇ／ｍｌのＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４＃１１Ｆ４抗体；４）２．５μｇ／ｍｌの抗ｈＰＤ１＃１抗体および１０μｇ／ｍｌの抗ｈＣＴＬＡ４＃１０Ｄ４抗体の混合物；５）２．５μｇ／ｍｌの抗ｈＰＤ１＃１抗体および１０μｇ／ｍｌの抗ｈＣＴＬＡ４＃１１Ｆ４抗体の混合物；または６）抗体を欠く対照溶液。ブドウ状球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）を種々の濃度（０、０．６、６、６０、または６００ｎｇ／ｍｌ）で全ウエルに加えた。全ての状態を二通りに試験した。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で４日間インキュベートした。４日目に、細胞上清を収集して、アッセイし、ＥＬＩＳＡを用いてＩＬ－２のレベルを測定した。ＩＬ－２の絶対濃度を、既知の量のＩＬ－２を用いて生成した検量線と比較することにより決定した。
【0385】
抗体を加えなかった対照試料は、ＩＬ－２産生の増加を示さなかった。図２２、パネルＡおよびＢ、「Ｘ」のマークの実線。ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１＃１抗体の添加は、ＩＬ－２産生をわずかに高めた。図２２、パネルＡおよびＢ、中実円マークの実線。ＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４＃１０Ｄ４またはＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４＃１１Ｆ４抗体の添加は、ＩＬ－２産生を顕著に増加させた。図２２、パネルＡまたはＢ、それぞれ、中実四角または中実ダイアモンドマークの点線。抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４＃１０Ｄ４または１１Ｆ４抗体の混合物の添加は、いずれかのこれらの抗体単独の添加よりも、ＩＬ－２産生を多く増加させた。図２２、パネルＡおよびＢ、それぞれ、中空四角または中空ダイアモンドマークの実線。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】