特許 7457413 代謝障害に対する新規なＦＧＦ１９タンパク質類似物質及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-19

(45)【発行日】2024-03-28

(54)【発明の名称】代謝障害に対する新規なＦＧＦ１９タンパク質類似物質及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/50 20060101AFI20240321BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240321BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240321BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240321BHJP

   C12Q 1/68 20180101ALI20240321BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240321BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240321BHJP

【ＦＩ】

C07K14/50

C12N15/12 ZNA

A61K38/18

A61P3/10

A61P1/16

A61P3/04

C12N15/63 Z

C12Q1/68

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2022546376

(86)(22)【出願日】2021-11-04

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-17

(86)【国際出願番号】 CN2021128690

(87)【国際公開番号】W WO2022188444

(87)【国際公開日】2022-09-15

【審査請求日】2022-10-05

(31)【優先権主張番号】202110269910.X

(32)【優先日】2021-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】514262886

【氏名又は名称】江南大学

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＮＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． １８００ Ｌｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｂｉｎ Ｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｗｕｘｉ， Ｊｉａｎｇｓｕ， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】朱升龍

(72)【発明者】

【氏名】陳永泉

(72)【発明者】

【氏名】王振

【審査官】大西 隆史

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０８３２７６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１５／０６５８９７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１６／０４８９９５（ＷＯ，Ａ２）

【文献】WU, Xinle et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010年07月26日，Vol. 107, No. 32，pp. 14158-14163，DOI: 10.1073/pnas.1009427107

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８

Ａ６１Ｋ ３５／００－５１／１２

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミノ酸配列が、配列番号１～４のいずれか一つで示されることを特徴とする、ＦＧＦ１９タンパク質類似物質。

【請求項2】

請求項１に記載のＦＧＦ１９タンパク質類似物質をコードする遺伝子。

【請求項3】

請求項２に記載の遺伝子を担持するベクター及び／又は微生物細胞。

【請求項4】

請求項１に記載のＦＧＦ１９タンパク質類似物質を含むことを特徴とする、糖尿病又は肥満を治療するための医薬又は医薬組成物。

【請求項5】

糖尿病又は肥満の治療は、体重増加の抑制、血中脂質及び血糖の低減、インスリン感受性の向上を含むことを特徴とする、請求項４に記載の医薬又は医薬組成物。

【請求項6】

前記医薬は、人体に許容される修飾、薬用担体及び／又は補助剤をさらに含むことを特徴とする、請求項４又は５に記載の医薬又は医薬組成物。

【請求項7】

請求項１に記載のＦＧＦ１９タンパク質類似物質を含有する、肝炎又はその関連疾患を治療するための医薬又は医薬組成物であって、
肝炎又はその関連疾患は、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎又は原発性硬化性胆管炎を含み、
肝炎又はその関連疾患の治療は、肝臓重量及び肝臓でのトリグリセリドの含有量の低減、肝臓損傷の修復、炎症性サイトカインの発現の阻害、又は非アルコール性脂肪肝炎、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎又は原発性硬化性胆管炎の改善を含むことを特徴とする、肝炎又はその関連疾患を治療するための医薬又は医薬組成物。

【請求項8】

請求項１に記載のＦＧＦ１９タンパク質類似物質又は請求項３に記載のベクター又は微生物細胞の、糖尿病、肥満、肝炎又は肝炎関連疾患中の１つ以上の疾患を治療するための医薬の製造における使用であって、
肝炎又は肝炎関連疾患は、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎又は原発性硬化性胆管炎を含む、使用。

【請求項9】

前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質の投与量は、０．２～１００ｍｇ／ｋｇであることを特徴とする、請求項８に記載の使用。

【請求項10】

前記医薬の投与経路は、皮内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴静脈注射、動脈注射、体腔内注射及び／又は経口投与を含むことを特徴とする、請求項８又は９に記載の使用。

【請求項11】

請求項２に記載の遺伝子の、糖尿病、肥満、肝炎又は肝炎関連疾患を治療するための医薬のスクリーニングにおける使用であって、
肝炎又は肝炎関連疾患は、非アルコール性脂肪肝炎、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎又は原発性硬化性胆管炎を含む、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、代謝障害に対する新規なＦＧＦ１９タンパク質類似物質及びその使用に関するものであり、医薬の技術分野に属する。

【背景技術】

【0002】

繊維芽細胞増殖因子１９（ＦＧＦ１９）は、胆汁酸により分泌されて腸管内に入った後、腸管での分泌や発現を促進する、新しく発見された代謝調節因子である。ＦＧＦ１９は、腸管から分泌された後、肝臓へ循環し、肝臓中のＦＧＦＲ４と結合してホルモンの様に作用する。詳しくは、ＦＧＦ１９は、例えば、胆汁酸代謝の調節、胆嚢の充填の調節、エネルギー代謝の向上による体重減少、血糖の改善などの重要な代謝調節作用を発揮する。これまでの多数の研究から明らかにされたように、ＦＧＦ１９は有糸分裂促進作用を有しているが、ＦＧＦＲ４は、肝臓におけるＦＧＦ１９の増殖を促進し得るため、発がん促進の誘因となる。２０１４年の研究により、ＦＧＦ１９のＮ末端ドメインはＦＧＦＲとの相互作用に重要なドメインであることが見出された。したがって、ＦＧＦＲ４受容体を認識するドメインを選択的にノックアウトすることにより、ＦＧＦ１９の有糸分裂促進活性を消失させることができる。したがって、いくつかの論文では、ＦＧＦ１９のＮ末端の変異が着目されていた。

【0003】

ＮＧＭ２８２は、ヒトＦＧＦ１９の非腫瘍性工学化変異体であり、ＦＧＦ１９のＮ末端修飾による突然変異体に属する。ＮＧＭ２８２は、米国では第ＩＩ相臨床試験が完了したばかりであるが、試験の結果、患者の７９％が主な治療エンドポイントに達し、患者の３４％が１２週目で正常な肝臓脂肪含有量に達したことが示された。この突然変異体は、患者の肝機能、脂質代謝、及び繊維化の血清バイオマーカーを改善し、代謝性疾患を治療する効果を示した。しかし、上記の臨床研究では、いくつかの一般的な消化器症状、吐き気、及び注射部位の紅斑が観察されたことに加えて、ＦＧＦ１９突然変異体であるＮＧＭ２８２を注射した後、コレステロール含有量の顕著な上昇が見られた。多くの研究により明らかとなったように、コレステロール含有量の上昇は、代謝疾患の顕著なハイリスク要因の1つであり、代謝疾患の治療にとって大きなリスクがある。また、ＦＧＦ１９は食欲不振、食欲低下等の症状を引き起こし、後の治療過程においても不安要素が存在する。

【発明の概要】

【0004】

上記の事情に鑑み、本発明では、予測及び試験によりオリジナル非発がん性配列を基礎として改造し、４種類の突然変異タンパク質を構築し、生産及び精製プロセスの最適化により、４種類の生物学的活性を有するＦＧＦ１９突然変異タンパク質を調製した。その結果、この４種類の突然変異体は、いずれも、肥満、過体重、メタボリックシンドローム、糖尿病、高血糖症、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を治療する効果を発揮することができたとともに、この４種類の突然変異体による治療効果は、ＮＧＭ２８２タンパク質よりも有意に優れていることが見出された。

【0005】

本発明は、アミノ酸配列が配列番号１～４のいずれか一つで示されるＦＧＦ１９タンパク質類似物質を提供する。

【0006】

本発明の一実施形態において、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質をコードする遺伝子を提供する。

【0007】

本発明の一実施形態において、配列番号１～４で示されるアミノ酸をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号５～８で示される。

【0008】

本発明は、前記遺伝子を担持するベクター及び／又は宿主細胞を提供する。

【0009】

本発明は、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質を含む、糖尿病又は肥満を治療するための医薬又は医薬組成物を提供する。

【0010】

本発明の一実施形態において、医薬又は医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は補助剤をさらに含む。

【0011】

本発明の一実施形態において、糖尿病又は肥満の治療は、体重増加の抑制、血中脂質及び血糖の低減、インスリン感受性の向上を含む。

【0012】

本発明は、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質を含む、肝炎又はその関連疾患を治療するための医薬又は医薬組成物を提供する。

【0013】

本発明の一実施形態において、医薬又は医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は補助剤をさらに含む。

【0014】

本発明の一実施形態において、肝炎又はその関連疾患の治療は、肝臓重量及び肝臓でのトリグリセリド含有量の低減、肝臓損傷の修復、炎症性サイトカインの発現の阻害、並びに非アルコール性脂肪肝炎、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎及び／又は原発性硬化性胆管炎の改善を含む。

【0015】

本発明は、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質の、糖尿病、肥満、肝炎又は肝炎関連疾患のうち１つ以上の疾患を治療するための医薬の製造における使用を提供する。

【0016】

本発明の一実施形態において、医薬又は医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は補助剤をさらに含む。

【0017】

本発明の一実施形態において、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質の投与量は、０．２～１００ｍｇ／ｋｇである。

【0018】

本発明の一実施形態において、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質の投与量は、０．２～３ｍｇ／ｋｇである。

【0019】

本発明の一実施形態において、前記医薬の投与経路は、皮内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射、点滴静脈注射、動脈注射、体腔内注射及び／又は経口投与を含む。

【0020】

本発明は、前記ＦＧＦ１９タンパク質類似物質をコードする遺伝子の、糖尿病、肥満症、肝炎又は肝炎関連疾患を治療するための医薬のスクリーニングにおける使用を提供する。

【0021】

本発明の一実施形態において、前記遺伝子のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号５～８で示される。

【0022】

（本発明による有利な効果）
（１）本発明に係る４種類の新規なＦＧＦ１９類似物質は、肥満、過体重、メタボリックシンドローム、糖尿病、高血糖症、血中脂質異常、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、アテローム性動脈硬化症、肝臓損傷、肝硬変、肝臓がん、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）及び原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）などの治療において、元のＦＧＦ１９突然変異体であるＮＧＭ２８２よりも、持続的に安定した優れた効果を有する。
（２）本発明に係る４種類の新規なＦＧＦ１９類似物質は、それを用いる治療過程において、元のＦＧＦ１９突然変異体であるＮＧＭ２８２の治療過程によるコレステロールの上昇及び飲食量の低下という副作用が一切見られず、有機体の正常な生命活動に与える影響が少ない。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】精製後のタンパク質の、大腸菌での発現量をＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動により分析した結果を示すものであり、前記タンパク質は、それぞれＦＧＦ１９－１タンパク質、ＦＧＦ１９－２タンパク質、ＦＧＦ１９－３タンパク質、ＦＧＦ１９－４タンパク質及びＮＧＭ２８２タンパク質である。

【図2】５種類のタンパク質のインビボ半減期を比較したものである。

【図3】５種類のタンパク質の、ｄｂ／ｄｂマウスの体重と飲食へ与えた影響を示すものである。

【図4】５種類のタンパク質の、ｄｂ／ｄｂマウスの血中脂質へ与えた影響を示すグラフである。

【図5】５種類のタンパク質の、ｄｂ／ｄｂマウスの糖尿病に係る関連指標へ与えた影響を示すグラフである。

【図6】５種類のタンパク質の、ＮＡＳＨモデルマウスの脂肪肝炎及び肝繊維化などに係る関連指標へ与えた影響を示すものである。

【図7】５種類のタンパク質の、肝臓がん移植マウスの腫瘍増殖へ与えた影響を示すものである。

【発明を実施するための形態】

【0024】

（実験動物及び飼育）
ヌードマウス及びｄｂ／ｄｂマウスはＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＬＡＣ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＡＮＩＭＡＬ ＣＯ． ＬＴＤから購入した。江南大学の無錫医学院の動物センターにて、温度２０±２℃で１２時間おきに交互に照明して飼育した。

【0025】

（細胞培養）
肝がん由来細胞株ＨｅｐＧ２は、中国科学院生物化学・細胞生物学研究所から入手した。ＤＭＥＭ、０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎは、ＢＯＳＴＥＲ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏ．ｌｔｄから購入した。ウシ胎児血清は、Ｓｉｊｉｑｉｎｇ社（四季青公司）から購入した。

【0026】

その他の試薬は、国産の分析用純度のものである。

【0027】

肝がん由来細胞株ＨｅｐＧ２を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液中で壁に貼り付けて増殖させ、５％ＣＯ_２潤湿インキュベーター内で、３７℃で培養し、１日おきに一回継代した。

【0028】

以下の実施例では、マウスに対して２ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１タンパク質を注射した。なお、これに対応する、人体に対する投与量は０．２ｍｇ／ｋｇである。また、ウサギに対して３０ｍｇ／ｋｇのＦＧＦ２１タンパク質を注射した。なお、これに対応する、人体に対する投与量は３ｍｇ／ｋｇである。

【0029】

（実施例１：組換えタンパク質の構築、発現及び精製）
（１）発現ベクターＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４の構築
コンピューターによりシミュレーションした置換及び大腸菌のコドンの選好に基づいて、４種の新規なＦＧＦ１９遺伝子を設計し、それぞれ、ＦＧＦ１９－１（ヌクレオチド配列は配列番号５で示される）、ＦＧＦ１９－２（ヌクレオチド配列は配列番号６で示される）、ＦＧＦ１９－３（ヌクレオチド配列は配列番号７で示される）、ＦＧＦ１９－４（ヌクレオチド配列は配列番号８で示される）とした。これらの４種の遺伝子は、その合成をＳｈａｎｇｈａｉ Ｇｅｎｅｒａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄに依頼したとともに、各遺伝子の両端にＮｄｅＩ制限酵素切断部位及びＢａｍＨＩ制限酵素切断部位をそれぞれ設計した。それぞれの標的遺伝子断片を含む合成された４種のベクター、及びｐＥＴ３０ａ（＋）をＮｄｅＩ制限酵素及びＢａｍＨＩ制限酵素でそれぞれ二重に切断した後、それぞれに必要な標的遺伝子断片をゲルで抽出した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、均一に混合された１０μＬのライゲーション反応系にて、４種の標的断片をそれぞれ原核生物発現ベクターｐＥＴ３０ａ（＋）に連結した。４℃で一晩連結させた後、それぞれ大腸菌ＤＨ５α内へ形質転換させた。陽性クローンをピックアップし、酵素切断により同定したところ、構築した４種の組換えプラスミドｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－１、ｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－２、ｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－３及びｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－４がそれぞれ得られた。

【0030】

（２）タンパク質の発現及び精製
正しく配列が決定された組換えプラスミドｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－１、ｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－２、ｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－３及びｐＥＴ３０ａ－ＦＧＦ１９－４を発現株Ｒｏｓｓｅｔａ（ＤＥ３）形質転換受容性細胞へ形質転換させた。形質転換したシングルコロニーを、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地２０ｍＬにそれぞれ接種し、３７℃で８時間培養した。その後、Ｋａｎ（５０μｇ／ｍＬ）を含む別の新鮮なＬＢ培地２０ｍＬに菌液を体積比１：１００で接種し、３７℃で培養した。そして、Ａ６００が０．３５程度になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度が０．２５ｍｍｏｌ／Ｌになるまで添加して誘導温度３０℃で誘導し、誘導してから５時間後、菌体を採取してＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）にて再懸濁させ、当該菌体を破砕した後遠心分離し、上清と沈殿をそれぞれ取り出して１２ｗｔ％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動により分析した。その結果、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、ＦＧＦ１９－４タンパク質の、大腸菌での発現が著しく増加し、ほとんどの標的タンパク質が封入体として存在していることが示された。

【0031】

誘導された菌体を大量に収集し、リゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）を菌体に加え、氷上で３０分間放置し、菌体細胞を超音波細胞破砕装置で破砕した（動作１ｓ、間隔１ｓ、４分間／回、合計で３回サイクル）。菌体破砕が完了した後、細胞破砕液をＱｕｉｘ Ｓｔａｎｄ前処理システム（７５０ｋＤ限外ろ過中空糸カラム）で処理し、封入体を集め、膜透過端の液体を廃棄した。総体積が約６０ｍＬになった時、ｗａｓｈｂｕｆｆｅｒ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、２ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１００ｍＬ加えて封入体を洗浄した。溶液の体積が５０ｍＬになった時、さらに当該溶液へウォッシュバッファーを１００ｍＬ加え、上記の操作を４回繰り返した。洗浄が完了した後、溶液の体積が５０ｍＬになった時、透過端を閉じ、洗浄を経た封入体へ変性液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１０ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を１５０ｍＬ加え、循環的に２時間変性させた。透過端を開放し、膜透過端の収集液をｍＦＧＦ２１変性液として得た。変性したｍＦＧＦ２１を５ＫＤの中空糸カラムにて８０ｍＬの体積となるまで濃縮した後、再生させた。再生液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を入れた容器を、ゴムチューブを介して中空糸カラムの貯液器に接続した。貯液器を密閉し、透過端から液体を流出させると、貯液器において負圧を発生するため、再生液が一定の速度で変性液へ滴下し、ゆっくりと等速に再生される。添加した再生液の体積が変性液の６倍になった時、再生を終了させ、８０００ｒｐｍ／ｍｉｎ（分）で、４℃で２０分間遠心分離して上清を収集した。ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１００システムにより、再生上清をカラム容積の５倍に相当するＩＥＸ ｂｕｆｆｅｒ Ａ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）でバランスを取っておいたＣａｐｔｏ Ｑカラム（ＸＫ１６／２０空カラムに取り付ける；カラムの高さが１０ｃｍであり、流速が３００ｃｍ／ｈ（時間）である）と完全に結合した後、カラム容積の３～４倍に相当するＩＥＸ ｂｕｆｆｅｒ Ａでリンスした。そして、紫外線曲線が安定ベースラインに達した時、ＩＥＸ ｂｕｆｆｅｒ ＡとＩＥＸ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ（２０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）の混合液で溶出させ、１５ｗｔ％と１００ｗｔ％のＩＥＸ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ液で夾雑タンパク質をリンスし、１８．５ｗｔ％～１９ｗｔ％のＩＥＸ ｂｕｆｆｅｒ Ｂ液で標的タンパク質を溶出させた。それぞれの溶出ピークを取得し、１５ｗｔ％のＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動により分析した。その結果、精製したタンパク質の純度が９５％以上であることが示された。図１に示すように、レーン１はタンパク質標準分子量マーカーであり、レーン２～６はそれぞれ精製したＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、ＦＧＦ１９－４である。

【0032】

（実施例２：組み換えタンパク質のインビボ半減期の測定）
ＮＧＭ２８２、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４の５種のタンパク質のインビボ半減期を測定した。

【0033】

体重約２ｋｇのウサギを２５匹選び、無作為に５つのグループに分けた。各グループに対して、ＮＧＭ２８２、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４の５種の蛋白質をそれぞれ３０ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下注射した。投与から０時間、１時間、３時間、５時間、７時間、２４時間後、耳介静脈から８００μＬ程度採血した。１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集して－２０℃で保存した。５種のタンパク質のインビボ半減期を、ＥＬＩＳＡ間接法で測定した。すなわち、希釈した異なる濃度のＮＧＭ２８２、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、ＦＧＦ１９－４タンパク質（２０μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ）をそれぞれ用い、タンパク質の濃度含有量の標準曲線を作成した；希釈した標準タンパク質及び血清を酵素標識プレートにコーティングし、ＥＬＩＳＡ間接法で各血清中の標的タンパク質の含有量を測定し、６種のタンパク質のインビボ半減期を統計学的に分析、算出した。

【0034】

インビボ半減期ｔ_１／２＝０．３０１＊（ｔ２－ｔ１）／ｌｏｇ（ＯＤ１／ＯＤ２）。ここで、ＯＤ１及びＯＤ２は、ｔ１及びｔ２の時点で取り出した血清に対応する、酵素標識プレート上での平均光吸収値をそれぞれ示す。

【0035】

その結果を図２に示す。ＮＧＭ２８２タンパク質、並びに突然変異で改造したタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４の、数式により算出したインビボ半減期は、それぞれ約３６分間、７９分間、６６分間、６７分間、６９分間であった。これは、４種の新規なＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４のインビボ半減期が著しく増加したことを意味する。

【0036】

（実施例３：組換えタンパク質が体重、飲食、血中脂質及び糖尿病の関連指標に及ぼす影響）
実施例１に係る方法に従って、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４の４種のタンパク質を調製した。

【0037】

ＳＰＦグレードの８週齢のｄｂ／ｄｂ雄マウスを５０匹取り、１週間予備飼育した後、体重を測定した。翌日、絶水せずに６時間絶食させた。尾静脈から採血してマウスの空腹時血糖値を測定した。体重異常のマウスを除外し、血糖値及び体重値が相対的に平均値に近いモデルマウスを４２匹選抜し、１グループにつき６匹とするように、生理食塩水グループ（Ｓａｌｉｎｅ）、ＮＧＭ２８２グループ、ＦＧＦ１９－１グループ、ＦＧＦ１９－２グループ、ＦＧＦ１９－３グループ、及びＦＧＦ１９－４グループに無作為に振り分けた。毎朝８時半頃、各実験グループについて、その対応する被験物質を２ｍｇ／ｋｇの投与量で1回腹腔内注射した。生理食塩水グループについては同量の生理食塩水を注射した。投与は８週間継続した。なお、実験の間、飲食及び飲水を制限せずに、マウスの飲食及び体重状態をモニタリングした。８週間の投与後、各実験グループのマウスを屠殺し(前夜から絶食)、眼部から採血し、各実験グループのマウスの血糖、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ－Ｃ）、及び高密度リポタンパク質（ＨＤＬ－Ｃ）のレベルを測定した。得られた実験データを統計学的に分析した。

【0038】

実験の測定データは図３～図５に示す。図３の結果からわかるように、生理食塩水を用いた対照グループと比べ、ＮＧＭ２８２タンパク質及び突然変異で改造した新型なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４は、そのいずれのグループも、マウスの体重を顕著に減らすことができた。ただし、ＮＧＭ２８２タンパク質を注射したマウスでは、著しく飲食量が低下し、食欲が抑制されたのに対し、４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４は、投与後、ＮＧＭ２８２と比べて、マウスの食欲に影響を与えることなく、体重をより強力的、顕著に抑制することができた。これは、この突然変異に基づく改造により、元のＦＧＦ１９による飲食量減少という副作用が見事に改善されたことを意味する。

【0039】

８週間の投与後、各実験グループのマウスの血清における脂質濃度の結果を図４に示した。生理食塩水グループに比べ、ＮＧＭ２８２グループのマウスの血清中のＴＧ、ＴＣ及びＬＤＬ－ｃの含有量が顕著に上昇したが、各種のＨＤＬ－ｃの含有量は、明らかな差がなかった。この結果は、これまでの多くの臨床報告と一致した。なお、コレステロール及び血中脂質の上昇は、代謝疾患に対する顕著なハイリスクの１つとして、代謝疾患の治療に対して多大なリスクを与えることが、多くの研究により明らかになっている。改造したことで、４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４は、注射後、元のＦＧＦ１９タンパク質によるＴＧ、ＴＣ、及びＬＤＬ－ｃの上昇という副作用が生じないだけでなく、血清におけるＴＧの含有量を顕著に低減させることもできた。これらの結果は、これらの突然変異による改造は、元のＦＧＦ１９による血中脂質の上昇という副作用を見事に改善し、ＦＧＦ１９の臨床的応用の安全性及び有効性を大幅に増加させることができることを意味する。

【0040】

投与期間において、それぞれ０週目、２週目、４週目及び８週目の時点で空腹時血糖値を測定した。それぞれの実験グループにおけるマウスの空腹時血糖レベルの結果を図５Ａに示した。２週間の治療後、ＮＧＭ２８２では、血糖を明らかに改善する効果がみられなかったが、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－３ではマウスの空腹時血糖値を顕著に低下させることができた。４週間の治療後、ＮＧＭ２８２では、血糖値を低下させる効果を発揮し始めたが、その治療効果は、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４よりも有意に低かった。８週間の治療後、それぞれのグループの間で有意な差はなかった。この結果は、突然変異した後の組換えＦＧＦ１９タンパク質は、その血糖降下作用が速く発揮できるとともに、元のＮＧＭ２８２よりも優れていることを示した。８週間の投与後に、ブドウ糖負荷試験及びインスリン負荷試験を行った。その結果を、図５Ｂ及び５Ｃに示した。突然変異で改造した４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４は、ＮＧＭ２８２よりも、糖尿病マウスのブドウ糖感受性及びインスリン感受性をより顕著に改善することができた。

【0041】

（実施例４：組換えタンパク質が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の関連指標に及ぼす影響）
実施例１の方法に従って、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４の４種のタンパク質を調製した。

【0042】

ＳＰＦグレードの８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスを６０匹取り、１週間予備飼育した後、メチオニン・コリン欠乏ＭＣＤ飼料を投与した。８週間の投与後、体重異常のマウスを除外し、血糖値及び体重値が相対的に平均値に近いモデルマウスを４２匹選抜し、１グループにつき６匹とするように、生理食塩水グループ（Ｓａｌｉｎｅ）、ＮＧＭ２８２グループ、ＦＧＦ１９－１グループ、ＦＧＦ１９－２グループ、ＦＧＦ１９－３グループ、及びＦＧＦ１９－４グループに無作為に振り分けた。毎朝８時半頃、各実験グループについて、その対応する被験物質を２ｍｇ／ｋｇの投与量で1回腹腔内注射した。生理食塩水グループについては同量の生理食塩水を注射した。投与は８週間継続した。なお、実験の間、飲食を制限しなかった。８週間の投与後、各実験グループのマウスを屠殺し(前夜から絶食)、各実験グループのマウスの肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスアミナーゼ（ＡＬＴ）のレベルを測定したとともに、組織切片の染色及び炎症指標の検出を行った。得られた実験データを統計学的に分析した。

【0043】

実験測定のデータは図６に示す。図６Ａの結果からわかるように、生理食塩水を用いた対照グループ（Ｓａｌｉｎｅ）と比べ、ＮＧＭ２８２タンパク質及び突然変異で改造した４種の新型なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４は、そのいずれのグループも、マウスの肝臓重量及び肝臓中のトリグリセリド（ＴＧ）含有量を顕著に減らすことができた。ただし、４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４による治療効果はＮＧＭ２８２の場合よりも明らかに優れている。図６Ｂに係るトランスアミナーゼの結果からさらに示されたように、４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４は、それらの肝臓損傷に対する保護作用がＮＧＭ２８２よりも顕著に優れている。また、ＨＥ染色の結果から直接に示されたように、４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４は、注射後、肝臓の脂肪空胞が顕著に低下し、顕微鏡下で空胞がほとんど観察されなかったのに対し、ＮＧＭ２８２の場合、治療後でも、部分の脂肪空胞が存在していた（図６Ｃ）。図６Ｄは、肝臓におけるコラーゲン繊維沈着の状況を観察するためのシリウスレッド染色の結果であり、肝臓の繊維化が反映されている。その結果から示されたように、突然変異で改造した４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３及びＦＧＦ１９－４は、そのいずれのグループも、肝臓繊維化を逆転させることができた。一方、ＮＧＭ２８２は、治療後でも部分的な繊維化の状態が存在していた。これは、改造した組換えタンパク質が、肝臓繊維化に対する逆転効果においてＮＧＭ２８２よりも有意に優れたことを意味する。ＮＡＳＨの主な病理的状態は肝臓に生じる炎症である。そのため、典型的な炎症性サイトカインの発現状況をｑＰＣＲによって検出した。その結果から示されたように、突然変異で改造した４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４は、そのいずれのグループも、炎症性サイトカインの発現を顕著に抑制することができたとともに、抑制効果が、ＮＧＭ２８２よりも有意に優れていた（図６Ｅ）。上記の多項の指標の測定により、突然変異で改造した４種の新規なタンパク質ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４の、ＮＡＳＨ及び肝臓損傷に対する治療効果が、元のＮＧＭ２８２よりも有意に優れることを見出した。

【0044】

（実施例５：組換えタンパク質が肝臓がんに及ぼす影響）
実施例１の方法に従って、ＦＧＦ１９－１、ＦＧＦ１９－２、ＦＧＦ１９－３、及びＦＧＦ１９－４の４種のタンパク質を調製した。

【0045】

ヒト肝臓がんの細胞ＨｅｐＧ２細胞を、１×１０^６個の細胞／匹にて、６週齢の雄ヌードマウスの皮下に接種した。また、腫瘍の増殖が２００ｍｍ^３となった時、１グループにつき６匹とするように、生理食塩水注射グループ（Ｓａｌｉｎｅ）、ＮＧＭ２８２グループ、ＦＧＦ１９－１グループ、ＦＧＦ１９－２グループ、ＦＧＦ１９－３グループ、及びＦＧＦ１９－４グループに無作為に振り分けた。毎朝８時半頃、各実験グループについて、その対応する被験物質を２ｍｇ／ｋｇの投与量で1回腹腔内注射した。生理食塩水グループについては、同量の生理食塩水を注射した。投与は、２１日間継続した。腫瘍の体積を毎日モニターニングし、３週間後、マウスを屠殺し、腫瘍の重量を測定した。その結果から示されたように、５種のタンパク質は、いずれも、移植された腫瘍の体積及び最終的な腫瘍の重量を抑制することができたのに対し、ＮＧＭ２８２の場合、その抑制効果は突然変異した組換えタンパク質よりも有意に低かった（図７に示す）。

【0046】

以上のように、本発明を、好ましい実施例を通して開示したが、これらの実施例は、本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明の主旨及び範囲から逸脱しない限り、様々な変更及び修正を行うことができる。したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲によって定義されるものを基準とするべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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