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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-21
(45)【発行日】2024-03-29
(54)【発明の名称】出血およびセンタキンによる蘇生後のエンドセリン受容体の変化
(51)【国際特許分類】
A61K 31/496 20060101AFI20240322BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240322BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240322BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240322BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240322BHJP
【ＦＩ】
A61K31/496
A61P13/12 ZNA
A61K38/16
A61K38/10
A61P43/00 121
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2020561786
(86)(22)【出願日】2019-05-03
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-09-02
(86)【国際出願番号】 US2019030652
(87)【国際公開番号】W WO2019213558
(87)【国際公開日】2019-11-07
【審査請求日】2022-05-02
(31)【優先権主張番号】62/666,675
(32)【優先日】2018-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】201841019588
(32)【優先日】2018-05-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(73)【特許権者】
【識別番号】510048370
【氏名又は名称】ミッドウェスタン ユニバーシティ
(73)【特許権者】
【識別番号】515055409
【氏名又は名称】ファーマズ，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000556
【氏名又は名称】弁理士法人有古特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】グラティ， アニル
(72)【発明者】
【氏名】ラヴハル， マニシュ
(72)【発明者】
【氏名】カティア， バウナ
(72)【発明者】
【氏名】シン， アビシェーク クマール
【審査官】堂畑 厚志
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２９６３３１（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５２３６９４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２５４２２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１５－５３０３８５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第１９９２／０１９６４４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１０－５２３５８４（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５３６８８０（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２３９６９（ＪＰ，Ａ）
【文献】MIGUEL, C. D. et al.，Endothelinreceptor-specific control of endoplasmic reticulum stress and apoptosis in thekidney，Sci. Rep.，2017年，vol. 7, 43152，p. 1-13
【文献】SRIMAL, R. C. et al.，Studies on 2-2-(4-(3-methylphenyl)1-piperazinyl)ethyl quinoline (centhaquin), a centrallyacting antihypertensive. II, Effect on cardiohaemodynamics，Asia pacific journal ofpharmacology，1990年，Vol 5, No. 3，pp 185-190
【文献】菱田 明，急性腎不全，日腎会誌，2002年，vol. 44, no. 2，p. 94-101
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
Ｐｕｂｍｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
センタキンまたはその塩を含有する、急性腎機能低下の治療用医薬組成物。
【請求項2】
前記急性腎機能低下が、急性腎不全に関連している、請求項１に記載の治療用医薬組成物。
【請求項3】
前記急性腎不全が、重篤な疾患、心拍出量の低減、外傷、血液酸素化の低減、別の臓器の障害に対する反応によって引き起こされる全身毒性、心腎症候群、心臓手術もしくは急性非代償性心不全に起因する全身性低血圧、出血、敗血症性ショック、血液量減少性ショック、重度のデング、外科的処置、横紋筋融解症または肝腎症候群もしくは肝移植に起因する局所腎血流の低減による循環量の低減、薬物、放射性造影剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗生物質、もしくは化学療法剤に起因する腎毒性、または下痢、嘔吐、利尿薬もしくは過度の発汗によって引き起こされる脱水によって引き起こされるか、またはこれらに関連している、請求項２に記載の治療用医薬組成物。
【請求項4】
センタキンまたはその塩を含有する、腎障害または腎不全の治療用医薬組成物。
【請求項5】
前記腎障害が、虚血性事象または虚血性再灌流事象に起因する、請求項４に記載の治療用医薬組成物。
【請求項6】
センタキンまたはその塩が、Ｎ－スクシニル－［Ｇｌｕ
９
、Ａｌａ
１１，１５
］エンドセリン１（ＩＲＬ－１６２０）、ＢＱ－３０２０、［Ａｌａ
１，３，１１，１５
］－エンドセリン、サラフォトキシンＳ６ｃ、およびエンドセリン３からなる群から選択されるエンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニストとともに投与される、請求項１～５のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項7】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストが、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される、請求項６に記載の治療用医薬組成物。
【請求項8】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストを複数回投与することを含む、請求項６または７に記載の治療用医薬組成物。
【請求項9】
前記ＥＴＢ受容体アゴニストを単回投与することを含む、請求項６または７に記載の治療用医薬組成物。
【請求項10】
前記腎障害または腎不全が急性である、請求項４～９のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項11】
前記腎不全が、放射性造影剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗生物質、化学療法剤、ニボルマブ誘発性急性肉芽腫性尿細管間質性腎炎または腎毒性薬への曝露に起因する、請求項４～９のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項12】
前記塩が、クエン酸塩、ピルビン酸塩、または乳酸塩である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項13】
前記塩が、クエン酸塩である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の治療用医薬品組成物。
【請求項14】
センタキンまたはその塩が、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項15】
センタキンまたはその塩が、単回用量または複数回の用量で投与される、請求項１４に記載の治療用医薬組成物。
【請求項16】
センタキンまたはその塩が、０．０００４ｍｇ／ｋｇ～０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項17】
センタキンまたはその塩が、０．０１ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【請求項18】
センタキンまたはその塩が、蘇生液とともに投与され、
前記蘇生液がコロイド溶液、晶質溶液、血液、血液成分または代用血液である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１８年５月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６６６，６７５号、および２０１８年５月２５日に出願されたインド特許出願第２０１８４１０１９５８８号の、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより優先権利益を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年５月３日に出願された米国仮特許出願第６２／６６６，６７５号、および２０１８年５月２５日に出願されたインド特許出願第２０１８４１０１９５８８号の、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより優先権利益を主張し、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、エンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニストおよび／またはα２アドレナリン作動薬を投与することを含む、腎障害または腎不全を治療または予防するための方法および組成物に関する。
【0003】
［電子的に提出された資料の参照による組込み］
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により組み込まれるコンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：50000A_Seqlisting.txt；サイズ：６７３バイト、作成日時：２０１９年５月２日）を含む。
本出願は、本開示の別個の部分として、その全体が参照により組み込まれるコンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：50000A_Seqlisting.txt；サイズ：６７３バイト、作成日時：２０１９年５月２日）を含む。
【背景技術】
【0004】
出血性ショックは、多くの場合、急速かつ過剰な失血の結果として、不十分な血液循環、灌流、および酸素化により、多臓器不全を引き起こす（非特許文献７２）。酸素化および組織の血流を維持するための複数の代償メカニズムは、出血の開始とともに開始される。循環および酸素供給を回復するための静脈内輸液による蘇生にもかかわらず、患者は依然として血液灌流の不可逆的喪失、凝固障害、低体温症、アシドーシス、免疫抑制、全身性炎症、酸化的ストレス、多臓器不全、および死亡を経験する可能性がある（非特許文献４８）。出血性ショックによる死亡は通常、非常に早期に発生し、ほとんどが入院後６時間以内に発生する（非特許文献８７）。
【0005】
内因性２１アミノ酸ペプチドであるエンドセリン（ＥＴ）は、ほぼ３０年前にブタの大動脈内皮細胞から最初に単離された（非特許文献９８）。ＥＴ－１、ＥＴ－２、およびＥＴ－３の３つの異なるイソペプチドがあり、血圧ならびに灌流の調節、アポトーシス、および細胞の増殖ならびに移動など、無数の生理学的および病理学的役割を果たしている様々な哺乳動物組織に存在する（非特許文献２１；非特許文献４７；非特許文献９３；非特許文献９８）。ＥＴペプチドは、Ｇタンパク質結合受容体：ＥＴＡおよびＥＴＢの活性化を介してその生物学的効果を生じさせる（非特許文献４）。しかしながら、ＥＴ－１およびその受容体は、血管系に限定されない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
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【発明の概要】
【0007】
いくつかの態様では、本開示は、急性腎不全の治療における、ＥＴＢ受容体アゴニストであるＩＲＬ－１６２０、およびアドレナリン作動薬であるセンタキン（ｃｅｎｔｈａｑｕｉｎ）の使用を目的とする。特に、ＥＴＢ受容体の過剰発現または刺激は、腎血液灌流を有意に増加させることが予想外に判明した。
【0008】
さらなる態様では、本開示は、ＥＴＢ受容体に対する特定のアゴニストを単独で、またはセンタキンと組み合わせて、それを必要とする個体に投与することを目的とする。いくつかの実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニストを単独で、またはセンタキンと組み合わせて投与することは、急性腎障害を予防または治療する。
【0009】
いくつかの態様では、本開示は、治療有効量のエンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニストを、それを必要とする個体に投与することにより、腎障害もしくは腎不全を予防または治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニストは、Ｎ－スクシニル－［Ｇｌｕ９、Ａｌａ１１，１５］エンドセリン１（ＩＲＬ－１６２０）、ＢＱ－３０２０、［Ａｌａ１，３，１１，１５］－エンドセリン、サラフォトキシンＳ６ｃ、およびエンドセリン３からなる群から選択される。さらなる実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニストは、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。いくつかの実施形態では、この方法は、複数の用量のＥＴＢ受容体アゴニストを投与することを含む。さらに他の実施形態では、投与は、単回用量のＥＴＢ受容体アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、治療有効量のセンタキンまたはその塩を個体に投与することをさらに含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、腎障害もしくは腎不全は急性である。さらなる実施形態では、腎不全は、放射性造影剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗生物質、化学療法剤、ニボルマブ誘発性急性肉芽腫性尿細管間質性腎炎または腎毒性薬への曝露に起因する。いくつかの実施形態では、急性腎不全は、重篤な疾患、心拍出量の低減、外傷、血液酸素化の低減、別の臓器の障害に対する反応によって引き起こされる全身毒性、心腎症候群、心臓手術もしくは非代償性心不全に起因する全身性低血圧、出血、敗血症性ショック、血液量減少性ショック、重度のデング、外科的処置、横紋筋融解症、または肝腎症候群もしくは肝移植に起因する局所腎血流の低減による循環量の低減、または下痢、嘔吐、利尿薬もしくは過度の発汗によって引き起こされる脱水によって引き起こされるか、またはこれらに関連している。
【0011】
いくつかの実施形態では、個体の腎糸球体濾過量が改善される。さらなる実施形態では、個体の血清クレアチニンレベルが低減する。
【0012】
いくつかの態様では、本開示は、（ａ）エンドセリン－Ｂ（ＥＴＢ）受容体アゴニスト、（ｂ）センタキンまたはその塩、および任意に（ｃ）賦形剤を含む組成物を提供する。
【0013】
さらなる態様では、本開示は、以下を含む製造物品を提供する：（ａ）エンドセリン－Ｂ（ＥＴＢ）受容体アゴニストおよびセンタキンまたはその塩を含むパッケージ化組成物、（ｂ）患者を治療するためのＥＴＢ受容体アゴニストとセンタキンまたはその塩との同時または連続投与のための指示を提供する挿入物、および（ｃ）（ａ）および（ｂ）のための容器。いくつかの実施形態では、エンドセリン－Ｂ（ＥＴＢ）受容体アゴニストは、Ｎ－スクシニル－［Ｇｌｕ９，Ａｌａ１１，１５］エンドセリン１（ＩＲＬ－１６２０）である。
【0014】
いくつかの態様では、本開示は、急性腎機能低下を患っている個体を治療する方法を提供し、これは、治療有効量の、センタキンまたはその塩を含む組成物を個体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、急性腎機能低下は、急性腎不全に関連している。いくつかの実施形態では、腎臓機能の急性低下の原因は、腎臓への血流の減少による腎前性、腎臓内の組織が直接損傷している内因性、および尿の流れが遮断されている腎後性である。いくつかの実施形態では、急性腎不全は、重篤な疾患、心拍出量の低減、外傷、血液酸素化の低減、別の臓器の障害に対する反応によって引き起こされる全身毒性、心腎症候群、心臓手術もしくは非代償性心不全に起因する全身性低血圧、出血、敗血症性ショック、血液量減少性ショック、重度のデング、外科的処置、横紋筋融解症、または肝腎症候群もしくは肝移植に起因する局所腎血流の低減による循環量の低減、薬物、放射性造影剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、抗生物質、もしくは化学療法剤に起因する腎毒性、または下痢、嘔吐、利尿薬もしくは過度の発汗によって引き起こされる脱水によって引き起こされるか、またはこれらに関連している。
【0015】
いくつかの態様では、本開示は、腎障害を患っている個体を治療する方法を提供し、これは、有効量の、センタキンまたはその塩を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、腎障害は、虚血性事象または虚血性再灌流事象に起因する。さらなる実施形態では、塩は、クエン酸塩、ピルビン酸塩、または乳酸塩である。いくつかの実施形態では、センタキンまたはその塩は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態では、センタキンまたはその塩は、単回または複数回の用量で投与される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】シャム（＝疑似的処置）ラットおよび出血したラットの平均動脈血圧および心拍出量に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）として表される。ベースラインと比較して＊ｐ＜０．０５、出血と比較して＃ｐ＜０．０５、ビヒクル対照群と比較してｘＰ＜０．０５。
【図1B】シャム（＝疑似的処置）ラットおよび出血したラットの心拍数および体血管抵抗に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）として表される。ベースラインと比較して＊ｐ＜０．０５、出血と比較して＃ｐ＜０．０５、ビヒクル対照群と比較してｘＰ＜０．０５。
【図2A】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＡ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図2B】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＡ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図2C】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＡ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図2D】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＡ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図3A】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＢ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図3B】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＢ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図3C】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＢ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図3D】シャムラットおよび出血したラットにおけるＥＴＢ受容体の発現に対する出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。レーン１－シャム；レーン２－出血性ショック；レーン３－高張食塩水（ビヒクル）；レーン４－ビヒクル＋センタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）；レーン５－ビヒクル＋センタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血または高張食塩水と比較して＃ｐ＜０．０５。
【図4】シャムラットおよび出血したラットにおける血漿ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０に及ぼす出血の影響を示す。出血したラットは、高張食塩水またはセンタキンで蘇生された。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）として表される。シャムと比較して＊ｐ＜０．０５、出血と比較して＃ｐ＜０．０５、高張食塩水と比較して＠Ｐ＜０．０５。
【図5】大量失血した雄ラットの腎灌流に対する出血の影響を示す。出血したラットは、ビヒクル（生理食塩水）またはセンタキン低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）または高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で蘇生された。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）として表される。出血と比較して＊ｐ＜０．０５、ビヒクル（生理食塩水）と比較して＃ｐ＜０．０５）。
【図6】大量失血した雌ラットの腎灌流に対する出血の影響を示す。出血したラットは、ビヒクル（生理食塩水）またはセンタキン低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）または高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で蘇生された。値は、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝５）として表される。出血と比較して＊ｐ＜０．０５、ビヒクル（生理食塩水）と比較して＃ｐ＜０．０５）。
【図7】雄ラットをウレタンで麻酔し、大腿静脈にカニューレを挿入して薬物投与し、大腿動脈にカニューレを挿入して、平均動脈血圧（ＭＡＰ）を測定し、レーザードップラーフロープローブを腎髄質中に配置して、血液灌流を測定する実験の結果を示す。出血性ショックの誘発は、ＭＡＰを３５ｍｍＨｇで３０分間維持するために採血することによって開始された。ＭＡＰを７０ｍｍＨｇに維持するために、ノルエピネフリン注入を行った。心血管機能に対するセンタキンの効果は、ショックの誘発前、ショック（出血）の３０分後、および蘇生の１５、３０、４５、６０、７５および９０分後に測定された。センタキンは、蘇生後のビヒクル対照と比較して、出血した雄ラットの腎血液灌流を改善した。ノルエピネフリン誘発性血管収縮の副作用は、センタキンによって弱めることができる。
【図8】雌ラットをウレタンで麻酔し、大腿静脈にカニューレを挿入して薬物投与し、大腿動脈にカニューレを挿入して、平均動脈血圧（ＭＡＰ）を測定し、レーザードップラーフロープローブを腎髄質中に配置して、血液灌流を測定する実験の結果を示す。出血性ショックの誘発は、ＭＡＰを３５ｍｍＨｇで３０分間維持するために採血することによって開始された。ＭＡＰを７０ｍｍＨｇに維持するために、ノルエピネフリン注入を行った。心血管機能に対するセンタキンの効果は、ショックの誘発前、ショック（出血）の３０分後、および蘇生の１５、３０、４５、６０、７５および９０分後に測定された。センタキンは、蘇生後のビヒクル対照と比較して、出血した雌ラットの腎血液灌流を改善し、実験の終わりまで改善された血液灌流が観察された。ノルエピネフリン誘発性血管収縮の副作用は、センタキンによって弱めることができる。
【図9】過剰失血による血液量減少性ショックの蘇生剤としてのセンタキンの第ＩＩ相試験の結果を示しており、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院する時点で（試験終了時）の収縮期血圧および拡張期血圧が測定された。中間分析は、センタキンで処置された患者の血圧上昇が、対照コホートで観察されたものよりも大きかったことを示した。これらの結果は、センタキンが効果的な蘇生剤であり、血液量減少性ショックの患者の転帰を改善したことを示した。
【図10】過剰失血による血液量減少性ショックの蘇生剤としてのセンタキンの第ＩＩ相試験の結果を示しており、すべての被験者が標準的なショック治療とともに標準的なケアを受けた。次いで、患者は、通常の生理食塩水と一緒に標準治療を受けた対照コホート、またはセンタキンと一緒に標準治療を受けたセンタキンコホートのいずれかにランダムに割り当てられた。血清クレアチニンレベルは、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院時（試験の終了時）に決定された。承認されたプロトコルによる中間分析は、血清クレアチニンレベルが対照コホートで２５．３５％、センタキン処置患者で４２．６１％減少したことを示した。データは、センタキンによる血清クレアチニンレベルの低減が、標準治療と比較して１７．２６％多いことを示した。
【図11】過剰失血による血液量減少性ショックの蘇生剤としてのセンタキンの第ＩＩ相試験の結果を示しており、すべての被験者が標準的なショック治療とともに標準的なケアを受けた。次いで、患者は、通常の生理食塩水と一緒に標準治療を受けた対照コホート、またはセンタキンと一緒に標準治療を受けたセンタキンコホートのいずれかにランダムに割り当てられた。血中尿素窒素は、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院時（試験の終了時）に決定された。承認されたプロトコルによる中間分析は、血中尿素窒素が対照コホートおよびセンタキン処置患者で同様であることを示した。
【図12】過剰失血による血液量減少性ショックの蘇生剤としてのセンタキンの第ＩＩ相試験の結果を示しており、すべての被験者が標準的なショック治療とともに標準的なケアを受けた。次いで、患者は、通常の生理食塩水と一緒に標準治療を受けた対照コホート、またはセンタキンと一緒に標準治療を受けたセンタキンコホートのいずれかにランダムに割り当てられた。糸球体濾過量は、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院時（試験の終了時）に決定された。承認されたプロトコルによる中間分析は、糸球体濾過量が対照コホートで４０．００％、センタキン処置患者で８１．５２％増加したことを示した。データは、センタキンによる糸球体濾過量の増加が、標準治療と比較して４１．５２％多いことを示した。
【発明を実施するための形態】
【0017】
低用量のセンタキン（２－［２－（４－（３－メチルフェニル）－１－ピペラジニル）］エチル－キノリン）シトレートは、出血性ショックにおいて血中乳酸を有意に減少させ、平均動脈血圧（ＭａＰ）、脈圧（ＰＰ）および心拍出量（ＣＯ）を増加させることが確立されている（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５８；非特許文献８０）。比較試験（実施例２を参照）は、センタキンと３つの異なるカテゴリーにグループ分けされた現状の蘇生剤：（ａ）乳酸加リンガー高張生理食塩水などの液体、（ｂ）ノルエピネフリンなどのアドレナリン作動薬、および（ｃ）新鮮な血液との間で実施した。（ｉ）固定圧失血のラットモデル、（ｉｉ）外傷を伴う制御不能な出血のウサギモデル、および（ｉｉｉ）大量失血のブタモデルを使用した結果は、センタキンが血液量減少性ショック後の死亡率を低減させるのに非常に効果的であることを示している（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５８；非特許文献８０）。他の蘇生剤（昇圧剤）とは異なり、センタキンは一回拍出量（ＳＶ）およびＣＯを増加させることによってＭＡＰを増加させ、心拍数および体血管抵抗（ＳＶＲ）を減少させた。
【0018】
腎臓および肺への血流の減少に伴う出血性ショック中の血漿ＥＴ－１レベルの上昇は、以前に報告されている（非特許文献１６；非特許文献２０）。出血性ショック後の肺および腎血流の減少は、ＥＴ－１のクリアランスの低減を引き起こし、血管緊張および組織血液灌流の維持に重要な役割を果たす循環血漿ＥＴ－１の増加の原因である可能性がある（非特許文献１６）。循環ＥＴ－１は、血管収縮剤としてＥＴＡ受容体に作用し、かつ血管拡張剤としてのＥＴＢ受容体に作用して、血管緊張を維持することにより、出血性ショック後の心血管系を調節することができる（非特許文献１０；非特許文献１５；非特許文献４３；非特許文献８５）。
【0019】
センタキンは現在、出血性ショックのための蘇生剤として臨床開発中である。理論に束縛されるものではないが、提案されたメカニズムは、センタキンが静脈α２Ｂアドレナリン作動受容体に作用して収縮を引き起こし、心臓への静脈還流を増加させ、中枢α２Ａアドレナリン作動受容体を刺激してＳＶＲの減少を生じさせるというものである。しかしながら、アドレナリン作動受容体はエンドセリン（ＥＴ）受容体によって調節されることが示されているため（非特許文献３１；非特許文献３８；非特許文献５７；非特許文献８４）、ＥＴ受容体が、出血性ショックにおけるセンタキンの作用機序に関与している可能性がある。
【0020】
腎障害／腎不全
急性腎不全は、電解質を失うことなく老廃物を濾過する腎臓の能力の突然の喪失である。ほとんどの場合、急性腎不全（急性腎障害またはＡＫＩとも呼ばれる）は、腎臓への血流の低減（腎前性急性腎不全）によって引き起こされるが、症例の約２０％は、腎臓に直接影響を与える感染症または毒素によるものであり（内因性ＡＲＦ）、および約１０％は腎臓の下流の遮断（腎後性閉塞）によるものである。急性腎障害（ＡＫＩ）は、救命救急患者に高い有病率を有する。早期発見は、患者が慢性腎臓疾患を発症するのを防ぎ、腎代替療法の必要性を防ぐことができる。入院患者の大多数では、急性腎不全は、虚血性および／または腎毒性の発作に起因する急性尿細管壊死によって引き起こされる。腎低灌流は、血液量減少性ショック、心原性ショックおよび敗血症性ショックによって、血管収縮薬の投与または腎血管障害によって引き起こされる。腎毒性には、造影剤およびアミノグリコシドなどの外因性毒素、ならびにミオグロビンなどの内因性毒素が含まれる。研究によると、腎組織のアポトーシスは、急性腎不全のほとんどのヒトの症例で顕著であり、アポトーシス細胞死の主な部位は遠位ネフロンである。虚血性障害の初期段階中に、アクチン細胞骨格の完全性の喪失が上皮の平坦化につながり、刷子縁の喪失、限局性細胞接触の喪失、およびその後の細胞の下にある基質からの離脱を伴う。アポトーシス性尿細管細胞死は、壊死性細胞死よりも機能的変化をより予測し得ることが示唆されている（非特許文献５３；非特許文献９０）。虚血性急性腎不全を発症するリスクのある個体には、糖尿病、基礎となる腎不全、腎炎症候群を有する個体、高齢者、アテローム性動脈硬化症を有する個体、腎毒性薬物のレシピエント、敗血症の個体、低血圧の個体、低酸素少の個体、手術前、ミオグロビン尿症－血尿、妊娠関連の急性腎不全、および肝疾患を有する個体が含まれる。
急性腎不全は、電解質を失うことなく老廃物を濾過する腎臓の能力の突然の喪失である。ほとんどの場合、急性腎不全（急性腎障害またはＡＫＩとも呼ばれる）は、腎臓への血流の低減（腎前性急性腎不全）によって引き起こされるが、症例の約２０％は、腎臓に直接影響を与える感染症または毒素によるものであり（内因性ＡＲＦ）、および約１０％は腎臓の下流の遮断（腎後性閉塞）によるものである。急性腎障害（ＡＫＩ）は、救命救急患者に高い有病率を有する。早期発見は、患者が慢性腎臓疾患を発症するのを防ぎ、腎代替療法の必要性を防ぐことができる。入院患者の大多数では、急性腎不全は、虚血性および／または腎毒性の発作に起因する急性尿細管壊死によって引き起こされる。腎低灌流は、血液量減少性ショック、心原性ショックおよび敗血症性ショックによって、血管収縮薬の投与または腎血管障害によって引き起こされる。腎毒性には、造影剤およびアミノグリコシドなどの外因性毒素、ならびにミオグロビンなどの内因性毒素が含まれる。研究によると、腎組織のアポトーシスは、急性腎不全のほとんどのヒトの症例で顕著であり、アポトーシス細胞死の主な部位は遠位ネフロンである。虚血性障害の初期段階中に、アクチン細胞骨格の完全性の喪失が上皮の平坦化につながり、刷子縁の喪失、限局性細胞接触の喪失、およびその後の細胞の下にある基質からの離脱を伴う。アポトーシス性尿細管細胞死は、壊死性細胞死よりも機能的変化をより予測し得ることが示唆されている（非特許文献５３；非特許文献９０）。虚血性急性腎不全を発症するリスクのある個体には、糖尿病、基礎となる腎不全、腎炎症候群を有する個体、高齢者、アテローム性動脈硬化症を有する個体、腎毒性薬物のレシピエント、敗血症の個体、低血圧の個体、低酸素少の個体、手術前、ミオグロビン尿症－血尿、妊娠関連の急性腎不全、および肝疾患を有する個体が含まれる。
【0021】
急性腎障害は、血清クレアチニンのベースラインよりも少なくとも５０％の増加、血清クレアチニンのベースラインよりも少なくとも０．３ｍｇ／ｄＬの絶対的な増加、ベースラインと比べて少なくとも２５％の糸球体濾過量の低減、および尿量の１時間当たりで体重１キログラム当たり０．５ｍｌ以下への減少が少なくとも６時間持続すること、からなる群から選択された少なくとも１つの状態によって特徴付けられる。
【0022】
市中急性腎不全（ＡＲＦ）の発生率は、人口１００万人あたりわずか約１００症例であり、死亡率は７％である。公表されているＡＲＦの発生率は、すべての入院の１～１３％（米国では３４×１０６／年）およびすべてのＩＣＵ入院の２０～３０％（米国では４．４×１０６／年）の範囲である。ＡＲＦのほとんどの症例は、他の病気または介入による合併症の結果として病院で発症する。最も一般的な原因は、敗血症、血液量減少、手術、造影剤、化学療法薬、ＮＳＡＩＤ、および一部の抗生物質である。
【0023】
急性腎障害は、心拍出量の低減によって引き起こされる、またはそれに関連する腎前性腎障害を伴い、腎臓への全体的な血流の低減、外傷、血液酸素化の低減、別の臓器の障害に対する反応によって引き起こされる全身毒性、心腎症候群または急性非代償性心不全に起因する体低血圧症、出血による循環量の低減、外科的処置、または肝腎症候群に起因する局所腎血流の低減につながる。
【0024】
ある研究では、急性腎障害はコホート全体の５２．６％（ｎ＝８２７０）で、若年成人の年齢層（１６～２５歳）の３９．８％で発症した。若年成人の年齢層では、糖尿病、入院の外科的理由、病気の重症度、低血圧症、および特定の薬物療法（バンコマイシンおよびカルシニューリン阻害剤）はすべて、独立して急性腎障害と関連していた。急性腎障害は、より長い入院期間、集中治療室の死亡率、退院後の死亡率の重要な予測因子であった。したがって、急性腎障害は共通の事象であり、入院期間の延長と死亡の高リスクに関連している（非特許文献２４）。
【0025】
２００１年の全米退院調査（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｄｉｓｃｈａｒｇｅ Ｓｕｒｖｅｙ）を使用して、非特許文献６１は、すべての退院の１．９％がＡＲＦのコードを示し、これは、米国の頻度６４６，０００に相当する。死亡率は、２１．３％であった。著者らは、２００１年にＳｔ．Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ’ｓ（Ｂｏｓｔｏｎ）から退院した１３，２３７人の患者全員を調査することによって研究を検証した。患者の２．６％がＡＲＦにコード化されていることが注目されたが、検査値は、患者の１２％がＡＲＦを経験したことを示した。したがって、ＡＲＦは発症の約２０％（おそらく最も深刻な症例）でのみコード化されている（非特許文献６１）。
【0026】
急性腎不全の治療は、腎臓が回復するのを待っている間に、血液量減少を逆転させ、毒素を洗い流すための液体を与えることである。場合によっては、患者が水分を保持しすぎたり、または電解質のバランスが、患者が透析を必要とするようになるほど悪化することがある。急性腎不全患者の最も一般的な死因は、心不全、敗血症、および呼吸不全である。急性腎不全から回復した患者は、その後５年と１０年で死亡および慢性腎臓疾患の確率の増加を示す。動物で有望であることが示された何十もの新しい治療法および薬物が急性腎不全患者で臨床的に試験されたが、ランダム化臨床試験で効果を示したものはない。試験された治療法のいくつかには、尿の流れを増やす利尿薬、腎臓への血流を増やすドーパミンと心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、フリーラジカルスカベンジャー、熱ショックタンパク質、ヘメオキシゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ阻害剤、プロスタグランジン、およびカルシウムチャネル遮断薬などの尿細管上皮細胞を保存する多くの細胞保護剤、および近位尿細管の回復を広げるための増殖成長因子が挙げられる（非特許文献２；非特許文献４５）。
【0027】
心臓手術、肝移植、重度のデング熱、敗血症性ショック、血液量減少性ショック、静脈内放射線造影剤、バンコマイシン、バンコマイシンと組み合わせたピペラシリン－タゾバクタム、コリスチン、ニボルマブ誘発性急性肉芽腫性尿細管間質性腎炎、抗癌剤、シスプラチン誘発性急性腎障害などの腎毒性薬、固形腫瘍の重症患者、結石誘発性の急性腎障害、横紋筋融解症の後に急性腎障害が報告されている。
【0028】
腎髄質血流に対するセンタキンの効果を決定するための研究が行われ、その結果は、重度の出血が腎髄質血流の減少を引き起こし、腎灌流を悪化させて虚血および腎不全を引き起こすことを示した（非特許文献２９；非特許文献３０）。外側腎髄質は代謝要求が高く、濾過された塩化ナトリウムの約３３％がヘンレ係蹄の太い上行脚に再吸収されることが知られている（非特許文献１８）。したがって、この領域は、過度の出血後に、低酸素または虚血性障害を起こしやすい。
【0029】
エンドセリン
エンドセリン（ＥＴ）は、２つの異なるＧタンパク質共役型受容体、ＥＴＡおよびＥＴＢに作用する内因性ペプチドであり、身体全体で多数の機能を実行する（非特許文献８；非特許文献２８）。腎臓および肺への血流の減少に伴う出血性ショック中の血漿ＥＴ－１レベルの上昇は、以前に報告されている（非特許文献１６；非特許文献２０）。出血性ショック後の肺および腎血流の減少は、ＥＴ－１のクリアランスの低減を引き起こし、血管緊張および組織血液灌流の維持に重要な役割を果たす循環血漿ＥＴ－１の増加の原因である可能性がある（非特許文献１６）。循環ＥＴ－１は、血管収縮剤としてＥＴＡ受容体に作用し、かつ血管拡張剤としてのＥＴＢ受容体に作用して、血管緊張を維持することにより、出血性ショック後の心血管系を調節することができる（非特許文献１０；非特許文献１５；非特許文献４３；非特許文献８５）。したがって、種々の組織におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の変化に対する出血性ショックおよびセンタキンによる蘇生の影響を検討することは興味深い。加えて、出血性ショックおよび蘇生が、全身性炎症反応のリスク増加に寄与し（非特許文献１７）、ＥＴ－１が敗血症および出血性ショック後の炎症において極めて重要な役割を果たす（非特許文献５６）ことが知られている。
エンドセリン（ＥＴ）は、２つの異なるＧタンパク質共役型受容体、ＥＴＡおよびＥＴＢに作用する内因性ペプチドであり、身体全体で多数の機能を実行する（非特許文献８；非特許文献２８）。腎臓および肺への血流の減少に伴う出血性ショック中の血漿ＥＴ－１レベルの上昇は、以前に報告されている（非特許文献１６；非特許文献２０）。出血性ショック後の肺および腎血流の減少は、ＥＴ－１のクリアランスの低減を引き起こし、血管緊張および組織血液灌流の維持に重要な役割を果たす循環血漿ＥＴ－１の増加の原因である可能性がある（非特許文献１６）。循環ＥＴ－１は、血管収縮剤としてＥＴＡ受容体に作用し、かつ血管拡張剤としてのＥＴＢ受容体に作用して、血管緊張を維持することにより、出血性ショック後の心血管系を調節することができる（非特許文献１０；非特許文献１５；非特許文献４３；非特許文献８５）。したがって、種々の組織におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の変化に対する出血性ショックおよびセンタキンによる蘇生の影響を検討することは興味深い。加えて、出血性ショックおよび蘇生が、全身性炎症反応のリスク増加に寄与し（非特許文献１７）、ＥＴ－１が敗血症および出血性ショック後の炎症において極めて重要な役割を果たす（非特許文献５６）ことが知られている。
【0030】
エンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニスト
本開示は、本明細書に開示される組成物および方法におけるエンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニストの使用を企図している。様々な実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニストは、Ｎ－スクシニル－［Ｇｌｕ９、Ａｌａ１１，１５］エンドセリン１（ＩＲＬ－１６２０）、ＢＱ－３０２０、［Ａｌａ１，３，１１，１５］－エンドセリン、サラフォトキシンＳ６ｃ、およびエンドセリン３からなる群から選択される。
本開示は、本明細書に開示される組成物および方法におけるエンドセリンＢ（ＥＴＢ）受容体アゴニストの使用を企図している。様々な実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニストは、Ｎ－スクシニル－［Ｇｌｕ９、Ａｌａ１１，１５］エンドセリン１（ＩＲＬ－１６２０）、ＢＱ－３０２０、［Ａｌａ１，３，１１，１５］－エンドセリン、サラフォトキシンＳ６ｃ、およびエンドセリン３からなる群から選択される。
【0031】
ＩＲＬ－１６２０Ｎ－スクシニル－［Ｇｌｕ９、Ａｌａ１１，１５］エンドセリン１］は、アミノ酸配列Ｓｕｃ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｌａ－Ｖａｌ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ａｓｐ－Ｉｌｅ－Ｉｌｅ－Ｔｒｐ（配列番号１）を有する、１８２１．９の分子量のＥＴ－１の類似体である。ＩＲＬ－１６２０は、ＥＴＡ受容体よりＥＴＢに対して約１２０，０００倍より選択的にする、それぞれ１．９μＭおよび１６ｐＭでのＥＴＡおよびＥＴＢ受容体に対するＫｉ値を有する、ＥＴＢ受容体に対する強力かつ特異的アゴニストである。ＩＲＬ－１６２０は、肺、肝臓、腎臓、胃腸、皮膚、および内分泌系におけるＥＴＢ受容体の生物学的作用を決定するために、多くの研究で使用されてきた（非特許文献７；非特許文献２２；非特許文献１０１；非特許文献５９；非特許文献６６；非特許文献６７）。
【0032】
本開示によれば、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、０．０００１～０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。さらなる実施形態では、エンドセリン－Ｂ受容体アゴニストは、約０．０００１～約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００１～約０．４ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００１～約０．３ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００１～約０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００１～約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１～約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１～約０．４ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１～約０．３ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１～約０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．００１～約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．４ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約０．１ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００５～約０．５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００５～約０．４ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００５～約０．３ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００５～約０．２ｍｇ／ｋｇ、または約０．０００５～約０．１ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与される。追加の実施形態において、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、少なくとも約０．０００１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０００２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０００５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．００１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．００２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．００５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．００７ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０３ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０４ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０５ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０６ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０７ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０８ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．０９ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．２ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．３ｍｇ／ｋｇ、または少なくとも約０．４ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。さらに他の実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０００２ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０００５ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．００１ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．００２ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．００５ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．００７ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０１ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０２ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０３ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０４ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０６ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０７ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０８ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．０９ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．１ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．２ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．３ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．４ｍｇ／ｋｇ未満、または約０．５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。いくつかの実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、約０．１～約０．６μｇ／ｋｇ、または約０．１～約０．５μｇ／ｋｇ、または約０．１～約０．４μｇ／ｋｇ、または約０．１～約０．３μｇ／ｋｇの用量で投与される。さらなる実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０μｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0033】
ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、様々な実施形態では、１～６時間の間隔で繰り返し患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、１～５時間ごと、または１～４時間ごと、または１～２時間ごと、または１時間ごと、または２時間ごと、または３時間ごと、または４時間ごと、または５時間ごと、または６時間ごとに患者に投与される。さらなる実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、２～５日ごと、または３～５日ごと、または２日ごと、または３日ごと、または４日ごと、または５日ごとに患者に投与される。いくつかの実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）は、１日１回、２回、３回、４回、または５回投与される。
【0034】
センタキン
アルファ２－受容体アゴニストおよび心血管活性剤であるセンタキンは、陽性変力作用をもたらし、摘出され灌流されたウサギの心臓の心室収縮を増加させることが示されている（非特許文献８）。センタキンの直接的または間接的な陽性変力作用は、心拍出量（ＣＯ）の増加につながる可能性がある。出血性ショックのブタモデルで実施された研究では、センタキン（０．０１５ｍｇ／ｋｇ）は、輸液蘇生期に投与されると、ＣＯを増加させ、体血管抵抗（ＳＶＲ）を低減させ、蘇生のためにより少ない輸液が必要となり、乳酸加リンガー（ＬＲ）と比較して有意に良好な生存率をもたらすことが判明した（非特許文献７９；非特許文献８０）。別の研究では、失血の５分の１の量で投与されたセンタキンは、出血したラットの平均動脈血圧（ＭＡＰ）を長期間維持し、生存率を改善した（非特許文献３９）。出血性ショックのラットモデルでは、センタキンはＣＯを有意に改善し、血中乳酸を減少させ、かつ生存率を改善した（非特許文献３３；非特許文献５８）。センタキンは、約１時間の半減期および高い分布容積を有する（非特許文献３２；非特許文献７４；非特許文献７５）。マウス、ラット、およびイヌの毒性学的研究とともに、化学、製造、および管理が成功したことにより、実験的センタキンのヒト第Ｉ相試験が成功裏に完了した。この試験は２４人のヒト対象に実施され、センタキンは安全で忍容性が高いことが判明した（非特許文献３２）。現在、出血性ショックのヒトを対象とした多施設第ＩＩ相試験が進行中であるＣＴＲＩ／２０１７／０３／００８１８４）。
アルファ２－受容体アゴニストおよび心血管活性剤であるセンタキンは、陽性変力作用をもたらし、摘出され灌流されたウサギの心臓の心室収縮を増加させることが示されている（非特許文献８）。センタキンの直接的または間接的な陽性変力作用は、心拍出量（ＣＯ）の増加につながる可能性がある。出血性ショックのブタモデルで実施された研究では、センタキン（０．０１５ｍｇ／ｋｇ）は、輸液蘇生期に投与されると、ＣＯを増加させ、体血管抵抗（ＳＶＲ）を低減させ、蘇生のためにより少ない輸液が必要となり、乳酸加リンガー（ＬＲ）と比較して有意に良好な生存率をもたらすことが判明した（非特許文献７９；非特許文献８０）。別の研究では、失血の５分の１の量で投与されたセンタキンは、出血したラットの平均動脈血圧（ＭＡＰ）を長期間維持し、生存率を改善した（非特許文献３９）。出血性ショックのラットモデルでは、センタキンはＣＯを有意に改善し、血中乳酸を減少させ、かつ生存率を改善した（非特許文献３３；非特許文献５８）。センタキンは、約１時間の半減期および高い分布容積を有する（非特許文献３２；非特許文献７４；非特許文献７５）。マウス、ラット、およびイヌの毒性学的研究とともに、化学、製造、および管理が成功したことにより、実験的センタキンのヒト第Ｉ相試験が成功裏に完了した。この試験は２４人のヒト対象に実施され、センタキンは安全で忍容性が高いことが判明した（非特許文献３２）。現在、出血性ショックのヒトを対象とした多施設第ＩＩ相試験が進行中であるＣＴＲＩ／２０１７／０３／００８１８４）。
【0035】
センタキンに加えて、他のα２アドレナリン作動薬は、本開示の方法において有用であることが企図される。例えば、限定されるものではないが、本開示は、センタキン、クロニジン、グアンファシン、グアナベンズ、グアノキサベンズ、グアネチジン、キシラジン、チザニジン、メチルドパ、ファドルミジン、アミデフリン、アミトラズ、アニソダミン、アプラクロニジン、ブリモニジン、シラゾリン、デトミジン、デクスメデトミジン、エピネフリン、エルゴタミン、エチレフリン、インダニジン、ロフェキシジン、メデトミジン、メフェンテルミン、メタラミノール、メトキサミン、ミバゼロル、ナファゾリン、ノルエピネフリン、ノルフェネフリン、オクトパミン、オキシメタゾリン、フェニルプロパノールアミン、リルメニジン、ロミフィジン、シネフリン、タリペキソール、これらの塩、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるα２アドレナリン作動薬の使用を企図する。
【0036】
α２アドレナリン作動薬の塩もまた、本発明の組成物および方法において使用することができる。好適な塩の例には、硝酸、ホウ酸、塩酸、臭化水素酸塩、硫酸、およびリン酸などの無機酸、ならびにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、およびクエン酸などの有機酸で形成される酸付加塩が含まれるが、これらに限定されない。α２アドレナリン作動薬の塩の非限定的な例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸、グリセリンリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、イセチオン酸塩、サリチル酸塩、メタンスルホン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ウンデカン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンジスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
好ましい塩は、例えば、クエン酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、コハク酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、アスコルビン酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩、ジグリコネート、およびアスパラギン酸塩などの有機酸の塩である。より好ましい塩は、クエン酸塩、乳酸塩、または酒石酸塩である。
【0038】
遊離塩基としてのセンタキンは、治療される個体の体重１ｋｇ当たり０．００１～０．０５ｍｇ未満（ｍｇ／ｋｇ）、好ましくは約０．００３～約０．０４ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．００５～約０．０３ｍｇ／ｋｇの量で投与されてもよい。より具体的には、遊離塩基としてのセンタキンは、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１０、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２０、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３０、０．０３１、０．０３２、０．０３３、０．０３４、０．０３５、０．０３６、０．０３７、０．０３８、０．０３９、０．０４０、０．０４１、０．０４２、０．０４３、０．０４４、０．０４５、０．０４６、０．０４７、０．０４８、または０．０４９ｍｇ／ｋｇ、およびその中の全ての範囲ならびに部分範囲の用量で投与される。
【0039】
センタキンはまた、本方法の利益を達成するために、塩、例えばクエン酸センタキンの形態で投与することができる。クエン酸センサキンは、約０．０００１～約１．５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．０００２～約０．８ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０００４～約０．５ｍｇ／ｋｇの量で投与される。いくつかの実施形態では、クエン酸センタキンは、約０．０００１～約１．０ｍｇ／ｋｇの量で投与される。より具体的には、クエン酸センタキンは、以下の用量のほぼいずれかまたは少なくともほぼいずれかのｍｇ／ｋｇの用量で（クエン酸センタキンとして）投与することができる：０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１０、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２０、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５、０．０２６、０．０２７、０．０２８、０．０２９、０．０３０、０．０３１、０．０３２、０．０３３、０．０３４、０．０３５、０．０３６、０．０３７、０．０３８、０．０３９、０．０４０、０．０４１、０．０４２、０．０４３、０．０４４、０．０４５、０．０４６、０．０４７、０．０４８、０．０４９、０．０５、０．０５１、０．０５２、０．０５３、０．０５４、０．０５５、０．０６、０．０６５、０．０７、０．０７５、０．０８、０．０８５、０．０９、０．０９５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５、およびその中のすべての範囲ならびに部分範囲。
【0040】
いくつかの実施形態では、α２アドレナリン作動薬（例えば、センタキンまたはその塩）は、蘇生液と同時投与される。蘇生液は、コロイド溶液、晶質溶液、血液、血液成分、または代用血液であり得る。コロイド溶液および晶質溶液の非限定的な例は、乳酸加リンゲル液、生理食塩水、高張生理食塩水、アルブミン溶液、デキストラン溶液、ヒドロキシエチルデンプン溶液、ゼラチン溶液、およびデンプン溶液である。血液成分の例は、血漿、赤血球、白血球、血小板、凝固因子、タンパク質、およびホルモンである。代用血液は、ヘモグロビンベースの代用血液またはペルフルオロカーボンベースの代用血液であり得る。
【0041】
蘇生液は、個体が失った血液、血漿、水などの液体の体積量の最大３倍の体積量で投与することができる。いくつかの実施形態では、蘇生液は、個体によって失われた液体の体積量よりも少ない体積量まで、例えば、失われた液体の体積量の５％、好ましくは１０％または２０％、および最大１００％まで投与される。
【0042】
組成物／投与
いくつかの態様では、本開示は、治療有効量のＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）を含む、腎障害または腎不全を治療するための組成物を提供し、治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量のセンタキンまたはその塩をさらに含み、治療有効量のセンタキンまたはその塩は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、センタキン塩は、クエン酸センタキンである。
いくつかの態様では、本開示は、治療有効量のＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）を含む、腎障害または腎不全を治療するための組成物を提供し、治療有効量は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量のセンタキンまたはその塩をさらに含み、治療有効量のセンタキンまたはその塩は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、センタキン塩は、クエン酸センタキンである。
【0043】
いくつかの態様では、本開示は、治療有効量のセンタキンまたはその塩を含む、急性腎機能低下または腎障害を治療するための組成物を提供し、治療有効量のセンタキンまたはその塩は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～１．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施形態では、センタキン塩は、クエン酸センタキンである。
【0044】
本開示の医薬組成物は、それらの意図された目的を達成するために有効成分が有効量で投与されるものを含む。より具体的には、「治療有効量」とは、腎障害もしくは腎不全を治療または予防するために、あるいは急性腎機能低下を治療するために有効な量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内にある。
【0045】
「治療有効量」とは、所望の効果の達成をもたらす活性剤の量を指す。このような活性剤の毒性および治療効果は、細胞培養物または実験動物における標準的な医薬手順によって、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定することによって、決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の比として表される。高い治療指数が好ましい。このようなデータから得られたデータは、ヒトで使用するための様々な投与量を処方する際に使用することができる。活性剤の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ５０を含むある範囲の循環化合物濃度内に収まっている。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。
【0046】
本明細書に開示される方法でヒトに投与する場合、センタキンの経口投与量は、平均的な成人患者（７０ｋｇ）に対して１日当たり約０．０１～約２００ｍｇであり、典型的には１日当たり２～３回の投与に分けられる。したがって、典型的な成人患者の場合、個々の錠剤またはカプセルは、１日１回または数回の単回または複数回投与での投与のために、適切な医薬的に許容されるビヒクルまたは担体中に約０．１～約２００ｍｇのセンタキンを含有する。静脈内、頬側、または舌下投与の投与量は、通常、必要に応じて単回投与当たり約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇである。実際には、医師は、個々の患者に最も好適である実際の投与レジメンを決定し、投与量は、特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上記の投与量は平均的な場合の例示であるが、より高いまたはより低い投与量に利点がある個々の場合もあり得、その場合も本開示の範囲内である。
【0047】
本明細書でさらに詳細に上述のように、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）の投与量は、平均的な成人患者に対して約０．１～約０．６μｇ／ｋｇであり、典型的には１日当たり１、２、または３回投与される。いくつかの実施形態では、ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）の用量は、約０．３μｇ／ｋｇであり、１日当たり１、２、または３回投与される。ＥＴＢ受容体アゴニスト（例えば、ＩＲＬ－１６２０）の投与量は、好適な医薬的に許容されるビヒクルまたは担体中にある。実際には、医師は、個々の患者に最も好適である実際の投与レジメンを決定し、投与量は、特定の患者の年齢、体重、および反応によって変化する。上記の投与量は平均的な場合の例示であるが、より高いまたはより低い投与量に利点がある個々の場合もあり得、その場合も本開示の範囲内である。
【0048】
本発明の活性剤は、単独で、または意図された投与経路および標準的な医薬的慣行に関して選択された医薬担体と混合して投与することができる。したがって、本開示に従った使用のための医薬組成物は、医薬的に使用することができる、本活性剤の加工を容易にするための賦形剤と助剤とを含む１つ以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の様式で製剤化することができる。
【0049】
これらの医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠形成（ｄｒａｇｅｅ－ｍａｋｉｎｇ）、乳化、カプセル化、封入（ｅｎｔｒａｐｐｉｎｇ）、または凍結乾燥プロセスによって製造することができる。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。治療有効量の本活性剤を経口投与する場合、組成物は、典型的には、錠剤、カプセル剤、粉剤、溶液剤、またはエリキシル剤の形態にある。錠剤形態で投与する場合、組成物はさらにゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含有することができる。錠剤、カプセル剤、および粉剤は、約５％～約９５％の本発明の活性剤、および好ましくは約２５％～約９０％の本発明の活性剤を含有する。液体形態で投与する場合、水、石油、または動物起源もしくは植物起源の油などの液体担体を添加することができる。組成物の液体形態は、生理食塩水溶液、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはグリコールをさらに含有することができる。液体形態で投与する場合、組成物は、約０．５重量％～約９０重量％、および好ましくは約１重量％～約５０重量％の活性剤を含有する。
【0050】
治療有効量の活性剤を静脈内、皮膚、または皮下注射により投与する場合、組成物は、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性などを考慮して、そのような非経口的に許容される溶液を調製することは、当該技術分野の技術範囲内である。静脈内、皮膚、または皮下注射のための好ましい組成物は、典型的には、本開示の化合物に加えて、等張性ビヒクルを含有する。
【0051】
好適な活性剤は、当技術分野において周知の医薬的に許容される担体と容易に組み合わせることができる。治療される患者による経口摂取のために、そのような担体により、活性剤を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能となる。経口使用のための医薬組成物は、活性剤に固体賦形剤を添加し、任意に、得られた混合物を粉砕し、所望する場合には好適な補助剤を添加した後に顆粒混合物を加工し、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。好適な賦形剤には、例えば、充填剤およびセルロース調製物が含まれる。所望される場合、崩壊剤を添加することができる。
【0052】
本活性剤は、注射によって、例えば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、例えばアンプルまたは複数回用量用容器中において防腐剤が添加された単位剤形で提供することができる。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液剤、またはエマルジョン剤などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有することができる。
【0053】
非経口投与用の薬学的組成物は、水溶性形態の活性剤の水溶液を含む。さらに、本活性剤の懸濁剤は、適切な油性注入用懸濁液剤として調製することができる。好適な親油性溶媒またはビヒクルには、脂肪油または合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注入用懸濁剤は、懸濁剤の粘度を高める物質を含有することができる。任意に、懸濁剤はまた、好適な安定剤、または化合物の溶解度を高めて高濃度溶液の調製を可能にする薬剤を含むことができる。あるいは、本開示の組成物は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない滅菌水で構成するための粉末形態であることができる。
【0054】
本活性剤は、例えば、従来の坐剤基剤を含有する坐剤または停留注腸などの直腸用組成物に製剤化することもできる。前に記載された製剤に加えて、本活性剤はまた、デポー調製物として製剤化することができる。そのような長時間作用型製剤は、移植（例えば皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注入により投与することができる。したがって、例えば、本活性剤は、好適なポリマー材料もしくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂を用いて、またはやや難溶性の誘導体として、例えば、やや難溶性の塩として製剤化することができる。
【0055】
特に、本活性剤は、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含有する錠剤の形態で、または単独もしくは賦形剤との混合物のいずれかとして、カプセル剤もしくはオブール剤（ｏｖｕｌｅｓ）の形態で、または香味剤もしくは着色剤を含むエリキシル剤または懸濁剤の形態で、経口、口腔内、または舌下投与することができる。そのような液体製剤は懸濁化剤などの薬学的に許容される添加剤を用いて調製することができる。活性剤はまた、非経口的に、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、髄腔内、大槽内、または冠状動脈内に注射することができる。非経口投与の場合、活性剤は、溶液を血液と等張性にするために、他の物質、例えば、塩、またはマンニトールもしくはグルコースなどの単糖を含むことができる滅菌水溶液の形態で最良に使用される。
【0056】
獣医学的使用の場合、活性剤は、通常の獣医学的慣行に従って、適切に許容される製剤として投与される。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定できる。
【0057】
［実施例］
以下の実施例は、出血性ショックのラットモデルにおける血漿ＥＴ－１の濃度および炎症メーカーとともに、種々の組織におけるエンドセリン（ＥＴＡおよびＥＴＢ）受容体に対する出血性ショックおよびセンタキンによる蘇生の影響を検討した。
以下の実施例は、出血性ショックのラットモデルにおける血漿ＥＴ－１の濃度および炎症メーカーとともに、種々の組織におけるエンドセリン（ＥＴＡおよびＥＴＢ）受容体に対する出血性ショックおよびセンタキンによる蘇生の影響を検討した。
【0058】
エンドセリン－１（ＥＴ－１）は、ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体に作用し、出血性ショック（ショック）に関与している。ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の発現に対するショックおよび蘇生の影響は、高張生理食塩水（生理食塩水）またはセンタキンを利用して研究した。ラットに麻酔をかけ、左大腿動脈に圧力カテーテルを留置し、平均動脈血圧（ＭＡＰ）を３５ｍｍＨｇに３０分間上昇させるために右大腿動脈から血液を採取し、蘇生を行い、９０分後に生化学的推定のためにサンプルを収集するために犠牲にした。センタキンによる蘇生は、血中乳酸を減少させ、かつＭＡＰを増加させた。ＥＴＡまたはＥＴＢ受容体のタンパク質レベルは、ショックまたは蘇生後の脳、心臓、肺および肝臓で変化しなかった。腹部大動脈では、ショックによりＥＴＡの発現が増加し（１４０％）、生理食塩水およびセンタキンによって減弱され、ＥＴＢの発現は、ショック後も変化しなかったが、センタキンによって増加した（７９％）。腎髄質では、ＥＴＡの発現はショック後も変化しなかったが、センタキンによって減少し（－６１％）、ショックによりＥＴＢの発現が減少（－３４％）し、この減少は、センタキンによって完全に減弱されたが、生理食塩水では減弱されなかった。大動脈および腎髄質におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体におけるショック誘導変化は、センタキンによって逆転され、その有効性に寄与し得る。
【0059】
実施例１
方法
動物オスのスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（３４０～３８０ｇ）（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、使用前に、制御された温度（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）および光（午前６：００～午後６：００）の部屋で少なくとも４日間収容した。食餌および水は、絶えず利用可能にした。動物の管理および実験手順の使用は、ミッドウエスタン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。すべての麻酔および外科的処置は、動物実験委員会によって確立されたガイドラインに準拠していた。
方法
動物オスのスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（３４０～３８０ｇ）（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、使用前に、制御された温度（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）および光（午前６：００～午後６：００）の部屋で少なくとも４日間収容した。食餌および水は、絶えず利用可能にした。動物の管理および実験手順の使用は、ミッドウエスタン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。すべての麻酔および外科的処置は、動物実験委員会によって確立されたガイドラインに準拠していた。
【0060】
薬物および化学薬品
クエン酸センタキン（ＰＭＺ－２０１０）は、Ｐｈａｒｍａｚｚ Ｉｎｄｉａ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｇｒｅａｔｅｒ Ｎｏｉｄａ，Ｉｎｄｉａで合成された。ウレタン（エチルカルバメート）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、米国薬局方注射用高張生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ，Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ ＩＬ，ＵＳＡ）および米国薬局方注射用ヘパリンナトリウム（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。エンドセリン－１酵素免疫測定アッセイキット（カタログ番号９００－０２０Ａ，Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＲＣ００６１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＲＣ０１０１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＴＮＦα ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＲ３ＴＮＦＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、様々な推定のために使用した。
クエン酸センタキン（ＰＭＺ－２０１０）は、Ｐｈａｒｍａｚｚ Ｉｎｄｉａ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｇｒｅａｔｅｒ Ｎｏｉｄａ，Ｉｎｄｉａで合成された。ウレタン（エチルカルバメート）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、米国薬局方注射用高張生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ，Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ ＩＬ，ＵＳＡ）および米国薬局方注射用ヘパリンナトリウム（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。エンドセリン－１酵素免疫測定アッセイキット（カタログ番号９００－０２０Ａ，Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）、ＩＬ－６ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＲＣ００６１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＩＬ－１０ ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＫＲＣ０１０１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＴＮＦα ＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＥＲ３ＴＮＦＡ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を、様々な推定のために使用した。
【0061】
心血管応答の決定
動物を、等張食塩水に溶解したウレタンで麻酔した。ウレタンは、腹腔内注射により体重１ｋｇ当たり１．５ｇの用量で投与した。ウレタンは、心臓血管系および呼吸器系の抑制作用を最小限に抑えて長時間（８～１０時間）麻酔をかけるため、麻酔剤として選択した。これは、心血管反射の保存によって特徴付けられるレベルの外科的麻酔を生じさせる（Ｍａｇｇｉ ａｎｄ Ｍｅｌｉ １９８６）。簡単に言えば、麻酔されたラットは、制御された加熱パッドを備えた外科用ボード上に固定化された。血液のＰｏ２、Ｐｃｏ２およびｐＨは、げっ歯類の人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）に接続された気管切開カニューレを使用して維持した。左心室の性能を測定するために、右頸動脈を露出させた。頸動脈の近位端の周りに外科用縫合糸（Ｄｅｋｎａｔｅｌ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）を固定し、超小型圧力容積（Ｐ－Ｖ）カテーテルＳＰＲ－８６９（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を動脈の近位端付近に作成した小さな切開部から挿入した。カテーテルのＰ－Ｖ端子を、ＰＥＣ－４ＤおよびＣＥＣ－４Ｂケーブルを通してＭＰＶＳ－３００ Ｐ－Ｖユニットに接続し、Ｐ－Ｖシグナルを取得するために左心室に進めた。シグナルを、ＭＰＶＳ－３００ Ｐ－Ｖユニット（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システム（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して継続的に取得した（１０００Ｓ－１）。ＭＡＰおよびＨＲを、ＡＥＣ－１０Ｃコネクタを介してＭＬ２２１ブリッジ増幅器（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続された圧力カテーテルＳＰＲ－３２０（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で左大腿動脈にカニューレを挿入することによって測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システムを使用してシグナルを取得した（１０００Ｓ－１）（非特許文献３３；非特許文献７７）。左大腿静脈にＰＥ５０チューブ（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を使用してカニューレを挿入し、蘇生のために固定した。
動物を、等張食塩水に溶解したウレタンで麻酔した。ウレタンは、腹腔内注射により体重１ｋｇ当たり１．５ｇの用量で投与した。ウレタンは、心臓血管系および呼吸器系の抑制作用を最小限に抑えて長時間（８～１０時間）麻酔をかけるため、麻酔剤として選択した。これは、心血管反射の保存によって特徴付けられるレベルの外科的麻酔を生じさせる（Ｍａｇｇｉ ａｎｄ Ｍｅｌｉ １９８６）。簡単に言えば、麻酔されたラットは、制御された加熱パッドを備えた外科用ボード上に固定化された。血液のＰｏ２、Ｐｃｏ２およびｐＨは、げっ歯類の人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）に接続された気管切開カニューレを使用して維持した。左心室の性能を測定するために、右頸動脈を露出させた。頸動脈の近位端の周りに外科用縫合糸（Ｄｅｋｎａｔｅｌ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ，ＮＣ）を固定し、超小型圧力容積（Ｐ－Ｖ）カテーテルＳＰＲ－８６９（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を動脈の近位端付近に作成した小さな切開部から挿入した。カテーテルのＰ－Ｖ端子を、ＰＥＣ－４ＤおよびＣＥＣ－４Ｂケーブルを通してＭＰＶＳ－３００ Ｐ－Ｖユニットに接続し、Ｐ－Ｖシグナルを取得するために左心室に進めた。シグナルを、ＭＰＶＳ－３００ Ｐ－Ｖユニット（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システム（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して継続的に取得した（１０００Ｓ－１）。ＭＡＰおよびＨＲを、ＡＥＣ－１０Ｃコネクタを介してＭＬ２２１ブリッジ増幅器（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続された圧力カテーテルＳＰＲ－３２０（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で左大腿動脈にカニューレを挿入することによって測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システムを使用してシグナルを取得した（１０００Ｓ－１）（非特許文献３３；非特許文献７７）。左大腿静脈にＰＥ５０チューブ（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を使用してカニューレを挿入し、蘇生のために固定した。
【0062】
動脈血ガスおよび塩基欠乏の決定
ベースラインの動脈血ｐＨ、Ｐｏ２、Ｐｃｏ２、Ｎａ＋、Ｋ＋、および乳酸を、ショックの誘発前、ショックの誘発から３０分後、およびビヒクルまたはセンタキン蘇生から３０分後と６０分後にモニターした。血液サンプル（０．１５ｍｌ）を、血液ガスサンプリングシリンジ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅａｗｏｏｄ，ＫＳ）を使用して動脈カニューレから採取し、ｐＨＯｘウルトラアナライザー（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析した。塩基欠乏は、次の式を使用して計算した（非特許文献１９；非特許文献７８）：
ＳＢＤ＝０．９２８７×［ＨＣＯ３ －－２４．４＋１４．８３×（ｐＨ－７．４）］
ベースラインの動脈血ｐＨ、Ｐｏ２、Ｐｃｏ２、Ｎａ＋、Ｋ＋、および乳酸を、ショックの誘発前、ショックの誘発から３０分後、およびビヒクルまたはセンタキン蘇生から３０分後と６０分後にモニターした。血液サンプル（０．１５ｍｌ）を、血液ガスサンプリングシリンジ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅａｗｏｏｄ，ＫＳ）を使用して動脈カニューレから採取し、ｐＨＯｘウルトラアナライザー（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析した。塩基欠乏は、次の式を使用して計算した（非特許文献１９；非特許文献７８）：
ＳＢＤ＝０．９２８７×［ＨＣＯ３ －－２４．４＋１４．８３×（ｐＨ－７．４）］
【0063】
出血性ショックの誘発
出血は、ＭＡＰが３５ｍｍＨｇに達するまで、約０．５～１ｍＬ／分の速度で大腿動脈から採血することによって誘発させた。このＭＡＰを、必要に応じてさらに採血することにより３０分間維持した。本試験で使用された出血性ショックモデルは、管理可能な圧力出血の確立されたげっ歯類モデルである（非特許文献１４；非特許文献３４；非特許文献３５）。失血量は各ラットで約８．０ｍｌであり、様々な群で同様であり、総血液量の約４０％に相当する。測定されたヘマトクリット値は、様々な群で類似していた。採血時間は約１５分であった。
出血は、ＭＡＰが３５ｍｍＨｇに達するまで、約０．５～１ｍＬ／分の速度で大腿動脈から採血することによって誘発させた。このＭＡＰを、必要に応じてさらに採血することにより３０分間維持した。本試験で使用された出血性ショックモデルは、管理可能な圧力出血の確立されたげっ歯類モデルである（非特許文献１４；非特許文献３４；非特許文献３５）。失血量は各ラットで約８．０ｍｌであり、様々な群で同様であり、総血液量の約４０％に相当する。測定されたヘマトクリット値は、様々な群で類似していた。採血時間は約１５分であった。
【0064】
実験計画
出血性ショックにおける心血管系および血漿サイトカインに対するセンタキンの蘇生効果を決定するために、ラットをランダムに５つの群に分けた：群１：シャム対照（非出血）（ｎ＝５）、群２：蘇生なしの出血（ｎ＝５）、群３：出血およびそれに続く３％の高張生理食塩水（ビヒクル）による蘇生（ｎ＝５）、群４：出血およびそれに続くビヒクルとセンタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）による蘇生（ｎ＝５）、群５：出血およびそれに続くビヒクルとセンタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）による蘇生（ｎ＝５）。蘇生は、輸液ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ／Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｐｕｍｐ，Ｍｉｌｌｉｓ，ＭＡ）を使用して大腿静脈を通して静脈内注入（１ｍＬ／分）として出血性ショックの誘発から３０分後に開始した。生化学的推定のために、血液サンプルを蘇生から３０分で収集し、６０分まで心血管パラメータをモニターし、その後動物を犠牲にした。蘇生液の量は、失血の量と等しく保った。これは典型的な人間の蘇生法を表すものではないが、この量は交絡因子を最小限に抑え、センタキンの蘇生効果をより正確に決定できるように選択された。
出血性ショックにおける心血管系および血漿サイトカインに対するセンタキンの蘇生効果を決定するために、ラットをランダムに５つの群に分けた：群１：シャム対照（非出血）（ｎ＝５）、群２：蘇生なしの出血（ｎ＝５）、群３：出血およびそれに続く３％の高張生理食塩水（ビヒクル）による蘇生（ｎ＝５）、群４：出血およびそれに続くビヒクルとセンタキン（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）による蘇生（ｎ＝５）、群５：出血およびそれに続くビヒクルとセンタキン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）による蘇生（ｎ＝５）。蘇生は、輸液ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ／Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ Ｐｕｍｐ，Ｍｉｌｌｉｓ，ＭＡ）を使用して大腿静脈を通して静脈内注入（１ｍＬ／分）として出血性ショックの誘発から３０分後に開始した。生化学的推定のために、血液サンプルを蘇生から３０分で収集し、６０分まで心血管パラメータをモニターし、その後動物を犠牲にした。蘇生液の量は、失血の量と等しく保った。これは典型的な人間の蘇生法を表すものではないが、この量は交絡因子を最小限に抑え、センタキンの蘇生効果をより正確に決定できるように選択された。
【0065】
血漿中のＥＴ－１レベルの決定
出血とそれに続く心肺蘇生後の血漿ＥＴ－１レベルの変化を分析するために、蘇生の３０分後に様々な群のラットから血液サンプルを収集し、アプロチニン（血液の５００ＫＩＵ．ｍＬ－１）を含有する冷却ＥＤＴＡチューブに収集した（血液の１ｍｇ．ｍｌ－１）。血液サンプルを、１，６００×ｇで１５分間、０℃で遠心分離し、酵素免疫測定法を使用して血漿ＥＴ－１レベルを推定した。簡単に言えば、血漿サンプルおよび標準を、ＥＴ－１に特異的なモノクローナル抗体でコーティングされたウェルに添加した。次いで、２４時間のインキュベーション後にプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体を添加した。３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、青色を生じる３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン基質の溶液を添加した。塩酸（１Ｎ）を添加して基質反応を停止し、得られた黄色を、ＤＴＸ８００マルチモード検出器を使用して４５０ｎｍで読み取り、データをマルチモード検出ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で分析した。測定された光学密度は、ＥＴ－１の濃度に正比例する（非特許文献５７）。
出血とそれに続く心肺蘇生後の血漿ＥＴ－１レベルの変化を分析するために、蘇生の３０分後に様々な群のラットから血液サンプルを収集し、アプロチニン（血液の５００ＫＩＵ．ｍＬ－１）を含有する冷却ＥＤＴＡチューブに収集した（血液の１ｍｇ．ｍｌ－１）。血液サンプルを、１，６００×ｇで１５分間、０℃で遠心分離し、酵素免疫測定法を使用して血漿ＥＴ－１レベルを推定した。簡単に言えば、血漿サンプルおよび標準を、ＥＴ－１に特異的なモノクローナル抗体でコーティングされたウェルに添加した。次いで、２４時間のインキュベーション後にプレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識モノクローナル抗体を添加した。３０分間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、青色を生じる３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン基質の溶液を添加した。塩酸（１Ｎ）を添加して基質反応を停止し、得られた黄色を、ＤＴＸ８００マルチモード検出器を使用して４５０ｎｍで読み取り、データをマルチモード検出ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｈａｒｂｏｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で分析した。測定された光学密度は、ＥＴ－１の濃度に正比例する（非特許文献５７）。
【0066】
ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の発現の推定
いくつかの修正を加えたウエスタンブロッティング手技（非特許文献１２；非特許文献６０）を使用して、ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の発現を決定した。心血管実験の完了後、動物を犠牲にし、臓器（脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、腹部大動脈）を直ちに解剖し、ドライアイス上でフラッシュ凍結し、さらなる分析のために－８０℃で保存した。組織を１０×（ｗ／ｖ）ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１．０％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％のグリセロール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸四ナトリウム塩（ＥＧＴＡ）、ホスファターゼ阻害剤および完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））を用いて均質化した。タンパク質を、可溶化された形で単離し、濃度を、フォリン－チオカルトの（Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ）フェノール試薬（非特許文献６３）により測定した。緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（６０μｇ）で変性させ、１０％のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離し、次いで、ニトロセルロースメンブレンに転写した後にトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）ブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で膜をブロッキングした。膜を１× ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、ウサギポリクローナル抗ＥＴＡ受容体（ａｂ８５１６３，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１：１０００）または抗ＥＴＢ受容体（ａｂ１１７５２９，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１：１０００）またはマウスモノクローナル抗β－アクチン（ａ１９７８，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体ヤギ抗ウサギ（ｓｃ２００４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，１：２０００）もしくはヤギ抗マウス（ａｂ９８６９３，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１：１０，０００）とインキュベートし、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ撮像システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ，ＩＬ）により視覚化し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用して分析した。
いくつかの修正を加えたウエスタンブロッティング手技（非特許文献１２；非特許文献６０）を使用して、ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の発現を決定した。心血管実験の完了後、動物を犠牲にし、臓器（脳、心臓、肝臓、肺、腎臓、腹部大動脈）を直ちに解剖し、ドライアイス上でフラッシュ凍結し、さらなる分析のために－８０℃で保存した。組織を１０×（ｗ／ｖ）ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ７．５、１２０ｍＭのＮａＣｌ、１．０％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、１．０％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％のグリセロール、１ｍＭのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、１ｍＭのエチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸四ナトリウム塩（ＥＧＴＡ）、ホスファターゼ阻害剤および完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））を用いて均質化した。タンパク質を、可溶化された形で単離し、濃度を、フォリン－チオカルトの（Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ）フェノール試薬（非特許文献６３）により測定した。緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（６０μｇ）で変性させ、１０％のドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で分離し、次いで、ニトロセルロースメンブレンに転写した後にトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中のＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（登録商標）ブロッキング緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ，ＩＬ）で膜をブロッキングした。膜を１× ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄し、ウサギポリクローナル抗ＥＴＡ受容体（ａｂ８５１６３，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１：１０００）または抗ＥＴＢ受容体（ａｂ１１７５２９，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１：１０００）またはマウスモノクローナル抗β－アクチン（ａ１９７８，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）抗体、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体ヤギ抗ウサギ（ｓｃ２００４，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ，１：２０００）もしくはヤギ抗マウス（ａｂ９８６９３，Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，１：１０，０００）とインキュベートし、そしてＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＭＰ撮像システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｎｏｖｅｒ Ｐａｒｋ，ＩＬ）により視覚化し、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）ソフトウェアを使用して分析した。
【0067】
血漿中のＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αレベルの決定
ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＴＮＦ－αの血漿レベルは、市販のラット酵素結合免疫吸着測定キットを使用して推定された：ＩＬ－６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、検出下限は５ｐｇ／ｍｌであり、他のサイトカインとの交差反応性のないラットＩＬ－６に非常に特異的）、ＩＬ－１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、検出下限は５ｐｇ／ｍｌであり、他のサイトカインとの交差反応性のないラットＩＬ－１０に非常に特異的）およびＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、検出下限は１５ｐｇ／ｍｌであり、他のサイトカインとの交差反応性のないラットＴＮＦ－αに非常に特異的）を様々な推定に使用した。すべてのアッセイは、製造業者が提供するプロトコルに従って以前に解凍されていない血漿サンプルを使用して実行した。
ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＴＮＦ－αの血漿レベルは、市販のラット酵素結合免疫吸着測定キットを使用して推定された：ＩＬ－６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、検出下限は５ｐｇ／ｍｌであり、他のサイトカインとの交差反応性のないラットＩＬ－６に非常に特異的）、ＩＬ－１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、検出下限は５ｐｇ／ｍｌであり、他のサイトカインとの交差反応性のないラットＩＬ－１０に非常に特異的）およびＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、検出下限は１５ｐｇ／ｍｌであり、他のサイトカインとの交差反応性のないラットＴＮＦ－αに非常に特異的）を様々な推定に使用した。すべてのアッセイは、製造業者が提供するプロトコルに従って以前に解凍されていない血漿サンプルを使用して実行した。
【0068】
統計分析検出力分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ－２．００を使用して実施した。検出力は８０％（β＝０．８）に設定し、使用された有意水準（α）は０．０５であった。検出力分析は、有意水準α＝０．０５の場合、群ごとの心血管のサンプルサイズが５、生化学的推定のサンプルサイズが４で、８０％の検出力を達成するのに十分であることを示した。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。有意差は、一元配置分散分析とそれに続く事後検定（ボンフェローニの方法）によって推定した。０．０５未満のＰ値は、有意であるとみなされた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理した。
【0069】
結果
出血したラットの動脈血ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ヘマトクリット値、血中乳酸および塩基欠乏に対するセンタキンの効果。出血後のラットでは血中ｐＨの有意な低減が観察され、これは、高張生理食塩水の投与後にさらに減少した。センタキン投与（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、出血したラットのｐＨの低減を有意に防止した。出血は、高張生理食塩水またはセンタキンでの蘇生による影響を受けなかった、有意なｐＣＯ２の減少およびｐＯ２の増加を生じさせた（表１）。
出血したラットの動脈血ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ヘマトクリット値、血中乳酸および塩基欠乏に対するセンタキンの効果。出血後のラットでは血中ｐＨの有意な低減が観察され、これは、高張生理食塩水の投与後にさらに減少した。センタキン投与（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）は、出血したラットのｐＨの低減を有意に防止した。出血は、高張生理食塩水またはセンタキンでの蘇生による影響を受けなかった、有意なｐＣＯ２の減少およびｐＯ２の増加を生じさせた（表１）。
【0070】
実験期間を通して、対照ラットのヘマトクリット値に変化はなかったが、ヘマトクリット値は出血後に有意に下降した（ｐ＜０．００１）。高張生理食塩水または０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のセンタキンで蘇生した場合、出血したラットは、処置後にヘマトクリット値に変化を示さなかった。
【0071】
実験期間を通して、対照ラットの血中乳酸レベルに変化はなかったが、乳酸レベルは出血後に有意に増加した（ｐ＜０．００１）。出血したラットは、０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のセンタキンで蘇生した場合、高張生理食塩水群と比較して血中乳酸レベルの有意な減少を示した（ｐ＜０．００１）（表１）。実験期間中、対照ラットの塩基欠乏に変化はなかった。塩基欠乏は、高張食塩水による蘇生の影響を受けなかった出血の誘発後に有意に（ｐ＜０．００１）増加した。一方、０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のセンタキンで蘇生したラットは、高張食塩水（－１６．３±１．３）と比較して、塩基欠乏（それぞれ－１２．０±０．２および－１１．６±０．５）の有意な減少（ｐ＜０．００１）を示した（表１）。蘇生されなかった出血ラットは６０分まで生存できなかったため、その時点でデータを取得できなかった。
【0072】
【表1】
【0073】
出血したラットの平均動脈血圧および心拍数に対するセンタキンの効果
対照ラットは、実験期間中にＭＡＰの変化を示さなかった。ＭＡＰは、出血の誘発後、すべての処置群で有意に減少した（ｐ＜０．００１）。高張食塩水で蘇生した出血ラットは、蘇生後３０分または６０分でＭＡＰの改善を示さなかった。センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で蘇生されたラットは、蘇生後の少なくとも６０分間、ＭＡＰの有意な増加（ｐ＜０．０１）を示した（図１Ａ）。出血前に、ベースラインＨＲは、すべての群で約３４５拍／分であった。出血は、ＨＲのわずかな増加をもたらした（約３７２拍／分）。高張食塩水で蘇生したラットでは、ＨＲは６０分で３５３±１１拍／分に降下したが、０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のセンタキンを用いて蘇生したラットでは、ＨＲはそれぞれ３６１±１０および３６３±１０であった（図１Ｂ）。高張食塩水またはセンタキンによる蘇生後のＨＲに有意差は観察されなかった。
対照ラットは、実験期間中にＭＡＰの変化を示さなかった。ＭＡＰは、出血の誘発後、すべての処置群で有意に減少した（ｐ＜０．００１）。高張食塩水で蘇生した出血ラットは、蘇生後３０分または６０分でＭＡＰの改善を示さなかった。センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で蘇生されたラットは、蘇生後の少なくとも６０分間、ＭＡＰの有意な増加（ｐ＜０．０１）を示した（図１Ａ）。出血前に、ベースラインＨＲは、すべての群で約３４５拍／分であった。出血は、ＨＲのわずかな増加をもたらした（約３７２拍／分）。高張食塩水で蘇生したラットでは、ＨＲは６０分で３５３±１１拍／分に降下したが、０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇの用量のセンタキンを用いて蘇生したラットでは、ＨＲはそれぞれ３６１±１０および３６３±１０であった（図１Ｂ）。高張食塩水またはセンタキンによる蘇生後のＨＲに有意差は観察されなかった。
【0074】
出血したラットの心拍出量および体血管抵抗に対するセンタキンの効果
ＣＯは、すべての群で出血後に有意に減少した。高張生理食塩水およびセンタキンで蘇生した出血ラットは、両方ともＣＯの有意な増加をもたらした（図１Ａ）。センタキン蘇生は、高張生理食塩水のみと比較して、蘇生後３０分および６０分で、ＣＯを有意に増加させた。ＳＶＲは、出血後に１４８±５から７７±３ダイン＊秒／ｃｍ５に減少し、これはさらに、両方の高張食塩水またはセンタキン処置を用いた蘇生から３０分および６０分に減少した（図１Ｂ）。
ＣＯは、すべての群で出血後に有意に減少した。高張生理食塩水およびセンタキンで蘇生した出血ラットは、両方ともＣＯの有意な増加をもたらした（図１Ａ）。センタキン蘇生は、高張生理食塩水のみと比較して、蘇生後３０分および６０分で、ＣＯを有意に増加させた。ＳＶＲは、出血後に１４８±５から７７±３ダイン＊秒／ｃｍ５に減少し、これはさらに、両方の高張食塩水またはセンタキン処置を用いた蘇生から３０分および６０分に減少した（図１Ｂ）。
【0075】
出血したラットの血漿ＥＴ－１レベルに対するセンタキンの効果
ベースラインの血漿ＥＴ－１レベルは１３．６±０．８７ｐｇ．ｍｌ－１であった。出血後、ＥＴ－１レベルは、２１．８±０．８７ｐｇ．ｍｌ－１に有意に増加した（ｐ＜０．００１）。高張生理食塩水で処置されたラットでは、ＥＴ－１レベルは２５．３±１．３５ｐｇ．ｍｌ－１であり、未処置の出血性ショック群と比較して有意な変化はなかった。しかしながら、センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置したラットでは、高張生理食塩水で蘇生した出血したラットと比較して、ＥＴ－１レベルが有意に増加した（それぞれ、３７．９±３．０３および３８．３±２．７ｐｇ．ｍｌ－１）。
ベースラインの血漿ＥＴ－１レベルは１３．６±０．８７ｐｇ．ｍｌ－１であった。出血後、ＥＴ－１レベルは、２１．８±０．８７ｐｇ．ｍｌ－１に有意に増加した（ｐ＜０．００１）。高張生理食塩水で処置されたラットでは、ＥＴ－１レベルは２５．３±１．３５ｐｇ．ｍｌ－１であり、未処置の出血性ショック群と比較して有意な変化はなかった。しかしながら、センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置したラットでは、高張生理食塩水で蘇生した出血したラットと比較して、ＥＴ－１レベルが有意に増加した（それぞれ、３７．９±３．０３および３８．３±２．７ｐｇ．ｍｌ－１）。
【0076】
出血したラットにおけるＥＴＡ受容体の発現に対するセンタキンの効果
脳、心臓、肝臓、肺、腎皮質のＥＴＡ受容体の発現に変化はなかった（図２Ａ～図２Ｄ）。腹部大動脈の出血性ショックに続いて、ＥＴＡ受容体の発現の有意な（ｐ＜０．０００１）増加が観察された。出血したラットの腹部大動脈におけるＥＴＡ受容体の発現は、シャム群と比較して１４０％増加した。高張生理食塩水および高張生理食塩水＋センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置した出血したラットでは、処置されていない出血したラットと比較して、腹部大動脈ではＥＴＡの発現の有意な減少（それぞれ－４８．８、－４７．６、および－４９．２％）が観察された（図２Ａ～図２Ｄ）。ラットの出血性ショック後の腎髄質では、ＥＴＡの発現に変化は観察されなかった。しかしながら、センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたラットは、出血性ショックと比較して、ＥＴＡ受容体の発現の有意な減少を提示した（それぞれ、－６１．３％および－７０．５％）（図２Ａ～図２Ｄ）。
脳、心臓、肝臓、肺、腎皮質のＥＴＡ受容体の発現に変化はなかった（図２Ａ～図２Ｄ）。腹部大動脈の出血性ショックに続いて、ＥＴＡ受容体の発現の有意な（ｐ＜０．０００１）増加が観察された。出血したラットの腹部大動脈におけるＥＴＡ受容体の発現は、シャム群と比較して１４０％増加した。高張生理食塩水および高張生理食塩水＋センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置した出血したラットでは、処置されていない出血したラットと比較して、腹部大動脈ではＥＴＡの発現の有意な減少（それぞれ－４８．８、－４７．６、および－４９．２％）が観察された（図２Ａ～図２Ｄ）。ラットの出血性ショック後の腎髄質では、ＥＴＡの発現に変化は観察されなかった。しかしながら、センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置されたラットは、出血性ショックと比較して、ＥＴＡ受容体の発現の有意な減少を提示した（それぞれ、－６１．３％および－７０．５％）（図２Ａ～図２Ｄ）。
【0077】
出血したラットにおけるＥＴＢ受容体の発現に対するセンタキンの効果
脳、心臓、肝臓、肺、腎皮質のＥＴＢ受容体の発現に変化はなかった（図３Ａ～図３Ｄ）。ラットの出血性ショック後の腹部大動脈では、ＥＴＢの発現に変化は観察されなかった。しかしながら、センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置したラットの腹部大動脈におけるＥＴＢ受容体の発現は、未処置の出血したラットと比較して有意に増加した（それぞれ７９．７％および５７．４％）（図３Ａ～図３Ｄ）。シャム群と比較して、出血性ショックに続いて、ＥＴＢ受容体の発現の有意な（ｐ＜０．０００１）減少（－３４％）が観察された。センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置した出血したラットでは、未処置の出血したラットと比較して、腎髄質でＥＴＢの発現の有意な増加（それぞれ７６．６％および６９．４％）が観察された（図３Ａ～図３Ｄ）。
脳、心臓、肝臓、肺、腎皮質のＥＴＢ受容体の発現に変化はなかった（図３Ａ～図３Ｄ）。ラットの出血性ショック後の腹部大動脈では、ＥＴＢの発現に変化は観察されなかった。しかしながら、センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置したラットの腹部大動脈におけるＥＴＢ受容体の発現は、未処置の出血したラットと比較して有意に増加した（それぞれ７９．７％および５７．４％）（図３Ａ～図３Ｄ）。シャム群と比較して、出血性ショックに続いて、ＥＴＢ受容体の発現の有意な（ｐ＜０．０００１）減少（－３４％）が観察された。センタキン（０．０１７および０．０５ｍｇ／ｋｇ）で処置した出血したラットでは、未処置の出血したラットと比較して、腎髄質でＥＴＢの発現の有意な増加（それぞれ７６．６％および６９．４％）が観察された（図３Ａ～図３Ｄ）。
【0078】
出血したラットの血漿ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αレベルに対するセンタキンの効果
センタキンの治療が炎症反応に影響を与えるかどうかをさらに評価するために、ラット血漿中のサイトカインの選択されたパネルを測定した。全体として、血漿ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αのレベルは、高張生理食塩水およびセンタキンによる蘇生の有無にかかわらず、すべての出血したラットで増加した。ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６レベルは、シャム対照と比較して、出血性ショックおよび高張食塩水による蘇生後に高かった。センタキンは、高張生理食塩水のみと比較して、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６のレベルをさらに増加させた（ｐ＜０．０１）。出血性ショックと高張食塩水またはセンタキンによる蘇生後のラット間で、血漿ＩＬ－１０に統計的に有意な差はなかった（図４）。
センタキンの治療が炎症反応に影響を与えるかどうかをさらに評価するために、ラット血漿中のサイトカインの選択されたパネルを測定した。全体として、血漿ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αのレベルは、高張生理食塩水およびセンタキンによる蘇生の有無にかかわらず、すべての出血したラットで増加した。ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６レベルは、シャム対照と比較して、出血性ショックおよび高張食塩水による蘇生後に高かった。センタキンは、高張生理食塩水のみと比較して、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６のレベルをさらに増加させた（ｐ＜０．０１）。出血性ショックと高張食塩水またはセンタキンによる蘇生後のラット間で、血漿ＩＬ－１０に統計的に有意な差はなかった（図４）。
【0079】
考察
センタキンは、血中乳酸を大幅に減少させ、ＭＡＰを回復させ、高張食塩水の蘇生効果を高めたので、以前の所見を確認した（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５８；非特許文献８０）。異なる組織におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体発現、血漿ＥＴ－１レベル、および炎症マーカーに対する、高張生理食塩水のみまたはセンタキンを加えたものを使用した出血性ショックおよび蘇生の影響を測定した。腹部大動脈および腎髄質におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体は、その蘇生作用に関与していることが判明した。出血性ショックに続いて、または高張生理食塩水もしくはセンタキンによる蘇生に続いて、脳、心臓、肺および肝臓においてＥＴＡまたはＥＴＢ受容体レベルの変化は観察されなかった。
センタキンは、血中乳酸を大幅に減少させ、ＭＡＰを回復させ、高張食塩水の蘇生効果を高めたので、以前の所見を確認した（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５８；非特許文献８０）。異なる組織におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体発現、血漿ＥＴ－１レベル、および炎症マーカーに対する、高張生理食塩水のみまたはセンタキンを加えたものを使用した出血性ショックおよび蘇生の影響を測定した。腹部大動脈および腎髄質におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体は、その蘇生作用に関与していることが判明した。出血性ショックに続いて、または高張生理食塩水もしくはセンタキンによる蘇生に続いて、脳、心臓、肺および肝臓においてＥＴＡまたはＥＴＢ受容体レベルの変化は観察されなかった。
【0080】
血管ＥＴＡ受容体は、強力な血管収縮作用を有することが確立されている（非特許文献８６）。出血は、腹部大動脈におけるＥＴＡ受容体の発現の増加をもたらした。高張食塩水とセンタキンによる蘇生は、腹部大動脈における出血誘発性のＥＴＡ受容体発現の増加を有意に逆転させた。しかしながら、ＥＴＢ受容体は出血性ショック後も変化しなかったが、センタキン処置によって増加した。出血性ショックに続いて、血管内の血管収縮剤ＥＴＡ受容体の発現の増加が起こり、血管緊張およびＭＡＰを維持する可能性がある。しかしながら、血管ＥＴＡ受容体の増加とともに循環ＥＴ－１の増加は、望ましくない血管収縮を引き起こし、組織灌流を減少させる可能性がある。
【0081】
一方、出血性ショック後の血漿ＥＴ－１レベルの増加は、血圧を維持するための代償メカニズムとして作用していることが報告されている（非特許文献１６；非特許文献２０；非特許文献３４；非特許文献８８）。ＥＴ－１の前駆体が、重度の出血を起こしたラットにおいて、ヘモグロビンベースの血液代替ジアスピリン架橋ヘモグロビンの蘇生効果を改善することも判明している（非特許文献３７）。正常なラットでは、ＥＴ－１は二相性の応答を引き起こす（初期の一過性の減少とそれに続く血圧の持続的な上昇（非特許文献２７；非特許文献４））が、出血したラットでは、ＥＴ－１は単相性の効果を生じ、ここでは、生存率の改善とともに血圧の上昇のみが観察された（非特許文献４９）。出血したラットにおけるＥＴ－１の蘇生効果は、特定のＥＴＡ受容体アゴニストであるＢＱ１２３によって遮断されたため、ＥＴＡ受容体を介して媒介された（非特許文献４９）。理論に束縛されるものではないが、血管のＥＴＡ受容体は、高張生理食塩水またはセンタキンのいずれかで蘇生すると逆転する代償メカニズムの一部として、出血性ショック後に増加する。腹部大動脈におけるＥＴＢ受容体は、出血ショック後に変化しなかったが、センタキンによって増加し、かつ高張生理食塩水の蘇生によって増加しなかった。血管ＥＴＢ受容体は血管拡張をもたらすため（非特許文献４；非特許文献１５；非特許文献４）、したがって、センタキンによって誘発される血管ＥＴＢ受容体の発現の増加は、組織の血液灌流の増加に寄与し、それによって出血したラットの血中乳酸レベルを減少させる可能性がある。
【0082】
ＥＴ受容体は互いに、かつアドレナリン作用と相互干渉する。ＥＴＢ受容体脱感作の効果は、ＥＴＡ受容体遮断の存在下で明らかになる（非特許文献７０）。一方、ＥＴＢ受容体は、ＥＴＡ受容体の薬理学を変化させることができる。ＥＴＢ受容体が遮断されたときに、静脈ＥＴＡ受容体の遮断は、より大きな程度までＥＴ－１誘発収縮を阻害することが示されている（非特許文献９１）。ＥＴＡとＥＴＢ受容体との間の相互干渉は、げっ歯類におけるいくつかの異なる血管に起こることが示されており（非特許文献６２；非特許文献９１）、これらの血管のすべては、収縮性ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体を有し、薬理学的ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体との相互作用が、収縮性ＥＴＢ受容体の存在を必要とすることを示唆している（非特許文献９１）。ＥＴＡ受容体は、クロニジンなどのアドレナリン作動薬の心血管応答を調節することが示されている（非特許文献３１；非特許文献３８；非特許文献５８）。センタキンは、アドレナリン作動受容体に作用するので、ＥＴＡ受容体の発現の変化がセンタキンの蘇生効果の一部を担当している可能性がある。
【0083】
腎髄質では、ＥＴＡ受容体レベルは出血性ショック後に変化しなかったが、センタキンによって減少し、一方ＥＴＢ受容体発現は出血性ショック後に減少し、これはセンタキンによって完全に減弱され、かつ高張生理食塩水では減弱されなかった。腎臓では、ＥＴ－１は血管収縮を引き起こし、ＥＴＡ受容体を介して媒介される糸球体濾過量を減少させる（非特許文献４２；非特許文献５４）。センタキンによって誘発されるＥＴＡ受容体の発現の減少は、腎髄質におけるＥＴ－１の血管収縮効果を低減し得る。外側腎髄質は、外側腎髄質を高い代謝活性とより良い血液灌流の要求のための部位にするヘンレ係蹄の太い上行脚によって、塩化ナトリウムの広範な再吸収が起こる部位である（非特許文献１８）。したがって、この領域は、過度の出血後に、低酸素または虚血性障害を起こしやすい。センタキンは、ＥＴＡ受容体の濃度を減少させることにより、腎髄質領域が出血性ショックに続く虚血性障害を防ぐ可能性がある。一方、ＥＴＢ受容体刺激は、ＮＯ、シクロオキシゲナーゼ、シトクロムｐ－４５０代謝物などの血管拡張薬を通して媒介される腎髄質の血流を増加させることが判明している（非特許文献４４；非特許文献９２）。本明細書で示されるように、出血性ショックは、生理食塩水による蘇生による影響を受けなかったが、センタキンによって減弱された腎髄質ＥＴＢ受容体の発現を減少させた。本明細書で提供される結果は、重度の出血が腎髄質におけるＥＴＢ受容体の発現の減少を引き起こし、これが腎髄質への血流の減少に寄与し、虚血および腎不全を引き起こす可能性があることを示している。センタキンによる蘇生がいかなる腎髄質ＥＴＢ受容体発現における減少も引き起こさなかったため、出血誘発される腎髄質虚血効果がセンタキンによって減弱される可能性がある。したがって、ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体におけるセンタキンに誘発された変化の両方が、腎髄質を出血性ショックに続く虚血性障害から防御するよう寄与し得る。
【0084】
腎髄質ＥＴＢ受容体はまた、ナトリウムおよび水の排泄の制御において役割を果たしている（非特許文献５２；非特許文献８６）。腎髄質集合管の上皮におけるＥＴＢ受容体は、ナトリウムおよび水の再吸収に対するＥＴ－１作用の阻害を主に担当している（非特許文献５１；非特許文献５２）。ＥＴ－１に対する利尿薬およびナトリウム利尿薬の反応は、ＥＴＢ受容体アンタゴニストによって減弱されることが判明した（非特許文献４６）。無尿または乏尿を呈する過度の失血のある患者は、急性腎不全がこのような患者の主な死因であるため、緊急医療処置が必要である（非特許文献８３）。センタキンよって減弱され得る腎髄質ＥＴＢ受容体の発現の減少が、乏尿症に寄与し得ることが可能である。センタキンは、出血性ショックによって媒介される腎障害を軽減するための新しい薬理学的介入であり得ると推測され得る。これらの所見は予備的なものであり、示唆的なものにすぎず、動物実験で広範囲に検討するする必要がある。腎流に対するセンタキンの効果、およびこれらの変化が特定のＥＴＡおよびＥＴＢ受容体アンタゴニストによって拮抗されるかどうかを検討するための研究が必要である。
【0085】
本研究では、出血がＥＴ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０の血漿濃度を増加させることが見出した。高張生理食塩水による蘇生は、血漿ＥＴ－１、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６またはＩＬ－１０を変化させなかったが、センタキンは血漿ＩＬ－１０濃度に影響を与えることなく、血漿ＥＴ－１、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を有意に増加させた。雑種犬で実施された研究では、失血量と相互に関連する出血後に血漿ＥＴ－１レベルの増加が観察された（非特許文献１６）。ＥＴ－１は、ＮＦ－κＢなどの転写因子の活性化およびＴＮＦ－α、ＩＬ－１、およびＩＬ－６などの炎症誘発性サイトカインの発現とともに、スーパーオキシドアニオンの産生およびサイトカイン分泌を増加させる（非特許文献５６；非特許文献９５）。サイトカインは、相互に、ＥＴ－１の分泌を調節することが示されている（非特許文献１１；非特許文献１００）。
【0086】
出血性ショックは、多臓器不全につながる可能性のある代謝、細胞、炎症反応を危うくする（非特許文献９；非特許文献４０；非特許文献６５）。この応答は通常、出血性ショックの直後に現れるＩＬ－６またはＴＮＦ－αなどの炎症誘発性サイトカインの放出によって特徴付けられる（非特許文献６８）。これに続いて、免疫抑制に寄与し得るＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインが持続的に放出される（非特許文献７６）。出血における過剰なＩＬ－６およびＴＮＦ－αの産生の全体的な影響については、依然として議論の余地がある。本所見は、出血後のＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＬ－１０の血漿レベルの増加を確認している。なかったが塩水による蘇生は、血漿ＴＮＦ－α、ＩＬ－６またはＩＬ－１０を変化させなかったが、センタキンは血漿ＩＬ－１０濃度に影響を与えることなく、血漿ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を有意に増加させた。以前の調査では、ＥＴＢ受容体の発現の増加は、特定の炎症誘発性サイトカインの増加と相関している可能性があることが示されている（非特許文献１１；非特許文献８２；非特許文献９６）。本明細書では、センタキン蘇生が、血漿ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６の濃度の上昇に伴って腹部大動脈および腎髄質においてＥＴＢ受容体の発現を増加させることを実証している。研究によると、強力な初期ＴＮＦ－α応答は外傷犠牲者の生存に関連しており、血漿ＴＮＦ－αの早期上昇は臓器損傷を制限するか、または修復プロセスを誘発するのに役立つことを示唆している（非特許文献７３）。サイトカインＩＬ－６は、炎症に対する全身性反応に重要な役割を果たしているようである。いくつかの研究では、関節炎（非特許文献８１）、多発性骨髄腫（非特許文献２６）、およびクローン病（非特許文献５）におけるＩＬ－６の遮断の有益な効果は示しているが、ＩＬ－６の阻害は、出血性ショックに有益であることは判明していない（非特許文献６８）。ＩＬ－６は、障害に対する炎症反応において二重の役割を果たし、局所的に炎症誘発性および全身的に抗炎症性として分類されることが多い。研究は、熱傷、敗血症、および出血の実験的パラダイムにおけるＩＬ－６欠損の有益な効果を示している（非特許文献２３；非特許文献７１；非特許文献９９）。対照的に、他の研究は、ＩＬ－６投与が出血によって誘発される上皮細胞および心筋細胞のアポトーシスを防ぐことを示している（非特許文献３；非特許文献７２）。出血性ショック後のＩＬ－６の全身注入は、肝臓および肺の炎症ならびに障害を軽減する（非特許文献６９）。研究はまた、ＴＮＦ－αの有益な効果も示している。ＴＮＦ受容体を欠くマウスは、虚血性脳障害においてより大きな梗塞を起こす（非特許文献１３）。海馬でのＴＮＦ－αの放出は、神経保護を促進し、脳微小血管系の修復プロセスを活性化し、ならびにニューロンの形成性を媒介し得る（非特許文献５０；非特許文献８９）。いくつかの実験的研究は、両方のサイトカインが脳内で保護作用を示すことを示唆している（非特許文献１３；非特許文献２５；非特許文献４１；非特許文献５５）。本研究では、センタキンはＩＬ－６とＴＮＦ－αを増加させたが、これらのサイトカインは炎症誘発性と抗炎症性の両方の機能を果たす能力を有するため、正常な動物および出血した動物の両方で、炎症に対するセンタキンの効果を完全に理解するために、炎症のより多くのマーカーが検討されている。
【0087】
エンドセリン－１（ＥＴ－１）は、ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体に作用し、出血性ショック（ショック）に関与している。ＥＴＡおよびＥＴＢ受容体の発現に対するショックおよび蘇生の影響は、高張生理食塩水（生理食塩水）またはセンタキンを利用して本明細書で研究した。ラットに麻酔をかけ、左大腿動脈に圧力カテーテルを留置し、平均動脈血圧（ＭＡＰ）を３５ｍｍＨｇに３０分間上昇させるために右大腿動脈から血液を採取し、蘇生を行い、９０分後に生化学的推定のためにサンプルを収集するために犠牲にした。センタキンによる蘇生は、血中乳酸を減少させ、かつＭＡＰを増加させた。ＥＴＡまたはＥＴＢ受容体のタンパク質レベルは、ショックまたは蘇生後の脳、心臓、肺および肝臓で変化しなかった。腹部大動脈では、ショックによりＥＴＡの発現が増加し（１４０％）、生理食塩水およびセンタキンによって減弱され、ＥＴＢの発現は、ショック後も変化しなかったが、センタキンによって増加した（７９％）。腎髄質では、ＥＴＡの発現はショック後も変化しなかったが、センタキンによって減少し（－６１％）、ショックによりＥＴＢの発現が減少（－３４％）し、この減少は、センタキンによって完全に減弱されたが、生理食塩水では減弱されなかった。大動脈および腎髄質におけるＥＴＡおよびＥＴＢ受容体におけるショック誘導変化は、センタキンによって逆転され、その有効性に寄与し得る。
【0088】
要約すると、センタキンは、ラットの出血性ショック（ＨＳ）後の蘇生を有意に改善した。ＨＳ後のセンタキンの投与は、血管収縮剤ＥＴＡ受容体の発現の減少および血管拡張剤ＥＴＢ受容体の発現の増加をもたらし、これらの変化についてのメカニズムはまだ解明されていない。同様に、出血性ショックおよびセンタキンによる蘇生後のサイトカインの上昇の意義は、これらの変化が組織の血液灌流を改善することが企図される。
【0089】
センタキンは、ラット、ウサギ、およびブタのモデルで広範囲の出血を起こした後、有意な蘇生効果があることが示されている。出血は、ＥＴＢ受容体の発現を減少させ、センタキンによる蘇生は、ＥＴＢ受容体の発現の増加を介してこの効果を減弱させることが企図される。具体的には、腎髄質におけるＥＴＢ受容体発現のセンタキン誘発性の増加は、血管拡張効果をもたらし、利尿およびナトリウム利尿を促進し、腎髄質への障害を防ぐことができる。
【0090】
実施例２
以下の実施例は、低用量のセンタキン（２－［２－（４－（３－メチルフェニル）－１－ピペラジニル）］エチル－キノリン）シトレートは、出血性ショックにおいて血中乳酸の有意に減少させ、平均動脈血圧（ＭａＰ）、脈圧（ＰＰ）および心拍出量（ＣＯ）を増加させることが確立する（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５８；非特許文献８０）。比較試験は、センタキンと３つの異なるカテゴリーにグループ分けされた現状の蘇生剤：（ａ）乳酸加リンガー高張生理食塩水などの液体、（ｂ）ノルエピネフリンなどのアドレナリン作動薬、および（ｃ）新鮮な血液との間で実施した。（ｉ）固定圧失血のラットモデル、（ｉｉ）外傷を伴う制御不能な出血のウサギモデル、および（ｉｉｉ）大量失血のブタモデルを使用した我々の結果は、センタキンが血液量減少性ショック後の死亡率を低減させるのに非常に効果的であることを示している（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５３；非特許文献８０）。他の蘇生剤（昇圧剤）とは異なり、センタキンは一回拍出量（ＳＶ）およびＣＯを増加させることによってＭＡＰを増加させ、心拍数および体血管抵抗（ＳＶＲ）を減少させた。センタキンは現在、出血性ショックのための蘇生剤として臨床開発中である。
以下の実施例は、低用量のセンタキン（２－［２－（４－（３－メチルフェニル）－１－ピペラジニル）］エチル－キノリン）シトレートは、出血性ショックにおいて血中乳酸の有意に減少させ、平均動脈血圧（ＭａＰ）、脈圧（ＰＰ）および心拍出量（ＣＯ）を増加させることが確立する（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５８；非特許文献８０）。比較試験は、センタキンと３つの異なるカテゴリーにグループ分けされた現状の蘇生剤：（ａ）乳酸加リンガー高張生理食塩水などの液体、（ｂ）ノルエピネフリンなどのアドレナリン作動薬、および（ｃ）新鮮な血液との間で実施した。（ｉ）固定圧失血のラットモデル、（ｉｉ）外傷を伴う制御不能な出血のウサギモデル、および（ｉｉｉ）大量失血のブタモデルを使用した我々の結果は、センタキンが血液量減少性ショック後の死亡率を低減させるのに非常に効果的であることを示している（非特許文献３３；非特許文献３９；非特許文献５３；非特許文献８０）。他の蘇生剤（昇圧剤）とは異なり、センタキンは一回拍出量（ＳＶ）およびＣＯを増加させることによってＭＡＰを増加させ、心拍数および体血管抵抗（ＳＶＲ）を減少させた。センタキンは現在、出血性ショックのための蘇生剤として臨床開発中である。
【0091】
出血性ショックは、特に障害の初期段階での外傷後の罹患率および死亡率の主な原因である（非特許文献９７）。出血性ショックによる死亡のほとんどは、外傷後の最初の６時間に発生し（非特許文献３）、これらの死亡の多くは予防することができる（非特許文献１）。ショックは循環器不全を伴い、これは主に死亡率および罹患率の原因となる。大量の乳酸加リンガー（ＬＲ）溶液を使用する現在推奨されている輸液療法は、血行力学的パラメータの回復に効果的であるが、ロジスティックおよび生理学的制限を提示する（非特許文献９４）。大量の晶質液を伴う蘇生は、二次性腹部コンパートメント症候群、肺水腫、心機能障害、および麻痺性イレウスと関連している（非特許文献６）。出血性ショックにおける循環器不全の二次的後遺症は腎不全であり、これは大量の輸液蘇生によって悪化する可能性がある。出血性ショック後の急性腎障害および腎不全の発生率は非常に高く、多くは腎代替療法を必要とする。出血性ショックにおける腎不全の病態生理学は、血流を心臓および脳に向けるが、腎臓の虚血性障害につながる可能性がある内臓および腎血管収縮の結果である。尿細管細胞の障害は、近位尿細管の真っ直ぐな部分およびヘンレ係蹄の太い上行脚部で最も顕著であり、特に比較的低酸素の延髄に食い込んでいる。近位尿細管細胞の変化は、尿細管腔側の小疱および刷子縁膜の喪失であり、続いて接合帯の極性および完全性が失われる。細胞レベルでは、虚血はアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の枯渇、細胞質ゾルカルシウムの増加、フリーラジカル形成、膜リン脂質の代謝、および細胞容積調節の異常を引き起こす。
【0092】
方法
動物試験
オスのスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（３４０～３８０ｇ）（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、使用前に、制御された温度（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）および光（午前６：００～午後６：００）の部屋で少なくとも４日間収容した。食餌および水は、絶えず利用可能にした。動物の管理および実験手順の使用は、ミッドウエスタン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。すべての麻酔および外科的処置は、動物実験委員会によって確立されたガイドラインに準拠していた。
動物試験
オスのスプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ）ラット（３４０～３８０ｇ）（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、使用前に、制御された温度（２３±１℃）、湿度（５０±１０％）および光（午前６：００～午後６：００）の部屋で少なくとも４日間収容した。食餌および水は、絶えず利用可能にした。動物の管理および実験手順の使用は、ミッドウエスタン大学の動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認された。すべての麻酔および外科的処置は、動物実験委員会によって確立されたガイドラインに準拠していた。
【0093】
薬物および化学薬品
クエン酸センタキン（ＰＭＺ－２０１０）は、Ｐｈａｒｍａｚｚ Ｉｎｄｉａ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｇｒｅａｔｅｒ Ｎｏｉｄａ，Ｉｎｄｉａで合成された。ウレタン（エチルカルバメート）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、米国薬局方注射用生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ，Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ ＩＬ，ＵＳＡ）および米国薬局方注射用ヘパリンナトリウム（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。
クエン酸センタキン（ＰＭＺ－２０１０）は、Ｐｈａｒｍａｚｚ Ｉｎｄｉａ Ｐｒｉｖａｔｅ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｇｒｅａｔｅｒ Ｎｏｉｄａ，Ｉｎｄｉａで合成された。ウレタン（エチルカルバメート）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、米国薬局方注射用生理食塩水（Ｈｏｓｐｉｒａ，Ｉｎｃ，Ｌａｋｅ ｆｏｒｅｓｔ ＩＬ，ＵＳＡ）および米国薬局方注射用ヘパリンナトリウム（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用した。
【0094】
心血管応答の決定
動物を、等張食塩水に溶解したウレタンで麻酔した。ウレタンは、腹腔内注射により体重１ｋｇ当たり１．５ｇの用量で投与した。ウレタンは、心臓血管系および呼吸器系の抑制作用を最小限に抑えて長時間（８～１０時間）麻酔をかけるため、麻酔剤として選択した。これは、心血管反射の保存によって特徴付けられるレベルの外科的麻酔を生じさせる（非特許文献６４）。簡単に言えば、麻酔されたラットは、制御された加熱パッドを備えた外科用ボード上に固定化された。血液のＰｏ２、Ｐｃｏ２およびｐＨは、げっ歯類の人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）に接続された気管切開カニューレを使用して維持した。ＭＡＰおよびＨＲを、ＡＥＣ－１０Ｃコネクタを介してＭＬ２２１ブリッジ増幅器（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続された圧力カテーテルＳＰＲ－３２０（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で左大腿動脈にカニューレを挿入することによって測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システムを使用してシグナルを取得した（１０００Ｓ－１）（非特許文献３３；非特許文献７７）。Ｐｅｒｉｍｅｄレーザードップラーフロープローブを腎髄質に配置して血液灌流を測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システムでデータを捕捉した。左大腿静脈にＰＥ５０チューブ（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を使用してカニューレを挿入し、蘇生のために固定した。
動物を、等張食塩水に溶解したウレタンで麻酔した。ウレタンは、腹腔内注射により体重１ｋｇ当たり１．５ｇの用量で投与した。ウレタンは、心臓血管系および呼吸器系の抑制作用を最小限に抑えて長時間（８～１０時間）麻酔をかけるため、麻酔剤として選択した。これは、心血管反射の保存によって特徴付けられるレベルの外科的麻酔を生じさせる（非特許文献６４）。簡単に言えば、麻酔されたラットは、制御された加熱パッドを備えた外科用ボード上に固定化された。血液のＰｏ２、Ｐｃｏ２およびｐＨは、げっ歯類の人工呼吸器（モデル６８３、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ）に接続された気管切開カニューレを使用して維持した。ＭＡＰおよびＨＲを、ＡＥＣ－１０Ｃコネクタを介してＭＬ２２１ブリッジ増幅器（ＡＤ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に接続された圧力カテーテルＳＰＲ－３２０（Ｍｉｌｌａｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で左大腿動脈にカニューレを挿入することによって測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システムを使用してシグナルを取得した（１０００Ｓ－１）（非特許文献３３；非特許文献７７）。Ｐｅｒｉｍｅｄレーザードップラーフロープローブを腎髄質に配置して血液灌流を測定し、ＰｏｗｅｒＬａｂ １６／３０データ収集システムでデータを捕捉した。左大腿静脈にＰＥ５０チューブ（Ｃｌａｙ Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐａｎｎｙ，ＮＪ）を使用してカニューレを挿入し、蘇生のために固定した。
【0095】
動脈血ガスおよび塩基欠乏の決定
ベースラインの動脈血ｐＨ、Ｐｏ２、Ｐｃｏ２、Ｎａ＋、Ｋ＋、および乳酸を、ショックの誘発前、ショックの誘発から３０分後、およびビヒクルまたはセンタキン蘇生から３０分後と６０分後にモニターした。血液サンプル（０．１５ｍｌ）を、血液ガスサンプリングシリンジ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅａｗｏｏｄ，ＫＳ）を使用して動脈カニューレから採取し、ｐＨＯｘウルトラアナライザー（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析した。塩基欠乏は、次の式を使用して計算した（非特許文献１９；非特許文献７８）：
ＳＢＤ＝０．９２８７×［ＨＣＯ３ －－２４．４＋１４．８３×（ｐＨ－７．４）］
ベースラインの動脈血ｐＨ、Ｐｏ２、Ｐｃｏ２、Ｎａ＋、Ｋ＋、および乳酸を、ショックの誘発前、ショックの誘発から３０分後、およびビヒクルまたはセンタキン蘇生から３０分後と６０分後にモニターした。血液サンプル（０．１５ｍｌ）を、血液ガスサンプリングシリンジ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｌｅａｗｏｏｄ，ＫＳ）を使用して動脈カニューレから採取し、ｐＨＯｘウルトラアナライザー（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して分析した。塩基欠乏は、次の式を使用して計算した（非特許文献１９；非特許文献７８）：
ＳＢＤ＝０．９２８７×［ＨＣＯ３ －－２４．４＋１４．８３×（ｐＨ－７．４）］
【0096】
出血性ショックの誘発
出血は、ＭＡＰが３５ｍｍＨｇに達するまで、約０．５～１ｍＬ／分の速度で大腿動脈から採血することによって誘発させた。このＭＡＰを、必要に応じてさらに採血することにより３０分間維持した。本試験で使用された出血性ショックモデルは、管理可能な圧力出血の確立されたげっ歯類モデルである（非特許文献１４；非特許文献３４；非特許文献３５）。失血量は各ラットで約８．０ｍｌであり、様々な群で同様であり、総血液量の約４０％に相当する。測定されたヘマトクリット値は、様々な群で類似していた。採血時間は約１５分であった。
出血は、ＭＡＰが３５ｍｍＨｇに達するまで、約０．５～１ｍＬ／分の速度で大腿動脈から採血することによって誘発させた。このＭＡＰを、必要に応じてさらに採血することにより３０分間維持した。本試験で使用された出血性ショックモデルは、管理可能な圧力出血の確立されたげっ歯類モデルである（非特許文献１４；非特許文献３４；非特許文献３５）。失血量は各ラットで約８．０ｍｌであり、様々な群で同様であり、総血液量の約４０％に相当する。測定されたヘマトクリット値は、様々な群で類似していた。採血時間は約１５分であった。
【0097】
実験計画
出血性ショックにおける心血管系に対するセンタキンの蘇生効果を決定するために、ラットをランダムに３つの群に分けた。出血したラットに、蘇生の最初の１０分の間に、通常生理食塩水（ビヒクル）の各々の１００％の出血量；通常生理食塩水に加えてセンタキン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）の各々の１００％の出血量、または通常生理食塩水に加えてセンタキン（０．１０ｍｇ／ｋｇ）の各々の１００％の出血量を投与した。通常生理食塩水（ＮＳ）またはセンタキン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたラット（失血に等しい量）においてＭＡＰを７０ｍｍＨｇに維持するために必要なノルエピネフリン（蘇生中に非常に一般的に使用される昇圧剤）の量が決定される、追加の実験も行った。
出血性ショックにおける心血管系に対するセンタキンの蘇生効果を決定するために、ラットをランダムに３つの群に分けた。出血したラットに、蘇生の最初の１０分の間に、通常生理食塩水（ビヒクル）の各々の１００％の出血量；通常生理食塩水に加えてセンタキン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）の各々の１００％の出血量、または通常生理食塩水に加えてセンタキン（０．１０ｍｇ／ｋｇ）の各々の１００％の出血量を投与した。通常生理食塩水（ＮＳ）またはセンタキン（０．０１ｍｇ／ｋｇ）で処置されたラット（失血に等しい量）においてＭＡＰを７０ｍｍＨｇに維持するために必要なノルエピネフリン（蘇生中に非常に一般的に使用される昇圧剤）の量が決定される、追加の実験も行った。
【0098】
統計的分析検出力分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔ－２．００を使用して実施した。検出力は８０％（β＝０．８）に設定し、使用された有意水準（α）は０．０５であった。検出力分析は、有意水準α＝０．０５の場合、群ごとの心血管のサンプルサイズが５、生化学的推定のサンプルサイズが４で、８０％の検出力を達成するのに十分であることを示した。データは平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。有意差は、一元配置分散分析とそれに続く事後検定（ボンフェローニの方法）によって推定した。０．０５未満のＰ値は、有意であるとみなされた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理した。
【0099】
結果
出血したラットの動脈血ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ヘマトクリット値、血中乳酸および塩基欠乏に対するセンタキンの効果。出血後のラットでは血中ｐＨの有意な低減が観察され、これは、生理食塩水の投与後にさらに減少した。センタキン投与（０．０１および０．１０ｍｇ／ｋｇ）は、出血したラットのｐＨの低減を有意に防止した。出血は、生理食塩水またはセンタキンでの蘇生による影響を受けなかった、有意なｐＣＯ２の減少およびｐＯ２の増加を生じさせた。
出血したラットの動脈血ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ヘマトクリット値、血中乳酸および塩基欠乏に対するセンタキンの効果。出血後のラットでは血中ｐＨの有意な低減が観察され、これは、生理食塩水の投与後にさらに減少した。センタキン投与（０．０１および０．１０ｍｇ／ｋｇ）は、出血したラットのｐＨの低減を有意に防止した。出血は、生理食塩水またはセンタキンでの蘇生による影響を受けなかった、有意なｐＣＯ２の減少およびｐＯ２の増加を生じさせた。
【0100】
実験期間を通して、対照ラットのヘマトクリット値に変化はなかったが、ヘマトクリット値は出血後に有意に下降した。生理食塩水またはセンタキンで蘇生した場合、出血したラットは、処置後にヘマトクリット値に変化を示さなかった。
【0101】
実験期間を通して、対照ラットの血中乳酸レベルに変化はなかったが、乳酸レベルは出血後に有意に増加した。出血したラットは、センタキンで蘇生した場合、生理食塩水群と比較して血中乳酸レベルの減少を示した。
【0102】
出血したラットの平均動脈血圧（ＭＡＰ）に対するセンタキンの効果。対照ラットは、実験期間中にＭＡＰの変化を示さなかった。ＭＡＰは、出血の誘発後、すべての処置群で有意に減少した。生理食塩水で蘇生した出血ラットは、蘇生後のＭＡＰの一時的な改善のみを示した。センタキン（０．０１および０．１０ｍｇ／ｋｇ）で蘇生されたラットは、蘇生後のＭＡＰの有意な増加（ｐ＜０．０１）を示した。
【0103】
出血したラットの腎血液灌流に対するセンタキンの効果。出血したラットは、ビヒクル（生理食塩水）またはセンタキン低用量（０．０１ｍｇ／ｋｇ）または高用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）で蘇生された。腎血液灌流に対するセンタキンの効果は、ショックの誘発前、ショック（出血）から３０分後、および蘇生から１０、３０、６０、９０および１２０分後に測定した。低用量のセンタキンは、等量の生理食塩水と比較して、出血した雄ラットの腎血液灌流を有意に改善した。この改善された腎髄質の血液灌流は、腎臓への障害を予防または治療するためのセンタキンの使用を示している（図５）。センタキンは、等量の生理食塩水と比較して、出血した雌ラットの腎血液灌流を有意に改善した（図６）。０．０２ｍｇ／ｋｇのセンタキンの低用量も、２０分間の腎動脈閉塞にさらされた出血ラットの腎血流量を増加させる上で効果的であることが判明した。１０倍高い０．２ｍｇ／ｋｇセンタキンの高用量は、０．０２ｍｇ／ｋｇのセンタキンの低用量と同じ腎血流量の増加効果を有さなかった。したがって、２０分間の腎動脈閉塞にさらされた出血ラットの腎血流を改善する上で、低用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ）のセンタキンは高用量（０．２ｍｇ／ｋｇ）のセンタキンよりも効果的であった。
【0104】
雄ラットをウレタンで麻酔した。薬物投与のために大腿静脈にカニューレを挿入し、平均動脈血圧（ＭＡＰ）を測定するために大腿動脈にカニューレを挿入し、血液灌流を測定するためにレーザードップラーフロープローブを腎髄質に配置した。出血性ショックの誘発は、ＭＡＰを３５ｍｍＨｇで３０分間維持するために採血することによって開始された。ＭＡＰを７０ｍｍＨｇに維持するために、ノルエピネフリン注入を行った。心血管機能に対するセンタキンの効果は、ショックの誘発前、ショック（出血）の３０分後、および蘇生の１５、３０、４５、６０、７５および９０分後に測定された。センタキンは、蘇生後のビヒクル対照と比較して、出血した雄ラットの腎血液灌流を改善した。ノルエピネフリン誘発性血管収縮の副作用は、センタキンによって弱めることができる（図７）。同様に、センタキンは、蘇生後のビヒクル対照と比較して、出血した雌ラットの腎血液灌流を改善し、実験の終わりまで改善された血液灌流が観察された（図８）。ノルエピネフリン誘発性血管収縮の副作用は、センタキンによって弱めることができる。
【0105】
実施例３
過剰な失血による血液量減少性ショックの蘇生剤としてのＰＭＺ－２０１０（センタキン）の前向き多施設無作為化二重盲検並行生理食塩水対照第ＩＩ相試験（ＣＴＲＩ／２０１７／０３／００８１８４）が実施中である。すべての被験者はショックの標準治療を受けた（登録機関が提供する種類の治療およびケア）。患者は、通常生理食塩水と一緒に標準治療を受ける対照コホート（Ｎ＝７）、またはＰＭＺ－２０１０と一緒に標準治療を受けるＰＭＺ－２０１０コホート（Ｎ＝１２）のいずれかにランダムに割り当てられた。中間分析は、両方のコホートで同等の患者の個体群統計を示した（表２）
過剰な失血による血液量減少性ショックの蘇生剤としてのＰＭＺ－２０１０（センタキン）の前向き多施設無作為化二重盲検並行生理食塩水対照第ＩＩ相試験（ＣＴＲＩ／２０１７／０３／００８１８４）が実施中である。すべての被験者はショックの標準治療を受けた（登録機関が提供する種類の治療およびケア）。患者は、通常生理食塩水と一緒に標準治療を受ける対照コホート（Ｎ＝７）、またはＰＭＺ－２０１０と一緒に標準治療を受けるＰＭＺ－２０１０コホート（Ｎ＝１２）のいずれかにランダムに割り当てられた。中間分析は、両方のコホートで同等の患者の個体群統計を示した（表２）
【0106】
【表2】
【0107】
治験薬ＰＭＺ－２０１０は安全性の主要評価項目を満たし、有害事象は報告されていない。ＰＭＺ－２０１０処置群で必要な用量数は、対照コホートで必要なものよりも少なかった（表３）。全入院期間のうち、ＰＭＺ－２０１０で処置された患者は、わずか３９．３％が集中治療室で過ごしたのに対し、対照群では５７．３％であった。人工呼吸器に費やされた時間は、ＰＭＺ－２０１０群の患者ではわずか０．８５±０．７１日であったが、対照群の患者では５．０９±３．１４日であった。蘇生の最初の４８時間に必要な総流体量は、ＰＭＺ－２０１０で処置された患者で１９．９％少なく、同様に、最初の４８時間に投与された総血液製剤は、対照と比較してＰＭＺ－２０１０処置群で２３．４％少なかった。収縮期血圧は、ベースライン（組み入れ時）から対照群の蘇生から４８時間後まで３４．５％増加したが、ＰＭＺ－２０１０処置群では４５．２％の増加が観察された（図９）。同様に、拡張期血圧は、蘇生から４８時間後に対照群で１５．４％増加し、一方ＰＭＺ－２０１０処置群では３４．９％増加した（図９）。蘇生の最初の４８時間に必要な昇圧剤の総量は、対照群では１８．４±１２．１ｍｇであったが、ＰＭＺ－２０１０処置患者では、わずか１．３±１．２ｍｇだけ必要であった。血中乳酸値は、対照群で４７％、ＰＭＺ－２０１０処置患者で６３％減少した。少数の患者の中間分析は、ＰＭＺ－２０１０が、その蘇生剤としての有効性を示す多くのパラメータを改善したことを示した。
【0108】
【表3】
【0109】
表３；第ＩＩ相試験の患者は、通常生理食塩水と一緒に標準治療を受ける対照コホート、またはＰＭＺ－２０１０と一緒に標準治療を受けるＰＭＺ－２０１０コホートのいずれかにランダムに割り当てられた。承認されたプロトコルによる中間分析は、ＰＭＺ－２０１０処置コホートで必要とされる用量数が対照コホートで必要とされた用量よりも少ないことを示した。統計的に有意ではないが、蘇生は標準治療よりも効果的であり、必要な用量が約２５％少ないことを示す傾向がある。
【0110】
血清クレアチニンレベルは、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院時（試験の終了時）に決定された。承認されたプロトコルによる中間分析は、血清クレアチニンレベルが対照コホートで２５．３５％、ＰＭＺ－２０１０処置患者で４２．６１％減少したことを示した。データは、ＰＭＺ－２０１０による血清クレアチニンレベルの低減が、標準治療と比較して１７．２６％多いことを示した。図１０を参照されたい。
【0111】
血中尿素窒素は、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院時（試験の終了時）に決定された。承認されたプロトコルによる中間分析は、血中尿素窒素が対照コホートおよびＰＭＺ－２０１０処置患者で同様であることを示した。図１１を参照されたい。
【0112】
糸球体濾過量は、患者が試験に導入されたとき（ベースライン）および退院時（試験の終了時）に決定された。承認されたプロトコルによる中間分析は、糸球体濾過量が対照コホートで４０．００％、ＰＭＺ－２０１０処置患者で８１．５２％増加したことを示した。データは、ＰＭＺ－２０１０による糸球体濾過量の増加が、標準治療と比較して４１．５２％多いことを示した。図１２を参照されたい。
【0113】
考察
急性腎不全の主な特徴は、糸球体濾過量（ＧＦＲ）の急激な低下であり、その結果、窒素廃棄物（尿素、クレアチニン）の保持をもたらす。一般的な世界の人口では、人口１００万人当たり、重度の急性腎不全の１７０～２００症例が毎年発生している。現在まで、急性腎不全に対する特定の治療法はない。いくつかの薬物は、異なる動物モデルにおける血清クレアチニンレベルの低下、組織学的損傷の低減、および腎機能のより迅速な回復によって明らかにされるように、毒性および虚血性の実験的急性腎不全を改善することが判明している。これらには、抗酸化剤、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、血管作用性物質、増殖因子、抗炎症剤などが挙げられる。しかしながら、臨床治験で試験されたこれらの薬物は効果を示さず、急性腎不全でのそれらの使用は承認されていない。前述の例は、急性腎不全の患者を予防および／または治療するためのセンタキンおよびその塩の使用を示している。
急性腎不全の主な特徴は、糸球体濾過量（ＧＦＲ）の急激な低下であり、その結果、窒素廃棄物（尿素、クレアチニン）の保持をもたらす。一般的な世界の人口では、人口１００万人当たり、重度の急性腎不全の１７０～２００症例が毎年発生している。現在まで、急性腎不全に対する特定の治療法はない。いくつかの薬物は、異なる動物モデルにおける血清クレアチニンレベルの低下、組織学的損傷の低減、および腎機能のより迅速な回復によって明らかにされるように、毒性および虚血性の実験的急性腎不全を改善することが判明している。これらには、抗酸化剤、カルシウムチャネル遮断薬、利尿薬、血管作用性物質、増殖因子、抗炎症剤などが挙げられる。しかしながら、臨床治験で試験されたこれらの薬物は効果を示さず、急性腎不全でのそれらの使用は承認されていない。前述の例は、急性腎不全の患者を予防および／または治療するためのセンタキンおよびその塩の使用を示している。
【0114】
センタキンは、ラット、ウサギ、およびブタのモデルで広範囲の出血を起こした後、有意な蘇生効果があることが示されている。センタキンは効果的な蘇生剤であることがわかり、血液量減少性ショックの患者の腎髄質への血流の増加および血清クレアチニンレベルの減少を誘発した。さらに、センタキンは血液量減少性ショックの患者の糸球体濾過量を増加させた。センタキンおよびその塩は、血管拡張作用をもたらし、利尿およびナトリウム利尿を促進し、糸球体濾過量を増加させ、血清クレアチニンレベルを減少させることによって腎機能を改善すると考えられている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】