特許 7459010 Ｔｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチド、ならびに標的濃縮の改善およびオフターゲット選択の低減のためのベイト

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-22

(45)【発行日】2024-04-01

(54)【発明の名称】Ｔｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチド、ならびに標的濃縮の改善およびオフターゲット選択の低減のためのベイト

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20240325BHJP

   C12Q 1/6813 20180101ALI20240325BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20240325BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20240325BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240325BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

C12Q1/6813 Z

C12Q1/6851 Z

C12Q1/686 Z

C12Q1/6869 Z

【請求項の数】 16

(21)【出願番号】P 2021052809

(22)【出願日】2021-03-26

(62)【分割の表示】P 2018208639の分割

【原出願日】2013-07-03

(65)【公開番号】P2021104031

(43)【公開日】2021-07-26

【審査請求日】2021-04-22

(31)【優先権主張番号】61/667,919

(32)【優先日】2012-07-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/745,435

(32)【優先日】2012-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510288529

【氏名又は名称】インテグレイテツド・デイー・エヌ・エイ・テクノロジーズ・インコーポレイテツド

(73)【特許権者】

【識別番号】515002735

【氏名又は名称】ファンデーション・メディスン・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001173

【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マーク・アーロン・ベールケ

(72)【発明者】

【氏名】ジョン・ロバート・ヘブンス

(72)【発明者】

【氏名】スコット・ダニエル・ローズ

(72)【発明者】

【氏名】ミルナ・ジャロス

(72)【発明者】

【氏名】ザカリー・ズビルコ

(72)【発明者】

【氏名】ドロン・リプソン

(72)【発明者】

【氏名】フランク・スー・ジュン

【審査官】長谷川 強

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１１／０２６３４３４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】米国特許出願公開第２０１２／００１００９１（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ１２Ｑ １／６８１３

Ｃ１２Ｑ １／６８５１

Ｃ１２Ｑ １／６８６

Ｃ１２Ｑ １／６８６９

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

末端アダプターを有する所望の鋳型核酸の選択方法における使用のためのオリゴヌクレオチドであって、以下の一つから選択されるオリゴヌクレオチド、
配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２５、２７、２８、３２、３４および３６
またはその組み合わせ。

【請求項2】

末端アダプターが、１５個のヌクレオチドから７５個のヌクレオチドのサイズ範囲を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

末端アダプターがバーコードドメインを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

請求項１～３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む、末端アダプターを有する所望の鋳型核酸の選択方法における使用のためのキット。

【請求項5】

請求項１に記載のオリゴヌクレオチドであって、
該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＴｍ増強基を含み、少なくとも１つのＴｍ増強基が、ロックド核酸基、二環式核酸基、Ｃ５修飾ピリミジン、ペプチド核酸基およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーであって、少なくとも１つのＴｍ増強基が１．４℃から２５℃を含む範囲の増強Ｔｍ値を提供する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

オリゴヌクレオチドが、所望の鋳型の少なくとも１つの配列に相補的である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

オリゴヌクレオチドが、ブロッカーまたはベイトから選択される少なくとも１つのメンバーを含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

ロックド核酸基または二環式核酸基が、シトシン、アデニンおよびチミンからなる群から選択される核酸塩基を含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

オリゴヌクレオチドがブロッカーを含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項10】

ブロッカーが、所望の鋳型核酸の末端における少なくとも１つの配列に対する配列相補性を有する、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項11】

ブロッカーが、複数のヌクレオチドを有するバーコードドメインをさらに含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項12】

複数のヌクレオチドが、連続して位置する５個から１２個のヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

バーコードドメインが、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、およびこれらの組合せから選択される群から選択される少なくとも１つのメンバーを核酸塩基として有するヌクレオチドを含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項14】

オリゴヌクレオチドからのポリメラーゼ指向性合成を防止する、３’末端修飾をさらに含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項15】

３’末端修飾が、３’－デオキシヌクレオチド、２’，３’－ジデオキシヌクレオチドまたは３’－スペーサーＣ３基を含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項16】

３’－デオキシヌクレオチド、２’，３’－ジデオキシヌクレオチドまたは３’－スペーサーＣ３基から選択される３’末端修飾をさらに含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９により、２０１２年７月３日に出願され、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＲＥＤＵＣＩＮＧ ＯＦＦ－ＴＡＲＧＥＴ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ」という名称である米国仮出願第６１／６６７，９１９号、および２０１２年１２月２１日に出願され、「Ｔ_Ｍ－ＥＮＨＡＮＣＥＤ ＢＬＯＣＫＩＮＧ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＡＮＤ ＢＡＩＴＳ ＦＯＲ ＩＭＰＲＯＶＥＤ ＴＡＲＧＥＴ ＥＮＲＩＣＨＭＥＮＴ ＩＮ ＭＡＳＳＩＶＥＬＹ ＰＡＲＡＬＬＥＬ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＳ」という名称である米国仮出願第６１／７４５，４３５号からの優先権の利益を請求し、これら両方の内容は参照によりこれらの全体を本明細書に組み込む。

【0002】

この発明は、修飾オリゴヌクレオチド組成物、ならびに核酸選択および配列決定のための方法におけるこれらの使用に関する。特に、本発明は、ブロッカーおよびベイトとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチド、ならびに標的濃縮の改善およびオフターゲット選択の低減のための他の試薬に属する。オリゴヌクレオチド組成物および試薬は、次世代配列決定用途のための核酸鋳型を調製するための強力な用途を見出す。

【背景技術】

【0003】

核酸ハイブリダイゼーションは、核酸の同定、選択および配列決定に属するバイオテクノロジー応用において重要な役割を有する。標的材料としてゲノム核酸を用いる配列決定用途は、高複合混合物から目的の核酸標的を選択することを要求する。配列決定努力の質は、選択プロセスの効率に依存し、これはさらに、核酸標的が非標的配列に対して、どのぐらい良好に濃縮され得るかにかかっている。

【0004】

ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡなど核酸の複合プールから所望の配列を濃縮するために、様々な方法が使用されてきた。これらの方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、分子反転プローブ（ＭＩＰ）、またはハイブリッド形成による配列捕捉（「ハイブリッド捕捉」；例えば、Ｍａｍａｎｏｖａ，Ｌ．、Ｃｏｆｆｅｙ，Ａ．Ｊ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｅ．、Ｋｏｚａｒｅｗａ，Ｉ．、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｅ．Ｈ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｈｏｗａｒｄ，Ｅ．、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．（２０１０）「Ｔａｒｇｅｔ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１１１－１１８を参照されたい。）が挙げられる。ハイブリッド捕捉は、この方法が、他の方法と比較して、より少ない標的核酸の酵素増幅または操作手順を必要とすることにおいて他の方法を超える利点を提供する。ハイブリッド捕捉方法は、結果として最終の配列決定ライブラリーに、より少ないエラーを導入する。この理由のため、ハイブリッド捕捉方法は、核酸の複合プールから所望の配列を濃縮するための好ましい方法であり、次世代配列決定（ＮＧＳ）用途において鋳型を調製するのに理想的である。

【0005】

ＮＧＳ用途は、通常、使用されるＮＧＳプラットフォームに依存して、長いゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを、１００－３，０００ｂｐ長のサイズ分布を有するより小さい断片サイズに無作為に切断することに関与する。ＤＮＡ末端は、酵素的に処理されてライゲーションを容易にし、ユニバーサルＤＮＡアダプターは、末端にライゲートされて、その結果得られるＮＧＳ鋳型を提供する。末端アダプター配列がプライマーハイブリダイゼーションのためのユニバーサル部位を提供して、所望のＤＮＡ標的のクローン拡大が達成され、ＮＧＳ用途において使用される自動化配列決定プロセスに導入され得る。ハイブリッド捕捉方法は、目的の特異的配列が濃縮されている例えば３×１０^９塩基（ヒトゲノム）から１０^３から１０^８塩基のずっと小さいサブセットまでのランダムＤＮＡ断片のプールの複雑性を低減すると意図される。このプロセスの効率は、出発複合プールからの所望のＤＮＡ配列のために達成される捕捉および濃縮の質に直接的に関係する。

【0006】

ＮＧＳ用途は、典型的に、以下の方式における濃縮のハイブリッド捕捉方法を使用する。ＮＧＳ鋳型の調製プールは熱変性され、捕捉プローブオリゴヌクレオチド（「ベイト」）のプールと混合される。ベイトは、標的ゲノム内で目的の領域にハイブリダイズするように設計されており、通常、６０－２００塩基長であり、さらに、これらのプローブの後続の捕捉を可能にするリガンドを含有するように修飾される。１つの共通の捕捉方法は、ベイト上にビオチン基（単数または複数）を組み込む。ハイブリダイゼーションが完了してＤＮＡ鋳型：ベイトハイブリッドを形成した後に、ベイトに対してだけ親和性を有する構成成分を用いて捕捉が行われる。例えば、ストレプトアビジン－磁性ビーズが使用されて、ハイブリダイズされているビオチン化ベイトのビオチン部分を、ＮＧＳ鋳型のプールからの所望のＤＮＡ標的に結合することができる。洗浄して非結合核酸を除去し、保持された材料の複雑性を低減する。保持された材料は、次いで、磁性ビーズから溶出され、自動化配列決定プロセスに導入される。

【0007】

ベイトとのＤＮＡハイブリダイゼーションは極めて特異的であり得るが、望まれない配列が、ハイブリッド捕捉方法の完了に続く濃縮プール中に残る。これらの望まれない配列の最も大きい部分は、ベイトに対する相補性を有さないＮＧＳ鋳型とそれを有するＮＧＳ鋳型との間の所望されないハイブリダイゼーション事象により存在する。ハイブリッド捕捉方法において起こる所望されないハイブリダイゼーションの２つの型としては、以下の配列が挙げられる：（１）内在性ゲノムＤＮＡにおいて見出される高反復性ＤＮＡ要素；および（２）プールのＮＧＳ鋳型の各々に操作される末端アダプター配列。

【0008】

複合プールにおける１つのＤＮＡ断片中に存在する、Ａｌｕ配列またはＬＩＮＥ配列などの反復性の内在性ＤＮＡ要素は、別の非関連性ＤＮＡ断片中に存在する別の同様の要素にハイブリダイズすることができる。本来はゲノム内の非常に異なる位置に由来し得るこれらの断片は、ハイブリッド捕捉方法のハイブリダイゼーションプロセス中に連結される。これらのＤＮＡ断片の１つが、ベイトのための結合部位を含有する所望の断片を表すならば、望まれない断片は所望の断片と一緒に捕捉される。このクラスの望まれないＮＧＳ鋳型は、過剰な反復要素をハイブリダイゼーション反応に付加することによって低減され得る。最も共通して、ヒトのＣ_ｏｔ－１ ＤＮＡがハイブリダイゼーション反応に付加され、反応が、標的中のＡｌｕ、ＬＩＮＥおよび他の反復部位を結合させ、これに基づいて互いに相互作用するＮＧＳ鋳型の能力をブロックする。

【0009】

ハイブリッド捕捉中に回復される望まれないＮＧＳ鋳型の、より問題のあるクラスは、プールのＮＧＳ鋳型の各々の上で操作される末端アダプター配列間の相互作用から起こる。ＮＧＳ鋳型のプールは、典型的に、あらゆるＤＮＡ断片上に同一の末端アダプター配列を含有するので、アダプター配列は、ハイブリダイゼーション溶液中に非常に高い有効濃度（単数または複数）で存在する。その結果として、非関連性ＮＧＳ鋳型は、これらの末端を介して互いにアニールし、これによって、一緒に連結される別段の非関連性ＤＮＡ断片の「デイジー鎖」をもたらすことがある。それで、これらの連結断片の１つがベイトのための結合部位を含有するならば、全デイジー鎖が捕捉される。このやり方で、単一の所望の断片の捕捉が、多数の所望されない断片をもたらす恐れがあり、このことが、所望の断片の濃縮の全体的効率を低減する。このクラスの望まれない捕捉事象は、過剰な一本鎖アダプター配列をハイブリダイゼーション反応に付加することによって低減され得る。なお、過剰なアダプター配列を用いるいわゆるデイジー鎖捕捉事象を有効に低減するための能力は、所望の断片を捕捉するための効率が約５０％－６０％に制限される。

【0010】

ハイブリダイゼーション反応におけるＣ_ｏｔ－１ ＤＮＡおよびアダプターブロッキングオリゴヌクレオチドの使用にもかかわらず、混入する望まれないＤＮＡ断片の相当量がハイブリッド捕捉ステップ後の配列決定プールに残るが、なぜならば主に、ブロッキング方法が完全に成功していないからである。したがって、目的の標的のより大きな部分および興味対象でないより少ない標的を配列決定することに供給源を充てることができるように、捕捉効率を改善するとともに所望されない配列からの混入を低減する必要がある。

【0011】

したがって、オフターゲット核酸相互作用は、捕捉プローブ、例えばオリゴヌクレオチドベイトに対するハイブリダイゼーション（例えば、溶液ハイブリダイゼーション）によって、標的核酸の選択の効率を制限する恐れがある。オフターゲット選択は、例えば、ハイブリダイゼーション捕捉および／またはアーチファクト的ハイブリッド捕捉の収率減少の１つ以上をもたらすことがあり、これが順じて、後続のステップ、例えば配列決定における非効率に至る。

【0012】

オフターゲット選択は、ハイブリッド選択のストリンジェンシー条件が低減される場合、例えば、より低い核酸溶融温度を有する標的：捕捉物二重鎖（例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖と比較してのＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖）のために選択する場合に典型的に増加される。したがって、オフターゲット配列の捕捉は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいてよりも問題であり得る。

【0013】

典型的に、ライブラリーメンバーとしては、ライブラリー挿入物、しばしば、目的の遺伝子からの配列のセグメント、例えば、配列決定するためのセグメントが挙げられる。メンバーがオンターゲットであるならば、ライブラリー挿入物は、捕捉プローブと二重鎖を形成する。典型的に、ライブラリーメンバーとしては、１つ以上の非標的配列も挙げられる。これらは典型的に、目的の遺伝子の部分ではなく、むしろアダプター配列、増幅プライマーもしくは増幅タグ、またはバーコードタグである。捕捉プローブハイブリダイズ化ライブラリーメンバーの非標的配列は、反応混合物における他の配列との二重鎖形成によって、所望されない配列、例えばオフターゲットライブラリーメンバーの選択に至る恐れがある。理論によって束縛されることを望まないが、オンターゲットライブラリーメンバーとオフターゲット配列との間の鎖状体形成は、オフターゲット配列の選択をもたらす恐れがある。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0014】

【文献】Ｍａｍａｎｏｖａ，Ｌ．、Ｃｏｆｆｅｙ，Ａ．Ｊ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ｅ．、Ｋｏｚａｒｅｗａ，Ｉ．、Ｔｕｒｎｅｒ，Ｅ．Ｈ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｈｏｗａｒｄ，Ｅ．、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．およびＴｕｒｎｅｒ，Ｄ．Ｊ．（２０１０）「Ｔａｒｇｅｔ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ７：１１１－１１８

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

オフターゲット核酸の選択を最小化するため、例えば、捕捉プローブで二重鎖を形成しないライブラリーメンバーの選択を最小化するための方法および組成物が、本明細書において開示されている。非標的配列、例えばアダプター媒介選択を低減する方法および組成物が本明細書において開示されている。

【課題を解決するための手段】

【0016】

（発明の要旨）
一態様において、本発明は、少なくとも１個のＴ_ｍ増強基を有するオリゴヌクレオチドを含む、所望の鋳型核酸の選択方法におけるオリゴヌクレオチドに関する。第１の観点において、オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド捕捉方法などの選択方法において有用である。第２の観点において、オリゴヌクレオチドは、所望の鋳型核酸として、鋳型の集団から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第３の観点において、オリゴヌクレオチドは、所望の鋳型の少なくとも１つの配列に対して実質的に相補的である。第４の観点において、オリゴヌクレオチドは、ブロッカーまたはベイトから選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第５の観点において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＴ_ｍ増強基として、ロックド核酸基、二環式核酸基、Ｃ５修飾ピリミジン、ペプチド核酸基、およびこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第６の観点において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＴ_ｍ増強基として、ロックド核酸基、二環式核酸基、またはこれらの組合せの１つを含む。第７の観点において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＴ_ｍ増強基として、ロックド核酸基または二環式核酸基を含む。第７の観点の好ましい実施形態として、オリゴヌクレオチドは、ロックド核酸基または二環式核酸基として、シトシンおよびアデニンの混合物ならびにシトシンおよびチミンの混合物を含めて、シトシン、アデニンおよびチミンからなる群から選択される核酸塩基を有する。第９の観点において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１個のＴ_ｍ増強基として、約１．４℃から約２５℃を含む範囲の最適な増強Ｔ_ｍ値を提供するものを含む。第１０の観点において、オリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３２、３４および３６からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第１１の観点において、オリゴヌクレオチドは、ブロッカーを含む。これらの観点の一つの好ましい実施形態において、ブロッカーは、所望の鋳型核酸の末端における少なくとも１つの配列に対する実質的な配列相補性を有する。この好ましい実施形態のさらなる精巧化において、ブロッカーは、複数のヌクレオチドを有するバーコード（またはインデックス）ドメインを含む。この観点のさらなる実施形態において、複数のヌクレオチドとしては、実質的に連続して位置する約５個から約１２個のヌクレオチドが挙げられる。別の実施形態において、バーコードドメインは、核酸塩基として、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、３－ニトロピロール、５－ニトロインドールおよびこれらの組合せから選択される群から選択される少なくとも１つのメンバーを有するヌクレオチドを含む。第１２の観点において、オリゴヌクレオチドは、所望の鋳型核酸の選択方法における改善を提供する。この観点の一つの好ましい実施形態において、改善は、所望されない鋳型核酸に対して所望の鋳型核酸の濃縮の改善からなる。なお別の実施形態において、濃縮の改善は、少なくとも６５％の濃縮を含む。第１３の観点において、オリゴヌクレオチドは、３’末端修飾をさらに含む。この観点において、３’末端修飾の好ましい実施形態は、オリゴヌクレオチドからのポリメラーゼ指向性合成を防止する。別の観点において、３’末端修飾としては、とりわけ２’，３’－ジデオキシヌクレオチド、３’－スペーサーＣ３基が挙げられる。

【0017】

第２の態様において、本発明は、鋳型核酸の集団から所望の鋳型核酸を選択する方法に関する。方法は、２つのステップを含む。第１のステップは、鋳型核酸の集団と、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチドとを接触させて、混合物を形成することである。第２のステップは、混合物から所望の鋳型核酸を単離することを含む。第１の観点において、方法は、接触ステップの一部として、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのほとんど最適な増強Ｔ_ｍ値の温度で混合物をインキュベートするサブステップを提供する。この観点の第１の好ましい実施形態において、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドは、複数のＴ_ｍ増強基を含む。これに関して、複数のＴ_ｍ増強基は、約２個から約２５個のＴ_ｍ増強基を含む。さらなる実施形態は、複数のＴ_ｍ増強基がロックド核酸基または二環式核酸基を含むことを提供する。これらの実施形態の好ましい態様としては、シトシン、アデニンおよびチミンからなる群から選択される核酸塩基を有するロックド核酸基または二環式核酸基の特色が挙げられる。第２の観点において、方法は、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドとして、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３２、３４および３６からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含む。第３の観点において、方法は、ブロッカーを含むＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを提供する。この観点の第１の好ましい実施形態において、ブロッカーは、鋳型核酸の集団の各メンバーの末端における少なくとも１つの配列に対する実質的な配列相補性を有する。なお別の好ましい実施形態において、ブロッカーは、複数のヌクレオチドを有するバーコードドメインをさらに含む。一部の実施形態において、複数のヌクレオチドとしては、実質的に連続して位置する約５個から約１２個のヌクレオチドが挙げられる。他の実施形態において、バーコードドメインとしては、核酸塩基としてアデニン、チミン、シトシン、グアニン、またはユニバーサル塩基、例えばイノシン、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール、およびこれらの組合せから選択される群から選択される少なくとも１つのメンバーを有するヌクレオチドが挙げられる。第３の観点において、この方法は、接触ステップとして、所望の鋳型核酸と所望されない鋳型核酸との間の複合体形成の実質的阻害をもたらすという目標を有する。第４の観点において、方法は、所望の鋳型核酸を単離するステップとして、２つの追加のステップを含む。第１のステップは、所望の核酸と第２のオリゴヌクレオチドとの間にハイブリッド複合体を形成することである。第２のステップは、混合物からハイブリッド複合体を分離することである。この第４の観点に関して、第２のオリゴヌクレオチドは、ベイトを含む。特定の実施形態において、ベイトは、所望の鋳型核酸内の配列に対する実質的な配列相補性を有する配列を含む。他の実施形態において、ベイトは、複数のＴ_ｍ増強基を含む。なお他の実施形態において、ベイトは、ハイブリッド複合体の選択をできるようにするための共有結合修飾を含む。これらの後者実施形態の一部として、共有結合修飾は、ビオチン化された基である。なお他の実施形態は、アビジンまたはストレプトアビジンで固定化された固体支持体と接触されているハイブリッド複合体を提供する。

【0018】

第３の態様において、本発明は、大規模平行配列決定を行う方法に関する。方法は、４つのステップを含む。第１のステップは、鋳型核酸のライブラリー集団を調製することである。第２のステップは、鋳型核酸のライブラリー集団と、ブロッカーとしての少なくとも１つのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチド、ベイトとしての複数のオリゴヌクレオチド、およびＣ_ｏｔ－１ＤＮＡとを接触させて、混合物を形成することである。第３のステップは、混合物から複数の所望の鋳型核酸を単離することである。第４のステップは、複数の所望の鋳型核酸を配列決定することである。ベイトとしての複数のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つのメンバーは、複数の所望の鋳型核酸の少なくとも１つのメンバー内の配列に対する実質的相補性を有する。第１の観点において、方法は、鋳型核酸のライブラリー集団のメンバーを含み、各々は、約１５個のヌクレオチドから約７５個のヌクレオチドのサイズ範囲を有する少なくとも１つの同一の末端アダプター配列を含む。第２の観点において、方法は、鋳型核酸のライブラリー集団の少なくとも１つの同一の末端アダプター配列に対する実質的な配列相補性を有するブロッカーを含む。第３の観点において、方法は、少なくとも１つの同一の末端アダプター配列として、バーコードドメインを含む。第４の観点において、方法は、少なくとも１つの同一の末端アダプター配列に対する実質的な配列相補性を有するブロッカーを提供する。第５の観点において、方法は、接触ステップとして、少なくとも１つのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのほとんど最適な増強Ｔ_ｍ値の温度で混合物をインキュベートするステップを含む。第６の観点において、方法は、少なくとも１つのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドが、ブロッカーとして、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３２、３４および３６からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含むことを提供する。第７の観点において、方法は、混合物から複数の所望の鋳型核酸を単離するステップが、２つのステップを含むことを提供する。第１のステップは、複数の所望の鋳型核酸と、ベイトとしての複数のオリゴヌクレオチドとの間に、複数のハイブリッド複合体を形成することである。第２のステップは、混合物から複数のハイブリッド複合体を分離することである。第８の観点において、方法は、ベイトとしての複数のオリゴヌクレオチドが、複数のＴ_ｍ増強基を含むことを提供する。この観点の実施形態において、各ベイトは、ベイトを含むハイブリッド複合体の選択を可能にするための共有結合修飾を含む。この観点のさらなる実施形態において、共有結合修飾は、ビオチン化された基である。この観点の別の実施形態として、複数のハイブリッド複合体は、アビジンまたはストレプトアビジンで固定化されている固体支持体と接触される。

【0019】

別の態様において、本発明は、核酸を選択するまたはハイブリダイゼーション反応におけるオフターゲット核酸選択を低減する方法を特色とする。ハイブリダイゼーション反応は、固相または溶液相ハイブリダイゼーションであり得る。この方法は、後続のプロセッシング、例えば配列決定のためのライブラリーメンバーの選択において使用され得る。

【0020】

この方法は、
（ａ）場合によって、複数の標的メンバー、例えば標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）メンバーを含むライブラリーを獲得し、ここで、１つ以上の標的メンバーは、挿入配列（例えば、目的の遺伝子のセグメント）および非標的核酸配列（例えば、アダプター配列）を含む、こと；ならびに
（ｂ）ライブラリーと、捕捉プローブ、例えばベイトセットまたは複数のベイトセット、およびブロッキングオリゴヌクレオチドとを接触させること
を含み、
（ｉ）ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ライブラリーメンバーの非標的核酸配列（例えば、アダプター配列）に相補的である、またはライブラリーメンバーの非標的核酸配列（例えば、アダプター配列）で二重鎖を形成し、
（ｉｉ）ブロッキングオリゴヌクレオチドとライブラリーメンバーの非標的核酸配列との間の結合相互作用に関連したパラメータについての値は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば他の相補的非標的核酸配列についての値より高く、これによってオフターゲット選択を最小化する。

【0021】

一実施形態において、方法は、選択ライブラリーメンバー（本明細書において「ライブラリーキャッチ」とも称される）を提供することをさらに含む。

【0022】

一実施形態において、方法は、捕捉プローブから選択ライブラリーメンバーを分離することをさらに含む。

【0023】

一実施形態において、方法は、選択ライブラリーメンバーの挿入物を配列決定すること、例えば、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個または５０個の遺伝子または核酸改変、例えば、本明細書に記載されている遺伝子または核酸改変からの挿入物を配列決定することをさらに含む。

【0024】

一実施形態において、結合相互作用に関連したパラメータについての値は、親和性、会合率、解離率の反比例、または核酸溶融温度（例えば、Ｔ_ｍ、ＤＮＡ鎖の半分が二重ヘリックス状態であり半分がランダムコイル状態である温度）についての値であってよい。

【0025】

一実施形態において、方法は、第１の非標的核酸配列、例えば第１のアダプター配列と二重鎖を形成する第１のブロッキングオリゴヌクレオチド、および場合によって、第２の非標的核酸配列、例えば第２のアダプター配列と二重鎖を形成する第２のブロッキングオリゴヌクレオチドの使用を含む。オリゴヌクレオチドブロッカーのセットは、複数の異なるオリゴヌクレオチドブロッカーを含む。

【0026】

一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、反応における配列と、捕捉プローブに対して二重鎖化されるライブラリーメンバーの非標的配列との間の二重鎖の形成を阻害する（例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ライブラリーメンバーの連鎖状鎖の形成を阻害する。）。

【0027】

一実施形態において、ライブラリーメンバーは、挿入、例えばサブゲノム間隔、および非標的配列、例えば複数のライブラリーメンバーに共通の配列を含む。一実施形態において、挿入は、例えば腫瘍試料からの核酸からのサブゲノム配列であり、非標的配列は、非ゲノム的発生配列またはサブゲノム配列中に存在しない配列、例えば増幅タグまたはバーコーディングタグである。

【0028】

一実施形態において、ライブラリーメンバーまたは選択ライブラリーメンバーは、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個または５０個の遺伝子または核酸改変、例えば本明細書に記載されている遺伝子または核酸改変からのサブゲノム間隔を含む。

【0029】

一実施形態において、複数のライブラリーメンバー、または選択ライブラリーメンバー、例えば、Ｘ個の（ここで、Ｘは、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）ライブラリーメンバー、または選択ライブラリーメンバーは、挿入の５’末端に第１の非標的配列を有し、挿入の３’末端に第２の非標的配列を有する。

【0030】

一実施形態において、非標的配列としては、複数の非標的配列中に存在する非標的配列、例えば増幅のための配列、および独特である非標的配列、例えばバーコードが挙げられる。ライブラリーのメンバーの典型的に一部、最も実質的に全て、または全ては、共通の非標的配列を含む。実施形態において、ライブラリーまたは選択ライブラリーメンバーは、共通の非標的配列を有する少なくともＸ個のメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）を含む。

【0031】

一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）の非標的核酸配列と二重鎖を形成し、この二重鎖は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば非標的配列の相補体によって形成される二重鎖のＴ_ｍより高いＴ_ｍを有する。一実施形態において、修飾ブロッキングオリゴヌクレオチド二重鎖のより高い核酸溶融温度は、非修飾ブロッキングオリゴヌクレオチド二重鎖の核酸溶融温度より約５℃から約２５℃、またはこれ以上（例えば、２℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、またはこれ以上）高い。一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドとライブラリーメンバーの非標的核酸配列との間の二重鎖についてのＴ_ｍは、非標的核酸配列およびこの正確な相補体の二重鎖についてのＴ_ｍより高い。

【0032】

他の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば非標的配列の相補体の会合率より高い、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）の非標的核酸配列に対する会合率を有する。一実施形態において、より高い会合率は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列の会合率の約２倍から１０倍超（例えば、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、またはこれ以上）である。

【0033】

なお他の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば非標的配列の相補体の解離率より低い、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）の非標的核酸配列に対する解離率を有する。一実施形態において、より低い解離率は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列の解離率の約２倍から１０倍超（例えば、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、またはこれ以上）である。

【0034】

一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さは、バックグラウンド核酸に対して、ライブラリーメンバー（例えば、アダプター配列）の非標的核酸配列のためのブロッキングオリゴヌクレオチドの結合相互作用における増加をもたらす。

【0035】

一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドと少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）の非標的核酸配列との間に形成される二重鎖は、非標的配列とこの相補体との間、例えば二本鎖化アダプターのワトソン鎖とクリック鎖との間に形成される二重鎖より長い。実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドと非標的核酸配列との間の二重鎖は、非標的配列とこの相補体との間、例えば二本鎖化アダプターのワトソン鎖とクリック鎖との間に形成される二重鎖より長い、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個または２０個のヌクレオチドである。

【0036】

一実施形態において、ブロッキングオリゴは、１個以上の非天然ヌクレオチドを含む。実施形態において、非天然ヌクレオチドを有するブロッキングオリゴヌクレオチドと、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）の非標的核酸配列との間に形成される二重鎖は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば他の相補的非標的核酸配列についての値より高い、結合相互作用に関連したパラメータ（例えば、親和性、会合率、解離率の反比例、またはＴ_ｍ）についての値を有する。例示的非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドが挙げられる。例示的修飾ヌクレオチド（例えば、修飾ＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド）としては、これらに限定されないが、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で修飾されているロックド核酸（ＬＮＡ）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、ペプチド結合によって連結されている反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位に構成されているＰＮＡ；低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン；および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。他の修飾ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、当技術分野において知られている。

【0037】

一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡであるまたはＲＮＡを含み、非標的核酸配列、例えばアダプターは、ＤＮＡであるまたはＤＮＡを含む。一実施形態において、非標的核酸配列は、複数のライブラリーメンバー、例えば少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、２、５、１０、２０、５０、１００、または２００に等しい。）に共通の配列であり、例えば増幅のため、例えばＰＣＲ、架橋ＰＣＲ、増幅のために使用され得る配列である。

【0038】

一実施形態において、非標的核酸配列は、増幅のため、例えばＰＣＲ、架橋ＰＣＲ、増幅のために使用され得る配列であり、バックグラウンド核酸は、第２の非標的配列である。

【0039】

一実施形態において、捕捉プローブは、ＤＮＡである（例えばＲＮＡに対立するものとして。）。実施形態において、捕捉プローブとしては、１種以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＤＮＡオリゴヌクレオチド）が挙げられる。

【0040】

一実施形態において、捕捉プローブはＲＮＡである。実施形態において、捕捉プローブとしては、１種以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＲＮＡオリゴヌクレオチド）が挙げられる。

【0041】

一実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、２０－８０、３０－８０、４０－８０、５０－８０、７０－８０、３０－７５、３０－６５、３０－５５、３０－４５、４０－７０、４０－６０、４０－５０、５０－６０、５０－７０、６０－７０ヌクレオチド長である。一実施形態において、ライブラリー挿入は、本明細書において他所で記載されている通り、５０－１０，０００、５０－１，０００、５０－５００、５０－２００、７７－１５０または１００－１５０ヌクレオチド長である。

【0042】

別の態様において、本発明は、例えば本明細書において記載されている通りの複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを含む調製物を特色とする。一実施形態において、調製物は：例えば本明細書において記載されている通りの複数のライブラリーメンバー；および例えば本明細書において記載されている通りの捕捉プローブの一方または両方をさらに含む。

【0043】

別の態様において、本発明は、例えば本明細書において記載されている通りの複数のブロッキングオリゴヌクレオチドを含むキットを特色とする。一実施形態において、キットは：例えば本明細書において記載されている通りの複数のライブラリーメンバー；および例えば本明細書において記載されている通りの捕捉プローブの一方または両方をさらに含む。実施形態において、構成成分は、別々の容器中に提供され、例えば、ブロッキングオリゴヌクレオチドは容器中に提供され、別の構成成分、例えば緩衝剤、または例えば本明細書において記載されている通りの複数のライブラリーメンバー、または例えば本明細書において記載されている通りの捕捉プローブは、異なる容器（単数または複数）中で提供される。

【0044】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載されている別の方法、例えば、本明細書に記載されている配列決定方法、本明細書に記載されているアラインメント方法、本明細書に記載されている変異呼び出し方法、または本明細書に記載されているベイトを使用する方法と組み合わされている、本明細書に記載されているオフターゲット核酸選択を低減する方法を特色とする。

【0045】

オフターゲット選択は、非標的配列の二重鎖がライブラリーメンバーの挿入配列および捕捉プローブの二重鎖より安定でないように、十分に短い非標的配列の使用によって最小化することもできる。したがって、別の態様において、本発明は、例えば固相または溶液ハイブリダイゼーションにおけるオフターゲット核酸選択を低減する方法を特色とする。この方法は、後続の配列決定のためのライブラリーメンバーの選択において使用され得る。

【0046】

この方法は、
（ａ）場合によって、複数の標的メンバー、例えば標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）メンバーを含むライブラリーを獲得し、ここで、標的メンバーの１つ以上は、挿入配列（例えば、目的の遺伝子のセグメント）および非標的核酸配列（例えば、アダプター配列）を含む、こと；ならびに
（ｂ）ライブラリーと、捕捉プローブ、例えばベイトセットまたは複数のベイトセットとを接触させること
を含み、
非標的配列は十分に短いので、挿入配列と捕捉プローブとの間の結合相互作用に関連したパラメータについての値は、非標的核酸配列およびこの相補体についてのその値より高く、これによってオフターゲット選択を最小化する。

【0047】

一実施形態において、この方法は、選択ライブラリーメンバー（本明細書において「ライブラリーキャッチ」とも称される）を提供することをさらに含む。

【0048】

一実施形態において、方法は、捕捉プローブから選択ライブラリーメンバーを分離することをさらに含む。

【0049】

一実施形態において、方法は、選択ライブラリーメンバーの挿入を配列決定すること、例えば、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個または５０個の遺伝子または核酸改変、例えば本明細書に記載されている遺伝子または核酸改変からの挿入を配列決定することをさらに含む。

【0050】

一実施形態において、結合相互作用に関連したパラメータについての値は、親和性、会合率、解離率の反比例、または核酸溶融温度（例えば、Ｔ_ｍ、ＤＮＡ鎖の半分が二重ヘリックス状態であり、半分がランダムコイル状態である温度）についての値であり得る。

【0051】

一実施形態において、ライブラリーメンバーは、挿入、例えばサブゲノム間隔、および非標的配列、例えば複数のライブラリーメンバーに共通の配列を含む。一実施形態において、挿入は、例えば腫瘍試料からの核酸からのサブゲノム配列であり、非標的配列は、非天然配列またはサブゲノム配列中に存在しない配列、例えば増幅タグまたはバーコーディングタグである。

【0052】

一実施形態において、ライブラリーメンバーまたは選択ライブラリーメンバーは、少なくとも２個、５個、１０個、１５個、２０個、３０個または５０個の遺伝子または核酸改変、例えば本明細書に記載されている遺伝子または核酸改変からのサブゲノム間隔を含む。

【0053】

一実施形態において、複数のライブラリーメンバーまたは選択ライブラリーメンバー、例えば、Ｘ個の（ここで、Ｘは、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）ライブラリーメンバーまたは選択ライブラリーメンバーは、挿入の５’末端に第１の非標的配列を有し、挿入の３’末端に第２の非標的配列を有する。

【0054】

一実施形態において、非標的配列としては、複数の非標的配列中に存在する非標的配列、例えば増幅のための配列、および独特である非標的配列、例えばバーコードが挙げられる。ライブラリーのメンバーの典型的に一部、最も実質的に全て、または全ては、共通の非標的配列を含む。実施形態において、ライブラリーまたは選択ライブラリーメンバーは、共通の非標的配列を有する少なくともＸ個のメンバー、（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）を含む。

【0055】

一実施形態において、挿入配列は、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）のための捕捉プローブと二重鎖を形成し、この二重鎖は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば非標的配列の相補体によって形成される二重鎖のＴ_ｍより高いＴ_ｍを有する。一実施形態において、挿入配列／捕捉プローブ二重鎖のより高い核酸溶融温度は、約５℃から２５℃、またはこれ以上（例えば、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、またはこれ以上）である。一実施形態において、挿入配列／捕捉プローブ間の二重鎖についてのＴ_ｍは、非標的核酸配列およびこの正確な相補体の二重鎖についてのＴ_ｍより高い。

【0056】

他の実施形態において、挿入配列は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば非標的配列の相補体の会合率より高い、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）のためのプローブに対する会合率を有する。一実施形態において、より高い会合率は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列の会合率の約２倍から１０倍超（例えば、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、またはこれ以上）である。

【0057】

なお他の実施形態において、挿入配列は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば非標的配列の相補体の解離率より低い、少なくともＸ個のライブラリーメンバー（ここで、Ｘは、１、２、５、１０、２０、５０、１００、２００、またはこれ以上に等しい。）のための捕捉プローブに対する解離率を有する。一実施形態において、より低い解離率は、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列の解離率の約２倍から１０倍超（例えば、２倍、４倍、６倍、８倍、１０倍、またはこれ以上）である。

【0058】

一実施形態において、非標的核酸配列は、増幅のため、例えばＰＣＲ、架橋ＰＣＲ、増幅のために使用され得る配列であり、バックグラウンド核酸は、第２の非標的配列である。

【0059】

一実施形態において、捕捉プローブは、ＤＮＡ（例えば、ＲＮＡに対立するものとして）である。一実施形態において、捕捉プローブはＲＮＡである。

【0060】

一実施形態において、ライブラリー挿入は、本明細書において他所で記載されている通り、５０－１０，０００、５０－１，０００、５０－５００、５０－２００、７７－１５０または１００－１５０ヌクレオチド長である。

【0061】

一実施形態において、方法は、本明細書において記載されている通り、ブロッキングオリゴヌクレオチドの使用をさらに含む。

【0062】

本発明の追加の特色および実施形態は、本明細書に記載されている。

【0063】

一実施形態において、この方法は、
（ｃ）例えば配列決定によって、例えば次世代配列決定方法を用いて、前記ライブラリーまたはライブラリーキャッチからの腫瘍メンバーからのサブゲノム間隔のための読み取りを獲得すること；
（ｄ）前記読み取りをアラインメントすること；および
（ｅ）予備選択ヌクレオチド位置、例えば、複数のサブゲノム間隔の各々、例えば複数の遺伝子の各々における予備選択ヌクレオチド位置に関する前記読み取りからのヌクレオチド値を割り当て（例えば、ベイズ方法を用いて、変異を呼び出す）、
これによって前記試料を分析すること
をさらに含む。

【0064】

一実施形態において、
（ｉ）Ｘヌクレオチド位置の各々は、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）もしくは（ｅ）の１つまたはこれらの組合せのための独特のセットの条件下で分析される（ここで、独特とは、他のＸ－１セットの条件と異なることを意味し、Ｘは、少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００または５００である。）。例えば、第１セットの条件、例えば本明細書に記載されている条件のセットは、例えば第１のサブゲノム間隔または遺伝子における第１のヌクレオチド位置のために使用され、第２セットの条件、例えば本明細書に記載されている条件の第２セットは、例えば第２のサブゲノム間隔または遺伝子における第２のヌクレオチド位置のために使用される；
（ｉｉ）Ｘ個のヌクレオチド位置の各々について、ヌクレオチド位置で発生し得る予備選択改変、例えば変異の特徴、例えば本明細書に記載されている特徴に応答して、ヌクレオチド位置は、独特のセットの条件下で分析される（ここで、独特とは、他のＸ－１セットの条件と異なることを意味し、Ｘは、少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００または５００である。）。例えば、第１のサブゲノム間隔におけるヌクレオチド位置で発生し得る予備選択改変、例えば変異の特徴、例えば本明細書に記載されている特徴に応答して、ヌクレオチド位置は第１セットの条件下で分析され、第２のサブゲノム間隔におけるヌクレオチド位置で発生し得る予備選択改変、例えば変異の特徴、例えば本明細書に記載されている特徴に応答して、ヌクレオチド位置は第２セットの条件下で分析される；
（ｉｉｉ）ここで、前記方法は、試料、例えば保存腫瘍試料上にて、少なくとも２、５、１０、２０、５０または１００個のサブゲノム間隔、例えば遺伝子におけるヌクレオチド位置に対する９５％、９８％もしくは９９％の感受性または特異性を可能にする条件下で行われる；または
（ｉｖ）ここで、方法は、
ａ）第１のサブゲノム間隔を配列決定して、約５００×またはこれより高い配列決定深度を提供すること、例えば、試料からの細胞の５％以下に存在する変異を配列決定すること；
ｂ）第２のサブゲノム間隔を配列決定して、約２００×以上、例えば約２００×－約５００×の配列決定深度を提供するステップこと、例えば、試料からの細胞の１０％以下に存在する変異を配列決定すること；
ｃ）第３のサブゲノム間隔を配列決定して、約１０－１００×の配列決定深度を提供すること、例えば、以下から選択される１つ以上のサブゲノム間隔（例えば、エクソン）を配列決定すること：ａ）異なる薬物を代謝するための患者の能力を説明し得る薬理ゲノミクス的（ＰＧｘ）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）またはｂ）患者を独特に同定する（例えば、指紋をとる。）ために使用され得るゲノムＳＮＰ；
ｄ）第４のサブゲノム間隔を配列決定して、約５－５０×の配列決定深度を提供すること、例えば、ゲノム転座またはインデルなどの構造ブレークポイントを検出すること
の１つ以上または全てを含む。例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するための５－５０×の配列対スパニング深度を必要とする。こうしたベイトセットは、例えば転座／インデル傾向の癌遺伝子を検出するために使用され得る；または
ｅ）第５のサブゲノム間隔を配列決定して、約０．１－３００×の配列決定深度を提供すること、例えばコピー数変化を検出すること。一実施形態において、配列決定深度は、コピー数変化を検出するために約０．１－１０×の配列決定深度を範囲とする。他の実施形態において、配列決定深度は、ゲノムＤＮＡのコピー数獲得／消失、またはヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を判定するために使用されるゲノムＳＮＰ／座位を検出するために約１００－３００×を範囲とする。

【0065】

例示的第１および第２のセットの条件は、
第１のベイトセットは、第１のサブゲノム間隔のために使用され、第２のベイトセットは、第２のサブゲノム間隔のために使用されること；
第１のアラインメント方法は、第１のサブゲノム間隔のための読み取りに適用され、第２のアラインメント方法は、第２のサブゲノム間隔のための読み取りに適用されること；
第１の変異呼び出し方法は、第１のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用され、第２の変異呼び出し方法は、第２のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用されること
を含む。

【0066】

一実施形態において、
第１のヌクレオチド位置は、第１のセットのベイト条件、第１のアラインメント方法、および第１の変異呼び出し方法を用いて分析され；
第２のヌクレオチド位置は、前記第１のセットのベイト条件、第２のアラインメント方法、および前記第１の変異呼び出し方法を用いて分析され；
第３のヌクレオチド位置は、前記第１のセットのベイト条件、前記第１のアラインメント方法、および第２の変異呼び出し方法を用いて分析されて、
各々が他の２つと比較して独特の条件下で分析される３つのヌクレオチド位置を提供する。

【0067】

一実施形態において、条件は、
第１のベイトセットは、第１のサブゲノム間隔のために使用され、第２のベイトセットは、第２のサブゲノム間隔のために使用されること；
第１のアラインメント方法は、第１のサブゲノム間隔のための読み取りに適用され、第２のアラインメント方法は、第２のサブゲノム間隔のための読み取りに適用されること；または
第１の変異呼び出し方法は、第１のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用され、第２の変異呼び出し方法は、第２のサブゲノム間隔のヌクレオチド位置に適用されること
を含む。

【0068】

例示的特徴としては、
（ｉ）改変が位置されている遺伝子または遺伝子の型、例えばオンコジーンもしくは腫瘍サプレッサー、予備選択バリアントもしくはバリアントの型、例えば変異体によってもしくは予備選択頻度の変異体によって特徴づけられる遺伝子もしくは遺伝子の型、または本明細書に記載されている他の遺伝子もしくは遺伝子の型；
（ｉｉ）改変の型、例えば置換、挿入、欠失または転座；
（ｉｉｉ）試料の型、例えば改変のために分析されるＦＦＰＥ試料；
（ｉｖ）評価される改変の前記ヌクレオチド位置またはこの付近における配列、例えば、サブゲノム間隔のためのミスアラインメント、例えばヌクレオチド位置またはこの付近における反復配列の存在の予想傾向に影響し得る配列；
（ｖ）例えば予備選択型の腫瘍における改変、例えば変異を示す読み取りを観察する事前（例えば、文献）予想；
（ｖｉ）単独での塩基呼び出しエラーによる改変を示す読み取りを観察する確率；または
（ｖｉｉ）改変を検出するのに所望される配列決定の予備選択深度
が挙げられる。

【0069】

一実施形態において、特徴は、配列決定されるヌクレオチドの同一性以外であり、すなわち、特徴は、配列がａまたはｔであるかどうかではない。

【0070】

一実施形態において、少なくともＸ個の遺伝子、例えば表１および１Ａからの少なくともＸ個の遺伝子、例えば表１および１Ａにおいて優先１のアノテーションを有する遺伝子からのサブゲノム間隔は、異なる条件下で分析され、Ｘは、２、３、４、５、１０、１５、２０または３０に等しい。

【0071】

一実施形態において、方法は、以下の１つ以上を含む：
（ｉ）方法、例えば上記の方法の（ｂ）は、本明細書に記載されているベイトセットの使用を含む；
（ｉｉ）方法、例えば上記の方法の（ｃ）は、サブゲノム間隔のセットまたは群のための読み取り、または本明細書に記載されている遺伝子のセットまたは群からの読み取りを獲得するステップを含む；
（ｉｉｉ）方法、例えば上記の方法の（ｄ）は、本明細書に記載されている複数のアラインメント方法の使用を含む；
（ｉｖ）方法、例えば上記の方法の（ｅ）は、本明細書に記載されている予備選択ヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てるための複数の方法の使用を含む；または
（ｖ）方法は、本明細書に記載されているサブゲノム間隔のセットにヌクレオチド値を割り当てることを含む。

【0072】

一実施形態において、方法は：（ｉ）および（ｉｉ）－（ｖ）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む。一実施形態において、方法は：（ｉｉ）ならびに（ｉ）および（ｉｉｉ）－（ｖ）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む。一実施形態において、方法は：（ｉｉｉ）ならびに（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む。一実施形態において、方法は：（ｉｖ）ならびに（ｉ）－（ｉｉｉ）および（ｖ）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む。一実施形態において、方法は：（ｖ）ならびに（ｉ）－（ｉｖ）の１つ、２つ、３つまたは全てを含む。
ベイト
本明細書に記載されている方法は、配列決定される標的核酸の選択のために、ベイト、例えば溶液ハイブリダイゼーションにおける使用のためのベイトの適切な選択によって、１つ以上の対象からの試料、例えば腫瘍試料からの多数の遺伝子および遺伝子産物の選択および／または配列決定を提供する。様々なサブゲノム間隔またはこれらのクラスのための選択の効率は、選択の予備選択効率を有するベイトセットに従って整合される。この項において使用される場合、「選択の効率」は、それが標的サブゲノム間隔（単数または複数）に従って調整される場合の配列カバレッジのレベルまたは深度を指す。

【0073】

したがって、方法（例えば、上記に列挙されている方法の要素（ｂ））は、ライブラリーと複数のベイトとを接触させて、選択メンバー（例えば、ライブラリーキャッチ）を提供することを含む。特定の実施形態において、方法は、ライブラリーとベイトまたはベイトセットの複数、例えば少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つとを接触させることを含み、ここで、前記複数の各ベイトまたはベイトセットは、選択（複数の他のベイトセットに対立するものとして。）の独特の予備選択効率を有する。例えば、各独特のベイトまたはベイトセットは、配列決定の独特の深度を提供する。「ベイトセット」という用語は、本明細書で使用される場合、１つのベイトまたは複数のベイト分子を集合的に指す。

【0074】

一実施形態において、複数における第１のベイトセットの選択の効率は、複数における第２のベイトセットの効率と少なくとも２倍異なる。一実施形態において、第１および第２のベイトセットは、少なくとも２倍異なる配列決定の深度を提供する。

【0075】

別の実施形態において、方法は、以下のベイトセットの１つまたは複数とライブラリーとを接触させることを含む：
ａ）サブゲノム間隔を含む充分なメンバーを選択して、約５００×以上の配列決定深度を提供する、例えば、試料からの細胞の５％以下に存在する変異を配列決定する、ベイトセット；
ｂ）サブゲノム間隔を含む充分なメンバーを選択して、約２００×以上、例えば約２００×から－約５００×の配列決定深度を提供する、例えば、試料からの細胞の１０％以下に存在する変異を配列決定する、ベイトセット；
ｃ）サブゲノム間隔を含む充分なメンバーを選択して、約１０－１００×の配列決定深度を提供する、例えば、以下から選択される１つ以上のサブゲノム間隔（例えば、エクソン）を配列決定する、ベイトセット：ａ）異なる薬物を代謝するための患者の能力を説明することができる薬理ゲノミクス的（ＰＧｘ）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、またはｂ）患者を独特に同定する（例えば、指紋をとる。）ために使用され得るゲノムＳＮＰ；
ｄ）サブゲノム間隔を含む充分なメンバーを選択して、約５－５０×の配列決定深度を提供する、例えば、ゲノム転座またはインデルなどの構造ブレークポイントを検出するベイトセット。例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために５－５０×の配列対スパニング深度を必要とする。こうしたベイトセットは、例えば転座／インデル傾向の癌遺伝子を検出するために使用され得る；または
ｅ）サブゲノム間隔を含む充分なメンバーを選択して、約０．１－３００×の配列決定深度を提供する、例えば、コピー数変化を検出する、ベイトセット。

【0076】

一実施形態において、配列決定深度は、コピー数変化を検出するために約０．１－１０×の配列決定深度の範囲である。他の実施形態において、配列決定深度は、ゲノムＤＮＡのコピー数獲得／消失またはヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を判定するために使用されるゲノムＳＮＰ／座位を検出するために約１００－３００×の範囲である。こうしたベイトセットは、例えば増幅／欠失傾向の癌遺伝子を検出するために使用され得る。配列決定深度のレベル（例えば、配列決定深度のＸ倍レベル）は、本明細書で使用される場合、二重読み取り、例えばＰＣＲ二重読み取りの検出および除去後の読み取り（例えば、独特の読み取り）のカバレッジのレベルを指す。

【0077】

一実施形態において、ベイトセットは、１つ以上の再編成を含有するサブゲノム間隔、例えばゲノム再編成を含有するイントロンを選択する。こうした実施形態において、ベイトセットは、選択効率を増加させるために反復性配列がマスクされるように設計されている。再編成が公知の接合配列を有するような実施形態において、相補的ベイトセットは、選択効率を増加させるために接合配列に設計することができる。

【0078】

実施形態において、方法は、２つ以上の異なる標的カテゴリーを捕捉するように設計されているベイトの使用を含み、各カテゴリーは、異なるベイト設計戦略を有する。実施形態において、本明細書において開示されているハイブリッド捕捉方法および組成物は、標的配列（例えば、標的メンバー）の定義されたサブセットを捕捉し、標的配列の相同カバレッジを提供し、他方でこのサブセットの外側でカバレッジを最小化する。一実施形態において、標的配列は、ゲノムＤＮＡからの全エキソーム、またはこの選択サブセットを含む。本明細書において開示されている方法および組成物は、複合標的核酸配列（例えば、核酸ライブラリー）についてのカバレッジの異なる深度およびパターンを達成するため異なるベイトセットを提供する。

【0079】

一実施形態において、この方法は、核酸ライブラリーの選択メンバー（例えば、ライブラリーキャッチ）を提供することを含む。この方法は、
複数のメンバー、例えば標的核酸メンバー（例えば、複数の腫瘍メンバー、参照メンバー、および／またはＰＧｘメンバーを含む）を含むライブラリー（例えば、核酸ライブラリー）を提供すること；
例えば溶液ベースの反応におけるライブラリーと、複数のベイト（例えば、オリゴヌクレオチドベイト）とを接触させて、複数のベイト／メンバーハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成すること；
前記ハイブリダイゼーション混合物から複数のベイト／メンバーハイブリッドを、例えば前記ハイブリダイゼーション混合物と前記複数のベイト／メンバーハイブリッドの分離を可能にする結合実体とを接触させることによって分離し、
これによって、ライブラリーキャッチ（例えば、ライブラリーからの核酸分子の選択されたまたは濃縮されたサブグループ）を提供すること
を含む、複数のベイトは、以下の２つ以上を含む：
ａ）低い頻度、例えば約５％以下で出現する改変（例えば、１つ以上の変異）（すなわち、試料からの細胞の５％は、これらのゲノムにおいて改変を持つ。）に対する高いレベルの感受性を可能にするために最も深いカバレッジが必要とされる高レベルの標的（例えば、遺伝子、エクソンまたは塩基などのサブゲノム間隔を含む１つ以上の腫瘍メンバー）を選択する第１のベイトセット。一実施形態において；第１のベイトセットは、約５００×以上の配列決定深度を必要とする改変（例えば、点変異）を含む腫瘍メンバーを選択する（例えば、それに相補的である。）；
ｂ）ａ）における高レベルの標的より高い頻度、例えば約１０％の頻度で出現する改変（例えば、１つ以上の変異）（すなわち、試料からの細胞１０％は、これらのゲノムにおける改変を持つ。）に対する高いレベルの感受性を可能にするために高いカバレッジが必要とされる中レベルの標的（例えば、遺伝子、エクソンまたは塩基などのサブゲノム間隔を含む１つ以上の腫瘍メンバー）を選択する第２のベイトセット。一実施形態において；第２のベイトセットは、約２００×以上の配列決定深度を必要とする改変（例えば、点変異）を含む腫瘍メンバーを選択する（例えば、それに相補的である。）；
ｃ）高いレベルの感受性を可能にするために、例えばヘテロ接合性対立遺伝子を検出するために低中程度のカバレッジが必要とされる低レベルの標的（例えば、遺伝子、エクソンまたは塩基などのサブゲノム間隔を含む１つ以上のＰＧｘメンバー）を選択する第３のベイトセット。例えば、ヘテロ接合性対立遺伝子の検出は、高い検出信頼性を確保するために１０－１００×の配列決定深度を必要とする。一実施形態において、第３のベイトセットは、以下から選択される１つ以上のサブゲノム間隔（例えば、エクソン）を選択する：ａ）異なる薬物を代謝するための患者の能力を説明することができる薬理ゲノミクス的（ＰＧｘ）単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、またはｂ）患者を独特に同定する（例えば、指紋をとる。）ために使用され得るゲノムＳＮＰ；
ｄ）例えばゲノム転座またはインデルなどの構造ブレークポイントを検出するために低中程度のカバレッジが必要とされる第１のイントロン標的（例えば、イントロン配列を含むメンバー）を選択する第４のベイトセット。例えば、イントロンブレークポイントの検出は、高い検出信頼性を確保するために５－５０×の配列対スパニング深度を必要とする。前記第４のベイトセットは、例えば転座／インデル傾向の癌遺伝子を検出するために使用され得る；または
ｅ）コピー数変化を検出するための能力を改善するために低密度のカバレッジが必要とされる第２のイントロン標的（例えば、イントロンメンバー）を選択する第５のベイトセット。例えば、いくつかの末端のエクソンの１コピー欠失の検出は、高い検出信頼性を確保するために０．１－３００×のカバレッジを必要とする。一実施形態において、カバレッジ深度は、コピー数変化を検出するために約０．１－１０×からを範囲とする。他の実施形態において、カバレッジ深度は、ゲノムＤＮＡのコピー数獲得／消失またはヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を判定するために使用されるゲノムＳＮＰ／座位を検出するため、約１００－３００×からを範囲とする。前記第５のベイトセットは、例えば、増幅／欠失傾向の癌遺伝子を検出するために使用され得る。

【0080】

前述のベイトセットの２つ、３つ、４つ、またはこれ以上の任意の組合せ、例えば、第１および第２のベイトセット；第１および第３のベイトセット；第１および第４のベイトセット；第１および第５のベイトセット；第２および第３のベイトセット；第２および第４のベイトセット；第２および第５のベイトセット；第３および第４のベイトセット；第３および第５のベイトセット；第４および第５のベイトセット；第１、第２および第３のベイトセット；第１、第２および第４のベイトセット；第１、第２および第５のベイトセット；第１、第２、第３、第４のベイトセット；第１、第２、第３、第４および第５のベイトセットなどの組合せが使用され得る。

【0081】

一実施形態において、第１、第２、第３、第４または第５のベイトセットの各々は、選択（例えば、捕捉）の予備選択効率を有する。一実施形態において、選択の効率についての値は、ａ）－ｅ）による全て５つのベイトの少なくとも２つ、３つ、４つについて同じである。他の実施形態において、選択の効率についての値は、ａ）－ｅ）による全て５つのベイトの少なくとも２つ、３つ、４つについて異なる。一部の実施形態において、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全て５つのベイトセットは、異なる予備選択効率値を有する。

【0082】

例えば、選択の効率についての値は、以下の１つ以上から選択される：
（ｉ）第１の予備選択効率は、少なくとも約５００×以上の配列決定深度である選択の第１の効率についての値を有し、例えば、選択の第２、第３、第４または第５の予備選択効率を超える、選択の効率についての値を有する（例えば、選択の第２の効率についての値より約２－３倍超；選択の第３の効率についての値より約５－６倍超；選択の第４の効率にてついての値より約１０倍超；選択の第５の効率についての値より約５０から５０００倍超）；
（ｉｉ）第２の予備選択効率は、少なくとも約２００×以上の配列決定深度である選択の第２の効率についての値を有し、例えば、選択の第３、第４または第５の予備選択効率を超える、選択の効率についての値を有する（例えば、選択の第３の効率についての値より約２倍超；選択の第４の効率についての値より約４倍超；選択の第５の効率についての値より約２０から２０００倍超）；
（ｉｉｉ）第３の予備選択効率は、少なくとも約１００×以上の配列決定深度である、選択の第３の効率についての値を有し、例えば、選択の第４または第５の予備選択効率を超える、選択の効率についての値を有する（例えば、選択の第４の効率についての値より約２倍超；選択の第５の効率についての値より約１０から１０００倍超）；
（ｉｖ）第４の予備選択効率は、少なくとも約５０×以上の配列決定深度である、選択の第４の効率についての値を有し、例えば、選択の第５の予備選択効率を超える、選択の効率についての値を有する（例えば、選択の第５の効率についての値より約５０から５００倍超）；または
（ｖ）第５の予備選択効率は、少なくとも約１０×から０．１×の配列決定深度である、選択の第５の効率についての値を有する。

【0083】

特定の実施形態において、選択の効率についての値は、以下の１つ以上によって修正されている：異なるベイトセットの示差表示、ベイトサブセットの示差重なり、示差ベイトパラメータ、異なるベイトセットの混合、および／または異なる型のベイトセットを使用すること。

【0084】

例えば、選択の効率（例えば、各ベイトセット／標的カテゴリーの相対配列カバレッジ）における変動は、以下の１つ以上を改変することによって調整され得る：
（ｉ）異なるベイトセットの示差表示－所定の標的（例えば、標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計は、より多い／より少ない数のコピーに含まれることにより、相対的な標的カバレッジ深度を増強／低減することができる；
（ｉｉ）ベイトサブセットの示差重なり－所定の標的（例えば、標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計に、隣接しているベイト間のより長いまたはより短い重なりが含まれることにより、相対的な標的カバレッジ深度を増強／低減することができる；
（ｉｉｉ）示差ベイトパラメータ－所定の標的（例えば、標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計に、配列修飾／より短い長さが含まれることにより、捕捉効率を低減し、相対的な標的カバレッジ深度を低下させることができる；
（ｉｖ）異なるベイトセットの混合－異なる標的セットを捕捉するように設計されているベイトセットは、異なるモル比で混合されることにより、相対的な標的カバレッジ深度を増強／低減することができる；
（ｖ）異なる型のオリゴヌクレオチドベイトセットを使用すること－特定の実施形態において、ベイトセットは、以下を含むことができる：
（ａ）１つ以上の、化学的に（例えば、非酵素的に）合成された（例えば、個別に合成された）ベイト、
（ｂ）アレイに合成された１つ以上のベイト、
（ｃ）１つ以上の、酵素的に調製された、例えばインビトロで転写されたベイト；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／もしくは（ｃ）の任意の組合せ、
（ｅ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＤＮＡオリゴヌクレオチド）、
（ｆ）１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＲＮＡオリゴヌクレオチド）、
（ｇ）（ｅ）および（ｆ）の組合せ、または
（ｈ）上記の任意のものの組合せ。

【0085】

異なるオリゴヌクレオチド組合せは、異なる比、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：５０；１：１００または１：１０００などから選択される比で混合され得る。一実施形態において、化学的に合成されたベイト対アレイで発生されたベイトの比は、１：５、１：１０または１：２０から選択される。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然または非天然であり得る。特定の実施形態において、ベイトは、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含むことで、例えば溶融温度を増加させる。例示的非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドが挙げられる。例示的修飾ヌクレオチド（例えば、修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド）としては、これらに限定されないが、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分が、２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で修飾されている、ロックド核酸（ＬＮＡ）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えば、ペプチド結合によって連結されている反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位から構成されているＰＮＡ；低ＧＣ領域を捕捉するように修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）；架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン；および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。他の修飾ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、当技術分野において知られている。

【0086】

特定の実施形態において、標的配列（例えば、標的メンバー）の実質的に均一または均質のカバレッジが得られる。例えば、各ベイトセット／標的カテゴリー内で、カバレッジの均一性は、ベイトパラメータを修飾することによって、例えば以下の１つ以上によって最適化され得る：
（ｉ）ベイトの表示または重なりの増加／減少が使用されて、同じカテゴリーにおける他の標的に対して、不足して／過度にカバーされる標的（例えば、標的メンバー）のカバレッジを増強／低減することができる；
（ｉｉ）標的配列（例えば、高ＧＣ含有量配列）を捕捉するのが困難な低いカバレッジは、ベイトセットで標的化されている領域を拡大して、例えば隣接配列（例えば、ＧＣが豊富でない隣接配列）をカバーする；
（ｉｉｉ）ベイト配列を修飾して、ベイトの二次構造を低減し、選択のそれの効率を増強することができる；
（ｉｖ）ベイトの長さの修飾が使用されて、同じカテゴリー内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション動態を等しくすることができる。ベイトの長さは、直接的に（変動する長さを有するベイトを生成することによって）または間接的に（一貫した長さのベイトを生成すること、およびベイト末端を任意の配列と置き換えることによって）修飾され得る；
（ｖ）同じ標的領域（すなわち、前方向鎖および逆方向鎖）に対して異なる配向のベイトの修飾は、異なる結合効率を有することができる。各標的に対して最適なカバレッジを提供するいずれかの配向を有するベイトセットが選択され得る；
（ｖｉ）結合実体、例えば各ベイト上に存在する捕捉タグ（例えば、ビオチン）の量の修飾は、それの結合効率に影響することができる。特異的標的を標的にするベイトのタグレベルの増加／減少が使用されて、相対的な標的カバレッジを増強／低減することができる；
（ｖｉｉ）異なるベイトのために使用されるヌクレオチドの型の修飾が変化されて、標的に対する結合親和性に影響し、相対的な標的カバレッジを増強／低減することができる；または
（ｖｉｉｉ）例えばより安定な塩基対形成を有する修飾オリゴヌクレオチドベイトが使用されて、高ＧＣ含有量に対して低いまたは正常のＧＣ含有量の区域間の融解ハイブリダイゼーション動態を等しくすることができる。

【0087】

例えば、異なる型のオリゴヌクレオチドベイトセットが使用され得る。一実施形態において、選択の効率についての値は、異なる型のベイトオリゴヌクレオチドを使用することによって修飾されて、予備選択された標的領域を包含する。例えば、第１のベイトセット（例えば、１０，０００－５０，０００のＲＮＡまたはＤＮＡベイトを含むアレイベースのベイトセット）が使用されて、大きな標的区域（例えば、１－２ＭＢの合計標的区域）をカバーすることができる。第１のベイトセットは、第２のベイトセット（例えば、５，０００未満のベイトを含む、個別に合成されたＲＮＡまたはＤＮＡベイトセット）でスパイクされて、予備選択された標的領域（例えば、標的区域の目的のスパニングの選択サブゲノム間隔、例えば２５０ｋｂ以下）および／またはより高い二次構造、例えばより高ＧＣ含有量の領域をカバーすることができる。目的の選択サブゲノム間隔は、本明細書に記載されている遺伝子もしくは遺伝子産物、またはこれらの断片の１つ以上に対応することができる。第２のベイトセットは、所望のベイト重なりに依存して、約１－５，０００、２－５，０００、３－５，０００、１０－５，０００、１００－５，０００、５００－５，０００、１００－５，０００、１０００－５，０００、２，０００－５，０００のベイトを含むことができる。他の実施形態において、第２のベイトセットは、第１のベイトセット中にスパイクされた選択オリゴベイト（例えば、４００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２または１未満のベイト）を含むことができる。第２のベイトセットは、個別のオリゴベイトの任意の比で混合することができる。例えば、第２のベイトセットは、１：１の等モル比として存在する個別のベイトを含むことができる。代替として、第２のベイトセットは、異なる比（例えば、１：５、１：１０、１：２０）で存在する個別のベイトを含むことで、例えば、特定の標的の捕捉を最適化することができる（例えば、特定の標的は、他の標的と比較して、５－１０×の第２のベイトを有することができる。）。

【0088】

他の実施形態において、選択の効率は、等モルミックスのベイトを使用する場合に観察される示差配列捕捉効率を参照にしてベイトの相対的豊富度または結合実体の密度（例えば、ハプテンまたは親和性タグの密度）を調整することおよび次いで内部平準化群２に対して示差過剰の内部平準化群１を全体的ベイトミックスに導入することにより、群内（例えば、第１、第２または第３の複数のベイト）の個別のベイトの効率を平準化することによって調整される。

【0089】

一実施形態において、方法は、腫瘍メンバー、例えば腫瘍細胞からのサブゲノム間隔を含む核酸分子を選択するベイトセット（本明細書において、「腫瘍ベイトセット」とも称される。）を含む複数のベイトセットの使用を含む。腫瘍メンバーは、腫瘍細胞または癌細胞中に存在する、本明細書において記載されている通りの、腫瘍細胞、例えば変異型、野生型、ＰＧｘ、参照またはイントロンヌクレオチド配列中に存在する任意のヌクレオチド配列であってよい。一実施形態において、腫瘍メンバーは、低い頻度で出現する改変（例えば、１つ以上の変異）を含め、例えば、腫瘍試料からの細胞の約５％以下が、これらのゲノムにおける改変を持つ。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、腫瘍試料からの細胞の約１０％の頻度で出現する改変（例えば、１つ以上の変異）を含む。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、ＰＧｘ遺伝子または遺伝子産物からのサブゲノム間隔、イントロン配列、例えば本明細書において記載されている通りのイントロン配列、腫瘍細胞中に存在する参照配列を含む。

【0090】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載されているベイトセット、本明細書に記載されている個別のベイトセットの組合せ、例えば本明細書に記載されている組合せを特色とする。ベイトセット（単数または複数）は、指示書、標準物、緩衝剤もしくは酵素、または他の試薬を場合によって含むことができるキットの一部であってよい。

【0091】

遺伝子選択
分析のための予備選択されたサブゲノム間隔、例えば、遺伝子および他の領域のセットまたは群のためのサブゲノム間隔の群またはセットは、本明細書に記載されている。

【0092】

したがって、実施形態において、方法は、獲得された核酸試料からの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、またはこれ以上の遺伝子または遺伝子産物からのサブゲノム間隔を含むライブラリーメンバーの選択および／または配列決定を含み、ここで、遺伝子または遺伝子産物は、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、またはＴＰ５３から選択され、これによって、腫瘍試料を分析する。

【0093】

他の実施形態において、方法は、試料からの少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、またはこれ以上の遺伝子または遺伝子産物からのサブゲノム間隔を含むライブラリーメンバーの選択および／または配列決定を含み、ここで、遺伝子または遺伝子産物は、以下から選択される：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、またはＴＰ５３。

【0094】

別の実施形態において、以下のセットまたは群の１つのサブゲノム間隔が分析される。例えば、腫瘍または癌遺伝子もしくは遺伝子産物、参照（例えば、野生型）遺伝子または遺伝子産物、およびＰＧｘ遺伝子または遺伝子産物に関連したサブゲノム間隔は、腫瘍試料からのサブゲノム間隔の群またはセットを提供することができる。

【0095】

一実施形態において、方法は、腫瘍試料からのサブゲノム間隔のセットのライブラリーメンバーの選択および／または配列決定を含み、ここで、サブゲノム間隔は、以下の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３個または全てから選択される：
Ａ）以下の少なくとも５つ以上から選択される変異もしくは野生型遺伝子または遺伝子産物からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個、またはこれ以上のサブゲノム間隔：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＨＲＡＳ、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＮＴＲＫ３、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＴＣＨ１、ＰＴＣＨ２、ＰＴＥＮ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＳＭＯ、ＳＴＫ１１、ＳＵＦＵ、またはＴＰ５３；
Ｂ）以下の少なくとも５個以上から選択される変異もしくは野生型遺伝子または遺伝子産物からのサブゲノム間隔の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０個、またはこれ以上：ＡＢＬ２、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＡＰ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＢＬ、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＭ６Ａ、ＫＤＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ６、ＬＴＫ、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ２、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＫ、ＴＮＫＳ２、ＴＯＰ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、またはＷＴ１；
Ｃ）表１、１Ａ、２、３または４による遺伝子または遺伝子産物からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０個、またはこれ以上のサブゲノム間隔；
Ｄ）腫瘍または癌に関連した、例えば正または負の処置応答予測因子である、正または負の予後因子である、または腫瘍または癌の鑑別診断を可能にする遺伝子または遺伝子産物、例えば以下の１つ以上から選択される遺伝子または遺伝子産物からの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０個、またはこれ以上のサブゲノム間隔：ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＥＢＰＡ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＬＴ３、ＪＡＫ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＲＡＲＡ、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＭＡＰ２Ｋ４、ＮＯＴＣＨ１、およびＴＰ５３；
Ｅ）以下の１つ以上から選択される変異または野生型コドンを含む、少なくとも５、６、７、８、９、１０個、またはこれ以上のサブゲノム間隔：ＡＢＬ１遺伝子のコドン３１５；ＡＰＣのコドン１１１４、１３３８、１４５０または１５５６；ＢＲＡＦのコドン６００；ＣＴＮＮＢ１のコドン３２、３３、３４、３７、４１または４５；ＥＧＦＲのコドン７１９、７４６－７５０、７６８、７９０、８５８または８６１；ＦＬＴ３のコドン８３５；ＨＲＡＳのコドン１２、１３または６１；ＪＡＫ２のコドン６１７；ＫＩＴのコドン８１６；ＫＲＡＳのコドン１２、１３または６１；ＰＩＫ３ＣＡのコドン８８、５４２、５４５、５４６、１０４７、または１０４９；ＰＴＥＮのコドン１３０、１７３、２３３または２６７；ＲＥＴのコドン９１８；ＴＰ５３のコドン１７５、２４５、２４８、２７３または３０６（例えば、表１に示されているコドンの１つ以上を含む、少なくとも５、１０、１５、２０個、またはこれ以上サブゲノム間隔）。

【0096】

Ｆ）以下から選択される薬物代謝、薬物応答性、または毒性（この中で「ＰＧｘ」遺伝子とも称される。）の１つ以上に関連した遺伝子または遺伝子産物中に存在するサブゲノム間隔の変異もしくは野生型遺伝子または遺伝子産物（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））からのサブゲノム間隔の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個、またはこれ以上：ＡＢＣＢ１、ＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＤＰＹＤ、ＥＲＣＣ２、ＥＳＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＧＳＴＰ１、ＩＴＰＡ、ＬＲＰ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＭＴＨＦＲ、ＮＱＯ１、ＮＲＰ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＯＤ２、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＴＰＭＴ、ＴＹＭＳ、ＵＧＴ１Ａ１、またはＵＭＰＳ；
Ｇ）以下の１つ以上に関連した遺伝子または遺伝子産物中に存在するサブゲノム間隔の変異もしくは野生型ＰＧｘ遺伝子または遺伝子産物（例えば、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ））からのサブゲノム間隔の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０個、またはこれ以上：（ｉ）薬物で処置された癌患者のより良好な生存（例えば、パクリタキセル（例えば、ＡＢＣＢ１遺伝子）で処置された乳癌患者のより良好な生存）；（ｉｉ）パクリタキセル代謝（例えば、表２に示されている、異なる座位および変異でのＣＹＰ２Ｃ８遺伝子；ＣＹＰ３Ａ４遺伝子）；（ｉｉｉ）薬物に対する毒性（例えば、ＡＢＣＣ４遺伝子（表２）で見られる通りの６－ＭＰ毒性；ＤＰＹＤ遺伝子、ＴＹＭＳ遺伝子またはＵＭＰＳ遺伝子（表２）で見られる通りの５－ＦＵ毒性；ＴＭＰＴ遺伝子（表２）で見られる通りのプリン毒性；ＮＲＰ２遺伝子で見られる通りのダウノルビシン毒性；Ｃｌｏｒｆ１４４遺伝子、ＣＹＰ１Ｂ１遺伝子（表２））；または（ｉｖ）薬物に対する副作用（例えば、ＡＢＣＧ２遺伝子、ＴＹＭＳ遺伝子、ＵＧＴ１Ａ１遺伝子、ＥＳＲ１遺伝子およびＥＳＲ２遺伝子（表２））；
Ｈ）表３による少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１１０個、またはこれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座改変；
Ｉ）ここに明記されている癌型からの固形腫瘍試料における、表３による少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１１０個、またはこれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座改変；
Ｊ）表４による少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、またはこれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座改変；
Ｋ）ここに明記されている癌型からのヘム腫瘍試料における、表４による少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、またはこれ以上の遺伝子または遺伝子産物の転座改変；
Ｌ）表１－４から選択される少なくとも５個の遺伝子または遺伝子産物、ここで、例えば予備選択位置での対立遺伝子の変動は、腫瘍の予備選択型に関連し、前記対立遺伝子の変動は、前記腫瘍型における細胞の５％未満に存在する；
Ｍ）ＧＣが豊富な領域に埋め込まれている、表１、１Ａ－４から選択される少なくとも５個の遺伝子または遺伝子産物；または
Ｎ）癌を発生させる遺伝子（例えば、生殖系列リスク）因子を示す少なくとも５個の遺伝子または遺伝子産物（例えば、遺伝子または遺伝子産物は、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＥＧＦＲ、ＨＲＡＳ、ＫＩＴ、ＭＰＬ、ＡＬＫ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＮＦ１、ＮＦ２、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＶＨＬまたはＷＴ１の１つ以上から選択される。）。

【0097】

なお別の実施形態において、方法は、腫瘍試料からのサブゲノム間隔のセットを含むライブラリーメンバーの選択および／または配列決定を含み、ここで、サブゲノム間隔は、表１Ｂに記載されている改変の１、２、３、４、５、１０、１５個、または全てから選択される。

【0098】

一実施形態において、サブゲノム間隔は、カテゴリーＡ、Ｂ、Ｃ、ＤまたはＥの１つ以上に分類される改変を含む。

【0099】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料、例えば大腸、肺または乳房腫瘍の試料におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄの改変を含む。

【0100】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料、例えばメラノーマまたは大腸腫瘍の試料におけるＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋの改変を含む。

【0101】

なお他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料、例えばメラノーマ、大腸または肺腫瘍の試料におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅの改変を含む。

【0102】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料、例えば肺腫瘍試料におけるＢＲＡＦ Ｄ５９４Ｇの改変を含む。

【0103】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料、例えば乳房または大腸腫瘍の試料におけるＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒの改変を含む。

【0104】

なお他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料、例えば肺腫瘍試料におけるＥＧＦＲ Ｌ８５８ＲまたはＴ７９０Ｍの改変を含む。

【0105】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＥＲＢＢ２の改変、例えば乳房腫瘍試料におけるＥＲＢＢ２増幅を含む。

【0106】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＢＲＣＡ１の改変、例えば乳房腫瘍試料におけるＢＲＣＡ１二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0107】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＢＲＣＡ２の改変、例えば膵腫瘍試料におけるＢＲＣＡ２二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0108】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＡＴＭの改変、例えば乳房腫瘍試料におけるＡＴＭ二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0109】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＴＳＣの改変、例えば大腸腫瘍試料におけるＴＳＣ二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0110】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＰＴＥＮの改変、例えば乳房または大腸腫瘍の試料におけるＰＴＥＮ二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0111】

なお他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＶＨＬの改変、例えば腎腫瘍試料におけるＶＨＬ二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0112】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＡＴＲの改変、例えば乳房腫瘍試料におけるＡＴＲ二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0113】

他の実施形態において、サブゲノム間隔は、腫瘍試料におけるＭＹＣの改変、例えば乳房腫瘍試料におけるＭＹＣ二対立遺伝子の不活性化を含む。

【0114】

サブゲノム間隔のこれらのおよび他のセットおよび群は、本明細書において他所でより詳細に考察されている。

【図面の簡単な説明】

【0115】

【図1】ハイブリッド捕捉方法を用いる所望の鋳型の選択につながる鋳型ライブラリーの典型的な設定を描写している図である。

【図2A】１０２：１０２の二重鎖形成に好都合である温度条件下で鋳型２０３において見出される対応アダプター１０２配列にハイブリダイズするための、ブロッカーとしてオリゴヌクレオチド１０２を使用する従来のオリゴヌクレオチドブロッキング戦略を描写している図である。複数の鋳型２０３は、１つのオリゴヌクレオチドベイト２０４の結合および固定化支持体２０５上の捕捉試薬に対するそれの相互作用を介して捕捉されることに注目されたい。

【図2B】ＮＧＳ鋳型の複合プールからの望まれないＤＮＡ配列の同時選択がない、所望のＤＮＡ標的の濃縮のためのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドブロッキング戦略を描写する図である。ブロッカーとしてオリゴヌクレオチド１０２を使用するよりむしろ、戦略は、ブロッカーとしてＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチド２０２を使用して、２０２：１０２の二重鎖形成に好都合である温度条件下で鋳型２０３において見出される対応アダプター１０２配列にハイブリダイズする。２０２：１０２の二重鎖は、最適な増強Ｔ_ｍ値に近い温度で、１０２：１０２の二重鎖より好都合であるので、より少ない所望されない鋳型２０３は、１つのオリゴヌクレオチドベイト２０４の結合および固定化支持体２０５上の捕捉試薬に対するそれの相互作用を介して捕捉される。

【図3A】腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態の工程表描写を示す図である。試料受容、品質管理およびＤＮＡ単離のための実施形態の工程表描写を描写している。

【図3B】腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態の工程表描写を示す図である。ＤＮＡ品質管理およびライブラリー生成のための実施形態の工程表描写を描写している。

【図3C】腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態の工程表描写を示す図である。ハイブリッド捕捉および配列決定のための実施形態の工程表描写を描写している。

【図3D】腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態の工程表描写を示す図である。配列データ品質管理および変異呼び出しのための実施形態の工程表描写を描写している。

【図3E】腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態の工程表描写を示す図である。レポート生成のための実施形態の工程表描写を描写している。

【図3F】腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法の実施形態の工程表描写を示す図である。レポート生成の追加の詳細のための実施形態の工程表描写を描写している。

【図4】変異検出における事前予想および読み取り深度の影響を描写するグラフである。

【図5】１００個超の臨床的癌試料における変異頻度を描写する図である。

【図6】カバレッジヒストグラムの線状表示を示すグラフである。標的の数（ｙ軸）は、カバレッジ（ｘ軸）の関数として描写されている。線番号１は、個別合成のビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトでスパイクされたアレイ誘導のビオチン化ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトを含むベイトセット（本明細書において「ベイトセット番号１」と称される。）を使用するカバレッジを表す。線番号２は、アレイ誘導のビオチン化ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみを含むベイトセット（本明細書において「ベイトセット番号２」と称される。）を使用して得られたカバレッジを表す。ベイトセット番号２を使用する全体平均カバレッジは９２４であったが、一方、ベイトセット番号２を使用する高ＧＣ含有量（約６８％）の区域におけるカバレッジは７３であった。対照的に、ベイトセット番号１が使用された場合、全体カバレッジは約９１８であったが、カバレッジは、高ＧＣ含有量の区域における１８３に対して改善された。

【図7】アレイ誘導のビオチン化ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみ（「ベイトセット番号３」）を含むベイトセットと比較して、個別合成のビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみからなるベイトセット（ベイトセット番号１）および個別合成のビオチン化ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトでスパイクされたアレイ誘導のビオチン化ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトを含むベイトセット（「ベイトセット番号２」）を用いて検出されたカバレッジにおける均一性を比較しているカバレッジヒストグラムを示す図である。ベイトセットは、図７における番号１、２および３として示されている。カバレッジにおけるいくつかのギャップは、図７に描写されている通り、ベイトセット番号３を使用して検出されたが、ベイトセット番号１－２を使用して検出されなかった。

【図8】ライブラリーメンバーの非標的鎖状体の例示的立体配置を形成しているダイアグラムを例示する図である。非標的領域（例えば、「Ｐ５」および「Ｐ７」として描写されているアダプター）は、これらの相補的非標的鎖（それぞれ「ｒｃＰ５」および「ｒｃＰ７」として描写されている。）にハイブリダイズしていると示されている。ライブラリーメンバー標的挿入の相補的領域にハイブリダイズしているビオチン－タグ付けベイトが示されている。

【図9】標準的および延長されたブロッキングオリゴを使用する標的選択の百分率を描写している棒グラフを示す図である。

【図10】標準的または延長されたブロッカーを使用する捕捉結果を示すエクソンカバレッジヒストグラムを描写している図である。

【図11】１試料当たりの配列読み取りの数を、実施形態のハイブリッド捕捉相において使用されたブロッカーの異なる型の関数として描写している図である。図において左から右へ、非濃縮対照（すなわち、ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いない。）；「Ｐ７／Ｐ５」オリゴ（配列番号それぞれ８１および２３；「Ｐ７Ｃｏｍｐ ６ｘＩ／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８２および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８４および８５）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８６および８７）；「Ｐ７ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ」オリゴ（それぞれ配列番号８８および８９）；「Ｐ７ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９０および９１）；および「Ｐ７ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９２および９３）。

【図12】＞１×（すなわち、１倍超）でカバーされた標的区域の百分率を、実施形態のハイブリッド捕捉相において使用されたブロッカーの異なる型の関数として描写している図である。図において左から右へ、「Ｐ７／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８１および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ ６ｘＩ／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８２および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８４および８５）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８６および８７）；「Ｐ７ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ」オリゴ（それぞれ配列番号８８および８９）；「Ｐ７ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９０および９１）；および「Ｐ７ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９２および９３）；百分率は、２×、１０×、２０×および３０×でカバーされた標的区域の関数として表現されている（描写されている各々について左から右へ、試験されたブロッカー対合型。）。

【図13】標的上でアラインメントする配列読み取りの百分率を、実施形態のハイブリッド捕捉相において使用されたブロッカーの異なる型の関数として描写している図である。図において左から右へ、「Ｐ７／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８１および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ ６ｘＩ／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８２および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８４および８５）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８６および８７）；「Ｐ７ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ」オリゴ（それぞれ配列番号８８および８９）；「Ｐ７ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９０および９１）；および「Ｐ７ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９２および９３）。

【図14】オンターゲット配列の倍数濃縮を、実施形態のハイブリッド捕捉相において使用されたブロッカーの異なる型の関数として描写している図である。図において左から右へ、「Ｐ７／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８１および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ ６ｘＩ／Ｐ５」オリゴ（それぞれ配列番号８２および２３）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８４および８５）；「Ｐ７Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号８６および８７）；「Ｐ７ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ」 オリゴ（それぞれ配列番号８８ および８９）；「Ｐ７ Ｍｅｄ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｍｅｄ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９０および９１）；および「Ｐ７ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ ６ｘＩ／Ｐ５Ｃｏｍｐ Ｈｉｇｈ ＢＮＡ」オリゴ（それぞれ配列番号９２および９３）。

【図15】標的上での配列読み取りの百分率を実施形態のハイブリッド捕捉相において使用されたブロッカーの異なる型の関数として描写している図である。図において左から右へ、「０」オリゴは、ＢＮＡ修飾Ｔ_ｍ増強基を含有しない（それぞれ配列番号９４および９７）；「８」オリゴは、各ブロッカーオリゴにおいて８個のＢＮＡ修飾Ｔ_ｍ増強基を含有し（それぞれ配列番号９５および９８）；「２２」オリゴは、ブロッカーオリゴに依存して各ブロッカーオリゴにおいて１７個または２２個のＢＮＡ修飾Ｔ_ｍ増強基を含有し（それぞれ配列番号９６および９７）；ブロッカー群の各型についての個別の棒グラフは、非依存性複製アッセイを表す。

【発明を実施するための形態】

【0116】

特定の用語が最初に定義されている。追加の用語は明細書の全体にわたって定義されている。

【0117】

本明細書において使用される用語は、「オープン」用語として意図される（例えば、「含む」という用語は「含むが限定されない」と解釈されるべきであり、「有する」という用語は「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「挙げられる」という用語は「挙げられるが限定されない」と解釈されるべきである、など。）。

【0118】

さらに、「Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つ、など」に類似した慣例が使用される例において、一般にこうした構文は、当業者が慣例を理解するという意味において意図される（例えば、「Ａ、ＢおよびＣの少なくとも１つを有するシステム」は、これらに限定されないが、Ａを単独で、Ｂを単独で、Ｃを単独で、ＡおよびＢを一緒に、ＡおよびＣを一緒に、ＢおよびＣを一緒に、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを一緒に有するシステムを含む。）。２つ以上の代替の用語を表す実質的に任意の離接語および／または成句は、記載中または図中であろうと、用語の１つ、用語のいずれかまたは両方の用語を含むという可能性を企図すると理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解される。例えば、「ＡまたはＢ」という成句は、「ＡまたはＢ」あるいは「ＡおよびＢ」の可能性を含むと理解される。

【0119】

「から」「まで」「最大～まで」、「少なくとも」、「超」および「未満」などの全ての言語は、列挙されている数を含め、上記で考察されている通り下位範囲に引き続いて分けられ得る範囲を指す。

【0120】

範囲は、各個別メンバーを含む。したがって、例えば、１－３つのメンバーを有する群は、１つ、２つまたは３つのメンバーを有する群を指す。同様に、６つのメンバーを有する群は、１つ、２つ、３つ、４つまたは６つのメンバーを有する群、その他を指す。

【0121】

「あり得る」という法動詞は、１つ以上の選択肢の好ましい使用もしくは選択、または同一内に含有されているいくつかの記載の実施形態もしくは特色の中での選択を指す。同一に含有されている特別な実施形態または特色に関して、選択肢または選択が開示されていない場合、「あり得る」という法動詞は、同一に含有されている記載の実施形態もしくは特色の態様をどのように作製もしくは使用するのかに関する肯定的行為、または同一に含有されている記載の実施形態もしくは特色に関する特異的技術を使用するという確定的決定を指す。この後者の文脈において、「あり得る」という法動詞は、「できる」という助動詞と同じ意味および含意を有する。

【0122】

本明細書で使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つ超まで（例えば、少なくとも１つまで）を指す。

【0123】

「約」および「およそ」は、一般に、測定の性質または精度を前提として、測定された定量についてのエラーの許容程度を意味する。エラーの例示的程度は、所定の値または値の範囲の２０－２５パーセント（％）内、典型的に１０％内、より典型的に５％内である。

【0124】

「獲得する」または「獲得すること」は、用語が本明細書において使用される場合、物理的実体または値を「直接的に獲得すること」または「間接的に獲得すること」によって、物理的実体、または値、例えば数値の所有を得ることを指す。「直接的に獲得すること」は、物理的実体または値を得るためのプロセス（例えば、合成または分析の方法を行うこと）を行うことを意味する。「間接的に獲得すること」は、別の団体または供給源（例えば、物理的実体または値を直接的に獲得した第三者の実験室）から物理的実体または値を受容することを指す。物理的実体を直接的に獲得することは、物理的物質、例えば出発材料における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的変化は、２つまたは１つの出発材料から物理的実体を作製すること、物質を剪断または断片化すること、物質を分離または精製すること、２つ以上の別々の実体を混合物に組み合わせること、共有結合または非共有結合を切断または形成することを含む化学反応を行うことを含む。値を直接的に獲得することは、試料または別の物質における物理的変化を含むプロセスを行うこと、例えば、物質、例えば試料、分析物、または試薬における物理的変化を含む分析的プロセス（本明細書において「物理的分析」と称されることがある。）を行うこと、分析方法、例えば、以下の１つ以上を含む方法を行うことを含む：物質、例えば分析物、または別の物質からの断片もしくはこの他の誘導体を分離または精製すること；分析物、またはこの断片もしくは他の誘導体と、別の物質、例えば緩衝剤、溶媒または反応物とを組み合わせること；または分析物またはこの断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば分析物の第１原子と第２原子との間で共有結合または非共有結合を切断もしくは形成することによって変化させること；または試薬またはこの断片もしくは他の誘導体の構造を、例えば試薬の第１原子と第２原子との間で共有結合または非共有結合を切断もしくは形成することによって変化させること。

【0125】

「配列を獲得すること」または「読み取りを獲得すること」は、用語が本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の所有を得ることを指し、配列または読み取りを「直接的に獲得すること」または「間接的に獲得すること」によって得ることを指す。配列または読み取りを「直接的に獲得すること」は、配列決定方法（例えば、次世代配列決定（ＮＧＳ）方法）を行うことなど、配列を得るためのプロセス（例えば、合成または分析の方法を行うこと）を行うことを意味する。配列または読み取りを「間接的に獲得すること」は、別の団体または供給源（例えば、配列を直接的に獲得した第三者の実験室）から配列の情報または知識を受容すること、または配列を受容することを指す。獲得された配列または読み取りは、全配列である必要がなく、例えば、少なくとも１つのヌクレオチドを配列決定すること、または対象に存在する通りの本明細書において開示されている改変の１つ以上を同定する情報もしくは知識を得ることは、配列を獲得することに相当する。

【0126】

配列または読み取を直接的に獲得することは、物理的物質、例えば出発材料、例えば組織もしくは細胞の試料、例えば生検、または単離された核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）試料における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的変化は、２つ以上の出発材料から物理的実体を作製すること、ゲノムＤＮＡ断片などの物質を剪断または断片化すること；物質を分離または精製すること（例えば、組織から核酸試料を単離すること）；２つ以上の別々の実体を混合物に組み合わせること、共有結合または非共有結合を切断または形成することを含む化学反応を行うことを含む。値を直接的に獲得することは、上に記載されている通りの試料または別の物質における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。

【0127】

「試料を獲得すること」は、用語が本明細書において使用される場合、試料を「直接的に獲得すること」または「間接的に獲得すること」によって、試料、例えば、組織試料または核酸試料の所有を得ることを指す。「試料を直接的に獲得すること」は、試料を得るためのプロセス（例えば、外科手術または抽出などの物理的方法を行うこと）を行うことを意味する。「試料を間接的に獲得すること」は、別の団体または供給源（例えば、試料を直接的に獲得した第三者の実験室）から試料を受容することを指す。試料を直接的に獲得することは、物理的物質、例えば出発材料、例えば組織、例えばヒト患者における組織または患者から事前に単離された組織における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。例示的変化としては、出発材料から物理的実体を作製すること、組織を解剖または断片化すること；物質（例えば、試料組織または核酸試料）を分離または精製すること；２つ以上の別々の実体を混合物に組み合わせること；共有結合または非共有結合を切断または形成することを含む化学反応を行うことが挙げられる。試料を直接的に獲得することには例えば上に記載されている通りの、試料または別の物質における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。

【0128】

遺伝子または遺伝子産物（例えば、マーカー遺伝子または遺伝子産物）の、本明細書で使用される場合の「改変」または「改変された構造」は、正常または野生型の遺伝子と比較して、変異または遺伝子もしくは遺伝子産物内の変異、例えば遺伝子もしくは遺伝子産物の量または活性に影響する変異の存在を指す。改変は、正常または健常の組織または細胞（例えば、対照）における量、構造および／または活性と比較して、癌組織または癌細胞における量、構造および／または活性における改変であってよく、癌などの疾患状態を伴う。例えば、癌を伴うまたは抗癌治療に対する応答性の前兆となる改変は、正常の健常組織または細胞と比較して、癌組織または癌細胞における改変されたヌクレオチド配列（例えば、変異）、アミノ酸配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性、またはメチル化状態を有することができる。例示的変異としては、これらに限定されないが、点変異（例えば、サイレント、ミスセンスまたはナンセンス）、欠失、挿入、逆位、連結変異、重複、転座、染色体間および染色体内の再編成が挙げられる。変異は、遺伝子のコード領域または非コード領域中に存在することができる。特定の実施形態において、改変（単数または複数）は、再編成、例えば、１つ以上のイントロンまたはこの断片を含むゲノム再編成（例えば、５’－および／または３’－ＵＴＲにおける１つ以上の再編成）として検出される。特定の実施形態において、改変は、表現型、例えば癌表現型（例えば、癌リスク、癌進行、癌処置、または癌処置に対する抵抗性の１つ以上）と関連する（または関連しない）。一実施形態において、改変は、癌に対する遺伝子危険因子、陽性処置応答予測因子、陰性処置応答予測因子、陽性予後因子、陰性予後因子または診断因子の１つ以上と関連する。

【0129】

「ベイト」は、本明細書で使用される場合、ハイブリッド捕捉試薬の型である。ベイトは、標的核酸にハイブリダイズする（例えば、相補的である。）ことができ、これによっての標的核酸の捕捉を可能にする核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよい。一実施形態において、ベイトは、ＲＮＡ分子（例えば、天然のまたは修飾されたＲＮＡ分子）；ＤＮＡ分子（例えば、天然のまたは修飾されたＤＮＡ分子）、またはこれらの組合せである。他の実施形態において、ベイトとしては、例えば、ベイトおよびベイトにハイブリダイズされた核酸によって形成されたハイブリッドを結合実体に結合することによって捕捉および分離を可能にする結合実体、例えば親和性タグが挙げられる。一実施形態において、ベイトは、溶液相ハイブリダイゼーションに適当である。

【0130】

「ベイトセット」は、本明細書で使用される場合、１つ以上のベイト分子を指す。

【0131】

「結合実体」は、分析物に特異的に結合できる、分子タグが直接的または間接的に付着され得る任意の分子を意味する。結合実体は、各ベイト配列上の親和性タグであり得る。特定の実施形態において、結合実体は、アビジン分子またはハプテンもしくはこの抗原結合断片に結合する抗体などのパートナーに結合することによって、ハイブリダイゼーション混合物からのベイト／メンバーハイブリッドの分離を可能にする。例示的結合実体としては、これらに限定されないが、ビオチン分子、ハプテン、抗体、抗体結合断片、ペプチドおよびタンパク質が挙げられる。

【0132】

「相補的」は、２つの核酸鎖の領域間、または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルであるならば第１の領域に逆平行である第２の核酸領域の残基との特異的水素結合（「塩基対合」）を形成できることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンであるならば第１の鎖に逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対合できることが知られている。核酸の第１の領域は、２つの領域が逆平行様式で編成されている場合に第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対合できるならば、同じまたは異なる核酸の第２の領域に相補的である。特定の実施形態において、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、これによって、第１および第２の部分が逆平行様式で編成される場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合できる。他の実施形態において、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対合できる。

【0133】

「癌」または「腫瘍」という用語は、本明細書において相互交換可能に使用される。これらの用語は、非制御増殖、不死性、転移能、急速な成長率および増殖率、ならびに特定の特徴的形態学的特色など、癌原因細胞に典型的な特徴を所有する細胞の存在を指す。癌細胞は、しばしば腫瘍の形態であるが、こうした細胞は、動物内に単独で存在することができる、または白血病細胞などの非腫瘍原性癌細胞であり得る。これらの用語は、固形腫瘍、軟組織腫瘍、または転移巣を含む。本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、前悪性癌、ならびに悪性癌を含む。

【0134】

「しそうである」または「見込みの増加」は、本明細書で使用される場合、物品、物体、物または人間が生じる確率の増加を指す。したがって、１つの例において、処置に応答しそうである対象は、参照対象または対象の群に対して、処置に応答する確率の増加を有する。

【0135】

「しそうでない」は、参照に関して事象、物品、物体、物または人間が生じる確率の減少を指す。したがって、処置に応答しそうでない対象は、参照対象または対象の群に対して、処置に応答する確率の減少を有する。

【0136】

「対照メンバー」は、非腫瘍細胞からの配列を有するメンバーを指す。

【0137】

「インデルアラインメント配列セレクター」は、本明細書で使用される場合、予備選択インデルの場合において読み取りがアラインメントされるべき配列の選択を可能にするまたは指向するパラメータを指す。こうした配列の使用は、インデルを含む予備選択サブゲノム間隔の配列決定を最適化することができる。インデルアラインメント配列セレクターについての値は、予備選択インデルの関数、例えばインデルについての識別子である。一実施形態において、値は、インデルの同一性である。

【0138】

本明細書で使用される場合、「ライブラリー」という用語は、メンバーの収集物を指す。一実施形態において、ライブラリーとしては、核酸メンバーの収集物、例えば、全ゲノム、サブゲノム断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ、ＲＮＡ断片、またはこれらの組合せの収集物が挙げられる。一実施形態において、ライブラリーメンバーの一部分または全ては、非標的アダプター配列を含む。アダプター配列は、一方または両方の末端に位置され得る。アダプター配列は、例えば、配列決定方法（例えば、ＮＧＳ方法）に、増幅に、逆転写に、またはベクターへのクローニングに有用であり得る。

【0139】

ライブラリーは、メンバー、例えば標的メンバー（例えば、腫瘍メンバー、参照メンバー、ＰＧｘメンバー、またはこれらの組合せ）の収集物を含むことができる。ライブラリーのメンバーは、単一の個体からであり得る。実施形態において、ライブラリーは、１個超の対象（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０個、またはこれ以上の対象）からのメンバーを含むことができ、例えば、異なる対象からの２つ以上のライブラリーは、組み合わされて、１つ超の対象からのメンバーを有するライブラリーを形成することができる。一実施形態において、対象は、癌または腫瘍を有するまたは有するリスクがあるヒトである。

【0140】

「ライブラリーキャッチ」は、ライブラリーのサブセット、例えば、予備選択サブゲノム間隔、例えば予備選択ベイトとのハイブリダイゼーションによって捕捉された生成物が濃縮されたサブセットを指す。

【0141】

「メンバー」もしくは「ライブラリーメンバー」または他の同様の用語は、本明細書で使用される場合、ライブラリーのメンバーである核酸分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの組合せを指す。典型的に、メンバーは、ＤＮＡ分子、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡである。メンバーは、断片化された、例えば剪断された、または酵素調製されたゲノムＤＮＡであり得る。メンバーは、対象からの配列を含み、対象から誘導されたのではない配列、例えば、非標的配列、例えばアダプター配列、プライマー配列、または同定を可能にする他の配列、例えば「バーコード」または「インデックス」配列を含むこともできる。

【0142】

「次世代配列決定またはＮＧＳもしくはＮＧ配列決定」は、本明細書で使用される場合、高スループット様式において、個別核酸分子（例えば、単一分子配列決定における。）または個別核酸分子のためのクローン的に拡大されたプロキシのいずれかのヌクレオチド配列を決定する任意の配列決定方法を指す（例えば、１０^３つ、１０^４つ、１０^５つ超、またはこれ以上の分子が同時に配列決定される。）。一実施形態において、ライブラリーにおける核酸種の相対的豊富度は、配列決定実験によって生成されたデータにおけるそれらの同族配列の出現の相対的数をカウントすることによって概算され得る。次世代配列決定方法は、当技術分野において知られており、例えば、参照により本明細書に組み込むＭｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：３１－４６に記載されている。次世代配列決定は、試料における核酸の５％未満に存在するバリアントを検出することができる。

【0143】

本明細書において称される「ヌクレオチド値」は、予備選択ヌクレオチド位置を占有するまたは割り当てられるヌクレオチド（単数または複数）の同一性を表す。典型的なヌクレオチド値は：欠損（例えば、欠失）；追加（例えば、同一性を含むことができるまたは含むことができない１つ以上のヌクレオチドの挿入）；または存在（占有）；Ａ；Ｔ；Ｃ；またはＧを含む。他の値は、例えば、ＹがＡ、Ｔ、ＧまたはＣである場合にはＹでなくてよく；ＸがＴ、ＧまたはＣの１つまたは２つである場合にはＡまたはＸ；ＸがＡ、ＧまたはＣの１つまたは２つである場合にはＴまたはＸ；ＸがＴ、ＡまたはＣの１つまたは２つである場合にはＧまたはＸ；ＸがＴ、ＧまたはＡの１つまたは２つである場合にはＣまたはＸ；ピリミジンヌクレオチド；またはプリンヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド値は、ヌクレオチド位置における１個以上、例えば２個、３個または４個の塩基の頻度（または本明細書に記載されている他の値、例えば欠損または追加）であり得る。例えば、ヌクレオチド値は、ヌクレオチド位置におけるＡの頻度およびＧの頻度を含むことができる。

【0144】

「または」は、別段に文脈が明確に示していないかぎり、本明細書において「および／または」という用語を意味するために使用されるとともに相互交換可能に使用される。本明細書において一部の箇所における「および／または」という用語の使用は、別段に文脈が明確に示していないかぎり、「または」という用語の使用が「および／または」という用語と相互交換可能でないことを意味しない。

【0145】

「一次対照」は、腫瘍試料におけるＮＡＴ組織以外の非腫瘍組織を指す。血液は典型的な一次対照である。

【0146】

「再編成アラインメント配列セレクター」は、本明細書で使用される場合、予備選択再編成の場合において読み取りがアラインメントされるべき配列の選択を可能にするまたは指向するパラメータを指す。こうした配列の使用は、再編成を含む予備選択サブゲノム間隔の配列決定を最適化することができる。再編成アラインメント配列セレクターについての値は、予備選択再編成の関数、例えば再編成の識別子である。一実施形態において、値は再編成の同一性である。「インデルアラインメント配列セレクター」（本明細書において他所でも定義さている。）は、再編成アラインメント配列セレクターの一例である。

【0147】

「試料」、「組織試料」、「患者試料」、「患者細胞または組織試料」または「標本」は、各々、対象または患者の組織または循環細胞から得られる同様の細胞の収集物を指す。組織試料の供給源は、新たな凍結および／または保存された臓器、組織試料、生検もしくは吸引物からの固体組織；血液もしくは任意の血液構成要素；脳脊髄液、羊水、腹水もしくは間質液などの体液；または対象の妊娠もしくは発育における任意の時点からの細胞であってよい。組織試料は、保存料、抗凝固剤、緩衝剤、固定液、栄養素または抗生物質などの組織と本来天然に混合されていない化合物を含有することができる。一実施形態において、試料は、凍結試料としてまたはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織調製物として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えばＦＦＰＥブロックまたは凍結試料中に包埋され得る。

【0148】

一実施形態において、試料は腫瘍試料であり、例えば、１つ以上の前悪性細胞または悪性細胞を含む。特定の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、固形腫瘍、軟組織腫瘍または転移巣から獲得される。他の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、外科的周縁部からの組織または細胞を含む。別の実施形態において、試料、例えば腫瘍試料は、１つ以上の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）（例えば、血液試料から獲得されたＣＴＣ）を含む。

【0149】

「感受性」は、本明細書で使用される場合、配列の異質の集団における予備選択配列バリアントを検出するための方法の能力の尺度である。予備選択配列バリアントが試料における配列の少なくともＦ％として存在する試料を前提として、方法がＣ％の予備選択信頼度_、Ｓ％の確率で予備選択配列を検出することができるならば、方法はＦ％のバリアントに対してＳ％の感受性を有する。例として、予備選択バリアント配列が試料における配列の少なくとも５％として存在する試料を前提として、方法が９９％の予備選択信頼度、１０のうち９の確率で予備選択配列を検出することができるならば（Ｆ＝５％；Ｃ＝９９％；Ｓ＝９０％）、方法は５％のバリアントに対して９０％の感受性を有する。例示的感受性としては、Ｃ＝９０％、９５％、９９％および９９．９％の信頼レベルにて、Ｆ＝１％、５％、１０％、２０％、５０％、１００％で、配列バリアントについてＳ＝９０％、９５％、９９％の感受性が挙げられる。

【0150】

「特異性」は、本明細書で使用される場合、本当に生じる予備選択配列バリアントを配列決定アーチファクトまたは他の密接に関連した配列と区別するための方法の能力の尺度である。それは、誤った陽性検出を回避するための能力である。誤った陽性検出は、試料調製中に目的の配列に導入されたエラー、配列決定エラー、または偽遺伝子もしくは遺伝子ファミリーのメンバーのような密接に関連した配列の不注意な配列決定から起こり得る。Ｘ_Ｔｒｕｅ配列が本当にバリアントであるとともにＸ_{Ｎｏｔ ｔｒｕｅ}が本当にはバリアントでないＮ_{Ｔｏｔａｌ}配列の試料セットに適用される場合に、方法が、本当ではないバリアントの少なくともＸ％をバリアントでないとして選択するならば、方法は、Ｘ％の特異性を有する。例えば、５００個の配列が本当にバリアントであるとともに５００個が本当ではないバリアントである１，０００個の配列の試料セットに適用される場合に、方法が、５００個の本当ではないバリアント配列の９０％をバリアントでないとして選択するならば、方法は、９０％の特異性を有する。例示的特異性としては、９０％、９５％、９８％および９９％が挙げられる。

【0151】

「腫瘍核酸試料」は、本明細書で使用される場合、腫瘍または癌の試料からの核酸分子を指す。典型的に、それは、ＤＮＡ、例えば、ゲノムＤＮＡ、または腫瘍もしくは癌の試料からのＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡである。特定の実施形態において、腫瘍核酸試料は、精製または単離される（例えば、それは、それの天然状態から除去される。）。

【0152】

「対照」または「参照」の「核酸試料」は、本明細書で使用される場合、対照または参照の試料からの核酸分子を指す。典型的に、それは、ＤＮＡ、例えばゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡであり、遺伝子または遺伝子産物において改変または変動を含有しない。特定の実施形態において、参照または対照の核酸試料は、野生型または非変異型の配列である。特定の実施形態において、参照核酸試料は、精製または単離される（例えば、それは、それの天然状態から除去される。）。他の実施形態において、参照核酸試料は、同じまたは異なる対象からの非腫瘍試料、例えば血液対照、正常の隣接腫瘍（ＮＡＴ）、または任意の他の非癌性試料からである。

【0153】

核酸分子を「配列決定すること」は、分子における少なくとも１個のヌクレオチドの同一性を決定することを必要とする。実施形態において、分子におけるヌクレオチドの全て未満の同一性が決定される。他の実施形態において、分子におけるヌクレオチドの大多数または全ての同一性が決定される。

【0154】

本明細書において称されている「サブゲノム間隔」は、ゲノム配列の一部を指す。一実施形態において、サブゲノム間隔は、例えばヌクレオチド位置バリアントが腫瘍表現型と（正または負に）関連する単一のヌクレオチド位置であってよい。一実施形態において、サブゲノム間隔は、１つ超のヌクレオチド位置を含む。こうした実施形態は、少なくとも２、５、１０、５０、１００、１５０または２５０のヌクレオチド位置長の配列を含む。サブゲノム間隔は、全遺伝子、またはこの予備選択部分、例えばコード領域（またはこの一部）、予備選択イントロン（またはこの一部）またはエクソン（またはこの一部）を含むことができる。サブゲノム間隔は、天然核酸、例えばゲノム核酸の断片の全てまたは一部を含むことができる。例えば、サブゲノム間隔は、配列決定反応にかけられるゲノムＤＮＡの断片に対応し得る。実施形態において、サブゲノム間隔は、ゲノム供給源からの連続的配列である。実施形態において、サブゲノム間隔は、ゲノムにおいて近接していない配列を含め、例えば、それは、ｃＤＮＡにおいてエクソン－エクソン接合部が見出される形成された接合部を含む。

【0155】

一実施形態において、サブゲノム間隔は、以下を含むまたは以下からなる：単一のヌクレオチド位置；遺伝子内領域または遺伝子間領域；エクソンもしくはイントロンまたはこれらの断片、典型的にエクソン配列またはこの断片；コード領域または非コード領域、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、または３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはこれらの断片；ｃＤＮＡまたはこの断片；ＳＮＰ；体細胞変異、生殖細胞系列変異または両方；改変、例えば点変異または単一変異；欠失変異（例えばインフレーム欠失、遺伝子内欠失、全遺伝子欠失）；挿入変異（例えば、遺伝子内挿入）；逆位変異（例えば、染色体内逆位）；連結変異；連結されている挿入変異；逆位された重複変異；タンデム重複（例えば、染色体内タンデム重複）；転座（例えば、染色体転座、非相互転座）；再編成、例えば、ゲノム再編成、例えば、１つ以上のイントロンの再編成、またはこの断片；再編成イントロンは、５’－および／または３’－ＵＴＲを含むことができる。）；遺伝子コピー数における変化；遺伝子発現における変化；ＲＮＡレベルにおける変化、またはこの組合せ。「遺伝子のコピー数」は、特別な遺伝子産物をコードする細胞におけるＤＮＡ配列の数を指す。一般に、所定の遺伝子について、哺乳動物は、各遺伝子の２つのコピーを有する。コピー数は、例えば遺伝子の増幅もしくは重複によって増加され、または欠失によって低減され得る。

【0156】

「閾値」は、本明細書で使用される場合、サブゲノム間隔にヌクレオチド値を割り当てるために存在するのに必要とされる読み取りの数の関数である値である。例えば、それは、ヌクレオチド位置における特異的ヌクレオチド値、例えばＡを有する読み取りの数の関数であって、サブゲノム間隔においてそのヌクレオチド値をそのヌクレオチド位置に割り当てるのに必要とされる関数である。閾値は、例えば、読み取りの数、例えば整数として（または、その関数として）、または予備選択値を有する読み取りの割合として表現され得る。例として、閾値がＸであり、「Ａ」のヌクレオチド値を有するＸ＋１つの読み取りが存在するならば、「Ａ」の値は、サブゲノム間隔における予備選択位置に割り当てられる。閾値は、変異もしくはバリアントの予想、変異頻度、またはベイズ事前の関数としても表現され得る。一実施形態において、予備選択変異頻度は、そのヌクレオチド値を呼び出すため、予備選択位置におけるヌクレオチド値、例えばＡまたはＧを有する読み取りの予備選択される数または割合を必要とする。実施形態において、閾値は、変異予想、例えば変異頻度、および腫瘍型の関数であり得る。例えば、予備選択ヌクレオチド位置での予備選択バリアントは、患者が第１の腫瘍型を有するならば第１の閾値を有し、患者が第２の腫瘍型を有するならば第２の閾値を有し得る。

【0157】

本明細書で使用される場合、「標的メンバー」は、核酸ライブラリーから単離することを所望する核酸分子を指す。一実施形態において、標的メンバーは、本明細書において記載されている通りの腫瘍メンバー、参照メンバー、対照メンバーまたはＰＧｘメンバーであり得る。

【0158】

「腫瘍メンバー」または他の同様の用語（例えば、「腫瘍または癌関連メンバー」）は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞からの配列を有するメンバーを指す。一実施形態において、腫瘍メンバーは、癌表現型と関連する改変（例えば、変異）を有する配列（例えば、ヌクレオチド配列）を有するサブゲノム間隔を含む。他の実施形態において、腫瘍メンバーは、野生型配列（例えば、野生型ヌクレオチド配列）を有するサブゲノム間隔を含む。例えば、癌細胞中に存在するヘテロ接合性またはホモ接合性の野生型対立遺伝子からのサブゲノム間隔。腫瘍メンバーは、参照メンバーまたはＰＧｘメンバーを含むことができる。

【0159】

「参照メンバー」または他の同様の用語（例えば、「対照メンバー」）は、本明細書で使用される場合、癌表現型と関連する配列（例えば、ヌクレオチド配列）を有するサブゲノム間隔を含むメンバーを指す。一実施形態において、参照メンバーは、変異される場合に癌表現型と関連する遺伝子または遺伝子産物の野生型または非変異のヌクレオチド配列を含む。参照メンバーは、癌細胞または非癌細胞中に存在し得る。

【0160】

「ＰＧｘメンバー」または他の同様の用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子の薬理遺伝学的または薬理ゲノミクス的プロファイルと関連するサブゲノム間隔を含むメンバーを指す。一実施形態において、ＰＧｘメンバーは、ＳＮＰ（例えば、本明細書において記載されている通りのＳＮＰ）を含む。他の実施形態において、ＰＧｘメンバーは、表１または表２によるサブゲノム間隔を含む。

【0161】

本明細書で使用される場合、「ユニバーサル核酸塩基」は、隣接している塩基対の相互作用を著しく不安定化することなく４つの正常な核酸塩基の任意のものを置き換える能力を呈する核酸塩基を指す。ユニバーサル核酸塩基組成物を含めて、こうした混合核酸塩基組成物がブロッカー中に存在する場合、それらは、好ましくは約５から約１２ヌクレオチド長を範囲とする、複数の実質的に連続するヌクレオチド位置を占有する。

【0162】

「バリアント」は、本明細書で使用される場合、１つ超の構造、例えば対立遺伝子を多型部位に有することができるサブゲノム間隔中に存在することができる構造を指す。

【0163】

見出し、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）などは、明細書および請求項を読み取ることの簡便さのために存在する。明細書または請求項における見出しの使用は、ステップまたは要素が、アルファベット順もしくは番号順またはそれらが表される順で行われることを必要としない。

【0164】

本発明は、標的濃縮を改善するとともにオフターゲット選択を低減するためのブロッカーおよびベイトとしての新規なＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドに関する。オリゴヌクレオチド組成物は、次世代配列決定用途のための核酸鋳型を調製する強力な用途を有する。オリゴヌクレオチドは、Ｔ_ｍ増強基で修飾されて、ハイブリダイゼーション／捕捉反応が非修飾オリゴヌクレオチドより高い温度およびストリンジェントな洗浄条件下で実行されることを可能にするそれらのそれぞれの標的に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性を増加させる。ＮＧＳ鋳型の末端アダプターと同一の配列を有するオリゴヌクレオチドブロッカーについて、ハイブリッド捕捉方法におけるブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの含有は、ＮＧＳ鋳型中のアダプター媒介ハイブリッド形成に由来する望まれない混入配列のレベルを低減し（「デイジー鎖効果」）、これによって、所望のＮＧＳ鋳型のための濃縮プロセスの全体的効率を増加させる。ブロッカーおよびベイトとしての新規なＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの組成物、ならびに大規模平行配列決定実験などの用途におけるそれらの使用を含めて標的濃縮の改善およびオフターゲット選択の低減のためのそれらの特異的使用が、下記においてさらに詳細に開示されている。

【0165】

図１を参照すると、インプットＤＮＡ１００は、適切なサイズ範囲を提供するために断片化される。その結果得られるＤＮＡ断片１０１の好ましいサイズ範囲は、特別な用途および／またはＮＧＳプラットフォームに依存するが、典型的には２００－５００ｂｐ長の範囲である。ＤＮＡ１００を断片化する好ましい方法は、超音波処理手順を使用してＤＮＡを剪断することによる。市販のソニファイアーおよび他の超音波処理器は、ＤＮＡ１００を適切なサイズ範囲に断片化するために使用され得る。剪断することによってＤＮＡ１００を断片化することが好ましい断片化手段である一方で、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮＡｓｅｓまたは制限エンドヌクレアーゼ）を使用するＤＮＡ１００の部分的消化など、他の断片化手順が使用され得る。

【0166】

その結果得られるＤＮＡ断片１０１が酵素処理されて、ＮＧＳ鋳型１０３を生成するために少なくとも１つの平滑末端を有するオリゴヌクレオチドアダプター１０２がライゲートされる平滑末端化された末端を調製する。典型的に、剪断ＤＮＡは、様々な末端、こうした平滑末端、５’－オーバーハング末端、および３’－オーバーハング末端を含むことができる。５’－オーバーハング末端を含むＤＮＡ断片は、適当なポリメラーゼ（例えば、とりわけＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな（クレノウ）断片、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して陥凹３’－末端に充填することによって平滑末端化され得る。３’－オーバーハングを含むＤＮＡ断片は、好ましくはｄＮＴＰ（例えば、とりわけＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな（クレノウ）断片、Ｐｆｕポリメラーゼ）の存在下でＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を使用することによって、平滑末端化され得る。５’－オーバーハング末端または３’－オーバーハング末端を有するＤＮＡ断片は、一本鎖ヌクレアーゼ（例えば、とりわけマングビーンヌクレアーゼ、Ｐ１ヌクレアーゼ、Ｓ１ヌクレアーゼ）を使用して平滑末端化することもできる。ＤＮＡポリメラーゼの使用は、断片１０１のための平滑末端化された末端を調製するための使用に好ましい。

【0167】

場合によって、その結果得られる断片１０１は、酵素操作されて、相補的単一ヌクレオチドオーバーハング（上記の例において、３’－ｄＴオーバーハング）を持つ少なくとも１つの末端を有するアダプター１０２とのライゲーションを容易にすることができる単一ヌクレオチドオーバーハング（例えば、３’－ｄＡオーバーハング）を含むことができる。こうした断片１０１は、典型的に、上に記載されている通りの平滑末端化された末端で作製され、次いで引き続いて、３’－ポリメラーゼ（「テーリング」）活性（例えば、とりわけＴｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、クレノウＤＮＡポリメラーゼ（エキソ^－））を有する酵素で処理される。

【0168】

さらに、剪断ＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ構造の完全な破損をもたらさない２つの相補鎖の１つ内の内部切断（例えば、ニック）を含むことができる。こうした内部切断は、ｄＮＴＰ（例えば、とりわけＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩの大きな（クレノウ）断片）の存在下、またはＡＴＰ（例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ）の存在下での適当なリガーゼの存在下でニック翻訳活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、修復され得る。断片１０１の剪断ＤＮＡ内の任意の一本鎖切断を修復するのは好ましく、というのは、最終の鋳型１０３が、好ましくは、２つの連続鎖の各末端上にライゲートされる２つのアダプター１０２を含むからである。

【0169】

アダプター１０２は、末端の異なる型を含むように設計されている。この好ましい設計が選択されて、その結果得られる鋳型１０３の各末端のために二本鎖化アダプター１０２の単一コピーを提供する。平滑末端化された末端を含むように酵素処理された断片１０１のため、アダプター１０２は、平滑末端を有する第１の末端およびオーバーハング末端を有する第２の末端を含むように設計されている。こうしたアダプター１０２のため、第２の末端は、他のアダプター１０２（例えば、とりわけリガーゼ－コンピテント基質、例えば５’－ホスフェート基、３’－ヒドロキシル基、および／または配列相補性を欠如する。）へのライゲーションを妨げる１つ以上の特色を含むように設計されている。単一ヌクレオチド末端を含むように酵素処理された断片１０１のため、アダプター１０２は、相補的単一ヌクレオチドオーバーハングを有する第１の末端および異なる型の末端を有する第２の末端を含むように設計されている。上に記載されていることのように、後者アダプター１０２の第２の末端は、好ましくは、他のアダプター１０２へのライゲーションを妨げる１つ以上の特色を含むように設計されている。

【0170】

アダプター１０２のオリゴヌクレオチド組成物は、好ましくは、従来の核酸塩基を含め、ここで、ヌクレオチジル間の連結は、従来のホスホジエステル部分である。アダプター１０２は、好ましくは、下記でさらに説明されている通りにＴ_ｍ増強特性を示す化学基を除く。オリゴヌクレオチドアダプター１０２の好ましい長さは、約１５ヌクレオチドから約７５ヌクレオチドを範囲とする。

【0171】

特定のＮＧＳ用途のため、大規模平行配列決定実験において多重配列決定できるようにするために「バーコード」配列を含むことが望ましい。この目的のため、アダプター１０２は、バーコード配列タグを表す「ユニバーサル」核酸塩基組成物（例えば、とりわけイノシン、３－ニトロピロール、５－ニトロインドール）を含め、混合核酸塩基組成物（例えば、特別な位置（単数または複数）での２つ以上の正準核酸塩基の混合物）を有する複数のヌクレオチド位置を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ユニバーサル核酸塩基」は、隣接している塩基対の相互作用を著しく不安定化することなく、４つの正常の核酸塩基の任意のものを置き換える能力を呈する核酸塩基を指す。ユニバーサル核酸塩基組成物を含めて、こうした混合核酸塩基組成物がアダプター１０２に存在する場合、それらは、好ましくは約５から約１２ヌクレオチド長を範囲とする複数の実質的に連続するヌクレオチド位置を占有する。好ましくは、これらの核酸塩基を含む複数の実質的に連続するヌクレオチド位置は、末端から離れた中心位置におけるオリゴヌクレオチド内に位置されている。

【0172】

アダプター１０２の一次配列組成は、多くの考慮に依存し得る。１つの考慮は、大規模平行配列決定実験のために使用されるＮＧＳプラットフォームである。例えば、ＮＧＳ用途のために使用される市販の自動計器は、異なるアダプター１０２を含有する鋳型１０３の異なるライブラリーを有するので、任意の所定の市販のＮＧＳ計器プラットフォームのための一次配列組成の選択は、その判断基準に依存する。別の考慮は、ブロッカーとしての相補的Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの一次配列組成設計である。下記で明らかになる通り、相補的アダプター１０２の一次配列組成に関する設計決定に影響を及ぼすことができるブロッカーのための特定の一次配列組成が好ましい。

【0173】

図２Ａ－Ｂを参照すると、ブロッカーおよびベイトとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの原理が、典型的なＮＧＳ用途について例示されている。二本鎖鋳型２０３、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドブロッカー２０２、ビオチン化オリゴヌクレオチドベイト２０４およびＣ_ｏｔ－１ ＤＮＡ（登録商標）（示されていない。）は、一緒に混合され、５×の生理食塩水クエン酸ナトリウム緩衝剤（ＳＳＣ）（または、当業者によく知られている通りの同様のハイブリダイゼーション緩衝剤）の最終濃度を含むように調整された緩衝剤混合物中にて９５℃で熱変性され、ベイト：標的ハイブリッドのための予測平均Ｔ_ｍ値より低いハイブリダイゼーション温度で２時間から３日の間維持される。ハイブリダイゼーション混合物が、９５℃変性ステップからハイブリダイゼーションステップに冷却すると、ベイト：標的ハイブリッドが形成する。ライブラリーにおける全ての標的核酸について同じである異なる標的核酸間またはアダプタードメイン間に共通であり得る反復ドメイン間の相互作用を介して互いに結合する相補的配列の領域を有する標的：標的ハイブリッドも形成する。ブロッキング核酸（反復ドメインを結合するためのＣ_ｏｔ－１ ＤＮＡ、およびアダプタードメインを結合するためのオリゴヌクレオチドブロッカー）は、所望されない標的：標的反応と競合するために添加される。しかしながら、非修飾ＤＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドが用いられるならば、ブロッカーおよびアダプター－アダプター二重鎖のＴ_ｍは同一であり、標的：標的二重鎖が形成するのを防止するための唯一のやり方は、大過剰の非修飾ブロッキングオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション反応に添加することによる質量作用を介する。Ｔ_ｍ増強修飾ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することは、非修飾ブロッカーの使用より良好に、標的：標的形成を防止する。修飾ブロッカーのＴ_ｍは非修飾アダプターより高いので、ブロッカー：アダプターハイブリッドは、アダプター：アダプターハイブリッドが形成する前に形成し、これによって、「デイジー鎖」の形成を防止する。例えば、非修飾アダプターのＴ_ｍが６５℃であり、修飾ブロッカーのＴ_ｍが７５℃であるならば、修飾ブロッカー：標的二重鎖は７５℃で形成し、全てのアダプターは、標的：標的二重鎖がアダプター相互作用を介して形成し得る温度である６５℃にハイブリダイゼーション混合物が冷却する前にブロックされる。混合物は次いで、２０３：２０４ハイブリッドの捕捉を可能にするためのストレプトアビジンを含有する固体支持媒体２０５に添加される。支持媒体／混合物は、連続的によりストリンジェントな条件下（例えば、１×ＳＳＣ、続いて０．１×ＳＳＣ）にて、概算されたベイト：標的Ｔ_ｍ値のものより下、好ましくは、非修飾アダプターのＴ_ｍ値のものより上の温度で洗浄される。アダプターが通常ベイトオリゴマーよりずっと短いと仮定して、ベイトＴ_ｍは通常、アダプターＴ_ｍのものより非常に上である。ブロッカー２０２は、鋳型上に見出される非修飾アダプターと比較して増強されたＴ_ｍ値を有するので、鋳型２０３は、増加したハイブリダイゼーション温度下でブロッカー２０２に優先的にハイブリダイズし、これによって、異なる鋳型２０３がこれらのそれぞれのアダプター配列を介してデイジー鎖化凝集体を形成することを最小化する。上昇させたハイブリダイゼーション温度でのストリンジェントな洗浄に続いて、１つの最終のストリンジェントな洗浄が室温で行われ、所望の鋳型が固定化支持体２０５から回復される。

【0174】

アダプター配列に対応する典型的オリゴヌクレオチドブロッカーは、ハイブリッド捕捉から得られる所望の標的配列の約６０％濃縮を提供することができる。対照的に、ブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドは、ハイブリッド捕捉から得られる所望の標的配列の約８０％を超える濃縮を提供することができる。ブロッカーとしてＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを用いるハイブリッド捕捉実験からの標的濃縮におけるその結果得られる改善は、ブロッカーとして非修飾オリゴヌクレオチドを用いて得られる収率に対して、所望の鋳型標的の収率の増加が約３０％を超える範囲である。

【0175】

ブロッカーおよびベイトとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの設計の各種実施形態が、ここで記載される。本明細書で使用される場合、「Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチド」は、ハイブリダイゼーションパートナーとして同一の核酸塩基組成物を有するオリゴヌクレオチドおよび非修飾基を含む二重鎖核酸に対して、ハイブリダイゼーションパートナーとしてオリゴヌクレオチドを含む二重鎖核酸について熱溶融温度値の増加（「Ｔ_ｍ値の増強」）を提供する少なくとも１つの修飾基（「Ｔ_ｍ増強基」）を含むオリゴヌクレオチドである。典型的に、Ｔ_ｍを増加させる修飾の使用は、標的に対するブロッカーの結合親和性も増加させて、Ｋ_ａまたは会合定数を増加させ、Ｋ_ｄ、または逆反応についての解離定数を減少させることもできる。

【0176】

多数のＴ_ｍ増強基が、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの設計において使用され得る。この目的のための適当なＴ_ｍ増強基の例としては、例えばロックド核酸（ＬＮＡ）、二環式核酸（ＢＮＡ、例えばＩｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからの拘束エチル核酸）、Ｃ５修飾ピリミジン塩基（例えば、とりわけ５－メチル－ｄＣ、プロピニルピリミジン）を含めて、核酸塩基またはリボース部分への修飾物が挙げられる。とりわけペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノなど、代わりの骨格化学も用いられ得る。マイナーグローブバインダー（ＭＧＢ）、スペルミン、Ｇ－クランプ、またはＵａｑアントラキノンキャップなど、非塩基モディファイヤーが用いられて、Ｔ_ｍ（または結合親和性）を増加させることができる。結合親和性を増加させるための多くの戦略が当業者に知られており、全てのこうした修飾物の使用は、本発明の範囲内と考えられる。

【0177】

好ましくは、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドは、複数のＴ_ｍ増強基を含む。Ｔ_ｍ増強基の好ましい数は、１つの相補鎖としてＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを含有する二重鎖ＤＮＡのために少なくとも約１．４℃のストリンジェントな条件（０．１×ＳＳＣ）（「最適なＴ_ｍ値増強」）下で最適なＴ_ｍ値における増加を提供するような数である。Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドにおける好ましい数のＴ_ｍ増強基は、約２℃から約２５℃を範囲とする最適なＴ_ｍ値増強を提供する。ＢＮＡヌクレオチドと末端ＭＧＢ基との組合せなど、１つ超の型のＴ_ｍ増強修飾が、単一修飾ブロッカーにおいて用いられ得る。

【0178】

ハイブリッド捕捉方法における鋳型濃縮の改善のためのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを設計するための好ましい手法は、オリゴヌクレオチドにおいて使用されるＴ_ｍ増強基に依存する。前述のＴ_ｍ増強基の任意のものを含有するＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのＴ_ｍ値は、ルーチン的経験的方法を使用して決定され得る。最小のまたは低減された経験的評価を必要とするこれらの後者Ｔ_ｍ増強基を含有するＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのＴ_ｍ値を正確に予測するための信頼できる方法が利用可能であるため、ＬＮＡまたはＢＮＡのＴ_ｍ増強基の使用が好ましい。この目的のための１つのこうした方法の例は、Ｂｅｈｌｋｅへの、ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＰＲＥＤＩＣＴＩＮＧ ＳＴＡＢＩＬＩＴＹ ＡＮＤ ＭＥＬＴＩＮＧ ＴＥＭＰＥＲＡＴＵＲＥＳ ＯＦ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＤＵＰＬＥＸＥＳという表題で２０１２年２月２日に公開された米国特許出願公開第２０１２／００２９８９号に提供されており、参照により全体を本明細書に組み込む。

【0179】

特定の好ましい実施形態のため、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドは、バーコード配列タグを含む。バーコード要素は、しばしば、ライブラリー構築中に標的核酸に付着される２つのアダプターオリゴヌクレオチドの１つに含まれる。バーコード要素は典型的に６個の塩基の長さであり；８個の塩基以上の長さなど、より長い要素も用いられ得る。典型的にバーコードアダプターは、ＮＧＳライブラリー調製において用いられる２つのアダプターの１つのみを含み、１つのアダプターは「独特であり、コードされており」、１つのアダプターは「ユニバーサル」である。両アダプター上にバーコードを置くことも可能である。バーコードされたアダプターの使用は、多重試料が、単一の多重配列決定実行において一緒に混合および加工されるのを可能にして、著しいコスト節約およびスループットの増加を提供する。配列は、配列決定した後の分析によってデコンボリューションされる。多重実験は、２、３、４、または最大１００個以上までのバーコード修飾アダプター配列の使用に関与することがある。各異なるバーコードアダプターが独特の配列を有すると、最も有効なブロッキングオリゴヌクレオチド（単数または複数）は、セットで存在する各独特のバーコードアダプターに対して完璧に相補的なマッチである配列である。アダプターとブロッカーとの間のバーコードドメイン内ミスマッチがＴ_ｍを低下させるため、この手法は、ブロッカーについての最も高い可能なＴ_ｍを確保する。そのため、例えば、４重反応における４つのバーコードアダプターの使用は、４つのバーコードアダプターのための４個の独特の配列および共通のユニバーサルアダプターのための１個の独特の配列を含む５つの明確に異なるブロッキングオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。しかしながら、多くの明確に異なるバーコードアダプターが用いられるならば、この手法は、高レベル多重実験のための１００以上もの多くの独特のブロッキングオリゴヌクレオチドの使用を必要とすることがあり、この手法は費用効果が高くない。さらに、アダプター「Ｂ」へのブロッカー「Ａ」のミスハイブリダイゼーションが発生しそうであり、ブロッキングオリゴヌクレオチドの結合親和性を低下させ、ブロッキングステップの有効性を減少する。１つの解決法は、アダプターにおけるバーコードドメインをスパンするためにアダプターオリゴヌクレオチド内の適当な位置にランダムＮ－ｍｅｒドメイン（例えば、ＮＮＮＮＮＮ混合塩基６量体配列）を含むブロッキングオリゴヌクレオバーコードに「ユニバーサル」ドメインを組み込むことである。この手法を用いて、単一のブロッキングオリゴヌクレオチドは、多数のバーコード化アダプターとともに使用され得る。６塩基Ｎ－ｍｅｒドメインを使用して、４０９６個の異なる配列は、ブロッキングオリゴヌクレオチドプール中に存在する。存在するこの多数のバーコードを有することは、大部分のブロッカー：アダプター対をもたらして、バーコードドメインにおけるミスマッチを含む。代替として、「ユニバーサル塩基」が、Ｎ塩基の代わりに用いられ得る。ユニバーサル塩基は、一部または全ての天然塩基にハイブリダイズする修飾核酸塩基であり、Ｇ：Ａ対またはＴ：Ｔ対など本当の塩基ミスマッチよりミスマッチの熱力学的コストが少ない。当業者によく知られているイノシン（「Ｉ」）、５－ニトロインドール（「５－ＮＩ」）など、多くのユニバーサル塩基が存在する。イノシンドメイン（ＩＩＩＩＩＩ）とバーコードとの対合は、平均して、完全にミスマッチのＮ－ｍｅｒドメイン（ＮＮＮＮＮＮ）より高いＴ_ｍを有する。そのため、以下の３つの手法が使用されて、バーコードアダプターのためのブロッキングオリゴヌクレオチドを作製することができる：１）各アダプターに完璧にマッチする一連のブロッカーを合成する、２）アダプターのバーコードドメインと対合するためのＮ－ｍｅｒドメインを有する単一のブロッカーを合成する、または３）アダプターのバーコードドメインと対合するためのユニバーサル塩基ドメインを有する単一のブロッカーを合成する。前述の方法を用いて、混合されているまたはユニバーサルな核酸塩基の配列に由来する配列寄与を省略することによって、バーコードアダプターを有するＬＮＡ基またはＢＮＡ基を含有する特別なＴ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチドについてのＴ_ｍ値の十分に正確な概算を算出することができる。こうしたオリゴヌクレオチドについての正確なＴ_ｍ値が次いで、ルーチン的経験的方法を使用して、より高精度に決定され得る。

【0180】

前に記述されている通り、アダプター１０２は、鋳型１０３上の２つの相補鎖として存在する。ハイブリッド捕捉の二本鎖化鋳型１０３の集団の変性に続いて、各一本鎖鋳型１０３は、アダプター１０２の対応する一本鎖コピーを含む。多くの非関連の鋳型１０３のデイジー鎖凝集をもたらす異なる一本鎖鋳型１０３の間での相互作用を防止するため、２つのアダプター１０２鎖の１つのみが、別の相補鎖アダプター１０２とのハイブリダイゼーションのためにブロックされる必要がある。この理由のため、および好ましい実施形態において、ブロッカーとしてただ１つのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチド鎖が、ＮＧＳ鋳型１０３を用いるハイブリッド捕捉方法において鋳型濃縮の改善を達成するために含められる必要がある。

【0181】

ブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの一次配列の設計は、オリゴヌクレオチドアダプター１０２の２つの相補鎖の１つの一次配列に基づく。Ｔ_ｍ増強基として、利用可能な核酸塩基のいずれかまたは全てをＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドに含めることができるが、修飾核酸塩基のただ１つの単一型または修飾核酸塩基の２つの異なる型を含むことが好ましい。

【0182】

Ｔ_ｍ増強核酸塩基で修飾されたオリゴヌクレオチドは、ヘアピンまたは自己二量体形成のリスクが増加する。オリゴヌクレオチド設計アルゴリズムまたはカルキュレーターが使用されて、配列のヘアピンおよび二量体の潜在性をモデル化することができ、使用されてスクリーン修飾パターンに役立つはずである。例えば、ＩＤＴウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／上で公的に利用可能であるＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒを参照されたい。この課題は、ＬＮＡ修飾またはＢＮＡ修飾が用いられるならば特に重要である。ＬＮＡ：ＤＮＡ塩基対は、ＤＮＡ：ＤＮＡ対に対してＴ_ｍ増加を示す。ＬＮＡ：ＬＮＡ塩基対は、ＬＮＡ：ＤＮＡ対に対してＴ_ｍ増加を示す。ヘアピン事象または自己二量体事象において発生する任意のＬＮＡ：ＬＮＡ対は特にこのましい（ＬＮＡ：ＤＮＡ対だけがブロッカーと標的との間に形成することができることに留意されたい。）。そのため、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの設計に注意して、ＬＮＡ：ＬＮＡ対合事象を介する自己二量体またはヘアピンの形成を促進するパターンを回避しなければならない。これはＢＮＡ修飾にも同等に当てはまる。

【0183】

この問題を防止するための１つの好ましい手法は、修飾核酸塩基の単一型だけを用いることである。例えば、Ｔ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡ－ＣまたはＢＮＡ－Ｃを使用することだけで作製され得る。塩基組成に依存して、単一塩基型の完全な置換は、最適な性能を提供するのに十分高いＴ_ｍ増加を達成しない恐れがある。この場合において、ＬＮＡ－ＣとＬＮＡ－Ａ、またはＢＮＡ－ＣとＢＮＡ－Ａなど、２つの異なる修飾核酸塩基が用いられ得る。一般に、修飾されたＣは、修飾されたＡまたは修飾されたＴとともに使用され得るが、修飾されたＧとともには使用され得ない。同様に、修飾されたＡは、修飾されたＣまたは修飾されたＧとともに使用され得るが、修飾されたＴとともには使用され得ない。修飾されたＧとの修飾されたＣの使用または修飾されたＴとの修飾されたＡの使用は、回避されるべきである。この戦略は、修飾された塩基間の潜在的相互作用を制限することによって、ヘアピン／二量体形成増加のリスクを制限する。プロピニルピリミジン修飾は、ｐｄＵ塩基およびｐｄＣ塩基としてだけ利用可能である。この場合において、修飾ブロッキングオリゴヌクレオチドは、１個または多くのｐｄＣ塩基を含むことができる。代替として、修飾ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ｐｄＣ塩基およびｐｄＵ塩基の混合物を含み、前に樹立された設計基準に応じ得る。

【0184】

Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのため、Ｔ_ｍ増強基の好ましい数は、オリゴヌクレオチドの組成の約２％から約５０％まで変動することができる。一般に、ブロッカーとして役立つオリゴヌクレオチドは、アダプター１０２において使用されるオリゴヌクレオチドの２つの相補鎖の１つと同じ長さ（例えば、約１５から約７５のヌクレオチド長）を有する。例えば、Ｔ_ｍ増強基の好ましい数は、５０個のヌクレオチドを有するブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドには１から約２５の範囲であり得る。修飾された残基のより高い部分の使用は、ますますＴ_ｍを増加させ、その試薬の「ブロッキング力」に増加的改善を加える。しかしながら、修飾された残基の付加は、合成オリゴヌクレオチドのコストを増加させ、自己二量体およびヘアピンの形成のリスクを増加させるので、こうした基の公正な使用が推奨される。ＮＧＳ用途の大多数において、ブロッカーとしてＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドだけが使用されて、大規模平行配列決定実験において標的濃縮における所望の改善を達成する。

【0185】

ベイトとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのため、Ｔ_ｍ増強基の好ましい数は、ブロッカーとしてのオリゴヌクレオチドの記載されている通りの百分率と同じ範囲内に入る。非修飾ベイトとして役立つオリゴヌクレオチドは、約６０から約２００のヌクレオチド長のサイズにおける範囲であり、ここで、最も共通して使用されるベイトの長さは、約１２０ヌクレオチド長である。しかしながら、ベイトとしてのオリゴヌクレオチドにＴ_ｍ増強基を含めることによって、約２０から約１００のヌクレオチド長の範囲である、より短いベイトを使用することができる。ＮＧＳ用途における特定の大規模平行配列決定実験のため、何百ものオリゴヌクレオチドの集団がベイトとして使用される。特定の用途において必要とされるベイトの数に非常に依存して、その集団内の各ベイト候補ための、より短いＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの使用は、ベイトとして非修飾オリゴヌクレオチドを使用することに対して経済的利点を提供することができる。

【0186】

さらなる利点は、品質管理手順を用いる標準化生成物規格に従って構造および活性が立証されたベイトの使用によって与えられる。他の手順は、ベイトを調製するのに利用可能であるが、複数のベイトを含む組成物（すなわち、別個のベイトオリゴヌクレオチドのセット）を捕捉試薬として調製することが好ましく、ここで、複数のベイトの各メンバーは、個別に調製される。

【0187】

この文脈において使用される場合、複数のベイトオリゴヌクレオチドのメンバーの数としては、約１０から１，０００，０００の範囲が挙げられる。用途に依存して、この範囲が好ましい。例えば、「スパイクイン」は、現存のアレイ合成セットを再平衡する必要があり、約１０－１００個のベイトオリゴヌクレオチドほども低いことがあり；完全な焦点化オリゴセットは、５００個から２５，０００個のベイトオリゴヌクレオチドを範囲としてよい；全体のエキソームセットは、約６００，０００個のベイトオリゴヌクレオチドを含むことができる。

【0188】

より好ましくは、複数のベイトの各メンバーは、化学的プロセスによって個別に合成され、ここで、生成物の品質は、合成中および精製後にモニタリングされ得る。いっそう好ましくは、複数の各メンバーは、合成化学プロセスによって調製され、精製され、ここで、合成および精製の両品質は、独立して判定され得る。最も好ましくは、複数のベイトの各メンバーは、複数のベイトが得ることができるように複数のベイトの他のメンバーからの非依存性生成物規格を有し、ここで、各メンバーの構造および活性は、複数のベイト内の他のメンバーに対して標準化される。標準化された活性を有する複数のベイトの使用は、特に高ＧＣ含有量領域を有する標的のために、目的の所定の標的の、より完全および均一なカバレッジを可能にする。これらの利点は、全ての型のオリゴヌクレオチドベイト、すなわち、非修飾オリゴヌクレオチドベイトおよびＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドベイトのために実現され得る。

【0189】

Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドは、内部または末端の修飾など、追加の特色を含むことができる。ブロッカーとして役立つＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドのため、ハイブリッド捕捉に続く所望のＮＧＳ鋳型の回復は、典型的に、ブロッカーの同時精製をもたらし得る。ブロッカーは、ＰＣＲ増幅の後続のステップとして鋳型の集団から実質的に希釈され、配列決定が進行する。なお、これらの後続のステップ中におけるプライマーとしてのブロッカーの参加を制限することが望ましい。この理由のため、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成のプライマーとして役立つためのブロッカーの利用能を妨げる３’末端基（例えば、とりわけ３’－ｄＣ；２’，３’－ｄｄＣ；逆位ｄＴ；３’－スペーサーＣ３、）を含むことができる。

【0190】

ベイトとして役立つオリゴヌクレオチドは、ハイブリッド捕捉中において鋳型１０３の集団からの所望の鋳型：ベイトハイブリッドの選択を可能にする少なくとも１つの修飾を含む。好ましい修飾の１つの例としては、化学合成中にオリゴヌクレオチドベイトに組み込まれるとともにハイブリッド選択のためのアビジンまたはストレプトアビジンを含有する固体支持媒体とともに使用され得るビオチンが挙げられる。当業者によく知られている通りのジゴキシゲニンまたは他の基など、他の捕捉リガンドが用いられ得る。

【0191】

ブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの好ましい例としては、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、２５、２７、２８、３０、３２、３４および３６が挙げられる。これらの特別な配列、これらの組成物、および大規模平行配列決定用途における使用の方法は、より詳細に実施例に記載されている。

【0192】

遺伝子または遺伝子産物の選択
選択された遺伝子または遺伝子産物（本明細書において「標的遺伝子または遺伝子産物」とも称される。）は、遺伝子内領域または遺伝子間領域を含むサブゲノム間隔を含むことができる。例えば、サブゲノム間隔は、エクソンまたはイントロン、またはこれらの断片、典型的にエクソン配列またはこの断片を含むことができる。サブゲノム間隔は、コード領域または非コード領域、例えばプロモーター、エンハンサー、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、もしくは３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、またはこれらの断片を含むことができる。他の実施形態において、サブゲノム間隔は、ｃＤＮＡまたはこの断片を含む。他の実施形態において、サブゲノム間隔は、例えば本明細書において記載されている通りのＳＮＰを含む。

【0193】

他の実施形態において、サブゲノム間隔、例えば、本明細書において記載されている通りのサブゲノム間隔の１つ以上は、ゲノムにおける実質的に全てのエクソン（例えば、目的の選択された遺伝子または遺伝子産物（例えば、本明細書において記載されている通りの癌表現型と関連する遺伝子または遺伝子産物）からのエクソン）を含む。一実施形態において、サブゲノム間隔は、体細胞変異、生殖細胞系列変異、または両方を含む。一実施形態において、サブゲノム間隔は、改変、例えば点変異もしくは単一変異、欠失変異（例えば、インフレーム欠失、遺伝子内欠失、全遺伝子欠失）、挿入変異（例えば、遺伝子内挿入）、逆位変異（例えば、染色体内逆位）、連結変異、連結挿入変異、逆位重複変異、タンデム重複（例えば、染色体内タンデム重複）、転座（例えば、染色体転座、非相互転座）、再編成、遺伝子コピー数における変化、またはこれらの組合せを含む。特定の実施形態において、サブゲノム間隔は、試料における腫瘍細胞のゲノムのコード領域の５％、１％、０．５％、０．１％、０．０１％、０．００１％未満を構成する。他の実施形態において、サブゲノム間隔は疾患に関与せず、例えば、本明細書において記載されている通りの癌表現型を伴わない。

【0194】

一実施形態において、標的の遺伝子または遺伝子産物は、バイオマーカーである。本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」または「マーカー」は、遺伝子、ｍＲＮＡ、または改変され得るタンパク質であり、ここで、前記改変は癌を伴う。改変は、正常または健常の組織または細胞（例えば、対照）におけるそれの量、構造および／または活性と比較して、癌組織または癌細胞における量、構造および／または活性における改変であってよく、癌などの疾患状態を伴う。例えば、癌を伴うまたは抗癌治療に対する応答性の前兆となるマーカーは、正常の健常組織または細胞と比較して、癌組織または癌細胞において、改変されたヌクレオチド配列、アミノ酸配列、染色体転座、染色体内逆位、コピー数、発現レベル、タンパク質レベル、タンパク質活性、またはメチル化状態を有し得る。さらに、「マーカー」としては、癌などの疾患状態を伴う組織または細胞中に存在する場合に、例えば置換、欠失または挿入によって、構造が改変されている、例えば変異されている（変異を含有する。）、例えばヌクレオチドまたはアミノ酸のレベルで野生型配列と異なる分子が挙げられる。

【0195】

一実施形態において、標的の遺伝子または遺伝子産物としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が挙げられる。別の実施形態において、遺伝子または遺伝子産物は、小さい欠失、例えば小さい遺伝子内欠失（例えば、インフレームまたはフレームシフトの欠失）を有する。なお別の実施形態において、標的配列は、全遺伝子の欠失に由来する。また別の実施形態において、標的配列は、小さい挿入、例えば小さい遺伝子内挿入を有する。一実施形態において、標的配列は、逆位、例えば染色体内逆位に由来する。別の実施形態において、標的配列は、染色体間転座に由来する。なお別の実施形態において、標的配列は、タンデム重複を有する。一実施形態において、標的配列は、望ましくない特色（例えば、高ＧＣ含有量または反復要素）を有する。別の実施形態において、標的配列は、例えばその反復性質のためにそれ自体首尾よく標的化され得ないヌクレオチド配列の一部を有する。一実施形態において、標的配列は、代替のスプライシングに由来する。別の実施形態において、標的配列は、表１、１Ａ、２、３または４による遺伝子または遺伝子産物、またはこれらの断片から選択される。

【0196】

癌としては、これらに限定されないが、Ｂ細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、メラノーマ、乳癌、肺癌（非小細胞肺癌腫またはＮＳＣＬＣなど）、気管支癌、直腸結腸癌、前立腺癌、膵癌、胃癌、卵巣癌、尿膀胱癌、脳癌または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔または咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆管癌、小腸癌または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌、腺癌腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、消化管ストローマ腫瘍（ＧＩＳＴ）、大腸癌、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、真性多血症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂質肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性肺癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞腫、胆管癌腫、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管細胞芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞癌腫、甲状腺癌、胃癌、頭頸部癌、小細胞癌、本態性血小板血症、特発性骨髄化生、過好酸性症候群、全身性肥満細胞症、家族性過好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌癌、およびカルチノイド腫瘍などが挙げられる。

【0197】

一実施形態において、標的の遺伝子または遺伝子産物は、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、ＡＢＬ１、ＡＢＬ２、ＡＫＴ１、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＡＲ、 ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＥＢＰＡ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＣＴＮＮＢ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＤＰＹＤ、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＣＣ２、ＥＲＧ、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ３、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＳＴＰ１、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＲＡＳ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＩＴＰＡ、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＲＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＮ１Ｂ１、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＥＴ、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＬＬ、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ１、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＯＴＣＨ１、ＮＰＭ１、ＮＱＯ１、ＮＲＡＳ、ＮＲＰ２、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＢ１、ＲＥＴ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＤ２、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＯＰ１、ＴＰ５３、ＴＰＭＴ、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＹＭＳ、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＭＰＳ、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、およびＷＴ１からなる群から選択される全長またはこの断片である。

【0198】

一実施形態において、標的の遺伝子もしくは遺伝子産物、またはこれらの断片は、薬理遺伝学および薬理ゲノミクス（ＰＧｘ）、例えば薬物代謝および毒性に関連している１つ以上のＳＮＰを有する。例示的遺伝子または遺伝子産物としては、これらに限定されないが、ＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、Ｃ１ｏｒｆ１４４、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＤＰＹＤ、ＥＲＣＣ２、ＥＳＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＧＳＴＰ１、ＩＴＰＡ、ＬＲＰ２、ＭＡＮ１Ｂ１、ＭＴＨＦＲ、ＮＱＯ１、ＮＲＰ２、ＳＬＣ１９Ａ１、ＳＬＣ２２Ａ２、ＳＬＣＯ１Ｂ３、ＳＯＤ２、ＳＵＬＴ１Ａ１、ＴＰＭＴ、ＴＹＭＳ、ＵＧＴ１Ａ１、およびＵＭＰＳが挙げられる。

【0199】

別の実施形態において、標的の遺伝子もしくは遺伝子産物、またはこれらの断片は、癌と関連する１つ以上のコドンを有する。例示的遺伝子または遺伝子産物としては、これらに限定されないが、ＡＢＬ１（例えば、コドン３１５）、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＡＰＣ（例えば、コドン１１１４、１３３８、１４５０および１５５６）、ＡＲ、ＢＲＡＦ（例えば、コドン６００）、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＥＢＰＡ、ＣＴＮＮＢ１（例えば、コドン３２、３３、３４、３７、４１および４５）、ＥＧＦＲ（例えば、７１９、７４６－７５０、７６８、７９０、８５８および８６１）、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３（例えば、コドン８３５）、ＨＲＡＳ（例えば、コドン１２、１３および６１）、ＪＡＫ２（例えば、コドン６１７）、ＫＩＴ（例えば、コドン８１６）、ＫＲＡＳ（例えば、コドン１２、１３および６１）、ＭＥＴ、ＭＬＬ、ＭＹＣ、ＮＦ１、ノッチ１、ＮＰＭ１、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ（例えば、コドン８８、５４２、５４５、５４６、１０４７および１０４９）、ＰＴＥＮ（例えば、コドン１３０、１７３、２３３および２６７）、ＲＢ１、ＲＥＴ（例えば、コドン９１８）、ＴＰ５３（例えば、１７５、２４５、２４８、２７３および３０６）が挙げられる。

【0200】

なお別の実施形態において、標的の遺伝子もしくは遺伝子産物またはこれらの断片は、癌と関連する。例示的遺伝子または遺伝子産物としては、これらに限定されないが、ＡＢＬ２、ＡＫＴ２、ＡＫＴ３、ＡＲＡＦ、ＡＲＦＲＰ１、ＡＲＩＤ１Ａ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＡＵＲＫＡ、ＡＵＲＫＢ、ＢＣＬ２、ＢＣＬ２Ａ１、ＢＣＬ２Ｌ１、ＢＣＬ２Ｌ２、ＢＣＬ６、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＣＡＲＤ１１、ＣＢＬ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＤ３、ＣＣＮＥ１、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＣＤＫ８、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＨＥＫ１、ＣＨＥＫ２、ＣＲＫＬ、ＣＲＬＦ２、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ５、ＥＰＨＡ６、ＥＰＨＡ７、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ４、ＥＰＨＢ６、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥＲＧ、ＥＴＶ１、ＥＴＶ４、ＥＴＶ５、ＥＴＶ６、ＥＷＳＲ１、ＥＺＨ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＢＸＷ７、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＦＯＸＰ４、ＧＡＴＡ１、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＧＰＲ１２４、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＨＯＸＡ３、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＫＢＫＥ、ＩＫＺＦ１、ＩＮＨＢＡ、ＩＲＳ２、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、ＫＤＲ、ＬＲＰ１Ｂ、ＬＴＫ、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＭＡＰ２Ｋ４、ＭＣＬ１、ＭＤＭ２、ＭＤＭ４、ＭＥＮ１、ＭＩＴＦ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＴＯＲ、ＭＵＴＹＨ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＦ２、ＮＫＸ２－１、ＮＴＲＫ１、ＮＴＲＫ３、ＰＡＫ３、ＰＡＸ５、ＰＤＧＦＲＢ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＫＨＤ１、ＰＬＣＧ１、ＰＲＫＤＣ、ＰＴＣＨ１、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＲＤ、ＲＡＦ１、ＲＡＲＡ、ＲＩＣＴＯＲ、ＲＰＴＯＲ、ＲＵＮＸ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＯＸ１０、ＳＯＸ２、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＴＢＸ２２、ＴＥＴ２、ＴＧＦＢＲ２、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＯＰ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＵＳＰ９Ｘ、ＶＨＬ、およびＷＴ１が挙げられる。

【0201】

前述の方法の用途は、医学標本において配列決定するための特別な遺伝子または遺伝子の全ての公知配列バリアント（またはこのサブセット）を含有するオリゴヌクレオチドのライブラリーを使用することを含む。

【0202】

核酸試料
様々な組織試料が、本方法において使用される核酸試料の供給源であり得る。ゲノムまたはサブゲノムの核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、対象の試料（例えば、腫瘍試料、正常の隣接組織（ＮＡＴ）、血液試料、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、または任意の正常の対照を含有する試料））から単離され得る。特定の実施形態において、組織試料は、凍結試料としてまたはホルムアルデヒドもしくはパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織調製物として保存される。例えば、試料は、マトリックス、例えばＦＦＰＥブロックまたは凍結試料中に包埋され得る。単離ステップは、個別の染色体をフロー選別すること；および／または対象の試料（例えば、腫瘍試料、ＮＡＴ、血液試料）を顕微解剖することを含むことができる。

【0203】

「単離」核酸分子は、核酸分子の天然供給源中に存在する他の核酸分子から分離されるものである。特定の実施形態において、「単離」核酸分子は、核酸が誘導される生物体のゲノムＤＮＡにおける核酸（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置されている配列）に天然にフランクする配列（タンパク質エンコード配列など）がない。例えば、各種実施形態において、単離核酸分子は、核酸が誘導される細胞のゲノムＤＮＡにおける核酸分子に天然にフランクするヌクレオチド配列を約５ｋＢ未満、約４ｋＢ未満、約３ｋＢ未満、約２ｋＢ未満、約１ｋＢ未満、約０．５ｋＢ未満または約０．１ｋＢ未満含有することができる。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組換え技法によって生成される場合に他の細胞性物質または培養培地が実質的にないことがあり、または化学合成される場合に化学的前駆体または他の化学薬品が実質的にないことがある。

【0204】

「他の細胞性物質または培養培地が実質的にない」という言語は、分子が単離または組換え生成される細胞の細胞構成成分から分子が分離される核酸分子の調製物を含む。したがって、細胞性物質が実質的にない核酸分子は、他の細胞性物質または培養培地を約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満または約５％未満（乾燥重量による）有する核酸分子の調製物を含む。

【0205】

特定の実施形態において、核酸は、熟成試料、例えば熟成ＦＦＰＥ試料から単離される。熟成試料は、例えば、年齢、例えば、１年、２年、３年、４年、５年、１０年、１５年、２０年、２５年、５０年、７５年、または１００年齢、またはこれより古くてよい。

【0206】

核酸試料は、様々なサイズの組織試料（例えば、生検試料またはＦＦＰＥ試料）から得られてよい。例えば、核酸は、５から２００μｍ、またはこれ以上の組織試料から単離され得る。例えば、組織試料は、５μｍ、１０μｍ、２０μｍ、３０μｍ、４０μｍ、５０μｍ、７０μｍ、１００μｍ、１１０μｍ、１２０μｍ、１５０μｍもしくは２００μｍ、またはこれ以上の大きさであり得る。

【0207】

組織試料からのＤＮＡ単離のためのプロトコールは、実施例１において提供されている。ホルムアルデヒド固定またはパラホルムアルデヒド固定のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離するための追加の方法は、例えばＣｒｏｎｉｎ Ｍ．ら、（２００４）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６４（１）：３５－４２；Ｍａｓｕｄａ Ｎ．ら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（２２）：４４３６－４４４３；Ｓｐｅｃｈｔ Ｋ．ら、（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５８（２）：４１９－４２９、Ａｍｂｉｏｎ ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９７５、２００８年９月）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ番号ＴＭ３４９、２０１１年２月）、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ、生成物番号Ｄ３３９９－００、Ｄ３３９９－０１、およびＤ３３９９－０２；２００９年６月）、およびＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３７６２５、２００７年１０月）に開示されている。ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、パラフィン包埋試料を可溶化するために昇温でキシレンを使用し、核酸を捕捉するためにガラス繊維フィルターを使用する。Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、ＦＦＰＥ組織の１μｍから１０μｍのセクションのゲノムＤＮＡの精製のためにＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔとともに使用される。ＤＮＡは、シリカクラッド常磁性粒子（ＰＭＰ）を使用して精製され、低溶出体積で溶出される。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔは、ゲノムＤＮＡの単離のためにスピンカラムおよび緩衝剤系を使用する。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔは、ゲノムおよびミトコンドリアのＤＮＡの精製のためにＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ技術を使用する。血液からのＤＮＡ単離のためのプロトコールは、例えばＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ およびＭａｘｗｅｌｌ １６ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ番号ＴＭ３３３、２０１１年１月１日）に開示されている。

【0208】

ＲＮＡ単離のためのプロトコールは、例えばＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ番号ＴＢ３５１、２００９年８月）に開示されている。

【0209】

単離核酸試料（例えば、ゲノムＤＮＡ試料）は、ルーチン的な技法を実践することによって、断片化または剪断される。例えば、ゲノムＤＮＡは、物理的剪断方法、酵素的開裂方法、化学的開裂方法、および当業者によく知られている他の方法によって断片化され得る。核酸ライブラリーは、ゲノムの複雑性の全てまたは実質的に全てを含有することができる。この文脈における「実質的に全て」という用語は、手順の初期ステップ中においてゲノム複雑性の一部の望まれない消失が実際にあり得るという可能性を指す。本明細書に記載されている方法は、核酸ライブラリーがゲノムの一部である場合、すなわち、ゲノムの複雑性が設計によって低減される場合においても有用である。一部の実施形態において、ゲノムの任意の選択部分は、本明細書に記載されている方法で使用され得る。特定の実施形態において、全エキソームまたはこのサブセットは単離される。

【0210】

本発明において特色とされている方法は、ライブラリー（例えば、本明細書において記載されている通りの核酸ライブラリー）を提供するために核酸試料を単離することをさらに含むことができる。特定の実施形態において、核酸試料は、全ゲノム断片、サブゲノム断片、または両方を含む。単離核酸試料は、核酸ライブラリーを調製するために使用され得る。したがって、一実施形態において、本発明において特色とされている方法は、ライブラリー（例えば、本明細書において記載されている通りの核酸ライブラリー）を提供するために核酸試料を単離することをさらに含む。全ゲノムまたはサブゲノムの断片からライブラリーを単離および調製するためのプロトコールは、当技術分野において知られている（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのゲノムＤＮＡ試料調製キット）。特定の実施形態において、ゲノムまたはサブゲノムのＤＮＡ断片は、対象の試料（例えば、腫瘍試料、正常の隣接組織（ＮＡＴ）、血液試料または任意の正常の対照））から単離される。一実施形態において、試料（例えば、腫瘍またはＮＡＴの試料）は、保存標本である。例えば、試料は、マトリックス、例えばＦＦＰＥブロックまたは凍結試料中に包埋されている。特定の実施形態において、単離ステップは、個別の染色体をフロー選別すること；および／または対象の試料（例えば、腫瘍試料、ＮＡＴ、血液試料）を顕微解剖することを含む。特定の実施形態において、核酸ライブラリーを生成するために使用される核酸試料は、５マイクログラム未満、１マイクログラム未満、または５００ｎｇ未満、２００ｎｇ未満、１００ｎｇ未満、５０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満または１ｎｇ未満である。

【0211】

また他の実施形態において、ライブラリーを生成するために使用される核酸試料は、ＲＮＡから誘導されるＲＮＡまたはｃＤＮＡを含む。一部の実施形態において、ＲＮＡとしては、全細胞ＲＮＡが挙げられる。他の実施形態において、特定の豊富なＲＮＡ配列（例えば、リボソームＲＮＡ）は枯渇されていた。一部の実施形態において、全ＲＮＡ調製物におけるポリ（Ａ）尾部ｍＲＮＡ画分は濃縮されていた。一部の実施形態において、ｃＤＮＡは、ランダムプライム化ｃＤＮＡ合成方法によって生成される。他の実施形態において、ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドによるプライミングによって、成熟したｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部で惹起される。枯渇、ポリ（Ａ）濃縮、およびｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者によく知られている。

【0212】

方法は、当業者によく知られている特異的または非特異的核酸増幅方法によって核酸試料を増幅することをさらに含むことができる。一部の実施形態、特定の実施形態において、核酸試料は、例えば、ランダムプライム化鎖置換増幅などの全ゲノム増幅方法によって増幅される。

【0213】

他の実施形態において、核酸試料は、物理的または酵素的方法によって断片化または剪断され、サイズ選択（例えば、調製用ゲル電気泳動法による。）および増幅（例えば、ＰＣＲによる。）された合成アダプターにライゲートされる。他の実施形態において、核酸の断片化およびアダプターライゲートされた基は、ハイブリッド選択より前の顕在的サイズ選択または増幅なく使用される。

【0214】

他の実施形態において、単離ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、断片化または剪断される。一部の実施形態において、ライブラリーは、ゲノムの簡約表示または定義部分であるゲノムＤＮＡのサブ部分、例えば他の手段によってサブ部分にされたゲノムＤＮＡのサブ部分などのゲノムＤＮＡを５０％未満含む。他の実施形態において、ライブラリーは、全てのゲノムＤＮＡまたは実質的に全てのゲノムＤＮＡを含む。

【0215】

一部の実施形態において、ライブラリーは、ゲノムの簡約表示または定義部分であるゲノムＤＮＡのサブ部分、例えば他の手段によってサブ部分にされたゲノムＤＮＡのサブ部分などのゲノムＤＮＡの５０％未満を含む。他の実施形態において、ライブラリーは、全てまたは実質的に全てのゲノムＤＮＡを含む。全ゲノムまたはサブゲノムの断片からライブラリーを単離および調製するためのプロトコールは、当技術分野において知られており（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａのゲノムＤＮＡ試料調製キット）、実施例２Ａ、２Ｂおよび３として本明細書に記載されている。ＤＮＡ剪断のための代替法は、例２Ｂとして本明細書に記載されている。例えば、代替のＤＮＡ剪断方法は、より自動化可能および／またはより効果的であり得る（例えば、分解ＦＦＰＥ試料を用いる。）。ＤＮＡ剪断方法の代替が使用されて、ライブラリー調製中にライゲーションステップを回避することもできる。

【0216】

本明細書に記載されている方法は、例えば供給源ＤＮＡの量が限定的である場合（例えば、全ゲノム増幅後でさえも）、少量の核酸を使用して行われ得る。一実施形態において、核酸は、約５μｇ、４μｇ、３μｇ、２μｇ、１μｇ、０．８μｇ、０．７μｇ、０．６μｇ、０．５μｇ、または４００ｎｇ、３００ｎｇ、２００ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ、５ｎｇ、１ｎｇ未満、またはこれ以下の核酸試料を含む。例えば、典型的に、５０－１００ｎｇのゲノムＤＮＡで開始することができる。しかしながら、ハイブリダイゼーションステップ、例えば溶液ハイブリダイゼーションの前にゲノムＤＮＡを（例えば、ＰＣＲを使用して）増幅するならば、それより少ない量で始めることができる。したがって、ハイブリダイゼーション、例えば溶液ハイブリダイゼーションの前にゲノムＤＮＡを増幅することは可能であるが、必要不可欠ではない。

【0217】

ライブラリーを生成するために使用される核酸試料は、ＲＮＡから誘導されるＲＮＡまたはｃＤＮＡも含むことができる。一部の実施形態において、ＲＮＡは、全細胞ＲＮＡを含む。他の実施形態において、特定の豊富なＲＮＡ配列（例えば、リボソームＲＮＡ）は、枯渇されていた。他の実施形態において、全ＲＮＡ調製におけるポリ（Ａ）尾部化ｍＲＮＡ画分は、濃縮されていた。一部の実施形態において、ｃＤＮＡは、ランダムプライム化ｃＤＮＡ合成方法によって生成される。他の実施形態において、ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドによるプライミングによって、成熟したｍＲＮＡｓのポリ（Ａ）尾部で惹起される。枯渇、ポリ（Ａ）濃縮、およびｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者によく知られている。

【0218】

方法は、当業者に知られている特異的または非特異的核酸増幅方法によって核酸試料を増幅することをさらに含むことができる。核酸試料は、例えば、ランダムプライム化鎖置換増幅などの全ゲノム増幅方法によって、増幅され得る。

【0219】

核酸試料は、本明細書において記載されている通りの物理的または酵素的方法によって断片化または剪断され、サイズ選択（例えば、調製用ゲル電気泳動法による。）および増幅（例えば、ＰＣＲによる。）された合成アダプターにライゲートされ得る。核酸の断片化およびアダプターライゲートされた基は、ハイブリッド選択より前の顕在的サイズ選択または増幅なく使用される。

【0220】

ライブラリーメンバー
「メンバー」もしくは「ライブラリーメンバー」または他の同様の用語は、本明細書で使用される場合、ライブラリーのメンバー（または「ライブラリーキャッチ」）である核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを指す。ライブラリーメンバーは、本明細書において記載されている通りの腫瘍メンバー、参照メンバー、またはＰＧｘメンバーの１つ以上であり得る。典型的に、メンバーは、ＤＮＡ分子、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子である。メンバーは、例えば酵素的に断片化されたまたは剪断することによって断片化されたゲノムＤＮＡであり得る。メンバーは、対象からのヌクレオチド配列を含むことができ、対象から誘導されたのではないヌクレオチド配列、例えばプライマーもしくはアダプター（例えば、ＰＣＲ増幅用または配列決定用）、または試料の同定を可能にする配列、例えば「バーコード」配列を含むこともできる。

【0221】

本明細書で使用される場合、「標的メンバー」は、核酸ライブラリーから単離するのを所望する核酸分子を指す。一実施形態において、標的メンバーは、本明細書において記載されている通りの腫瘍メンバー、参照メンバー、またはＰＧｘメンバーであり得る。核酸ライブラリーから実際に選択されたメンバーは、本明細書において「ライブラリーキャッチ」と称される。一実施形態において、ライブラリーキャッチは、ライブラリーのメンバーの選択または濃縮、例えば、本明細書において記載されている通りのハイブリッド捕捉の１回以上のラウンド後のライブラリーの濃縮または選択されたアウトプットを含む。

【0222】

標的メンバーは、ライブラリーのサブグループであってよく、すなわち、ライブラリーメンバーの全てが、本明細書に記載されているプロセスの任意の特別な使用によって選択されるというわけではない。他の実施形態において、標的メンバーは、所望の標的領域内にある。例えば、標的メンバーは、一部の実施形態において、１０％ほども低いまたは９５％－９８％ほども高い、またはこれより高いライブラリーメンバーの百分率であり得る。一実施形態において、ライブラリーキャッチは、標的メンバーの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％、またはこれ以上を含む。別の実施形態において、ライブラリーは、標的メンバーの１００％を含有する。一実施形態において、ライブラリーキャッチの純度（アラインメント標的に対する読み取りの百分率）は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、９９．９％、またはこれ以上である。

【0223】

ゲノムＤＮＡから得られる標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）は、ゲノムＤＮＡの約０．０００１％未満、少なくとも約０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．０１％もしくは少なくとも約０．１％を含むように、全ゲノムＤＮＡの小部分を含むことができ、またはゲノムＤＮＡの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％もしくは１０％、もしくはゲノムＤＮＡの１０％超を含むように、全ゲノムＤＮＡのより大きな部分を含むことができる。

【0224】

一実施形態において、標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）は、ゲノムの複合混合物から選択される。例えば、１つの細胞型（例えば、癌細胞）からのＤＮＡの選択は、他の細胞型（例えば、正常細胞）からのＤＮＡを含有する試料からである。こうした用途において、標的メンバーは、複合試料中に存在する核酸配列の全複雑性の０．０００１％未満、少なくとも０．０００１％、少なくとも約０．００１％、少なくとも約０．０１％、または少なくとも約０．１％を含むことができ、または錯体試料中に存在する核酸配列の全複雑性の少なくとも約１％、２％、５％、１０％、または１０％超を含むように、より大きな部分を含むことができる。

【0225】

一実施形態において、本明細書に記載されている方法（例えば、溶液ハイブリダイゼーション選択方法）によって選択される標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）は、ゲノムエクソンの約０．１％、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％超など、ゲノムにおけるエクソンの全てまたは一部を含む。別の実施形態において、標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）は、エクソン、例えば少なくとも約１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個または１０００個の特別なエクソン、例えば、癌などの特別な疾患と関連するエクソンの特異的群であり得る。なお別の実施形態において、標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）は、目的の選択遺伝子のエクソンまたは他の対を含有する。特異的ベイト配列の使用は、実務者が、特別な選択のための核酸の群からの多くのエクソンまたはわずかなエクソン（または他の配列）を含有する標的配列（選択された配列の理想的セット）および核酸のサブグループ（選択された配列の実際のセット）を選択するのを可能にする。

【0226】

一実施形態において、標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）は、ｃＤＮＡのセットを含む。ｃＤＮＡを捕捉することは、例えばスプライスバリアントを見出すため、および融合転写物（例えば、ゲノムＤＮＡ転座から。）を同定するために使用され得る。別の実施形態において、標的メンバー（およびライブラリーキャッチ）は、例えば腫瘍において、細胞、組織または臓器のＲＮＡ画分中に発現される単一塩基の変化および他の配列変化を見出すために使用される。

【0227】

標的メンバー（またはライブラリーキャッチ）（例えば、エクソン、ｃＤＮＡおよび他の配列）は、所望通りに関連または非関連であってよい。例えば、選択標的メンバー（およびライブラリーキャッチ）は、疾患に関与される遺伝子である核酸の群、例えば、癌など１種以上の疾患に関係づけられる遺伝子の群、特異的ＳＮＰを含有する核酸の群から得ることができる。

【0228】

一実施形態において、ライブラリーメンバーの一部または全ては、非標的アダプター配列を含む。アダプター配列は、例えば配列決定方法（例えば、ＮＧＳ方法）に、増幅に、逆転写に、またはベクターへのクローニングに有用であり得る。アダプター配列は、一方または両方の末端に位置され得る。アダプターは、例えば付属の実施例に記載されている通り、ライブラリー挿入の５’－または３’－３末端でライゲートされ得る。アダプターは、ＤＮＡオリゴについてはＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの市販供給元から得ることができる。

【0229】

アダプターに相補的なブロッキングオリゴヌクレオチドは、当技術分野において知られている方法、例えばオリゴ合成の方法によって、設計および調製され得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡオリゴについてはＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓなどの市販供給元から得ることもできる。これらのアダプターの長さおよび組成は、例えば、当技術分野において知られている方法に従って相補的アダプターとの結合相互作用（例えば、本明細書において記載されている通りのＴ_ｍ）を修飾するために調整され得る。

【0230】

ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方の組合せを含むことができる。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然または非天然であってよい。特定の実施形態において、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、例えば溶融温度を増加させるため、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む。例示的非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドが挙げられる。例示的修飾ＲＮＡヌクレオチドは、ロックド核酸（ＬＮＡ）であり、ここで、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で修飾されている（Ｋａｕｒ，Ｈ；Ａｒｏｒａ，Ａ；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ；Ｍａｉｔｉ，Ｓ；Ａｒｏｒａ，Ａ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｍａｉｔｉ，Ｓ．（２００６）。「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ，Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ，ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ」。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３）：７３４７－５５）。他の修飾された例示的ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドとしては、これらに限定されないが、ペプチド結合によって連結されている反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位から構成されているペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５（６４４６）：５６６－８）；低ＧＣ領域を捕捉するために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）または架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン；および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。他の修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、当技術分野において知られている。

【0231】

ベイトの設計および構築
ベイトは、標的核酸にハイブリダイズし（例えば、相補的である。）、これによって、標的核酸の捕捉を可能にすることができる核酸分子、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子であり得る。一実施形態において、ベイトはＲＮＡ分子である。他の実施形態において、ベイトは、例えば結合実体に結合することによって、ベイトおよびベイトにハイブリダイズされる核酸により形成されるハイブリッドの捕捉および分離を可能にする結合実体、例えば親和性タグを含む。一実施形態において、ベイトは、溶液相ハイブリダイゼーションに適当である。

【0232】

典型的に、ＲＮＡ分子は、ベイト配列として使用される。ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖より安定であり、そのため、核酸の潜在的により良好な捕捉を提供する。

【0233】

ＲＮＡベイトは、これらに限定されないが、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡ分子のデノボ化学合成および転写を含めて当技術分野において知られている方法を使用して、本明細書において他所で記載されている通りに作製され得る。一実施形態において、ベイト配列は、ＰＣＲなどの公知の核酸増幅方法を使用して、例えば、鋳型としてヒトＤＮＡまたはプールされたヒトＤＮＡ試料を使用して生成される。オリゴヌクレオチドは、次いで、ＲＮＡベイトに変換され得る。一実施形態において、インビトロ転写は、例えば、オリゴヌクレオチドの１つの末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加することに基づいて使用される。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、例えばＰＣＲまたは他の核酸増幅方法を使用してベイト配列を増幅または再増幅することによって、例えばＲＮＡプロモーター配列を用いる各標的特異的プライマー対の１つのプライマーをテーリングすることによって、ベイトの末端に付加される。一実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼまたはＴ３ポリメラーゼである。一実施形態において、ＲＮＡベイトは、タグ、例えば親和性タグで標識される。一実施形態において、ＲＮＡベイトは、例えばビオチン化ＵＴＰを使用するインビトロ転写によって作製される。別の実施形態において、ＲＮＡベイトは、ビオチンを用いることなく生成され、次いでビオチンは、ソラレン架橋など当技術分野においてよく知られている方法を使用して、ＲＮＡ分子に架橋される。一実施形態において、ＲＮＡベイトは、ＲＮａｓｅ分解に抵抗するＲＮＡ分子を生成するために例えば転写中に修飾ヌクレオチドを使用することによって作製され得るＲＮａｓｅ抵抗性ＲＮＡ分子である。一実施形態において、ＲＮＡベイトは、二本鎖化ＤＮＡ標的の１つの鎖だけに対応する。典型的に、こうしたＲＮＡベイトは、自己相補的でなく、ハイブリダイゼーションドライバーとして、より有効である。

【0234】

ベイトセットは、ベイトが参照配列の標的を選択するのに最適であるように参照配列から設計され得る。一部の実施形態において、ベイト配列は、混合塩基（例えば、縮重）を使用して設計される。例えば、混合塩基（単数または複数）は、共通のＳＮＰまたは変異の位置（単数または複数）でベイト配列に含められることで、対立遺伝子の両方（例えば、ＳＮＰおよび非ＳＮＰ；変異体および非変異体）をキャッチするためのベイト配列を最適化することができる。一部の実施形態において、全ての公知配列変動（またはこのサブセット）は、混合縮重オリゴヌクレオチドを使用することによるよりむしろ、複数のオリゴヌクレオチドベイトを用いて標的化され得る。

【0235】

特定の実施形態において、ベイトセットは、約１００ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。典型的に、ベイトセットは、約１３０ヌクレオチド長から２３０ヌクレオチド長、または約１５０ヌクレオチド長から２００ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。他の実施形態において、ベイトセットは、約３００ヌクレオチド長から１０００ヌクレオチド長の間のオリゴヌクレオチド（または複数のオリゴヌクレオチド）を含む。

【0236】

一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドにおける標的メンバー特異的配列は、約４０ヌクレオチド長から１０００ヌクレオチド長、約７０ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長、約１００ヌクレオチド長から２００ヌクレオチド長の間、典型的には、約１２０ヌクレオチド長から１７０ヌクレオチド長の間である。

【0237】

一部の実施形態において、ベイトセットは、結合実体を含む。結合実体は、各ベイト配列上の親和性タグであり得る。一部の実施形態において、親和性タグは、ビオチン分子またはハプテンである。特定の実施形態において、結合実体は、アビジン分子などのパートナー、またはハプテンに結合する抗体もしくはこの抗原結合断片に結合することによって、ハイブリダイゼーション混合物からベイト／メンバーハイブリッドの分離を可能にする。

【0238】

他の実施形態において、ベイトセットにおけるオリゴヌクレオチドは、同じ標的メンバー配列に対して順方向および逆の相補配列を含有し、これによって、逆相補体メンバー特異的配列を有するオリゴヌクレオチドは、逆相補体ユニバーサル尾部も保有する。これは、同じ鎖であるＲＮＡ転写物、すなわち互いに相補的でないＲＮＡ転写物に至ることができる。

【0239】

他の実施形態において、ベイトセットは、１つ以上の位置に縮重塩基または混合塩基を含有するオリゴヌクレオチドを含む。また他の実施形態において、ベイトセットは、生物体の単一の種または群集の集団中に存在する複数のまたは実質的に全ての公知配列バリアントを含む。一実施形態において、ベイトセットは、ヒト集団中に存在する複数のまたは実質的に全ての公知配列バリアントを含む。

【0240】

他の実施形態において、ベイトセットは、ｃＤＮＡ配列を含む、またはｃＤＮＡ配列から誘導される。他の実施形態において、ベイトセットは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはクローニングＤＮＡから増幅される増幅生成物（例えば、ＰＣＲ生成物）を含む。

【0241】

他の実施形態において、ベイトセットは、ＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態において、セットは、これらに限定されないが、より安定であり、ＲＮａｓｅに抵抗性であるものを含めて、化学的酵素的に修飾されたまたはインビトロ転写されたＲＮＡ分子を含む。

【0242】

なお他の実施形態において、ベイトは、参照により本明細書に組み込むＵＳ ２０１０／００２９４９８ およびＧｎｉｒｋｅ，Ａ．ら（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。２７（２）：１８２－１８９に記載されている方法によって生成される。例えば、ビオチン化ＲＮＡベイトは、元々マイクロアレイ上で合成された合成の長いオリゴヌクレオチドのプールを得ること、およびオリゴヌクレオチドを増幅してベイト配列を提供することによって生成される。一部の実施形態において、ベイトは、ベイト配列の１つの末端でＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加すること、およびＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ配列を合成することによって生成される。一実施形態において、合成のオリゴデオキシヌクレオチドのライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．などの市販供給元から得られ、公知の核酸増幅方法を使用して増幅させることができる。

【0243】

したがって、上述のベイトセットを作製する方法が提供される。方法は、１つ以上の標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列（例えば、本明細書において記載されている通りの１つ以上の変異捕捉、参照または対照オリゴヌクレオチド配列）を選択すること；標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを得ること（例えば、マイクロアレイ合成によって、標的特異的ベイトオリゴヌクレオチド配列のプールを合成すること）；および場合によって、オリゴヌクレオチドを増幅してベイトセットを生成することを含む。

【0244】

他の実施形態において、方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを使用するオリゴヌクレオチドを増幅すること（例えば、ＰＣＲによる。）をさらに含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、マイクロアレイに付着された各オリゴヌクレオチドの末端にユニバーサル配列を含む。方法は、オリゴヌクレオチドからユニバーサル配列を除去することをさらに含む。こうした方法は、オリゴヌクレオチドの相補鎖を除去すること、オリゴヌクレオチドをアニーリングすること、およびオリゴヌクレオチドを延長することも含むことができる。これらの実施形態の一部において、オリゴヌクレオチドを増幅する（例えば、ＰＣＲによる。）ための方法は、１つ以上のビオチン化プライマーを使用する。一部の実施形態において、方法は、増幅オリゴヌクレオチドをサイズ選択することをさらに含む。

【0245】

一実施形態において、ＲＮＡベイトセットが作製される。方法は、本明細書に記載されている方法に従ってベイト配列のセットを生成すること、ベイト配列の１つの末端でＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加すること、およびＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ配列を合成することを含む。ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼまたはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼから選択され得る。他の実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列は、ベイト配列を増幅すること（例えば、ＰＣＲによる。）によって、ベイト配列の末端で付加される。ゲノムまたはｃＤＮＡからの特異的プライマー対を用いるＰＣＲによってベイト配列が増幅される実施形態において、各対における２つの特異的プライマーの１つの５’末端にＲＮＡプロモーター配列を付加することは、標準的方法を使用してＲＮＡベイトに転写され得るＰＣＲ生成物に至る。

【0246】

他の実施形態において、ベイトセットは、鋳型としてヒトＤＮＡ試料またはプールされているヒトＤＮＡ試料を使用して生成され得る。こうした実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅される。他の実施形態において、増幅されたオリゴヌクレオチドは、ローリングサークル増幅または超分岐ローリングサークル増幅によって再増幅される。同方法は、鋳型としてヒトＤＮＡ試料またはプールされているヒトＤＮＡ試料を使用してベイト配列を生成することにも使用され得る。同方法は、これらに限定されないが、制限消化、パルスフィールドゲル電気泳動、フロー選別、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離、選択的動態学的再会合、染色体調製物の顕微解剖、および当業者に知られている他の部分化方法を含めて、他の方法によって得られるゲノムのサブ部分を使用して、ベイト配列を生成するためにも使用され得る。

【0247】

特定の実施形態において、ベイトセットにおけるベイトの数は、１，０００未満である。他の実施形態において、ベイトセットにおけるベイトの数は、１，０００超、５，０００超、１０，０００超、２０，０００超、５０，０００超、１００，０００超または５００，０００超である。

【0248】

ベイト配列の長さは、約７０ヌクレオチドから１０００ヌクレオチドの間であり得る。一実施形態において、ベイトの長さは、約１００から３００ヌクレオチド長、１１０から２００ヌクレオチド長、または１２０から１７０ヌクレオチド長の間である。上に記述されているものに加えて、約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００および９００ヌクレオチド長の中間体オリゴヌクレオチド長さが、本明細書に記載されている方法において使用され得る。一部の実施形態において、約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０または２３０塩基長のオリゴヌクレオチドが使用され得る。

【0249】

各ベイト配列は、一方または両方の末端上に標的特異的（例えば、メンバー特異的）ベイト配列およびユニバーサル尾部を含むことができる。本明細書で使用される場合、「ベイト配列」という用語は、標的特異的「ベイト配列」およびオリゴヌクレオチドの他のヌクレオチドを含めて、標的特異的ベイト配列または全オリゴヌクレオチドを指すことができる。ベイトにおける標的特異的配列は、約４０ヌクレオチド長から１０００ヌクレオチド長の間である。一実施形態において、標的特異的配列は、約７０ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長の間である。別の実施形態において、標的特異的配列は、約１００ヌクレオチド長から２００ヌクレオチド長の間である。なお別の実施形態において、標的特異的配列は、約１２０ヌクレオチド長から１７０ヌクレオチド長の間、典型的には１２０ヌクレオチド長である。約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００および９００ヌクレオチド長の標的特異的配列、ならびに上に記述されている長さの間の長さの標的特異的配列など、上に記述されているものに加えて中間の長さも、本明細書に記載されている方法において使用され得る。

【0250】

一実施形態において、ベイトは、約５０から２００ヌクレオチド長（例えば、約５０、６０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１９０または２００ヌクレオチド長）のオリゴマー（例えば、ＲＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴマー、またはこれらの組合せで構成されている。）である。一実施形態において、各ベイトオリゴマーは、標的特異的ベイト配列である、約１２０から１７０、または典型的には約１２０ヌクレオチドを含む。ベイトは、一方または両方の末端に追加の非標的特異的ヌクレオチド配列を含むことができる。追加のヌクレオチド配列は、例えば、ＰＣＴ増幅のためまたはベイト識別子として使用され得る。特定の実施形態において、ベイトは、本明細書において記載されている通りの結合実体（例えば、ビオチン分子などの捕捉タグ）を追加として含む。結合実体、例えばビオチン分子は、ベイトに、例えばベイトの５’、３’末端または内部に（例えば、ビオチン化ヌクレオチドを組み込むことにより）付着され得る。一実施形態において、ビオチン分子は、ベイトの５’末端で付着される。

【0251】

１つの例示的実施形態において、ベイトは、１２０ヌクレオチドが標的特異的「ベイト配列」である約１５０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。この他の３０ヌクレオチド（例えば、各末端上の１５ヌクレオチド）は、ＰＣＲ増幅のために使用されるユニバーサルな任意の尾部である。尾部は、ユーザーによって選択される任意の配列であってよい。例えば、合成のオリゴヌクレオチドのプールは、Ｎ_１２０が標的特異的ベイト配列を示す５’－ＡＴＣＧＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＴＮ_１２０ＣＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＣＴＣＡ－３’（配列番号１００）の配列のオリゴヌクレオチドを含むことができる。

【0252】

本明細書に記載されているベイト配列は、エクソンおよび短い標的配列の選択のために使用され得る。一実施形態において、ベイトは、約１００ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長の間である。別の実施形態において、ベイトは、約１３０ヌクレオチド長から２３０ヌクレオチド長の間である。なお別の実施形態において、ベイトは、約１５０ヌクレオチド長から２００ヌクレオチド長の間である。例えばエクソンおよび短い標的配列の選択のための、ベイトにおける標的特異的配列は、約４０ヌクレオチド長から１０００ヌクレオチド長の間である。一実施形態において、標的特異的配列は、約７０ヌクレオチド長から３００ヌクレオチド長の間である。別の実施形態において、標的特異的配列は、約１００ヌクレオチド長から２００ヌクレオチド長の間である。なお別の実施形態において、標的特異的配列は、約１２０ヌクレオチド長から１７０ヌクレオチド長の間である。

【0253】

一部の実施形態において、長いオリゴヌクレオチドは、標的配列を捕捉するのに必要なオリゴヌクレオチドの数を最小化することができる。例えば、エクソン１個当たり１個のオリゴヌクレオチドが使用され得る。ヒトゲノムにおけるタンパク質コードエクソンの平均長さおよび中央長さはそれぞれ約１６４および１２０塩基対であることが、当技術分野において知られている。より長いベイトは、より特異的であり、より短いものより良好に捕捉することができる。結果として、オリゴヌクレオチドベイト配列１個当たりの成功率は、短いオリゴヌクレオチドを用いるより高い。一実施形態において、最小ベイトにカバーされる配列は、例えばエクソンサイズ標的を捕捉するため、１つのベイトのサイズ（例えば、１２０－１７０塩基）である。ベイト配列の長さを決定する際に、不必要に長いベイトが、標的に直接隣接する望まれないＤＮＡをより多くキャッチすることも考慮に入れることができる。より長いオリゴヌクレオチドベイトは、ＤＮＡ試料中の標的化領域における多型に対して、より短いものより耐性であることもあり得る。典型的に、ベイト配列は、参照ゲノム配列から誘導される。実際のＤＮＡ試料における標的配列が参照配列から外れるならば、例えばそれが単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含有するならば、ベイトに対して効果的にハイブリダイズできず、そのため、ベイト配列にハイブリダイズされた配列において表示不足または完全に存在しないことがある。例えば１２０個から１７０個の塩基における単一の不対合が、それぞれ多重増幅およびマイクロアレイ捕捉における典型的なベイトまたはプライマーの長さである２０個または７０個の塩基における単一のミスマッチよりもハイブリッド安定性に対する効果がないことがあるという理由のため、ＳＮＰによる対立遺伝子の脱落は、より長い合成のベイト分子にはありそうにない。

【0254】

ゲノム領域など、捕捉ベイトの長さと比較して長い標的の選択のため、ベイト配列長さは、典型的に、上に記述されている短い標的のためのベイトと同じサイズ範囲であるが、但し、隣接配列の標的化を最小化するという唯一の目的のためにベイト配列の最大サイズを限定する必要がない場合を除く。代替として、オリゴヌクレオチドは、よりずっと広いウィンドウ（典型的に６００個の塩基）にわたってタイトル付けされ得る。この方法は、典型的エクソンよりずっと大きい（例えば、約５００個の塩基）ＤＮＡ断片を捕捉するために使用され得る。結果として、より多くの望まれないフランキング非標的配列が選択される。

【0255】

ベイト合成
ベイトは、任意の型のオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＤＮＡまたはＲＮＡベイト（「オリゴベイト」）は、個別に合成され得る、またはＤＮＡまたはＲＮＡベイトセットとしてのアレイ（「アレイベイト」）において合成され得る。オリゴベイトは、アレイフォーマットで提供されるかまたは単離オリゴとして提供されるかにかかわらず、典型的に一本鎖である。ベイトは、本明細書において記載されている通りの結合実体（例えば、ビオチン分子などの捕捉タグ）を追加として含み得る。結合実体、例えばビオチン分子は、ベイトに、例えばベイトの５’または３’末端で、典型的にはベイトの５’末端で付着され得る。

【0256】

一部の実施形態において、個別のオリゴベイトは、アレイベイトセットに付加され得る。これらの場合において、オリゴベイトは、アレイベイトによって標的化されるものと同じ区域を標的にするように設計することができ、追加のオリゴベイトは、ゲノムの特定の区域において、増強されたまたはより徹底的なカバレッジを達成するように設計され、標準的アレイベイトに付加され得る。例えば、追加のオリゴベイトは、標準的アレイベイトセットを用いる初期の配列決定ラウンドに続いて不十分な配列決定カバレッジの区域を標的にするように設計され得る。一部の実施形態において、オリゴベイトは、アレイベイトセットのためのカバレッジの区域に対するタイル張り効果、または他のオリゴベイトのためのカバレッジの区域に対するタイル張り効果を有するように設計されている。

【0257】

一実施形態において、個別のオリゴベイトは、ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴアレイベイトセットまたはこれらの組合せ（例えば、市販のアレイベイトセット）を補充するために使用されるＤＮＡオリゴである。他の実施形態において、個別のオリゴベイトは、個別に設計および合成されているオリゴの収集物であるＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴベイトセットまたはこれらの組合せを補充するために使用されるＤＮＡオリゴである。一実施形態において、個別のオリゴベイトは、ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴアレイベイトセットまたはこれらの組合せ（例えば、市販のアレイベイトセット）を補充するために使用されるＲＮＡオリゴである。他の実施形態において、個別のオリゴベイトは、個別に設計および合成されているオリゴの収集物である、ＲＮＡもしくはＤＮＡオリゴベイトセットまたはこれらの組合せを補充するために使用されるＲＮＡオリゴである。

【0258】

なお別の実施形態において、個別のオリゴベイトは、ＤＮＡオリゴアレイベイトセット（例えば、市販のアレイベイトセット）を補充するために使用されるＤＮＡオリゴであり、他の実施形態において、個別のオリゴベイトは、個別に設計および合成されているオリゴの収集物であるＤＮＡオリゴベイトセットを補充するために使用されるＤＮＡオリゴである。

【0259】

なお別の実施形態において、個別のオリゴベイトは、ＲＮＡオリゴアレイベイトセット（例えば、市販のアレイベイトセット）を補充するために使用されるＤＮＡオリゴであり、他の実施形態において、個別のオリゴベイトは、個別に設計および合成されているオリゴの収集物であるＲＮＡオリゴベイトセットを補充するために使用されるＤＮＡオリゴである。

【0260】

なお別の実施形態において、個別のオリゴベイトは、ＲＮＡオリゴアレイベイトセット（例えば、市販のアレイベイトセット）を補充するために使用されるＲＮＡオリゴであり、他の実施形態において、個別のオリゴベイトは、個別に設計および合成されているオリゴの収集物であるＲＮＡオリゴベイトセットを補充するために使用されるＲＮＡオリゴである。

【0261】

なお別の実施形態において、個別のオリゴベイトは、ＤＮＡオリゴアレイベイトセット（例えば、市販のアレイベイトセット）を補充するために使用されるＲＮＡオリゴであり、他の実施形態において、個別のオリゴベイトは、個別に設計および合成されているオリゴの収集物であるＤＮＡオリゴベイトセットを補充するために使用されるＲＮＡオリゴである。

【0262】

一実施形態において、オリゴベイトは、特に目的の遺伝子における配列を標的にするように、例えば、拡大された遺伝子セットの配列決定カバレッジの増加を達成するように設計される。

【0263】

別の実施形態において、オリゴベイトは、ゲノムのサブセットを表す配列を標的にするように設計され、アレイベイトの代わりにまたはアレイベイトに加えて、プールとして混合および使用される。

【0264】

一実施形態において、オリゴベイトの第１のセットは、不十分な配列決定カバレッジの区域を標的にするように設計され、オリゴベイトの第２のセットは、特に目的の遺伝子を標的にするように設計される。次いで、オリゴベイトの両セットは組み合わされ、場合によって、配列決定のために使用されるべき標準的アレイベイトセットと混合される。

【0265】

一実施形態において、オリゴベイトミックスは、例えば、標的化遺伝子パネルを同時に配列決定するため、およびゲノム再編成およびコピー数の改変（アレイ化ＣＧＨ（比較用ゲノムハイブリダイゼーション）と同等）を探すという目的のために創出される単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）のパネルをスクリーンするために使用される。例えば、最初にＳＮＰのパネルが、アレイベイトとしてアレイ方法によって創出され、次いで、追加のＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトが、遺伝子の標的化セットに対して不十分な配列決定カバレッジの区域を標的にするように設計され得る。ＳＮＰの収集物の配列決定は、次いで、元のアレイベイトセットプラス追加のオリゴベイトで反復されて、意図される全配列決定カバレッジを達成することができる。

【0266】

一部の実施形態において、オリゴベイトは、標準的アレイベイトセットに付加されて、より徹底的な配列決定カバレッジを達成する。一実施形態において、オリゴベイトは、標準的アレイベイトセットを用いる初期の配列決定ラウンドに続いて、不十分な配列決定カバレッジの区域を標的にするように設計されている。

【0267】

別の実施形態において、オリゴベイトは、特に目的の遺伝子における配列を標的にするように設計されている。これらのオリゴベイトは、標準的アレイベイトセットに、または現存のオリゴ／アレイハイブリッドベイトセットに付加されて、例えば、全アレイベイトプール再設計サイクルを経ることなく拡大された遺伝子セットの配列決定カバレッジの増加を達成することができる。

【0268】

オリゴベイトは、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）またはＤＮＡオリゴについてはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの市販供給源から得ることができる。オリゴは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからも得ることができる。濃縮のためのプロトコールは、公的に入手可能であり、例えばＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔである。

【0269】

濃縮系
ベイトは、参照により本明細書に組み込むＵＳ ２０１０／００２９４９８およびＧｎｉｒｋｅ，Ａ．ら（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（２）：１８２－１８９に記載されている方法によって生成され得る。例えば、ビオチン化ＲＮＡベイトは、マイクロアレイ上で元々合成される合成の長いオリゴヌクレオチドのプールを得ること、およびオリゴヌクレオチドを増幅してベイト配列を生成することによって生成され得る。一部の実施形態において、ベイトは、ベイト配列の１つの末端でＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を付加すること、およびＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡ配列を合成することによって生成される。一実施形態において、合成のオリゴデオキシヌクレオチドのライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．などの市販供給元から得られ、公知の核酸増幅方法を使用して増幅され得る。

【0270】

例えば、ベイトの大きな収集物は、オリゴヌクレオチドアレイ、例えばＡｇｉｌｅｎｔプログラム制御可能なＤＮＡマイクロアレイ上で元々合成された合成のオリゴヌクレオチドのカスタムプールから生成され得る。したがって、少なくとも約２，５００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３，０００、４０，０００、５０，０００、または６０，０００個の独特のオリゴヌクレオチドは、同時に合成され得る。

【0271】

一実施形態において、独特のオリゴヌクレオチドの最小セットが選択され、追加のコピー（例えば、逆相補体と元の順方向鎖との間で交互する。）が、例えば標的の予備選択セット（例えば、エクソンの予備選択セット）を捕捉するように設計されているベイトのために合成のオリゴヌクレオチドアレイの最大容量が達されるまで付加される。別の実施形態において、標的は、例えば順方向および逆相補体オリゴヌクレオチドの両方を合成することによって、少なくとも２回表される。所定の標的に対する順方向および逆相補体オリゴヌクレオチドを合成することは、非常に同じ配列を２回合成することより良好なリダンダンシーを合成ステップで提供することができる。なお別の実施形態において、ＰＣＲ生成物またはベイトは、順方向および逆相補体オリゴヌクレオチドに関して同じである。

【0272】

チップからのオリゴヌクレオチドは、１回合成され、次いで増幅されて、何回も使用され得るオリゴヌクレオチドのセットを創出することができる。この手法は、多数の選択実験のためのベイトとして使用され得るユニバーサル試薬を生成し、これによって、配列決定コストのごく一部であるべきチップのコストを償却する。代替として、ベイト配列は、ＰＣＲなどの公知の核酸増幅方法を使用し、鋳型としてヒトＤＮＡ試料またはプールされているヒトＤＮＡ試料を使用して生成され得る。

【0273】

合成に続いて、オリゴヌクレオチドは、化学的開裂、続いて保護基の除去、およびユニバーサルプライマーを使用して二本鎖化ＤＮＡに増幅されたＰＣＲによって、アレイから放出され得る（例えば、剥離される。）。ＰＣＲの第２のラウンドは、ＤＮＡを一本鎖ＲＮＡに転写するために使用されるアンプリコンに、プロモーター（例えば、Ｔ７、ＳＰ６またはＴ３プロモーター）部位を組み込むために使用され得る。

【0274】

一実施形態において、ベイトは、ギャップまたは重なりなく配列（例えば、エクソン）に沿ってタイル張りされている。例えば、ベイトはＵＣＳＣゲノムブラウザにおいて示されている参照ゲノム配列の鎖中の最も「左」のコード塩基で開始することができ（例えば、遺伝子の配向に依存してコード配列に沿って５’から３’または３’から５’）、追加のベイトは、全てのコード塩基がカバーされるまで付加される。別の実施形態において、各標的に対して少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのベイトが、少なくとも約１５個、３０個、４５個または６０個の塩基が重なって設計される。オリゴヌクレオチド合成、およびユニバーサルプライマーを使用するＰＣＲ増幅の後、二本鎖化ＤＮＡの尾部の１つが酵素分解され、続いて、鎖の１つが分解され得る。一本鎖生成物は、ハイブリダイズされ、充填することによって完全二本鎖化にされ、ＰＣＲによって増幅され得る。この方式において、化学合成され得るよりも多い、少なくとも約３００個、４００個、５００個または６００個の連続する標的特異的塩基を含有するベイトを生成することが可能である。こうした長いベイトは、高い特異性および感受性を必要とする用途に、またはベイトの長さを限定することから必ずしも利益を得ない用途（例えば、長い近接するゲノム領域の捕捉）に有用であり得る。

【0275】

一実施形態において、各標的のカバレッジは判定することができ、同様のカバレッジを得る標的はグループ化することができる。ベイト配列の明確に異なるセットは、標的の各群のために創出されて、表示をさらに改善することができる。別の実施形態において、マイクロアレイチップからのオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの効力について試験され、オリゴヌクレオチドがそれらの捕捉効力によってグループ化されるマイクロアレイチップの生成ラウンドが要求され、したがって、ベイト効力における変動を相殺する。なお別の実施形態において、相対的に少数の複合体プールを形成するためにオリゴヌクレオチドプールが凝集されて、これらの間の捕捉効力における変動はほとんどない。

【0276】

本明細書に記載されているベイトは、タグ、例えば親和性タグで標識され得る。例示的親和性タグとしては、これらに限定されないが、ビオチン分子、磁性粒子、ハプテン、またはタグ分子でタグ付けされたベイトの単離を可能にする他のタグ分子が挙げられる。こうした分子および核酸にこれらを付着させる方法（例えば、本明細書において開示されている方法において使用されるベイト）は、当技術分野においてよく知られている。ビオチン化ベイトを作製するための例示的方法は、例えば、参照により全体が本明細書に組み込むＧｎｉｒｋｅＡ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；２７（２）：１８２－９に記載されている。

【0277】

その上、当技術分野において知られているのは、タグ付けされたベイトのセットに結合するまたはハイブリダイゼーション混合物からそれを分離させられる分子、粒子または装置である。一実施形態において、分子、粒子または装置は、タグ（例えば、親和性タグ）に結合する。一実施形態において、分子、粒子または装置は、アビジン分子、磁石、または抗体もしくはこの抗原結合断片である。一実施形態において、タグ付けされたベイトは、ストレプトアビジン分子でコーティングされている磁性ビーズを使用して分離される。

【0278】

オリゴヌクレオチドライブラリーを調製するための例示的方法は、例えば、参照により全体を本明細書に組み込むＧｎｉｒｋｅ Ａ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；２７（２）：１８２－９、およびＢｌｕｍｅｎｓｔｉｅｌ Ｂ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２０１０；１８章：１８．４ユニットに記載されている。

【0279】

本発明において特色とされている方法および組成物は、各ベイトセット／標的カテゴリーの相対配列カバレッジを調整することを伴う。ベイト設計における相対配列カバレッジの差異を与えるための方法は、以下の１つ以上を含む：
（ｉ）異なるベイトセットの示差表示－所定の標的（例えば、標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計は、相対的な標的カバレッジ深度を増強／低減するため、より多い／より少ない数のコピーに含められ得る；
（ｉｉ）ベイトサブセットの示差重なり－所定の標的（例えば、標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計は、隣接しているベイト間により長いまたはより短い重なりを含むことで、相対的な標的カバレッジ深度を増強／低減することができる；
（ｉｉｉ）示差ベイトパラメータ－所定の標的（例えば、標的メンバー）を捕捉するためのベイトセット設計は、配列修飾／より短い長さを含むことで、捕捉効率を低減するとともに相対的な標的カバレッジ深を低下させることができる；
（ｉｖ）異なるベイトセットの混合－異なる標的セットを捕捉するにように設計されているベイトセットは、異なるモル比で混合されて、相対的な標的カバレッジ深度を増強／低減することができる；
（ｖ）オリゴヌクレオチドベイトセットの異なる型を使用すること－特定の実施形態において、ベイトセットは、以下を含むことができる：
（ａ）１つ以上の化学的に（例えば、非酵素的に）合成された（例えば、個別に合成された）ベイト、
（ｂ）アレイにおいて合成された１つ以上のベイト、
（ｃ）１つ以上の酵素的に調製された、例えばインビトロ転写されたベイト；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）および／もしくは（ｃ）の任意の組合せ、
（ｅ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＤＮＡオリゴヌクレオチド）、
（ｆ）１つ以上のＲＮＡオリゴヌクレオチド（例えば、天然または非天然のＲＮＡオリゴヌクレオチド）、
（ｇ）（ｅ）および（ｆ）の組合せ、または
（ｈ）上記の任意のものの組合せ。

【0280】

異なるオリゴヌクレオチド組合せは、異なる比、例えば１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：１０、１：２０、１：５０；１：１００または１：１０００などから選択される比で混合され得る。一実施形態において、化学合成ベイト対アレイ生成ベイトの比は、１：５、１：１０または１：２０から選択される。ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然または非天然であり得る。特定の実施形態において、ベイトは、例えば溶融温度を増加させるため、１つ以上の非天然ヌクレオチドを含む。例示的非天然オリゴヌクレオチドとしては、修飾されているＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチドが挙げられる。例示的修飾ＲＮＡヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）であり、ここで、ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で修飾される（Ｋａｕｒ，Ｈ；Ａｒｏｒａ，Ａ；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ；Ｍａｉｔｉ，Ｓ；Ａｒｏｒａ，Ａ．；Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．；Ｍａｉｔｉ，Ｓ．（２００６）。「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ、Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ、ａｎｄ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｔｏ ＤＮＡ Ｄｕｐｌｅｘｅｓ」。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４５（２３）：７３４７－５５）。他の例示的修飾ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドとしてはこれらに限定されないが、ペプチド結合によって連結されている反復Ｎ－（２－アミノエチル）－グリシン単位から構成されているペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５（６４４６）：５６６－８）；低ＧＣ領域を捕捉するために修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチド；二環式核酸（ＢＮＡ）または架橋オリゴヌクレオチド；修飾５－メチルデオキシシチジン；および２，６－ジアミノプリンが挙げられる。他の修飾ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドは、当技術分野において知られている。

【0281】

特定の実施形態において、標的配列（例えば、標的メンバー）の実質的に均一なまたは均質のカバレッジが得られる。例えば、各ベイトセット／標的カテゴリー内で、カバレッジの均一性は、例えば以下の１つ以上によってベイトパラメータを修飾することによって最適化され得る：
（ｉ）ベイト表示または重なりを増加／減少することが使用されて、同じカテゴリーにおける他の標的に対して、不足して／過度にカバーされる標的（例えば、標的メンバー）のカバレッジを増強／低減することができる；
（ｉｉ）低いカバレッジのため、標的配列（例えば、高ＧＣ含有量配列）を捕捉するのが難しいのであれば、カバーするためにベイトセット、例えば隣接配列（例えば、ＧＣが豊富でない隣接配列）で標的化されている領域を拡大する；
（ｉｉｉ）ベイト配列の修飾がなされて、ベイトの二次構造を低減するとともに選択のそれの効率を増強することができる；
（ｉｖ）ベイトの長さを修飾することが使用されて、同じカテゴリー内の異なるベイトの融解ハイブリダイゼーション動態を等しくすることができる。ベイトの長さは、直接的に（変動する長さでベイトを生成することによって）または間接的に（一貫性の長さのベイトを生成すること、およびベイト末端を任意の配列で置換することによって）修飾され得る；
（ｖ）同じ標的領域ための異なる配向のベイト（すなわち、順方向および逆の鎖）を修飾することは、異なる結合効率を有することがある。各標的のための最適なカバレッジを提供するいずれかの配向を有するベイトセットが選択され得る；
（ｖｉ）各ベイト上に存在する結合実体、例えば捕捉タグ（例えば、ビオチン）の量を修飾することは、それの結合効率に影響することがある。特異的標的を標的にするベイトのタグレベルを増加／減少することが使用されて、相対的な標的カバレッジを増強／低減することができる；
（ｖｉｉ）異なるベイトのために使用されるヌクレオチドの型を修飾することが改変されて、標的に対する結合親和性に影響するとともに相対的な標的カバレッジを増強／低減することができる；または
（ｖｉｉｉ）修飾オリゴヌクレオチドベイトを使用し、例えば、より安定な塩基対合を有することが使用されて、高ＧＣ含有量に対して低いまたは正常のＧＣ含有量の区域間の融解ハイブリダイゼーション動態を等しくすることができる。

【0282】

例えば、オリゴヌクレオチドベイトセットの異なる型が使用され得る。

【0283】

一実施形態において、選択の効率についての値は、予備選択標的領域を包含するためのベイトオリゴヌクレオチドの異なる型を使用することによって修飾される。例えば、第１のベイトセット（例えば、１０，０００－５０，０００個のＲＮＡまたはＤＮＡベイトを含むアレイベースのベイトセット）は、大きな標的区域（例えば、１－２ＭＢ全標的区域）をカバーするために使用され得る。第１のベイトセットは、第２のベイトセット（例えば、５，０００個未満のベイトを含む、個別に合成されたＲＮＡまたはＤＮＡベイトセット）でスパイクされて、予備選択標的領域（例えば、標的区域の目的のスパニングの選択サブゲノム間隔、例えば２５０ｋｂ以下）および／またはより高い二次構造、例えばより高ＧＣ含有量の領域をカバーすることができる。目的の選択サブゲノム間隔は、本明細書に記載されている遺伝子もしくは遺伝子産物、またはこの断片の１つ以上に対応することができる。第２のベイトセットは、所望されるベイト重なりに依存して、約２，０００－５，０００個のベイトを含むことができる。なお他の実施形態において、第２のベイトセットは、第１のベイトセットにスパイクされた選択オリゴベイト（例えば、４００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１０個未満のベイト）を含むことができる。第２のベイトセットは、個別のオリゴベイトの任意の比で混合され得る。例えば、第２のベイトセットは、１：１の等モル比で存在する個別のベイトを含むことができる。代替として、第２のベイトセットは、異なる比（例えば、１：５、１：１０、１：２０）で存在する個別のベイトを含むことで、例えば、特定の標的の捕捉を最適化することができる（例えば、特定の標的は、他の標的と比較して、５－１０×の第２のベイトを有することができる。）。

【0284】

ハイブリダイゼーション条件
本発明において特色とされる方法は、ライブラリー（例えば、核酸ライブラリー）と複数のベイトとを接触させて、選択ライブラリーキャッチを提供するステップを含む。接触ステップは、溶液ハイブリダイゼーションにおいて達成され得る。特定の実施形態において、方法には、溶液ハイブリダイゼーションの１つ以上の追加のラウンドによってハイブリダイゼーションステップを反復することが含まれる。一部の実施形態において、方法は、ベイトの同じまたは異なる収集物を用いる溶液ハイブリダイゼーションの１つ以上の追加のラウンドに、ライブラリーキャッチをかけることをさらに含む。

【0285】

他の実施形態において、本発明において特色とされる方法は、ライブラリーキャッチを増幅すること（例えば、ＰＣＲによる）をさらに含む。他の実施形態において、ライブラリーキャッチは増幅されない。

【0286】

なお他の実施形態において、方法は、ライブラリーキャッチを遺伝子型同定にかけ、これによって、選択核酸の遺伝子型を同定するステップをさらに含む。

【0287】

より具体的に、数千個のベイト配列の混合物は、核酸の群における相補的核酸に有効にハイブリダイズすることができ、こうしたハイブリダイズ化核酸（核酸のサブグループ）は、有効に分離および回復される。一実施形態において、本明細書に記載されている方法は、約１，０００個超のベイト配列、約２，０００個超のベイト配列、約３，０００個超のベイト配列、約４，０００個超のベイト配列、約５，０００個超のベイト配列、約６，０００個超のベイト配列、約７，０００個超のベイト配列、約８，０００個超のベイト配列、約９，０００個超のベイト配列、約１０，０００個超のベイト配列、約１５，０００個超のベイト配列、約２０，０００個超のベイト配列、約３０，０００個超のベイト配列、約４０，０００個超のベイト配列、または約５０，０００個超のベイト配列を含有するベイト配列のセットを使用する。

【0288】

一部の実施形態において、選択プロセスは、例えば選択核酸の濃縮を増大するために、核酸の選択サブグループ上で反復される。例えば、ハイブリダイゼーションの１つのラウンド後、核酸の数千倍の濃縮が観察され得る。第２のラウンド後、濃縮は、単一のシークエンサー実行において標的の何百倍のカバレッジを提供できる例えば約１５，０００倍の平均濃縮率まで上昇することができる。したがって、ハイブリッド選択の単一のラウンドにおいて達成不可能な濃縮因子を必要とする実験のため、方法は、典型的に、ベイト配列のセットを用いる溶液ハイブリダイゼーションの１つ以上の追加のラウンドに核酸の単離サブグループ（すなわち、標的配列の一部または全て）をかけることを含む。

【0289】

２つの異なるベイト配列（ベイト１、ベイト２）を用いる順次のハイブリッド選択は、「交差点」、すなわち、例えばこれらに限定されないが染色体間を濃縮することが挙げられる用途のために使用されるベイト１およびベイト２に結合するＤＮＡ配列のサブグループを、単離および配列決定するために使用され得る。例えば、第１染色体上の配列に対して特異的なベイトを用いる腫瘍試料からのＤＮＡの選択、続いて、第２染色体に対して特異的なベイトにハイブリダイズする配列の第１の選択の生成物からの選択は、両染色体からの配列を含有する染色体転座接合部で配列を濃縮することができる。

【0290】

核酸の選択サブグループの体積モル濃度は、任意の特別な核酸の体積モル濃度が、核酸のサブグループにおける全ての選択核酸の平均体積モル濃度の小さい変動内であるように制御され得る。標的表示の均等性を制御および最適化するための方法として、これらに限定されないが、当技術分野においてよく知られているプローブ設計の物理化学的および経験的規則に基づくベイト配列の合理的設計、ならびに働きが不十分であると知られているまたは疑われている配列がそれらの固有の弱点を補うために過剰表示されているベイトのプールが挙げられる。一部の実施形態において、核酸の単離サブグループの少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％は、平均体積モル濃度の約２０倍、１５倍、１０倍、５倍、３倍または２倍内である。一実施形態において、核酸の単離サブグループの少なくとも約５０％は、平均体積モル濃度の約３倍内である。別の実施形態において、核酸の単離サブグループの少なくとも約９０％は、平均体積モル濃度の約１０倍内である。

【0291】

選択の効率における変動は、ベイトの濃度を改変することによってさらに調整され得る。一実施形態において、選択の効率は、ベイトの等モルミックスを使用する場合に観察される示差配列捕捉効率を参照してベイトの相対的豊富度または結合実体（例えば、ハプテンまたは親和性タグの密度）の密度を調整することによって群（例えば、第１、第２または第３の複数のベイト）内の個別のベイトの効率を平準化すること、および次いで内部平準化群２に対して、ちょうど等しい内部平準化群１の示差的過剰を全体的ベイトミックスに導入することによって調整される。

【0292】

特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、標的配列の均等カバレッジを達成することができる。一実施形態において、予想されるカバレッジの少なくとも約５０％を有する標的塩基のパーセントは、例えば、タンパク質コードエクソンなどの短い標的について少なくとも約６０％、７０％、８０％または９０％である。別の実施形態において、予想されるカバレッジの少なくとも約５０％を有する標的塩基のパーセントは、例えば、ゲノム領域など捕捉ベイトの長さと比較して長い標的について少なくとも約８０％、９０％または９５％である。

【0293】

ハイブリダイゼーションより前に、ベイトは、当技術分野においてよく知られている方法に従って変性され得る。一般に、ハイブリダイゼーションステップは、過剰なブロッキングＤＮＡを標識化ベイト組成物に付加すること、ブロックされたベイト組成物を、ハイブリダイズ条件下で、検出されるべき標的配列と接触させること、未ハイブリダイズ化ベイトを洗い流すこと、および標的へのベイト組成物の結合を検出することを含む。

【0294】

ベイトは、ハイブリダイズ条件下で標的配列にハイブリダイズまたはアニールされる。「ハイブリダイズ条件」は、ベイトと標的核酸との間のアニーリングを容易にする条件である。異なるベイトのアニーリングは、プローブ長さおよび塩基濃度などに依存して変動するので、アニーリングは、ベイト濃度、ハイブリダイゼーション温度、塩濃度、および当技術分野においてよく知られている他の因子を変動することによって容易にされる。

【0295】

ハイブリダイゼーション条件は、ベイトの濃度、塩基組成、複雑性および長さ、ならびにインキュベーションの塩濃度、温度および長さを変動することによって容易にされる。例えば、ハイブリダイゼーションは、５×のＳＳＰＥ、５×のデンハート液、５ｍＭのＥＤＴＡおよび０．１％のＳＤＳ、ならびに非特異的ハイブリダイゼーションを抑制するためのブロッキングＤＮＡを含有するハイブリダイゼーション緩衝剤中で行われ得る。ＲＮａｓｅ阻害剤は、ベイトがＲＮＡであるならば使用され得る。一般に、ハイブリダイゼーション条件は、上に記載されている通り、約２５℃から約６５℃、典型的に約６５℃の温度、および約０．５時間から約９６時間、典型的に約６６時間のインキュベーション長さを含む。追加の例示的ハイブリダイゼーション条件は、本明細書における実施例１２Ａ－１２Ｃおよび表１４にある。

【0296】

本明細書に記載されている方法は、標準的液体取扱い方法および装置に適応可能である。一部の実施形態において、方法は、マルチウェルプレートを取り扱う装置など、当技術分野において知られている通りの自動化液体取扱い技術を使用して実施される（例えば、Ｇｎｉｒｋｅ，Ａ．ら（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（２）：１８２－１８９を参照されたい。）。これは、これらに限定されないが自動化ライブラリーの構築、ならびに設定を含む溶液ハイブリダイゼーションおよび溶液ハイブリダイゼーション後の洗浄のステップを含むことができる。例えば、こうした自動化方法を実施するために、溶液ハイブリダイゼーション反応後のビーズの捕捉および洗浄のステップのための器具が使用され得る。例示的器具は、これらに限定されないが、以下の位置を含むことができる：ストレプトアビジンがコーティングされた磁性ビーズを含有するマルチウェルプレートのための位置、溶液ハイブリッド選択反応を含有するマルチウォールプレート、試薬を予備加熱するとともにユーザーに定義された温度で洗浄ステップを実施するためのＩ／Ｏ制御の熱ブロックのための位置、ピペット先端のラックための位置、磁石で固定化されたビーズからの上澄みの分離を容易にする特定の立体配置でレイアウトされている磁石、ピペット先端を洗浄するとともに廃棄物を処分する洗浄ステーションを有する位置、ならびに低いおよび高ストリンジェンシーの洗浄緩衝剤または最終キャッチのアルカリ性溶出のための溶液など他の溶液および試薬のための位置。一実施形態において、器具は、平行してキャッチ中和ステップを介するビーズ捕捉ステップからの最大９６個までのハイブリッド選択物を加工するように設計されている。別の実施形態において、１つ以上の位置は、二重機能を有する。なお別の実施形態において、ユーザーは、１つのプレートを別のプレートと交換するためのプロトコールによって指示される。

【0297】

直接的に選択された核酸は、連鎖状化および剪断することができ、これは、短い配列決定読み取りの限界を乗り越えるのに行われる。一実施形態において、各エクソンサイズの配列決定標的は、標的とほぼ同じサイズであるとともに標的の末端点に近い末端点を有する単一のベイト分子で捕捉される。およそ１００個以上の連続する塩基対を有する二重鎖分子を形成するハイブリッドだけが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション後の洗浄を生き残る。結果として、核酸の選択サブグループ（すなわち、「キャッチ」）は、末端がベイト分子の末端に近い無作為に剪断されたゲノムＤＮＡ断片が濃縮される。非常に短い配列決定読み取りを用いる「キャッチ」の、より末端の配列決定は、標的の末端に（または外側さえに）近くでより高いカバレッジ、および中間近くでより低いカバレッジを与えることができる。

【0298】

ライゲーションによって「キャッチ」分子を連鎖状化すること、ならびに続いて、ランダム剪断することおよびショットガン配列決定することは、標的配列の全長に沿って配列カバレッジを得るための１つの方法である。この方法は、非常に短い読み取りでの末端配列決定より高い百分率の、標的（近くの標的に相対する。）上にある配列決定塩基を生成する。同時ライゲーションによって分子を連鎖状化するための方法は、当技術分野においてよく知られている。鎖状体形成は、単純なブラント末端ライゲーションによって行われ得る。効果的ライゲーションのための「粘性」末端は、それらの５’末端近くに制限部位を有するＰＣＲプライマーを用いる「キャッチ」のＰＣＲ増幅、続いて、対応する制限酵素（例えば、ＮｏｔＩ）を用いる消化を含む様々な方法によって、またはＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ Ｊｏｎｇ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：６０６９－６０７４、１９９０）による部分的「チューバック」もしくはＵＤＧグリコシラーゼおよびリアーゼエンドＶＩＩＩ（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓカタログＥ５５００Ｓ）を用いるウラシル含有ＰＣＲ生成物の処理など、ＰＣＲ生成物のライゲーション非依存性クローニングのために共通して使用されるものと同様の戦略によって生成され得る。

【0299】

別の実施形態において、ベイト分子のスタガーセットが、領域を標的にするために使用されて、標的領域の全体にわたって頻出のベイト末端を得る。一部の実施形態において、単に末端配列決定された「キャッチ」（すなわち、鎖状体形成および剪断することがない。）は、実際の配列決定標的（例えば、エクソン）を含むベイトによってカバーされる全領域に沿ってかなり均一な配列カバレッジを提供する。ベイト分子をスタガーすることは、ベイトによってカバーされるセグメントを広くするので、配列決定塩基は、より広い区域にわたって分布される。結果として、標的上の配列対近くの標的の比は、標的１つ当たり単一のベイトだけをしばしば必要とする重ならないベイトを用いる選択よりも低い。

【0300】

別の実施形態において、若干より長い読み取り（例えば、７６個の塩基）を用いる末端配列決定は、短い選択標的（例えば、エクソン）を配列決定するための典型的方法である。非常に短い読み取りを用いる末端配列決定とは異なり、この方法は、中間でのカバレッジにおいて低下することなく、単様式のカバレッジプロファイルに至る。この方法は、上に記載されている連鎖状化および剪断方法より行うのが簡便であり、標的に沿って相対的に均等なカバレッジをもたらし、ベイトおよび適正な標的に向かう高い百分率の配列決定塩基を生成する。

【0301】

一実施形態において、核酸の選択サブグループは、増幅される（例えば、ＰＣＲによる。）後に、配列決定することまたは遺伝子型を同定することによって分析される。別の実施形態において、サブグループは、例えば単一の分子を読み取ることができる高感度分析方法によって選択サブグループが分析される場合、増幅ステップがなくて分析される。

【0302】

配列決定
本発明は、核酸を配列決定する方法も含む。これらの方法において、核酸ライブラリーメンバーは、本明細書に記載されている方法を使用すること、例えば溶液ハイブリダイゼーションを使用することによって単離され、これによって、ライブラリーキャッチを提供する。ライブラリーキャッチまたはこのサブグループは、配列決定され得る。したがって、本発明において特色とされる方法は、ライブラリーキャッチを分析することをさらに含む。一実施形態において、ライブラリーキャッチは、配列決定方法、例えば本明細書において記載されている通りの次世代配列決定方法によって分析される。方法は、溶液ハイブリダイゼーションによってライブラリーキャッチを単離すること、およびライブラリーキャッチを核酸配列決定にかけることを含む。特定の実施形態において、ライブラリーキャッチは、再配列決定され得る。

【0303】

当技術分野において知られている配列決定の任意の方法が、使用され得る。選択方法によって単離された核酸の配列決定は、典型的に、次世代配列決定（ＮＧＳ）を使用して実施される。次世代配列決定は、高度に平行な様式（例えば、１０^５個超の分子が同時に配列決定される。）にて、個別の核酸分子または個別の核酸分子のためのクローン的に拡大されたプロキシのいずれかのヌクレオチド配列を決定する任意の配列決定方法を含む。一実施形態において、ライブラリーにおける核酸種の相対的豊富度は、配列決定実験によって生成されるデータにおけるそれらの同族配列の出現の相対的な数をカウントすることによって概算され得る。次世代配列決定方法は、当技術分野において知られており、例えば、参照により本明細書に組み込むＭｅｔｚｋｅｒ，Ｍ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１：３１－４６に記載されている。

【0304】

一実施形態において、次世代配列決定は、個別の核酸分子のヌクレオチド配列の決定を可能にする（例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓの ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステム、およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの ＰａｃＢｉｏ ＲＳシステム）。他の実施形態において、配列決定方法は、個別の核酸分子のためのクローン的に拡大されたプロキシのヌクレオチド配列を決定する（例えば、Ｓｏｌｅｘａシークエンサー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ；４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）、およびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ）。例えば、大規模に平行な短い読み取り配列決定（例えば、Ｓｏｌｅｘａシークエンサー、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）は、より少ないがより長い読み取りを生成する他の配列決定方法より、配列単位１個当たりの配列の塩基を多く生成する。次世代配列決定するための他の方法または機械としては、これらに限定されないが、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．；ＳＯＬｉＤ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）によって提供されるシークエンサー、ならびにエマルジョンおよびマイクロ流体配列決定技術ナノ液滴（例えば、ＧｎｕＢｉ液滴）が挙げられる。

【0305】

次世代配列決定するためのプラットフォームとしては、これらに限定されないが、Ｒｏｃｈｅ／４５４のＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）ＦＬＸ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）、Ｌｉｆｅ／ＡＰＧのＳｕｐｐｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システム、ＰｏｌｏｎａｔｏｒのＧ．００７システム、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉＳｃｏｐｅ Ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇシステム、およびＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰａｃＢｉｏ ＲＳシステムが挙げられる。

【0306】

ＮＧＳ技術は、１つ以上のステップ、例えば鋳型調製、配列決定および撮像、ならびにデータ分析を含むことができる。

【0307】

追加の例示的配列決定方法論は、当技術分野において知られており、例えば、これらの一部は、ともに２０１１年１２月２９日に出願された共同所有のＵＳＳＮ第１３／３３９，９８６およびＰＣＴ／ＵＳ１１／６７７２５に記載されており、これらの内容は参照により組み込まれる。

【0308】

アラインメント
アラインメントは、読み取りを位置、例えばゲノムの位置に関して整合するプロセスである。ミスアラインメント（例えば、ゲノムにおける不正確な位置上の短い読み取りからの塩基対の配置）、例えば、実際の癌変異の周辺での読み取りの配列状況（例えば、反復性配列の存在）によるミスアラインメントは、代わりの対立遺伝子の読み取りが代わりの対立遺伝子読み取りの主な重層から回避され得るので、変異検出の感受性における低減に至る恐れがある。実際の変異が存在しないという問題のある配列状況が発生するならば、ミスアラインメントは、参照ゲノム塩基の実際の読み取りを間違った位置に設置することによって、「変異された」対立遺伝子のアーチファクト的読み取りを導入する恐れがある。増殖多重遺伝子分析のための変異－呼び出しアルゴリズムは、低豊富度変異にも高感度であるべきなので、これらのミスアラインメントは、偽陽性発見率を増加／特異性を低減する恐れがある。

【0309】

本明細書において考察されている通り、実際の変異に対する感受性の低減は、分析されている遺伝子における予想変異部位の周辺でのアラインメントの質を（手動で、または自動化様式で）評価することによって取り組まれ得る。評価されるべき部位は、癌変異のデータベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）から得ることができる。問題ありと同定される領域は、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントなど、より緩徐であるがより正確なアラインメントアルゴリズムを使用するアラインメントの最適化（または再アラインメント）によって、関連の配列状況におけるより良好な性能を与えるために選択されたアルゴリズムの使用で修正され得る。一般のアラインメントアルゴリズムが問題を修正することができない場合において、カスタム化されたアラインメント手法が、例えば以下によって創出され得る：置換を含有するという高い見込みを有する遺伝子のための最大差異ミスマッチペナルティーパラメータの調整；特定の腫瘍型（例えば、メラノーマにおけるＣ→Ｔ）において共通である特異的変異型に基づく特異的ミスマッチペナルティーパラメータを調整すること；または特定の試料型において共通である特異的変異型（例えば、ＦＦＰＥにおいて共通である置換）に基づく特異的ミスマッチペナルティーパラメータを調整すること。

【0310】

ミスアラインメントによる遺伝子領域の評価における特異性の低減（偽陽性率の増加）は、配列決定された試料における全ての変異呼び出しの手動検査または自動検査によって判定され得る。ミスアラインメントによる擬似変異呼び出しの傾向があると見出されたそれらの領域は、上記と同じアラインメント修正にかけられ得る。アルゴリズムの修正が可能だと見出されない場合において、問題の領域からの「変異」は、試験パネルから分類またはスクリーンして除かれ得る。

【0311】

挿入／欠失（インデル）
一般に、インデル変異の正確な検出は、本明細書において無効にされた配列決定プラットフォーム上での擬似インデル率が相対的に低いので、アラインメントにおける運動である（したがって、正しくアラインメントされたインデルのわずかな観察でも変異の強い証拠であり得る。）。しかしながらインデルの存在下での正確なアラインメントは難しいことがある（殊に、インデル長さが増加する場合。）。アラインメントに伴う一般の、例えば置換の課題に加えて、インデルこれ自体が、アラインメントの問題を引き起こす恐れがある。（例えば、ジヌクレオチド反復の２ｂｐの欠失は、容易に断定的に配置することはできない。）感受性および特異性の両方は、より短い（＜１５ｂｐ）見かけのインデル含有読み取りの不正確な配置によって低減され得る。より大きいインデル（本発明者らの本プロセスにおける個別の読み取りの長さ－３６ｂｐと規模が近づいている。）は、読み取りを全くアラインメントし損ねる原因となり、アラインメントされた読み取りの標準的セットにおけるインデルの検出を不可能にする恐れがある。

【0312】

癌変異のデータベースは、これらの問題に取り組むとともに性能を改善するために使用され得る。偽陽性インデル発見を低減する（特異性を改善する。）ため、共通して予想されるインデルの周辺の領域は、配列状況による問題のあるアラインメントについて検査され、上記の置換と同様に取り組まれ得る。インデル検出の感受性を改善するため、癌において予想されるインデル上の情報を使用するいくつかの異なる手法が使用され得る。例えば、短い読み取りが含有されている予想されるインデルがシミュレートされ、アラインメントが試みられ得る。アラインメントは研究することができ、問題のあるインデル領域は、例えばギャップ開口／延長ペナルティを低減することによって、または部分的な読み取り（例えば、読み取りの前半または後半）をアラインメントすることによって、アラインメントパラメータを調整させることができる。

【0313】

代替として、初期のアラインメントは、正常の参照ゲノムを用いるだけでなく、公知のまたは見込みのある癌インデル変異の各々を含有するゲノムの代わりのバージョンも用いて試みることができる。この手法において、初期にアラインメントし損ねたまたは不正確にアラインメントしたインデルの読み取りは、ゲノムの代わりの（変異された）バージョン上に首尾よく配置される。

【0314】

追加の例示的アラインメント方法論は当技術分野において知られており、例えば、これらの一部は、ともに２０１１年１２月２９日に出願された共同所有のＵＳＳＮ第１３／３３９，９８６およびＰＣＴ／ＵＳ１１／６７７２５に記載されており、これらの内容は参照により組み込まれる。

【0315】

変異呼び出し
塩基呼び出しは、配列決定装置の生アウトプットを指す。変異呼び出しは、配列決定されているヌクレオチド位置について、ヌクレオチド値、例えばＡ、Ｇ、ＴまたはＣを選択するプロセスを指す。典型的に、位置についての配列決定読み取り（または塩基呼び出し）は、１つ超の値を提供し、例えば、一部の読み取りはＴを与え、一部はＧを与える。変異呼び出しは、ヌクレオチド値、例えば配列に対してそれらの値の１つを割り当てるプロセスである。それは「変異」呼び出しと称されるが、それは、任意のヌクレオチド位置、例えば変異体対立遺伝子、野生型対立遺伝子、変異体または野生型のいずれかと特徴付けられなかった対立遺伝子に対応する位置にまたは変動によって特徴付けされていない位置にヌクレオチド値を割り当てるために適用される。変異呼び出しのための方法は、以下の１つ以上を含むことができる：参照配列における各位置での情報に基づき非依存性呼び出しをすること（例えば、配列読み取りを検査すること；塩基呼び出しおよび品質スコアを検査すること；潜在的遺伝子型を前提として、観察された塩基および品質スコアの確率を算出すること；および遺伝子型を割り当てること（例えば、ベイズ規則を使用する。））；偽陽性を除去すること（例えば、予想されるのよりずっと低いまたは高い読み取り深度を有するＳＮＰを拒絶するための深度閾値を使用する；小さいインデルによる偽陽性を除去するための局所再アラインメント）；および連鎖不平衡（ＬＤ）／インピュテーションに基づく分析を行うことで呼び出しを精密にすること。

【0316】

特異的遺伝子型および位置に関連する遺伝子型見込みを算出するための反応式は、例えばＬｉ Ｈ．およびＤｕｒｂｉｎ Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２０１０；２６（５）：５８９－９５に記載されている。特定の癌型における特別な変異のための事前予想は、その癌型からの試料を評価する場合に使用され得る。こうした見込みは、癌変異の公開データベース、例えば、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）、ＨＧＭＤ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）、Ｔｈｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＢＩＣ）、およびＢｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＢＣＧＤ）から誘導され得る。

【0317】

ＬＤ／インピュテーションに基づく分析の例は、例えばＢｒｏｗｎｉｎｇ Ｂ．Ｌ．およびＹｕ Ｚ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９、８５（６）：８４７－６１に記載されている。低カバレッジＳＮＰ呼び出し方法の例は、例えばＬｉ Ｙ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９、１０：３８７－４０６に記載されている。

【0318】

変異呼び出し：置換
アラインメントの後、置換の検出は、呼び出し方法、例えば、ベイズ変異呼び出し方法を使用して行うことができ；これは、サブゲノム間隔の各々における各塩基、例えば評価されるべき遺伝子のエクソンに適用され、ここで、代わりの対立遺伝子の存在が観察される。この方法は、変異の存在下での読み取りデータを観察する確率を、塩基呼び出しエラー単独の存在下での読み取りデータを観察する確率と比較する。この比較が変異の存在を十分に強く支持しているならば、変異が呼び出され得る。

【0319】

癌ＤＮＡの分析について５０％または１００％の頻度からの偏差の制限に取り組む方法が開発された。（例えば、ＳＮＶＭｉｘ －Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ。２０１０年３月１５日；２６（６）：７３０－７３６。）本明細書において開示されている方法は、しかしながら、試料ＤＮＡの１％から１００％の間のどこかで、殊に５０％より低いレベルで変異体対立遺伝子の存在の可能性の考慮を可能にするこの手法は、天然型（多クローン性）腫瘍ＤＮＡの低純度ＦＦＰＥ試料における変異の検出にとって特に重要である。

【0320】

ベイズ変異検出手法の利点は、変異の存在の確率と塩基呼び出しエラー単独での確率との比較が、部位での変異の存在の事前予想によって重み付けされ得ることである。代わりの対立遺伝子の一部の読み取りが、所定の癌型に関する頻繁に変異される部位で観察されるならば、変異の存在は、変異の証拠の量が通常の閾値に合わなくても確信的に呼び出しされ得る。この柔軟性は、なお希少な変異／なお低い純度試料に対する検出感受性を増加させるため、または読み取りカバレッジにおける減少に対して試験をより頑強にするために使用され得る。癌において変異されているゲノムにおけるランダム塩基対の見込みは、約１ｅ－６である。典型的多重遺伝子癌ゲノムパネルにおける多くの部位での特異的変異の見込みは、より高い桁であり得る。これらの見込みは、癌変異の公開データベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）から誘導され得る。

【0321】

変異呼び出し：インデル
インデル呼び出しは、挿入または欠失が参照配列と異なる配列決定データにおける塩基を見出すプロセスであり、典型的には、関連の信頼スコアまたは統計的証拠メトリックを含む。

【0322】

インデル呼び出しの方法は、候補インデルを同定するステップ、局所再アラインメントを介する遺伝子型見込みを算出するステップ、ならびにＬＤベースの遺伝子型推測および呼び出しを行うステップを含むことができる。典型的に、潜在的インデル候補を得るためにベイズ手法が使用され、次いで、これらの候補は、ベイズフレームワークにおいて参照配列と一緒に試験される。

【0323】

候補インデルを生成するためのアルゴリズムは、例えば、ＭｃＫｅｎｎａ Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０；２０（９）：１２９７－３０３；Ｙｅ Ｋ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２００９；２５（２１）：２８６５－７１；Ｌｕｎｔｅｒ Ｇ．およびＧｏｏｄｓｏｎ Ｍ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０、印刷に先立って電子出版；Ｌｉ Ｈ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００９、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（１６）：２０７８－９に記載されている。

【0324】

インデル呼び出しおよび個別レベルの遺伝子型見込みを生成するための方法としては、例えば、Ｄｉｎｄｅｌアルゴリズム（Ａｌｂｅｒｓ Ｃ．Ａ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０年１０月２７日．［印刷に先立って電子出版］）が挙げられる。例えば、ベイズＥＭアルゴリズムは、読み取りを分析し、初期インデル呼び出しをし、各候補インデルについて遺伝子型見込みを生成するために使用することができ、その後、例えばＱＣＡＬＬ（Ｌｅ Ｓ．Ｑ．およびＤｕｒｂｉｎ Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０年１０月２７日。［印刷に先立って電子出版］）を使用する遺伝子型のインピュテーションが続く。インデルを観察するという事前予想などのパラメータは、インデルのサイズまたは位置に基づいて調整され得る（例えば、増加または減少される。）。

【0325】

追加の例示的変異呼び出し方法論は、当技術分野において知られており、例えば、これらの一部は、ともに２０１１年１２月２９日に出願された共同所有のＵＳＳＮ １３／３３９，９８６およびＰＣＴ／ＵＳ１１／６７７２５に記載されており、これらの内容は参照により組み込まれる。

【実施例】

【0326】

本発明は、追加として、例示の目的で提供されるとともに任意の方式で本発明を限定すると意図されない以下の実施例を参照することにより記載される。当技術分野においてよく知られている標準的技術または下に具体的に記載されている技法が利用され得る。

【0327】

［実施例１］ 捕捉生成物へのＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション
下記の手順は、捕捉生成物を用いるＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションに必要なステップを要約している。

【0328】

Ａ．ハイブリダイゼーション
プールされたビオチン化ベイト１００ナノグラム、適応ＤＮＡライブラリー５００ｎｇ、Ｃ_ｏｔ－１ ＤＮＡ ２μｇ、２．０μＬ中のオリゴヌクレオチドブロッカー２ナノモルを、１０μＬの体積に合わせ、予備加温されたＧｅｎｉｓｐｈｅｒｅ Ｂｕｆｆｅｒ ６（２×のＳＤＳ系ハイブリダイゼーション緩衝剤：０．５０ＭのＮａＰＯ_４、１％のＳＤＳ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２×のＳＳＣ、４×のデンハート液）１０μＬと混合する。混合物のボルテックス混合に続いて、４０μＬの鉱物油のオーバレイを適用し、混合物を熱サイクラー内にて９５℃で５分間変性し、７１℃にゆっくり減少する。混合物を７１℃で４８時間インキュベートする。

【0329】

Ｂ．ストレプトアビジンビーズに結合
ストレプトアビジンビーズを、ハイブリダイゼーション混合物への付加の前に以下の方式で調製する。ストレプトアビジンビーズを室温で３０分間静置する。各ハイブリダイゼーション反応のため、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｍ２７０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎビーズ（磁性）５０μＬを、２×のＢｉｎｄ、およびＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で２回洗浄する。５０μＬのＢｉｎｄおよびＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒならびに水３０μＬを含む８０μＬ中に、ビーズを再懸濁する。

【0330】

４８時間のハイブリダイゼーション期間の最後に、ハイブリダイゼーション液体２０μＬを鉱物油の下から除去し、ビーズ８０μＬに添加して、１００μＬの総体積を提供する。混合物をチューブローテーター上で３０分間回転させて、ハイブリダイズ化鋳型：ベイト複合体上のビオチンとビーズ上のストレプトアビジンとの間に結合が生成するのを可能にする。

【0331】

Ｃ．ストレプトアビジンビーズを洗浄
回転期間に続いて、試料を磁性分離ラック上へ配置する。ビーズを上澄みから分離させておき、捕捉プローブに結合していないＤＮＡを含有する上澄みを除去し、捨てる。ビーズに結合されたプローブを以下の溶液で順次に洗浄する。各洗浄のため、所定の温度に予備平衡化された洗浄溶液を添加し、示された時間ローテーター上に配置し、短時間でスピンダウンし（磁石）、上澄みを回収し、捨てる。第１の洗浄は、回転しながら７１℃で５分間、１０００μＬの１×のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いる。第２の洗浄は、回転しながら７１℃で５分間、１０００μＬの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いる。第３の洗浄は、回転しながら７１℃で５分間、１０００μＬの０．１×のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いる。第４の洗浄は、回転しながらＲＴで５分間、１０００μＬの０．１×のＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いる。第５の洗浄は、なお磁石上のチューブを用いてＲＴで３０秒間、１０００μＬの０．２×のＳＳＣを用いる。最終の洗浄溶液は、下記に説明されている通り、事前のさらなる加工より前に完全に除去する。

【0332】

最終洗浄の後、５０μＬの０．１２５Ｎ ＮａＯＨを添加し、混合物をＲＴで１０分間インキュベートし、２分毎にボルテックス処理して、溶液中にビーズを保持する。ビーズを有するチューブを磁石上に戻して１分間配置する。ビーズが磁石上にある間、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）の５０μＬのアリコットを、新たな１．５ｍＬのＲＮＡｓｅ／ＤＮＡｓｅフリーのＰＣＲチューブに添加する。磁石上のチューブからの上澄み（０．１２５ＮのＮａＯＨ）を、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を含有するチューブに添加して、溶液を中和する。回復された鋳型断片を、１．５×の体積を使用するとともに２０μＬのＥＢ緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．５）中で溶出して、ＡＭＰｕｒｅビーズで精製する。

【0333】

［実施例２］一本鎖鋳型材料を用いるＰＣＲ反応
Ａ．最終のＰＣＲ濃縮
回復された一本鎖鋳型（１６μＬ）を、以下の反応ミックス構成成分（ＫＡＰＡ ＨｉＦｉマスターミックス（２５μＬ）；１０μＭのプライマー１（２．５μＬ）、１０μＭのプライマー２（２．５μＬ）、水（４μＬ））を有する５０μＬの総体積に調製した。ＤＮＡを短時間でボルテックスし、簡潔な遠心分離に続いて溶液として再回収した。以下のプログラムを用いる熱サイクラー内に、反応物を配置した：５つ以上のサイクルに関して、９８℃（５．０分）；９８℃（２０秒）；６０℃（１５秒）；７２℃（２０秒）；７７℃（５．０分）。増幅された生成物を、１．５×の体積を使用するとともに２０μＬのＥＢ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）中で溶出して、ＡＭＰｕｒｅビーズで精製した。その結果得られるＤＮＡ濃度を、Ｑｕｉｂｉｔ Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで測定し、適切なＮＧＳ配列決定プラットフォームでの使用のために希釈した。

【0334】

５つのサイクルの増幅を、捕捉後のＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔライブラリーのために使用し、典型的に１８以下のサイクルの増幅を、捕捉後のＩｌｌｕｍｉｎａライブラリーに使用する。標準的Ｉｌｌｕｍｉｎａプロトコールを、以下のＰＣＲ手順を使用して最適化する。回復された一本鎖ＤＮＡ鋳型（２ｍＬ）を、２５μＬのＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ、８ｐｍｏｌのプライマー１および８ｐｍｏｌのプライマー２を含む５０μＬの最終体積中で合わせる。反応物を９６ウェルｑＰＣＲプレート中に設置して、最終のＰＣＲ濃縮を模倣し、以下のプログラムを実行する：９５℃（５分）、続いて、９５℃（３０秒）および６０℃（４５秒）の３０サイクル。曲線の中点（増幅開始とプラトーとの中間）を見出すために、閾値を手動で調整し、この値から３サイクルを引き、最終のＰＣＲ濃縮に対して実行するためのサイクルの数を決定する。最適化するＤＮＡの量は、最終の濃縮反応に入れるものより８×少ないので、３サイクルを引き；中和された捕捉生成物の２μＬはＰＣＲ最適化反応に入り、１６μＬは最終のＰＣＲ濃縮に入る。

【0335】

［実施例３］ バーコードドメイン対してイノシン塩基を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームにおける使用のためのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチド
表Ｉにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームを用いるＤＮＡ鋳型ライブラリーに対するハイブリッド捕捉実験において使用するため、以下のブロッキングオリゴヌクレオチドを設計した。Ｔ_ｍ増強基としてＬＮＡ（「＋Ｃ」または「＋Ａ」）を使用して、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを調製した。ホスホラミダイト化学法を使用して、全てのオリゴヌクレオチドを調製した。参照によりその全体が組み込まれるＯｗｃｚａｒｚｙ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１１ ５０：９３５２－９３６７）の方法を使用して、７５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝剤（５×のＳＳＣと同様のイオン強度）中のＬＮＡ塩基について、および１５ｍＭのＮａＣｌ緩衝剤（０．１×のＳＳＣと同様のイオン強度）についてＴ_ｍ値を概算する。ＢＮＡ修飾はＬＮＡ修飾と同様の熱力学的な効果を有するので、本明細書に示される予測は両クラスの修飾ブロッカーに当てはまり、ＬＮＡ／ＢＮＡ修飾は全ての実施例において置換することができる。例えば、ＬＮＡ誘導の最も近い隣接するパラメータを使用して、下記の実施例における熱力学的モデル化を行い、他方で、ＢＮＡ塩基を使用して、オリゴヌクレオチド合成を行った。

【0336】

【表1】

【0337】

表Ｉにおいて、全てのＣ位（すなわち、Ｃを有する９つの位置）が徹底的に置換されるまで、ＬＮＡ－ＣＴ_ｍ増強基が最初にＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドに含められ、続いて、ＬＮＡ－ＡＴ_ｍ増強基がＡ位でその後に含められる。

【0338】

下記の表ＩＩにおいて、バーコード配列（８－イノシン）を含有するアダプターに反するブロッカーとしての使用のための一連のＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの設計が示されている。詳細な記述で説明すると、可変塩基と対合されたイノシン（表ＩＩの配列において「Ｉ」および「／ｉｄｅｏｘｙＩ／」と定義されている。）で評価された増強Ｔ_ｍをモデル化するやり方はない。したがって、イノシン塩基をＴ_ｍ分析に含めなかったが、最終配列中に存在する。実際の配列についての正確な増強Ｔ_ｍ値は、しかしながら、ルーチン的経験的方法によって容易に決定される。Ｔ_ｍ増強基としてＬＮＡ（「＋Ｃ」または「＋Ａ」）を使用して、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを調製した。ホスホラミダイト化学法を使用して、全てのオリゴヌクレオチドを調製した。

【0339】

【表2】

【0340】

表ＩＩにおいて、全てのＣ位（すなわち、Ｃを有する１７つの位置）が徹底的に置換されるまで、ＬＮＡ－ＣＴ_ｍ増強基が初期にＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドに含められ、続いて、ＬＮＡ－ＡＴ_ｍ増強基がＡ位でその後に含められる。この実施例において、イノシン塩基を組み込んでバーコードドメインを広げた。全ての４核酸塩基または他のユニバーサル塩基の「Ｎ」塩基ランダムミックス、例えば５－ニトロインドールは、本明細書においてすでに記載されている通りに用いることができる。

【0341】

［実施例４］ バーコードドメインのための混合塩基（「Ｎ」塩基）を用いるＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームにおける使用のためのＴ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチド
表ＩＩＩにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定プラットフォームを用いるＤＮＡ鋳型ライブラリーに対するハイブリッド捕捉実験における使用のために、以下のオリゴヌクレオチドを設計した。Ｔ_ｍ増強基としてＢＮＡ（「／ｉＢＮＡ－ｍｅＣ／」、「／ｉＢＮＡ－Ｔ／」、または「／ｉＢＮＡ－Ａ／」）を使用して、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを調製した。ホスホラミダイト化学法を使用して、全てのオリゴヌクレオチドを調製した。

【0342】

【表3】

【0343】

表ＩＩＩは、ブロッカーとしてアダプター配列のいずれかの鎖を使用してＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを設計した実施例を提供している。ブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドとしての使用のための好ましい鎖は、最も少ないＴ_ｍ増強基の含有で、修飾基１個当たり最大「ブロッキング力」（すなわち、最も大きい最適な増強Ｔ_ｍ値）を提供するものである。例えば、配列番号１９および２２（配列番号２２が好ましい。）および配列番号２５および２８（配列番号２５が好ましい。）を比較されたい。

【0344】

［実施例５］ Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ配列決定プラットフォームにおける使用のためのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチド
表ＩＶにおいて、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭ配列決定プラットフォームを用いるＤＮＡ鋳型ライブラリーに対するハイブリッド捕捉実験における使用のために、以下のオリゴヌクレオチドを設計した。Ｔ_ｍ増強基としてＬＮＡ（「＋Ｃ」または「＋Ａ」）を使用して、Ｔ_ｍ増強オリゴヌクレオチドを調製した。ホスホラミダイト化学法を使用して、全てのオリゴヌクレオチドを調製した。

【0345】

【表4】

【0346】

表ＩＶは、ブロッカーとしてアダプター配列のいずれかの鎖を使用してＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドが設計され得る追加実施例を提供している。ブロッカーとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドとしての使用のための好ましい鎖は、最も少ないＴ_ｍ増強基の含有で、修飾基１個当たり最大「ブロッキング力」（すなわち、最も大きい最適な増強Ｔ_ｍ値）を提供するものである。この実施例は、Ｔｍ増強オリゴヌクレオチドとして選択された鎖に依存して、ＬＮＡ－Ｃが、ＬＮＡ－Ａと比較してＴ_ｍ増強基１個当たりに基づく優れた「ブロッキング力」を有することも示す。例えば、配列番号３０および３２（配列番号３０が好ましい。）および配列番号３４および３６（配列番号３４が好ましい。）を比較されたい。

【0347】

［実施例６］ Ｉｌｌｕｍｉｎａに基づく配列決定を用いるブロッキングオリゴヌクレオチドとしてのＴ_ｍ増強オリゴヌクレオチドの使用。

【0348】

Ｔ_ｍ増強ブロッカーの有効性を検証するために、８つの個別にバーコードされた（インデックスされた）ライブラリーを、同じｇＤＮＡ供給源ＮＡ０７０３４（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｄｅｎ、ＮＪ）から、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑアダプター（０１、０３、０５、０６、０８、０９、１０、１１）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用し、Ｉｌｌｕｍｉｎａのライブラリー調製プロトコールに従って作製した。Ｓ２２０焦点化ウルトラソニケーター（Ｃｏｖａｒｉｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用し、１７５Ｗピークパワー、デューティファクタ２．０および２００サイクル／バーストで、１マイクログラムのゲノムＤＮＡを剪断した。Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰシステム（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、剪断されたＤＮＡを精製にかけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを使用して、末端を修復し、Ａを尾部にした。

【0349】

表Ｖにリストされている様々なブロッカーを使用し、実施例１に概説されているプロトコールを使用し、各ライブラリー５００ｎｇおよび各ブロッキングオリゴヌクレオチド１ナノモルを用いて、ライブラリーの７つをハイブリダイゼーション捕捉に基づく濃縮にかけた。捕捉オリゴヌクレオチドプールは、２６５個の遺伝子を標的にするおよそ１１，０００の１２０ｍｅｒ５’ビオチン化オリゴヌクレオチド（Ｌｏｃｋｄｏｗｎ（商標）プローブ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ Ｉｏｗａ）からなっていた。捕捉／濃縮された配列を増幅し、標準化し、非濃縮ライブラリーを含めてプールした。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑベンチトップシークエンサーを使用して、プールされた材料を配列決定した。Ｇａｌａｘｙ計算生物学プラットフォームを使用して、配列決定の結果を分析した。図１１は、各インデックス化ライブラリーについて得られた独特の配列の数を示す。配列の数は４．３百万から３．１百万を範囲とし、任意の所定のブロッキングオリゴ配列に有意な低減は見られなかった。

【0350】

【表5】

【0351】

１つの性能メトリックは、２０－３０倍（「２０×－３０×」）のカバレッジの深度で所望の標的配列にアラインメントする（マップする）配列の百分率である。図１２は、非修飾ＤＮＡブロッキングオリゴヌクレオチドならびにＴ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチドについてのカバレッジの深度を示す。インデックス配列における分散について説明するため、一連の縮重塩基位置（全ての４個のヌクレオシド塩基）、またはデオキシイノシンなどのユニバーサル塩基のいずれかを使用するのが共通技術である。カバレッジ値の深度は表ＶＩに示されている。Ｔ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチド（ユニバーサル塩基を含有する。）の性能は、同じユニバーサル塩基を含有する非Ｔ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチドと比較した場合、カバレッジの深度における全体的増加を２０×および３０×で示す。二重化配列決定読み取りを、分析より前に除いた。

【0352】

【表6】

【0353】

別の性能メトリックは、目的の配列にアラインメントする配列の百分率（標的に対するパーセント）である。図１３は、様々なブロッキングオリゴヌクレオチドを用いて得られたオン標的百分率を要約している。デオキシイノシンユニバーサル塩基を有する非修飾ＤＮＡブロッカーと比較して、デオキシイノシンユニバーサル塩基を有するＴ_ｍ増強ブロッカーで、有意な改善（１６－１９％）が観察される。特異的インデックス配列を有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含有する非ＢＮＡ対デオキシイノシンを含有するブロッキングオリゴヌクレオチドを含有するＢＮＡの間に、限定された改善（９％）が観察された。さらに、ブロッキングオリゴヌクレオチドを含有する１３個対２０個のＢＮＡの間に、有意な追加の改善が観察されなかった（３９．８６％対３８．０９％）。

【0354】

第３の性能メトリックは、非標的配列を超える標的配列の濃縮の平均レベルであり、図１４は、倍数濃縮レベルを要約している。非増強ブロッキングオリゴヌクレオチドと比較して、Ｔｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチドでの倍数濃縮における有意な増加が観察される。濃縮の範囲は、デオキシイノシンを含有する非増強ブロッキングオリゴヌクレオチドについて１９７の低さから、Ｔ_ｍ増強ブロッキングオリゴヌクレオチドについて５８０倍の高さまでであった。

【0355】

配列番号９５および９８ならびに配列番号９６および９９に対応するＴ_ｍ増強ブロッカーオリゴヌクレオチド対を持つ８－ヌクレオチドバーコードインデックス配列を有するＩｌｌｕｍｉｎａライブラリーを使用するハイブリッド捕捉実験において、匹敵できる傾向が得られた。配列番号９４および９７に対応する非修飾ブロッカーオリゴヌクレオチド対は、標的上の配列決定読み取りの約５０％をもたらした。対照的に、配列番号９５および９８ならびに配列番号９６および９９に対応するＴ_ｍ増強ブロッカーオリゴヌクレオチド対は、標的上の配列決定読み取りのそれぞれ約７０％および約７５％をもたらした。したがって、８個のＴ_ｍ増強基を有するＴ_ｍ増強ブロッカーは、約４０％（（［７０％－５０％］／５０％）×１００％）の、非修飾ブロッカーを超えるおよその相対増加を生み出した。そして、１７－２２個のＴ_ｍ増強基を有するＴ_ｍ増強ブロッカーは、約５０％（（［７５％－５０％］／５０％）×１００％）の非修飾ブロッカーを超えるおよその相対増加をもたらした。（図１５を参照されたい。）

【0356】

下記に開示されている実施例Ａ－Ｎは、図３に提供されている流れ図を介して描写されている、腫瘍試料の多重遺伝子分析のための方法についての実施形態の特色を示している。

【0357】

［実施例Ａ］ 腫瘍試料からの核酸単離
パラフィンブロックから切断された３×２０μｍのセクションを４００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＦＴＬと、ボルテックスすることによって混合し、９０℃で１５分間、１．５ｍＬの遠心管内でインキュベートした。８８－９２℃の範囲が、インキュベーションのための許容範囲であった。次いで、２０μＬのプロテイナーゼＫを用いて５５℃で６時間、および１０μＬのＲＮａｓｅ（１ｍｇ／ｍＬ）を用いて室温で５分間、試料をインキュベートした。次に、４６０μＬのＢｕｆｆｅｒＢＬおよび５００μＬの無水エタノールを試料に添加した。結果として得られた試料溶液を、さらに使用するまで室温で保持した。

【0358】

ＤＮＡ結合のためのカラムを調製するため、１００μＬの平衡緩衝剤をＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムに添加し、カラムを１０，０００×ｇで３０秒間遠心分離した。上に記載されている試料溶液７００μＬをＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムに移し、カラムを１０，０００×ｇで１分間遠心分離した。流体がＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを完全に通過しなかった場合には遠心分離ステップを反復した。残留している試料溶液を、上に記載されているのと同じやり方でＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムに適用した。次いで、ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを５００μＬのＢｕｆｆｅｒ ＨＢで処理し、１０，０００×ｇで１分間遠心分離した。次に、エタノールで希釈された７００μＬのＤＮＡ Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒをＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラム中に添加し、カラムを１０，０００×ｇで１分間遠心分離した。エタノールで希釈された７００μＬのＤＮＡ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを再び使用してＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを洗浄し、１０，０００×ｇで１分間遠心分離し、＞１３，０００×ｇで３分間遠心分離して、カラムを乾燥した。ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラムを、上部が除去された標準的１．５ｍＬ遠心管中に配置した。７０℃に予備加熱された５０－７５μＬのＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをカラム中に添加し、室温で３分間インキュベートした。カラムをコレクションチューブ内で＞１３，０００×ｇで１分間遠心分離した。７０℃に予備加熱した別の５０－７５μＬのＥｌｕｔｉｏｎ ＢｕｆｆｅｒをＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラム中に添加し、室温で３分間インキュベートした。カラムを再びコレクションチューブ中にて＞１３，０００×ｇで１分間遠心分離した。全溶液を新たな１．５ｍＬの遠心管に移し、－２０℃で貯蔵した。

【0359】

ＦＴＬ緩衝剤、プロテイナーゼＫ、ＢＬ Ｂｕｆｆｅｒ、Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ、ＭｉｃｒｏＥｌｕｔｅカラム、Ｂｕｆｆｅｒ ＨＢ、ＤＮＡ Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒおよびＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒは、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ（ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ；カタログ番号Ｄ３３９９－００、Ｄ３３９９－０１およびＤ３３９９－０２）において提供された。

【0360】

ホルムアルデヒド固定またはパラホルムアルデヒド固定のパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離するための追加の方法は、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ Ｍ．ら、（２００４）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ。１６４（１）：３５－４２；Ｍａｓｕｄａ Ｎ．ら、（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（２２）：４４３６－４４４３；Ｓｐｅｃｈｔ Ｋ．ら、（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５８（２）：４１９－４２９、Ａｍｂｉｏｎ ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ、カタログ番号ＡＭ１９７５、２００８年９月）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ番号ＴＭ３４９、２０１１年２月）、およびＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３７６２５、２００７年１０月）に開示されている。ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、キシレンを昇温で使用して、パラフィン包埋試料およびガラス繊維フィルターを可溶化して核酸を捕捉する。Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを、ＦＦＰＥ組織の１μｍから１０μｍのセクションからのゲノムＤＮＡの精製のために、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔとともに使用する。ＤＮＡは、シリカクラッドの常磁性粒子（ＰＭＰ）を使用して精製し、低溶出体積で溶出する。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔは、ゲノムおよびミトコンドリアのＤＮＡの精製のために、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ技術を使用する。

【0361】

［実施例Ｂ．１］ ＤＮＡの剪断
循環チラー付きのＣｏｖａｒｉｓ（商標）Ｅ２１０機器を４℃に設定した。機器の水タンクに蒸留／脱イオン水を充填ラインのレベル「６」まで充填した。ＳｏｎｏＬａｂ（商標）ソフトウェアを起動し、指示された時にシステムがホーミング配列を実行するのを可能にした。試料を剪断する前に少なくとも４５分間、機器のタンク中の水を脱気した。

【0362】

剪断するためのゲノムＤＮＡ試料を調製するため、試料を最初に、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）上のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量化した。濃度に基づいて、低いＴＥ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を有する１２０μｌの所望のインプットＤＮＡ（２ｎｇ／μｌ）を実験に使用した。１００μｌの個別の試料を、チューブの蓋の中の隔壁を介してＣｏｖａｒｉｓ ＭｉｃｒｏＴＵＢＥ（Ｃｏｖａｒｉｓ カタログ番号５２００４５）中にピペットでゆっくり取った。Ｃｏｖａｒｉｓ ＭｉｃｒｏＴＵＢＥを次いで、Ｃｏｖａｒｉｓ Ｅシリーズのチューブラック内に配置した。２００ｂｐ剪断のため、設定は以下の通りであった：１０％のデューティサイクル、５の強度、２００のサイクル／バースト、時間１８０秒、およびＦｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｓｗｅｅｐｉｎｇモード。剪断した後、ミニ遠心機における適切なアダプターを使用して、Ｃｏｖａｒｉｓ ＭｉｃｒｏＴＵＢＥを短時間でスピンダウンし、剪断された試料を清潔な１．５ｍｌ微量遠心機チューブに移した。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを使用して、各剪断ＤＮＡ試料を精製した。短時間で、５×のＱＩＡＧＥＮ ＰＢＩ緩衝剤を、１．５ｍｌ微量遠心機チューブ中の試料に添加した（例えば、ＰＢＩ緩衝剤５００μｌを試料１００μｌに添加した。）。各試料をボルテックスし、短時間でスピンダウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。７５０μｌのＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝剤をカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。スピンカラムを再び１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、清潔な１．５ｍｌ微量遠心機チューブに移した。カラムを２－３分間風乾した。第１の溶出のため、１８μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを各カラムに添加し、２－３分間インキュベートし、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。第２の溶出のため、１５μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間インキュベートし、次いで１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出液を回収し、スピンカラムを捨てた。

【0363】

典型的には、２００ｎｇがＤＮＡ剪断のために使用されるが、ＤＮＡの量は、２０ｎｇから２００ｎｇまたはこれより高い範囲であってよい。

【0364】

［実施例Ｂ．２］ ＤＮＡ剪断の代替
この実施例は、実施例２ＡからのＤＮＡ剪断のための代替方法を記載する。

【0365】

二本鎖ゲノムＤＮＡを最初に一本鎖ＤＮＡに変性し、次いで、プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、および少量のｄｄＮＴＰと混合する。プライマー配列は、ランダム６量体、またはアダプター配列と５’末端でタグ付けされたランダム６量体であってよい。タグ付けされたランダム６量体増幅を使用して微量のＤＮＡクローンおよび配列決定する方法は、例えばＷｏｎｇ Ｋ．Ｋ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９６；２４（１９）：３７７８－８３に記載されている。プライマー鋳型アニーリングおよびＤＮＡ合成を可能にする条件下で、反応物をインキュベートさする。新たに合成された第１の鎖にｄｄＮＴＰが組み込まれると、ＤＮＡ合成は終了する。合成された第１の鎖ＤＮＡの長さは、ｄＮＴＰ対ｄｄＮＴＰの比によって制御することができる。例えば、ｄＮＴＰ対ｄｄＮＴＰのモル比は、少なくとも約１０００：１、約５０００：１、または約１００００：１である。第１の鎖合成後、短い断片（短い長さおよびｄｄＮＴＰを有するプライマーおよび合成された第１の鎖ＤＮＡなど）を、サイズ選択によって（例えば、サイズ選択スピンカラムを使用して）除去することができる。結果として得られた第１の鎖ＤＮＡを、プライマー（例えば、ランダム６量体またはアダプター配列でタグ付けされたランダム６量体）、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼ）、およびｄＮＴＰと混合する。Ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼを使用して、第１の鎖ＤＮＡから末端３’－ｄｄＮＴＰを除去することができ、または第２のプライミング部位上でブラント末端を生成することさえできる。反応物を次いで、プライマー－鋳型アニーリングおよびＤＮＡ合成を可能にする条件下でインキュベートする。第２の鎖の合成後、結果として得られた二本鎖ＤＮＡ断片を精製し、ライブラリー構築において直接的に使用することができる。代替として、二本鎖ＤＮＡ断片は、アダプター配列を含有するプライマーを使用してＰＣＲ増幅することができるが、これらのアダプター配列が第１および第２の鎖合成のためのプライマーに含められていた場合である。ＰＣＲ増幅のためのプライマーは、全配列および／またはバーコード配列も含むことができる。

【0366】

［実施例Ｃ］ ライブラリー調製
末端修復反応
末端修復試薬（ＮＥＢ番号Ｅ６０５０Ｌ）を解凍し、末端修復マスターミックスを氷上で調製した。１試料当たり７０μｌのマスターミックス調製するため、５５μｌのヌクレアーゼフリー水を１０μｌの１０×のＥｎｄ Ｒｅｐａｉｒ反応緩衝剤および５μｌのＥｎｄ Ｒｅｐａｉｒ酵素ミックスと混合した。次いでマスターミックス７０μｌを各剪断ＤＮＡ試料３０μｌに、氷上の９６ウェルＰＣＲプレート内で添加した。反応物を熱サイクラー内にて２０℃で３０分間インキュベートした。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを使用して、各試料を精製した。短時間で、５×のＱＩＡＧＥＮＰＢＩ緩衝剤を試料に（例えば、ＰＢＩ緩衝剤５００μｌを試料１００μｌに添加した。）、１．５ｍｌ微量遠心機チューブ内で添加した。各試料をボルテックスし、短時間でスピンダウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。ＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝剤７５０μｌをカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。スピンカラムを再び１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、清潔な１．５ｍｌ微量遠心機チューブに移した。カラムを２－３分間風乾した。第１の溶出のため、２２μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）を各カラムに添加し、２－３分インキュベートし、次いで、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。第２の溶出のため、２２μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間インキュベートし、次いで、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出液を回収し、スピンカラムを捨てた。

【0367】

３’Ａ塩基付加
Ａ塩基付加試薬（ＮＥＢ番号Ｅ６０５３Ｌ）を氷上で解凍し、Ａ塩基付加マスターミックスを氷上で調製した。１試料当たり１０μｌのマスターミックスを調製するため、２μｌのヌクレアーゼフリー水を５μｌの１０×のｄＡ－Ｔａｉｌｉｎｇ反応緩衝剤および３μｌのＫｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（３’→５’ｅｘｏ－）と混合した。マスターミックス１０μｌを各精製末端修復ＤＮＡ試料４０μｌに、氷上の９６ウェルＰＣＲプレート内で添加した。反応物を熱サイクラー内にて３７℃で３０分間インキュベートした。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを使用して、各試料を精製した。短時間で、５×のＱＩＡＧＥＮ ＰＢＩ緩衝剤を、１．５ｍｌ微量遠心機チューブ内の試料に添加した（例えば、ＰＢＩ緩衝剤２５０μｌを試料５０μｌに添加した。）。各試料をボルテックスし、短時間でスピンダウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。ＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝剤７５０μｌをカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。スピンカラムを再び１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、清潔な１．５ｍｌ微量遠心機チューブに移した。カラムを２－３分間風乾した。第１の溶出のため、１３μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）を各カラムに添加し、２－３分間インキュベートし、次いで、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。第２の溶出のため、１３μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間インキュベートし、次いで、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出液を回収し、スピンカラムを捨てた。

【0368】

マルチプレックスアダプターのライゲーション
ライゲーション試薬（ＮＥＢ番号Ｅ６０５６Ｌ）を解凍し、ライゲーションマスターミックスを氷上で調製した。１試料当たり３６μｌのマスターミックスを調製するため、１２μｌの５×のＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ反応緩衝剤を３．３μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｄａｐｔｏｒ（１５ｕＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａカタログ番号ＰＥ－４００－１００１中に含まれる。）に添加した（３．３μｌのアダプター／１μｇの出発インプットＤＮＡを使用した。）。例えば、５００ｎｇのインプットＤＮＡの１つの試料のため、アダプターを最初に水中で希釈し（２μｌのアダプタープラス２μｌのＨ_２Ｏ）、次いで、この希釈アダプターミックス３．３μｌ、ヌクレアーゼフリー水１５．７μｌおよびＱｕｉｃｋ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ５μｌを、ライゲーション反応に添加した。＞１μｇの出発材料のため、アダプター＞３．３μｌを使用した。したがって、より少ない水を添加して、希釈アダプターミックスおよびヌクレアーゼフリー水の総体積を１９μｌに保持した。

【0369】

マスターミックス３６μｌおよび各ｄＡ尾部ＤＮＡ試料２４μｌを氷上の９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに添加した。反応物を熱サイクラー内にて２５℃で３０分間インキュベートした。ＱＩＡＧＥＮ ＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）カラムを使用して、各試料を精製した。短時間で、５×のＱＩＡＧＥＮ ＰＢＩ緩衝剤を、１．５ｍｌ微量遠心機チューブ内の試料に添加した（例えば、ＰＢＩ緩衝剤３００μｌを試料６０μｌに添加した。）。各試料をボルテックスし、短時間でスピンダウンし、ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムに移した。ＭｉｎＥｌｕｔｅスピンカラムを１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。ＱＩＡＧＥＮ ＰＥ緩衝剤７５０μｌをカラムに添加し、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、フロースルーを捨てた。スピンカラムを再び１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、清潔な１．５ｍｌ微量遠心機チューブに移した。カラムを２－３分間風乾した。第１の溶出のため、２０μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）を各カラムに添加し、２－３分間インキュベートし、次いで、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。第２の溶出のため、２０μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、１分間インキュベートし、次いで、１３，０００ｒｐｍで１分間遠心分離した。溶出液を回収し、スピンカラムを捨てた。

【0370】

ＰＣＲ濃縮
ＰＣＲ試薬を解凍し、ＰＣＲマスターミックスを氷上で調製した。１試料当たり６２μｌのマスターミックスのため、ＨＦ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ、ＮＥＢ カタログ番号Ｆ－５３１Ｓ）を有する５０μｌの２×のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスターミックス、８μｌのヌクレアーゼフリー水、２μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐｒｉｍｅｒ １．０（２５μＭ）、および２μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐｒｉｍｅｒ ２．０（０．５μＭ）を使用した。次いでマスターミックス６２μｌを、適切なバーコードを有する２μｌのＩｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ（２５μＭ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ カタログ番号ＰＥ－４００－１００１に含まれる。）および３６μｌのライゲートＤＮＡ試料と、９６ウェルＰＣＲプレート内で混合した。

【0371】

反応物を熱サイクラー内にて以下の通りにインキュベートした：
１サイクル ９８℃ ３０秒
１８サイクル ９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
７２℃ ３０秒
１サイクル ７２℃ ５分
４℃ 保持

【0372】

各ＰＣＲ反応物を１．８×体積のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ；Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓカタログ番号Ａ６３８８）でサイズ選択した。短時間で、１．８×のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを、１．５ｍｌ微量遠心機チューブ内の試料に添加し（例えば、１８０μｌのビーズを１００μｌの試料に添加した。）、ボルテックスし、転倒回転混合しながら５分間インキュベートした。溶液が清澄になるまでチューブを磁石台上に配置した（２分）。磁石上に捕捉されたビーズを妨げることなく上澄みを捨てた。６００μｌの新たに作製された７０％エタノールをビーズに添加し、１分間インキュベートし、続いてエタノールを除去した。６００μｌの新たに作製された７０％エタノールの第２のアリコットをビーズに添加し、１分間インキュベートし、エタノールを除去した。チューブを磁石台上に戻して１－２分間置くことで、ビーズを再捕捉した。任意の残留しているエタノールを除去し、ビーズを室温で５－１０分間風乾した。３０μｌのＱＩＡＧＥＮ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをビーズに添加し、ボルテックスし、２分間インキュベートした。溶液が清澄になるまでチューブを磁石台上に戻して配置した（２分）。上澄みを新たな１．５ｍＬチューブに移し、ビーズを捨てた。Ｑ－ＰＣＲアッセイを使用して溶出されたＤＮＡ試料を定量化した。これらの定量化は、等モルにプールするのを可能にして、プールされたハイブリッド捕捉選択内の各ライブラリーの等しい表示を確保する。

【0373】

［実施例Ｄ］ ハイブリッド選択
プールインデックス試料ライブラリー
インデックスされ、精製され、Ｑ－ＰＣＲによって定量化されたライブラリーのプール（最大１２ｐｌｅｘまで）を氷上で作製した。等モルのプールを１．５ｍｌ微量遠心機チューブ内で調製して、ハイブリッド選択プロセスにおいて同等に各試料を表すことを確保した。これらのプールの各々に関するＤＮＡの全インプットは、２０００ｎｇから５００ｎｇの範囲であってよい。典型的に、全インプットＤＮＡは２０００ｎｇである。したがって、１２個の試料がプールされるなら、各々１６６．６７ｎｇがプールされて、合計２０００ｎｇを達成することができる。２０００ｎｇのライブラリープールの最終体積は、４μｌであるはずである。インデックス化ライブラリーの濃度を変動することにより、プールはより大きい任意の体積で作製することができるが、次いでプールはｓｐｅｅｄｖａｃによって（低熱を使用して）乾燥し、４μｌのヌクレアーゼフリー水中で再構成することができる。

【0374】

ライブラリー構築における収率が大きければ大きいほど、ライブラリーの複雑性が大きくなる。
ビオチン化ＲＮＡベイトへのプールＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーション
Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄキット（番号Ｇ３３６０Ａ－Ｊ）を、この実験に使用した。Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ番号３、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ番号１、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ番号２、Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄ Ｐｒｉｍｅｒ １．０ブロック、Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ １－１２ブロック、ＲＮＡｓｅブロック、およびビオチン化ＲＮＡベイトを氷上で解凍した。

【0375】

以下のマスターミックスを調製した：
ａ．ハイブリダイゼーション緩衝剤ミックス（１反応当たり１３μｌ）：
ｉ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ番号１（Ａｇｉｌｅｎｔ）－２５μｌ
ｉｉ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ番号２（Ａｇｉｌｅｎｔ）－１μｌ
ｉｉｉ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ番号３（Ａｇｉｌｅｎｔ）－１０μｌ
ｉｖ．Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ番号４（Ａｇｉｌｅｎｔ）－１３μｌ
ｂ．ブロッキングミックス（１反応当たり８μｌ）：
ｉ．ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ番号１（Ａｇｉｌｅｎｔ）－２．５μｌ
ｉｉ．ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｌｏｃｋ番号２（Ａｇｉｌｅｎｔ）－２．５μｌ
ｉｉｉ．Ｐａｉｒｅｄ Ｅｎｄプライマー１．０ブロック（ＩＤＴ、Ｈ_２Ｏを用いて２００μＭに再懸濁される。）－１．５μｌ
ｉｖ．Ｉｎｄｅｘ Ｐｒｉｍｅｒ １－１２ブロック（ＩＤＴ、Ｈ_２Ｏを用いて２００μＭに再懸濁される。）－１．５μｌ
ｃ．ＲＮａｓｅブロックの希釈
ｉ．テリトリー＜３Ｍｂを有するカスタムビオチン化ＲＮＡベイト用：１μｌのＲＮａｓｅ Ｂｌｏｃｋ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を９μｌの水中に希釈した。
ｉｉ．ベイトテリトリー＞３Ｍｂを有するカスタムベイト用：１μｌのＲＮａｓｅブロックを３μｌの水中に希釈した（捕捉反応７μＬ当たり、まだ０．５μｌのＲＮａｓｅブロック）
ｄ．ベイトミックス：（１反応当たり７μｌ）
ｉ．ＲＮＡベイト－２μｌ（ベイトテリトリー＞３Ｍｂを有するベイトには、５μｌベイトを使用した。）
ｉｉ．希釈ＲＮａｓｅブロック－５μｌ（ベイトテリトリー＞３Ｍｂを有するベイトには、上記に示されている通りに希釈された２μｌのＲＮａｓｅブロックを使用した。）

【0376】

ハイブリダイゼーション緩衝剤ミックス、ブロッキングミックス、およびベイトミックス（単数または複数）を調製すると、ハイブリダイゼーション緩衝剤ミックスをボルテックスし、スピンダウンし、熱ブロック内で６５℃に加熱した。ハイブリッド選択するべき各プール試料ライブラリー４μｌを、ブロッキングミックス８μｌと、９６ウェルＰＣＲプレート内で混合した。反応物を熱サイクラー内にて９５℃で５分間インキュベートし、次いで６５℃で保持した。プール試料ライブラリー／ブロッキングミックスを９５℃で５分間および次いで６５℃で２．５分間インキュベートした時、ベイトミックス（＝ベイト／ＲＮＡｓｅブロックミックス）を熱ブロック内に６５℃で２．５分間置いた。ハイブリダイゼーション緩衝剤含有チューブを迅速にスピンダウンし、次いで直ちに６５℃の熱ブロックに戻した。加熱されたハイブリダイゼーション緩衝剤ミックス１３μｌを各試料ライブラリー／ブロックミックス中にピペットで取り、一方で９６ウェルプレートを熱サイクラー内に６５℃で残した。ベイトミックスを２．５分間６５℃でインキュベートするとすぐに、ベイトミックス７μｌを各試料ライブラリー／ブロック／ハイブリダイゼーション緩衝剤ミックスに添加し、一方９６ウェルプレートを熱サイクラー内に６５℃で残した。反応物（総体積は３２μｌであった。）を６５℃で２４時間熱サイクラー内にてインキュベートした。

【0377】

磁性ビーズの調製
ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ番号２を６５℃で熱ブロック内にて予備加温した。Ｄｙｎａｌ ＭｙＯｎｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｔ１ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をボルテックスし、再懸濁した。Ｄｙｎａｌビーズ（例えば、１２００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを使用して、３００μｌのＤｙｎａｌビーズを調製した。）５０μｌ当たり２００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加することによって、ビーズを洗浄した。ビーズを５秒間ボルテックスし、短時間でスピンダウンする。ビーズを磁石台上に約１５秒間または全てのビーズを捕捉するまで配置した。上澄みを除去し、捨てた。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを用いてさらに２回洗浄を反復し、合計３回洗浄した。洗浄した後、Ｄｙｎａｌビーズ５０μｌ当たり２００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中にビーズを再懸濁した（例えば、１２００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを使用して、３００μｌのＤｙｎａｌビーズを調製した。）。再懸濁ビーズをボルテックスし、短時間でスピンダウンした。再懸濁ビーズ２００μｌを個別の１．５ｍｌ微量遠心機チューブ内にアリコットした。

【0378】

ハイブリッド捕捉ＤＮＡの選択
インキュベーションの２４時間後に、６５℃での熱サイクラー内のＰＣＲプレートから、調製ビーズ２００μｌを含有するチューブ中に室温で、各ハイブリダイズ化試料を迅速にピペットで取った。試料およびビーズの混合物を５秒間ボルテックスし、ローテーター上にて室温で３０分間インキュベートして、適正な混合を確保した。次いでチューブを迅速にスピンダウンした。ビーズを磁石上に捕捉し（２分間）、上澄みを除去し、捨てた。低ストリンジェンシー洗浄のために、ビーズを５００μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ番号１中に再懸濁した。試料を５秒間ボルテックスし、１５分間室温でインキュベートし、磁石から外した。試料を３－５分毎に５秒間ボルテックスした。チューブを迅速にスピンダウンした。ビーズを次いで磁石台上で２分間捕捉し、上澄みを除去し、捨てた。オフターゲット材料を除去するための高ストリンジェンシー洗浄のため、６５℃に予備加熱されたたＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ番号２でビーズを洗浄した。短時間で、ビーズを５００μｌの予備加温ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ番号２中に再懸濁し、ボルテックサー上で５秒間混合して、ビーズを再懸濁した。ビーズを遠心機内にて短時間でスピンダウンし、５秒間室温で時折ボルテックス混合しながら６５℃で１０分間熱ブロック内にてインキュベートした。次いでビーズを遠心機内にて短時間でスピンダウンし、磁石上で２分間捕捉した。予備加温ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ番号２を用いて６５℃でさらに２回洗浄を反復し、合計３回洗浄した。次いで洗浄緩衝剤を完全に除去し、５０μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｅｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒをビーズに添加し、続いて、５秒間ボルテックスしてビーズを混合した。５秒間時折ボルテックス混合しながら、試料を１０分間室温でインキュベートした。ビーズを遠心機内にて短時間でスピンダウンし、磁石台上で捕捉した。捕捉ＤＮＡを含有する上澄みを、新たな１．５ｍｌ微量遠心機チューブにピペットで取った。５０μｌのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを捕捉ＤＮＡに添加した。試料を５秒間ボルテックスし、遠心機内にて短時間でスピンダウンし、１．８×体積のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを使用して精製した。ＤＮＡを４０μｌのヌクレアーゼフリー水中に溶出した。

【0379】

捕捉ＤＮＡのＰＣＲ濃縮
ＰＣＲ試薬を解凍し、ＰＣＲマスターミックスを氷上で調製した。１試料当たりのマスターミックス６０μｌのため、ＨＦ緩衝剤（ＮＥＢ番号Ｆ－５３１Ｓ）を有する５０μｌの２×のＰｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスターミックスを、８μｌのヌクレアーゼフリー水、１μｌのＱＰＣＲプライマー１．１（Ｈ_２Ｏ中１００μＭ）、および１μｌのＱＰＣＲプライマー２．１（Ｈ_２Ｏ中１００μＭ）と混合した。Ｑ－ＰＣＲのためのプライマー配列は：
ＱＰＣＲプライマー１．１（ＩＤＴからＨＰＬＣ精製された。）：
５’ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴ３’（配列番号７９）
ＱＰＣＲプライマー２．１（ＩＤＴからＨＰＬＣ精製された。）：
５’ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡ３’（配列番号８０）
マスターミックス６０μｌを各精製捕捉ＤＮＡ試料４０μｌに、９６ウェルＰＣＲプレート中で添加した。反応物を熱サイクラー内にて以下の通りにインキュベートした：
１サイクル ９８℃ ３０秒
１２サイクル ９８℃ １０秒
６５℃ ３０秒
７２℃ ３０秒
１サイクル ７２℃ ５分
４℃ 保持

【0380】

１．８×体積のＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを用いて、ＰＣＲ反応物各１００μｌを精製し、溶出緩衝剤（１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）３５μｌ中に溶出した。Ｑ－ＰＣＲアッセイを使用して、ハイブリッド選択／捕捉されたＤＮＡ試料を定量化した。Ｑ－ＰＣＲアッセイは末端アダプターを検出し、読み取りは、適切なクラスター密度を得るためにどれだけの各試料を配列決定フローセル上に装填するべきかを示した。

【0381】

［実施例Ｅ］ 方法
以下は、実施例に従って改変を同定するために使用された方法および実験条件の特定の実施形態を例証する。追加の転座スクリーニングは、例えば予備選択腫瘍試料から調製されたｃＤＮＡのいずれかのｑＲＴ－ＰＣＲ分析を使用して行うことができる。

【0382】

アーカイブされた固定パラフィン包埋組織から単離されたＤＮＡを使用してハイブリダイゼーション捕捉されたアダプターライゲーションベースのライブラリー上で、大規模平行ＤＮＡ配列決定を行った。分析ツールの組合せを使用してデータを分析し、ＤＮＡ改変呼び出しを割り当てた。凍結腫瘍から調製されたｃＤＮＡのｑＲＴ－ＰＣＲ分析またはアーカイブされたＦＦＰＥ標本のＩＨＣ判定のいずれかを使用して、追加の転座スクリーニングを行った。ＦＦＰＥ組織から単離されたＲＮＡを使用する両方の新規な転座の発現を確認するため、大規模平行ｃＤＮＡ配列決定を行った。再編成の体細胞起源を確認するためインデックスＮＳＣＬＣ患者について、血液からの整合された正常の参照ゲノムＤＮＡを配列決定した。

【0383】

ゲノムＤＮＡ配列決定
アーカイブされたホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）腫瘍標本からのＤＮＡ；ＮＳＣＬＣ患者から２４個を使用して、１４５個の癌遺伝子の２５７４個のエクソンの配列決定を行った。ゲノムＤＮＡを使用するアダプターライゲーション方法、続いて、最適化されたＲＮＡハイブリダイゼーション捕捉プローブを用いるハイブリダイゼーション選択によって、配列決定ライブラリーを構築した（Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔカスタムキット）。２５３×の平均深度に対して３６×３６つの対合読み取りを使用して、ＨｉＳｅｑ ２０００機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上での配列決定を行った。腫瘍組織からの変異呼び出しのために最適化されたツールの組合せを使用して、塩基置換、インデル、コピー数改変およびゲノム再編成のデータ加工および変異割り当てを行った。

【0384】

ｃＤＮＡ配列決定
Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅキットを使用して単一の５－１０μｍのＦＦＰＥ組織セクションから抽出された全ＲＮＡからｃＤＮＡを生成し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってランダム６量体プライマーを有するｃＤＮＡに逆転写した。二本鎖ｃＤＮＡをＮＥＢＮｅｘｔ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で作製し、ＦＦＰＥ ＤＮＡ試料に関してライブラリー構築、ハイブリッド捕捉および配列決定へのインプットとして使用した。分析ツールの組合せを用いて、発現レベルの分析を行った。

【0385】

［実施例Ｆ］ マルチプレックス分析のための例示的選択遺伝子およびバリアント
この実施例は、マルチプレックス分析のための遺伝子、バリアントおよび癌型の選択を要約する４つの例示的表を提供する。

【0386】

【表7】

【0387】

「優先１」は、選択遺伝子または遺伝子産物の最も高い優先を指す。

【0388】

「癌遺伝子」は、優先１に対して優先でない癌関連遺伝子または遺伝子産物を指す。

【0389】

「ＰＧｘ遺伝子」は、薬理遺伝学および薬理ゲノミクス（ＰＧｘ）に重要である遺伝子を指す。

【0390】

【表8】

【0391】

作用性カテゴリーは、下に記載されている通りに分類されている。表１Ｂは、異なる癌型における例示的改変に対する異なるカテゴリーの用途の要約を提供する。

【0392】

カテゴリーＡ：承認された／標準的な治療に対する感受性または抵抗性を予測する承認された／標準的な改変
転移性大腸癌におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ
乳癌におけるＥＲＢＢ２増幅
非小細胞肺癌におけるＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ

【0393】

カテゴリーＢ：特異的実験治療のための包含または除外の基準である改変
大腸癌、肺癌または乳癌におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ
メラノーマ、大腸癌または肺癌におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ
メラノーマにおけるＮＲＡＳ Ｑ６１Ｋ
乳癌におけるＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ
乳癌におけるＦＧＦＲ１増幅
乳癌におけるＰＴＥＮ二対立遺伝子不活性化
乳癌または膵癌におけるＢＲＣＡ１二対立遺伝子不活性化

【0394】

カテゴリーＣ：標準治療または実験治療に対する感受性または抵抗性を予測する限定された証拠（早期臨床的データ、矛盾する臨床的データ、前臨床データ、理論）を有する改変
大腸癌におけるＫＲＡＳ Ｑ６１Ｈ（早期臨床）
乳癌におけるＰＩＫ３ＣＡ Ｈ１０４７Ｒ（矛盾する臨床）
大腸癌におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（矛盾する臨床）
肺癌におけるＥＲＢＢ２変異または増幅（事例レポート）
肺癌におけるＢＲＡＦ Ｄ５９４Ｇ（前臨床）
乳癌におけるＦＧＦＲ１増幅（前臨床）
乳癌におけるＡＴＭ二対立遺伝子不活性化（前臨床）
大腸癌におけるＴＳＣ１二対立遺伝子不活性化（前臨床）
乳癌におけるＡＴＲ二対立遺伝子不活性化（理論）
肉腫におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異（理論）

【0395】

カテゴリーＤ：癌の特別なサブタイプにおける予後または診断の有用性を有する改変
大腸癌におけるＭＳＨ２二対立遺伝子不活性化（強い臨床的証拠）
大腸癌におけるＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ（強い臨床的証拠）
肺癌におけるＫＲＡＳ Ｇ１３Ｄ（強い臨床的証拠）
乳癌におけるＢＲＣＡ１不活性化（強い臨床的証拠）

【0396】

カテゴリーＥ：明確な臨床的意味合いのない癌（すなわち、ドライバー変異）における明確な生物学的有意性を有する改変
大腸癌におけるＡＰＣ二対立遺伝子不活性化
乳癌におけるＴＰ５３二対立遺伝子不活性化
メラノーマにおけるＭＩＴＦ増幅
卵巣癌におけるＡＲＩＤ１Ａ

【0397】

カテゴリーＦ：癌における公知の生物学的有意性のない改変
公知癌遺伝子における新規な改変
治療の標的
公知癌遺伝子のオルソログ

【0398】

【表9】

【0399】

【表10】

【0400】

【表11】

【0401】

【表12】

【0402】

［実施例Ｇ］ ハイブリッド捕捉のための例示的ベイト配列
表７は、３つの標的：ＳＭＡＤ３＿標的＿１０、ＳＭＡＤ３＿標的＿１１、ＳＭＡＤ３＿標的＿１２のための例示的ベイトを提供している。

【0403】

【表13】

【0404】

は、２つの標的：二次構造を低減するために修飾されたＦＬＴ３＿標的＿２のための配列を有するベイトを提供する。ＦＬＴ４＿標的＿３１は、より短いベイトと効果的に同様であるベイトの両末端に一部の任意配列を有する。両方が、カバレッジを約４×改善する（カバレッジにおける約４×の改善）。

【0405】

【表14】

【0406】

［実施例Ｈ］ 臨床的癌標本の次世代配列決定からの体細胞ゲノムの改変の高感度検出のためのベイズ手法
本明細書に記載されているベイズ手法を、以下の実施例において実施した。

【0407】

この手法の有用性は電力算出によって例示され、臨床状況における関連の変異頻度のより低い範囲における置換検出に対するデータ駆動の事前影響を記載する。図４に示されている通り、事前予想（例えば、１ｅ－６または１０％の事前）および変異頻度（例えば、１％、５％または１５％の変異）の値は、それぞれ「Ａ Ｂａｙｅｓｉａｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」の（ｉ）および（ｉｉ）に記載されている値に対応する。図４は、事前予想を組み込むことが、例えば、変異部位での必要とされるカバレッジ深度を低減すること、または変異を検出するための概算された力（感受性）を増加させることによって、より希少な変異に対する検出力を改善することができることを示す。

【0408】

［実施例Ｉ］ ベイズ手法：構築された低純度の多クローン性試料への適用
本明細書において開示されているベイズ手法のこれらの利益をさらに実証するため、人工的な低純度の多クローン性「腫瘍」試料を、１０００ゲノムプロジェクトにおける１０人の参加者からのＤＮＡの等しい付加混合物によって構築し、これによって、全ＤＮＡ（非公式のヘテロ接合性ＳＮＰから生じる。）の約５％または１０％に存在する多数の配列バリアントを含有するＤＮＡプールを創出する。ミックスを、１８２個の癌関連遺伝子エクソンのハイブリッド選択にかけ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ２０００プラットフォーム上で配列決定して、遺伝子パネルにわたっておよそ３５０×の平均カバレッジを得た。各構成要素試料を同様に個別に加工して、全てのＳＮＰ部位で遺伝子型を決定した。プール中に存在するおよそ２６０個の約５％「変異」のうち、１ｅ－６の事前を使用して高い信頼で８９％を検出したが、一方で、それぞれ１％および１０％の事前を使用して９４％および９５％が検出可能であり（見逃された部位の平均カバレッジ約１２５×）、上記の理論的結論を支持した。プール中に存在する１０２個の１０％「変異」のうち、１ｅ－６の事前を使用して高い信頼で９８％を検出したが、一方で、１％および１０％の事前を使用して９９％および９９％が検出可能であった（見逃した部位のカバレッジ１３×）。

【0409】

［実施例Ｊ］ ベイズ手法：肺および大腸腫瘍試料への適用。
ＣＯＳＭＩＣデータベース（ワールドワイドウェブ上でｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＣＧＰ／ｃｏｓｍｉｃ）からのいくつかの癌型における関連の変異の頻度の事前予想を誘導し、ルーチン的臨床標本から抽出された８０超の肺癌および大腸癌の試料を分析した。この癌型におけるこの変異についての３％事前の組込みによってのみ検出することができる大腸癌における１％のＰＩＫ３ＣＡ変異ｐ．Ｈ１０４７Ｒを含めて、２０個超の異なる遺伝子における公知の変異を観察した。これらの結果は、腫瘍型特異的変異スペクトルの周辺での事前予想の賢明な組込みが、臨床状況にとってＮＧＳベースの腫瘍ゲノム分析の翻訳に有益であり得ることを示している。

【0410】

［実施例Ｋ］ ベイズ手法：乳癌試料への適用
ＦＦＰＥ乳癌試料について約２６０×に配列決定された１８２個の癌関連遺伝子のエクソンにおける置換変異呼び出しを行った。代わりの対立遺伝子の＞２コピーを有する部位の数は１，７９３である。変異の存在における＞９９％の事後信頼を有する部位の数は４０２である。フィルター後に残留している部位の数は１８８であり、これはおよそ、バリアント部位の予想数である。ｄｂＳＮＰにない部位の数は１４であり、これは、およそ、ｄｂＳＮＰが＞９０％の変動を捕捉する場合にｄｂＳＮＰにない部位の予想数である。非同義部位の数は５である。ＣＯＳＭＩＣにおける部位の数は２である（ＰＩＫ３ＣＡ ｐ．Ｈ１０４７ＲおよびＰ５３ ｐ．Ｆ１１３Ｓ）。

【0411】

［実施例Ｌ］ ベイズ手法：稀な変異の検出
多くのルーチン的臨床標本は、関連の希少変異を含有する。図５は、１００個超の臨床的癌試料における変異頻度を示す。試料は、主に大腸癌および肺癌のＦＦＰＥ生検物、外科的切除物または細針吸引物であった。一連の臨床試料において見出された公知の変異の頻度スペクトルは、表１２に示されている。

【0412】

【表15】

【0413】

［実施例Ｍ．１］ 個別に合成されたオリゴヌクレオチド捕捉プローブを使用する、高性能溶液ベースの標的選択
溶液ベースのゲノム標的選択技法の利用能は、標的化配列決定用途の急速な開発を可能にし、この一部は、臨床的配列決定試験の導入に至った。市販化されたハイブリダイゼーション捕捉試薬は、ビオチン化ＤＮＡまたはＲＮＡプローブ（「ベイト」）に変換されているアレイ合成オリゴヌクレオチドに基づく。しかしながら、プローブのこれらの複合プールを生成する方法は、性能課題、例えば高ＧＣ含有量標的の捕捉に直面する。

【0414】

５７個の臨床的に関連のおよび作用性の癌関連遺伝子を表す約１３０ｋｂの標的領域を捕捉するための個別に合成された、５’－ビオチン化オリゴヌクレオチド（「オリゴベイト」）を使用する代替の手法は、本明細書に記載されている。２４時間ハイブリダイゼーション手順を用いてこれらのオリゴベイトを使用して選択されたインデックス化配列決定ライブラリーで、５，０００倍の標的濃縮を得た。５０Ｍの４９×４９対合末端読み取りで、５６８×の標準偏差を有する２１００×の平均標的カバレッジを生成した（２７％）。全ての標的は首尾よくカバーされ、標的化塩基の９９．９５％が＞５００×でカバーされた。さらに、標的カバレッジは、ＧＣバイアスを実質的に有していなかった。ＧＣ含有量＞７０％を有する標的は、平均すると１，９７５×カバレッジになり、ＧＣ含有量＜３５％を有する標的は、平均すると１，９９６×のカバレッジになった。

【0415】

いっそう短いハイブリダイゼーション時間を使用して、高性能を保持し：２．５時間のハイブリダイゼーション後に、標的化塩基の９９．３％が＞５００×でカバーされた。

【0416】

ＳＳＰＥ（Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ、ＰＥ）／デンハート液の使用は、ＴＥＡＣｌ、ＴＭＡＣｌおよび／または硫酸デキストランを含有するｈｙｂ／洗浄緩衝剤より性能が優れていた。

【0417】

オリゴベイトをアレイ誘導ベイトプールにスパイクして、そうでなければ捕捉するのが困難な（例えば、高い％ＧＣ）領域のカバレッジを増加させる、または新たな遺伝子含有量を急速に増大することができる。この手法は、高性能の標的化臨床的配列決定試験を開発するための非常に有効なおよびスケーラブルな方法を提供する。

【0418】

［実施例Ｍ．２］ 捕捉ベイトを最適化する方法
３つのベイトセットを試験した。結果は図７に要約されている。ベイトセットは以下の通りであった：
ベイトセット番号１は、５’－ビオチン化の個別合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみからなる。

【0419】

ベイトセット番号２は、５’－ビオチン化の個別合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトでスパイクされた、ビオチン化されたアレイ誘導ＲＮＡベイトを含む。

【0420】

ベイトセット番号３は、ビオチン化されたアレイ誘導ＲＮＡベイトのみからなる。

【0421】

全ての５’－ビオチン化の個別合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、５’ビオチンを有する１２０個の塩基であった。

【0422】

図７は、ベイトセット番号３と比較した、ベイトセット番号１およびベイトセット番号２で検出されたカバレッジにおける均一性を比較するカバレッジヒストグラムである。ベイトセットは、図７において番号１、２および３として示されている。高い％ＧＣに対応するベイトセット番号３を使用するカバレッジにおけるいくつかのギャップが存在したが、一方、対応する領域は、図７において描写されている通り、ベイトセット番号１および番号２を使用して深くカバーされた。図７において、「ＧＣ＿密度＿標的…」と標識されている左手のパネルは、標的内の局所ＧＣ含有量を示している。線は６５％ＧＣ含有量を表し、ここで、線を超える任意の値は、より高いＧＣ含有量を表す。ヒストグラムに示されている通り、カバレッジは、高ＧＣ含有量の区域におけるベイトセット番号３が最も低い。「ＩＤＴ＿ベイト…」と標識されている図７における最下のパネルは、示されている標的をカバーするオリゴの配置を示している。

【0423】

標的の数、および単独でアレイ誘導ベイトセットを使用するまたは個別に合成されたベイトでスパイクされたアレイ誘導ベイトセットを使用するカバレッジにおける変化のグラフィック表示が、図６に描写されている。より具体的に、図６は、カバレッジヒストグラムの線状表示である。標的の数（ｙ軸）は、カバレッジ（ｘ軸）の関数として描写されている。線番号１は、５’－ビオチン化の個別合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトでスパイクされた５’－ビオチン化されたアレイ誘導ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトを含むベイトセット（図６において「ベイトセット番号１」と称される。）を使用するカバレッジを表す。線番号２は、ビオチン化されたアレイ誘導ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみを含むベイトセット（図６において「ベイトセット番号２」と称される。）を使用して得られたカバレッジを表す。ベイトセット番号２を使用する全体の平均カバレッジは９２４であったが、一方、ベイトセット番号２を使用する高ＧＣ含有量（約６８％）の区域におけるカバレッジは７３であった。対照的に、ベイトセット番号１を使用した場合、全体カバレッジはベイトセット番号１と同様で約９１８であったが、高ＧＣ含有量の区域において、カバレッジは１８３に改善された。

【0424】

［実施例Ｍ．３］ ベイトセットを評価するための例示的実験条件
ベイトセットＡは、５’－ビオチン化の個別合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみからなる。元のセットは、標的テリトリーの１３３ｋｂをカバーする１０００個のオリゴであった（本明細書において「大きなセット」、「ベイトセットＡ」または「ＤＮＡオリゴベイト」と称される。）。

【0425】

「スパイクイン」実験のため、元の１０００のＤＮＡオリゴセット（「大きなセット」）を、ビオチン化されたアレイ誘導ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトからなるベイトセットに添加した（この例において「ベイトセットＢ」または「ＲＮＡベイト」と称される。）。ベイトセットＡからの異なる比のＤＮＡオリゴベイトを、ベイトセットＢからのＲＮＡベイトと混合した。特に、１：１０のＤＮＡオリゴベイト：ＲＮＡベイト比を使用した（１０ｎｇの全ＤＮＡオリゴベイト対１００ｎｇの全ＲＮＡベイト）。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を、ＲＮＡベイトに最も理想的である条件に整合した。

【0426】

ベイト配置に対応したＤＮＡオリゴベイトを使用した場合、低いタイリング密度で、カバレッジにおける強い周期性を検出した。加えて、低いタイリング密度は、インデルを有する対立遺伝子の捕捉をより困難にする恐れがある。そのため、表１３に描写されている異なるタイリング密度でＭＡＰ３Ｋ１のために、ベイトセットを設計した。下記のミックスにおいて、６つの癌関連遺伝子（ＤＡＸＸ、ＴＲＲＡＰ、ＣＲＥＢＢＰ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＳＰＯＰ、ＧＮＡ１１）のエクソンを捕捉するように設計された５’－ビオチン化の個別合成ＤＮＡオリゴベイトを含有するミックス１を、アレイ誘導ＲＮＡオリゴヌクレオチドベイトのみにスパイクした（ベイトセットＢ）。ＤＡＸＸ、ＴＲＲＡＰ、ＣＲＥＢＢＰ、ＧＲＩＮ２ＡおよびＳＰＯＰは、ＲＮＡベイトセット中に存在しなかった。ミックス２－４をベイトセットＡ（ＤＮＡオリゴベイトの大きなセット）にスパイクして、ＭＡＰ３Ｋ１のエクソンのための捕捉ベイトの異なるタイリング密度（最も高密度であるミックス２を用いる。）を試験した。ＲＮＡベイトセットは単独で、約１ＭＢの配列をカバーした。

【0427】

【表16】

【0428】

捕捉物にインプットしたのは、２μｇのプールされた細胞株ＤＮＡライブラリーであった。２μｇのライブラリーをブロッキングミックス（表１４）と混合し、乾燥させ、９μｌの水中に再懸濁した。この混合物を次いでプレート中に置き、サイクラーに移し、９８℃で５分間、続いて６８℃で２分間実行した。プレートを次いで開封し、６８℃の１１μＬのＤＮＡベイト／ｈｙｂ緩衝剤混合物を添加した。６８℃でのＤＮＡベイト／ｈｙｂ混合物＝１０μＬのｈｙｂ緩衝剤＋１μＬのベイト（１０ｎｇ、５０ｎｇまたは１００ｎｇのベイトを含有する。）。

【0429】

ＤＮＡベイト単独（例えば、ベイトセットＡ）を用いた捕捉物について、ハイブリダイゼーションを６８℃で行い、洗浄を行った。ベイトを５ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１０００ｎｇおよび２０００ｎｇ（インプットライブラリー２μｇ当たり）で試験した。２４時間のｈｙｂについて、５－１０ｎｇの条件、および最大１００ｎｇまでの条件を試験した。

【0430】

不十分な性能／高ＧＣの領域を救出するためにＲＮＡ－アレイベイトセット（Ｂ）にスパイクされた大きなＤＮＡベイトセット（１００ｋｂ）を用いた捕捉物について、ハイブリダイゼーションを６８℃で行い、洗浄を７０℃で行った。ベイトセットを、１：１０のＤＮＡオリゴ：ＲＮＡベイト（すなわち、１０ｎｇの総質量のオリゴベイトおよび１００ｎｇの総質量のＲＮＡベイト）で試験した。

【0431】

ＲＮＡベイトセットにスパイクされた小さい遺伝子焦点化ＤＮＡベイトセットを用いた捕捉物について、ハイブリダイゼーションを６８℃で行い、広範な洗浄温度を試験した（６２℃、６４℃、６６℃、６８℃、７０℃および７２℃）。

【0432】

ミックス１（６個の新たな遺伝子を添加する。）を、以下の比：１：５、１：１０および１：２０の全オリゴＤＮＡベイト質量：ＲＮＡベイト質量（すなわち、２０ｎｇ：１００ｎｇ、１０ｎｇ：１００ｎｇおよび５ｎｇ：１００ｎｇ）で試験した。

【0433】

ミックス５（経路低カバレッジに対するＳＴＫ１１のエクソン３を表す３個のオリゴ）を、１：５００、１：１０００および１：２０００のＤＮＡオリゴ：ＲＮＡオリゴで試験した。全ＲＮＡベイト１００ｎｇを使用した。ＳＴＫ１１は、ＲＮＡベイト単独を用いて捕捉された場合にそれが不十分な検出性能で重要な癌標的を表す時に試験した。ＳＴＫ１１のエクソン３のＤＮＡオリゴスパイキングは、カバレッジを７０×の平均から３００×に押し上げた。

【0434】

【表17】

【0435】

［実施例Ｎ］ ライブラリーメンバーのオフターゲット核酸結合を低減
オフターゲット核酸相互作用は、捕捉プローブ、例えばオリゴヌクレオチドベイトへのハイブリダイゼーション（例えば、溶液または固相ハイブリダイゼーション）によって標的核酸の選択の効率を制限する恐れがある。オフターゲット選択は、典型的に、ハイブリッド選択のストリンジェンシー条件が低減される場合、例えばより低い核酸溶融温度（例えば、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖と比較した場合のＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＴ_ｍ）を有する標的：捕捉二重鎖のために選択する場合に増加される。したがって、オフターゲット配列の捕捉は、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて、より問題であり得る。オフターゲット選択は、例えば、ハイブリダイゼーション捕捉および／またはアーチファクト的ハイブリッド捕捉の減少収率の１つ以上をもたらす恐れがあり、これが順じて、後続のステップ、例えば配列決定における非効率に至る。

【0436】

ライブラリーメンバーは、ライブラリー挿入（オンターゲットならば、捕捉プローブ、例えばベイトで二重鎖を形成する。）および１つ以上の非標的配列（例えば、アダプター配列、増幅プライマーまたはタグの１つ以上、およびバーコードタグ）を含むことができる。典型的に、ベイトは、ライブラリー挿入、例えば標的ＤＮＡにハイブリダイズする。しかしながら、ライブラリー挿入は、ライブラリーにおいてあらゆる断片上に典型的に存在するユニバーサルアダプターを有することができる。反応混合物における他の配列を用いる（例えば、アダプター配列への結合を介する。）二重鎖形成による、捕捉プローブハイブリダイズ化ライブラリーメンバーの非標的配列は、所望されない配列、例えばオフターゲットライブラリーメンバーの選択に至る恐れがある。

【0437】

理論に束縛されることを望まないが、捕捉プローブで二重鎖を形成したオンターゲットライブラリーメンバーとオフターゲット配列との間の鎖状体形成は、オフターゲット配列の選択をもたらすことがある。図６は、ダイアグラム形態において、ライブラリーメンバーの非標的鎖状体の例示的立体配置を例示している。非標的領域（例えば、「Ｐ５」および「Ｐ７」として描写されているアダプター）は、それらの相補的非標的鎖（それぞれ「ｒｃＰ５」および「ｒｃＰ７」として描写されている。）にハイブリダイズするとして示されている。ビオチン－タグ付けされたベイトは、ライブラリーメンバーの標的挿入の相補的領域にハイブリダイズして示されている。オフターゲット結合は、ライブラリーメンバーの鎖状体形成に至り、したがって、標的結合特異性における低減（本明細書においてオフターゲット選択の増加とも称される。）に至る恐れがある。

【0438】

ＤＮＡ（ライブラリーメンバー）：ＲＮＡ（ベイト）二重鎖を伴う標的：捕捉二重鎖において、捕捉プローブで二重鎖を形成したオンターゲットライブラリーメンバーとオフターゲット配列との間の鎖状体形成は、６５－７０℃で典型的に行われる高ストリンジェンシー洗浄中に崩壊されることがある。典型的に、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のより低い溶融を伴う洗浄は、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖に対して、より低い温度で行われる。鎖状体形成を崩壊することができないことで、ＤＮＡベイトを使用する場合に、標的捕捉の百分率を相対的に低く保持してきた（４５－５０％）。アダプターに相補的な市販のブロッキングオリゴは、鎖状体形成を最小化するために添加されるが、それらは典型的に、特にＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて鎖形成を適切に阻害することはない。

【0439】

非標的配列（例えば、アダプター）媒介選択を低減する方法および組成物は、本明細書において開示されている。特定の実施形態において、ライブラリーメンバーの非標的核酸配列（例えば、アダプター配列）に相補的であるまたはライブラリーメンバーの非標的核酸配列（例えば、アダプター配列）で二重鎖を形成することができとともに、バックグラウンド核酸に対する非標的核酸配列、例えば他の相補的非標的核酸配列についての値より高い、ブロッキングオリゴヌクレオチドとライブラリーメンバーの非標的核酸配列との間の結合相互作用に関連のパラメータについての値を有するブロッキングオリゴヌクレオチドが、開示されている。増加された結合相互作用を有する例示的ブロッキングオリゴヌクレオチドとしては、延長されたブロッカー長さ、例えば非標的核酸に対する延長された相補性を有するオリゴヌクレオチド；１つ以上の非天然ヌクレオチドを有するブロッキングオリゴヌクレオチド；およびデオキシリボヌクレオチドの代わりにオリゴリボヌクレオチドを含む（または、これから実質的に構成されている。）ブロッキングオリゴヌクレオチドが挙げられる。

【0440】

［実施例Ｏ］ 延長されたブロッカー長さ
この実施例は、パーセントオンターゲット選択が、ブロッキングオリゴヌクレオチドの長さを延長することによって改善され得ることを実証する。

【0441】

アダプター特異的ブロッキングオリゴヌクレオチドが、本明細書において記載されている通りに行われるハイブリダイゼーション反応に添加されて、実施例１４に記載されている通りのオフターゲット核酸結合のキャリーオーバーを防止する。実施例４に記載されている実験条件において、オフターゲット結合を変性しそうである高ストリンジェンシー洗浄が行われる。しかしながら、ＤＮＡ：ＤＮＡ相互作用のための最適なハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は、実施例１３Ａ－１３Ｃに記載されている通り、洗浄の温度を低下させ、したがって、オフターゲット結合を増加させる。

【0442】

ブロッキングオリゴは、アダプター、例えば実施例Ｃに記載されているＩｌｌｕｍｉｎａマルチプレックスアダプターに相補的に設計されて、アダプターとブロッキングオリゴとの間の相補性の程度を増加させることができる。例えば、Ｐ５ブロッキングオリゴは５８ｂｐ塩基長であるが、ブロッカーは４６塩基だけである。Ｐ５ブロッキングオリゴの長さを１９塩基延長した。ブロッキングオリゴの長さを１９塩基延長して、選択効率がおよそ５％増加した（図９に示されている。）。図９は、標準的および延長されたブロッキングオリゴを使用する標的選択の百分率を描写する棒グラフである。４つの代表的実験からのデータが示されている。図１０は、標準的または延長されたブロッカーを使用する捕捉結果を示すエクソンカバレッジヒストグラムを描写している。

【0443】

改善されたブロッキングは、アダプターとブロッキングオリゴとの間の相補性領域の長さを延長することによって達成され、したがって、溶融温度を増加させることができる。

【0444】

参照による組込み
本明細書において記述されている全ての公報、特許および特許出願は、各個別の公報、特許または特許出願が参照により組み込まれると具体的および個別に示されているかのように、本明細書によって参照によりそれらの全体を組み込まれる。矛盾の場合において、本明細書における任意の定義を含めて、本出願が優先される。

【0445】

その上、参照によりそれらの全体を組み込まれるのは、ワールドワイドウェブ上のｔｉｇｒ．ｏｒｇにおけるゲノム研究所（ＴＩＧＲ）および／またはワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおける国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって維持されているものなど、公開データベースにおけるエントリーと相関する受託番号を参照する任意のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列である。

【0446】

本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、限定的なものではない。当業者は、本明細書に記載の複数および／または単数の用語の実質的な使用に関して、文脈および／または用途に適切であるように複数形に言い換えることができる。様々な単数／複数の置き換えは、明確さのために本明細書においてはっきりと述べられていることがある。

【0447】

本発明は特定の実施形態を参照して記載されてきたが、本発明は様々に変更することができるとともに本発明の範囲から逸脱することなく均等物に置き換え得ることは、当業者によって理解されよう。加えて、特別な状況または材料を、本発明の範囲から逸脱することなく本発明の教示に適応させるために、多くの改変が採用される。そのため、本発明は開示されている特別な実施形態または実施例に限定されるべきでないが、本発明は添付の請求項の範囲内にある全ての実施形態を含むものとみなす。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【配列表】

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