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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-18
(45)【発行日】2024-03-27
(54)【発明の名称】Ｍ１ウイルス変異体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/40 20060101AFI20240319BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240319BHJP
A61K 35/768 20150101ALI20240319BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240319BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240319BHJP
A61K 48/00 20060101ALN20240319BHJP
【ＦＩ】
C12N15/40 ZNA
C12N7/01
A61K35/768
A61P35/00
A61P35/02
A61K48/00
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2021571298
(86)(22)【出願日】2020-05-31
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-04
(86)【国際出願番号】 CN2020093642
(87)【国際公開番号】W WO2020239118
(87)【国際公開日】2020-12-03
【審査請求日】2022-01-14
(31)【優先権主張番号】201910472439.7
(32)【優先日】2019-05-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【微生物の受託番号】CCTCC CCTCC V201423
(73)【特許権者】
【識別番号】516234063
【氏名又は名称】広州威溶特医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＶＩＲＯＴＥＣＨ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ４１６－４２８， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ Ｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｎｏ．３， Ｌａｎｙｕｅ Ｒｏａｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ， Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１０６６３ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】顔光美
(72)【発明者】
【氏名】林園
(72)【発明者】
【氏名】郭莉
(72)【発明者】
【氏名】林子青
(72)【発明者】
【氏名】呉広恩
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５２６６１２（ＪＰ，Ａ）
【文献】nonstructural polyprotein [Cloning vector pCHIK-37997ic], ABX40010，[online], National Center for Biotechnology Information, 2007年11月24日掲載, 2022年12月7日検索, インターネット，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABX40010.1?
【文献】recombinant envelope protein 2 [synthetic construct], QBB02187，[online], National Center for Biotechnology Information, 2019年2月13日掲載, 2022年12月7日検索, インターネット，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/QBB02187.1?
【文献】structural polyprotein [Cloning vector pCHIK-37997ic], ABX40011， [online], National Center for Biotechnology Information, 2007年11月24日掲載, 2022年12月7日検索, インターネット，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/ABX40011.1?
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
Ｃ１２Ｎ ７／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
腫瘍溶解性を有するＭ１変異ウイルスであって、配列番号８又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、若しくは少なくとも９９．８％の配列同一性を有し、且つ配列番号８又は配列番号１８における第３５８位でのアミノ酸残基Ｍが、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｋ、Ｒ又はＨに置換されたアミノ酸配列を含む、ＮＳ３タンパク質、および／または、
配列番号１２又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、若しくは少なくとも９９．８％の配列同一性を有し、且つ配列番号１２における第４位でのアミノ酸残基Ｋ、又は配列番号３１における第４位でのアミノ酸残基Ｅが、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｎ又はＤに置換されたアミノ酸配列を含む、エンベロープタンパク質Ｅ２、
を含む、Ｍ１変異ウイルス。
【請求項2】
腫瘍溶解性を有するＭ１変異ウイルスであって、配列番号８又は配列番号１８において、第３５８位でのアミノ酸残基Ｍが、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｋ、Ｒ又はＨに置換されたアミノ酸配列を含む、ＮＳ３タンパク質、および／または、
配列番号１２において第４位でのアミノ酸残基Ｋ、又は配列番号３１において第４位でのアミノ酸残基Ｅが、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｎ又はＤに置換されたアミノ酸配列を含む、エンベロープタンパク質Ｅ２、
を含む、Ｍ１変異ウイルス。
【請求項3】
前記Ｍ１変異ウイルスは、配列番号５に示される配列を有するＭ１ウイルスに対して、前記ＮＳ３タンパク質の前記第３５８位でのアミノ酸残基ＭがＧ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｋ、Ｒ又はＨに変異し、および／または、前記Ｅ２タンパク質の前記第４位でのアミノ酸残基ＫがＭ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｓ、Ｃ、Ｎ又はＤに変異したものである、請求項１又は２に記載のＭ１変異ウイルス。
【請求項4】
前記Ｍ１変異ウイルスは、配列番号１５に示される配列を有するＭ１ウイルスに対して、前記ＮＳ３タンパク質の前記第３５８位でのアミノ酸残基ＭがＬに変異し、および／または、前記Ｅ２タンパク質の前記第４位でのアミノ酸残基ＥがＤに変異したものである、請求項１～３のいずれか一項に記載のＭ１変異ウイルス。
【請求項5】
抗腫瘍薬の製造における、請求項１～４のいずれか一項に記載のＭ１変異ウイルスの使用。
【請求項6】
前記抗腫瘍薬の治療対象腫瘍が固形腫瘍及び血液腫瘍から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項7】
前記固形腫瘍は、肝臓がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵臓がん、鼻咽頭がん、肺がん、胃がん、副腎皮質がん、アクセサリーレナル皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫、ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、胆管上皮がん、脊索腫、大腸がん、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管がん、胚細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽細胞腫、頭蓋内胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、卵管がん、胆嚢がん、頭頸部がん、下咽頭がん、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、唇がん、口腔がん、メルケル細胞がん、悪性中皮腫、多発性内分泌腺腫症、菌状息肉症、鼻腔・副鼻腔がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓神経内分泌腫瘍、膵島細胞腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔・鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽喉頭がん、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、網膜芽細胞腫、唾液腺腫瘍、肉腫、セザール症候群、皮膚ガン、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、精巣がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜及び子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん及び単発性骨髄腫から選択される１種又は複数種である、請求項６に記載の使用。
【請求項8】
前記血液腫瘍は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞又は大細胞性－濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症及び前白血病から選択される１種又は複数種である、請求項６に記載の使用。
【請求項9】
請求項１から４のいずれか一項に記載のＭ１変異ウイルスを含む抗腫瘍剤。
【請求項10】
有効量の請求項１から４のいずれか一項に記載のＭ１変異ウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項11】
前記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
前記組成物は、化学療法剤をさらに含む、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記組成物は抗腫瘍に用いられる、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
剤形は、注射剤、錠剤、カプセル、キット及び貼付剤から選択される、請求項９に記載の抗腫瘍剤又は請求項１０～１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項15】
前記腫瘍は、固形腫瘍及び血液腫瘍から選択される、請求項９に記載の抗腫瘍剤、又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項16】
前記固形腫瘍は、肝臓がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵臓がん、鼻咽頭がん、肺がん、胃がん、副腎皮質がん、アクセサリーレナル皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫、ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、胆管上皮がん、脊索腫、大腸がん、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管がん、胚細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽細胞腫、頭蓋内胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、卵管がん、胆嚢がん、頭頸部がん、下咽頭がん、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、唇がん、口腔がん、メルケル細胞がん、悪性中皮腫、多発性内分泌腺腫症、菌状息肉症、鼻腔・副鼻腔がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓神経内分泌腫瘍、膵島細胞腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔・鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽喉頭がん、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、網膜芽細胞腫、唾液腺腫瘍、肉腫、セザール症候群、皮膚ガン、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、精巣がん、胸腺腫及び胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜及び子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん及び単発性骨髄腫から選択される１種又は複数種である、請求項１５に記載の抗腫瘍剤、又は請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記血液腫瘍は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞又は大細胞性－濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症及び前白血病から選択される１種又は複数種である、請求項１５に記載の抗腫瘍剤、又は請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオ医薬分野に属し、具体的には、Ｍ１ウイルス変異体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
正常細胞における遺伝子とエピジェネティクスの蓄積された変化は、正常細胞の悪性腫瘍細胞への変化を促進する。この複雑な病理学的プロセスは、さまざまな腫瘍の発生、維持、及び転移に係るメカニズムの多様性を決定する（１－３）。腫瘍の伝統的な治療法には外科的切除、化学療法、放射線療法がある。しかし、腫瘍の外科的切除では再発しやすい問題があり、放射線療法と化学療法では深刻な副作用という問題がある（４）。近年、ＩＬ－２制御、養子細胞療法、ＰＤ－１などの免疫チェックポイントの調節を含む標的療法および腫瘍免疫療法は、臨床治療において一定の効果を達成している。しかしながら、標的療法では薬剤耐性を起こしやすく、免疫療法では反応率が低く、且つ深刻な免疫関連の有害事象を引き起こす可能性がある（５，６）。そのため、低毒性で効果的で薬剤耐性が低い新しい抗がん治療法の研究開発が必要とされている。
【0003】
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を殺すだけでなく、宿主の免疫系にがんの存在を注意する。ウイルス療法は、健康な組織よりもがん組織を攻撃する傾向が高いという腫瘍溶解性ウイルスの特性に基づく方法である。２００５年に、中国食品薬品監督管理局は、初の腫瘍溶解性ウイルス療法に適用される治療薬（商品名：Ｏｎｃｏｒｉｎｅ）の販売を承認した。これは、腫瘍細胞を優先的に攻撃する遺伝子組み換えウイルスであり、既に頭頸部がんの治療に用いられている。２０１５年にアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）は黒色腫治療用のＴ－ＶＥＣを承認した。これは、遺伝子組み換えヘルペスウイルスを使用するものであり、翌年にオーストラリアと欧州連合で承認された。さらに、いくつかの腫瘍溶解性ウイルスが研究されている。ここ数十年で、ウイルス療法は大きな進歩を遂げたが、依然として多くの困難に直面している。
【0004】
まず、治療効果には問題がある。腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍効果又は抗腫瘍スペクトルは限られている。多くの腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞を十分に阻害又は殺すことができず、他の化学療法剤又は免疫チェックポイント阻害剤と併用する必要があり、放射線療法の補助療法として使用する場合もある。例えば、中国特許出願第２０１４１０４２５５１０．３号に記載のＭ１ウイルスは、抗腫瘍薬として使用する際に、結腸直腸がん、肝臓がん、膀胱がん及び乳がんに対する効果が最も高く、膵臓がん、鼻咽頭がん、前立腺がん及び黒色腫に対する効果が低くなり、神経膠腫、子宮頸がん、肺がんに対する効果がさらに低くなり、胃がんに対する効果が最も低い。
【0005】
また、安全性には問題がある。人体に危険なウイルスもあり、危険なウイルスではウイルス治療に使用する前に修飾して弱毒化する必要がある。しかし、修飾して弱毒化した後においても、腫瘍溶解性ウイルスは、「エスケープウイルス」、つまり放出後に再び変化し、又は既に患者の体内に存在する病原体と結合して健康な組織に急速に感染するウイルスになる可能性がある。
【0006】
さらに、ウイルスの送達、即ち、如何にウイルスを病巣に送達するかという問題がある。既存の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された黒色腫治療用のＴ－ＶＥＣ）は、ほとんど腫瘍組織に注射される。しかしながら、多くの固形腫瘍や微小転移巣は直接注射できないか、血液腫瘍などの非固形腫瘍は全身に分布し、固定した注射部位がない。これらのタイプの腫瘍の治療では、既存のウイルス療法を使用することは困難である。
【0007】
したがって、腫瘍溶解性ウイルスの開発は依然として大きな挑戦である。
【0008】
アルファウイルスは、トガウイルス科に属し、エンベロープ構造を有する一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスの一種である。アルファウイルス属のチクングニアウイルスは、人体に病原性のあるウイルスであり、毒性が高く、感染後に発熱、発疹、関節炎、さらには致命的な脳炎を引き起こすことが報告されている（７，８）。アルファウイルス属の別のウイルスであるベネズエラ馬脳炎ウイルスは、樹状細胞を形質導入して腫瘍を治療するための担体として使用されることが報告されている（９）。しかし、この脳炎ウイルスは、ヒトに発熱、痙攣、流産、さらには死亡を引き起こしたことがある（１０）。
【0009】
Ｍ１ウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ Ｍ１）はアルファウイルス属（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）に属し、１９６４年に中国海南島のアカイエカから分離され、ウイルスの分離方法が文献に発表されている（１１）。Ｍ１ウイルスは、ゲタウイルスとの相同性が９７．８％と高く、ゲタ類似ウイルスに属する（１２）。２００８年に、Ｍ１株の全ゲノムに対する配列決定が完成した（１３）。Ｍ１ウイルスは特許ＣＮ２０１４１０４２５５１０．３において腫瘍溶解効果を有することが報告されているが、既存の野生型Ｍ１ウイルスの抗腫瘍スペクトルと抗腫瘍強度には改善の余地がある。
【発明の概要】
【0010】
いくつかの実施形態において、Ｍ１ウイルスが提供される。前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基はＭではなく、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ２の第４位に相当する位置のアミノ酸残基はＥ又はＫではない。
【0011】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ３）の第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基はＧ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり、および／または前記Ｍ１ウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ２（ｅｎｖｅｌｏｐｅｐｒｏｔｅｉｎ２）の第４位に相当する位置のアミノ酸残基はＭ、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｒ又はＨである。
【0012】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスに含まれるＮＳ３タンパク質は、配列番号８又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、および／または前記Ｍ１ウイルスに含まれるＥ２タンパク質は、配列番号１２又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％或１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。いくつかの実施形態において、Ｍ１ウイルスが提供される。その核酸配列によってコードされるＮＳ３タンパク質の第３５８位の位置に相当するアミノ酸残基はＭではなく、および／またはＥ２タンパク質の第４位の位置に相当するアミノ酸残基はＥ又はＫではない。
【0013】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスの核酸配列は、配列番号５、配列番号１５、ジーンバンクアクセッション番号ＥＵ０１５０６１．１、ジーンバンクアクセッション番号ＥＦ０１１０２３．１、又はＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３に示されるＭ１配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0014】
いくつかの実施形態において、好ましくは、前記ＮＳ３タンパク質の第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基はＧ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨであり、および／または前記Ｅ２タンパク質の第４位に相当する位置のアミノ酸残基はＭ、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｒ又はＨである。
【0015】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスは、野生型Ｍ１ウイルス又は偽野生型Ｍ１ウイルスに対して変異を有する。
【0016】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスは、配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルス又は配列番号１５に示されるＭ１ウイルスに対して変異を有する。
【0017】
いくつかの実施形態において、前記変異は、ＮＳ３タンパク質におけるＭ３５８Ｇ、Ｍ３５８Ａ、Ｍ３５８Ｌ、Ｍ３５８Ｉ、Ｍ３５８Ｖ、Ｍ３５８Ｐ、Ｍ３５８Ｓ、Ｍ３５８Ｑ、Ｍ３５８Ｔ、Ｍ３５８Ｃ、Ｍ３５８Ｎ、Ｍ３５８Ｆ、Ｍ３５８Ｙ、Ｍ３５８Ｗ、Ｍ３５８Ｄ、Ｍ３５８Ｅ、Ｍ３５８Ｋ、Ｍ３５８Ｒ又はＭ３５８Ｈであり、および／またはＥ２タンパク質におけるＫ４Ｍ、Ｋ４Ｇ、Ｋ４Ａ、Ｋ４Ｌ、Ｋ４Ｉ、Ｋ４Ｖ、Ｋ４Ｐ、Ｋ４Ｓ、Ｋ４Ｑ、Ｋ４Ｔ、Ｋ４Ｃ、Ｋ４Ｎ、Ｋ４Ｆ、Ｋ４Ｙ、Ｋ４Ｗ、Ｋ４Ｄ、Ｋ４Ｒ、Ｋ４Ｈ、Ｅ４Ｍ、Ｅ４Ｇ、Ｅ４Ａ、Ｅ４Ｌ、Ｅ４Ｉ、Ｅ４Ｖ、Ｅ４Ｐ、Ｅ４Ｓ、Ｅ４Ｑ、Ｅ４Ｔ、Ｅ４Ｃ、Ｅ４Ｎ、Ｅ４Ｆ、Ｅ４Ｙ、Ｅ４Ｗ、Ｅ４Ｄ、Ｅ４Ｒ又はＥ４Ｈである。
【0018】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスは、配列番号５に示される配列を有するＭ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基ＭがＧ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨに変異し、および／またはＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基ＫがＭ、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｒ又はＨに変異したものである。
【0019】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスは、配列番号１５に示されるＭ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基ＭがＬに変異し、および／またはＥ２タンパク質の第４位に相当する位置のアミノ酸残基ＥがＤに変異したものである。
【0020】
いくつかの実施形態において、上述したいずれかのＭ１ウイルスを含む核酸配列が提供される。
【0021】
いくつかの実施形態において、Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質に対応するアミノ酸配列が提供される。その第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基はＭではない。
【0022】
いくつかの実施形態において、前記第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基はＧ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨである。
【0023】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号８又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0024】
いくつかの実施形態において、Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質に対応するアミノ酸配列がさらに提供される。その第４位に相当する位置のアミノ酸残基はＥ又はＫではない。
【0025】
いくつかの実施形態において、前記第４位に相当する位置のアミノ酸残基はＭ、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｒ又はＨである。
【0026】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番号１２又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0027】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列が提供される。
【0028】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードする核酸配列が提供される。
【0029】
いくつかの実施形態において、担体が提供される。前記担体は、Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質および／またはＮＳ３タンパク質をコードする核酸を含む。前記ＮＳ３タンパク質の第３５８位の位置に相当するアミノ酸残基はＭではなく、前記Ｅ２タンパク質の第４位の位置に相当するアミノ酸残基はＥ又はＫではない。
【0030】
いくつかの実施形態において、前記ＮＳ３タンパク質の第３５８位に相当する位置のアミノ酸残基はＧ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ又はＨである。
【0031】
いくつかの実施形態において、前記Ｅ２タンパク質の第４位に相当する位置のアミノ酸残基はＭ、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｐ、Ｓ、Ｑ、Ｔ、Ｃ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｄ、Ｒ又はＨである。
【0032】
いくつかの実施形態において、前記ＮＳ３タンパク質は、配列番号８又は配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％或１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0033】
いくつかの実施形態において、前記Ｅ２タンパク質は、配列番号１２又は配列番号３１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0034】
いくつかの実施形態において、前記担体は、Ｍ１ウイルスのＮＳ１タンパク質、ＮＳ２タンパク質、ＮＳ４タンパク質、Ｃタンパク質、Ｅ３タンパク質、６Ｋタンパク質、および／またはＥ１タンパク質のコード配列をさらに含む。
【0035】
いくつかの実施形態において、前記ＮＳ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６又は配列番号１６に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0036】
いくつかの実施形態において、前記ＮＳ２タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号７又は配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0037】
いくつかの実施形態において、前記ＮＳ４タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号９又は配列番号１９に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0038】
いくつかの実施形態において、前記Ｃタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１０又は配列番号２０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0039】
いくつかの実施形態において、前記Ｅ３タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１１又は配列番号３０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0040】
いくつかの実施形態において、前記６Ｋタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３又は配列番号３２に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0041】
いくつかの実施形態において、前記Ｅ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１４又は配列番号３３に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％、少なくとも９９．９％若しくは１００％の配列同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0042】
いくつかの実施形態において、前記担体は、Ｍ１ウイルスに対する外来遺伝子をさらに含む。
【0043】
いくつかの実施形態において、前記外来遺伝子は、抗腫瘍関連分子を発現する。
【0044】
いくつかの実施形態において、前記担体は、ウイルスから選択される。
【0045】
いくつかの実施形態において、前記担体は、レトロウイルス、ニューカッスル病ウイルス、狂犬病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、マラバウイルス、アルファウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、牛痘ウイルス又は麻疹ウイルスから選択される。
【0046】
いくつかの実施形態において、前記担体は、プラスミドから選択される。
【0047】
いくつかの実施形態において、前記核酸配列を含む担体が提供される。
【0048】
いくつかの実施形態において、前記担体は、プラスミドから選択される。
【0049】
いくつかの実施形態において、ウイルス担体が提供される。前記ウイルスは上述したいずれかの前記Ｍ１ウイルスである。
【0050】
いくつかの実施形態において、前記担体に外来遺伝子が挿入される。
【0051】
いくつかの実施形態において、前記外来遺伝子は、抗腫瘍関連分子を発現する。
【0052】
いくつかの実施形態において、抗腫瘍薬の製造における前記Ｍ１ウイルス、前記核酸配列、前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列、前記Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質のアミノ酸配列、前記ＮＳ３タンパク質若しくはＥ２タンパク質の核酸配列、前記担体又は前記ウイルス担体の使用がさらに提供される。
【0053】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルス、前記核酸配列、前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列、前記Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質のアミノ酸配列、前記核酸配列、前記担体又は前記ウイルス担体を含む抗腫瘍剤がさらに提供される。
【0054】
いくつかの実施形態において、有効量の前記Ｍ１ウイルス、前記核酸配列、前記Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質のアミノ酸配列、前記Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質のアミノ酸配列、前記担体又は前記ウイルス担体と、薬学的に許容される担体とを含む組成物がさらに提供される。
【0055】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む。
【0056】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、化学療法剤をさらに含む。
【0057】
もちろん、いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスには、免疫チェックポイント阻害剤および／または化学療法剤が含まらなくてもよい。本発明の一実施形態において、他のいかなる抗がん剤（化学療法剤、免疫チェックポイント阻害剤又は抗腫瘍効果を有する他の従来物質又はツール）と併用しない場合においても、単独のＭ１ウイルスは非常に高い腫瘍抑制効果を有する。
【0058】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、少なくとも１０１個のウイルス粒子又はＰＦＵを含む。
【0059】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、１０１～１０３０個のウイルス粒子又はＰＦＵを含む。
【0060】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２個のウイルス粒子又はＰＦＵ。
【0061】
いくつかの実施形態において、前記組成物は、２×１０６個のウイルス粒子又はＰＦＵを含む。
【0062】
いくつかの実施形態において、前記組成物は抗腫瘍に用いられる。
【0063】
いくつかの実施形態において、前記抗腫瘍剤又は前記組成物の剤形は、注射剤、錠剤、カプセル、キット又は貼付剤から選択される。
【0064】
いくつかの実施形態において、前記剤形は注射剤から選択される。
【0065】
いくつかの実施形態において、前記使用、前記抗腫瘍剤又は前記組成物における前記腫瘍は、固形腫瘍又は血液腫瘍から選択される。
【0066】
いくつかの実施形態において、前記固形腫瘍は、肝臓がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵臓がん、鼻咽頭がん、肺がん、胃がん、副腎皮質がん、アクセサリーレナル皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、非定型奇形腫、ラブドイド腫瘍、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、心臓腫瘍、胆管上皮がん、脊索腫、大腸がん、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管がん、胚細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、嗅神経芽細胞腫、頭蓋内胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼がん、卵管がん、胆嚢がん、頭頸部がん、下咽頭がん、カポジ肉腫、腎臓がん、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、唇がん、口腔がん、メルケル細胞がん、悪性中皮腫、多発性内分泌腺腫症、菌状息肉症 、鼻腔・副鼻腔がん、神経芽細胞腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓神経内分泌腫瘍、膵島細胞腫瘍、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔・鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽喉頭がん、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性腹膜がん、網膜芽細胞腫、唾液腺腫瘍、肉腫、セザール症候群、皮膚ガン、小細胞肺がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、精巣がん、胸腺腫及胸腺がん、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮内膜及び子宮肉腫、膣がん、血管腫瘍、外陰がん及び単発性骨髄腫から選択される１種又は複数種である。
【0067】
いくつかの実施形態において、前記血液腫瘍は、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（ＢＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（ＴＡＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞前骨髄球性白血病、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、小細胞又は大細胞性－濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、形質芽細胞リンパ腫、形質細胞様樹状細胞腫瘍、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症及び前白血病から選択される１種又は複数種である。
【0068】
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、肝臓がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵臓がん、鼻咽頭がん、肺がん和胃がんから選択される１種又は複数種である。
【0069】
いくつかの実施形態において、得られたＭ１ウイルスは、多種類の腫瘍を効果的に治療可能である。前記腫瘍には、肝臓がん、結腸直腸がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、前立腺がん、神経膠腫、黒色腫、膵臓がん、鼻咽頭がん、肺がん、胃がんが含まれる。インビトロ実験により、本発明のＭ１ウイルスは腫瘍の細胞死を引き起こすことができることが証明されている。インビボ実験により、本発明のＭ１ウイルスが体内で肝臓がん、結腸直腸がんの成長を顕著に抑制できることが証明されている。インビトロ又はインビボを問わず、本発明のＭ１ウイルスの有効性は、ほとんど野生型ウイルスより高い。
【0070】
いくつかの実施形態において、得られたＭ１ウイルスは、選択性及び安全性が良好である。細胞実験の結果から明らかなように、本発明Ｍ１のウイルスは、正常細胞に対して細胞毒性を示さず、腫瘍細胞を選択的に殺すことができる。これは、本発明のＭ１ウイルスが腫瘍選択性を有することを示している。動物実験の結果から明らかなように、本発明のＭ１ウイルスを尾静脈注射してもヌードマウスの体重及び精神状態に影響を与えることがないとともに、正常臓器にはウイルス分布が観察されなかったことで、本発明のＭ１ウイルスの安全性が証明されている。
【0071】
いくつかの実施形態において、得られたＭ１ウイルスを腫瘍内又は静脈注射で投与することにより腫瘍増殖を顕著に抑制することができる。市販の腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内注射では、医師や看護師を専門に訓練する必要があり、患者の受容性も高くなく、深部臓器腫瘍や微小転移巣には適していない。これに対し、本発明のＭ１ウイルスは静脈内投与により治療することができる。これによって、本発明のＭ１ウイルスは、臨床応用においてより便利で実行可能であり、応用範囲がより広い。
【0072】
本明細書において、文脈に別段の要求がない限り、「包含」、「含有」のような用語は、前記ステップ、要素、又はステップと要素との組み合わせを含むことを意味するが、他のステップ、要素、又はステップと要素との組み合わせを除外するものではなく、即ち、開放的な限定である。
【0073】
例えば、いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスに「含まれる」変異における「含まれる」とは、前記変異（例えば、非構造タンパク質ＮＳ３の第３５８位のアミノ酸残基および／または構造タンパク質Ｅ２の第４位のアミノ酸残基における変異）に加えて、他の変異（特に、沈黙変異）、例えば、ウイルスの機能に影響を与えない変異、又は基本的な機能に影響を与えず、変異体Ｍ１の基本的な機能を干渉することなく、ウイルスのある能力を増強させるか、毒性を減少させるか、若しくは安定性を向上させる変異を含む可能性があることを意味する。
【0074】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスは二重部位変異である。即ち、ＮＳ３タンパク質におけるＭ３５８Ｌ、並びにＥ２タンパク質におけるＫ４Ｎ、Ｋ４Ｄ、Ｅ４Ｎ及びＥ４Ｄのうちの１つである。ここでいうのは、前記変異体にはこれらの変異のみがあり、他の変異がないことである。
【0075】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスに対応する野生型的Ｍ１ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３（詳細は中国特許１０４８１４９８４Ａを参照）に示されるウイルスである。
【0076】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスに対応する野生型的Ｍ１ウイルスは、寄託番号ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３（詳細は中国特許１０４８１４９８４Ａを参照）に示されるウイルスのゲノム配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％の同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有する。
【0077】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスに対応する野生型的Ｍ１ウイルスは、ジーンバンクアクセッション番号ＥＵ０１５０６１．１又はＥＦ０１１０２３．１（出願日／優先日の情報に従う）に示される通りである。
【0078】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスに対応する野生型Ｍ１ウイルスは、ジーンバンクアクセッション番号ＥＵ０１５０６１．１、ＥＦ０１１０２３．１（出願日／優先日の情報に従う）、又はＺｈａｉ ＹＧによって発表（１３）されたウイルスのゲノム配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．８％の同一性（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有し、ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３と同じ株に由来する可能性が高いウイルスと考えられている。
【0079】
いくつかの実施形態において、前記タンパク質は分離されたポリペプチドである。
【0080】
いくつかの実施形態において、前記核酸は分離されたポリ核酸である。
【0081】
いくつかの実施形態において、前記Ｍ１ウイルスは分離されたウイルスである。
【図面の簡単な説明】
【0082】
【図1】４種類の変異ウイルス（ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－ｃ６ｖ１）の変異部位での核酸配列決定を示す。図１Ａは、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基近傍での核酸配列決定を示す。前記部位での野生型核酸配列はＣＣＡであり、対応するアミノ酸はＭであり、変異後の核酸配列はＣＣＣであり、対応するアミノ酸はＬである。図１Ｂは、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基近傍での核酸配列決定を示す。前記部位での野生型核酸配列はＡＡＡ又はＧＡＡであり、対応するアミノ酸はＫ又はＥであり、変異型核酸配列はＡＡＣ又はＧＡＣであり、対応するアミノ酸はＮ又はＤである。
【図2】部位特異的変異ウイルス（ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ）のＨＣＴ １１６細胞株での腫瘍溶解効果の増強を示す。図２Ａは、１ＭＯＩでＨＣＴ １１６細胞を感染させた４８ｈ後の細胞形態を観察した結果を示す。図２Ｂは、ＭＴＴ法によりｒＭ１－ＷＴ、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ及びｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスを用いて０．００１－１０ＭＯＩで感染させた７２ｈ後の細胞生存率を比較した結果を示す。
【図3】動物モデルでのｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスの安全性及び有効性試験を示す。ヌードマウスにＨＣＴ１１６を皮下担癌させ、腫瘍接種の１４日後にウイルスを静脈注射し、腫瘍体積及びヌードマウス体重を繰り返し測定し、ＡＮＯＶＡにより統計した結果、＊ｐ＜０．０５であり、統計的に有意である。図３Ａは、ヌードマウス皮下担癌モデルにおける腫瘍増殖の変化状況を示す。図３Ｂは、ヌードマウス皮下担癌モデルにおけるヌードマウスの体重の変化状況を示す。
【図4】ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスに感染させると、腫瘍組織中の細胞アポトーシス指標Ｃｌ－ｃａｓｐ３の発現はアップレギュレートし、細胞増殖指標Ｋｉ６７の発現はダウンレギュレートしたことを示す。ヌードマウス皮下担癌モデルでは、ｒＭ１－ＷＴ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍを用いて３日間治療した後に、腫瘍組織を剥離し、免疫組織化学染色によりＣｌ－ｃａｓｐ３及びＫｉ６７の発現を測定した。
【図5】正常臓器組織においてｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスによる毒性病変が観察されなかったことを示す。
【図6】動物モデルにおけるＭ１－ｃ６ｖ１ウイルスの安全性及び有効性の実験結果を示す。Ｃ５７ ＢＬ／６マウスにＢ１６－Ｆ１０を皮下担癌させ、腫瘍接種の１１日後にウイルスを静脈注射し、腫瘍体積及びヌードマウスの体重を繰り返し測定し、ＡＮＯＶＡにより統計した結果、＊ｐ＜０．０５、統計的に有意である。図６Ａは、マウス皮下担癌モデルにおける腫瘍増殖の変化情况を示す。図６Ｂは、マウス皮下担癌モデルにおけるヌードマウスの体重の変化情况を示す。
【図7-1】図７Ａ－７ＺはＭ１ウイルスの各部位特異的変異株の変異部位の配列決定図である。図７ＡはｒＭ１－ＷＴ（Ｅ２－４Ｋ）（ＡＡＡ）である。図７Ｂは変異株（Ｅ２－４Ｌ，ＡＡＡ→ＣＴＧ）である。図７Ｃは変異株（Ｅ２－４Ｉ，ＡＡＡ→ＡＴＴ）である。図７Ｄは変異株（Ｅ２－４Ｖ，ＡＡＡ→ＧＴＧ）である。図７Ｅは変異株（Ｅ２－４Ｓ，ＡＡＡ→ＡＧＣ）である。図７Ｆは変異株（Ｅ２－４Ｃ，ＡＡＡ→ＴＧＣ）である。図７Ｇは変異株（Ｅ２－４Ｌ，ＡＡＡ→ＣＴＧ）である。図７Ｈは変異株（Ｅ２－４Ｄ，ＡＡＡ→ＧＡＴ）である。
【図7-2】図７ＩはｒＭ１－ＷＴ（ＮＳ３－３５８Ｍ，ＡＴＧ）である。図７Ｊは変異株（ＮＳ３－３５８Ｇ，ＡＴＧ→ＧＧＣ）である。図７Ｋは変異株（ＮＳ３－３５８Ａ，ＡＴＧ→ＧＣＧ）である。図７Ｌは変異株（ＮＳ３－３５８Ｌ，ＡＴＧ→ＣＴＧ）である。図７Ｍは変異株（ＮＳ３－３５８Ｉ，ＡＴＧ→ＡＴＴ）である。図７Ｎは変異株（ＮＳ３－３５８Ｖ，ＡＴＧ→ＧＴＧ）である。図７Ｏは変異株（ＮＳ３－３５８Ｐ，ＡＴＧ→ＣＣＧ）である。図７Ｐは変異株（ＮＳ３－３５８Ｓ，ＡＴＧ→ＡＧＣ）である。
【図7-3】図７Ｑは変異株（ＮＳ３－３５８Ｑ，ＡＴＧ→ＣＡＧ）である。図７Ｒは変異株（ＮＳ３－３５８Ｔ，ＡＴＧ→ＡＣＣ）である。図７Ｓは変異株（ＮＳ３－３５８Ｃ，ＡＴＧ→ＴＧＣ）である。図７Ｔは変異株（ＮＳ３－３５８Ｎ，ＡＴＧ→ＡＡＣ）である。図７Ｕは変異株（ＮＳ３－３５８Ｆ，ＡＴＧ→ＴＴＴ）である。図７Ｖは変異株（ＮＳ３－３５８Ｙ，ＡＴＧ→ＴＡＴ）である。図７Ｗは変異株（ＮＳ３－３５８Ｄ，ＡＴＧ→ＧＡＴ）である。図７Ｘは変異株（ＮＳ３－３５８Ｋ，ＡＴＧ→ＡＡＡ）である。
【図8-1】図８Ａ－８ＺはＭ１ウイルスの各部位特異的変異（単一部位変異）株のＨＣＴ１１６に対する殺傷曲線である。図８ＡはｒＭ－ＷＴ（Ｅ２－４Ｋ）の殺傷曲線である。図８Ｂは変異株Ｅ２－４Ｌの殺傷曲線である。図８Ｃは変異株Ｅ２－４Ｉの殺傷曲線である。図８Ｄは変異株Ｅ２－４Ｖの殺傷曲線である。
【図8-3】図８ＩはｒＭ－ＷＴ的（ＮＳ３－３５８Ｍ）の殺傷曲線である。図８Ｊは変異株ＮＳ３－３５８Ｇの殺傷曲線である。図８Ｋは変異株ＮＳ３－３５８Ａの殺傷曲線である。図８Ｌは変異株ＮＳ３－３５８Ｌの殺傷曲線である。
【図8-4】図８Ｍは変異株ＮＳ３－３５８Ｉの殺傷曲線である。図８Ｎは変異株ＮＳ３－３５８Ｖの殺傷曲線である。図８Ｏは変異株ＮＳ３－３５８Ｐの殺傷曲線である。図８Ｐは変異株ＮＳ３－３５８Ｓの殺傷曲線である。
【図8-5】図８Ｑは変異株ＮＳ３－３５８Ｑの殺傷曲線である。図８Ｒは変異株ＮＳ３－３５８Ｔの殺傷曲線である。図８Ｓは変異株ＮＳ３－３５８Ｃの殺傷曲線である。図８Ｔは変異株ＮＳ３－３５８Ｎの殺傷曲線である。
【発明を実施するための形態】
【0083】
以下、具体的な実施例により本発明の技術的手段をさらに説明する。以下の具体的な実施例は、本発明の保護範囲を制限するものではない。当業者が本発明の思想に基づいて行った非本質的な修正及び調整も本発明の保護範囲に含まれる。
【0084】
定義
別段の定義がない限り、本発明で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は当業者の一般的な理解と同じ意味を有する。
別段の定義がない限り、本発明で使用される全ての技術的用語及び科学的用語は当業者の一般的な理解と同じ意味を有する。
【0085】
特に明記しない限り、本発明の変異には、自然変異、強制的な変異又は選択的変異が含まれ、遺伝子修飾、配列増加若しくは削除、又は部分的置換が含まれるが、これらに限定されない。
【0086】
前記「変異」は、野生型ウイルス株の特定部位に対して人為的変異（変異誘発又は遺伝子工学）を行うことが含まれるが、限定されない。当該技術分野において、野生型及び変異は相対的な概念であり、野生型ウイルスその自体には核酸又はアミノ酸残基配列の違いが存在することが知られている。
【0087】
本明細書で使用される用語「および／または」は、１つ又は複数の関連項目の任意及び全ての可能な組み合わせを含むことを指す。２つ以上の項目のリストに使用される場合、用語「および／または」は、示される項目のうちのいずれか１つを単独で使用してもよく、又は示される項目のうちの２つ以上を組み合わせて使用してもよいことを指す。例えば、組成物、組み合わせ、構造などの用語は、成分Ａ、Ｂ、Ｃおよび／またはＤを含む（又は含有する）として使用される場合、前記組成物は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ｄ単独、ＡとＢの組み合わせ、ＡとＣの組み合わせ、ＡとＤの組み合わせ、ＢとＣの組み合わせ、ＢとＤの組み合わせ、ＣとＤの組み合わせ、ＡとＢとＣの組み合わせ、ＡとＢとＤの組み合わせ、ＡとＣとＤの組み合わせ、ＢとＣとＤの組み合わせ、又はＡとＢとＣとＤの組み合わせを含む。
【0088】
本明細書において、例えば、ＮＳ３タンパク質のＭ３５８Ｇは、Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基にＭ３５８Ｇ変異が発生し、ＭからＧに変異したことを指す。例えば、「Ｍ３５８Ａ」は、Ｍ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基にＭ３５８Ａ変異が発生し、ＭからＡに変異したことを指す。他は同様である。
【0089】
本明細書において、例えば、Ｅ２タンパク質のＫ４Ｍは、Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基にＫ４Ｍ変異が発生し、ＫからＭに変異したことを指す。例えば、Ｅ２タンパク質のＫ４Ａは、Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基にＫ４Ａ変異が発生し、ＫからＡに変異したことを指す。他は同様である。
【0090】
【表1】
【0091】
ＮＳ３タンパク質：非構造タンパク質３，ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ３。
【0092】
Ｅ２タンパク質：エンベロープタンパク質２，ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ２。
【0093】
本明細書において、各配列の番号を下記表Ａに示す。
【表2】
【0094】
野生型Ｍ１ウイルスは、自然界から得られたウイルス株を指し、その対応するゲノムが野生型ゲノムである。野生型ゲノムは、特定の部位に多様性がある可能性がある。例えば、知られている野生型Ｍ１ウイルスのＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基はＥ又はＫである。
【0095】
偽野生型Ｍ１ウイルスは、既知の野生型Ｍ１ウイルスの配列と完全に一致しないが、生物学的特性が既知の野生型Ｍ１ウイルスと顕著に違いがないＭ１ウイルスを指す。
【0096】
いくつかの実施例において、野生型Ｍ１ウイルス、例えば、寄託番号ＣＣＴＣＣ Ｖ２０１４２３のＭ１ウイルス及びそのモノクローナルウイルスＭ１－ｃ６ウイルス、又は、例えば、ＥＵ０１５０６１．１、ＥＦ０１１０２３．１である。
【0097】
例えば、いくつかの実施形態において、野生型をもとに、非構造タンパク質ＮＳ２における第２および／または第７８６位のアミノ酸残基、非構造タンパク質ＮＳ３における第３０および／または第３９３位のアミノ酸残基、非構造タンパク質ＮＳ３における第３８１位のアミノ酸残基、構造タンパク質Ｃにおける第１５４位のアミノ酸残基、及び構造タンパク質Ｅ２における第２４６位のアミノ酸残基のうちの１つ又は複数の部位に変異が発生したものであってもよい。
【0098】
ｒＭ１－ＷＴは、ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスであり、含まれるＮＳ１タンパク質の配列が配列番号６に示され、含まれるＮＳ２タンパク質の配列が配列番号７に示され、含まれるＮＳ３タンパク質の配列が配列番号８に示され、含まれるＮＳ４タンパク質の配列が配列番号９に示され、含まれるＣタンパク質の配列が配列番号１０に示され、含まれるＥ３タンパク質の配列が配列番号１１に示され、含まれるＥ２タンパク質の配列が配列番号１２に示され、含まれる６Ｋタンパク質の配列が配列番号１３に示され、含まれるＥ１タンパク質の配列が配列番号１４に示される。含まれるＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基がＭであり、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基がＫである。
【0099】
ｒＭ１－ＮＳ３Ｍは、組換えＭ１ウイルスを指す。前記ウイルスは、ｒＭ１－ＷＴをもとにＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基にＭ３５８Ｌ変異（即ち、ＭからＬへの変異）が発生したものである。
【0100】
ｒＭ１－Ｅ２Ｍは、組換えＭ１ウイルスを指す。前記ウイルスは、ｒＭ１－ＷＴをもとにＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基にＫ４Ｎ変異（即ち、ＫからＮへの変異）が発生したものである。
【0101】
ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍは、組換えＭ１ウイルスを指す。前記ウイルスは、ｒＭ１－ＷＴをもとにＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基にＭ３５８Ｌ変異（即ち、ＭからＬへの変異）が発生し、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基にＫ４Ｎ変異（即ち、ＫからＮへの変異）が発生したものである。
【0102】
Ｍ１－ｃ６は、ゲノム配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルスであり、含まれるＮＳ１タンパク質の配列が配列番号１６に示され、含まれるＮＳ２タンパク質の配列が配列番号１７に示され、含まれるＮＳ３タンパク質の配列が配列番号１８に示され、含まれるＮＳ４タンパク質の配列が配列番号１９に示され、含まれるＣタンパク質の配列が配列番号２０に示され、含まれるＥ３タンパク質の配列が配列番号３０に示され、含まれるＥ２タンパク質の配列が配列番号３１に示され、含まれる６Ｋタンパク質の配列が配列番号３２に示され、含まれるＥ１タンパク質の配列が配列番号３３に示される。そのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基がＭであり、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基がＥである。
【0103】
Ｍ１－ｃ６ｖ１は、組換えＭ１－ｃ６ウイルスである。前記ウイルスは、Ｍ１－ｃ６をもとにＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基にＭ３５８Ｌ変異（即ち、ＭからＬへの変異）が発生し、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基にＥ４Ｄ変異（即ち、ＥからＤへの変異）が発生したものである。
【0104】
ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基は、既知の野生型Ｍ１ウイルスにおいて前記部位がＮＳ３タンパク質の第３５８位にあり、その上流であるＮ端にある３つのアミノ酸残基の配列がＹＥＴであり、その下流であるＣ端にある３つのアミノ酸残基の配列はＥＶＶである。「３５８」という数字は、絶対的な制限ではなく、位置する機能ドメイン又はモチーフに応じてある特定のアミノ酸残基（例えば、変異したアミノ酸残基）が前記部位に位置するかを判断すべきである。例えば、他の偽野生型Ｍ１ウイルスの配列において前記部位がＮＳ３タンパク質の一次構造における配列順序が必ず第３５８位ではなく、この場合、「３５８」は絶対的な制限と見なされてはならず、位置する機能ドメイン又はモチーフに応じて前記特定のアミノ酸残基が本明細書に記載のＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に属するか否かを判断すべきである。
【0105】
Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基については、既知の野生型Ｍ１ウイルスにおいて、前記部位はＥ２タンパク質の第４位にあり、その上流であるＮ端にある３つのアミノ酸残基の配列がＳＶＴであり、その下流であるＣ端にある３つのアミノ酸残基の配列がＨＦＮである。「４」という数字は、絶対的な制限ではなく、位置する機能ドメイン又はモチーフに応じてある特定のアミノ酸残基（例えば、変異したアミノ酸残基）が前記部位に位置するかを判断すべきである。例えば、他の偽野生型Ｍ１ウイルスの配列において前記部位がＥ２タンパク質の一次構造における配列順序が必ず第４位ではなく、この場合、「４」は絶対的な制限と見なされてはならず、位置する機能ドメイン又はモチーフに応じて前記特定のアミノ酸残基が本明細書に記載のＮＳ３タンパク質の第４位のアミノ酸残基に属するか否かを判断すべきである。
【0106】
薬学的に許容される担体は、ヒトに投与するときにアレルギー又は類似の副作用が発生しない分子実体又は組成物であり、溶媒、分散媒体、媒介物、コート、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどのいずれかを含む。これらの薬物活性物質の媒体及び試薬の使用は当該技術分野において知られているものである。いずれかの一般的な媒体又は試薬と活性成分が相溶しない場合を除き、治療用組成物への使用が期待されている。
【0107】
免疫チェックポイント阻害剤は、１種又は複数種のチェックポイントタンパク質を全体又は部分的に減少、阻害、干渉又は調節する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化又は機能を調節する。複数種類のチェックポイントタンパク質、例えば、ＣＴＬＡ－４、そのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６、並びにＰＤ１、そのリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２が知られている（Ｐａｒｄｏｌｌ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １２：２５２－２６４，２０１２）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激又は相互作用の阻害を担当する。免疫チェックポイントタンパク質は、自己耐性及び生理的免疫反応の持続時間と幅を調節して維持する。免疫チェックポイント阻害剤は抗体を含むか、又は抗体に由来する。
【0108】
化学療法剤は、がんの治療に適用できる化合物である。
【0109】
治療とは、症状を緩和すること、症因を一時的若しくは恒久的に解消すること、または特定の疾患または病状を予防または遅延させることを指す。
【0110】
有効量とは、本発明で使用されるアルファウイルス又はプロテアソーム阻害剤を含めて所望の治療効果を提供するのに十分な量を指す。必要な精確量は、対象によって異なり、治療を受ける種、対象の年齢、一般的な病状、治療される病状の重症度、投与される特定の薬剤及び投与態様などに依存する。しかし、所定の状況に対しては、当業者は症状の重症度、再発の頻度及び治療計画に対する生理学的応答に応じて本発明の医薬組成物の用量を調整することができる。
【0111】
実施例１：Ｍ１部位特異的変異ウイルス株の構築及び同定
材料
１．クローン：コンピテントＴＯＰ１０、プラスミド抽出キット、ＤＮＡ生成物回収キット；Ｇｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。
２．制限酵素ＳｐｅＩ、ＳｗａＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＸｂａＩ
３．部位特異的変異プライマーを表２に示す。
４．野生型Ｍ１ウイルス全長ゲノムプラスミド：ｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴは、配列が配列番号５に示されるＭ１全ゲノムを含むプラスミド担体である。配列番号５に示される配列に基づいて全遺伝子合成を行い、組換えＤＮＡ技術によりＭ１配列をｐＢＲ３２２担体（ポリクローナル部位を添加する）のＣｌａＩとＥｃｏＲＩ酵素切断部位の間にクローニングし、ｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴ担体を形成する。同様の方法によりｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６担体を構築する。Ｍ１－ｃ６は、配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルスであり、そのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基がＭ、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基がＥである。
５．変異ウイルス全長ゲノムプラスミド：部位特異的変異技術によりｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴ担体に変異を導入してｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３Ｍ（即ち、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に発生したＭ３５８Ｌ変異を含む）、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２Ｍ（即ち、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基に発生したＫ４Ｎ変異を含む）、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ（即ち、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に発生したＭ３５８Ｌ変異及びＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基に発生したＫ４Ｎ変異を含む）を形成し、ｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６に変異を導入してｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６ｖ１（即ち、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に発生したＭ３５８Ｌ変異及びＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基に発生したＥ４Ｄ変異を含む）を形成する。
６．ＤＨ５αコンピテント細胞、高純度プラスミド抽出キット；ＪＭ１１０コンピテント細胞；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ。
７．ＲＮＡ抽出：ＴＲＩｚｏｌ；クロロホルム、イソプロパノール、無水エタノール。
８．逆転写：Ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ、ｄＮＴＰ、ＭＭＬＶ、ＲＮａｓｅＯＵＴ。
９．ＰＣＲ：Ｑ５ハイフィデリティ―酵素、ＰＣＲプライマー（表３）。プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって合成される。
１０．アガロースゲルＤＮＡ回収キット。
１１．ＤＮＡ電気泳動：Ａｇａｒｏｓｅ、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ。
材料
１．クローン：コンピテントＴＯＰ１０、プラスミド抽出キット、ＤＮＡ生成物回収キット；Ｇｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ；Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ。
２．制限酵素ＳｐｅＩ、ＳｗａＩ、ＸｈｏＩ、ＡｐａＩ、ＸｂａＩ
３．部位特異的変異プライマーを表２に示す。
【表3】
４．野生型Ｍ１ウイルス全長ゲノムプラスミド：ｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴは、配列が配列番号５に示されるＭ１全ゲノムを含むプラスミド担体である。配列番号５に示される配列に基づいて全遺伝子合成を行い、組換えＤＮＡ技術によりＭ１配列をｐＢＲ３２２担体（ポリクローナル部位を添加する）のＣｌａＩとＥｃｏＲＩ酵素切断部位の間にクローニングし、ｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴ担体を形成する。同様の方法によりｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６担体を構築する。Ｍ１－ｃ６は、配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルスであり、そのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基がＭ、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基がＥである。
５．変異ウイルス全長ゲノムプラスミド：部位特異的変異技術によりｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴ担体に変異を導入してｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３Ｍ（即ち、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に発生したＭ３５８Ｌ変異を含む）、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２Ｍ（即ち、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基に発生したＫ４Ｎ変異を含む）、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ（即ち、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に発生したＭ３５８Ｌ変異及びＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基に発生したＫ４Ｎ変異を含む）を形成し、ｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６に変異を導入してｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６ｖ１（即ち、ＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基に発生したＭ３５８Ｌ変異及びＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基に発生したＥ４Ｄ変異を含む）を形成する。
６．ＤＨ５αコンピテント細胞、高純度プラスミド抽出キット；ＪＭ１１０コンピテント細胞；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＲＮＡｉＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ。
７．ＲＮＡ抽出：ＴＲＩｚｏｌ；クロロホルム、イソプロパノール、無水エタノール。
８．逆転写：Ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ、ｄＮＴＰ、ＭＭＬＶ、ＲＮａｓｅＯＵＴ。
９．ＰＣＲ：Ｑ５ハイフィデリティ―酵素、ＰＣＲプライマー（表３）。プライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって合成される。
１０．アガロースゲルＤＮＡ回収キット。
１１．ＤＮＡ電気泳動：Ａｇａｒｏｓｅ、ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ、ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ。
【0112】
【表4】
【0113】
方法
１．ウイルス遺伝子全長のプラスミド担体の構築
ｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴ、ｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６菌種を５ｍＬ ＬＢ培地に加え、３７℃で一晩シェイクした。プラスミド抽出キットによりプラスミドを抽出し、ＮａｎｏｄｒｏｐによりプラスミドＤＮＡの濃度を測定した。ＰＣＲ増幅系を表４に示す。
１．ウイルス遺伝子全長のプラスミド担体の構築
ｐＢＲ－Ｍ１－ＷＴ、ｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６菌種を５ｍＬ ＬＢ培地に加え、３７℃で一晩シェイクした。プラスミド抽出キットによりプラスミドを抽出し、ＮａｎｏｄｒｏｐによりプラスミドＤＮＡの濃度を測定した。ＰＣＲ増幅系を表４に示す。
【表5】
【0114】
反応条件：９８℃で３ｍｉｎ初期熱変性（ｐｒｅ－ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を行い、９８℃１５ｓ、５８℃１５ｓ、７２℃４５ｓを１サイクルとし、３５回繰り返し、７２℃で５ｍｉｎ拡張させ、終了後に温度を４℃に冷却した。アガロースゲル電気泳動により生成物があるか否か及びサイズが正確であるか否かを検出した。
【0115】
担体プラスミドの酵素による切断：ＮＳ３及びＥ２変異の酵素切断系を構築した（表５）。
【表6】
【0116】
３７℃で１ｈ反応させ、切断されたプラスミドをキットで回収し、濃度を測定した。
【0117】
Ｇｉｂｓｏｎ ＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘキットにより担体及びＰＣＲ断片を組み立てた。反応系は、ＰＣＲ断片１＋ＰＣＲ断片２＋プラスミド＋２×Ｍｉｘ＋Ｈ２Ｏ＝１＋１＋１＋１０＋７（μＬ）、反応条件は、５０℃、１ｈであった。
【0118】
形質転換クローン：１０μＬの接続生成物を取り、１００μＬのＤＨ５ａコンピテント細胞を形質転換し、アンピシリン耐性プレートを用いてスクリーニングした。クローンを選択して配列決定を行った。二重部位変異したウイルスは、Ｅ２変異した担体プラスミドにおいてさらにＮＳ３部位に変異したものであった。
【0119】
２．部位特異的変異ウイルスの製造
ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３Ｍ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２Ｍ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ及びｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６ｖ１菌種を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩シェイクする。キットによりプラスミドを抽出して濃度を測定した。ＪＭ１１０を形質転換し（ＪＭ１１０コンピテントの形質転換効率が低いため、１００μＬコンピテントを形質転換するためにより多くのプラスミドが必要である。３００μＬのＬＢ液を追加して１ｈ回復させた後、全部プレートに塗布する）、アンピシリン耐性プレートを用いてスクリーニングした。モノクローンを選択して５００μｌのＬＢ／アンピシリン培地に加え、３７℃で１２ｈシェイクし、さらに拡大培養し、３７℃で１４～１６ｈシェイクした。菌液の濃度が適宜になると、グリセリンの最終濃度１５～３０％で菌種を保存した。エンドトキシンを除去できるプラスミド抽出キットによりプラスミドを抽出し、濃度を測定した。ＸｂａＩエンドヌクレアーゼでプラスミドを線形化させた（表６）。
ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３Ｍ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２Ｍ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ及びｐＢＲ－Ｍ１－ｃ６ｖ１菌種を５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩シェイクする。キットによりプラスミドを抽出して濃度を測定した。ＪＭ１１０を形質転換し（ＪＭ１１０コンピテントの形質転換効率が低いため、１００μＬコンピテントを形質転換するためにより多くのプラスミドが必要である。３００μＬのＬＢ液を追加して１ｈ回復させた後、全部プレートに塗布する）、アンピシリン耐性プレートを用いてスクリーニングした。モノクローンを選択して５００μｌのＬＢ／アンピシリン培地に加え、３７℃で１２ｈシェイクし、さらに拡大培養し、３７℃で１４～１６ｈシェイクした。菌液の濃度が適宜になると、グリセリンの最終濃度１５～３０％で菌種を保存した。エンドトキシンを除去できるプラスミド抽出キットによりプラスミドを抽出し、濃度を測定した。ＸｂａＩエンドヌクレアーゼでプラスミドを線形化させた（表６）。
【表7】
【0120】
２つの試験管に分けて３７℃で２ｈ反応させた。
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）で１０倍希釈し、各管に２．５μＬ加え、さらに５μＬの１０％ＳＤＳを加え、５０℃で３０ｍｉｎインキュベートした。キットにより酵素切断後の線形プラスミドＤＮＡを回収し、濃度を測定した。
インビトロ転写：３７℃で２ｈ反応させ、その後、生成物を凍結保存してはならず、そのまま次の操作に用いた。転写系を表７に示す。
Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ消化：Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０ｍｇ／ｍｌ）で１０倍希釈し、各管に２．５μＬ加え、さらに５μＬの１０％ＳＤＳを加え、５０℃で３０ｍｉｎインキュベートした。キットにより酵素切断後の線形プラスミドＤＮＡを回収し、濃度を測定した。
インビトロ転写：３７℃で２ｈ反応させ、その後、生成物を凍結保存してはならず、そのまま次の操作に用いた。転写系を表７に示す。
【表8】
【0121】
ＤＮＡテンプレートの除去：１Ｕ／μｇ ＤＮＡテンプレートでＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（１Ｕ／μＬ）を加え、３７℃で１５ｍｉｎ反応させた。
ＲＮＡトランスフェクション：１日前にＶｅｒｏ細胞を３×１０５個の細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種し、１．５ｍｌ完全培地で培養し、１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと３．７５μＬのＬｉｐｏｍＲＮＡ、及び１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと２．５μｇのＲＮＡをそれぞれ均一に混合し、そして両者を１つの試験管に入れて均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置し、ＲＮＡとトランスフェクション試薬の複合物を細胞培養皿に入れ、次の２～４日間に細胞病変形態があるか否かを観察し、上清を回収し、さらにＶｅｒｏ細胞でウイルスを増幅させた。
ＲＮＡトランスフェクション：１日前にＶｅｒｏ細胞を３×１０５個の細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種し、１．５ｍｌ完全培地で培養し、１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと３．７５μＬのＬｉｐｏｍＲＮＡ、及び１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭと２．５μｇのＲＮＡをそれぞれ均一に混合し、そして両者を１つの試験管に入れて均一に混合し、室温で５ｍｉｎ静置し、ＲＮＡとトランスフェクション試薬の複合物を細胞培養皿に入れ、次の２～４日間に細胞病変形態があるか否かを観察し、上清を回収し、さらにＶｅｒｏ細胞でウイルスを増幅させた。
【0122】
３．ＴＲＩｚｏｌ法によるＲＮＡ抽出
ＴＲＩｚｏｌを加え、ピペッティングして細胞を十分に溶解した。沈殿が発生したら、４℃、１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集した。２００μＬクロロホルムを加え、激しく振盪して均一に混合し、室温で３ｍｉｎ静置した。４℃、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離、約５００μＬの上層水相を吸い取り、新しいＥＰ管に移した。５００μＬイソプロパノールを加え、軽くひっくり返して均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置した。４℃、１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。事前に冷却された７５％のエタノール５００μＬで沈殿を洗浄し、４℃、１２０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。乾燥後に、適量のＤＥＰＣ水でＲＮＡ沈殿を溶解した。ＮａｎｏｄｒｏｐによりＲＮＡの濃度を測定した。
ＴＲＩｚｏｌを加え、ピペッティングして細胞を十分に溶解した。沈殿が発生したら、４℃、１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集した。２００μＬクロロホルムを加え、激しく振盪して均一に混合し、室温で３ｍｉｎ静置した。４℃、１２０００ｇで１５ｍｉｎ遠心分離、約５００μＬの上層水相を吸い取り、新しいＥＰ管に移した。５００μＬイソプロパノールを加え、軽くひっくり返して均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ静置した。４℃、１２０００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。事前に冷却された７５％のエタノール５００μＬで沈殿を洗浄し、４℃、１２０００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。乾燥後に、適量のＤＥＰＣ水でＲＮＡ沈殿を溶解した。ＮａｎｏｄｒｏｐによりＲＮＡの濃度を測定した。
【0123】
４．逆転写
ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写を行った。
ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写を行った。
【表9】
【0124】
表８に従って各反応成分を加え、６５℃で５ｍｉｎ初期熱変性をした後、直ちに氷に置き、２－３ｍｉｎ静置した。
４μＬの５×ｂｕｆｆｅｒ反応液、２μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ試薬、１μＬのＤＴＴ及び１μＬの逆転写酵素ＭＭＬＶを加え、２５℃１０ｍｉｎ、３７℃５０ｍｉｎ、７０℃１５ｍｉｎの条件で反応させた。
４μＬの５×ｂｕｆｆｅｒ反応液、２μＬのＲＮａｓｅＯＵＴ試薬、１μＬのＤＴＴ及び１μＬの逆転写酵素ＭＭＬＶを加え、２５℃１０ｍｉｎ、３７℃５０ｍｉｎ、７０℃１５ｍｉｎの条件で反応させた。
【0125】
５．ＰＣＲ
逆転写後のｃＤＮＡを２～５倍希釈し、Ｑ５ハイフィデリティ―酵素でＤＮＡをＰＣＲ増幅した（１０個の断片に分けてＭ１ゲノムを増幅した）。
逆転写後のｃＤＮＡを２～５倍希釈し、Ｑ５ハイフィデリティ―酵素でＤＮＡをＰＣＲ増幅した（１０個の断片に分けてＭ１ゲノムを増幅した）。
【表10】
【0126】
反応条件：９８℃で３０ｓ初期熱変性を行い、９８℃１０ｓ、５８℃３０ｓ、７２℃１ｍｉｎを１サイクルとし、３５回繰り返し、７２℃で２ｍｉｎ拡張させ、終了後に温度を４℃に冷却した。
【0127】
１％アガロースゲル電気泳動によるＰＣＲ生成物の検出
０．５ｇアガロースを秤量し、５０ｍＬ水に入れ、加熱してアガロースを十分に溶解し、約５０℃に冷却したときに１万分の１でＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ染料を加え、ゲルプレートに入れ、櫛を挿入し、完全に凝固した後に電気泳動槽に入れ、各ウェルに５μＬのサンプルを加え、電圧１００Ｖで約４０ｍｉｎ電気泳動し、Ｔｉａｎｎｅｎｇ ＩｍａｇｅｒによりＤＮＡ生成物を観察して撮影した。
０．５ｇアガロースを秤量し、５０ｍＬ水に入れ、加熱してアガロースを十分に溶解し、約５０℃に冷却したときに１万分の１でＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ染料を加え、ゲルプレートに入れ、櫛を挿入し、完全に凝固した後に電気泳動槽に入れ、各ウェルに５μＬのサンプルを加え、電圧１００Ｖで約４０ｍｉｎ電気泳動し、Ｔｉａｎｎｅｎｇ ＩｍａｇｅｒによりＤＮＡ生成物を観察して撮影した。
【0128】
【表11】
【0129】
６．ＰＣＲ生成物をＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社に郵送して配列決定してもらった。
【0130】
結果
図１に示すように、遺伝子配列の比較から分かるように、部位特異的変異ウイルスはいずれも成功に構築された。それぞれは以下の４種類の変異ウイルスである。
(１）ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ：ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基が変異し、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）に変わったものである。
(２）ｒＭ１－Ｅ２Ｍ：ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスのＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基が変異し、リジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変わったものである。
(３）ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ：ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基が変異し、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）に変わり、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基が変異し、リジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変わったものである。
(４）ｒＭ１－ｃ６ｖ１：ゲノム配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルス（即ち、Ｍ１－ｃ６）のＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基が変異し、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）に変わり、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基が変異し、グルタミン酸（Ｅ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変わったものである。
図１に示すように、遺伝子配列の比較から分かるように、部位特異的変異ウイルスはいずれも成功に構築された。それぞれは以下の４種類の変異ウイルスである。
(１）ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ：ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基が変異し、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）に変わったものである。
(２）ｒＭ１－Ｅ２Ｍ：ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスのＥ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基が変異し、リジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変わったものである。
(３）ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ：ゲノム配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスのＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基が変異し、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）に変わり、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基が変異し、リジン（Ｋ）からアスパラギン（Ｎ）に変わったものである。
(４）ｒＭ１－ｃ６ｖ１：ゲノム配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルス（即ち、Ｍ１－ｃ６）のＮＳ３タンパク質の第３５８位のアミノ酸残基が変異し、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）に変わり、Ｅ２タンパク質の第４位のアミノ酸残基が変異し、グルタミン酸（Ｅ）からアスパラギン酸（Ｄ）に変わったものである。
【0131】
結論
部位特異的変異により４種類の変異ウイルスｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ及びｒＭ１－ｃ６ｖ１を成功に構築した。そのうち、変異ウイルスｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ及びｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍは、配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスをもとに部位特異的変異により得られたものであり、ｒＭ１－ｃ６ｖ１は、配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルスＭ１－ｃ６をもとに部位特異的変異により得られたものである。
部位特異的変異により４種類の変異ウイルスｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ及びｒＭ１－ｃ６ｖ１を成功に構築した。そのうち、変異ウイルスｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ及びｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍは、配列が配列番号５に示されるＭ１ウイルスをもとに部位特異的変異により得られたものであり、ｒＭ１－ｃ６ｖ１は、配列が配列番号１５に示されるＭ１ウイルスＭ１－ｃ６をもとに部位特異的変異により得られたものである。
【0132】
実施例２：多種類の腫瘍細胞に対する４種類の変異Ｍ１ウイルスの抗腫瘍効果
１．実験材料及び機器
１．１．主な薬品、試薬及び調製
主な薬品及び試薬
・Ｍ１ウイルス：ｒＭ１－ＷＴ、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、Ｍ１－ｃ６、Ｍ１－ｃ６ｖ１
・Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）：東仁化学科技（上海）有限公司（型番：ＣＫ－０４）
・塩化カリウム：メルク化工技術（上海）有限公司（バッチ番号：Ｋ４６８３７８０９６０３）
・リン酸二水素カリウム：メルク化工技術（上海）有限公司（バッチ番号：ＡＭ１２１７５３９８０５）
・重炭酸ナトリウム：メルク化工技術（上海）有限公司（バッチ番号：Ｋ４９８０４０２３８０４）
・リン酸水素二ナトリウム十二水和物：成都華邑薬用補料製造有限責任公司（バッチ番号：２０１７０４０２）
・無水塩化カルシウム：河北華辰製薬有限公司（バッチ番号：１７１００９）
・塩化マグネシウム六水和物：成都華邑薬用補料製造有限責任公司（バッチ番号：２０１７０８０７）
・マンニトール：フランスのロケット社（バッチ番号：Ｅ９３９Ｘ）
・トレハロース：米国ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ（バッチ番号：３６３５８Ａ）
・ヒトアルブミン：深セン市衛光生物製品股分有限公司（バッチ番号：２０１７１１４４Ｂ）
１．実験材料及び機器
１．１．主な薬品、試薬及び調製
主な薬品及び試薬
・Ｍ１ウイルス：ｒＭ１－ＷＴ、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、Ｍ１－ｃ６、Ｍ１－ｃ６ｖ１
・Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ－８（ＣＣＫ－８）：東仁化学科技（上海）有限公司（型番：ＣＫ－０４）
・塩化カリウム：メルク化工技術（上海）有限公司（バッチ番号：Ｋ４６８３７８０９６０３）
・リン酸二水素カリウム：メルク化工技術（上海）有限公司（バッチ番号：ＡＭ１２１７５３９８０５）
・重炭酸ナトリウム：メルク化工技術（上海）有限公司（バッチ番号：Ｋ４９８０４０２３８０４）
・リン酸水素二ナトリウム十二水和物：成都華邑薬用補料製造有限責任公司（バッチ番号：２０１７０４０２）
・無水塩化カルシウム：河北華辰製薬有限公司（バッチ番号：１７１００９）
・塩化マグネシウム六水和物：成都華邑薬用補料製造有限責任公司（バッチ番号：２０１７０８０７）
・マンニトール：フランスのロケット社（バッチ番号：Ｅ９３９Ｘ）
・トレハロース：米国ｐｆａｎｓｔｉｅｈｌ（バッチ番号：３６３５８Ａ）
・ヒトアルブミン：深セン市衛光生物製品股分有限公司（バッチ番号：２０１７１１４４Ｂ）
【0133】
１．２．主な機器
【表12】
【0134】
２．実験細胞の由来源
細胞は、ＡＴＣＣ又は中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫から購入された。
細胞は、ＡＴＣＣ又は中国科学院典型培養物保蔵委員会細胞庫から購入された。
【0135】
３．実験方法
・細胞培養
各細胞の説明書に従って適宜な培養条件を使用し、説明書に記載の継代比率にて細胞増殖継代を行った。
・細胞培養
各細胞の説明書に従って適宜な培養条件を使用し、説明書に記載の継代比率にて細胞増殖継代を行った。
【0136】
・実験群分け及び処理
各細胞の増殖に対するＭ１－ｃ６ｖ１の抑制効果を検出した。具体的な群分け及び処理を表１２に示す。
各細胞の増殖に対するＭ１－ｃ６ｖ１の抑制効果を検出した。具体的な群分け及び処理を表１２に示す。
【0137】
【表13】
【0138】
細胞を対数増殖期に継代培養した後、細胞を消化し、対応する密度の細胞を４８ウェルプレートに接種し、上記群別に従って実験を計画し、各群について実験を３回繰り返し、ブランク対照群では細胞を接種しなかった。細胞が容器壁に付着して２４ｈ後にサンプルを加え、引き続き７２ｈ培養した後に、細胞の生存率を測定した。
【0139】
・ＣＣＫ－８法による細胞生存率の測定
４８ウェルプレート中の元の培養液を取り除き、２００μＬ／ウェルで壁に沿って発色液（１００％完全培地＋１０％ＣＣＫ－８溶液）をゆっくりと加え、３７℃で引き続き０．５－３ｈ培養した後、吸光マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの波長下で各ウェルの吸光度の値を測定した。
４８ウェルプレート中の元の培養液を取り除き、２００μＬ／ウェルで壁に沿って発色液（１００％完全培地＋１０％ＣＣＫ－８溶液）をゆっくりと加え、３７℃で引き続き０．５－３ｈ培養した後、吸光マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの波長下で各ウェルの吸光度の値を測定した。
【0140】
・各細胞に対するＭ１ウイルスの半数阻害濃度（ＩＣ５０）の計算
測定された各ウェルの吸光度の値から算式「細胞増殖阻害率（ＩＲ）＝（平均ＯＤ陰性－ＯＤ実験）／（平均ＯＤ陰性－平均ＯＤブランク）×１００％」により各ウェルの細胞の増殖阻害率を算出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアにより細胞増殖阻害率曲線を作成し、ｌｏｇ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）解析方程式により腫瘍細胞に対するＭ１－ｃ６ｖ１又はｒＭ１－ｃ６の半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値を算出した。
測定された各ウェルの吸光度の値から算式「細胞増殖阻害率（ＩＲ）＝（平均ＯＤ陰性－ＯＤ実験）／（平均ＯＤ陰性－平均ＯＤブランク）×１００％」により各ウェルの細胞の増殖阻害率を算出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０ソフトウェアにより細胞増殖阻害率曲線を作成し、ｌｏｇ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）解析方程式により腫瘍細胞に対するＭ１－ｃ６ｖ１又はｒＭ１－ｃ６の半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値を算出した。
【0141】
・ＭＴＴによる細胞活性の検出
細胞を２万個／ウェルで２４ウェルプレート（５００μｌ培地／ウェル）に接種し、壁に付着した状態を２４ｈ維持する。野生型及び変異ウイルスを１０倍段階希釈し、１０ＭＯＩのウイルス量を２４ウェルプレートに加えた。ウイルスに感染した７２ｈ後に、各ウェルにＭＴＴ５０μＬを加え、均一に混合し、インキュベータ内で引き続き２－４ｈ静置した。上清を慎重に吸い出し、各ウェルに５００μＬのＤＭＳＯを加えて青紫色のホルマザン結晶を溶解し、マイクロウェルプレート発振器上で振盪してホルマザンを完全に溶解して均一に混合し、マイクロプレートリーダーにて５７０ｎｍの波長下で吸光度を測定した。実験を少なくとも３回繰り返した。ブランク対照群で各群の吸光度の値を標準化し、各処理群の相対細胞生存率を算出し、細胞生存曲線を作成した。
細胞を２万個／ウェルで２４ウェルプレート（５００μｌ培地／ウェル）に接種し、壁に付着した状態を２４ｈ維持する。野生型及び変異ウイルスを１０倍段階希釈し、１０ＭＯＩのウイルス量を２４ウェルプレートに加えた。ウイルスに感染した７２ｈ後に、各ウェルにＭＴＴ５０μＬを加え、均一に混合し、インキュベータ内で引き続き２－４ｈ静置した。上清を慎重に吸い出し、各ウェルに５００μＬのＤＭＳＯを加えて青紫色のホルマザン結晶を溶解し、マイクロウェルプレート発振器上で振盪してホルマザンを完全に溶解して均一に混合し、マイクロプレートリーダーにて５７０ｎｍの波長下で吸光度を測定した。実験を少なくとも３回繰り返した。ブランク対照群で各群の吸光度の値を標準化し、各処理群の相対細胞生存率を算出し、細胞生存曲線を作成した。
【0142】
・統計的処理
全ての実験結果に対して、それぞれ独立して実験を２回以上繰り返した。実験結果を平均値±標準偏差で示す。
全ての実験結果に対して、それぞれ独立して実験を２回以上繰り返した。実験結果を平均値±標準偏差で示す。
【0143】
４．実験結果
図２Ａに示すように、顕微鏡下でｒＭ１－ＮＳ３Ｍ及びｒＭ１－Ｅ２Ｍウイルスに感染した後の細胞に病変が発生したことが観察されたため、単一部位変異が腫瘍細胞におけるＭ１ウイルスの複製及び腫瘍溶解効果を独立して増強できることを示している。野生型及び単一部位変異ウイルスと比べて、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ二重部位変異ウイルスに感染した後、感染率が９０％以上に達し、ほとんどの細胞に病変が生じた。さらに、ＭＴＴ法によりｒＭ１－ＷＴ、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２ＭのＨＣＴ １１６細胞に対する殺傷効果を比較した。顕微鏡下での観察と一致し、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ及びｒＭ１－Ｅ２Ｍウイルスの用量効果曲線が左にシフトし、ＥＣ５０ｓｈｉｆｔ効果向上を計算した結果、それぞれ８０倍及び６０倍であり、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスの用量効果曲線が左へシフトする幅がより大きく、ＥＣ５０ｓｈｉｆｔ効果向上は７６００倍に達し（図２Ｂ）、二重変異部位がウイルスの腫瘍溶解効果を相乗的に増強できることを示している。
図２Ａに示すように、顕微鏡下でｒＭ１－ＮＳ３Ｍ及びｒＭ１－Ｅ２Ｍウイルスに感染した後の細胞に病変が発生したことが観察されたため、単一部位変異が腫瘍細胞におけるＭ１ウイルスの複製及び腫瘍溶解効果を独立して増強できることを示している。野生型及び単一部位変異ウイルスと比べて、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ二重部位変異ウイルスに感染した後、感染率が９０％以上に達し、ほとんどの細胞に病変が生じた。さらに、ＭＴＴ法によりｒＭ１－ＷＴ、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２ＭのＨＣＴ １１６細胞に対する殺傷効果を比較した。顕微鏡下での観察と一致し、ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ及びｒＭ１－Ｅ２Ｍウイルスの用量効果曲線が左にシフトし、ＥＣ５０ｓｈｉｆｔ効果向上を計算した結果、それぞれ８０倍及び６０倍であり、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスの用量効果曲線が左へシフトする幅がより大きく、ＥＣ５０ｓｈｉｆｔ効果向上は７６００倍に達し（図２Ｂ）、二重変異部位がウイルスの腫瘍溶解効果を相乗的に増強できることを示している。
【0144】
より多くの腫瘍細胞及び正常細胞を用いてｒＭ１－ＷＴとｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍの３種類のＭ１ウイルス変異体との腫瘍溶解効果及び安全性を比較した。結果を表１３～表１５に示す。結果は、ｒＭ１－ＷＴウイルスに比べ、３種類のＭ１ウイルス変異体はいずれも腫瘍溶解効果を異なる程度で増強させるとともに、正常細胞に対して顕著な毒性を有しないことを示している。
【0145】
【表14】
【0146】
【表15】
【0147】
【表16】
【0148】
同様に、複数株の腫瘍細胞及び正常細胞を用いてＭ１－ｃ６とＭ１－ｃ６ｖ１ウイルス変異体の腫瘍溶解効果及び安全性を比較した。結果を表１６に示す。Ｍ１－ｃ６ｖ１はほとんどの悪性腫瘍細胞に対して顕著な殺傷作用を有する。Ｍ１－ｃ６ｖ１はほとんどのマウス由来悪性腫瘍細胞に対して同様に顕著な殺傷効果を有する。Ｍ１－ｃ６の殺傷効果（ＩＣ５０）に比べ、Ｍ１－ｃ６ｖ１のＩＣ５０はＭ１－ｃ６のＩＣ５０よりも１．３－２０．５倍低く、Ｍ１－ｃ６ｖ１の腫瘍溶解効果がＭ１－ｃ６よりも高いことを示している。
【0149】
【表17】
【0150】
５．実験の結論
変異株ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、Ｍ１－ｃ６ｖ１は、ヒト由来及びマウス由来悪性腫瘍のほとんどの悪性腫瘍細胞に対して顕著な殺傷作用を有する。
変異株ｒＭ１－ＮＳ３Ｍ、ｒＭ１－Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、Ｍ１－ｃ６ｖ１は、ヒト由来及びマウス由来悪性腫瘍のほとんどの悪性腫瘍細胞に対して顕著な殺傷作用を有する。
【0151】
実施例３：体内でのｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスの有効性及び安全性研究
材料
１．ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－ＷＴウイルス
２．結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ １１６
３．３０匹の６－８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕヌードマウス
材料
１．ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ、ｒＭ１－ＷＴウイルス
２．結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ １１６
３．３０匹の６－８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕヌードマウス
【0152】
方法
１．４－６週齢の雌ヌードマウスを購入し、事前に十分量のＨＣＴ １１６細胞を培養し、消化した後に無菌ＰＢＳで再懸濁させ、数を計測して必要に応じて細胞懸濁液を調製し、ＨＣＴ １１６細胞を５×１０６／１００μＬの量でヌードマウス背中の皮下に接種した。腫瘍のサイズが約５０ｍｍ３になったときに、ランダムに群に分け、６日間連続投与した。３日ごとに腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積（体積＝（長さ×幅２）／２）を計算し、増殖曲線を作成した。投与後の３日目に腫瘍組織と肝臓、心臓、脳、肺臓などの正常臓器とを分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学実験に用いた。
１．４－６週齢の雌ヌードマウスを購入し、事前に十分量のＨＣＴ １１６細胞を培養し、消化した後に無菌ＰＢＳで再懸濁させ、数を計測して必要に応じて細胞懸濁液を調製し、ＨＣＴ １１６細胞を５×１０６／１００μＬの量でヌードマウス背中の皮下に接種した。腫瘍のサイズが約５０ｍｍ３になったときに、ランダムに群に分け、６日間連続投与した。３日ごとに腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積（体積＝（長さ×幅２）／２）を計算し、増殖曲線を作成した。投与後の３日目に腫瘍組織と肝臓、心臓、脳、肺臓などの正常臓器とを分離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、免疫組織化学実験に用いた。
【0153】
２．免疫組織化学実験
ヌードマウスの腫瘍組織及び正常臓器を取り、４％パラホルムアルデヒドで固定し、サンプルを谷歌生物公司に郵送してＣｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ ３ 、Ｋｉ６７の量を測定してもらった。
ヌードマウスの腫瘍組織及び正常臓器を取り、４％パラホルムアルデヒドで固定し、サンプルを谷歌生物公司に郵送してＣｌｅａｖｅｄ－ｃａｓｐａｓｅ ３ 、Ｋｉ６７の量を測定してもらった。
【0154】
結果
１．ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを用いて皮下担癌モデルを構築し、連続して６回投与（静脈）し、ヌードマウスの生存状況を観察した結果、対照群に比べ、投与群のヌードマウスの体重が顕著に変化せず（図３Ｂ）、精神状態が良好であり、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ変異ウイルスの安全性が良好であることをある程度示している。対照群に比べ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ投与群のヌードマウスの腫瘍体積が顕著に小さく（図３Ａ）、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスは腫瘍細胞に到達し、腫瘍細胞を殺して腫瘍増殖を抑制できることを示している。
１．ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを用いて皮下担癌モデルを構築し、連続して６回投与（静脈）し、ヌードマウスの生存状況を観察した結果、対照群に比べ、投与群のヌードマウスの体重が顕著に変化せず（図３Ｂ）、精神状態が良好であり、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ変異ウイルスの安全性が良好であることをある程度示している。対照群に比べ、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍ投与群のヌードマウスの腫瘍体積が顕著に小さく（図３Ａ）、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスは腫瘍細胞に到達し、腫瘍細胞を殺して腫瘍増殖を抑制できることを示している。
【0155】
２．体内での腫瘍増殖に対するｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍの抑制作用をさらに調査するために、投与の３日後に腫瘍組織を剥離し、せん断体ｃａｓｐａｓｅ－３（Ｃｌ－ｃａｓｐ３）及びＫｉ６７を用いて免疫組織化学染色を行う。Ｃｌ－ｃａｓｐ３はアポトーシスのマーカーであり、その発現量が腫瘍細胞のアポトーシス程度を示す。Ｋｉ６７は増殖のマーカーであり、その発現量が腫瘍細胞の増殖能力を示す。図４では、茶色は陽性信号を示す。ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２ＭウイルスはＣｌ－ｃａｓｐ３の発現を顕著にアップレギュレートし、Ｋｉ６７の発現を顕著にダウンレギュレートすることができ、腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすとともに、腫瘍細胞の迅速増殖という悪性表現型を抑制できることを示している。
【0156】
３．腫瘍溶解性ウイルス療法の安全性は非常に重要である。Ｍ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスが正常細胞株において安全であることが実証されているが、体内での安全性についてはさらなる研究が必要である。ヌードマウス皮下腫瘍形成モデルにおいて、投与後の３日目に各群の実験動物の主な臓器（心臓、脳、肝臓、肺臓、結腸及び関節などの組織を含む）を分離し、免疫組織化学法によりｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスタンパク質の発現を観察した。ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスが結腸直腸がん細胞株上で連続的に継代して得られるため、心臓、脳などの重要な臓器に加えて、マウスの結腸上皮細胞内でのウイルス複製にも注目した。また、多くのアルファウイルスが関節炎を引き起こすことが報告されているため、実験に用いる２種類のウイルスが関節で複製したかを観察した。図５から明らかなように、ウイルスの複製がなく、各群の組織細胞の形態に違いがなく、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスが免疫不全のヌードマウスの体内において安全性が良好であることを示している。
【0157】
結論
動物実験により、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスが体内で抗腫瘍効果を効果的に発揮し、腫瘍の増殖を抑制でき、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍが腫瘍組織のアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞の悪性表現型を抑制できることが検証されている。実験中で、ヌードマウスの体重に明らかな変化がなく、正常組織臓器にウイルスの複製が観察されず、安全性が良好であった。
動物実験により、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍウイルスが体内で抗腫瘍効果を効果的に発揮し、腫瘍の増殖を抑制でき、ｒＭ１－Ｎ３Ｅ２Ｍが腫瘍組織のアポトーシスを誘導し、腫瘍細胞の悪性表現型を抑制できることが検証されている。実験中で、ヌードマウスの体重に明らかな変化がなく、正常組織臓器にウイルスの複製が観察されず、安全性が良好であった。
【0158】
実施例４：体内での腫瘍増殖に対するＭ１－ｃ６ｖ１ウイルスの効果的な抑制
材料
１．Ｍ１－ｃ６ｖ１、Ｍ１－ｃ６ウイルス
２．マウス黒色腫Ｂ１６－Ｆ１０細胞
３．４０匹の５－６週齢のＣ５７ ＢＬ／６マウス、雌
材料
１．Ｍ１－ｃ６ｖ１、Ｍ１－ｃ６ウイルス
２．マウス黒色腫Ｂ１６－Ｆ１０細胞
３．４０匹の５－６週齢のＣ５７ ＢＬ／６マウス、雌
【0159】
方法
５－６週齢のＣ５７ ＢＬ／６雌マウスを購入し、事前に十分量のＢ１６－Ｆ１０細胞を培養し、消化した後に無菌ＰＢＳで再懸濁させ、数を計測して必要に応じて細胞懸濁液を調製し、Ｂ１６－Ｆ１０細胞を５×１０４／１００μＬの量でマウス背中の皮下に接種した。腫瘍のサイズが約６０ｍｍ３になったときに、ランダムに群に分け、７日間連続投与した。３日ごとに腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積（体積＝（長さ×幅２）／２）を計算し、増殖曲線を作成した。
５－６週齢のＣ５７ ＢＬ／６雌マウスを購入し、事前に十分量のＢ１６－Ｆ１０細胞を培養し、消化した後に無菌ＰＢＳで再懸濁させ、数を計測して必要に応じて細胞懸濁液を調製し、Ｂ１６－Ｆ１０細胞を５×１０４／１００μＬの量でマウス背中の皮下に接種した。腫瘍のサイズが約６０ｍｍ３になったときに、ランダムに群に分け、７日間連続投与した。３日ごとに腫瘍の長さと幅を測定し、腫瘍体積（体積＝（長さ×幅２）／２）を計算し、増殖曲線を作成した。
【0160】
結果
Ｃ５７ ＢＬ／６マウスを用いて皮下担癌モデルを構築し、連続して７日間腫瘍内注射した後、マウスの生存状況を観察した結果、対照群に比べ、投与群のマウスの体重が顕著に変化せず（図６Ｂ）、精神状態が良好であり、Ｍ１－ｃ６ｖ１変異ウイルスの安全性が良好であることをある程度示している。対照群及びＭ１－ｃ６投与群に比べ、Ｍ１－ｃ６ｖ１投与群マウスの腫瘍体積が顕著に小さく（図６Ａ）、Ｍ１－ｃ６ｖ１ウイルスが腫瘍細胞を殺傷して腫瘍増殖を抑制できることを示している。
Ｃ５７ ＢＬ／６マウスを用いて皮下担癌モデルを構築し、連続して７日間腫瘍内注射した後、マウスの生存状況を観察した結果、対照群に比べ、投与群のマウスの体重が顕著に変化せず（図６Ｂ）、精神状態が良好であり、Ｍ１－ｃ６ｖ１変異ウイルスの安全性が良好であることをある程度示している。対照群及びＭ１－ｃ６投与群に比べ、Ｍ１－ｃ６ｖ１投与群マウスの腫瘍体積が顕著に小さく（図６Ａ）、Ｍ１－ｃ６ｖ１ウイルスが腫瘍細胞を殺傷して腫瘍増殖を抑制できることを示している。
【0161】
結論
動物実験により、Ｍ１－ｃ６ｖ１ウイルスが体内で抗腫瘍効果を効果的に発揮し、腫瘍の増殖を抑制できることが実証されている。実験中で、マウスの体重に明らかな変化がなかったため、安全性が良好であることを示している。
動物実験により、Ｍ１－ｃ６ｖ１ウイルスが体内で抗腫瘍効果を効果的に発揮し、腫瘍の増殖を抑制できることが実証されている。実験中で、マウスの体重に明らかな変化がなかったため、安全性が良好であることを示している。
【0162】
実施例５：Ｍ１部位特異的変異ウイルス株の構築、同定、及び効果検証
点変異の過程
ゲノム配列が配列番号５に示されるｒＭ１－ＷＴウイルスをもとに一連の部位特異的変異を行い（金斯瑞生物科技股分有限公司によって完成する）、それぞれｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｋ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｌ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｉ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｖ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｓ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｃ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｌ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｄプラスミド；及びｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｍ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｇ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ａ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｌ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｉ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｖ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｐ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｓ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｑ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｔ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｃ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｎ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｆ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｙ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｄ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｋ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｒ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｈを得た。
点変異の過程
ゲノム配列が配列番号５に示されるｒＭ１－ＷＴウイルスをもとに一連の部位特異的変異を行い（金斯瑞生物科技股分有限公司によって完成する）、それぞれｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｋ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｌ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｉ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｖ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｓ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｃ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｌ、ｐＢＲ－Ｍ１－Ｅ２－４Ｄプラスミド；及びｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｍ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｇ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ａ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｌ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｉ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｖ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｐ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｓ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｑ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｔ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｃ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｎ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｆ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｙ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｄ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｋ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｒ、ｐＢＲ－Ｍ１－ＮＳ３－３５８Ｈを得た。
【0163】
５．１試薬、材料
主な薬品及び試薬
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１１３２０－０３３）
・ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃ１１０９５５００ＢＴ）
・ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，１０－０１３－ＣＶＲＣ）
・新生仔ウシ血清（杭州天杭生物，２２０１１－８６１５）
・ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５－０８１－ＣＶ）
・プロテアーゼＫ（天根，ＲＴ４０３）
・トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ，２５２００－０７２）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＬＭＲＮＡ００３）
・Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（１Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ，３１９８５－０７０）
・制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１４５Ｓ）
・Ｒｉｂｏ ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１７１１）
・ＤＮＡ精製回収キット（天根，ＤＰ２０９）
・ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，２００１２０２７）
・ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１２８０）
・ＧｏｓｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ５００１）
・総ＲＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＬＳ１０４０）
・Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＶＰ－ＳＦＭ）（Ｇｉｂｃｏ，１１６８１－０２０）
・ＧｌｕｔａＭａｘ Ｉ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，３５０５００６１）
・ＭＥＭ ＮＥＡＡ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，１１１４００５０）
・Ｅ２配列決定用プライマー（金唯智，注文番号８０－４２３８８９５３７）
・Ｎ３配列決定用プライマー（金唯智，注文番号８０－４２９４０１７０６、８０－４２６０６６９０９）
主な溶液の調製
・ＶＰ－ＳＦＭ溶液の調製
１０ｍＬの１００×ＭＥＭ ＮＥＡＡ及び２０ｍＬの１００×ＧｌｕｔａＭａｘ Ｉを１Ｌ ＶＰ－ＳＦＭに加え、均一に混合し、４℃で保存し、予備した。
主な薬品及び試薬
・ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，１１３２０－０３３）
・ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃ１１０９５５００ＢＴ）
・ＤＭＥＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，１０－０１３－ＣＶＲＣ）
・新生仔ウシ血清（杭州天杭生物，２２０１１－８６１５）
・ウシ胎児血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５－０８１－ＣＶ）
・プロテアーゼＫ（天根，ＲＴ４０３）
・トリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ，２５２００－０７２）
・Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ，ＬＭＲＮＡ００３）
・Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（１Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ，３１９８５－０７０）
・制限酵素ＸｂａＩ（ＮＥＢ，Ｒ０１４５Ｓ）
・Ｒｉｂｏ ｍ７Ｇ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１７１１）
・ＤＮＡ精製回収キット（天根，ＤＰ２０９）
・ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ，２００１２０２７）
・ＲｉｂｏＭＡＸＴＭ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｐ１２８０）
・ＧｏｓｃｒｉｐｔＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ａ５００１）
・総ＲＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＬＳ１０４０）
・Ｖｉｒｕｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＶＰ－ＳＦＭ）（Ｇｉｂｃｏ，１１６８１－０２０）
・ＧｌｕｔａＭａｘ Ｉ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，３５０５００６１）
・ＭＥＭ ＮＥＡＡ（１００×）（Ｇｉｂｃｏ，１１１４００５０）
・Ｅ２配列決定用プライマー（金唯智，注文番号８０－４２３８８９５３７）
・Ｎ３配列決定用プライマー（金唯智，注文番号８０－４２９４０１７０６、８０－４２６０６６９０９）
主な溶液の調製
・ＶＰ－ＳＦＭ溶液の調製
１０ｍＬの１００×ＭＥＭ ＮＥＡＡ及び２０ｍＬの１００×ＧｌｕｔａＭａｘ Ｉを１Ｌ ＶＰ－ＳＦＭに加え、均一に混合し、４℃で保存し、予備した。
【0164】
５．２機器設備
【表18】
【0165】
５．３実験細胞
【表19】
【0166】
５．４試験ステップ
５．４．１プライマリシードロットウイルス的構築
プラスミド線形化
５．４．１プライマリシードロットウイルス的構築
プラスミド線形化
【表20】
【0167】
Ａ．ＰＣＲ管において表１９に従ってプラスミド線形化系を調製した後、ＰＣＲ機に置いて３７℃で１ｈインキュベータした。
Ｂ．各管に５μＬのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｋを加え、引き続きＰＣＲ機に置いて５０℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
Ｂ．各管に５μＬのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｋを加え、引き続きＰＣＲ機に置いて５０℃で３０ｍｉｎインキュベートした。
【0168】
（２）ＤＮＡの精製回収
Ａ．吸着カラムに５００μＬのＢＬを加え、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した。
Ｂ．線形化されたプラスミドを１．５ｍＬのＥＰ管に移し、５００μＬのＰＢを加え、十分に混合した。
Ｃ．混合液を吸着カラムに移し、室温で２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、濾液を除去した。
Ｄ．６００μＬのＰＷを加え、２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、濾液を除去した。
Ｅ．ステップＤを繰り返した。
Ｆ．濾液を除去し、１２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、蓋を開け、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｇ．３０μＬ無菌ＤＥＰＣ水を加え、１ｍｉｎ静置し、２回溶出し、濾液を収集した。
Ｈ．ＤＮＡ定量
Ａ．吸着カラムに５００μＬのＢＬを加え、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した。
Ｂ．線形化されたプラスミドを１．５ｍＬのＥＰ管に移し、５００μＬのＰＢを加え、十分に混合した。
Ｃ．混合液を吸着カラムに移し、室温で２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、濾液を除去した。
Ｄ．６００μＬのＰＷを加え、２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、濾液を除去した。
Ｅ．ステップＤを繰り返した。
Ｆ．濾液を除去し、１２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離し、蓋を開け、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｇ．３０μＬ無菌ＤＥＰＣ水を加え、１ｍｉｎ静置し、２回溶出し、濾液を収集した。
Ｈ．ＤＮＡ定量
【0169】
（３）インビトロ転写
Ａ．ＰＣＲ管において表２０に従ってインビトロ転写系を調製した後、ＰＣＲ機に置いて３７℃で２ｈインキュベートした。
Ｂ．ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（１μＬ／１μｇＤＮＡ）を加え、引き続きＰＣＲ機に置いて３７℃で１５ｍｉｎインキュベートした。
【表21】
Ｂ．ＲＱ１ ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ（１μＬ／１μｇＤＮＡ）を加え、引き続きＰＣＲ機に置いて３７℃で１５ｍｉｎインキュベートした。
【0170】
（４）ＲＮＡトランスフェクション
Ａ．細胞接種
各細胞の説明書に従って適宜な培養条件下で説明書に記載の継代比率で細胞を継代増幅培養した。細胞が対数増殖期になった後、細胞を消化し、４Ｅ０５／フラスコの密度でＶｅｒｏ細胞をＴ２５培養フラスコに接種し、細胞インキュベータに置いて引き続き培養し、壁に付着したままで２４ｈ培養した。
Ａ．細胞接種
各細胞の説明書に従って適宜な培養条件下で説明書に記載の継代比率で細胞を継代増幅培養した。細胞が対数増殖期になった後、細胞を消化し、４Ｅ０５／フラスコの密度でＶｅｒｏ細胞をＴ２５培養フラスコに接種し、細胞インキュベータに置いて引き続き培養し、壁に付着したままで２４ｈ培養した。
【0171】
Ｂ．トランスフェクション
１．５ｍｌ遠心分離管に２５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び７．５μＬのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを加え、別の遠心分離管に１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び全てのＲＮＡを加え、両者を均一に混合し、Ｖｅｒｏ細胞に滴下し、ウイルスインキュベータに置いて引き続き培養した。
１．５ｍｌ遠心分離管に２５０μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び７．５μＬのＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸを加え、別の遠心分離管に１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地及び全てのＲＮＡを加え、両者を均一に混合し、Ｖｅｒｏ細胞に滴下し、ウイルスインキュベータに置いて引き続き培養した。
【0172】
（５）ウイルス収集
細胞状態及び蛍光の有無を毎日観察した。蛍光が顕著に多くなることを観察したら、撮影して記録し、９０％の細胞が浮き上がった後、Ｖｅｒｏ細胞上清を収集し、４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を凍結保存管に保存し、プライマリシードロットとして液体窒素で保存した。
細胞状態及び蛍光の有無を毎日観察した。蛍光が顕著に多くなることを観察したら、撮影して記録し、９０％の細胞が浮き上がった後、Ｖｅｒｏ細胞上清を収集し、４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。上清を凍結保存管に保存し、プライマリシードロットとして液体窒素で保存した。
【0173】
５．４．２シードロットウイルスの配列決定
（１）ＲＮＡ抽出
Ａ．液体窒素下で保存されたシードロットウイルスサンプルを取り出して解凍した。
Ｂ．１００μＬサンプルを吸い取り、１．５ｍＬ遠心分離管に置いた。
Ｃ．３００μＬ溶解液を加え、渦を巻き、短時間遠心分離した後、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｄ．３００μＬ希釈液を加え、渦を巻き、短時間遠心分離した後、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｅ．３５０μＬ無水エタノールを加え、渦を巻き、短時間遠心分離し、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｆ．混合液を遠心分離カラム（キットに含まれる）に移し、サンプルをカラムに２回でロードした。１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、濾液を捨てた。
Ｇ．６００μＬのＲＮＡ洗浄液を加え、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、濾液を捨てた。
Ｈ． 吸着膜の中央に５０μＬのＤＮＡＳＥ Ｉインキュベーション溶液（表２１）を加え、室温で１５ｍｉｎ静置した。
Ｉ．６００μＬのＲＮＡ洗浄液を加え、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、濾液を捨て、２回繰り返し、濾液を捨てた。遠心分離カラムを新たに収集管に置き、１２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ遠心分離した。
Ｊ．遠心分離カラムを溶出管に移し、遠心分離カラム膜の中央に５０μＬヌクレアーゼフリー水を加え、室温で２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、ＲＮＡを－８０℃で保存した。
（１）ＲＮＡ抽出
Ａ．液体窒素下で保存されたシードロットウイルスサンプルを取り出して解凍した。
Ｂ．１００μＬサンプルを吸い取り、１．５ｍＬ遠心分離管に置いた。
Ｃ．３００μＬ溶解液を加え、渦を巻き、短時間遠心分離した後、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｄ．３００μＬ希釈液を加え、渦を巻き、短時間遠心分離した後、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｅ．３５０μＬ無水エタノールを加え、渦を巻き、短時間遠心分離し、室温で５ｍｉｎ静置した。
Ｆ．混合液を遠心分離カラム（キットに含まれる）に移し、サンプルをカラムに２回でロードした。１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、濾液を捨てた。
Ｇ．６００μＬのＲＮＡ洗浄液を加え、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離した後、濾液を捨てた。
Ｈ． 吸着膜の中央に５０μＬのＤＮＡＳＥ Ｉインキュベーション溶液（表２１）を加え、室温で１５ｍｉｎ静置した。
【表22】
Ｊ．遠心分離カラムを溶出管に移し、遠心分離カラム膜の中央に５０μＬヌクレアーゼフリー水を加え、室温で２ｍｉｎ静置し、１２０００ｒｐｍで１ｍｉｎ遠心分離し、ＲＮＡを－８０℃で保存した。
【0174】
（２）逆転写（表２２）
【表23】
【0175】
（３）ＰＣＲ増幅
Ａ．得られたｃＤＮＡをテンプレートとして断片のＰＣＲを行った。反応系を表２３に示す。
反応条件を表２４に示す。
Ａ．得られたｃＤＮＡをテンプレートとして断片のＰＣＲを行った。反応系を表２３に示す。
【表24】
【表25】
【0176】
（４）配列決定
配列決定の結果を図７に示す。各変異株ウイルスはいずれも予想通りに部位特異的変異を実現した。
配列決定の結果を図７に示す。各変異株ウイルスはいずれも予想通りに部位特異的変異を実現した。
【0177】
５．４．３ウイルス動作ライブラリの構築
（１）細胞接種、ウイルス収集、及びサンプル回収
細胞の説明書に従って適宜な培養条件下で説明書に記載の継代比率で細胞を継代増幅培養した。細胞が対数増殖期になった後、細胞を消化し、６×１０５個の細胞をＴ２５細胞培養フラスコに接種し、壁に付着したままで引き続き２４ｈ培養した。
壁に付着して２４ｈ後に元の培地を吸って除去し、２０μＬシードロットウイルスが入ったＶＰ－ＳＦＭウイルス培地を加え、ウイルスインキュベータに置いて細胞がウイルスを産生するまで待った。２４ｈごとに細胞形態及び蛍光の有無を観察し、９０％以上の細胞が浮き上がったら、撮影して記録し、Ｖｅｒｏ細胞上清を収集し、４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。１００μＬ上清を取ってウイルス力価測定のサンプルとして１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、残りの上清に凍結保存中（約１．５ｍＬ／管）に入れ、液体窒素下で保存した。
（１）細胞接種、ウイルス収集、及びサンプル回収
細胞の説明書に従って適宜な培養条件下で説明書に記載の継代比率で細胞を継代増幅培養した。細胞が対数増殖期になった後、細胞を消化し、６×１０５個の細胞をＴ２５細胞培養フラスコに接種し、壁に付着したままで引き続き２４ｈ培養した。
壁に付着して２４ｈ後に元の培地を吸って除去し、２０μＬシードロットウイルスが入ったＶＰ－ＳＦＭウイルス培地を加え、ウイルスインキュベータに置いて細胞がウイルスを産生するまで待った。２４ｈごとに細胞形態及び蛍光の有無を観察し、９０％以上の細胞が浮き上がったら、撮影して記録し、Ｖｅｒｏ細胞上清を収集し、４０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離した。１００μＬ上清を取ってウイルス力価測定のサンプルとして１．５ｍＬ遠心分離管に入れ、残りの上清に凍結保存中（約１．５ｍＬ／管）に入れ、液体窒素下で保存した。
【0178】
（２）ウイルス力価の測定
１．ＢＨＫ－２１細胞を１５００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞接種後の１２－３６時間内で用いた。
２．適量のＭＥＭ基礎培地を仕込槽に入れ、培地を１８０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、希釈液として用意した。測定されるサンプルの数に応じてＭＥＭ希釈液を準備し、各サンプルについて２回繰り返し、参考品について４回繰り返した。
３．測定されるサンプルを渦発振器上で１５－３０秒十分に振盪した。２０μＬの測定されるサンプルを取り、上記「２」における第１列のウェルに加えた。均一に混合した後、２０μＬ吸い取って次の列のウェルに加えた。第８列のウェルまで順次希釈した。なお、列ごとにピペットを交換しなければならない。希釈した測定されるサンプルをマイクロウェルプレートミキサに固定し、約３０００ｒｐｍで３分間振盪した。
４．希釈したウイルス溶液を細胞に加え、２０μＬ／ウェルで１０－３－１０－８のウイルス液を９６ウェルプレートの細胞に加え、プレートごとに２つのサンプルを測定した。
５．サンプルを加えた後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で５日間（ウイルスを加えた当日を１日目とする）した。
６．５日後に、顕微鏡で細胞に細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生したかを観察して記録した。
７．Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法によりＣＣＩＤ５０値を計算した。ｌｇ（ＣＣＩＤ５０×２０／１０００）＝Ｌ－Ｄ（Ｓ－０．５），Ｌ：最大希釈度の対数，－１；Ｄ：希釈度の対数間の差，１；Ｓ－陽性ウェル比率の総和（ＣＰＥ数の総和／８）。
１．ＢＨＫ－２１細胞を１５００個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。細胞接種後の１２－３６時間内で用いた。
２．適量のＭＥＭ基礎培地を仕込槽に入れ、培地を１８０μＬ／ウェルで９６ウェルプレートに入れ、希釈液として用意した。測定されるサンプルの数に応じてＭＥＭ希釈液を準備し、各サンプルについて２回繰り返し、参考品について４回繰り返した。
３．測定されるサンプルを渦発振器上で１５－３０秒十分に振盪した。２０μＬの測定されるサンプルを取り、上記「２」における第１列のウェルに加えた。均一に混合した後、２０μＬ吸い取って次の列のウェルに加えた。第８列のウェルまで順次希釈した。なお、列ごとにピペットを交換しなければならない。希釈した測定されるサンプルをマイクロウェルプレートミキサに固定し、約３０００ｒｐｍで３分間振盪した。
４．希釈したウイルス溶液を細胞に加え、２０μＬ／ウェルで１０－３－１０－８のウイルス液を９６ウェルプレートの細胞に加え、プレートごとに２つのサンプルを測定した。
５．サンプルを加えた後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２条件下で５日間（ウイルスを加えた当日を１日目とする）した。
６．５日後に、顕微鏡で細胞に細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生したかを観察して記録した。
７．Ｓｐｅａｒｍａｎ－Ｋａｒｂｅｒ法によりＣＣＩＤ５０値を計算した。ｌｇ（ＣＣＩＤ５０×２０／１０００）＝Ｌ－Ｄ（Ｓ－０．５），Ｌ：最大希釈度の対数，－１；Ｄ：希釈度の対数間の差，１；Ｓ－陽性ウェル比率の総和（ＣＰＥ数の総和／８）。
【0179】
動作ロットウイルス力価の測定結果を表２５に示す。
【表26】
【0180】
５．４．４ ＨＣＴ１１６細胞に対するウイルスの殺傷効果
（１）細胞接種及び投与
各細胞の説明書に記載の培養条件、継代比率で細胞を継代増幅培養した。細胞が対数増殖期になった後、細胞を消化し、１００００個の細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに接種し、各ウェルの総体積は２００μＬであった。ブランク対照群、陰性対照群、ウイルスの複数の勾配：
の実験群（いずれも３回繰り返す（表２６）。表におけるＡ－Ｈは異なるウイルスを示す）を設置し、ブランク対照群に細胞を接種せず、陰性対照群ではウイルスの代わりにウイルス接種量と同量のＶＰ－ＳＦＭを投与した。
（１）細胞接種及び投与
各細胞の説明書に記載の培養条件、継代比率で細胞を継代増幅培養した。細胞が対数増殖期になった後、細胞を消化し、１００００個の細胞／ウェルの密度で４８ウェルプレートに接種し、各ウェルの総体積は２００μＬであった。ブランク対照群、陰性対照群、ウイルスの複数の勾配：
【0181】
【表27】
【0182】
投与した後、引き続き７２ｈ培養し、終点時に顕微鏡で細胞状態を観察し、撮影して記録し、細胞活性を検出し、各ウイルスの前記検出細胞上のＩＣ５０を計算した。
【0183】
（２）ＣＣＫ－８法による細胞生存率の測定
４８ウェルプレートにおける元の培養液を除去し、壁に沿って発色液（９０％完全培地＋１０％ＣＣＫ－８溶液）を２００μＬ／ウェルでゆっくりと加え、３７℃で引き続き０．５－３ｈ培養した後、吸光マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度の値を測定した。
４８ウェルプレートにおける元の培養液を除去し、壁に沿って発色液（９０％完全培地＋１０％ＣＣＫ－８溶液）を２００μＬ／ウェルでゆっくりと加え、３７℃で引き続き０．５－３ｈ培養した後、吸光マイクロプレートリーダーにより４５０ｎｍの波長で各ウェルの吸光度の値を測定した。
【0184】
（３）各細胞に対するウイルスの半数阻害濃度（ＩＣ５０）の計算
得られた各ウェルの吸光度の値から、算式：細胞増殖阻害率（ＩＲ）＝（平均ＯＤ溶媒－ＯＤ実験）／（平均ＯＤ溶媒－平均ＯＤブランク）×１００％により各ウェルの細胞の増殖阻害率を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアにより細胞増殖阻害率曲線を作成し、ｌｏｇ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）解析方程式により腫瘍細胞に対する各ウイルスの半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値を算出した。
得られた各ウェルの吸光度の値から、算式：細胞増殖阻害率（ＩＲ）＝（平均ＯＤ溶媒－ＯＤ実験）／（平均ＯＤ溶媒－平均ＯＤブランク）×１００％により各ウェルの細胞の増殖阻害率を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０ソフトウェアにより細胞増殖阻害率曲線を作成し、ｌｏｇ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｖｓ． ｒｅｓｐｏｎｓｅ－－Ｖａｒｉａｂｌｅ ｓｌｏｐｅ（ｆｏｕｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）解析方程式により腫瘍細胞に対する各ウイルスの半数阻害濃度（ＩＣ５０）の値を算出した。
【0185】
ＨＣＴ１１６に対するＭ１ウイルスの各部位特異的変異株の殺傷曲線を図８Ａ－８Ｚに示す（注：図における各曲線は１回の独立実験を示し、横軸はウイルス感染ＭＯＩ、縦軸は阻害率を示す）。
＜参考文献＞
1. Greenman C, Stephens P, Smith R, et al: Patterns of somatic mutation in human cancer genomes. Nature 446: 153-158, 2007.
2. Wood LD, Parsons DW, Jones S, et al: The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science 318: 1108-1113, 2007.
3. Pavet V, Portal MM, Moulin JC, Herbrecht R and Gronemeyer H: Towards novel paradigms for cancer therapy. Oncogene 30: 1-20, 2011.
4. Workenhe ST and Mossman KL: Oncolytic virotherapy and immunogenic cancer cell death: sharpening the sword for improved cancer treatment strategies. Mol Ther 22: 251-256, 2014.
5. Sun Q1, Barz M2, De Geest BG3,et al:Nanomedicine and macroscale materials in immuno- oncology. chemical society 2018 Nov 22.
6. Tran E1, Robbins PF1, Rosenberg SA ：‘Final common pathway’ of human cancer immun- otherapy: targeting random somaticmutations. Nature immunology 2017 Feb 15;18(3):255-262.
7. Das T, Jaffar-Bandjee MC, Hoarau JJ, et al: Chikungunya fever: CNS infection and pathologies of a re-emerging arbovirus. Prog Neurobiol 91: 121-129, 2010.
8. Kelvin AA: Outbreak of Chikungunya in the Republic of Congo and the global picture. J Infect Dev Ctries 5: 441-444, 2011.
9. Moran TP, Burgents JE, Long B, et al: Alphaviral vector-transduced dendritic cells are successful therapeutic vaccines against neu-overexpressing tumors in wild-type mice. Vaccine 25: 6604-6612, 2007.
10.Weaver SC, Salas R, Rico-Hesse R, et al: Re-emergence of epidemic Venezuelan equine encephalomyelitis in South America. VEE Study Group. Lancet 348: 436-440, 1996.
11.Li XD, Qiu FX, Yang H, Rao YN and Calisher CH: Isolation of Getah virus from mosquitos collected on Hainan Island, China, and results of a serosurvey. Southeast Asian J Trop Med Public Health 23: 730-734, 1992.
12.Wen JS, Zhao WZ, Liu JW, et al: Genomic analysis of a Chinese isolate of Getah-like virus and its phylogenetic relationship with other Alphaviruses. Virus Genes 35: 597-603, 2007.
13.Zhai YG, Wang HY, Sun XH, et al: Complete sequence characterization of isolates of Getah virus (genus Alphavirus, family Togaviridae) from China. J Gen Virol 89: 1446-1456, 2008.
14.Charlotte Rafaluk, Gunther Jansen, Hinrich Schulenburg, and Gerrit Joop: When experimental selection for virulence leads to loss of virulence Trends Parasitol. 2015 Sep;31(9):426-34.
15.Jose ´ Luis Marti´nez, Fernando Baquero and Dan I Andersson: Beyond serial passages: new methods for predicting the emergence of resistance to novel antibiotics. Current Opinion in Pharmacology 2011, 11:439-445.
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15.Jose ´ Luis Marti´nez, Fernando Baquero and Dan I Andersson: Beyond serial passages: new methods for predicting the emergence of resistance to novel antibiotics. Current Opinion in Pharmacology 2011, 11:439-445.
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図8-5】
【図8-6】
【図8-7】
【配列表】