特許 7457895 糖鎖結合性一本鎖抗体およびその作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-21

(45)【発行日】2024-03-29

(54)【発明の名称】糖鎖結合性一本鎖抗体およびその作製方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20240322BHJP

   C40B 60/10 20060101ALI20240322BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240322BHJP

   G16B 35/00 20190101ALI20240322BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20240322BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240322BHJP

   C40B 40/10 20060101ALN20240322BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00 ZNA

C40B60/10

C12P21/08

G16B35/00

C12N1/21

C12N15/13

C40B40/10

【請求項の数】 4

(21)【出願番号】P 2019091686

(22)【出願日】2019-05-14

(65)【公開番号】P2019199472

(43)【公開日】2019-11-21

【審査請求日】2022-05-12

(31)【優先権主張番号】P 2018093399

(32)【優先日】2018-05-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】504258527

【氏名又は名称】国立大学法人 鹿児島大学

(73)【特許権者】

【識別番号】307011381

【氏名又は名称】株式会社スディックスバイオテック

(73)【特許権者】

【識別番号】300071579

【氏名又は名称】学校法人立教学院

(73)【特許権者】

【識別番号】507219686

【氏名又は名称】静岡県公立大学法人

(72)【発明者】

【氏名】隅田 泰生

(72)【発明者】

【氏名】常盤 広明

(72)【発明者】

【氏名】伊藤 創平

(72)【発明者】

【氏名】中野 祥吾

(72)【発明者】

【氏名】新地 浩之

【審査官】松井 一泰

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１４－１００１１６（ＪＰ，Ａ）

【文献】MUCHIMA, Kaname et al.，Development of sugar chain-binding single-chain variable fragment antibody to adult T-cell leukemia cells using glyco-nanotechnology and phage display method，J. Biochem.，2018年01月17日，163(4)，pp. 281-291

【文献】MUZARD, Julien et al.，Design and humanization of a murine scFv that blocks human platelet glycoprotein VI in vitro，FEBS J.，2009年，276，pp. 4207-4222

【文献】CHEN, Wei et al.，Improved Isolation of Anti-rhTNF-α scFvs from Phage Display Library by Bioinformatics，Mol Biotechnol，2009年，43，pp. 20-28

【文献】ROSANO, German L. et al，Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges，Front. Microbiol.，2014年，vol. 5, 172

【文献】ZHANG, Xiuyuan et al.，Construction of a Single Chain Variable Fragment Antibody (scFv) against Carbaryl and Its Interaction with Carbaryl，Biochemistry，2015年，Vol. 80, No. 5，pp. 640-646

【文献】ZARSCHLER, Kristof et al.，High-yield production of functional soluble single-domain antibodies in the cytoplasm of Escherichia coli，Microb. Cell Fact.，2013年，12:97，pp. 1-13

【文献】大腸菌タンパク質発現系のゴールドスタンダードpETシステム活用のポイント，[RBM023]1705-2K/H，メルク株式会社，2017年，File://ipccdom.local/shareroot/userhomeX$/KDAV/Downloads/RBM023-0426-pETGuide%20(5).pdf

【文献】赤沼哲史，祖先型設計法を用いた耐熱性タンパク質の配列探索，生物物理，2013年，53(3)，pp. 128-133

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ４０Ｂ １０／００

Ｃ４０Ｂ ４０／０２

Ｃ４０Ｂ ４０／０６－ ４０／１０

Ｃ４０Ｂ ５０／０６

Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖鎖結合一本鎖抗体の連結部にアミノ酸置換を導入する糖鎖結合一本鎖抗体の改変抗体配列の設計方法であって、
糖鎖結合一本鎖抗体のアミノ酸配列に対して、統計学手法と祖先型設計法に基づいてアミノ酸置換を行い、糖鎖結合性一本鎖抗体の改変抗体のアミノ酸配列を設計する工程、
前記糖鎖結合性一本鎖抗体の改変抗体の配列のうち、可変部位（ＣＤＲ）を、前記糖鎖結合一本鎖抗体の配列に置換する工程、
を備える、
糖鎖結合一本鎖抗体の改変抗体配列の設計方法。

【請求項2】

前記統計学手法が、Ｂｌａｓｔｐを用いて、鋳型としたスクリーニングで得られた糖鎖結合一本鎖抗体の類似配列を１００００個以上選別し、そこからランダムに選抜した配列からなる配列ペアを１，０００個以上作成し、それを統計学的手法を用いて解を行い、得られた結果からアミノ酸残基を特定して、それら残基を有する類似配列のみ選別・抽出する工程を含む、請求項１記載の糖鎖結合一本鎖抗体の改変抗体配列の設計方法。

【請求項3】

糖鎖結合一本鎖抗体の改変抗体の製造方法であって、
請求項1記載の方法によって前記糖鎖結合一本鎖抗体の改変抗体のアミノ酸配列を設計する工程、
設計された前記改変抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むタンパク質発現ベクターにより大腸菌を形質転換する工程、
形質転換された前記大腸菌を用いて前記改変抗体を製造する工程、
を備える、糖鎖結合一本鎖抗体の改変抗体の製造方法。

【請求項4】

前記タンパク質発現ベクターが、Ｍｙｃエピトープタグをコードする配列を含まないタンパク質発現ベクターである請求項３記載の糖鎖結合一本鎖抗体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、癌細胞表層の糖鎖抗原に対して高い結合性を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の安定性と特異性を向上させるために、抗体発現遺伝子の遺伝子組み換えとバイオインフォマティクスにより、改変した抗体とそれを作製する手法および硫酸化オリゴ糖鎖に特異的に結合する一本鎖抗体である。

【背景技術】

【0002】

糖鎖は、生体内に普遍的に存在する生体分子で、糖タンパク質や糖脂質、プロテオグリカンのような複合糖質の形で存在する。細胞表層の糖鎖は、糖鎖－タンパク質間や糖鎖－糖鎖同士の相互作用を介して、細胞接着や情報伝達、ウイルスや細菌の感染などに関与し、生体内で極めて多様な生理機能を担う。

【0003】

糖鎖の構造や発現量は、炎症や疾患などの細胞内外の環境変化に応じて、動的に変化することが知られている。細胞のがん化においては、特定の糖鎖の過剰発現や欠損が起きたり、一部が欠損した不完全な構造の糖鎖が出現したりすることがある。また、正常細胞には存在しない糖鎖構造が発現することもあり、がんの進展に伴って、様々な糖鎖の発現変化が起こることが知られている。したがって、がんの進行度や転移性、患者の予後などが予測できると期待されており、疾患特異的に発現する糖鎖をバイオマーカーに利用するための研究が活発に行われている。

【0004】

疾患特異的な糖鎖は、がんマーカーとしての利用だけでなく、分子標的薬開発のための標的分子としても利用されている。疾患特異的な糖鎖に対する分子標的薬は、新たな診断薬や医薬品の開発にも繋がることから、近年盛んに研究されている。一方、抗糖鎖抗体の作製においては、疾患特異的な糖鎖構造の同定が非常に難しいこと、糖鎖の抗原性が低く、実験動物に免疫してハイブリドーマを得る従来の手法では抗体の作製が難しいこと、糖鎖の抗原性を向上させるために、糖脂質への誘導や抗原性タンパク質との複合化などが必要なことなど、技術的に様々な課題があり、簡便且つ効率的に特異性の高い抗糖鎖抗体を作製可能な新たな手法の確立が求められている。

【0005】

一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）は、抗体の抗原結合部位を含む領域であるＦａｂの重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）から構成される抗体の一種であり、リンカーペプチドによりＶＨとＶＬ同士がつながった構造を持つ。目的のｓｃＦｖを探索・単離する有効な手法としてファージディスプレイ法があり、ウイルスの一種であるバクテリオファージ表面にｓｃＦｖを提示させ、多数のライブラリーの中から特定の抗原に結合するｓｃＦｖ提示ファージを効率的に選別・濃縮することが出来る。得られたｓｃＦｖ提示ファージは、大腸菌のタンパク質発現系を用いて、可溶性のｓｃＦｖを発現させることができ、産生されたｓｃＦｖは、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）等のエピトープタグを用いたアフィニティー精製により、簡便に精製することが出来る。さらには、ＩｇＧ抗体へと誘導出来るため、特異性の高いヒト由来抗体を作製する技術として大きな注目を集めている。

【0006】

発明者らはこれまでに、効率的に疾患特異的な糖鎖に対する抗体を得る手法の確立するために、ファージライブラリー法と独自のシュガーチップ技術（特許文献１、非特許文献１、２）を用いて、成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）に対する抗糖鎖抗体の開発を行ってきた。即ち、ＡＴＬ患者より樹立した細胞株であるＳ１Ｔ細胞表層のＯ－型糖鎖を遊離させ、独自のリンカー化合物と複合化後、ファイバー型シュガーチップを作製し、Ｓ１Ｔ細胞表層のＯ－型糖鎖に結合するｓｃＦｖ提示ファージを選別することで、ＡＴＬ細胞に強く結合するｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）を得ることに成功している（特許文献２、非特許文献３）。一方、大腸菌のタンパク質発現系を用いてファージミドからｓｃＦｖを調製すると、約１ヶ月後には、細胞への結合性を観察できなくなるため、安定性に欠けることが課題であった。また、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１が結合する糖鎖の構造を、有機化学的に合成されたＯ－型糖鎖部分二糖構造のライブラリーを固定化したシュガーチップ用いて解析したところ、高硫酸化されたグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖の複数の構造に結合性を示し、その特異性が十分に高くないことも課題であった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【文献】特許第５２７８９９２号

【文献】特開２０１４－１００１１６

【非特許文献】

【0008】

【文献】Wakao M., et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18:2499-2504(2008)

【文献】Wakao M., et al., Anal. Chem. 17:1086-1091(2017)

【文献】Muchima K., et al., J. Biochem. 163：281-291（2018）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

これまでに得られたＳ１ＴＳＣＦＲ３－１と命名したｓｃＦｖは、安定性に欠け、約一ヶ月保存後には、細胞への結合性が観察できなくなること、および高硫酸化された複数の構造のＧＡＧ鎖に結合し、特異性が十分に高くないことが課題であった。これらは、以下が原因だと考えられた。即ち、ｓｃＦｖの細胞への結合性を観察できなくなるのは、ファージにｓｃＦｖを発現させるために組み込まざるをえないエピトープタグペプチドの一部がｓｃＦｖの立体構造に巻き込まれてしまうこと、あるいはｓｃＦｖの立体構造自体を、時間経過に伴い変化させてしまうこと、また糖鎖への特異性が十分に高くないのは、ｓｃＦｖのわずかな立体構造の変化(立体構造のゆらぎ)により、抗原結合部位となる相補性決定領域（ＣＤＲ）の立体構造がゆらぐため、糖鎖への特異性が低下することが考えられた。したがって、これらを改善することで、ｓｃＦｖの安定性と糖鎖特異性を改善できると考えられた。

【0010】

我々は、このような背景に立脚して研究を開始し、ｓｃＦｖの安定性と糖鎖特異性を向上させるために、以下を行った。ｓｃＦｖの安定性を改善するために、ｐＥＴ発現システムを用いた遺伝子組み換えにより、ｓｃＦｖのエピトープタグの一部であるＭｙｃエピトープタグを除去したｓｃＦｖを調製した。ｓｃＦｖの糖鎖特異性を向上させるために、バイオインフォマティクスにより、抗原結合部位となるＣＤＲのアミノ酸配列は改変せず、構造安定性に寄与するフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を改変したｓｃＦｖを設計し、遺伝子組み換えと大腸菌による発現システムを使用して、新たなｓｃＦｖを１６種類調製した。その結果、ｓｃＦｖの安定性と、糖鎖特異性を向上させることに成功し、安定且つＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓ－ＧｌｃＡ２Ｓ構造に高い特異性を示す、ｐＥＴ－ＴＭ－４および安定且つＧｌｃＮＳ３Ｓ６Ｓ－ＩｄｏＡ２Ｓ構造に高い特異性を示す、ｐ－ＴＭ－４が得られた。

【0011】

本発明は、上記従来の問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、癌細胞表層に発現する糖鎖抗原に結合するｓｃＦｖの安定性と特異性を向上させるために、ｓｃＦｖのエピトープタグの一部であるＭｙｃエピトープタグを除去したｓｃＦｖ、およびそれを調製する手法とバイオインフォマティクスにより、ｓｃＦｖの立体構造を安定化した改変抗体を設計し、抗体発現遺伝子の遺伝子組み換えにより、糖鎖特異性を高めた改変抗体、およびそれを作製する手法を提供することにある。特に、硫酸化オリゴ糖鎖に対する抗体は、オリゴ糖鎖の硫酸基による負電荷が大きく、抗体の親和性に影響するため、オリゴ糖鎖の構造を厳格に区別することは困難であったが、本発明はそれをも解決した。
本発明は、例えば、遺伝子組み換えとバイオインフォマティクスにより、ｓｃＦｖ提示ファージのライブラリーから、スクリーニングにより得られたＡＴＬ細胞特異的に発現する糖鎖に結合するｓｃＦｖの安定性を改善し、特定の糖鎖構造に高い選択性を示すｓｃＦｖを調製することで、ＡＴＬに対する新規診断薬・治療薬を提供することができる。また、極めて厳格に硫酸化オリゴ糖鎖の構造を認識する抗体が得られるので、ＡＴＬ以外の癌細胞を検出するためのバイオマーカーや、治療薬としての応用も期待できる。

【課題を解決するための手段】

【0012】

本発明に係る糖鎖結合性ｓｃＦｖの安定性と糖鎖特異性の改善は、ｐＥＴ発現システムを用いた遺伝子組み換えにより、ｓｃＦｖのエピトープタグの一部であるＭｙｃエピトープタグを除去したｓｃＦｖを調製すること、またバイオインフォマティクスにより、ｓｃＦｖ提示ファージのライブラリーからスクリーニングにより得られた糖鎖結合性ｓｃＦｖの改変抗体を設計し、遺伝子組み換えにより改変抗体遺伝子を作製後、大腸菌のタンパク質発現システムを用いて、特異性の高い改変抗硫酸化糖鎖抗体を作製することを特徴としている。

【発明の効果】

【0013】

本発明に係る遺伝子組み換えとバイオインフォマティクスによる糖鎖結合性ｓｃＦｖの改変は、スクリーニングにより得られた糖鎖結合性ｓｃＦｖの安定性と特異性を向上させることができる。
本発明の遺伝子組み換えとバイオインフォマティクスによる糖鎖結合性ｓｃＦｖの改変は、安定且つ特異性の高い改変抗体を作製する手法として、医薬品開発の現場での利用が大いに期待される。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子のｐＥＴ-２８ｂ（＋）ベクターへの挿入の概略を示す図である。

【図2】ｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子の調製の概略を示す図である。

【図3】Ｓ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価したｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の安定性を示す図である。

【図4】ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８の８種類のｓｃＦｖをコードする遺伝子の塩基配列を示す。

【図5】ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８の８種類のｓｃＦｖをコードする遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列を示す。

【図6】ｐＥＴ－ＴＭ－４を用いたＳ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞に対する結合性解析の結果を示す。

【図7】ＳＰＲイメージングによる糖鎖結合性解析に使用したシュガーチップの糖鎖マップを示す。

【図8】ｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１とｐＥＴ－ＴＭ－４を用いたＳＰＲイメージングによる糖鎖結合性解析の結果を示す。

【図9】Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子のｐＥＴ-２６ｂ（＋）ベクターへの挿入の概略を示す図である。

【図10】ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８の８種類のｓｃＦｖをコードする遺伝子の塩基配列を示す。

【図11】ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８の８種類のｓｃＦｖをコードする遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列を示す。

【図12】ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－４を用いたＳ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞に対する結合性解析の結果を示す。

【図13】ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－４を用いたＳＰＲイメージングによる糖鎖結合性解析の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

以下に本発明について詳述する。ｓｃＦｖの安定性は、ｐＥＴ発現システムを用いた遺伝子組み換えにより、ｓｃＦｖのエピトープタグの一部であるＭｙｃエピトープタグを除去したｓｃＦｖを調製することで改善することができる。糖鎖特異性を向上させた改変抗体は、次のように調製することができる。ｓｃＦｖ提示ファージのライブラリーから、スクリーニングによりｓｃＦｖ提示ファージを得る。これらのｓｃＦｖ発現遺伝子配列に対して、ＧｅｎＢａｎｋに登録されている抗体ライブラリーのアミノ酸配列をもとにした統計学的知見と生物進化に従って変化してきたアミノ酸をもとにした進化学的知見に基づくバイオインフォマティクスにより、ＦＲのアミノ酸配列を改変したｓｃＦｖ発現遺伝子を設計する。次に、ｓｃＦｖ提示ファージのプラスミドを、制限酵素で消化し、ｓｃＦｖ発現遺伝子の遺伝子断片（プラスミドインサート部）を得る。得られた遺伝子断片を、タンパク質発現用ベクター（プラスミドベクター）に組み込み、ｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドを構築する。その後、塩基配列の１箇所に変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲにより、プラスミドの全配列を増幅することで、特定の塩基配列に変異を導入した新規のプラスミドを調製する。得られたプラスミドを、大腸菌に形質転換し、タンパク質を強制発現させることで、ｓｃＦｖを調製することができる。

【0016】

（１－１．糖鎖結合性ｓｃＦｖ発現遺伝子のタンパク質発現用ベクターへの組み込み）
糖鎖結合性ｓｃＦｖ発現遺伝子のタンパク質発現用ベクターへの組み込みは、ｓｃＦｖ提示ファージのライブラリーからスクリーニングにより得られた糖鎖結合性ｓｃＦｖを、制限酵素消化し、得られたプラスミドインサート部を、プラスミドベクターに組み込むことで行うことができる。

【0017】

ｓｃＦｖ発現遺伝子からなるプラスミドインサート部は、ｓｃＦｖ提示ファージのプラスミドを、タンパク質発現用ベクターと、共通する２種類の制限酵素を用いて消化することで、調製することができる。

【0018】

プラスミドベクターは、プラスミドインサート部の調製に用いた２種類の制限酵素でタンパク質発現用ベクターを消化することにより、調製することができる。

【0019】

なお、タンパク質発現用ベクターと共通の制限酵素を使用できない場合、遺伝子組み換えを行うことができない。そのため、ｓｃＦｖ発現遺伝子を、タンパク質発現用ベクターと、共通の制限酵素認識配列を有するＴＡクローニングベクター等に組み込むことや、ＰＣＲを用いて点変異を導入することで、共通の制限酵素を組み込む必要がある。

【0020】

プラスミドインサート部と、プラスミドベクターが得られれば、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて連結し、ｐＥＴベクターに組み込まれたｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドを構築することができる。

【0021】

得られたｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株等に形質転換し、イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、ｓｃＦｖの発現を誘導する。

【0022】

タンパク質発現用ベクターにｐＥＴ－２８ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒを用いた場合、菌体内発現用ベクターであるため、発現したタンパク質の多くが不活性な不溶性の封入体として細胞質内に産生される。そのため、不溶性のタンパク質を可溶化し、還元後、リフォールディングすることで正しい立体構造を持つであろう活性型のｓｃＦｖを調製することができる。

【0023】

タンパク質発現用ベクターにｐＥＴ－２６ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒを用いた場合、ペリプラズム輸送シグナルを有するため、発現したタンパク質は、可溶性のｓｃＦｖとしてペリプラズム領域に輸送される。そのため、大腸菌を超音波の照射、または浸透圧変化によって破砕後、リフォールディングせずに、可溶性のｓｃＦｖを得ることができる。

【0024】

なお、上記タンパク質発現用ベクターとしては、特に限定されるものではないが、例えば、ｐＥＴ－２８ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＴ－２１ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒ等を挙げることができる。

【0025】

上記制限酵素としては、特に限定されるものではないが、例えば、ＨｉｎｄIII、ＮｏｔＩ、ＢｓｍＢＩ等を挙げることができる。

【0026】

（１－２．糖鎖結合性ｓｃＦｖの改変抗体の設計）
改変抗体の設計に関しては、以下に示す手順により行った。なお以下の設計を行うにあたり、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列を鋳型として用いた。実際の操作条件及び方法は実施例に詳述する。
（１）Ｂｌａｓｔｐを用いて、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１類似配列を１１７２４個選別する。
（２）鋳型としたＳ１ＴＳＣＦＲ３－１と、（１）で選別した配列からランダムに５～１０個、選抜した配列からなる配列ペアを１，０００個以上作成し、それをＩＮＴＭＳＡｌｉｇｎ（Ｓｈｏｇｏ Ｎａｋａｎｏ ａｎｄ Ｙａｓｕｈｉｓａ Ａｓａｎｏ, Ｓｃｉ. Ｒｅｐ., ５, ８１９３, ２０１５）により統計学的手法を用いて解析を行う。
（３）（２）の手法を用いて得られた結果から、以下６つのアミノ酸残基（１２、２３、３２、４１、５４及び８２位がＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ及びＧｌｕ）を特定、それら残基を有する類似配列のみ選別し、６７個の配列を抽出する。
（４）（２）で抽出した配列を用いて祖先型設計法を用いて、改変抗体の配列設計を行う。
（５）（３）で設計した改変抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、スクリーニングで得られた糖鎖結合性ｓｃＦｖ（Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１）のものに置換することで、改変抗体の配列設計を完了した。

【0027】

（１－３．糖鎖結合性ｓｃＦｖの改変抗体の調製）
バイオインフォマティクスにより設計した改変抗体は、タンパク質発現用ベクターに組み込まれたｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドを大腸菌に形質転換後、タンパク質を強制発現させることで、調製することができる。

【0028】

タンパク質発現用ベクターに組み込まれたｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドは、人工合成、または、塩基配列の１箇所に変異を導入したプライマーを用いたＰＣＲにより、プラスミドの全配列を増幅することで、調製することができる。

【0029】

変異箇所の異なるプライマーを用いたＰＣＲにより、ｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドに、順に点変異を導入することができる。点変異が導入されたプラスミドは、大腸菌に形質転換してタンパク質を強制発現させることで、ｓｃＦｖを調製することができる。

【0030】

以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

【0031】

［実施例１：ファージプラスミド由来Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子のタンパク質発現用ベクターｐＥＴ-２８ｂ（＋）ベクターへの挿入］
図１は、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子のｐＥＴ-２８ｂ（＋）ベクターへの挿入の概略を示す図である。

【0032】

Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子を有するバクテリオファージが感染した大腸菌ＨＢ２１５１株の単コロニーを、２ＹＴＡＧ液体培地５ｍＬに加え、３７℃で一晩振とう培養し、オーバーナイトカルチャーを調製した。ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、得られたオーバーナイトカルチャーよりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドは、エタノール沈殿法により精製し、プラスミド溶液を得た。

【0033】

プラスミドのＳ１ＴＳＣＦＲ３-１発現遺伝子を、Ｅｘ Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲにより増幅した。得られたそれぞれのＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、７５０ｂｐ付近のバンドをＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてそれぞれ抽出した。

【0034】

Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子（１０ｎｇ/μＬ、１μＬ）のＰＣＲ産物と、ＴＡ－Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）付属のｐＭＤ２０Ｔ－ｖｅｃｔｏｒ（５０ｎｇ/μＬ、１μＬ）、ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（３μＬ）を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ（５μＬ）を加え、１６℃で２４時間インキュベートすることでＳ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子を、ｐＭＤ２０Ｔ－ｖｅｃｔｏｒに組み込んだ。得られた組換えプラスミドは、ヒートショック法により、大腸菌ＪＭ１０９株へ形質転換した。形質転換体の解析は、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを用いたコロニーＰＣＲおよびＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ解析によって行った。

【0035】

ＴＡ－Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを用いて調製したＳ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子を有するプラスミドが形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、プラスミドを抽出し、制限酵素消化した。プラスミド（１μｇ、２μＬ）にＨｉｎｄIII溶液（１ｕｎｉｔ、８μＬ）を加え、３７℃で１２時間インキュベート後、Ｎｏｔ Ｉ溶液（１ｕｎｉｔ、１０μＬ）を用いて３７℃で１２時間インキュベートした。その後、１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、７５０ｂｐ付近のバンドを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出し、エタノール沈殿法により精製することでプラスミドインサート部を得た。

【0036】

ｐＥＴ－２８ｂ（＋）ベクターを制限酵素消化した。ｐＥＴ－２８ｂ（＋）ベクター（１μｇ、２μＬ）にＨｉｎｄIII溶液（１ｕｎｉｔ、８μＬ）を加え、３７℃で１２時間インキュベート後、Ｎｏｔ Ｉ溶液（１０μＬ）を加え、３７℃で１２時間インキュベートした。その後、１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、約５，０００ｂｐのバンドをＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出し、エタノール沈殿法により精製することでプラスミドベクターを得た。

【0037】

プラスミドインサート部とプラスミドベクターの連結反応は、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１（タカラバイオ社製）の推奨プロトコールに従って行った。プラスミドベクター（７．５ｆｍｏｌ、１μＬ）とプラスミドインサート部（３７．５ｆｍｏｌ、０．８５μＬ）を混合し、キット付属のＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（１．８５μＬ）を加え、１６℃で２４時間インキュベートすることで組換えプラスミド溶液を得た。得られた組換えプラスミドは、ヒートショック法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株へ形質転換した。

【0038】

［実施例２：ｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の調製］
図２は、ｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１発現遺伝子の調製の概略を示す図である。

【0039】

実施例２で調製した遺伝子組換えプラスミドを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のシングルコロニーを、ＬＢＫ液体培地（５ｍＬ）に加え、３７℃で一晩振とう培養することでオーバーナイトカルチャーを得た。これらは、それぞれ新しいＬＢＫ液体培地に加え、３７℃でさらに１時間振とう培養した。培地交換のため、遠心分離（３，０００×ｇ、１０分）し、上清を除去後、ＬＢＫＩ液体培地（５０ｍＬ／サンプル）を加え、３０℃で２０時間振とう培養した。その後、培養液を遠心分離（３，０００×ｇ、２０分、４℃）し、沈殿物を回収した。沈殿物に１×ＴＥＳ（２ｍＬ）を加えて懸濁後、氷冷しながら５分間静置した。その後、１/５×ＴＥＳ（４．５ｍＬ）を加え、氷冷しながらさらに３０分間静置した。次いで、超音波ホモジナイザーを用いて超音波照射（１０秒）と氷冷（１分）を３回繰り返すことで、大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液は、遠心分離（１５，０００×ｇ、５分、４℃）により可溶性画分と不溶性画分に分離した。

【0040】

不溶性のタンパク質画分に、０．３％Ｔｗｅｅｎ ２０含有トリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＬ）を加え、懸濁した。得られた懸濁液を遠心分離（５，８００×ｇ、３０分、４℃）し、上清を除去した。この操作を３回繰り返した。その後、トリス緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、２５ｍＬ）に再懸濁し、得られたタンパク質溶液を、トリス緩衝液を加えて、３ｍｇ/ｍＬに調製した。その後、タンパク質溶液を遠心分離（５，８００×ｇ、３０分、４℃）し、沈殿物を回収した。得られた沈殿物に６Ｍグアニジン塩酸塩を加え、一晩静置（４℃）し、タンパク質を可溶化した。

【0041】

可溶化後のタンパク質をリフォールディングし、ｓｃＦｖを調製した。リフォールディングに用いる希釈液は、グアニジン塩酸塩溶液（８Ｍ、１．９ｍＬ）、グリセロール（１００％、２２．５ｍＬ）、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ溶液（３０ｍＭ、ｐＨ８．０、２．５ｍＬ）を超純水（４５．６ｍＬ）に混合することで調製した。
別途、可溶化したタンパク質溶液（２．５ｍＬ）に水素化ホウ素ナトリウム水溶液（９．５μＬ）を加え、暗所で４時間静置し、タンパク質を還元処理した。この溶液を、先に調製した希釈液（７２．５ｍＬ）に撹拌しながらゆっくりと滴下し、４℃で２４時間以上撹拌することでリフォールディングした。得られたｓｃＦｖは、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。

【0042】

［実施例３：ｓｃＦｖの細胞結合性解析］
Ｓ１Ｔ細胞またはＭＯＬＴ－４細胞の細胞培養液を回収し、遠心分離（７００ｒｐｍ、５分）後、培養上清を除去し、細胞数が１×１０＾６個/ｍＬになるようにＰＢＳを加え、細胞懸濁液を調製した。続いて、細胞懸濁液（１ｍＬ）をエッペンチューブに移し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）後、上清を除去し、ｓｃＦｖ溶液（１０μｇ/ｍＬ、２０μＬ）を加え、氷冷下で３０分間静置した。その後、ＰＢＳ（１ｍＬ）を加え、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）し、沈殿物をＰＢＳで洗浄した。次に、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）後、ＰＢＳで５００倍希釈したＡｎｔｉ－Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１００μＬ）を加え、氷冷下で３０分間静置した。ＰＢＳ（９００μＬ）を加え、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）後、沈殿物をＰＢＳで洗浄した。続いて、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）後、沈殿物を５００倍希釈したＡｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ－ＦＩＴＣ（１００μＬ）で懸濁し、氷冷下で３０分間静置した。その後、ＰＢＳ（９００μＬ）を加え、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）し、沈殿物をＰＢＳで洗浄した。遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分）後、沈殿物をＰＢＳ（５００μＬ）で細胞を懸濁し、フローサイトメトリー解析（励起光：４８８ｎｍ、蛍光検出：５２５ ｎｍ）を行った。

【0043】

図３は、Ｓ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞を用いたフローサイトメトリーにより評価したｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の安定性を示す図である。

【0044】

［実施例４：バイオインフォマティクスによるＴＭ－１～ＴＭ－８の設計］
（工程－１）
Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列（ＦＡＳＴＡ形式）をクエリー配列とし、以下の手順で類似配列の選別を行った。Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の配列をＢＬＡＳＴｐの“Ｅｎｔｅｒ Ｑｕｅｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ”に入力した。次に、データベースとしてｎｏｎ－ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ｎｒ）、ＡｌｇｏｒｉｔｈｍとしてＢＬＡＳＴｐ（ｈｔｔｐ：//ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を選択し、Ｗｅｂサイト上の“Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ”のタブをクリックして、Ｍａｘ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ２００００、Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄを１．０Ｅ－３を入力した。アラインメントのスコア行列にはＢＬＯＳＵＭ６２を用い、Ｏｒｇａｎｉｓｍを“Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ”に指定した。その他のパラメータは初期値のまま、検索を実行した。検索完了後に出現した画面について、“Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ”の項目が見えるまでスクロールバーを動かしたのち、“Ｓｅｌｅｃｔ：”の項目の横にある“Ａｌｌ”のタブをクリックした。次いで“Ｄｏｗｎｌｏａｄ”のタブをクリックし、“Ｆａｓｔａ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”を選択して、“Ｃｏｎｔｉｎｕｅ”のタブをクリックして１１７２４個の類似配列を入手し、これを配列ライブラリーとした。

【0045】

（工程－２）
工程-１で取得した配列ライブラリーから５～１０個の配列をランダムに選抜し、それに鋳型となるＳ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列を加えた配列ペアを作成した。この配列ペアを１，０００個以上作成したのち、ＩＮＴＭＳＡｌｉｇｎを用いて配列の統計解析を行った。Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列を基準に各アミノ酸残基の出現頻度が計算されたＩＮＴＭＳＡｌｉｇｎの出力結果を基に、配列ライブラリー数を１００以下にすることが可能なアミノ酸残基の選抜を行った。結果、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の１２、２３、３２、４１、５４及び８２位の６残基を予測した。

【0046】

（工程－３）
Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列と、工程－１で取得した配列ライブラリー中の配列を、一つずつペアワイズアラインメントを行った。アラインメントを行った配列中に、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列を基準として、工程－２で選抜した１２、２３、３２、４１、５４及び８２位がＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ、Ｐｒｏ及びＧｌｕで保存されているかを調べ、６残基が全て保存されている場合に限り、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１とペアを作った配列として抽出して保存した。最終的に６７個の配列を抽出した。

【0047】

（工程－４）
工程－３で抽出した配列を、マルチプルシークエンスアラインメント用のソフトウェア、ＭＡＦＦＴ（Ｋａｔｏｈ, Ｋ. ａｎｄ Ｔｏｈ, Ｈ., Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ, ９, ２８６－９８, ２００８）を用いてアラインメントを行った。アラインメントの結果をソフトウェア、ＭＥＧＡ６（Ｔａｍｕｒａ, Ｋ. ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌ. Ｂｉｏｌ. Ｅｖｏｌ., ３０, ２７２５－２７２９, ２０１３）を用いて系統解析を行い、最尤法を用いて系統樹を作成した。作成したアラインメントと系統樹のデータを、祖先型配列設計ソフトウェア、ＦＡＳＴＭＬ（ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔｍｌ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／）を用いて解析し、Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の祖先型配列を得た。

【0048】

（工程－５）
工程－４で設計した祖先型配列とＳ１ＴＳＣＦＲ３－１のアミノ酸配列についてペアワイズアラインメントを行った。Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１の可変領域をコードする配列を祖先型配列に移植することで、改変抗体ＴＭ－１～ＴＭ－８の８種類を設計した。

【0049】

［実施例５：ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８の調製］
ｐＥＴ－ＴＭ－１プラスミドは、Ｇｅｎ Ｓｃｒｉｐｔ社より購入し、ｐＥＴ－２８ｂ（＋）ベクターにＴＭ－１発現遺伝子を組み込んだプラスミドを人工合成により作製した。ｐＥＴ－ＴＭ－２～ｐＥＴ－ＴＭ－８の７種類は、ｐＥＴ－ＴＭ－１に順に点変異を導入することで調製した。まず、ｐＥＴ－ＴＭ－１発現遺伝子を有するプラスミドを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株よりプラスミドを抽出した。その後、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いたＰＣＲによりプラスミドの全配列を増幅した。この際、プライマーに、点変異を導入したフォワードプライマーと、リバースプライマーと、をそれぞれ用いた。得られたＰＣＲ産物（１０ｎｇ／μＬ、１μＬ）は、ヒートショック法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテントセルへ形質転換した。その後、大腸菌からプラスミドを抽出し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いてＰＣＲを行い、次の点変異を導入した。この操作を繰り返すことで順番に点変異を導入した。得られたｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８の発現遺伝子は、実施例２に記載の手法で、タンパク質の発現を誘導し、ｓｃＦｖを調製した。

【0050】

図４に、ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８をコードする遺伝子の塩基配列を示す。

【0051】

図５に、ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８をコードする遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列を示す。

【0052】

図６に、ｐＥＴ－ＴＭ－４を用いたＳ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞に対する結合性解析（１次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－Ｔａｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、２次抗体：Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｅｘ.４８８ｎｍ、Ｅｍ.５３０±１５ｎｍ）の結果を示す。

【0053】

［実施例６：ｓｃＦｖの糖鎖結合性解析］
ニッケルアフィニティークロマトグラフィーにより精製したｓｃＦｖの溶出液（０．３ｍＬ）にＰＢＳ－Ｔ（２．７ｍＬ）を加えた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ（ＭＷＣＯ：１０ｋ）を用いて約１０倍に濃縮し、ｓｃＦｖの溶媒をＰＢＳ－Ｔへ置換した。
図７に糖鎖マップを示す一連のＧＡＧ二糖部分構造が固定化されたアレイ型シュガーチップは、マッチングオイル（ＮＤ＝１．７００）を使ってプリズムに固定した。ランニングバッファーにはＰＢＳ－Ｔを使用し、流速は１５０μＬ/ｍｉｎに設定した。ＳＰＲイメージング解析は、以下のように行った。まず、ＰＢＳ－Ｔで７０秒間チップを洗浄し、ｓｃＦｖのＰＢＳ－Ｔ溶液（１１３ｎＭ、２２５ｎＭ）を４分間循環させた。その後、ＰＢＳ－Ｔに置換し、２分間洗浄した。次に、１０ｍＭ ＮａＯＨ水溶液に洗浄し、再びＰＢＳ－Ｔに置換し、２分間洗浄した。この一連の操作を繰り返してＳＰＲイメージング解析を行った。データ解析には、ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ ａｎａｌｙｔｉｃ ｐｒｏｇｒａｍ（東洋紡社製）を用い、ｓｃＦｖのＰＢＳ－Ｔ溶液を循環後、ＰＢＳ－Ｔに置換し、２分間滞在した後の結果を解析した。

【0054】

図８に、ＧＡＧ二糖部分構造ライブラリーを固定化したシュガーチップを用いたＳＰＲイメージングによるｐＥＴ－Ｓ１ＴＳＣＦＲ３－１とｐＥＴ－ＴＭ－４の糖鎖結合性解析の結果を示す。

【0055】

［実施例７：ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８の調製］
図９は、ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８の８種類のｓｃＦｖ発現遺伝子の調製の概略を示す図である。

【0056】

ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８は、ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８のｓｃＦｖ発現遺伝子領域をｐＥＴ－２６ｂ（＋）ベクターに組み換えすることで調製した。ｐＥＴ－ＴＭ－１～ｐＥＴ－ＴＭ－８のｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドを形質導入した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株よりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いてそれぞれプラスミドを抽出した。その後、ＰＣＲによりＮｃｏＩ認識配列をそれぞれのプラスミドに導入した。得られた部位特異的変異導入により制限酵素認識部位（ＮｃｏＩ）が導入されたプラスミドは、ヒートショック法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株へ形質転換した。次に、プラスミドが形質転換された大腸菌からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、プラスミドを抽出した。プラスミド（１μｇ、５μＬ）に制限酵素のＮｃｏＩとＮｏｔＩ溶液（５μＬ）を加え、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、７４０ｂｐ付近のバンドをＭｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出し、エタノール沈殿法により精製することでプラスミドインサート部を得た。

【0057】

ｐＥＴ－２６ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒの制限酵素消化は、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）ｖｅｃｔｏｒ（１μｇ、２６μＬ）に制限酵素のＮｃｏＩとＮｏｔＩ溶液（５μＬ）を加え、３７℃で１６時間インキュベートした。その後、１．０％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、５，０００ｂｐ付近のバンドを切り出し後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＤＮＡ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて抽出し、エタノール沈殿法により精製することでプラスミドベクターを得た。
プラスミドインサート部とプラスミドベクターとの連結反応は、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ２．１の推奨プロトコールに従って行った。プラスミドベクター（５．７ｆｍｏｌ、２．５μＬ）とプラスミドインサート部（２８．５ｆｍｏｌ、２．６５μＬ）を混合し、キット付属のＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（１．８５μＬ）を加え、１６℃で２４時間インキュベートすることで組換えプラスミド溶液を得た。

【0058】

大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株またはＲｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ２（ＤＥ３）株のコンピテントセル溶液（２０μＬ）と調製した遺伝子組換えプラスミド溶液（１０μＬ）を混合し、３０分間氷冷した。次いで、４２℃で４５秒間加熱処理し、２分間氷冷後、菌体懸濁液にＬＢ液体培地（８０μＬ）を加え、３７℃で１時間振盪培養（１８０ｒｐｍ）した。得られた培養液（１００μＬ）をＬＢ／Ｋａｎ寒天培地に播種し、３７℃で一晩培養することで、組換えプラスミドが形質転換された大腸菌のシングルコロニーを得た。

【0059】

ｓｃＦｖ発現遺伝子を有するプラスミドを形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株またはＲｏｓｅｔｔａ－ｇａｍｉ２（ＤＥ３）株のシングルコロニーをＬＢ/Ｋａｎ液体培地（５ｍＬ）に加え、３７℃で一晩振とう培養することでオーバーナイトカルチャーを得た。このオーバーナイトカルチャー（５ｍＬ）を新しいＬＢ/Ｋａｎ液体培地（５０ｍＬ）に加え、３７℃でさらに１時間振とう培養した。ＩＰＴＧ溶液（５０μＬ、１ｍＭ）を加え、３０℃で２０時間振とう培養した。その後、培養液を遠心分離（３，０００×ｇ、２０分、４℃）し、大腸菌を含む沈殿物を回収した。可溶性のｓｃＦｖは、以下に示す、超音波による大腸菌の破砕、または、浸透圧を変化させて大腸菌を破砕することで回収した。超音波による大腸菌の破砕の場合は、沈殿物に１×ＴＥＳ（２ｍＬ）を加えて懸濁後、氷冷しながら５分間静置した。その後、１/５×ＴＥＳ（０．７ｍＬ）を加え、氷冷しながらさらに３０分間静置した。次いで、氷冷下で超音波ホモジナイザーを用いて５分間超音波照射し、大腸菌を破砕した。浸透圧を変化させて大腸菌を破砕する場合は、沈殿物を１×ＴＥＳ（１ｍＬ）に懸濁し、氷冷しながら２時間静置した。さらに、１／５×ＴＥＳ（２ｍＬ）加え、氷冷しながら１時間静置することで、大腸菌を破砕した。大腸菌破砕液は遠心分離（７，５００×ｇ、１５分、４ ℃）により可溶性画分と不溶性画分に分離した。可溶性画分に含まれるｓｃＦｖは、ニッケルアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。

【0060】

図１０に、ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８をコードする遺伝子の塩基配列を示す。

【0061】

図１１に、ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８をコードする遺伝子の塩基配列から推定したアミノ酸配列を示す。

【0062】

図１２に、ｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－８を用いたＳ１Ｔ細胞およびＭＯＬＴ－４細胞に対する結合性解析（１次抗体：Ａｎｔｉ－Ｈｉｓ－Ｔａｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ、２次抗体：Ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＦＩＴＣ ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｅｘ.４８８ｎｍ、Ｅｍ.５３０±１５ｎｍ）の結果を示す。
図１３に、ＧＡＧ二糖部分構造ライブラリーを固定化したシュガーチップを用いたＳＰＲイメージングによるｐ－ＴＭ－１～ｐ－ＴＭ－４の糖鎖結合性解析の結果を示す。

【0063】

以上から、遺伝子組み換えとバイオインフォマティクスにより糖鎖結合性ｓｃＦｖの安定性と硫酸化オリゴ糖鎖への結合特異性が向上したこと、さらに大腸菌の発現システムを利用することで可溶性の糖鎖結合性ｓｃＦｖが得られることが明らかとなった。

【産業上の利用可能性】

【0064】

以上の結果より、本発明に係る遺伝子組み換えとバイオインフォマティクスによる糖鎖結合性ｓｃＦｖの安定性と特異性の改善ついては、安定且つ特異性の高い改変抗体を作製する手法として、医薬品開発の現場での利用可能性が大いに期待される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】