特許 7459103 血液試料中で血液凝固酵素阻害剤である抗凝固薬の存在を検出する、同定する及び定量するための方法並びにその実装手段

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-22

(45)【発行日】2024-04-01

(54)【発明の名称】血液試料中で血液凝固酵素阻害剤である抗凝固薬の存在を検出する、同定する及び定量するための方法並びにその実装手段

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/48 20060101AFI20240325BHJP

   G16H 70/00 20180101ALI20240325BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20240325BHJP

【ＦＩ】

G01N33/48 K

G16H70/00

C12Q1/37

【請求項の数】 24

(21)【出願番号】P 2021532293

(86)(22)【出願日】2019-12-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-27

(86)【国際出願番号】 EP2019084069

(87)【国際公開番号】W WO2020115315

(87)【国際公開日】2020-06-11

【審査請求日】2022-12-05

(31)【優先権主張番号】1872562

(32)【優先日】2018-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(73)【特許権者】

【識別番号】508328800

【氏名又は名称】ディアグノスチカ・スタゴ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】セバスティアン・ケルデロ

【審査官】下村 一石

(56)【参考文献】

【文献】特開２０１２－１４１３１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１６－５００４４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１６／０１８７３３８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０１４／１３４２２３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｇ０１Ｎ ３３／４８－３３／９８

Ｇ１６Ｈ ７０／００

Ｃ１２Ｑ １／３７

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的試料中で、第Xa因子(FXa)及び第IIa因子(FIIa)から独立して選択される血液凝固酵素の阻害剤の存在を検出するためのin vitro方法であって、以下の工程:
a.以前に対象から得られた血液試料に対して1又は複数回の競合酵素アッセイを実施し、第Xa因子の阻害剤又は第IIa因子の阻害剤に関する競合速度論測定からなる結果を記録する工程、その後
b.工程a.で実施された競合酵素アッセイからの結果として、工程a.で実施された競合速度論測定からなる、記録された結果を、自動教師あり学習モデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルAに入力する工程、その後
i.判定モデルAが、分析試料中でその存在が探求される血液凝固酵素の阻害剤の存在を排除する場合、前記阻害剤の非存在を結論付ける工程、又は
ii.判定モデルAが、分析試料中でその存在が探求される血液凝固酵素の阻害剤の存在を確認する場合、前記阻害剤の存在を結論付ける工程
を含む、方法。

【請求項2】

生物学的試料中で、第Xa因子(FXa)及び第IIa因子(FIIa)から独立して選択される血液凝固酵素の阻害剤を同定するためのin vitro方法であって、以下の工程:
1.請求項1に記載の方法の工程を実施する工程、その後
2.請求項1のポイントa.の工程又は上記の工程1.で実施された競合酵素アッセイから得られた競合速度論測定からなる結果、及び請求項1の工程b.ii.の最後に得られた結果を、自動教師あり学習モデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルBに入力し、モデルBをトレーニングするために使用されるデータセットが、阻害剤の以下のカテゴリー:不可逆的間接阻害剤(ヘパリン)又は可逆的直接阻害剤(DOAC)に関連するデータを含む場合、モデルBにより、阻害剤のカテゴリーをこれら2つのカテゴリーのうちの1つに割り当て、モデルBにより決定される阻害剤のカテゴリーを出力する工程
を含む、方法。

【請求項3】

請求項1の工程b.iiでその存在が検出された阻害剤の特徴付けを行う追加の工程を含み、すなわち、請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.で実施された競合酵素アッセイから得られた競合速度論測定からなる結果及び決定された出力データを、自動教師あり学習モデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルCに入力し、問題の阻害剤の特徴付けをモデルCにより出力し、阻害剤が:
a.問題の阻害剤のカテゴリーがヘパリンのカテゴリーである場合、UFH若しくはLMWH、又は
b.問題の阻害剤のカテゴリーがDOACのカテゴリーである場合、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン若しくはダビガトラン
の中から同定され、
モデルCにより決定された阻害剤の特徴付けを出力する、請求項2に記載の方法。

【請求項4】

特徴付けされた阻害剤の定量的アッセイを行う追加の工程を含み、ここで、請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.で得られた競合速度論測定からなる結果及び分析血液試料中に存在する阻害剤を同定する請求項3によって得られた特徴付けデータを、回帰モデルDに供給し、前記回帰モデルDが、請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.のものと同一の測定条件下で得られたデータセットでトレーニングされており、分析試料中で同定された阻害剤の濃度が出力として決定されることを可能にする、請求項3に記載の方法。

【請求項5】

問題の阻害剤が:
I.UFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンから選択される第Xa因子(FXa)の阻害剤、又は
II.UFH、LMWH、ダビガトランから選択される第IIa因子(FIIa)の阻害剤
である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

請求項1の工程b.iiでその存在が検出された第Xa因子の阻害剤の調査に適用され、以下の追加の特徴付け工程:
I.阻害剤のカテゴリーが、請求項2の工程2.においてヘパリンのカテゴリーに割り当てられた場合、
i.その存在が検出された阻害剤のカテゴリーに関する決定された出力データ、及び請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.で実施された競合酵素アッセイから得られた第Xa因子の阻害剤に関する競合速度論測定からなる結果を、自動教師あり学習モデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルCに入力する工程、及び
ii.問題の阻害剤の特徴付けを分類判定モデルCにより出力し、阻害剤が、UFH又はLMWHの中から同定され、分類判定モデルCにより決定された阻害剤の特徴付けを出力する工程、又は代替的に、
II.阻害剤のカテゴリーが、請求項2の工程2.においてDOACのカテゴリーに割り当てられた場合、
i.同じ対象から得られた血液試料に対して競合酵素アッセイを実施することにより、1又は複数回の新規の競合速度論測定を得る工程であり、前記競合酵素アッセイが、第Xa因子を阻害するDOACの存在が関与する競合状況に適合された試料に対する希釈係数及び/又は測定期間で、第Xa因子の阻害剤に関して競合速度論測定を実施するために好適であり、希釈係数及び/又は測定期間が、請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.で得られた速度論測定の測定に利用されるものと異なる工程、その後
ii.その存在が検出された阻害剤のカテゴリーに関する、前記決定された出力データ、及び先行する工程i.で得られた競合速度論測定からなる結果を、自動教師あり学習モデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルCに入力する工程、及び
iii.問題の阻害剤の特徴付けを分類判定モデルCにより出力し、阻害剤が、リバーロキサバン、アピキサバン又はエドキサバンの中から同定され、分類判定モデルCにより決定された阻害剤の特徴付けを出力する工程
を含む、請求項2に記載の方法。

【請求項7】

請求項6の工程I.又はII.の最後に同定された阻害剤の定量的アッセイを行う追加の工程を含み、それぞれ、
I.請求項6の工程I.で同定された阻害剤がUFH又はLMWHである場合、請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.で得られた競合速度論測定からなる結果及び分析血液試料中に存在する阻害剤を同定する請求項6の工程I.iiで決定された出力データを、回帰モデルDに入力し、前記回帰モデルDが、請求項1の工程a.又は請求項2の工程1.のものと同一の測定条件下で得られたデータセットでトレーニングされており、前記回帰モデルDが、分析試料中で同定された阻害剤の濃度が出力として決定されることを可能にする、或いは
II.請求項6の工程II.で同定された阻害剤がリバーロキサバン、アピキサバン又はエドキサバンである場合、請求項6の工程II.i.で得られた競合速度論測定からなる結果及び特徴付けデータを、回帰モデルDに入力し、前記回帰モデルDが、請求項6の工程II.i.のものと同一の測定条件下で得られたデータセットでトレーニングされており、前記回帰モデルDが、分析試料中で同定された阻害剤の濃度が出力として決定されることを可能にする、請求項6に記載の方法。

【請求項8】

回帰モデルDにより決定された、分析試料中で同定された阻害剤の濃度が200ng/mL以下である場合、請求項1の工程a.で得られた競合速度論測定からなる結果を回帰モデルD2に入力し、前記回帰モデルD2が、請求項1の工程a.のものと同一の測定条件下で得られたデータセットでトレーニングされており、前記回帰モデルD2が、分析試料中で同定された阻害剤の濃度の再計算を可能にする、請求項7のポイントII.に記載の方法。

【請求項9】

対象から得られた血液試料に対する競合酵素アッセイにより得られる競合速度論測定のin vitro測定が、以下の工程:
a.希釈された又は希釈されていない血液試料を準備する工程、その後
b.血液試料に、問題の阻害剤に応じて第Xa因子又は第IIa因子のいずれかに特異的な基質を添加する工程、
c.b.で得られた混合物の温度を35℃～39℃の間の温度に上昇させてインキュベートする工程、
d.c.で得られた反応混合物に、阻害反応と誘発される酵素反応との間の競合を開始させるように、工程b.で添加された基質に応じて第Xa因子又は第IIa因子を添加する工程、
e.それに対する分析される酵素(第Xa因子又は第IIa因子)の作用による基質の変換から生じた生成物の分量を、経時的に機器を使用して測定し、得られた速度論を記録する工程
を含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

工程bにおける基質が発色性又は蛍光発生基質であり、工程eにおける測定が前記酵素反応中に遊離した基質に関連付けられるマーカーの測定により実施される、請求項9に記載の方法。

【請求項11】

競合酵素アッセイが第Xa因子に特異的であり、
a.工程a.において、血液試料がOwren Koller緩衝液中で1/2に希釈された血漿の試料であり、
b.工程b.において、基質が試薬MAPA-Gly-Arg-pNAであり、
c.工程c.において、インキュベーション期間が37℃で240秒であり、
d.工程d.で混合物に添加される第Xa因子がウシ第Xa因子であり、
e.工程e.におけるパラニトロアニリン(pNA)の遊離の測定が、比色分析により405nmで2秒ごとに156秒間、STA-R型(登録商標)の適切な機器において実施される、
又は代替的には
a.工程a.において、血液試料がOwren Koller緩衝液中で8分の1に希釈された血漿の試料であり、
b.工程b.において、基質が試薬MAPA-Gly-Arg-pNAであり、
c.工程c.において、インキュベーション期間が37℃で240秒であり、
d.工程d.で混合物に添加される第Xa因子がウシ第Xa因子であり、
e.工程e.におけるパラニトロアニリン(pNA)の遊離の測定が、比色分析により405nmで2秒ごとに86秒間、STA-R型(登録商標)の適切な機器において実施される、
請求項9又は10に記載の方法。

【請求項12】

競合酵素アッセイが、小型デバイスにおいて1～20μLの間の反応体積で実施される、請求項9又は10に記載の方法。

【請求項13】

生物学的試料が血液試料である、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

血液試料が血漿の試料である、請求項13に記載の方法。

【請求項15】

I.利用される1又は複数の判定モデルが、試験データで試験した際に、使用される種々のモデルの合計及び/又は使用される各モデルに適用される、70%又は75%又は80%又は85%又は90%又は95%以上のそれが与える結果の正確度の精度に到達することを可能にする、及び/又は
II.使用される回帰モデルDが、試験データで試験した際に、0.9～1.1の間に含まれる線形回帰の傾き、及び0.70又は0.80又は0.90又は0.95以上(CLSI EP9-A2の判定基準に従い)の決定係数R2により特徴付けられる出力結果を得ることを可能にする、
請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

自動教師あり学習モデルに実験的に得られた速度論測定を入力する工程が、測定期間にわたる各別個の測定時点について測定された各値によって構成される値の組を提供することから構成される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

モデルA、B、C、D又はD2のいずれか一つが、以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から独立に選択される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

少なくとも請求項1の工程b.を実施するための手段を含み、請求項2に記載の方法の工程2.を実施するための手段を含むもしくは含まない、データ処理システム又はデバイス。

【請求項19】

請求項18に示される工程を実施するように適合されたプロセッサを更に含む、請求項18に記載のデータ処理システム又はデバイス。

【請求項20】

コンピュータプログラムであって、プログラムがコンピュータによって実行されると、前記コンピュータに少なくとも請求項1の工程b.を実施させる指示を含む、あるいはプログラムがコンピュータによって実行されると、前記コンピュータに請求項1の工程b.及び請求項2に記載の方法の工程2.を実行させる指示を含む、コンピュータプログラム。

【請求項21】

請求項18又は請求項19に記載のデータ処理システム又はデバイスであって、請求項1又は6に規定の速度論測定を行うための機器を含むデバイス、又は測定機器を使用するデータ処理システム又はデバイスを制御して少なくとも請求項1の工程b.を実行させる指示を含む、あるいは請求項1の工程b.及び請求項2に記載の方法の工程2の両方を実行させる指示を含む、コンピュータプログラム。

【請求項22】

コンピュータによって読み出し可能な記憶媒体であって、コンピュータによって実行されると、コンピュータに少なくとも請求項1の工程b.を実施させる指示を含む、あるいはコンピュータによって実行されると、コンピュータに請求項1の工程b.及び請求項2に記載の方法の工程2.を実施させる指示を含む、記憶媒体。

【請求項23】

コンピュータによって読み出し可能な、その上に請求項21又は22に記載のコンピュータプログラムが記憶されるデータキャリア、又は請求項21若しくは請求項22に記載のコンピュータプログラムを搬送するデータキャリアからの信号。

【請求項24】

請求項1から17のいずれか一項に記載の方法を実施するように適合されたキットであって、
a.FXa及び/又はFIIaに特異的な基質
を含み、かつ
b.FXa及び/又はFIIa、並びに/あるいは
c.1種又は複数の適切な緩衝液、並びに/あるいは
d.基質を利用して競合酵素アッセイを実施することにより、1又は複数回の競合速度論測定を行うための指示、並びに/あるいは
e.システム及び/又はデバイス及び/又はコンピュータプログラム及び/又は請求項18から23のいずれか一項に規定のコンピュータによって読み出し可能なデータキャリア、並びに/あるいは
f.請求項1から17のいずれか一項に記載の方法を実施させる指示、並びに/あるいは
g.請求項1から17のいずれか一項に記載の方法を実施するための、請求項23に記載のデータキャリアからの信号の使用に関連する指示
を含む、又は含まない、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、止血の分野、特に血液の凝固の分野に関し、分析試料中に見出される血液凝固酵素の阻害剤である抗凝固薬の「ブラインド」検出、続いて適切な場合は同定、及び定性的そして定量的特徴付け(アッセイ)のための方法及び手段を提供する。

【0002】

本発明は、血液試料に実施された速度論測定の後処理を目的として、人工知能ツール、特に自動教師あり学習モデルを利用する。

【0003】

したがって、且つより詳細には、本発明は、第Xa因子及び第IIa因子から選択される血液凝固酵素の阻害剤の存在を検出し、阻害剤の存在が評価できる場合には、そのカテゴリー、その性質、及び更にはその有効な特徴付けを含む前記阻害剤の同定を行い、この同定後にその定量的アッセイを行うためのin vitro方法に関する。本発明は主に、ヒト対象から採取された生物学的試料中の問題の阻害剤の存在のin vitro検出を対象とする。

【0004】

本発明はまた、この目的に有用であり適合された手段:適切なデータ処理システム又はデバイス、コンピュータプログラム、記憶媒体又はデータキャリア、及びそれらが実験によるかin silicoであるかにかかわらず、本明細書に記載される実施される方法の工程のすべてを可能にするキットに関する。

【背景技術】

【0005】

凝固は、カスケードとして生じ、複数の血漿タンパク質が関与する複雑な生理学的現象である。このプロセスは、一旦誘発されると血栓(血小板の栓)の形成をもたらし、非病理学的な生理学的状態では、これによって出血が緩徐化する、減速する又は抑制される。対照的に、出血のリスクの上昇につながる凝固に伴う問題は、血友病として公知である。自然な血液凝固は、ともに作用して凝固の自然な傾向と出血の自然な傾向との間の正常な均衡をもたらす種々の凝固因子の存在によって調節される。

【0006】

特定の場合、特に病理学的状況では、凝固プロセスは、特定の問題又は病態を処置する又は予防するための抗凝固剤の投与によって修正又は改変されなければならない。薬物の形態のこれらの薬剤を使用した場合に達成される抗凝固効果の程度は、多くの場合あまり十分に知られていない多数の因子に左右される。しかし、過剰投薬の場合には、自然の開口部からの偶発的な出血が生じる可能性がある。したがって、そのような処置は、一般的に血液試験を実施することによる、抗凝固の程度の規則的なモニタリングを伴う。

【0007】

このため、非生理学的な抗凝固薬、例えば合成抗凝固薬、すなわち医薬抗凝固薬が、診断される問題の予防及び/又は処置のために一般に処方される。

【0008】

凝固酵素を阻害する入手可能な医薬抗凝固剤は、2つの大きな抗凝固薬のファミリー:1/ヘパリン及び2/直接経口抗凝固薬(DOAC)に属し、2つのファミリーの薬剤は、凝固第Xa因子及び/又は第IIa因子の阻害剤に対応する。

【0009】

ヘパリンは、第Xa因子及び第IIa因子の不可逆的な間接阻害剤である。これらは2つのクラス:未分画ヘパリン(UFH)及び低分子量ヘパリン(LMWH)に分けることができる。UFHは、1に近い(抗Xa能/抗IIa能)比を有する一方、LMWHは、2又は3に近い(抗Xa能/抗IIa能)比を有する。

【0010】

直接経口抗凝固薬(DOAC)は、第Xa因子又は第IIa因子に特異的な可逆的直接阻害剤である。第Xa因子に特異的な主なDOACは、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンである。第IIa因子に特異的な主なDOACはダビガトランである。Tables 18 and 20(表18及び表20)は、第Xa因子及び第IIa因子の他の公知の合成阻害剤の更に完全な詳細を示す。

【0011】

それを必要とする臨床状況にある対象の止血状態を決定するため、及び抗凝固薬処置を受けている患者の止血状態をモニタリングするために、凝固パラメータを検出及び/又はアッセイするための種々の試験が想定されている。

【0012】

例として、プロトロンビンレベル又はクイックタイムが増加した場合等に、凝固低下状態の存在を決定するために使用できる臨床試験が公知である。しかし、これらの医学的生物学的試験は、あらゆる場所で常に利用可能であるわけではない実験室用設備を必要とする。

【0013】

その存在が疑われる、正確な、通常は固有の抗凝固薬の存在を検出するために使用できる試験もまた公知である。例として、本出願人が販売するSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xaキットは、STA-R(登録商標)系列からの機器とともに使用し、合成発色性基質を使用する競合試験においてそれらの抗Xa活性を測定することにより、未分画ヘパリン(UFH)又は低分子量ヘパリン(LMWH)の血漿レベルの定量的決定を行うことを目的としている。約10分で実施可能なこの試験は、経験、設備の利用可能性及び操作者の反応性に応じて、特に何を探し求めるかが把握されている場合に高度に適切である。しかし、この種類の試験は、較正試験の実施を常に必要とする。

【0014】

UFHとLMWHの両方のアッセイに使用することができるStago社STA(登録商標)-Multi-Hep Calibratorキットもまた公知である。このキットは、一般的方法論及びハイブリッド較正を使用する。しかし、このキットはDOACを検出するために使用することはできない。

【0015】

考慮されている患者の薬物レジメンが確実に把握されていない又は決定できず(例えば、患者が意識不明である場合)、検出プロセスが複雑になる状況、特に臨床状況が依然として存在する。例えば、例えば薬物処置、生物学的若しくは臨床試験、又は外科的介入の文脈では、患者に投与された1種又は複数の抗凝固薬を同定することにより患者の抗凝固薬レジメンを把握し、患者における、実際には可能であれば患者の入院直後に、可能であれば緊急状態下でそれらの濃度を把握することが必要である又は好ましい場合がある。一般的に、公知の抗凝固薬物のうちの1つの血液試料中の存在の検出、又は実際にはそれらの同定は、緊急状況(出血、解毒の用意等の文脈)で高度に有用である可能性がある。抗凝固剤をアッセイするための利用可能な試験は、その同一性が既知であり、患者の検査中に適時に伝達され、かつ検査される患者に処方又は投与されたことが確認できる抗凝固薬のアッセイに適している。対照的に、生物学的又は臨床情報を収集するために有効な試験において、第1の工程で生物学的試料中の抗凝固薬の存在を同定し、次にそれらのカテゴリー及び/又はそれらの同一性、最後に適切であればそれらの濃度を決定することができる「ブラインド」アッセイ試験は、患者の臨床ケアにおける特定の状況に応答するために明らかに有用であるにもかかわらず、入手可能ではない。

【0016】

最後に、現在では上述の種々の抗凝固薬をアッセイするための複数の商業的な解決策が存在するが、これらの解決策のすべてが、必ずしもその独自の較正及び対照、並びにその独自の実験的方法論を有する専用キットの使用を含むわけではない。

【0017】

実際、第Xa因子を阻害する抗凝固薬の存在の測定の例を使用すると、現行の方法の使用は、最低4種のアッセイを強要する(例えば、ハイブリッド方法論を使用するヘパリンのアッセイ及び3種の抗Xa DOACアッセイ)。抗凝固薬分子に関する事前情報無しでの同定は、現在のところ不可能である。

【0018】

したがって特に、本発明は、前段落に特定された問題の一部又はすべて、特に血液試料中で血液凝固酵素を阻害する抗凝固薬の存在又は非存在を「ブラインド」検出する問題を解決することを提案する。特に、提案される解決策は、臨床ケア状況、特に緊急事態の文脈、患者の処置レジメンに関して不明確である状況、又は患者が意識不明である状況に特に好適な試験を初めて提供する。この種類の試験は、臨床ケアの文脈において簡便且つ使用者の時間の節制にならなければならないが、状況が生命を脅かすものである可能性を考慮すると、当然信頼性もなければならない。そのような試験は、その存在が未知である又は疑われる可能性のある、血液試料中に含有される薬剤の信頼性のある同定を可能にすべきである。現在のところ、この種類の試験は存在しないことが留意される。

【0019】

特定の態様によると、本発明は、本明細書で「合成」抗凝固薬とも称される外来性抗凝固剤の検出、特に抗凝固薬物の検出、好ましくは更に、単一の試験を使用した検出を許容し、多数の別個の試験を繰り返す必要なく結論に到達することを可能とすることに関する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0020】

【文献】Geron, 2017

【文献】Bonaccorso, G. (2017)

【文献】Segel, 1993

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0021】

この理由から、及びこれらの問題を解決するために、生物学的試料中、特に血液試料中で、第Xa因子(FXa)及び第IIa因子(FIIa)から独立して選択される血液凝固酵素の阻害剤の存在を検出するためのin vitro方法であって、以下の工程:
a.対象から得られた血液試料に対して競合酵素アッセイを実施することにより1又は複数回の競合速度論測定(competitive kinetics measurements)を行う工程であり、前記アッセイが、第Xa因子の阻害剤又は第IIa因子の阻害剤のいずれかを考慮して(互いに独立して)競合速度論測定を実施するために好適である工程、その後
b.工程aで得られた速度論測定を、自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルAに入力する工程であり、特にパラメータがトレーニングにより計算されている工程、その後
i.判定モデルAが、分析試料中でその存在が探求される血液凝固酵素の阻害剤の存在を排除する場合、前記阻害剤の非存在を結論付け、必要に応じて対応する情報を出力として、例えば変数でモデルAによって割り当てる工程、又は
ii.判定モデルAが、分析試料中でその存在が探求される血液凝固酵素の阻害剤の存在を確認する場合、前記阻害剤の存在を結論付け、必要に応じて対応する情報を出力として、例えば変数でモデルAによって割り当てる工程
を含む、方法。

【0022】

試験される血液試料は、例えば血液の試料又は血漿の試料である。血液試料は、必要とされるものに応じて希釈されてもされなくてもよい。

【0023】

本発明は、いわゆる「ブラインド検出」の問題を解決する。「ブラインド検出」という用語は、本発明によると、標的酵素の阻害剤が試料中に存在するかどうかも、更にはどの阻害剤が存在しうるかも事前に不明であることを指し示し、したがって本明細書に記載される方法は、第Xa因子及び/又は第IIa因子に作用する任意の凝固阻害剤の検出に好適であり、この文脈で提供されるモデルによっては、そのために機能することができる。

【0024】

より詳細には、本発明は、「天然」又は生理学的(区別はTables 17 to 20(表17～20)にリストの形態で例示される)とされる阻害剤とは対照的に、本明細書で医薬と称される(Tables 17 to 20(表17～20)では「合成」とも称される)第Xa因子(FXa)又は第IIa因子(FIIa)の阻害剤であって、標的化酵素によって選択的な抗凝固機能を有する阻害剤の検出を想定する。本発明の特定の実施形態では、凝固酵素の問題の阻害剤は、したがって非生理学的阻害剤である。そのような阻害剤は、特に医薬阻害剤である。特定の態様によると、医薬阻害剤は、「天然の」生理学的濃度より実質的に高い濃度で患者からの試料中に見出される場合がある。特定の実施形態によると、前記阻害剤は、ヘパリンのファミリー又はDOACのファミリーに属する。

【0025】

したがって、それらの活性物質又はINNによって命名される第Xa因子の医薬(合成)阻害剤の例は、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン、ベトリキサバン、UFH、例えばUFHカルシウム、UFHナトリウム、LMWH、五糖、ダナパロイドナトリウムである。本出願で報告される概念実証は、より詳細には、UFHカルシウム又はUFHナトリウム等の未分画ヘパリン(UFH)、Fragmine(登録商標)、Lovenox(登録商標)、Innohep(登録商標)の活性成分を構成するもの等の低分子量ヘパリン(LMWH)であるヘパリン、又はDOAC、つまりリバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンを想定するが、本明細書に記載される方法は、酵素に好適な基質が与えられる場合、及び本明細書に記載及び例示される基本理念と一致する好適なモデルが生成された又は生成されうる場合は、第Xa因子及び又は第IIa因子の任意の種類の阻害剤のために実装されてもよいことが理解されるべきである。したがって、それらの活性物質又はINNによって命名される第IIa因子の医薬(合成)阻害剤の例は、ダビガトラン、メラガトラン、アルガトロバン、ビバリルジン、UFH、LMWHである。人工知能アルゴリズム及びそれらの随意のそれらの実装に関する文献に基づき、且つ本明細書の実験セクションの内容に従い、当業者は、本明細書に記載されるプロトコールを適合させ、判定を行うことを可能にする他のモデルを代用する、組み込む又は加えることができる。

【0026】

したがって、「選択される血液凝固酵素」という用語は、同じ試験においてその阻害剤がそれぞれ互いとは無関係に調査される第Xa因子及び第IIa因子を想定する。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、2種の同時検出を除く、第Xa因子の阻害剤又は第IIa因子の阻害剤のいずれかの存在を検出すること(及び適切な場合は後続の工程で、同一性を検出すること、及び好ましくは例えば濃度を示すために定量的アッセイを実施すること)を提案する。

【0027】

工程a.における「1又は複数回の競合速度論測定を行う工程」という用語は、特定の実施形態によると、対象(好ましくはヒト、特に患者)から採取された同じ血液試料に対して複数回測定を繰り返し、より良好な信頼性をもたらしてもよいことを示す。したがって、それを必要とする工程のすべてにおいて複数の速度論測定が行われてもよく、又は他のものをすべて組み込んだ単一の速度論測定が行われてもよい。本発明の文脈における競合速度論を得るように酵素アッセイを実施するために、生化学反応を実施するための以下の条件が組み合わされなければならない:標的凝固酵素阻害剤を含有する可能性がある血液試料を、標的酵素のために選択された基質、好ましくは標的酵素に特異的な基質の存在下に持ち込み、インキュベーション工程を実施し、その後標的酵素を、酵素の阻害反応と前記酵素とその基質の酵素反応との間の競合を可能にする条件下で反応混合物に添加する。利用される基質は、通常、酵素がこの基質と相互作用し、それを酵素反応の生成物に変換させる際にマーカーの遊離を可能とし、その後遊離した前記マーカーの測定、及び阻害剤が試料中に存在する場合に影響を受けるマーカーの遊離速度論の形態のその経時的な変化を記録することを可能とするように標識され、この影響もまた、阻害剤の濃度によってモジュレートされる。競合アッセイ反応の速度論スキームは、実施例に例示される。標的酵素との酵素反応のために指し示される基質は、当業者に公知である。言及することができる本発明を実施するために好適な基質の例は、第Xa因子に特異的な基質MAPA-Gly-Arg-pNAであって、FXaによって変換されると、比色分析によって405nmで測定して検出されうるパラニトロアラニン(pNA)の遊離を誘導する基質、又は基質MAPA-Gly-Arg-AMC若しくはその任意の公知の変異体であって、蛍光定量によって検出されうるアミノメチルクマリン(AMC)の遊離を誘導する基質若しくはその任意の公知の変異体、又は第IIa因子に特異的な基質EtM-SPro-Arg-pNA若しくは当業者に公知の任意の変異体である。

【0028】

工程a.による競合速度論の測定は、止血試験の分野における通常の慣例に従い、且つその例が以下に提供される周知の技術に従いin vitroで実施される測定である。この実験工程は、当業者に周知の従来の慣例に従い実施される。

【0029】

しかし、本発明で提案される分類の連鎖を通した結果の信頼性、モデルをトレーニングするために使用されるデータセット、及び考慮される対象からの血液試料から得られる速度論データの間には切断できない連結が存在するため、前記データセット及び対象からの試料に対して実施される試験の前記速度論データは、同一でなければほぼ同一の実験条件下で得られなければならないことが理解される。したがって、使用される判定モデルは、対象からの試験データの収集の文脈で使用される試薬及び機器に連結する/関連付けられると言うことができる。

【0030】

このように述べたが、本発明は、特定のモデルの機器若しくは測定デバイスにおいて、又は特定のモデルの試薬を用いて実施されなければならないというわけではない。結果に誤りがないように、同様の実験条件下で実施される試験又は実験の結果を単純に比較することで十分である。本明細書に記載されるアルゴリズム方法は、機器間較正に取って代わり、且つ実施される各試験又は試験のまとまりごとに較正を行う必要を排除するために使用できる。

【0031】

「自動教師あり学習モデル」、例えば以下のカテゴリー:「サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデル」のうちの1種から選択されるモデル「をトレーニングすることにより得られる分類判定モデルA」という用語は、特定の文献に記述されるもの等の自動教師あり学習モデルを実装するための複数の可能性を指す。それらの一般的知識に基づき、当業者は、観察される性能をそれらの必要性及び想定される目的に適合させるために使用するモデルの種類を改変することができる。例えば、排他的ではないが、[Geron, 2017]又はBonaccorso, G. (2017)を参照されたい。

【0032】

本質的に、自動教師あり学習モデルのパラメータは、分野で慣例的な形でトレーニングすることによって計算されている。例えば、排他的ではないが、[Geron, 2017]又はBonaccorso, G. (2017)を参照されたい。

【0033】

特定の実施形態によると、分類判定モデルAはサポートベクターマシンであり、詳細にはサポートベクターマシンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0034】

本発明の本質から判断すると、本明細書に記載される方法は、既に収集及び確立されたデータセットでの自動学習モデルのトレーニングの結果を考慮に入れる。典型的に、そのような分類判定モデルは、入力データセット(その構成は本発明による方法を実施する前は未知である)に適用されると解を与えることができる、経験的に決定された数学関数に対応する行列からなってもよい。モデルAに関して、解は、例えば問題の阻害剤の存在又は非存在を意味する「yes」又は「no」のいずれか(「1」又は「0」等の整数によってエンコードされる場合がある)であってもよい。

【0035】

実際、上記で報告される工程b.は、学習により経験的に決定される数学関数の複雑さのために、コンピュータにより必ず実施される工程である。

【0036】

別の特定の実施形態によると、分類判定モデルAはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンであり、詳細にはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるそのようなモデルAのより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0037】

特にサポートベクターマシン又は多層パーセプトロン等のニューラルネットワークの実装のためのモデルの実装の例は、必要であれば分野における文献を参照して(例えば、排他的ではないが、[Geron, 2017]又はBonaccorso, G. (2017)を参照されたい)当業者に公知である。より正確には、scikit-learnライブラリ(https://scikit-learn.org/)で実装されるLIBSVMパッケージ(https://www.csie.ntu.edu.tw/～cjlin/libsvm/)を使用することができる。当業者が固定しようとするパラメータの例は、互いに独立して又は非独立的に、ノード(線形、多項式、ガウス、シグモイド等)、ノードの係数及びSVMモデルに関連付けられる素のパラメータである。当業者は、前述のパラメータを固定するためのモダリティーの考慮を含め、そのようなモデルの実装に関して、必要であれば本明細書に明示的又は黙示的に含まれる指針を含め、Geron, 2017又はBonaccorso, G. (2017)を特に参照してもよい。

【0038】

阻害剤の存在が確認された場合、本発明の更なる実施形態は、次に前記検出された酵素の阻害剤を同定するための工程を含む。

【0039】

したがって、本発明は更に、生物学的試料、特に血液試料中で、第Xa因子(FXa)及び第IIa因子(FIIa)から独立して選択される血液凝固酵素の阻害剤を同定するためのin vitro方法であって、以下の工程:
1.上記に記載された検出方法の工程、又は記載される通りの、且つ本明細書におけるこの方法の任意の特定の実施形態を実施する工程、その後
2.上記のポイントa.の工程で得られた速度論(検出の文脈において)、及び上記の工程b.ii.の最後に得られた結果(検出の文脈において)を、自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルBに入力し、特にここでパラメータがトレーニングにより計算されており、特にモデルBをトレーニングするために使用されるデータセットが、阻害剤の以下の2種のカテゴリー:不可逆的間接阻害剤(ヘパリン)又は可逆的直接阻害剤(DOAC)に関連するデータを含む場合、阻害剤のカテゴリーのモデルBにより、これら2つのカテゴリーのうちの1つに割り当て、モデルBにより決定される阻害剤のカテゴリーを、例えば変数に割り付けることにより出力する工程
を含む、方法に関する。

【0040】

類推により、「分類判定モデルB」という用語は、「モデルA」に関する上記と同じものを指し示す。

【0041】

特定の実施形態によると、分類判定モデルBはk近傍法モデルであり、詳細にはk近傍法モデルをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0042】

「特にモデルBをトレーニングするために使用されるデータセットが、阻害剤のこれら2つのカテゴリー、すなわち不可逆的間接阻害剤(ヘパリン)及び可逆的直接阻害剤(DOAC)に関連するデータを含む場合」という用語は、本発明が、学習のために使用されるデータセットが未知且つ得られるべき情報の種類と相関していなければならないことを要求することを意味すると理解されるべきである。当業者のための指針は、当然ながら実験セクションに提供される実施例から得られる。

【0043】

実際、モデルBを実装するための工程は、学習により経験的に決定される数学関数の複雑さのために、コンピュータにより必ず実施される工程である。

【0044】

別の特定の実施形態によると、分類判定モデルBはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンであり、詳細にはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるそのようなモデルBのより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0045】

特にk近傍法モデル又は多層パーセプトロン等のニューラルネットワークの実装のためのモデルの実装の例は、必要であれば分野における文献を参照して(例えば、排他的ではないが、[Geron, 2017]又はBonaccorso, G. (2017)を参照されたい)当業者に公知である。より正確には、例えばscikit-learnライブラリ(https://scikit-learn.org/)を使用することができる。当業者が固定しようとするパラメータは、例えば、互いに独立して又は非独立的に、近傍数及び距離尺度である。当業者は、前述のパラメータを固定するためのモダリティーの考慮を含め、そのようなモデルの実装に関して、必要であれば本明細書に明示的又は黙示的に含まれる指針を含め、Geron, 2017又はBonaccorso, G. (2017)を特に参照してもよい。

【0046】

モデルBの実装により、可逆的直接阻害剤(代替的に本文書では「DOAC」として既知)、不可逆的間接阻害剤(代替的に本文書では「ヘパリン」として既知)(図1におけるこれらの概念の説明を参照されたい)の2つから選択される「阻害剤のカテゴリー」に関連する応答が与えられる。実際、ヘパリンはすべて不可逆的間接阻害剤であり、DOAC(直接経口抗凝固薬)はすべて可逆的直接阻害剤であるため、実験セクションに記載される概念実証に対応する特定の実施形態に従い、学習のために提供されるデータセットが、これら2つのファミリーに属する活性成分のみを含む場合、本発明による方法は、これら2つの特定のファミリーを区別し、それらを「ヘパリン」及び「DOAC」と指し示すことができる。

【0047】

別の態様によると、前段落に記載される同定のためのin vitro方法(上述の「検出」方法とは対照的に)は、上記の工程b.iiでその存在が検出された(検出の文脈において)阻害剤の特徴付けを行うための追加の工程を更に含んでもよく、すなわち、上記の工程1.に相当する上記の工程a.で得られた速度論測定(検出の文脈において)及び決定された出力データ、例えばその存在が検出された阻害剤のカテゴリーに関するモデルBを実装する、上記の工程2.で割り当てられた変数を、自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルCに入力し、特にここでパラメータがトレーニングにより計算されており、問題の阻害剤の特徴付けをモデルCにより出力し、阻害剤が、
a.問題の阻害剤のカテゴリーがヘパリンのカテゴリーである場合、UFH若しくはLMWH(第Xa因子及び/又は第IIa因子の阻害剤に対して)、又は
b.問題の阻害剤のカテゴリーがDOACのカテゴリーである場合、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン(第Xa因子の阻害剤に対して)若しくはダビガトラン(第IIa因子の阻害剤に対して)
の中から同定され、
モデルCにより決定された阻害剤の特徴付けを、例えば変数に割り付けることにより出力する。

【0048】

類推により、「分類判定モデルC」という用語は、「モデルA」又は「モデルB」に関する上記と同じものを指し示す。

【0049】

特定の実施形態によると、分類判定モデルCはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンであり、詳細にはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0050】

実際、モデルCを実装するための工程は、学習により経験的に決定される数学関数の複雑さのために、コンピュータにより必ず実施される工程である。特にニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンの実装のためのモデルの実装の例は、必要であれば分野における文献を参照して(例えば、排他的ではないが、[Geron, 2017]又はBonaccorso, G. (2017)を参照されたい)当業者に公知である。より正確には、例えばscikit-learnライブラリ(https://scikit-learn.org/)を使用することができる。当業者が固定しようとするパラメータは、例えば、互いに独立して又は非独立的に、ニューロンの層の数、層あたりのニューロンの数及び種々のニューロンのための活性化関数である。しかし、使用者は、学習アルゴリズム又は正則化パラメータに関して実装についてある程度の自由を有する。当業者は、前述のパラメータを固定するためのモダリティーの考慮を含め、そのようなモデルの実装に関して、必要であれば本明細書に明示的又は黙示的に含まれる指針を含め、Geron, 2017又はBonaccorso, G. (2017)を特に参照してもよい。

【0051】

別の態様によると、前段落に記載される同定のためのin vitro方法は、モデルCを実装した後に、特徴付けされた阻害剤の定量的アッセイを行う追加の工程を更に含んでもよく、ここで、上記の工程1.に相当する上記の工程a.で得られた速度論測定(検出の文脈において)及び分析血液試料中に存在する阻害剤を同定するモデルCの実装後に得られた特徴付けデータを、回帰モデルD、特に自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルに入力し、前記回帰モデルが、上記の工程1.に相当する上記の工程a.(検出の文脈において)のものと同一の測定条件下で得られたデータセットでトレーニングされており、分析試料中で同定された阻害剤の濃度が出力において決定されることを可能にし、必要に応じて、モデルDにより決定された濃度を、例えば変数に割り付けることにより出力する。

【0052】

「...同定された阻害剤の濃度が出力において決定されることを可能にする」は、「同定された阻害剤の濃度を出力において決定する」又は「同定された阻害剤の濃度を出力に返す」と記述されてもよい。

【0053】

類推により、「回帰モデルD」又は「回帰モデルタイプの自動学習モデル」という用語は、「モデルA」、「モデルB」又は「モデルC」に関する上記と同じものを指し示す。

【0054】

特定の実施形態によると、モデルDはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンであり、詳細にはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0055】

実際、モデルDを実装するための工程は、学習により経験的に決定される数学関数の複雑さのために、コンピュータにより必ず実施される工程である。

【0056】

特にニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンの実装のためのモデルの実装の例は、必要であれば分野における文献を参照して(例えば、非排他的に、[Geron, 2017]を参照されたい)当業者に公知である。より正確には、例えばscikit-learnライブラリ(https://scikit-learn.org/)を使用することができる。当業者が固定しようとするパラメータは、例えば、互いに独立して又は非独立的に、ニューロンの層の数、層あたりのニューロンの数及び種々のニューロンのための活性化関数である。しかし、使用者は、学習アルゴリズム又は正則化パラメータに関して実装についてある程度の自由を有する。当業者は、前述のパラメータを固定するためのモダリティーの考慮を含め、そのようなモデルの実装に関して、必要であれば本明細書に明示的又は黙示的に含まれる指針を含め、Geron, 2017又はBonaccorso, G. (2017)を特に参照してもよい。

【0057】

本明細書で考察されるモデルに対する参照記号「A」、「B」、「C」及び「D」は読み易さのために示されたが、これらの文字は、これらにより示される意味を改変することなく省略することができることが明白である。詳細には、
- 文字「A」により言及されるモデルは、その阻害剤について本明細書に記載される定義のうちのいずれか1つに従い、分析試料中でその存在が探求される血液凝固酵素の阻害剤の存在を排除する又は確認するように機能する;
- 文字「B」により言及されるモデルは、実装される場合、可逆的直接阻害剤(代替的に本文書では「DOAC」として既知)、不可逆的間接阻害剤(代替的に本文書では「ヘパリン」として既知)の2つから選択される「阻害剤のカテゴリー」を決定するように機能する;
- 文字「C」により言及されるモデルは、実装される場合、モデル「B」により開始される特徴付けを定義するように機能する:ヘパリンのうち、問題の阻害剤はUFH又はLMWH(問題の阻害剤が第Xa因子及び/又は第IIa因子の阻害剤であるかにかかわらず)と分類されてもよく、DOACのうち、問題の阻害剤はリバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバン(第Xa因子の阻害剤に対して)又はダビガトラン(第IIa因子の阻害剤に対して)の間で分類されてもよい;
- 文字「D」により言及されるモデルは、実装される場合、同定された阻害剤の濃度を出力において決定するように機能する。これは、本明細書で「D2」と称されるモデルにも当てはまり、以下に詳述される:このモデルも、阻害剤の濃度を出力において決定するように機能する。

【0058】

この段階で、本明細書に記載される1又は複数の方法は、上記に詳述された工程の連鎖が完全に実装されるか部分的に実装されるかにかかわらず、且つ実施例の主題である概念実証によって実証される通り、普遍的なアルゴリズム処理方法論と組み合わされた競合酵素試験を実施することによって上記で言及された問題の解決策をもたらすことが留意されるべきである。本明細書に記載される1又は複数の方法は、適切であれば柔軟な濃度の範囲内で抗凝固剤抗Xa又は抗IIaの存在に対して高感度にされており、競合酵素試験は、種々の特定の実施形態によると自動学習モデルのカスケードにより実装される(それらの全体又は部分が実施される)人工知能と結び付く。このことの利点は以下の通りである:
・普遍的な方法論の提供:単一の試験が、種々の濃度で試料中の複数の種類の抗凝固薬(抗Xa及び/又は抗IIa抗凝固薬)、特に、より詳細には本明細書の主題を形成する任意の実施形態に従い記載される抗凝固薬の存在に高感度でありうる;
・この存在を検出するために、複数(UFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンのアッセイの5種、又はヘパリンに対して1つのキットのみの、上記で考察されたハイブリッド方法論の4つ)ではなく単一の試験が実施される;
・較正を排除する:使用者にとっての使い易さ;
・特定の数からの所望の外来性抗凝固薬分子の同定:これは現在のところ不可能であり、したがって患者に対する臨床的利点は明白である。

【0059】

本発明の特定の実施形態によると、本文書に記載される1又は複数の方法は、UFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン、エドキサバンから選択される第Xa因子(FXa)の阻害剤の研究に適用される。

【0060】

本発明の別の特定の実施形態によると、本文書に記載される1又は複数の方法は、UFH、LMWH、ダビガトランから選択される第IIa因子(FIIa)の阻害剤の探索に適用される。

【0061】

より正確な実施形態によると、本発明の方法は、第Xa因子の阻害剤の探索に正確且つ特異的に適用される。

【0062】

実施例の特定の場合、特に「DOACのために最適化された方法論」と称される方法論の重要性に関して実験セクションを参照することにより、一部の場合では、より信頼性のある検証を可能にする、又はより正確な目的若しくは異なる目的に適合させる(特に、検出が可能になる阻害剤の濃度の範囲に関して)ために本発明によって許容される、例えば後続の判定の連鎖に使用されてもよい新規の実験測定工程の導入を可能にするように、判定サイクルを適合させることが適切である場合があることが容易に理解される。

【0063】

実際、ヘパリンの研究に適合された希釈条件下及び測定期間にわたってDOACを研究するための上述の前記STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaキットの使用(キットは当初この目的にために設計された)は、阻害剤の濃度に対して想定された値の完全な範囲にわたって測定値を得るために使用することはできないことが確認されている:したがって、特定の濃度を標的化することができるという特定の目的に適合するように本明細書に記載される方法を最適化し、モジュレートするために、希釈及び測定期間に関して調整が提案されている。この調整は、別様に既に開始されていた方法に組み込まれる「実験フォローアップ」(競合酵素アッセイを実施することにより、新規の競合速度論測定を行う)の形態で実装された。実験フォローアップの利点は、調査によって標的化される抗Xa抗凝固薬(ヘパリン、DOAC)の阻害活性、及び特に正確に測定されるべき濃度の範囲に依存する場合がある。しかし、本発明は、例えば実施例の「普遍的な方法論」又は「DOACのために最適化された方法論」のいずれかで利用される条件が最初から使用される状況を包含する。

【0064】

本明細書で提供される指針は、使用者が、速度論測定の実施に利用される任意のキット、特に当技術分野で公知のものから、学習データに影響を及ぼす測定と、有効にブラインド測定されるデータの測定の両方に均質に適用されるべき希釈条件、及び必要であれば測定期間を決定することを可能にする。

【0065】

一般的に、実施例に記載されるこれらの調整は、当業者が、それに従って本明細書に記載される「モデル」又は分類、判定のためのモダリティーと比較されるデータを連結させ、本出願に黙示的又は明示的に詳述される指針に従って実験フォローアップを組み込むことができる様態を調整することができることを実証する。

【0066】

実際、概念実証を提供する実験セクションで示唆されるように、本発明の方法は、上述の「検出」工程a.で最初に得られる実験データが実験フォローアップから得られる実験データに代わって使用される場合にも機能する:検出されうる阻害剤の濃度の値の範囲は、この場合単純に異なる。ここで、これは、当業者が一般的知識に基づいて且つ必要に応じて本明細書に提供される指針から適用することができる最適化である。更に、本明細書に記載される調整は、必要であれば実験セクションに示される試験方法とともに、本発明の本質が疑われることなく、記載される本発明を異なる公知の検出又はアッセイキットに適合させるために当業者によってなされてもよい。

【0067】

したがって、特定の実施形態によると、本発明はまた、上記の工程b.iiでその存在が検出された(検出の文脈において)第Xa因子の阻害剤を同定するためのin vitro方法であって、以下の追加の特徴付け工程:
I.阻害剤のカテゴリーが、モデルBが実装された工程2.においてヘパリンのカテゴリーに割り当てられた場合、
i.前記決定された出力データ、例えばその存在が検出された阻害剤のカテゴリーに関するモデルBを実装する上記の工程2.で割り当てられた変数、及び上記の工程1.に相当する上記の工程a.で得られた第Xa因子の阻害剤に関する競合速度論測定(検出の文脈において)を、自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク(特に多層パーセプトロン)、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルCに入力する工程であり、特にパラメータがトレーニングにより計算されている工程、及び
ii.問題の阻害剤の特徴付けをモデルCにより出力し、阻害剤が、UFH又はLMWHの中から同定され、モデルCにより決定された阻害剤の特徴付けを、例えば変数に割り付けることにより出力する工程、又は代替的に、
II.阻害剤のカテゴリーが、モデルBが実装された工程2.においてDOACのカテゴリーに割り当てられた場合、
i.1人の(且つ同じ)対象から得られた血液試料に対して競合酵素アッセイを実施することにより、1又は複数回の新規の競合速度論測定(実験フォローアップ)を行う工程であり、前記アッセイが、第Xa因子を阻害するDOACの存在が関与する競合状況に適合された、試料に対する希釈係数及び/又は測定期間、特に上記の工程1.に相当する上記の工程a.で得られた速度論測定(検出の文脈において)の測定に利用されるものと異なる希釈係数及び/又は測定期間を用いて、第Xa因子の阻害剤に関して競合速度論測定を実施するために好適である工程、その後
ii.前記決定された出力データ、例えばその存在が検出された阻害剤のカテゴリーに関するモデルBを実装する上記の工程2.で割り当てられた変数、及び先行する工程i.で得られた速度論測定を、自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク(特に多層パーセプトロン)、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルをトレーニングすることにより得られる分類判定モデルCに入力する工程であり、特にパラメータがトレーニングにより計算されている工程、及び
iii.問題の阻害剤の特徴付けをモデルCにより出力し、阻害剤が、リバーロキサバン、アピキサバン又はエドキサバンの中から同定され、モデルCにより決定された阻害剤の特徴付けを、例えば変数に割り付けることにより出力する工程
を含む、方法に関する。

【0068】

しかし、類推により、「分類判定モデルC」という用語は、「モデルA」又は「モデルB」に関する上記と同じものを指し示す。

【0069】

特定の実施形態によると、分類判定モデルCはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンであり、詳細にはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0070】

実際、モデルCを実装するための工程は、学習により経験的に決定される数学関数の複雑さのために、コンピュータにより必ず実施される工程である。前段落の工程ii.を実施する文脈では、想定される分類判定モデルCは、それが利用される文脈を考慮して適切なトレーニングデータでトレーニングされたことが理解されるべきである。特に、これらのデータは、実験フォローアップを含む測定の環境を考慮に入れ(競合速度論測定が工程i.の文脈で実施されることを可能にするパラメータを考慮して、特に利用される試料に対する希釈係数及び/又は測定期間に関して、言い換えると且つ論理的に、測定を実施するための「文脈」は、使用される学習データ、利用される測定パラメータ(又は利用される測定キット)及び試験される標的試料に想定される測定ゾーンに関する文脈と一致する/対応する)、分類の有効な実装に適合される。

【0071】

特にニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンの実装のためのモデルの実装の例は、必要であれば分野における文献を参照して(例えば、非排他的に、[Geron, 2017]を参照されたい)当業者に公知である。より正確には、例えばscikit-learnライブラリ(https://scikit-learn.org/)を使用することができる。当業者が固定しようとするパラメータは、例えば、互いに独立して又は非独立的に、ニューロンの層の数、層あたりのニューロンの数及び種々のニューロンのための活性化関数である。しかし、使用者は、アルゴリズム又は正則化パラメータに関して実装についてある程度の自由を有する。当業者は、前述のパラメータを固定するためのモダリティーの考慮を含め、そのようなモデルの実装に関して、必要であれば本明細書に明示的又は黙示的に含まれる指針を含め、Geron, 2017又はBonaccorso, G. (2017)を特に参照してもよい。

【0072】

この特定の実施形態に適切な競合酵素アッセイを実施することにより、1又は複数回の新規の競合速度論測定(実験フォローアップ)を行う文脈では、有利には、
- この新規の測定は、「検出」のために最初に実施された測定と同じ対象から得られた血液試料に対して実施される(しかし明らかに、最初の測定に利用されたものは再使用できない)、
- 実験フォローアップのための前記アッセイは、測定が意味を成すように、当然ながら第Xa因子を阻害するDOACの存在が関与する競合状況に適合された試料に対する希釈係数及び/又は測定期間を用いて第Xa因子の阻害剤に関して競合速度論測定を実施するように適合される(実験セクションに例示される検証方法を利用することにより、当業者は、例えばこの適合を検証することができる)、並びに
- 好ましくは、実験フォローアップにおける分析試料の希釈係数及び/又は測定期間は、上記の工程a.で得られる速度論測定(検出の文脈において)の測定に利用されるものと異なる
ことが留意されるべきである。

【0073】

アッセイは、分野における従来の慣例に従って速度論追跡を得ることができ次第、「当然ながら第Xa因子を阻害するDOACの存在を示す競合状況に適合された希釈係数及び/又は測定期間を用いて、第Xa因子の阻害剤に関して競合速度論測定を実施する」ように適合されたとみなされる。追跡の例は、図5～図9に示される。当業者は、目的に合うとみなされるこの追跡の種類を得るために、アッセイ試験の実験条件を適合させることができる。

【0074】

以下に示されるように、次のパラメータが考慮されてもよい:
- 利用される基質は、第Xa因子に特異的であるが、酵素とその阻害剤との間の反応に干渉しないよう、第Xa因子にわずかな親和性を有さなければならない。
- 例として、利用される基質は、高いとみなされる、特におよそ10μM～1000μMのミカエリス定数KMを有さなければならない;及び/又は
- 酵素と基質との間の親和性が低くなるように故意に選択されるため、基質に対する酵素の触媒定数kcatは十分に高い、例えばおよそ10s-1より高い、又は10s-1より高くなければならない;及び/又は
- 基質の初期濃度[S]0は、測定の期間d全体にわたってマーカーの生成を可能にするのに十分でなければならず、これは当業者にとって従来の適合の一部である(以下の実験セクションにおける配合も参照されたい)。一実施形態によると、基質の初期濃度[S]0はKM^*10未満である;及び/又は
- 測定の継続時間は、存在する場合、抗凝固薬が酵素に対してその阻害作用を発揮することを可能とし、且つそれが測定によって観察可能であるように十分長くなるよう選択される;例として、含まれる継続時間は10～1000秒である。

【0075】

利用される基質が第Xa因子に特異的である状況に関連して前段落で示された要素は、利用される基質が第IIa因子に特異的である状況に同一に適用される。実際、これらの要素は、概して本明細書で想定される速度論のいずれの実施形態にも適用される。

【0076】

実験フォローアップにおける分析試料に対する希釈係数及び/又は測定期間は、上記の工程1.に相当する上記の工程a.で得られた速度論測定(検出の文脈において)を測定するために利用されるものと異なり、単に例示として、2つの場合において、これら2つのパラメータに想定されてもよい値の範囲は、以下の通りでありうる:
- 希釈係数に関して、試料は、必要であれば1/2～1/50の範囲に希釈される(速度論測定に一般的に利用される体積それ自体は、本明細書で以下に示される通りであるが、測定体積はそのような測定に提供されるデバイスに応じて異なる可能性があるため、この態様は決して限定的ではない)及び/又は
- 測定期間は、10～1000秒の間に含まれる。

【0077】

これらのパラメータは、相対的に普遍的なパラメータであるが、当業者がアッセイに使用される設備に応じてこれらを適合させなければならない場合があるため、限定的ではない。

【0078】

希釈は、当業者に公知のように又は製造業者の説明書に示されるように、この目的のために従来的に使用される任意の緩衝液中で実施されてもよい。

【0079】

実際、本出願は、試料が、必要であれば且つ試料が分析される個体から以前に回収された出発試料に対して1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12; 1/13、1/14、1/15、1/16、1/17、1/18、1/19、1/20、1/21、1/22; 1/23、1/24、1/25、1/26、1/27、1/28、1/29、1/30、1/31、1/32; 1/33、1/34、1/35、1/36、1/37、1/38、1/39、1/40、1/41、1/42; 1/43、1/44、1/45、1/46、1/47、1/48、1/49、1/50又はこれらの値のいずれか1つの間の任意の間隔の比で希釈される状況を包含する。

【0080】

実際、本出願は、速度論測定に利用される体積それ自体が1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400μL、又は直前で言及された値のうちのいずれか1つの間の間隔として定義される値の範囲内に含まれる任意の中間値である状況を包含する。

【0081】

本発明の別の実装変形形態によると、本明細書に記載される方法又は方法のうちの1つは、専用のポイントオブケアデバイス、例えば、例えばマイクロ流体を利用するデバイス等の小型化デバイスを用いて単位試験を実施するためのシステムで実施されてもよい。この場合、且つ従来的に、本明細書に記載される方法又は方法のうちの1つは、使用されるデバイス又は実装の文脈に適合される反応体積を用いて実施されてもよく、前記体積は、おそらく利用される小型デバイスに応じて、これらに限定されないが1～20μLの範囲内である。必要であれば且つ当業者に慣例の態様で、インキュベーション期間はまた、使用される前記デバイスの特徴に応じて、又は利用される実装の文脈内で適合されてもよい。

【0082】

測定期間に関して且つ例示として、測定期間は、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000秒又は直前で言及された値のうちのいずれか1つの間の間隔として定義される値の範囲内に含まれる任意の中間値であってもよい。

【0083】

当業者は、上述の専用のポイントオブケアデバイスを用いるそのような本発明を実施する様態によると、前記測定期間は、当業者にとって従来的な様態で適合されてもよいことを理解する。

【0084】

追求される目的に応じて想定される実験フォローアップは、より特定の範囲の濃度、又は少なくとも異なる範囲でブラインド分析される試料中に存在する第Xa因子の阻害剤の同定及び/又はアッセイの最適化を可能にする場合がある。実験セクションは、実験フォローアップが重要である又は速度論測定を有効に得ることができることを検証するために、当業者が容易に再現できる原理を提供する。別の態様によると、且つ上記の記載と同様にして、実験フォローアップに基づいて実装される分類判定モデルCに続き、回帰モデルDが適用されてもよい。

【0085】

しかし、且つ別の実施形態によると、適切であれば第Xa因子の阻害剤の同定に適用され、且つ回帰モデルDを利用する、特徴付けられた阻害剤の定量的アッセイを行うための追加の工程を含む、本明細書に記載される同定のためのin vitro方法は、上述の分類判定モデルCの上流ではなく、前記回帰モデルDのみの実装の上流で1人の(且つ同じ)対象から得られた血液試料に対して競合酵素アッセイを実施することにより、1又は複数回の新規の競合速度論測定(実験フォローアップ)を行うことを利用してもよい。この場合、上述の工程は、上述と同じモダリティーに従い、本明細書に記載されるプロセスと同様にして、実験フォローアップから新規に得られた速度論測定及び既に実行された分類モデルCの実装の結果を前記モデルDに付与することにより、前記回帰モデルDを実装する前に、新規の測定(実験フォローアップ)を実施することを単に組み込むように改変される。そのような実施形態の文脈では、一方でモデルCの学習及び検証、他方でモデルDの学習及び検証はそれぞれ、試料を用いて本発明の方法を実施する場合に患者から得られるデータとの比較を可能にする速度論測定条件が関与するデータセットで実施される。これは論理的に、そのような実施形態の文脈では、モデルCは本明細書に記載される「最初の」測定と同じ条件下で行われた速度論測定に基づいてトレーニングされ、モデルDは本明細書に記載される「実験フォローアップ」測定と同じ条件下で行われる速度論測定に基づいてトレーニングされることを意味する。

【0086】

これは、比較可能な条件(且つ特定の実施形態によると、同一の条件)下で得られるデータの比較を必要とする、又は比較可能な条件(且つ特定の実施形態によると、同一の)下で実施される測定に基づいて得られた及び/又は検証されたモデルに関してデータを比較することが、本発明に使用されるもの等の分類又は回帰方法を利用する当業者によって考慮に入れられることは明らかである。したがって、前段落における記述は、それらの種々の組合せの本明細書の実施形態のすべてに一般的に適用される。

【0087】

しかし、別の態様によると、本発明者らは、上述の普遍的な方法論により以前に測定された速度論(前記最適化された方法論(DOACのために)により測定された速度論ではない、この速度論は一般的に、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンから選択されるDOACの濃度の第1の計算において使用されており、前記計算は第1の回帰モデルDを利用する)を入力として使用する、本明細書で回帰モデルD2と称される第2の回帰モデルを実装することにより、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンから選択されるDOACの濃度を再計算することを利用する特定の実施形態も実装した。この特定の実施形態は、工程7.1「普遍的な方法論により測定された速度論を使用する濃度の再計算」を含め、図16のスキームに表示される予備工程の特定の連続に記述される。そのような実施形態に関連付けられる結果は、以下の実験セクションのセクション3及び4で、見出し「リバーロキサバン/アピキサバン/エドキサバンのアッセイ、普遍的な測定」でそれぞれセクション3.8/4.8(図20、リバーロキサバン)、3.10/4.10(図22、アピキサバン)、3.12/4.12(図24、エドキサバン)で例示される。この文脈における「普遍的な方法論」という表現の使用は、一般的に前に使用される回帰モデルDとは異なる別の回帰モデルを用いてDOACの濃度の再計算を実施するために利用される速度論が、本明細書に記載される普遍的な方法論を使用して測定される速度論である(実際、この種類の速度論は、一般的に本明細書に記載される方法の実装の連続工程中に上流で既に測定されている)という事実を反映する。この文脈では、文脈が「普遍的な方法論」と、上記及び本明細書で利用される「DOACのために最適化された方法論」との説明の違いを明確にするのに十分でない場合、「普遍的な方法論」という表現を「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」で置き換えることができる。「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」という表現は、より詳細には、図16で7.1と表される工程等の「再計算」工程に到達するために、連続で実装されるモデルの連鎖の全体に言及する。

【0088】

実験セクションに例示されるように、本明細書に記載される判定モデルの連鎖の下流の正確な時機に行われるこの再計算を実施する利点は、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンから選択される低濃度のDOACについて測定された濃度のより正確な結果を得ることである。このため、この特定の実施形態は、有利には第1の回帰モデルにより測定されるリバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンから選択されるDOACの濃度が200ng/mL未満又はそれ以下である場合に利用される。

【0089】

したがって、この特定の実施形態によると、上記の回帰モデルDの実装の最後に実装される回帰モデルD2を使用して、特徴付けされた阻害剤の定量的アッセイを行う追加の工程(特徴付けされた阻害剤の濃度の再計算のための工程とも称される)を含む本発明の方法は、モデルDにより決定された、分析試料中で同定された阻害剤の濃度が200ng/mL以下である場合、上記の工程a.で得られた速度論測定(検出の文脈において)を回帰モデルD2、特に自動教師あり学習モデル、例えば以下のカテゴリー:サポートベクターマシン、ニューラルネットワーク、決定木、アンサンブル方法及びk近傍法モデルのうちの1種から選択されるモデルに入力し、前記モデルが、上記の工程a.のものと同一の測定条件下で得られたデータセット(検出の文脈において)でトレーニングされており、前記回帰モデルD2が、出力において分析試料中で同定された阻害剤の濃度の計算(又は回帰モデルDを実装することにより既に実施された計算に関しては、むしろ再計算)を可能にし、必要に応じて、モデルD2により決定された濃度を、例えば変数に割り付けることにより出力するように記載する。

【0090】

「出力において同定された阻害剤の濃度の計算/再計算を可能にする」は、「出力において同定された阻害剤の濃度の決定を可能にする」又は「出力において同定された阻害剤の濃度を決定する」又は「同定された阻害剤の濃度を出力に返す」と記述されてもよい。この出力データは、回帰モデルDを使用して既に計算及び/又は返されたデータの代わりとなる、又は例えば差を例示するために追加されてもよい。

【0091】

この実施形態の一態様によると、最初の回帰モデルDにより測定されるリバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンから選択されるDOACの濃度が200ng/mLより大きい、又はそれ以上である場合、回帰モデルD2は実装されず、判定モデル又は回帰モデルの連鎖の最終結果は回帰モデルD2の実装で終了する。

【0092】

当業者は、200ng/mLの閾値は、本明細書に記載される判定モデル又は回帰モデルの連鎖によって得られる可能性がある結果を最適化するために、試験実験条件下で決定されたことを認識する。

【0093】

しかし、回帰モデルD2が関与する特定の実施形態は、有利であるが、その実装が意義のある結果を得るために必要不可欠ではない追加的な特徴にすぎない(この追加的な補足機能無しの実装を記載する実験セクションを参照されたい):この実施形態は、その種々の可能な実装に従い本明細書の他箇所に一般的に記載される、モデルの連鎖の特定の時点における追加的な特徴である。

【0094】

上述の工程a.で得られる速度論測定を参照して本明細書に例示される「検出」をもたらすために、最初に実施される速度論の測定のものに関して実験フォローアップの文脈で改変された特徴は、本明細書の上記でも想起され、実験及びそれにより特徴を識別することができる当業者に向けた指針を用いて実験セクションで例示される。

【0095】

類推により、「回帰モデルD2」又は「回帰モデルタイプの自動学習モデル」という用語は、「モデルA」、「モデルB」又は「モデルC」又は「モデルD」に関する上記と同じものを指し示す。

【0096】

特定の実施形態によると、モデルD2はニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンであり、詳細にはニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンをトレーニングすることにより得られる。第Xa因子の阻害剤を研究するために適用されるより特定の実施形態は、実験セクションに記載される通りである。

【0097】

実際、モデルD2を実装するための工程は、学習により経験的に決定された数学関数の複雑さのために、コンピュータにより必ず実施される工程である。D2タイプのモデルは、本明細書に記載される「普遍的な方法論」タイプの方法論を使用して得られるデータでトレーニングされる。

【0098】

特にニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンの実装のためのモデルの例の実装の例は、必要であれば分野における文献を参照して(例えば、非排他的に[Geron, 2017]を参照されたい)当業者に公知である。より正確には、例えばscikit-learnライブラリ(https://scikit-learn.org/)を使用することができる。当業者が固定しようとするパラメータは、例えば、互いに独立して又は非独立的に、ニューロンの層の数、層あたりのニューロンの数及び種々のニューロンのための活性化関数である。しかし、使用者は、学習アルゴリズム又は正則化パラメータに関して実装についてある程度の自由を有する。当業者は、前述のパラメータを固定するためのモダリティーの考慮を含め、そのようなモデルの実装に関して、適切であれば本明細書に明示的又は黙示的に含まれる指針を含め、Geron, 2017又はBonaccorso, G. (2017)を特に参照してもよい。

【0099】

本明細書で考察されるモデルに対する参照記号「A」、「B」、「C」「D」及び「D2」は読み易さのために示されたが、これらの文字は、これらにより示される意味を改変することなく省略できることが明白である。本明細書に記載されるD2タイプのモデルの実装は、1つの工程に、本明細書に記載されるように200ng/mL未満の阻害剤の濃度が既に検出されている場合、濃度の再計算を含む。

【0100】

一実施形態によると、対象から得られた血液試料に対する競合酵素アッセイによる競合速度論のin vitro測定は(最初の速度論測定の文脈であるか、又は実験フォローアップの文脈であるかにかかわらず)、以下の工程:
a.希釈された又は希釈されていない血液試料を準備する工程、その後
b.血液試料に、標的酵素及び問題の阻害剤に応じて第Xa因子又は第IIa因子のいずれかに特異的な基質、特に、例えば視認可能な検出可能マーカー(例えば発色性、蛍光性又は化学蛍光性マーカー)を有する基質、特に発色性又は蛍光発生基質を添加する工程、
c.b.で得られた混合物の温度を35℃～39℃(限界値を含む)、特に37℃の温度に上昇させてインキュベートする工程、
d.c.で得られた反応混合物に、阻害反応とそれにより生じる酵素反応との間の競合を開始させるように、工程b.で添加された基質に応じて第Xa因子及び第IIa因子から選択される標的凝固酵素を添加する工程、
e.適切であれば前記酵素反応中に遊離した基質に関連付けられるマーカーの測定により、それに対する分析される酵素(第Xa因子又は第IIa因子)の作用による基質の変換から生じた生成物の分量を経時的に、機器を使用して測定し、得られた速度論を記録する工程
を含む。

【0101】

特定の実施形態では、機器は、Stago社製STA-R機器である。しかし、この例は限定的ではない。分光光度計を収容する任意の機器が使用されてもよい。他の例として、公知の、及びDiagnostica Stago社により商品名Compact Max, STA-R又はSTA-R Maxで市販される機器が挙げられる。

【0102】

特定の実施形態では、競合酵素アッセイは第Xa因子に特異的であり、
a.使用される血液試料は、Owren Koller緩衝液中で1/2に希釈された血漿の試料であり、
b.工程b.において、基質は試薬MAPA-Gly-Arg-pNAであり、
c.工程c.において、インキュベーション期間は37℃で240秒であり、
d.工程d.で混合物に添加される第Xa因子は、ウシ第Xa因子(又は代替的に、別の実施形態によるとヒト又は組換え第Xa因子、又は当業者に公知の任意の代替物)であり、
e.工程e.におけるパラニトロアニリン(pNA)の遊離の測定は、比色分析により405nmで2秒ごとに156秒間、Diagnostica Stago社によって市販されるSTA-R型の適切な機器(上記で非限定的に引用される種類を参照されたい)において実施される。

【0103】

別の特定の実施形態では、競合酵素アッセイは第Xa因子に特異的であり、
a.使用される血液試料は、Owren Koller緩衝液中で8分の1に希釈された血漿の試料であり、
b.工程b.において、基質は試薬MAPA-Gly-Arg-pNAであり、
c.工程c.において、インキュベーション期間は37℃で240秒であり、
d.工程d.で混合物に添加される第Xa因子は、ウシ第Xa因子(又は代替的に、別の実施形態によるとヒト又は組換え第Xa因子、又は当業者に公知の任意の代替物)であり、
e.工程e.におけるパラニトロアニリン(pNA)の遊離の測定は、比色分析により405nmで2秒ごとに86秒間、Diagnostica Stago社によって市販されるSTA-R型の適切な機器(上記で非限定的に引用される種類を参照されたい)において実施される。

【0104】

特定の実施形態では、競合酵素アッセイは第IIa因子に特異的であり、
a.使用される血液試料は、TRIS EDTA緩衝液(特にpH8.4)中で1/12に希釈された血漿の試料であり、
b.工程b.において、基質は試薬EtM-SPro-Arg-pNAであり、
c.工程c.において、インキュベーション期間は、特に37℃で240秒であり、
d.工程d.で混合物に添加される第IIa因子は、ウシ第IIa因子(又は代替的に、別の実施形態によるとヒト又は組換え第IIa因子、又は当業者に公知の任意の代替物)であり、
e.工程e.におけるパラニトロアニリン(pNA)の遊離の測定は、比色分析により405nmで2秒ごとに156秒間、Diagnostica Stago社によって市販されるSTA-R型の適切な機器(上記で非限定的に引用される種類を参照されたい)において実施される。

【0105】

本出願に一般的又は特異的に記載される実施形態のすべてに適用可能な変形実施形態によると、競合酵素アッセイは、小型デバイス、例えばマイクロ流体を使用するデバイスにおいて1～20μLの間の反応体積で実施される。実際、本発明の方法は、本明細書に記載されるすべての変形形態において、有利にはそれを使用して解決できる問題を考慮して小型デバイスによって実装されてもよい。

【0106】

本明細書に記載される他の実施形態のいずれか1つに適用可能な一実施形態では、基質が蛍光分析用基質である場合、蛍光分析によって実施されるものは、フルオロフォア、例えばAMCの遊離の測定である。

【0107】

本発明の特定の実施形態では、分析血液試料は血漿の試料である。

【0108】

本発明の別の特定の実施形態では、分析血液試料は全血の試料である。

【0109】

本発明の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、第Xa因子を用いた試験における最終モル濃度[E]に関して定義される以下の範囲にわたって、第Xa因子の阻害剤の定量的アッセイに使用されてもよい。
・およそ[E]^*10.0/3.0～およそ[E]^*200.0/3.0の間に含まれるUFHの濃度。[0.1,2.0]IU/mLの範囲で第Xa因子のこの阻害剤を正確にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される;
・およそ[E]^*20.0～およそ[E]^*400.0の間に含まれるLMWHの濃度。[0.1,2.0]IU抗Xa/mLの範囲で第Xa因子のこの阻害剤を正確にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される;
・およそ[E]/6.0～およそ[E]^*3.0の間に含まれるリバーロキサバンの濃度。[20,600]ng/mLの範囲で第Xa因子のこの阻害剤を正確にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される;
・およそ[E]/6.0～およそ[E]^*3.0の間に含まれるアピキサバンの濃度。[20,600]ng/mLの範囲で第Xa因子のこの阻害剤を正確にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。
・およそ[E]/8.0～およそ[E]^*3.0の間に含まれるエドキサバンの濃度。[20,600]ng/mLの範囲で第Xa因子のこの阻害剤を正確にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。

【0110】

本明細書に提供される指針に基づき、当業者は、実施例に定義される試験方法を実施することにより、アッセイ可能な阻害剤の濃度を困難なく決定できることが留意されるべきである。更に、上記で与えられた指標と比較して、当業者は、試料の希釈によってほぼ同じ値の範囲内の標的濃度を用いたアッセイが得られるどうかを、最も近い希釈係数に対して困難なく決定することができる。

【0111】

試料、緩衝液及び試薬に対する適切な体積の選択は、本発明の酵素アッセイの分野の従来の慣例の一部である。

【0112】

実施例に定義される実験条件下で得られる本発明の特定の例では、本明細書に記載される方法は、以下の範囲にわたって第Xa因子の阻害剤の定量的アッセイを可能にする:
・UFHに対して0.0～2.0IU/mL;
・LMWHに対して0.0～2.0IU抗Xa/mL;
・リバーロキサバンに対して0.0～180.0ng/mL;
・アピキサバンに対して0.0～190.0ng/mL;
・エドキサバンに対して0.0～230.0ng/mL。

【0113】

本明細書に記載される実験フォローアップが関与する、実施例に定義される実験条件下で得られる別の特定の例によると、第Xa因子の阻害剤の定量的アッセイは以下の範囲にわたって可能である:
・UFHに対して0.0～2.0IU/mL;
・LMWHに対して0.0～2.0IU抗Xa/mL;
・リバーロキサバンに対して0.0～720.0ng/mL;
・アピキサバンに対して0.0～760.0ng/mL;
・エドキサバンに対して0.0～920.0ng/mL。

【0114】

前述の値をモルに変換するために、以下の変換規則が使用される:nmでの阻害剤Iの分量=(ng/mLでのIの分量)/(kg/molでのIの分子量)*(試料体積)/(全体積)。

【0115】

本発明の特定の実施形態では、試験試料の速度論測定は、10～10000秒の間、又は10～9000秒の間、又は10～8000秒の間、又は10～7000秒の間、又は10～6000秒の間、又は10～5000秒の間、又は10～4000秒の間、又は10～3000秒の間、又は10～2000秒の間、又は10～1000秒の間、又は10～900秒の間、又は10～800秒の間、又は10～700秒の間、又は10～600秒の間、又は10～500秒の間、又は10～400秒の間、又は10～300秒の間、又は10～200秒の間、又は20～200秒の間、又は30～200秒の間、又は40～200秒の間、又は50～200秒の間、又は60～200秒の間、又は70～200秒の間、又は80～150秒の間に含まれる期間にわたって記録される。特定の例が実験セクションで与えられ、これは本明細書における異なるセクションに記載される任意の実装に適用されてもよい。本明細書で提供される説明は、当業者が、当業者の要求に好適な速度論測定を得ることができることを検証することにより(必要であれば実験セクションに提供される試験指針に従うことにより)、当業者が測定期間を調整できることを示唆する。

【0116】

A、B、Cタイプの分類判定モデル、又は回帰モデルD2を含む回帰モデルDが実験セクションに例として与えられる:検証データでの最適化後に得られたハイパーパラメータが示される。しかし明らかに、これらのハイパーパラメータに適用されてもよい絶対値は、使用されるデータセットに依存しうる。したがって、これらは固定することができない。しかし、当業者であれば、本明細書で指針として供給される指標及び入手可能な参考資料(例えば、且つ非限定的に、本明細書で引用されるGeron, A. (2017)又はBonaccorso, G. (2017))を使用して、自動学習モデルを容易に定義、トレーニング及び評価することができる。

【0117】

例えば、
a.分類判定モデルAは、サポートベクターマシン又は人工ニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンを、上述の検出のための工程a.を実施する際に実装されたものと同一の条件下で得られた速度論を含むデータセットを用いて、半教師ありの形で、何であれ適切な、実験セクションに示される得られたハイパーパラメータを用いて、トレーニングすることにより得られてもよい、並びに/或いは
b.分類判定モデルBは、k近傍法モデル又は人工ニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンを、上述の検出のための工程a.を実施する際に実装されたものと同一の条件下で得られた速度論を含むデータセットを用いて、何であれ適切な、例えば5に等しい値k及びユークリッド距離である尺度である、得られたハイパーパラメータを用いて、トレーニングすることにより得られてもよい、並びに/或いは
c.分類判定モデルCは、人工ニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンを、上述の検出のための工程a.を実施する際に実装されたものと同一の条件下で得られた、又は実験フォローアップの実装中に実装されたものと同一の条件下で得られた速度論を含むデータセットを用いて、何であれ適切な、例えば実験セクションに示される通りの得られたハイパーパラメータを用いて、トレーニングすることにより得られてもよい、並びに/或いは
d.回帰モデルD又はD2は、人工ニューラルネットワーク、特に多層パーセプトロンを、上述の検出のための工程a.を実施する際に実装されたものと同一の条件下で得られた、又は実験フォローアップの実装中に実装されたものと同一の条件下(回帰モデルDの場合)で得られた速度論を含むデータセットを用いて、何であれ適切な、例えば実験セクションに示される通りの得られたハイパーパラメータを用いて、トレーニングすることにより得られてもよい。

【0118】

実際、本発明による学習アルゴリズムは、有利には試験データ(トレーニング及び最適化されたモデルの全体的及び実際の性能を評価するために使用できる)で試験した際に、使用される一連の種々のモデルの結果及び/又は使用される各モデルに適用される、70%又は75%又は80%又は85%又は90%又は95%以上の返された結果の精度及び正確度を得るために使用できる1又は複数の判定モデルを実装する。この性能を評価するための例示的な特定の方法を示す実験セクションを参照されたい。

【0119】

精度は、前記トレーニングされたモデルにより予測された結果を実際値と比較することによって評価される。例示的な例は、本明細書のTables 1 to 6(表1～6)(実験セクション)に提供される。

【0120】

別の態様によると、回帰モデルは、使用される場合、試験データ(トレーニング及び最適化されたモデルの全体的及び実際の性能を評価するために使用できる)で試験した際に、0.9～1.1の間に含まれる線形回帰、及び0.70又は0.80又は0.90又は0.95以上(CLSI EP9-A2の判定基準に従い)の決定係数R2により特徴付けられる結果を出力において得るために使用できる。例として、この性能を評価するための特定の方法を示す実験セクションを参照されたい。本明細書で示される得られた性能により、本発明による方法によって得られた結果は、従来的とされるアプローチ(すなわち、特に臨床状況で現在まで従来的に使用されるアッセイ方法)により得られた結果と少なくとも定性的に同等であるとみなされる。

【0121】

一実施形態によると、本明細書に記載されるモデルの少なくとも1つの自動教師あり学習に使用されるトレーニング及び検証データは、モデルに供給される速度論測定の種類に関して、特に速度論を商業化するために使用できるキットを上市する際に、分野において既に従来的に実施されているように、速度論曲線のための事前較正又は較正曲線の決定を可能とする実験に利用されてもよい種類のものである。データの量及びデータが回収された患者の選択は、有利にはモデルに供給されたデータが有効な学習を可能にすることを保証することができる。実験セクションは、供給されてもよい種類のデータの定量的な例を、信頼性の点で意義がある試験結果とともに提供する。これにより又は一般的に、当業者は、必要な出発試料を決定することができる。

【0122】

一実施形態によると、実験的に得られた速度論をモデルに入力する工程は、測定期間にわたって生成された、各別個の測定時点について測定された各値によって構成される値の組を提供することにより構成される。

【0123】

本発明はまた、本明細書に記載される方法のいずれか1つのモデルAの実装、及び適切であれば、本明細書に記載される方法のいずれか1つのモデルBを使用する工程も含む、少なくとも本明細書に記載される「検出」方法の工程b.を実施するための手段を含み、且つ必要に応じてこれらの工程中に生成される変数を入力及び/又は出力するための手段も含み、且つ必要に応じて、いずれもそれらの変形形態で本明細書に記載される分類判定モデル又は回帰モデルC、D、及び適切であればD2が関与する工程を実施するための手段、特にこれらのモデルのパラメータの固定を可能にする学習プロセスから生じた行列を使用し、モデルに提供される変数を考慮に入れて分類又は回帰の結果を返すことを可能にする手段も含む、データ処理システム又はデバイスに関する。

【0124】

一実施形態によると、そのようなデータ処理システム又はそのようなデバイスは、本明細書に記載される速度論測定を行うための機器、特に本明細書に記載されるように、対象から以前に得られた血液試料に対して競合アッセイを実施することにより、1又は複数回の競合速度論測定を行うための工程a.を実施するために必要な測定機器を含む、又はそのような測定機器を特に遠隔的に呼び出す。実際、測定機器は、前記測定工程a.を、特にデータ処理システム又はデバイスの制御下で、自動又は半自動的に実行することもできる。

【0125】

「手動」、又は半自動機器が利用される場合は少なくとも半自動とされる測定は、本発明による方法の実装に関して除外されないが、この種類の測定は、作動するために、測定機器に加え、対象から以前に得られた血液試料に対する競合アッセイにより1又は複数回の競合速度論測定を行う分野で従来的に使用される薬剤を必要とする(例として、本明細書に記載されるキットの内容を参照されたい)ことが留意されるべきである。

【0126】

本発明はまた、上記及び本明細書で示される工程を実施するように適合されたプロセッサを更に含む、そのようなデータ処理システム又はそのようなデバイスに関する。

【0127】

特に、且つ非限定的に、本発明は、ネットワークに接続されたコンピュータステーション(必要に応じて、専用のコンピュータステーション)によって又は配線接続によって、又は統合システム(専用の)内で実装されてもよい。

【0128】

実際、本明細書に記載される「検出」方法の工程b.、及び本明細書に記載されるA、B、C、D又はD2タイプのモデルを利用する場合、後続の工程からの工程は、それらのためにコンピュータが実施される必要があることが想定されうる。1又は複数回の競合速度論測定を行う工程a.は、別々に、手動、半自動若しくは自動的に操作されてもよく、又はそれが必要とする手段が、特に本明細書に記載されるデータ処理システム又はデバイスに統合され、速度論測定の実施が前記データ処理システム又は前記デバイスから制御された形で操作されてもよい。

【0129】

本発明はまた、コンピュータプログラムであって、プログラムがコンピュータによって実行されると、コンピュータに少なくとも本明細書に記載される「検出」方法の工程b.、及び適切であれば本明細書に記載される方法のいずれか1つのモデルBを使用する工程も実施させる指示、及び必要に応じて、これらの工程中に生成される変数を入力及び/又は出力するための指示、及び必要に応じて、コンピュータに、本明細書に記載される任意の実施形態に適合される、本明細書に記載される分類判定モデル又は回帰モデルC、D、及び適切であればD2が関与する工程を実施させる指示を含むコンピュータプログラムに関する。

【0130】

特定の実施形態によると、そのようなコンピュータプログラムは、データ処理システム又はデバイス、特に本出願に定義及び記載される速度論測定を行うための機器を含む、又は特に遠隔的にそのような測定機器を使用するデバイスに、少なくとも本明細書に記載される「検出」方法の工程b.、及び適切であれば、更に本明細書に記載される方法のいずれか1つのモデルBを使用する工程の工程を実行させ、且つ必要に応じて、本明細書に記載される分類判定モデル又は回帰モデルC、D、及び適切であればD2が関与する工程の実行をもたらす指示を含む。

【0131】

特定の実施形態によると、コンピュータプログラムは、プログラムがコンピュータによって実行されると、コンピュータに、プログラムの指示によって制御された形で、本明細書に記載されるように対象から得られた血液試料に対する競合アッセイを実施することによって、1又は複数回の競合速度論測定を行うための工程a.も実施させる指示を更に含む。

【0132】

代替的に、本明細書に開示される実施形態のいずれか1つによる本発明に従い、生物学的試料中で血液凝固酵素の阻害剤の存在を検出するためのin vitro方法は、1又は複数回の競合速度論測定を行うためのその工程a.を、後続の工程のために必要な手段の制御を一元化する制御システムとは別に実施させてもよい。対照的に、別の実施形態によると、実施される測定の特異性を少なくとも部分的に考慮に入れ、一元化された形で前記工程a.を実施するための手段は、本明細書に記載されるコンピュータにより実行されるプログラムの形態で、単一の制御手段内で一元化されてもよい。

【0133】

本発明はまた、コンピュータによって読み出し可能な記憶媒体であって、コンピュータによって実行されると、コンピュータに本明細書に記載される「検出」方法の少なくとも工程b.、及び適切であれば、本明細書に記載される方法のいずれか1つのモデルBを利用する工程も実施させ、且つ必要に応じて、これらの工程中に生成される変数の入力及び/又は出力も可能にさせ、且つ必要に応じて、本明細書に記載される分類判定モデル又は回帰モデルC、D、及び適切であればD2が関与する工程を実施させる指示を含む記憶媒体に関する。

【0134】

特定の実施形態によると、コンピュータによって読み出し可能な記憶媒体は、コンピュータによって実行されると、コンピュータに、本明細書に記載されるように対象から以前に得られた血液試料に対する競合アッセイを実施することによって、1又は複数回の競合速度論測定を行うための工程a.も実施させる指示を更に含む。

【0135】

本発明はまた、コンピュータによって読み出し可能な、その上に本明細書に記載されるコンピュータプログラムが記録されるデータキャリア、又は本明細書に記載されるコンピュータプログラムを搬送するデータキャリアからの信号に関する。

【0136】

最後に、本発明は、特に任意の実施形態で本明細書に記載される方法を実施するために好適なキットであって、
a.FXa又はFIIaに特異的な基質、例えば第Xa因子に対する基質MAPA-Gly-Arg-pNA、例えば第IIa因子に対する基質EtM-SPro-Arg-pNA、並びに
b.必要に応じてFXa及び/又はFIIa、例えばウシ第Xa因子、例えばヒト第Xa因子、例えばウシ第IIa因子、例えばヒト第IIa因子、並びに
c.必要に応じて1種又は複数の適切な緩衝液、例えばOwren Koller緩衝液、例えばTRIS EDTA緩衝液、並びに
d.必要に応じて、基質を利用して競合酵素アッセイを実施することによって1又は複数回の競合速度論測定を行うための指示、並びに
e.システム及び/又はデバイス及び/又はコンピュータプログラム及び/又は本明細書に記載されるコンピュータによって読み出し可能なデータキャリア、
f.並びに必要に応じて、実施されるべき競合酵素アッセイの特徴に関する、適切であれば上記のポイントd.からの指示に関連する本発明による方法の実施を可能にする指示、
g.並びに必要に応じて、本明細書に記載される実施形態のいずれか1つによる方法を実施するための、本明細書に記載されるデータキャリアからの信号の使用に関する指示
を含む、キットに関する。

【0137】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例及び本発明の特定の実施形態の実行を例示する図面から明らかになる。

【図面の簡単な説明】

【0138】

【図1】血液凝固酵素の阻害剤の競合in vitroアッセイの原理:速度論スキーム。

【図2】測定の原理。(1)凝固のための酵素Eの阻害剤I(及び必要であれば)分子A)を含有することが疑われる血液試料(希釈された又はされていない)を消耗品の内部に置く。(2)酵素Eに特異的な基質Sを反応混合物に添加する。(3)インキュベーション工程(一般的に数十秒)により、反応混合物を温度(典型的には37℃)まで引き上げる。(4)酵素Eを反応混合物に添加し、それにより阻害反応と酵素反応との間の競合を開始する。(5)次に測定それ自体を実施する(一般的に数十秒の期間にわたって);酵素Eが基質Sを生成物Pに変換させると同時に、試料に存在する場合は阻害剤I(及び必要であれば分子A)により阻害される。基質Sの生成物Pへの切断により、機器を使用して測定可能なマーカーの遊離が誘導される。(6)測定により、阻害剤I(及び必要であれば分子A)の存在、作用様式及び濃度の影響を受ける速度論測定が記録される。符号:(A)阻害剤を含有することが疑われる試料、(B)酵素。

【図3】自動学習モデルのカスケード。図表の符号:1.開始、2.酵素の阻害剤の存在?、3.阻害剤のカテゴリー、4.可逆的直接、5.不可逆的間接、6.阻害剤の同定、7.阻害剤の定量、8.終了。

【図4】本発明の原理。血液凝固酵素の阻害剤の検出、同定及び定量。図表の符号:1.測定、2.速度論の記録、3.自動学習モデルを使用した後処理、4.生物学的結果、5.血液凝固酵素の阻害剤の検出、同定及び定量。(1)凝固のための酵素Eの阻害剤Iを含有することが疑われる血液試料を、in vitroで同じ消耗品中で、酵素E及び酵素Eに特異的な基質Sと接触させる。酵素Eによる基質Sの生成物Pへの切断により、実験室機器を使用して測定可能なマーカーが遊離する。(2)実験測定により、経時的な生成物Pの濃度に比例する曲線が記録される。これらの速度論は、阻害剤の存在、作用様式及び濃度の影響を受ける。(3)速度論を自動学習モデルのカスケードにより分析、解釈し、それにより生物学的結果を得る。(4)得られた生物学的結果により、酵素Eの阻害剤が測定される試料中に存在するか、及び存在する場合は何であるか、及びどの程度の濃度であるかが示される。

【図5】普遍的な抗Xa方法論:UFHに対する感度。図は、この方法のUFHの種々の濃度に対する感度を例示する:方法が、およそ[E]*10.0/3.0～[E]*200.0/3.0([E]は酵素試験における最終濃度である)の間に含まれるUFHの濃度をアッセイするために使用できることが観察される。曲線は、本明細書に記載される特定の普遍的な方法論を使用して測定された([E]=10nM、[UFH](nM)=33、67、133、200、267、333、400、467、533、600及び670、すなわち[UFH](IU/mL)=0.1、0.2、.0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8及び2.0)。

【図6】普遍的な抗Xa方法論:LMWHに対する感度。図は、この方法のLMWHの種々の濃度における感度を例示する:方法が、およそ[E]*20.0～[E]*400.0([E]は酵素試験における最終濃度である)の間に含まれるLMWHの濃度をアッセイするために使用できることが観察される。曲線は、本明細書に記載される特定の普遍的な方法論を使用して測定された([E]=10nM、[LMWH](nM)=200、400、800、1200、1600、2000、2200、2400、2600、2800及び4000、すなわち[LMWH](IU抗Xa/mL)= 0.1、0.2、.0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8及び2.0)。

【図7】普遍的な抗Xa方法論:リバーロキサバンに対する感度。図は、この方法のリバーロキサバンの種々の濃度における感度を例示する:方法が、およそ[E]/6.0～[E]*3.0([E]は酵素試験における最終濃度である)の間に含まれるリバーロキサバンの濃度をアッセイするために使用できることが観察される。曲線は、本明細書に記載される特定の普遍的な方法論を使用して測定された([E]=10nM、[リバーロキサバン](nM)=1.65、3.3、6.6、9.9、13.2、16.5、19.8、23.1、26.4、29.7及び33、すなわち[リバーロキサバン](ng/mL)=10、20、40、60、80、100、120、140、160、180及び200)。

【図8】普遍的な抗Xa方法論:アピキサバンに対する感度。図は、この方法のアピキサバンの種々の濃度における感度を例示する:方法が、およそ[E]/6.0～[E]*3.0([E]は酵素試験における最終濃度である)の間に含まれるアピキサバンの濃度をアッセイするために使用できることが観察される。曲線は、本明細書に記載される特定の普遍的な方法論を使用して測定された([E]=10nM、[アピキサバン](nM)=1.56、3.1、6.2、9.3、12.4、15.5、18.6、21.7、24.8、27.9及び31、すなわち[アピキサバン](ng/mL)=10、20、40、60、80、100、120、140、160、180及び200)。

【図9】普遍的な抗Xa方法論:エドキサバンに対する感度。図は、この方法のエドキサバンの種々の濃度における感度を例示する:方法が、およそ[E]/8.0～[E]*3.0([E]は酵素試験における最終濃度である)の間に含まれるエドキサバンの濃度をアッセイするために使用できることが観察される。曲線は、本明細書に記載される特定の普遍的な方法論を使用して測定された([E]=10nM、[エドキサバン](nM)=1.3、2.6、5.2、7.8、10.4、13.0、15.6、18.2、20.8、23.4及び26、すなわち[エドキサバン](ng/mL)=10、20、40、60、80、100、120、140、160、180及び200)。

【図10】第Xa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量のための自動学習モデルのカスケード。図表の符号:1.開始、2.第Xa因子の阻害剤の存在?、3.抗Xaのカテゴリー、4.ヘパリン、5.DOAC、5.1.実験フォローアップ、6.同定、6.1.UFH、6.2.LMWH、6.3.リバーロキサバン、6.4.アピキサバン、6.5.エドキサバン、7.定量、8.濃度、9.終了。

【図11】UFHのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.018x-0.0005及び決定係数R2=0.9844の直線が得られた。B.3試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.002x+0.002及び決定係数R2=0.9925の直線が得られた。

【図12】HDPMのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるLMWHの濃度([LMWH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるLMWHの濃度([LMWH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.995x+0.006及び決定係数R2=0.9962の直線が得られた。B.3試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるLMWHの濃度([LMWH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるLMWHの濃度([LMWH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=O.9977x+0.004及び決定係数R2=0.997の直線が得られた。

【図13】リバーロキサバンのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.05x+19.65及び決定係数R2=0.991の直線が得られた。B.3試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.04x+20.3及び決定係数R2=0.9934の直線が得られた。

【図14】アピキサバンのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.14x-6.73及び決定係数R2=0.9945の直線が得られた。B.3試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.13x-5.46及び決定係数R2=0.9958の直線が得られた。

【図15】エドキサバンのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.905x+12.35及び決定係数R2=0.9853の直線が得られた。B.3試行分析:試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.93x+8,18及び決定係数R2=0.9881の直線が得られた。

【図16】第Xa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量のための自動学習モデルのカスケード。図表の符号:1.開始、2.第Xa因子の阻害剤の存在?、3.抗Xaのカテゴリー、4.ヘパリン、5.DOAC、5.1.実験フォローアップ、6.同定、6.1.UFH、6.2.LMWH、6.3.リバーロキサバン、6.4.アピキサバン、6.5.エドキサバン、7.定量、7.1.普遍的な方法論により測定される速度論を使用した濃度の再計算、8.濃度、9.終了。

【図17A】UFHのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.043x-0.03及び決定係数R²=0.9851の直線が得られた。

【図17B】UFHのアッセイ。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるUFHの濃度([UFH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.04x-0.03及び決定係数R²=0.9856の直線が得られた。

【図18A】HDPMのアッセイ。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるLMWH濃度([LMWH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるLMWH濃度([LMWH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.02x-0.02及び決定係数R²=0.996の直線が得られた。

【図18B】HDPMのアッセイ。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるLMWHの濃度([LMWH]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるLMWHの濃度([LMWH]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.027x-0.03及び決定係数R²=0.9971の直線が得られた。

【図19A】リバーロキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.05x+19.65及び決定係数R²=0.991の直線が得られた。

【図19B】リバーロキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.04x+20.3及び決定係数R2=0.9934の直線が得られた。

【図20A】リバーロキサバンのアッセイ(普遍的な方法論、又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.04x+1.74及び決定係数R²=0.985の直線が得られた。

【図20B】リバーロキサバンのアッセイ(普遍的な方法論、又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるリバーロキサバンの濃度([リバーロキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.032x+1.99及び決定係数R²=0.989の直線が得られた。

【図21A】アピキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.14x-6.73及び決定係数R²=0.9945の直線が得られた。

【図21B】アピキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.13x-5.46及び決定係数R²=0.9958の直線が得られた。

【図22A】アピキサバンのアッセイ(普遍的な方法論、又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.041x-2.66及び決定係数R²=0.9792の直線が得られた。

【図22B】アピキサバンのアッセイ(普遍的な方法論、又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるアピキサバンの濃度([アピキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=1.041x-2.41及び決定係数R²=0.9877の直線が得られた。

【図23A】エドキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.905x+12.35及び決定係数R²=0.9853の直線が得られた。

【図23B】エドキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.93x+8.18及び決定係数R²=0.9881の直線が得られた。

【図24A】エドキサバンのアッセイ(普遍的な方法論、又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)。A.単一試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.9431x+4.51及び決定係数R²=0.9968の直線が得られた。

【図24B】エドキサバンのアッセイ(普遍的な方法論、又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)。B.3試行分析:試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]予測)と、標準的なアプローチを使用して測定されるエドキサバンの濃度([エドキサバン]測定)とのアッセイの比較の結果により、式y=0.9442x+4.26及び決定係数R²=0.9962の直線が得られた。

【発明を実施するための形態】

【0139】

概論-実験方法論-方法の原理
1.本発明が基づく原理の開示
本発明は、血液凝固酵素の阻害剤を血液試料中で検出、同定及び定量するための方法を提案する。このために、血液凝固酵素、この酵素に特異的な基質及び血液試料を、有利には分野において酵素アッセイに従来利用されるもの等の、従来の消耗品であってもよい同じ消耗品中にまとめる。次に、酵素が基質を生成物へと切断し、これによりマーカー(マーカーは、例えば発色性、蛍光性等であってもよい)が遊離する;このマーカーの外観により、血液試料の物理的特性の観察可能な変化が誘導される:次に、測定は、機器(機器は、マーカーが発色性の場合は分光光度計であってもよく、マーカーが蛍光性の場合は蛍光分析計等であってもよい)を使用して経時的な試料の物理的特性の変化を記録することから構成される、すなわち、速度論を記録する。酵素の阻害剤が血液試料中に存在する場合、それによってその基質に対する酵素の活性が低減し、結果として測定される速度論に影響が及ぶ。後処理アルゴリズムはこれらの速度論を解釈し、予想される生物学的結果:阻害剤の検出、同定及び定量を与える。

【0140】

1.1実験方法論
血液凝固酵素の阻害剤は、天然であるか合成であるかにかかわらず、2つの別個のファミリー:直接阻害剤及び間接阻害剤に属する。直接阻害剤は、酵素に直接結合してその阻害作用を発揮する。間接阻害剤は、最初に第2の分子に結合して複合体を形成し、それにより酵素に対する阻害作用を発揮することが可能になる。更に、これらの阻害剤はまた、2つの異なる反応機序:可逆的速度論スキーム及び不可逆的速度論スキームに従って作用する。酵素に結合して分離できない複合体を形成する不可逆的阻害剤とは対照的に、可逆的阻害剤は、酵素に結合して分離可能な複合体を形成する。したがって、血液凝固酵素の阻害剤は、4つのカテゴリー:
- 可逆的直接阻害剤、
- 不可逆的直接阻害剤、
- 可逆的間接阻害剤、
- 不可逆的間接阻害剤
に分類することができる。

【0141】

従来、これらの阻害剤の酵素アッセイは、2つの生化学的反応を伴う:
- 阻害反応
・阻害剤が可逆的直接である場合、反応スキームは、

【0142】

【化1】

【0143】

(式中、阻害剤Iは酵素Eに直接結合し、不活性且つ分離可能な複合体E・Iを形成する)
である。
・阻害剤が不可逆的直接である場合、反応スキームは、

【0144】

【化2】

【0145】

(式中、阻害剤Iは酵素Eに直接結合し、不活性且つ分離できない複合体E・Iを形成する)
である。
・阻害剤が可逆的間接である場合、反応スキームは、

【0146】

【化3】

【0147】

(式中、阻害剤Iは第2の分子Aと会合して、酵素Eに結合可能な複合体A・Iを形成し、不活性且つ分離可能な複合体E・A・Iを形成する)
である。
・阻害剤が不可逆的間接である場合、反応スキームは、

【0148】

【化4】

【0149】

(式中、阻害剤Iは第2の分子Aと会合して、酵素Eに結合可能な複合体A・Iを形成し、不活性且つ分離できない複合体E・A・Iを形成する)
である。
- 酵素反応

【0150】

【化5】

【0151】

(式中、
・Eは試料中に存在することが疑われる阻害剤Iにより標的化される血液凝固酵素を示し;
・Sは、一般的に酵素の活性部位に特異的なペプチド配列及び発色性、蛍光性、電気化学的等でありうるマーカーから構成される、酵素に特異的な基質を表し;
・E・Sは、不安定な酵素・基質複合体を示し;
・Pは、酵素による基質の触媒作用から得られる生成物を表す:本発明者らの場合、触媒作用はマーカー(発色性、蛍光性、電気化学的等)の遊離をもたらす)。

【0152】

可逆的阻害反応は、酵素-阻害剤複合体の形成に関して二次速度論に従い、その分離に関して一次速度論に従うことが留意されるべきである。不可逆的阻害反応は、酵素-阻害剤複合体の形成に対して二次速度論に従う。酵素反応の速度論は、アンリ-ミカエリス-メンテン式に則る[Segel, 1993]。

【0153】

これらの種々の阻害剤の酵素アッセイを実施するために、2つの生化学的反応は逐次的であっても競合してもよい。いずれの場合でも、アッセイは2つの連続工程:インキュベーション及び測定に分かれる。2つの生化学的反応が逐次的である場合、インキュベーション工程は、阻害剤I(及び必要であれば分子A)を含有することが疑われる血液試料を過剰の酵素Eと接触させることから構成される。阻害剤I(又は複合体A-I)は、次に可逆的又は不可逆的に酵素Eを阻害する;インキュベーション期間は、阻害反応がその生化学平衡に到達するのを可能とするために十分長くなければならない。したがって、酵素Eの残留濃度は、酵素Iの初期濃度に反比例し、これによりその阻害活性を示す。次に、測定工程は、酵素Eに特異的な基質Sを反応混合物に添加することから構成される;残留分量で存在する酵素Eは、次に基質Sを生成物Pに変換し、これにより経時的にマーカーの遊離を誘導し、典型的に直線の速度論測定が行われることを可能にする。2つの生化学的反応が競合状態にある場合、インキュベーション工程は、阻害剤I(及び必要であれば分子A)を含有することが疑われる血液試料を基質Sと接触させることから構成される:この工程の目的は、単純に反応混合物を37℃に昇温することである。次に、測定工程は、酵素Eを反応混合物に添加し、阻害反応と酵素反応を並行して開始させることから構成される:これらは、阻害剤Iと基質Sが酵素Eのために競合することから競合反応とされる。これにより、酵素Eは基質Sを生成物Pへと切断すると同時に、阻害剤Iにより直接又は間接的に阻害される。基質Sの生成物Pへの変換により、経時的にマーカーの遊離が誘導され、これを速度論の記録に使用することができる:基質の生成物への変換の反応は、酵素に対する阻害剤の作用により影響されるため、記録される速度論もまた影響される。このため、阻害剤の濃度及び酵素に対するその作用様式は、酵素アッセイによって2つの生化学的反応が競合状態に置かれる場合、測定工程中に記録される速度論を改変する。

【0154】

本明細書に記載される本発明は、競合的アプローチを使用する:図1は、血液凝固酵素の種々の阻害剤のin vitroアッセイに関連付けられる速度論スキームを要約する。したがって、血液凝固酵素の阻害剤の検出、同定及び定量の測定のためのin vitroアッセイは、図2に例示される以下の原理に従って実施される:
・凝固のための酵素Eの阻害剤I(及び必要であれば分子A)を含有することが疑われる血液試料(希釈された又はされていない)を消耗品の内部に置く;
・酵素Eに特異的な基質Sを反応混合物に添加する;
・インキュベーション工程(一般的に数十秒)により、反応混合物を昇温する(典型的には37℃);
・酵素Eを反応混合物に添加し、それにより阻害反応と酵素反応との間の競合を開始する;
・測定それ自体を実行する(一般的に数十秒の期間にわたって):酵素Eが基質Sを生成物Pに変換させると同時に、試料中に存在する場合は阻害剤I(及び必要であれば分子A)により阻害される。基質Sの生成物Pへの切断により、機器を使用して測定可能なマーカーの遊離が誘導される;
・測定により、阻害剤I(及び必要であれば分子A)の存在、作用様式及び濃度の影響を受ける速度論測定が記録される。

【0155】

より詳細には、不可逆的間接阻害剤(本明細書では、本明細書に記載されるヘパリンのカテゴリーとも示される)又は可逆的直接阻害剤(本明細書では、本明細書に記載されるDOACのカテゴリーとも示される)のいずれかである第Xa因子及び/又は第IIa因子の抗凝固薬阻害剤の検出、及び適切であれば同定、又は更には定量を想定する、本明細書に記載される方法の適用分野のために、反応混合物に添加され、競合を開始する酵素Eは、それぞれ第Xa因子又は第IIa因子である。従来的に、この酵素は、速度論の記録をもたらす測定の開始直前に添加する必要がある。

【0156】

本明細書に記載される方法は、分析試料中に含有されることが疑われる第Xa因子及び/又は第IIa因子の阻害剤の「ブラインド」検出を初めて可能にすることができるため、本明細書に記載される方法が有効になる、分析試料中に含有されることが疑われる阻害剤(第Xa因子及び/又は第IIa因子の)の濃度の値の1又は複数の範囲を把握するという問題が生じる。

【0157】

速度論測定方法が、検出、及び適切であれば同定、又は更には定量のために特に利用する阻害剤(第Xa因子及び/又は第IIa因子の)の濃度の決定は、第Xa因子の阻害剤の研究を実証する目的のために適用される「実施例」セクションに記載される手順に従って実施されてもよい。当業者は、検出が可能なこれらの濃度範囲は、酵素の種類、及び特に血液試料中で酵素の存在を検出するための試験の分野で従来利用される基質に応じて異なる可能性があることを理解する。このため、「実施例」セクションで以下に開示される方法論により、当業者は、研究することができる阻害剤の濃度の範囲が目的のために好適であるかどうかを困難なく決定することができる。更に、開示される方法論はまた、例えば、特に先行技術で公知の所与の酵素-基質対に対して、想定される範囲に応じて検出、同定又は更には定量の感度の範囲をモジュレートすることが可能であることを示す。これは、例示的実施形態に基づいて以下で実験的に示されるように、分析される試料の開始希釈度をモジュレートすることによって実施されてもよい。このようにして、特に「DOACのために最適化された方法論」と称される特定の実施形態が、より正確に定義された要件を想定する変形形態によって設計及び開発される。したがって、当業者は、ブラインド研究されている阻害剤に想定される範囲の感度を得るように、開始試料の希釈度を適合させることができる。本明細書に一般的に開示される新規のブラインド検出方法の文脈で包含される、これらの特定の実施形態のための例示的な例が本出願に含まれる。

【0158】

最後に、特に問題の目的に従う経時的なシークエンスによると、1(又は複数)の後処理アルゴリズムは、適切であれば試料中に存在する阻害剤(及び適切であれば上記で言及された分子A)の存在、作用様式及び濃度に影響される速度論を解釈し、これにより予想される生物学的結果:阻害剤の検出及び/又は同定及び/又は定量を与える。これは次のセクションで説明される。

【0159】

1.2 後処理
先行するセクションは、競合酵素アッセイを用いて血液凝固酵素の阻害剤の存在、作用様式及び濃度に影響される速度論を得ることを可能にする実験方法論について記載した。このセクションは、速度論を解釈して予想される生物学的結果:阻害剤の検出、同定及び定量を与える人工知能(AI)アルゴリズムに基づく後処理のための方法を提示する。

【0160】

人工知能は、1950年代に開発された情報技術学問分野である。極めて簡潔には、その目的は、ヒトの脳の認知機能を再現することができるアルゴリズムを開発することである。これらの認知機能の中でも、学習(技能、知識又はノウハウの習得をもたらす一連の機序)はAIの文脈でこれまで最も研究されている適用分野である。自動学習、又は実際には機械学習として公知の学習は、無数の科学刊行物の対象であるが、それに加えて且つとりわけ、日常生活において現在多くの用途を有する。本発明は、教師あり学習モデルとして公知の学習モデルを利用する。

【0161】

従来のアルゴリズムとは対照的に、自動学習モデルは、それらが実行しなければならないタスクのために明示的にプログラムされるのではなく、タスクでトレーニングされる。実際、自動学習モデルは、経験的数学関数を用いて入力データと出力データの間にデジタルリンクを確立する。したがって、所与の入力データについて、モデルは関連付けられる出力を計算する。出力が整数である場合、自動学習モデルは、分類問題(例えば、患者が健康である又は患者が病気である)に応答し、出力が実数である場合、自動学習モデルは、回帰問題(例えば、抗凝固の濃度)に応答する。経験的数学関数のパラメータは、対(入力データ、出力データ)から構成されるデータベースでトレーニングすることにより計算される:学習アルゴリズムは、所与の入力データについて、モデルが関連付けられる出力データをできるだけ正確に再計算するようにパラメータを調整する。最も広く使用される学習モデルの例は、ニューラルネットワーク、決定木及びサポートベクターマシンである[Geron, 2017]。当業者は、例えば既存の文献(特に[Geron, 2017]又はBonaccorso, G. (2017))を参照することにより、自動学習モデルのハイパーパラメータを最適化する従来の方法を随意に用い、それらを目的とされるものに適合させることができる。

【0162】

自動学習モデルを定義、トレーニング及び評価するための従来のアプローチは、3つの別個のデータセット:
・トレーニングデータ、これは対を連結する経験的数学関数のパラメータの決定を可能にする(入力データ、出力データ);
・検証データ、これは当業者の知識に従い自動学習モデルのハイパーパラメータを最適化し(例えば、[Geron, 2017]を参照されたい)、トレーニングデータでトレーニングされた自動学習モデルの汎化能力を測定するように機能する;
・試験データ、これはトレーニングデータでトレーニングされ、検証データで最適化された自動学習モデルの全体的且つ実際の性能の評価を可能にする
に分けられたデータベースを利用することである。

【0163】

自動学習モデルの開発は、必ずしも対(入力データ、出力データ)から構成されるデータベースの入手可能性を伴うものではないことに留意することが重要である。これらのデータの分量及び品質が高いほど、これらのモデルのトレーニングが向上し、それらの汎化能力が向上する。

【0164】

結論の連鎖の最後に、すべての可能性のある想定可能な到達可能な結論を使用する特定の実施形態では、本明細書で提案される本発明は、実験的に測定された速度論を分析及び解釈するために、自動学習モデルのカスケードを使用する。このカスケードは、生物学的結果を与えることを目的とする:これは、結果及び研究される分析に応じてすべての工程が実装される必要はなくてもよいことを理解した上で図3に記載される。

【0165】

本明細書に記載される特定の最も完全なカスケードは、4つの自動学習モデルから構成される。これら4つのモデルは、入力として実験測定によって得られた(同じ)速度論を受け取り、以下の結果を出力する:
・第1のモデル(モデルAとしても既知)は分類モデルである:それに入力される速度論の外観により、分析試料が酵素の阻害剤を含有するかどうかをyes又はnoで決定する;
・第2のモデル(モデルBとしても既知)も分類モデルである:分析試料が酵素の阻害剤を含有することを把握した上で、且つそれに入力される速度論の外観により、阻害剤のカテゴリーを識別する;
・第3のモデル(モデルCとしても既知)もまた分類モデルである:酵素の阻害剤のカテゴリーを把握した上で、且つそれに入力される速度論の外観により、分析試料中に存在する阻害剤を同定する;
・第4及び最後の可能性のあるモデル(モデルDとしても既知)は回帰モデルである:分析試料中に存在する阻害剤を把握した上で、且つそれに入力される速度論の外観により、この阻害剤の濃度を計算する。

【0166】

これらのモデルのそれぞれは、特に以下に記載され、特定の実施形態に関して結果のセクションで詳述される、既に生成されている3つの別個のセット(トレーニングセット、検証セット及び試験セット)に分かれたデータベースからのデータの対(速度論、出力データ)によってトレーニングされる自動学習モデル、例えばニューラルネットワーク、サポートベクターマシン等である。自動学習モデル(ニューラルネットワーク、サポートベクターマシン等)の選択は、検証セットで得られた性能に応じてなされる。実験セクションは、検証セットで得られた性能を分析する方法を示す。第1のモデルは、対(速度論、存在=yes又は存在=no)でトレーニングされる。第2のモデルは、対(速度論、阻害剤のカテゴリー=可逆的直接又は阻害剤のカテゴリー=不可逆的直接又は阻害剤のカテゴリー=可逆的間接又は阻害剤のカテゴリー=不可逆的間接)でトレーニングされる。第3のモデルは、対(速度論、阻害剤の名称=阻害剤1又は阻害剤の名称=阻害剤2又は阻害剤の名称=等)でトレーニングされる。第4のモデルは、対(速度論、阻害剤の濃度)でトレーニングされる。最後に、これらの種々のモデルをカスケードすることにより、研究される結果:血液凝固酵素の阻害剤の検出、同定及び定量に依存する予想される生物学的結果が得られる。

【0167】

1.3 合成
本出願の目的は、本明細書に記載されるように、血液凝固酵素の阻害剤のin vitroでの存在の検出、同定又は更には定量である。一般的に、血液凝固酵素の阻害剤は、天然であるか合成であるかにかかわらず、4つのカテゴリー:可逆的直接阻害剤、不可逆的直接阻害剤、可逆的間接阻害剤及び不可逆的間接阻害剤に分類することができる。各カテゴリーは、その独自の固有の生化学的反応機序を有する。したがって、アッセイを実施可能とするために、血液の凝固のための酵素Eの阻害剤Iを含有することが疑われる血液試料を同じ消耗品中で酵素E及び酵素Eに特異的な基質Sと接触させる。実験測定は、阻害反応(EとIとの間)と酵素反応(EとSとの間)との間の競合からなる。酵素Eによる基質Sの生成物Pへの切断によってマーカーの遊離が生じ、これにより測定機器を使用して経時的に記録される試料の物理的特性の観察可能な変化が誘導される。得られる速度論は、阻害剤の存在、生化学的反応機序及び濃度の影響を受ける。次に自動学習モデルのカスケードによってこれらの速度論を分析及び解釈し、それによって予想される生物学的結果を得る。図4は、本発明の基礎を成す原理を要約する。

【実施例】

【0168】

2.適用例:第Xa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量
2.1 序論
第Xa因子は、リン脂質膜上でカルシウムの存在下で第Va因子と会合し、プロトロンビンのトロンビン(又は第Ha因子)への活性化を担うプロトロンビナーゼ酵素複合体を形成する血液凝固酵素である。トロンビンへと活性化されたプロトロンビンは、次にフィブリン形成として公知の血液凝固カスケードの最終工程である、可溶性フィブリノーゲンの不溶性フィブリンの血栓への変換を行うことができる。したがって、第Xa因子は、血液凝固プロセスにおいて重要な役割を果たす酵素である:その活性を促進すると血液の凝固が促され増幅されるが、その活性を制限すると血液の凝固が低減し緩徐化する。したがって、多くの治療は第Xa因子を標的とし、その活性を低減させ、それにより静脈炎又は肺塞栓症等の血栓塞栓性事象の出現又は再発を予防する。これらは、ヘパリン又は実際には直接経口抗Xa抗凝固薬を含む。

【0169】

ヘパリンは、皮下又は静脈内投与される抗凝固薬物である。第Xa因子を阻害するために、ヘパリンは血漿タンパク質:アンチトロンビンと組み合わせられる。アンチトロンビンは、第Ha因子、第Xa因子、第IXa因子、及び程度は劣るが第VIIa因子(組織因子と会合する又はしない可能性がある)、第XIa因子及び第XIIa因子等の血液凝固酵素の天然阻害剤である。その阻害作用を発揮するために、アンチトロンビンは、これらの種々の酵素の活性部位に不可逆的に結合する。ヘパリンと会合すると、その活性は因子の1000倍になる。したがって、ヘパリンはとりわけ第Xa因子の不可逆的間接阻害剤である。ヘパリンの2つの主なファミリー:未分画ヘパリン(UFH)及び低分子量ヘパリン(LMWH)が存在する。ヘパリンの第3のファミリー:例えばフォンダパリヌクス又はイドラパリヌクス等の五糖類が存在する。UFHは、主としてトロンビンに対するアンチトロンビンの作用を強調する一方、LMWHは、主に第Xa因子に対するアンチトロンビンの作用を増強する。

【0170】

直接経口抗凝固薬(DOAC)は、経口投与される抗凝固薬物である。これらは2つのクラス:第Xa因子の直接抗Xa阻害剤及びトロンビンの直接抗IIa阻害剤に分けることができる。本発明の概念実証の文脈では、市販される分子が、Bayer/Janssen Pharmaceutical社から市販のリバーロキサバン又はXarelto(登録商標)、Bristol-Myers Squibb/Pfizer社から市販のアピキサバン又はEliquis(登録商標)及び第一三共社から市販のエドキサバン又はLixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標)である抗Xaファミリーのみに着目する。これら3種の分子は、酵素の活性部位に直接且つ可逆的に結合することにより第Xa因子を阻害する:したがって、これら3種の分子は、第Xa因子の可逆的直接阻害剤である。

【0171】

概念実証として、このセクションは、セクション1に記載される方法の第Xa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量への適用について記載する。ここで記載される要素は、第IIa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量に困難なく置き換えることができる。この点に関して、ヘパリンは第Xa因子と第IIa因子との両方の不可逆的間接阻害剤であることも留意されるべきである。

【0172】

2.2 原理
2.2.1 実験方法論
2.2.1.1 異なる濃度の研究される阻害剤に対する本発明による方法の感度、及び必要であれば適合技術
ヘパリン及びDOAC等の抗Xa抗凝固薬をアッセイするために現在入手可能な商業的方法は、すべて同じ原理:専用の実験方法論、専用の較正並びに各分子(UFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバン)のための専用の較正物質を用いた酵素アッセイに従って機能する。Stago STA(登録商標)-Multi-Hep Calibratorキットも公知である。これは、一般的な方法論及びハイブリッド較正を使用してUFH及びLMWHをアッセイするために使用することができる。しかし、このキットはDOACの検出には使用できない。

【0173】

本明細書で提案されるアプローチを使用して、抗Xa抗凝固薬、すなわちヘパリン(UFH及びLMWH)並びにDOAC(リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバン)の大部分の存在に感度を有する「普遍的な方法論」を実施することができる。この目的のために、アッセイされる試料からのある体積の血漿を緩衝液中で希釈する。第Xa因子に特異的な基質を反応混合物に添加し、次に集合物をインキュベートして37℃まで上げる。最後に、第Xa因子を添加して反応を開始し、数秒にわたって測定を実施する。

【0174】

本発明は、必然的に競合的であるアッセイに関する:更に、酵素は開始試薬でなければならず、したがって測定の開始前に最後に添加されなければならない。

【0175】

第Xa因子を使用する試験における最終モル濃度[E]に関して、本明細書で「普遍的な方法論」と題される方法論を使用して、図5に例示されるようにおよそ[E]^*10.0/3.0～およそ[E]^*200.0/3.0の間に含まれるUFHの濃度を測定できることが実験的に観察され、実証された。[0.1,2.0]IU/mLの範囲で完全にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。

【0176】

第Xa因子を使用する試験における最終モル濃度[E]に関して、本明細書で「普遍的な方法論」と題される方法論を使用して、図6に例示されるようにおよそ[E]^*20.0～およそ[E]^*400.0の間に含まれるLMWHの濃度を測定できることが実験的に観察され、実証された。[0.1,2.0]IU抗Xa/mLの範囲で完全にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。

【0177】

第Xa因子を使用する試験における最終モル濃度[E]に関して、本明細書で「普遍的な方法論」と題される方法論を使用して、図7に例示されるようにおよそ[E]/6.0～およそ[E]^*3.0の間に含まれるリバーロキサバンの濃度を測定できることが実験的に観察され、実証された。[20,600]ng/mLの範囲で完全にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。

【0178】

第Xa因子を使用する試験における最終モル濃度[E]に関して、本明細書で「普遍的な方法論」と題される方法論を使用して、図8に例示されるようにおよそ[E]/6.0～およそ[E]^*3.0の間に含まれるアピキサバンの濃度を測定できることが実験的に観察され、実証された。[20,600]ng/mLの範囲で完全にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。

【0179】

第Xa因子を使用する試験における最終モル濃度[E]に関して、本明細書で「普遍的な方法論」と題される方法論を使用して、図9に例示されるようにおよそ[E]/8.0～およそ[E]^*3.0の間に含まれるエドキサバンの濃度を測定できることが実験的に観察され、実証された。[20,600]ng/mLの範囲で完全にアッセイするために、異なる体積の試料、緩衝液及び試薬が選択され、調整される。

【0180】

測定は競合的であるため、本明細書に記載される特定の実施形態の文脈では、基質は明らかに第Xa因子に特異的でなければならないが、酵素とその阻害剤との間の反応に干渉しないよう、第Xa因子にわずかな親和性を有さなければならない。この目的のために、基質はおよそ10μM～1000μMの間の高いミカエリス定数KMを有さなければならない。酵素と基質との間の親和性は低くなるように故意に選択されるため、基質に対する酵素の触媒定数kcatは、生成物P(すなわち、マーカー)を生成して信号の測定を可能にするために十分に高い、例えばおよそ10s-1より高くなければならない。高い触媒定数は、酵素-基質複合体の濃度を最小化するためにも使用できる。最後に、基質の初期濃度[S]₀は、測定の期間d全体にわたってマーカーの生成を可能にする、例えば以下の不等式:

【0181】

【数1】

【0182】

を満たすのに十分でなければならない。しかし、初期濃度は、酵素とその阻害剤との間の反応にできるだけ干渉しないように高すぎてはならない:その値は、例えばKM^*10未満であってもよい。

【0183】

測定の継続時間は、存在する場合、抗凝固薬が酵素に対してその阻害作用を発揮できるようにするために、且つそれが測定によって観察可能であるように十分長く選択される;例は、10～1000秒の間に含まれる継続時間である。

【0184】

2.2.1.2 特定の例示的実施形態
第Xa因子の合成阻害剤は、不可逆的間接阻害剤であるヘパリン、及び可逆的直接阻害剤である抗Xa DOACである。

【0185】

最後に、「普遍的な方法論」と題された方法論の文脈における特定の例示的実施形態は、Stago STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キットを用いて実装された。当業者であれば、本明細書に提供される概念実証を容易に適合させて、最初のアッセイに対して本明細書で使用されるものと同じ範囲を有する任意のキットを使用する、又はそのようなキットの組成を適合させる、特に所与の酵素-基質対の性質を適合させることができる。本明細書に提供される概念実証は、本発明による方法の実施に本質的に限定されない。必要であれば、理解をより容易にするために、適切なキットの選択を可能にする要素が上記に列挙される。これらの指標は:
- 利用される基質は、第Xa因子に特異的であるが、酵素とその阻害剤との間の反応に干渉しないよう、第Xa因子にわずかな親和性を有さなければならない。
- 例えば、利用される基質は、高いとみなされる、特におよそ10μM～1000μMの間のミカエリス定数KMを有さなければならない;
- 酵素と基質との間の親和性が低くなるように故意に選択されるため、基質に対する酵素の触媒定数kcatは十分に高い、例えばおよそ10s-1より高い、又は10s-1より高くなければならない;
- 基質の初期濃度[S]0は、酵素とその阻害剤との間の反応に最小限に干渉するように、高くなりすぎることなく測定の期間d全体にわたってマーカーの生成を可能にするのに十分でなければならない:その値は、例えばKM^*10未満であってもよい;
- それ自体は市販キットの一部を成さない測定の継続時間は、好ましくは存在する場合は抗凝固薬が酵素に対してその阻害作用を発揮することを可能にし、且つそれが測定によって観察可能であるように十分長く選択される;例は、10～1000秒の間に含まれる継続時間である。特定の例が以下に記載される。
でありうる。

【0186】

この特定の実施形態によると、第Xa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量のためのin vitro測定は、以下の原理に従って実施された:
・ヘパリン又は抗Xa DOACを含有することが疑われる血漿試料25μLを、25μLのOwren Koller緩衝液(TOK)中で希釈し、消耗品に入れた;
・第Xa因子に特異的な「基質」試薬(MAPA-Gly-Arg-pNA)(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット中の試薬)150μLを反応混合物に添加した;
・240秒のインキュベーション工程により、反応混合物を37℃まで上げた;
・試薬「F.Xa」(ウシ第Xa因子)(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット中の試薬)150μLを反応混合物に添加し、それにより阻害反応と酵素反応との間の競合を開始する;
・次に測定それ自体を156秒間にわたって実施した:第Xa因子が基質を生成物に変換させると同時に、試料中に存在する場合はヘパリン又はDOACにより阻害された。基質の生成物への切断によってパラニトロアニリン(pNA)の遊離が誘導され、これをSTA-R(登録商標)型の機器において比色測定によって405nmで2秒ごとに測定する。
・測定により、第Xa因子のこれらの合成阻害剤の存在、作用様式及び濃度の影響を受ける速度論測定が記録される。

【0187】

更に、別の特定の実施形態によると、上述の方法論は、第Xa因子の合成阻害剤の存在の検出、第Xa因子の合成阻害剤のカテゴリーの識別、ヘパリンの同定並びにUFH及びLMWHのアッセイすべてを可能にするように最適化された。上記で「普遍的」として既知である最初の方法論は、実際には所望の濃度範囲(この範囲は当然目的に応じて変動しうる)全体にわたってDOACのアッセイを可能とすることができなかった。第2の方法論は、DOACの同定並びにリバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンのアッセイのために最適化された。これは、以下の原理に従い実施された:
・抗Xa DOACを含有した血漿試料6.25μLを、43.75μLのOwren Koller緩衝液(TOK)中で希釈し、消耗品に入れた;
・第Xa因子に特異的な「基質」試薬(MAPA-Gly-Arg-pNA、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット中の試薬)150μLを反応混合物に添加した;
・240秒のインキュベーション工程により、反応混合物を37℃まで上げた;
・試薬「F.Xa」(ウシ第Xa因子、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット中の試薬)150μLを反応混合物に添加し、それにより阻害反応と酵素反応との間の競合を開始する;
・次に測定それ自体を86秒間にわたって実施した:第Xa因子が基質を生成物に変換させると同時に、試料中に存在するDOACにより阻害された。基質の生成物への切断によってパラニトロアニリン(pNA)の遊離が誘導され、これをSTA-R(登録商標)型の機器において比色測定によって405nmで2秒ごとに測定する。
・測定により、抗Xa DOACの存在、作用様式及び濃度の影響を受ける速度論測定が記録された。

【0188】

第2の方法論は、試料の希釈係数を除き第1の方法論と同一であることが留意されるべきである。測定の継続時間も異なった:光学密度は2秒ごとにt=86sまで測定した。本明細書では、「普遍的な方法論」の特定の実施形態に対応して第1の方法論の特徴が参照されるべきであり、「最適化されたDOAC方法論」の特定の実施形態に対応して第2の方法論の特色が参照されるべきである。

【0189】

実際、本明細書で報告される方法論の2つの特定の例の検出の感度に関して、本明細書に記載される実装のモダリティーに依存して(特に酵素-基質対、試料の希釈及び測定期間)、実施され図5～図9に示される、上記で述べられた検証により以下のことを実証することができた。

【0190】

上記で「第Xa因子」に適用される普遍的な方法論に関して、試験における最終濃度は、
・酵素に対して[E]≒10nM
・基質に対して[S]≒482μM
・阻害剤が
・ UFHである場合、0≦[I]≦670nM又は2IU/mL;
・ LMWHである場合、0≦[I]≦4000nM又は2IU抗Xa/mL;
・ リバーロキサバンである場合、0≦[I]≦30nM又は180ng/mL;
・ アピキサバンである場合、0≦[I]≦30nM又は190ng/mL;
・ エドキサバンである場合、0≦[I]≦30nM又は230ng/mL;
である。

【0191】

更に、酵素-基質反応に関連付けられる触媒定数kcat及びミカエリス定数KMは、それぞれおよそ400s-1及び500μMであった。

【0192】

最適化されたDOAC方法論に関して、試験における最終濃度は、
・酵素に対して同上;
・基質に対して同上;
・阻害剤が
・ リバーロキサバンである場合、0≦[I]≦30nM又は720ng/mL;
・ アピキサバンである場合、0≦[I]≦30nM又は760ng/mL;
・ エドキサバンである場合、0≦[I]≦30nM又は920ng/mL;
であった。

【0193】

酵素-基質反応に関連付けられる触媒定数kcat及びミカエリス定数KMは、上記と同じ値を有する。

【0194】

要約すると、本明細書に記載されるアプローチは、普遍的な方法論を使用して、以下の範囲にわたってUFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンをアッセイすることができることを意味する:
・UFHについて0.0～2.0IU/mL;
・LMWHについて0.0～2.0IU抗Xa/mL;
・リバーロキサバンについて0.0～180.0ng/mL;
・アピキサバンについて0.0～190.0ng/mL;
・エドキサバンについて0.0～230.0ng/mL。

【0195】

上記で「第Xa因子」に適用される最適化されたDOAC方法論を使用することにより、それを使用することによって以下の範囲にわたってリバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバンをアッセイすることができる(実験結果は本明細書に示されないが、図5～図9の結果を得ることができたものと同一のマニピュレーションに従い、本明細書で最適化されたDOAC方法論と称される方法論で操作された調整を用いて得られた):
・リバーロキサバンについて0.0～720.0ng/mL;
・アピキサバンについて0.0～760.0ng/mL;
・エドキサバンについて0.0～920.0ng/mL。

【0196】

したがって、専用の方法論及び分子毎の較正を必要とし、強要する現行の商業的方法とは対照的に、単一の方法を用いて且つ較正を伴わずに、本出願で提案及び記載されるアプローチを使用して5種の抗Xa分子の存在を検出し、アッセイすることができる。アプローチは、現在では不可能な分子の同定を行うために使用することもできる。より詳細には、第IIa因子の阻害剤の探索に適用されるアッセイは、以下の工程及び/又はモダリティーを含んでもよい:
- V(試料)=175μL
- STA-Stachrom Heparinキットの試薬R2を用いた12分の1までの希釈
・組成:TRIS EDTA pH8.4
・調製:15mLフラスコ、QSP 150mL
- インキュベーション240秒(特に、他の実施例又は本出願で示される温度で)
- Ra=75μL=STA-Stachrom ATIII基質
・組成:CBS 61.50発色性基質、再構成された試薬1mLあたりおよそ1.4μモルのEtM-SPro-Arg-pNA、AcOH
・6mLの蒸留水で再構成
- Rd=50μL=STA-Stachrom ATIIIトロンビン
・組成:ウシトロンビン、再構成後1mLあたりおよそ11.3nKat
・再構成:6mLの既に希釈されたR2 STA-Stachrom Heparinを用いる。

【0197】

2.2.2 後処理
図10は、予想される生物学的結果を与えることを目的とした実験測定により得られる速度論を分析及び解釈する、本明細書で実装される特定の実施形態の代表である自動学習モデルのカスケードを詳述する。

【0198】

カスケードは、9つの自動学習モデルから構成される。これら9つのモデルは、入力として実験測定によって得られた速度論を受け取り、出力において結果を提供した:
・第1のモデル(モデルA)は分類モデルである:それに入力される速度論の外観により、分析試料が第Xa因子の合成阻害剤を含有するかどうかをyes又はnoで決定する;
・第2のモデル(モデルB)も分類モデルである:分析試料が第Xa因子の合成阻害剤を含有することを把握した上で、且つそれに入力される速度論の外観により、合成阻害剤抗Xaのカテゴリー:ヘパリン又はDOACを識別する;
・阻害剤がヘパリンである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、分類モデル(モデルC)はそれがUFHであるかLMWHであるか同定する;
・阻害剤がUFHである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはUFHの濃度を計算する;
・阻害剤がLMWHである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはLMWHの濃度を計算する;
・特定の実施形態により、阻害剤がDOACである場合、本明細書に詳述される最適化されたDOAC方法論を使用した実験測定が続き、新規のセットの速度論が記録され、その後阻害剤がリバーロキサバン、アピキサバン又はエドキサバンであるか同定する分類モデル(モデルC)の入力に提示される、
・阻害剤がリバーロキサバンである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはリバーロキサバンの濃度を計算する;
・阻害剤がアピキサバンである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはアピキサバンの濃度を計算する;
・阻害剤がエドキサバンである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはエドキサバンの濃度を計算する。

【0199】

最後に、回帰モデルDを使用してアッセイを実施することができる。

【0200】

以下のセクションは、これらの自動学習モデルのそれぞれについて、それらをトレーニングするために使用された学習及び検証データセット、並びに関連付けられるアルゴリズムを、本発明の基礎を成す概念実証を例示するようにそれぞれ列挙する。

【0201】

各データセットについて、第Xa因子の合成阻害剤(UFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバン)の濃度は、STA-R(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット並びに関連付けられる市販の較正物質及び方法論を使用して、自動STA-R(登録商標)機器を使用して測定されたことが留意されるべきである。当然ながら、本出願で定義される本発明も、適切であれば製造業者の指針に従い、実装するために異なるキットの内容物を使用して実行されてもよい。本実験セクションは、特に検出できる阻害剤の値の範囲に関して、適正な置換えを保証するために使用できる方法を詳述する。最後に、論理的に、速度論測定が実施される条件は、考慮される各学習モデルについて、本発明の方法によって分析される試料と学習及び検証データを生じるために使用されたものとの間で同じでなければならないことが留意される。

【0202】

抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出
データセット
・学習データ
・ 0.0IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における3セットの速度論測定;
・ 0.0ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における3セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。

【0203】

自動学習モデル:サポートベクターマシン(One Class SVM)を上述のデータセット(第Xa因子の阻害剤が補充されない血漿)を用いて半教師ありの形でトレーニングした。「一個抜き交差検証」を使用してハイパーパラメータの最適化を実施した。モデルのハイパーパラメータは以下であった:
・コア関数:放射基底関数
・γ≒3.77 10-5
・ν≒0.0131

【0204】

抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定
データセット
・学習データ
・ 0.12、0.225、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.9、0.875、0.995、1.13、1.24、1.315、1.44、1.53、1.63、1.7、1.88、1.955及び2.005IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における60セットの速度論測定;
・ 0.11、0.21、0.32、0.43、0.545、0.625、0.635、0.76、0.87、0.965、1.14、1.17、1.295、1.425、1.52、1.605、1.695、1.835、1.84及び1.99IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.145、0.245、0.35、0.44、0.535、0.64、0.735、0.85、0.935、1.07、1.14、1.24、1.265、1.44、1.495、1.55、1.66、1.745、1.785及び2.255IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.105、0.19、0.3、0.4、0.485、0.57、0.685、0.78、0.865、0.945、1.035、1.145、1.23、1.32、1.42、1.495、1.58、1.69、1.755及び1.805IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.11、0.2、0.295、0.395、0.465、0.535、0.63、0.795、0.885、0.955、1.055、1.21、1.27、1.37、1.455、1.515、1.64、1.81、1.83及び1.97IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 10、20、30、38、46、64、72、82、90、101、110、115、130、140、148、152、166、164及び192ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における60セットの速度論測定;
・ 10、20、32、41、46、57、65、76、79、96、105、116、125、135、138、152、161、169、180及び186ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における60セットの速度論測定;
・ 10、21、29、39、48、60、73、81、92、107、115、129、136、129、127、149、163、181、195及び200ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における60セットの速度論測定;
・ 10、20、35、41、49、56、66、73、84、93、105、110、116、134、143、155、160、175、181及び198ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 10、20、20、26、36、43、53、60、70、75、93、103、110、121、135、136、152、160、175、185及び191ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 10、21、27、40、49、64、73、90、99、108、122、132、144、130、136、153、169、192、194及び216ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 10、20、25、34、43、50、62、74、84、93、104、108、118、133、143、159、158、176、173及び202ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 10、20、25、34、44、50、61、70、74、94、103、110、122、135、138、147、162、173、182及び186ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 10、20、28、40、49、64、74、95、103、110、122、132、143、131、132、157、171、195、191及び201ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。
・検証データ
・ 0.095、0.205、0.315、0.44、0.555、0.655、0.77、0.84、0.855、0.98、1.15、1.275、1.335、1.43、1.555、1.6、1.75、1.845、1.92及び1.96IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における60セットの速度論測定;
・ 0.115、0.23、0.32、0.455、0.535、0.655、0.66、0.78、0.865、0.995、1.175、1.2、1.355、1.47、1.555、1.64、1.735、1.8、1.88及び2.025IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 0.165、0.255、0.345、0.445、0.54、0.63、0.73、0.82、0.92、1.045、1.125、1.16、1.3、1.355、1.475、1.57、1.685、1.75、1.835及び2.16IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における60セットの速度論測定;
・ 0.1、0.195、0.31、0.4、0.515、0.625、0.71、0.83、0.925、1.015、1.085、1.205、1.28、1.36、1.49、1.575、1.65、1.81、1.85及び1.965IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 0.14、0.22、0.305、0.42、0.5、0.56、0.66、0.83、0.905、0.995、1.07、1.25、1.275、1.365、1.47、1.615、1.66、1.805、1.9及び1.975IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 10、20、35、41、48、59、65、77、85、95、103、113、121、134、145、160、161、171、169及び202ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における60セットの速度論測定;
・ 10、20、27、39、41、52、61、67、76、93、96、105、123、127、140、145、155、167、184及び182ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における60セットの速度論測定;
・ 10、21、28、41、49、62、74、92、101、112、120、132、142、129、133、155、168、188、200及び206ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における60セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。

【0205】

自動学習モデル
k近傍法モデルを上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・k=5;
・尺度:ユークリッド距離。

【0206】

ヘパリンの同定
データセット
・学習データ
・ 0.12、0.225、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.9、0.875、0.995、1.13、1.24、1.315、1.44、1.53、1.63、1.7、1.88、1.955及び2.005IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における60セットの速度論測定;
・ 0.095、0.205、0.315、0.44、0.555、0.655、0.77、0.84、0.855、0.98、1.15、1.275、1.335、1.43、1.555、1.6、1.75、1.845、1.92及び1.96IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における60セットの速度論測定;
・ 0.11、0.21、0.32、0.43、0.545、0.625、0.635、0.76、0.87、0.965、1.14、1.17、1.295、1.425、1.52、1.605、1.695、1.835、1.84及び1.99IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.115、0.23、0.32、0.455、0.535、0.655、0.66、0.78、0.865、0.995、1.175、1.2、1.355、1.47、1.555、1.64、1.735、1.8、1.88及び2.025IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 0.145、0.245、0.35、0.44、0.535、0.64、0.735、0.85、0.935、1.07、1.14、1.24、1.265、1.44、1.495、1.55、1.66、1.745、1.785及び2.255IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.165、0.255、0.345、0.445、0.54、0.63、0.73、0.82、0.92、1.045、1.125、1.16、1.3、1.355、1.475、1.57、1.685、1.75、1.835及び2.16IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における60セットの速度論測定;
・ 0.105、0.19、0.3、0.4、0.485、0.57、0.685、0.78、0.865、0.945、1.035、1.145、1.23、1.32、1.42、1.495、1.58、1.69、1.755及び1.805IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.1、0.195、0.31、0.4、0.515、0.625、0.71、0.83、0.925、1.015、1.085、1.205、1.28、1.36、1.49、1.575、1.65、1.81、1.85及び1.965IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 0.11、0.2、0.295、0.395、0.465、0.535、0.63、0.795、0.885、0.955、1.055、1.21、1.27、1.37、1.455、1.515、1.64、1.81、1.83及び1.97IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における60セットの速度論測定;
・ 0.14、0.22、0.305、0.42、0.5、0.56、0.66、0.83、0.905、0.995、1.07、1.25、1.275、1.365、1.47、1.615、1.66、1.805、1.9及び1.975IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における60セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。
・検証データ
・ 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及び2.0IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における24セットの速度論測定;
・ 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及び2.0IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における24セットの速度論測定;
・ 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及び2.0IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における24セットの速度論測定;
・ 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及び2.0IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における24セットの速度論測定;
・ 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75及び2.0IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06399における24セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。

【0207】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に77ニューロン;
・隠れ層に27ニューロン;
・出力層に3ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU);
・出力層の各ニューロンの活性化関数:softmax。

【0208】

未分化ヘパリンのアッセイ
データセット
・学習データ
・ 0.0、0.12、0.225、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.9、0.875、0.995、1.13、1.24、1.315、1.44、1.53、1.63、1.7、1.88、1.955及び2.005IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05450における63セットの速度論測定;
・ 0.0、0.11、0.21、0.32、0.43、0.545、0.625、0.635、0.76、0.87、0.965、1.14、1.17、1.295、1.425、1.52、1.605、1.695、1.835、1.84及び1.99IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における63セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。
・検証データ
・ 0.0、0.095、0.205、0.315、0.44、0.555、0.655、0.77、0.84、0.855、0.98、1.15、1.275、1.335、1.43、1.555、1.6、1.75、1.845、1.92及び1.96IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における63セットの速度論測定;
・ 0.0、0.115、0.23、0.32、0.455、0.535、0.655、0.66、0.78、0.865、0.995、1.175、1.2、1.355、1.47、1.555、1.64、1.735、1.8、1.88及び2.025IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における63セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。

【0209】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に77ニューロン;
・隠れ層に27ニューロン;
・出力層に1ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU)。

【0210】

低分子量ヘパリンのアッセイ
データセット
・学習データ
・ 0.0、0.145、0.245、0.35、0.44、0.535、0.64、0.735、0.85、0.935、1.07、1.14、1.24、1.265、1.44、1.495、1.55、1.66、1.745、1.785及び2.255IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における63セットの速度論測定;
・ 0.0、0.105、0.19、0.3、0.4、0.485、0.57、0.685、0.78、0.865、0.945、1.035、1.145、1.23、1.32、1.42、1.495、1.58、1.69、1.755及び1.805IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における63セットの速度論測定;
・ 0.0、0.11、0.2、0.295、0.395、0.465、0.535、0.63、0.795、0.885、0.955、1.055、1.21、1.27、1.37、1.455、1.515、1.64、1.81、1.83及び1.97IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT06366における63セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。
・ 検証データ
・ 0.0、0.165、0.255、0.345、0.445、0.54、0.63、0.73、0.82、0.92、1.045、1.125、1.16、1.3、1.355、1.475、1.57、1.685、1.75、1.835及び2.16IU抗Xa/mLのLMWH(Fragmine(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT05016における63セットの速度論測定;
・ 0.0、0.1、0.195、0.31、0.4、0.515、0.625、0.71、0.83、0.925、1.015、1.085、1.205、1.28、1.36、1.49、1.575、1.65、1.81、1.85及び1.965IU抗Xa/mLのLMWH(Lovenox(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における63セットの速度論測定;
・ 0.0、0.14、0.22、0.305、0.42、0.5、0.56、0.66、0.83、0.905、0.995、1.07、1.25、1.275、1.365、1.47、1.615、1.66、1.805、1.9及び1.975IU抗Xa/mLのLMWH(Innohep(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00603における63セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 普遍的な方法論。

【0211】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に77ニューロン;
・隠れ層に27ニューロン;
・出力層に1ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU)。

【0212】

抗Xa DOACの同定
データセット
・学習データ
・ 10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における60セットの速度論測定;
・ 10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における69セットの速度論測定;
・ 16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における69セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。
・検証データ
・ 10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における60セットの速度論測定;
・ 10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における69セットの速度論測定;
・ 16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における69セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。

【0213】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に42ニューロン;
・第1の隠れ層に29ニューロン;
・第2の隠れ層に16ニューロン;
・出力層に3ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU);
・出力層の各ニューロンの活性化関数:softmax。

【0214】

リバーロキサバンのアッセイ
データセット
・学習データ
・ 0、10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における63セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。
・検証データ
・ 0、10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLのリバーロキサバン(Xarelto(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における63セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。

【0215】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に42ニューロン;
・第1の隠れ層に29ニューロン;
・第2の隠れ層に16ニューロン;
・出力層に1ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU)。

【0216】

アピキサバンのアッセイ
データセット
・学習データ
・ 0、10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における72セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。
・検証データ
・ 0、10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLのアピキサバン(Eliquis(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における72セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。

【0217】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に42ニューロン;
・第1の隠れ層に29ニューロン;
・第2の隠れ層に16ニューロン;
・出力層に1ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU)。

【0218】

エドキサバンのアッセイ
データセット
・学習データ
・ 0、16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における72セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。
・検証データ
・ 0、16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLのエドキサバン(Lixiana(登録商標)/Savaysa(登録商標))が補充された血漿に対するSTA-R(登録商標)AUT00460における72セットの速度論測定;
・ 各レベルの補充に対して3試行測定を実施した;
・ 最適化されたDOAC方法論。

【0219】

自動学習モデル
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を上述のデータセットを用いてトレーニングした。そのハイパーパラメータは以下であった:
・入力層に42ニューロン;
・第1の隠れ層に29ニューロン;
・第2の隠れ層に16ニューロン;
・出力層に1ニューロン;
・種々の隠れ層の各ニューロンの活性化関数:正規化線形ユニット(又はReLU)。

【0220】

2.3 結果
このセクションは、セクション2.2.1に記載された実験方法論を使用して実試料で測定されたデータにおいて、図10の特定のカスケードの種々の自動学習モデルによって得られた性能の結果を列挙する。各サブセクションは、測定されたデータ及び得られた性能について詳述する。単一試行測定が結果を得るために十分であった。しかし、このセクションが実証するように、3試行測定により性能が改善する可能性がある。

【0221】

2.3.1 抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出
このセクションは、本発明を使用した抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出について得られた結果を提供する。

【0222】

試験データ
・単一試行分析:298個の実際の試料(39個の正常の血漿試料、259個の抗Xa抗凝固薬を摂取する患者からの血漿試料)に対する298セットの速度論測定;
・3試行分析:298個の実際の試料(39個の正常の血漿試料、259個の抗Xa抗凝固薬を摂取する患者からの血漿試料)に対する894セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・普遍的な方法論。

【0223】

【表1】

【0224】

【表2】

【0225】

結果
Tables 1 and 2(表1及び表2)は、分析を試験データセットに対して単一試行で実施した場合と、3試行分析を実施した場合の抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。抗Xa抗凝固薬の存在の検出の結果は、単一試行分析が実施された場合に99.61%の正確度、3試行分析が実施された場合に99.61%の正確度をもたらした。抗Xa抗凝固薬の非存在の検出の結果は、単一試行分析が実施された場合に97.44%の正確度、3試行分析が実施された場合に97.44%の正確度をもたらした。

【0226】

2.3.2 抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定
このセクションは、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用した抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定について得られた結果を提供する。

【0227】

このセクションは、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用した抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定について得られた結果を提供する。

【0228】

試験データ
・単一試行分析:259個の実際の試料(91個のヘパリンを摂取する患者からの血漿試料、168個の抗Xa DOACを摂取する患者からの血漿試料)に対する259セットの速度論測定;
・3試行分析:259個の実際の試料(91個のヘパリンを摂取する患者からの血漿試料、168個の抗Xa DOACを摂取する患者からの血漿試料)に対する777セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・普遍的な方法論。

【0229】

【表3】

【0230】

【表4】

【0231】

結果
Tables 3 and 4(表3及び表4)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合の抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定の結果は、単一試行分析が実施された場合に98.07%の正確度、3試行分析が実施された場合に97.68%の正確度をもたらした。

【0232】

2.3.3 ヘパリンの同定
このセクションは、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用したヘパリンの同定について得られた結果を提供する。

【0233】

試験データ
・単一試行分析:91個の実際の試料(29個のUFHを摂取する患者からの実際の試料、62個のLMWHを摂取する患者からの実際の試料)に対する91セットの速度論測定;
・3試行分析:91個の実際の試料(29個のUFHを摂取する患者からの実際の試料、62個のLMWHを摂取する患者からの実際の試料)に対する273セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・普遍的な方法論。

【0234】

【表5】

【0235】

【表6】

【0236】

結果
Tables 5 and 6(表5及び表6)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合のヘパリンの同定に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。ヘパリンの同定の結果は、単一試行分析が実施された場合に92.31%の正確度、3試行分析が実施された場合に93.41%の正確度をもたらした。

【0237】

2.3.4 未分化ヘパリンのアッセイ
このセクションは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用して得られた患者からの試料に対するUFHの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R2が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0238】

試験データ
・単一試行分析:UFHを摂取する患者からの24個の実際の試料に対する24セットの速度論測定;
・3試行分析:UFHを摂取する患者からの24個の実際の試料に対する72セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・普遍的な方法論。

【0239】

結果
図11は、試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されたUFHの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたUFHの濃度との比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.018x-0.0005及び決定係数R2=0.9844の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.002x+0.002及び決定係数R2=0.9925の直線が得られた。

【0240】

2.3.5 低分子量ヘパリンのアッセイ
このセクションは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用して得られた患者からの試料に対するLMWHの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R2が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0241】

試験データ
・単一試行分析:LMWHを摂取する患者からの62個の実際の試料に対する62セットの速度論測定;
・3試行分析:LMWHを摂取する患者からの62個の実際の試料に対する186セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・普遍的な方法論。

【0242】

結果
図12は、試験データセットに対する本明細書に記載されるアプローチを使用して測定されたLMWHの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたLMWHの濃度との比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=0.995x+0.006及び決定係数R2=0.9962の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=0.9977x+0.004及び決定係数R2=0.997の直線が得られた。

【0243】

2.3.6 抗Xa DOACの同定
このセクションは、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用した抗Xa DOACの同定について得られた結果を提供する。

【0244】

試験データ
・単一試行分析:168個の実際の試料(65個のリバーロキサバンを摂取する患者からの実際の試料、45個のアピキサバンを摂取する患者からの実際の試料、58個のエドキサバンを摂取する患者からの実際の試料)に対する168セットの速度論測定;
・3試行分析:168個の実際の試料(65個のリバーロキサバンを摂取する患者からの実際の試料、45個のアピキサバンを摂取する患者からの実際の試料、58個のエドキサバンを摂取する患者からの実際の試料)に対する504セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・最適化されたDOAC方法論。

【0245】

結果
Tables 7 and 8(表7及び表8)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合の抗Xa DOACの同定に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。抗Xa DOACの同定の結果は、単一試行分析が実施された場合に91.67%の正確度、3試行分析が実施された場合に96.43%の正確度をもたらした。

【0246】

【表7】

【0247】

【表8】

【0248】

2.3.7 リバーロキサバンのアッセイ
このセクションは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用して得られた患者からの試料に対するリバーロキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R2が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0249】

試験データ
・単一試行分析:リバーロキサバンを摂取する患者からの62個の実際の試料に対する62セットの速度論測定;
・3試行分析:リバーロキサバンを摂取する患者からの62個の実際の試料に対する186セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・最適化されたDOAC方法論。

【0250】

結果
図13は、試験データセットに対する本明細書に記載される本発明の特定の実施形態のアプローチを使用して測定されたリバーロキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたリバーロキサバンの濃度との比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.05x+19.65及び決定係数R2=0.991の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.04x+20.3及び決定係数R2=0.9934の直線が得られた。

【0251】

2.3.8 アピキサバンのアッセイ
このセクションは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用して得られた患者からの試料に対するアピキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R2が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0252】

試験データ
・単一試行分析:アピキサバンを摂取する患者からの45個の実際の試料に対する45セットの速度論測定;
・3試行分析:アピキサバンを摂取する患者からの45個の実際の試料に対する135セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・最適化されたDOAC方法論。

【0253】

結果
図14は、試験データセットに対する本明細書に記載される本発明の特定の実施形態のアプローチを使用して測定されたアピキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたアピキサバンの濃度との比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.14x-6.73及び決定係数R2=0.9945の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.13x-5.46及び決定係数R2=0.9958の直線が得られた。

【0254】

2.3.9 エドキサバンのアッセイ
このセクションは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態を使用して得られた患者からの試料に対するエドキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R2が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0255】

試験データ
・単一試行分析:エドキサバンを摂取する患者からの56個の実際の試料に対する56セットの速度論測定;
・3試行分析:エドキサバンを摂取する患者からの56個の実際の試料に対する168セットの速度論測定;
・機器はSTA-R(登録商標)AUT06399であった;
・最適化されたDOAC方法論。

【0256】

結果
図15は、試験データセットに対する本明細書に記載される本発明の特定の実施形態のアプローチを使用して測定されたエドキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたエドキサバンの濃度との比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=0.905x+12.35及び決定係数R2=0.9853の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=0.93x+8.18及び決定係数R2=0.9881の直線が得られた。

【0257】

3.第Xa因子の合成阻害剤の検出、同定及び定量の第2の後処理研究
図6は、予想される生物学的結果を与えることを目的とした実験測定により得られた速度論を分析及び解釈する、自動学習モデルのカスケード(この第2の研究の文脈において従う)を詳述する。

【0258】

カスケードは、12個の自動学習モデルから構成された。これら12個のモデルは、入力として実験測定によって得られた速度論測定を受け取り、出力において結果を提供した:
- 第1のモデルは分類モデルであった:それに入力される速度論の外観により、分析試料が第Xa因子の合成阻害剤を含有したかどうかをyes又はnoで決定した;
- 第2のモデルも分類モデルであった:分析試料が第Xa因子の合成阻害剤を含有したことを把握した上で、且つそれに入力される速度論の外観により、合成阻害剤抗Xaのカテゴリー:ヘパリン又はDOACを識別した;
- 阻害剤がヘパリンであった場合、且つそれに入力される速度論の外観により、分類モデルはそれがUFHであるかLMWHであるか同定した;
- 阻害剤がUFHであった場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはUFHの濃度を計算した;
- 阻害剤がLMWHである場合、且つそれに入力される速度論の外観により、回帰モデルはLMWHの濃度を計算する;
- 阻害剤がDOACであった場合、最適化されたDOAC方法論を使用した実験フォローアップ測定が実施され、新規の速度論測定が行われ、その後阻害剤がリバーロキサバン、アピキサバン又はエドキサバンであるか同定する分類モデルの入力に提示された:
- 阻害剤がリバーロキサバンであった場合、且つそれに入力される速度論(最適化されたDOAC方法論によって測定される)の外観により、回帰モデルはリバーロキサバンの濃度を計算した;この濃度が200ng/mL未満であった場合、今回は普遍的な方法論によって測定された速度論を入力して、第2の回帰モデルがリバーロキサバンの濃度を再計算した:これにより、低濃度のリバーロキサバンに対するより正確な結果が与えられた。そうでなければ、結果は直接与えられる。(この実施形態は、本明細書で「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」と記載される方法論に対応した)。
- 阻害剤がアピキサバンであった場合、且つそれに入力される速度論(最適化されたDOAC方法論によって測定される)の外観により、回帰モデルはアピキサバンの濃度を計算した;この濃度が200ng/mL未満であった場合、今回は普遍的な方法論によって測定された速度論を入力して、第2の回帰モデルがアピキサバンの濃度を再計算した:これにより、低濃度のアピキサバンに対するより正確な結果が与えられる。そうでなければ、結果は直接与えられた。(この実施形態は、本明細書で「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」と記載される方法論に対応した)。
- 阻害剤がエドキサバンであった場合、且つそれに入力される速度論(最適化されたDOAC方法論によって測定される)の外観により、回帰モデルはエドキサバンの濃度を計算した;この濃度が200ng/mL未満であった場合、今回は普遍的な方法論によって測定された速度論を入力して、第2の回帰モデルがエドキサバンの濃度を再計算した:これにより、低濃度のエドキサバンに対するより正確な結果が与えられる。そうでなければ、結果は直接与えられた。(この実施形態は、本明細書で「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」と記載される方法論に対応した)。

【0259】

以下のセクションは、これらの自動学習モデルのそれぞれに対する、それらをトレーニングするために使用された学習及び検証データセット、並びに関連付けられるアルゴリズムをそれぞれ列挙する。

【0260】

各データセットについて、第Xa因子の合成阻害剤(UFH、LMWH、リバーロキサバン、アピキサバン及びエドキサバン)の濃度は、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット並びに関連付けられる市販の較正物質及び方法論を使用し、自動STA-R(登録商標)機器に対して測定されたことが留意されるべきである。

【0261】

3.1 抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出
3.1.1 データセット
異なる試験のために抗凝固薬を含まない試料を生産した。これらは、試験日にスパイクされた試料と同じ割合で希釈された血漿マトリックスに関係した:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に3セットの速度論測定。
- 即席調製され、2つの機器において同時に試験された正常血漿プール試料、0.00IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において18.07.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製された正常血漿プール試料、理論濃度の0.00IU/mLのUFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に3セットの速度論測定。
- 即席調製され、2つの機器において同時に試験された正常血漿プール試料、0.00IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において17.07.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製された正常血漿プール試料、理論濃度の0.00IU/mLのUFHカルシウム(Calciparine(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に3セットの速度論測定。
- 即席調製され、2つの機器において同時に試験された0.00IU/mLのLMWHダルテパリンナトリウム(Fragmine(登録商標))が補充されたバッチ03.2017で測定された速度論測定。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において17.07.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製された正常血漿プール試料、理論濃度の0.00IU/mLのLMWHダルテパリンナトリウム(Fragmine(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製され、2つの機器において同時に試験された正常血漿プール試料、0.00IU/mLのLMWHエノキサパリンナトリウム(Lovenox(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において19.07.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製された正常血漿プール試料、理論濃度の0.00IU/mLのLMWHエノキサパリンナトリウム(Lovenox(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に3セットの速度論測定。
- 即席調製され、2つの機器において同時に試験された正常血漿プール試料、0.00IU/mLのLMWHチンザパリンナトリウム(InnoHep(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において18.07.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製された正常血漿プール試料、理論濃度の0.00IU/mLのLMWHチンザパリンナトリウム(InnoHep(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において18.07.2017に3セットの速度論測定
- 即席調製された正常血漿プール試料、理論濃度の0.00IU/mLのフォンダパリヌクス(Arixtra(登録商標))が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に3セットの速度論測定
- 調製され-80℃で保管された正常血漿プール試料、0ng/mLのXarelto(登録商標)(リバーロキサバン)が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251738。
- STA-R AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.02.2018に3セットの速度論測定
- 調製され-80℃で保管された正常血漿プール試料、0ng/mLのXarelto(登録商標)(リバーロキサバン)が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において21.09.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において20.09.2017に3セットの速度論測定
- 調製され-80℃で保管された正常血漿プール試料、0ng/mLのLixiana(登録商標)(エドキサバン)が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251738。
- STA-R AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.02.2018に3セットの速度論測定
- 調製され-80℃で保管された正常血漿プール試料、0ng/mLのLixiana(登録商標)(エドキサバン)が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06360(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に3セットの速度論測定+STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に3セットの速度論測定
- 調製され-80℃で保管された正常血漿プール試料、0ng/mLのEliquis(登録商標)(アピキサバン)が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251738。
- STA-R AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.02.2018に3セットの速度論測定
- 調製され-80℃で保管された正常血漿プール試料、0ng/mLのEliquis(登録商標)(アピキサバン)が補充されたバッチ03.2017。
- STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251187。

【0262】

UFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.12、0.23、0.32、0.46、0.54、0.66、0.66、0.78、0.86、1.00、1.18、1.20、1.36、1.47、1.56、1.64、1.74、1.80、1.88及び2.03IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.21、0.32、0.43、0.55、0.63、0.64、0.76、0.87、0.97、1.14、1.17、1.30、1.43、1.52、1.61、1.70、1.84、1.84及び1.99IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0263】

UFHカルシウム(Calciparine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.21、0.32、0.44、0.56、0.66、0.77、0.84、0.86、0.98、1.15、1.28、1.34、1.43、1.56、1.60、1.75、1.85、1.92及び1.96IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.12、0.23、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.90、0.88、1.00、1.13、1.24、1.32、1.44、1.53、1.63、1.70、1.88、1.96及び2.01IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0264】

LMWHダルテパリンナトリウム(Fragmine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0265】

LMWHエノキサパリンナトリウム(Lovenox(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0266】

LMWHチンザパリンナトリウム(InnoHep(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251187、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びヘパリン補充物の商業的アッセイのために使用されたバッチ。

【0267】

Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、35、41、49、56、66、74、84、93、105、110、116、134、143、155、160、175、181及び198ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、35、41、48、59、65、77、85、95、103、113、121、134、145、160、161、172、169、202ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、25、34、43、50、62、74、84、93、104、109、118、133、143、159、158、176、173及び203ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、30、38、46、57、64、72、82、90、101、110、115、130、140、148、152、166、164及び192ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0268】

Eliquis(登録商標)(アピキサバン)に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、27、39、41、52、61、67、76、93、96、105、123、127、140、145、155、167、184及び182ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06360(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、26、36、43、53、60、70、75、93、103、109、121、135、136、153、160、175、185及び192ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、26、34、44、50、61、70、74、94、103、109、122、135、138、147、162、173、182及び186ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、33、41、46、57、65、76、79、96、105、116、125、135、138、153、161、169、180及び186ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0269】

Lixiana(登録商標)(エドキサバン)に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、28、40、49、64、74、95、103、109、122、132、144、131、132、157、171、195、191及び201ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、21、28、41、49、62、74、92、102、112、120、133、142、129、133、155、168、188、200及び206ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において21.09.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、21、27、40、49、64、73、90、99、108、122、132、144、130、136、153、169、192、194及び216ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において20.09.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、21、29、39、48、60、73、81、92、107、115、129、136 .129、127、149、163、181、195及び199ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251738、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びDOAC装填物の商業的アッセイのために使用されたバッチ。

【0270】

3.1.2 自動学習モデル
データの編成
抗凝固薬分子を含まない試料に関連するデータを混合し、本明細書でABSENCE-0及びABSENCE-1と表記される2つのデータセットに分割した。

【0271】

自動学習モデルを、以下のように2つのサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- ABSENCE-0、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:
- ABSENCE-1、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標)、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- ABSENCE-1、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:
- ABSENCE-0、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0272】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 2ニューロン
- 活性化関数:Softmax
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.00001
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:クロスエントロピー

【0273】

3.2 抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定
3.2.1 データセット
UFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.12、0.23、0.32、0.46、0.54、0.66、0.66、0.78、0.86、1.00、1.18、1.20、1.36、1.47、1.56、1.64、1.74、1.80、1.88及び2.03IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.21、0.32、0.43、0.55、0.63、0.64、0.76、0.87、0.97、1.14、1.17、1.30、1.43、1.52、1.61、1.70、1.84、1.84及び1.99IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0274】

UFHカルシウム(Calciparine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.21、0.32、0.44、0.56、0.66、0.77、0.84、0.86、0.98、1.15、1.28、1.34、1.43、1.56、1.60、1.75、1.85、1.92及び1.96IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.12、0.23、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.90、0.88、1.00、1.13、1.24、1.32、1.44、1.53、1.63、1.70、1.88、1.96及び2.01IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0275】

LMWHダルテパリンナトリウム(Fragmine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0276】

LMWHエノキサパリンナトリウム(Lovenox(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0277】

LMWHチンザパリンナトリウム(InnoHep(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251187、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びヘパリン補充物の商業的アッセイのために使用されたバッチ。

【0278】

Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、35、41、49、56、66、74、84、93、105、110、116、134、143、155、160、175、181及び198ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、35、41、48、59、65、77、85、95、103、113、121、134、145、160、161、172、169、202ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、25、34、43、50、62、74、84、93、104、109、118、133、143、159、158、176、173及び203ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、30、38、46、57、64、72、82、90、101、110、115、130、140、148、152、166、164及び192ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0279】

Eliquis(登録商標)(アピキサバン)に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、27、39、41、52、61、67、76、93、96、105、123、127、140、145、155、167、184及び182ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06360(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、26、36、43、53、60、70、75、93、103、109、121、135、136、153、160、175、185及び192ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、26、34、44、50、61、70、74、94、103、109、122、135、138、147、162、173、182及び186ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、33、41、46、57、65、76、79、96、105、116、125、135、138、153、161、169、180及び186ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0280】

Lixiana(登録商標)(エドキサバン)に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、20、28、40、49、64、74、95、103、109、122、132、144、131、132、157、171、195、191及び201ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、21、28、41、49、62、74、92、102、112、120、133、142、129、133、155、168、188、200及び206ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において21.09.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、21、27、40、49、64、73、90、99、108、122、132、144、130、136、153、169、192、194及び216ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において20.09.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、10、21、29、39、48、60、73、81、92、107、115、129、136 .129、127、149、163、181、195及び199ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251738、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びDOAC装填物の商業的アッセイのために使用されたバッチ。

【0281】

3.2.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように2つのサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標)、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0282】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 18ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 2ニューロン
- 活性化関数:Softmax
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.001
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:クロスエントロピー

【0283】

3.3 ヘパリンの同定
3.3.1 データセット
UFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.12、0.23、0.32、0.46、0.54、0.66、0.66、0.78、0.86、1.00、1.18、1.20、1.36、1.47、1.56、1.64、1.74、1.80、1.88及び2.03IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.21、0.32、0.43、0.55、0.63、0.64、0.76、0.87、0.97、1.14、1.17、1.30、1.43、1.52、1.61、1.70、1.84、1.84及び1.99IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において18.07.2017に24セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75及び2.00IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製した。

【0284】

UFHカルシウム(Calciparine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.21、0.32、0.44、0.56、0.66、0.77、0.84、0.86、0.98、1.15、1.28、1.34、1.43、1.56、1.60、1.75、1.85、1.92及び1.96IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.12、0.23、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.90、0.88、1.00、1.13、1.24、1.32、1.44、1.53、1.63、1.70、1.88、1.96及び2.01IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において17.07.2017に24セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75及び2.00IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製した。

【0285】

LMWHダルテパリンナトリウム(Fragmine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において17.07.2017に24セットの速度論測定
- 正常血漿プール、理論濃度の0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75及び2.00IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製した。

【0286】

LMWHエノキサパリンナトリウム(Lovenox(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において19.07.2017に24セットの速度論測定
- 正常血漿プール、理論濃度の0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75及び2.00IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製した。

【0287】

LMWHチンザパリンナトリウム(InnoHep(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に60セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において18.07.2017に24セットの速度論測定
- 正常血漿プール、理論濃度の0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75及び2.00IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251187、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びヘパリン補充物の商業的アッセイ(該当する場合)のために使用されたバッチ。

【0288】

3.3.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように編成された交差検証によりトレーニングした:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))。
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標)、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))。

【0289】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 2ニューロン
- 活性化関数:Softmax
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.9
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:クロスエントロピー

【0290】

3.4 未分化ヘパリンのアッセイ
3.4.1 データセット
UFHナトリウム(Heparin Choay(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.12、0.23、0.32、0.46、0.54、0.66、0.66、0.78、0.86、1.00、1.18、1.20、1.36、1.47、1.56、1.64、1.74、1.80、1.88及び2.03IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において24.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.11、0.21、0.32、0.43、0.55、0.63、0.64、0.76、0.87、0.97、1.14、1.17、1.30、1.43、1.52、1.61、1.70、1.84、1.84及び1.99IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0291】

UFHカルシウム(Calciparine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.10、0.21、0.32、0.44、0.56、0.66、0.77、0.84、0.86、0.98、1.15、1.28、1.34、1.43、1.56、1.60、1.75、1.85、1.92及び1.96IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において23.10.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.12、0.23、0.33、0.43、0.55、0.66、0.75、0.90、0.88、1.00、1.13、1.24、1.32、1.44、1.53、1.63、1.70、1.88、1.96及び2.01IU/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251187、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びヘパリン補充物の商業的アッセイのために使用されたバッチ。

【0292】

3.4.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように4つのサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))。
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))。
- サブセット3:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))。
- サブセット4:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))、
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたUFHナトリウムデータ(Heparin Choay(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたUFHカルシウムデータ(Calciparine(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0293】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.01
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0294】

3.5 低分子量ヘパリンのアッセイ
3.5.1 データセット
LMWHダルテパリンナトリウム(Fragmine(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05016(ソフトバージョン3.04.07)において19.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.15、0.25、0.35、0.44、0.54、0.64、0.74、0.85、0.94、1.07、1.14、1.24、1.27、1.44、1.50、1.55、1.66、1.75、1.79、2.26IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0295】

LMWHエノキサパリンナトリウム(Lovenox(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において26.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.10、0.20、0.31、0.40、0.52、0.63、0.71、0.83、0.93、1.02、1.09、1.21、1.28、1.36、1.49、1.58、1.65、1.81、1.85、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。

【0296】

LMWHチンザパリンナトリウム(InnoHep(登録商標))に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において25.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0.00、0.11、0.20、0.30、0.40、0.46、0.54、0.63、0.80、0.89、0.96、1.06、1.21、1.27、1.37、1.46、1.52、1.64、1.81、1.83、1.97IU抗Xa/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を即席調製し、2つの機器において同時に試験した。
STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaのバッチ番号:251187、普遍的な方法論を使用して速度論を生成するため、及びヘパリン補充物の商業的アッセイのために使用されたバッチ。

【0297】

3.5.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように2つのサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))。
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))。
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT05016において生成されたLMWHダルテパリンナトリウムデータ(Fragmine(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHエノキサパリンナトリウムデータ(Lovenox(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたLMWHチンザパリンナトリウムデータ(InnoHep(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0298】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.1
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0299】

3.6 抗Xa DOACの同定(最適化されたDOAC方法論)
3.6.1 データセット
Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)に関連して生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00460において2016年1月に測定された60の速度論測定
- 10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLが補充された正常血漿プール
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT00722において2016年6月に測定された60の速度論測定
- 10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0300】

Eliquis(登録商標)(アピキサバン)に関連して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00460において2016年1月に測定された69の速度論測定
- 10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLが補充された正常血漿プール
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT00722において2016年6月に測定された69の速度論測定
- 10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0301】

Lixiana(登録商標)(エドキサバン)に関連して生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00460において2016年1月に測定された69の速度論測定
- 16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLが補充された正常血漿プール
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT00722において2016年6月に測定された69の速度論測定
- 16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0302】

3.6.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように編成された交差検証によりトレーニングした:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00460において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00460において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00460において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- 検証データ:
- STA-R(登録商標)AUT00722において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00722において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT00722において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、

【0303】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 42ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 29ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 隠れ層
- 16ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 3ニューロン
- 活性化関数:Softmax
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.01
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:クロスエントロピー

【0304】

3.7 リバーロキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)
3.7.1 データセット
Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)に関連して生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00460において2016年1月に測定された63の速度論測定
- 0、10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLが補充された正常血漿プール
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT00722において2016年6月に測定された63の速度論測定
- 0、10、20、29、37、44、54、62、89、115、143、160、192、226、252、287、319、331、361、391及び407ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0305】

3.7.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように編成された交差検証によりトレーニングした:
- 学習データ:STA-R(登録商標)AUT00460において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT00722において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。

【0306】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 42ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 29ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 隠れ層
- 16ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.01
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0307】

3.8 リバーロキサバンのアッセイ(普遍的な方法論又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)
3.8.1 データセット
Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)に関連するデータを2つの別個の研究中に生成した。
第1の研究に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、35、41、49、56、66、74、84、93、105、110、116、134、143、155、160、175、181及び198ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、35、41、48、59、65、77、85、95、103、113、121、134、145、160、161、172、169、202ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、25、34、43、50、62、74、84、93、104、109、118、133、143、159、158、176、173及び203ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において10.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、30、38、46、57、64、72、82、90、101、110、115、130、140、148、152、166、164及び192ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
この第1の研究では、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251738を使用して普遍的な方法論を使用して速度論を生成し、リバーロキサバンの補充物の商業的アッセイを行った。

【0308】

第2の研究に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05676(ソフトバージョン3.04.07)において14.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、11、21、28、42、50、58、68、77、93、102、113、121、129、141、153、160、174、184、201及び204ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05980(ソフトバージョン3.04.07)において14.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、15、23、32、47、52、61、74、77、92、108、112、120、129、139、151、164、174、184、191及び206ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において14.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、13、22、29、44、51、60、72、79、96、104、118、122、132、143、155、161、175、186、198及び201ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
この第2の研究では、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ253225を使用して普遍的な方法論を使用して速度論を生成し、リバーロキサバンの補充物の商業的アッセイを行った。

【0309】

3.8.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように7個のサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- サブセット3:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- サブセット4:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- サブセット5:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- サブセット6:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- サブセット7:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたリバーロキサバンデータ(Xarelto(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0310】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.001
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0311】

3.9 アピキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)
3.9.1 データセット
Eliquis(登録商標)(アピキサバン)に関連して生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00460において2016年1月に測定された72の速度論測定
- 0、10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT00722において2016年6月に測定された72の速度論測定
- 0、10、20、31、42、48、72、92、116、143、163、192、217、247、276、298、321、348、370、397、416、439、459及び473ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0312】

3.9.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように編成された交差検証によりトレーニングした:
- 学習データ:STA-R(登録商標)AUT00460において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT00722において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。

【0313】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 42ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 29ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 隠れ層
- 16ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.01
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0314】

3.10 アピキサバンのアッセイ(普遍的な方法論又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)
3.10.1 データセット
Eliquis(登録商標)(アピキサバン)に関連するデータを2つの別個の研究中に生成した。
第1の研究に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、27、39、41、52、61、67、76、93、96、105、123、127、140、145、155、167、184及び182ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06360(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、26、36、43、53、60、70、75、93、103、109、121、135、136、153、160、175、185及び192ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において16.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、26、34、44、50、61、70、74、94、103、109、122、135、138、147、162、173、182及び186ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において05.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、33、41、46、57、65、76、79、96、105、116、125、135、138、153、161、169、180及び186ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
この第1の研究では、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251738を使用して普遍的な方法論を使用して速度論を生成し、アピキサバンの補充物の商業的アッセイを行った。

【0315】

第2の研究に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05676(ソフトバージョン3.04.07)において07.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、11、16、32、39、52、62、70、84、95、104、118、123、132、142、156、167、174、183、190及び198ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05980(ソフトバージョン3.04.07)において07.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、16、23、37、48、60、73、80、96、102、111、125、136、146、155、166、186、191、193、205及び211ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において07.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、9、16、29、36、50、61、67、81、94、102、115、123、126、144、156、159、175、183、191及び192ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
この第2の研究では、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ253225を使用して普遍的な方法論を使用して速度論を生成し、アピキサバンの補充物の商業的アッセイを行った。

【0316】

3.10.2自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように7個のサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット3:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット4:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット5:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット6:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- サブセット7:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06360において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたアピキサバンデータ(Eliquis(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0317】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.001
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0318】

3.11 エドキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)
3.11.1 データセット
Lixiana(登録商標)(エドキサバン)に関連して生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00460において2016年1月に測定された72の速度論測定
- 0、16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT00722において2016年6月に測定された72の速度論測定
- 0、16、21、30、39、51、76、100、128、142、155、187、215、245、269、284、322、347、359、380、393、410、426及び436ng/mLが補充された正常血漿プール;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。

【0319】

3.11.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように編成された交差検証によりトレーニングした:
- 学習データ:STA-R(登録商標)AUT00460において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT00722において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。

【0320】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 42ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 29ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 隠れ層
- 16ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.01
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0321】

3.12 エドキサバンのアッセイ(普遍的な方法論又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)
3.12.1 データセット
Lixiana(登録商標)(エドキサバン)に関連するデータを2つの別個の研究中に生成した。
第1の研究に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT00603(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、20、28、40、49、64、74、95、103、109、122、132、144、131、132、157、171、195、191及び201ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT05450(ソフトバージョン3.04.07)において17.10.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、21、28、41、49、62、74、92、102、112、120、133、142、129、133、155、168、188、200及び206ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において21.09.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、21、27、40、49、64、73、90、99、108、122、132、144、130、136、153、169、192、194及び216ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
- STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)において20.09.2017に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、10、21、29、39、48、60、73、81、92、107、115、129、136 .129、127、149、163、181、195及び199ng/mLが補充されたバッチ03.2017;
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製し、-80℃で保管した。
この第1の研究では、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ251738を使用して普遍的な方法論を使用して速度論を生成し、エドキサバンの補充物の商業的アッセイを行った。

【0322】

第2の研究に関して、生成されたデータは以下であった:
- STA-R(登録商標)AUT05676(ソフトバージョン3.04.07)において06.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、12、19、27、36、50、59、70、81、89、100、112、119、136、145、142、163、176、186、198及び207ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT05980(ソフトバージョン3.04.07)において06.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、13、20、29、37、50、61、71、83、88、95、108、115、134、141、137、161、169、176、188及び198ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
- STA-R(登録商標)AUT06366(ソフトバージョン3.04.07)において06.05.2019に63セットの速度論測定
- 正常血漿プール、0、14、20、29、35、52、58、70、77、85、97、107、114、131、140、136、165、170、177、189及び200ng/mLが補充されたバッチ19059RD(コード22824);
- 各試料レベルをn=3で試験した;
- 試料を調製して-80℃で保管し、次に3つの機器において同時に試験した。
この第2の研究では、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaバッチ253225を使用して普遍的な方法論を使用して速度論を生成し、エドキサバンの補充物の商業的アッセイを行った。

【0323】

3.12.2 自動学習モデル
データの編成
自動学習モデルを、以下のように7個のサブセットに分けられた交差検証によりトレーニングした:
- サブセット1:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- サブセット2:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- サブセット3:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- サブセット4:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- サブセット5:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- サブセット6:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- サブセット7:
- 学習データ:
- STA-R(登録商標)AUT05450において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05676において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT05980において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06366(2回)において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))、
- STA-R(登録商標)AUT06399において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
- 検証データ:STA-R(登録商標)AUT00603において生成されたエドキサバンデータ(Lixiana(登録商標))。
最終学習はデータ全体で実施した。

【0324】

自動学習モデルの説明
多層パーセプトロン(ニューラルネットワーク)を、先のセクションに記載される戦略に従いトレーニングした。これは、以下のパラメータ及びハイパーパラメータによって定義された:
- データの前処理:0～1の間で正規化
- 自動学習モデル:多層パーセプトロン
- ハイパーパラメータ:
- 入力層
- 77ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 隠れ層
- 40ニューロン
- 活性化関数:ReLU
- 出力層
- 1ニューロン
- 活性化関数:Identity
- 重み及びバイアス行列の初期化:Xavier Glorot
- 重み及びバイアスの最適化のためのデジタル方式:L-BFGS
- 正則化法:L2、alpha=0.001
- 学習戦略:シード探索
- コスト関数:平均二次誤差

【0325】

4 第2の研究(上記セクション3.からのデータ)の結果
このセクションでは、本明細書に記載された実験方法論を使用して実試料について測定されたデータにおいて、図6のカスケードの様々な自動学習モデルによって得られた性能の結果を列挙する。各サブセクションは、測定されたデータ及び得られた性能について詳述する。単一試行測定が結果を得るために十分であった。しかし、このセクションで実証されるように、3試行測定により性能が改善する可能性がある。

【0326】

4.1 抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出
このセクションでは、上記のセクション3.に記載される方法を使用した抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出について得られた結果を提供する。

【0327】

4.1.1 試験データ
TP、TCA及びフィブリノーゲンの結果に基づき正常と同定された39個の試料、未分化ヘパリン(UFH)で処置された患者からの24個の凍結試料、低分子量ヘパリン(LMWH)で処置された患者からの62個の凍結試料、Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)で処置された患者からの44個の凍結試料、Eliquis(登録商標)(アピキサバン)で処置された患者からの37個の凍結試料、及びLixiana(登録商標)(エドキサバン)で処置された患者からの42個の凍結試料を試験した。

【0328】

データは、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成され、各試料は、n=3で普遍的な方法論を用いて試験された。

【0329】

最後に、248個の試料に対する248セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、248個の試料に対する744セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0330】

4.1.2 結果
Tables 9 and 10(表9及び表10)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合の抗Xa抗凝固薬の存在又は非存在の検出に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。抗Xa抗凝固薬の存在の検出の結果は、分析が単一試行として又は3試行として実施されたかにかかわらず、100%の正確度をもたらした。抗Xa抗凝固薬の非存在の検出の結果は、分析が単一試行として又は3試行として実施されたかにかかわらず、97.44%の正確度をもたらした。

【0331】

【表9】

【0332】

【表10】

【0333】

4.2 抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定
このセクションでは、上記のセクション3.に記載される方法を使用した抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定について得られた結果を提供する。

【0334】

4.2.1 試験データ
未分化ヘパリン(UFH)で処置された患者からの24個の凍結試料、低分子量ヘパリン(LMWH)で処置された患者からの62個の凍結試料、Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)で処置された患者からの44個の凍結試料、Eliquis(登録商標)(アピキサバン)で処置された患者からの37個の凍結試料、及びLixiana(登録商標)(エドキサバン)で処置された患者からの42個の凍結試料を試験した。

【0335】

データは、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成され、各試料はn=3で普遍的な方法論を用いて試験された。

【0336】

最後に、209個の試料に対する209セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、209個の試料に対する627セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0337】

4.2.2 結果
Tables 11 and 12(表11及び表12)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合の抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。抗Xa抗凝固薬のカテゴリーの同定の結果は、単一試行分析が実施された場合に100%の正確度をもたらし、3試行分析が実施された場合に100%の正確度をもたらした。

【0338】

【表11】

【0339】

【表12】

【0340】

4.3 ヘパリンの同定
このセクションでは、上記のセクション3.に記載される方法を使用したヘパリンの同定について得られた結果を提供する。

【0341】

4.3.1 試験データ
未分化ヘパリン(UFH)で処置された患者からの24個の凍結試料及び低分子量ヘパリン(LMWH)で処置された患者からの62個の凍結試料を試験した。

【0342】

データは、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成され、各試料はn=3で普遍的な方法論を用いて試験された。

【0343】

最後に、86個の試料に対する86セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、86個の試料に対する258セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0344】

4.3.2 結果
Tables 13 and 14(表13及び表14)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合のヘパリンの同定に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。ヘパリンの同定の結果は、単一試行分析が実施された場合に91.86%の正確度をもたらし、3試行分析が実施された場合に90.70%の正確度をもたらした。

【0345】

【表13】

【0346】

【表14】

【0347】

4.4 未分化ヘパリンのアッセイ
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、上記のセクション3.に記載される方法を使用して得られた患者からの試料に対するUFHの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R2が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0348】

4.4.1 試験データ
未分化ヘパリン(UFH)で処置された患者からの24個の凍結試料を試験した。

【0349】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いて、STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で普遍的な方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0350】

最後に、24個の試料に対する24セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、24個の試料に対する72セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0351】

4.4.2 結果
図17は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたUFHの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたUFHの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.04x-0.03及び決定係数R²=0.9851の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.04x-0.03及び係数R²=0.9856の直線が得られた。

【0352】

4.5 低分子量ヘパリンのアッセイ
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明を使用して得られた患者からの試料に対するLMWHの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0353】

4.5.1 試験データ
低分子量ヘパリン(LMWH)で処置された患者からの62個の凍結試料を試験した。

【0354】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いて、STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で普遍的な方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0355】

最後に、62個の試料に対する62セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、62個の試料に対する186セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0356】

4.5.2 結果
図18は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたLMWHの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたLMWHの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.02x-0.02及び決定係数R²=0.996の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.027x-0.03及び決定係数R²=0.9971の直線が得られた。

【0357】

4.6 抗Xa DOACの同定(最適化されたDOAC方法論)
このセクションでは、本文書に記載される本発明を使用した抗Xa DOACの同定について得られた結果を提供する。

【0358】

4.6.1 試験データ
Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)で処置された患者からの62個の凍結試料、Eliquis(登録商標)(アピキサバン)で処置された患者からの45個の凍結試料、及びLixiana(登録商標)(エドキサバン)で処置された患者からの56個の凍結試料を試験した。

【0359】

データは、STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成され、各試料はn=3で最適化されたDOAC方法論を用いて試験された。

【0360】

最後に、163個の試料に対する163セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、163個の試料に対する489セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0361】

4.6.2 結果
Tables 15 and 16(表15及び表16)は、試験データセットに単一試行分析を実施した場合と、3試行で分析を実施した場合の抗Xa DOACの同定に関連付けられる混同行列をそれぞれ提供する。抗Xa DOACの同定の結果は、単一試行分析が実施された場合に92.64%の正確度をもたらし、3試行分析が実施された場合に97.55%の正確度をもたらした。

【0362】

【表15】

【0363】

【表16】

【0364】

4.7 リバーロキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明(最適化されたDOAC方法論)を使用して得られた患者からの試料に対するリバーロキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0365】

4.7.1 試験データ
Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)で処置された患者からの62個の凍結試料を試験した。

【0366】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いて、STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で最適化されたDOAC方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0367】

最後に、62個の試料に対する62セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、62個の試料に対する186セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0368】

4.7.2 結果
図19は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたリバーロキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたリバーロキサバンの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.05x+19.65及び決定係数R²=0.991の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.04x+20.3及び決定係数R²=0.9934の直線が得られた。

【0369】

4.8 リバーロキサバンのアッセイ(普遍的な方法論又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明(普遍的な方法論)を使用して得られた患者からの試料に対するリバーロキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0370】

4.8.1試験データ
Xarelto(登録商標)(リバーロキサバン)で処置された患者からの44個の凍結試料を試験した。

【0371】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で普遍的な方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0372】

最後に、44個の試料に対する44セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、44個の試料に対する132セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0373】

4.8.2 結果
図20は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたリバーロキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたリバーロキサバンの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.04x+1.74及び決定係数R²=0.985の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.032x+1.99及び係数R²=0.989の直線が得られた。

【0374】

4.9 アピキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明(最適化されたDOAC方法論)を使用して得られた患者からの試料に対するアピキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0375】

4.9.1 試験データ
Eliquis(登録商標)(アピキサバン)で処置された患者からの45個の凍結試料を試験した。

【0376】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で最適化されたDOAC方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0377】

最後に、45個の試料に対する45セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、45個の試料に対する135セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0378】

4.9.2 結果
図21は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたアピキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたアピキサバンの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.14x-6.73及び決定係数R²=0.9945の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.13x-5.46及び決定係数R²=0.9958の直線が得られた。

【0379】

4.10 アピキサバンのアッセイ(普遍的な方法論又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明(普遍的な方法論)を使用して得られた患者からの試料に対するアピキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0380】

4.10.1 試験データ
Eliquis(登録商標)(アピキサバン)で処置された患者からの37個の凍結試料を試験した。

【0381】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で普遍的な方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0382】

最後に、37個の試料に対する37セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、37個の試料に対する111セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0383】

4.10.2 結果
図22は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたアピキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたアピキサバンの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=1.041x-2.66及び決定係数R²=0.9792の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=1.041x-2.41及び係数R²=0.9877の直線が得られた。

【0384】

4.11 エドキサバンのアッセイ(最適化されたDOAC方法論)
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明(最適化されたDOAC方法論)を使用して得られた患者からの試料に対するエドキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0385】

4.11.1 試験データ
Lixiana(登録商標)(エドキサバン)で処置された患者からの56個の凍結試料を試験した。

【0386】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いて、STA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で最適化されたDOAC方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論による参照方法を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0387】

最後に、56個の試料に対する56セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、56個の試料に対する168セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0388】

4.11.2 結果
図23は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたエドキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたエドキサバンの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=0.905x+12.35及び決定係数R²=0.9853の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=0.93x+8.18及び決定係数R²=0.9881の直線が得られた。

【0389】

4.12 エドキサバンのアッセイ(普遍的な方法論又は「普遍的な方法論に基づく改善された方法論」)
このセクションでは、標準的なアプローチ(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xa市販キット)を使用して測定された濃度と比較した、本文書に記載される本発明(普遍的な方法論)を使用して得られた患者からの試料に対するエドキサバンの濃度のアッセイの結果を提供する。結果は、線形回帰の傾きが0.9～1.1の間に含まれ、決定係数R²が0.95以上であった場合(CLSI EP9-A2からの判断基準)に良好と判断された。

【0390】

4.12.1 試験データ
Lixiana(登録商標)(エドキサバン)で処置された患者からの42個の凍結試料を試験した。

【0391】

データは、以下の条件下でSTA(登録商標)-Liquid Anti-Xa(バッチ251187)を用いてSTA-R(登録商標)AUT06399(ソフトバージョン3.04.07)で生成された:
- 各試料をn=3で普遍的な方法論を用いて試験した;
- 各試料をn=2で参照方法(STA(登録商標)-Liquid Anti-Xaの商業的方法論)を用いて試験した。したがって、方法の比較に使用した参照濃度は、試料の凍結後に検証された濃度であった。

【0392】

最後に、42個の試料に対する42セットの速度論測定に単一試行分析を実施し、42個の試料に対する126セットの速度論測定に3試行分析を実施した。

【0393】

4.12.2 結果
図24は、試験データセットに対する本文書に記載されるアプローチを使用して測定されたエドキサバンの濃度のアッセイの、標準的なアプローチを使用して測定されたエドキサバンの濃度の比較の結果を提供する。これらの比較により、単一試行分析が実施された場合に式y=0.9431x+4.51及び決定係数R²=0.9968の直線が得られ、3試行分析が実施された場合に式y=0.9442x+4.26及び係数R²=0.9962の直線が得られた。

【0394】

阻害剤
I 第Xa因子の阻害剤
Tables 17 and 18(表17及び表18)は、現在公知の第Xa因子の天然及び合成阻害剤をそれぞれ列挙する。

【0395】

【表17】

【0396】

【表18】

【0397】

II 第IIa因子の阻害剤
Tables 19 and 20(表19及び20)は、現在公知の第IIa因子の天然及び合成阻害剤をそれぞれ列挙する。

【0398】

【表19】

【0399】

【表20】

【0400】

(参考文献)

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図21A】

【図21B】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】