特許 7456990 皮膚障害及び状態を予防又は治療するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-18

(45)【発行日】2024-03-27

(54)【発明の名称】皮膚障害及び状態を予防又は治療するための方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/506 20060101AFI20240319BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240319BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240319BHJP

   A61Q 17/04 20060101ALI20240319BHJP

   C07D 403/04 20060101ALN20240319BHJP

   C07D 403/14 20060101ALN20240319BHJP

【ＦＩ】

A61K31/506

A61P17/00

A61P35/00

A61P43/00 105

A61P37/08

A61Q17/04

C07D403/04

C07D403/14

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2021212519

(22)【出願日】2021-12-27

(65)【公開番号】P2023014969

(43)【公開日】2023-01-31

【審査請求日】2021-12-27

(31)【優先権主張番号】17/378,839

(32)【優先日】2021-07-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504187858

【氏名又は名称】佛教慈濟醫療財團法人

(74)【代理人】

【識別番号】100176072

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 功

(74)【代理人】

【識別番号】100230156

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 心

(74)【代理人】

【識別番号】100230156

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 心

(72)【発明者】

【氏名】張 中興

【審査官】横田 倫子

(56)【参考文献】

【文献】Proc Natl Acad Sci U S A ., 2017, Vol.114 No.38, p.E8035-E8044.，doi: 10.1073/pnas.1702763114.

【文献】Cell, 2018, Vol.175 No.1, p.171-185

【文献】EMBO Rep., 2004, Vol.5 No.1, p.60-65

【文献】J Biol Chem., 2000, Vol.275 No.26, p.20052-60

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３１／５０６

Ａ６１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を含む、それを必要とする対象の皮膚の障害、疾患、又は状態を予防、改善又は治療するために使用される組成物であって、前記カゼインキナーゼ１阻害剤が、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１、式Ｉで表される化合物：

【化1】

（ここで：
Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換され；あるいは、Ｒ_１及びＲ_２は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ_２の少なくとも１つを任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成し；
Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立して、Ｈ；それらは、必要に応じてハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択され；又は
Ｒ_１又はＲ_２は、Ｒ_３とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ_２の少なくとも１つで任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい、４～７員の飽和、不飽和又は芳香環を形成し；
Ｒ_５及びＲ_８は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ_６は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員複素環からなる群から選択され；
Ｒ_７は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員の複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される）、
式ＩＩで表される化合物、式ＩＩＩで表される化合物、式ＩＶで表される化合物、式Ｖで表される化合物及び式ＶＩで表される化合物：

【化2】

（ＩＩ）、

（ＩＩＩ）、

（ＩＶ）、

（Ｖ）、

（ＶＩ）
からなる群から選択され、
前記カゼインキナーゼ１阻害剤は、前記対象に局所投与され、
前記皮膚の障害、疾患、又は状態は、ＵＶの過剰曝露により引き起こされる、組成物。

【請求項2】

前記皮膚の障害、疾患、又は状態は、日光性紅斑、日光性アレルギー、日光性蕁麻疹、日光弾性線維症、光老化、日焼け、急性日焼け、皮膚癌、日光性角化症、非定型ほくろ（ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｏｌｅ）、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記皮膚癌は、基底細胞癌、メラノーマ、メルケル細胞癌、扁平上皮癌、皮膚悪性メラノーマ、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項２に記載の組成物。

【請求項4】

有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を含む、それを必要とする対象の皮膚の障害、疾患、又は状態を予防、改善又は治療するために使用される組成物であって、前記カゼインキナーゼ１阻害剤が、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１、式Ｉで表される化合物：

【化3】

（ここで：
Ｒ _１ 及びＲ _２ は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換され；あるいは、Ｒ _１ 及びＲ _２ は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ _２ の少なくとも１つを任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成し；
Ｒ _３ 及びＲ _４ は、それぞれ独立して、Ｈ；それらは、必要に応じてハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択され；又は
Ｒ _１ 又はＲ _２ は、Ｒ _３ とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ _２ の少なくとも１つで任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい、４～７員の飽和、不飽和又は芳香環を形成し；
Ｒ _５ 及びＲ _８ は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ _６ は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員複素環からなる群から選択され；
Ｒ _７ は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員の複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される）、
式ＩＩで表される化合物、式ＩＩＩで表される化合物、式ＩＶで表される化合物、式Ｖで表される化合物及び式ＶＩで表される化合物：

【化4】

（ＩＩ）、

（ＩＩＩ）、

（ＩＶ）、

（Ｖ）、

（ＶＩ）
からなる群から選択され、
前記カゼインキナーゼ１阻害剤は、前記対象に局所投与され、
前記皮膚の障害、疾患、又は状態は、低メラニン症（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ）、特発性滴状低メラニン症、ぶち症、白色粃糠疹、癜風、進行性黄斑低メラニン症、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、ワールデンブルグ症候群、炎症後の色素脱失、創傷後の色素沈着過剰、又はそれらの任意の組み合わせである、組成物。

【請求項5】

有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を含む、それを必要とする対象の皮膚の障害、疾患、又は状態を予防、改善又は治療するために使用される組成物であって、前記カゼインキナーゼ１阻害剤が、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１、式Ｉで表される化合物：

【化5】

（ここで：
Ｒ _１ 及びＲ _２ は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換され；あるいは、Ｒ _１ 及びＲ _２ は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ _２ の少なくとも１つを任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成し；
Ｒ _３ 及びＲ _４ は、それぞれ独立して、Ｈ；それらは、必要に応じてハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択され；又は
Ｒ _１ 又はＲ _２ は、Ｒ _３ とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ _２ の少なくとも１つで任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい、４～７員の飽和、不飽和又は芳香環を形成し；
Ｒ _５ 及びＲ _８ は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ _６ は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員複素環からなる群から選択され；
Ｒ _７ は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員の複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される）、
式ＩＩで表される化合物、式ＩＩＩで表される化合物、式ＩＶで表される化合物、式Ｖで表される化合物及び式ＶＩで表される化合物：

【化6】

（ＩＩ）、

（ＩＩＩ）、

（ＩＶ）、

（Ｖ）、

（ＶＩ）
からなる群から選択され、
前記カゼインキナーゼ１阻害剤は、前記対象に局所投与され、
前記皮膚の障害、疾患、又は状態は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、α－メラノサイト刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）、及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）の少なくとも１つが関与するシグナル経路の欠陥により引き起こされる、組成物。

【請求項6】

有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を含む、それを必要とする対象のユーメラニンレベルを増加させるために使用される組成物であって、前記カゼインキナーゼ１阻害剤が、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１、式Ｉで表される化合物：

【化7】

（ここで：
Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換され；あるいは、Ｒ_１及びＲ_２は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ_２の少なくとも１つを任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成し；
Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立して、Ｈ；それらは、必要に応じてハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択され；又は
Ｒ_１又はＲ_２は、Ｒ_３とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ_２の少なくとも１つで任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい、４～７員の飽和、不飽和又は芳香環を形成し；
Ｒ_５及びＲ_８は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ_６は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員複素環からなる群から選択され；
Ｒ_７は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員の複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される）、
式ＩＩで表される化合物、式ＩＩＩで表される化合物、式ＩＶで表される化合物、式Ｖで表される化合物及び式ＶＩで表される化合物：

【化8】

（ＩＩ）

（ＩＩＩ）

（ＩＶ）

（Ｖ）

（ＶＩ）
からなる群から選択され、
前記カゼインキナーゼ１阻害剤が、前記対象の皮膚においてフェオメラニンレベルよりもユーメラニンレベルを選択的に増加させるために前記対象に局所投与される、組成物。

【請求項7】

前記ユーメラニンレベルの増加は、前記対象の皮膚の色素沈着を増加させる、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記皮膚の色素沈着は、ＵＶから前記対象を保護する、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記ユーメラニンレベルは、前記対象の表皮で増加する、請求項６に記載の組成物。

【請求項10】

前記ユーメラニンレベルの増加は、前記対象の表皮におけるＫｉｔＬレベルの増加を伴う、請求項６に記載の組成物。

【請求項11】

前記表皮におけるＫｉｔＬレベルの増加は、前記対象の真皮から前記表皮へのメラノサイトの移動を誘導する、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記対象はヒトである、請求項６に記載の組成物。

【請求項13】

有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を含む、それを必要とする対象の皮膚細胞におけるカゼインキナーゼ１の活性を阻害するために使用される組成物であって、前記カゼインキナーゼ１阻害剤が、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１、式Ｉで表される化合物：

【化9】

（ここで：
Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換され；あるいは、Ｒ_１及びＲ_２は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ_２の少なくとも１つを任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成し；
Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立して、Ｈ；それらは、必要に応じてハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択され；又は
Ｒ_１又はＲ_２は、Ｒ_３とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ_２の少なくとも１つで任意に含み、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい、４～７員の飽和、不飽和又は芳香環を形成し；
Ｒ_５及びＲ_８は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択され；
Ｒ_６は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員複素環からなる群から選択され；
Ｒ_７は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員の複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される）、
式ＩＩで表される化合物、式ＩＩＩで表される化合物、式ＩＶで表される化合物、式Ｖで表される化合物及び式ＶＩで表される化合物：

【化10】

（ＩＩ）

（ＩＩＩ）

（ＩＶ）

（Ｖ）

（ＶＩ）
からなる群から選択され、
前記カゼインキナーゼ１阻害剤は、前記対象の皮膚に局所投与される、組成物。

【請求項14】

前記皮膚細胞と前記有効量の前記カゼインキナーゼ１阻害剤との接触は、前記皮膚細胞のユーメラニンレベルを増加させる、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記皮膚細胞は、表皮細胞である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項16】

前記カゼインキナーゼ１阻害剤は、カゼインキナーゼ１α阻害剤である、請求項１３に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、カゼインキナーゼ１阻害剤を用いて、皮膚の障害、疾患、又は状態を予防、改善、又は治療するための方法に関する。また、本明細書では、カゼインキナーゼ１を阻害することによって皮膚の色素沈着を増加させる方法も提供される。

【背景技術】

【0002】

紫外線（ＵＶ）は、活性酸素種（ＲＯＳ）の発生による間接的な細胞損傷と、ＤＮＡのヌクレオチド構造への直接的な損傷の両方によって皮膚を傷害し、それにより、急性日焼け反応を引き起こすことができる。したがって、紫外線は、他の皮膚障害や状態の中でも、皮膚がんの発症と非常に関連している。

【0003】

表皮は主にケラチノサイトとメラノサイトで構成され、ＵＶなどの継続的な外傷から生体を保護する高度なバリア組織として機能する。ケラチノサイトはＵＶに敏感で、皮膚の主要な応答者である。それらは、ＵＶに応答してさまざまなパラクリン因子を生成し、微小環境に影響を与えるとともに、隣接するメラノサイトを活性化させ、ケラチノサイト－メラノサイトの機能ユニットを形成する。皮膚の色素沈着過剰は、メラノサイトでのメラニン合成の増加とそれに続く隣接するケラチノサイトへのメラニンの分布に起因するものでありＵＶに対する生体の生物学的反応の１つである。

【0004】

そのため、メラニンは、天然の日焼け止めとして、ＵＶと可視光線が増殖中の細胞が存在する皮膚深層部にまでの浸透を直接防ぎ、強力な抗酸化物質とフリーラジカル消去物質として機能する。肌の色が濃い人は、ＵＶによる皮膚がんの発生率が低いが、肌の色が薄い人は、ＵＶによる損傷や腫瘍の形成を起こしやすく、日焼けへの反応も弱い。実際には、メラノサイトは、黒褐色のユーメラニンと黄赤色のフェオメラニンという２種類のメラニン色素を生成する。両方のメラニン色素は肌の色が異なる種族に見られるが、黒褐色のユーメラニンは黒髪及び／又は褐色の髪の人によく見られる一方、黄赤色のフェオメラニンは主に赤髪及びそばかすのある個人に生成される。しかしながら、メラニンの有益な効果は主に、ＵＶをほとんど吸収し、ＵＶによって生成されたフリーラジカルを消去するユーメラニンの存在に起因し、フェオメラニンは発がん性があることが知られている。したがって、メラニン色素の操作は、フェオメラニンのレベルではなく、ユーメラニンのレベルを選択的に増加させるように慎重に実行しなければならない。

【0005】

したがって、ＵＶによるＤＮＡ損傷及び皮膚癌の予防のために、ユーメラニンの有益なレベルを選択的に増加させる効果的な方法が高度的に求められている。

【発明の概要】

【0006】

本明細書は、有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤（ＣＫＩ）を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の皮膚の障害、疾患、又は状態を予防、改善、又は治療するための方法が提供される。少なくとも１つの実施形態において、前記皮膚の障害、疾患、又は状態は日焼けである。少なくとも１つの実施形態において、前記皮膚の障害、疾患、又は状態は、急性の日焼けである。少なくとも１つの実施形態において、前記皮膚の障害、疾患、又は状態は色素脱失（ｈｙｐｏｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）である。いくつかの実施形態において、前記皮膚の障害、疾患、又は状態は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、α－メラノサイト刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）及び小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）の少なくとも１つが関与するシグナル経路の欠陥によって引き起こされる。

【0007】

また、本明細書では、有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を対象に投与することを含む、対象を紫外線から保護するための方法が提供される。

【0008】

さらに、本明細書では、有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の皮膚色素沈着を増加させるための方法が提供される。

【0009】

本明細書は、対象に有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を投与することを含む、それを必要とする対象にユーメラニンレベルを増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態において、前記ユーメラニンレベルの増加は、ＫｉｔＬレベルの増加を伴う。いくつかの実施形態において、前記表皮のＫｉｔＬレベルの増加は、対象における真皮から表皮へのメラノサイトの移動が誘導される。少なくとも１つの実施形態において、前記ユーメラニンレベルは、フェオメラニンレベルよりも選択的に増加される。いくつかの実施形態において、前記ユーメラニンレベルは、対象の表皮で増加する。

【0010】

少なくとも１つの実施形態において、本明細書で提供される方法は、メラノサイトの細胞数の増加又は真皮から表皮へのメラノサイトの移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を伴う。

【0011】

少なくとも１つの実施形態において、本明細書で提供される方法は、カゼインキナーゼ１阻害剤の局所投与を伴う。

【0012】

本明細書は、皮膚細胞を有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤と接触させることを含む、皮膚細胞におけるカゼインキナーゼ１の活性を阻害する方法が提供される。

【0013】

本明細書は、皮膚細胞を有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤と接触させることを含む、皮膚細胞中のユーメラニンレベルを増加させる方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

本開示は、添付の図面と併せて以下の説明を参照することにより、より容易に理解される。

【図1A】図１Ａ～１Ｈは、野生型（ＷＴ）マウスに対するＣＫＩであるＡ５１の局所治療のＵＶ保護効果を示す。図１Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの耳にＣＫＩを０．１ｍｇ／ｃｍ^２の量で４週間隔日に投与し、合計１．２ｍｇのＣＫＩを投与した場合の局所投与の治療流れを示した。６週目での矢印は、組織分析用の耳サンプルの採取時点を示す（Ｎ＝１０）。

【図1B】図１Ｂは、耳の組織の免疫組織化学（ＩＨＣ）分析による耳の表現型、フォンタナ－マッソン染色、ｃ－Ｋｉｔ染色、及びＴｒｐ１染色の写真を示す。また、表皮の厚度、メラニン強度、及び染色から定量化され、ヒストグラムで表されたｃ－Ｋｉｔ＋細胞及びＴｒｐ１＋細胞の数も示す。皮膚の色素沈着の詳細は、デジタル顕微鏡（ＵＰＧ６５０、Ｕｐｍｏｓｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で撮影された。６週目の表皮では、メラノサイト数の増加が観察された。フォンタナ－マッソン染色では、表皮のユーメラニン量の増加と表皮厚度の増加が確認された。ｃ－Ｋｉｔ染色では、ケラチノサイト及びメラノサイトでＫｉｔの発現が増加していることを示した。Ｔｒｐ１染色では、表皮のメラノサイト数が増加していることを示した。

【図1C】図１Ｃは、局所ＣＫＩ投与後に皮膚全体におけるユーメラニン（ＥＭ）とフェオメラニン（ＰＭ）の比率が有意に増加し、ユーメラニン比率の増加は、真皮ではなく主に表皮に局在化したことを示した。ＮＳ：有意ではない。

【図1D】図１Ｄ及び１Ｅは、野生型マウス（対照群）に、１ｍｇ／ｃｍ^２を１回、その後０．５ｍｇ／ｃｍ^２を６回及び０．２ｍｇ／ｃｍ^２を５回、1日おきにマウスの耳に局所投与する流れに従って、４週間にわたって、合計５ｍｇのＣＫＩ治療を行ったＵＶ保護効果の結果を示す。

【図1E】図１Ｄ及び１Ｅは、野生型マウス（対照群）に、１ｍｇ／ｃｍ^２を１回、その後０．５ｍｇ／ｃｍ^２を６回及び０．２ｍｇ／ｃｍ^２を５回、1日おきにマウスの耳に局所投与する流れに従って、４週間にわたって、合計５ｍｇのＣＫＩ治療を行ったＵＶ保護効果の結果を示す。

【図1F】図１Ｆでは、Ｔｙｒ－ＣｒｅＥＲ^Ｔ２；ＦｕｓｉｏｎＲｅｄマウスが生成され、メラノサイト特異的なチロシナーゼプロモーターによって駆動されるＣｒｅ組換えからのＦｕｓｉｏｎＲｅｄ蛍光によってメラノサイトを追跡するために使用される。タモキシフェン誘導後、メラノサイトは、組織内の緑色蛍光（ＧＦＰ）細胞の中で、膜上に赤色蛍光（ＦｕｓｉｏｎＲｅｄ）を特異的に発現する。タモキシフェン誘導後に耳の皮膚を採取し、１５μｍの切片に切り取った。切片をＤＡＰＩ含有封入剤に封入し、蛍光顕微鏡で観察した。対照群マウスでは、耳の表皮にＦｕｓｉｏｎＲｅｄ標識メラノサイトがまれに見られた（Ｎ＝３）。マウスの耳に１．２ｍｇのＣＫＩを局所投与した後、矢印で示される表皮のＦｕｓｉｏｎＲｅｄ標識メラノサイトが増加する（Ｎ＝３）。表皮内のメラノサイトの数を計算し、ヒストグラムに示した。

【図1G】図１Ｇは、背側耳皮膚組織におけるＫｉｔＬ／ｃ－Ｋｉｔ経路およびメラニンに関連するターゲットのタンパク質発現レベルをウエスタンブロッティング分析で示したものである。薄い灰色のバーは対照群を表し、濃い灰色のバーは１．２ｍｇのＣＫＩ投与を受けた群を表する。ｎ．ｓ．：有意ではない。

【図1H】図１Ｈは、ＵＶＢ照射で誘導された短期ケラチノサイトのＤＮＡ損傷に対する局所ＣＫＩ治療の保護効果の治療流れと結果を示す。０．１ｍｇのＣＫＩを１日おきに局所投与し、合計６回の投与で、合計０．６ｍｇＣＫＩ治療後、２１日目にマウスを７５０ｍＪ／ｃｍ^２ＵＶＢ（Ｎ＝６）に２４時間照射した。採取されたサンプルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィンに包埋するか、最適切断温度（ＯＣＴ）で凍結した。ＵＶＢ照射によるＤＮＡ損傷は、ＵＶＢ照射の衝突による特定のマーカーであるシクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の量で調査した。ＣＫＩ治療後のＣＰＤ染色の減少は、より高用量のＣＫＩ（１．２ｍｇ又は５ｍｇ）で処理された肌の色が目に見えて濃くなる前に、低用量のＣＫＩ（０．６ｍｇ）で局所ＣＫＩのＵＶ保護効果が有効であることを示す。信号はすべてＩｍａｇｅＪソフトウェアによって定量化され、統計結果は対応のないｔ検定分析によって決定され、平均値±ＳＤとして示された。星印＊＊＊は、Ｐ＜０．００１の有意差を示す。

【図2A】図２Ａ～２Ｌは、ＭＣ１Ｒ変異マウスのケラチノサイトにおけるＣＫ１α消去の効果と、ＭＣ１Ｒ変異マウスに対する局所ＣＫＩ治療のＵＶ保護効果を示す。図２Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６及びＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスの表現型と、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスのケラチノサイトにおけるＣＫ１α消去の生成を示す。

【図2B】図２Ｂは、誘導性ＭＣ１Ｒ変異マウスを得るために交配するマウスの流れを示す。

【図2C】図２Ｃは、タモキシフェン誘導と１４、２８、４２日目の皮膚サンプル採取の流れを示す。

【図2D】図２Ｄは、ケラチノサイトでＣＫ１αを消去したＭＣ１Ｒ変異マウスの皮膚の表現型を示す。

【図2E】図２Ｅは、ケラチノサイトでのＣＫ１α消去によるＭＣ１Ｒ変異マウスの皮膚のフォンタナ－マッソン染色を示す。

【図2F】図２Ｆは、皮膚全体（全体）、表皮、及び真皮におけるフォンタナ－マッソン染色細胞の定量化された数を示し、表皮、真皮、及び皮膚全体におけるユーメラニンの増加を示す。

【図2G】図２Ｇは、局所ＣＫＩ投与の治療流れを示し、ＣＫＩを０．１ｍｇ／回及び０．３ｍｇ／週で４週間局所投与され、合計１．２ｍｇのＣＫＩが投与され、組織分析のために６週目に皮膚が採取される（Ｎ＝６）。

【図2H】図２Ｈは、表皮厚度とユーメラニン量をそれぞれ観察するためにフォンタナ－マッソン染色を施した局所ＣＫＩ治療の６週間後に採取された耳のサンプルを示す。

【図2I】図２Ｉは、ウエスタンブロッティング分析による耳サンプルにおけるＫｉｔＬ／ｃ－Ｋｉｔ経路とメラノサイト関連ターゲットのタンパク質の発現レベルを示し、局所的にビヒクルで治療されたマウスと比較し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスにおける１．２ｍｇのＣＫＩの局所治療後に、ＫｉｔＬ、ｃ－Ｋｉｔ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びｐ５３の発現がすべて有意に増加したことを示す。

【図2J】図２Ｊは、合計２．６ｍｇのＣＫＩを局所投与したＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスのＥＭ／ＰＭ比の増加を示す。

【図2K】図２Ｋは、ＣＫＩ処理の有無にかかわらず、７５０ｍＪ／ｃｍ^２でのＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスに対するＵＶＢ照射の効果を示す。皮膚サンプルは、流れに示されているように処理され、２１日目に７５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ照射を２４時間行った後に採取され、ＤＮＡ損傷を調べるために抗ＣＰＤ抗体で染色された。合計０．６ｍｇのＣＫＩで処理された変異マウスは、表皮及び真皮（皮脂上皮、毛包上皮、線維芽細胞）でシクロブテンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）染色の減少を示し、局所ＣＫＩ処理のＵＶ保護効果を示す。ヒストグラムは、対照群の表皮と真皮、及びＣＫＩ治療群のＣＰＤ陽性細胞の数をそれぞれ示している。

【図2L】図２Ｌは、野生型（ＷＴ）マウスとＭＣ１Ｒ変異マウスから得られたＣＰＤ染色を、局所ＣＫＩ治療のあり或いはなしを比較し、局所ＣＫＩ治療がＷＴ及びＭＣ１Ｒ変異マウスの両方で皮膚のＵＶ損傷を予防することを示す。

【図3A】図３Ａ～３Ｅは、局所ＣＫＩ投与がヒトの皮膚外植片におけるＵＶＢによるＤＮＡ損傷を予防するＵＶ保護効果を発揮することを示す。図３Ａは、ヒトの包皮試料を使用したＣＫＩ治療の流れを示す。試料は１２ウェルプレートで培養した（Ｎ＝５）。外植片培養２４時間後、試料を０．０１ｍｇＣＫＩで処理し、タイムラインに示すように、その２日後にもう一つの０．０１ｍｇのＣＫＩ処理を行った。５日目に、試料を１Ｊ／ｃｍ^２ＵＶＢ光で照射された。その６時間後にサンプルを採取した。皮膚試料の写真は、局所ＣＫＩ治療後の皮膚はより暗いことを示した。

【図3B】図３Ｂは、合計０．０２ｍｇの局所ＣＫＩ治療後のＥＭ／ＰＭ比の増加を示す。

【図3C】図３Ｃは、直接観察用の組織を４％ＰＦＡで固定して、パラフィンで包埋し、フォンタナ－マッソン染色によるメラニン分布を調べた写真を示す。さらに、Ｍｅｌａｎ－Ａ及びＴｒｐ－１ラベリングのＩＨＣ分析のために、ＯＣＴへの凍結包埋も行われた。Ｍｅｌａｎ－Ａ＋細胞とＴｒｉｐ－１＋細胞の数、及び対照群又はＣＫＩ治療群の相対的なメラニン強度がヒストグラムで定量化されている。

【図3D】図３Ｄは、ｐ５３及び色素沈着関連タンパク質の発現レベルを調べるために、表皮から抽出された総タンパク質のウエスタンブロッティングの結果と対応する定量化されたヒストグラムを示す。

【図3E】図３Ｅは、ＩｍａｇｅＪソフトウェアにより、ＣＫＩ処理のあり或いはない場合のＵＶＢ照射サンプルにおけるＣＰＤ発現とＣＰＤ＋細胞数の定量化を示す。統計結果は、対応のないｔ検定分析によって決定され、平均値±ＳＤとして示された。星印＊＊＊は、Ｐ＜０．００１の有意差を示す。

【図4A】図４Ａ～４Ｇは、ヒト初代ケラチノサイト及びメラノサイトに対するＣＫＩ処理の効果を示す。図４Ａは、ＣＫＩ処理の実験計画を示す。

【図4B】図４Ｂでは、ヒト初代ケラチノサイトは、細胞のコンフルエンスが９０％であるときに、表示濃度のＣＫＩで処理された。細胞溶解物をウエスタンブロッティングで分析したところ、ｐ５３の活性化と、ＫｉｔＬ及びｃ－Ｋｉｔの発現の増加を用量依存的に示した。

【図4C】図４Ｃでは、７２時間の処理後に培地を回収し、ＥＬＩＳＡアッセイに供したところ、ＫｉｔＬの濃度がＣＫＩ処理によって増加したことが示された。合計３回の独立した実験から得られた統計結果は、対応のないｔ検定分析で決定され、平均値±ＳＤとして示された。「ＮＳ」は有意差がないことを示し、星印＊＊＊はＰ＜０．００１で有意差があることを示す。

【図4D】図４Ｄ及び４Ｅでは、初代メラノサイトは、ケラチノサイトを３日間培養し、ＣＫＩのあり或いはない処理された条件培地で培養された。図４Ｄは、抗ＨＭＢ４５抗体で染色されたメラノソームの結果を示す。細胞数をトリパンブルー染色でカウントし、樹状突起の長さをＨＭＢ４５染色細胞で測定した。

【図4E】図４Ｅでは、さまざまなＣＫＩ濃度で処理されたケラチノサイトに由来する条件培地で培養されたメラノサイトは、メラノサイト特異的調節因子、チロシナーゼ、及びＭＩＴＦの発現レベルの増加を示す。

【図4F】図４Ｆでは、細胞のコンフルエンシーが９０％であるとき、初代ヒトメラノサイトをさまざまな濃度のＣＫＩで処理した。７２時間の処理後に総タンパク質を抽出し、ｃ－Ｋｉｔ受容体、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、リン酸化ＭＫＫ６などのメラノサイト成熟マーカーの発現を調べた。ウエスタンブロッティングの結果は、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びｐ－ＭＫＫ６の発現が用量依存的に増加することを示した。

【図4G】図４Ｇでは、初代メラノサイトを移動アッセイに供した。メラノサイト付着後、培地を溶媒対照群又は５０ｎＭＣＫＩのものに交換した。インサートは２４時間後に取り外され、写真は０、２４、及び４８時間に撮影された。データは、ＣＫＩがメラノサイトの移動を促進することを示した。

【図5A】図５Ａ及び５Ｂは、ＭＣ１Ｒ変異マウスに対するＤ４４７６及びＩＣ２６１治療の効果を示す。図５Ａは実験計画を示す。

【図5B】図５ＢはＫｉｔＬ／ｃ－Ｋｉｔ経路及びメラノサイト関連ターゲットにおけるタンパク質の発現レベルのウエスタンブロッティング分析を示す。

【図6A】図６Ａ～６Ｅは、別のＣＫＩであるＤ４４７６をヒトの皮膚外植片に局所治療した場合のＵＶ保護効果を示す。図６Ａは、Ｄ４４７６局所投与流れの実験計画を示し、３つの外植片でそれぞれ０．０４ｍｇを２回、合計０．０８ｍｇで、又は０．０５ｍｇを２回、合計０．１ｍｇであることが含まれる。

【図6B】図６Ｂは、Ｄ４４７６で処理された皮膚のフォンタナ－マッソン染色結果による組織学的分析を示す。

【図6C】図６Ｃ及び６Ｄは、ｃ－Ｋｉｔ経路におけるタンパク質及びメラニン生成関連タンパク質の発現レベルのウエスタンブロッティング分析結果及び定量化された量をそれぞれ示している。

【図6D】図６Ｃ及び６Ｄは、ｃ－Ｋｉｔ経路におけるタンパク質及びメラニン生成関連タンパク質の発現レベルのウエスタンブロッティング分析結果及び定量化された量をそれぞれ示している。

【図6E】図６Ｅは、合計０．０８ｍｇの局所Ｄ４４７６を投与された皮膚試料のＣＰＤ染色結果を示し、ヒストグラムは、ＣＰＤで染色された細胞の定量化された数（ＣＰＤ^＋細胞の数）を示す。

【図7A】図７Ａ～７Ｃは、Ｋｉｔ経路及びヒトのケラチノサイトのメラニン生成関連タンパク質発現レベルに対する、Ａ５１、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１を含む付加のカゼインキナーゼ１阻害剤の効果を示す。

【図7B】図７Ａ～７Ｃは、Ｋｉｔ経路及びヒトのケラチノサイトのメラニン生成関連タンパク質発現レベルに対する、Ａ５１、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１を含む付加のカゼインキナーゼ１阻害剤の効果を示す。

【図7C】図７Ａ～７Ｃは、Ｋｉｔ経路及びヒトのケラチノサイトのメラニン生成関連タンパク質発現レベルに対する、Ａ５１、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１を含む付加のカゼインキナーゼ１阻害剤の効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下の例は、本開示を説明するために使用される。当業者は、本明細書の開示に基づいて、本開示の他の利点および効果を容易に想像できる。また、本開示は異なる実施例に記載されるように実施または適用できる。異なる態様および用途について、その範囲に違反することなしに、本開示を実施するために上記の例を修正または変更することが可能である。

【0016】

一般的に、本明細書で使用される命名法及び本明細書に記載される有機化学、医薬品化学、生化学、生物学、及び薬理学における実験手順は当該技術分野に周知されかつ一般的に使用される。他に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、一般的に、本開示に属する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。しかしながら、これらの用語は、当業者の意図、判例、又は新技術の出現に応じて異なる意味を有する場合がある。また、一部の用語は、出願人が任意に選択することができ、この場合、選択された用語の意味は、本開示の説明に詳細に記載される。したがって、本明細書で使用される用語は、本明細書全体の説明とともに用語の意味に基づいて定義されなければならない。

【0017】

さらに、本開示で使用される場合に、単数形の「一（ａ）」、「一（ａｎ）」、及び「当該／前記（ｔｈｅ）」は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。「又は」という用語は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、「及び／又は」という用語と交換可能に使用される。

【0018】

また、ある部品が構成要素又は工程を「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」場合、それとは反対の特定の説明がない限り、その部品は、他の構成要素又は他の工程をさらに含むことができ、他の構成要素または他の工程を除外しない。

【0019】

「対象」、「患者」及び「個体」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、霊長目（例えば、ヒト）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、又はマウスを含むが、これらに限定されない温血動物を指す。「対象」及び「患者」という用語は、例えば、ヒト対象などの哺乳動物対象を参照して、本明細書では交換可能に使用される。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。

【0020】

「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療中（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、障害、疾患、状態、或いは障害、疾患、状態に関連する１つ以上の症状を軽減又は無効にすることを含むことを意味する。又は、障害、疾患、又は状態自体の原因を軽減又は根絶する。

【0021】

「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防し（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、障害、疾患、又は状態、及び／又はそれに付随する症状の発症を遅延及び／又は排除する方法、対象が障害、疾患、又は状態を得ることから防止する方法、又は対象が障害、疾患、又は状態を得るリスクを軽減する方法を含むことを意味する。

【0022】

「軽減（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」及び「軽減する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」という用語は、障害、疾患、又は状態の１つ以上の症状（例えば、痛み）を緩和又は軽減することを指す。これらの用語は、有効成分に関連する副作用を軽減することに指してもよい。いくつかの実施形態において、対象が予防剤又は治療剤に由来する有益な効果は、障害、疾患、又は状態の治癒をもたらさない。

【0023】

「接触する（ｃｏｎｔａｃｔｉｎｇ）」又は「接触（ｃｏｎｔａｃｔ）」という用語は、そのような接触の結果として生理学的及び／又は化学的効果が生じるように、化粧品又は治療剤と細胞又は組織とを一緒にすることを意味する。接触は、試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）、又は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で行ってもよい。いくつかの実施形態において、化粧品又は治療剤は、細胞に対する化粧品又は治療剤の効果を決定するために、細胞培養（試験管内）で細胞と接触している。いくつかの実施形態において、化粧品又は治療剤と細胞又は組織との接触は、接触される細胞又は組織を有する対象への化粧品又は治療剤の投与を含む。

【0024】

「治療有効量」又は「有効量」という用語は、投与されたときに、治療中の障害、疾患、又は状態の１つ以上の発症を予防するか、又はある程度緩和するのに十分な化合物の量を含むことを意味する。「治療有効量」又は「有効量」という用語は、研究者、獣医、医師、又は臨床医によって求められている生体分子（例えば、タンパク質、酵素、ＲＮＡ、又はＤＮＡ）、細胞、組織、システム、動物、又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘導するのに十分な化合物の量を指す。

【0025】

「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「生理学的に許容される担体」又は「生理学的に許容される賦形剤」という用語は、液体又は固体の充填剤、希釈剤、溶媒、カプセル化材料などの化粧品的又は薬学的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを意味する。いくつかの実施形態において、それぞれの成分は、「薬学的に許容される」とは、化粧品又は医薬製剤の他の成分と適合し、また、過剰な毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、又はその他の問題や合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に見合った形で、対象（例えば、ヒト又は動物）の組織又は器官と接触して使用するのに適していることを意味である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、22nd ed.；Allen Ed.：Philadelphia, PA, 2012；Handbook of Pharmaceutical Excipients、7th ed.；Rowe et al., Eds.;The Pharmaceutical Press and the American Pharmaceutical Association：2012; Handbook of Pharmaceutical Additives, 3rd ed.；Ash and Ash Eds.; Gower Publishing Company: 2007; Pharmaceutical Preformulation and Formulation、2nd ed.; Gibson Ed.; CRC Press LLC: Boca Raton, FL, 2009を参照。

【0026】

「約（ａｂｏｕｔ）」又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される所定の値に対する許容可能な誤差を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるかに部分的に依存する。いくつかの実施形態では、「約」又は「およそ」という用語は、１、２、３、又は４標準偏差内を意味する。「約」又は「およそ」という用語は、所定の値又は範囲の５０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、又は０．０５％以内を意味する。

【0027】

「有効成分」及び「活性物質」という用語は、障害、疾患、または状態の１つ以上の症状を予防、改善又は治療するために、単独で、又は１つ以上の化粧品又は薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて対象に投与される化合物を指す。本明細書で使用される場合、「有効成分」及び「活性物質」は、本明細書に記載の化合物の光学活性異性体であってもよい。

【0028】

「薬物」、「化粧剤」及び「治療剤」という用語は、障害、疾患、又は状態の１つ以上の症状を予防、改善又は治療するために、対象に投与される化合物又は化粧品あるいはそれらの医薬組成物を指す。

【0029】

Ｃｓｎｋｌａｌ遺伝子によってコードされるカゼインキナーゼ１α（ＣＫ１α）は、β－カテニン分解複合体の成分であり、Ｗｎｔシグナル経路の調節因子である。その除去は、Ｗｎｔとｐ５３の両方の活性化を誘導する。ＣＫ１αは、β－カテニンをＳｅｒ４５でリン酸化し、これにより、ＧＳＫ－３１３によるリン酸化の準備が整う。ＧＳＫ－３１３は、Ｓｅｒ３３、Ｓｅｒ３７、及びＴｈｒ４ｌでβ－カテニンをリン酸化することにより、β－カテニンを不安定化させ、ＳＣＦβ－ＴｒＣＰＥ３によるユビキチン化及びプロテアソーム分解のためにβ－カテニンをマークする。このＣＫ１α依存性リン酸化は、Ｗｎｔ経路の分子スイッチとして機能する。ＣＫ１αのホモ接合性欠損は胚の致死性を引き起こし、胚形成におけるＣＫ１αの基本的な役割を示唆している。マウス腸上皮の研究では、ＣＫ１α欠損がＷｎｔ活性化、細胞老化、及びＤＮＡ損傷応答を誘導し、組織幹細胞を含む多くの種類の組織で強力なｐ５３活性化と細胞老化を引き起こすことがわかった。これらの事実は、ＣＫ１αがさまざまな組織の細胞プロセスに関与しており、少なくとも部分的にｐ５３と協調していることを示唆している。

【0030】

公知の腫瘍抑制タンパク質であるｐ５３は、遺伝子毒性ストレス及びＤＮＡ損傷に対する細胞応答に関与する転写因子である。皮膚では、ｐ５３はＵＶダメージに対しても作用する。ＵＶ照射はｐ５３の活性化を引き起こし、ｐ５３はプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）遺伝子の転写アップレギュレーションを促し、ＰＯＭＣは翻訳後に副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、α－メラノサイト刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）、及びβ－エンドルフィンに変換される。分泌されたα－ＭＳＨはメラノサイトのメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）に結合し、メラニンの生成を引き起こす。メラニンはメラノソーム内に内蔵され、ケラチノサイトに戻され、そこでＵＶに対する保護的な日焼け反応の一部として核上に局在する。ケラチノサイトから分泌されたα－メラノサイト刺激ホルモン（α－ＭＳＨ）は、メラノサイト上のメラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）に結合し、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）の発現を刺激するｃＡＭＰのアップレギュレーションを引き起こす。次にＭＩＴＦは、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質１（Ｔｙｒｐ１）を含む酵素機構の発現を転写的に活性化する。したがって、皮膚では、ｐ５３はｐ５３／ＰＯＭＣ／α－ＭＳＨ／ＭＣ１Ｒ／ＭＩＴＦ皮膚日焼け経路及びＤＮＡ修復／細胞周期停止／アポトーシス経路を介して、ＵＶダメージの防止にも効く。

【0031】

ＵＶは、皮膚がんの主要な外因性因子として認識されている。皮膚のメラニンは、光老化と光発癌からの保護に関与している可能性がある。ユーメラニンは、日光にさらされている間に誘導される天然の日焼け止めである。ヒトのメラノサイトは、暗褐色のメラニンであるユーメラニンと、赤黄色のフェオメラニンを合成する。メラノサイトによるユーメラニンとフェオメラニンの合成の相対速度は、肌の色と太陽ＵＶの劇的な影響に対する肌の感受性を決定する。ユーメラニンは、フェオメラニンよりも安定しており、光分解を受けにくいである。ユーメラニンは、フェオメラニンではなく、ＲＯＳのスカベンジャーとして非常に効率的である。フェオメラニン色素経路は、酸化的損傷のメカニズムによって、ＵＶに依存しないメラノーマの発がん性に寄与する。ユーメラニン含有量と、ＤＮＡ光生成物の主要な形態であるシクロブタンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の生成との間には反比例の関係がある。

【0032】

ＭＣ１Ｒ、その作動薬、及び関与するシグナル経路は、ユーメラニンの合成を調節する役割を果たす。シグナル伝達喪失ＭＣ１Ｒ多型は、色白で、日光に敏感で、皮膚がんになりやすい集団（例：北欧人）によく見られ、フェオメラニンは合成できるが、ユーメラニンはほとんど合成できない。最も一般的なＭＣ１Ｒ変異（Ｄ８４Ｅ、Ｒ１５１Ｃ、Ｒ１６０Ｗ、及びＤ２９４Ｈ）は、赤毛の色、そばかす、及びＵＶ曝露後にやけどしやすい傾向にかかるので、一般に「ＲＨＣ」（赤毛の色）対立遺伝子と呼ばれる。ＲＨＣ変異体のようなシグナル伝達喪失ＭＣ１Ｒの対立遺伝子は、メラノーマやその他の皮膚がんの生涯リスクが最大４倍に増加することに関連している。

【0033】

本明細書に開示されるように、β－カテニン分解複合体の成分であるＣＫ１αの除去は、ｐ５３の安定化を引き起こし、ケラチノサイトにおけるｐ５３依存性ＫｉｔＬの発現を誘導した。ＫｉｔＬは、メラノサイトの受容体ｃ－ｋｉｔに作用してメラニン形成プロセスを開始し、ユーメラニン生成と皮膚の色素沈着過剰を増加させる傍分泌因子である。ＣＫ１α阻害によって誘導されるユーメラニンは、ケラチノサイトのアポトーシスを減少させ、マウスモデルの炎症性サイトカイン生成を減少させて、急性日焼けから皮膚を効率的に保護する。ケラチノサイトにおけるＣＫ１αの阻害は、ｐ５３／ＫｉｔＬ／Ｋｉｔという別の経路を活性化し、発癌性フェオメラニンなしで保護ユーメラニンの生成を誘導する。したがって、ＣＫ１αの阻害は、ＭＣ１Ｒ障害又はＭＣ１Ｒが関与するシグナル経路の機能が低下した集団において、太陽光から皮膚を保護し、ユーメラニン形成を救済するためのＵＶを回避する戦略となることが期待されている。ＣＫ１αの阻害は、ユーメラニンを増加させる可能性を示すだけでなく、メラノサイト細胞数の増加を示し、白斑などの脱色性疾患を治療するためのアプローチを提供する。

【0034】

少なくとも１つの実施形態において、本明細書は、治療有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤（ＣＫＩ）を対象に投与することを含む、対象におけるユーメラニンレベルを増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＫＩは、対象に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、ＣＫＩは、対象の皮膚に局所的に投与される。いくつかの実施形態において、ユーメラニンレベルを増加させるために本明細書で提供される方法は、ユーメラニンレベルをフェオメラニンレベルよりも選択的に増加させることである。いくつかの実施形態において、ユーメラニンレベルを増加させるために本明細書で提供される方法は、ユーメラニンレベルをフェオメラニンレベルよりも少なくとも１０倍以上増加させることである。いくつかの実施形態において、ＣＫＩは、対象の皮膚の選択された領域に局所的に投与されて、対象の標的化された身体部分におけるユーメラニンレベルを増加させる。

【0035】

少なくとも１つの実施形態において、本明細書は、化粧品的又は治療的に有効な量のカゼインキナーゼ１阻害剤（ＣＫＩ）を対象に投与することを含む、対象の皮膚障害、疾患、又は状態を予防、改善又は治療するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、化粧品的又は治療的に有効な量のＣＫＩの投与は、対象に局所的に投与される。

【0036】

少なくとも１つの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、ＵＶの過剰曝露により引き起こされる。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、日光性紅斑、日光性アレルギー、日光性蕁麻疹、日光弾性線維症、光老化、又は日焼けである。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、日焼けである。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、急性日焼けである。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、色素脱失、炎症後の色素脱失又は創傷後色素沈着過剰である。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、低メラニン症（ｈｙｐｏｍｅｌａｎｏｓｉｓ）、特発性滴状低メラニン症、ぶち症、白色粃糠疹、癜風、進行性黄斑低メラニン症、白斑（ｖｉｔｉｌｉｇｏ）、又はワールデンブルグ症候群である。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、白斑である。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、皮膚癌である。いくつかの実施形態において、皮膚の障害、疾患、又は状態は、日光性角化症、非定型ほくろ（ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｏｌｅ）、基底細胞癌（ＢＣＣ）、メラノーマ、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、又は皮膚悪性メラノーマである。

【0037】

本開示のいくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、患者の年齢に関係なく対象を治療することを含むが、いくつかの疾患又は障害は特定の年齢層でより一般的である。

【0038】

本開示のいくつかの実施形態において、本明細書は、有効量のカゼインキナーゼ１阻害剤を対象に投与することを含む、対象をＵＶから保護するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書は、対象において化粧品的又は治療的に有効な量のカゼインキナーゼ１阻害剤を投与することを含む、対象における皮膚色素沈着を増加させるための方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＵＶから対象を保護し、皮膚の色素沈着を増加させるための方法は、対象に局所的に投与される化粧品的又は治療的に有効な量のＣＫＩの投与を含む。いくつかの実施形態において、ＣＫＩは、対象の皮膚の選択された領域に局所的に投与されて、対象の標的化された身体部分に影響を与える。

【0039】

本開示において予防又は治療する方法は、ＣＫ１を阻害することができる薬剤に接触／投与することによって達成される。ＣＫ１は、酵母ないしヒトまで、試験されたすべての生物に見られる、よく保存されたＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼのファミリーである。哺乳類では、ＣＫ１ファミリーは７つの遺伝子（α、β、γ１、γ２、γ３、δ、及びε）から構成されており、１１の選択的スプライシングアイソフォームをコードしている。ＣＫ１ファミリーのメンバーは、保存された触媒ドメインとＡＴＰ結合部位を共有しており、他のキナーゼファミリーとは一線を画している。ＣＫ１は、すべての細胞に遍在する酵素であり、細胞内のさまざまな場所に局在し、Ｗｎｔシグナル伝達以外にもさまざまな細胞プロセスに関与している。

【0040】

いくつかの実施形態において、ＣＫ１阻害剤（ＣＫＩ）は、ｐ５３の発現及び／又は活性を（少なくとも２倍）増加させ、及び／又はＤＮＡ損傷応答（ＤＤＲ）を活性化する。

【0041】

本開示のＣＫ１阻害剤（ＣＫＩ）は、細胞周期を調節するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）などの他のキナーゼ（例えば：Ｃｄｋ２、Ｃｄｋ４、及びＣｄｋ６）と比較して、ＣＫ１に対して少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の阻害活性を有してもよい。さらに、ＣＫ１阻害剤は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、ＰＫＡ、ＨＥＲ２、ｒａｆ－１、ＭＥＫ１、ＭＡＰキナーゼ、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＰＩ３キナーゼ、Ｗｅｅ１キナーゼ、Ｓｒｃ、及び／又はＡｂｌと比較して、ＣＫ１に対して少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の阻害活性を示す。

【0042】

ＣＫＩはＣＫ１－α（ＣＳＮＫ１Ａ；ゲノム、ｍＲＮＡ、又はタンパク質レベルで、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１０２０２７６、ＮＭ＿００１０２５１０５及びＮＭ＿００１０２０２７６）に対して選択的である。したがって、例えば、そのようなＣＫ１阻害剤は、ＣＫ１－δ及びＣＫ１－εと比較して、ＣＫ１－αに対して少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の阻害剤活性を有する。

【0043】

少なくとも１つの実施形態において、カゼインキナーゼ１阻害剤は、以下の一般式Ｉで表され、任意の立体異性体又はその塩を含む。

【0044】

【化1】

、

【0045】

ここで、
Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それらのそれぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換されている。又はＲ_１及びＲ_２は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ_２の少なくとも１つを任意に含んでもよく、かつ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノのうちの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和又は芳香環を形成する。

【0046】

Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立して、Ｈ；ハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択される。又は

【0047】

Ｒ_１又はＲ_２は、Ｒ_３とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ_２の少なくとも１つを任意に含んでもよく、かつ直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成する。

【0048】

Ｒ_５及びＲ_８は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される。

【0049】

Ｒ_６は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員複素環から選択される。

【0050】

Ｒ_７は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される。

【0051】

付加のカゼインキナーゼＩ阻害薬は、国際公開番号第ＷＯ２０１７／０２１９６９に記載されているものを含み、その開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0052】

いくつかの実施形態において、カゼインキナーゼ１阻害剤は、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１、及び式ＩからＶＩＩによって表される化合物からなる群から選択される。

【0053】

【化2】

、

【0054】

ここで、
Ｒ_１及びＲ_２は、それぞれ独立して、Ｈ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルコキシ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アシル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、及びＣ３－Ｃ７ヘテロアリールからなる群から選択され、それらのそれぞれは、ハロゲン化物、ヒドロキシ、エステル、エーテル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、及びアミドの少なくとも１つで任意に置換される。又はＲ_１及びＲ_２は、それらが結合している窒素原子とともに、Ｎ、Ｏ、ＮＨ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ及びＳＯ_２及びの少なくとも１つを任意に含んでもよく、かつ、直鎖又は分枝Ｃ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、ハロゲン化物及びシアノのうちの少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員の飽和、不飽和または芳香環を形成する。

【0055】

Ｒ_３及びＲ_４は、それぞれ独立して、Ｈ；ハロゲン化物、ヒドロキシ、アルコキシ、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、エステル及びアミドの少なくとも１つで任意に置換された直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキルからなる群から選択される。又は

【0056】

Ｒ_１又はＲ_２は、Ｒ_３とそれらがそれぞれ結合している炭素原子及び窒素原子とともに、Ｎ、ＮＨ、Ｏ、Ｃ＝Ｎ、Ｃ＝Ｏ、及びＳＯ_２、の少なくとも１つで任意に含んでもよく、かつ、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ５アルキル、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ヒドロキシ、カルボニル、及びハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換されてもよい４～７員飽和、不飽和又は芳香環を形成する。

【0057】

Ｒ_５及びＲ_８は、それぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン化物；少なくとも１個のハロゲン化物で任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される。

【0058】

Ｒ_６は、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される、直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニル、Ｃ５－Ｃ１０シクロアルキル、及び飽和又は不飽和４～６員の複素環からなる群から選択される。

【0059】

Ｒ_７は、Ｃ３－Ｃ７シクロアルキル、４～６員複素環、Ｃ５－Ｃ１５アリール、Ｃ３－Ｃ７ヘテロアリール、ハロゲン化物、ヒドロキシ、及びＣ１－Ｃ５アルキルハロゲン化物の少なくとも１つで任意に置換される直鎖又は分岐したＣ１－Ｃ８アルキル、直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルケニル、及び直鎖又は分岐したＣ２－Ｃ８アルキニルからなる群から選択される。

【0060】

【化3】

【0061】

本明細書で使用される局所投与には、（内）皮膚、結膜、角膜内、眼内、眼科、耳介、経皮、鼻内、膣内、尿道、呼吸、及び直腸の投与が含まれる。

【0062】

本明細書で提供される化粧品又は医薬組成物は、局所的または全身的な効果を得るための局所投与に適した任意の剤形で製剤化することができ、乳剤、溶液、懸濁液、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、軟膏、散布剤、包帯剤、エリキシル剤、ローション、懸濁液、着色剤、ペースト、フォーム、フィルム、エアロゾル、洗浄剤、スプレー、坐剤、包帯、及び皮膚パッチなどが含まれ。また、本明細書で提供される化粧品又は医薬組成物の局所製剤は、リポソーム、ミセル、ミクロスフェア、ナノシステム、及びそれらの任意の混合物を含んでもよい。

【0063】

本明細書で提供される局所製剤に使用するのに適した化粧品的又は薬学的に許容される担体及び賦形剤には、水性ビヒクル、水混和性ビヒクル、非水性ビヒクル、微生物の増殖に対する抗菌剤又は防腐剤、安定剤、溶解性向上剤、等張剤、緩衝剤、酸化防止剤、局所麻酔剤、懸濁剤・分散剤、湿潤剤・乳化剤、錯化剤、封鎖剤・キレート剤、浸透促進剤、凍結防止剤、凍結保護剤、増粘剤、及び不活性ガスが含まれるが、これらに限定されない。

【0064】

また、化粧品又は医薬組成物は、電気穿孔法、イオントフォレーシス、フォノフォレシス、ソノフォレーシス、マイクロニードル又は無針注射によって局所的に投与でき、例えば、ＰｏｗｄｅｒＴｅｃｔ（カイロン社、エメリービルＣＡ）及びＢｉｏｊｅｃｔ（Ｂｉｏｊｅｃｔ医療技術会社、テュアラティン、ＯＲ）などがある。

【0065】

本明細書で提供される化粧品又は医薬組成物は、軟膏、クリーム、及びゲルの形態で提供できる。適当な軟膏ビヒクルとしては、ラード、ベンゾイン化ラード、オリーブ油、綿実油、及び他の油、白色ワセリンを含む油性又は炭化水素ビヒクル；親水性ワセリン、ヒドロキシステアリン硫酸塩、及び無水ラノリンなどの乳化性又は吸収性ビヒクル；親水性軟膏などの水除去性ビヒクル、様々な分子量のポリエチレングリコールを含む水溶性軟膏ビヒクル；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセリル、ラノリン、及びステアリン酸を含む、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョン又は水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンのいずれかのエマルジョンビヒクル（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacyを参照）が含まれる。これらのビヒクルにはエモリエント効果はあるが、一般的に酸化防止剤と防腐剤を添加する必要がある。

【0066】

適当なクリームベースは、水中油型又は油中水型であってもよい。適当なクリームビヒクルは、水洗可能で、油相、乳化剤、及び水相を含むことができ。油相は「内相」とも呼ばれ、一般的にワセリンとセチルアルコールやステアリルアルコールなどの脂肪アルコールで構成される。水相は必ずしもそうではないが、通常、油相よりも体積が大きく、一般的に保湿剤を含んでいる。クリーム製剤中の乳化剤は、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、又は両性の界面活性剤であってもよい

【0067】

ゲルは、半固体、懸濁液タイプのシステムであってもよい。単相ゲルには、液体担体全体に実質的に均一に分布した有機高分子が含まれている。適当なゲル化剤は、カルボマー、カルボキシポリアルキレン、及びカルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）などの架橋アクリル酸ポリマー；ポリエチレンオキシド、ポリオキシエチレン－ポリオキシプロピレンコポリマー、及びポリビニルアルコールなどの親水性ポリマー；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びメチルセルロースなどのセルロース系ポリマー；トラガカントガムやキサンタンガムなどのガム；アルギン酸ナトリウム；及びゼラチンを含むが、これらに限らない。均一なゲルを調製するために、アルコール又はグリセリンなどの分散剤を添加するか、又はゲル化剤を粉砕、機械的な混合、及び／又は攪拌によって分散させることができる。

【実施例】

【0068】

本開示の例示的な実施形態は、以下の実施例でさらに説明されているが、これは、本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0069】

一般に、本明細書で使用される命名法及び本開示で記載される実験手順には、分子的、生化学的及び組換えＤＮＡ技術が含まれる。このような技術は文献で詳しく説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋなどの「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒ．Ｍ．編集の「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」第Ｉ－ＩＩＩ巻（１９９４）；Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓの「分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎなどの「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ）」、サイエンティフィック・アメリカンブック；Ｂｉｒｒｅｎなど（編）の「細胞生物学：実験室ハンドブック（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）」、第Ｉ－ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ、Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「動物細胞の培養－基本的なテクニックのマニュアル（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ - Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ。（１９９４）、第三版；「転写及び翻訳（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）」、Ｈａｍｅｓ、Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．、編（１９８４）；「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｒ。Ｉ．、編（１９８６）；「固定化細胞及び酵素（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ）」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「分子クローニングの実用ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｐｅｒｂａｌ、Ｂ．、（１９８４）及び「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、第１－３１７巻、アカデミック・プレス；「ＰＣＲプロトコール：方法及び応用ガイドトン（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、アカデミック・プレス、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋなど、「タンパク質の精製と特性評価のための戦略-実験コースマニュアル（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ-Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨＬプレス（１９９６）；を参照。これらのすべては、本明細書に完全に記載されているのように参照により組み込まれる。他の一般的な参考文献は、この開示全体を通して提供される。その中の手順は当技術分野でよく知られていると考えられており、読者の便宜のために提供されている。そこに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0070】

材料及び方法

【0071】

マウス

【0072】

Ｔｙｒ－ＣｒｅＥＲ／ＦｕｓｉｏｎＲｅｄマウスは、メラノサイト特異的チロシナーゼプロモーターによって駆動されるＣｒｅ－組換え（Ｃｒｅ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）からのＦｕｓｉｏｎＲｅｄ蛍光によってメラノサイト幹細胞を追跡するように設計されている。位置５４９で１つの単一ヌクレオチドが欠失して１２アミノ酸のフレーム外変異を引き起こす変異Ｍｃ１ｒ遺伝子を持つＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して生成された。次に、黄色の毛色のＭＣ１Ｒ変異マウスをＫ１４－ＣｒｅＥＲ；ＣＫ１α^ｆ／ｆマウスと交配して、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲ；ＣＫ１α^ｆ／ｆ；ＭＣ１Ｒ^{ＫＩ／ＫＩ}マウスを作成した。変異マウスと野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、台湾の台南にある国立実験動物センターで作成された。実験と動物の世話は、台湾の花蓮にある慈済大学の実験動物センターで行われた。

【0073】

ＣＫＩとその局所使用の準備

【0074】

本開示で使用されるＣＫ１α（ＣＫＩ）を標的とする小分子阻害剤は、Ｙｉｎｏｎ Ｂｅｎ－Ｎｅｒｉａｎ博士によって開発され、贈与された。ＣＫＩの詳細が公開された（Ｍｉｎｚｅｌ Ｗ．、Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ Ａ．、Ｆｉｎｋ Ａ．、など「Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｃｏ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＫ１α ａｎｄ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｋｉｎａｓｅｓ ＣＤＫ７／９ Ｃｏｎｔｒｏｌ ＡＭＬ ｉｎ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｓ．」細胞。２０１８。１７５（１）：１７１－１８５）。

【0075】

本開示において、マウス皮膚への局所投与のために、１ｍｇのＣＫＩを６μＬのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、６０％のホワイトワックス及び４０％のパラフィン油を含む５４μＬのビヒクルと混合した。

【0076】

ヒトの皮膚外植片に局所使用するために、６μＬのＤＭＳＯに１ｍｇを含むＣＫＩ溶液を５９４μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して使用した。最終作業濃度は０．０１ｍｇ／６μＬである。

【0077】

さらに、本開示では、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１を含む、既知のカゼインキナーゼ１阻害活性を有する他の化合物も試験された。Ｄ４４７６は、最初Ｒｅｎａ Ｇ．などにより、ジャーナル記事「ＣＫ１の細胞透過性阻害剤であるＤ４４７６は、ＦＯＸＯ１ａの部位特異的リン酸化と核排除を抑制する（Ｄ４４７６、ｃｅｌｌ－ｐｅｒｍｅａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＣＫ１、ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ＦＯＸＯ１ａ）。」ＥＭＢＯ Ｒｅｐ． ２００４ Ｊａｎ． ５（１）：６０－５で報告され、ＩＣ２６１は、Ｍａｓｈｈｏｏｎ Ｎ．，などにより、ジャーナル記事「コンフォメーション選択的カゼインキナーゼ１阻害剤の結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ－１ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｊｕｎ ３０． ２７５（２６）：２００５２－６０で報告された。また、両方の分子は商業的に入手することができる。

【0078】

ヒトの皮膚の外植片

【0079】

ヒト包皮は、試験管内での外植片培養実験に使用された。ＩＲＢは、花蓮慈済病院の研究倫理委員会（ＩＲＢ１０７－５１－Ａ）によって承認された。脂肪を取り除いた後、あらかじめに０．１％ゼラチンでコーティングしたプレートに試料を移した。包皮外植片は、５％のＣＯ_２を添加した加湿インキュベーター内で、３７℃で２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。２４時間後、０．０１ｍｇのＣＫＩを１日間隔で２回培養皮膚に滴下し、合計０．０２ｍｇのＣＫＩを投与した。ＣＫＩ投与の５日後、組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、パラフィンで包埋して組織学的検査を行った。さらに、表皮と真皮はテルモリシンによって分離された。表皮の総タンパク質は、Ｔ－ＰＥＲ組織タンパク質抽出試薬（７８５１０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって抽出して、ウエスタンブロッティング分析を行った。

【0080】

フォンタナ－マッソン及びヘマトキシリン及びエオシン染色

【0081】

皮膚生検は４％ホルマリン又はパラホルムアルデヒドで固定され、パラフィンに包埋された。切片はミクロトームで５μｍの厚さに切り取られた。

【0082】

フォンタナ－マッソン及びヘマトキシリン及びエオシン染色は、ＳｃｙＴｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社のキットを用いて、メーカーの指示に従って実行した。

【0083】

フォンタナ－マッソン染色では、簡単に説明すると、アンモニア性銀溶液を５８～６０℃の水浴で予熱した。切片を脱パラフィンし、蒸留水で水和して、温めたアンモニア性銀溶液中で、黄色が現れるまで３０分間インキュベートした。次に、スライドを塩化金溶液（０．２％）で３０秒間インキュベートすると、この工程でメラニン染色が黒色としてはっきりと観察された。最後に、スライドを核ファストレッド溶液で５分間処理した後、無水アルコールで脱水した。

【0084】

免疫組織化学

【0085】

免疫組織化学は、９５℃で３０分間の抗原賦活化溶液（クエン酸塩ｐＨ６．０、Ｄａｋｏ Ｓ２３６９８４）で示され、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックするためにｄｄＨ_２Ｏ中の３％過酸化水素を使用した。一次抗体を４℃で一晩投与した後、二次抗体と室温で３０分間インキュベートした。シグナルは、ＡＥＣ ＋ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ－Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ（Ｋ３４６１１１、Ｄａｋｏ）又はＤａｋｏ ＲＥＡＬ ＥｎＶＤｅｔｅｃｔＳｙｓ Ｐｅｒｏｘ／ＤＡＢ ＋、Ｒｂ／Ｍ（Ｋ５００７１１、Ｄａｋｏ）によって検出され、ヘマトキシリンで対比染色され、水性又は有機ベースの培地で配置された。

【0086】

蛍光染色のために、二次抗体のインキュベート後、数滴の水性封入剤を４'，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）（ＣｈｅｍＣｒｕｚ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で拭き、カバースライドで覆って、４℃で保存して分析を行った。イメージングは、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ２）を使用して取得した。

【0087】

ウエスタンブロット

【0088】

組織を用いた実験では、組織を均質化した後、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む１ｘ組織タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で溶解し、氷に保持した。細胞を用いた実験では、細胞ペレットを収集し、プロテアーゼ阻害剤（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む１ｘ放射性免疫沈降評価（ＲＩＰＡ）溶解バッファーで溶解し、氷に保持した。総タンパク質濃度は、マイクロプレートリーダーでメーカーの指示に従って、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｄｙｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して決定した。サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプルバッファー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で希釈し、９５℃で５分間加熱した。次に、タンパク質サンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（ＴＧＸ ＦａｓｔＣａｓｔアクリルアミド溶液、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で分離し、ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。５％ＢＳＡを使用した後、メンブレンを一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、メンブレンをＴｗｅｅｎ ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）で洗浄し、二次抗体と室温で１時間インキュベートした。信号は、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのｉＢｒｉｇｈｔＦＬ１０００ ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍを使用して検出された。

【0089】

抗体

【0090】

本開示における免疫組織化学（ＩＨＣ）及びウエスタンブロッティング（ＷＢ）で使用される抗体は、以下の表１に示され、メーカー、カタログ番号、及び使用される希釈比が提供された。

【0091】

【表1】

【0092】

ＵＶＢ照射

【0093】

ＵＶＢ照射の前に、マウスの毛皮を剃り、切り取った。７５０ｍＪ／ｃｍ^２～１，０００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ照射は、マイクロプロセッサ制御のＵＶ照射システム－３２１ｎｍ（ＷｉｔｅｃＡＧのＢＬＸ－３１２）で実行された。照射の２４時間後、マウスの皮膚を採取して分析した。

【0094】

ユーメラニン及びフェオメラニン分析

【0095】

表皮シートの分離のために、ＣＫＩ治療を完了したマウスの尾の皮膚を入手した。皮膚サンプルを測定し、Ｃａ^２＋－、Ｍｇ^２＋のないＰＢＳ（ｐＨ７．４）でリンスして血液汚染物質を除去した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の０．２５％トリプシン（Ｄｉｆｃｏ． Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で２８℃で１６～１８時間処理した。表皮と真皮を分離し、使用するまで－８０℃で保存した。

【0096】

メラニン含有量の評価のために、組織をはさみで細かく切り刻み、２８℃で１０倍量のＰＢＳで均質化した。

【0097】

表皮及び真皮のサンプルは、ユーメラニンの化学分析には特定の分解生成物であるピロール－２，３，５－トリカルボン酸（ＰＴＣＡ）を検出することで、、フェオメラニンの化学分析には特定の分解生成物である４－アミノ－３－ヒドロキシフェニルアラニン（４－ＡＨＰ）を検出することで処理された。１ナノグラムのＰＴＣＡ又は４－ＡＨＰは、５０ｎｇのユーメラニン又は９ｎｇのフェオメラニンに相当する。ユーメラニンとフェオメラニンの含有量の違いの統計的有意性は、同じサイズのグループの比較によるスチューデントのｔ検定によって決定された。

【0098】

細胞培養

【0099】

ヒトのケラチノサイトとメラノサイトは、ヒトの包皮から培養された。ケラチノサイトは、完全無血清培地であるケラチノサイト無血清培地（ＳＦＭ）、又はＫ－ＳＦＭで培養し、、使用時にはヒト組換え上皮成長因子（ｒＥＧＦ）及びウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）（Ｇｉｂｃｏ、１７００５０４２）を添加した。メラノサイトは、ヒトメラノサイト増殖サプリメント（ＨＭＧＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｍ２５４５００）を含む培地２５４で培養された。培養物は３７℃及び５％ＣＯ_２で維持された。ケラチノサイトＫｉｔのリガンド分泌は、ヒトのＳＣＦ ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、ａｂ１７６１０９）によって検出された。すべての手順はメーカーの指示に従った。

【0100】

メラノサイト移動評価

【0101】

創傷治癒評価は、細胞移動を検出するために採用された。具体的には、メラノサイトを培養インサートにウェルあたり１０^３細胞の密度で播種した。細胞を一晩付着させた後、培養インサートを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄して非付着細胞を除去した。ＣＫＩの含まない或いは含む新鮮な培地を添加して、２４時間培養した。創傷空間に移動した細胞の数は、光学顕微鏡（オリンパス、ＣＫＸ５３）でウェルあたり３つのフィールドで手動で計算した。次に、ＩｍａｇｅＪ分析を使用して面積を定量化した。

【0102】

統計分析

【0103】

本開示における統計分析は、分析結果を平均±標準偏差として示す。グループ間の比較には、スチューデントのｔ検定を適用した。０．０５未満のＰ値は統計的に有意であると見なされた。

【0104】

実施例１．野生型マウスに対する局所ＣＫＩ投与のＵＶ保護効果

【0105】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、局所ＣＫＩの安全用量をテストするための実験モデルとして使用された。ＣＫＩは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの耳に、１回の塗布量が０．１ｍｇとなるように、１日おきの頻度（Ｑ．Ｏ．Ｄ．）で４週間局所的に投与された。したがって、ＣＫＩは週に３回局所的に投与され、合計０．３ｍｇのＣＫＩが週に投与され、合計１．２ｍｇのＣＫＩが４週間にわたって投与された。

【0106】

マウスの表現型を毎週記録した。図１Ａに示すように、耳のサンプルは、組織分析のために、１２回の局所ＣＫＩ投与で合計１．２ｍｇのＣＫＩを投与した後、６週目の終わりに採取された。

【0107】

図１Ｂ及び図１Ｄに示すように、表現型の写真は、対照群と比較して、局所ＣＫＩ治療後にマウスの耳の皮膚の色が目に見えて暗くなることを示した。処理されたＣＫＩの総用量は１．２ｍｇ（図１Ｂ）又は５ｍｇ（図１Ｄ）であった。図１Ｂ及び図１Ｄにも示されているように、フォンタナ－マッソン染色は、表皮のメラニンの量が１．２ｍｇＣＫＩの治療後にすでに有意に増加し、５ｍｇＣＫＩの治療後にさらに強くなることを示した。さらに、ｃ－Ｋｉｔ染色は、ケラチノサイト及び表皮のメラノサイトの受容体ＫＩＴも有意に増加したことを示した。これらの結果は、局所ＣＫＩがＵＶ日焼けと同じ方法で皮膚の色素沈着と表皮厚度を増加させることを明らかにした。

【0108】

マウスの皮膚において、メラノサイトは主に真皮に存在した。図１Ｃに示すように、ユーメラニンとフェオメラニンの分析は、１．２ｍｇＣＫＩの局所治療後、ユーメラニンの含有量が皮膚で有意に増加し、増加したユーメラニンは主に真皮ではなく表皮に局在し、ユーメラニンとフェオメラニンの比率が有意に増加することを示した。したがって、局所的なＣＫＩの投与は、真皮から表皮へのメラノサイトの移動につながる傍分泌因子を誘導する可能性がある。図１Ｅに示すように、合計５ｍｇのＣＫＩで処理したマウスは、ユーメラニンとフェオメラニンの比率が大幅に増加したことも観察された。

【0109】

メラノサイト幹細胞の挙動を調査するために、レポーターマウスＴｙｒ：：ＣｒｅＥＲ^Ｔ２；Ｇ／ｍＲが作製された。このレポーターマウスにタモキシフェンを誘導することにより、緑色蛍光（ＧＦＰ）を発現する組織内の他の細胞の中で、メラノサイトが膜上で赤い蛍光（Ｆｕｓｉｏｎ Ｒｅｄ）を特異的に発現することができる。したがって、レポーターマウスはメラノサイトの移動を追跡するために使用される。図１Ｆに示すように、局所ＣＫＩ治療の前には、メラノサイトは主に真皮に制限されており、表皮にはほとんど存在しなかった（左写真を参照）。しかし、合計１．２ｍｇのＣＫＩの局所治療後、表皮のメラノサイト数が大幅に増加し（右のグラフに示すように）、局所ＣＫＩが真皮から表皮へのメラノサイトの移動を誘導したことを示した。さらに、皮膚組織のウエスタンブロッティング分析は、図１Ｇに示すように、メラノサイトの移動と生存に関わる因子として知られるＫｉｔリガンド（ＫｉｔＬ）が局所ＣＫＩ治療後に増加したことを示した。また、図１Ｇから、主要なメラノサイト調節転写因子であるＭＩＴＦと、メラニン形成の律速酵素であるチロシナーゼは、いずれも有意にアップレギュレーションされていた。これらの結果は、局所ＣＫＩがＫｉｔリガンド生成を誘導し、それがメラノサイトの表皮への移動を促進し、メラニン形成を刺激することを確認した。

【0110】

さらに、局所ＣＫＩ治療の光防護効果は、ＵＶＢ照射後の皮膚におけるシクロブテンピリミジンダイマー（ＣＰＤ）の量を測定することによって調べられた。図１Ｈに示すように、７５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ照射の２４時間後にマウスの皮膚を採取し、合計０．６ｍｇのＣＫＩを投与したＣＫＩ治療群の皮膚を免疫組織化学的に分析したところ、ＣＫＩ投与なしの対照群に比べて、ＵＶ照射による損傷を表すＣＰＤ^＋細胞が少ないことが示された。これは、局所ＣＫＩが皮膚にＵＶ保護機能を発揮することを示す。

【0111】

実施例２．ＭＣ１Ｒ変異マウスへのＣＫ１α阻害及び局所ＣＫＩ投与は、メラニン生成を誘導し、ＭＣ１Ｒ変異マウスをＵＶＢによるＤＮＡ損傷から保護する。

【0112】

メラノコルチン受容体（ＭＣＲ）は、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーに属し、機能と組織での発現に応じて、ＭＣ１Ｒ、ＭＣ２Ｒ、ＭＣ３Ｒ、ＭＣ４Ｒ、ＭＣ５Ｒを含む５つのメンバーに分類される。ＵＶ保護の役割で、ＭＣ１Ｒはプロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）に由来するメラノコルチンと呼ばれるペプチドホルモンによって活性化される。α－ＭＳＨは、ケラチノサイトから分泌されるメラノコルチンの一種で、ヒトの皮膚の色素沈着の責任を負う。したがって、ユーメラニンの生成には、ＰＯＭＣ／α－ＭＳＨ／ＭＣ１Ｒ経路が関与している。上に示したように、ＣＫＩの局所投与によるＣＫ１α阻害はＫｉｔＬ／Ｋｉｔ経路を活性化し、ＭＣ１Ｒ変異を有するマウスにおけるＣＫ１α阻害の効果を示すためにさらに調査される。

【0113】

変異を有するＭＣ１Ｒ変異マウスが報告されており、当該変異ＭＣ１Ｒ遺伝子は、ＭＣ１Ｒ遺伝子の５４９位の単一ヌクレオチドを欠失させて、１２アミノ酸のアウトオブフレーム変異を起こす（Ｍｏｕｎｔｊｏｙ、Ｒｏｂｂｉｎｓなど、１９９２）。ＫｉｔＬ／Ｋｉｔシグナル経路がメラニン生成におけるＣＫＩの代替標的であることを証明するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるＭＣ１Ｒ遺伝子の５４９位の単一ヌクレオチドの欠失を伴うＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスを作製した。この欠失はフレームシフト変異を引き起こし、ＭＣ１Ｒタンパク質の機能が失われることで、メラノサイトがフェオメラニンを独占的に合成し、ユーメラニンを合成できないので、図２Ａの写真に示すように、マウスの毛色が黄色になる。

【0114】

図２Ｂに示すように、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスとＫ１４－ＣｒｅＥＲ；ＣＫ１α^ｆ／ｆマウスと交配させ、Ｋ１４－ＣｒｅＥＲ；ＣＫ１α^ｆ／ｆ；ＭＣ１Ｒ^{ＫＩ／ＫＩ}マウスを作成し、誘導性ＭＣ１Ｒ変異マウスを取得した。図２Ｃは、誘導性Ｋ１４－ＣｒｅＥＲ；ＣＫ１α^ｆ／ｆ；ＭＣ１Ｒ^{ＫＩ／ＫＩ}マウスのケラチノサイトにおいてＣＫ１αを除去するために用いた流れを示す。具体的には、７週齢のマウスのケラチノサイトにおけるＣＫ１α除去は、矢印で示された日に合計６回、１００ｍｇ／ｋｇのタモキシフェンの腹腔内注射によって誘導された。１４、２８、４２日目に皮膚サンプルを採取して分析した。図２Ｄは、ケラチノサイトでＣＫ１αが除去されたＭＣ１Ｒ変異マウスの皮膚の表現型を示し、ケラチノサイトでＣＫ１αが除去されていないＭＣ１Ｒ変異マウスと比較して、２８日目に尾の色素沈着が増加したことがわかった。さらに、フォンタナ－マッソン染色では、図２Ｅに示すように、ケラチノサイトでのＣＫ１α除去後の１４日目、２８日目、４２日目の時間経過分析で、表皮厚度が増加するとともに、表皮、真皮、又は皮膚全体のユーメラニン色素沈着が増加していることが示され、また、皮膚全体、表皮及び真皮におけるフォンタナ－マッソン染色細胞の数を定量化して、図２Ｆのヒストグラムに示した。

【0115】

メラニン生成及びＵＶＢによるＤＮＡ損傷からの保護に対する局所ＣＫＩ投与の効果を調査するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスは、実施例１における野生型に使用されたのと同じ流れである図２Ｇに示す流れに従って局所ＣＫＩ治療を受けた。図２Ｈに示すように、フォンタナ－マッソン染色は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスで合計１．２ｍｇのＣＫＩ処理を行った後、表皮厚度の増加と表皮のメラニンの増加を示した。さらに、皮膚組織のウエスタンブロッティング分析では、図２Ｉに示すように、ＣＫＩ治療群でのＫｉｔリガンド（ＫｉｔＬ）、ｃ－Ｋｉｔ、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、及びｐ５３のタンパク質レベルの上昇を示した。図２Ｊに示すように、ＥＭ／ＰＭの比率の増加は、合計ＣＫＩ ２．６ｍｇの局所投与で治療されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスでも見られた。また、図２Ｋに示すように、合計０．６ｍｇの局所ＣＫＩで治療されたＭＣ１Ｒ変異マウスに７５０ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ照射を適用した後、局所ＣＫＩはＭＣ１Ｒ変異マウスのＣＰＤ形成も減少させた。より多くのＣＰＤ染色結果が図２Ｌに示され、局所ＣＫＩがＭＣ１Ｒ変異体及び野生型マウスの表皮、皮脂腺、及び毛包上皮細胞のＵＶＢによるＣＰＤを低下させることがわかった。結果は、局所ＣＫＩが通常の野生型マウスと同じようにＭＣ１Ｒ変異マウスのｐ５３／Ｋｉｔ－Ｌｉｇａｎｄ／ｃ－ｋｉｔ経路を活性化し、局所ＣＫＩ治療がメラニンの生成を促進し、皮膚をＵＶ照射の損傷から保護することを示した。

【0116】

実施例３．局所ＣＫＩ投与は、ヒトの皮膚外植片におけるメラニン生成を増加させ、ＵＶＢ曝露によるＤＮＡ損傷を予防する

【0117】

マウスの耳の皮膚とは異なり、ヒトの皮膚は表皮が厚く、メラノサイトは主に表皮に存在する。局所ＣＫＩがヒトの皮膚に及ぼす影響を調べるために、包皮を使用し、試験管内のヒトの皮膚外植片培養モデルを構築した。図３Ａに示す治療流れに従って、実施例１および２でマウスに使用したものと比較してはるかに低い用量である合計０．０２ｍｇのＣＫＩをヒトの皮膚に局所投与したところ、ＣＫＩで治療したヒトの皮膚外植片は、溶媒のみで処理された対照群と比較して、色が目に見えて濃くなった。図３Ｂは、合計０．０２ｍｇの局所ＣＫＩ治療後のＥＭ／ＰＭ比の増加を示す。また、図３Ｃに示す免疫組織化学的分析では、メラノサイトのマーカーであるＭｅｌａｎ－ＡとＴｒｐ－１の両方が染色で増加していることがわかった。これらの結果は、局所ＣＫＩ治療後の表皮におけるメラノサイト数の増加を示した。さらに、フォンタナ－マッソン染色では、表皮でのメラニン量が大幅に増加していることも示された。図３Ｄは、ヒト外植片組織のウエスタンブロッティング分析結果を示し、局所ＣＫＩ治療後にｐ５３やβ－カテニンなどのＣＫ１αの下流タンパク質、及びＫｉｔリガンド、ｃ－ｋｉｔ受容体、ＭＩＴＦ、及びチロシナーゼなどの色素沈着関連タンパク質の発現レベルは、いずれも上昇したことが明らかになった。さらに、局所ＣＫＩ治療後のヒト皮膚外植片に１Ｊ／ｃｍ^２ＵＶＢを照射し、６時間後にＣＰＤ分析のために収集した。ＣＰＤ分析の結果は、図３Ｅに示すように、溶媒のみを投与した対照群と比較して、ＣＫＩ治療群のＣＰＤレベルの低下を示し、局所ＣＫＩ治療がＵＶ誘導ＤＮＡ損傷からヒトの皮膚を保護することを示した。

【0118】

実施例４．ヒトのケラチノサイト及びメラノサイトに対するＣＫＩ治療は、ＫｉｔＬ生成及びメラノサイトの増殖、成熟、及び移動を増加させる

【0119】

皮膚では、ケラチノサイトは傍分泌成長因子と細胞間接着接合部のシステムを介してメラノサイトと相互作用し、安定した皮膚の恒常性バランスを保っている。この実施形態において、ケラチノサイト及びメラノサイトの初代培養物は、ヒト包皮から調製された。初代ヒトのケラチノサイトを表示した濃度のＣＫＩで３日間処理し、条件培地を収集してメラノサイトを３日間処理するために使用した。

【0120】

ケラチノサイトでそれぞれ１０、２０、及び５０ｎＭのＣＫＩ処理を３日間行った後、ウエスタンブロッティング分析により、図４Ｂに示すように、ｐ５３、β－カテニン、ＫｉｔＬ、及びｃ－Ｋｉｔの発現がすべて用量依存的に増加したことが示された。また、ケラチノサイト培養物の培地を収集して、ＫｉｔＬのＥＬＩＳＡ分析を行った。その結果、図４Ｃに示すように、ＫｉｔＬ濃度は、５０及び７５ｎＭのＣＫＩ処理後のケラチノサイト培養培地の両方では増加することがわかった。

【0121】

さらに、培養したケラチノサイトに由来する条件培地を使用してヒトメラノサイトを処理し、メラノサイトの細胞挙動を調べた。ＨＭＢ４５はメラニントランスポーターのメラノソームのマーカーであり、ＨＭＢ４５抗体による染色は、図４Ｄに示すように、メラノソームの強度、メラノサイトの細胞数、及びメラノサイトの樹状突起の長さがすべてＣＫＩ処理条件培地によって増強されることを示した。ウエスタンブロッティング分析は、図４Ｅに示すように、メラノサイトで用量依存的にチロシナーゼとＭＩＴＦの発現が増加していることを示し、ケラチノサイト由来のＫｉｔＬの傍分泌効果を示す。

【0122】

メラノサイトに対するＣＫＩの影響も調べた。様々な濃度のＣＫＩを初代メラノサイト培養物に加えた。図４Ｆに示すように、ＣＫＩの存在下では、ＭＩＴＦ、チロシナーゼ、リン酸化ＭＫＫ６などのメラノサイト成熟に関与する因子はすべて用量依存的に増加した。さらに、メラノサイトの移動能力も移動評価で調査され、図４Ｇに示すように、ＣＫＩ処理はメラノサイトの移動を有意に増加させた。これらの結果は、ＣＫＩ処理がケラチノサイト由来のＫｉｔＬを介したメラノサイトの挙動だけでなく、メラノサイトの機能にも直接影響を与えることを示す。

【0123】

実施例５．付加のカゼインキナーゼ１阻害剤のＵＶ保護効果。

【0124】

前の実施形態で使用されたＣＫＩに加えて、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１などの他の既知のカゼインキナーゼ１阻害剤についても、マウス皮膚、ヒト皮膚外植片及びヒトのケラチノサイトに対するそれらのＵＶ保護効果を調べた。

【0125】

図５Ａに示すように、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１をＣ５７ＢＬ／６Ｊ－Ｍｃ１ｒ^ｅｍ１マウスに０．０４ｍｇ／回及び０．１２ｍｇ／週で２週間局所投与し、合計０．２４ｍｇを投与し、３週目に耳の皮膚を採取して組織分析を行った。

【0126】

図５Ｂは、実施例２に示した結果と同様に、Ｄ４４７６及びＩＣ２６１の０．２４ｍｇ処理後に、Ｋｉｔ－Ｌ、ｃ－Ｋｉｔ、及びチロシナーゼの発現が増加したことを示す。

【0127】

ヒトの皮膚外植片へのＤ４４７６の局所投与も、実施例３のＣＫＩと同様のＵＶ保護効果を示した。図６Ａの治療流れに示されるように、ヒトの包皮を１２ウェルプレートで２４時間培養した後、それぞれ０．０４または０．０５ｍｇのＣＫＩで２回処理し、合計０．０８又は０．１ｍｇのＣＫＩを投与された。５日目に、上記のＣＫＩ処理を受けた試料に１，０００ｍＪ／ｃｍ^２のＵＶＢ照射を行った。その後の分析のために、ＵＶ照射の６時間後にサンプルを採取した。

【0128】

試料のフォンタナ－マッソン染色による組織学では、図６Ｂに示すように、合計０．１ｍｇのＤ４４７６で処理された表皮のメラニン強度の増加が示された。図６Ｃに示されているウエスタンブロッティング分析、及び図６Ｄに示されている定量化された相対的発現レベルは、図３の前のＣＫＩに示されたものと同様に、ｐ５３及びβ－カテニンが安定化し、０．１ｍｇのＤ４４７６で処理した検体では、対照群と比較して、ＫｉｔＬ、ｃ－Ｋｉｔ、チロシナーゼが増加したことを示した。さらに、図６ＥのＣＰＤ染色結果では、０．０８ｍｇのＤ４４７６で処理された試料でＣＰＤの低下を示し、０．０８ｍｇの量のＤ４４７６をヒトの皮膚に局所投与することで、ＵＶによるＤＮＡ損傷を予防及び保護できることを示す。

【0129】

付加のカゼインキナーゼ１阻害剤を使用して、ヒトのケラチノサイト培養物でのＫｉｔＬ生成に対する効果を調べた。図７Ａに示すように、Ａ５１に加えて、異なる濃度のＣＫＩ７、Ｄ４４７６、ＩＣ２６１を含む３つの付加のカゼインキナーゼ１阻害剤を使用し、ヒトのケラチノサイトを処理し、ＫｉｔＬ発現レベルを試験した。Ａ５１はＹｉｎｏｎＢｅｎ－Ｎｅｒｉａｈ博士から贈与されたＣＫＩであり、Ｄ４４７４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｄ１９４４）及びＩＣ２６１（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ４０００９０）は市販されており、ＤＭＳＯに溶解した。ＣＫＩ７は市販の別のＣＫＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃ０７４２）であり、ｄｄＨ_２Ｏに溶解した。試験されたすべてのカゼインキナーゼ１阻害剤は、β－カテニンの発現がＣＫＩ処理によって安定化されたことを示した。ＫｉｔＬの発現は、ＣＫＩ、ＣＫＩ７、Ｄ４４７６、及びＩＣ２６１で７２時間処理した後、ＤＭＳＯ又はモック（Ｍｏｃｋ）と比較して増加した。モックは、ケラチノサイトがＤＭＳＯ又はＣＫＩで処理されていない実験の比較群であった。図７Ｂにおいて、ヒトのケラチノサイトに対する５００ｎＭから５０００ｎＭの濃度でのＤ４４７６処理は、７２時間後に処理されたケラチノサイトにおいて、ｐ５３及びＫｉｔＬの発現が用量非依存的に増加することがさらに示された。また、図７Ｃにおいて、５００ｎＭから５０００ｎＭの濃度でのヒトのケラチノサイトに対するＩＣ２６１処理は、７２時間後に処理されたケラチノサイトにおいて、ｐ５３及びＫｉｔＬの発現が用量非依存的に増加することも示された。これらのデータは、実施例１～４で使用したＣＫＩに加えて、他のカゼインキナーゼ１阻害剤も、Ｋｉｔ経路及びその後のメラニン形成を誘導するのと同様の能力を有することを示した。

【0130】

本開示は、その実施形態とともに記載されており、本開示の範囲から逸脱することなく、様々な修正が本開示の実施形態によるものであることが理解される。したがって、記載された実施形態は、本開示を限定するのではなく、本開示の範囲内の改変を含むことを意図している。したがって、特許請求の範囲は、そのようなすべての修正を包含するように、最も広い解釈を与えられるべきである。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図4G】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図7C】