特許 7458619 フィブロイン繊維の製造方法及びフィブロイン溶液

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-22

(45)【発行日】2024-04-01

(54)【発明の名称】フィブロイン繊維の製造方法及びフィブロイン溶液

(51)【国際特許分類】

   D01F 4/02 20060101AFI20240325BHJP

【ＦＩ】

D01F4/02

【請求項の数】 9

(21)【出願番号】P 2019016225

(22)【出願日】2019-01-31

(65)【公開番号】P2020122249

(43)【公開日】2020-08-13

【審査請求日】2022-01-31

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成３０年度、内閣府、革新的研究開発推進プログラム、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】508113022

【氏名又は名称】Ｓｐｉｂｅｒ株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100185591

【弁理士】

【氏名又は名称】中塚 岳

(72)【発明者】

【氏名】後藤 康夫

(72)【発明者】

【氏名】シャファート オリバー セイエッド

【審査官】斎藤 克也

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１０－２７０４２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／１６４２３４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２００７－５１５３９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１８／２１６７７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２００８－２４５６２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】欧州特許出願公開第０２７１２９５５（ＥＰ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１４／０２８８６３８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２０１７－０６１７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０６－３４６３１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開２００９－２２１４０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５１９５９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１７／０９４７２２（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｄ０１Ｆ１／００－６／９６

Ｄ０１Ｆ９／００－９／０４

Ｄ０１Ｄ１／００－１３／０２

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

フィブロインと、第１の溶媒を主成分として含み、かつ前記第１の溶媒の沸点より高い沸点を有する第２の溶媒を添加成分として含む溶媒とを含有するドープ液を、乾式紡糸により紡糸する工程を備える、フィブロイン繊維の製造方法（ただし、前記乾式紡糸がエレクトロスピニングである場合を除く）。

【請求項2】

前記第２の溶媒の含有量に対する前記第１の溶媒の含有量の質量比が９５／５以上である、請求項１に記載のフィブロイン繊維の製造方法。

【請求項3】

前記工程により得られた繊維を水中で延伸する工程を更に備える、請求項１又は２に記載のフィブロイン繊維の製造方法。

【請求項4】

前記第１の溶媒の沸点が４０℃以上１２０℃以下であり、前記第２の溶媒の沸点が８０℃以上２８０℃以下である、請求項１～３のいずれか一項に記載のフィブロイン繊維の製造方法。

【請求項5】

前記フィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、請求項１～４のいずれか一項に記載のフィブロイン繊維の製造方法。

【請求項6】

前記フィブロインが改変フィブロインである、請求項１～５のいずれか一項に記載のフィブロイン繊維の製造方法。

【請求項7】

改変フィブロインと、
第１の溶媒を主成分として含み、かつ前記第１の溶媒の沸点より高い沸点を有する第２の溶媒を添加成分として含む溶媒と、を含有し、
前記第１の溶媒の沸点が４０℃以上１２０℃以下であり、前記第２の溶媒の沸点が８０℃以上２８０℃以下であり、
前記第２の溶媒の含有量に対する前記第１の溶媒の含有量の質量比が９５／５以上である、フィブロイン溶液。

【請求項8】

前記改変フィブロインが、昆虫又はクモ類由来の改変フィブロインである、請求項７に記載のフィブロイン溶液。

【請求項9】

乾式紡糸に用いられる、請求項７又は８に記載のフィブロイン溶液。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、フィブロイン繊維の製造方法及びフィブロイン溶液に関する。

【背景技術】

【0002】

各種産業分野において、利用価値の高い新素材としてフィブロイン繊維に関心が寄せられている。フィブロイン繊維として、従来から再生絹フィブロイン繊維及びクモ糸フィブロイン繊維が知られている。これらのフィブロイン繊維の製造方法として、湿式紡糸法及び乾湿式紡糸法が多数報告されている。しかしながら、それらの製造方法においては、凝固浴及び水洗浴において液体を多量に用いる必要があり、生産性の向上には限度がある。

【0003】

乾式紡糸法としては、例えば、精錬後の蚕絹フィブロインを塩化カルシウムとギ酸の混合有機溶媒に溶解させたドープをシリンジから気中に吐出させて繊維を形成させる方法（非特許文献１）や、精錬後の蚕絹フィブロインをヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶解させたドープをシリンジから気中に吐出させて繊維を形成させる方法（非特許文献２）が報告されている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0004】

【文献】Xiaoxiao Yue et al, MaterialsLetters, 128, 2014, pp.175-178

【文献】Andreas Koeppel et al, ACSBiomaterials Science & Engineering, 2017, 3, 226-237

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、従来の乾式紡糸法で得られるフィブロイン繊維では、十分な引張強度を得ることが困難である。

【0006】

そこで、本発明は、引張強度に優れるフィブロイン繊維を得ることを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
（１） フィブロインと、第１の溶媒を主成分として含み、かつ第１の溶媒の沸点より高い沸点を有する第２の溶媒を添加成分として含む溶媒とを含有するドープ液を、乾式紡糸により紡糸する工程を備える、フィブロイン繊維の製造方法。
（２） 第２の溶媒の含有量に対する第１の溶媒の含有量の質量比が９５／５以上である、（１）に記載のフィブロイン繊維の製造方法。
（３） 上記工程により得られた繊維を水中で延伸する工程を更に備える、（１）又は（２）に記載のフィブロイン繊維の製造方法。
（４） 第１の溶媒の沸点が４０℃以上１２０℃以下であり、第２の溶媒の沸点が８０℃以上２８０℃以下である、（１）～（３）のいずれかに記載のフィブロイン繊維の製造方法。
（５） フィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、（１）～（４）のいずれかに記載のフィブロイン繊維の製造方法。
（６） フィブロインが改変フィブロインである、（１）～（５）のいずれかに記載のフィブロイン繊維の製造方法。
（７） フィブロインと、第１の溶媒を主成分として含み、かつ第１の溶媒の沸点より高い沸点を有する第２の溶媒を添加成分として含む溶媒と、を含有する、フィブロイン溶液。
（８） 第２の溶媒の含有量に対する第１の溶媒の含有量の質量比が９５／５以上である、（７）に記載のフィブロイン溶液。
（９） 第１の溶媒の沸点が４０℃以上１２０℃以下であり、第２の溶媒の沸点が８０℃以上２８０℃以下である、（７）又は（８）に記載のフィブロイン溶液。
（１０） フィブロインが、昆虫又はクモ類由来のフィブロインである、（７）～（９）のいずれかに記載のフィブロイン溶液。
（１１） フィブロインが改変フィブロインである、（７）～（１０）のいずれかに記載のフィブロイン溶液。
（１２） 乾式紡糸に用いられる、（７）～（１１）のいずれかに記載のフィブロイン溶液。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、引張強度に優れるフィブロイン繊維を得ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。

【図2】天然由来のフィブロインのｚ／ｗ（％）の値の分布を示す図である。

【図3】天然由来のフィブロインのｘ／ｙ（％）の値の分布を示す図である。

【図4】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。

【図5】改変フィブロインのドメイン配列の一例を示す模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。

【0011】

〔フィブロイン溶液〕
本実施形態のフィブロイン溶液（ドープ液とも呼ばれる）は、フィブロインと、溶媒とを含有する。溶媒は、第１の溶媒を主成分として含み、第２の溶媒を添加成分として含む。

【0012】

第１の溶媒は、フィブロインを溶解し得る溶媒であり、好ましくは、フィブロインに対して大きな溶解度を有している。第１の溶媒は、好ましくは、２５℃において６質量％以上のフィブロインを溶解し得る溶媒である。

【0013】

第１の溶媒の沸点ＢＰ１は、例えば、４０℃以上、４５℃以上、５０℃以上、又は５５℃以上であってよく、１２０℃以下、１１０℃以下、１００℃以下、９０℃以下、８０℃以下、７０℃以下、又は６０℃以下であってよい。本明細書中、沸点は、大気圧下における沸点を意味する。第１の溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロパノール、パーフルオロ－ｔ－ブタノール、トリフルオロエタノール、トリフルオロ酢酸等が挙げられる。

【0014】

第２の溶媒は、第１の溶媒の沸点ＢＰ１より高い沸点ＢＰ２を有する溶媒である。第２の溶媒のフィブロインに対する溶解度は、特に制限されない。

【0015】

第１の溶媒の沸点ＢＰ１と第２の溶媒の沸点ＢＰ２との差（ＢＰ２－ＢＰ１）は、例えば、３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上、６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、１００℃以上、１１０℃以上、１２０℃以上、又は１３０℃以上であってよく、例えば２００℃以下であってよい。

【0016】

第２の溶媒の沸点ＢＰ２は、例えば、８０℃以上、１００℃以上、１２０℃以上、１４０℃以上、１６０℃以上、又は１８０℃以上であってよく、２８０℃以下、２６０℃以下、２４０℃以下、２３０℃以下、２２０℃以下、２１０℃以下、又は２００℃以下であってよい。第２の溶媒としては、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、ギ酸、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、炭酸プロピレン、イミダゾール、１－メチルイミダゾール、イオン液体（１－ブチル－３－メチルイミダゾリウムクロリドや１－エチル－３－メチルイミダゾリウムジエチルホスフェート等）等が挙げられる。

【0017】

第１の溶媒と第２の溶媒との合計含有量は、フィブロイン溶液全量に対して、５０質量％以上、６０質量％以上、７０質量％以上、又は８０質量％以上であってよい。第２の溶媒の含有量に対する第１の溶媒の含有量の質量比（第１の溶媒の含有量／第２の溶媒の含有量）は、フィブロインを溶媒に好適に溶解させて、引張強度に優れるフィブロイン繊維を得る観点から、例えば、９５／５以上であってよく、９６／４以上であってもよく、９７／３以上であってもよく、９８／２以上であってもよい。当該質量比は、９９／１以下であってもよい。

【0018】

本実施形態におけるフィブロイン溶液は、沸点の低い第１の溶媒と沸点の高い第２の溶媒とを含有しているため、このフィブロイン溶液を用いて乾式紡糸を行うことにより、引張強度に優れる繊維（原料繊維）が得られる。また、この原料繊維は、水中で延伸することが可能であるため、その強度を更に向上させることができる。その理由は定かではないが、本発明者らは、以下のように推察している。
すなわち、二次延伸による引張強度向上には、フィブロイン分子を塑性変形させて繊維軸内での分子鎖の再配列（配向）を大きくする必要がある。水はフィブロインの可塑剤となるので、延伸時に分子配向を進める一方、結晶化を過度に促進しない効果を期待できる。水中延伸する際、再生フィブロイン繊維の結晶性が低い場合には、可塑剤となる水の浸透量が多すぎて膨潤に伴う破断（溶断）しやすくなり、逆に結晶性が高すぎる場合には、フィブロインの強い凝集力のため塑性変形が妨げられ分子鎖の再配列が困難となる。第１の溶媒のみを用いた場合の乾式紡糸では、結晶性の低い再生繊維しか得られないため水中で溶断する。これに対して、第１の溶媒より沸点の高い第２の溶媒を含むと、繊維中に残留する第２の溶媒が可塑剤となってフィブロイン分子の運動性をもたらし、結晶性を進行させ、水中でも溶断せずに二次延伸可能となる。したがって、第１の溶媒に加えて第２の溶媒を用いることで、適度な結晶性を有し、かつ引張強度に優れるフィブロイン繊維を作製でき、また、水中延伸が可能となり、強度のより高いフィブロイン繊維を得ることができる。

【0019】

フィブロインは、例えば、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン、及びホーネットシルクフィブロインからなる群より選択される１種以上であってよい。特に、フィブロインは、絹フィブロイン、クモ糸フィブロイン又はこれらの組み合わせであってもよい。絹フィブロインとクモ糸フィブロインとを併用する場合、絹フィブロインの割合は、例えば、クモ糸フィブロイン１００質量部に対して、４０質量部以下、３０質量部以下、又は１０質量部以下であってよい。

【0020】

絹糸は、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）の幼虫である蚕の作る繭から得られる繊維（繭糸）である。一般に、１本の繭糸は、２本の絹フィブロインと、これらを外側から覆うニカワ質（セリシン）とから構成される。絹フィブロインは、多数のフィブリルで構成される。絹フィブロインは、４層のセリシンで覆われる。実用的には、精錬により外側のセリシンを溶解して取り除いて得られる絹フィラメントが、衣料用途に使用されている。一般的な絹糸は、１．３３の比重、平均３．３ｄｅｃｉｔｅｘの繊度、及び１３００～１５００ｍ程度の繊維長を有する。絹フィブロインは、天然若しくは家蚕の繭、又は中古若しくは廃棄のシルク生地を原料として得られる。

【0021】

絹フィブロインとしては、セリシン除去絹フィブロイン、セリシン未除去絹フィブロイン、又はこれらの組み合わせであってもよい。セリシン除去絹フィブロインは、絹フィブロインを覆うセリシン、及びその他の脂肪分などを除去して精製したものである。このようにして精製した絹フィブロインは、好ましくは、凍結乾燥粉末として用いられる。セリシン未除去絹フィブロインは、セリシンなどが除去されていない未精製の絹フィブロインである。

【0022】

クモ糸フィブロインは、天然クモ糸タンパク質、及び天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチド（人造クモ糸タンパク質）からなる群より選ばれるクモ糸ポリペプチドを含有していてもよい。

【0023】

天然クモ糸タンパク質としては、例えば、大吐糸管しおり糸タンパク質、横糸タンパク質、及び小瓶状腺タンパク質が挙げられる。大吐糸管しおり糸は、結晶領域と非晶領域（無定形領域とも言う。）からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つ。クモ糸の横糸は、結晶領域を持たず、非晶領域からなる繰り返し領域を持つという特徴を有する。横糸は、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。

【0024】

大吐糸管しおり糸タンパク質は、クモの大瓶状線で産生され、強靭性に優れるという特徴を有する。大吐糸管しおり糸タンパク質としては、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２、並びに二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３及びＡＤＦ４が挙げられる。ＡＤＦ３は、ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つである。天然クモ糸タンパク質に由来するポリペプチドは、これらのしおり糸タンパク質に由来するポリペプチドであってもよい。ＡＤＦ３に由来するポリペプチドは、比較的合成し易く、また、強伸度及びタフネスの点で優れた特性を有する。

【0025】

横糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ ｇｌａｎｄ）で産生される。横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる。

【0026】

フィブロインは、改変フィブロイン（組換えフィブロイン）であってもよい。改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。改変フィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。

【0027】

本明細書において「改変フィブロイン」とは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列とは異なるフィブロインであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列と同一であるフィブロインであってもよい。本明細書でいう「天然由来のフィブロイン」もまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。

【0028】

「改変フィブロイン」は、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列をそのまま利用したものであってもよく、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列に依拠してそのアミノ酸配列を改変したもの（例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列を改変することによりアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、また天然由来のフィブロインに依らず人工的に設計及び合成したもの（例えば、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより所望のアミノ酸配列を有するもの）であってもよい。

【0029】

本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）_ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）_ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２～２７である。（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２～２０、４～２７、４～２０、８～２０、１０～２０、４～１６、８～１６、又は１０～１６の整数であってよい。また、（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２～３００の整数を示し、１０～３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）_ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。

【0030】

改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列に対し、例えば、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行うことで得ることができる。アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加は、部分特異的突然変異誘発法等の当業者に周知の方法により行うことができる。具体的には、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１０，６４８７（１９８２）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，４４８（１９８３）等の文献に記載されている方法に準じて行うことができる。

【0031】

天然由来のフィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であり、具体的には、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。

【0032】

昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ Ｃｙｎｔｈｉａ ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ ｓｉｍｉｌｌｉｍａ ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。

【0033】

昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。

【0034】

クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）等が挙げられる。

【0035】

クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のより具体的な例としては、例えば、ｆｉｂｒｏｉｎ－３（ａｄｆ－３）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１０（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５５（塩基配列））、ｆｉｂｒｏｉｎ－４（ａｄｆ－４）［Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ４７０１１（アミノ酸配列）、Ｕ４７８５６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ０４５０４（アミノ酸配列）、Ｕ３７５２０（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ６８８５６（アミノ酸配列）、ＥＦ５９５２４６（塩基配列））、ｄｒａｇｌｉｎｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖａｔａ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３２４７２（アミノ酸配列）、ＡＦ４４１２４５（塩基配列））、ｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ １［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ由来］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＪ００４２８（アミノ酸配列）、ＡＪ９７３１５５（塩基配列））、及びｍａｊｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ ２［Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ３２２４９．１（アミノ酸配列）、ＡＭ４９０１６９（塩基配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ １［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５８９．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ２［Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ１４５９１．１（アミノ酸配列））、ｍｉｎｏｒ ａｍｐｕｌｌａｔｅ ｓｐｉｄｒｏｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ［Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ ｃｒｕｅｎｔａｔａ］（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＲ３７２７８．１（アミノ酸配列）等が挙げられる。

【0036】

天然由来のフィブロインのより具体的な例としては、更に、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに配列情報が登録されているフィブロインを挙げることができる。例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列情報のうちＤＩＶＩＳＩＯＮとしてＩＮＶを含む配列の中から、ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮにｓｐｉｄｒｏｉｎ、ａｍｐｕｌｌａｔｅ、ｆｉｂｒｏｉｎ、「ｓｉｌｋ及びｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」、又は「ｓｉｌｋ及びｐｒｏｔｅｉｎ」がキーワードとして記載されている配列、ＣＤＳから特定のｐｒｏｄｕｃｔの文字列、ＳＯＵＲＣＥからＴＩＳＳＵＥ ＴＹＰＥに特定の文字列の記載された配列を抽出することにより確認することができる。

【0037】

改変フィブロインは、改変絹（シルク）フィブロイン（カイコが産生する絹タンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよく、改変クモ糸フィブロイン（クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質のアミノ酸配列を改変したもの）であってもよい。改変フィブロインとしては、改変クモ糸フィブロインが好ましい。

【0038】

改変フィブロインの具体的な例として、クモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質に由来する改変フィブロイン（第１の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第２の改変フィブロイン）、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第３の改変フィブロイン）、グリシン残基の含有量、及び（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減された改変フィブロイン（第４の改変フィブロイン）、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むドメイン配列を有する改変フィブロイン（第５の改変フィブロイン）、並びにグルタミン残基の含有量が低減されたドメイン配列を有する改変フィブロイン（第６の改変フィブロイン）が挙げられる。

【0039】

第１の改変フィブロインとしては、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質が挙げられる。第１の改変フィブロインにおいて、（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数は、３～２０の整数が好ましく、４～２０の整数がより好ましく、８～２０の整数が更に好ましく、１０～２０の整数が更により好ましく、４～１６の整数が更によりまた好ましく、８～１６の整数が特に好ましく、１０～１６の整数が最も好ましい。第１の改変フィブロインは、式１中、ＲＥＰを構成するアミノ酸残基の数は、１０～２００残基であることが好ましく、１０～１５０残基であることがより好ましく、２０～１００残基であることが更に好ましく、２０～７５残基であることが更により好ましい。第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるアミノ酸配列中に含まれるグリシン残基、セリン残基及びアラニン残基の合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して、４０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、７０％以上であることが更に好ましい。

【0040】

第１の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるアミノ酸配列の単位を含み、かつＣ末端配列が配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列又は配列番号１～３のいずれかに示されるアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であるポリペプチドであってもよい。

【0041】

配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７、ＮＣＢＩ）のアミノ酸配列のＣ末端の５０残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列と同一であり、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２０残基取り除いたアミノ酸配列と同一であり、配列番号３に示されるアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列のＣ末端から２９残基取り除いたアミノ酸配列と同一である。

【0042】

第１の改変フィブロインのより具体的な例として、（１－ｉ）配列番号４（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｐｉｄｅｒ ｓｉｌｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＤＦ３ＫａｉＬａｒｇｅＮＲＳＨ１）で示されるアミノ酸配列、又は（１－ｉｉ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0043】

配列番号４で示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号５）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が第１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号４で示されるアミノ酸配列のＣ末端のアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と同一である。

【0044】

（１－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0045】

第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第２の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。

【0046】

第２の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中のＧＧＸ及びＧＰＧＸＸ（但し、Ｇはグリシン残基、Ｐはプロリン残基、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）から選ばれる少なくとも一つのモチーフ配列において、少なくとも１又は複数の当該モチーフ配列中の１つのグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0047】

第２の改変フィブロインは、上述のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたモチーフ配列の割合が、全モチーフ配列に対して、１０％以上であってもよい。

【0048】

第２の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の全ＲＥＰに含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列中の総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが３０％以上、４０％以上、５０％以上又は５０．９％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。

【0049】

第２の改変フィブロインは、ＧＧＸモチーフの１つのグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換することにより、ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合を高めたものであることが好ましい。第２の改変フィブロインは、ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が３０％以下であることが好ましく、２０％以下であることがより好ましく、１０％以下であることが更に好ましく、６％以下であることが更により好ましく、４％以下であることが更によりまた好ましく、２％以下であることが特に好ましい。ドメイン配列中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合は、下記ＸＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合（ｚ／ｗ）の算出方法と同様の方法で算出することができる。

【0050】

ｚ／ｗの算出方法を更に詳細に説明する。まず、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる全てのＲＥＰから、ＸＧＸからなるアミノ酸配列を抽出する。ＸＧＸを構成するアミノ酸残基の総数がｚである。例えば、ＸＧＸからなるアミノ酸配列が５０個抽出された場合（重複はなし）、ｚは５０×３＝１５０である。また、例えば、ＸＧＸＧＸからなるアミノ酸配列の場合のように２つのＸＧＸに含まれるＸ（中央のＸ）が存在する場合は、重複分を控除して計算する（ＸＧＸＧＸの場合は５アミノ酸残基である）。ｗは、ドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列に含まれる総アミノ酸残基数である。例えば、図１に示したドメイン配列の場合、ｗは４＋５０＋４＋１００＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝２３０である（最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフは除いている。）。次に、ｚをｗで除すことによって、ｚ／ｗ（％）を算出することができる。

【0051】

ここで、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、フィブロイン中のＧＧＸからなるアミノ酸配列の含有割合が６％以下である天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｚ／ｗを算出した。その結果を図２に示す。図２の横軸はｚ／ｗ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図２から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｚ／ｗは、いずれも５０．９％未満である（最も高いもので、５０．８６％）。

【0052】

第２の改変フィブロインにおいて、ｚ／ｗは、５０．９％以上であることが好ましく、５６．１％以上であることがより好ましく、５８．７％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、８０％以上であることが更によりまた好ましい。ｚ／ｗの上限に特に制限はないが、例えば、９５％以下であってもよい。

【0053】

第２の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、グリシン残基をコードする塩基配列の少なくとも一部を置換して別のアミノ酸残基をコードするように改変することにより得ることができる。このとき、改変するグリシン残基として、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフにおける１つのグリシン残基を選択してもよいし、またｚ／ｗが５０．９％以上になるように置換してもよい。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記態様を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

【0054】

上記の別のアミノ酸残基としては、グリシン残基以外のアミノ酸残基であれば特に制限はないが、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、メチオニン（Ｍ）残基、プロリン（Ｐ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びトリプトファン（Ｗ）残基等の疎水性アミノ酸残基、グルタミン（Ｑ）残基、アスパラギン（Ｎ）残基、セリン（Ｓ）残基、リシン（Ｋ）残基及びグルタミン酸（Ｅ）残基等の親水性アミノ酸残基が好ましく、バリン（Ｖ）残基、ロイシン（Ｌ）残基、イソロイシン（Ｉ）残基、フェニルアラニン（Ｆ）残基及びグルタミン（Ｑ）残基がより好ましく、グルタミン（Ｑ）残基が更に好ましい。

【0055】

第２の改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉ）配列番号６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３８０）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｉ）配列番号６、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0056】

（２－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列のＲＥＰ中の全てのＧＧＸをＧＱＸに置換したものである。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、配列番号６で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の各（Ａ）_ｎモチーフのＣ末端側に２つのアラニン残基を挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、配列番号７の分子量とほぼ同じとなるようにＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域（但し、当該領域のＣ末端側の数アミノ酸残基が置換されている。）を４回繰り返した配列のＣ末端に所定のヒンジ配列とＨｉｓタグ配列が付加されたものである。

【0057】

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）におけるｚ／ｗの値は、４６．８％である。配列番号６で示されるアミノ酸配列、配列番号７で示されるアミノ酸配列、配列番号８で示されるアミノ酸配列、及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ５８．７％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。また、配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のギザ比率（後述する）１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は、それぞれ１５．０％、１５．０％、９３．４％、９２．７％及び８９．８％である。

【0058】

（２－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0059】

（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0060】

（２－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号６、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。

【0061】

第２の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。

【0062】

タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ｍｅｔａｌ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による改変フィブロインの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含むアミノ酸配列）が挙げられる。

【0063】

また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。

【0064】

さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に改変フィブロインを精製することができる。

【0065】

さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着したタンパク質をプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した改変フィブロインを回収することもできる。

【0066】

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（２－ｉｉｉ）配列番号１２（ＰＲＴ３８０）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（２－ｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0067】

配列番号１６（ＰＲＴ３１３）、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。

【0068】

（２－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0069】

（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（２－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0070】

（２－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＲＥＰ中に含まれるＸＧＸ（但し、Ｘはグリシン以外のアミノ酸残基を示す。）からなるアミノ酸配列の総アミノ酸残基数をｚとし、上記ドメイン配列中のＲＥＰの総アミノ酸残基数をｗとしたときに、ｚ／ｗが５０．９％以上であることが好ましい。

【0071】

第２の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

【0072】

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。第３の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。

【0073】

第３の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインから（Ａ）_ｎモチーフを１０～４０％欠失させたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0074】

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって１～３つの（Ａ）_ｎモチーフ毎に１つの（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0075】

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つ連続した（Ａ）_ｎモチーフの欠失、及び１つの（Ａ）_ｎモチーフの欠失がこの順に繰り返されたことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0076】

第３の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、少なくともＮ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってもよい。

【0077】

第３の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが２０％以上、３０％以上、４０％以上又は５０％以上であるアミノ酸配列を有するものであってもよい。（Ａ）_ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数は８３％以上であってよいが、８６％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることが更に好ましく、１００％であること（アラニン残基のみで構成されることを意味する）が更により好ましい。

【0078】

ｘ／ｙの算出方法を、図１を参照しながら更に詳細に説明する。図１には、改変フィブロインからＮ末端配列及びＣ末端配列を除いたドメイン配列を示す。当該ドメイン配列は、Ｎ末端側（左側）から（Ａ）_ｎモチーフ－第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第３のＲＥＰ（１０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフ－第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）－（Ａ）_ｎモチーフという配列を有する。

【0079】

隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットは、重複がないように、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、順次選択する。このとき、選択されない［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットが存在してもよい。図１には、パターン１（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第３のＲＥＰと第４のＲＥＰの比較）、パターン２（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン３（第２のＲＥＰと第３のＲＥＰの比較、及び第４のＲＥＰと第５のＲＥＰの比較）、パターン４（第１のＲＥＰと第２のＲＥＰの比較）を示した。なお、これ以外にも選択方法は存在する。

【0080】

次に各パターンについて、選択した隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニット中の各ＲＥＰのアミノ酸残基数を比較する。比較は、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときの、他方のアミノ酸残基数の比を求めることによって行う。例えば、第１のＲＥＰ（５０アミノ酸残基）と第２のＲＥＰ（１００アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第１のＲＥＰを１としたとき、第２のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、１００／５０＝２である。同様に、第４のＲＥＰ（２０アミノ酸残基）と第５のＲＥＰ（３０アミノ酸残基）の比較の場合、よりアミノ酸残基数の少ない第４のＲＥＰを１としたとき、第５のＲＥＰのアミノ酸残基数の比は、３０／２０＝１．５である。

【0081】

図１中、よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組を実線で示した。本明細書中、この比をギザ比率と呼ぶ。よりアミノ酸残基数の少ない方を１としたときに、他方のアミノ酸残基数の比が１．８未満又は１１．３超となる［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの組は破線で示した。

【0082】

各パターンにおいて、実線で示した隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットの全てのアミノ酸残基数を足し合わせる（ＲＥＰのみではなく、（Ａ）_ｎモチーフのアミノ酸残基数もである。）。そして、足し合わせた合計値を比較して、当該合計値が最大となるパターンの合計値（合計値の最大値）をｘとする。図１に示した例では、パターン１の合計値が最大である。

【0083】

次に、ｘをドメイン配列の総アミノ酸残基数ｙで除すことによって、ｘ／ｙ（％）を算出することができる。

【0084】

第３の改変フィブロインにおいて、ｘ／ｙは、５０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましく、６５％以上であることが更に好ましく、７０％以上であることが更により好ましく、７５％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、例えば、１００％以下であってよい。ギザ比率が１：１．９～１１．３の場合には、ｘ／ｙは８９．６％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．８～３．４の場合には、ｘ／ｙは７７．１％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～８．４の場合には、ｘ／ｙは７５．９％以上であることが好ましく、ギザ比率が１：１．９～４．１の場合には、ｘ／ｙは６４．２％以上であることが好ましい。

【0085】

第３の改変フィブロインが、ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）_ｎモチーフの少なくとも７つがアラニン残基のみで構成される改変フィブロインである場合、ｘ／ｙは、４６．４％以上であることが好ましく、５０％以上であることがより好ましく、５５％以上であることが更に好ましく、６０％以上であることが更により好ましく、７０％以上であることが更によりまた好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。ｘ／ｙの上限に特に制限はなく、１００％以下であればよい。

【0086】

ここで、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙについて説明する。まず、上述のように、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋにアミノ酸配列情報が登録されているフィブロインを例示した方法により確認したところ、６６３種類のフィブロイン（このうち、クモ類由来のフィブロインは４１５種類）が抽出された。抽出された全てのフィブロインのうち、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列で構成される天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、上述の算出方法により、ｘ／ｙを算出した。ギザ比率が１：１．９～４．１の場合の結果を図３に示す。

【0087】

図３の横軸はｘ／ｙ（％）を示し、縦軸は頻度を示す。図３から明らかなとおり、天然由来のフィブロインにおけるｘ／ｙは、いずれも６４．２％未満である（最も高いもので、６４．１４％）。

【0088】

第３の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように（Ａ）_ｎモチーフをコードする配列の１又は複数を欠失させることにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から、ｘ／ｙが６４．２％以上になるように１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

【0089】

第３の改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉ）配列番号１７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３９９）、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｉ）配列番号１７、配列番号７、配列番号８若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0090】

（３－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１７で示されるアミノ酸配列は、天然由来のフィブロインに相当する配列番号１０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ３１３）で示されるアミノ酸配列から、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって２つおきに（Ａ）_ｎモチーフを欠失させ、更にＣ末端配列の手前に［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］を１つ挿入したものである。配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列は、第２の改変フィブロインで説明したとおりである。

【0091】

配列番号１０で示されるアミノ酸配列（天然由来のフィブロインに相当）のギザ比率１：１．８～１１．３におけるｘ／ｙの値は１５．０％である。配列番号１７で示されるアミノ酸配列、及び配列番号７で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、いずれも９３．４％である。配列番号８で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、９２．７％である。配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｘ／ｙの値は、８９．８％である。配列番号１０、配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列におけるｚ／ｗの値は、それぞれ４６．８％、５６．２％、７０．１％、６６．１％及び７０．０％である。

【0092】

（３－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0093】

（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0094】

（３－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１７、配列番号７、配列番号８又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３（ギザ比率が１：１．８～１１．３）となる隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。

【0095】

第３の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に上述したタグ配列を含んでいてもよい。

【0096】

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（３－ｉｉｉ）配列番号１８（ＰＲＴ３９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（３－ｉｖ）配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0097】

配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１７、配列番号７、配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。

【0098】

（３－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0099】

（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（３－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0100】

（３－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号１８、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつＮ末端側からＣ末端側に向かって、隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのＲＥＰのアミノ酸残基数を順次比較して、アミノ酸残基数が少ないＲＥＰのアミノ酸残基数を１としたとき、他方のＲＥＰのアミノ酸残基数の比が１．８～１１．３となる隣合う２つの［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］ユニットのアミノ酸残基数を足し合わせた合計値の最大値をｘとし、ドメイン配列の総アミノ酸残基数をｙとしたときに、ｘ／ｙが６４．２％以上であることが好ましい。

【0101】

第３の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

【0102】

第４の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、（Ａ）_ｎモチーフの含有量が低減されたことに加え、グリシン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有するものである。第４の改変フィブロインのドメイン配列は、天然由来のフィブロインと比較して、少なくとも１又は複数の（Ａ）_ｎモチーフが欠失したことに加え、更に少なくともＲＥＰ中の１又は複数のグリシン残基が別のアミノ酸残基に置換されたことに相当するアミノ酸配列を有するものということができる。すなわち、第４の改変フィブロインは、上述した第２の改変フィブロインと、第３の改変フィブロインの特徴を併せ持つ改変フィブロインである。具体的な態様等は、第２の改変フィブロイン、及び第３の改変フィブロインで説明したとおりである。

【0103】

第４の改変フィブロインのより具体的な例として、（４－ｉ）配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）、配列番号９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７９９）、配列番号１３（ＰＲＴ４１０）、配列番号１４（ＰＲＴ５２５）若しくは配列番号１５（ＰＲＴ７９９）で示されるアミノ酸配列、又は（４－ｉｉ）配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４若しくは配列番号１５で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４又は配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロインの具体的な態様は上述のとおりである。

【0104】

第５の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列を有するものであってよい。

【0105】

局所的に疎水性指標の大きい領域は、連続する２～４アミノ酸残基で構成されていることが好ましい。

【0106】

上述の疎水性指標の大きいアミノ酸残基は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましい。

【0107】

第５の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に、天然由来のフィブロインと比較して、１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。

【0108】

第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基に置換したこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変を行ってもよい。

【0109】

第５の改変フィブロインは、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含み、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフから上記ドメイン配列のＣ末端までの配列を上記ドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であるアミノ酸配列を有してもよい。

【0110】

アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ Ｒ（１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５－１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、以下「ＨＩ」とも記す。）は、下記表１に示すとおりである。

【0111】

【表1】

【0112】

ｐ／ｑの算出方法を更に詳細に説明する。算出には、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列から、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列を除いた配列（以下、「配列Ａ」とする）を用いる。まず、配列Ａに含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値を算出する。疎水性指標の平均値は、連続する４アミノ酸残基に含まれる各アミノ酸残基のＨＩの総和を４（アミノ酸残基数）で除して求める。疎水性指標の平均値は、全ての連続する４アミノ酸残基について求める（各アミノ酸残基は、１～４回平均値の算出に用いられる。）。次いで、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域を特定する。あるアミノ酸残基が、複数の「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」に該当する場合であっても、領域中には１アミノ酸残基として含まれることになる。そして、当該領域に含まれるアミノ酸残基の総数がｐである。また、配列Ａに含まれるアミノ酸残基の総数がｑである。

【0113】

例えば、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が２０カ所抽出された場合（重複はなし）、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、連続する４アミノ酸残基（重複はなし）が２０含まれることになり、ｐは２０×４＝８０である。また、例えば、２つの「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が１アミノ酸残基だけ重複して存在する場合、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域には、７アミノ酸残基含まれることになる（ｐ＝２×４－１＝７。「－１」は重複分の控除である。）。例えば、図４に示したドメイン配列の場合、「疎水性指標の平均値が２．６以上となる連続する４アミノ酸残基」が重複せずに７つ存在するため、ｐは７×４＝２８となる。また、例えば、図４に示したドメイン配列の場合、ｑは４＋５０＋４＋４０＋４＋１０＋４＋２０＋４＋３０＝１７０である（Ｃ末端側の最後に存在する（Ａ）_ｎモチーフは含めない）。次に、ｐをｑで除すことによって、ｐ／ｑ（％）を算出することができる。図４の場合２８／１７０＝１６．４７％となる。

【0114】

第５の改変フィブロインにおいて、ｐ／ｑは、６．２％以上であることが好ましく、７％以上であることがより好ましく、１０％以上であることが更に好ましく、２０％以上であることが更により好ましく、３０％以上であることが更によりまた好ましい。ｐ／ｑの上限は、特に制限されないが、例えば、４５％以下であってもよい。

【0115】

第５の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインのアミノ酸配列を、上記のｐ／ｑの条件を満たすように、ＲＥＰ中の１又は複数の親水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がマイナスであるアミノ酸残基）を疎水性アミノ酸残基（例えば、疎水性指標がプラスであるアミノ酸残基）に置換すること、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性アミノ酸残基を挿入することにより、局所的に疎水性指標の大きい領域を含むアミノ酸配列に改変することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列から上記のｐ／ｑの条件を満たすアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。いずれの場合においても、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のアミノ酸残基が疎水性指標の大きいアミノ酸残基に置換されたこと、及び／又はＲＥＰ中に１又は複数の疎水性指標の大きいアミノ酸残基が挿入されたことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当する改変を行ってもよい。

【0116】

疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、特に制限はないが、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）が好ましく、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びイソロイシン（Ｉ）がより好ましい。

【0117】

第５の改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉ）配列番号１９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ７２０）、配列番号２０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｉ）配列番号１９、配列番号２０若しくは配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0118】

（５－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号１９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）で示されるアミノ酸配列に対し、Ｃ末端側の端末のドメイン配列を除いて、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入し、更に一部のグルタミン（Ｑ）残基をセリン（Ｓ）残基に置換し、かつＣ末端側の一部のアミノ酸を欠失させたものである。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を１カ所挿入したものである。配列番号２１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し、ＲＥＰ一つ置きにそれぞれ３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列（ＶＬＩ）を２カ所挿入したものである。

【0119】

（５－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0120】

（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0121】

（５－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号１９、配列番号２０又は配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。

【0122】

第５の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。

【0123】

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（５－ｉｉｉ）配列番号２２（ＰＲＴ７２０）、配列番号２３（ＰＲＴ６６５）若しくは配列番号２４（ＰＲＴ６６６）で示されるアミノ酸配列、又は（５－ｉｖ）配列番号２２、配列番号２３若しくは配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変フィブロインを挙げることができる。

【0124】

配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１９、配列番号２０及び配列番号２１で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。

【0125】

（５－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0126】

（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（５－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0127】

（５－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号２２、配列番号２３又は配列番号２４で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有し、かつ最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、連続する４アミノ酸残基の疎水性指標の平均値が２．６以上となる領域に含まれるアミノ酸残基の総数をｐとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれるアミノ酸残基の総数をｑとしたときに、ｐ／ｑが６．２％以上であることが好ましい。

【0128】

第５の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

【0129】

第６の改変フィブロインは、天然由来のフィブロインと比較して、グルタミン残基の含有量が低減されたアミノ酸配列を有する。

【0130】

第６の改変フィブロインは、ＲＥＰのアミノ酸配列中に、ＧＧＸモチーフ及びＧＰＧＸＸモチーフから選ばれる少なくとも一つのモチーフが含まれていることが好ましい。

【0131】

第６の改変フィブロインが、ＲＥＰ中にＧＰＧＸＸモチーフを含む場合、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率は、通常１％以上であり、５％以上であってもよく、１０％以上であるのが好ましい。ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の上限に特に制限はなく、５０％以下であってよく、３０％以下であってもよい。

【0132】

本明細書において、「ＧＰＧＸＸモチーフ含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるＧＰＧＸＸモチーフの個数の総数を３倍した数（即ち、ＧＰＧＸＸモチーフ中のＧ及びＰの総数に相当）をｓとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率はｓ／ｔとして算出される。

【0133】

ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としているのは、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列」（ＲＥＰに相当する配列）には、フィブロインに特徴的な配列と相関性の低い配列が含まれることがあり、ｍが小さい場合（つまり、ドメイン配列が短い場合）、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出結果に影響するので、この影響を排除するためである。なお、ＲＥＰのＣ末端に「ＧＰＧＸＸモチーフ」が位置する場合、「ＸＸ」が例えば「ＡＡ」の場合であっても、「ＧＰＧＸＸモチーフ」として扱う。

【0134】

図５は、改変フィブロインのドメイン配列を示す模式図である。図５を参照しながらＧＰＧＸＸモチーフ含有率の算出方法を具体的に説明する。まず、図５に示した改変フィブロインのドメイン配列（「［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフ」タイプである。）では、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、ｓを算出するためのＧＰＧＸＸモチーフの個数は７であり、ｓは７×３＝２１となる。同様に、全てのＲＥＰが「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」（図５中、「領域Ａ」で示した配列。）に含まれているため、当該配列から更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数ｔは５０＋４０＋１０＋２０＋３０＝１５０である。次に、ｓをｔで除すことによって、ｓ／ｔ（％）を算出することができ、図５の改変フィブロインの場合２１／１５０＝１４．０％となる。

【0135】

第６の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましく、７％以下であることがより好ましく、４％以下であることが更に好ましく、０％であることが特に好ましい。

【0136】

本明細書において、「グルタミン残基含有率」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域に含まれるグルタミン残基の総数をｕとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、グルタミン残基含有率はｕ／ｔとして算出される。グルタミン残基含有率の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。

【0137】

第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、又は他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を有するものであってよい。

【0138】

「他のアミノ酸残基」は、グルタミン残基以外のアミノ酸残基であればよいが、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基であることが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標は表１に示すとおりである。

【0139】

表１に示すとおり、グルタミン残基よりも疎水性指標の大きいアミノ酸残基としては、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、スレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、プロリン（Ｐ）及びヒスチジン（Ｈ）から選ばれるアミノ酸残基を挙げることができる。これらの中でも、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、フェニルアラニン（Ｆ）、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）及びアラニン（Ａ）から選ばれるアミノ酸残基であることがより好ましく、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）及びフェニルアラニン（Ｆ）から選ばれるアミノ酸残基であることが更に好ましい。

【0140】

第６の改変フィブロインは、ＲＥＰの疎水性度が、－０．８以上であることが好ましく、－０．７以上であることがより好ましく、０以上であることが更に好ましく、０．３以上であることが更により好ましく、０．４以上であることが特に好ましい。ＲＥＰの疎水性度の上限に特に制限はなく、１．０以下であってよく、０．７以下であってもよい。

【0141】

本明細書において、「ＲＥＰの疎水性度」は、以下の方法により算出される値である。
式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むフィブロイン（改変フィブロイン又は天然由来のフィブロイン）において、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列（図５の「領域Ａ」に相当する配列。）に含まれる全てのＲＥＰにおいて、その領域の各アミノ酸残基の疎水性指標の総和をｖとし、最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除き、更に（Ａ）_ｎモチーフを除いた全ＲＥＰのアミノ酸残基の総数をｔとしたときに、ＲＥＰの疎水性度はｖ／ｔとして算出される。ＲＥＰの疎水性度の算出において、「最もＣ末端側に位置する（Ａ）_ｎモチーフからドメイン配列のＣ末端までの配列をドメイン配列から除いた配列」を対象としている理由は、上述した理由と同様である。

【0142】

第６の改変フィブロインは、そのドメイン配列が、天然由来のフィブロインと比較して、ＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当する改変に加え、更に１又は複数のアミノ酸残基を置換、欠失、挿入及び／又は付加したことに相当するアミノ酸配列の改変があってもよい。

【0143】

第６の改変フィブロインは、例えば、クローニングした天然由来のフィブロインの遺伝子配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失させること、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換することにより得ることができる。また、例えば、天然由来のフィブロインのアミノ酸配列からＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を欠失したこと、及び／又はＲＥＰ中の１又は複数のグルタミン残基を他のアミノ酸残基に置換したことに相当するアミノ酸配列を設計し、設計したアミノ酸配列をコードする核酸を化学合成することにより得ることもできる。

【0144】

第６の改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉ）配列番号２５（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８８）、配列番号２６（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６５）、配列番号２７（Ｍｅｔ－ＰＲＴ８８９）、配列番号２８（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１６）、配列番号２９（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９１８）、配列番号３０（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９９）、配列番号３１（Ｍｅｔ－ＰＲＴ６９８）若しくは配列番号３２（Ｍｅｔ－ＰＲＴ９６６）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６－ｉｉ）配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１若しくは配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。

【0145】

（６－ｉ）の改変フィブロインについて説明する。配列番号２５で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号２６で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＴＳに置換し、かつ残りのＱをＡに置換したものである。配列番号２７で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。配列番号２８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＩに置換し、かつ残りのＱをＬに置換したものである。配列番号２９で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。

【0146】

配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ５２５）中のＱＱを全てＶＬに置換したものである。配列番号３１で示されるアミノ酸配列は、配列番号８で示されるアミノ酸配列中のＱＱを全てＶＬに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。

【0147】

配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｍｅｔ－ＰＲＴ４１０）中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換したものである。

【0148】

配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率は９％以下である（表２）。

【0149】

【表2】

【0150】

（６－ｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0151】

（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１又は配列番号３２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｉ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0152】

（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｉ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。

【0153】

第６の改変フィブロインは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含んでいてもよい。これにより、改変フィブロインの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。

【0154】

タグ配列を含む改変フィブロインのより具体的な例として、（６－ｉｉｉ）配列番号３３（ＰＲＴ８８８）、配列番号３４（ＰＲＴ９６５）、配列番号３５（ＰＲＴ８８９）、配列番号３６（ＰＲＴ９１６）、配列番号３７（ＰＲＴ９１８）、配列番号３８（ＰＲＴ６９９）、配列番号３９（ＰＲＴ６９８）若しくは配列番号４０（ＰＲＴ９６６）で示されるアミノ酸配列を含む改変フィブロイン、又は（６－ｉｖ）配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９若しくは配列番号４０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む改変フィブロインを挙げることができる。

【0155】

配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１及び配列番号３２で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグ配列及びヒンジ配列を含む）を付加したものである。Ｎ末端にタグ配列を付加しただけであるため、グルタミン残基含有率に変化はなく、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９及び配列番号４０で示されるアミノ酸配列は、いずれもグルタミン残基含有率が９％以下である（表３）。

【0156】

【表3】

【0157】

（６－ｉｉｉ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。

【0158】

（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９又は配列番号４０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものである。（６－ｉｖ）の改変フィブロインもまた、式１：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ、又は式２：［（Ａ）_ｎモチーフ－ＲＥＰ］_ｍ－（Ａ）_ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質である。上記配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。

【0159】

（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、グルタミン残基含有率が９％以下であることが好ましい。また、（６－ｉｖ）の改変フィブロインは、ＧＰＧＸＸモチーフ含有率が１０％以上であることが好ましい。

【0160】

第６の改変フィブロインは、組換えタンパク質生産系において生産されたタンパク質を宿主の外部に放出するための分泌シグナルを含んでいてもよい。分泌シグナルの配列は、宿主の種類に応じて適宜設定することができる。

【0161】

改変フィブロインは、第１の改変フィブロイン、第２の改変フィブロイン、第３の改変フィブロイン、第４の改変フィブロイン、第５の改変フィブロイン、及び第６の改変フィブロインが有する特徴のうち、少なくとも２つ以上の特徴を併せ持つ改変フィブロインであってもよい。

【0162】

＜改変フィブロインの製造方法＞
上記いずれの実施形態に係る改変フィブロインも、例えば、当該改変フィブロインをコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで形質転換された宿主により、当該核酸を発現させることにより生産することができる。

【0163】

改変フィブロインをコードする核酸の製造方法は、特に制限されない。例えば、天然のフィブロインをコードする遺伝子を利用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅しクローニングし、遺伝子工学的手法により改変する方法、又は、化学的に合成する方法によって、当該核酸を製造することができる。核酸の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手したフィブロインのアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ ｐｌｕｓ １０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結する方法によって遺伝子を化学的に合成することができる。この際に、改変フィブロインの精製及び／又は確認を容易にするため、上記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなる改変フィブロインをコードする核酸を合成してもよい。

【0164】

調節配列は、宿主における改変フィブロインの発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとして、宿主細胞中で機能し、改変フィブロインを発現誘導可能な誘導性プロモーターを用いてもよい。誘導性プロモーターは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモーターである。

【0165】

発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、改変フィブロインをコードする核酸を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが好適に用いられる。

【0166】

宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。

【0167】

原核生物の宿主の好ましい例として、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する細菌を挙げることができる。エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ等を挙げることができる。ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ等を挙げることができる。セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス等を挙げることができる。バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス等を挙げることができる。ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム等を挙げることができる。ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム等を挙げることができる。コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス等を挙げることができる。シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ等を挙げることができる。

【0168】

原核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２（ベーリンガーマンハイム社製）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ、ｐＵＢ１１０、ｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。

【0169】

真核生物の宿主としては、例えば、酵母及び糸状真菌（カビ等）を挙げることができる。酵母としては、例えば、サッカロマイセス属、ピキア属、シゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。糸状真菌としては、例えば、アスペルギルス属、ペニシリウム属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属等に属する糸状真菌を挙げることができる。

【0170】

真核生物を宿主とする場合、改変フィブロインをコードする核酸を導入するベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）等を挙げることができる。上記宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、コンピテント法等を挙げることができる。

【0171】

発現ベクターで形質転換された宿主による核酸の発現方法としては、直接発現のほか、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。

【0172】

改変フィブロインは、例えば、発現ベクターで形質転換された宿主を培養培地中で培養し、培養培地中に当該改変フィブロインを生成及び蓄積させ、該培養培地から採取することにより製造することができる。宿主を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。

【0173】

宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。

【0174】

炭素源としては、上記形質転換微生物が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。無機塩類としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。

【0175】

大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。

【0176】

また、培養中、必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。

【0177】

発現させた改変フィブロインの単離及び精製は通常用いられている方法で行うことができる。例えば、当該改変フィブロインが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、宿主細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁した後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー及びダイノミル等により宿主細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、タンパク質の単離精製に通常用いられている方法、すなわち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）－セファロース、ＤＩＡＩＯＮ ＨＰＡ－７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の方法を単独又は組み合わせて使用し、精製標品を得ることができる。

【0178】

また、改変フィブロインが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に宿主細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分として改変フィブロインの不溶体を回収する。回収した改変フィブロインの不溶体はタンパク質変性剤で可溶化することができる。該操作の後、上記と同様の単離精製法により改変フィブロインの精製標品を得ることができる。当該改変フィブロインが細胞外に分泌された場合には、培養上清から当該改変フィブロインを回収することができる。すなわち、培養物を遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、その培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。

【0179】

フィブロインの含有量は、フィブロイン溶液全量に対して、３質量％以上、５質量％以上、１０質量％以上、１５質量％以上、又は２０質量％以上であってよく、４０質量％以下、３５質量％以下、３０質量％以下、又は２５質量％以下であってよい。

【0180】

フィブロイン溶液の粘度は、使用用途等に応じて適宜設定してよい。フィブロイン溶液を紡糸液として用いる場合には、乾式紡糸が可能な粘度であればよく、特に限定されないが、生産性の観点から、フィブロイン溶液の粘度は、２５℃において、例えば、１０，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以上であってよく、２００，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、１５０，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、１００，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、８０，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、５０，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、３０，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、２０，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下、又は１５，０００ｍＰａ・ｓｅｃ以下であってよい。フィブロイン溶液の粘度は、例えば、京都電子工業社製の商品名「ＥＭＳ粘度計」を使用して測定することができる。

【0181】

フィブロイン溶液は、必要に応じて、各種の添加剤を更に含有していてよい。添加剤としては、例えば、可塑剤、レベリング剤、架橋剤、結晶核剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、着色剤、フィラー、合成樹脂が挙げられる。添加剤の含有量は、フィブロイン溶液全量に対して、５０質量％以下であってよい。

【0182】

以上説明したフィブロイン溶液は、フィブロインを含む繊維（フィブロイン繊維）の製造に用いられる溶液（ドープ液）として好適であり、フィブロインを含む繊維（フィブロイン繊維）の紡糸（特に好ましくは乾式紡糸）に用いられる溶液（ドープ液又は紡糸液）として特に好適である。

【0183】

〔フィブロイン繊維の製造方法〕
本実施形態に係るフィブロイン繊維の製造方法は、上述したフィブロイン溶液（ドープ液又は紡糸液）を乾式紡糸により紡糸する工程（紡糸工程）を備えている。

【0184】

紡糸工程では、紡糸液を紡糸口金から空気中に吐出した後、加熱して溶媒を気化させてフィブロイン繊維（凝固糸）を得る。紡糸工程は、例えば、紡糸液として上述したフィブロイン溶液を使用する他は、公知の乾式紡糸法により実施することができる。紡糸工程は、エレクトロスピニング法（静電紡糸法）により実施することもできるが、製造工程の簡易化及び製造コスト低減という観点から、エレクトロスピニング法以外の方法で実施することが好ましい。

【0185】

紡糸口金からフィブロイン溶液（紡糸液）を吐出する方法に特に制限はないが、例えば、フィブロイン溶液（紡糸液）の送液手段として定量ポンプを用いる方法を使用することができる。吐出量は生産速度に応じて適宜調整することができる。

【0186】

紡糸口金を通過する際のフィブロイン溶液（紡糸液）の温度、及び紡糸口金の温度は、特に限定されるものではなく、用いるフィブロイン溶液の濃度及び粘度、溶媒の種類等により適宜調整すればよい。当該温度は、フィブロインの劣化等を防止するという観点から、好ましくは３０℃～１００℃である。当該温度は、溶媒の揮発による圧力上昇、フィブロイン溶液の固形化による配管内の閉塞が発生する可能性を低減するという観点から、フィブロイン溶液中の溶媒の沸点未満の温度を上限とし、溶媒の融点以上の温度を下限とすることが好ましい。これにより工程安定性が向上する。

【0187】

紡糸口金の口金形状、ホール形状、ホール数などは特に限定されるものではなく、所望の繊維径及び単糸本数等に応じて適宜選択できる。例えば、紡糸口金のホール形状が円形である場合は、０．０１ｍｍ以上０．６ｍｍ以下の孔径を例示できる。孔径が０．０１ｍｍ以上であると、圧力損失を低減することができ設備費用を抑えることができる。孔径が０．６ｍｍ以下であると、繊維径を細くするための延伸操作の必要性を低減することができ、吐出から引き取りまでの間で延伸切れを起こす可能性を低減することができる。

【0188】

本実施形態に係る製造方法は、フィブロイン溶液の吐出前に紡糸液を濾過する工程（濾過工程）及び／又は吐出前に紡糸液を脱泡する工程（脱泡工程）を更に備えていてもよい。

【0189】

紡糸工程により得られたフィブロイン繊維は、そのまま任意の用途に用いられてよい。あるいは、フィブロイン繊維を延伸する工程（延伸工程）を更に行い、任意の延伸倍率に延伸したフィブロイン繊維を得て、得られたフィブロイン繊維を任意の用途に用いてもよい。

【0190】

すなわち、フィブロイン繊維の製造方法は、紡糸工程の後に、紡糸されたフィブロイン繊維を延伸する工程（延伸工程）を更に含んでよい。延伸方法としては、湿熱延伸、乾熱延伸等を挙げることができる。

【0191】

延伸方法は、強度の点で更に優れたフィブロイン繊維が得られる観点から、好ましくは湿熱延伸であり、より好ましくは、水中でフィブロイン繊維を延伸する水中延伸である。水中延伸時の水の温度は、２０℃以上、３０℃以上、４０℃以上、５０℃以上、又は６０℃以上であってよく、９０℃以下、８５℃以下、又は８０℃以下であってよい。

【0192】

乾熱延伸は、接触型の熱板、及び非接触型の炉などの装置を用いて行うことができるが、特に限定されるものではなく、繊維を所定の温度まで昇温させ、かつ所定の倍率で延伸が可能な装置であればよい。温度としては、例えば、１００℃～２７０℃であってよく、１４０℃～２３０℃であってよく、１４０℃～２００℃であってよく、１６０℃～２００℃であってよく、１６０℃～１８０℃であってよい。

【0193】

延伸工程における延伸倍率は、原料繊維（未延伸糸又は前延伸糸）に対して、例えば、１～３０倍であってよく、１～２５倍であってよく、１～２０倍であってよく、１～１５倍であってよく、１～１０倍であってよく、２～１０倍であってよく、２～８倍であってよく、２～６倍であってよく、２～４倍であってよく、２～３倍であってよい。

【0194】

延伸工程は、湿熱延伸（水中延伸）及び乾熱延伸を、それぞれ単独で行うものであってもよく、またこれらを多段で、又は組み合わせて行うものであってもよい。すなわち、延伸工程として、一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を乾熱延伸で行う、又は一段目延伸を湿熱延伸で行い、二段目延伸を湿熱延伸で行い、更に三段目延伸を乾熱延伸で行う等、湿熱延伸及び乾熱延伸を適宜組み合わせて行うことができる。

【0195】

延伸工程を経たフィブロイン繊維の最終的な延伸倍率の下限値は、原料繊維（未延伸糸又は前延伸糸）に対して、例えば、１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、又は９倍のうちの何れかであってよい。延伸工程を経たクモ糸フィブロイン繊維の最終的な延伸倍率の上限値は、例えば、４０倍、３０倍、２０倍、１５倍、１４倍、１３倍、１２倍、１１倍、又は１０倍のうちの何れかであってよい。また、例えば、最終的な延伸倍率は３～４０倍であってよく、３～３０倍であってよく、５～３０倍であってよく、５～２０倍であってよく、５～１５倍であってよく、５～１３倍であってよい。ただし、延伸倍率は、所望する繊維の太さ、機械物性などの特性が得られる範囲であれば限定されるものではない。

【0196】

延伸工程の前又は後に、必要に応じて、繊維に対して、帯電抑制性、収束性及び潤滑性等を付与する目的で油剤を付与してもよい。付与する油剤の種類及び付与する量等は、特に限定されるものではなく、繊維を使用する用途、繊維の取扱い性等を考慮し適宜調整することができる。

【0197】

〔製品〕
本実施形態に係る製品は、上述したフィブロイン繊維を含む各種の製品であってよい。製品としては、例えば、繊維、糸、布帛、編み物、組み物、不織布、紙、及び綿を挙げることができる。繊維としては、例えば、長繊維、短繊維、モノフィラメント、又はマルチフィラメント等を挙げることができ、糸としては、紡績糸、撚糸、仮撚糸、加工糸、混繊糸、又は混紡糸等を挙げることができる。さらに、これらの繊維や糸から、織物等の布帛、編物、組み物、若しくは不織布等、紙及び綿等を製造することができる。これらの製品は、公知の方法により製造することができる。

【実施例】

【0198】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【0199】

〔改変フィブロインの製造〕
（１）発現ベクターの作製
ネフィラ・クラビペス（Ｎｅｐｈｉｌａ ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来のフィブロイン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｐ４６８０４．１、ＧＩ：１１７４４１５）の塩基配列及びアミノ酸配列に基づき、配列番号４０を有する改変クモ糸フィブロイン（以下、「ＰＲＴ９６６」ともいう。）を設計した。なお、配列番号４０で示されるアミノ酸配列は、ネフィラ・クラビペス由来のアミノ酸配列に対して、なお、配列番号４０で示されるアミノ酸配列は、疎水度の向上を目的として、配列番号７で示されるアミノ酸配列中に存在する２０個のドメイン配列の領域を２回繰り返した配列中のＱＱを全てＶＦに置換し、かつ残りのＱをＩに置換した配列を有し、さらにＮ末端に配列番号１１で示されるアミノ酸配列(タグ配列及びヒンジ配列) が付加されている。

【0200】

次に、設計した配列番号４０でアミノ酸配列を有する改変クモ糸フィブロインＰＲＴ９６６をコードする核酸を合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。当該核酸をクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、それぞれタンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。

【0201】

（２）改変フィブロインの発現
（１）で得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を形質転換した。当該形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ_６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ_６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。

【0202】

【表4】

【0203】

当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ_６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。

【0204】

【表5】

【0205】

生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、改変フィブロインを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とする改変フィブロインサイズのバンドの出現により、目的とする人造構造タンパク質の発現を確認した。

【0206】

（３）改変フィブロインの精製
ＩＰＴＧを添加してから２時間後に回収した菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の菌体を約１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に懸濁させ、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製）で細胞を破砕した。破砕した細胞を遠心分離し、沈殿物を得た。得られた沈殿物を、高純度になるまで２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。洗浄後の沈殿物を１００ｍｇ／ｍＬの濃度になるように８Ｍ グアニジン緩衝液（８Ｍ グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ リン酸二水素ナトリウム、２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で懸濁し、６０℃で３０分間、スターラーで撹拌し、溶解させた。溶解後、透析チューブ（三光純薬株式会社製のセルロースチューブ３６／３２）を用いて水で透析を行った。透析後に得られた白色の凝集タンパク質を遠心分離により回収し、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収することにより、改変フィブロイン（ＰＲＴ９６６）を得た。

【0207】

［フィブロイン溶液（ドープ液）の調製］
＜実施例１－１～１－３＞
得られた改変フィブロインを溶媒中に２０質量％となるように溶解させ、フィブロイン溶液（ドープ液）を調製した。溶媒としては、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ、沸点：５８℃）に、第２成分としてギ酸（沸点：１０１℃）を表６に示す質量比で混合した溶媒を用いた。

【0208】

＜参考例１－１～１－３＞
第２成分としてアセトン（沸点：５７℃）を表６に示す質量比で混合した以外は、実施例１－１～１－３と同様にしてフィブロイン溶液（ドープ液）を調製した。

【0209】

＜比較例１＞
溶媒としてＨＦＩＰのみを用いた以外は、実施例１－１～１－３と同様にしてフィブロイン溶液（ドープ液）を調製した。

【0210】

［フィブロイン繊維の作製］
実施例１－１～１－３、参考例１－１～１－３及び比較例１の各フィブロイン溶液を、当該溶液を充填した紡糸用シリンジ先端部に取りつけたΦ０．２５ｍｍ，長さ１２．７ｍｍ又は２５．４ｍｍのノズルを通して吐出した。形成された糸は、ノズル直下５０ｃｍに配置した第１ローラーにて、１．０ｍ／分又は２．５ｍ／分の速度で巻取り、同じ速度で第２ローラーを介して、巻取り機で巻き取った。このようにして作製したフィブロイン繊維は、恒温恒湿環境（温度２０±２℃，相対湿度６５±２％）にて保管した。

【0211】

［フィブロイン繊維の評価］
相対湿度６５％の条件で引張り試験機（ＩＮＳＴＲＯＮ３３４２）を用いて、得られたフィブロイン繊維の引張強度を測定した。引張強度は、溶媒としてＨＦＩＰのみを用いた場合（比較例１）の引張強度を１００としたときの相対値により評価した。当該相対値を表６に示す。

【0212】

また、得られた繊維について、同日又は２０℃、６５％ＲＨの環境下に１日置いた後、水中延伸を試みた。水中延伸では、送り出しローラー及び巻取ローラーを具備する連続延伸機を用い、延伸時の水の温度を２０℃、繊維が水中に浸漬している長さを３０ｃｍとし、延伸倍率１倍から３倍の条件とした。延伸直後に６０℃のホットローラーに巻き付け乾燥を行ってから、巻取り機で巻き取った。水中延伸の適性について、以下の基準で評価した。結果を表６に示す。
Ａ：水中延伸は可能であり、延伸後の繊維を５分間以上にわたって収集できた。
Ｂ：水中延伸は可能であり、延伸後の繊維を５分間未満だけ収集できた。
Ｃ：水中延伸は可能であったが、延伸後の繊維を収集できなかった。
Ｄ：水中延伸は不可能であった。

【0213】

【表6】

【0214】

表６から分かるように、ＨＦＩＰにＨＦＩＰより沸点の高い溶媒を混合した溶媒を用いた実施例では、ＨＦＩＰのみを用いた比較例や、ＨＦＩＰにＨＦＩＰより沸点の低い溶媒を混合した溶媒を用いた参考例に比べて、引張強度が大幅に向上している。また、実施例は、水中延伸の適性の点でも優れている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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