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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-21
(45)【発行日】2024-03-29
(54)【発明の名称】凝固因子インヒビター力価の測定方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/86 20060101AFI20240322BHJP
G01N 33/48 20060101ALI20240322BHJP
【ＦＩ】
G01N33/86
G01N33/48 Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021516204
(86)(22)【出願日】2020-04-23
(86)【国際出願番号】 JP2020017507
(87)【国際公開番号】W WO2020218425
(87)【国際公開日】2020-10-29
【審査請求日】2023-03-13
(31)【優先権主張番号】P 2019086658
(32)【優先日】2019-04-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】390037327
【氏名又は名称】積水メディカル株式会社
(73)【特許権者】
【識別番号】507126487
【氏名又は名称】公立大学法人奈良県立医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】川辺 俊樹
(72)【発明者】
【氏名】小田 由紀夫
(72)【発明者】
【氏名】遠見 真理
(72)【発明者】
【氏名】嶋 緑倫
(72)【発明者】
【氏名】野上 恵嗣
(72)【発明者】
【氏名】荻原 建一
(72)【発明者】
【氏名】下西 成人
【審査官】海野 佳子
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１６－１９４４２６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１６－１１８４４２（ＪＰ，Ａ）
【文献】特開２０１７－１０６９２５（ＪＰ，Ａ）
【文献】和田英夫，APTT波形解析，日本血栓止血学会誌，2018年08月10日，第29巻第４号，第413-420頁
【文献】松本智子，凝固波形解析の活用法と見方，Medical Technology，2018年01月15日，Vol.46, No.1，pp.66-71
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
凝固因子インヒビターの力価の測定方法であって、被検血液検体と正常血液検体とを含む混合検体を調製すること；
該混合検体を加温し、該加温した混合検体についての凝固反応曲線を取得すること；
該加温を受けていない該混合検体の凝固反応曲線を取得すること；
該加温を受けていない該混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータを第１のパラメータとして算出すること；
該加温した混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータを第２のパラメータとして算出すること；
該第１のパラメータと第２のパラメータとの比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出すること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記凝固反応曲線に関するパラメータが、前記凝固反応曲線に関するパラメータ、該凝固反応曲線の一次微分曲線に関するパラメータ、及び該凝固反応曲線の二次微分曲線に関するパラメータからなる群より選択される少なくとも１種のパラメータである、請求項１記載の方法。【請求項3】
前記パラメータが、前記一次微分曲線又は二次微分曲線の所定領域の加重平均点に関係するパラメータである、請求項１又は２記載の方法。【請求項4】
前記加重平均点が、加重平均時間vT及び加重平均高さvHで規定される座標（vT, vH）で表される前記１次微分曲線の加重平均点であり、該vTと該vHが、該１次微分曲線をF(t)（tは時間）、F(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
【数1】
該加重平均点に関係するパラメータが、該vT、該vH、ピーク幅vB、加重平均ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、vABa及びvAWaからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅vBが、該t1からt2までのうちのF(t)≧Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
該vABが、該vHと該vBとの比を表し、
該vTBが、該vTと該vBとの比を表し、 該vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
該vTWが、該vTと該vWとの比を表し、 該vTa、該vHa、及び該vTmは、F(t)、t1及びt2が前記と同じ定義であり、F(t1)からF(t2)までのデータ点数をｎとするとき、それぞれ下記式で表され、
【数2】
該vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
請求項３記載の方法。
【請求項5】
前記加重平均点が、加重平均時間pT及び加重平均高さpHで規定される座標（pT, pH）で表される前記２次微分曲線のプラスピークの加重平均点であり、該pTと該pHが、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
【数3】
該ピーク幅pBが、該t1からt2までのうちのF'(t)≧Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅pWが、前記t1からt2までのF'(t)≧pHとなる時間長であり、
該pABが、該pHと該pBとの比を表し、
該pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
該pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
該pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
請求項３記載の方法。
【請求項6】
前記加重平均点が、加重平均時間mT及び加重平均高さmHで規定される座標（mT, mH）で表される前記２次微分曲線のマイナスピークの加重平均点であり、該mTと該mHが、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
【数4】
該加重平均点に関係するパラメータが、該mT、該mH、ピーク幅mB、加重平均ピーク幅mW、B扁平率mAB、B時間率mTB、W扁平率mAW、及びW時間率mTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅mBが、該t1からt2までのうちのF'(t)≦Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅mWが、前記t1からt2までのF'(t)≦mHとなる時間長であり、
該mABが、該mHと該mBとの比を表し、
該mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
該mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
該mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
請求項３記載の方法。
【請求項7】
前記第１のパラメータと第２のパラメータとの比又は差から、検量線に基づいて、前記被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価が算出される、請求項１～６のいずれか１項記載の方法。【請求項8】
前記凝固因子が血液凝固第VIII因子である、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。【請求項9】
前記混合検体が、前記被検血液検体と前記正常血液検体を１：９～９：１の容量比で含む、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。【請求項10】
前記被検血液検体を前記正常血液検体と混合する前に希釈するか、又は調製した前記混合検体を希釈することをさらに含む、請求項９記載の方法。【請求項11】
前記混合検体の加温が３０℃以上４０℃以下で２～３０分間行われる、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。【請求項12】
前記被検血液検体が、前記凝固因子インヒビターの存在に起因してＡＰＴＴの延長を示す血液検体である、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。【請求項13】
前記凝固因子インヒビターの力価がベセスダ単位で算出される、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。 【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、血液検体の凝固因子インヒビター力価の測定方法に関する。
【背景技術】
【0002】
血液凝固検査は、患者の血液検体に所定の試薬を添加して血液凝固時間等を測定することにより、患者の血液凝固機能を診断するための検査である。血液凝固検査によって患者の止血能力や線溶能力の状態を把握することができる。血液凝固時間の典型的な例としては、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、トロンビン時間などがある。近年では、血液凝固検査の自動測定を行う自動分析装置も汎用されており、血液凝固検査を簡便に実施することが可能である。
【0003】
血液凝固時間の延長が生じる原因としては、凝固阻害薬剤の影響、凝固関与成分の減少、先天的な血液凝固因子の欠乏、後天的な凝固反応を阻害する自己抗体などが挙げられる。例えば、ＡＰＴＴの延長が見られた場合、一般的にはクロスミキシング試験が行われ、ＡＰＴＴの延長が凝固因子インヒビター（抗凝固因子）、ループスアンチコアグラント（ＬＡ）、又は血友病等の凝固因子欠乏のうち何れに起因するかが判定される。クロスミキシング試験では正常血漿、被検血漿、及び被検血漿と正常血漿とを様々な容量比で含む混合血漿の、混合直後のＡＰＴＴ（即時反応）と２時間３７℃でインキュベーションした後のＡＰＴＴ（遅延反応）とが測定される。測定値は、縦軸をＡＰＴＴ測定値（秒）、横軸を被検血漿と正常血漿の容量比としてグラフ化される。作成された即時反応及び遅延反応のグラフは、ＡＰＴＴ延長要因に応じてそれぞれ「下に凸」、「直線」又は「上に凸」のパターンを示す。これら即時反応及び遅延反応のパターンに基づいて、ＡＰＴＴ延長要因が判定される。
【0004】
ＡＰＴＴ延長が凝固因子インヒビターに起因すると判定された場合、一般的にはベセスダ（Bethesda）法によりインヒビター力価が測定される。ベセスダ法では、被検血漿の希釈系列と正常血漿とを混合したサンプルを３７℃で２時間加温した後、該サンプルにおける凝固因子の残存活性を測定し、測定値から検量線に基づいて該凝固因子のインヒビターの力価を測定する。ベセスダ法は現在、凝固第VIII因子（FVIII）及び第IX因子（FIX）に対するインヒビター力価の標準的な定量法である。
【0005】
血液凝固検査においては、血液検体への試薬添加後の血液凝固反応量を経時的に測定することにより、凝固反応曲線を求めることができる。この凝固反応曲線は、血液凝固系の異常のタイプに応じてそれぞれ異なる形状を有する（非特許文献１）。そのため、凝固反応曲線に基づいて血液凝固系の異常を判定する方法が開示されている。例えば、特許文献１～３には、患者の血液についての凝固反応曲線の一次微分曲線及び二次微分曲線に関するパラメータ、例えば最大凝固速度、最大凝固加速度及び最大凝固減速度などに基づいて、該患者における凝固因子の異常の有無を評価する方法が記載されている。特許文献４には、患者の凝固反応が最大凝固速度又は最大凝固加速度に達する時間までの凝固速度の平均変化率に基づいて、血友病の重症度を判定する方法が記載されている。特許文献５には、患者血漿の希釈倍率に対する凝固時間を表す直線の傾きと、対照血漿の希釈倍率に対する凝固時間を表す直線の傾きとの比に基づいて、FVIIIインヒビターの存在を判定する方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】特開２０１６－１９４４２６号公報
【文献】特開２０１６－１１８４４２号公報
【文献】特開２０１７－１０６９２５号公報
【文献】特開２０１８－０１７６１９号公報
【文献】特開２０１８－５１７１５０号公報
【非特許文献】
【0007】
【文献】British Journal of Haematology, 1997, 98:68-73
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
ベセスダ法は、サンプルの加温時間を含め測定に２時間以上の長い時間を要するうえ、分析装置による自動測定には不向きである。さらに上述のクロスミキシング試験の時間も考慮すると、ベセスダ法による現在のインヒビター力価測定は、多大な労力及び時間を要求する。ベセスダ法に関しては、日本血栓止血学会の用語集（www. jsth.org/glossary/）の「インヒビター（抗凝固因子）測定」に「基準値は“検出されない”であり、０．５ＢＵ／ｍｌ以上を陽性と判断する。」、「０～０．５ＢＵ／ｍｌの範囲を精度よく測定するのは困難である。」との記載があることから、検出下限値は０．５ＢＵ／ｍＬとされている。
【0009】
したがって、簡便かつ短時間に凝固因子インヒビターの力価を測定する方法が求められている。インヒビター力価測定を自動化することができればなお望ましい。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者は、被検血液検体と正常血液検体との混合検体を短時間加温処理したものと該加温処理をしなかったものについての凝固反応曲線に由来する各種パラメータを用いることで、従来法と比べて極めて短時間に凝固因子インヒビターの力価を測定できることを見出した。
【0011】
本発明は、以下を提供する。
〔１〕凝固因子インヒビターの力価の測定方法であって、
被検血液検体と正常血液検体とを含む混合検体を調製すること；
該混合検体を加温し、該加温した混合検体についての凝固反応曲線を取得すること；
該加温を受けていない該混合検体の凝固反応曲線を取得すること；
該加温を受けていない該混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータを第１のパラメータとして算出すること；
該加温した混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータを第２のパラメータとして算出すること；
該第１のパラメータと第２のパラメータとの比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出すること、
を含む、方法。
〔２〕前記凝固反応曲線に関するパラメータが、前記凝固反応曲線に関するパラメータ、該凝固反応曲線の一次微分曲線に関するパラメータ、及び該凝固反応曲線の二次微分曲線に関するパラメータからなる群より選択される少なくとも１種のパラメータである、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記パラメータが、前記一次微分曲線又は二次微分曲線の所定領域の加重平均点に関係するパラメータである、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記加重平均点が、加重平均時間vT及び加重平均高さvHで規定される座標（vT, vH）で表される前記１次微分曲線の加重平均点であり、
該vTと該vHが、該１次微分曲線をF(t)（tは時間）、F(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
かつ、
該加重平均点に関係するパラメータが、該vT、該vH、ピーク幅vB、加重平均ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、vABa及びvAWaからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅vBが、該t1からt2までのうちのF(t)≧Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
該vABが、該vHと該vBとの比を表し、
該vTBが、該vTと該vBとの比を表し、
該vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
該vTWが、該vTと該vWとの比を表し、
該vTa、該vHa、及び該vTmは、F(t)、t1及びt2が前記と同じ定義であり、F(t1)からF(t2)までのデータ点数をｎとするとき、それぞれ下記式で表され、
該vABaが、該vHaと該vBとの比を表し、
該vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
〔３〕記載の方法。
〔５〕前記加重平均点が、加重平均時間pT及び加重平均高さpHで規定される座標（pT, pH）で表される前記２次微分曲線のプラスピークの加重平均点であり、
該pTと該pHが、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
かつ、
該加重平均点に関係するパラメータが、該pT、該pH、ピーク幅pB、加重平均ピーク幅pW、B扁平率pAB、B時間率pTB、W扁平率pAW、及びW時間率pTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅pBが、該t1からt2までのうちのF'(t)≧Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅pWが、前記t1からt2までのF'(t)≧pHとなる時間長であり、
該pABが、該pHと該pBとの比を表し、
該pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
該pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
該pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
〔３〕記載の方法。
〔６〕前記加重平均点が、加重平均時間mT及び加重平均高さmHで規定される座標（mT, mH）で表される前記２次微分曲線のマイナスピークの加重平均点であり、
該mTと該mHが、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
かつ、
該加重平均点に関係するパラメータが、該mT、該mH、ピーク幅mB、加重平均ピーク幅mW、B扁平率mAB、B時間率mTB、W扁平率mAW、及びW時間率mTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅mBが、該t1からt2までのうちのF'(t)≦Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅mWが、前記t1からt2までのF'(t)≦mHとなる時間長であり、
該mABが、該mHと該mBとの比を表し、
該mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
該mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
該mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
〔３〕記載の方法。
〔７〕前記第１のパラメータと第２のパラメータとの比又は差から、検量線に基づいて、前記被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価が算出される、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記凝固因子が血液凝固第VIII因子である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記混合検体が、前記被検血液検体と前記正常血液検体を１：９～９：１の容量比で含む、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記被検血液検体を前記正常血液検体と混合する前に希釈するか、又は調製した前記混合検体を希釈することをさらに含む、〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記混合検体の加温が３０℃以上４０℃以下で２～３０分間行われる、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕前記被検血液検体が、前記凝固因子インヒビターの存在に起因してＡＰＴＴの延長を示す血液検体である、〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕前記凝固因子インヒビターの力価がベセスダ単位で算出される、〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
〔１〕凝固因子インヒビターの力価の測定方法であって、
被検血液検体と正常血液検体とを含む混合検体を調製すること；
該混合検体を加温し、該加温した混合検体についての凝固反応曲線を取得すること；
該加温を受けていない該混合検体の凝固反応曲線を取得すること；
該加温を受けていない該混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータを第１のパラメータとして算出すること；
該加温した混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータを第２のパラメータとして算出すること；
該第１のパラメータと第２のパラメータとの比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出すること、
を含む、方法。
〔２〕前記凝固反応曲線に関するパラメータが、前記凝固反応曲線に関するパラメータ、該凝固反応曲線の一次微分曲線に関するパラメータ、及び該凝固反応曲線の二次微分曲線に関するパラメータからなる群より選択される少なくとも１種のパラメータである、〔１〕記載の方法。
〔３〕前記パラメータが、前記一次微分曲線又は二次微分曲線の所定領域の加重平均点に関係するパラメータである、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記加重平均点が、加重平均時間vT及び加重平均高さvHで規定される座標（vT, vH）で表される前記１次微分曲線の加重平均点であり、
該vTと該vHが、該１次微分曲線をF(t)（tは時間）、F(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
【数1】
該加重平均点に関係するパラメータが、該vT、該vH、ピーク幅vB、加重平均ピーク幅vW、B扁平率vAB、B時間率vTB、W扁平率vAW、W時間率vTW、平均時間vTa、平均高さvHa、vTm、vABa及びvAWaからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅vBが、該t1からt2までのうちのF(t)≧Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅vWが、前記t1からt2までのF(t)≧vHとなる時間長であり、
該vABが、該vHと該vBとの比を表し、
該vTBが、該vTと該vBとの比を表し、
該vAWが、該vHと該vWとの比を表し、
該vTWが、該vTと該vWとの比を表し、
該vTa、該vHa、及び該vTmは、F(t)、t1及びt2が前記と同じ定義であり、F(t1)からF(t2)までのデータ点数をｎとするとき、それぞれ下記式で表され、
【数2】
該vAWaが、該vHaと該vWとの比を表す、
〔３〕記載の方法。
〔５〕前記加重平均点が、加重平均時間pT及び加重平均高さpHで規定される座標（pT, pH）で表される前記２次微分曲線のプラスピークの加重平均点であり、
該pTと該pHが、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
【数3】
該加重平均点に関係するパラメータが、該pT、該pH、ピーク幅pB、加重平均ピーク幅pW、B扁平率pAB、B時間率pTB、W扁平率pAW、及びW時間率pTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅pBが、該t1からt2までのうちのF'(t)≧Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅pWが、前記t1からt2までのF'(t)≧pHとなる時間長であり、
該pABが、該pHと該pBとの比を表し、
該pTBが、該pTと該pBとの比を表し、
該pAWが、該pHと該pWとの比を表し、
該pTWが、該pTと該pWとの比を表す、
〔３〕記載の方法。
〔６〕前記加重平均点が、加重平均時間mT及び加重平均高さmHで規定される座標（mT, mH）で表される前記２次微分曲線のマイナスピークの加重平均点であり、
該mTと該mHが、該２次微分曲線をF'(t)（tは時間）、F'(t)が所定値Xである時間をt1、t2（t1<t2）とするとき、下記式で表され、
【数4】
該加重平均点に関係するパラメータが、該mT、該mH、ピーク幅mB、加重平均ピーク幅mW、B扁平率mAB、B時間率mTB、W扁平率mAW、及びW時間率mTWからなる群より選択される１つ以上のパラメータを含み、
該ピーク幅mBが、該t1からt2までのうちのF'(t)≦Xとなる時間長であり、
該加重平均ピーク幅mWが、前記t1からt2までのF'(t)≦mHとなる時間長であり、
該mABが、該mHと該mBとの比を表し、
該mTBが、該mTと該mBとの比を表し、
該mAWが、該mHと該mWとの比を表し、
該mTWが、該mTと該mWとの比を表す、
〔３〕記載の方法。
〔７〕前記第１のパラメータと第２のパラメータとの比又は差から、検量線に基づいて、前記被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価が算出される、〔１〕～〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記凝固因子が血液凝固第VIII因子である、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記混合検体が、前記被検血液検体と前記正常血液検体を１：９～９：１の容量比で含む、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕前記被検血液検体を前記正常血液検体と混合する前に希釈するか、又は調製した前記混合検体を希釈することをさらに含む、〔９〕記載の方法。
〔１１〕前記混合検体の加温が３０℃以上４０℃以下で２～３０分間行われる、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕前記被検血液検体が、前記凝固因子インヒビターの存在に起因してＡＰＴＴの延長を示す血液検体である、〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法。
〔１３〕前記凝固因子インヒビターの力価がベセスダ単位で算出される、〔１〕～〔１２〕のいずれか１項記載の方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によれば、従来法と比べて極めて短時間に凝固因子インヒビターの力価を測定することができる。また本発明の方法は、従来のベセスダ法に比べてより高感度なインヒビター力価測定を可能にする。さらに本発明の方法は、従来の血液凝固検査に用いられる自動分析装置への応用も可能であることから、測定に要する労力を大きく低減させることができる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】本発明による凝固因子インヒビター力価の測定方法の手順の一実施形態。
【図3】凝固反応曲線の一例。
【図4】ベースライン調整後の凝固反応曲線の一例。
【図5】Ａ：凝固反応曲線の一例の部分拡大図、Ｂ：ベースライン調整後の凝固反応曲線の一例の部分拡大図。
【図6】補正処理済み凝固反応曲線の一例。
【図7】Ａ：補正１次曲線の一例。Ｂ：補正２次曲線の一例。
【図8】１次曲線から算出されるパラメータの概念図。
【図9】演算対象域値、解析対象となる補正０次曲線及び補正１次曲線の範囲、ならびに加重平均点について説明するための概念図。
【図10】２次曲線から算出されるパラメータの概念図。
【図11】加重平均点と、vTs、vTe、vB、vWを示す概念図。点線は、１次曲線の10％演算対象域を示す。
【図12】vTa、vHa、vTmを示す概念図。
【図12-2】Ａ：演算対象域値が10%の場合の加重平均点などについて説明するための概念図、Ｂ：演算対象域値が80%の場合の加重平均点などについて説明するための概念図。
【図13】ＬＡ検体の加温及び非加温での補正１次曲線。
【図14】FVIIIインヒビター陽性検体の加温及び非加温での補正１次曲線。
【図15】加温検体及び非加温検体の補正１次曲線。Ａ：ＬＡ陽性検体と正常検体との混合検体（ＬＡ－ＮＰ）、Ｂ：FVIIIインヒビター陽性検体と正常検体との混合検体（ＩＮ－ＮＰ）。
【図16】各種凝固因子の濃度によるパラメータ値の変化の一例。
【図17】Ａ：パラメータ群の回帰直線。Ｂ：被検検体と参照の補正１次曲線。Sample AF：被検検体、Template A：参照。
【図18A】各種検体のＡＰＴＴについての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図18B】各種検体のVmaxについての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図18C】各種検体のAmaxについての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図18D】各種検体のvB10％についての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図18E】各種検体のvT10％についての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図18F】各種検体のvAB10％についての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図18G】各種検体のvTB10％についての、Ｐａ、Ｐｂ、Ｐａ／Ｐｂ、及びＰｂ－Ｐａの分布。
【図19】Ａ：インヒビター含有混合検体のＡＰＴＴのＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図20】Ａ：インヒビター含有混合検体のVmaxのＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図21】Ａ：インヒビター含有混合検体のAmaxのＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図22】Ａ：インヒビター含有混合検体のVmaxTのＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図23】Ａ：インヒビター含有混合検体のAmaxTのＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図24】Ａ：インヒビター含有混合検体のvT10%のＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図25】Ａ：インヒビター含有混合検体のvAB10%のＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図26】Ａ：インヒビター含有混合検体のT5のＰｂ／Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図27】Ａ：インヒビター含有混合検体のT5のＰｂ－Ｐａの、被検検体のインヒビター力価の実測値に対するプロット。Ｂ：検量線。Ｃ：被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、Ｂに示す検量線に基づく演算値のプロット。Ｄ：低力価領域についての実測値に対する演算値のプロット。図中、力価は対数値で表されている。
【図28】高インヒビター力価検体の希釈検体から求めた演算力価を含む、演算力価の実測力価に対するプロット。
【発明を実施するための形態】
【0014】
本発明の一実施形態について、以下に図面を参照して説明する。本実施形態は、血液検体、好ましくは凝固時間延長を示す血液検体、さらに好ましくは、凝固因子インヒビターの存在に起因する凝固時間延長を示す血液検体における凝固因子インヒビターの力価測定に関する。
【0015】
１．測定方法
１．１．方法の概要
本実施形態に係る凝固因子インヒビターの力価の測定方法（以下、本発明の方法ともいう）においては、被検血液検体と正常血液検体とを含む混合検体を調製し、次いで加温した又は該加温なしの該混合検体それぞれの凝固反応曲線を取得し、該曲線に関するパラメータを算出する。次いで、該加温した又は該加温なしの混合検体から算出したパラメータの間の比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出する。好ましくは、本発明の方法において、該凝固因子インヒビター力価はベセスダ単位（ＢＵ／ｍＬ）として算出される。
１．１．方法の概要
本実施形態に係る凝固因子インヒビターの力価の測定方法（以下、本発明の方法ともいう）においては、被検血液検体と正常血液検体とを含む混合検体を調製し、次いで加温した又は該加温なしの該混合検体それぞれの凝固反応曲線を取得し、該曲線に関するパラメータを算出する。次いで、該加温した又は該加温なしの混合検体から算出したパラメータの間の比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出する。好ましくは、本発明の方法において、該凝固因子インヒビター力価はベセスダ単位（ＢＵ／ｍＬ）として算出される。
【0016】
本発明の方法の一実施形態の概要を、図１に示すフローチャートを参照して説明する。本方法では、まず、被検検体を含む混合検体が調製され（ステップ１）、次いで加温した該混合検体及び該加温なしの該混合検体それぞれの凝固反応計測が実行され（ステップ２）、次いで、得られた計測データが解析されて、該加温した検体及び該加温なし検体それぞれの凝固反応曲線に関するパラメータが取得される（ステップ３）。得られた該加温した検体及び該加温なし検体についてのパラメータに基づいて、該被検検体の凝固因子インヒビター力価が算出される（ステップ４）。
【0017】
１．２．検体調製及び凝固反応計測
初めに、血液検体（以下、単に検体ともいう）が調製される（ステップ１）。該血液検体としては、好ましくは血漿が用いられる。該検体には、凝固検査に通常用いられる周知の抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血された後、遠心分離されることで血漿が得られる。本発明の方法においては、凝固因子インヒビター力価測定が求められている被検者に由来する血液検体（被検血液検体、又は単に被検検体ともいう）を正常血液検体（又は単に正常検体ともいう）と所定の容量比で混合した混合検体が調製され得る。
初めに、血液検体（以下、単に検体ともいう）が調製される（ステップ１）。該血液検体としては、好ましくは血漿が用いられる。該検体には、凝固検査に通常用いられる周知の抗凝固剤が添加され得る。例えば、クエン酸ナトリウム入り採血管を用いて採血された後、遠心分離されることで血漿が得られる。本発明の方法においては、凝固因子インヒビター力価測定が求められている被検者に由来する血液検体（被検血液検体、又は単に被検検体ともいう）を正常血液検体（又は単に正常検体ともいう）と所定の容量比で混合した混合検体が調製され得る。
【0018】
当該被検検体の例としては、血液凝固検査でＡＰＴＴ延長を示す血液検体、好ましくは、凝固因子インヒビターの存在に起因する凝固時間（例えば、ＡＰＴＴ）の延長を示す血液検体が挙げられる。より好ましくは、該被検検体は、既にクロスミキシング試験等により凝固因子インヒビターの存在に起因する凝固時間延長を示すことが確認されており、かつ凝固因子活性検査により該インヒビターが阻害する凝固因子の種類が同定されている検体である。
【0019】
あるいは、該被検検体は、凝固時間（例えば、ＡＰＴＴ）の延長を示すことが確認されているが、該凝固時間の延長の原因が未知の検体であってもよい。本発明の方法では、後述する２．１～２．２に記載する手法により、被検検体のＡＰＴＴ延長要因の判定（例えばＡＰＴＴ延長が凝固因子インヒビターの存在に起因するか否か、又は該インヒビターに阻害されている凝固因子の種類の判定）が可能である。したがって、被検検体のＡＰＴＴ延長要因の判定の手順を、力価測定の手順に先立って、又は並行して行うことにより、予めクロスミキシング試験等を行うことなく、凝固反応計測（ＡＰＴＴ測定）と、それにより得られた凝固反応曲線に関する解析を行うだけで、凝固因子インヒビター力価を測定することを可能にし得る。
【0020】
混合検体の調製では、被検検体と、別途に準備した正常検体とが所定の比率で混合される。該被検検体と該正常検体との混合比は、合計を１０容量とした容量比で、被検検体：正常検体＝１：９～９：１の範囲であればよく、好ましくは４：６～６：４の範囲、より好ましくは５：５である。なお、被検検体の凝固因子インヒビター力価が高い場合には、被検検体を、正常検体と混合する前に予め２～１００倍程度に希釈し、得られた希釈検体を上記の容量比で正常検体と混合して、混合検体を調製してもよい。被検検体の希釈には、正常血漿、緩衝液、FVIII欠乏血漿などを用いることができる。あるいは、被検検体と正常検体とを上記の容量比で含む混合検体を、被検検体の最終的な容量比が１／２～１／１００程度になるように正常検体で希釈して、希釈混合検体を調製してもよい。
【0021】
調製された混合検体の一部は、加温される。該加温の温度は、例えば３０℃以上４０℃以下であればよく、好ましくは３５℃以上３９℃以下、より好ましくは３７℃である。該加温の時間は、例えば、２～３０分間の範囲であればよく、好ましくは５～３０分間である。該加温時間はさらに長くてもよいが、好ましくは１時間以内、最大でも２時間以内である。本明細書においては、本発明の方法で用いられる上記の加温処理で得られた混合検体を「加温検体」とも称する。一方、本発明の方法では、上記の加温処理を受けていない混合検体も用いられ、これを本明細書では「非加温検体」とも称する。ただし、該「非加温検体」は、通常の凝固反応計測における検体の予備的加温処理、例えば、３０℃以上４０℃以下で１分以下の加温を受けていてもよく、その場合、該「加温検体」は、上記の加温処理に加えて、該予備的加温処理を受けていてもよい。
【0022】
本発明の方法では、当該加温検体及び非加温検体についての凝固反応計測が行われる（ステップ２）。したがって、本発明の方法においては、調製された混合検体のうち、一部は上記の加温処理後に凝固反応計測が行われ得、一部は該加温処理なしで凝固反応計測が行われ得る。該凝固反応計測は、具体的にはＡＰＴＴ測定である。該加温検体と非加温検体の凝固反応計測の順序は、特に限定されない。例えば、該混合検体の一部を加温した後、該加温検体と、非加温検体との凝固反応計測を行ってもよく、又は非加温検体の凝固反応計測を行った後に、加温検体の凝固反応計測を行ってもよい。
【0023】
凝固反応計測される混合検体は、凝固時間測定試薬と混和されて、凝固反応計測用の検体溶液へと調製される。該凝固時間測定試薬は、ＡＰＴＴ測定のための試薬であればよく、例えば接触因子系の活性化剤とリン脂質とが挙げられる。活性化剤の例としては、エラグ酸、セライト、カオリン、シリカ、ポリフェノール化合物などが挙げられる。リン脂質の例としては、動物由来、植物由来、合成由来のリン脂質などが挙げられる。動物由来のリン脂質の例としては、ウサギ脳由来、ニワトリ由来、ブタ由来のものが挙げられる。植物由来のリン脂質の例としては、大豆由来のものが挙げられる。また、該検体溶液には、必要に応じて、トリス塩酸等の緩衝液が添加されてもよい。あるいは、該ＡＰＴＴ測定のための試薬には、市販のＡＰＴＴ測定試薬を用いてもよい。市販のＡＰＴＴ測定試薬の例としては、コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。調製された検体溶液は加温され、該溶液中の接触因子は活性化される。該加温の温度は、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。
【0024】
その後、上記検体溶液に塩化カルシウム液（カルシウムイオン）が添加され、血液凝固反応が開始される。塩化カルシウム液添加後の溶液の凝固反応が計測され得る。凝固反応の計測には、一般的な手段、例えば、散乱光量、透過度、吸光度等を計測する光学的な手段、又は血漿の粘度を計測する力学的な手段などを用いればよい。計測される時間は、例えば、塩化カルシウム液の添加時点から数十秒～５分程度であり得る。該計測時間の間、所定の間隔で計測が繰り返し行われ得る。例えば、０．１秒間隔で計測が行われればよい。計測中の反応液の温度は、例えば３０℃以上４０℃以下、好ましくは３５℃以上３９℃以下である。凝固反応の反応開始時間は、典型的には該検体溶液に塩化カルシウム液が添加された時点として定義され得るが、他のタイミングが反応開始時間として定義されてもよい。また、計測の各種条件は、検体や試薬、計測手段等に応じて適宜設定され得る。
【0025】
上述の凝固反応計測における一連の操作は、自動分析装置を用いて行われてもよい。自動分析装置の一例として、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）が挙げられる。あるいは、一部の操作が手作業で行われてもよい。例えば、検体や凝固反応計測用の検体溶液の調製を人間が行い、それ以降の操作は自動分析装置で行うことができる。
【0026】
１．３．データ解析
１．３．１．データのベースライン調整及び補正処理
次に、凝固反応計測で得られたデータに対する所定の解析が行われる（ステップ３）。ステップ３のデータ解析について説明する。データ解析のフローの一実施形態を図２に示す。ステップ３でのデータ解析は、ステップ２の凝固反応計測と並行して行われてもよく、又は予め測定した凝固反応計測のデータを用いて、後から行われてもよい。ステップ３のデータ解析は、加温検体及び非加温検体のそれぞれについて行われる。以下のステップ３ａ～３ｅの手順は、基本的には加温検体及び非加温検体で共通である。
１．３．１．データのベースライン調整及び補正処理
次に、凝固反応計測で得られたデータに対する所定の解析が行われる（ステップ３）。ステップ３のデータ解析について説明する。データ解析のフローの一実施形態を図２に示す。ステップ３でのデータ解析は、ステップ２の凝固反応計測と並行して行われてもよく、又は予め測定した凝固反応計測のデータを用いて、後から行われてもよい。ステップ３のデータ解析は、加温検体及び非加温検体のそれぞれについて行われる。以下のステップ３ａ～３ｅの手順は、基本的には加温検体及び非加温検体で共通である。
【0027】
ステップ３ａにおいて、上記凝固反応計測での計測データが取得される。このデータは、例えば上述のステップ２でのＡＰＴＴ測定で得られる、検体の凝固反応過程を反映するデータである。例えば、検体と凝固時間測定試薬とを含む反応液の塩化カルシウム液添加後の凝固反応の進行量（例えば散乱光量）の時間変化を示すデータが取得される。これら凝固反応計測で得られたデータを、本明細書において凝固反応情報とも称する。
【0028】
ステップ３ａで取得される凝固反応情報の一例を図３に示す。図３は散乱光量に基づく凝固反応曲線であり、横軸は塩化カルシウム液の添加後の経過時間（凝固反応時間）を示し、縦軸は散乱光量を示す。時間経過とともに、検体の凝固反応が進むため、散乱光量は増加している。本明細書では、このような散乱光量等で示される凝固反応時間に対する凝固反応量の変化を示す曲線を、凝固反応曲線と称する。
【0029】
図３に示すような散乱光量に基づく凝固反応曲線は、通常、シグモイド状である。一方、透過光量に基づく凝固反応曲線は、通常、逆シグモイド状である。以降の本明細書では、凝固反応情報として散乱光量に基づく凝固反応曲線を用いたデータ解析について説明する。凝固反応情報として透過光量や吸光度に基づく凝固反応曲線を用いたデータ解析の場合にも同様の処理が行われ得ることは、当業者に明らかである。あるいは、凝固反応情報として、混合液の粘度変化等の力学的な手段で得られた凝固反応曲線が解析対象にされてもよい。
【0030】
ステップ３ｂにおいて、凝固反応曲線のベースライン調整が行われる。該ベースライン調整には、ノイズを除去するための平滑化処理と、ゼロ点調整とが含まれる。図４は、ベースライン調整（平滑化処理及びゼロ点調整）された図３の凝固反応曲線の一例を示す。平滑化処理には、公知のノイズ除去方法の何れかが用いられ得る。また図３に示すように、検体を含む反応液は元々光を散乱させるため、測定開始時点（時間0）での散乱光量は0より大きい。平滑化処理後のゼロ点調整により、図４に示すように時間0での散乱光量が0に調整される。図５Ａ及びＢは、それぞれ、ベースライン調整前及び後の図３の凝固反応曲線の部分拡大図を示す。図５Ｂでは、図５Ａのデータに対して、平滑化処理及びゼロ点調整が行われている。
【0031】
凝固反応曲線の高さは、検体のフィブリノゲン濃度に依存する。一方、フィブリノゲン濃度には個人差があるため、該凝固反応曲線の高さは検体によって異なる。したがって、本方法では、必要に応じて、ステップ３ｃにおいてベースライン調整後の凝固反応曲線を相対値化するための補正処理が行われる。該補正処理によって、フィブリノゲン濃度に依存しない凝固反応曲線を得ることができ、それにより検体間でのベースライン調整後の凝固反応曲線の形状の差異を定量的に比較することができるようになる。
【0032】
一実施形態において、当該補正処理では、ベースライン調整後の凝固反応曲線を、最大値が所定値となるように補正する。好適には、当該補正処理では、下記式(1)に従って、ベースライン調整後の凝固反応曲線から補正凝固反応曲線P(t)を求める。式(1)中、D(t)はベースライン調整後の凝固反応曲線を表し、Dmax及びDminは、それぞれD(t)の最大値及び最小値を表し、Drangeは、D(t)の変化幅（すなわちDmax-Dmin）を表し、Aは、補正凝固反応曲線の最大値を表す。
P(t)=[(D(t)-Dmin)/Drange]×A (1)
P(t)=[(D(t)-Dmin)/Drange]×A (1)
【0033】
一例として、図６に、図４に示す凝固反応曲線が最大値100となるように補正されたデータを示す。なお、図６では補正後の値が0から100までとなるように補正したが、他の値（例えば0から10000まで、すなわち式(1)でA=10000）であってもよい。また、この補正処理は必ずしも行われなくてもよい。
【0034】
あるいは、上述のような補正処理は、後述する凝固速度に関する波形、又は該波形から抽出したパラメータ群に対して行われてもよい。すなわち、補正処理が行われないベースライン調整後の凝固反応曲線D(t)について凝固速度に関する波形を算出した後、これをP(t)に相当する値に変換することができる。あるいは、該凝固速度に関する波形からパラメータ群を抽出した後、該パラメータ群に含まれる個々のパラメータの値をP(t)に相当する値に変換することができる。
【0035】
１．３．２．凝固速度に関する波形の算出
ステップ３ｄでは、凝固反応曲線を微分した微分曲線が算出される。本明細書において、該微分曲線としては、凝固反応曲線（上記の補正処理あり又はなし）の一回微分によって得られる一次微分曲線と、該凝固反応曲線の二回微分（あるいは一次微分曲線の一回微分）によって得られる二次微分曲線が挙げられる。一次微分曲線には、未補正一次微分曲線（凝固速度曲線）と、補正一次微分曲線とが含まれる。凝固速度曲線は、凝固反応曲線（補正処理なし）を一回微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の変化率（凝固速度）を表す。補正一次微分曲線は、凝固反応曲線（補正処理あり）を一回微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の相対変化率（本明細書において凝固進行率と称する場合がある）を表す。したがって、該一次微分曲線は、検体の凝固反応における凝固速度又はその相対値を表す波形であり得る。
ステップ３ｄでは、凝固反応曲線を微分した微分曲線が算出される。本明細書において、該微分曲線としては、凝固反応曲線（上記の補正処理あり又はなし）の一回微分によって得られる一次微分曲線と、該凝固反応曲線の二回微分（あるいは一次微分曲線の一回微分）によって得られる二次微分曲線が挙げられる。一次微分曲線には、未補正一次微分曲線（凝固速度曲線）と、補正一次微分曲線とが含まれる。凝固速度曲線は、凝固反応曲線（補正処理なし）を一回微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の変化率（凝固速度）を表す。補正一次微分曲線は、凝固反応曲線（補正処理あり）を一回微分して得られる値、すなわち任意の凝固反応時間における凝固反応量の相対変化率（本明細書において凝固進行率と称する場合がある）を表す。したがって、該一次微分曲線は、検体の凝固反応における凝固速度又はその相対値を表す波形であり得る。
【0036】
二次微分曲線は、凝固反応曲線（補正処理あり又はなし）の二回微分によって得られる。凝固反応曲線（補正処理なし）に由来する二次微分曲線は、凝固加速度曲線とも称され、その時間に対する値は凝固加速度を示す。凝固反応曲線（補正処理あり）に由来する二次微分曲線は、補正二次微分曲線とも称され、凝固進行率の時間変化率を表す。
【0037】
なお、本明細書においては、補正処理済み凝固反応曲線、及び補正処理なし凝固反応曲線を、それぞれ補正０次曲線、及び未補正０次曲線ともいい、またこれらを総称して「０次曲線」ともいう。また本明細書においては、該補正０次曲線、及び該未補正０次曲線の一次微分曲線を、それぞれ補正１次曲線、及び未補正１次曲線ともいい、またこれらを総称して「１次曲線」ともいう。また本明細書においては、該補正０次曲線、及び該未補正０次曲線の二回微分曲線、あるいは該補正１次曲線、及び該未補正１次曲線の一回微分曲線を、それぞれ補正２次曲線、及び未補正２次曲線ともいい、またこれらを総称して「２次曲線」ともいう。
【0038】
また本明細書では、由来する凝固反応曲線の補正処理あり、補正処理なしに係わらず、１次曲線による凝固の進行を表す値を総称して１次微分値ともいう。また本明細書では、由来する凝固反応曲線の補正処理あり、補正処理なしに係わらず、２次曲線による１次微分値の変化率を表す値を総称して２次微分値という。
【0039】
当該０次曲線及び１次曲線の微分は、公知の手法を用いて行うことができる。図７Ａは、図６に示す補正０次曲線を一回微分して得られる補正１次曲線を示す。図７Ａの横軸は凝固反応時間を表し、縦軸は１次微分値を表す。図７Ｂは、図７Ａに示す補正１次曲線を一回微分して得られる補正２次曲線を示す。図７Ｂの横軸は凝固反応時間を表し、縦軸は２次微分値を表す。
【0040】
１．３．３．パラメータの抽出
ステップ３ｅでは、上記の０次曲線、１次曲線、又は２次曲線を特徴付けるパラメータの抽出が行われる。該パラメータは、検体の凝固反応曲線に関するパラメータである。本発明の方法において、該１次曲線又は２次曲線からのパラメータの抽出工程においては、該曲線から１つ以上の所定領域が抽出される一方、該１つ以上の所定領域の各々に対して、それを特徴付けるパラメータが抽出される。結果、該１つ以上の所定領域のそれぞれに対して、それを特徴付ける１つ以上のパラメータが抽出され得る。より詳細には、該１次曲線又は２次曲線からのパラメータは、検体の該１次曲線又は２次曲線の該所定領域の加重平均点に関係するパラメータである。以下に、１次曲線からのパラメータの抽出手順を例示しながら該パラメータについて説明する。
ステップ３ｅでは、上記の０次曲線、１次曲線、又は２次曲線を特徴付けるパラメータの抽出が行われる。該パラメータは、検体の凝固反応曲線に関するパラメータである。本発明の方法において、該１次曲線又は２次曲線からのパラメータの抽出工程においては、該曲線から１つ以上の所定領域が抽出される一方、該１つ以上の所定領域の各々に対して、それを特徴付けるパラメータが抽出される。結果、該１つ以上の所定領域のそれぞれに対して、それを特徴付ける１つ以上のパラメータが抽出され得る。より詳細には、該１次曲線又は２次曲線からのパラメータは、検体の該１次曲線又は２次曲線の該所定領域の加重平均点に関係するパラメータである。以下に、１次曲線からのパラメータの抽出手順を例示しながら該パラメータについて説明する。
【0041】
１．３．３．１．演算対象域の抽出
パラメータの抽出においては、まず、１次曲線から１つ以上の所定領域を抽出する。以下、該パラメータ抽出に用いられる所定領域を、演算対象域とも称する。該演算対象域は、１次曲線の１次微分値（ｙ値）が所定の演算対象域値以上である領域（セグメント）である。いいかえると、該演算対象域は、１次曲線の１次微分値（ｙ値）が所定の演算対象域値以上且つ最大値以下である領域（セグメント）である。
パラメータの抽出においては、まず、１次曲線から１つ以上の所定領域を抽出する。以下、該パラメータ抽出に用いられる所定領域を、演算対象域とも称する。該演算対象域は、１次曲線の１次微分値（ｙ値）が所定の演算対象域値以上である領域（セグメント）である。いいかえると、該演算対象域は、１次曲線の１次微分値（ｙ値）が所定の演算対象域値以上且つ最大値以下である領域（セグメント）である。
【0042】
演算対象域について、図８を参照して説明する。図８には、時間tでの補正１次曲線F(t)が示されている。また図８には、１次微分値の最大値Vmax、ならびに下記に説明するパラメータである、演算対象域値X（Vmaxを100％としたときのx%）での演算対象域の加重平均点（黒丸印）の位置を表す座標vTxとvHx、及びピーク幅を表すvBxが表示されている。図８では補正１次曲線を例に挙げたが、未補正１次曲線でも同様のパラメータが算出される。
【0043】
演算対象域値は、演算対象域の１次微分値の下限を指定する所定値であり、本明細書において演算対象域値Xとも称される。すなわち演算対象域は、１次曲線における１次微分値（図８では補正１次微分値）が演算対象域値X以上且つVmax以下の（すなわちF(t)≧Xである）領域である。演算対象域値Xは、１次曲線のピーク形状を反映する範囲を限定するために設定され得る。演算対象域値Xが大きくなるほど、１次曲線のピークの上部形状の影響が相対的に大きく解析結果に反映される。
【0044】
本発明の方法では、１つ以上の演算対象域を抽出すればよい。本発明の方法において抽出される演算対象域の数は、必ずしも限定されない。複数の演算対象域を抽出する場合、該複数の演算対象域は、異なる領域である。
【0045】
１．３．３．２．加重平均点
演算対象域の加重平均点について、図８を参照して説明する。１次曲線（図８では補正１次曲線）F(t)（F(t)=１次微分値、t=時間）について、F(t)が演算対象域値以上の値を演算対象データとしたときの「重み付き平均値」に相当する位置が、加重平均点（vT, vH）として算出される。本明細書においては、異なる演算対象域に由来する加重平均点を識別するため、それが由来する演算対象域値X（ここでX=Vmax×x%）に従って（vTx, vHx）と称することがある。例えば、XがVmaxの5%のときの演算対象域の加重平均点は、（vT5%, vH5%）である。
演算対象域の加重平均点について、図８を参照して説明する。１次曲線（図８では補正１次曲線）F(t)（F(t)=１次微分値、t=時間）について、F(t)が演算対象域値以上の値を演算対象データとしたときの「重み付き平均値」に相当する位置が、加重平均点（vT, vH）として算出される。本明細書においては、異なる演算対象域に由来する加重平均点を識別するため、それが由来する演算対象域値X（ここでX=Vmax×x%）に従って（vTx, vHx）と称することがある。例えば、XがVmaxの5%のときの演算対象域の加重平均点は、（vT5%, vH5%）である。
【0046】
１次曲線において、加重平均点を示す時間（t）を加重平均時間vTとする。すなわち、加重平均時間vTは、凝固反応開始時間から加重平均点までの時間である。１次曲線において、加重平均点を示す１次微分値を加重平均高さvHとする。すなわち、加重平均時間vT及び加重平均高さvHは、図８に示すような１次曲線における加重平均点の座標である。
【0047】
より具体的には、加重平均時間vTと加重平均高さvHは、以下の手順で求めることができる。まず、F(t)の最大値がVmax、演算対象域値がVmaxのx%であるとき、F(t)≧Vmax×x×0.01を満たす時間t[t1, …, t2]（t1＜t2）を求め、積和値Mを下記式(2)により求める。
【0048】
【数5】
【0049】
加重平均時間vT及び加重平均高さvHは、それぞれ次式(3)及び(4)で算出される。求めたvTとvHから、加重平均点が導かれる。
【0050】
【数6】
【0051】
上述の説明では、図８を参照して補正１次曲線の演算対象域の加重平均点を算出したが、未補正１次曲線の場合にも、同様に、演算対象域の加重平均点、加重平均時間vT及び加重平均高さvHが定義され得る。これら加重平均時間vT及び加重平均高さvHは、演算対象域を特徴付けるパラメータとして用いられ得る。本明細書においては、異なる演算対象域に由来するvT及びvHを識別するため、それが由来する演算対象域値X（ここでX=Vmax×x%）に従って、それぞれvTx及びvHxと称することがある。例えば、XがVmaxの5%である演算対象域のvT及びvHは、vT5%及びvH5%である。
【0052】
図９に、演算対象域値Xと、その際の解析対象となる補正０次曲線（左）及び補正１次曲線(右)の領域（演算対象域）と、加重平均点との関係を示す。図９において、上段、中段、及び下段は、演算対象域値XがそれぞれVmax（=100%）の10%、50%及び80%の場合を示す。実線は補正０次曲線を示し、点線は補正１次曲線の演算対象域を示し、黒丸印は加重平均点を示す。演算対象域値Xの変化に伴って、演算対象域及び加重平均点の位置は、図９に示すように変化する。
【0053】
同様に、２次曲線についても、加重平均点、加重平均時間、及び加重平均高さが定義され得る。２次曲線は、図１０に示すように２次微分値のプラス方向及びマイナス方向の双方にピークを有する。そのため、２次曲線の加重平均点は、プラスピーク及びマイナスピークの両方に対して算出され得る。例えば、プラスピークについては、２次曲線A=F'(t)の最大値がAmaxであり、演算対象域値がAmaxのx%のとき、F'(t)≧Amax×x×0.01を満たす時間t[t1, …, t2]（t1＜t2）を求め、下式(2)’～(4)’に従って、プラスピークの加重平均時間pT、及び加重平均高さpHを算出する。マイナスピークについては、２次曲線A=F'(t)の最小値がAminであり、演算対象域値がAminのx%のとき、F'(t)≦Amin×x×0.01を満たす時間t[t1, …, t2]（t1＜t2）を求め、上式(2)’、(3)”及び(4)”に従って、マイナスピークの加重平均時間mT、及び加重平均高さmHを算出する。演算対象域値Xの変化に伴って、加重平均点の位置は変化する。
【数7】
【0054】
１．３．３．３．ピーク幅、扁平率及び時間率
上述したF(t)≧Xを満たす時間t[t1, …, t2]の最小値（t1）及び最大値（t2）は、１次曲線の演算対象域での凝固反応時間の最小値と最大値を表し、これらをそれぞれ領域始点時間vTs、及び領域終点時間vTe（vTs＜vTe）と呼ぶことがある。vTsからvTeまでの時間のうち、F(t)≧Xとなる時間長（F(t)≧Xとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）を、１次曲線のピーク幅vBとする。より具体的には、演算対象域値がVmaxのx％のときのvTs及びvTeをそれぞれvTsx及びvTexで表したとき、vTsxからvTexまで（vTsx及びvTexを含む）がピーク幅vBxとなる。
上述したF(t)≧Xを満たす時間t[t1, …, t2]の最小値（t1）及び最大値（t2）は、１次曲線の演算対象域での凝固反応時間の最小値と最大値を表し、これらをそれぞれ領域始点時間vTs、及び領域終点時間vTe（vTs＜vTe）と呼ぶことがある。vTsからvTeまでの時間のうち、F(t)≧Xとなる時間長（F(t)≧Xとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）を、１次曲線のピーク幅vBとする。より具体的には、演算対象域値がVmaxのx％のときのvTs及びvTeをそれぞれvTsx及びvTexで表したとき、vTsxからvTexまで（vTsx及びvTexを含む）がピーク幅vBxとなる。
【0055】
本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、加重平均ピーク幅vWが挙げられる。vWは、１次曲線F(t)≧vHを満たすピーク幅（F(t)≧vHを満たす最小時間から最大時間までのうち、F(t)≧vHとなる時間長）である。図１１に示すとおり、vWは、１次曲線F(t)≧vHを満たす加重平均点でのピークの幅である。本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、vTrが挙げられる。vTrは、vTsからvTeまでの幅である。vTrは、通常はvBと同じ値になるが、曲線形状が２峰性ピークであり、かつ演算対象域値Xが該２峰性ピークの谷底より高い位置となる場合には、vB＜vTrとなる。図１１は、演算対象域値XがVmaxの10％のときの１次曲線の演算対象領域（点線）を示す。図１１Ａには加重平均点（vT, vH）（黒丸印）、vTs、vTeが、図１１Ｂには、vB、vWが示されている。
【0056】
同様に、２次曲線のプラスピークについては、F'(t)≧Xを満たす時間の最小値及び最大値はそれぞれpTs、pTeであり、pTsからpTeまでの時間のうち、F'(t)≧Xを満たす時間長（F'(t)≧Xとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）をピーク幅pBとし、F'(t)≧pHを満たす時間長を加重平均ピーク幅pWとする。２次曲線のマイナスピークについては、F'(t)≦Xを満たす時間の最小値及び最大値はそれぞれmTs、mTeであり、mTsからmTeまでの時間のうち、F'(t)≦Xを満たす時間長（F'(t)≦Xとなるデータ点数から１を引いたものに測光時間間隔を乗じて得られた値）をピーク幅mBとし、F'(t)≦mHを満たす時間長を加重平均ピーク幅mWとする。
【0057】
本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、平均時間vTa、平均高さvHa、及び領域中央時間vTmが挙げられる。図１２には、演算対象域値XがVmaxの10％のときの１次曲線の平均点（vTa, vHa）（白菱印）、加重平均点（vT, vH）（黒丸印）、vTs、vTe、及びvTmが示されている。vTa、vHa、及びvTmは、F(vTs)からF(vTe)までのデータ点数をｎとしたときにそれぞれ以下の式で表される。
【0058】
【数8】
【0059】
本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、１次曲線のピーク幅に基づく扁平率（B扁平率）vAB及びvABa、ならびに加重平均ピーク幅に基づく扁平率（W扁平率）vAW及びvAWaが挙げられる。一実施形態においては、下記式のとおり、vABは、加重平均高さvHとピーク幅vBとの比で定義され、vAWは、加重平均高さvHと加重平均ピーク幅vWとの比で定義される。vABaは、平均高さvHaとピーク幅vBとの比で定義され、vAWaは、平均高さvHaと加重平均ピーク幅vWとの比で定義される。
vAB=vH/vB (8a)
vAW=vH/vW (8b)
vABa=vHa/vB (8c)
vAWa=vHa/vW (8d)
vAB=vH/vB (8a)
vAW=vH/vW (8b)
vABa=vHa/vB (8c)
vAWa=vHa/vW (8d)
【0060】
本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、１次曲線のピーク幅に基づく時間率（B時間率）vTB、及び加重平均ピーク幅に基づく時間率（W時間率）vTWが挙げられる。一実施形態においては、下記式のとおり、vTBは、加重平均時間vTとピーク幅vBとの比で定義され、vTWは、加重平均時間vTと加重平均ピーク幅vWとの比で定義される。
vTB=vT/vB (9a)
vTW=vT/vW (9b)
vTB=vT/vB (9a)
vTW=vT/vW (9b)
【0061】
なお、扁平率は、vAB=vB/vH、又はvAW=vW/vHであってもよく、またvABa=vB/vHa、又はvAWa=vW/vHaであってもよい。同様に、時間率は、vTB=vB/vT、又はvTW=vW/vTであってもよい。また、これら比に定数Kを乗じてもよい。すなわち、例えば、扁平率は、vAB=(vH/vB)K、vAB=(vB/vH)K、vAW=(vH/vW)K、又はvAW=(vW/vH)K（Kは定数）であってもよく、又は、vABa=(vHa/vB)K、vABa=(vB/vHa)K、vAWa=(vHa/vW)K、又はvAWa=(vW/vHa)Kであってもよく、時間率は、vTB=(vT/vB)K、vTB=(vB/vT)K、vTW=(vT/vW)K、又はvTW=(vW/vT)K（Kは定数）であってもよい。
【0062】
以上のような、ピーク幅vB、pB、mB、加重平均ピーク幅vW、pW、mW、平均時間vTa、平均高さvHa、領域始点時間vTs、領域終点時間vTe、領域中央時間vTm、扁平率vAB、vAW、vABa、vAWa、及び時間率vTB、vTWは、演算対象域を特徴付けるパラメータになり得る。本明細書においては、異なる演算対象域に由来するパラメータを識別するため、各パラメータを、それが由来する演算対象域値X（ここでX=Vmax×x%）に従って、それぞれvBx、vABx、vTBxなどと称することがある。このとき、例えばvABx及びvTBxは、vBxと、vHx又はvTxとから算出される。例えば、XがVmaxの5%である演算対象域のvB、vW、vTa、vHa、vTs、vTe、vTm、vAB、vAW、vABa、vAWa、vTB、vTWは、vB5%、vW5%、vTa5%、vHa5%、vTs5%、vTe5%、vTm5%、vAB5%、vAW5%、vABa5%、vAWa5%、vTB5%、vTW5%である。また、XがAmax又はAminの5%である演算対象域のpB、mB、pW、mWは、pB5%、mB5%、pW5%、mW5%である。
【0063】
図１２－２Ａ及びＢは、同じ１次曲線に基づく、異なる演算対象域値XについてのvH、vT及びvBを示す。図１２－２Ａは、演算対象域値XがVmaxの10%の場合を示し、図１２－２Ｂは、演算対象域値XがVmaxの80%の場合を示す。いずれもVmaxは100%である。
【0064】
２次曲線についても同様に、ピーク幅又は加重平均ピーク幅に基づいて扁平率及び時間率を求めることができ、これらは本発明のパラメータとして用いることができる。
【0065】
１．３．３．４．曲線下面積（AUC）
本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、１次曲線又は２次曲線の演算対象域における曲線下面積（AUC）が挙げられる。２次曲線はプラス側ピークとマイナス側ピークを有するため、２次曲線の最大ピーク高さを100％とした演算対象域における曲線下面積（AUC）は、プラス側ピークについての演算対象域におけるAUC（pAUC）とマイナス側ピークの演算対象域におけるAUC（mAUC）があり得る（ただし、mAUCの場合、正確には曲線上面積である）。本明細書においては、異なる演算対象域に由来するAUCを識別するため、それが由来する演算対象域値X（ここでX=Vmax×x%）に従って、AUCxと称することがある。例えば、XがVmax、Amax及びAminの5%である演算対象域のvAUC、pAUC、及びmAUCは、それぞれvAUC5%、pAUC5%、及びmAUC5%である。
本発明で用いられるパラメータのさらなる例としては、１次曲線又は２次曲線の演算対象域における曲線下面積（AUC）が挙げられる。２次曲線はプラス側ピークとマイナス側ピークを有するため、２次曲線の最大ピーク高さを100％とした演算対象域における曲線下面積（AUC）は、プラス側ピークについての演算対象域におけるAUC（pAUC）とマイナス側ピークの演算対象域におけるAUC（mAUC）があり得る（ただし、mAUCの場合、正確には曲線上面積である）。本明細書においては、異なる演算対象域に由来するAUCを識別するため、それが由来する演算対象域値X（ここでX=Vmax×x%）に従って、AUCxと称することがある。例えば、XがVmax、Amax及びAminの5%である演算対象域のvAUC、pAUC、及びmAUCは、それぞれvAUC5%、pAUC5%、及びmAUC5%である。
【0066】
１．３．３．５．その他
上述の加重平均点に関係するパラメータ以外のさらなるパラメータが、本発明で用いる凝固反応曲線に関するパラメータに含まれ得る。さらなるパラメータの例としては、最大１次微分値Vmax、最大２次微分値Amax、最小２次微分値Amin、及びそれらに到達する時間を表すVmaxT、AmaxT、AminTが挙げられる。さらに、０次曲線における散乱光量の変化量が所定条件を満たした時点での散乱光量を100%としたときに、散乱光量がc%に相当する反応経過時間は、凝固時間Tcとして、本発明で用いるパラメータに含まれ得る。ｃは任意の値でよく、例えばTcはT50である。
上述の加重平均点に関係するパラメータ以外のさらなるパラメータが、本発明で用いる凝固反応曲線に関するパラメータに含まれ得る。さらなるパラメータの例としては、最大１次微分値Vmax、最大２次微分値Amax、最小２次微分値Amin、及びそれらに到達する時間を表すVmaxT、AmaxT、AminTが挙げられる。さらに、０次曲線における散乱光量の変化量が所定条件を満たした時点での散乱光量を100%としたときに、散乱光量がc%に相当する反応経過時間は、凝固時間Tcとして、本発明で用いるパラメータに含まれ得る。ｃは任意の値でよく、例えばTcはT50である。
【0067】
以上、散乱光量に基づく凝固反応曲線に基づいて、凝固反応曲線に関するパラメータについて説明した。一方、他の凝固計測手段（例えば透過光量や吸光度）に基づく凝固反応曲線から同等のパラメータが取得できることは、当業者に明らかである。例えば、透過光量に基づくような逆シグモイド状の凝固反応曲線から得られる１次曲線F(t)は、上述した散乱光量に基づくものに対して正負が逆になる。このような場合に、パラメータの計算においてF(t)の符号が逆転すること、例えば、最大値Vmaxは最小値Vminに置き換えられ、演算対象域はF(t)≦Xを満たす領域であり、vB及びvWがそれぞれt1からt2までのF(t)≦X及びF(t)≦vHとなる時間長であること等は、当業者に明らかである。
【0068】
２．凝固反応曲線に関するパラメータを用いた凝固因子インヒビター力価の測定
上記の手順により、混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータが取得される。該パラメータは、該凝固反応曲線の形状に依存して値が変化し得る。正常血漿と、凝固異常を有する被検検体とを含む混合検体とは、凝固異常の原因又は加温の影響によって、凝固反応曲線の形状が異なることがある。したがって、凝固異常の原因によっては、該加温検体から得られたパラメータと、非加温検体から得られたパラメータは、異なる値を有することがある。なお本明細書において、パラメータの値について、例えばその比や差について述べる場合には、「パラメータ」と「パラメータ値」は同義である。一方、パラメータの種類について述べる場合には、「パラメータ」と「パラメータ種」は同義である。
上記の手順により、混合検体の凝固反応曲線に関するパラメータが取得される。該パラメータは、該凝固反応曲線の形状に依存して値が変化し得る。正常血漿と、凝固異常を有する被検検体とを含む混合検体とは、凝固異常の原因又は加温の影響によって、凝固反応曲線の形状が異なることがある。したがって、凝固異常の原因によっては、該加温検体から得られたパラメータと、非加温検体から得られたパラメータは、異なる値を有することがある。なお本明細書において、パラメータの値について、例えばその比や差について述べる場合には、「パラメータ」と「パラメータ値」は同義である。一方、パラメータの種類について述べる場合には、「パラメータ」と「パラメータ種」は同義である。
【0069】
本発明の方法では、該加温検体及び非加温検体のそれぞれについて、上述した凝固反応曲線に関するパラメータ（好ましくは後述する表１に記載のパラメータ）からなる群より選択される少なくとも１種が取得される。該非加温検体から取得されたパラメータを第１のパラメータと呼び、該加温検体から取得されたパラメータを第２のパラメータと呼ぶ。本発明の方法では、該第１のパラメータと該第２のパラメータとの比又は差に基づいて、混合検体に含まれる被検検体における凝固因子インヒビターの力価を算出する（ステップ４）。
【0070】
本発明の方法の一実施形態においては、混合検体に含まれる被検検体が、既にクロスミキシング試験等により、特定の凝固因子インヒビターの存在に起因するＡＰＴＴ延長を示す血液検体であることが判定されている。この場合は、後述する２．３の手順に従って、該第１及び第２のパラメータに基づいて凝固因子インヒビター力価を算出することができる。本発明の方法の別の一実施形態においては、混合検体に含まれる被検検体が、特定の凝固因子インヒビターの存在に起因するＡＰＴＴ延長を示すか否かが未知である。この場合、本発明の方法においては、後述する２．１～２．２の手順に従って、ＡＰＴＴ延長要因の判定、及び凝固因子インヒビターの鑑別を実施することができる。その後は、後述する２．３の手順に従って、該第１及び第２のパラメータに基づいて凝固因子インヒビター力価を算出することができる。後者の実施形態では、時間のかかるクロスミキシング試験を行う必要がないため、より簡便に凝固因子インヒビター力価の測定が実現される。
【0071】
２．１ ＡＰＴＴ延長要因の判定
上述のとおり、検体に含まれる凝固異常原因成分又は検体の加温が、凝固反応曲線の形状に影響を及ぼすことがある。凝固異常の原因又は加温による凝固反応曲線の変化の例を、図１３～１５を参照して示す。図１３は、ＬＡ血漿（ＬＡ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。図１４は、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。図１５Ａは、ＬＡ血漿（ＬＡ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。図１５Ｂは、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）と正常血漿との１：１（ＩＮ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。
上述のとおり、検体に含まれる凝固異常原因成分又は検体の加温が、凝固反応曲線の形状に影響を及ぼすことがある。凝固異常の原因又は加温による凝固反応曲線の変化の例を、図１３～１５を参照して示す。図１３は、ＬＡ血漿（ＬＡ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。図１４は、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。図１５Ａは、ＬＡ血漿（ＬＡ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。図１５Ｂは、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）と正常血漿との１：１（ＩＮ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。
【0072】
図１３のように、ＬＡ血漿（ＬＡ）では、加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。また図１４のように、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）では、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。
【0073】
図１５Ａのように、ＬＡ血漿（ＬＡ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）は、正常血漿と混合したことにより、図１３と比較するとピークが早く現われ（凝固時間が短縮）、形状もシャープ化している。ＬＡ－ＮＰでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。
【0074】
図１５Ｂのように、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＩＮ－ＮＰ）では、非加温検体は、正常血漿と混合したことにより、図１４と比較するとＬＡ－ＮＰと同様にピークが早く現われて形状もシャープ化している。一方、加温検体は、ピークが遅く現われ、ピーク高さが低くなると共にピーク幅は広くなった。この形状変化は、加温処理中にＩＮに含まれていたインヒビター（抗FVIII抗体）と正常血漿に含まれていたFVIIIとの抗原抗体反応が進行したために、混合血漿の凝固反応が阻害されたことによると判断された。この非加温と加温との形状変化をパラメータの変化として指標化することによってＩＮをＬＡと鑑別できる可能性が確認できた。
【0075】
図１５に示されるように、混合検体の凝固反応曲線が、凝固異常原因成分又は加温によって変化し得ることは、非加温検体及び加温検体の凝固反応曲線に関するパラメータを解析することで、凝固因子インヒビターの存在に起因するＡＰＴＴ延長を示す被検検体を検出可能であることを意味する。該パラメータに基づくＡＰＴＴ延長要因の評価を後述の表２に例示する。表２には、正常検体（ＮＰ）、ＬＡ陽性検体（ＬＡ）、ＬＡ陽性検体と正常検体との１：１混合検体（ＬＡ－ＮＰ（ｍｉｘ））、FVIIIインヒビター陽性検体（ＩＮ）、及びFVIIIインヒビター陽性検体と正常検体との１：１混合検体（ＩＮ－ＮＰ（ｍｉｘ））について、非加温検体の凝固反応曲線から取得した第１のパラメータ（Ｐａ）、１０分加温した加温検体の凝固反応曲線から取得した第２のパラメータ（Ｐｂ）、及びそれらのパラメータの比（Ｐｂ／Ｐａ）が示されている。
【0076】
表２に示すパラメータのうち、ＡＰＴＴは、ベースライン調整済み凝固反応曲線の散乱光量が50%となる反応経過時間（T50（秒））を示し、Vmaxは、補正１次曲線の最大値を示し、VmaxTは、測光開始後からVmaxとなるまでの時間を示す。また表２には、演算対象域値10％での加重平均点に関するパラメータvH10％、vT10%、vB10%、vAB10%、及びvTB10%が示されている。
【0077】
表２に示すとおり、加温に影響されない正常検体（ＮＰ）では、全てのパラメータで比（Ｐｂ／Ｐａ）は１に近い値である。ＬＡ陽性検体（ＬＡ）及び正常検体との混合検体（ＬＡ－ＮＰ（ｍｉｘ））では、図１５Ａに示したように凝固反応が加温の影響をあまり受けないため、比（Ｐｂ／Ｐａ）は１に近い値となる。
【0078】
一方、FVIIIインヒビター陽性検体を含む混合検体（ＩＮ－ＮＰ（ｍｉｘ））の凝固反応は、図１５Ｂに示したように加温の影響を大きく受け、それはパラメータ比（Ｐｂ／Ｐａ）に反映される。表２に示すとおり、ＩＮ－ＮＰ（ｍｉｘ）では、比（Ｐｂ／Ｐａ）はＡＰＴＴ、VmaxT、vT、vBでは顕著に大きくなり、Vmax、vHでは小さくなる。これらのパラメータは、FVIIIインヒビター陽性検体を検出する指標となり得る。また、表２に示すとおり、vABの比（Ｐｂ／Ｐａ）は、ＩＮ－ＮＰ（ｍｉｘ）では１からの顕著な減少を示し、ＬＡやＮＰとは明確に異なる挙動を示した。さらに後述する図１８には、ＡＰＴＴ、Vmax、Amax、vB10％、vT10％、vAB10％、及びvTB10％について、それらの比（Ｐｂ／Ｐａ）が、FVIIIインヒビター陽性検体を含む混合検体では１からの増加又は減少を示すが、ＬＡ、ＮＰ、又は凝固因子欠損（例えば血友病Ａ及び血友病Ｂ）を含む混合検体では１に近い値であること、またそれらの差（Ｐｂ－Ｐａ）が、FVIIIインヒビター陽性検体を含む混合検体では０から大きく外れているが、ＬＡ、ＮＰ、又は凝固因子欠損を含む混合検体では０に近い値であることが示されている。
【0079】
以上のとおり、FVIIIインヒビター陽性検体では、非加温検体からの第１のパラメータと加温検体からの第２のパラメータは異なっており、かつ、このようなパラメータ値への加温の影響は、正常検体やＬＡ陽性検体では見られない。したがって、加温検体と非加温検体から取得した上述したパラメータに基づいて、混合検体に含まれる被検検体がFVIIIインヒビター陽性であるか否かを判定可能である。好ましくは、第１のパラメータと第２のパラメータの値の変化率や変化幅を反映できる指標、例えば、表２に示したような第１のパラメータと第２のパラメータとの比、又は第１のパラメータと第２のパラメータの差に基づいて、FVIIIインヒビター陽性検体を検出することができる。
【0080】
以上、第１のパラメータと第２のパラメータを用いてFVIIIインヒビターの存在に起因してＡＰＴＴ延長を示す血液検体を判定する手順について説明した。同様の手順で、他の凝固因子（例えばFIX）インヒビター陽性検体とＬＡ陽性検体とを区別することも可能である。
【0081】
２．２ 凝固因子インヒビターの鑑別
上記２．１の手順で凝固因子インヒビターの存在に起因してＡＰＴＴ延長を示す血液検体を検出した場合、次に、凝固因子インヒビターの種類が不明である場合には、その種類を判定することが必要となる。凝固因子インヒビターは、発生件数の多い順にFVIIIインヒビター、FIXインヒビター、及び他因子のインヒビターが知られている。
上記２．１の手順で凝固因子インヒビターの存在に起因してＡＰＴＴ延長を示す血液検体を検出した場合、次に、凝固因子インヒビターの種類が不明である場合には、その種類を判定することが必要となる。凝固因子インヒビターは、発生件数の多い順にFVIIIインヒビター、FIXインヒビター、及び他因子のインヒビターが知られている。
【0082】
図１６に、各種凝固因子の濃度とvTB80%の関係を示す。なお、凝固因子の濃度は対数値であり、濃度0.1%以下は0.1%として対数変換した。因子濃度10%以下のvTB80%において、同じ濃度における各種凝固因子の中でFVIIIの値は他の凝固因子の値よりも明らかに低いことから、FVIII欠乏を他の凝固因子欠乏と区別することができる。これにより、vTB80%の値によりインヒビターの種類がFVIIIインヒビターであることを判定することができる。
【0083】
別の一実施形態においては、上記の本発明のパラメータを用いたテンプレートマッチングによって、欠乏する凝固因子の種類や濃度を評価する。より詳細には、上述するパラメータを取得する際に、複数の演算対象域を設定して、各々の演算対象域の加重平均点を求め、vT、vH、vB、vAB、vTBなどの上述した演算対象域を特徴付けるパラメータを取得する。これらのパラメータは、各演算対象域についていずれか１種類を取得すればよいが、好ましくは２種類以上取得する。演算対象域の数は、特に限定されないが、好ましくは３～１００個、より好ましくは５～２０個であるとよい。さらにVmax、VmaxT、Amax、AmaxTなどの値を取得してもよい。一方で、凝固因子の濃度が既知かつ様々に異なる検体（参照）を準備し、それについて同様にパラメータの取得を行う。このとき、参照検体について設定する演算対象域及び取得するパラメータの種類が被検検体と対応するようにする。次いで、得られた被検検体についてのパラメータ群と、参照の各々についてのパラメータ群との間の直線回帰式を求め、回帰直線の相関性（例えば傾き、切片、相関係数、決定係数等）を求める。被検検体との相関性が最も高い参照における凝固因子の濃度を、被検検体における該凝固因子の濃度として推定する。被検検体と参照との直線回帰式の例を図１７に示す。図１７Ａは、ともにFVIII活性が0.2％未満である被検検体（Sample AF）と参照（Template A）との間でのパラメータ群の回帰直線を表す。パラメータ群には、１０個の演算対象域（X=5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%及び90%、Vmaxに対して）についての５０個のパラメータ（vB [vB5%, vB10%, …, vB90%]、vT [vT5%, vT10%, …, vT90%]、vH [vH5%, vH10%, …, vH90%]、vAB [vAB5%, vAB10%, …, vAB90%]、及びvTB [vTB5%, vTB10%, …, vTB90%]）からなるパラメータ群を用いている。図１７Ｂは、図１７Ａの被検検体（Sample AF）と参照（Template A）の補正１次曲線を示す。２つの曲線は非常に似た形状を有しており、血液凝固特性の近似度が、検体のパラメータ群同士の相関性に反映されることを示している。
【0084】
あるいは、従来の手法に従って、クロスミキシング試験、凝固因子活性検査により、被検検体のＡＰＴＴ延長が凝固因子インヒビターの存在に起因するか否か、及び該凝固因子インヒビターの種類を決定することができる。
【0085】
２．３ 凝固因子インヒビター力価の算出
上記２．１で述べたように、凝固因子インヒビターによるＡＰＴＴ延長を示す被検検体を含む混合検体は、加温によりその凝固反応曲線の形状が変化する。さらに、該凝固反応曲線の形状の変化の大きさは、凝固因子インヒビターの活性（力価）依存的である。したがって、該非加温検体及び加温検体からの第１のパラメータの値と第２のパラメータの値との比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出することができる。
上記２．１で述べたように、凝固因子インヒビターによるＡＰＴＴ延長を示す被検検体を含む混合検体は、加温によりその凝固反応曲線の形状が変化する。さらに、該凝固反応曲線の形状の変化の大きさは、凝固因子インヒビターの活性（力価）依存的である。したがって、該非加温検体及び加温検体からの第１のパラメータの値と第２のパラメータの値との比又は差に基づいて、該被検血液検体における凝固因子インヒビターの力価を算出することができる。
【0086】
より詳細には、第１のパラメータの値と第２のパラメータの値との比又は差を求め、この値から、検量線に基づいて、凝固因子インヒビターの力価を算出する。該検量線は、予め作成することができる。例えば、特定の凝固因子インヒビターの力価が既知かつ様々に異なる一連の標準検体について、上記の被検検体の場合と同様の手順により第１のパラメータと第２のパラメータを求め、次いで、該標準検体のインヒビター力価と、該第１と第２のパラメータの比又は差を用いて検量線を作成すればよい。
【0087】
本発明の方法による力価測定に用いられる好ましいパラメータの例としては、Vmax、vT、vH、vB、vAB、vTB、vAW、vTW、pAUC、mAUCが挙げられる。これらのパラメータを用いるための演算対象域値Xは、Vmax100％のとき、好ましくは5～90％、より好ましくは30～70％である。
【0088】
本発明の方法において力価測定される凝固因子インヒビターの種類は、特に限定されないが、FVIIIインヒビター、FIXインヒビターなどが挙げられ、好ましくはFVIIIインヒビターが挙げられる。力価を測定すべき目的の凝固因子インヒビターについての検量線を予め作成しておくことで、混合検体の第１と第２のパラメータの比又は差に基づいて、目的の凝固因子インヒビターの力価を算出することができる。
【実施例】
【0089】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0090】
以下の実施例に用いられるパラメータは、特に言及しない限り、補正０次～２次曲線由来のパラメータを表す。一方、未補正０次～２次曲線由来のパラメータは、各パラメータの名称の頭にRを付けて表される。例えば、補正１次曲線の加重平均高さがvHであるとき、未補正１次曲線の加重平均高さはRvHで表され、補正１次曲線の加重平均時間がvTであるとき、未補正１次曲線の加重平均時間はRvTで表される。パラメータの一覧を下記の表１に示す。以降の説明においては、組み合わせ波形パラメータのＢ扁平率、Ｗ扁平率、Ｂ時間率及びＷ時間率は、係数ｋを省略したパラメータの演算内容が分かる表記をする場合がある。
【0091】
【表1】
【0092】
参考例１
１）被検検体
実施例で用いた被検検体を以下に示す。正常血漿（ＮＰ）には、健常人より得られたクエン酸加血漿を用いた。ＬＡ血漿（ＬＡ）には、George King Biomedical, Inc.のPositive Lupus Anticoagulant Plasmaを用いた。第VIII因子欠乏血漿（ＨＡ）及び第IX因子欠乏血漿（ＨＢ）には、George King BiomedicalのFactor VIII Deficient、Factor IX Deficientを用いた。第VIII因子（FVIII）インヒビター陽性血漿（ＩｎＬ、ＩｎＭ及びＩｎＨ）には、George King Biomedical, Inc.のFactor VIII Deficient with Inhibitorを用いた。
群No. 検体種 検体数
１ 正常血漿（ＮＰ） ２３
２ ＬＡ血漿（ＬＡ） ６
３ 血友病Ａ（ＨＡ） １４
４ 血友病Ｂ（ＨＢ） １２
５ FVIIIインヒビター低力価血漿（ＩｎＬ） １２
６ FVIIIインヒビター中力価血漿（ＩｎＭ） ３５
７ FVIIIインヒビター高力価血漿（ＩｎＨ） ８
検量線用検体（Ｃａｌ） ７
なお、インヒビター力価の「低」、「中」、「高」は、ベセスダ単位（ＢＵ／ｍＬ）の値によって以下のように分類した：
低：０．３～１．６（ＢＵ／ｍＬ）
中：２．０～４０．５（ＢＵ／ｍＬ）
高：６６～３０２（ＢＵ／ｍＬ）
１）被検検体
実施例で用いた被検検体を以下に示す。正常血漿（ＮＰ）には、健常人より得られたクエン酸加血漿を用いた。ＬＡ血漿（ＬＡ）には、George King Biomedical, Inc.のPositive Lupus Anticoagulant Plasmaを用いた。第VIII因子欠乏血漿（ＨＡ）及び第IX因子欠乏血漿（ＨＢ）には、George King BiomedicalのFactor VIII Deficient、Factor IX Deficientを用いた。第VIII因子（FVIII）インヒビター陽性血漿（ＩｎＬ、ＩｎＭ及びＩｎＨ）には、George King Biomedical, Inc.のFactor VIII Deficient with Inhibitorを用いた。
群No. 検体種 検体数
１ 正常血漿（ＮＰ） ２３
２ ＬＡ血漿（ＬＡ） ６
３ 血友病Ａ（ＨＡ） １４
４ 血友病Ｂ（ＨＢ） １２
５ FVIIIインヒビター低力価血漿（ＩｎＬ） １２
６ FVIIIインヒビター中力価血漿（ＩｎＭ） ３５
７ FVIIIインヒビター高力価血漿（ＩｎＨ） ８
検量線用検体（Ｃａｌ） ７
なお、インヒビター力価の「低」、「中」、「高」は、ベセスダ単位（ＢＵ／ｍＬ）の値によって以下のように分類した：
低：０．３～１．６（ＢＵ／ｍＬ）
中：２．０～４０．５（ＢＵ／ｍＬ）
高：６６～３０２（ＢＵ／ｍＬ）
【0093】
２）混合検体の調製
１）の各被検検体と正常血漿とを１：１の容量比で混合して、混合検体を調製した。該正常血漿には、１）の正常血漿を全て混合したものを用いた。
１）の各被検検体と正常血漿とを１：１の容量比で混合して、混合検体を調製した。該正常血漿には、１）の正常血漿を全て混合したものを用いた。
【0094】
３）インヒビター力価（ベセスダ単位）の測定
検体のインヒビター力価を、当業者で周知のベセスダ単位を求める方法により測定した。検体を緩衝液で希釈したのち、正常血漿と１：１の容量比で混合して、３７℃で２時間インキュベーション後、FVIII活性の測定を行って、残存するFVIII活性よりベセスダ単位（ＢＵ／ｍＬ）を求めた。
検体のインヒビター力価を、当業者で周知のベセスダ単位を求める方法により測定した。検体を緩衝液で希釈したのち、正常血漿と１：１の容量比で混合して、３７℃で２時間インキュベーション後、FVIII活性の測定を行って、残存するFVIII活性よりベセスダ単位（ＢＵ／ｍＬ）を求めた。
【0095】
４）ＡＰＴＴ測定
ＡＰＴＴ試薬には、コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を、塩化カルシウム液には、コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ 塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。ＡＰＴＴ測定には、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いた。以下の手順で通常モード（非加温）又は加温モードで処理した：
キュベット（反応容器）に検体５０μＬを吐出後、
（通常モード）３７℃で４５秒間の加温
（加温モード）３７℃で６００～７２０秒間の加温
その後、キュベットに約３７℃に加温したＡＰＴＴ試薬５０μＬを添加し、１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬ添加して、凝固反応を開始させた。凝固反応はキュベットを約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の検出は、波長６６０ｎｍのＬＥＤを光源とする光を照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱した散乱光量を測光した。測光時間は３６０秒間とした。同じ検体について、非加温（通常モード）及び加温（加温モード）条件でのＡＰＴＴの測定をそれぞれ行い、ＡＰＴＴ測定による凝固反応データとして測光データを得た。
ＡＰＴＴ試薬には、コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル株式会社製）を、塩化カルシウム液には、コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ 塩化カルシウム液（積水メディカル株式会社製）を用いた。ＡＰＴＴ測定には、血液凝固自動分析装置ＣＰ３０００（積水メディカル株式会社製）を用いた。以下の手順で通常モード（非加温）又は加温モードで処理した：
キュベット（反応容器）に検体５０μＬを吐出後、
（通常モード）３７℃で４５秒間の加温
（加温モード）３７℃で６００～７２０秒間の加温
その後、キュベットに約３７℃に加温したＡＰＴＴ試薬５０μＬを添加し、１７１秒経過後に２５ｍＭ塩化カルシウム液５０μＬ添加して、凝固反応を開始させた。凝固反応はキュベットを約３７℃に維持した状態で行った。凝固反応の検出は、波長６６０ｎｍのＬＥＤを光源とする光を照射し、０．１秒間隔で９０度側方散乱した散乱光量を測光した。測光時間は３６０秒間とした。同じ検体について、非加温（通常モード）及び加温（加温モード）条件でのＡＰＴＴの測定をそれぞれ行い、ＡＰＴＴ測定による凝固反応データとして測光データを得た。
【0096】
５）測光データの解析
得られた測光データに対し、ノイズ除去を含む平滑化処理、及び測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整を行って凝固反応曲線を得た。続いて、凝固反応曲線の最大高さが１００となるように補正して補正０次曲線を得た。この補正０次曲線を１次微分して補正１次曲線を得、さらにこれを微分して補正２次曲線を得た。
得られた測光データに対し、ノイズ除去を含む平滑化処理、及び測光開始時点の散乱光量が０となるようにゼロ点調整を行って凝固反応曲線を得た。続いて、凝固反応曲線の最大高さが１００となるように補正して補正０次曲線を得た。この補正０次曲線を１次微分して補正１次曲線を得、さらにこれを微分して補正２次曲線を得た。
【0097】
６）パラメータ抽出
得られた補正０次曲線から凝固時間（ＡＰＴＴ）を求めた。ＡＰＴＴは、補正０次曲線の最大高さを１００％としたときに５０％高さに達する時間（T50）とした。補正１次曲線から最大１次微分値（Vmax）、及び補正２次曲線から最大及び最小２次微分値（Amax及びAmin）を取得した。さらに、補正１次曲線及び補正２次曲線から加重平均点に関するパラメータを算出した。加重平均点算出のための演算対象域値Xは、補正１次曲線の最大高さVmax（100%）に対して0.5％～90％のいずれかに設定した。各Xについて、補正１次曲線の値がX以上を満たす区間をピーク幅vBとして算出した。各演算対象域について、上記式(2)、(3)及び(4)を用いて加重平均時間vT及び加重平均高さvHを算出した。求めたvT及びvHから、下記式により扁平率vAB及び時間率vTBを算出した。
vAB=(vH/vB)K1（K1=100）
vTB=(vT/vB)K2（K2=1）
得られた補正０次曲線から凝固時間（ＡＰＴＴ）を求めた。ＡＰＴＴは、補正０次曲線の最大高さを１００％としたときに５０％高さに達する時間（T50）とした。補正１次曲線から最大１次微分値（Vmax）、及び補正２次曲線から最大及び最小２次微分値（Amax及びAmin）を取得した。さらに、補正１次曲線及び補正２次曲線から加重平均点に関するパラメータを算出した。加重平均点算出のための演算対象域値Xは、補正１次曲線の最大高さVmax（100%）に対して0.5％～90％のいずれかに設定した。各Xについて、補正１次曲線の値がX以上を満たす区間をピーク幅vBとして算出した。各演算対象域について、上記式(2)、(3)及び(4)を用いて加重平均時間vT及び加重平均高さvHを算出した。求めたvT及びvHから、下記式により扁平率vAB及び時間率vTBを算出した。
vAB=(vH/vB)K1（K1=100）
vTB=(vT/vB)K2（K2=1）
【0098】
取得した各パラメータについて、パラメータ比Ｐｂ／Ｐａ、又はパラメータ差（Ｐｂ－Ｐａ）を求めた。ここで、Ｐａは非加温検体のパラメータ、Ｐｂは加温検体のパラメータである。なお、未補正０次曲線からも、同様に未補正１次曲線、及び未補正２次曲線を算出し、これらの曲線から同様にパラメータを算出し、比Ｐｂ／Ｐａ、又は差（Ｐｂ－Ｐａ）を求めた。
【0099】
実施例１ 被検検体の加温による１次曲線への影響
図１３に、ＬＡ血漿（ＬＡ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。ＬＡでは、加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。また図１４に、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。ＩＮでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。
図１３に、ＬＡ血漿（ＬＡ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。ＬＡでは、加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。また図１４に、FVIIIインヒビター陽性血漿（ＩＮ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。ＩＮでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。
【0100】
実施例２ 混合検体の加温による１次曲線への影響
図１５Ａには、ＬＡ血漿（ＬＡ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。正常血漿と混合したことにより、図１３と比較するとピークが早く現われ（凝固時間が短縮）、形状もシャープ化している。ＬＡ－ＮＰでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。一方、図１５Ｂには、FVIIIインヒビター陽性血漿と正常血漿との１：１（ＩＮ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。非加温では、正常血漿と混合したことにより、図１４と比較するとＬＡ－ＮＰと同様にピークが早く現われて形状もシャープ化している。一方、加温では、ピークが遅く現われ、ピーク高さが低くなると共にピーク幅は広くなった。この形状変化は、加温処理中にＩＮに含まれていたインヒビター（抗FVIII抗体）と正常血漿に含まれていたFVIIIとの抗原抗体反応が進行したために、混合血漿の凝固反応が阻害されたことによると判断された。この非加温と加温との形状変化をパラメータの変化として指標化することによってＩＮをＬＡと鑑別できる可能性が確認できた。
図１５Ａには、ＬＡ血漿（ＬＡ）と正常血漿との１：１混合血漿（ＬＡ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。正常血漿と混合したことにより、図１３と比較するとピークが早く現われ（凝固時間が短縮）、形状もシャープ化している。ＬＡ－ＮＰでは、ＬＡと同様に加温による曲線形状の変化はほとんどなかった。一方、図１５Ｂには、FVIIIインヒビター陽性血漿と正常血漿との１：１（ＩＮ－ＮＰ）の加温及び非加温での補正１次曲線を示す。非加温では、正常血漿と混合したことにより、図１４と比較するとＬＡ－ＮＰと同様にピークが早く現われて形状もシャープ化している。一方、加温では、ピークが遅く現われ、ピーク高さが低くなると共にピーク幅は広くなった。この形状変化は、加温処理中にＩＮに含まれていたインヒビター（抗FVIII抗体）と正常血漿に含まれていたFVIIIとの抗原抗体反応が進行したために、混合血漿の凝固反応が阻害されたことによると判断された。この非加温と加温との形状変化をパラメータの変化として指標化することによってＩＮをＬＡと鑑別できる可能性が確認できた。
【0101】
各被検検体から調製した正常検体との混合検体について、加温及び非加温での凝固反応曲線に関するパラメータを算出した。得られたパラメータについて、非加温検体のパラメータＰａ、加温検体のパラメータＰｂ、パラメータ比Ｐｂ／Ｐａ、及びパラメータ差Ｐｂ－Ｐａを求めた。
【0102】
表２に、非加温検体及び加温検体（１０分加温）から得た各種パラメータ値と、それらの比（Ｐｂ／Ｐａ）を示す。FVIIIインヒビター血漿の混合血漿（ＩＮ－ＮＰ（ｍｉｘ））のＰｂ／Ｐａは１から大きく外れており、正常血漿（ＮＰ）、ＬＡ血漿（ＬＡ）、ＬＡ混合血漿（ＬＡ－ＮＰ（ｍｉｘ））とは明らかに相違した。したがって、各種パラメータのＰｂ／Ｐａに基づいてFVIIIインヒビター陽性血漿の判別が可能であることが示された。
【0103】
【表2】
【0104】
図１８Ａ～Ｇは、各種のパラメータについて、各種血漿の非加温でのパラメータＰａ、加温でのパラメータＰｂ、それらの比Ｐａ／Ｐｂ、及び差Ｐｂ－Ｐａを示す。FVIIIインヒビター中力価血漿（ＩｎＭ）は、Ｐａ／Ｐｂが１より大きく又は小さくなる傾向、又はＰｂ－Ｐａが０から外れる傾向があった。一方、FVIIIインヒビター高力価血漿（ＩｎＨ）は、全体的にはＰａ／Ｐｂが１より大きくもしくは小さくなる傾向、又はＰｂ－Ｐａが０から外れる傾向があったが、一部のパラメータ（APTT、vT）はＰａ／Ｐｂが１に近い場合があった。しかしＩｎＨのAPTT又はvTは、Ｐａ／Ｐｂが約１になる場合でもＰｂ－Ｐａは０ではなく、少なくとも５秒は延長した。したがって、ＰａとＰｂの比及び差を組み合わせて用いることでAPTT又はvTを用いてＩｎＨを判別可能であった。
【0105】
図１８Ａより、ＡＰＴＴについて以下の結果が示された。なお、ＡＰＴＴの「延長」とは、ＡＰＴＴが正常血漿より長いことを示し、ＡＰＴＴの「短縮」とは、ＡＰＴＴが正常血漿と同じかそれに近い値であることを示す。
・ＬＡを含む混合検体は、Ｐａ及びＰｂともに延長し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＨＡとＨＢを含む混合検体は、Ｐａ及びＰｂともに短縮し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＩｎＬを含む混合検体は、Ｐａ及びＰｂともに短縮し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＩｎＭを含む混合検体は、Ｐａで僅かに延長し、ＰｂではＰａよりさらに延長し、Ｐｂ／Ｐａは１より大になる。
・ＩｎＨを含む混合検体は、Ｐａは延長し、ＰｂはＰａと同程度かさらに延長し、Ｐｂ／Ｐａは約１か又は１より大になる。
・ＬＡを含む混合検体は、Ｐａ及びＰｂともに延長し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＨＡとＨＢを含む混合検体は、Ｐａ及びＰｂともに短縮し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＩｎＬを含む混合検体は、Ｐａ及びＰｂともに短縮し、Ｐｂ／Ｐａは約１である。
・ＩｎＭを含む混合検体は、Ｐａで僅かに延長し、ＰｂではＰａよりさらに延長し、Ｐｂ／Ｐａは１より大になる。
・ＩｎＨを含む混合検体は、Ｐａは延長し、ＰｂはＰａと同程度かさらに延長し、Ｐｂ／Ｐａは約１か又は１より大になる。
【0106】
上記の結果を表３にまとめた。加温及び非加温でのＡＰＴＴに基づいて、混合検体に含まれる被検検体を次のように判別できることが示された。
（１）ＰａとＰｂがともに延長し、かつＰｂ／Ｐａが約１であれば、被検検体はＬＡ又はＩｎＨである。
（２）ＰａとＰｂがともに短縮し、かつＰｂ／Ｐａが約１であれば、被検検体はＨＡＢ（ＨＡ又はＨＢ）又はＩｎＬである。
（３）ＰａとＰｂがともに延長し、かつＰｂ／Ｐａが１より大であれば、被検検体はＩｎＭ又はＩｎＨである。
（１）ＰａとＰｂがともに延長し、かつＰｂ／Ｐａが約１であれば、被検検体はＬＡ又はＩｎＨである。
（２）ＰａとＰｂがともに短縮し、かつＰｂ／Ｐａが約１であれば、被検検体はＨＡＢ（ＨＡ又はＨＢ）又はＩｎＬである。
（３）ＰａとＰｂがともに延長し、かつＰｂ／Ｐａが１より大であれば、被検検体はＩｎＭ又はＩｎＨである。
【0107】
【表3】
【0108】
また図１８Ｂより、VmaxでのＰｂ／Ｐａは、ＬＡ、ＨＡ、ＨＢ、ＩｎＬ及び一部のＩｎＨではＡＰＴＴと同様に約１となり、一方ＩｎＭと一部を除いたＩｎＨでは１より小となった。凝固反応がインヒビターによる阻害を受ける場合、インヒビター力価に応じてＡＰＴＴが延長すると共に凝固速度は小さくなり、結果、それらのパラメータ比Ｐｂ／Ｐａは１から外れる。そのため、ＩｎＭと一部を除いたＩｎＨでは、ＡＰＴＴのＰｂ／Ｐａは１より大になり、VmaxのＰｂ／Ｐａは１より小になった。一部のＩｎＨは、高力価群の中でも力価が高い検体（超高力価検体）であり、Vmaxは、非加温（Ｐａ）において１付近まで低下しており、加温（Ｐｂ）においてもほとんど変化が無いため、パラメータ比Ｐｂ／Ｐａは１付近になった。ＩｎＨの中で超高力価検体を判別するためには、一例として、非加温（Ｐａ）でのVmaxが２以下となる検体と定義すればよい。
【0109】
また図１８Ｃ～Ｇに示すとおり、AmaxはVmaxと同様の傾向を示し、vB、vTはＡＰＴＴと同様の傾向を示し、vAB及びvTBはVmaxやAmaxと同様の傾向を示した。
【0110】
以上の結果から、各種パラメータのＰａとＰｂの比、差、又はそれらの組み合わせに基づいて、APTT延長要因が凝固因子インヒビターである検体を判別可能であることが示された。
【0111】
実施例３ パラメータの比又は差を用いた凝固因子インヒビター力価の算出
１）インヒビター力価とパラメータ値との関係
異なるFVIIIインヒビター力価を有する被検検体を用いて、参考例１に記載の手順で混合検体を調製し、該混合検体のＰａ、Ｐｂ、及びＰｂ／Ｐａを求めた。FVIIIインヒビター力価とＰｂ／Ｐａとの関係性を調べた。被検検体には、ＩｎＬ及びＩｎＭの４７検体（FVIIIインヒビター力価が0.3から40.5（BU/mL）まで）を用いた。各混合検体から得た各種パラメータのＰｂ／Ｐａの、該混合検体に含まれる被検検体のインヒビター力価の対数値に対するプロットの例を図１９Ａ～２６Ａに示す。Ｐｂ／Ｐａの算出に用いたパラメータは、図１９ＡはＡＰＴＴ、図２０ＡはVmax、図２１ＡはAmax、図２２ＡはVmaxT、図２３ＡはAmaxT、図２４ＡはvT10%、図２５ＡはvAB10%、図２６Ａは凝固時間T5であった。図１９Ａ～２６Ａに示すように、これらのパラメータの比Ｐｂ／Ｐａはインヒビター力価とともに増加又は減少し、Ｐｂ／Ｐａがインヒビター力価と相関関係を有することが示された。一方で、インヒビター力価が低い領域と高い領域とで、Ｐｂ／Ｐａの分布に異なる傾向がみられた。このことから、低インヒビター力価領域と高インヒビター力価領域を異なる直線で回帰させると、力価とＰｂ／Ｐａとの相関性が向上することが示唆された。
１）インヒビター力価とパラメータ値との関係
異なるFVIIIインヒビター力価を有する被検検体を用いて、参考例１に記載の手順で混合検体を調製し、該混合検体のＰａ、Ｐｂ、及びＰｂ／Ｐａを求めた。FVIIIインヒビター力価とＰｂ／Ｐａとの関係性を調べた。被検検体には、ＩｎＬ及びＩｎＭの４７検体（FVIIIインヒビター力価が0.3から40.5（BU/mL）まで）を用いた。各混合検体から得た各種パラメータのＰｂ／Ｐａの、該混合検体に含まれる被検検体のインヒビター力価の対数値に対するプロットの例を図１９Ａ～２６Ａに示す。Ｐｂ／Ｐａの算出に用いたパラメータは、図１９ＡはＡＰＴＴ、図２０ＡはVmax、図２１ＡはAmax、図２２ＡはVmaxT、図２３ＡはAmaxT、図２４ＡはvT10%、図２５ＡはvAB10%、図２６Ａは凝固時間T5であった。図１９Ａ～２６Ａに示すように、これらのパラメータの比Ｐｂ／Ｐａはインヒビター力価とともに増加又は減少し、Ｐｂ／Ｐａがインヒビター力価と相関関係を有することが示された。一方で、インヒビター力価が低い領域と高い領域とで、Ｐｂ／Ｐａの分布に異なる傾向がみられた。このことから、低インヒビター力価領域と高インヒビター力価領域を異なる直線で回帰させると、力価とＰｂ／Ｐａとの相関性が向上することが示唆された。
【0112】
図２７Ａには、凝固時間T5のパラメータ差Ｐｂ－Ｐａの、該混合検体に含まれる被検検体のインヒビター力価の対数値に対するプロットを示す。Ｐｂ／Ｐａと同様に、Ｐａ－Ｐｂがインヒビター力価と相関関係を有することが示された。
【0113】
２）検量線に基づくインヒビター力価の算出
上記のようにパラメータ比Ｐｂ／Ｐａ、又は差Ｐｂ－Ｐａが対数変換したインヒビター力価と相関することを利用し、FVIIIインヒビター力価が既知の検体を用いて検量線を作成した。検量線作成用の検体には、FVIII欠損（ＨＡ）の１検体、及びFVIIIインヒビター力価が0.5、1.1、2.2、4.4、8.7、17.4、34.9（BU/mL）の検量線用検体（Ｃａｌ）を７検体の合計８検体を用いた。
FVIII欠損検体のインヒビター力価は0.1とみなし、各検体のインヒビター力価の対数変換値とＰｂ／Ｐａ又はＰｂ－Ｐａとの回帰直線を求めた。その際、検体をインヒビター力価の低い群と高い群に分け、それぞれについての回帰直線を求めた。低インヒビター力価群と高インヒビター力価群との境界となる力価は2.2（BU/mL）とした。作成した検量線の例を図１９Ｂ～２７Ｂに示す。用いたパラメータは、それぞれＡ図と同じである。いずれの検量線も、２つの直線から成る折れ線とした。
上記のようにパラメータ比Ｐｂ／Ｐａ、又は差Ｐｂ－Ｐａが対数変換したインヒビター力価と相関することを利用し、FVIIIインヒビター力価が既知の検体を用いて検量線を作成した。検量線作成用の検体には、FVIII欠損（ＨＡ）の１検体、及びFVIIIインヒビター力価が0.5、1.1、2.2、4.4、8.7、17.4、34.9（BU/mL）の検量線用検体（Ｃａｌ）を７検体の合計８検体を用いた。
FVIII欠損検体のインヒビター力価は0.1とみなし、各検体のインヒビター力価の対数変換値とＰｂ／Ｐａ又はＰｂ－Ｐａとの回帰直線を求めた。その際、検体をインヒビター力価の低い群と高い群に分け、それぞれについての回帰直線を求めた。低インヒビター力価群と高インヒビター力価群との境界となる力価は2.2（BU/mL）とした。作成した検量線の例を図１９Ｂ～２７Ｂに示す。用いたパラメータは、それぞれＡ図と同じである。いずれの検量線も、２つの直線から成る折れ線とした。
【0114】
作成した検量線を基に、パラメータ比Ｐｂ／Ｐａ又は差Ｐｂ－Ｐａから被検検体のFVIIIインヒビター力価（の推測値）を算出した。図１９Ｃ～２７Ｃは、各被検検体のインヒビター力価の実測値に対する、検量線に基づく演算値のプロットである。図１９Ｄ～２７ＤはＣ図の実測値２０ＢＵ／ｍＬ以下のデータのみを用いて再プロットした図である。
【0115】
表４～５には、各種パラメータの比Ｐｂ／Ｐａを用いて作成した検量線に基づく演算力価（y）の、実測力価（x）に対する回帰式の傾きと切片、及び相関係数を示す。表４は、補正あり曲線（補正０次～２次曲線）からのパラメータを示し、表５は、補正なし曲線（未補正０次～２次曲線）からのパラメータを示す。さらにそれらの中から、高い相関性を示したパラメータを表６に示す。また、表７には、各種パラメータの差Ｐｂ－Ｐａを用いて作成した検量線に基づく演算力価（y）の、実測力価（x）に対する回帰式の傾きと切片、及び相関係数を示す。表７には、補正あり曲線（補正０次～２次曲線）からのパラメータと、補正なし曲線（未補正０次～２次曲線）からのパラメータを示す。さらにそれらの中から、高い相関性を示したパラメータを表８に示す。
【0116】
【表4】
【0117】
【表5】
【0118】
【表6】
【0119】
【表7】
【0120】
【表8】
【0121】
表９～１０には、表４～５のものとは別の各種パラメータの比Ｐｂ／Ｐａを用いて作成した検量線に基づく演算力価（y）の、実測力価（x）に対する回帰式の傾きと切片、及び相関係数を示す。表９は、補正１次曲線からのパラメータを示し、表１０は、未補正１次曲線からのパラメータを示す。さらにそれらの中から、高い相関性を示したパラメータを表１１に示す。
【0122】
【表9】
【0123】
【表10】
【0124】
【表11】
【0125】
実施例５ 高インヒビター力価検体の検体希釈によるインヒビター力価の算出
インヒビター力価が実施例３で求めた検量線の力価範囲より高い高インヒビター力価検体について、希釈検体を用いて上記と同様のパラメータを用いた検量線に基づく力価演算を実施し、その結果に希釈倍率を乗じることによって演算力価を求めた。
具体的には、被検検体として、インヒビター力価が９９、１１３、１６６、２５３及び２５９（ＢＵ／ｍＬ）であったＩｎＨの５検体を用いた。該被検検体を正常血漿により１０倍希釈し、その１０倍希釈検体を正常血漿と容量比１：１で混合して混合検体を調製した。参考例１と同様の手順で該混合検体のＰａ、Ｐｂ、及びＰｂ／Ｐａを求め、実施例３で用いた検量線に基づいて希釈検体の演算力価を算出し、これに希釈倍率を乗じることによって被検検体の演算力価を求めた。この結果をＩｎＬ及びＩｎＭの４７検体についての結果と合わせた。図２８は、ＩｎＬ及びＩｎＭの４７検体についての演算力価と、上記で求めた５検体のＩｎＨの演算力価の、実測力価に対するプロットである。各プロット図の下には、演算力価と実測力価との回帰式と相関係数を示した。いずれのパラメータも良好な相関関係が得られ、検体希釈処理によって高力価検体の測定が可能であることが確認された。
インヒビター力価が実施例３で求めた検量線の力価範囲より高い高インヒビター力価検体について、希釈検体を用いて上記と同様のパラメータを用いた検量線に基づく力価演算を実施し、その結果に希釈倍率を乗じることによって演算力価を求めた。
具体的には、被検検体として、インヒビター力価が９９、１１３、１６６、２５３及び２５９（ＢＵ／ｍＬ）であったＩｎＨの５検体を用いた。該被検検体を正常血漿により１０倍希釈し、その１０倍希釈検体を正常血漿と容量比１：１で混合して混合検体を調製した。参考例１と同様の手順で該混合検体のＰａ、Ｐｂ、及びＰｂ／Ｐａを求め、実施例３で用いた検量線に基づいて希釈検体の演算力価を算出し、これに希釈倍率を乗じることによって被検検体の演算力価を求めた。この結果をＩｎＬ及びＩｎＭの４７検体についての結果と合わせた。図２８は、ＩｎＬ及びＩｎＭの４７検体についての演算力価と、上記で求めた５検体のＩｎＨの演算力価の、実測力価に対するプロットである。各プロット図の下には、演算力価と実測力価との回帰式と相関係数を示した。いずれのパラメータも良好な相関関係が得られ、検体希釈処理によって高力価検体の測定が可能であることが確認された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図12-2】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図18F】
【図18G】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
