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特許7458404イズロン酸－２－スルファターゼ免疫グロブリン融合タンパク質の精製
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-21
(45)【発行日】2024-03-29
(54)【発明の名称】イズロン酸－２－スルファターゼ免疫グロブリン融合タンパク質の精製
(51)【国際特許分類】
C07K 1/36 20060101AFI20240322BHJP
C07K 1/18 20060101ALI20240322BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20240322BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240322BHJP
C12N 9/16 20060101ALN20240322BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20240322BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240322BHJP
C12P 21/00 20060101ALN20240322BHJP
【ＦＩ】
C07K1/36 ZNA
C07K1/18
C07K1/22
C07K19/00
C12N9/16 Z
C07K16/00
C12N15/62 Z
C12P21/00 C
【請求項の数】
7
(21)【出願番号】P 2021535571
(86)(22)【出願日】2019-12-20
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(86)【国際出願番号】 US2019067868
(87)【国際公開番号】W WO2020132452
(87)【国際公開日】2020-06-25
【審査請求日】2022-12-16
(31)【優先権主張番号】62/782,834
(32)【優先日】2018-12-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】508105751
【氏名又は名称】アーマジェン・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＡＲＭＡＧＥＮ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(72)【発明者】
【氏名】チェリカニ，ラフル
(72)【発明者】
【氏名】ユアン，ハン
(72)【発明者】
【氏名】ベーコン，フランシス
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，イン
【審査官】北村 悠美子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１３－５３０１５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】Bioconjugate Chemistry，2013年，Vol.24, pp.1741-1749
【文献】Biotechnology and Bioengineering，2014年，Vol.111, No.11, pp.2317-2325
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｐ ２１／００－２１／０８
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーをこの順序で行うことによって、免疫グロブリンおよびイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む融合タンパク質を不純な調製物から精製することを含む方法であって、
該アフィニティークロマトグラフィーが、プロテインＡ抗体クロマトグラフィーであり、該プロテインＡ抗体クロマトグラフィーが、１０～１００ｍＭの範囲の均一濃度のクエン酸ナトリウムを含むｐＨが３．３～３．９である溶出緩衝液を用いて行われ
該陽イオン交換クロマトグラフィーカラムが、１０～３００ｍＭの範囲の均一濃度のＮａＣｌを含むｐＨが５．２～５．８である溶出緩衝液を用いて行われ、及び
該マルチモーダルクロマトグラフィーカラムが、約７．０のｐＨで実行されるものである、方法。
【請求項2】
該陽イオン交換クロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーであり、該マルチモーダルクロマトグラフィーが、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
１．０～２．０Ｍの塩濃度のＮａＣｌが、クロマトグラフィーカラムの充填および洗浄において使用される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
ウイルス不活化の工程をさらに含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
最後のクロマトグラフィーカラムの後にウイルス濾過の工程をさらに含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
該融合タンパク質が、既知組成培地中で培養される哺乳類細胞によって産生され、該哺乳類細胞がＣＨＯ細胞であり、該哺乳類細胞がバイオリアクター中で培養され、該バイオリアクターが、攪拌槽型灌流バイオリアクタープロセスとして機能する、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
不純な調製物が、哺乳類細胞から分泌された該融合タンパク質を含む既知組成培地から調製される、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，８３４号の利益および優先権を主張し、この内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
本願は、２０１８年１２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／７８２，８３４号の利益および優先権を主張し、この内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表の参照による組み込み
２０１９年１２月１８日に作成された３７１９６バイトのサイズの「SHR-182-AGT-SequenceListing.txt」という名前のテキストファイルの内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
２０１９年１２月１８日に作成された３７１９６バイトのサイズの「SHR-182-AGT-SequenceListing.txt」という名前のテキストファイルの内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳ ＩＩ、ハンター症候群）は、イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）という酵素の欠損に起因するＸ染色体連鎖劣性遺伝のリソソーム蓄積症である。Ｉ２Ｓは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のデルマタン硫酸およびヘパラン硫酸から末端２－Ｏ－硫酸部分を切断する。ハンター症候群の患者では、Ｉ２Ｓ酵素の欠損または欠陥のためにＧＡＧが多様な細胞型のリソソームにおいて徐々に蓄積し、細胞拡張(cellular engorgement)、臓器肥大、組織破壊および臓器系の機能障害をもたらす。
【0004】
一般に、ハンター症候群の人の物理的症状には、身体症状および神経症状の両方が含まれる。例えば、ハンター症候群の一部の症例では、中枢神経系（ＣＮＳ）の関与により、発達遅延および神経系の障害が生じる。神経変性および精神遅滞などの症状は小児期に現れ、神経作用に苦しむハンター症候群患者は脳への臓器障害のために若年齢で死亡することが多い。同様に、ＧＡＧの蓄積は身体の臓器系に悪影響を及ぼし得る。最初に心臓、肺および気道の壁の肥厚ならびに肝臓、脾臓および腎臓の異常な肥大として現れ、これらの重大な変化は最終的に広範囲の壊滅的な臓器不全をもたらし得る。結果として、ハンター症候群は常に重篤で進行性であり、致死的である。
【0005】
酵素補充療法（ＥＲＴ）はハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ）を処置するための承認された治療法であり、外因性の補充用Ｉ２Ｓ酵素をハンター症候群の患者に投与することを含む。しかし、全身投与されたＩ２Ｓ酵素は血液脳関門（ＢＢＢ）を容易に通過できないため、この疾患のＣＮＳ症状を処置するには不十分であると示されることが多い。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、特に、ハンター症候群に関連するＣＮＳ症状の処置のために血液脳関門（ＢＢＢ）を効果的に通過し得る著しく強力なイズロン酸－２－スルファターゼ融合タンパク質を提供する。さらに、本発明は、酵素補充療法を介してハンター症候群を処置するための改善された方法および組成物を提供する。本発明は、ヒトインスリン受容体抗体－Ｉ２Ｓ（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）融合タンパク質が未処理の生体物質（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む細胞培地など）からわずか３つのクロマトグラフィーカラムを含むプロセスを用いて精製され得るという驚くべき発見に部分的に基づく。本発明は、Ｉ２Ｓ酵素のバイオアベイラビリティおよび／またはリソソーム標的化の促進を増加させ得る２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６ＰまたはビスＭ６Ｐ）レベルの調節を可能にする。実施例の項に記載されているように、本発明により３つのカラムプロセスを用いて精製されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、Ｉ２Ｓ酵素の活性に重要なＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）を高い割合（例えば、７０％よりも高く、最大で１００％）で保持している。さらに、本発明により精製されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、高い純度レベル（＜８ｐｐｍの宿主細胞タンパク質）を示す。したがって、本発明は、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を精製するためのより効果的で安価かつ迅速なプロセスを提供する。
【0007】
以下に記載される任意の態様および実施態様は任意の所望の方法で組み合わされ得、文脈が他を示している場合を除き、任意の実施態様または実施態様の組合せが以下に記載される各態様に適用され得ることが理解される。
【0008】
ある態様において、免疫グロブリンおよびイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む精製された融合タンパク質を含む組成物が提供され、融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約６０％の変換を含み、精製された融合タンパク質は、グリカンマップ上の１％～１０％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）ピーク面積を特徴とする。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、グリカンマップ上の４％～９％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）ピーク面積を特徴とする。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、グリカンマップ上の５．２％～７．２％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）ピーク面積を特徴とする。ある実施態様において、融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約６０％の変換を含み、精製された融合タンパク質は、分子ごとに平均で約３．０ｍｏｌ／ｍｏｌ～約４．０ｍｏｌ／ｍｏｌのマンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）残基を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約７０％の変換を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約８０％の変換を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約９０％の変換を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約９５％の変換を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約９８％の変換を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、哺乳類細胞に由来する。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞に由来する。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、５．２％～７．２％の２－Ｍ６Ｐ残基レベルを含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、キメラモノクローナル抗体を含む免疫グロブリンを含む。ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に結合するキメラモノクローナル抗体を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、Ｉ２Ｓと融合したヒトインスリン受容体モノクローナル抗体を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１１と同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、キメラモノクローナル抗体は、組換えヒトＩｇＧ軽鎖を含む。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号１２と同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、融合タンパク質は、リンカーを含まない。ある実施態様において、ヒトインスリン受容体は、内在性脳毛細血管内皮インスリン受容体を介した輸送を媒介する。ある実施態様において、ヒトインスリン受容体は、内在性神経インスリン受容体を介した輸送を媒介する。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、２－Ｍ６Ｐ残基を含むイズロン酸－２－スルファターゼを含む。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ残基は、Ｍ６Ｐ受容体に結合する。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ受容体は、内在性リソソームＭ６Ｐ受容体を介した輸送を媒介する。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ残基は、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約６０％の結合を促進する。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ残基は、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約７０％の結合を促進する。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ残基は、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約７５％の結合を促進する。ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体への少なくとも約７０％の結合を促進する。ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体への少なくとも約８０％の結合を促進する。ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体への少なくとも約９０％の結合を促進する。ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体への少なくとも約９５％の結合を促進する。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、プレートに基づく蛍光酵素アッセイによって決定される少なくとも約３Ｕ／ｍｇの比活性を有する。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、１０ｎｇ／ｍｇ（ｐｐｍ）未満のＨＣＰを含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、少なくとも１５ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、少なくとも２０ｍｏｌ／ｍｏｌのシアル酸含有量を含む。
【0009】
別の態様において、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーのうち１つ以上を行うことによって、免疫グロブリンおよびイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）を含む融合タンパク質を不純な調製物から精製することを含む方法を提供する。ある実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、プロテインＡ抗体クロマトグラフィーである。ある実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーである。ある実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーは、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーである。ある実施態様において、本方法は、３つのクロマトグラフィーの工程を含む。ある実施態様において、本方法は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーをこの順序で行う。ある実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、均一濃度のクエン酸ナトリウム溶出を含む溶出緩衝液を用いて溶出される。ある実施態様において、均一濃度のクエン酸ナトリウム溶出は、１０～１００ｍＭの範囲のクエン酸ナトリウムを含む。ある実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーカラムは、３．３～３．９のｐＨで実行される。ある実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、均一濃度のＮａＣｌ溶出を含む溶出緩衝液を用いて溶出される。ある実施態様において、ＮａＣｌ溶出は、１０～３００ｍＭの範囲のＮａＣｌを含む。ある実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、５．２～５．８のｐＨで実行される。ある実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、フロースルーモードおよび／または結合／溶出モードで操作される。ある実施態様において、１．０～２．０Ｍの塩濃度のＮａＣｌが、クロマトグラフィーカラムの充填および洗浄において使用される。ある実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、約７．０のｐＨで実行される。ある実施態様において、本方法は、ウイルス不活化の工程をさらに含む。ある実施態様において、本方法は、最後のクロマトグラフィーカラムの後にウイルス濾過の工程をさらに含む。ある実施態様において、免疫グロブリンおよびＩ２Ｓタンパク質を含む融合タンパク質は、既知組成培地中で培養される哺乳類細胞によって産生される。ある実施態様において、哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。ある実施態様において、哺乳類細胞はバイオリアクター中で培養される。ある実施態様において、バイオリアクターは、攪拌槽型灌流バイオリアクタープロセスとして機能する。ある実施態様において、不純な調製物は、哺乳類細胞から分泌された融合タンパク質を含む既知組成培地から調製される。
【0010】
別の態様において、先行請求項のいずれかに記載の方法に従って精製された免疫グロブリンおよびＩ２Ｓタンパク質を含む精製された融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に結合するキメラモノクローナル抗体を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、Ｉ２Ｓポリペプチド、およびヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に結合するキメラモノクローナル抗体を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１１と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、精製された融合タンパク質は、配列番号１１と同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、キメラモノクローナル抗体は、組換えヒトＩｇＧ軽鎖を含む。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号１２と少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号１２と同一のアミノ酸配列を含む。
【0011】
別の態様において、処置を必要とする対象に本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む、ハンター症候群を処置する方法を提供する。
【0012】
本発明の他の特徴および利点は、図面ならびに以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【0013】
上記の特徴およびさらなる特徴は、添付の図面と組み合わせた場合に以下の詳細な説明からより明確に理解される。しかし、図面は説明のみを目的とするものであり、制限のためのものではない。
【0014】
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
定義
本明細書において参照されている特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。本明細書において引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願および参考文献（ＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベース配列を含む）は、それぞれが参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において、変数についての数値範囲の記載は、本発明がその範囲内のいずれかの値に等しい変数を用いて実施され得ることを示すことを意図している。したがって、本質的に離散的な変数について、該変数は数値範囲内の任意の整数値（範囲の端点を含む）に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数について、該変数は数値範囲内の任意の実数値（範囲の端点を含む）に等しくなり得る。例として、限定されないが、０～２の間の値を有すると記述されている変数は、該変数が本質的に離散的である場合、０、１または２の値を取り得、該変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値または≧０かつ≦２の他の任意の実数値を取り得る。
本明細書において参照されている特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立している。本明細書において引用されている発行された米国特許、許可された出願、公開された外国出願および参考文献（ＧｅｎＢａｎｋまたは他のデータベース配列を含む）は、それぞれが参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において、変数についての数値範囲の記載は、本発明がその範囲内のいずれかの値に等しい変数を用いて実施され得ることを示すことを意図している。したがって、本質的に離散的な変数について、該変数は数値範囲内の任意の整数値（範囲の端点を含む）に等しくなり得る。同様に、本質的に連続的な変数について、該変数は数値範囲内の任意の実数値（範囲の端点を含む）に等しくなり得る。例として、限定されないが、０～２の間の値を有すると記述されている変数は、該変数が本質的に離散的である場合、０、１または２の値を取り得、該変数が本質的に連続的である場合、０．０、０．１、０．０１、０．００１の値または≧０かつ≦２の他の任意の実数値を取り得る。
【0028】
本明細書において、特に明記されていない限り、単語「または」は「および／または」という包括的な意味で使用され、「いずれか／または」という排他的な意味で使用されない。
【0029】
本明細書において、用語「およそ」または「約」は、それが修飾する値の±１０％以内を意味する。例えば、「約１」は「０．９～１．１」を意味し、「約２％」は「１．８％～２．２％」を意味し、「約２％～３％」は「１．８％～３．３％」を意味し、「約３％～約４％」は「２．７％～４．４％」を意味する。文脈から明らかでない限り、本明細書で与えられるあらゆる数値は、用語「約」によって修飾されている。
【0030】
本明細書において、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他を示していない限り、複数の指示対象を含む。
【0031】
用語「１以上」、「少なくとも１つ」、「１よりも大きい」などは、限定されないが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９もしくは１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００またはそれ以上およびそれらの間の任意の数を含むことが理解される。
【0032】
本明細書において、語句「生物学的に活性」は、生体システム（例えば、細胞培養物、生物など）中で活性を有する任意の物質の特性を指す。例えば、生物に投与された場合にその生物に生物学的な影響を与える物質は、生物学的に活性であると考えられる。生物学的活性は、インビトロでのアッセイ（例えば、硫酸塩放出アッセイなどのインビトロでの酵素アッセイ）によって決定され得る。特定の実施態様において、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的に「生物学的に活性な」部分と呼ばれる。いくつかの実施態様において、タンパク質は、対象に投与された場合に生物学的活性を示す細胞培養系から産生および／または精製される。いくつかの実施態様において、タンパク質は、生物学的に活性になるためにさらなる処理を必要とする。いくつかの実施態様において、タンパク質は、生物学的に活性になるために翻訳後修飾（限定されないが、グリコシル化（例えばシアリル化）、ファルネシル化(farnysylation)、切断、フォールディング、ホルミルグリシン変換およびそれらの組合せなど）を必要とする。いくつかの実施態様において、プロフォーム（すなわち未熟な形態）として産生されたタンパク質は、生物学的に活性になるためにさらなる修飾を必要とし得る。
【0033】
本明細書において、用語「陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）」は、リソソームに輸送されることになるゴルジ装置中の酸性ヒドロラーゼ前駆体上のマンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）タグに結合する細胞受容体を指す。ＣＩ－ＭＰＲは、マンノース－６－リン酸に加えて他のタンパク質（ＩＧＦ－ＩＩを含む）にも結合する。ＣＩ－ＭＰＲは、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、「ＣＩ－ＭＰＲ／ＩＧＦ－ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ－ＩＩ受容体」または「ＩＧＦ２受容体」としても知られている。これらの用語およびその略語は、本明細書において互換的に使用される。
【0034】
本明細書において、用語「クロマトグラフィー」は、混合物を分離するための技術を指す。通常、混合物は「移動相」と呼ばれる流体に溶解され、「固定相」と呼ばれる別の物質を保持する構造体に運ばれる。カラムクロマトグラフィーは、固定層が管（すなわちカラム）内にある分離技術である。
【0035】
本明細書において、用語「希釈剤」は、再構成された製剤の調製に有用な薬学的に許容され得る（例えば、ヒトへの投与について安全かつ非毒性の）希釈物質を指す。例示的な希釈剤には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。
【0036】
本明細書において、用語「溶出」は、溶媒で洗浄することによってある物質を別の物質から抽出するプロセスを指す。例えばイオン交換クロマトグラフィーでは、溶出は充填されている樹脂を洗浄して捕捉されているイオンを除去するプロセスである。
【0037】
本明細書において、用語「溶出物」は、典型的に溶出の結果としてクロマトグラフィーから出てくる移動相「担体」および分析物質の組合せを指す。
【0038】
本明細書において、用語「酵素補充療法（ＥＲＴ）」は、不足している酵素を与えることによって酵素の欠乏を補正する任意の治療戦略を指す。酵素が投与されると、酵素は細胞に取り込まれてリソソームに輸送され、酵素の欠乏のためにリソソーム中に蓄積している物質を除去するように作用する。通常、有効なリソソーム酵素補充療法のために、治療用酵素は貯蔵の欠損が明らかな標的組織の適切な細胞中のリソソームに送達される。
【0039】
本明細書において、クロマトグラフィーに関する用語「平衡化する」または「平衡化」は、一般に液体（例えば緩衝液）の成分の安定かつ均衡した分布を達成するために、第１の液体（例えば緩衝液）と別の液体とのバランスを取るプロセスを指す。例えば、いくつかの実施態様において、１以上のカラム容量の所望の液体（例えば緩衝液）をカラムに通すことによって、クロマトグラフィーカラムは平衡化され得る。
【0040】
本明細書において、用語「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」または文法上同等の用語は、ベースラインの測定値（本明細書に記載されている処置を開始する前の同一の個体における測定値、または本明細書に記載されている処置を行わない対照の個体（もしくは複数の対照の個体）における測定値など）に対する値を示す。「対照の個体」は処置されている個体と同じ形態のリソソーム蓄積症に罹患している個体であり、（処置されている個体および対照の個体の疾患の段階が同等であることを保証するために）処置されている個体とおよそ同じ年齢である。
【0041】
本明細書において、用語「不純物」は、標的の物質または化合物の化学組成とは異なる、限定された量の液体、気体または固体の内部にある物質を指す。不純物は混入物とも呼ばれる。
【0042】
本明細書において、用語「リンカー」は、融合タンパク質において天然タンパク質の特定の位置に現れるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を指し、一般に柔軟であるか、または２つのタンパク質部分の間に構造（ａヘリックスなど）を介入させるように設計される。リンカーはスペーサーとも呼ばれる。
【0043】
本明細書において、用語「充填」は、クロマトグラフィーにおいて試料を含む液体または固体をカラムに添加することを指す。いくつかの実施態様において、カラム上に充填された試料の特定の成分は、充填された試料がカラムを通過する際に捕捉される。いくつかの実施態様において、カラム上に充填された試料の特定の成分は、充填された試料がカラムを通過する際にカラムに捕捉されないか、またはカラムを「流れる」。
【0044】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は一般的に、ペプチド結合によって互いに結合している少なくとも２つのアミノ酸の列を指すように互換的に使用される。すなわち、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドの記載およびタンパク質の記載に等しく適用され、その逆もまた同様である。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは少なくとも３～５個のアミノ酸を含み得、これらの各アミノ酸は少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に結合している。当業者は、ポリペプチドが「非天然」アミノ酸またはポリペプチド鎖に統合できる他の実体を任意で含む場合があることを理解している。
【0045】
本明細書において、クロマトグラフィーに関する用語「プールする」は、カラムを通過した流体の１以上の分画を組み合わせることを指す。例えば、いくつかの実施態様において、クロマトグラフィーによって分離された試料の所望の成分を含む１以上の分画（例えば「ピーク分画」）が「プール」され得、単一の「プールされた」分画を生成し得る。
【0046】
本明細書において、用語「置換酵素」は、処置される疾患において欠損または不足している酵素を少なくとも部分的に置換するように作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施態様において、用語「置換酵素」は、処置されるリソソーム蓄積症において欠損または不足しているリソソーム酵素を少なくとも部分的に置換するように作用し得る任意の酵素を指す。いくつかの実施態様において、置換酵素は哺乳類リソソーム中に蓄積した物質を減少させることができ、または１以上のリソソーム蓄積症の症状を救助もしくは改善し得る。本発明に適した置換酵素は野生型または修飾されたリソソーム酵素の両方を含み、組換え法および合成法を用いて製造され得、または天然の供給源から精製され得る。置換酵素は、組換え酵素、合成酵素、遺伝子活性化酵素または天然酵素であり得る。
【0047】
本明細書において、用語「可溶性」は、治療物質が均一な溶液を形成する能力を指す。いくつかの実施態様において、治療物質が投与されており、作用の標的部位に輸送される溶液中の治療物質の溶解度は、治療有効量の治療物質が作用の標的部位に送達されることを可能にするのに十分である。治療物質の溶解度にはいくつかの要因が影響し得る。例えば、タンパク質の溶解度に影響を与え得る関連した要因には、イオン強度、アミノ酸配列および他の共可溶性(co-solubilizing)物質または塩（例えばカルシウム塩）の存在が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明における治療物質は対応する医薬組成物に可溶である。
【0048】
本明細書において、用語「安定」は、治療物質（例えば組換え酵素）が長期間にわたってその治療効果（例えば、意図された生物学的活性および／または物理化学的完全性のすべてまたは大部分）を維持する能力を指す。治療物質の安定性およびそのような治療物質の安定性を維持する医薬組成物の能力は、長期間（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月またはそれ以上）にわたって評価され得る。製剤の文脈において安定な製剤とは、その中の治療物質が保存により、およびプロセス（凍結／解凍、機械的混合および凍結乾燥など）の間に物理的完全性および／または化学的完全性および生物学的活性を本質的に保持している製剤である。タンパク質の安定性について、これは高分子量（ＨＭＷ）凝集体の形成、酵素活性の低下、ペプチドフラグメントの生成および電荷プロファイルの変化による尺度であり得る。
【0049】
本明細書において、用語「ウイルス処理」は、ウイルスを単に試料から除去する「ウイルス除去」、またはウイルスが非感染性の形態で試料中に保持される「ウイルス不活化」を指す。いくつかの実施態様において、ウイルス除去は、特にナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を利用し得る。いくつかの実施態様において、ウイルス不活化は、特に溶媒不活化、界面活性剤不活化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活化および／または紫外線不活化を利用し得る。
【0050】
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、本願が属する分野の当業者によって通常理解され、本願が属する分野において通常使用されている意味と同じ意味を有する；このような分野は参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書（定義を含む）が支配的である。
【0051】
詳細な説明
本発明は、特に、酵素補充療法を介してハンター症候群を処置するための組成物を製造および精製する改善された方法を提供する。本発明は、ハンター症候群に関連するＣＮＳ症状の処置のために血液脳関門（ＢＢＢ）を効果的に通過し得る著しく強力なイズロン酸－２－スルファターゼ融合タンパク質（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質）を提供する。さらに、本発明は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーのうち１つ以上に基づくプロセスを用いて、スルファターゼ融合タンパク質（例えばＩ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質）を不純な調製物から精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、プロテインＡクロマトグラフィー、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーおよびＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーを行うことにより、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を不純な調製物から精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、このような著しく強力なイズロン酸－２－スルファターゼ融合タンパク質を商業的に実行可能な規模で製造できるプロセスを提供する。本発明はさらに、精製されたＩ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質およびその使用方法を提供する。
本発明は、特に、酵素補充療法を介してハンター症候群を処置するための組成物を製造および精製する改善された方法を提供する。本発明は、ハンター症候群に関連するＣＮＳ症状の処置のために血液脳関門（ＢＢＢ）を効果的に通過し得る著しく強力なイズロン酸－２－スルファターゼ融合タンパク質（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質）を提供する。さらに、本発明は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーのうち１つ以上に基づくプロセスを用いて、スルファターゼ融合タンパク質（例えばＩ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質）を不純な調製物から精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、プロテインＡクロマトグラフィー、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーおよびＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーを行うことにより、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を不純な調製物から精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、このような著しく強力なイズロン酸－２－スルファターゼ融合タンパク質を商業的に実行可能な規模で製造できるプロセスを提供する。本発明はさらに、精製されたＩ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質およびその使用方法を提供する。
【0052】
本発明の様々な態様が以下のサブセクションにおいてさらに詳細に説明される。サブセクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各サブセクションは、本発明の任意の態様に適用され得る。本願において、「または」の使用は、別段の記載がない限り「および／または」を意味する。
【0053】
イズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）
本発明に適したＩ２Ｓは、天然に存在するイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の少なくとも部分的な活性を代替し得るか、またはＩ２Ｓの欠乏に関連する１以上の表現型もしくは症状を救助し得る任意のタンパク質またはタンパク質の一部である。本明細書において、用語「Ｉ２Ｓ酵素」および「Ｉ２Ｓタンパク質」ならびに文法上同等の用語は互換的に使用される。
本発明に適したＩ２Ｓは、天然に存在するイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の少なくとも部分的な活性を代替し得るか、またはＩ２Ｓの欠乏に関連する１以上の表現型もしくは症状を救助し得る任意のタンパク質またはタンパク質の一部である。本明細書において、用語「Ｉ２Ｓ酵素」および「Ｉ２Ｓタンパク質」ならびに文法上同等の用語は互換的に使用される。
【0054】
通常、ヒトＩ２Ｓタンパク質は、前駆体型として産生される。ヒトＩ２Ｓの前駆体型は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１～２５）、プロペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基２６～３３）、ならびに４２ｋＤａ鎖（完全長前駆体の残基３４～４５５）および１４ｋＤａ鎖（完全長前駆体の残基４４６～５５０）にさらにプロセシングされ得る鎖（完全長前駆体の残基３４～５５０）を含む。通常、前駆体型は、５５０個のアミノ酸を含む完全長前駆体または完全長Ｉ２Ｓタンパク質とも呼ばれる。典型的な野生型または天然に存在するヒトＩ２Ｓタンパク質のシグナルペプチドが除去された成熟型（配列番号１）および完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を表１に示す。シグナルペプチドには下線が引かれている。さらに、ヒトＩ２Ｓタンパク質アイソフォームａおよびｂ前駆体のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４として表１に示す。
表１．ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ
表１．ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ
【表1】
【0055】
いくつかの実施態様において、本発明に適したＩ２Ｓは、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号１）である。本明細書に開示されているように、配列番号１はヒトＩ２Ｓタンパク質の標準的なアミノ酸配列を表す。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、Ｉ２Ｓ遺伝子の５’ＵＴＲ内の代替開始部位における転写に起因する配列番号１のスプライスアイソフォームおよび／またはバリアントであり得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＩ２Ｓタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するＩ２Ｓタンパク質（例えば配列番号１）と比較して１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む改変された成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質であり得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号１）と実質的に相同である。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、成熟ヒトＩ２Ｓタンパク質のフラグメントまたは一部を含む。
【0056】
あるいは、適切なＩ２Ｓは完全長Ｉ２Ｓタンパク質である。いくつかの実施態様において、適切なＩ２Ｓは、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＩ２Ｓタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在する完全長Ｉ２Ｓタンパク質（例えば配列番号２）と比較して１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む改変された完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）と実質的に相同である。例えば、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号２と実質的に同一である。例えば、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、完全長ヒトＩ２Ｓタンパク質のフラグメントまたは一部を含む。本明細書において、完全長Ｉ２Ｓタンパク質は通常、シグナルペプチド配列を含む。
【0057】
いくつかの実施態様において、適切なＩ２ＳはヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質である。いくつかの実施態様において、適切なＩ２Ｓは、ヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、ヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＩ２Ｓタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（例えば配列番号３）と比較して１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む改変されたヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施態様において、適切なＩ２Ｓは、ヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（配列番号３）と実質的に相同である。例えば、適切なＩ２Ｓは、配列番号３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、適切なＩ２Ｓは、配列番号３と実質的に同一である。例えば、適切なＩ２Ｓは、配列番号３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、適切なＩ２Ｓは、ヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質のフラグメントまたは一部を含む。本明細書において、ヒトＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質は通常、シグナルペプチド配列を含む。
【0058】
いくつかの実施態様において、適切なＩ２ＳはヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質である。いくつかの実施態様において、適切なＩ２Ｓは、ヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、ヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の相同体または類似体は、実質的なＩ２Ｓタンパク質活性を保持しながら、野生型または天然に存在するヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（例えば配列番号４）と比較して１以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む改変されたヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質であり得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（配列番号４）と実質的に相同である。例えば、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号４と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号４と実質的に同一である。例えば、Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号４と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質のフラグメントまたは一部を含む。本明細書において、ヒトＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質は通常、シグナルペプチド配列を含む。
【0059】
当業者は、Ｉ２Ｓポリペプチドにおいて保存的アミノ酸置換がなされ得、前述のポリペプチドの機能的に同等なバリアント（すなわち、バリアントはＩ２Ｓポリペプチドの機能を保持している）が提供され得ることを理解する。本明細書において、保存的アミノ酸置換は、ポリペプチドの三次構造および／または活性をあまり変化させないアミノ酸置換を指す。バリアントは、当業者に公知のポリペプチド配列を変化させる方法に従って調製され得、そのような方法をまとめた文献（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York）において見出されるバリアントを含む。例示的なＩ２Ｓポリペプチドの機能的に同等なバリアントは、配列番号２の保存的アミノ酸置換を含む。アミノ酸の保存的置換には、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【0060】
Ｉ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質
本発明は、任意の精製されたスルファターゼ－免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、Ｉ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質）を製造するために使用され得る。特に本発明は、介在配列を伴って、または伴わずにＩ２Ｓを血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる免疫グロブリンに融合させた融合タンパク質を製造するために使用され得る。本明細書において、「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は末梢循環と脳および脊髄との間の障壁を指し、これは脳毛細血管内皮細胞の細胞膜内の密着結合によって形成され、脳への分子の輸送を制限する非常に緊密な障壁を形成する；ＢＢＢは、分子量６０Ｄａの尿素のように小さな分子でさえ制限できるほど緊密である。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門および網膜内の血液網膜関門は中枢神経系（ＣＮＳ）内の隣接した毛細血管関門であり、まとめて血液脳関門またはＢＢＢと呼ばれる。
本発明は、任意の精製されたスルファターゼ－免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、Ｉ２Ｓ－免疫グロブリン融合タンパク質）を製造するために使用され得る。特に本発明は、介在配列を伴って、または伴わずにＩ２Ｓを血液脳関門（ＢＢＢ）を通過できる免疫グロブリンに融合させた融合タンパク質を製造するために使用され得る。本明細書において、「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は末梢循環と脳および脊髄との間の障壁を指し、これは脳毛細血管内皮細胞の細胞膜内の密着結合によって形成され、脳への分子の輸送を制限する非常に緊密な障壁を形成する；ＢＢＢは、分子量６０Ｄａの尿素のように小さな分子でさえ制限できるほど緊密である。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門および網膜内の血液網膜関門は中枢神経系（ＣＮＳ）内の隣接した毛細血管関門であり、まとめて血液脳関門またはＢＢＢと呼ばれる。
【0061】
免疫グロブリン
ＢＢＢは、血液から脳への高分子の輸送を可能にする特異的な受容体を有することが示されている。例えば、受容体介在性エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスを誘導し得る任意の免疫グロブリンが使用され得る。本発明において有用な例示的な内在性ＢＢＢ受容体介在性輸送系には、インスリン、トランスフェリン、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦｌおよびＩＧＦ２）、レプチンおよびリポタンパク質を輸送する系が含まれる。したがって、いくつかの実施態様において、本発明における適切な免疫グロブリンは、内在性ＢＢＢ受容体に結合することにより、ＢＢＢを通過する。様々な内在性ＢＢＢ受容体が当分野で公知であり、よく特徴付けられている。例えば、インスリン受容体およびその細胞外インスリン結合ドメイン（ＥＣＤ）は、構造的および機能的に当分野で広範に特徴付けられている。例えば、Yip et al (2003), J. Biol. Chem, 278(30):27329-27332；およびWhittaker et al. (2005), J. Biol. Chem, 280(22):20932-20936を参照。ヒトインスリン受容体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００２０８に見出され得る。
ＢＢＢは、血液から脳への高分子の輸送を可能にする特異的な受容体を有することが示されている。例えば、受容体介在性エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスを誘導し得る任意の免疫グロブリンが使用され得る。本発明において有用な例示的な内在性ＢＢＢ受容体介在性輸送系には、インスリン、トランスフェリン、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦｌおよびＩＧＦ２）、レプチンおよびリポタンパク質を輸送する系が含まれる。したがって、いくつかの実施態様において、本発明における適切な免疫グロブリンは、内在性ＢＢＢ受容体に結合することにより、ＢＢＢを通過する。様々な内在性ＢＢＢ受容体が当分野で公知であり、よく特徴付けられている。例えば、インスリン受容体およびその細胞外インスリン結合ドメイン（ＥＣＤ）は、構造的および機能的に当分野で広範に特徴付けられている。例えば、Yip et al (2003), J. Biol. Chem, 278(30):27329-27332；およびWhittaker et al. (2005), J. Biol. Chem, 280(22):20932-20936を参照。ヒトインスリン受容体のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ０００２０８に見出され得る。
【0062】
限定されない例として、本発明における適切な免疫グロブリンは、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、インスリン様増殖因子１および２（ＩＧＦ１およびＩＧＦ２）受容体、レプチン受容体および／またはリポタンパク質受容体に結合する。他の実施態様において、適切な免疫グロブリンは、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（ＦＣ５またはＦＣ４４など）であり得る。
【0063】
本明細書において、用語「免疫グロブリン」は、抗体または抗体の一部を指す。「抗体」は、特定の標的抗原に対する特異的な結合を与えるのに十分な標準的な免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドである。抗体は２つの重鎖ポリペプチドおよび２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤ）を含み、これらは互いに結合して「Ｙ字型」構造と一般に呼ばれる構造をとる。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（可変（ＶＨ）ドメインおよび３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）から構成される。各軽鎖は２つのドメイン（可変（ＶＬ）ドメインおよび定常（ＣＬ）ドメイン）から構成される。（重鎖または軽鎖にかかわらず）各可変ドメインは、「相補性決定領域」として知られる３つの超可変ループ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）およびいくらか不変の４つの「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含む。フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域は、２つの重鎖のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素およびエフェクター細胞（例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞を含む）上の受容体に結合する。したがって、「免疫グロブリン」は、抗体の構造単位（例えば、重鎖または軽鎖）、フラグメント（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂ’）もしくは領域（例えば、可変領域、より具体的にはＣＤＲ）、または組換え抗体（限定されないが、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合物、二重特異性抗体、三重特異性抗体および四重特異性抗体を含む）を指し得る。「抗体」は、２つの異なる抗体のフラグメントから構成され、結果として２つの異なる種類の抗原に結合する人工タンパク質である二重特異性抗体であり得る。抗体は、アイソタイプまたはクラスと呼ばれる種々の分類であり得る。有胎盤哺乳類には、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭとして知られる５つの抗体アイソタイプが存在する。価数は、抗体の抗原結合部位の数である。したがって、複数の抗原結合部位を含む種々のアイソタイプが存在し得る。例えば、ＩｇＭは５つの「Ｙ」字型単量体の５量体である；したがって、完全なＩｇＭタンパク質は１０個の重鎖、１０個の軽鎖および１０個の抗原結合アームを含み、ＩｇＭの価数は１０である。
【0064】
本発明が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄフラグメント；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がヒトまたは非ヒト相同配列に置換されているキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がヒトまたは非ヒト相同配列に置換されているキメラＦ（ａｂ’）２フラグメント抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域がヒトまたは非ヒト相同配列に置換されているキメラＦａｂフラグメント抗体；ならびに、ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域がヒトまたは非ヒト相同配列に置換されているキメラＦｄフラグメント抗体を包含することは、当業者には明らかである。本発明はまた、いわゆる単鎖抗体を含む。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は１つのＣＤＲのみを含む。
【0065】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（Ｍａｂ）であり、典型的にはマウスモノクローナル抗体のヒト化によって得られるヒト－マウスキメラ抗体である。このような抗体は、例えば抗原投与に応答して特異的なヒト抗体を産生するように「設計」されたトランスジェニックマウスから得られる。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の要素が、内在性重鎖および軽鎖の遺伝子座の標的破壊を含む胚性幹細胞株由来のマウスの系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成し得、ヒト抗体分泌ハイブリドーマを製造するために使用され得る。
【0066】
ヒトに使用される場合、ヒトに投与してもあまり免疫原性ではない程度のヒト配列（例えば、約８０％のヒトおよび約２０％のマウス、または約８５％のヒトおよび約１５％のマウス、または約９０％のヒトおよび約１０％のマウス、または約９５％のヒトおよび５％のマウス、または約９５％よりも大きいヒトおよび約５％未満のマウス）を含むキメラ抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ、ＢＢＢを通過できる他の抗体）が好ましい。より高度にヒト化された形態の抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ、ＢＢＢを通過できる他の抗体）が設計され得、ヒト化抗体（例えばＨＩＲ Ａｂ）はマウスＨＩＲ Ａｂと同等の活性を有し、本発明の実施態様において使用され得る。例えば、２００２年１１月２７日に出願された米国特許出願公開第２００４－０１０１９０４号および２００５年２月１７日に出願された第２００５－０１４２１４１号を参照。本発明における使用に十分なヒト配列を有するヒトＢＢＢインスリン受容体に対するヒト化抗体は、例えば、Boado et al. (2007), Biotechnol Bioeng, 96(2):381-391に記載されている。
【0067】
ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ－融合タンパク質
ある実施態様において、本開示の抗体は、Ｉ２Ｓと融合させたヒトインスリン受容体モノクローナル抗体（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）である。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓは、配列番号５と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列によって規定される。ある実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ配列は配列番号５と同一である。配列番号５は、成熟した５２５アミノ酸のヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をキメラヒトインスリン受容体モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）のカルボキシ末端に融合させたＩｇＧ ＨＣ融合タンパク質（９７０アミノ酸）をコードしている。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓのアミノ酸配列を以下の表２に示す。
ある実施態様において、本開示の抗体は、Ｉ２Ｓと融合させたヒトインスリン受容体モノクローナル抗体（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）である。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓは、配列番号５と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列によって規定される。ある実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ配列は配列番号５と同一である。配列番号５は、成熟した５２５アミノ酸のヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）酵素をキメラヒトインスリン受容体モノクローナル抗体の重鎖（ＨＣ）のカルボキシ末端に融合させたＩｇＧ ＨＣ融合タンパク質（９７０アミノ酸）をコードしている。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓのアミノ酸配列を以下の表２に示す。
【0068】
ある実施態様において、本開示の抗体は、組換えヒトＩｇＧ軽鎖のアミノ酸配列を含む。組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号６と約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一であるアミノ酸配列によって規定される。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は配列番号６と同一である。
表２：Ｉ２Ｓと融合させたヒトインスリン受容体モノクローナル抗体（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）
＊配列番号５の下線部分は、ヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の成熟した５２５アミノ酸配列に対応している。
表２：Ｉ２Ｓと融合させたヒトインスリン受容体モノクローナル抗体（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）
【表2】
【0069】
当業者は、本明細書に提示されているポリペプチド（例えば、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ、組換えヒトＩｇＧ軽鎖および／またはＩ２Ｓ）のいずれかにおいて保存的アミノ酸置換がなされ得、前述のポリペプチドの機能的に同等なバリアント（すなわち、バリアントは機能を保持している）が提供され得ることを理解する。
【0070】
ある実施態様において、ＨＩＲ抗体またはＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、上述のＨＩＲ重鎖およびＨＩＲ軽鎖のいずれかに対応する重鎖および軽鎖の両方を含む。
【0071】
いくつかの実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に結合するキメラモノクローナル抗体を含む。ＨＩＲは、内在性脳毛細血管内皮インスリン受容体を介して血液脳関門を通過する輸送を媒介し得る。ＨＩＲは、内在性神経インスリン受容体を介した輸送を媒介し得る。
【0072】
本発明において使用されるＨＩＲ抗体はグリコシル化されていてもよく、非グリコシル化されていてもよい。抗体がグリコシル化されている場合、抗体の機能にあまり影響を与えない任意のグリコシル化のパターンが使用され得る。グリコシル化は抗体が作製される細胞に典型的なパターンで生じ得、細胞の種類によって様々であり得る。例えば、マウス骨髄腫細胞によって産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化パターンは、遺伝子導入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるモノクローナル抗体のグリコシル化パターンとは異なり得る。いくつかの実施態様において、抗体は、遺伝子導入されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって産生されるパターンでグリコシル化される。
【0073】
当業者は、現在の技術が膨大な数の候補抗体（例えば、ＨＩＲ Ａｂ、ＢＢＢを通過できる他の抗体）の配列バリアントを（例えばインビトロで）生成でき、標的抗原（ヒトインスリン受容体のＥＣＤまたはその単離されたエピトープなど）への結合についてスクリーニングできることを認識している。例えば、抗体配列バリアントの超ハイスループットスクリーニングの例について、Fukuda et al. (2006) "In vitro evolution of single-chain antibodies using mRNA display," Nuc. Acid Res., 34(19)（オンラインで公開されている）を参照。また、Chen et al. (1999), "In vitro scanning saturation mutagenesis of all the specificity determining residues in an antibody binding site," Prot Eng, 12(4): 349-356も参照。インスリン受容体ＥＣＤは、例えばColoma et al. (2000) Pharm Res, 17:266-274に記載されているように精製され得、ＨＩＲ Ａｂおよび公知のＨＩＲ ＡｂのＨＩＲ Ａｂ配列バリアントについてスクリーニングするために使用され得る。
【0074】
したがって、いくつかの実施態様において、所望のレベルのヒト配列を有する遺伝子組換えＨＩＲ ＡｂをＩ２Ｓと融合し、二機能性分子である組換え融合抗体が作製される。ＨＩＲ Ａｂ－Ｉ２Ｓ融合抗体は、（ｉ）ヒトインスリン受容体の細胞外ドメインに結合し；（ｉｉ）デルマタンおよび／またはヘパラン硫酸における結合の加水分解を触媒し；かつ、（ｉｉｉ）ＢＢＢ ＨＩＲ上の輸送を介してＢＢＢを通過でき、末梢投与後に脳内でＩ２Ｓ活性を保持できる。
【0075】
リンカー
本明細書に記載のＩ２Ｓ融合タンパク質（例えばＨＩＲＭＡｂ－Ｉ２Ｓ）は、免疫グロブリンとＩ２Ｓとの間に共有結合を含み得る。共有結合は、免疫グロブリン（例えばＨＩＲ抗体）のカルボキシ末端またはアミノ末端およびＩ２Ｓのアミノ末端またはカルボキシ末端に対する結合であり得、この結合は、免疫グロブリンが受容体のＥＣＤに結合して血液脳関門を通過することを可能にし、Ｉ２Ｓがその活性の治療上有用な部分を保持することを可能にする。ある実施態様において、共有結合は抗体の重鎖とＩ２Ｓとの間にある。いくつかの実施態様において、共有結合は抗体の軽鎖とＩ２Ｓとの間にある。任意の適切な結合（例えば、軽鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、重鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、軽鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、重鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、軽鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合、重鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合、軽鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合、または重鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合）が使用され得る。いくつかの実施態様において、結合はＨＣのカルボキシ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合である。
本明細書に記載のＩ２Ｓ融合タンパク質（例えばＨＩＲＭＡｂ－Ｉ２Ｓ）は、免疫グロブリンとＩ２Ｓとの間に共有結合を含み得る。共有結合は、免疫グロブリン（例えばＨＩＲ抗体）のカルボキシ末端またはアミノ末端およびＩ２Ｓのアミノ末端またはカルボキシ末端に対する結合であり得、この結合は、免疫グロブリンが受容体のＥＣＤに結合して血液脳関門を通過することを可能にし、Ｉ２Ｓがその活性の治療上有用な部分を保持することを可能にする。ある実施態様において、共有結合は抗体の重鎖とＩ２Ｓとの間にある。いくつかの実施態様において、共有結合は抗体の軽鎖とＩ２Ｓとの間にある。任意の適切な結合（例えば、軽鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、重鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、軽鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、重鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合、軽鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合、重鎖のカルボキシ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合、軽鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合、または重鎖のアミノ末端からＩ２Ｓのカルボキシ末端への結合）が使用され得る。いくつかの実施態様において、結合はＨＣのカルボキシ末端からＩ２Ｓのアミノ末端への結合である。
【0076】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、融合アミノ酸配列の一部としてＩ２Ｓと免疫グロブリンとの間にリンカーまたはスペーサーを含む。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の融合タンパク質は、融合タンパク質の間にリンカーまたはスペーサーを含まない。通常、適切なリンカーまたはスペーサーはアミノ酸リンカーまたはスペーサー（ペプチドリンカーまたはスペーサーとも呼ばれる）である。アミノ酸（またはペプチド）リンカーまたはスペーサーは、一般に柔軟であるか、または２つのタンパク質部分の間に構造（アルファ－ヘリックスなど）を介入させるように設計される。適切なペプチド配列リンカーは、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のアミノ酸長であり得る。いくつかの実施態様において、ペプチドリンカーは、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１未満のアミノ酸長である。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓは標的化抗体に直接結合しており、したがって０アミノ酸長である。いくつかの実施態様において、適切なペプチドリンカーは、例えば１０～５０（例えば、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１０～３５、１０～４０、１０～４５、１０～５０）アミノ酸長であり得る。
【0077】
いくつかの実施態様において、適切なリンカーは、グリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を任意の組合せまたは順序で含む。いくつかの例において、リンカー中のグリシン、セリンおよびアラニン残基の合計の割合は、リンカー中の残基の総数の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である。いくつかの実施態様において、リンカー中のグリシン、セリンおよびアラニン残基の合計の割合は、リンカー中の残基の総数の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である。いくつかの実施態様において、任意の数のアミノ酸（天然または合成アミノ酸を含む）の組合せがリンカーに使用され得る。いくつかの実施態様において、２アミノ酸リンカーが使用される。いくつかの実施態様において、リンカーは配列Ｓｅｒ－Ｓｅｒを有する。いくつかの実施態様において、２アミノ酸リンカーは、グリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を任意の組合せまたは順序で含む（例えば、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、Ｓｅｒ－Ｇｌｙ、Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、Ｓｅｒ－Ｓｅｒ、Ａｌａ－Ａｌａ、Ｓｅｒ－ＡｌａまたはＡｌａ－Ｓｅｒリンカー）。いくつかの実施態様において、２アミノ酸リンカーは、１つのグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基と別のアミノ酸からなる（例えば、Ｓｅｒ－Ｘ、ここでＸは任意の公知のアミノ酸である）。さらに他の実施態様において、２アミノ酸リンカーは、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＡｌａを除く任意の２つのアミノ酸（例えばＸ－Ｘ）からなる。
【0078】
本明細書に記載されているように、いくつかの実施態様において、リンカーは２アミノ酸長よりも長い。そのようなリンカーはまた、本明細書にさらに記載されているように、グリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を任意の組合せまたは順序で含み得る。いくつかの実施態様において、リンカーは、１つのグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を他のアミノ酸とともに含む（例えば、Ｓｅｒ－ｎＸ、ここでＸは任意の公知のアミノ酸であり、ｎはアミノ酸の数である）。他の実施態様において、リンカーは、任意の２つのアミノ酸（例えば、Ｘ－Ｘ）からなる。いくつかの実施態様において、前記の任意の２つのアミノ酸は、任意の組合せまたは順序のＧｌｙ、ＳｅｒまたはＡｌａであり、それらの間に介在する可変数のアミノ酸内にある。いくつかの実施態様において、適切なリンカーは、少なくとも１つのＧｌｙ、少なくとも１つのＳｅｒ、および／または少なくとも１つのＡｌａを含む。いくつかの実施態様において、リンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＧｌｙ、Ｓｅｒおよび／またはＡｌａ残基を含む。いくつかの実施態様において、適切なリンカーは、反復配列中に任意の組合せまたは数のＧｌｙおよびＳｅｒ（（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３または他のバリエーションなど）を含む。
【0079】
いくつかの実施態様において、リンカーまたはスペーサーは、配列ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号７）、ＧＡＰ（配列番号８）またはＧＧＧＧＧＰ（配列番号９）を含み得る。いくつかの実施態様において、様々な短いリンカー配列が縦列反復で存在し得る。例えば、適切なリンカーは、縦列反復で存在するＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号７）のアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施態様において、適切なリンカーは、ＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧ（配列番号７）の配列をフレーム化(frame)する１以上のＧＡＰ配列をさらに含み得る。例えば、適切なリンカーは、ＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰＧＧＧＧＧＡＡＡＡＧＧＧＧＧＡＰ（配列番号１０）のアミノ酸配列を含み得る。
【0080】
いくつかの実施態様において、適切なリンカーまたはスペーサーは、本明細書に記載のリンカー配列のいずれかと少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一の配列を含み得る。
【0081】
追加の例示的なリンカーまたはスペーサー配列がＵＳ８，５８０，９２２に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0082】
本発明における使用のためのリンカーは、当分野で公知の任意の方法を用いて設計され得る。例えば、融合タンパク質の設計において最適なアミノ酸リンカーを決定するための複数の公開されているプログラムが存在する。タンパク質の配列およびリンカーの所望の長さについての使用者の入力に基づいて最適なリンカーのアミノ酸配列を自動的に生成する公開されているコンピュータプログラム（ＬＩＮＫＥＲプログラムなど）が、本方法および本組成物のために使用され得る。多くの場合、このようなプログラムは、タンパク質サブドメインに結合する天然に存在するリンカーの観察された傾向を用いてタンパク質工学における使用に最適なタンパク質リンカーを予測し得る。いくつかの例において、そのようなプログラムは、最適なリンカーを予測する他の方法を使用する。本発明のためのリンカーを予測するのに適したいくつかのプログラムの例が当分野において記載されている（例えば、Xue et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32, W562-W565（機能的な融合タンパク質を構築するためのリンカー配列の設計を支援するＬＩＮＫＥＲプログラムへのインターネットリンクを提供するウェブサーバーの発行物）；George and Heringa, (2003), Protein Engineering, 15(11):871-879（リンカープログラムへのインターネットリンクを提供し、タンパク質リンカーの合理的な設計を記述している）；Argos, (1990), J. Mol. Biol. 211 :943-958；Arai et al. (2001) Protein Engineering, 14(8):529-532；Crasto and Feng, (2000) Protein Engineering 13(5):309-312を参照）。
【0083】
ペプチドリンカー配列はプロテアーゼ切断部位を含み得る；しかし、これはＩ２Ｓ活性を維持するための必要条件ではない。
【0084】
リソソーム標的化部分
いくつかの実施態様において、本発明の適切な融合タンパク質は、リソソーム標的化部分をさらに含む。通常、リソソーム標的化部分は、標的細胞の表面上の受容体に結合して細胞への取り込みおよび／またはリソソーム標的化を促進する部分を指す。例えば、このような受容体は、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基に結合する陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）であり得る。さらに、ＣＩ－ＭＰＲは他のタンパク質（ＩＧＦ－ＩＩを含む）にも結合する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＩ２Ｓ融合タンパク質は、タンパク質の表面上にＭ６Ｐ残基を含む。特に、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＣＩ－ＭＰＲに対してより高い結合親和性を有するビスリン酸化オリゴ糖を含み得る。いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、マンノース－６リン酸依存的な様式でＣＩ－Ｍ６ＰＲに結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、ＣＩ－Ｍ６ＰＲの領域、ドメインおよび／または細胞外部分に直接結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、Ｍ６Ｐ残基を介してＣＩ－Ｍ６ＰＲの領域、ドメインおよび／または細胞外部分に直接結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。いくつかの実施態様において、Ｍ６Ｐ残基は、２－マンノース－６－リン酸残基である。
いくつかの実施態様において、本発明の適切な融合タンパク質は、リソソーム標的化部分をさらに含む。通常、リソソーム標的化部分は、標的細胞の表面上の受容体に結合して細胞への取り込みおよび／またはリソソーム標的化を促進する部分を指す。例えば、このような受容体は、マンノース－６－リン酸（Ｍ６Ｐ）残基に結合する陽イオン非依存性マンノース－６－リン酸受容体（ＣＩ－ＭＰＲ）であり得る。さらに、ＣＩ－ＭＰＲは他のタンパク質（ＩＧＦ－ＩＩを含む）にも結合する。したがって、いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＩ２Ｓ融合タンパク質は、タンパク質の表面上にＭ６Ｐ残基を含む。特に、本明細書に記載の融合タンパク質は、ＣＩ－ＭＰＲに対してより高い結合親和性を有するビスリン酸化オリゴ糖を含み得る。いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、マンノース－６リン酸依存的な様式でＣＩ－Ｍ６ＰＲに結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、ＣＩ－Ｍ６ＰＲの領域、ドメインおよび／または細胞外部分に直接結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、Ｍ６Ｐ残基を介してＣＩ－Ｍ６ＰＲの領域、ドメインおよび／または細胞外部分に直接結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。いくつかの実施態様において、Ｍ６Ｐ残基は、２－マンノース－６－リン酸残基である。
【0085】
いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、マンノース－６－リン酸非依存的な様式でＣＩ－Ｍ６ＰＲに結合する任意のタンパク質、ペプチドまたはそのフラグメントである。適切なリソソーム標的化部分は、限定されないが、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ、ＡｐｏＥ、ＴＡＴ、ＲＡＰ、ｐ９７、プラスミノーゲン、白血病抑制因子ペプチド（ＬＩＦ）、Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞抑制因子ペプチド（ＣＲＥＧ）、ヒトソルチリン(Sortlin)－１プロペプチド（ＳＰＰ）、ヒトプロサポシンペプチド（ＳａｐＤＣ）およびプログラニュリンを含むタンパク質またはペプチドに由来し得る。
【0086】
様々なさらなるリソソーム標的化部分が当分野で公知であり、本発明の実施に使用され得る。例えば、特定のペプチドに基づくリソソーム標的化部分が、米国特許第７，３９６，８１１号、第７，５６０，４２４号および第７，６２９，３０９号；米国出願公開第２００３－００８２１７６号、第２００４－０００６００８号、第２００３－００７２７６１号、第２００４０００５３０９号、第２００５－０２８１８０５号、第２００５－０２４４４００号、ならびに国際公開ＷＯ０３／０３２９１３、ＷＯ０３／０３２７２７、ＷＯ０２／０８７５１０、ＷＯ０３／１０２５８３、ＷＯ２００５／０７８０７７、ＷＯ／２００９／１３７７２１に記載されており、これらの開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0087】
いくつかの実施態様において、リソソーム標的化部分は、細胞によってＭ６Ｐリン酸化される任意のペプチドである。いくつかの実施態様において、該ペプチドはＣＩ－Ｍ６ＰＲに結合できる。いくつかの実施態様において、該ペプチドは、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、ベータ－グルクロニダーゼ、ベータ－マンノシダーゼ、アルファ－フコシダーゼ、ベータ－ヘキソサミニダーゼ、アリールスルファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ホスホマンナン（Phosphomannan）、潜在型ＴＧＦベータ、白血病抑制因子、プロリフェリン、プロレニン、単純ヘルペスウイルス、ＰＩ－ＬＬＣ切断型ＧＰＩアンカー、レチノイン酸、ＩＧＦＩＩ、プラスミノーゲン、サイログロブリン、ＴＧＦベータＲ－Ｖ、ＣＤ８７、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇｉ－１、Ｇｉ－２およびＧｉ－３）、ＨＡ－Ｉアダプチン、ＨＡ－ＩＩアダプチン、およびこれらの組合せからなる群から選択されるタンパク質内に見出されるアミノ酸配列である。いくつかの実施態様において、該アミノ酸配列は、カテプシンＢ、カテプシンＤ、カテプシンＬ、ベータ－グルクロニダーゼ、ベータ－マンノシダーゼ、アルファ－フコシダーゼ、ベータ－ヘキソサミニダーゼ、アリールスルファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ホスホマンナン、潜在型ＴＧＦベータ、白血病抑制因子、プロリフェリン、プロレニン、単純ヘルペスウイルス、ＰＩ－ＬＬＣ切断型ＧＰＩアンカー、レチノイン酸、ＩＧＦＩＩ、プラスミノーゲン、サイログロブリン、ＴＧＦベータＲ－Ｖ、ＣＤ８７、ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇｉ－１、Ｇｉ－２およびＧｉ－３）、ＨＡ－Ｉアダプチン、ＨＡ－ＩＩアダプチン、およびこれらの組合せからなる群から選択される１以上のタンパク質のドメイン、フラグメント、領域またはセグメントを含む。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは合成により作製される。いくつかの実施態様において、ポリペプチドは組換えにより作製される。両方の手法が当分野で広く使用されており、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。
【0088】
いくつかの実施態様において、適切なリソソーム標的化部分は、Ｍ６Ｐ受容体への結合を促進するために追加のグリコシル化部位を提供し得る。Ｎ結合型グリコシル化部位を有する限り、任意のペプチドが本発明の範囲内で使用され得る。Ｎ結合型グリコシル化部位は、コンピュータアルゴリズムおよびソフトウェア（これらの多くは当分野で一般的に知られている）によって予測され得る。あるいは、Ｎ結合型グリコシル化は、当分野で一般的に知られている多くのアッセイのいずれかを用いて実験的に決定され得る。
【0089】
Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の作製
本発明は、様々な手段によって作製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を精製するために使用され得る。例えば、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を発現するように設計された宿主細胞系を利用することによって作製され得る。本明細書において、用語「宿主細胞」は、本明細書に記載のＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を作製するために使用され得る細胞を指す。特に、宿主細胞は、本明細書に記載のＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を大規模に作製するのに適している。適切な宿主細胞は、多様な生物（限定されないが、哺乳類、植物、鳥類（例えば、鳥類系）、昆虫、酵母および細菌を含む）に由来し得る。いくつかの実施態様において、宿主細胞は哺乳類細胞である。
本発明は、様々な手段によって作製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を精製するために使用され得る。例えば、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を発現するように設計された宿主細胞系を利用することによって作製され得る。本明細書において、用語「宿主細胞」は、本明細書に記載のＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を作製するために使用され得る細胞を指す。特に、宿主細胞は、本明細書に記載のＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を大規模に作製するのに適している。適切な宿主細胞は、多様な生物（限定されないが、哺乳類、植物、鳥類（例えば、鳥類系）、昆虫、酵母および細菌を含む）に由来し得る。いくつかの実施態様において、宿主細胞は哺乳類細胞である。
【0090】
哺乳類細胞株
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の哺乳類細胞または細胞型が、宿主細胞として本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の限定されない例には、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Leiden、The Netherlands））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれる。いくつかの実施態様において、適切な哺乳類細胞は、エンドソーム酸性化欠損細胞ではない。
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の哺乳類細胞または細胞型が、宿主細胞として本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の限定されない例には、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、ＨｅＬａ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Leiden、The Netherlands））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胎児腎臓株（浮遊培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１ ５８７）；ヒト子宮頸がん細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；ｂｕｆｆａｌｏラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ５１）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞がん株（Ｈｅｐ Ｇ２）が含まれる。いくつかの実施態様において、適切な哺乳類細胞は、エンドソーム酸性化欠損細胞ではない。
【0091】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する商業的または非商業的に利用可能な任意の数のハイブリドーマ細胞株が本発明に従って利用され得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が種々の栄養要求を有し得、かつ／または最適な増殖およびポリペプチドまたはタンパク質の発現のために種々の培養条件を必要とし得ることを理解しており、必要に応じて条件を改変できる。
【0092】
非哺乳類細胞株
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の非哺乳類由来細胞または細胞型が、宿主細胞として本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る非哺乳類宿主細胞および細胞株の限定されない例には、酵母について、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia angusta、Schizosacccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiae、およびYarrowia lipolytica；昆虫について、Sodoptera frugiperda、Trichoplusis ni、Drosophila melangosterおよびManduca sexta；細菌について、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、Bacillus lichenifonnis、Bacteroides fragilis、Clostridia perfringens、Clostridia difficile；両生類からのXenopus Laevis；ならびに、植物からのDaucus carota、tobacco Nicotiana tabacum、Zizania aquatic、Zizania palustris、Zizania latifoliaおよびLemna（ウキクサ）に由来する細胞および細胞株が含まれる。
細胞培養およびポリペプチドの発現に感受性のある任意の非哺乳類由来細胞または細胞型が、宿主細胞として本発明に従って利用され得る。本発明に従って使用され得る非哺乳類宿主細胞および細胞株の限定されない例には、酵母について、Pichia pastoris、Pichia methanolica、Pichia angusta、Schizosacccharomyces pombe、Saccharomyces cerevisiae、およびYarrowia lipolytica；昆虫について、Sodoptera frugiperda、Trichoplusis ni、Drosophila melangosterおよびManduca sexta；細菌について、Escherichia coli、Salmonella typhimurium、Bacillus subtilis、Bacillus lichenifonnis、Bacteroides fragilis、Clostridia perfringens、Clostridia difficile；両生類からのXenopus Laevis；ならびに、植物からのDaucus carota、tobacco Nicotiana tabacum、Zizania aquatic、Zizania palustris、Zizania latifoliaおよびLemna（ウキクサ）に由来する細胞および細胞株が含まれる。
【0093】
高活性Ｉ２Ｓ融合タンパク質の大規模作製
本発明において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を発現するように設計された細胞は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を商業的に実行可能な規模で作製する能力について選択される。特に、本発明において設計された細胞は、Ｉ２Ｓ融合タンパク質を高いレベルおよび高い酵素活性で作製できる。
本発明において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を発現するように設計された細胞は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を商業的に実行可能な規模で作製する能力について選択される。特に、本発明において設計された細胞は、Ｉ２Ｓ融合タンパク質を高いレベルおよび高い酵素活性で作製できる。
【0094】
上述のように、通常、Ｉ２Ｓの酵素活性は（例えば５９番目のアミノ酸における）保存されたシステインのホルミルグリシンへの翻訳後修飾によって影響される。この翻訳後修飾は小胞体におけるタンパク質合成中に生じ、ＦＧＥによって触媒される。Ｉ２Ｓの酵素活性は、Ｉ２Ｓがホルミルグリシン修飾を有する程度と正に相関する。例えば、比較的多くの量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓ調製物は通常、比較的高い酵素比活性を有する；一方、比較的少量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓ調製物は通常、比較的低い酵素比活性を有する。
【0095】
Ｉ２ＳとＦＧＥのタンパク質またはｍＲＮＡの細胞内比率が、作製されたＩ２Ｓ融合タンパク質上のホルミルグリシン修飾の程度に影響し得ることがさらに想定される。いくつかの実施態様において、所望の細胞中に発現したＩ２ＳおよびＦＧＥは、異なるタンパク質および／またはｍＲＮＡ発現レベルを有する。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルは、ＦＧＥのタンパク質またはｍＲＮＡレベルよりも少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、９、１０、１５、２０、２５、２０、３５、３０、４５、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００倍高い。いくつかの実施態様において、組換えＦＧＥタンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルは、Ｉ２Ｓ融合タンパク質のタンパク質またはｍＲＮＡレベルよりも少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８、９または１０倍高い。ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを測定するための様々な方法が当分野で公知であり、本発明を実施するために使用され得る。ｍＲＮＡレベルを測定するための例示的な方法には、限定されないが、ノーザンブロット、ＱＲＴＰＣＲ、ＲＮＡシークエンシングおよびマイクロアレイが含まれる。タンパク質レベルを測定するための例示的な方法には、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、Ａｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎ、ＥＣＬおよびラベルフリーバイオレイヤーが含まれる。
【0096】
したがって、いくつかの実施態様において、細胞培養条件（例えば、標準的な大規模浮遊または接着培養条件）下で培養された所望の細胞は、約３０ｍｇ／Ｌ／日、３５ｍｇ／Ｌ／日、４０ｍｇ／Ｌ／日、４５ｍｇ／Ｌ／日、５０ｍｇ／Ｌ／日、５５ｍｇ／Ｌ／日、６０ｍｇ／Ｌ／日、６５ｍｇ／Ｌ／日、７０ｍｇ／Ｌ／日、７５ｍｇ／Ｌ／日、８０ｍｇ／Ｌ／日、８５ｍｇ／Ｌ／日、９０ｍｇ／Ｌ／日、９５ｍｇ／Ｌ／日、１００ｍｇ／Ｌ／日、１０５ｍｇ／Ｌ／日、１１０ｍｇ／Ｌ／日、１１５ｍｇ／Ｌ／日、１２０ｍｇ／Ｌ／日、１２５ｍｇ／Ｌ／日、１３０ｍｇ／Ｌ／日、１３５ｍｇ／Ｌ／日、１４０ｍｇ／Ｌ／日、１４５ｍｇ／Ｌ／日、１５０ｍｇ／Ｌ／日、２００ｍｇ／Ｌ／日、２５０ｍｇ／Ｌ／日、３００ｍｇ／Ｌ／日、３５０ｍｇ／Ｌ／日、４００ｍｇ／Ｌ／日、４５０ｍｇ／Ｌ／日、５００ｍｇ／Ｌ／日、５５０ｍｇ／Ｌ／日、６００ｍｇ／Ｌ／日、もしくは６５０ｍｇ／Ｌ／日またはそれ以上の平均回収力価（ｍｇ／Ｌ）でＩ２Ｓ融合タンパク質を産生し得る。本明細書において、用語「力価」は、細胞培養によって一日に産生される組換えにより発現されたポリペプチドまたはタンパク質の合計時間平均量を、所定の培地容量で割ったものを指す。
【0097】
いくつかの実施態様において、細胞培養条件（例えば、標準的な大規模浮遊または接着培養条件）下で培養された所望の細胞は、約０．１ピコグラム／細胞／日またはそれ以上の量（例えば、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ピコグラム／細胞／日よりも多くの量）のＩ２Ｓ融合タンパク質を産生し得る。いくつかの実施態様において、細胞培養条件（例えば、標準的な大規模浮遊または接着培養条件）下で培養された所望の細胞は、約１～１０ピコグラム／細胞／日の範囲の量（例えば、約１～９ピコグラム／細胞／日、約１～８ピコグラム／細胞／日、約１～７ピコグラム／細胞／日、約１～６ピコグラム／細胞／日、約１～５ピコグラム／細胞／日、約１～４ピコグラム／細胞／日、約１～３ピコグラム／細胞／日、約２～９ピコグラム／細胞／日、約２～８ピコグラム／細胞／日、約２～７ピコグラム／細胞／日、約２～６ピコグラム／細胞／日、約２～５ピコグラム／細胞／日、約２～４ピコグラム／細胞／日、約２～３ピコグラム／細胞／日）のＩ２Ｓ酵素を産生できる。
【0098】
いくつかの実施態様において、細胞培養条件（例えば、標準的な大規模浮遊または接着培養条件）下で培養された所望の細胞は、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）の変換を含むＩ２Ｓ融合タンパク質を産生し得る。
【0099】
ＦＧｌｙ変換の割合を決定するための様々な方法が公知であり、使用され得る。一般に、ホルミルグリシン変換の割合（％ＦＧ）は、以下の式を用いて算出され得る：
【数1】
【0100】
例えば、５０％ＦＧは、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質の半分がいかなる治療効果も有さず、酵素的に不活性であることを意味する。％ＦＧを算出するために様々な方法が使用され得る。例えば、ペプチドマッピングが使用され得る。簡潔に述べると、Ｉ２Ｓタンパク質は、プロテアーゼ（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を用いて短いペプチドに消化され得る。短いペプチドは、各ペプチド（特に、成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチド）の性質および量が対照（例えば、ＦＧｌｙ変換を有しないＩ２Ｓタンパク質または１００％のＦＧｌｙ変換を有するＩ２Ｓタンパク質）と比較して決定され得るように、クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）を用いて分離および特徴付けされ得る。（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）ＦＧｌｙを含むペプチドの量ならびに（全Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）ＦＧｌｙおよびＣｙｓを有するペプチドの総量が決定され得、％ＦＧを反映する割合が算出され得る。
【0101】
細胞培地および条件
Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を作製するために様々な細胞培地および条件が使用され得る。例えば、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、血清含有培地または無血清培地中で作製され得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、既知組成培地中で作製される。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、動物質を含まない培地（すなわち、動物由来成分を有しない培地）中で作製される。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、既知組成培地中で作製される。本明細書において、用語「既知組成栄養培地」は、実質的にすべての化学成分が公知である培地を指す。いくつかの実施態様において、既知組成栄養培地は、動物由来成分（血清、血清由来タンパク質（例えばアルブミンまたはフェチュイン）および他の成分など）を含まない。いくつかの例において、既知組成培地は、１以上のタンパク質（例えば、タンパク質増殖因子またはサイトカイン）を含む。いくつかの例において、既知組成栄養培地は、１以上のタンパク質加水分解物を含む。他の例において、既知組成栄養培地は、タンパク質を含まない培地（すなわち、タンパク質、加水分解物または未知の組成の成分を含まない無血清培地）である。
Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を作製するために様々な細胞培地および条件が使用され得る。例えば、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、血清含有培地または無血清培地中で作製され得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、既知組成培地中で作製される。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、動物質を含まない培地（すなわち、動物由来成分を有しない培地）中で作製される。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、既知組成培地中で作製される。本明細書において、用語「既知組成栄養培地」は、実質的にすべての化学成分が公知である培地を指す。いくつかの実施態様において、既知組成栄養培地は、動物由来成分（血清、血清由来タンパク質（例えばアルブミンまたはフェチュイン）および他の成分など）を含まない。いくつかの例において、既知組成培地は、１以上のタンパク質（例えば、タンパク質増殖因子またはサイトカイン）を含む。いくつかの例において、既知組成栄養培地は、１以上のタンパク質加水分解物を含む。他の例において、既知組成栄養培地は、タンパク質を含まない培地（すなわち、タンパク質、加水分解物または未知の組成の成分を含まない無血清培地）である。
【0102】
いくつかの実施態様において、既知組成培地に、１以上の動物由来成分が補充され得る。そのような動物由来成分には、限定されないが、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ヒト血清、およびアルブミン（例えばウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）などの血清由来タンパク質が含まれる。
【0103】
いくつかの実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を産生する細胞はバイオリアクター中で培養される。Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を大規模に作製するために、様々な細胞培養条件（限定されないが、ローラーボトル培養、バイオリアクターバッチ培養、バイオリアクターフェドバッチ培養、バイオリアクター波動(wave)灌流培養およびバイオリアクター撹拌槽型灌流培養を含む）が使用され得る。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、浮遊培養された細胞によって産生される。いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、接着細胞によって産生される。ある実施態様において、バイオリアクターは、撹拌槽型灌流バイオリアクタープロセスとして機能する。
【0104】
例示的な細胞培地および培養条件が実施例のセクションに記載されている。
【0105】
Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の精製
いくつかの実施態様において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーのうち１つ以上に基づくプロセスを用いて、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を不純な調製物から精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、４つ未満（例えば、４つ未満または３つ未満）のクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、２、３または４つのクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、３つのクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーをこの順序で行う。
いくつかの実施態様において、本発明は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーのうち１つ以上に基づくプロセスを用いて、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を不純な調製物から精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、４つ未満（例えば、４つ未満または３つ未満）のクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、２、３または４つのクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、３つのクロマトグラフィー工程を含む。いくつかの実施態様において、本発明による本方法は、アフィニティークロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびマルチモーダルクロマトグラフィーをこの順序で行う。
【0106】
不純な調製物
本明細書において、不純な調製物は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を含む未処理の生体物質を含む任意の生体物質であり得る。例えば、不純な調製物は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を産生する細胞（例えば哺乳類細胞）から分泌されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を含む未処理の細胞培地、またはＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を含む生の細胞可溶化物であり得る。いくつかの実施態様において、不純な調製物は、部分的に処理された細胞培地または細胞可溶化物であり得る。例えば、細胞培地または細胞可溶化物は、濃縮、希釈、またはウイルス不活化、ウイルス処理もしくはウイルス除去により処理され得る。いくつかの実施態様において、ウイルス除去は、特にナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を利用し得る。いくつかの実施態様において、ウイルスの不活化は、特に溶媒不活化、界面活性剤不活化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活化および／または紫外線不活化を利用し得る。いくつかの実施態様において、低ｐＨウイルス不活化の工程は、アフィニティカラムの工程の後、陽イオン交換カラムの工程の前に行われる。ある実施態様において、エンベロープウイルスを不活化するために、アフィニティークロマトグラフィー溶出物試料は低ｐＨ（例えば、約３．６～３．８ｐＨ）で約３０～６０分間維持される。いくつかの実施態様において、最後のクロマトグラフィーカラム工程を行った後に、ウイルス濾過工程が行われる。
本明細書において、不純な調製物は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を含む未処理の生体物質を含む任意の生体物質であり得る。例えば、不純な調製物は、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を産生する細胞（例えば哺乳類細胞）から分泌されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を含む未処理の細胞培地、またはＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を含む生の細胞可溶化物であり得る。いくつかの実施態様において、不純な調製物は、部分的に処理された細胞培地または細胞可溶化物であり得る。例えば、細胞培地または細胞可溶化物は、濃縮、希釈、またはウイルス不活化、ウイルス処理もしくはウイルス除去により処理され得る。いくつかの実施態様において、ウイルス除去は、特にナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を利用し得る。いくつかの実施態様において、ウイルスの不活化は、特に溶媒不活化、界面活性剤不活化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活化および／または紫外線不活化を利用し得る。いくつかの実施態様において、低ｐＨウイルス不活化の工程は、アフィニティカラムの工程の後、陽イオン交換カラムの工程の前に行われる。ある実施態様において、エンベロープウイルスを不活化するために、アフィニティークロマトグラフィー溶出物試料は低ｐＨ（例えば、約３．６～３．８ｐＨ）で約３０～６０分間維持される。いくつかの実施態様において、最後のクロマトグラフィーカラム工程を行った後に、ウイルス濾過工程が行われる。
【0107】
細胞培地または細胞可溶化物はプロテアーゼ、ＤＮａｓｅおよび／またはＲＮａｓｅで処理され得、宿主細胞タンパク質および／または核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）のレベルを低下させ得る。いくつかの実施態様において、未処理または部分的に処理された生体物質（例えば、細胞培地または細胞可溶化物）は凍結され得、所望の温度（例えば、２～８℃、－４℃、－２５℃、－７５℃）で一定期間保存され得、次いで精製のために解凍され得る。本明細書において、不純な調製物は出発物質または充填物質とも呼ばれる。
【0108】
アフィニティークロマトグラフィー
いくつかの実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーを含む、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を精製する方法が提供される。簡潔に述べると、アフィニティークロマトグラフィーは、（抗原と抗体との間、酵素と基質との間、または受容体とリガンドとの間などの）高度に特異的な相互作用に依存して生化学的混合物を分離するクロマトグラフィー技術である。いくつかの実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、抗原および抗体のクロマトグラフィー（特にプロテインＡクロマトグラフィー）である。
いくつかの実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーを含む、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を精製する方法が提供される。簡潔に述べると、アフィニティークロマトグラフィーは、（抗原と抗体との間、酵素と基質との間、または受容体とリガンドとの間などの）高度に特異的な相互作用に依存して生化学的混合物を分離するクロマトグラフィー技術である。いくつかの実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、抗原および抗体のクロマトグラフィー（特にプロテインＡクロマトグラフィー）である。
【0109】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、標的タンパク質が固相（シリカまたはガラスを含む）上に固定化されたプロテインＡに吸着され；固相に結合している混入物が疎水性電解質溶媒で洗浄することによって除去され；標的タンパク質が固相から回収される場合に、一般に実施される。適切なプロテインＡ樹脂は当分野で公知であり、市販されており、限定されないが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（登録商標）、Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）およびプロテインＡ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）を含む。ある実施態様において、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（登録商標）樹脂である。
【0110】
ある実施態様において、アフィニティークロマトグラフィーは、アフィニティークロマトグラフィーカラムが均一濃度のクエン酸Ｎａ溶出を含む溶出緩衝液を用いて溶出される場合に実施される。いくつかの実施態様において、溶出緩衝液は、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭまたは６０ｍＭのクエン酸Ｎａを含む。ある実施態様において、溶出緩衝液は、５０ｍＭのクエン酸Ｎａを含む。ある実施態様において、均一濃度のクエン酸Ｎａ溶出は、０～２５０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０～２００ｍＭ、０～１５０ｍＭのクエン酸Ｎａ、０～１００ｍＭのクエン酸Ｎａ、０～５０ｍＭのクエン酸Ｎａまたは０～２５ｍＭのクエン酸Ｎａの範囲を含む。
【0111】
いくつかの実施態様において、均一濃度のクエン酸Ｎａ溶出を含む溶出緩衝液は、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９または４．０のｐＨを含む。いくつかの実施態様において、溶出緩衝液のｐＨは、３．０～４．０、３．１～３．９、３．２～３．８、３．３～３．７、３．４～３．６、または３．６～３．７の範囲内である。
【0112】
陽イオン交換クロマトグラフィー
いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、Ｉ２Ｓ融合タンパク質を精製する方法が提供される。簡潔に述べると、陽イオン交換クロマトグラフィーは、正に帯電した化合物と負に帯電した樹脂との間の電荷－電荷相互作用に依存したクロマトグラフィー技術である。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである。
いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーを含む、Ｉ２Ｓ融合タンパク質を精製する方法が提供される。簡潔に述べると、陽イオン交換クロマトグラフィーは、正に帯電した化合物と負に帯電した樹脂との間の電荷－電荷相互作用に依存したクロマトグラフィー技術である。いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、強力な陽イオン交換クロマトグラフィーである。
【0113】
陽イオン交換クロマトグラフィーは一般に、スルホニウムイオンを含む強力な、もしくは弱い陽イオン交換カラム、または通常カルボキシメチル（ＣＭ）またはカルボン酸（ＣＸ）の官能基を有する弱い陽イオン交換体を用いて実施される。多くの適切な陽イオン交換樹脂が当分野で公知であり、市販されており、限定されないが、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（登録商標）、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）、ＣＭ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）；Ａｍｂｅｒｊｅｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）樹脂；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）樹脂（例えば、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標） ＩＲＡ１２０）；ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰｒｏＰａｃ（登録商標） ＳＣＸ－１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標） ＷＣＸ－１０、ＰｒｏＰａｃ（登録商標） ＷＣＸ－１０）；ＴＳＫ－ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ ＢｉｏＡｓｓｉｓｔ Ｓ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－５ＰＷ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＣＸ；ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ－ＳＴＡＴ；ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－５ＰＷ；ＴＳＫｇｅｌ ＯＡｐａｋ－Ａ；ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－２ＳＷ、ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－３ＳＷ、およびＴＳＫｇｅｌ ＣＭ－ＳＴＡＴ）；およびＡｃｃｌａｉｍ（登録商標）樹脂を含む。ある実施態様において、陽イオン交換樹脂はＣａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ（登録商標）である。
【0114】
いくつかの実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、均一濃度のＮａＣｌ溶出を含む溶出緩衝液を用いて溶出される。ある実施態様において、溶出緩衝液は、０～４００ｍＭのＮａＣｌ、０～３５０ｍＭのＮａＣｌ、０～３００ｍＭのＮａＣｌ、０～２５０ｍＭのＮａＣｌまたは０～２００ｍＭのＮａＣｌの範囲を含む。
【0115】
通常、均一濃度の溶出は緩衝されている。ある実施態様において、均一濃度の溶出は緩衝されていない。ある実施態様において、均一濃度の溶出は、約５～約１４の間のｐＨに緩衝されている。ある実施態様において、均一濃度の溶出は、約５～約１０の間のｐＨに緩衝されている。ある実施態様において、均一濃度の溶出は、約５～約７の間のｐＨに緩衝されている。ある実施態様において、均一濃度の溶出は、約５．５～約６．０の間のｐＨに緩衝されている。ある実施態様において、均一濃度の溶出は、約５．２～約５．８の間のｐＨに緩衝されている。ある実施態様において、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムは、５．２～５．８の間のｐＨで実行される。ある実施態様において、均一濃度の溶出は、約５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５または１０のｐＨに緩衝されている。
【0116】
マルチモーダルクロマトグラフィー
いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーを含む、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を精製する方法が提供される。簡潔に述べると、マルチモーダルクロマトグラフィーは、中程度に帯電した化合物間のイオン交換相互作用に依存することによって中程度の精製を提供するクロマトグラフィー技術である。標的タンパク質はカラムを流れ得るが、不純物（例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ））はカラムに結合する。いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、フロースルーモードで操作される。ある実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、結合／溶出モードで操作される。いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーは、フロースルーモードおよび結合／溶出モードの組合せで操作される。
いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーを含む、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質を精製する方法が提供される。簡潔に述べると、マルチモーダルクロマトグラフィーは、中程度に帯電した化合物間のイオン交換相互作用に依存することによって中程度の精製を提供するクロマトグラフィー技術である。標的タンパク質はカラムを流れ得るが、不純物（例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ））はカラムに結合する。いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ樹脂である。いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、フロースルーモードで操作される。ある実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、結合／溶出モードで操作される。いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーは、フロースルーモードおよび結合／溶出モードの組合せで操作される。
【0117】
いくつかの実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、約４．５～約７．５、約５．０～約７．０、または約５．５～約６．５のｐＨで実行される。ある実施態様において、マルチモーダルクロマトグラフィーカラムは、約７．０のｐＨで実行される。
【0118】
いくつかの実施態様において、充填および洗浄は、精製プロセスの最初および／または精製プロセス全体にわたって行われる。ある実施態様において、約１．０Ｍ～約２．０Ｍの塩濃度のＮａＣｌが、クロマトグラフィーカラムの充填および洗浄において使用される。
【0119】
Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の特徴付け
精製されたＩ２Ｓ免疫グロブリンタンパク質は、様々な方法を用いて特徴付けされ得る。
精製されたＩ２Ｓ免疫グロブリンタンパク質は、様々な方法を用いて特徴付けされ得る。
【0120】
ＨＩＲ結合アッセイ；ＢＢＢ輸送
ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体への少なくとも約７０％の結合、ヒトインスリン受容体への８０％の結合、ヒトインスリン受容体への９０％の結合、またはヒトインスリン受容体への９５％の結合を促進する。
ある実施態様において、免疫グロブリンは、ヒトインスリン受容体への少なくとも約７０％の結合、ヒトインスリン受容体への８０％の結合、ヒトインスリン受容体への９０％の結合、またはヒトインスリン受容体への９５％の結合を促進する。
【0121】
Ｍ６Ｐ結合アッセイ；リソソーム輸送
いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ上に存在する２－Ｍ６Ｐ残基はＭ６Ｐ受容体に結合し、内在性リソソームＭ６Ｐ受容体を介した輸送を媒介する。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ残基は、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約６０％の結合、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約７０％の結合、またはＭ６Ｐ受容体への少なくとも約７５％の結合を促進する。
いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ上に存在する２－Ｍ６Ｐ残基はＭ６Ｐ受容体に結合し、内在性リソソームＭ６Ｐ受容体を介した輸送を媒介する。ある実施態様において、２－Ｍ６Ｐ残基は、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約６０％の結合、Ｍ６Ｐ受容体への少なくとも約７０％の結合、またはＭ６Ｐ受容体への少なくとも約７５％の結合を促進する。
【0122】
いくつかの実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、グリカンマップ上の１％～９％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）ピーク面積を含み、これは２－アミノベンズアミドグリカン標識プロセスを介して測定される。ある実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、グリカンマップ上の５％～８％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）ピーク面積、またはグリカンマップ上の５．２％～７．２％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）ピーク面積を含む。ある実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、５．２％～７．２％の２－マンノース－６－リン酸（２－Ｍ６Ｐ）残基レベルを含む。
【0123】
純度
精製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の純度は通常、最終生成物中に存在する様々な不純物（例えば宿主細胞タンパク質または宿主細胞ＤＮＡ）のレベルによって測定される。例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定され得る。いくつかの実施態様において、精製されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、１０ｎｇ未満のＨＣＰ／ｍｇ Ｉ２Ｓ融合タンパク質（例えば、９、８、７、６、５、４、３ｎｇ未満のＨＣＰ／ｍｇ Ｉ２Ｓ融合タンパク質）を含む。様々なアッセイ対照（特にＦＤＡなどの規制機関に許容され得るアッセイ対照）が使用され得る。
精製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の純度は通常、最終生成物中に存在する様々な不純物（例えば宿主細胞タンパク質または宿主細胞ＤＮＡ）のレベルによって測定される。例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ－ＰＡＧＥによって測定され得る。いくつかの実施態様において、精製されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質は、１０ｎｇ未満のＨＣＰ／ｍｇ Ｉ２Ｓ融合タンパク質（例えば、９、８、７、６、５、４、３ｎｇ未満のＨＣＰ／ｍｇ Ｉ２Ｓ融合タンパク質）を含む。様々なアッセイ対照（特にＦＤＡなどの規制機関に許容され得るアッセイ対照）が使用され得る。
【0124】
比活性 － ４－ＭＵアッセイ
いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の酵素活性は、当分野で公知の様々な方法（例えば、４－メチルウンベリフェリル硫酸塩（４－ＭＵＳ）の硫酸塩および自然蛍光性４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）への加水分解を測定する４－ＭＵアッセイなど）を用いて決定され得る。いくつかの実施態様において、作製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の（インビトロでの４－ＭＵアッセイによって測定される）所望の酵素活性は、少なくとも約０．５Ｕ／ｍｇ、１．０Ｕ／ｍｇ、１．５Ｕ／ｍｇ、２Ｕ／ｍｇ、２．５Ｕ／ｍｇ、３Ｕ／ｍｇ、４Ｕ／ｍｇ、４．５Ｕ／ｍｇまたは５．０Ｕ／ｍｇである。インビトロでの４－ＭＵアッセイを行うための例示的な条件を以下に示す。通常、４－ＭＵアッセイは、Ｉ２Ｓタンパク質が４－メチルウンベリフェリル硫酸塩（４－ＭＵＳ）を硫酸塩および自然蛍光性４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）に加水分解する能力を測定する。１ミリユニットの活性は、１ナノモルの４－ＭＵＳを４－ＭＵに３７℃において１分間で変換するのに必要な酵素の量として定義される。通常、既知の活性を有するＩ２Ｓ試験試料によって生成された平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線が生成され得、これは対象の試料の酵素活性を算出するために使用され得る。次いで、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって比活性が算出され得る。
いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の酵素活性は、当分野で公知の様々な方法（例えば、４－メチルウンベリフェリル硫酸塩（４－ＭＵＳ）の硫酸塩および自然蛍光性４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）への加水分解を測定する４－ＭＵアッセイなど）を用いて決定され得る。いくつかの実施態様において、作製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の（インビトロでの４－ＭＵアッセイによって測定される）所望の酵素活性は、少なくとも約０．５Ｕ／ｍｇ、１．０Ｕ／ｍｇ、１．５Ｕ／ｍｇ、２Ｕ／ｍｇ、２．５Ｕ／ｍｇ、３Ｕ／ｍｇ、４Ｕ／ｍｇ、４．５Ｕ／ｍｇまたは５．０Ｕ／ｍｇである。インビトロでの４－ＭＵアッセイを行うための例示的な条件を以下に示す。通常、４－ＭＵアッセイは、Ｉ２Ｓタンパク質が４－メチルウンベリフェリル硫酸塩（４－ＭＵＳ）を硫酸塩および自然蛍光性４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）に加水分解する能力を測定する。１ミリユニットの活性は、１ナノモルの４－ＭＵＳを４－ＭＵに３７℃において１分間で変換するのに必要な酵素の量として定義される。通常、既知の活性を有するＩ２Ｓ試験試料によって生成された平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線が生成され得、これは対象の試料の酵素活性を算出するために使用され得る。次いで、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって比活性が算出され得る。
【0125】
いくつかの実施態様において、比活性は、４－メチルウンベリフェリル硫酸塩（４－ＭＵＳ）の硫酸塩および４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）への加水分解を測定するプレートに基づく蛍光酵素活性アッセイを用いて測定される。そのような実施態様において、試料は４－ＭＵＳ基質溶液とともに９６ウェルプレート中で３７℃、ｐＨ５．０において６０分間インキュベートされる。次いで、ｐＨ１０．７のグリシン炭酸停止緩衝液の添加によって、酵素反応が停止され得る。高いｐＨは蛍光性アニオン型４－ＭＵ生成物を生成し、これはそれぞれ３６０ｎｍおよび４６０ｎｍの励起波長および発光波長で測定され得る。酵素触媒反応で生成した４－ＭＵの量は、４－ＭＵの検量線から内挿され得る。
【0126】
報告され得る値はＤＳのＵ／ｍｇで表され得、ここでＵは３７℃およびｐＨ５．０で１分間に１マイクロモルの４－メチルウンベリフェロンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。
【0127】
いずれの例においても、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質組成物のタンパク質濃度は、タンパク質濃度を決定するために当分野で公知の任意の適切な方法によって決定され得る。いくつかの例では、タンパク質濃度は、紫外光吸収アッセイによって決定される。いくつかの実施態様において、そのような吸収アッセイは、それぞれ３６０ｎｍおよび４６０ｎｍの励起波長および発光波長で測定される。
【0128】
比活性 － ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイ
いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の酵素活性は、当分野で公知の様々な方法（例えば、ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイなど、これはその概略が図７に示されている）を用いて決定され得る。いくつかの実施態様において、作製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の（インビトロでのＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイによって測定される）所望の酵素活性は、少なくとも約１Ｕ／ｍｇ、２．５Ｕ／ｍｇ、５Ｕ／ｍｇ、１０Ｕ／ｍｇ、１５Ｕ／ｍｇ、２０Ｕ／ｍｇ、２５Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、３５Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、４５Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、５５Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、６５Ｕ／ｍｇ、または７０Ｕ／ｍｇである。インビトロでのＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイを行うための例示的な条件を以下に示す。通常、ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイは、Ｉ２Ｓタンパク質の能力を２段階の方法を介して測定する。第１の段階では、基質ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵがウンベリフェリル－α－Ｌ－イドピラノシドウロン酸（ＩｄｏＡ－４－ＭＵ）および硫酸塩に加水分解される。第２の段階では、過剰量のＩＤＵＡの添加によって、ＩｄｏＡ－４－ＭＵの自然蛍光性４－ＭＵへの完全な変換が達成され得る。通常、既知の活性を有するＩ２Ｓ試験試料によって生成される平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線が生成され得、これは対象の試料の酵素活性を算出するために使用され得る。次いで、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって比活性が算出され得る。
いくつかの実施態様において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の酵素活性は、当分野で公知の様々な方法（例えば、ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイなど、これはその概略が図７に示されている）を用いて決定され得る。いくつかの実施態様において、作製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質の（インビトロでのＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイによって測定される）所望の酵素活性は、少なくとも約１Ｕ／ｍｇ、２．５Ｕ／ｍｇ、５Ｕ／ｍｇ、１０Ｕ／ｍｇ、１５Ｕ／ｍｇ、２０Ｕ／ｍｇ、２５Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、３５Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、４５Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、５５Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、６５Ｕ／ｍｇ、または７０Ｕ／ｍｇである。インビトロでのＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイを行うための例示的な条件を以下に示す。通常、ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイは、Ｉ２Ｓタンパク質の能力を２段階の方法を介して測定する。第１の段階では、基質ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵがウンベリフェリル－α－Ｌ－イドピラノシドウロン酸（ＩｄｏＡ－４－ＭＵ）および硫酸塩に加水分解される。第２の段階では、過剰量のＩＤＵＡの添加によって、ＩｄｏＡ－４－ＭＵの自然蛍光性４－ＭＵへの完全な変換が達成され得る。通常、既知の活性を有するＩ２Ｓ試験試料によって生成される平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線が生成され得、これは対象の試料の酵素活性を算出するために使用され得る。次いで、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって比活性が算出され得る。
【0129】
いくつかの実施態様において、比活性はプレートに基づく蛍光酵素活性アッセイを用いて測定される。いくつかの実施態様において、反応は、温度制御されたサーマルサイクラーを用いて９６ウェルＰＣＲプレート中で実施され得る。そのような実施態様において、反応は、各２０μＬの２ｍＭ ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵ基質溶液および５ｎｇ／ｍＬ Ｉ２Ｓ試料溶液を２Ｘアッセイ緩衝液中で混合することによって開始され得、これは３７℃で１時間インキュベートされる。いくつかの実施態様において、緩衝液は、０．０３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む５０ｍＭの酢酸緩衝反応混合物、ｐＨ５．２を含み得る。いくつかの実施態様において、マッキルベイン緩衝液（０．４０Ｍリン酸ナトリウム、０．２０Ｍクエン酸塩、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ４．５）中の２５μｇ／ｍＬ ＩＤＵＡを４０μＬ添加してＩ２Ｓ反応が停止され得、これは同じ温度でさらに１時間インキュベートされ得る。いくつかの実施態様において、２００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ１０．７の添加によって第２段階の反応がクエンチされ得る。そのような実施態様において、観察される４－ＭＵの蛍光は、それぞれ３６５ｎｍおよび４５０ｎｍのλｅｘおよびλｅｍで測定され得る。
【0130】
グリカンマッピング
いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、そのプロテオグリカン組成（通常、グリカンマッピングと呼ばれる）によって特徴付けられ得る。任意の理論に拘束されることを望むものではないが、グリカン結合は分岐構造の形状および複雑性とともに、インビボでのクリアランス、リソソーム標的化、バイオアベイラビリティおよび／または有効性に影響を与え得ると考えられる。
いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、そのプロテオグリカン組成（通常、グリカンマッピングと呼ばれる）によって特徴付けられ得る。任意の理論に拘束されることを望むものではないが、グリカン結合は分岐構造の形状および複雑性とともに、インビボでのクリアランス、リソソーム標的化、バイオアベイラビリティおよび／または有効性に影響を与え得ると考えられる。
【0131】
通常、グリカンマップは、酵素消化およびその後のクロマトグラフィー分析によって決定され得る。酵素消化には様々な酵素（限定されないが、適切なグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プロテアーゼおよびホスファターゼを含む）が使用され得る。いくつかの実施態様において、適切な酵素はアルカリホスファターゼである。いくつかの実施態様において、適切な酵素はノイラミニダーゼである。グリカン（例えばホスホグリカン）は、クロマトグラフィー分析によって検出され得る。例えば、ホスホグリカンは、パルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出され得る。グリカンマップ上の各ピークによって表されるグリカン（例えばホスホグリカン）の量は、当分野で公知であり、本明細書に開示されている方法に従ってグリカン（例えばホスホグリカン）の検量線を用いて算出され得る。
【0132】
いくつかの実施態様において、本発明における精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、中性（ピーク群１）、モノシアリル化（ピーク群２）、ジシアリル化（ピーク群３）、一リン酸化（ピーク群４）、トリシアリル化（ピーク群５）、テトラシアリル化（ピーク群６）、二リン酸化（ピーク群７）およびピーク群８のＩ２Ｓ融合タンパク質をそれぞれ示す８個のピーク群を含むグリカンマップを示す。Ｉ２Ｓ融合タンパク質のグリカン含有量の例示的な分析は、図４、５および６に示されている。いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、８個未満のピーク群を有するグリカンマップ（例えば、７、６、５、４、３または２個のピーク群を有するグリカンマップ）を有する。いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、８個よりも多いピーク群（例えば、９、１０、１１、１２またはそれ以上）を有するグリカンマップを有する。
【0133】
各ピーク群に対応するグリカンの相対量は、所定の参照標準における対応するピーク群の面積と比較したピーク群の面積に基づいて決定され得る。いくつかの実施態様において、ピーク群１（中性）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約４０～１２０％（例えば、約４０～１１５％、約４０～１１０％、約４０～１００％、約４５～１２０％、約４５～１１５％、約４５～１１０％、約４５～１０５％、約４５～１００％、約５０～１２０％、約５０～１１０％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。いくつかの実施態様において、ピーク群２（モノシアリル化）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約８０～１４０％（例えば、約８０～１３５％、約８０～１３０％、約８０～１２５％、約９０～１４０％、約９０～１３５％、約９０～１３０％、約９０～１２０％、約１００～１４０％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。いくつかの実施態様において、ピーク群３（ジシアリル化）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約８０～１１０％（例えば、約８０～１０５％、約８０～１００％、約８５～１０５％、約８５～１００％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。いくつかの実施態様において、ピーク群４（一リン酸化）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約１００～５５０％（例えば、約１００～５２５％、約１００～５００％、約１００～４５０％、約１５０～５５０％、約１５０～５００％、約１５０～４５０％、約２００～５５０％、約２００～５００％、約２００～４５０％、約２５０～５５０％、約２５０～５００％、約２５０～４５０％、または約２５０～４００％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。いくつかの実施態様において、ピーク群５（トリシアリル化）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約７０～１１０％（例えば、約７０～１０５％、約７０～１００％、約７０～９５％、約７０～９０％、約８０～１１０％、約８０～１０５％、約８０～１００％、または約８０～９５％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。いくつかの実施態様において、ピーク群６（テトラシアリル化）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約９０～１３０％（例えば、約９０～１２５％、約９０～１２０％、約９０～１１５％、約９０～１１０％、約１００～１３０％、約１００～１２５％、または約１００～１２０％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。いくつかの実施態様において、ピーク群７（二リン酸化）は、参照標準における対応するピーク群の面積と比較して約７０～１３０％（例えば、約７０～１２５％、約７０～１２０％、約７０～１１５％、約７０～１１０％、約８０～１３０％、約８０～１２５％、約８０～１２０％、約８０～１１５％、約８０～１１０％、約９０～１３０％、約９０～１２５％、約９０～１２０％、約９０～１１５％、約９０～１１０％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。グリカンマッピングのための様々な参照標準が当分野で公知であり、本発明を実施するために使用され得る。通常、ピーク群７（二リン酸化）は、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質の表面上のｄｉ－Ｍ６Ｐのレベルに対応する。
【0134】
精製されたＩ２Ｓのグリコシル化パターンは、リソソームおよびニューロン膜の標的化に影響を与えることが想定される。様々なインビトロでの細胞取り込みアッセイが当分野で公知であり、本発明を実施するために使用され得る。例えば、Ｍ６Ｐ受容体によるＩ２Ｓの取り込みを評価するために、Ｍ６Ｐ受容体をその表面上に発現するヒト線維芽細胞を用いて細胞取り込みアッセイが実施される。取り込まれたＩ２Ｓの量は、ＥＬＩＳＡ法によって測定され得る。いくつかの実施態様において、本発明における精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、インビトロでの取り込みアッセイによって決定される７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％よりも大きい細胞取り込みを特徴とする。
【0135】
ホルミルグリシン変換率
ペプチドマッピングは、ＦＧｌｙ変換率を決定するために使用され得る。上述したように、Ｉ２Ｓ活性化は、以下に示されるホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）による（成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）システインのホルミルグリシンへの変換を必要とする：
ペプチドマッピングは、ＦＧｌｙ変換率を決定するために使用され得る。上述したように、Ｉ２Ｓ活性化は、以下に示されるホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）による（成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）システインのホルミルグリシンへの変換を必要とする：
【化1】
【0136】
したがって、ホルミルグリシン変換率（％ＦＧ）は、以下の式を用いて算出され得る：
【数2】
【0137】
％ＦＧを算出するために、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質は、プロテアーゼ（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を用いて短いペプチドに消化され得る。短いペプチドは、例えばサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分離および特徴付けされ得る。成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチドは、５９位のＣｙｓが対照（例えば、ＦＧｌｙ変換を有しないＩ２Ｓタンパク質または１００％のＦＧｌｙ変換を有するＩ２Ｓタンパク質）と比較してＦＧｌｙに変換されているか否かを決定するために特徴付けられ得る。（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）ＦＧｌｙを含むペプチドの量ならびに（全Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）ＦＧｌｙおよびＣｙｓを有するペプチドの総量が対応するピーク面積に基づいて決定され得、％ＦＧを反映する割合が算出され得る。
【0138】
いくつかの実施態様において、本発明における精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、ヒトＩ２Ｓ（配列番号１）のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の変換を有する。いくつかの実施態様において、本発明における精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、ヒトＩ２Ｓ（配列番号１）のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基のＣα－ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）への実質的に１００％の変換を有する。
【0139】
シアル酸含有量
いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、そのシアル酸組成によって特徴付けられ得る。理論に拘束されることを望むものではないが、タンパク質上のシアル酸残基は、肝細胞上に存在するアシアロ糖タンパク質受容体を介したそれらの迅速なインビボでのクリアランスを妨げ、低下させ、または阻害し得ることが想定される。したがって、比較的高いシアル酸含有量を有するＩ２Ｓ融合タンパク質は通常、インビボにおいて比較的長い循環時間を有すると考えられる。
いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質は、そのシアル酸組成によって特徴付けられ得る。理論に拘束されることを望むものではないが、タンパク質上のシアル酸残基は、肝細胞上に存在するアシアロ糖タンパク質受容体を介したそれらの迅速なインビボでのクリアランスを妨げ、低下させ、または阻害し得ることが想定される。したがって、比較的高いシアル酸含有量を有するＩ２Ｓ融合タンパク質は通常、インビボにおいて比較的長い循環時間を有すると考えられる。
【0140】
いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質のシアル酸含有量は、当分野で周知の方法を用いて決定され得る。例えば、Ｉ２Ｓ融合タンパク質のシアル酸含有量は、酵素消化およびその後のクロマトグラフィー分析によって決定され得る。酵素消化は、任意の適切なシアリダーゼを用いて達成され得る。いくつかの例では、消化はグリコシドヒドロラーゼ酵素（ノイラミニダーゼなど）によって行われる。シアル酸は、クロマトグラフィー分析（例えば、パルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）など）によって検出され得る。精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質組成物中のシアル酸の量は、当分野で公知であり、本明細書に開示されている方法に従ってシアル酸の検量線を用いて算出され得る。
【0141】
いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質のシアル酸含有量は、少なくとも１５ｍｏｌ／ｍｏｌであり得る。いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ融合タンパク質のシアル酸含有量は、少なくとも２０ｍｏｌ／ｍｏｌであり得る。シアル酸含有量の文脈における単位「ｍｏｌ／ｍｏｌ」は、酵素１モル当たりのシアル酸残基のモル数を指す。いくつかの例において、Ｉ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質のシアル酸含有量は、約１６．５ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１８ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１９ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２１ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２２ｍｏｌ／ｍｏｌ、約２３ｍｏｌ／ｍｏｌ、またはそれ以上である。いくつかの実施態様において、精製されたＩ２Ｓ免疫グロブリン融合タンパク質のシアル酸含有量は、約１７～２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７～２１ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７～２２ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７～２３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１７～２４ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１７～２５ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１８～２０ｍｏｌ／ｍｏｌ、１８～２１ｍｏｌ／ｍｏｌ、約１８～２２ｍｏｌ／ｍｏｌ、１８～２３ｍｏｌ／ｍｏｌ、１８～２４ｍｏｌ／ｍｏｌ、または約１８～２５ｍｏｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。
【0142】
医薬組成物および投与
本発明におけるＩ２Ｓ融合タンパク質は、Ｉ２Ｓ欠乏症（例えばハンター症候群）に罹患しやすい、または罹患している対象を処置するために使用され得る。本発明はＣＮＳにおけるＩ２Ｓ欠乏症の処置に特に有用であり、ここでＣＮＳへの直接投与はＢＢＢの物理的な貫通または破壊を含む。受容体を媒介する輸送を介してＢＢＢを通過する能力のために、本発明のいくつかの実施態様は、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む医薬組成物の全身投与を提供する。全身投与の経路には、限定されないが、静脈内、動脈内筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経頬、経皮、直腸、経肺胞(transalveolar)（吸入）または経口投与が含まれる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＩ２Ｓ融合タンパク質の全身投与は、他の直接的なＣＮＳ投与（髄腔内送達など）と組み合わせて実施され得る。いくつかの実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む医薬組成物は、Ｉ２Ｓ欠乏症の身体症状および認知症状の両方を処置し得る。
本発明におけるＩ２Ｓ融合タンパク質は、Ｉ２Ｓ欠乏症（例えばハンター症候群）に罹患しやすい、または罹患している対象を処置するために使用され得る。本発明はＣＮＳにおけるＩ２Ｓ欠乏症の処置に特に有用であり、ここでＣＮＳへの直接投与はＢＢＢの物理的な貫通または破壊を含む。受容体を媒介する輸送を介してＢＢＢを通過する能力のために、本発明のいくつかの実施態様は、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む医薬組成物の全身投与を提供する。全身投与の経路には、限定されないが、静脈内、動脈内筋肉内、皮下、腹腔内、鼻腔内、経頬、経皮、直腸、経肺胞(transalveolar)（吸入）または経口投与が含まれる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載のＩ２Ｓ融合タンパク質の全身投与は、他の直接的なＣＮＳ投与（髄腔内送達など）と組み合わせて実施され得る。いくつかの実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む医薬組成物は、Ｉ２Ｓ欠乏症の身体症状および認知症状の両方を処置し得る。
【0143】
本明細書におけるＩ２Ｓ欠乏症には、ハンター症候群、ハンター病およびムコ多糖症ＩＩ型として知られる１つ以上の疾患が含まれる。Ｉ２Ｓ欠乏症は、体内（心臓、肝臓、脳など）で生じるヘパリン硫酸およびデルマタン硫酸の蓄積を特徴とする。
【0144】
いくつかの実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物は、静脈内投与によって対象に投与される。ある実施態様において、医薬組成物は、配列番号１１と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有するＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、配列番号１１と同一のアミノ酸配列を有するＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、医薬組成物は、組換えヒトＩｇＧ軽鎖を有するＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を含む。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号１２と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、組換えヒトＩｇＧ軽鎖は、配列番号１２と同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施態様において、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物は、皮下（すなわち皮膚の下）投与によって対象に投与される。そのような目的のために、製剤は注射器を用いて注入され得る。しかし、製剤を投与するための他の装置（注射装置（例えば、Inject-easeTMおよびGenjectTM装置）；インジェクターペン（GenPenTMなど）；無針装置（例えば、MediJectorTMおよびBioJectorTM）；および皮下パッチ送達システムなど）が利用可能である。
【0145】
本発明は、本明細書に記載の治療有効量のＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物の単回投与および複数回投与を想定している。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物は、対象の状態の性質、重症度および程度に応じて一定の間隔で投与され得る。いくつかの実施態様において、治療有効量のＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物は、一定の間隔（例えば、１年に１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（１ヶ月に１回）、隔週（２週間に１回）、毎週、毎日または連続的）で定期的に投与され得る。
【0146】
ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質またはそれを含む医薬組成物は、医薬組成物を調製するために生理的に許容され得る担体または賦形剤とともに製剤化され得る。担体および治療物質は無菌であり得る。製剤は投与方法に適合しているべきである。
【0147】
薬学的に許容され得る適切な担体には、限定されないが、水、塩類溶液（例えばＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝生理食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロースまたはデンプンなど）、糖（マンニトール、スクロースまたは他の糖など）、ブドウ糖、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、およびそれらの組合せが含まれる。医薬品は必要に応じて、活性化合物と有害に反応せず、またはその活性を妨げない補助物質（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香味料および／または芳香剤など）と混合され得る。いくつかの実施態様において、静脈内投与に適した水溶性担体が使用される。
【0148】
組成物または薬剤は必要に応じて、少量の湿潤剤、乳化剤またはｐＨ緩衝物質を含み得る。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末であり得る。組成物はまた、従来の結合剤および担体（トリグリセリドなど）とともに坐剤として製剤化され得る。経口製剤は、標準的な担体（医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。
【0149】
組成物または薬剤は、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として通常の手順に従って製剤化され得る。例えば、いくつかの実施態様において、静脈内投与のための組成物は通常、無菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要に応じて、組成物は、可溶化物質および注射部位の痛みを和らげるための局所麻酔薬を含み得る。一般に、成分は別々に、またはともに混合されて単位用量の剤形で（例えば、密封容器（活性物質の量を示すアンプルまたは小袋など）中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として）供給される。組成物が注入によって投与される場合、組成物は無菌の医薬品グレードの水、生理食塩水またはブドウ糖／水を含む輸液ボトルに分注され得る。組成物が注射によって投与される場合、成分が投与前に混合され得るように注射用の滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【0150】
本明細書において、用語「治療有効量」は、本発明の医薬組成物に含まれる治療物質の総量に基づいて主に決定される。一般に、治療有効量は、対象に対して有意義な利益（例えば、基礎疾患または状態の処置、調節、治癒、予防および／または改善）を達成するのに十分である。例えば、治療有効量は、所望の治療効果および／または予防効果を達成するのに十分な量（リソソーム酵素受容体またはその活性を調節することにより、そのようなリソソーム蓄積症またはその症状を処置（例えば、本発明の組成物を対象に投与した後の「ゼブラ小体」または細胞空胞化の存在または発生率の減少または除去）するのに十分な量など）であり得る。一般に、必要とする対象に投与される治療物質（例えば組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特徴に依存する。そのような特徴には、対象の状態、疾患の重症度、全身状態、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらの要因および他の関連した要因に応じて適切な投与量を容易に決定できる。さらに、最適な投与量の範囲を特定するために、客観的なアッセイおよび主観的なアッセイの両方が任意で利用され得る。
【0151】
治療有効量は通常、複数の単位用量を含み得る投与計画で投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療有効量（および／または有効な投与計画における適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬品との組合せに応じて様々であり得る。また、任意の特定の患者のための具体的な治療有効量（および／または単位用量）は、様々な要因（処置される障害および障害の重症度；使用される具体的な医薬品の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、全身状態、性別および食生活；使用される具体的な融合タンパク質の投与時間、投与経路および／または排出速度もしくは代謝速度；処置期間；ならびに、医学分野で周知の類似の要因を含む）に依存し得る。
【0152】
任意の特定の対象のために、具体的な投与計画は個々の必要性および酵素補充療法の投与者または監督者の専門的な判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載されている投与量の範囲は例示的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載の発明の範囲または実施を制限することを意図していないことがさらに理解されるはずである。
【0153】
いくつかの実施態様において、本発明の組成物（例えばＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質）は、併用療法の一部として投与され得る。併用療法は、Ｉ２Ｓ欠乏症に罹患している患者に典型的に見出される症状の処置または軽減のための別の治療と組み合わせた本発明の組成物の投与を含む。本発明の組成物が別のＣＮＳ障害の方法または組成物と組み合わせて使用される場合、本発明の組成物および追加の方法または組成物の任意の組合せが使用され得る。したがって、例えば、本発明の組成物の使用が別のＣＮＳ障害処置物質と組み合わされる場合、両者は、同時に、連続的に、重複する期間において、類似の頻度で、同じ頻度で、または異なる頻度などで投与され得る。いくつかの例において、本発明の組成物を１以上の他のＣＮＳ障害処置物質と組み合わせて含む組成物が使用される。
【0154】
いくつかの実施態様において、組成物（例えばＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）は、同じ製剤内の、または別個の組成物としての別の薬剤とともに患者に同時投与される。例えば、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓは、Ｉ２Ｓ以外の組換えタンパク質をヒト血液脳関門を越えて送達するように設計されている別の融合タンパク質とともに製剤化され得る。さらに、Ｉ２Ｓ融合タンパク質は他の巨大分子または小分子と組み合わせて製剤化され得る。
【0155】
さらなる例示的な医薬組成物および投与方法が、「Methods and Compositions for CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase」という題名のＰＣＴ出願公開ＷＯ２０１１／１６３６４９；および２０１２年３月３０日に出願された「Subcutaneous administration of iduronate 2 sulfatase」という題名の仮出願番号第６１／６１８，６３８号に記載されており、両者の開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0156】
任意の特定の対象のために、具体的な投与計画は個々の必要性および酵素補充療法の投与者または監督者の専門的な判断に従って経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載されている投与量の範囲は例示的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載の発明の範囲または実施を制限することを意図していないことがさらに理解されるはずである。
【0157】
上記の任意の態様および実施態様は、図面、要約および／または詳細な説明（以下の実施例を含む）に開示されている任意の他の態様または実施態様と組み合わされ得る。
【実施例】
【0158】
本発明は以下の実施例によってさらに説明されるが、これらは制限として解釈されるべきではない。当業者は、本明細書に記載されている特定の物質および手順に対する多数の等価物を認識し、日常的な実験のみを用いて確認できる。そのような等価物は、以下の実施例に続く特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【0159】
実施例１：ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の捕捉および精製プロセス
本実施例は、ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を捕捉および精製するために使用され得る単純化された下流の精製プロセスを示す。例示的な精製スキームを図１に示す。
本実施例は、ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を捕捉および精製するために使用され得る単純化された下流の精製プロセスを示す。例示的な精製スキームを図１に示す。
【0160】
ヒトインスリン受容体モノクローナル抗体－イズロン酸－２－スルファターゼ（ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ）融合タンパク質を安定に発現する細胞株を開発した。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓのアミノ酸配列を表２に示す。例示的な細胞株の生成および特徴付けは、２０１０年１０月８日に出願された「Methods and Compositions for Increasing Iduronate-2-sulfatase Activity in the CNS」という題名の米国特許第８，８３４，８７４号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0161】
撹拌槽型灌流バイオリアクタープロセスを用いた。細胞密度、より高い生存率、より高い全収率、３０日の回収にわたって一貫した生成物の質を増加させるために、既知組成培地（ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯ）をバイオリアクタープロセスにおいて使用した。
【0162】
下流の精製プロセスを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕｒｅプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製される清澄化された回収物質を用いて開始した。低ｐＨウイルス不活化工程の後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー溶出物の解凍およびプールを行った。陽イオン交換（Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ）および混合モード（Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ）クロマトグラフィー工程の連続した工程、ならびにその後のウイルス除去のための濾過、原薬の限外濾過／透析濾過、および５．０±０．５ｍｇ／ｍＬでの製剤化により、精製プロセスを進行させた。バルク原薬を生成するために最後の濾過工程を行った。特に、この精製プロセスは、プロテインＡアフィニティー、Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓ、およびＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅのクロマトグラフィー様式を利用した。例示的な工程を表３に示す。
表３：精製プロセスの例示的な工程
表３：精製プロセスの例示的な工程
【表3】
【0163】
実施例２：模擬ＤＳ ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の分析
精製した模擬原薬ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、ＣＨＯ ＨＣＰ含有量、ＣＥ－ＳＤＳ（非還元）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ％）によって純度について評価した。酵素比活性、シアル酸含有量およびグリカンマップを標準的な方法を用いて測定した。基質クリアランスアッセイを、％ＲＰを測定することによって行った。例示的な結果を表４に示す。
表４：精製された模擬ＤＳ ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の分析
精製した模擬原薬ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、ＣＨＯ ＨＣＰ含有量、ＣＥ－ＳＤＳ（非還元）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ％）によって純度について評価した。酵素比活性、シアル酸含有量およびグリカンマップを標準的な方法を用いて測定した。基質クリアランスアッセイを、％ＲＰを測定することによって行った。例示的な結果を表４に示す。
表４：精製された模擬ＤＳ ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の分析
【表4】
【0164】
特に、ＣＥ－ＳＤＳアッセイは、純度／不純物プロファイルおよび抗体の重鎖と軽鎖との間の比率を評価する。４－メチルウンベリフェリル硫酸塩（４－ＭＵＳ）の硫酸塩および４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）への加水分解を測定するプレートに基づく蛍光酵素活性アッセイを用いて、比活性を得た。ここで、４－ＭＵをそれぞれ３６０ｎｍおよび４６０ｎｍの励起波長および発光波長での蛍光として測定し、触媒反応で生成した４－ＭＵの量を４－ＭＵの検量線から内挿した。報告され得る比活性の値をＵ／ｍｇで表し、ここでＵは３７℃およびｐＨ５．０で１分間に１マイクロモルの４－ＭＵを放出するのに必要な酵素の量として定義される。基質クリアランスアッセイでは、細胞取り込みおよび酵素の比活性を測定した。精製されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のグリカンマップは、シアル酸およびマンノース－６－リン酸残基に由来する負電荷の量の増加に従って溶出する７つのピーク群を含み、これらは溶出順に、中性、モノシアリル化、ジシアリル化、一リン酸化、トリシアリル化および複合型（モノシアリル化およびキャッピングされたＭ６Ｐ）、テトラシアリル化および複合型（ジシアリル化およびキャッピングされたＭ６Ｐ）、ならびに二リン酸化グリカンを示す。
【0165】
まとめると、本実施例は、単純化された３つのカラム精製プロセスを用いて、既知組成培地中に大量に産生されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質をうまく精製できることを示している。
【0166】
実施例３：例示的なＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質生成物の質
ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、１０Ｌの規模の撹拌槽型灌流バイオリアクターを用いたプロセスによって作製した。既知組成培地ＯｐｔｉＣＨＯプラスＣｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５を用いた。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、実施例１に記載されているプロセスによって精製した。
ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、１０Ｌの規模の撹拌槽型灌流バイオリアクターを用いたプロセスによって作製した。既知組成培地ＯｐｔｉＣＨＯプラスＣｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５を用いた。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、実施例１に記載されているプロセスによって精製した。
【0167】
精製したＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、ホルミルグリシン含有量、ヒトインスリン受容体への結合（％ＲＳ）、グリカンマップ（１－Ｍ６Ｐおよび２－Ｍ６Ｐ、％ピーク面積）、Ｍ６Ｐ受容体への結合（％ＲＳ）、および基質クリアランスアッセイ（ＲＳに対する％）について評価した。例示的な結果を表５に示す。
表５：例示的な精製したＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質
表５：例示的な精製したＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質
【表5】
【0168】
本明細書に記載されているプロセスは、細胞取り込みおよび酵素比活性の組合せを測定する基質クリアランスアッセイからなる。
【0169】
ホルミルグリシン変換率
ペプチドマッピングは、ＦＧｌｙ変換率を決定するために使用され得る。Ｉ２Ｓ活性化は、以下に示すようにホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）による（成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）システインのホルミルグリシンへの変換を必要とする：
したがって、ホルミルグリシン変換率（％ＦＧ）は、以下の式を用いて算出され得る：
ペプチドマッピングは、ＦＧｌｙ変換率を決定するために使用され得る。Ｉ２Ｓ活性化は、以下に示すようにホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）による（成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）システインのホルミルグリシンへの変換を必要とする：
【化2】
【数3】
【0170】
例えば、５０％ＦＧは、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の半分がいかなる治療効果も有さず、酵素的に不活性であることを意味する。
【0171】
％ＦＧを算出するためにペプチドマッピングを用いた。簡潔に述べると、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、プロテアーゼ（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を用いて短いペプチドに消化した。短いペプチドを、ＨＰＬＣを用いて分離および特徴付けた。成熟ヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチドを、５９位のＣｙｓが対照（例えば、ＦＧｌｙ変換を有しないＩ２Ｓタンパク質または１００％のＦＧｌｙ変換を有するＩ２Ｓタンパク質）と比較してＦＧｌｙに変換されていたか否かを決定するために特徴付けた。（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）ＦＧｌｙを含むペプチドの量ならびに（全Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）ＦＧｌｙおよびＣｙｓを有するペプチドの総量を対応するピーク面積に基づいて決定し得、％ＦＧを反映する割合を算出した。
【0172】
表６は、既知組成細胞培地（ＯｐｔｉＣＨＯ＋ＣＢ５）を用いて１０Ｌの撹拌槽型灌流バイオリアクタープロセスによって作製したＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質、ならびにＳＦＭ４ＣＨＯ（加水分解産物および動物成分を含む産生培地）を添加したＷＡＶＥバイオリアクターを用いて作製したロットＡ１～Ａ６およびそれよりも大きな規模のロットの比較を示す。
表６：ロットＡ１～Ａ６、ＢおよびＣの比較
表６：ロットＡ１～Ａ６、ＢおよびＣの比較
【表6】
【0173】
典型的に、本明細書に記載のプロセスを使用した場合、２－Ｍ６Ｐ含有量はロットＡ１～Ａ６において測定されたものよりもわずかに低く、ホルミルグリシン含有量（％ＦＧｌｙ）は高かった。まとめると、本実施例は、単純化された３つのカラム精製プロセスが、ロットＡ１～Ａ６と比較して調節されたレベルの２－Ｍ６Ｐを伴って既知組成培地中で大量に作製したＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質をうまく精製するのに使用され得ることを示している。
【0174】
実施例４：ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質生成物の質に対する培地の分析
本研究の目的は、培地条件を評価し、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５を含む、および含まない既知組成培地（ＯｐｔｉＣＨＯ）を用いた動物質を含まない灌流プロセスにおけるＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のタンパク質産生の有効性を評価し、加水分解産物および動物成分を含む培地条件（ＳＦＭ４ＣＨＯ）と比較して生成物の質を特徴付けることであった。
本研究の目的は、培地条件を評価し、Ｃｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ５を含む、および含まない既知組成培地（ＯｐｔｉＣＨＯ）を用いた動物質を含まない灌流プロセスにおけるＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のタンパク質産生の有効性を評価し、加水分解産物および動物成分を含む培地条件（ＳＦＭ４ＣＨＯ）と比較して生成物の質を特徴付けることであった。
【0175】
本研究は、既知組成培地のバイオリアクターから得られたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ産生プロセスの性能および生成物の質を評価した。
【0176】
初期、中期および後期の回収段階からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収試料をプールおよび捕捉した。回収物質を、遠心分離保持装置を含む波動灌流１０Ｌバイオリアクターおよび追加のＣｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５を含む既知組成増殖培地（ＯｐｔｉＣＨＯ）を用いて細胞株から生成した。回収物質を、遠心分離装置を含む波動灌流１０Ｌバイオリアクターおよび追加のＣｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５を含まない既知組成増殖培地を用いて細胞株から生成した。また、回収物質を、ブリーディングを伴わない遠心分離灌流プロセスならびに加水分解産物および動物成分を含むＳＦＭ４ＣＨＯ培地を用いて細胞株から生成した。
【0177】
図２は、上述の培地条件下で得られた初期、中期および後期のＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収物質の比活性（Ｕ／ｍｇ）およびホルミルグリシン含有量（％ＦＧ）を示している。
【0178】
図３は、基質クリアランスアッセイ（ＳＣＡ）、ヒトインスリン受容体への結合（％ＲＳ）、およびＭ６Ｐ受容体への結合（％ＲＳ）を示している。
【0179】
まとめると、本実施例は、既知組成のＯｐｔｉＣＨＯ培地を含む細胞培養条件が、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質における２－Ｍ６Ｐレベルをうまく調節し、後期の回収物に対して活性および基質クリアランスを保持するために使用され得ることを示している。本実施例は、生成物の質のデータにより、ＯｐｔｉＣＨＯ培地が初期から後期の回収物から活性物質を生成することが確認され、これが加水分解産物および動物成分を含む培地を用いた従来の実行に対する実質的な改善であることを示している。
【0180】
実施例５：ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のグリカンマップに対する培地の分析
本研究の目的は、培地条件を評価し、加水分解産物および動物成分を含む培地条件（ＳＦＭ４ＣＨＯ）と比較してＯｐｔｉＣＨＯにより産生されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質生成物の質のグリカンマップを特徴付けることであった。
本研究の目的は、培地条件を評価し、加水分解産物および動物成分を含む培地条件（ＳＦＭ４ＣＨＯ）と比較してＯｐｔｉＣＨＯにより産生されたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質生成物の質のグリカンマップを特徴付けることであった。
【0181】
本研究は、既知組成培地のバイオリアクターから得られたＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質におけるマンノース－６－リン酸およびシアル酸のレベルを評価した。
【0182】
図４は、上述の培地条件下で得られた初期、中期および後期のＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収物質におけるマンノース－６－リン酸グリカン含有量（１－Ｍ６Ｐおよび２－Ｍ６Ｐ）のレベルを示している。
【0183】
図５は、上述の培地条件下で得られた初期、中期および後期のＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収物質におけるシアリル化グリカン含有量（１－、２－、３－および４－ＳＡ）のレベルを示している。
【0184】
図６は、上述の培地条件下で得られた初期、中期および後期のＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収物質における中性およびＰｅａｋ８グリカン含有量のレベルを示している。
【0185】
典型的に、本明細書に記載のプロセスを使用した場合、ＯｐｔｉＣＨＯ培地条件は、ＳＦＭ４ＣＨＯ対照よりも低い２－Ｍ６Ｐレベルを生成した。まとめると、本実施例は、既知組成のＯｐｔｉＣＨＯ培地を含む細胞培養条件が、ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質における２－Ｍ６Ｐレベルをうまく調節するために使用され得ることを示している。
【0186】
グリカンマップ － マンノース－６－リン酸およびシアル酸含有量
初期、中期および後期の回収段階からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収試料を、実施例４に記載されているようにプールおよび捕捉した。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収物質のグリカンおよびシアル酸組成を決定した。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてグリカン組成の定量化を行い、グリカンマップを作成した。以下に記載されているように、本明細書に記載の条件下で精製したＩ２Ｓ融合タンパク質のグリカンマップは、負電荷の量の増加に従って溶出する７つのピーク群からなり、これは酵素消化に起因するシアル酸およびマンノース－６－リン酸のグリコフォームに少なくとも部分的に由来している。簡潔に述べると、ＯｐｔｉＣＨＯ、ＯｐｔｉＣＨＯ＋Ｃｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５および対照のＳＦＭ４ＣＨＯ細胞培養物からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、（１）シアル酸残基の除去のための精製されたノイラミニダーゼ酵素（Arthrobacter Ureafaciensから単離されている（１０ｍＵ／μＬ）、Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat. # 269 611（１Ｕ／１００μＬ））、（２）マンノース－６－リン酸残基の完全な放出のための３７±１℃における２時間のアルカリホスファターゼ、（３）アルカリホスファターゼ＋ノイラミニダーゼ、または（４）無処理のいずれかで処理した。各酵素消化物を、Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ガードカラムを備えたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１分析カラムを用いてパルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）によって分析した。各アッセイのために、０．４～２．０ナノモルの範囲の一連のシアル酸およびマンノース－６－リン酸の標準物質を実行した。各ピークを溶出するために、１００ｍＭ水酸化ナトリウム中の４８ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた均一濃度の方法を、周囲カラム温度および１．０ｍＬ／分の流速で最低でも１５分間実行した。図４、５および６に示されているように、無血清培地からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のグリカンマップは、中性、モノシアリル化、ジシアリル化、一リン酸化、トリシアリル化および複合型（モノシアリル化およびキャッピングされたマンノース－６－リン酸）、テトラシアリル化および複合型（ジシアリル化およびキャッピングされたマンノース－６－リン酸）、ならびに二リン酸化グリカンを（溶出順で）構成する代表的な溶出ピークを示した。
初期、中期および後期の回収段階からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収試料を、実施例４に記載されているようにプールおよび捕捉した。ＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質回収物質のグリカンおよびシアル酸組成を決定した。陰イオン交換クロマトグラフィーを用いてグリカン組成の定量化を行い、グリカンマップを作成した。以下に記載されているように、本明細書に記載の条件下で精製したＩ２Ｓ融合タンパク質のグリカンマップは、負電荷の量の増加に従って溶出する７つのピーク群からなり、これは酵素消化に起因するシアル酸およびマンノース－６－リン酸のグリコフォームに少なくとも部分的に由来している。簡潔に述べると、ＯｐｔｉＣＨＯ、ＯｐｔｉＣＨＯ＋Ｃｅｌｌ ｂｏｏｓｔ５および対照のＳＦＭ４ＣＨＯ細胞培養物からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を、（１）シアル酸残基の除去のための精製されたノイラミニダーゼ酵素（Arthrobacter Ureafaciensから単離されている（１０ｍＵ／μＬ）、Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat. # 269 611（１Ｕ／１００μＬ））、（２）マンノース－６－リン酸残基の完全な放出のための３７±１℃における２時間のアルカリホスファターゼ、（３）アルカリホスファターゼ＋ノイラミニダーゼ、または（４）無処理のいずれかで処理した。各酵素消化物を、Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１ガードカラムを備えたＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１分析カラムを用いてパルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ－ＰＡＤ）によって分析した。各アッセイのために、０．４～２．０ナノモルの範囲の一連のシアル酸およびマンノース－６－リン酸の標準物質を実行した。各ピークを溶出するために、１００ｍＭ水酸化ナトリウム中の４８ｍＭ酢酸ナトリウムを用いた均一濃度の方法を、周囲カラム温度および１．０ｍＬ／分の流速で最低でも１５分間実行した。図４、５および６に示されているように、無血清培地からのＨＩＲＭａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のグリカンマップは、中性、モノシアリル化、ジシアリル化、一リン酸化、トリシアリル化および複合型（モノシアリル化およびキャッピングされたマンノース－６－リン酸）、テトラシアリル化および複合型（ジシアリル化およびキャッピングされたマンノース－６－リン酸）、ならびに二リン酸化グリカンを（溶出順で）構成する代表的な溶出ピークを示した。
【0187】
実施例６：ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の捕捉および精製プロセス
本実施例は、ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の比活性を正確に測定し、阻害効果を補正する方法を示している。例示的な比活性アッセイを図７に示す。
本実施例は、ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の比活性を正確に測定し、阻害効果を補正する方法を示している。例示的な比活性アッセイを図７に示す。
【0188】
ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵをCarbosynth（Compton, Berkshire, UK）によりカスタム合成し、α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）をShireにより生成した。４－メチル－ウンベリフェロン（４－ＭＵ）ナトリウム塩をSigma-Aldrichから入手した。Ｏｐｔｉ ＣＨＯ培養培地をThermoFisherから入手した。ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のＩ２Ｓ活性測定を、わずかな修正を伴ってVoznyi YV, Keulemans, JLM, van Diggelen, OP (2001) J. Inherit. Metab. Dis. 24 675-680（これはあらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように蛍光検出を伴う２段階のプレートに基づく方法を用いて実施した。ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質によって触媒される第１の反応を、等量の基質溶液とプロセス中の希釈した試料を混合することによって開始した；基質であるＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵは、ウンベリフェリル－α－Ｌ－イドピラノシドウロン酸（ＩｄｏＡ－４－ＭＵ）および硫酸塩に加水分解される。第２の反応では、過剰量のＩＤＵＡを添加することによって、ＩｄｏＡ－４－ＭＵの４－ＭＵへの完全な変換を達成した。
【0189】
通常、ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵアッセイは、２段階の方法によりＩ２Ｓタンパク質の能力を測定する（図７）。第１の段階では、基質であるＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵを、ウンベリフェリル－α－Ｌ－イドピラノシドウロン酸（ＩｄｏＡ－４－ＭＵ）および硫酸塩に加水分解した。第２の段階では、過剰量のＩＤＵＡを添加することによって、ＩｄｏＡ－４－ＭＵの自然蛍光性４－ＭＵへの完全な変換が達成され得る。通常、既知の活性を有するＩ２Ｓ試験試料によって生成される平均蛍光単位（ＭＦＵ）が検量線を生成するために使用され得、検量線は対象の試料の酵素活性を算出するために使用され得る。そして、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって比活性が算出され得る。
【0190】
いくつかの実施態様において、比活性はプレートに基づく蛍光酵素活性アッセイを用いて測定される。いくつかの実施態様において、反応は、温度制御されたサーマルサイクラーを用いて９６ウェルＰＣＲプレート中で実施される。そのような実施態様において、反応は、各２０μＬの２ｍＭ ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵ基質溶液および５ｎｇ／ｍＬ Ｉ２Ｓ試料溶液を２Ｘアッセイ緩衝液中で混合することによって開始され得、これは３７℃で１時間インキュベートされる。いくつかの実施態様において、緩衝液は、０．０３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む５０ｍＭの酢酸緩衝反応混合物、ｐＨ５．２を含む。いくつかの実施態様において、マッキルベイン緩衝液（０．４０Ｍリン酸ナトリウム、０．２０Ｍクエン酸塩、０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ４．５）中の２５μｇ／ｍＬ ＩＤＵＡを４０μＬ添加してＩ２Ｓ反応が停止され得、これは同じ温度でさらに１時間インキュベートされ得る。いくつかの実施態様において、２００μＬの０．５Ｍ炭酸ナトリウム溶液、ｐＨ１０．７の添加によって第２段階の反応がクエンチされる。そのような実施態様において、観察される４－ＭＵの蛍光は、それぞれ３６５ｎｍおよび４５０ｎｍのλｅｘおよびλｅｍで測定され得る。
【0191】
マトリックスの障害を理解するために、上記のアッセイを必要に応じて改変した。マトリックス効果について試験した緩衝液を表１に示す。
【0192】
基質ＩｄｏＡ２Ｓ－４－ＭＵの最終濃度を変動させたことを除いて、ＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質試料を用いたアッセイと同一の方法で反応を行った。基質溶液をＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質と混合する前に段階希釈し、最終的な反応混合物において３１．２５～２０００μＭの濃度を与えた。
【0193】
観測された活性の基質濃度に対する依存性を下記の式１に記載されているミカエリスメンテン式にフィットさせることにより、Ｋｍを決定した：
【数4】
【0194】
緩衝液マトリックスの存在下におけるアッセイ。緩衝液マトリックスの効果を評価するために、固定量のＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質を様々に希釈されたプロセス中の緩衝液と混合した。各１０μＬの希釈された緩衝液および基質溶液を２Ｘアッセイ緩衝液中の２０μＬの酵素溶液と混合して第１の段階の反応を開始し、その後は上述のようにアッセイを進行させた。反応物中の最終酵素濃度は２．５ｎｇ／ｍＬであった。
【0195】
酵素比活性（ｖ／［Ｅ］）対希釈倍率の逆数（１／ＤＦ）を、上述のＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のミカエリスメンテン分析から決定されたＫｍ＝３８６μＭの値を用いて、式２に示される迅速平衡混合阻害(rapid equilibrium mixed inhibition)の式にフィットさせた
ここで、
は、阻害成分の見かけの濃度である
Ｋｉｓは、阻害剤が遊離の酵素に結合する阻害定数である
Ｋｉｉは、阻害剤がＥＳ複合体に結合する阻害定数である
【数5】
【数6】
Ｋｉｓは、阻害剤が遊離の酵素に結合する阻害定数である
Ｋｉｉは、阻害剤がＥＳ複合体に結合する阻害定数である
【0196】
基質濃度が固定されている場合、パラメータＫｉｉおよびＫｉｓは冗長になるため、阻害が競合的、非競合的、不競合的または混合的のいずれであるかにかかわらず、同一の適合曲線が得られ得る。したがって、必要なパラメータが適合から決定された場合、実際にどの阻害様式が作用しているかにかかわらず、同一の阻害フリーの活性（ｖ０／［Ｅ］）が算出された（式３）。
【数7】
【0197】
式２の速度の線形化によるデータ処理の単純化。阻害フリーの活性はまた、式４により線形化された式を用いて算出され得る。
または、
ここで、
および
【数8】
【数9】
【数10】
【数11】
【0198】
上記の式は以下のように単純化され得る：
【数12】
【0199】
阻害剤の非存在下における活性を、データを線形方程式にフィットさせた後に式６から算出した。
【数13】
【0200】
しかしながら、逆数プロットの単純な線形フィッティングでは、より大きなランダム誤差を伴うより小さなｖ／［Ｅ］の値が大きく重み付けされ、結果を歪め得る。これを回避するために、適切な重み付け係数をデータ点に適用したか、または著しく低い値を単純に適合から除外した。
【0201】
種々のプロセス中の試料の測定された比活性が、アッセイに使用した希釈された試料の濃度に依存し得ることが認識された。いくつかの実施態様において、より高い濃度（より低い希釈倍率）の試料は、より低い比活性値を与えた。この効果がプロセス中の試料緩衝液マトリックスによる阻害によるものであるか否かを決定するために、以下に記載されるようにさらなる実験を行った。
【0202】
測定された比活性値に対する緩衝液マトリックスの効果を評価するために、様々な濃度のプロセス中の６つの緩衝液において固定濃度のＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質でアッセイを行った（表１）。緩衝液１、２、３および４を用いたより高い緩衝液濃度において比活性の低下が観察され、緩衝液５および６ではより小さな低下が観察された。実験の結果を図８に示す。
表１．酵素活性の阻害について試験したプロセス中の試料緩衝液
表１．酵素活性の阻害について試験したプロセス中の試料緩衝液
【表7】
【0203】
マトリックスフリーの活性（ｖ０／［Ｅ］）およびパラメータ（Ｋｉｉ＝∞での、Ｋｉｓ／Ｃ）の値を、プロセス中の各試料緩衝液について観察された比活性（ｖ／［Ｅ］）対ＤＦの式（４）への適合から決定する。これらの結果を表２Ａに示す。非線形適合からのパラメータが既知になった場合、同一の式を用いて単一の濃度点からのデータを用いてマトリックスフリーの活性ｖ０／［Ｅ］が決定され得る。単一の濃度点から決定した阻害フリーの活性の値は、相対的なランダム誤差がより大きい高い阻害（低い比活性）の場合を除いて、希釈倍率にかかわらず一貫していた。マトリックスフリーの活性はまた、高いランダム誤差のために低い活性値が除外されている場合、データを線形化した式５にフィットさせることによって決定され得る（図９）。算出されたマトリックスフリーの活性値は、非線形適合からのものと同等であった（表２Ａおよび２Ｂを参照）。
表２Ａ．一定の酵素濃度（２．５ｎｇ／ｍＬ）およびプロセス中の様々な緩衝液濃度（Ｃ／ＤＦ）で測定した酵素比活性の非線形適合（Ａ）および線形適合（Ｂ）による様々な緩衝液中のＳＨ６３１のマトリックスフリーの活性（ｖ０／［Ｅ］）－非線形適合。
表２Ｂ．一定の酵素濃度（２．５ｎｇ／ｍＬ）およびプロセス中の様々な緩衝液濃度（Ｃ／ＤＦ）で測定した酵素比活性の非線形適合（Ａ）および線形適合（Ｂ）による様々な緩衝液中のＳＨ６３１のマトリックスフリーの活性（ｖ０／［Ｅ］）－線形適合。
表２Ａ．一定の酵素濃度（２．５ｎｇ／ｍＬ）およびプロセス中の様々な緩衝液濃度（Ｃ／ＤＦ）で測定した酵素比活性の非線形適合（Ａ）および線形適合（Ｂ）による様々な緩衝液中のＳＨ６３１のマトリックスフリーの活性（ｖ０／［Ｅ］）－非線形適合。
【表8】
【表9】
【0204】
緩衝液３、４および６についての本実験からのデータを、図に示す希釈範囲にわたって水で段階希釈された対応する実際のプロセス中の試料の結果に重ね合わせた（図１０Ａ～１０Ｃ）。結果は、緩衝液３および６について、緩衝液単独（定数［Ｅ］）よりも実際のプロセス中の試料についての阻害が著しく強いことを示している。これらの結果は、緩衝液３および６での実際の試料において観察された阻害が緩衝液マトリックスのみによるものではないことを示している。
【0205】
いくつかの実施態様において、実際のプロセス中の試料において観察された、緩衝液マトリックスのみに起因するものを超える追加の阻害の起源は以下である：
（１）基質枯渇；より小さなＤＦ（より高い酵素濃度）においてより多くの基質が消費されることにより、ｖ／［Ｅ］が低下する
および／または
（２）生成物の阻害；プロセス中の試料のより低いＤＦにおいて、酵素濃度がより高いため、より多くの生成物が生成し、より大きな阻害を生じる。
（１）基質枯渇；より小さなＤＦ（より高い酵素濃度）においてより多くの基質が消費されることにより、ｖ／［Ｅ］が低下する
および／または
（２）生成物の阻害；プロセス中の試料のより低いＤＦにおいて、酵素濃度がより高いため、より多くの生成物が生成し、より大きな阻害を生じる。
【0206】
阻害効果の起源を調べるため、緩衝液３（ＤＳ製剤緩衝液）を用いて３セットの試料を作成した。セットＡ：様々な酵素濃度および様々な緩衝液濃度、セットＢ：様々な酵素濃度および一定の緩衝液濃度、ならびにセットＣ：一定の酵素濃度および様々な緩衝液濃度（図１１）。
【0207】
［Ｓ］≒［Ｓ］開始であるように、生成物に変換された基質の量は＜６％であったため（図１２）、基質の枯渇は観察された阻害の原因ではなかった。
【0208】
試料セットＡ（様々な［Ｅ］、様々な［緩衝液］）およびセットＢ（様々な［Ｅ］、一定の［緩衝液］）からのデータは、セットＣ（一定の［Ｅ］、様々な［緩衝液］）よりも比活性の濃度（１／ＤＦに比例する）に対するより強い依存性を示す。これらの結果（図１３Ａ～１３Ｃ）は、阻害がマトリックスのみによって生じたのではなく、生成物の阻害によるものであったことを示した。
【0209】
これらの結果は、マトリックスおよび生成物の両方が、より低い試料ＤＦにおいてＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質の阻害および比活性の低下を引き起こし得ることを示している。いくつかのプロセス中の試料の種類について、生成物の阻害は観察された阻害の主要な起源である。マトリックス対生成物の阻害の相対的な重要性は、アッセイに使用されるマトリックスの性質および希釈倍率によって決定される。
【0210】
プロセス中の試料におけるＨＩＲ Ｍａｂ－Ｉ２Ｓ融合タンパク質のより低い希釈倍率での比活性の低下は、マトリックスの阻害および生成物の阻害の組合せによるものであり得る。これは、マトリックス成分による阻害（様々な緩衝液マトリックス濃度、一定の酵素濃度）対生成物による阻害（様々な酵素濃度、一定の緩衝液マトリックス濃度）を示す別々の実験において示された。
【0211】
酵素濃度が十分に高く、マトリックス効果がわずかである場合におけるプロセス中の試料の阻害フリーの比活性を決定するために、以下の方法を用いた：
Ｉ．精製したＳＨＰ６３１を用いて、比活性の［Ｅ］に対する依存性を決定する。［Ｅ］／ｖ対１／ＤＦの線形適合を行い、勾配（式４の「ａ」）を得る。
ＩＩ．単一の規定された希釈倍率でプロセス中の試料の比活性（ｖ／［Ｅ］）を測定する。
ＩＩＩ．段階（ｉ）の勾配ａを用いて、式６から阻害フリーの比活性（ｖ０／［Ｅ］）を算出する。
Ｉ．精製したＳＨＰ６３１を用いて、比活性の［Ｅ］に対する依存性を決定する。［Ｅ］／ｖ対１／ＤＦの線形適合を行い、勾配（式４の「ａ」）を得る。
ＩＩ．単一の規定された希釈倍率でプロセス中の試料の比活性（ｖ／［Ｅ］）を測定する。
ＩＩＩ．段階（ｉ）の勾配ａを用いて、式６から阻害フリーの比活性（ｖ０／［Ｅ］）を算出する。
【0212】
阻害の起源が同定されていないプロセス中の試料の種類について、様々な希釈物においてアッセイを行い、［Ｅ］／ｖ対１／ＤＦをプロットし、無限希釈物（１／ＤＦ＝０）に外挿することによって、阻害フリーの比活性が決定され得る。これは、様々なプロセス中の試料の種類にわたる酵素活性値の直接比較を可能にする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】