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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-18
(45)【発行日】2024-03-27
(54)【発明の名称】第Ｘａ因子のための新規な化学発光基質
(51)【国際特許分類】
C07D 277/66 20060101AFI20240319BHJP
C07K 5/10 20060101ALI20240319BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20240319BHJP
G01N 21/76 20060101ALI20240319BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240319BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240319BHJP
【ＦＩ】
C07D277/66 CSP
C07K5/10
C12Q1/66 ZNA
G01N21/76
G01N33/50 T
G01N33/68
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2021546466
(86)(22)【出願日】2019-10-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-01-19
(86)【国際出願番号】 EP2019078224
(87)【国際公開番号】W WO2020079155
(87)【国際公開日】2020-04-23
【審査請求日】2022-10-12
(31)【優先権主張番号】18201051.2
(32)【優先日】2018-10-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】521161727
【氏名又は名称】エンザイヤ ビー．ブイ．
【氏名又は名称原語表記】ＥＮＺＹＲＥ Ｂ．Ｖ．
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】ファン ヘールデ， ワーンデル ローレンス
(72)【発明者】
【氏名】ファン ゲッフェン， マーク
(72)【発明者】
【氏名】ステーグス， ダニーク
【審査官】藤代 亮
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１４－５０２４９２（ＪＰ，Ａ）
【文献】Biolumin. Chemilumin.: Instrum. Appl. ，1985年，Volume 2，Pages 25-39
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ ２７７／６６
Ｃ０７Ｋ ５／１０
Ｃ１２Ｑ １／６６
Ｇ０１Ｎ ２１／７６
Ｇ０１Ｎ ３３／５０
Ｇ０１Ｎ ３３／６８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（Ｉ－３）若しくは（Ｉ－４）【化1】
（式中、
ｒは、０、１、２又は３であり、
ｒ’は、０、１、２又は３であり、
ｄは、０、１又は２であり、
ｇは、０又は１であり、
ｇ’は、０又は１であり、
Ｘは、ＮＨ２、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨ及びＮＰ’（式中、Ｐ’はアミン保護基である）から選択される末端部分である）
の化合物又はその生理学的に許容される塩。
【請求項2】
ｄが、０又は１、好ましくは１である、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
ｒが、１若しくは２であるか、又はｇが１であり、好ましくはｒが１であり、より好ましくはｒが１であり、且つｇが１である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
一般式（Ｉ－３ｓ）又は（Ｉ－４ｓ）【化2】
（式中、ｒ、ｒ’、ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、請求項１～３のいずれか一項に定義された通りである）
の、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
一般式（ＩＩ－３）又は（ＩＩ－４）【化3】
（式中、ｒ、ｒ’、ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、請求項１～４のいずれか一項に定義された通りである）
の、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
一般式（ＩＩＩ－３）又は（ＩＩＩ－４）【化4】
（式中、
ｄは、０、１又は２であり、
ｒは、０、１、２又は３であり、
ｒ’は、０、１、２又は３であり、
ｇは、０又は１であり、
ｇ’は、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｐは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｓは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ａは、０又は１である）
の、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
ｄが、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又はｒが、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ｒ’が、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ｇが、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｇ’が、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｍが、０若しくは１であり、及び／又は
ｐが、１、２若しくは３、好ましくは２であり、及び／又は
ｓが、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ａが１である、請求項６に記載の化合物。
【請求項8】
ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ及びＭｅＰＥＧ２－ＩＤＧＲ【化5】
から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項9】
Ｐ’が、トリチル、アリル、ベンジル（Ｂｎ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２－トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、トシル（Ｔｓ）、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチル、フタルイミド、ベンジリデンアミン及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から、好ましくはベンジル（Ｂｎ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トシル（Ｔｓ）及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択され、より好ましくはＰ’がベンジルオキシカルボニルである、請求項１～５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項10】
ＨＣｌ塩、酢酸塩、ギ酸塩、ＴＦＡ塩及びメシル酸塩から任意選択で選択される酸付加塩、好ましくはＨＣｌ塩又はＴＦＡ塩、最も好ましくはＴＦＡ塩である、請求項１～９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物と、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる化合物とを含む組合せ。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物を含み、好ましくはポイントオブケアデバイスである、化学発光を測定するためのデバイス。
【請求項13】
サンプル中の凝固因子を定量する方法であって、ａ）前記サンプルを、請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、
ｂ）前記アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、
ｃ）前記ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップと
を含む、方法。
【請求項14】
前記凝固因子が、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、プレカリクレイン及びカリクレインから選択される、任意選択で、ステップａ）の間、前記組成物が、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第Ｘ因子、プレカリクレイン及びカリクレインから選択される少なくとも１つのさらなる凝固因子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
サンプル中の抗凝固剤を定量する方法であって、ａ）前記サンプルを、第Ｘａ因子と請求項１～１０のいずれか一項に記載の化合物とを含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、
ｂ）前記アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、
ｃ）前記ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップと
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
［発明の分野］
本発明は、血液凝固酵素第Ｘａ因子の監視に適した化学発光基質分子に関する。化学発光基質は、凝固因子のアッセイと、サンプル中の抗凝固剤の定量とに特に有用である。
本発明は、血液凝固酵素第Ｘａ因子の監視に適した化学発光基質分子に関する。化学発光基質は、凝固因子のアッセイと、サンプル中の抗凝固剤の定量とに特に有用である。
【0002】
［背景技術］
凝固としても既知の血液の凝固は、液体からゲルへの血液の変換であり、血餅を生じる。凝固は止血過程の一部であり、最終的に過剰な失血を防ぐ。凝固は、血管の内皮層が損なわれた後間もなく始まる。内皮下腔の曝露は、組織因子への血漿第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の結合につながり、最終的にフィブリン形成につながる。いわゆる一次止血において、血小板が損傷部位において血栓をすぐに形成する。いわゆる二次止血が同時に起こり、凝固因子が複雑なカスケードで反応してフィブリン線維を形成し、血小板血栓を強化する。凝固は、生物学全体を通じて高度に保存されている。
凝固としても既知の血液の凝固は、液体からゲルへの血液の変換であり、血餅を生じる。凝固は止血過程の一部であり、最終的に過剰な失血を防ぐ。凝固は、血管の内皮層が損なわれた後間もなく始まる。内皮下腔の曝露は、組織因子への血漿第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）の結合につながり、最終的にフィブリン形成につながる。いわゆる一次止血において、血小板が損傷部位において血栓をすぐに形成する。いわゆる二次止血が同時に起こり、凝固因子が複雑なカスケードで反応してフィブリン線維を形成し、血小板血栓を強化する。凝固は、生物学全体を通じて高度に保存されている。
【0003】
第Ｘ因子（ＦＸ）は、凝固において重要なタンパク質である。ＦＸは、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）のチモーゲンである。ＦＸは、因子ＶＩＩ（ａ）との組織因子（ＴＦ）の複合体（ＦＶＩＩ（ａ））によって、又はテナーゼ複合体によって活性化することができる。テナーゼ複合体は、酵素としての活性化第ＩＸ因子（ＦＩＸａ）と、補因子としての活性化ＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩａ）と、負電荷を帯びたある一定の百分率のリン脂質を含むリン脂質表面とすべて結合したチモーゲンＦＸとを含む。テナーゼ複合体はＦＸをＦＸａへと変換する。
【0004】
ＦＸ又はＦＸａ活性の検出及び定量は、様々な理由で重要である。ＦＸａは、プロトロンビンを切断することにより作用し、活性トロンビンを与え、ＦＸはＦＸａのチモーゲンであり、したがってＦＸをＦＸａに変換することができる。したがって、それらの検出は、血液凝固動態の洞察を与える。ＦＸａ活性は、抗凝固活性の尺度として使用することもでき、ＦＸａ又はその生成の検出は、プロテインＣ及びプロテインＳのような抗凝固タンパク質の濃度を測定するのに適用することができる。最後に、ＦＸａは、ＦＸａに対するヘパリノイド又は直接経口抗凝固剤（ＤＯＡＣ）化合物のようないくつかの抗凝固薬の読出しとしても使用される。
【0005】
血液凝固因子を定量する方法は周知である（Ｓ．Ｓ．ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ、博士論文第１章、２００８、Ｒａｄｂｏｕｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ参照）。より新しいクラスのアッセイである包括的止血アッセイのための方法がＭ．ｖａｎ Ｇｅｆｆｅｎ（博士論文第２章及び第３章、２０１２、Ｒａｄｂｏｕｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ）により記述されている。従来、血液凝固因子の定量のためのこれらの既知の方法では、フィブリン形成が読出しとして測定される。或いは、ペプチドに結合されたパラニトロアニリンに基づく、後に開発された発色プローブは、トロンビンなどの酵素又はＦＸａによりペプチドが切断されると、パラニトロアニリン（ｐＮＡ）を遊離する。得られた色は定量することができ、酵素活性の尺度である。例は、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘから市販されているＳ－２７６５（Ｚ－Ｄ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ・２ＨＣｌである）及びＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘから市販されているＳ－２２２２（Ｂｚ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ・ＨＣｌを含む）である（ＩＥＧＲは配列番号１である）。
【0006】
発色試験は不利な点を有し、すなわち、発色試験の方法は光学密度の測定に依存するので、血塊形成のために濁るであろう混合物中で行うことができず、発色の黄色は、血漿の固有の黄色を妨害する。したがって発色試験は、脱線維素血漿中、したがって乏血小板血漿中で行われるべきである。さらに発色試験は、連続的な設定で測定することができないため、サブサンプリングを必要とする。乏血小板血漿（ＰＰＰ）から多血小板血漿（ＰＲＰ）、全血へと進むと、生理系は、体内で起こることをさらに表すようになるが、同時に、評価することが技術的により困難になる。
【0007】
蛍光発生基質の適用は、脱線維素されていない多血小板血漿及び全血における測定を可能にし、したがって、連続監視を可能にしながらアッセイ系を生理系に１ステップ近づけた。上記で引用したＶａｎ Ｂｅｒｋｅｌの論文は、トロンビン用蛍光発生プローブの開発について論じている。
【0008】
蛍光定量プローブａｂ２０４７１１が市販されている（Ａｂｃａｍ ＰＬＣ（英国）製）。この第Ｘａ因子活性アッセイキット（蛍光定量）（ａｂ２０４７１１）は、合成基質を切断し、それによって蛍光リーダーにより定量することができるフルオロフォアを放出する第Ｘａ因子の能力を利用する。同様のキットがＭｅｒｃｋから入手可能である（カタログ番号ＭＡＫ２３８－１ＫＴ）。
【0009】
他の市販の基質は、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ製センソライト（ＳｅｎｓｏＬｙｔｅ）（登録商標）Ｒｈ１１０第Ｘａ因子アッセイキットであり、基質のＦＸａ切断後に検出することができるフルオロフォアを生成する蛍光発生基質を同じく使用する。センソライト（登録商標）５２０第Ｘａ因子アッセイキットは５－ＦＡＭ／ＱＸＬ（商標）５２０蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ペプチドを使用し、ここで５－ＦＡＭの蛍光は、ＱＸＬ（商標）５２０により消光される。インタクトなペプチドをＦＸａが２つの別々の断片に切断すると、５－ＦＡＭの蛍光が回復する。このＦＲＥＴペプチドは、試験化合物及び細胞成分の自己蛍光からのより少ない妨害を示す。国際公開第２００６／０７２６０２号は、１つのサンプル中のいくつかの生成物の検出を可能にする、異なる特徴を有する複数の蛍光発生基質の使用について記載している。
【0010】
蛍光発生基質は不利な点を有し、すなわち、凝固系の分析のための商業的プラットホームは蛍光定量分析を一般的にはサポートせず、したがって追加の計装を必要とする。加えて、可能な場合はすべての凝固試験を１つの分析装置で実施して、試験を単純化し、且つ労力を最小化することが望まれている。したがって、包括的アッセイを測定するための別々の機器の使用は、ルーチン法としての機器の適用可能性を低減する。さらに、蛍光シグナルは、内部フィルター効果及び消光効果のために生成物濃度と直線的ではないという欠点を有する。
【0011】
発光基質は、これらの不利な点を有さない。発光基質は、発色基質又は蛍光発生基質よりも敏感であり、複雑なフィルター又は励起源を必要としない。米国特許第５０３５９９９号は発光基質に関するが、この発光基質は、水様溶液（血漿など）中の測定に適しておらず、連続測定にも適していない。国際公開第２０１２０９６５６６号は、トロンビン用又はプラスミン用基質に関する。Ｃｏｓｂｙら（「Ｃｕｓｔｏｍ ｅｎｚｙｍｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙｓ」、Ｃｅｌｌ Ｎｏｔｅｓ、１８号、９～１１ページ、２００７）は発光基質に関するが、この発光基質は、水様溶液（血漿など）中の測定に適しておらず、連続測定にも適していない。乏しい溶解度は、アッセイの生理学的条件を損なう有機共溶媒をしばしば必要とするか、又はより大量のサンプル、若しくはより大量の試薬の添加を必要とする。
【0012】
多くの臨床例（例えば、小児の採血において、家庭状況におけるポイントオブケア監視、救急ヘリコプターを使用したアウトバウンドクリティカルケア状況において）にとって、より小さい反応体積を必要とする、したがって、より少ない血液を必要とする凝固因子用診断試験を有することが望ましいであろう。このシステムは、その設計がかなり単純であるべきであり、且つ高度な技術を必要とすべきではなく、（使い捨ての）オールインワンのポイントオブケアデバイスにおいてこのシステムを適用可能にすべきである。さらに、プローブは、広いダイナミックレンジ、好ましくは既存のアッセイによって実現されるダイナミックレンジの３桁超を可能にすべきである。プローブは、ＦＸａなどのその酵素に特異的であるべきであり、且つ小さいサンプル体積中でその使用を可能にするように敏感であるべきである。リアルタイム測定の可能化は、この新しいプローブが使用され得るアッセイの柔軟性を改善するであろう。
【0013】
上記で示された欠点を有さない、すなわち、より単純であるべきであり、且つ直接的な方法で、好ましくは線形モードで血液凝固因子及び線溶因子の生成を測定可能であるべきである、ＦＸａ生成及び／又は他の血液凝固因子若しくはその活性の測定値を測定するための新しいアッセイが必要とされている。本発明の目的は、そのようなアッセイのための基質及び方法を提供することである。
【0014】
［発明の概要］
本発明は、医学に関するアッセイにおける使用のための基質としての新しい分子の分野にあり、特に血液凝固の分野にある。新しい分子は、適切な酵素により切断されると、化学発光物質を放出する。より詳細には、新しい分子は、止血因子の活性を直接測定する新規な方法において使用することができる。より正確には、本発明は、凝固因子を定量するための方法における使用のための分子、又は包括的アッセイにおいてＦＸａ生成を分析するための方法における使用のための分子に関する。定量される凝固因子は、少なくとも凝固促進因子ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ並びに抗凝固因子アンチトロンビン、プロテインＣ及びプロテインＳである。本発明は、Ｘａに対するヘパリノイド及び直接経口抗凝固剤（ＤＯＡＣ）を定量するための方法にも関する。
本発明は、医学に関するアッセイにおける使用のための基質としての新しい分子の分野にあり、特に血液凝固の分野にある。新しい分子は、適切な酵素により切断されると、化学発光物質を放出する。より詳細には、新しい分子は、止血因子の活性を直接測定する新規な方法において使用することができる。より正確には、本発明は、凝固因子を定量するための方法における使用のための分子、又は包括的アッセイにおいてＦＸａ生成を分析するための方法における使用のための分子に関する。定量される凝固因子は、少なくとも凝固促進因子ＦＩＸ、ＦＶＩＩＩ、ＦＶＩＩ並びに抗凝固因子アンチトロンビン、プロテインＣ及びプロテインＳである。本発明は、Ｘａに対するヘパリノイド及び直接経口抗凝固剤（ＤＯＡＣ）を定量するための方法にも関する。
【0015】
１つの態様において、本発明は、一般式（Ｉ－３）若しくは（Ｉ－４）
（式中、ｒは、０、１、２又は３であり、ｒ’は、０、１、２又は３であり、ｄは、０、１又は２であり、ｇは、０又は１であり、ｇ’は、０又は１であり、Ｘは、ＮＨ２、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨ及びＮＰ’（式中、Ｐ’はアミン保護基である）から選択される末端部分であり、任意選択で、アミノルシフェリン部分は、異なる化学発光アミンによって置き換えられている）の化合物又はその生理学的に許容される塩に関する。
【化1】
（式中、ｒは、０、１、２又は３であり、ｒ’は、０、１、２又は３であり、ｄは、０、１又は２であり、ｇは、０又は１であり、ｇ’は、０又は１であり、Ｘは、ＮＨ２、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨ及びＮＰ’（式中、Ｐ’はアミン保護基である）から選択される末端部分であり、任意選択で、アミノルシフェリン部分は、異なる化学発光アミンによって置き換えられている）の化合物又はその生理学的に許容される塩に関する。
【0016】
別の態様において、本発明は、第１の態様に定義された化合物と、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる化合物とを含む組合せに関する。好ましい実施形態において、組合せは、第１の態様の化合物を含む、化学発光を測定するためのデバイスに関する。
【0017】
別の態様において、本発明は、サンプル中の凝固因子を定量する方法であって、ａ）サンプルを、第１の態様の化合物を含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、ｂ）アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、ｃ）ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップとを含む、方法に関する。ステップａ）においてＦＸａが用意されたとき、この方法を使用して、サンプル中の抗凝固剤を定量することができる。
【0018】
［実施形態の説明］
本発明者らは、化学発光化合物の一クラスを止血アッセイにおいて使用して、ＦＸａ活性を検出することができるか、又はＦＸａ検出を介して他の因子の活性を間接的に検出することができることを驚くべきことに見出した。したがって、第１の態様において、本発明は、一般式（Ｉ－３）若しくは（Ｉ－４）
（式中、
ｒは、０、１、２又は３であり、
ｒ’は、０、１、２又は３であり、
ｄは、０、１又は２であり、
ｇは、０又は１であり、
ｇ’は、０又は１であり、
Ｘは、ＮＨ２、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨ及びＮＰ’（式中、Ｐ’はアミン保護基である）から選択される末端部分であり、
任意選択で、アミノルシフェリン部分は、異なる化学発光アミンによって置き換えられており、
任意選択で、カルボン酸部分は、Ｃ１－４アルカノールでエステル化されている）
の化合物又はその生理学的に許容される塩を提供する。そのような化合物は、以下、本発明による化合物と呼ばれる。
本発明者らは、化学発光化合物の一クラスを止血アッセイにおいて使用して、ＦＸａ活性を検出することができるか、又はＦＸａ検出を介して他の因子の活性を間接的に検出することができることを驚くべきことに見出した。したがって、第１の態様において、本発明は、一般式（Ｉ－３）若しくは（Ｉ－４）
【化2】
（式中、
ｒは、０、１、２又は３であり、
ｒ’は、０、１、２又は３であり、
ｄは、０、１又は２であり、
ｇは、０又は１であり、
ｇ’は、０又は１であり、
Ｘは、ＮＨ２、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨ及びＮＰ’（式中、Ｐ’はアミン保護基である）から選択される末端部分であり、
任意選択で、アミノルシフェリン部分は、異なる化学発光アミンによって置き換えられており、
任意選択で、カルボン酸部分は、Ｃ１－４アルカノールでエステル化されている）
の化合物又はその生理学的に許容される塩を提供する。そのような化合物は、以下、本発明による化合物と呼ばれる。
【0019】
一般式Ｉ－３の化合物は、アミド結合を介して化学発光アミンに結合されたトリペプチドを含む。一般式Ｉ－４の化合物は、アミド結合を介して化学発光アミンに結合されたテトラペプチドを含む。Ｘがアミノ酸を形成している場合、一般式Ｉ－３についてはトリペプチドという用語が、一般式Ｉ－４についてはテトラペプチドという用語が依然として使用され、テトラペプチドはトリペプチドを含むが、これらの用語が一般にトリペプチド及びテトラペプチドを指す代わりに一般式Ｉ－３又はＩ－４の構造体を指すことが意図されるときは文脈から明らかになる。一般式Ｉ－３及びＩ－４は多くの特徴を共有する。したがって、本明細書において用いられるとき、－３又は－４などの表示がない一般式への言及は、その一般式の－３及び－４バリアントの両方に関することが意図される。例えば、一般式Ｉは、Ｉ－３及びＩ－４の両方に関し、一般式Ｉｓは、Ｉ－３ｓ及びＩ－４ｓの両方に関する。参照を容易にするため、トリペプチド又はテトラペプチド中に存在するアミノ酸は、化学発光アミンに直接隣接するカチオン性アミノ酸から始まる番号が付けられる。したがって、Ｘに結合された残基は、一般式Ｉ－３では残基３であり、一方、一般式Ｉ－４では残基４である。
【0020】
化学発光分子は、当技術分野において既知である。化学発光アミンの例は、ホタルルシフェリン、ラチアルシフェリン、バクテリアルルシフェリン、セレンテラジン、シプリジンルシフェリン又は３－ヒドロキシヒスピジンのアミンなどのルシフェリンのアミンである。化学発光アミンは、好ましくは２－（６－アミノ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－４，５－ジヒドロチアゾール－（４／５）－カルボン酸などのホタルルシフェリンのアミノルシフェリン又は任意選択でそのＣ１－４アルキルエステル、より好ましくは（４Ｓ）－２－（６－アミノ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－４，５－ジヒドロチアゾール－４－カルボン酸又は任意選択のそのＣ１－４アルキルエステルなどの２－（６－アミノ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－４，５－ジヒドロチアゾール－４－カルボン酸又は任意選択でそのＣ１－４アルキルエステル、最も好ましくは（４Ｓ）－２－（６－アミノ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－４，５－ジヒドロチアゾール－４－カルボン酸である。
【化3】
【0021】
好ましい実施形態において、一般式（ＩＩ－３）又は（ＩＩ－４）：
（式中、ｒ、ｒ’、ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、本明細書の他の場所に定義された通りであり、好ましくはアミノルシフェリン部分の４－カルボン酸はＳである）
の、本発明による化合物が提供される。
【化4】
（式中、ｒ、ｒ’、ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、本明細書の他の場所に定義された通りであり、好ましくはアミノルシフェリン部分の４－カルボン酸はＳである）
の、本発明による化合物が提供される。
【0022】
化学発光アミンは、本発明による化合物に含まれているとき、化学発光アミンの対応するルシフェラーゼ酵素に対する基質ではあり得ない。ＦＸａによる切断は、化学発光アミンを遊離し、且つ対応する酵素による変換を可能にして、光子の放出、又は言い換えれば光量子の発生につながる。
【0023】
本発明による化合物はカルボン酸部分を有することができる。任意選択で、カルボン酸部分をＣ１－４アルカノールでエステル化することができる。Ｃ１－４アルカノールの例は、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、ｎ－ブタノール、ブタン－２－オール及びイソブタノールである。この文脈において、好ましいＣ１－４アルカノールはメタノールである。Ｃ１－４アルカノールは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のフッ素などのハロゲン原子で任意選択で置換されており、且つメトキシ又はエトキシで任意選択で置換されている。Ｃ１－４アルカノールは、任意選択でビニルアルコール又はアリルアルコールなどの不飽和でもあり得る。本発明による化合物は、そのようなエステル及び遊離酸の混合物、例えば、一般式Ｉ－４又は０－４の３位におけるメチルエステルの１：１混合物であり得る。
【0024】
したがって、本発明による化合物は、一般式０：
（式中、ｒ、ｒ’ ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、上記で定義された通りであり、Ｒは、Ｈ又はＣ１－４アルキルであり、好ましくはＲはＨである）
により表すこともできる。Ｃ１－４アルキルは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のフッ素などのハロゲン原子で任意選択で置換されており、且つメトキシ又はエトキシで任意選択で置換されている。Ｃ１－４アルキルは、任意選択でビニル又はアリルなどの不飽和でもあり得る。
【化5】
（式中、ｒ、ｒ’ ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、上記で定義された通りであり、Ｒは、Ｈ又はＣ１－４アルキルであり、好ましくはＲはＨである）
により表すこともできる。Ｃ１－４アルキルは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又は９個のフッ素などのハロゲン原子で任意選択で置換されており、且つメトキシ又はエトキシで任意選択で置換されている。Ｃ１－４アルキルは、任意選択でビニル又はアリルなどの不飽和でもあり得る。
【0025】
本発明による化合物は、生理学的に許容される塩であり得る。そのような塩は、当技術分野において既知であり、当業者は、適した塩形態を選択することができる。この文脈において、生理学的に許容される塩は、本明細書において後に例示されるようにアッセイにおいて基質として依然として使用することができる塩である。生理学的に許容される塩の例は、ナトリウム塩又はカリウム塩などの酸付加塩又はアルカリ塩である。酸付加塩が好ましい。適した酸付加塩は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、トリフルオロ酢酸、メシル酸、トシル酸、又はＨＢｒ若しくはＨＣｌなどのハロゲン化水素酸の付加により生成された塩である。好ましい実施形態において、ＨＣｌ塩、酢酸塩、ギ酸塩、ＴＦＡ塩及びメシル酸塩から任意選択で選択される酸付加塩、好ましくはＨＣｌ塩又はＴＦＡ塩、最も好ましくはＴＦＡ塩である、本発明による化合物が提供される。
【0026】
一般式Ｉ－４の化合物の第３の残基は、１、２又は３メチレン単位長であり得る側鎖を有する。これはｄが０、１又は２であるからである。第３の残基は、ｄが０であるときアスパラギン酸であり得、第３の残基は、ｄが１であるときグルタミン酸であり得る。そのような化合物は良好な結果を示した。したがって、好ましい実施形態において、ｄが、０又は１、好ましくは１である、本発明による化合物が提供される。
【0027】
一般式Ｉの第１の残基はカチオン性側鎖を有し、一般式Ｉ－３の第３の残基もカチオン性側鎖を有する。これらのカチオン性側鎖は、ｇ又はｇ’が０であるとき一級アミンに基づき得、ｇ又はｇ’が１であるときグアニジン部分に基づき得る。ｇが１である基質は、ＦＸａに対する良好な親和性を有し、したがって、好ましい実施形態において、ｇは１である。好ましい実施形態において、ｇ’は１である。より好ましい実施形態において、ｇ及びｇ’は１である。アルギニンではｒが１でありｇが１であるので、ｇが１であるとき、ｒが１であることが好ましい。同様に、リシンではｒが２でありｇが０であるので、ｇが０であるとき、ｒが２であることが好ましい。同様に、ｇ’が１であるとき、ｒ’が１であることが好ましい。同様に、ｇ’が０であるとき、ｒ’が２であることが好ましい。好ましい実施形態において、ｒが、１若しくは２であるか、又はｇが１であり、好ましくはｒが１であり、より好ましくはｒが１であり、且つｇが１である、本発明による化合物が提供される。
【0028】
ＦＸａを含むセリンプロテアーゼ活性の定量にアルギニン及びリシンが好ましい。より速く作用する基質が望ましいとき、アルギニンが好ましい可能性がある。より遅く作用する基質が望ましいとき、リシンが好ましい可能性がある。ＦＸａに対する本発明による化合物の親和性はアッセイパラメータに影響がある。包括的アッセイについては、より低い親和性を有する基質が望ましい。定量的アッセイについては、より高い親和性を有する基質が望ましい。
【0029】
特定のキラリティーを有する基質は、ＦＸａに対する改善された親和性を有することが見出された。好ましくは、第１の残基はＬである。側鎖がなく、したがってグリシンと言える第２の残基に対するキラル選好は存在しない。第３の残基に対する一般的な選好は存在しないが、トリペプチドを含む一般式については、第３の残基は好ましくはＤであり、一方、テトラペプチドを含む一般式については、第３の残基は好ましくはＬである。第４の残基は好ましくはＬである。したがって、好ましい実施形態において、本発明による化合物は、Ｌである第１の残基を有する。より好ましい実施形態において、本発明による化合物は、一般式Ｉ－３の化合物であるとき、Ｌである第１の残基と、Ｄである第３の残基とを有するか、又は一般式Ｉ－４の化合物であるとき、Ｌである第３及び第４の残基を有する。したがって、好ましい実施形態において、一般式（Ｉ－３ｓ）又は（Ｉ－４ｓ）
（式中、ｒ、ｒ’、ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、本明細書の他の場所に定義された通りである）
の、本発明による化合物が提供される。
【化6】
（式中、ｒ、ｒ’、ｄ、ｇ、ｇ’及びＸは、本明細書の他の場所に定義された通りである）
の、本発明による化合物が提供される。
【0030】
Ｘは、ＮＨ２、ＯＨ、Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨ及びＮＰ’（式中、Ｐ’はアミン保護基である）から選択される末端部分である。この文脈において、末端部分は、本発明による化合物の末端に必ずしもないが、一般式Ｉのトリペプチド又はテトラペプチドの末端（一般的にはＮ末端側）にある。（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６部分を含む末端部分が、良好な水性溶解度を有する本発明による化合物につながることが見出された。したがって、好ましくはＸは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ又はＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）である。
【0031】
Ｘが、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）又はＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨであるとき、Ｘは、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｏ）０－１モチーフのために、アミド又はカルバメートを介して本発明による化合物に結合されている。好ましくは、Ｘは、これらの場合アミドである。したがって、好ましい実施形態において、Ｘは、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキレン）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）又はＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキレン）ＯＨであり、より好ましくはＸは、ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６ＯＨ又はＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキレン）（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６Ｏ（Ｃ１－６アルキル）である。
【0032】
Ｘに含まれたとき、Ｃ１－６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソブチル、ｎ－ペンチル、ｔｅｒｔ－ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ－ペンチル、３－ペンチル、ｓｅｃ－イソペンチル、２－メチルブチル、ｎ－ヘキシル又はイソヘキシルであり得、好ましくはＣ１－６アルキルは、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル又はイソブチルであり、より好ましくはＣ１－６アルキルは、メチル、エチル、イソプロピル又はｔｅｒｔ－ブチル、最も好ましくはメチルである。
【0033】
Ｘに含まれたとき、Ｃ１－６アルキレンは、メチレン、メチルメチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、メチルエチレン、ｎ－ブチレン、１－メチルプロピレン、１，１－ジメチルエチレン、ｎ－ペンチレン、イソペンチレン、２－メチルブチレン、ｎ－ヘキシレン又はイソヘキシレンであり得、好ましくはＣ１－６アルキレンは、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、ｎ－ブチレン、ｎ－ペンチレン又はｎ－ヘキシレンであり、より好ましくはＣ１－６アルキレンは、メチレン、エチレン、ｎ－プロピレン、ｎ－ブチレン又はｎ－ペンチレン、最も好ましくはメチレンである。
【0034】
Ｘに含まれたとき、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６はエチレングリコール繰返しを表す。好ましくは、（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６は、（ＯＣＨ２ＣＨ２）２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）３、（ＯＣＨ２ＣＨ２）４又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）５、より好ましくは（ＯＣＨ２ＣＨ２）２、（ＯＣＨ２ＣＨ２）３又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）４、さらにより好ましくは（ＯＣＨ２ＣＨ２）２又は（ＯＣＨ２ＣＨ２）３、最も好ましくは（ＯＣＨ２ＣＨ２）２である。Ｘが（ＯＣＨ２ＣＨ２）１－６を含むとき、どのＣ１－６アルキレンも好ましくはメチレン又はエチレン、より好ましくはメチレンであり、どのＣ１－６アルキルも好ましくはメチル又はｔｅｒｔ－ブチル、より好ましくはメチルである。
【0035】
ＸはＮＰ’でもあり得る。Ｐ’はアミン保護基である。アミン保護基は、当技術分野において既知であり、且つアミン中の窒素原子並びに他の窒素原子を保護することができる。適したアミン保護基の例は、当技術分野において、例えばＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ及びＴ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅによりＧｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第４版、２００６（ＩＳＢＮ：９７８－０－４７１－６９７５４－１）において詳しく記述されている。当業者は、本発明に従って使用されるべき適した保護基を選択することができるであろう。適したアミン保護基の例は、トリチル、アリル、ベンジル（Ｂｎ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２－トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、トシル（Ｔｓ）、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチル、フタルイミド、ベンジリデンアミン及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）である。Ｐ’に好ましい基は、トリチル、アリル、ベンジル（Ｂｎ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トシル（Ｔｓ）及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）である。Ｐ’により好ましい基は、アリルオキシカルボニル及びｔ－ブチルオキシカルボニルである。Ｐ’は窒素に常に結合されており、アミン保護基の複数の例が、（当業者に理解されるように）単一のアミン又は窒素原子を保護することができ、アミン保護基は、ピリジン環内の窒素原子など、厳密にアミンではない窒素原子を保護することもできる。Ｐ’が結合されている窒素の正しい原子価を保つために水素が付加又は除去されるべきである。したがって、原子価が許せば、ＮＰ’をＮＨＰ’と交換することができ、ＮＨＰ’をＮＰ’と交換することができる。好ましい実施形態において、Ｐ’が、トリチル、アリル、ベンジル（Ｂｎ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、２－トリメチルシリルエチルオキシカルボニル、トシル（Ｔｓ）、アセチル（Ａｃ）、トリフルオロアセチル、フタルイミド、ベンジリデンアミン及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から、好ましくはベンジル（Ｂｎ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、トシル（Ｔｓ）及びアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択され、より好ましくはＰ’がベンジルオキシカルボニルである、本発明による化合物が提供される。
【0036】
好ましい実施形態において、Ｘは、一般式Ｘ－２：
（式中、ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ｐは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ｓは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ａは、０又は１であり、ｍ、ｓ又はｐに含まれたメチレン部分は、メチル、エチル又はイソプロピルで置換することができ、任意選択で、得られたアルキル部分又はアルキレン部分は、１個又は複数のフッ素又は塩素などのハロゲン原子で置換することができる）により表される。したがって、好ましい実施形態において、一般式（ＩＩＩ－３）又は（ＩＩＩ－４）
（式中、
ｄは、０、１又は２であり、
ｒは、０、１、２又は３であり、
ｒ’は、０、１、２又は３であり、
ｇは、０又は１であり、
ｇ’は、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｐは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｓは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ａは、０又は１であり、
ｍ、ｓ又はｐに含まれたメチレン部分は、メチル、エチル又はイソプロピルで置換することができ、任意選択で、得られたアルキル部分は、１個又は複数のフッ素又は塩素などのハロゲン原子で置換することができる）
の、本発明による化合物が提供される。正しい原子価を保つために水素原子を付加又は除去することができる。好ましくは、ｍに含まれたメチレン部分が置換されているとき、ｍは、１又は２であり、より好ましくは、ｍに含まれたメチレン部分が置換されているとき、ｍは２であり、酸素原子に隣接するメチレン部分は、１個又は２個のメチル部分で置換されている。これは、それぞれイソプロポキシ及びｔｅｒｔ－ブトキシを形成している。ｐが、１、２、３、４、５又は６であるとき、ｍが０、１又は２であることが好ましく、ｍが２であるとき、酸素原子に隣接するメチレン部分が１個又は２個のメチル部分で置換されていることが好ましい。
【化7】
（式中、ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ｐは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ｓは、０、１、２、３、４、５又は６であり、ａは、０又は１であり、ｍ、ｓ又はｐに含まれたメチレン部分は、メチル、エチル又はイソプロピルで置換することができ、任意選択で、得られたアルキル部分又はアルキレン部分は、１個又は複数のフッ素又は塩素などのハロゲン原子で置換することができる）により表される。したがって、好ましい実施形態において、一般式（ＩＩＩ－３）又は（ＩＩＩ－４）
【化8】
（式中、
ｄは、０、１又は２であり、
ｒは、０、１、２又は３であり、
ｒ’は、０、１、２又は３であり、
ｇは、０又は１であり、
ｇ’は、０又は１であり、
ｍは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｐは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ｓは、０、１、２、３、４、５又は６であり、
ａは、０又は１であり、
ｍ、ｓ又はｐに含まれたメチレン部分は、メチル、エチル又はイソプロピルで置換することができ、任意選択で、得られたアルキル部分は、１個又は複数のフッ素又は塩素などのハロゲン原子で置換することができる）
の、本発明による化合物が提供される。正しい原子価を保つために水素原子を付加又は除去することができる。好ましくは、ｍに含まれたメチレン部分が置換されているとき、ｍは、１又は２であり、より好ましくは、ｍに含まれたメチレン部分が置換されているとき、ｍは２であり、酸素原子に隣接するメチレン部分は、１個又は２個のメチル部分で置換されている。これは、それぞれイソプロポキシ及びｔｅｒｔ－ブトキシを形成している。ｐが、１、２、３、４、５又は６であるとき、ｍが０、１又は２であることが好ましく、ｍが２であるとき、酸素原子に隣接するメチレン部分が１個又は２個のメチル部分で置換されていることが好ましい。
【0037】
ａは、０又は１である整数であり、したがって、アミド部分をＸに導入することができる。ａが１である化合物が、その好都合な合成の利用可能性のために好ましい。
【0038】
ｓは、０、１、２、３、４、５、６又は６である整数である。ｓが０であり、且つａが１であるとき、Ｘはカルバメート部分を含む。他の例において、ｓは、存在するときオリゴエチレングリコール部分と、又は末端アルコール若しくはメチルエーテルとペプチドを結合するリンカー部分を形成することができる。ｓ内のメチレン部分は、メチル、エチル又はメトキシで任意選択で置換することができ、且つ１個又は複数のフッ素又は塩素などのハロゲン原子で任意選択で置換されている。ｐが、１、２、３、４、５又は６であるとき、ｓが０、１又は２であることが好ましく、より好ましくは１又は２、より好ましくは１である。ｐが、１、２、３、４、５又は６であるとき、ａが０であり、且つｓが０、１又は２であることが好ましく、より好ましくはａが１であり、且つｓが１又は２であり、より好ましくは１である。
【0039】
ｐは、０、１、２、３、４、５、６又は６である整数である。ｐは、本発明の化合物の水性溶解度に対してプラスの効果を有することができるオリゴエチレングリコール部分を形成することができる。ｐ内のエチレングリコール部分は、メチルで任意選択で置換することができ、且つ１個又は複数のフッ素又は塩素などのハロゲン原子で任意選択で置換されている。ｐは、好ましくは１、２、３又は４、より好ましくは１、２又は３、さらにより好ましくは２又は３、最も好ましくは２である。
【0040】
好ましい実施形態において、本発明は、一般式ＩＩＩ－３又はＩＩＩ－４
（式中、
ｄは、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｒは、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ｒ’は、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ｇは、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｇ’は、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｍは、０又は１であり、及び／又は
ｐは、１、２若しくは３、好ましくは２であり、及び／又は
ｓは、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ａは１である）
の化合物を提供する。
（式中、
ｄは、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｒは、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ｒ’は、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ｇは、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｇ’は、０若しくは１、好ましくは１であり、及び／又は
ｍは、０又は１であり、及び／又は
ｐは、１、２若しくは３、好ましくは２であり、及び／又は
ｓは、１若しくは２、好ましくは１であり、及び／又は
ａは１である）
の化合物を提供する。
【0041】
表１は、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の好ましい実施形態を示す。
【0042】
【表1】
【0043】
好ましい実施形態において、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の化合物は、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ、ＡＰ、ＡＵ、ＡＶ、ＡＷ及びＡＸから選択される。好ましい実施形態において、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の化合物は、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ及びＡＰから選択される。好ましい実施形態において、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の化合物は、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＮ及びＡＯから選択され、より好ましくはＡＦ、ＡＧ、ＡＮ及びＡＯから選択され、さらにより好ましくはＡＦ及びＡＮから選択され、最も好ましくはＡＮである。
【0044】
表２は、一般式Ｉ－３、Ｉ－３ｓ、ＩＩ－３又はＩＩＩ－３の好ましい実施形態を示す。
【0045】
【表2】
【0046】
表３は、一般式Ｘ－２の、Ｘの好ましい実施形態を示す。
【0047】
【表3】
【0048】
ｍが１又は２である表３の実施形態の好ましい実施形態において、ｍは１である。好ましくは、ｍが１又は２である表３の実施形態において、ｍが２であるとき、酸素原子に隣接するメチレン部分は、１個又は２個のメチル部分で置換されている。好ましい実施形態において、Ｘは、ＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ、ＸＢＶ、ＸＢＷ、ＸＢＸ、ＸＢＹ、ＸＢＺ、ＸＣＡ、ＸＣＢ、ＸＣＣ及びＸＣＤからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ及びＸＢＶからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＳ、ＸＢＴ及びＸＢＵからなる群から選択され、最も好ましくはＸＢＴである。
【0049】
好ましい実施形態において、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の化合物は、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ、ＡＰ、ＡＵ、ＡＶ、ＡＷ及びＡＸから選択され、最も好ましくはＡＮであり、ここで、Ｘは、ＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ、ＸＢＶ、ＸＢＷ、ＸＢＸ、ＸＢＹ、ＸＢＺ、ＸＣＡ、ＸＣＢ、ＸＣＣ及びＸＣＤからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ及びＸＢＶからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＳ、ＸＢＴ及びＸＢＵからなる群から選択され、最も好ましくはＸＢＴである。好ましい実施形態において、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の化合物は、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＡＭ、ＡＮ、ＡＯ及びＡＰから選択され、最も好ましくはＡＮであり、ここで、Ｘは、ＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ、ＸＢＶ、ＸＢＷ、ＸＢＸ、ＸＢＹ、ＸＢＺ、ＸＣＡ、ＸＣＢ、ＸＣＣ及びＸＣＤからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ及びＸＢＶからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＳ、ＸＢＴ及びＸＢＵからなる群から選択され、最も好ましくはＸＢＴである。好ましい実施形態において、一般式Ｉ－４、Ｉ－４ｓ、ＩＩ－４又はＩＩＩ－４の化合物は、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＭ、ＡＮ及びＡＯから選択され、最も好ましくはＡＮであり、ここで、Ｘは、ＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ、ＸＢＶ、ＸＢＷ、ＸＢＸ、ＸＢＹ、ＸＢＺ、ＸＣＡ、ＸＣＢ、ＸＣＣ及びＸＣＤからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＲ、ＸＢＳ、ＸＢＴ、ＸＢＵ及びＸＢＶからなる群から、より好ましくはＸＢＯ、ＸＢＰ、ＸＢＱ、ＸＢＳ、ＸＢＴ及びＸＢＵからなる群から選択され、最も好ましくはＸＢＴである。
【0050】
表４は、本発明による化合物の好ましい実施形態を示す。本発明によるより好ましい化合物は、表４に示された化合物の生理学的に許容される塩、より好ましくは酸付加塩、最も好ましくはＴＦＡ塩である。好ましい実施形態において、ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ、ＭｅＰＥＧ２－ＩＤＧＲ、ＭｅＰＥＧ３－ＩＥＧＲ、ＭｅＰＥＧ３－ＩＤＧＲ、ＭｅＰＥＧ２－ＲＧＲ、ＭｅＰＥＧ２－ＲＧＫ、ＭｅＰＥＧ３－ＲＧＲ及びＭｅＰＥＧ３－ＲＧＫから選択される、本発明による化合物が提供される。
【0051】
【表4】
【0052】
より好ましい実施形態において、化合物は、ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ、ＭｅＰＥＧ２－ＩＤＧＲ、ＭｅＰＥＧ３－ＩＥＧＲ、ＭｅＰＥＧ３－ＩＤＧＲ、ＭｅＰＥＧ２－ＲＧＲ及びＭｅＰＥＧ３－ＲＧＲから選択される。さらにより好ましい実施形態において、化合物は、ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ、ＭｅＰＥＧ２－ＩＤＧＲ、ＭｅＰＥＧ３－ＩＥＧＲ及びＭｅＰＥＧ３－ＩＤＧＲから選択される。最も好ましい実施形態において、ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ及びＭｅＰＥＧ２－ＩＤＧＲ、好ましくはＭｅＰＥＧ２－ＩＤＧＲ、より好ましくはＴＦＡ塩などのその生理学的に許容される塩から選択される、本発明による化合物が提供される。
【0053】
組合せ
別の態様において、本発明は、本発明による化合物と、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる化合物とを含む組合せを提供する。そのような組合せは、以下、本発明による組合せと呼ばれる。好ましくは、組合せは、ルシフェラーゼ、又は第Ｘａ因子などの凝固因子をさらに含み、最も好ましくはルシフェラーゼをさらに含む。好ましい実施形態において、本発明による組合せは、本発明による化合物、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子のそれぞれを含む。
別の態様において、本発明は、本発明による化合物と、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる化合物とを含む組合せを提供する。そのような組合せは、以下、本発明による組合せと呼ばれる。好ましくは、組合せは、ルシフェラーゼ、又は第Ｘａ因子などの凝固因子をさらに含み、最も好ましくはルシフェラーゼをさらに含む。好ましい実施形態において、本発明による組合せは、本発明による化合物、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子のそれぞれを含む。
【0054】
ルシフェラーゼは、基質としてルシフェリンを使用して生物発光を生じる酸化酵素のクラスの総称である。ルシフェラーゼは外部光源を必要としないが、ルシフェリン及びＯ２を必要とし、ＡＴＰもしばしば必要とする。Ｍｇ２＋は、ルシフェラーゼの発光収率を増加させることが既知である。ルシフェラーゼ及びそのアッセイは、当技術分野において既知であり、当業者は、本発明による化合物に含まれたルシフェリン基質との組合せに適したルシフェラーゼを選択することができる。ルシフェラーゼは、光量子の放出下、アミノルシフェリンが遊離された後、本発明による化合物に含まれたアミノルシフェリンをその酸化類似体へと変換できるべきである。適したルシフェラーゼは、ホタルルシフェラーゼ（ＥＣ １．１３．１２．７）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）－ルシフェリン２－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ １．１３．１２．５）及びメトリディア（Ｍｅｔｒｉｄｉａ）ルシフェラーゼ（ＭｅｔＬｕｃ）である。本発明による化合物が２－（６－アミノ－１，３－ベンゾチアゾール－２－イル）－４，５－ジヒドロチアゾール－（４／５）－カルボン酸部分を含むとき、ルシフェラーゼは好ましくはホタルルシフェラーゼである。ルシフェラーゼは、当技術分野において既知であるか、又はまだ発見若しくは工学されていない任意のルシフェラーゼでもよい。多くのルシフェラーゼが当技術分野において既知である。ルシフェラーゼは、例えばＰｒｏｍｅｇａ、Ｓｉｇｍａなどの製造者から商業的に得ることができる。ルシフェラーゼは、天然、組換え又は変異ルシフェラーゼでもよい。前記変異ルシフェラーゼは、そのルシフェラーゼ活性を保持する限りにおいて、好ましくは天然（組換え）ルシフェラーゼのルシフェラーゼ活性の少なくとも２５％、５０％、７５％を保持する限りにおいて、１つ又は複数のアミノ酸置換、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含む改変ルシフェラーゼでもよい。前記変異ルシフェラーゼは、ルシフェラーゼ活性を有する限りにおいて、任意の生物由来でもよい。好ましい実施形態において、ルシフェラーゼは、速く作用するルシフェラーゼであり、これは、ルシフェラーゼが定量的情報を与えるべきアッセイに特に適しており、その理由は、ルシフェラーゼの速い作用が、飽和しているか、又はその線形範囲外にあるルシフェラーゼによって引き起こされるおそれのある妨害を低減するからである。
【0055】
ＡＴＰは、ルシフェラーゼにより必要とされ、好ましくは、ルシフェラーゼ活性の可能化に適した量で本発明による組合せ中に存在するか、又はルシフェラーゼ活性を可能にする希釈液の調製に適した量で原液中に存在する。適したＡＴＰ原液は、蒸留水中の１ｍＭ溶液であるが、任意の生理学的に許容される溶媒系中の２００μＭ～１０ｍＭの範囲内の任意の原液であり得る。
【0056】
ルシフェラーゼにより生成された発光シグナルをマグネシウムイオンが強めることが見出されたため、本発明による組合せはマグネシウムイオンをさらに含んでもよい。しかし、Ｍｎ２＋などの他の二価カチオンを用いてこの効果を実現することも可能である（Ｒｏｄｉｏｎｏｖａ及びＰｅｔｕｓｈｋｏｖ、Ｊ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ Ｂ．、ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２００５．１２．０１４）。Ｍｇ２＋源はマグネシウムイオンの源であり、ルシフェラーゼの機能を向上させる。Ｍｇ２＋の好ましい源は、クエン酸マグネシウム、ＭｇＳＯ４、ＭｇＣＯ３、ＭｇＯ、ＭｇＣｌ２、ＭｇＦ２、ＭｇＩ２、ＭｇＢｒ２などのマグネシウム塩及びその水和物である。ＭｇＣｌ２、ＭｇＦ２、ＭｇＩ２、ＭｇＢｒ２であるハロゲン化マグネシウム及びその水和物がより好ましい。最も好ましいＭｇ２＋源は、ＭｇＣｌ２又はその水和物である。
【0057】
本発明による組合せは凝固因子をさらに含むことができる。凝固因子は、止血因子と呼ばれることがあり、当技術分野において周知である。適した凝固因子の例は、セリンプロテアーゼ、特にセリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．２１）の群であり、好ましくはトロンビン、ＦＸａ、プラスミン、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、血漿カリクレイン、第ＸＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）（好ましくは二本鎖ｔＰＡ（ｔｃ－ｔＰＡ））、活性化プロテインＣ及びウロキナーゼ（ｕＰＡ）（好ましくはｔｃ－ｕＰＡ）からなる群から選択される。プロトロンビン、ＦＸ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ、プレカリクレイン、ＦＸＩＩ、ＦＸＩ、ｓｃ－ｔＰＡ（一本鎖ｔＰＡ）、プロテインＣ及びｓｃ－ｕＰＡなど、セリンプロテアーゼのチモーゲンも包含される。非常に好ましい実施形態において、止血因子はＦＸａ又はＦＸである。好ましくは、存在する因子によりＦＸａを生成することができるか、又は本発明による組合せをさらなる凝固因子を含むサンプルと接触させたときＦＸａを生成することができるような組合せ中に凝固因子は存在する。そのような場合、サンプルは、カスケードから欠損している凝固因子を供給してＦＸａを生成し、サンプルとの接触は、ＦＸａ生成を可能にする。好ましくは、単一の因子のみを欠損するようなカスケード中に存在するすべての因子が、欠損している因子の予想される濃度に対して過剰に存在する。これにより、サンプルからの因子がその濃度に応じてＦＸａを生成することが可能となり、その後、ＦＸａは、その濃度に比例する、したがってサンプル中の因子の濃度に比例する発光シグナルを生成することができる。方法に関するセクションでは、そのような組成物を構成することができる方法についてより詳細に説明する。
【0058】
好ましい実施形態において、組合せの物質は、単一の組成物に含まれている。そのような組成物は、添加剤などのさらなる物質を含んでもよい。蒸留水などの水は適した添加剤である。他の適した添加剤は、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）などの緩衝塩である。
【0059】
他の好ましい実施形態において、組合せの物質は、別個の組成物に含まれている。これは、部品のキットの提供に好都合であり得る。好ましい実施形態において、本発明は、本発明による化合物と、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋源、及び第Ｘａ因子などの凝固因子からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる化合物とを含む部品のキットを提供する。
【0060】
特定の実施形態において、本発明は、本発明による化合物を含み、好ましくはポイントオブケアデバイスである、化学発光を測定するためのデバイスを提供する。そのようなデバイスは、以下、本発明によるデバイスと呼ばれる。
【0061】
本発明によるデバイスは、例えば、従来のベンチトップルミノメーター又は手術室内での使用のためのルミノメーターなどのルミノメーターであり得るか、又は光学顕微鏡であり得、好ましくはルミノメーターである。ルミノメーター及び顕微鏡は、当技術分野において既知であり、当業者は、本発明による化合物との使用に適しているルミノメーター又は顕微鏡を選択することができる。本発明によるデバイスは、本発明による化合物又は本発明による組合せを含む使い捨てか、又は使い捨てでないカートリッジ又はインサート又はキュベット又は反応器容積でもあり得る。そのようなデバイスは、好ましくは、従来のルミノメーター又は顕微鏡との使用のために設計される。
【0062】
好ましい実施形態において、本発明によるデバイスはポイントオブケアデバイスである。本明細書において後述するように本発明による方法を使用して測定することができる小さい体積は、本発明による方法をベッドサイド分析、現場での分析又は移動中の分析などのポイントオブケア分析に理想的に適したものにする。好ましいポイントオブケアデバイスは、移動式ルミノメーターを含み、現場で、又は移動中に、又はベッドサイドで得られるか、又は得られたサンプル中の酵素活性の測定に適している。
【0063】
好ましくは、本発明によるデバイスは、分析における使用のための光源を含まない。好ましくは、本発明によるデバイスは、複数のパラメータの同時分析に使用することができる複数の容積又はチャネルを有する。好ましくは、本発明によるデバイスは、高々１００、８０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５、４、３、２又は１μＬの体積のサンプルを、より好ましくは高々１５、１０、５、４、３、２又は１μＬの体積の、さらにより好ましくは高々５μＬの体積のサンプルを分析するように構成されている。好ましくは、本発明によるデバイスは、表示画面又はゲージ若しくはレベルインジケータを介するなどして、その分析出力をリアルタイムで提示するように構成されている。少なくとも２つの異なるアッセイ、好ましくはＦＶＩＩＩ活性又はＦＸａ活性などの酵素活性のための定量的アッセイと、血液凝固アッセイなどの包括的アッセイとの同時分析のために本発明によるデバイスが構成されているとき非常に好ましい。
【0064】
方法
さらなる態様において、本発明は、サンプル中の凝固因子を定量する方法であって、
ａ）サンプルを、本発明による化合物を含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、
ｂ）アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、
ｃ）ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
さらなる態様において、本発明は、サンプル中の凝固因子を定量する方法であって、
ａ）サンプルを、本発明による化合物を含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、
ｂ）アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、
ｃ）ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップと
を含む、方法を提供する。
【0065】
そのような方法は、以下、本発明によるアッセイと呼ばれる。この文脈において、凝固因子の定量は、凝固因子の活性の定量として理解することができる。チモーゲンの活性が決定されるとき、その対応する酵素の活性はアッセイの一部であることを当業者は理解するであろう。
【0066】
ルシフェラーゼが関与する化学発光の原理は当業者に周知である。ルシフェラーゼが関与する化学発光は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、ＡＴＰ、及び光子生成のための分子状酸素を典型的に使用し、Ｍｇ２＋は、反応の発光収率を改善することが既知である。ルシフェラーゼは、ＡＴＰへのルシフェリンの結合、並びにルシフェリル－ＡＭＰ中間体のその後の酸化を触媒する。最終的に、ルシフェラーゼは、酸化されたルシフェリン中間体が再配列してオキシルシフェリンと、高量子効率を有する単一光子とを生成する環境を提供する。そのような発光から生じた光強度は、遊離された発光分子の化学変換又は酵素変換に関与する成分の濃度に依存する。過剰なそのような成分を使用することにより、本発明の方法の発光シグナルは、本明細書において後述するように、関心のある止血因子、例えばＦＸａ又は別の因子による基質の切断による遊離発光分子の生成にのみ依存するようになる。したがって、そのような状況下では、光強度は前記止血因子の生成、例えばＦＸａ生成に比例する。したがって、関心のある凝固因子の濃度はアッセイの光出力に比例するため、本発明によるアッセイの設計を通じて関心のある凝固因子を定量することができる。
【0067】
本発明による化合物を使用することにより、血液凝固因子の生成を測定する発色法又は蛍光発生法に必要とされるような一次導関数の計算を必要とせずに、止血因子の生成、例えばＦＸａ生成を直接的であれ間接的であれ、又はＦＸａ濃度自体を、連続的に、半連続的に、又は直接的な方法で測定することができることを本発明者らは見出した。典型的には、関心のある止血因子により本発明の基質が切断されると、アミノルシフェリンである「発光分子」が遊離され、発光分子は、検出可能な光シグナル（又は「光量子」又は「光子」又は「光単位」）を生成するその後の化学変換又は酵素変換を受けやすい。光量子は不可逆ステップで生成されるため出力シグナルの蓄積がなく、出力シグナルはＦＸａ活性（したがって、おそらくＦＸａ生成に関与する因子の活性）の直接的な尺度である。任意の所与の時点で存在する止血因子の量に正比例するシグナルをリアルタイムで検出することができ、蓄積する光シグナルの一次導関数を計算する必要がないことは、蛍光基質又は発色基質を使用する既存の方法と比べて、本方法の著しい利点である。本方法では、光シグナルのさらなる生成による妨害がない。加えて、外部光源及び光学フィルターは光シグナルの測定に必要とされない。したがって、本発明の方法は先行技術の方法よりも好都合である。
【0068】
サンプルは、対象からのサンプルであり得、好ましくは対象からあらかじめ得られたサンプルである。対象はヒトであり得る。対象は非ヒトであり得る。サンプルは好ましくは流体である。好ましいサンプルは血液又は血液由来である。適したサンプルは、全血、及び乏血小板血漿又は多血小板血漿などの血漿である。最も好ましいサンプルは、対象からあらかじめ得られた乏血小板血漿などの乏血小板血漿である。
【0069】
凝固因子は、当技術分野において周知である。本発明によるアッセイの文脈において、好ましい凝固因子は、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、第ＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）、第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）、第ＶＩＩａ因子（ＦＶＩＩａ）、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）、第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）、第ＸＩＩａ因子（ＦＸＩＩａ）、第Ｘ因子（ＦＸ）及び第Ｘａ因子（ＦＸａ）である。ＦＸ（ａ）などの表記は、ＦＸ及びＦＸａの両方又はいずれかを参照する。
【0070】
凝固因子の生理学的役割は、トロンビン生成を最終的に可能にすることである。トロンビンは、そのフィードバック活性化の役割の点から、凝固カスケードの最も重要な構成要素である。ヒトでは、プロセスの一部は一般的には以下の通りである：他の任意の活性化凝固因子よりも多い量のＦＶＩＩａが流れている。血管への損傷に続いて、ＦＶＩＩ（ａ）は組織因子（ＴＦ）と接触することができ、最終的に活性化複合体（ＴＦ－ＦＶＩＩａ）を形成する。ＴＦ－ＦＶＩＩａはＦＩＸを活性化してＦＩＸａを生成し、且つＦＸを活性化してＦＸａを生成する。ＴＦ－ＦＶＩＩａによるＦＸの活性化（ＦＸａを生成する）は、ＴＦ－ＴＦＰＩ－ＦＸａ複合体内でＴＦ（組織因子）経路阻害剤（ＴＦＰＩ）により、ほとんどすぐに阻害される。ＦＸａ及びその補因子ＦＶａはプロトロンビナーゼ複合体を形成し、プロトロンビナーゼ複合体はプロトロンビンをトロンビンに活性化する。次いで、トロンビンは、（ＦＩＸとの複合体を形成する）ＦＶ及びＦＶＩＩＩを含む凝固カスケードの他の成分を活性化し、ＦＶＩＩＩを活性化してｖＷＦとの結合から放出し、ＦＶＩＩＩａを生成する。ＦＶＩＩＩａはＦＩＸａの補因子であり、一緒にこれらは「テナーゼ」複合体を形成し、テナーゼ複合体はＦＸを活性化し、サイクルを継続する。
【0071】
好ましい実施形態において、凝固因子が、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第Ｘ因子及び第Ｘａ因子から選択される、本発明によるアッセイが提供される。凝固因子はＦＸａであるべきであるか、又はＦＸａの形成に寄与すべきである。
【0072】
例えば、アッセイされる凝固因子がＦＸａであるときは、凝固因子はＦＸａである。アッセイされる凝固因子がＦＸａではないときは、凝固因子はＦＸａの形成に寄与すべきである。このため、ＦＸが存在すべきである。
【0073】
ある種の組合せにおいて、ＦＸａの生成は、テナーゼ複合体内のＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸのようないくつかの凝固因子又はＴＦ－ＦＶＩＩａ複合体内の組織因子若しくはＦＶＩＩａの濃度に比例する。欠損している因子を除くすべての因子が過剰に存在するときは、欠損している因子の活性は、発光出力により決定された最終的なＦＸａ活性に相関し得る。
【0074】
ＦＶＩＩａによるか、又はＴＦの存在下のＦＶＩＩａによりＦＸをＦＸａへと変換することができ、したがってＦＶＩＩａがアッセイされるとき、凝固因子はＦＸであるべきであり、これは、次いで、サンプル中のＦＶＩＩａが、過剰なＦＸをＦＸａへと変換することができるからである。
【0075】
いわゆるテナーゼ複合体内でＦＩＸａ及びＦＶＩＩＩａによりＦＸをＦＸａへと変換することもできる。テナーゼ複合体は、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸ、アニオン性リン脂質及びカルシウムからなる。したがって、ＦＩＸａがアッセイされるとき、凝固因子はＦＸ又はＦＶＩＩＩａであるべきであり、好ましくはＦＸ及びＦＶＩＩＩａの両方が存在すべきであり、より好ましくはアニオン性リン脂質及びカルシウムと共に存在すべきである。したがって、ＦＶＩＩＩａがアッセイされるとき、凝固因子はＦＸ又はＦＩＸａであるべきであり、好ましくはＦＸ及びＦＩＸａの両方が存在すべきであり、より好ましくはアニオン性リン脂質及びカルシウムと共に存在すべきである。ひいては、ＦＸＩａによりＦＩＸをＦＩＸａへと変換することができ、したがってＦＩＸがアッセイされるとき、ＦＩＸａについて記載された条件に加えてＦＸＩａが好ましくは存在する。当業者は、凝固経路における様々な相互作用を認識しており、どの凝固因子がアッセイされるかに応じて、本発明によるアッセイにおいて存在すべき適した凝固因子を選択することができるであろう。一般に、アッセイされる成分を除いて、凝固経路の成分は過剰に存在すべきである。次いで、アッセイされる凝固因子がサンプルを介して供給され、その基質、補因子又は他の相互作用物質のいずれかが過剰に存在するため、アッセイされる凝固因子の量は、生じて、本発明による化合物を介して最終的に検出されるＦＸａ活性と直接相関することになる。
【0076】
チモーゲンの検出が対応する酵素の検出を一般的には含むこと、及びしたがってチモーゲンの検出がチモーゲン及び対応する活性酵素の両方の検出になることを当業者は理解するであろう。例えば、ＦＶＩＩの検出は、結果としてＦＶＩＩ及びＦＶＩＩａの同時検出になる。
【0077】
包括的アッセイ
好ましい実施形態の１つのクラスでは、凝固経路のすべての成分が存在する。そのようなアッセイは、包括的アッセイと本明細書では呼ばれ、好ましくは、サンプル自体により供給された凝固因子を使用して事前に作成される。したがって、包括的アッセイにおいて、好ましくは凝固経路の成分は、生理系で見出される比に似た比で存在する。包括的アッセイに好ましいサンプルは、全血、及び多血小板血漿又は乏血小板血漿などの血漿、より好ましくは血漿、最も好ましくは乏血小板血漿である。包括的止血アッセイは、好ましくはＦＸＩＩａ、ＦＸＩａ又はＦＩＸａなどの活性凝固因子、組織因子（ＴＦ）及び／又はカルシウムの血漿への添加、より好ましくはＴＦ及び／又はカルシウムの添加、最も好ましくはＴＦ及びカルシウムの両方の添加により開始され、これは、ＦＸａ生成とその後に続くトロンビン生成及びその後の血塊形成につながる。開始後、トロンビンがカスケードの伝播及び停止に必要とされる。そのような包括的設計におけるＦＸａ濃度の測定は、凝固カスケードのサンプルの能力に関する情報を与える。
好ましい実施形態の１つのクラスでは、凝固経路のすべての成分が存在する。そのようなアッセイは、包括的アッセイと本明細書では呼ばれ、好ましくは、サンプル自体により供給された凝固因子を使用して事前に作成される。したがって、包括的アッセイにおいて、好ましくは凝固経路の成分は、生理系で見出される比に似た比で存在する。包括的アッセイに好ましいサンプルは、全血、及び多血小板血漿又は乏血小板血漿などの血漿、より好ましくは血漿、最も好ましくは乏血小板血漿である。包括的止血アッセイは、好ましくはＦＸＩＩａ、ＦＸＩａ又はＦＩＸａなどの活性凝固因子、組織因子（ＴＦ）及び／又はカルシウムの血漿への添加、より好ましくはＴＦ及び／又はカルシウムの添加、最も好ましくはＴＦ及びカルシウムの両方の添加により開始され、これは、ＦＸａ生成とその後に続くトロンビン生成及びその後の血塊形成につながる。開始後、トロンビンがカスケードの伝播及び停止に必要とされる。そのような包括的設計におけるＦＸａ濃度の測定は、凝固カスケードのサンプルの能力に関する情報を与える。
【0078】
ステップａ）－アミノルシフェリンの放出
ステップａ）において、サンプルを、本発明による化合物を含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出する。ＦＸａは、本発明による化合物に含まれたペプチドを認識することができ、発光部分からペプチドを切断して、アミノルシフェリンを放出する。したがって、ＦＸａがアッセイされる凝固因子であるとき、ステップａ）の間、他の凝固因子が存在する必要はない。非常に好ましい実施形態において、ステップａ）の間、カルシウム及びリン脂質が存在する。カルシウム及びリン脂質は、テナーゼ複合体の形成に適しているべきである。このリン脂質は好ましくはアニオン性リン脂質である。
ステップａ）において、サンプルを、本発明による化合物を含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出する。ＦＸａは、本発明による化合物に含まれたペプチドを認識することができ、発光部分からペプチドを切断して、アミノルシフェリンを放出する。したがって、ＦＸａがアッセイされる凝固因子であるとき、ステップａ）の間、他の凝固因子が存在する必要はない。非常に好ましい実施形態において、ステップａ）の間、カルシウム及びリン脂質が存在する。カルシウム及びリン脂質は、テナーゼ複合体の形成に適しているべきである。このリン脂質は好ましくはアニオン性リン脂質である。
【0079】
凝固因子活性のための条件は、当技術分野において既知であり、接触が好ましくは行われるのはこの状況下である。一例は、生理学的に許容される緩衝液、例えばＢＳＡなどの１％血清アルブミンを任意選択で含むトリス緩衝液の使用である。適したトリス緩衝液の一例はトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）である。本発明による基質の濃度は、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０μＭ以上、より好ましくは少なくとも３０μＭなど、少なくとも２０又は３０μＭである。本発明による基質の濃度は、好ましくは高々５０００、４０００、３０００、２０００、１７５０、１５００、１２５０、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０μＭ又はそれ未満、より好ましくは高々２５００又は２００μＭ又は１７５０μＭ又は１５００μＭ又は１２５０μＭ又は１０００μＭ又は９００μＭ又は８００μＭ又は７００μＭ又は６００μＭ又は５００μＭ又はそれ未満、さらにより好ましくは高々７５０μＭなど、高々２０００又は７５０μＭ又はそれ未満である。
【0080】
このステップは、アッセイされる凝固因子の存在を発光出力と関連させるものであり、したがってルシフェラーゼの基質がこのステップにおいて放出される。この文脈において、放出は、例えばカルボン酸がＳである一般式ＩＩ－４に示されたアミノルシフェリン部分の加水分解と解釈されるべきである。基質に応じて、他の発光部分も放出することができる。化学発光基質は、本発明による化合物に含まれているとき、さらなる変換に利用可能ではないため、放出は、化学発光基質をステップｂ）におけるその後の変換に利用可能にするものである。
【0081】
好ましい実施形態において、アッセイされる凝固因子が、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第Ｘ因子、第Ｘａ因子、プレカリクレイン及びカリクレインから選択される、好ましくは第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第Ｘ因子及び第Ｘａ因子から選択される、
【0082】
任意選択で、ステップａ）の間、組成物が、第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩａ因子、第Ｘ因子、プレカリクレイン及びカリクレインから選択される、好ましくは第ＩＸ因子、第ＩＸａ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩａ因子及び第Ｘ因子から選択される少なくとも１つのさらなる凝固因子を含む、本発明によるアッセイが提供される。上述のように凝固因子はＦＸａであるべきであるか、又はＦＸａの形成に寄与すべきである。さらなる凝固因子はＦＸａの生成に寄与すべきである。
【0083】
いわゆるテナーゼ複合体内でＦＩＸａ及びＦＶＩＩＩａによりＦＸをＦＸａへと変換することができる。テナーゼ複合体は、ＦＩＸａ、ＦＶＩＩＩａ、ＦＸ、アニオン性リン脂質及びカルシウムからなる。したがって、ＦＩＸａがアッセイされるとき、凝固因子は、ＦＸ又はＦＶＩＩＩａのうちのいずれか１つであり得、次いで、さらなる凝固因子は、どちらの因子が既に選択される凝固因子ではないかに応じて、好ましくはＦＸ又はＦＶＩＩＩａのいずれかである。したがって、ＦＶＩＩＩａがアッセイされるとき、凝固因子は、ＦＸ又はＦＩＸａのうちのいずれか１つであるべきであり、さらなる凝固因子は、どちらの因子が既に選択される凝固因子ではないかに応じて、好ましくはＦＸ又はＦＩＸａのいずれかであるべきである。当業者は、凝固経路における様々な相互作用を認識しており、どの凝固因子がアッセイされるかに応じて、本発明によるアッセイにおいて存在すべき適した凝固因子及びさらなる凝固因子を選択することができるであろう。
【0084】
ステップｂ）－ルシフェラーゼによるアミノルシフェリンの酸化
ステップｂ）において、アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させる。この接触の目的は、放出されたアミノルシフェリンからなど、ステップａ）において放出された化学発光分子から光量子を発生させることである。化学発光基質を変換して光量子を生成する方法は当技術分野において確立されており、この接触の間にさらなる物質も存在すると、ルシフェラーゼ、好ましくはホタルルシフェラーゼはより機能的になることができる。したがって、好ましい実施形態において、ステップｂ）は、放出された化学発光分子をＡＴＰと接触させるステップをさらに含む。好ましい実施形態において、ステップｂ）は、放出された化学発光分子をＭｇ２＋と接触させるステップをさらに含む。非常に好ましい実施形態において、ステップｂ）は、放出された化学発光分子をＡＴＰ及びＭｇ２＋と接触させるステップをさらに含む。ステップｂ）の間にＡＴＰも存在するとき、ＡＴＰは、約５０～１０００μＭの最終濃度で、好ましくは約２５０～５００μＭの、より好ましくは約３３３μＭなど約３００～４００μＭの最終濃度で存在することができる。ステップｂ）の間にＭｇ２＋が存在するとき、Ｍｇ２＋は、約１～３０μＭの最終濃度で存在することができ、Ｍｇ２＋は、好ましくは約４～１２ｍＭの、より好ましくは約８．３ｍＭなど約６～１０ｍＭの最終濃度で存在する。ルシフェラーゼは、好ましくは約０．０５～５０ｍｇ／ｍＬで、より好ましくは約０．１～１０ｍｇ／ｍＬで、さらにより好ましくは約０．９ｍｇ／ｍＬでなど約０．５～５ｍｇ／ｍＬで存在する。
ステップｂ）において、アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させる。この接触の目的は、放出されたアミノルシフェリンからなど、ステップａ）において放出された化学発光分子から光量子を発生させることである。化学発光基質を変換して光量子を生成する方法は当技術分野において確立されており、この接触の間にさらなる物質も存在すると、ルシフェラーゼ、好ましくはホタルルシフェラーゼはより機能的になることができる。したがって、好ましい実施形態において、ステップｂ）は、放出された化学発光分子をＡＴＰと接触させるステップをさらに含む。好ましい実施形態において、ステップｂ）は、放出された化学発光分子をＭｇ２＋と接触させるステップをさらに含む。非常に好ましい実施形態において、ステップｂ）は、放出された化学発光分子をＡＴＰ及びＭｇ２＋と接触させるステップをさらに含む。ステップｂ）の間にＡＴＰも存在するとき、ＡＴＰは、約５０～１０００μＭの最終濃度で、好ましくは約２５０～５００μＭの、より好ましくは約３３３μＭなど約３００～４００μＭの最終濃度で存在することができる。ステップｂ）の間にＭｇ２＋が存在するとき、Ｍｇ２＋は、約１～３０μＭの最終濃度で存在することができ、Ｍｇ２＋は、好ましくは約４～１２ｍＭの、より好ましくは約８．３ｍＭなど約６～１０ｍＭの最終濃度で存在する。ルシフェラーゼは、好ましくは約０．０５～５０ｍｇ／ｍＬで、より好ましくは約０．１～１０ｍｇ／ｍＬで、さらにより好ましくは約０．９ｍｇ／ｍＬでなど約０．５～５ｍｇ／ｍＬで存在する。
【0085】
ステップａ）及びステップｂ）を同時に及び／又は同じ反応体積中で実施することができる。好ましい実施形態において、ステップａ）及びステップｂ）は同じ反応体積中で実施され、反応体積は、ステップａ）及びｂ）の両方に必要なすべての試薬を好ましくは同時に含む。これにより、放出された化学発光分子をルシフェラーゼにより遅滞なく変換することが可能となる。
【0086】
ステップｃ）－相対光強度の決定
ステップｃ）において、発光シグナルが決定される。これは、当技術分野において既知である任意の方法で、例えばルミノメーターを使用して行うことができる。決定された光強度は、アッセイされる凝固因子を定量するための基礎として使用される。これは、本明細書において先述したように、そして実施例５及び６に例示されるように、凝固因子の濃度は、相対光単位（ＲＬＵ）として好ましくは表された相対光強度に相関するからである。いくつかの実施形態において、相対光強度は、基準値又は検量曲線と比較される。そのような検量曲線は、例えば実施例に示されるように、既知量のアッセイされる凝固因子を使用して好ましくは作成された。基準値は、所定の値などの設定値であり得るか、又は対照サンプルによるアッセイ結果であり得る。この文脈において、対照サンプルは、好ましくは、ある種の仕様を満たすことが既知であるサンプル、若しくは健常対象から（あらかじめ）得られたサンプルであり、又は対照サンプルは正常プール血漿である。
ステップｃ）において、発光シグナルが決定される。これは、当技術分野において既知である任意の方法で、例えばルミノメーターを使用して行うことができる。決定された光強度は、アッセイされる凝固因子を定量するための基礎として使用される。これは、本明細書において先述したように、そして実施例５及び６に例示されるように、凝固因子の濃度は、相対光単位（ＲＬＵ）として好ましくは表された相対光強度に相関するからである。いくつかの実施形態において、相対光強度は、基準値又は検量曲線と比較される。そのような検量曲線は、例えば実施例に示されるように、既知量のアッセイされる凝固因子を使用して好ましくは作成された。基準値は、所定の値などの設定値であり得るか、又は対照サンプルによるアッセイ結果であり得る。この文脈において、対照サンプルは、好ましくは、ある種の仕様を満たすことが既知であるサンプル、若しくは健常対象から（あらかじめ）得られたサンプルであり、又は対照サンプルは正常プール血漿である。
【0087】
相対光強度は、実際のルシフェラーゼ活性を直接表し、ひいては、放出される発光基質の実際の量を直接表し、ひいては、ＦＸａ活性を直接表す。上述のように、ひいては、ＦＸａ活性は、他の凝固因子の活性を直接表すことができる。したがって、相対光強度は、関与する酵素及び基質の一定のｋａのために、アッセイされる凝固因子の量に関する直接的な情報を与える。これは、蛍光発生アッセイ又は発色アッセイなどの蓄積するアッセイとは対照的である。蛍光発生アッセイ又は発色アッセイについては、変換率を決定するために傾きを計算しなければならない。発光アッセイでは、（例えばＲＬＵの）平坦な出力が変換率を直接示す。好ましい実施形態において、ステップｃ）は、ステップｃ）において決定された任意のシグナルの導関数を決定するステップを含まない。より好ましい実施形態において、ステップｃ）は、ルシフェラーゼにより発生した相対光強度の一次導関数を決定するステップを含まない。この文脈において、ルシフェラーゼにより発生した光強度は、本発明による化合物から放出されるアミノルシフェリンなどの発光分子から生じた相対光強度に関する。発光は、当技術分野において既知の方法による波長で測定することができる。適した波長の例は、３６０～６３０ｎｍの間の波長である。
【0088】
したがって、ある時点で決定された相対光強度は、凝固因子活性に関する関連情報を直接与える。それでも、設定期間の間の、又はある一定の条件が満たされるまでの相対光強度の決定は、アッセイの動態に関する関連情報を与えることができる。これは、出力が一般的にはベル型曲線になる上述のような包括的アッセイに特に有用である。したがって、好ましい実施形態において、ステップｃ）は、ある期間にわたりルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップを含む。この期間は、好ましくは高々１５０、１２０、９０、８０、７０、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１分又はそれ未満、より好ましくは高々３５、３０、１５又は１０分又はそれ未満である。期間は、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０秒、より好ましくは少なくとも３０秒など少なくとも１０、２０又は３０秒である。
【0089】
サンプル中の抗凝固剤を定量する方法
本発明によるアッセイを改変して、抗凝固剤の定量を可能にすることができる。したがって、本発明は、サンプル中の抗凝固剤を定量する方法であって、
ａ）サンプルを、第Ｘａ因子と本発明による化合物とを含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、
ｂ）アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、
ｃ）ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップと
を含む、方法も提供する。
本発明によるアッセイを改変して、抗凝固剤の定量を可能にすることができる。したがって、本発明は、サンプル中の抗凝固剤を定量する方法であって、
ａ）サンプルを、第Ｘａ因子と本発明による化合物とを含む組成物と接触させて、アミノルシフェリンを放出するステップと、
ｂ）アミノルシフェリンをルシフェラーゼと接触させるステップと、
ｃ）ルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップと
を含む、方法も提供する。
【0090】
この方法は、ＦＸａ活性の阻害を定量する方法であり、以下、本発明による阻害アッセイと呼ばれる。上述のような本発明によるアッセイとの違いは、この方法ではＦＸａもステップａ）において用意されることである。この結果は、本発明による化合物からアミノルシフェリンを放出するＦＸａ活性の結果として、ＦＸａの阻害剤が存在しないとき既知量の発光シグナルが生成されることである。したがって、発光出力のいかなる減少も、抗凝固剤が存在するときなど、ＦＸａ阻害に帰因させることができる。アッセイされる好ましい抗凝固剤は、直接作用型抗凝固剤（ＤＯＡＣ）、ヘパリン及びヘパリノイドである。好ましいＤＯＡＣは、リバーロキサバン（ＣＡＳ ３６６７８９－０２－８）、アピキサバン（ＣＡＳ ５０３６１２－４７－３）及びエドキサバン（ＣＡＳ ４８０４４９－７０－５）など、ＦＸａに対するものである。
【0091】
論じたように、ＦＸａはステップａ）において既に用意されている。ＦＸａのこの用意は、ＦＸａの直接的な用意であり得るか、又はＦＸａを生成することができる組成物の用意であり得る。そのような組成物は、当技術分野において既知である。好ましくは、ＦＸａを生成することができる組成物の用意をステップａ）が含むとき、組成物は、一定量又は既知量のＦＸａを生成する。
【0092】
ステップｂ）及びｃ）は実質的に異ならず、したがって上述されている。抗凝固剤の定量のためのこの方法において使用されるステップｃ）については、基準値が、既知量のアッセイされる抗凝固剤によるＦＸａ阻害が使用された検量曲線であるとき特に、基準値との比較が好ましい可能性がある。これは実施例４及び図４に例示される。
【0093】
好ましい実施形態において、本発明は、ステップｃ）が、ある期間にわたりルシフェラーゼにより発生した相対光強度を決定するステップを含む本発明によるアッセイ若しくは本発明による阻害アッセイ、及び／又はルシフェラーゼにより発生した相対光強度の一次導関数を決定するステップを含まない本発明によるアッセイ若しくは本発明による阻害アッセイを提供する。
【0094】
全体で、本発明は、試験サンプル中の止血因子の生成を監視する改善された敏感な方法を提供する。本発明の方法は、１種又は複数種の止血因子の生成を測定するための光学的なポイントオブケアデバイスの設計を可能にする。
【0095】
一般的な定義
好ましい実施形態において、本発明による化合物及び組成物は、本発明による方法における使用のためのもの、又は本発明による使用のためのものである。本明細書に記載の各実施形態は、特に記載のない限り互いに組み合わせられてもよい。
好ましい実施形態において、本発明による化合物及び組成物は、本発明による方法における使用のためのもの、又は本発明による使用のためのものである。本明細書に記載の各実施形態は、特に記載のない限り互いに組み合わせられてもよい。
【0096】
構造式又は化学名がキラル中心を有すると当業者に理解されるが、各キラル中心のキラリティーは示されないとき、ラセミ混合物（任意のエナンチオマー過剰率を有する）、純粋なＲエナンチオマー及び純粋なＳエナンチオマーのいずれかの３つすべてが個々に参照される。
【0097】
本発明において提供される化合物及び使用のための化合物は、任意選択で置換することができる。適した任意選択の置換は、ハロゲンによる－Ｈの置換えである。好ましいハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩである。さらなる適した任意選択の置換は、－ＮＨ２、－ＯＨ、＝Ｏ、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アルケン、ハロアルケン、アルキン、ハロアルキン及びシクロアルキルによる１個又は複数の－Ｈの置換である。アルキル基は、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１を有し、代わりに線状又は分枝状でもよい。非置換のアルキル基は、環状部分をさらに含んでもよく、したがって同時一般式ＣｎＨ２ｎ－１を有してもよい。任意選択で、アルキル基は、本文書においてさらに指定された１個又は複数の置換基で置換されている。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、２－プロピル、ｔ－ブチル、１－ヘキシル、１－ドデシルなどが含まれる。本出願全体にわたり、原子の原子価は常に満たされるべきであり、必要に応じてＨを付加又は除去することができる。最も好ましくは、任意選択の置換は、Ｆ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＣＨ３又はＯＣＨ２ＣＨ３による１個、２個又は３個の－Ｈの置換である。
【0098】
物質のパラメータが本発明の文脈において論じられる場合は常に、特に指定のない限り、パラメータは生理学的条件下で決定、測定又は明示されることが想定される。生理学的条件は、当業者に既知であり、水性溶媒系、大気圧、６～８の間のｐＨ値、室温～約３７℃（約２０℃～約４０℃）の範囲の温度、及び適した濃度の緩衝塩又は他の成分を含む。電荷が平衡にしばしば関連することが理解される。電荷を運ぶ又は持つと言われる部分は、部分がそのような電荷を持たない又は運ばない状態よりもしばしば、部分がそのような電荷を持つ又は運ぶ状態で見出される部分である。したがって、当業者に理解されるように、電荷を帯びることが本開示において示されている原子が特定の条件下で電荷を帯びないこともあり、中性の部分が特定の条件下で電荷を帯びることもある。
【0099】
本発明の文脈において、評価されるパラメータの減少又は増加は、評価されるパラメータに対応する値の少なくとも５％の変化を意味する。より好ましくは、値の減少又は増加は、少なくとも１０％、さらにより好ましくは少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％又は１００％の変化を意味する。この後者の場合、これは、パラメータに関連する検出可能な値がもはや存在しない場合であり得る。
【0100】
本文書及びその特許請求の範囲において、「を含む（ｔｏ ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、その非限定的な意味で使用されて、この語の後に続く項目が含まれるが具体的に述べられない項目が除外されないことを意味する。「止血（Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」及び「止血（Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ）」は、本明細書において同義で用いられ得る。加えて、要素のうちのただ１つが存在することが文脈により明確に要求されていない限り、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への言及は、１つを超える要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は「少なくとも１つの」を通常は意味する。「約」又は「およそ」という語は、数値と共に使用された場合（例えば約１０）、数値が数値の１％だけより多い又はより少ない（１０の）所与の値でもよいことを好ましくは意味する。加えて、「なる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ）」という動詞は、本発明の組成物が、具体的に記載された成分の他に本発明の特有の特徴を変化させない（１つ又は複数の）追加の成分を含んでもよいことを意味する「から本質的になる（ｔｏ ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」によって置き換えられてもよい。
【0101】
本明細書に引用されたすべての特許及び参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【0102】
本発明の文脈において、細胞又はサンプルは、対象から得られたサンプルからの細胞又はサンプルであり得る。そのような得られたサンプルは、対象からあらかじめ得られたサンプルであり得る。そのようなサンプルはヒト対象から得ることができる。そのようなサンプルは非ヒト対象から得ることができる。
【0103】
以下は、本発明において参照される配列である：
配列番号１ ＩＥＧＲ 配列番号２ ＩＤＧＲ
配列番号３ ＩＥＧＫ 配列番号４ ＩＤＧＫ
配列番号１ ＩＥＧＲ 配列番号２ ＩＤＧＲ
配列番号３ ＩＥＧＫ 配列番号４ ＩＤＧＫ
【図面の簡単な説明】
【0104】
【図1A】本発明による化合物の合成。Ａ）共有Ｇｌｙ－Ａｒｇ／Ｇｌｙ－Ｏｒｎコアへの合成。
【図1B】Ｂ）ペプチドコアＩｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇを有する前駆体への共有コアの変換。
【図1C】Ｃ）ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲへのＩｌｅ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ中間体の変換。
【図2】１．６ｎＭのＦＸａ濃度における酵素ＦＸａ及びその基質ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲのミカエリス－メンテン速度式。Ｖｍａｘ＝４６８０００ＲＬＵ及びＫＭ＝６１９μＭが決定され、Ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［ＦＸａ］＝１．０５×１０１４ｓ－１が導かれた。
【図3A】基質ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲは、ＦＸａ以外のセリンプロテアーゼとの最小限の交差反応性を有する。Ａ）８０ｎｍ ＦＸａは、１，０００，０００ＲＬＵのシグナルを与え、５２ｎＭトロンビンは約３０，０００ＲＬＵを与え、８ｎＭプラスミンは約８，０００ＲＬＵを与え、１９３ＩＵ／ｍＬ ｔＰＡ（線溶を促進する通常の濃度）は約６，０００ＲＬＵを与え、１４５ｎＭ ＦＸＩＩａは約５００ＲＬＵを与えた。ｔＰＡ以外の濃度は、活性化後のヒト血漿中の濃度の代表である。
【図3B】Ｂ）ｙ軸が対数目盛に変換されたパネルＡの一部のより詳細な図。
【図4】アピキサバンは、基質ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲの変換を阻害する。１００ｐｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬアピキサバンの存在下のＦＸａ（４ｎＭ）は、１０～１０００ｎｇ／ｍｌ範囲内の阻害を明らかにする。
【図5A】カスケード関与物の過剰な成分を含むがＦＶＩＩＩのない反応混合物を用意することにより、ＦＸａ活性に基づいてサンプル中のＦＶＩＩＩ活性が決定された。したがって、ＦＸａ活性によって引き起こされた発光はＦＶＩＩＩ活性の尺度になる。Ａ）正常プール血漿の百分率として表された異なるＦＶＩＩＩ濃度において測定されたＲＬＵ。
【図5B】Ｂ）パネルＡ中の結果の検量線。検量は、ｙ＝３０３３１＋４３７６ｘ及びｒ２＝０．９９３５の線形回帰を有する。
【図6A】カスケード関与物の過剰な成分を含むがＦＩＸのない反応混合物を用意することにより、ＦＸａ活性に基づいてサンプル中のＦＩＸ活性が決定された。したがって、ＦＸａ活性によって引き起こされた発光はＦＩＸ活性の尺度になる。Ａ）正常プール血漿の百分率として表された異なるＦＩＸ濃度において測定されたＲＬＵ。
【図6B】Ｂ）パネルＡ中の結果の検量線。検量は、ｙ＝９７４７１＋８５４７ｘ及びｒ２＝０．９８７２の線形回帰を有する。
【図7】高組織因子濃度及び低組織因子濃度（７ｐＭ又は０．２８ｐＭ）を使用した包括的止血アッセイにおけるＦＸａ活性化。
【図8A】Ａ）化学発光リーダーを用いて速度論的に測定された生データ。
【図8B】Ｂ）この例は、一定時点、この場合は３分を使用して検量曲線を作成している。
【図8C】Ｃ）この例は、各キャリブレーターの０．５～３分の間の傾きを計算して検量曲線を作成している。
【図9A】Ａ）３１個のＦＶＩＩＩ臨床サンプルを測定するために利用された４本の検量曲線の重ね合せ。組み合わせられたこれら４本の検量曲線の平均Ｒ２値は０．９８１０であった。
【図9B】Ｂ）組換えＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ生成物を含むサンプルを使用した化学発光に基づくアッセイ並びに発色ＦＶＩＩＩアッセイの両方における臨床サンプルの回収。
【図9C】Ｃ）Ｂ）と同様だが、組換え全長ＦＶＩＩＩ生成物を含むサンプルを使用した。
【図10A】Ａ）様々なＦＩＸレベルを含むキャリブレーターを用いて、化学発光リーダーを用いて速度論的に測定された生データ。
【図10B】Ｂ）作成された検量曲線。
【実施例】
【0105】
実施例１－本発明による基質の用意
図１Ａに示されたように、重要な中間体Ａ１を経由して基質を合成した。この中間体の合成は、ベンゾチアゾール１からニトリル２への収率９１％の変換から始まった。還元は、順相及び逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーの後、純粋なアニリン３を収率５４％で与えた。ピリジン中のＰＣｌ３を用いてＦｍｏｃ－Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（４）とのカップリングを実施した。Ｆｍｏｃ脱保護後、化合物６がうまく得られた。８へのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ ７との６のペプチドカップリング及びＢｏｃ脱保護は、これら２つのステップを通じて収率８４％で９を与えた。１，３－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－（トリフルオロメタンスルホニル）グアニジンとの反応は、フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製後、良好な収率及び純度でグアニジン１０を与えた。他のアミノ酸が存在する一般式Ｉ－３又はＩ－４の化合物の用意については、前記他のアミノ酸を用いて上記のプロトコルが繰り返されるか、又は化合物８が化合物１０へと変換されない。
図１Ａに示されたように、重要な中間体Ａ１を経由して基質を合成した。この中間体の合成は、ベンゾチアゾール１からニトリル２への収率９１％の変換から始まった。還元は、順相及び逆相フラッシュカラムクロマトグラフィーの後、純粋なアニリン３を収率５４％で与えた。ピリジン中のＰＣｌ３を用いてＦｍｏｃ－Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（４）とのカップリングを実施した。Ｆｍｏｃ脱保護後、化合物６がうまく得られた。８へのＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ ７との６のペプチドカップリング及びＢｏｃ脱保護は、これら２つのステップを通じて収率８４％で９を与えた。１，３－ビス（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）－２－（トリフルオロメタンスルホニル）グアニジンとの反応は、フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製後、良好な収率及び純度でグアニジン１０を与えた。他のアミノ酸が存在する一般式Ｉ－３又はＩ－４の化合物の用意については、前記他のアミノ酸を用いて上記のプロトコルが繰り返されるか、又は化合物８が化合物１０へと変換されない。
【0106】
図１Ｂに示されたように、Ｆｍｏｃ脱保護及びＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ １２との即座のさらなるカップリングは、２つのステップを通じて収率７２％で１３を与えた。このシーケンスの、ただし今回はＦｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ １５を使用した繰返しは、２つのステップを通じて収率７８％でテトラペプチド１６を与えた。重要なビルディングブロックＡ１へのＦｍｏｃ脱保護は収率９５％で進んだ。他のアミノ酸が存在する一般式Ｉ－３又はＩ－４の化合物の用意については、前記他のアミノ酸を用いて上記のプロトコルが繰り返される。
【0107】
図１Ｃに示されたように、収率９３％の１８への［２－（２－メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸１７とのＡ１のペプチドカップリングにより合成を続けた。他の部分Ｘについては、適切な試薬を使用して同様のカップリングを実施することができる。ｄ－システイン１９とのカップリングは、逆相分取クロマトグラフィーによる精製後、アミノルシフェリン２０を収率７６％で与えた。トリフルオロ酢酸を使用することにより保護基の除去を実施し、その後、ジエチルエーテル中の研和により、ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲと名付けられた生成物を単離した。
【0108】
実施例２－本発明による基質の速度論的挙動
酵素ＦＸａ及びその基質ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ（これらの例ではＴＦＡ塩を使用した）についてミカエリス－メンテン速度式を決定した。以下の組成物を氷上のマイクロバイアル中で調製した：
組成物１：
１６０μＬトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ） ５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
４μＬ ＡＴＰ（最終濃度３３３μＭ）
４μＬ ＭｇＣｌ２（最終濃度８．３ｍＭ）
１２μＬルシフェラーゼ（最終濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）
基質組成物２ａ～ｇ：
３０μＬ基質濃度でマイクロバイアルを準備し、２０００、１３３３、１０００、６６６、３３３、１６７及び６６μＭの最終濃度に至った。
酵素組成物３：
ＦＸａ（Ｃｏａｃｈｒｏｍ、１６ｎＭ）組成物を氷上のマイクロバイアル中で調製した
続いて、以下の組成物を白色の３８４ウェルプレート内で合わせた：
組成物１ ２４μＬ
組成物２ａ～ｇ ３μＬ
組成物３ ３μＬ
続いてウェルプレートを３７℃恒温のＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）内に置いた。発光放射波長を１５００ｍｓの積分時間で３０分の間、３０秒毎に１秒間測定した。
酵素ＦＸａ及びその基質ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ（これらの例ではＴＦＡ塩を使用した）についてミカエリス－メンテン速度式を決定した。以下の組成物を氷上のマイクロバイアル中で調製した：
組成物１：
１６０μＬトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ） ５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）
４μＬ ＡＴＰ（最終濃度３３３μＭ）
４μＬ ＭｇＣｌ２（最終濃度８．３ｍＭ）
１２μＬルシフェラーゼ（最終濃度０．９ｍｇ／ｍｌ）
基質組成物２ａ～ｇ：
３０μＬ基質濃度でマイクロバイアルを準備し、２０００、１３３３、１０００、６６６、３３３、１６７及び６６μＭの最終濃度に至った。
酵素組成物３：
ＦＸａ（Ｃｏａｃｈｒｏｍ、１６ｎＭ）組成物を氷上のマイクロバイアル中で調製した
続いて、以下の組成物を白色の３８４ウェルプレート内で合わせた：
組成物１ ２４μＬ
組成物２ａ～ｇ ３μＬ
組成物３ ３μＬ
続いてウェルプレートを３７℃恒温のＦｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）内に置いた。発光放射波長を１５００ｍｓの積分時間で３０分の間、３０秒毎に１秒間測定した。
【0109】
結果が図２に示されている。１．６ｎＭのＦＸａ濃度においてＶｍａｘ＝４６８０００ＲＬＵ及びＫＭ＝６１９μＭが決定され、Ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／［ＦＸａ］＝１．０５×１０１４ｓ－１が導かれた。
【0110】
実施例３－交差反応性
交差反応性を決定するために、ヒト血漿中の代表的な濃度の様々な凝固酵素を使用してアッセイを実施した。凝固酵素の選ばれた濃度は、活性化後のｉｎ ｖｉｖｏで予想される濃度と同等である。組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）については、これは線溶を促進する通常の濃度である。
交差反応性を決定するために、ヒト血漿中の代表的な濃度の様々な凝固酵素を使用してアッセイを実施した。凝固酵素の選ばれた濃度は、活性化後のｉｎ ｖｉｖｏで予想される濃度と同等である。組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）については、これは線溶を促進する通常の濃度である。
【0111】
８０ｎｍ ＦＸａの濃度は１，０００，０００ＲＬＵのシグナルを与えた。他の凝固酵素は以下のシグナルを生じた：５２ｎＭトロンビンは約３０，０００ＲＬＵを与え、８ｎＭプラスミンは約８，０００ＲＬＵを与え、１９３ＩＵ／ｍＬ ｔＰＡは約６，０００ＲＬＵを与え、１４５ｎＭ ＦＸＩＩａは約５００ＲＬＵを与えた（図３）。これらのデータは、本発明による基質がＦＸａにより優先的に切断されることを示す。
【0112】
実施例４－抗凝固活性の定量
抗凝固剤の一例として、アピキサバン（ＣＡＳ番号５０３６１２－４７－３）をＦＸａ及びＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲの混合物中に異なる濃度で加えた。アピキサバンは、静脈血栓塞栓性事象の治療のための、経口的に摂取される抗凝固剤である。アピキサバンは、直接的なＦＸａ阻害剤である。図４は、１００ｐｇ／ｍＬ～最大１００ｍｇ／ｍＬアピキサバンの存在下のＦＸａ（４ｎＭ）により、基質の変換に対するアピキサバンの阻害を示す。ＦＸａ活性に対する阻害効果が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ範囲内で示されている。
抗凝固剤の一例として、アピキサバン（ＣＡＳ番号５０３６１２－４７－３）をＦＸａ及びＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲの混合物中に異なる濃度で加えた。アピキサバンは、静脈血栓塞栓性事象の治療のための、経口的に摂取される抗凝固剤である。アピキサバンは、直接的なＦＸａ阻害剤である。図４は、１００ｐｇ／ｍＬ～最大１００ｍｇ／ｍＬアピキサバンの存在下のＦＸａ（４ｎＭ）により、基質の変換に対するアピキサバンの阻害を示す。ＦＸａ活性に対する阻害効果が１０～１０００ｎｇ／ｍｌ範囲内で示されている。
【0113】
実施例５－定量的ＦＶＩＩＩアッセイ
この発光ＦＶＩＩＩアッセイは２ステップの活性アッセイであり、サンプルからの一定量のＦＶＩＩＩの活性化をもたらし、続いて、ＦＸ活性化、したがって本発明による基質の安定した変換をもたらす。発光因子アッセイは、光子の速い減衰時間のために安定した基質変換をもたらし、一方、発色基質又は蛍光基質はシグナルを蓄積（例えば４０５ｎｍにおいて）し、シグナルを経時的に増加させる（ＯＤ／分）。発色基質又は蛍光基質のアッセイについては、変換率を決定するために傾きを計算しなければならない。発光アッセイでは、（ＲＬＵの）平坦な出力が変換率を直接示し、これは本発明の方法を非常に好都合にする。
この発光ＦＶＩＩＩアッセイは２ステップの活性アッセイであり、サンプルからの一定量のＦＶＩＩＩの活性化をもたらし、続いて、ＦＸ活性化、したがって本発明による基質の安定した変換をもたらす。発光因子アッセイは、光子の速い減衰時間のために安定した基質変換をもたらし、一方、発色基質又は蛍光基質はシグナルを蓄積（例えば４０５ｎｍにおいて）し、シグナルを経時的に増加させる（ＯＤ／分）。発色基質又は蛍光基質のアッセイについては、変換率を決定するために傾きを計算しなければならない。発光アッセイでは、（ＲＬＵの）平坦な出力が変換率を直接示し、これは本発明の方法を非常に好都合にする。
【0114】
アッセイにおいて、トロンビンを加えてＦＶＩＩＩを活性化する。活性化因子ＶＩＩＩは、第ＩＸａ因子、リン脂質（ＰＬＰ）及びカルシウムとの酵素複合体を形成する。この複合体は、第Ｘ因子をＦＸａへと活性化し、ＦＸは、アッセイにおいて一定濃度で及び過剰に供給される。ＦＸａは、本発明による基質に作用してルシフェラーゼの基質を遊離し、発光活性をもたらす。したがって、発光活性は第ＶＩＩＩ因子活性の量に直接関連し、これは、一定量の第ＩＸａ因子の存在下の制限因子である。次いで、生成された第Ｘａ因子は、本発明の特異的第Ｘａ因子発光基質に対するその活性により正確に測定される。第Ｘａ因子は基質を切断し、光子の放出をもたらす。生成された光子の量（相対光単位ＲＬＵとして表される）は、第Ｘａ因子活性、したがって第ＶＩＩＩ因子の量に正比例する。そのようなアッセイの発色類似体は市販されている（例えばＨｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ製ＢＩＯＰＨＥＮ第ＶＩＩＩ因子アッセイ、カタログ番号２２１４０２）。この例との重要な違いは、発色基質の代わりに、本発明による基質がＡＴＰ、Ｍｇ２＋及びルシフェラーゼと共に使用されることである。
【0115】
異なる量のＦＶＩＩＩ（正常プール血漿（ＮＰＰ）又はその希釈液を使用）をアッセイにおいて使用した。サンプルをＦＸの溶液と混合した。３７℃で約２分のインキュベーションの後、蒸留水中のＦＩＸａ、トロンビン、カルシウム及びリン脂質の溶液を加え、その後、反応物を３７℃で約３分間インキュベートした。次いで、ＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲ（この場合はＴＦＡ塩）をＦＸａの基質として加え、その後、ルシフェラーゼ、ＡＴＰ及びＭｇ２＋の従来の混合物を使用して発光を決定した。図５Ａは、ＮＰＰ百分率として表された加えられたＦＶＩＩＩに対する、サンプル中に存在するＦＶＩＩＩ活性に依存するＦＸａ活性のＲＬＵを示す。図５Ｂは、付随する検量線を示す。検量は、ｙ＝３０３３１＋４３７６ｘ及びｒ２＝０．９９３５の線形回帰を有する。
【0116】
実施例５．１－詳細なＦＶＩＩＩアッセイ
試薬
試薬１（Ｒ１）：
試験又は検量曲線に使用された希釈血漿サンプル。サンプルは、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈される。
試薬
試薬１（Ｒ１）：
試験又は検量曲線に使用された希釈血漿サンプル。サンプルは、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈される。
【0117】
試薬２（Ｒ２）：
ヒト第ＩＸａ因子、ヒトトロンビン、カルシウム、フィブリン重合阻害剤としてのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ及び合成リン脂質（２８％ホスファチジルセリン）。リン脂質及びカルシウムは４～８℃で保管される。他の成分は－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
ヒト第ＩＸａ因子、ヒトトロンビン、カルシウム、フィブリン重合阻害剤としてのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ及び合成リン脂質（２８％ホスファチジルセリン）。リン脂質及びカルシウムは４～８℃で保管される。他の成分は－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
【0118】
試薬３（Ｒ３）：
ヒト第Ｘ因子、ＡＴＰ、マグネシウム、第Ｘａ因子に特異的な発光基質（この例ではＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲを使用した）及びＰｒｏｍｅｇａ製組換えルシフェラーゼＵｌｔｒａ－Ｇｌｏ。ルシフェラーゼはＱｕａｎｔｉＬｕｍルシフェラーゼと交換することができ、いずれのタイプも適用することができる。マグネシウムは４～８℃で保管される。個々の成分は、水性溶液中、－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
ヒト第Ｘ因子、ＡＴＰ、マグネシウム、第Ｘａ因子に特異的な発光基質（この例ではＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲを使用した）及びＰｒｏｍｅｇａ製組換えルシフェラーゼＵｌｔｒａ－Ｇｌｏ。ルシフェラーゼはＱｕａｎｔｉＬｕｍルシフェラーゼと交換することができ、いずれのタイプも適用することができる。マグネシウムは４～８℃で保管される。個々の成分は、水性溶液中、－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
【0119】
検量曲線サンプルの調製
表５は、ＦＶＩＩＩアッセイのための検量サンプルの調製を示す。検量曲線の準備のために、以下の希釈血漿サンプルが、表５に示されているように混合される。３８４ウェルアッセイプレートにおいて、３μＬの希釈サンプル又はキャリブレーターが１０μＬ試験体積に使用される。未知試料は１００％サンプルと同じように調製される。
表５は、ＦＶＩＩＩアッセイのための検量サンプルの調製を示す。検量曲線の準備のために、以下の希釈血漿サンプルが、表５に示されているように混合される。３８４ウェルアッセイプレートにおいて、３μＬの希釈サンプル又はキャリブレーターが１０μＬ試験体積に使用される。未知試料は１００％サンプルと同じように調製される。
【0120】
【表5】
【0121】
タンパク質試薬の調製
表６及び表７は、それぞれ試薬２又は３の調製について記載している。これらの体積は、１０μＬ又は３０μＬの最終的な試験体積に対する３８４ウェルプレート中の１つの反応物又は１つのサンプルを表す。各ウェルにおける最終濃度が表８に記載されている。
表６及び表７は、それぞれ試薬２又は３の調製について記載している。これらの体積は、１０μＬ又は３０μＬの最終的な試験体積に対する３８４ウェルプレート中の１つの反応物又は１つのサンプルを表す。各ウェルにおける最終濃度が表８に記載されている。
【0122】
【表6】
【0123】
【表7】
【0124】
【表8】
【0125】
手順
試験は、３７℃で化学発光リーダーを使用して実施される。３７℃でインキュベートされた３８４ウェルマイクロプレートに３つの混合物が別々に分注される。表９は、ただ１つのウェルの分配を示す。試験中、反応物が混合され、相対光単位（ＲＬＵ）強度が２０分間、速度論的に測定される。最終結果の取扱い方は以下で説明される。
試験は、３７℃で化学発光リーダーを使用して実施される。３７℃でインキュベートされた３８４ウェルマイクロプレートに３つの混合物が別々に分注される。表９は、ただ１つのウェルの分配を示す。試験中、反応物が混合され、相対光単位（ＲＬＵ）強度が２０分間、速度論的に測定される。最終結果の取扱い方は以下で説明される。
【0126】
【表9】
【0127】
検量曲線
化学発光に基づく定量的ＦＶＩＩＩアッセイを検量して、第ＶＩＩＩ因子を分析することができる。アッセイは、表５に示されたダイナミックレンジをカバーする。速度論的データを使用して検量曲線を作成するための少なくとも２つの方法が存在する。第１の選択肢は、生データを観察した後に時点を設定するものである。個々のキャリブレーターサンプルの曲線がプラトーを形成するとき、非常に適した時点が考慮されている。第２の選択肢は、およそ０．５～３分の間の傾きを決定するものである。検量曲線は、いずれの方法についても両対数でプロットされる。
化学発光に基づく定量的ＦＶＩＩＩアッセイを検量して、第ＶＩＩＩ因子を分析することができる。アッセイは、表５に示されたダイナミックレンジをカバーする。速度論的データを使用して検量曲線を作成するための少なくとも２つの方法が存在する。第１の選択肢は、生データを観察した後に時点を設定するものである。個々のキャリブレーターサンプルの曲線がプラトーを形成するとき、非常に適した時点が考慮されている。第２の選択肢は、およそ０．５～３分の間の傾きを決定するものである。検量曲線は、いずれの方法についても両対数でプロットされる。
【0128】
図に示された検量曲線は、１０μＬの最終的な試験体積でＦｌｅｘ３ Ｓｔａｔｉｏｎ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）で得られた。この図（生データ）に基づいて、上述の２つの選択肢を使用して、最終的な検量曲線を作成した。
【0129】
この定量的アッセイのより早いバージョンは、３０μＬでＱｕａｎｔｉＬｕｍルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてほとんど実施した。１０μＬ構造に使用したＵｌｔｒａ－Ｇｌｏルシフェラーゼと同じ環境でこのルシフェラーゼが同じ強度を達成しないことを考えると、後者はインポートノートである。したがって、図１～図３と図４～図６は一対一で比較することができない。図４～図６は、３０μＬアッセイ構造で得られた結果を視覚化している。ＦＶＩＩＩ補充療法を受けている３１人の血友病患者の臨床サンプルで、このアッセイの検証を実施した。２２サンプルが組換えＰＥＧ化ＦＶＩＩＩ生成物を含んでおり、そのうちの３つを１％未満ＦＶＩＩＩに割り当て、１％未満ＦＶＩＩＩとして回収した。１０サンプルが組換え全長ＦＶＩＩＩ生成物を含んでおり、そのうちの１つを１％未満ＦＶＩＩＩに割り当て、１％未満ＦＶＩＩＩとして回収した。これらのサンプルをゴールデンスタンダード試験並びに発光に基づくＦＶＩＩＩアッセイの両方で測定した。検証に利用されたゴールデンスタンダードアッセイは、ウシ因子を含む発色ＦＶＩＩＩアッセイであった。
【0130】
実施例６－定量的ＦＩＸアッセイ
実施例５と同じ戦略を用いて、発光ＦＩＸアッセイを設計した。アッセイ設計は上述のＦＶＩＩＩアッセイと同等であるが、ＦＩＸａの代わりに過剰量のＦＸＩａを用意することにより、ＦＩＸにより特異的に感作されている。ＦＩＸは、ＦＸＩａにより切断されてＦＩＸａを生成することができるチモーゲンである。Ｃａ２＋、膜リン脂質及びＦＶＩＩＩａの存在下で、ＦＩＸａはＦＸを加水分解してＦＸａを生成する。反応混合物中、このカスケードの因子は、アッセイされるＦＩＸを除いて過剰に存在していた。したがって、反応混合物に加えられたＦＩＸの量は、相関量のＦＸａをもたらし、ひいては、検出可能な発光をもたらす。そのようなアッセイの発色類似体は市販されている（例えばＨｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ製ＢＩＯＰＨＥＮ第ＩＸ因子アッセイ、カタログ番号２２１８０２）。この例との重要な違いは、発色基質の代わりに、本発明による基質がＭｇ２＋及びＡＴＰ及びルシフェリンと一緒に使用されることである。
実施例５と同じ戦略を用いて、発光ＦＩＸアッセイを設計した。アッセイ設計は上述のＦＶＩＩＩアッセイと同等であるが、ＦＩＸａの代わりに過剰量のＦＸＩａを用意することにより、ＦＩＸにより特異的に感作されている。ＦＩＸは、ＦＸＩａにより切断されてＦＩＸａを生成することができるチモーゲンである。Ｃａ２＋、膜リン脂質及びＦＶＩＩＩａの存在下で、ＦＩＸａはＦＸを加水分解してＦＸａを生成する。反応混合物中、このカスケードの因子は、アッセイされるＦＩＸを除いて過剰に存在していた。したがって、反応混合物に加えられたＦＩＸの量は、相関量のＦＸａをもたらし、ひいては、検出可能な発光をもたらす。そのようなアッセイの発色類似体は市販されている（例えばＨｙｐｈｅｎ Ｂｉｏｍｅｄ製ＢＩＯＰＨＥＮ第ＩＸ因子アッセイ、カタログ番号２２１８０２）。この例との重要な違いは、発色基質の代わりに、本発明による基質がＭｇ２＋及びＡＴＰ及びルシフェリンと一緒に使用されることである。
【0131】
異なる量のＦＩＸ（ＮＰＰ又はその希釈液を使用）を反応混合物に加え、その後、発光を決定した。図６Ａは、ＮＰＰ百分率として表された加えられたＦＩＸに対する、サンプル中に存在するＦＩＸ活性に依存するＦＸａ活性のＲＬＵを示す。図６Ｂは、付随する検量線を示す。検量は、ｙ＝９７４７１＋８５４７ｘ及びｒ２＝０．９８７２の線形回帰を有する。
【0132】
実施例６．１－詳細なＦＩＸアッセイ
試薬
試薬４（Ｒ４）：
試験又は検量曲線に使用された希釈血漿サンプル。サンプルは、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液を含む緩衝液（ｐＨ７．４）に希釈される。
試薬
試薬４（Ｒ４）：
試験又は検量曲線に使用された希釈血漿サンプル。サンプルは、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液を含む緩衝液（ｐＨ７．４）に希釈される。
【0133】
試薬５（Ｒ５）：
組換えヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒト第ＸＩａ因子、ヒトトロンビン、合成リン脂質（２８％）、カルシウム及びフィブリン重合阻害剤としてのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ。個々の成分は、水性溶液中、－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液を含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
組換えヒト第ＶＩＩＩ因子、ヒト第ＸＩａ因子、ヒトトロンビン、合成リン脂質（２８％）、カルシウム及びフィブリン重合阻害剤としてのＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｐｒｏ。個々の成分は、水性溶液中、－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液を含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
【0134】
試薬６（Ｒ６）：
ヒト第Ｘ因子、ＡＴＰ、マグネシウム、第Ｘａ因子に特異的な発光基質（この例ではＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲを使用した）及びＰｒｏｍｅｇａ製組換えルシフェラーゼＱｕａｎｔｉｌｕｍ。ルシフェラーゼはＵｌｔｒａ－Ｇｌｏルシフェラーゼと交換することができ、いずれのタイプも適用することができる。マグネシウムは４～８℃で保管される。個々の成分は、水性溶液中、－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
ヒト第Ｘ因子、ＡＴＰ、マグネシウム、第Ｘａ因子に特異的な発光基質（この例ではＭｅＰＥＧ２－ＩＥＧＲを使用した）及びＰｒｏｍｅｇａ製組換えルシフェラーゼＱｕａｎｔｉｌｕｍ。ルシフェラーゼはＵｌｔｒａ－Ｇｌｏルシフェラーゼと交換することができ、いずれのタイプも適用することができる。マグネシウムは４～８℃で保管される。個々の成分は、水性溶液中、－８０℃で保管される。試薬混合物は、５０ｍＭイミダゾール及び１００ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製される。
【0135】
検量曲線サンプルの調製
検量曲線の準備のために、以下の希釈血漿サンプルが、表６に示されているように混合される。３８４ウェルアッセイプレートにおいて、６μＬの希釈サンプル又はキャリブレーターが３０μＬ試験体積に使用される。未知試料は１００％サンプルと同じように調製される。
検量曲線の準備のために、以下の希釈血漿サンプルが、表６に示されているように混合される。３８４ウェルアッセイプレートにおいて、６μＬの希釈サンプル又はキャリブレーターが３０μＬ試験体積に使用される。未知試料は１００％サンプルと同じように調製される。
【0136】
【表10】
【0137】
タンパク質試薬の調製
表７及び表８は、試薬を調製する方法を示す。これらの体積は、３０μＬの最終的な試験体積に対する３８４ウェルプレート中の１サンプル又は１ウェルを表す。１つのサンプル中の各成分の最終濃度が表９に示されている。
表７及び表８は、試薬を調製する方法を示す。これらの体積は、３０μＬの最終的な試験体積に対する３８４ウェルプレート中の１サンプル又は１ウェルを表す。１つのサンプル中の各成分の最終濃度が表９に示されている。
【0138】
【表11】
【0139】
【表12】
【0140】
【表13】
【0141】
手順
試験は、３７℃で化学発光リーダーを使用して実施される。３７℃でインキュベートされた３８４ウェルマイクロプレートに４つの混合物が別々に分注される。表１０は、ただ１つのウェルの分配を示す。試験中、相対光単位（ＲＬＵ）強度が速度論的に測定される。
試験は、３７℃で化学発光リーダーを使用して実施される。３７℃でインキュベートされた３８４ウェルマイクロプレートに４つの混合物が別々に分注される。表１０は、ただ１つのウェルの分配を示す。試験中、相対光単位（ＲＬＵ）強度が速度論的に測定される。
【0142】
【表14】
【0143】
検量曲線
第ＩＸ因子又は治療濃縮物のアッセイのためにＦＩＸ発光試験を検量することができる。示されたダイナミックレンジをカバーする血漿キャリブレーターが表６に示されており、これらを使用して検量曲線を作成することができる。まず生データが目視で評価され、その後、検量曲線を作成するために用いられる適した時点が選択される。検量曲線は両対数でプロットされる。
第ＩＸ因子又は治療濃縮物のアッセイのためにＦＩＸ発光試験を検量することができる。示されたダイナミックレンジをカバーする血漿キャリブレーターが表６に示されており、これらを使用して検量曲線を作成することができる。まず生データが目視で評価され、その後、検量曲線を作成するために用いられる適した時点が選択される。検量曲線は両対数でプロットされる。
【0144】
図に示された検量曲線はＦｌｅｘ３ Ｓｔａｔｉｏｎ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）で得られた。この図（生データ）に基づいて、上述の２つの選択肢を使用して、最終的な検量曲線を作成した。
【0145】
実施例７－ＦＸａ生成アッセイ
基質を包括的止血アッセイにおいて同じく使用した。ここで、組織因子、リン脂質及びカルシウムにより開始されると、凝固過程においてＦＸの活性化により乏血小板血漿中でＦＸａが生成される。ＦＸａ生成アッセイは、血漿への組織因子及びカルシウムの添加により開始され、ＦＸａ生成とその後に続くトロンビン生成及びその後の血塊形成につながる。ＦＸａ生成及びそれに続く生理学的阻害剤による阻害はベル型曲線につながる（図７）。異なる用量の組織因子を使用した：７ｐＭ又は０．２８ｐＭ。そのような包括的設計におけるＦＸａ濃度の測定は、第Ｘａ因子のレベルにおける凝固カスケードの能力に関する情報を与える。
基質を包括的止血アッセイにおいて同じく使用した。ここで、組織因子、リン脂質及びカルシウムにより開始されると、凝固過程においてＦＸの活性化により乏血小板血漿中でＦＸａが生成される。ＦＸａ生成アッセイは、血漿への組織因子及びカルシウムの添加により開始され、ＦＸａ生成とその後に続くトロンビン生成及びその後の血塊形成につながる。ＦＸａ生成及びそれに続く生理学的阻害剤による阻害はベル型曲線につながる（図７）。異なる用量の組織因子を使用した：７ｐＭ又は０．２８ｐＭ。そのような包括的設計におけるＦＸａ濃度の測定は、第Ｘａ因子のレベルにおける凝固カスケードの能力に関する情報を与える。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10A】
【図10B】
【配列表】