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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-18
(45)【発行日】2024-03-27
(54)【発明の名称】抗体結合ＢＣＭＡ及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240319BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240319BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240319BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240319BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240319BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240319BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240319BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240319BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P35/00
A61P35/02
A61K39/395 L
A61K48/00
A61K31/7088
A61K38/16
A61K47/68
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022535936
(86)(22)【出願日】2020-12-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-03-08
(86)【国際出願番号】 CN2020141099
(87)【国際公開番号】W WO2021136308
(87)【国際公開日】2021-07-08
【審査請求日】2022-07-27
(31)【優先権主張番号】62/956,642
(32)【優先日】2020-01-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】522040148
【氏名又は名称】ビオシオン インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン、ミンジウ
(72)【発明者】
【氏名】タン、ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ジョン、キャシー シャオヤン
(72)【発明者】
【氏名】シア、シュカイ
【審査官】山内 達人
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５１２４６４（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０９４８５７３３（ＣＮ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／１９０９６９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０９０３２７（ＷＯ，Ａ２）
【文献】国際公開第２０１９／０６６４３５（ＷＯ，Ａ２）
【文献】岡山医学会雑誌，2009年，第121巻，pp. 119-122
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
Ｃ０７Ｋ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分であって、ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域であって、前記ＶＨ ＣＤＲ１領域、前記ＶＨ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＨ ＣＤＲ３領域が、配列番号１、２及び３のそれぞれのアミノ酸配列を含む、重鎖可変領域；及び
ｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域であって、前記ＶＬ ＣＤＲ１領域、前記ＶＬ ＣＤＲ２領域及び前記ＶＬ ＣＤＲ３領域が、配列番号４、５及び６のそれぞれのアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域
を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項2】
前記重鎖可変領域が、配列番号７、８、又は９に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列番号９における３７番目、７２番目および７４番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｍｅｔ（Ｍ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＬｙｓ（Ｋ）；またはＶａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＬｙｓ（Ｋ）である、
請求項１に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項3】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１０又は１１に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ｔｈｒ（Ｔ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｔｙｒ（Ｙ），およびＰｈｅ（Ｆ）；Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＬｅｕ（Ｌ）；Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｔｙｒ（Ｙ），およびＬｅｕ（Ｌ）；Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＬｅｕ（Ｌ）；またはＡｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＰｈｅ（Ｆ）である、
請求項１または２に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項4】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号７及び１０のそれぞれ；
（２）配列番号８及び１１のそれぞれであって、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ｔｈｒ（Ｔ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｔｙｒ（Ｙ），およびＰｈｅ（Ｆ）；Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＬｅｕ（Ｌ）；Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｔｙｒ（Ｙ），およびＬｅｕ（Ｌ）；またはＡｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＬｅｕ（Ｌ）である；
（３）配列番号９及び１１のそれぞれであって、前記配列番号９における３７番目、７２番目および７４番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｍｅｔ（Ｍ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＬｙｓ（Ｋ）；またはＶａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＬｙｓ（Ｋ）であり、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ｔｈｒ（Ｔ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｔｙｒ（Ｙ），およびＰｈｅ（Ｆ）である；
（４）配列番号９及び１１のそれぞれであって、前記配列番号９における３７番目、７２番目および７４番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｍｅｔ（Ｍ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＬｙｓ（Ｋ）；またはＶａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＬｙｓ（Ｋ）であり、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＬｅｕ（Ｌ）である；
（５）配列番号９及び１１のそれぞれであって、前記配列番号９における３７番目、７２番目および７４番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｍｅｔ（Ｍ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＬｙｓ（Ｋ）；またはＶａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＬｙｓ（Ｋ）であり、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｔｙｒ（Ｙ），およびＬｅｕ（Ｌ）である；
（６）配列番号９及び１１のそれぞれであって、前記配列番号９における３７番目、７２番目および７４番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｍｅｔ（Ｍ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＴｈｒ（Ｔ）； Ｖａｌ（Ｖ），Ａｒｇ（Ｒ），およびＬｙｓ（Ｋ）；またはＶａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＬｙｓ（Ｋ）であり、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ（Ａ），Ｖａｌ（Ｖ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＬｅｕ（Ｌ）である；又は
（７）配列番号９及び１１のそれぞれであって、前記配列番号９における３７番目、７２番目および７４番目のアミノ酸残基は、Ｖａｌ（Ｖ），Ｓｅｒ（Ｓ），およびＴｈｒ（Ｔ）であり、前記配列番号１１における４３番目、４４番目、７１番目および７３番目のアミノ酸残基は、Ａｌａ（Ａ），Ｐｒｏ（Ｐ），Ｐｈｅ（Ｆ），およびＰｈｅ（Ｆ）である；のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項5】
前記重鎖可変領域に連結された、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域、及び前記軽鎖可変領域に連結された配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項6】
マウス、キメラ又はヒト化抗体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項7】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を含む免疫抱合体。
【請求項9】
前記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は細胞毒と結合する、請求項８に記載の免疫抱合体。
【請求項10】
前記細胞毒は、配列番号２３のアミノ酸配列を含む組み換えタンパク質である、請求項９に記載の免疫抱合体。
【請求項11】
請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子。
【請求項12】
請求項１１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項13】
ｉ）請求項１～７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分、請求項８から１０のいずれか一項に記載の免疫抱合体、請求項１１に記載の核酸分子、及び／又は請求項１２に記載の発現ベクターと、ｉｉ）薬学的に許容される担体と
を含む医薬組成物。
【請求項14】
対象における増加したＢＣＭＡ発現に関連する腫瘍を治療するのに使用するための請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記腫瘍が、白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫である、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願及び援用
本出願は、２０２０年１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９５６，６４２号に対する優先権を主張するものである。
本出願は、２０２０年１月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９５６，６４２号に対する優先権を主張するものである。
【0002】
上記の出願、及びその中に又はその審査手続中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）及び本明細書に引用又は参照される全ての文献（本明細書に引用される全ての文献、特許、公開特許出願を含むがこれらに限定されない）（「本明細書に引用される文献」）、及び本明細書に引用される文献に引用又は参照される全ての文献は、本明細書又は参照により本明細書に援用されるあらゆる文献に記載される、あらゆる製品についてのあらゆる製造業者の説明書、記載、製品仕様書、及び製品シートと一緒に、参照により本明細書に援用され、本発明の実施に用いられ得る。より詳細には、全ての参照される文献は、各個々の文献が、具体的に及び個別に、参照により援用されることが示されるのと同程度に、参照により援用される。本開示に記載されるあらゆるＧｅｎｂａｎｋ配列は、本開示の最先の有効出願日のものであるＧｅｎｂａｎｋ配列とともに、参照により援用される。
【0003】
本開示は、一般に、高い親和性及び機能性でヒトＢＣＭＡに特異的に結合する、単離モノクローナル抗体、特に、マウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。抗体又は抗原結合部分をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞及び抗体又は抗原結合部分を発現するための方法も提供される。本開示はさらに、免疫抱合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、及び抗体又はその抗原結合部分を含む腫瘍溶解性ウイルス、並びに本開示の抗体又はその抗原結合部分を用いた診断又は治療方法を提供する。
【背景技術】
【0004】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳ１７）とも呼ばれるＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、システインリッチ細胞外ドメインを有する膜貫通タンパク質である（Ｍａｄｒｙ Ｃ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（１１）：１６９３－７０２；Ｌａａｂｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（７）：１１４７－５４；Ｌａａｂｉ Ｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ １１（１１）：３８９７－９０４）。それは、２つのＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーＢＡＦＦ－Ｒ及びＴＡＣＩとともに、液性免疫、Ｂ細胞発生及び恒常性、特に、Ｂ細胞増殖、生存、成熟及び形質細胞（ＰＣ）への分化を調節する（Ｍａｃｋａｙ Ｆ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：２３１－６４；Ｍａｒｓｔｅｒｓ ＳＡ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １０（１３）：７８５－８；Ｇｒｏｓｓ ＪＡ ｅｔ ａｌ．，（２０００），Ｎａｔｕｒｅ ４０４（６７８１）：９９５－９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＪＳ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２（１）：１２９－３５）。ＢＣＭＡはまた、長期生存型ＰＣ生存のために重要である。
【0005】
ＢＣＭＡは、形質芽球及び分化されたＰＣの表面のみにおいて、正常ＰＣより悪性ＰＣにおいてより高度に発現され（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＲＯ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９（８）：２０４８－６０；Ｏ'Ｃｏｎｎｏｒ ＢＰ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９９（１）：９１－８；Ｂｅｎｓｏｎ ＭＪ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８０（６）：３６５５－９；Ｙａｎｇ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７５（５）：２８１４－２４；Ａｖｅｒｙ ＤＴ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １１２（２）：２８６－９７；Ｎｏｖａｋ ＡＪ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３（２）：６８９－９４；Ｃｈｉｕ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｌｏｏｄ １０９（２）：７２９－３９；Ｌｅｅ Ｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｂｌｏｏｄ １３１（７）：７４６－５８；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＲＯ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）上記参照；Ｔａｉ ＹＴ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｌｏｏｄ １２３（２０）：３１２８－３８；Ｃｌａｕｄｉｏ ＪＯ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｂｌｏｏｄ １００（６）：２１７５－８６；Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ Ａ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３１（３）：３９６－４１０）、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫に関与することが報告されている。例えば、増加した血漿中ＢＣＭＡレベルが、慢性リンパ球性白血病の患者において観察され、臨床状態と相関していた（Ｋｙｌｅ Ａ Ｕｄｄ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｂｌｏｏｄ．１２６（２３）：２９３１）。ＢＣＭＡはまた、多発性骨髄腫腫瘍細胞において高度に発現されることが分かっており、これらの細胞内でのＢＣＭＡ過剰発現又はＢＣＭＡへのＡＰＲＩＬ結合は、インビボで細胞増殖及び生存を著しく促進する（Ｔａｉ ＹＴ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｂｌｏｏｄ １２７（２５）：３２２５－３６；Ｍａｔｔｈｅｓ Ｔ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｂｌｏｏｄ １１８（７）：１８３８－４４）。さらに、ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩへの結合を介して、ＮＦκＢ経路をさらに活性化し、抗アポトーシスタンパク質（Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ｘＬ）を上方制御して、デキサメタゾン－及び血清枯渇による細胞死から多発性骨髄腫腫瘍細胞を保護する（Ｍｏｒｅａｕｘ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｌｏｏｄ １０３（８）：３１４８－５７；Ｎｅｒｉ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １３（１９）：５９０３－９；Ｓｈｅｎ Ｘ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｆｕｎｃｔ ３４（２）：１０４－１０）。
【0006】
二番目に多い造血器悪性腫瘍として、多発性骨髄腫は、デノボ、又は意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）からの増悪としての、血液循環に拡散する前に骨髄内の複数の部位で発生するクローン性Ｂ細胞悪性腫瘍である。それは、パラプロテイン及び破骨細胞活性の増加、並びに高カルシウム血症、血球減少症、腎機能障害、過粘稠及び末梢神経障害によって一般的に特徴付けられる。正常な抗体レベル及び好中球数の減少も一般的であり、生命を脅かす感染感受性をもたらす。ＣＤ３８及びＳＬＡＭＦ７を標的とする２つのモノクローナル抗体が、再発性及び難治性多発性骨髄腫の治療のために２０１５年後半に承認されたが、正常組織における２つの抗原の広い発現により、それらの長期の臨床用途が制限された。対照的に、ＢＣＭＡは、その限られた発現パターン及び独自の膜貫通構造のため、潜在的な治療標的として浮上した。最初の治療用抗ＢＣＭＡ抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、ＧＳＫ２８５７９１６は、２つのマウスモデルにおいて多発性骨髄腫細胞を急速に除去し、マウス生存期間を有意に延長する（Ｔａｉ ＹＴ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）上記参照）。別の抗ＢＣＭＡ ＡＤＣ、ＨＤＰ－１０１は、ピコモル範囲で多発性骨髄腫細胞に対するインビトロ細胞毒性を示し、良好な忍容性で有意な腫瘍退縮をもたらした。いくつかの抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法も、印象的な臨床転帰を示した（Ｓｈｉｈ－Ｆｅｎｇ Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９：１８２１）。
【0007】
より効力が高く及び安全な、抗体を含むさらなるＢＣＭＡ結合部分を発見するために継続的な取り組みがなされている。
【0008】
本出願におけるいずれの文献の引用又は特定も、このような文献が本開示に対する先行技術として利用可能であることを認めるものではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
本開示は、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合し、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、より高くないとしても同等の、ＢＣＭＡに対する結合親和性及びＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合に対するブロッキング活性を有する、単離モノクローナル抗体、例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。本開示の抗ＢＣＭＡ抗体はまた、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、特定の濃度、例えば、低い濃度で、より高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する。
【0010】
本開示の抗体又は抗原結合部分は、ＢＣＭＡタンパク質の検出、並びに癌及び感染症などのＢＣＭＡ関連疾患の治療及び予防を含む様々な用途に使用され得る。
【0011】
したがって、一態様において、本開示は、ＢＣＭＡに結合し、ｉ）ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２ 領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域を含み得る重鎖可変領域であって、ＶＨ ＣＤＲ１領域、ＶＨ ＣＤＲ２領域及びＶＨ ＣＤＲ３領域が、配列番号１、２及び３のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、重鎖可変領域；及び／又はＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域及びＶＬ ＣＤＲ３領域を含み得る軽鎖可変領域であって、ＶＬ ＣＤＲ１領域、ＶＬ ＣＤＲ２領域、及びＶＬ ＣＤＲ３領域が、配列番号４、５及び６のそれぞれに対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る、軽鎖可変領域を有する、単離モノクローナル抗体（例えば、マウス、キメラ又はヒト化抗体）、又はその抗原結合部分に関する。
【0012】
重鎖可変領域は、配列番号７、８、又は９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｋ；又はＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｋ）に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。配列番号７に記載されるアミノ酸配列は、配列番号１７又は２４のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ）に記載されるアミノ酸配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0013】
軽鎖可変領域は、配列番号１０又は１１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｙ、Ｘ４＝Ｆ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｌ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ、Ｘ４＝Ｌ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｌ；又はＸ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｆ）に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。配列番号１０に記載されるアミノ酸配列は、配列番号１９又は２５のヌクレオチド配列によってコードされ得る。配列番号１１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｆ）に記載されるアミノ酸配列は、配列番号２０のヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0014】
本開示の単離モノクローナル抗体又は抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み得、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、（１）配列番号７及び１０のそれぞれ；（２）配列番号８及び１１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｙ、Ｘ４＝Ｆ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｌ；Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ、Ｘ４＝Ｌ；又はＸ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｌ）のそれぞれ；（３）配列番号９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｋ；又はＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｋ）及び１１（Ｘ１＝Ｔ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｙ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれ；（４）配列番号９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｋ；又はＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｋ）及び１１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｌ）のそれぞれ；（５）配列番号９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｋ；又はＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｋ）及び１１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｙ、Ｘ４＝Ｌ）のそれぞれ；（６）配列番号９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｍ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ；Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｒ、Ｘ３＝Ｋ；又はＸ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｋ）及び１１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｖ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｌ）のそれぞれ；（７）配列番号９（Ｘ１＝Ｖ、Ｘ２＝Ｓ、Ｘ３＝Ｔ）及び１１（Ｘ１＝Ａ、Ｘ２＝Ｐ、Ｘ３＝Ｆ、Ｘ４＝Ｆ）のそれぞれに記載されるアミノ酸配列を含み得る。
【0015】
本開示の単離モノクローナル抗体又は抗原結合部分は、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含む重鎖と、軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含む軽鎖とを含み得、ここで、重鎖可変領域のＣ末端は、重鎖定常領域のＮ末端に連結され、軽鎖可変領域のＣ末端は、軽鎖定常領域のＮ末端に連結され、ここで、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、上記のアミノ酸配列を含む。重鎖定常領域は、例えば、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを有するヒトＩｇＧ１定常領域であり得、軽鎖定常領域は、例えば、配列番号１３に記載されるアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを有するヒトκ定常領域であり得る。配列番号１２及び１３に記載されるアミノ酸配列は、配列番号２１及び２２のそれぞれのヌクレオチド配列によってコードされ得る。
【0016】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むか又はそれからなり得、ここで、各重鎖は、上述される重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み、各軽鎖は、上述される軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含む。本開示の抗体は、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４アイソタイプの完全長抗体であり得る。他の実施形態における本開示の抗体は、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）抗体、又はＦａｂ若しくはＦａｂ'２フラグメントなどの抗体フラグメントであり得る。
【0017】
本開示の抗体又は抗原結合部分は、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体より、高くないとしても同等の、ヒトＢＣＭＡに対する結合親和性／能力及びＢＣＭＡ－ＢＡＦＦブロッキング活性を有する。本開示の抗体又は抗原結合部分はまた、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、特定の濃度、例えば、低い濃度で、より高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する。
【0018】
本開示はまた、細胞毒素、例えば、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＧ（３Ｃ）の受容体結合ドメイン及びＣ１、Ｃ２、及びＣ３ドメインを欠くジフテリア毒素（ＤＴ）を含む組換えタンパク質ＤＴ３Ｃなどの治療剤に連結された、本開示の抗体又は抗原結合部分を含む、抗体－薬物コンジュゲートなどの免疫抱合体を提供する。ＤＴ３Ｃなどの細胞毒素とコンジュゲートされるとき、本開示の抗体又は抗原結合部分は、細胞によってより迅速に内在化され、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体より高い標的細胞殺滅活性を示す。本開示はまた、抗体又は抗原結合部分と異なる結合特異性を有する第２の機能的部分（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍｏｉｅｔｙ）（例えば、第２の抗体）に連結された、本開示の抗体又は抗原結合部分を含む二重特異性分子を提供する。別の態様において、本開示の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部であり得る。Ｔ細胞などの、抗原キメラ受容体を含む免疫細胞も提供される。本開示の抗体又はその抗原結合部分はまた、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされるか又は腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。
【0019】
本開示の抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、又はＣＡＲをコードする核酸分子、並びにこのような核酸分子を含む発現ベクター及びこのような発現ベクターを含む宿主細胞も、本開示によって包含される。宿主細胞を用いて、本開示の抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、又はＣＡＲを調製するための方法であって、（ｉ）宿主細胞において抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、又はＣＡＲを発現する工程及び（ｉｉ）宿主細胞又はその細胞培養物から抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、又はＣＡＲを単離する工程を含む方法も提供される。
【0020】
本開示の抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、ＣＡＲ、免疫細胞、腫瘍溶解性ウイルス、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
【0021】
さらに別の態様において、本開示は、増加したＢＣＭＡ発現に関連する腫瘍を治療するための方法であって、治療有効量の、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。腫瘍は、白血病、リンパ腫又は多発性骨髄腫であり得る。ある実施形態において、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ－３抗体、抗ＳＴＡＴ３抗体、及び／又は抗ＲＯＲ１抗体などの少なくとも１つのさらなる抗癌抗体が、本開示の医薬組成物とともに投与され得る。さらに別の実施形態において、対象は、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－２１、ＧＭ－ＣＳＦ及び／又はＩＬ－４）、又は刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）をさらに投与される。本開示の抗体又は抗原結合部分は、例えば、マウス、ヒト、キメラ又はヒト化抗体又は抗原結合部分であり得る。
【0022】
本開示の他の特徴及び利点は、限定であると解釈されるべきではない以下の詳細な説明及び実施例から明らかになるであろう。本出願を通して引用される全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリ、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【0023】
したがって、本発明の目的は、任意の既に公知の製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法を本発明に包含することではなく、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に公知の製品、プロセス、又は方法の放棄を本明細書に開示する。本発明は、ＵＳＰＴＯの書面による記載及び実施可能要件（米国特許法第１１２条、第１段落）又はＥＰＯ（欧州特許条約（ＥＰＣ）８３条）を満たさない任意の製品、プロセス、又はその製品の作製方法又はその製品の使用方法を本発明の範囲内に包含することを意図しないことがさらに留意され、したがって、本出願人は、その権利を留保し、任意の既に記載された製品、その製品の作製方法、又はその製品の使用方法の放棄を本明細書に開示する。本発明の実施において、５３条（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣに準拠していることが有利であり得る。本出願の系統又は任意の他の系統又は任意の第三者の任意の先行出願における出願人の任意の登録特許の主題である任意の実施形態を明確に放棄する全ての権利が、明確に留保される。本明細書に記載されるいずれも、保証として解釈されるべきではない。
【0024】
本開示、特に、特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し得；例えば、それらは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味し得ること；及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語が、米国特許法による意味を有し、例えば、それらは、明示されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるか又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素を除外することが留意される。
【0025】
例として示されるが、本発明を記載される特定の実施形態のみに限定することは意図されていない、以下の詳細な説明が、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＢＣＭＡに対するマウス抗体Ｂ１Ｈ２の結合能力を示す。
【図2】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＢＣＭＡを発現するＵ２６６細胞に対するマウスＢ１Ｈ２抗体の結合能力を示す。
【図3】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合に対するマウス抗体Ｂ１Ｈ２のブロッキング能力を示す。
【図4】競合ＥＬＩＳＡ試験における、ベンチマーク－ヒトＢＣＭＡ結合に対するマウス抗体Ｂ１Ｈ２のブロッキング能力を示す。
【図5】捕捉ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＢＣＭＡに対するキメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体の結合能力を示す。
【図6】間接ＥＬＩＳＡにおける、カニクイザルＢＣＭＡに対するキメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体の結合能力を示す。
【図7】細胞ベースの結合ＦＡＣＳアッセイにおける、ヒトＢＣＭＡを発現する２９３Ｆ細胞に対するキメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体の結合能力を示す。
【図8】競合ＥＬＩＳＡにおける、ヒトＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合に対するキメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体のブロッキング能力を示す。
【図9】競合ＥＬＩＳＡ試験における、ベンチマーク－ヒトＢＣＭＡ結合に対するキメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体のブロッキング能力を示す。
【図10A】インビトロでＵ２６６細胞に対する抗体依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導するキメラ及びヒト化抗体ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１０の能力を示す。
【図10B】インビトロでＵ２６６細胞に対する抗体依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導するキメラ及びｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３の能力を示す。
【図11】Ｕ２６６細胞におけるヒト化抗体－ＤＴ３Ｃコンジュゲートの内在化媒介性細胞毒性を示す。
【図12A】ヒト化抗体ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１０のプロテインサーマルシフトアッセイ結果を示す。
【図12B】ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３（Ｂ）のプロテインサーマルシフトアッセイ結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本開示がより容易に理解され得ることを確実にするために、いくつかの用語がまず定義される。さらなる定義は、詳細な説明を通して記載される。
【0028】
「ＢＣＭＡ」という用語は、Ｂ細胞成熟抗原、又は腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７を指す。「ＢＣＭＡ」という用語は、変異体、アイソフォーム、ホモログ、オルソログ及びパラログを含む。例えば、ヒトＢＣＭＡタンパク質に特異的な抗体は、ある場合において、サルなどの、ヒト以外の種に由来するＢＣＭＡタンパク質と交差反応し得る。他の実施形態において、ヒトＢＣＭＡタンパク質に特異的な抗体は、ヒトＢＣＭＡタンパク質に完全に特異的であり得、他の種に対する又は他のタイプの交差反応性を示さないことがあり、又は全ての他の種ではなく特定の他の種に由来するＢＣＭＡと交差反応し得る。
【0029】
「ヒトＢＣＭＡ」という用語は、ＮＰ＿００１１８３．２のＧｅｎｂａｎｋ受託番号を有するヒトＢＣＭＡのアミノ酸配列などの、ヒトに由来するアミノ酸配列を有するＢＣＭＡタンパク質を指す。「サル又はアカゲザルＢＣＭＡ」及び「マウスＢＣＭＡ」という用語はそれぞれ、サル及びマウスＢＣＭＡ配列を指し、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＸＰ＿００１１０６８９２．１及びＮＰ＿０３５７３８．１を有するアミノ酸配列を有するものである。
【0030】
本明細書において言及される「抗体」という用語は、全抗体及びその任意の抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結される２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）及び重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから構成される。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存されている領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに分類され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【0031】
本明細書において使用される際の、抗体の「抗原結合部分」若しくは「抗原結合フラグメント」（又は単に「抗体部分」）という用語は、抗原（例えば、ＢＣＭＡタンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が、完全長抗体のフラグメントによって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一のアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；並びに（ｖｉｉｉ）ナノボディ、単一可変ドメイン及び２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、それらをＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）として作製可能にする合成リンカーによる、組換え方法を用いて結合され得る。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を用いて得られ、これらのフラグメントは、インタクトな抗体と同じように有用性についてスクリーニングされる。
【0032】
本明細書において使用される際の「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図される（例えば、ＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＢＣＭＡタンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＢＣＭＡタンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するＢＣＭＡタンパク質などの他の抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0033】
本明細書において使用される際の「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合特異性及び親和性を示す。
【0034】
本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、フレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がマウス生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことが意図される。さらに、抗体が定常領域を含む場合、定常領域はまた、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する。本開示のマウス抗体は、マウス生殖細胞系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでランダム若しくは部位特異的変異誘発又はインビボで体細胞変異によって導入される変異）を含み得る。しかしながら、本明細書において使用される際の「マウス抗体」という用語は、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列にグラフトされている抗体を含むことは意図されていない。
【0035】
「キメラ抗体」という用語は、非ヒト源に由来する遺伝物質を、ヒトに由来する遺伝物質と組み合わせることによって作製される抗体を指す。又はより一般に、キメラ抗体は、特定の種に由来する遺伝物質を、別の種に由来する遺伝物質とともに有する抗体である。
【0036】
本明細書において使用される際の「ヒト化抗体」という用語は、タンパク質配列が、ヒトにおいて天然に産生される抗体形態との類似性を増大するように修飾された、非ヒト種に由来する抗体を指す。
【0037】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【0038】
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書において、「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と同義的に使用される。
【0039】
本明細書において使用される際、「ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する」抗体は、ヒトＢＣＭＡタンパク質（場合により、１つ以上の非ヒトに由来するＢＣＭＡタンパク質）に結合するが、非ＢＣＭＡタンパク質に実質的に結合しない抗体を指すことが意図される。好ましくは、抗体は、「高い親和性」、すなわち、５．０×１０－８Ｍ以下、より好ましくは、１．０×１０－８Ｍ以下、より好ましくは、７．０×１０－９Ｍ以下のＫＤでヒトＢＣＭＡタンパク質に結合する。
【0040】
本明細書において使用される際の、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という用語は、タンパク質又は細胞に結合しないか又は高い親和性で結合しない、すなわち、１．０×１０－６Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０－５Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０－４Ｍ以上、より好ましくは、１．０×１０－３Ｍ以上、さらにより好ましくは、１．０×１０－２Ｍ以上のＫＤでタンパク質又は細胞に結合することを意味する。
【0041】
ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的抗原に対して１．０×１０－６Ｍ以下、より好ましくは、５．０×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは、７．０×１０－９Ｍ以下、さらにより好ましくは、１．０×１０－９Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。しかしながら、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変化し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０－６Ｍ以下、より好ましくは、１０－７Ｍ以下、さらにより好ましくは、１０－８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。
【0042】
本明細書において使用される際の「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」という用語が、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指すことが意図される一方、本明細書において使用される際の「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。本明細書において使用される際の「ＫＤ」という用語は、解離定数を指すことが意図され、これは、Ｋｄ対Ｋａの比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体についてのＫＤ値は、当該技術分野において十分に確立された方法を用いて決定され得る。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いる、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることによる。
【0043】
本明細書において使用される際の「抗体依存的細胞毒性」、「抗体依存的細胞媒介性細胞毒性」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、免疫系のエフェクター細胞が、腫瘍細胞などの標的細胞を活発に溶解させ、その膜表面抗原が抗ＢＣＭＡ抗体などの抗体によって結合されている、細胞媒介性免疫防御の機構を指す。
【0044】
最大半量の有効濃度としても知られている「ＥＣ５０」という用語は、特定の曝露時間の後の、ベースラインと最大値との間の中間の応答を誘導する抗体の濃度を指す。
【0045】
半数阻害濃度としても知られている「ＩＣ５０」という用語は、抗体の非存在と比べて５０％だけ特定の生物学的又は生化学的機能を阻害する抗体の濃度を指す。
【0046】
「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、及びは虫類などの、哺乳動物及び非哺乳動物を含むが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ及びウマなどの哺乳動物が好ましい。
【0047】
「治療有効量」という用語は、疾患若しくは病態（癌など）に関連する症状を予防若しくは改善し、及び／又は疾患若しくは病態の重症度を低下させるのに十分な、本開示の抗体の量を意味する。治療有効量は、治療される病態に関して理解され、実際の有効量は、当業者によって容易に理解される。
【0048】
本開示の様々な態様が、以下のサブセクションにさらに詳細に記載される。
【0049】
ヒトＢＣＭＡに対する増加した結合親和性及びＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合に対するより良好なブロッキング活性を有する抗ＢＣＭＡ抗体
本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの既に記載された抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、より良好でないとしても同等の、結合親和性／能力でヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。本開示の抗体又は抗原結合部分はまた、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、特定の濃度、例えば、低い濃度で、より高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する。ＤＴ３Ｃなどの細胞毒素とコンジュゲートされるとき、本開示の抗体又は抗原結合部分は、細胞によってより迅速に内在化され、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体より高い細胞殺滅活性を示す。
本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの既に記載された抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、より良好でないとしても同等の、結合親和性／能力でヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。本開示の抗体又は抗原結合部分はまた、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体と比較して、特定の濃度、例えば、低い濃度で、より高い抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導する。ＤＴ３Ｃなどの細胞毒素とコンジュゲートされるとき、本開示の抗体又は抗原結合部分は、細胞によってより迅速に内在化され、ＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分などの先行技術の抗ＢＣＭＡ抗体より高い細胞殺滅活性を示す。
【0050】
さらなる機能特性は、ＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合をブロックする能力を含む。
【0051】
本開示の好ましい抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば、キメラモノクローナル抗体であり得る。
【0052】
モノクローナル抗ＢＣＭＡ抗体
本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、後述されるように、構造的に及び化学的に特徴付けられる。抗体の重鎖／軽鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列ＩＤ番号は、以下の表１に要約され、いくつかの抗体は、同じＶＨ又はＶＬを共有する。抗体の重鎖定常領域は、例えば、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり得、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、配列番号１３に記載されるアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを有するヒトκ定常領域であり得る。これらの抗体はまた、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域、及びマウスκ定常領域を含有し得る。
本開示の例示的な抗体又はその抗原結合部分は、後述されるように、構造的に及び化学的に特徴付けられる。抗体の重鎖／軽鎖可変領域及びＣＤＲのアミノ酸配列ＩＤ番号は、以下の表１に要約され、いくつかの抗体は、同じＶＨ又はＶＬを共有する。抗体の重鎖定常領域は、例えば、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり得、抗体の軽鎖定常領域は、例えば、配列番号１３に記載されるアミノ酸配列、又はその機能的フラグメントを有するヒトκ定常領域であり得る。これらの抗体はまた、マウスＩｇＧ１重鎖定常領域、及びマウスκ定常領域を含有し得る。
【0053】
表１中の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって定義されている。しかしながら、当該技術分野において周知であるように、ＣＤＲ領域はまた、重鎖／軽鎖可変領域配列に基づいて、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＡｂＭ、及びＣｏｎｔａｃｔ番号付けシステム／方法などの他のシステムによって決定され得る。
【0054】
ヒトＢＣＭＡに結合する他の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は、本開示の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）と「混合及び適合させる」ことができる。好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖（又はこのような鎖内のＣＤＲ）が、混合及び適合される場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＨ配列が、構造的に類似のＶＨ配列で置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対合からのＶＬ配列が、構造的に類似のＶＬ配列で置き換えられる。
【0055】
したがって、一実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は別の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＬを含み、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。
（ａ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は別の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＬを含み、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。
【0056】
【表1】
【0057】
別の実施形態において、本開示の抗体、又はその抗原結合部分は、
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。
（ａ）表１中で上に列挙される重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域；及び
（ｂ）表１中で上に列挙される軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３領域又は別の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲを含み、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。
【0058】
さらに別の実施形態において、抗体、又はその抗原結合部分は、ヒトＢＣＭＡに結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、重鎖可変領域からのＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３と組み合わされた抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域、並びに／或いは異なる抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変領域からのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３を含む。
【0059】
さらに、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して、ＣＤＲ３ドメインは、単独で、同種抗原に対する抗体の結合特異性を決定することができること、及び複数の抗体が、予想通りに、共通のＣＤＲ３配列に基づいて、同じ結合特異性を有して生成され得ることが当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ ８３（２）：２５２－２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０－８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１－２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９－２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９－７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２－７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ７２：８０７－１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４－８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ ａｎｄ Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８－５３２９（１９９４）及びＸｕ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３：３７－４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号明細書；同第６，９１４，１２８号明細書；同第６，０９０，３８２号明細書；同第６，８１８，２１６号明細書；同第６，１５６，３１３号明細書；同第６，８２７，９２５号明細書；同第５，８３３，９４３号明細書；同第５，７６２，９０５号明細書及び同第５，７６０，１８５号明細書を参照されたい。これらの参照文献はそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される。
【0060】
したがって、別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２、並びに抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域の少なくともＣＤＲ３、又は別の抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３を含み、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合することが可能である。これらの抗体は、好ましくは、（ａ）ＢＣＭＡとの結合について競合し；（ｂ）機能的特性を保持し；（ｃ）同じエピトープに結合し；及び／又は（ｄ）本開示の抗ＢＣＭＡ抗体と同様の結合親和性を有する。さらに別の実施形態において、抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合することが可能である。別の実施形態において、本開示の抗体は、抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１をさらに含み得、ここで、抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合することが可能である。
【0061】
保存的修飾
別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾だけ、本開示の抗ＢＣＭＡ抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。特定の保存的配列修飾が、抗原結合を除去せずに作製され得ることが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。
別の実施形態において、本開示の抗体は、１つ以上の保存的修飾だけ、本開示の抗ＢＣＭＡ抗体のものと異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。特定の保存的配列修飾が、抗原結合を除去せずに作製され得ることが、当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ'Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照されたい。
【0062】
したがって、一実施形態において、抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域及び／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、ここで：
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み；
（ｅ）抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。
（ａ）重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｂ）重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｃ）重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列、及び／又はその保存的修飾を含み；及び／又は
（ｄ）軽鎖可変領域ＣＤＲ１、及び／又はＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３配列は、上記の表１に列挙される配列；及び／又はその保存的修飾を含み；
（ｅ）抗体は、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合する。
【0063】
本開示の抗体は、ヒトＢＣＭＡに対する高親和性結合、及びＢＣＭＡ発現細胞に対するＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘導する能力などの、上述される以下の機能特性の１つ以上を有する。
【0064】
様々な実施形態において、抗体は、例えば、マウス、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であり得る。
【0065】
本明細書において使用される際、「保存的配列修飾」という用語は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に実質的に影響を与えないか又は変化させないアミノ酸修飾を指すことが意図される。このような保存的修飾は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの、当該技術分野において公知の標準的な技術によって、本開示の抗体に導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β－分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。したがって、本開示の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換され得、改変された抗体が、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上記の機能）について試験され得る。
【0066】
操作及び修飾された抗体
本開示の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発材料として本開示の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を用いて調製され得る。抗体は、１つ又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することによって操作され得る。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作され得る。
本開示の抗体は、修飾された抗体を操作するように、出発材料として本開示の抗ＢＣＭＡ抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を用いて調製され得る。抗体は、１つ又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内及び／又は１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上の残基を修飾することによって操作され得る。それに加えて又はその代わりに、抗体は、例えば抗体のエフェクター機能を改変するために、定常領域内の残基を修飾することによって操作され得る。
【0067】
特定の実施形態において、ＣＤＲグラフト法は、抗体の可変領域を操作するのに使用され得る。抗体は、主に、６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して、標的抗原と相互作用する。この理由のため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外部の配列より個々の抗体間でより異なっている。ＣＤＲ配列が、ほとんどの抗体－抗原相互作用に関与するため、異なる特性を有する異なる抗体からのフレームワーク配列にグラフトされた特定の天然抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することによって、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．を参照されたい。Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９－１００３３；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書も参照されたい）。
【0068】
したがって、本開示の別の実施形態は、上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及び／又は上述される、本開示の配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離モノクローナル抗体、又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体が、本開示のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ ＣＤＲ配列を含む一方、それらは、異なるフレームワーク配列を含み得る。
【0069】
このようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベース又は刊行されている参照文献から得られる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃ－ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで、インターネットで利用可能）、並びにＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）（上記に引用される）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６－７９８；及びＣｏｘ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７－８３６（これらのそれぞれの内容が、参照により本明細書に明示的に援用される）において見出され得る。別の例として、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースにおいて見出され得る。例えば、ＨＣｏ７ ＨｕＭＡｂマウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、３－３３（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）並びに３－７（ＮＧ－－００１０１０９＆ＮＴ－－０２４６３７）において利用可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ ＨｕＭＡｂ マウスにおいて見出される以下の重鎖生殖細胞系列配列は、添付のＧｅｎｂａｎｋ受託番号１－６９（ＮＧ－－００１０１０９、ＮＴ－－０２４６３７及びＢＣ０７０３３３）、５－５１（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、４－３４（ＮＧ－－００１０１０９及びＮＴ－－０２４６３７）、３－３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）並びに３－２３（ＡＪ４０６６７８）において利用可能である。
【0070】
抗体タンパク質配列は、当業者に周知の、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）、上記を参照）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、コンパイルされたタンパク質配列データベースに対して比較される。
【0071】
本開示の抗体において使用するための好ましいフレームワーク配列は、本開示の抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。ＶＨ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域にグラフトされ得、又はＣＤＲ配列は、生殖細胞系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域にグラフトされ得る。例えば、ある場合において、抗体の抗原結合能力を維持又は強化するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが分かっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書を参照されたい）。
【0072】
別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨ及び／又はＶＬ ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させることであり、それによって、対象とする抗体の１つ以上の結合特性（例えば、親和性）を改善する。部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介変異誘発は、変異を導入するために行われ得、抗体結合に対する効果、又は対象とする他の機能的特性が、当該技術分野において公知のインビトロ又はインビボアッセイにおいて評価され得る。好ましくは、保存的修飾（当該技術分野において公知であるように）が導入される。変異は、アミノ酸置換、付加又は欠失であり得るが、好ましくは、置換である。さらに、典型的に、ＣＤＲ領域内の１、２、３、４又は５つ以下の残基が改変される。
【0073】
したがって、別の実施形態において、本開示は、（ａ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１領域；（ｂ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２領域；（ｃ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３領域；（ｄ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１領域；（ｅ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２領域；及び（ｆ）本開示の配列、又は１、２、３、４若しくは５つのアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体、又はその抗原結合部分を提供する。
【0074】
本開示の操作された抗体は、修飾が、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に行われたものを含む。典型的に、このようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一手法は、１つ以上のフレームワーク残基を対応する生殖細胞系列配列へと「復帰変異（ｂａｃｋ－ｍｕｔａｔｅ）」させることである。より詳細には、体細胞変異を起こした抗体は、抗体が由来する生殖細胞系列配列と異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖細胞系列配列と比較することによって同定され得る。
【0075】
別のタイプのフレームワーク修飾は、Ｔ細胞エピトープを除去し、それによって、抗体の潜在的な免疫原性を低下させるために、フレームワーク領域内、或いは１つ以上のＣＤＲ領域内の１つ以上の残基を変異させることを含む。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３／０１５３０４３号明細書にさらに詳細に記載されている。
【0076】
フレームワーク若しくはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて、又はその代わりに、本開示の抗体は、典型的に、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／又は抗原依存的細胞毒性などの、抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために、Ｆｃ領域内に修飾を含むように操作され得る。さらに、本開示の抗体は、同様に抗体の１つ以上の機能的特性を改変するために化学修飾され得るか（例えば、１つ以上の化学部分が、抗体に結合され得る）又はそのグリコシル化を改変するために修飾され得る。
【0077】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化される、例えば、増加又は減少されるように修飾される。この手法は、米国特許第５，６７７，４２５号明細書にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組み立てを容易にするために、又は抗体の安定性を増大若しくは低下させるために変化される。
【0078】
別の実施形態において、抗体のＦｃヒンジ領域は、抗体の生体半減期を減少させるように変異される。より詳細には、１つ以上のアミノ酸変異は、抗体が、天然Ｆｃ－ヒンジ領域ＳｐＡ結合と比べて損なわれたブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を有するように、Ｆｃ－ヒンジフラグメントのＣＨ２－ＣＨ３ドメイン境界領域に導入される。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号明細書にさらに詳細に記載されている。
【0079】
さらに別の実施形態において、抗体のグリコシル化は、修飾される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体は、グリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増大するために改変され得る。このような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を改変することによって達成され得る。例えば、１つ以上のアミノ酸置換は、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位をなくし、それによって、その部位におけるグリコシル化をなくすように行われ得る。このようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増大し得る。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号明細書及び同第６，３５０，８６１号明細書を参照されたい。
【0080】
それに加えて又はその代わりに、改変されたタイプのグリコシル化を有する抗体、例えば、減少した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体が作製され得る。このような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大することが実証されている。このような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を有する宿主細胞において抗体を発現することによって達成され得る。改変されたグリコシル化機構を有する細胞は、当該技術分野において記載されており、本開示の組換え抗体を発現する宿主細胞として使用され、それによって、改変されたグリコシル化を有する抗体を産生することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（α（１，６）－フコシルトランスフェラーゼ）を欠いており、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９細胞株において発現される抗体が、それらの炭水化物においてフコースを欠くようになっている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５、及びＭｓ７０９ ＦＵＴ８－／－細胞株を、２つの置換ベクターを用いて、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的化破壊によって生成した（米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号明細書及びＹａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ８７：６１４－２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、このような細胞株において発現される抗体が、α－１，６結合関連酵素を減少させるか又は除去することによって低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子が機能的に破壊された細胞株が記載されている。また、欧州特許第１，１７６，１９５号明細書には、抗体のＦｃ領域に結合するか又は酵素活性を有さない、フコースのＮ－アセチルグルコサミンへの付加に対して低い酵素活性を有する細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６６２）が記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に結合する能力を低下させ、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されている（Ｓｈｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３－２６７４０も参照）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体はまた、国際公開第０６／０８９２３１号に記載されるように、ニワトリ卵において産生され得る。或いは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、アオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ）などの植物細胞において産生され得る。植物系における抗体の産生のための方法は、２００６年８月１１日に出願されたＡｌｓｔｏｎ＆Ｂｉｒｄ ＬＬＰ代理人整理番号０４０９８９／３１４９１１号に対応する米国特許出願に開示されている。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株において発現される抗体が、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）－Ｎ－アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６－１８０も参照）。或いは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断され得；例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼは、抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。
【0081】
本開示によって想定される本明細書の抗体の別の修飾は、ペグ化である。抗体は、例えば、抗体の生体（例えば、血清）半減期を増加させるために、ペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体、又はそのフラグメントは、典型的に、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに結合される条件下で、ＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応される。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応によって行われる。本明細書において使用される際、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－又はアリールオキシ－ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するのに使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することが意図される。特定の実施形態において、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は、当該技術分野において公知であり、本開示の抗体に適用され得る。例えば、欧州特許第１５４ ３１６号明細書及び欧州特許第０ ４０１ ３８４号明細書を参照されたい。
【0082】
抗体の物理的特性
本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。
本開示の抗体は、その異なるクラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けられ得る。
【0083】
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかにおける１つ以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗体の増加した免疫原性又は改変された抗原結合による抗体のｐＫの改変をもたらし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ ｅｔ ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ４１：６７３－７０２；Ｇａｌａ ａｎｄ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７２：５４８９－９４；Ｗａｌｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６８：１０９９－１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １２：４３Ｒ－５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４５２－７；Ｍｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３７：６９７－７０６）。グリコシル化は、Ｎ－Ｘ－Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフにおいて起こることが知られている。ある場合には、可変領域グリコシル化を含まない抗ＢＣＭＡ抗体を有することが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択することによって、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることによって、達成され得る。
【0084】
好ましい実施形態において、抗体は、アスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ－Ｇ又はＤ－Ｇ配列において起こり得、結合をポリペプチド鎖に導入し、その安定性を低下させる（イソアスパラギン酸効果）イソアスパラギン酸残基の生成をもたらし得る。
【0085】
各抗体は、一般に６～９．５のｐＨ範囲内の特有の等電点（ｐＩ）を有する。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、典型的に、７～９．５のｐＨ範囲内であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは、典型的に、６～８のｐＨ範囲内である。正常範囲外のｐＩを有する抗体が、インビボ条件下でいくらかのアンフォールディング及び不安定性を有し得ると推測されている。したがって、正常範囲内のｐＩ値を有する抗ＢＣＭＡ抗体を有することが好ましい。これは、正常範囲内のｐＩを有する抗体を選択することによって、又は荷電表面残基を変異させることによって達成され得る。
【0086】
本開示のモノクローナル抗体の産生
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術を含む。キメラ又はヒト化抗体も、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書（これらの内容は、全体が参照により本明細書に具体的に援用される）を参照されたい。
本開示のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を用いて産生され得る。モノクローナル抗体を産生するための他の実施形態は、Ｂリンパ球のウイルス又は発癌性形質転換及びファージディスプレイ技術を含む。キメラ又はヒト化抗体も、当該技術分野において周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；同第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書及び同第６，１８０，３７０号明細書（これらの内容は、全体が参照により本明細書に具体的に援用される）を参照されたい。
【0087】
本開示のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの生成
本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野において周知であるような、組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターにライゲートされることを意味することが意図される。
本開示の抗体はまた、例えば、当該技術分野において周知であるような、組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマ中で産生され得る（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術によって得られる部分的又は完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように、１つ以上の発現ベクターに挿入される。これに関して、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳調節配列が、抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子が、ベクターにライゲートされることを意味することが意図される。
【0088】
「調節配列」という用語は、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指向するウイルス要素、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルスに由来するプロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）及びポリオーマを含む。或いは、ユビキチンプロモーター又はβ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列が使用され得る。さらにまた、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長い末端反復配列からの配列を含む、ＳＲαプロモーター系などの異なる源に由来する配列から構成される（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６－４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。
【0089】
抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同じ又は別個の発現ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、可変領域は、ＶＨセグメントが、ベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、ＶＬセグメントが、ベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに可変領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの完全長抗体遺伝子を生成するために使用される。それに加えて又はその代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが、抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質に由来するシグナルペプチド）であり得る。
【0090】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書；同第４，６３４，６６５号明細書及び同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的に、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞において、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅とともにｄｈｆｒ－宿主細胞における使用のため）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【0091】
軽鎖及び重鎖の発現のため、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターは、標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態が、外来性ＤＮＡを原核生物又は真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれにおいても本開示の抗体を発現させることが理論上可能であるが、真核細胞、特に哺乳動物細胞が、原核細胞より、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立て、分泌する可能性が高いため、このような真核細胞、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も好ましい。
【0092】
本開示の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（例えば、Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１に記載されているような、ＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６－４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞を含む。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用について、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許第３３８，８４１号明細書に開示されるＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが、哺乳動物宿主細胞に導入されるとき、抗体は、宿主細胞における抗体の発現又は、より好ましくは、宿主細胞が増殖される培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたって、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を用いて、培養培地から回収され得る。
【0093】
免疫抱合体
本開示の抗体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫抱合体を形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。好適な治療剤としては、ＤＴ３Ｃなどの細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；及び同第７，１２９，２６１号明細書；国際公開第０２／０９６９１０号；国際公開第０７／０３８，６５８号；国際公開第０７／０５１，０８１号；国際公開第０７／０５９，４０４号；国際公開第０８／０８３，３１２号；及び国際公開第０８／１０３，６９３号；米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書；同第２００６／０００４０８１号明細書；及び同第２００６／０２４７２９５号明細書（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されているように調製され得る。
本開示の抗体は、抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの免疫抱合体を形成するために、治療剤にコンジュゲートされ得る。好適な治療剤としては、ＤＴ３Ｃなどの細胞毒素、アルキル化剤、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質、及び抗有糸分裂剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、好ましくは、ペプチジル、ジスルフィド、又はヒドラゾンリンカーなどの切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。より好ましくは、リンカーは、Ｖａｌ－Ｃｉｔ、Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｖａｌ、Ｌｙｓ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｓｎ－Ｖａｌ、Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ、Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｓｎ、Ｃｉｔ－Ｃｉｔ、Ｖａｌ－Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、又はＧｌｕなどのペプチジルリンカーである。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号明細書；同第６，９８９，４５２号明細書；及び同第７，１２９，２６１号明細書；国際公開第０２／０９６９１０号；国際公開第０７／０３８，６５８号；国際公開第０７／０５１，０８１号；国際公開第０７／０５９，４０４号；国際公開第０８／０８３，３１２号；及び国際公開第０８／１０３，６９３号；米国特許出願公開第２００６／００２４３１７号明細書；同第２００６／０００４０８１号明細書；及び同第２００６／０２４７２９５号明細書（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）に記載されているように調製され得る。
【0094】
二重特異性分子
別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体又はリガンド）に連結された本開示の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される際、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。
別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を生成するために、少なくとも１つの他の機能分子、例えば、別のペプチド又はタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体又はリガンド）に連結された本開示の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書において使用される際、「二重特異性分子」は、３つ以上の特異性を有する分子を含む。
【0095】
一実施形態において、二重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＢＣＭＡ結合特異性に加えて、第３の特異性を有する。第３の特異性は、抗促進因子（ａｎｔｉ－ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ）（ＥＦ）、例えば、細胞毒性活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子に関するものであり得る。例えば、抗促進因子は、細胞毒性Ｔ細胞（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、若しくはＩＣＡＭ－１を介して）又は他の免疫細胞に結合して、標的細胞に対する増加した免疫応答をもたらし得る。
【0096】
二重特異性分子は、多くの異なるフォーマット及びサイズであり得る。サイズスペクトルの一方の側では、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、それぞれ異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除いて、従来の抗体フォーマットを保持している。他方の側では、ペプチド鎖によって連結される２つの一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ'ｓ）、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２構築物からなる二重特異性分子である。中間サイズの二重特異性分子は、ペプチジルリンカーによって連結される２つの異なるＦ（ａｂ）フラグメントを含む。これらの及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子組換え、体細胞ハイブリダイゼーション、又は化学的方法によって調製され得る。例えば、Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ（上記に引用される）；Ｃａｏ ａｎｄ Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５－６４４（１９９８）；及びｖａｎ Ｓｐｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１－３９７（２０００）、並びにそれらの中に引用される参照文献を参照されたい。
【0097】
抗体をコードする又は抗体を担持する腫瘍溶解性ウイルス
腫瘍溶解性ウイルスは、優先的に、癌細胞を感染させ、死滅させる。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。或いは、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの身体に導入され得る。
腫瘍溶解性ウイルスは、優先的に、癌細胞を感染させ、死滅させる。本開示の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスとともに使用され得る。或いは、本開示の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、ヒトの身体に導入され得る。
【0098】
キメラ抗原受容体
抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供され、この抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、本明細書に記載されるＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む。
抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も、本明細書において提供され、この抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖは、本明細書に記載されるＣＤＲ及び重鎖／軽鎖可変領域を含む。
【0099】
抗ＢＣＭＡ ＣＡＲは、（ａ）抗ＢＣＭＡ ｓｃＦｖを含む細胞外抗原結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；及び（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【0100】
ＣＡＲは、新生受容体を小胞体に指向する、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるシグナルペプチド、及び受容体を結合のためにより多く利用できるようにする、細胞外抗原結合ドメインのＮ末端におけるヒンジペプチドを含有し得る。ＣＡＲは、好ましくは、細胞内シグナル伝達ドメインにおいて、主要な細胞内シグナル伝達ドメイン及び１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。主に使用される、最も有効な主要な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含むＣＤ３－ζ細胞質ドメインであり、そのリン酸化が、Ｔ細胞活性化をもたらす。共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７及びＯＸ４０などの共刺激タンパク質に由来し得る。
【0101】
ＣＡＲは、Ｔ細胞増殖、持続性、及び抗腫瘍活性を促進する因子、例えば、サイトカイン、及び共刺激リガンドをさらに追加し得る。
【0102】
本明細書において提供されるＣＡＲを含む操作された免疫エフェクター細胞も提供される。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、又は胚性幹細胞である。ある実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞である。
【0103】
本開示の抗体をコードする核酸分子
別の態様において、本開示は、本開示の抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、又はＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞で、細胞溶解物で、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されたとき、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」ものとなる。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても又は含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
別の態様において、本開示は、本開示の抗体又は抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、又はＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。核酸は、全細胞で、細胞溶解物で、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、標準的な技術によって、他の細胞成分又は他の汚染物質、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から精製されたとき、「単離された」又は「実質的に純粋にされた」ものとなる。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでいても又は含まなくてもよい。好ましい実施形態において、核酸は、ｃＤＮＡ分子である。
【0104】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下にさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから調製されたハイブリドーマ）によって発現される抗体について、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得られる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージディスプレイ技術を用いて）得られる抗体について、このような抗体をコードする核酸が、遺伝子ライブラリーから回収され得る。
【0105】
本開示の好ましい核酸分子は、ＢＣＭＡモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ配列又はＣＤＲをコードするものを含む。ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントは、例えば、可変領域遺伝子を完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂフラグメント遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換するために、標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作され得る。これらの操作において、ＶＬ－又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントは、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡフラグメントに作動可能に連結される。この文脈において使用される際の「作動可能に連結される」という用語は、２つのＤＮＡフラグメントによってコードされるアミノ酸配列がフレーム内に留まるように、２つのＤＮＡフラグメントが結合されることを意味することが意図される。
【0106】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂフラグメント重鎖遺伝子について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【0107】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野において公知であり、これらの領域を含むＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅によって得られる。好ましい実施形態において、軽鎖定常領域は、κ又はλ定常領域であり得る。
【0108】
ｓｃＦｖ遺伝子を生成するために、ＶＨ及びＶＬ配列が、フレキシブルリンカーによって結合されたＶＬ及びＶＨ領域を有する連続一本鎖タンパク質として発現され得るように、ＶＨ－及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントは、フレキシブルリンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別のフラグメントに作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４を参照されたい）。
【0109】
医薬組成物
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、本開示の１つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）を含む医薬組成物を提供する。抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）は、組成物が、２つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）を含むとき、別々に投与され得る。組成物は、１つ以上のさらなる薬学的に有効な成分、例えば、別の抗体又は薬剤、例えば、抗腫瘍薬を任意に含有し得る。
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体とともに製剤化される、本開示の１つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）を含む医薬組成物を提供する。抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）は、組成物が、２つ以上の抗体（又はその抗原結合部分、二重特異性体、ＣＡＲ－Ｔ細胞、腫瘍溶解性ウイルス、免疫抱合体、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞）を含むとき、別々に投与され得る。組成物は、１つ以上のさらなる薬学的に有効な成分、例えば、別の抗体又は薬剤、例えば、抗腫瘍薬を任意に含有し得る。
【0110】
医薬組成物は、あらゆる賦形剤を含み得る。使用され得る賦形剤は、担体、表面活性剤、増粘剤又は乳化剤、固体結合剤、分散若しくは懸濁補助剤、可溶化剤、着色剤、香味剤、コーティング、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、防腐剤、等張剤、及びそれらの組合せを含む。好適な賦形剤の選択及び使用が、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）（その開示内容は、参照により本明細書に援用される）に教示されている。
【0111】
好ましくは、医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば、注射又は注入による）に好適である。投与経路に応じて、有効成分は、酸の作用及びそれを不活性にし得る他の天然条件からそれを保護するための材料でコーティングされ得る。本明細書において使用される際の「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の、通常注射による投与方法を意味し、限定はされないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外並びに胸骨内注射及び注入を含む。或いは、本開示の抗体は、経口（ｎｏｎ－ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）経路によって、例えば、局所、表皮又は粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下又は局所的に投与され得る。
【0112】
医薬組成物は、滅菌水溶液又は分散体の形態であり得る。それらはまた、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は他の高い薬物濃度に好適な規則的な構造で製剤化され得る。
【0113】
単一剤形を製造するために担体材料と組み合わされ得る有効成分の量は、治療される対象及び特定の投与方法に応じて変化し、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、１００％のうち、この量は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、約０．０１％～約９９％の有効成分、好ましくは、約０．１％～約７０％、最も好ましくは、約１％～約３０％の有効成分の範囲である。
【0114】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するために調整される。例えば、単回ボーラスが投与されてもよく、経時的に数回の分割投与で投与されてもよく、又は用量は、治療状況の緊急性により示されるとき比例的に減少若しくは増加され得る。投与の容易性及び投与量の均一性のため、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書において使用される際の投与単位形態は、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に分離した単位を指し；各単位は、必要な医薬担体とともに、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の有効成分を含有する。或いは、抗体は、あまり頻繁でない投与が必要とされる場合、徐放性製剤として投与され得る。
【0115】
組成物の投与のため、投与量は、約０．０００１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例示的な治療計画は、週１回の投与を含む。
【0116】
本開示の抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合部分、免疫抱合体、二重特異性分子、ＣＡＲ、免疫細胞、腫瘍溶解性ウイルス、核酸分子、発現ベクター又は宿主細胞の「治療有効投与量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低下、疾患の無症状期間の頻度及び持続時間の増加、又は疾患の苦痛に起因する障害若しくは身体障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍を有する対象の治療について、「治療有効投与量」は、好ましくは、非治療対象と比べて、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、さらにより好ましくは、少なくとも約８０％だけ腫瘍増殖を阻害する。治療有効量の治療用抗体は、腫瘍サイズを減少させるか、又は典型的にヒトであるか又は別の哺乳動物であり得る対象において症状を改善することができる。
【0117】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤であり得る。生分解性、生体適合性ポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸が使用され得る。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【0118】
治療用組成物は、医療デバイス、例えば、（１）無針皮下注射デバイス（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；及び同第４，５９６，５５６号明細書）；（２）微小注入ポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号明細書）；（３）経皮デバイス（米国特許第４，４８６，１９４号明細書）；（４）注入装置（米国特許第４，４４７，２３３号明細書及び同第４，４４７，２２４号明細書）；並びに（５）浸透デバイス（米国特許第４，４３９，１９６号明細書及び同第４，４７５，１９６号明細書）（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）によって投与され得る。
【0119】
特定の実施形態において、本開示のモノクローナル抗体は、インビボで適切な分布を確実にするため製剤化され得る。例えば、本開示の治療用抗体が、血液脳関門を通過することを確実にするために、それらは、リポソーム中で製剤化され得、これらは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を促進するための標的分子をさらに含み得る。例えば米国特許第４，５２２，８１１号明細書；同第５，３７４，５４８号明細書；同第５，４１６，０１６号明細書；及び同第５，３９９，３３１号明細書；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ ａｎｄ Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２７３を参照されたい。
【0120】
本開示の使用及び方法
本開示の医薬組成物は、例えば、増加したＢＣＭＡ発現に関連する腫瘍の治療を含む、多くのインビトロ及びインビボでの有用性を有する。
本開示の医薬組成物は、例えば、増加したＢＣＭＡ発現に関連する腫瘍の治療を含む、多くのインビトロ及びインビボでの有用性を有する。
【0121】
ＢＣＭＡ発現腫瘍細胞の増殖及び生存を阻害する本開示の抗ＢＣＭＡ抗体又はその抗原結合部分の能力を所与として、本開示は、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、腫瘍の増殖が対象において阻害されるように、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示の抗体によって治療され得る腫瘍の非限定的な例としては、限定はされないが、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫などが挙げられる。さらに、増殖が本開示の抗体を用いて阻害され得る難治性又は再発性悪性腫瘍が挙げられる。
【0122】
組合せ治療
別の態様において、本開示は、本開示の医薬組成物が、対象における腫瘍増殖を阻害する際に有効な１つ以上のさらなる抗体と共投与される組合せ治療の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、対象における腫瘍増殖を阻害するための方法であって、本開示の医薬組成物並びに抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体などの１つ以上のさらなる抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。
別の態様において、本開示は、本開示の医薬組成物が、対象における腫瘍増殖を阻害する際に有効な１つ以上のさらなる抗体と共投与される組合せ治療の方法を提供する。一実施形態において、本開示は、対象における腫瘍増殖を阻害するための方法であって、本開示の医薬組成物並びに抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＰＤ－１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ－４抗体などの１つ以上のさらなる抗体を対象に投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。
【0123】
ＢＣＭＡシグナル伝達活性化はまた、標準的な癌治療とさらに組み合わされ得る。例えば、ＢＣＭＡシグナル伝達活性化は、ＣＴＬＡ－４及び／又はＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－１遮断及びさらに化学療法レジメンと組み合わされ得る。例えば、細胞毒性剤であり得る化学療法剤が、抗ＢＣＭＡ抗体とともに投与され得る。例えば、エピルビシン、オキサリプラチン、及び５－ＦＵが、抗ＢＣＭＡ療法を受けている患者に投与される。
【0124】
任意に、本開示の医薬組成物及び１つ以上のさらなる抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ－４及び／又は抗ＬＡＧ－３及び／又は抗ＰＤ－１抗体）の組合せは、免疫原、例えば、癌性細胞、精製された腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド、及び炭水化物分子を含む）、並びに免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞とさらに組み合わされ得る（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９－２８）。使用され得る腫瘍ワクチンの非限定的な例としては、黒色腫抗原のペプチド、例えば、ｇｐ１００のペプチド、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ－２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼ、又はサイトカインＧＭ－ＣＳＦを発現するようにトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられる。
【0125】
抗ＢＣＭＡ療法と組み合わされ得る他の療法としては、限定はされないが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）投与、放射線、外科手術、又はホルモン遮断が挙げられる。
【0126】
本明細書において説明される治療剤の組合せは、薬学的に許容される担体中の単一の組成物と同時に、又は薬学的に許容される担体中の各薬剤を含む別個の組成物として同時に投与され得る。別の実施形態において、治療剤の組合せは、連続して投与され得る。
【0127】
さらに、組合せ治療の２つ以上の用量が、連続して投与される場合、連続投与の順序は、投与の各時点で逆になり得るか又は同じ順序に保持され得、連続投与は、同時投与と組み合わされ得、又はそれらの任意の組合せである。
【0128】
本開示は、以下の実施例によってさらに例示され、これは、さらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用される全ての図及び全ての参照文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【実施例】
【0129】
実施例１ ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の生成
免疫化
マウスを、Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法にしたがって免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを有する組換えヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ５２５４、Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、免疫原として使用した。ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。免疫化投与量は、一次及び追加免疫の両方のために２５μｇのヒトＢＣＭＡ－Ｆｃタンパク質／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、まず、ボルテックスを用いてバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント－抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．２５～０．３４ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、得られた混合物を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原エマルジョンを、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で２５μｇの抗原を、１５０～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて２～３回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。
免疫化
マウスを、Ｅ Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法にしたがって免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１ Ｆｃタグを有する組換えヒトＢＣＭＡタンパク質（Ｃａｔ＃ＢＣ７－Ｈ５２５４、Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、免疫原として使用した。ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、抗血清力価を決定するため、及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマをスクリーニングするために使用した。免疫化投与量は、一次及び追加免疫の両方のために２５μｇのヒトＢＣＭＡ－Ｆｃタンパク質／マウス／注射を含んでいた。免疫応答を増加させるために、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）を、一次及び追加免疫のためにそれぞれ使用した。簡潔には、まず、ボルテックスを用いてバイアル中でアジュバントを穏やかに混合することによって、アジュバント－抗原混合物を調製した。所望の量のアジュバントを、加圧滅菌された１．５ｍＬの微小遠心分離管に移した。抗原を、０．２５～０．３４ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度を有するＰＢＳ又は生理食塩水中で調製した。次に、計算された量の抗原を、アジュバントとともに微小遠心分離管に加え、得られた混合物を、２分間にわたって穏やかにボルテックスすることによって混合して、油中水型エマルジョンを生成した。次に、アジュバント－抗原エマルジョンを、動物に注射するための適切なシリンジに吸い込ませた。合計で２５μｇの抗原を、１５０～２００μｌの体積で注射した。各動物を免疫化し、次に、抗血清力価に応じて２～３回追加接種した。良好な力価を有する動物に、融合前に腹腔内注射によって最終追加接種を与えた。
【0130】
ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週間後、各ウェルからの上清を、ビオチンで標識したヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質を用いて捕捉ＥＬＩＳＡに供した。次に、ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質に結合された抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマを、ヒトＢＡＦＦ－ＢＣＭＡブロッキング活性についてさらに試験した。高特異性ヒトＢＣＭＡ結合及びＢＣＭＡ－ＢＡＦＦブロッキング活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするために限られた希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。簡潔に述べると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を、５～１０カラム体積中でＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。細胞上清を、次に、カラムに通過させ、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、カラムを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。カラムを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離し、直ちに中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌ管に収集した。免疫グロブリンを含有する画分を、プールし、４℃で一晩、ＰＢＳ中で透析した。続いて、精製されたモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を、以下のように特性決定した。
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ－１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数期段階に到達させた。免疫化マウスに由来する脾臓細胞を、Ｋｏｈｌｅｒ Ｇ，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ，"Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ"，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５－４９７（１９７５）に記載される方法にしたがって、滅菌的に調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合された「ハイブリッド細胞」を、ＤＭＥＭ／２０％のＦＣＳ／ＨＡＴ培地中の９６ウェルプレート中に分配した。生存しているハイブリドーマコロニーが、融合の７～１０日後に顕微鏡で観察された。２週間後、各ウェルからの上清を、ビオチンで標識したヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質を用いて捕捉ＥＬＩＳＡに供した。次に、ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質に結合された抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移した。これらのハイブリドーマを、ヒトＢＡＦＦ－ＢＣＭＡブロッキング活性についてさらに試験した。高特異性ヒトＢＣＭＡ結合及びＢＣＭＡ－ＢＡＦＦブロッキング活性を示した抗体を産生するハイブリドーマクローンを、細胞株のクローン性を確実にするために限られた希釈によってサブクローニングし、次に、モノクローナル抗体を精製した。簡潔に述べると、プロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を、５～１０カラム体積中でＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。細胞上清を、次に、カラムに通過させ、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、カラムを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄した。カラムを、溶出緩衝液（０．１Ｍのグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）で溶離し、直ちに中和緩衝液（１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を含む１．５ｍｌ管に収集した。免疫グロブリンを含有する画分を、プールし、４℃で一晩、ＰＢＳ中で透析した。続いて、精製されたモノクローナル抗体のインビトロ機能活性を、以下のように特性決定した。
【0131】
実施例２ ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴技術を用いたマウス抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の親和性決定
実施例１で生成された、精製抗ＢＣＭＡマウスモノクローナル抗体Ｂ１Ｈ２（ｍＡｂ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、親和性及び結合速度について特性決定した。
実施例１で生成された、精製抗ＢＣＭＡマウスモノクローナル抗体Ｂ１Ｈ２（ｍＡｂ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ２００システム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって、親和性及び結合速度について特性決定した。
【0132】
簡潔に述べると、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３８、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を、ＢＩＡｃｏｒｅ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）によって提供される標準的なアミンカップリングキットを用いて、第一級アミンを介して、ＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストラン被覆チップ）に共有結合した。バイオセンサー表面上の未反応部分を、エタノールアミンでブロックした。プロテインＧチップ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃２９－１７９３－１５）を、陽性対照、すなわち、配列番号１４及び１５に記載される重鎖及び軽鎖アミノ酸を用いて社内で調製される、ＢＣＭＡ ＢＭ１又はＢＭとも呼ばれるＧＳＫ２８５７９１６のＢＣＭＡ結合部分を含有する完全長抗体の親和性決定に使用した。２μｇ／ｍＬの濃度で精製マウス抗ＢＣＭＡ抗体及び陽性対照を、１０μＬ／分の流量でチップ上に流した。次に、連続希釈された組換えヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓ（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ）又はカニクイザルＢＣＭＡ－Ｆｃタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｃ５２５３）、１０ｎＭから出発してＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中の２倍希釈（Ｂｉａｃｏｒｅ製）を、３０μＬ／分の流量でチップ上に流した。抗原－抗体結合速度を、２分間にわたって追跡し、解離速度を、１０分間にわたって追跡した。結合及び解離曲線を、ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。ＫＤ、Ｋａ及びＫｄ値を決定し、以下の表２に要約した。
【0133】
【表2】
【0134】
マウス抗体Ｂ１Ｈ２は、ベンチマークより高い結合親和性でヒトＢＣＭＡに特異的に結合したが、サルＢＣＭＡに結合しなかった。
【0135】
実施例３ マウス抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の結合活性
ヒトＢＣＭＡに対するマウス抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の結合活性を、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定した。
ヒトＢＣＭＡに対するマウス抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の結合活性を、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって決定した。
【0136】
３．１ 捕捉ＥＬＩＳＡ
簡潔に述べると、９６ウェルマイクロプレートを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５－００５－０７１）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、３７℃で２時間にわたって２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。プレートを再度洗浄し、１００μｌ／ウェルの連続希釈された精製マウス抗ＢＣＭＡ Ｂ１Ｈ２抗体、ベンチマーク及び陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）、１００００ｎｇ／ｍｌから出発してＰＢＳＴ中２．５％の無脂肪乳中の５倍希釈のそれぞれとともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、次に、再度４回洗浄した。捕捉抗ＢＣＭＡ抗体を含有するプレートを、ビオチン標識ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＢＳＴ中２．５％の無脂肪乳中４．１２５ｎｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル）とともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）とともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。最後の洗浄の後、プレートを、１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃａｔ＃ＴＭＢ－Ｓ－００２）とともにインキュベートした。反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４で、室温で３～１０分間で停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ５０値を報告した。結果を、図１に示した。
簡潔に述べると、９６ウェルマイクロプレートを、１００μｌ／ウェルのＰＢＳ中の２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５－００５－０７１）で被覆し、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、３７℃で２時間にわたって２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。プレートを再度洗浄し、１００μｌ／ウェルの連続希釈された精製マウス抗ＢＣＭＡ Ｂ１Ｈ２抗体、ベンチマーク及び陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）、１００００ｎｇ／ｍｌから出発してＰＢＳＴ中２．５％の無脂肪乳中の５倍希釈のそれぞれとともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、次に、再度４回洗浄した。捕捉抗ＢＣＭＡ抗体を含有するプレートを、ビオチン標識ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＰＢＳＴ中２．５％の無脂肪乳中４．１２５ｎｇ／ｍＬ、１００μｌ／ウェル）とともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ中１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４、１００μｌ／ウェル）とともに、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。最後の洗浄の後、プレートを、１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ、Ｃａｔ＃ＴＭＢ－Ｓ－００２）とともにインキュベートした。反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４で、室温で３～１０分間で停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ５０値を報告した。結果を、図１に示した。
【0137】
３．２ 細胞ベースの結合ＦＡＣＳ
Ｕ２６６細胞の表面への抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって試験した。簡潔に述べると、ヒト骨髄腫細胞Ｕ２６６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１９６（商標））を、細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％ ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。９６ウェルプレート中のウェル当たり２×１０５個の細胞を、氷上で４０分間にわたって、ＦＡＣＳ緩衝液中の１００μｌの連続希釈された抗ＢＣＭＡ抗体又は対照（１０μｇ／ｍＬから出発して、５倍連続希釈）とともにインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５－１１６－１４６）を加えた。暗所で、４℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて測定し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、Ｕ２６６細胞への最大抗ＢＣＭＡ結合の５０％を達成する抗体濃度としてのＥＣ５０値を報告した。結果を、図２に示した。
Ｕ２６６細胞の表面への抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって試験した。簡潔に述べると、ヒト骨髄腫細胞Ｕ２６６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１９６（商標））を、細胞培養フラスコから収集し、２回洗浄し、２％ ｖ／ｖのウシ胎仔血清（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で再懸濁させた。９６ウェルプレート中のウェル当たり２×１０５個の細胞を、氷上で４０分間にわたって、ＦＡＣＳ緩衝液中の１００μｌの連続希釈された抗ＢＣＭＡ抗体又は対照（１０μｇ／ｍＬから出発して、５倍連続希釈）とともにインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＲ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５－１１６－１４６）を加えた。暗所で、４℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、細胞を３回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中で再懸濁させた。蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ－ＨＴＳ機器を用いて測定し、ＭＦＩ（平均蛍光強度）を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、Ｕ２６６細胞への最大抗ＢＣＭＡ結合の５０％を達成する抗体濃度としてのＥＣ５０値を報告した。結果を、図２に示した。
【0138】
結果は、マウス抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２が、ヒトＢＣＭＡに特異的に結合したことを示した。図１において、Ｂ１Ｈ２は、捕捉ＥＬＩＳＡにおいて陽性対照より低いＥＣ５０を有していた。図２によれば、本開示のマウス抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２は、ベンチマークより低いＥＣ５０及び高いＢｍａｘで細胞表面においてヒトＢＣＭＡに結合した。データは、Ｂ１Ｈ２抗体が、より良好なＢＣＭＡ結合能力を有していたことを示唆した。
【0139】
実施例４ マウス抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の競合ＥＬＩＳＡ
４．１ リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ
ＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合をブロックする本開示の抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。簡潔に述べると、１００μｌのヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ）を、３７℃で２時間にわたって、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中２μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上で被覆した。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で洗浄し、３７℃で２時間にわたって、ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳でブロックした。次に、プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。
４．１ リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ
ＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ結合をブロックする本開示の抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した。簡潔に述べると、１００μｌのヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ）を、３７℃で２時間にわたって、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液中２μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上で被覆した。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で洗浄し、３７℃で２時間にわたって、ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳でブロックした。次に、プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。
【0140】
２．５％ ｗ／ｖの無脂肪乳とともに、ＰＢＳＴ中の連続希釈された抗ＢＣＭＡ Ｂ１Ｈ２抗体又は対照（４倍連続希釈で２００ｎＭから出発する）を、ＢＣＭＡ－ｈｉｓ結合プレートに、ウェル当たり１００μｌで加え、４０分間にわたって３７℃で、ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質とともにインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて４回洗浄し、次に、１００μｌ／ウェルの１０．５ｎｇ／ｍＬのビオチン標識ＢＡＦＦ－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃１００５６－Ｈ０１Ｈ）を加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。その後、プレートに、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰ（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃０１６－０３０－０８４）を加え、３７℃で４０分間にわたってインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止させた。各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ５０値を報告した。
【0141】
４．２ ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ
ベンチマーク－ヒトＢＣＭＡ結合をブロックする本開示の抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、ＢＣＭＡ ＢＭ１を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上で、ウェル当たり１００μｌで被覆し、３７℃で２時間にわたってインキュベートした。次に、プレートを、洗浄緩衝液で洗浄し、３７℃で２時間にわたって、ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳でブロックした。ブロックしながら、本開示の抗ＢＣＭＡ抗体又は対照を、４倍連続希釈で、１００ｎＭから出発してビオチン標識ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、２．５％の無脂肪乳でＰＢＳＴ中３．３ｎｇ／ｍＬ）で希釈し、室温で４０分間インキュベートした。プレート洗浄の後、抗体／ビオチン標識ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓ混合物を、ウェル当たり１００μｌでＢＣＭＡ ＢＭ１被覆プレートに加えた。３７℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、プレートを、洗浄緩衝液を用いて洗浄した。次に、プレートに、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰを加え、３７℃で４０分間にわたってそれとともにインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止させた。各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ５０値を報告した。
ベンチマーク－ヒトＢＣＭＡ結合をブロックする本開示の抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２の能力を、競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡潔に述べると、ＢＣＭＡ ＢＭ１を、ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬで、９６ウェルマイクロプレート上で、ウェル当たり１００μｌで被覆し、３７℃で２時間にわたってインキュベートした。次に、プレートを、洗浄緩衝液で洗浄し、３７℃で２時間にわたって、ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳でブロックした。ブロックしながら、本開示の抗ＢＣＭＡ抗体又は対照を、４倍連続希釈で、１００ｎＭから出発してビオチン標識ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、２．５％の無脂肪乳でＰＢＳＴ中３．３ｎｇ／ｍＬ）で希釈し、室温で４０分間インキュベートした。プレート洗浄の後、抗体／ビオチン標識ヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓ混合物を、ウェル当たり１００μｌでＢＣＭＡ ＢＭ１被覆プレートに加えた。３７℃で４０分間にわたるインキュベーションの後、プレートを、洗浄緩衝液を用いて洗浄した。次に、プレートに、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジンコンジュゲートＨＲＰを加え、３７℃で４０分間にわたってそれとともにインキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを加え、反応を、１ＭのＨ２ＳＯ４を用いて停止させた。各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取り、次に、ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＩＣ５０値を報告した。
【0142】
２つのアッセイの結果を、図３及び４に要約した。
【0143】
抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２が、ＢＣＭＡ ＢＭ１よりわずかに高いブロッキング活性で、ＢＡＦＦへのヒトＢＣＭＡ結合をブロックすることができたことが、図３から分かる。
【0144】
図４は、抗体Ｂ１Ｈ２が、ヒトＢＣＭＡ－ＢＭ１結合をブロックすることができたことを示し、これは、それが、ＢＣＭＡ ＢＭ１が結合したのと同じ又は同様のエピトープに結合したことを示唆している。
【0145】
実施例５ キメラ抗体の生成
抗ＢＣＭＡマウスｍＡｂ Ｂ１Ｈ２の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、シーケンシングし、配列ＩＤ番号を、表１に要約した。
抗ＢＣＭＡマウスｍＡｂ Ｂ１Ｈ２の重鎖及び軽鎖の可変ドメインを、シーケンシングし、配列ＩＤ番号を、表１に要約した。
【0146】
重鎖及び軽鎖の可変ドメインをそれぞれ、ヒトＩｇＧ１重鎖（配列番号１２）及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号１３）にインフレームでクローニングし、ここで、可変領域のＣ末端が、それぞれの定常領域のＮ末端に連結された。
【0147】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結された重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域に連結された軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクターを、１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩで、１．１：１の軽鎖対重鎖構築物の比率で、５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中で一過性にトランスフェクトした。
【0148】
細胞上清を、振とうフラスコ中で６日後に収集し、沈降させて、細胞をペレット化し、次に、キメラ抗体を、細胞上清から精製した。
【0149】
実施例６ 抗ＢＣＭＡマウスモノクローナル抗体Ｂ１Ｈ２のヒト化
マウス抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２を、ヒト化し、さらに特性決定した。このマウス抗体のヒト化を、以下に詳細に記載される十分に確立されたＣＤＲグラフト方法を用いて行った。
マウス抗ＢＣＭＡ抗体Ｂ１Ｈ２を、ヒト化し、さらに特性決定した。このマウス抗体のヒト化を、以下に詳細に記載される十分に確立されたＣＤＲグラフト方法を用いて行った。
【0150】
マウス抗体Ｂ１Ｈ２のヒト化のための受容体フレームワークを選択するために、このマウス抗体Ｂ１Ｈ２の軽鎖及び重鎖可変領域配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラストした。最も高い相同性を有するヒト生殖細胞系列を、ヒト化のための受容体フレームワークとして選択した。マウス抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを、選択されたフレームワークに挿入し、フレームワーク中の残基を、より多い候補重鎖／軽鎖可変領域を得るようにさらに変異させた。合計で２５のヒト化Ｂ１Ｈ２抗体（すなわち、ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１からｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ２４及びｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３）が得られ、その重鎖／軽鎖可変領域配列を表１に示した。
【0151】
ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（配列番号１２）に連結されたヒト化Ｂ１Ｈ２重鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクター、及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号１３）に連結されたヒト化Ｂ１Ｈ２軽鎖可変領域をコードするヌクレオチドをそれぞれ含むベクターを、１ｍｇ／ｍｌのＰＥＩで、６０％対４０％の軽鎖対重鎖構築物の比率で、５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中で一過性にトランスフェクトした。
【0152】
実施例７ ヒト化Ｂ１Ｈ２抗体の特性決定
ヒト化抗体を含有する細胞上清を、振とうフラスコ中で６日後に収集し、後述されるプロトコルにしたがって、Ｏｃｔｅｃｔによって、ヒトＢＣＭＡに対する結合親和性について試験した。
ヒト化抗体を含有する細胞上清を、振とうフラスコ中で６日後に収集し、後述されるプロトコルにしたがって、Ｏｃｔｅｃｔによって、ヒトＢＣＭＡに対する結合親和性について試験した。
【0153】
Ｏｃｔｅｔ親和性試験を、Ｏｃｔｅｔシステム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ９６）を用いて行った。簡潔に述べると、ＡＨＣバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ製の抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ捕捉）を、３秒間にわたって１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）で予め浸漬させ、次に、３秒間にわたってランニングバッファー（ＰＢＳＴ中０．５％ ｗ／ｖのＢＳＡ）で、ウェル中でディッピングし、浸漬及びディッピング工程を、３回繰り返した。次に、センサーを、１００秒間にわたって、ヒト化抗体、１０μｇ／ｍｌでＨＢＳ－ＥＰ＋中のキメラＢ１Ｈ２抗体、又は１０μｇ／ｍｌでＨＢＳ－ＥＰ＋中のＢＣＭＡ ＢＭ１を含有する細胞上清で、ウェル中でディッピングし、次に、５分間にわたってランニングバッファーを含むウェル中に沈めた。新たなベースラインを、ランニングバッファーを含む別のウェル中で１８０秒間試験した。次に、センサーを、１００秒間にわたってランニングバッファー中で希釈されたヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｈ５２２Ｙ、２倍連続希釈で、８０ｎＭから出発する）で、ウェル中でディッピングし、次に、１０分間にわたってベースラインウェルに沈めた。最後に、センサーを、３秒間にわたって１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）で予め浸漬させ、次に、３秒間にわたってランニングバッファーで、ウェル中でディッピングし、浸漬及びディッピング工程を、３回繰り返した。結合及び解離曲線を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ８．１評価ソフトウェアを用いて、１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。Ｋａ、Ｋｄ及びＫＤ値を決定し、以下の表３に要約した。
【0154】
データは、ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１からｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ７、ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１２及びｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３などの試験されるヒト化抗体が、キメラＢ１Ｈ２抗体と比較して、高い及び同等の結合親和性を示したことを示した。
【0155】
【表3】
【0156】
ヒト化抗体ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１０及びｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３を、上述されるように精製し、若干の修正を加えた上記の実施例におけるプロトコル及び後述されるプロトコルにしたがって、Ｂｉａｃｏｒｅ、捕捉ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、プロテインサーマルシフトアッセイ、細胞ベースの結合ＦＡＣＳ、競合ＥＬＩＳＡ、内在化媒介性細胞毒性及び抗体依存的細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて試験した。
【0157】
ＢＩＡｃｏｒｅアッセイでは、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ）を、ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりにＣＭ５チップに共有結合し、ＣＭ５チップを、プロテインＧチップの代わりにベンチマークに使用した。結果を、表５に示した。
【0158】
捕捉ＥＬＩＳＡでは、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－００５－０９８）を、ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的の代わりに、１００μｌ／ウェルで使用した。結果を、図５に示した。
【0159】
カニクイザルＢＣＭＡタンパク質への抗体の結合能力を試験するための間接ＥＬＩＳＡを、以下のように行った。簡潔に述べると、９６ウェルマイクロプレートを、３７℃で２時間にわたって、ＰＢＳ中の１００μｌの２μｇ／ｍｌのカニクイザルＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ＢＣＡ－Ｃ５２Ｈ７）で被覆した。プレートを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０、ＰＢＳＴ）で１回洗浄し、次に、３７℃で２時間にわたって２００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（ＰＢＳＴ中５％ ｗ／ｖの無脂肪乳）でブロックした。プレートを再度洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、１００μｌ／ウェルの、本開示の連続希釈された抗ＢＣＭＡ抗体、ＢＣＭＡ ＢＭ１又は陰性対照ｈＩｇＧ（静脈注射用のヒト免疫グロブリン（ｐＨ４）、Ｈｕａｌａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｉｎｃ．）（１００００ｎｇ／ｍｌから出発して、２．５％の無脂肪乳でＰＢＳＴ中５倍希釈）とともにインキュベートした。ＥＬＩＳＡプレートを、４回洗浄し、３７℃で４０分間にわたって、ペルオキシダーゼＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的（ＰＢＳＴ緩衝液中１：５０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－０３６－０９８、１００μｌ／ウェル）とともにインキュベートした。最後の洗浄の後、プレートを、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ）とともにインキュベートした。反応を、５０μｌ／ウェルの１ＭのＨ２ＳＯ４で、室温で３～１０分後に停止させ、各ウェルの吸光度を、ＴＭＢについて４５０ｎｍ及び基準波長として６３０ｎｍの二波長モードを用いて、マイクロプレートリーダーで読み取った。ＯＤ（４５０～６３０）値を、抗体濃度に対してプロットした。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ５０値を報告した。結果を、図６に示した。
【0160】
細胞ベースの結合ＦＡＣＳにおいて、ヒトＢＣＭＡ（配列番号１６、ｕｎｉｐｒｏｔ ＃Ｑ０２２２３のアミノ酸残基１～１８４）を安定して発現するＢｉｏｓｉｏｎ社内調製２９３Ｆ－ＢＣＭＡ細胞を、Ｕ２６６細胞の代わりに、２×１０５個の細胞／ウェルで使用し、ここで、２９３Ｆ－ＢＣＭＡ細胞は、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書にしたがって、２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｉｎｃ．、Ｃａｔ＃ １１６２５０１９）を、ＮｏｔＩとＸｂａＩ部位との間にＢＣＭＡ（配列番号１６）コード配列が挿入されたｐｃＤＮＡ３．１プラスミドでトランスフェクトすることによって調製された。Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異的、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１０９－１１５－０９８）を、Ｒ－フィコエリトリンＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ'）２フラグメントヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）の代わりに、１００μｌ／ウェルで使用した。結果を、図７に示した。
【0161】
サーマルシフトアッセイでは、プロテインサーマルシフトアッセイを用いて、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｃａｔ＃ ３３０２２－Ｔ）を用いて溶融温度（Ｔｍ）を決定した。簡潔に述べると、ＧｌｏＭｅｌｔ（商標）色素を解凍し、室温に到達させた。色素を含むバイアルをボルテックスし、遠心分離した。次に、１０倍色素を、５μＬの２００倍色素を９５μＬのＰＢＳに加えることによって調製した。２μＬの１０倍色素に、１０μｇのヒト化抗体を加え、ＰＢＳを、２０μＬの総反応体積になるまで加えた。色素及び抗体を含む管を、短時間にわたって回転させ、表４中のパラメータを有する融解曲線プログラムを用いて設定されたリアルタイムＰＣＲサーモサイクラー（Ｒｏｃｈｅ、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ）に入れた。結果を、図１２Ａ及び図１２Ｂに示した。
【0162】
【表4】
【0163】
抗ＢＣＭＡヒト化抗体によって誘導されたＡＤＣＣ活性を、ルシフェラーゼ検出システム（Ｂｉｏ－Ｌｉｔｅ（商標）Ｌｕｃｉｄｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｅ６１２０）を用いて試験した。細胞膜上でＣＤ１６ａを安定して発現するエフェクター細胞株として、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６ａ安定細胞株（クローンＩＤ＃２Ｂ１－１Ｄ２）は、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の説明書にしたがって、ルシフェラーゼレポーター遺伝子ｌｕｃ２Ｐ（ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ））及びｐＵＮＯ１－ｈＦＣＧＲ３Ａｃプラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅ、Ｃａｔ＃ｐＵＮＯ１－ｈＦＣＧＲ３Ａｃ）の転写を駆動するＮＦＡＴ応答要素（ＮＦＡＴ－ＲＥ）を含んでいたｐＧＬ４．３０プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃ｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ）でＪｕｒｋａｔ細胞をトランスフェクトすることによって社内で作製された。特に、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９－１４１）が補充された１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃Ａ１０４９１－０１）中の標的細胞としての１．２５×１０４個の細胞Ｕ２６６細胞を、９６ウェルプレートに播種し、３７℃で、ＣＯ２培養器中で１時間にわたって、様々な濃度（１３３．３３ｎＭ、６６．６７ｎＭ、６．６７ｎＭ、０．６７ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００００１ｎＭ及び０．０ｎＭ）の５０μｌの抗ＢＣＭＡ抗体とともにインキュベートした。次に、プレートに、１０％のＦＢＳが補充された５０μＬのＲＰＭＩ１６４０培地中で７．５×１０４個のエフェクター細胞を加え、６：１のＥ／Ｔ比で標的細胞と混合した。混合物を、５％のＣＯ２で覆われた加湿雰囲気中で、３７℃で６時間インキュベートした。次に、ウェル当たり１００μｌの上清を廃棄した。プレートに、ルシフェラーゼ検出試薬（５０μＬ／ウェル、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｅ６１２０）を加え、それとともにインキュベートし、１０分後、Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダーによって分析した。発光シグナルのデータを、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、ＥＣ５０値を報告した。結果を、図１０Ａ及び図１０Ｂに示した。
【0164】
細胞ベースの内在化アッセイにおいて、抗ＢＣＭＡヒト化抗体を、Ｕ２６６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＩＢ－１９６）内でのそれらの内在化効率性について正確に評価した。まず、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＧ（３Ｃ）（社内で調製された、配列番号２３）の受容体結合ドメイン及びＣ１、Ｃ２、及びＣ３ドメインを欠くジフテリア毒素（ＤＴ）からなる、ＤＴ３Ｃと呼ばれる組換えタンパク質を合成した。次に、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃１００９９－１４１）が補充された１００μＬのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ＃Ａ１０４９１－０１）中の１．５×１０４個のＵ２６６細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃａｔ＃３９０３）の各ウェル上で平板培養した。一方、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中４０μｇ／ｍＬの、本開示の抗ＢＣＭＡ抗体又は対照を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地中４０μｇ／ｍＬのＤＴ３Ｃタンパク質と、１：１の体積比で混合し、室温で３０分間インキュベートした。次に、１００μｌの連続希釈された抗体／ＤＴ３Ｃ混合物（２０μｇ／ｍＬから出発して、培養培地中３倍連続希釈）を、細胞プレートに加え、７２時間にわたって３７℃で、ＣＯ２培養器中でインキュベートした。プレートに、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ＃Ｇ７５７０）を加え、１０分間インキュベートした。次に、細胞培養プレートを、Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００Ｐｒｏプレートリーダーによって分析した。データを、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、細胞生存について最大阻害の５０％を達成した抗体濃度としてのＩＣ５０値を報告した。ｍＡｂ－ＤＴ３Ｃコンジュゲートが、標的細胞によって内在化された場合、標的細胞生存は、著しく低下した。コンジュゲートが、内在化されなかった場合、遊離ＤＴ３Ｃは、全く又はほとんど細胞殺滅活性を有さなかった。データを、図１１及び表６に示した。
【0165】
【0166】
【表5】
【0167】
マウス、キメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体が、ＢＣＭＡ ＢＭ１と比較して、より高い結合親和性／能力を示したことが、表５及び図５及び７から分かる。
【0168】
抗ＢＣＭＡヒト化抗体ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１０及びｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３が、カニクイザルＢＣＭＡに結合しなかったことが、図６から分かる。
【0169】
図８は、マウス、キメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体が、対照抗体より高い、ＢＣＭＡ－ＢＡＦＦ相互作用に対するブロッキング能力を示したことを示した。
【0170】
さらに、図１０Ａ～図１０Ｂに示されるように、キメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体は、用量依存的に、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－ＣＤ１６ａ細胞によるＵ２６６細胞の殺滅を誘導した。特に、キメラ及びヒト化Ｂ１Ｈ２抗体は、低い用量で、ＢＣＭＡ ＢＭ１より高いＡＤＣＣを誘導した。
【0171】
Ｉ抗ＢＣＭＡ抗体－ＤＴ３Ｃコンジュゲートが、Ｕ２６６細胞によって内在化され、細胞死を引き起こした一方、組換えタンパク質ＤＴ３Ｃ単独又はアイソタイプ対照－ＤＴ３Ｃコンジュゲートは、Ｕ２６６細胞に侵入するのが難しく、低い細胞殺滅活性をもたらしたことが、図１１及び表６から分かる。ＢＣＭＡ ＢＭ１－ＤＴ３Ｃコンジュゲートと比較して、ｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ１０－ＤＴ３Ｃコンジュゲート及びｈｕＢ１Ｈ２－Ｖ３３－ＤＴ３Ｃコンジュゲートは、より低いＩＣ５０及びより高い最大細胞生存阻害を含む、より高い標的細胞殺滅活性を示した。
【0172】
【表6】
【0173】
【0174】
本開示は、１つ以上の実施形態とともに上述されているが、本開示が、それらの実施形態に限定されないことが理解されるべきであり、説明は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれ得る際、全ての代替例、修飾、及び均等物を包含することが意図される。本明細書に引用される全ての参照文献は、全体が参照によりさらに援用される。
【0175】
本出願中の配列が、以下に要約される。
【0176】
【表7】
【0177】
【表8】
【0178】
【表9】
【0179】
【表10】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【配列表】