(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-22
(45)【発行日】2024-04-01
(54)【発明の名称】改変Ｔ細胞、その調製方法および使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240325BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240325BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20240325BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240325BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240325BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240325BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240325BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240325BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240325BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
C12N5/0783
C12N15/09 110
C12N15/113 140Z
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
C12N15/13
C12N15/12
【請求項の数】
18
(21)【出願番号】P 2021538886
(86)(22)【出願日】2019-09-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-17
(86)【国際出願番号】 CN2019106109
(87)【国際公開番号】W WO2020057486
(87)【国際公開日】2020-03-26
【審査請求日】2021-05-10
(31)【優先権主張番号】201811080440.7
(32)【優先日】2018-09-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】520176566
【氏名又は名称】中国科学院動物研究所
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＺＯＯＬＯＧＹ，ＣＨＩＮＥＳＥ ＡＣＡＤＥＭＹ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．５， １ Ｂｅｉｃｈｅｎ Ｗｅｓｔ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１０１， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】王 皓毅
(72)【発明者】
【氏名】張 興穎
(72)【発明者】
【氏名】程 晨
(72)【発明者】
【氏名】唐 娜
(72)【発明者】
【氏名】李 娜
【審査官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１７／００２０９２２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１６－５４０５１１（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ ５／００－ ５／２８
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
改変Ｔ細胞を調製するためのインビトロの方法であって、Ｔ細胞における少なくとも１種の抑制タンパク質の発現を低減または消失させる工程を含み、抑制タンパク質が、ＴＧＦβ受容体であり、かつ前記方法が、Ｔ細胞におけるＰＤ１の発現を低減または消失させる工程をさらに含む、インビトロの方法。
【請求項2】
抑制タンパク質がＴＧＦＢＲＩＩである、請求項１に記載のインビトロの方法。
【請求項3】
前記Ｔ細胞が、外来性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である、請求項１または２に記載のインビトロの方法。
【請求項4】
前記低減または消失が、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミル、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲシステムによって達成される、請求項１～３のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項5】
前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである、請求項４に記載のインビトロの方法。
【請求項6】
前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、配列番号２８～３１からなる群から選択される細胞内のヌクレオチド配列の１つまたは複数を標的とする、請求項５に記載のインビトロの方法。
【請求項7】
ＴＣＲまたはＣＡＲが、腫瘍関連抗原に対する抗原結合ドメインを含む、請求項３～６のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項8】
腫瘍関連抗原が、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－胎児グロブリン（ＡＦＰ）、レクチン応答性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インシュリン成長因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異性ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチン・エクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）、ならびにＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）からなる群から選択される、請求項７に記載のインビトロの方法。
【請求項9】
抗原結合性ドメインが、モノクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、シングルドメイン抗体、抗体単鎖可変領域、およびこれらの抗原結合性断片から選択される、請求項７または８に記載のインビトロの方法。
【請求項10】
ＣＡＲが、メソテリン、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対するｓｃＦｖを含む、請求項３～９のいずれか一項に記載のインビトロの方法。
【請求項11】
ＣＡＲが、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のインビトロの方法。
【請求項12】
請求項１～１１のいずれか一項に記載のインビトロの方法によって調製される改変Ｔ細胞。
【請求項13】
がんの処置のための医薬の製造における、請求項１２に記載の改変Ｔ細胞の使用。
【請求項14】
がんを処置するための医薬組成物であって、請求項１２に記載の改変Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項15】
がんが、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎がん、膀胱がん、乳がん、肝がん、リンパ腫、血液系腫瘍、頭頸部がん、グリア系腫瘍、胃がん、上咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、および骨肉腫からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項16】
がんが、骨がん、膵がん、皮膚がん、前立腺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮体がん、腟がん、腟がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、およびアスベスト誘発性がんを含めた環境誘発性がん、ならびにこれらのがんの組合せからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項17】
がんが、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎がん、膀胱がん、乳がん、肝がん、リンパ腫、血液系腫瘍、頭頸部がん、グリア系腫瘍、胃がん、上咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、および骨肉腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項18】
がんが、骨がん、膵がん、皮膚がん、前立腺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮体がん、腟がん、腟がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、およびアスベスト誘発性がんを含めた環境誘発性がん、ならびにこれらのがんの組合せからなる群から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、遺伝子編集および腫瘍免疫療法の分野に関する。特に、本発明は、遺伝子編集によってＣＡＲ－Ｔ細胞などの改変Ｔ細胞を調製するための方法ならびに該方法によって調製される改変Ｔ細胞およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｔ細胞は、抗腫瘍免疫で重要な役割を果たしている。しかし、腫瘍を有する患者では、局所特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の含量が非常に低い。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）でＣＴＬを取得し、増殖させることは難しく、ＣＴＬの親和性が低いため、腫瘍の臨床処置へのその適用が制限されている。
【0003】
Ｔ細胞の養子移入は、近年高い注目をあびている特異的かつ低毒性の抗腫瘍方法である。例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によるＴ細胞の遺伝的改変は、腫瘍特異的Ｔ細胞を生み出すのに最も一般的に用いられている方法である。
【0004】
ＴＣＲ遺伝子導入技術は、担体としてレトロウイルスまたはレンチウイルスを用い、当初のＴ細胞を抗原特異的ＴＣＲで改変するための遺伝子操作技術を使用して、腫瘍応答性のＴ細胞由来のＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖をクローニングし、それによって、Ｔ細胞が腫瘍細胞を特異的に特定および殺滅できるようにし、腫瘍に対するＴ細胞の親和性を増大させるものである。ＴＣＲ遺伝子導入技術は、患者由来の自家Ｔ細胞を改変するのに用いられる。インビトロでの増殖の後、特異的かつ効率的な認識能を有する多数のＴ細胞が得られ、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗腫瘍作用を発揮させるため、養子注入により患者に戻される。
【0005】
ＣＡＲは、細胞外ドメイン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインからなり、細胞外ドメインは、典型的には、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来し、細胞内ドメインは、１個または複数の共刺激ドメインまたはシグナリングドメインを有する（ＫａｋａｒｌａおよびＧｏｔｔｓｃｈａｌｋ、２０１４）。ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、ＣＤ１９陽性悪性血液腫瘍の処置における初期の臨床研究では成功していた（Ｄａｖｉａｌａら、２０１４；Ｌｅｅら、２０１５；Ｍａｕｄｅら、２０１４）が、固形腫瘍の不均一性が大きく、腫瘍微小環境が複雑であり、ＣＡＲ－Ｔ細胞の浸入が難しいため、ＣＡＲ－Ｔ細胞で固形腫瘍抗原を標的にすることに対する臨床応答は限定的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
したがって、腫瘍、特に固形腫瘍を抑制または殺滅するのに有効なＴ細胞を取得する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0007】
一態様において、本発明は、改変Ｔ細胞を調製するための方法であって、Ｔ細胞における少なくとも１種の抑制タンパク質の発現を低減または消失させる工程を含み、抑制タンパク質がＴ細胞表面抑制受容体および／またはＴ細胞疲弊関連タンパク質であり、例えば、抑制タンパク質が、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの任意の組合せから選択される方法を提供する。
【0008】
一部の実施形態では、前記Ｔ細胞が、外来性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である。
【0009】
一部の実施形態では、前記低減または消失が、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミル、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲシステムによって達成される。
【0010】
一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。
【0011】
一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、配列番号１～２１および２８～３１からなる群から選択される細胞内のヌクレオチド配列の１つまたは複数を標的とする。
【0012】
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはＣＡＲが、腫瘍関連抗原に対する抗原結合ドメインを含む。
【0013】
一部の実施形態では、腫瘍関連抗原が、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－胎児グロブリン（ＡＦＰ）、レクチン応答性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異性抗原（ｐｒｏｓｔａｔａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（Ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ（ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インシュリン成長因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異性ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）、ならびにＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）からなる群から選択される。
【0014】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、モノクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、シングルドメイン抗体、抗体単鎖可変領域、およびこれらの抗原結合性断片から選択される。
【0015】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、メソテリン、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対するｓｃＦｖを含む。
【0016】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。
【0017】
別の態様では、本発明は、本発明の方法によって調製される改変Ｔ細胞を提供する。
【0018】
別の態様では、本発明は、Ｔ細胞の少なくとも１種の抑制タンパク質の発現が、改変されていないＴ細胞と比較して低減または消失しており、抑制タンパク質がＴ細胞表面抑制受容体および／またはＴ細胞疲弊関連タンパク質であり、例えば、抑制タンパク質が、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの任意の組合せから選択される、改変Ｔ細胞を提供する。
【0019】
一部の実施形態では、前記Ｔ細胞が、外来性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である。
【0020】
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはＣＡＲが、腫瘍関連抗原に対する抗原結合ドメインを含む。
【0021】
一部の実施形態では、腫瘍関連抗原が、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－胎児グロブリン（ＡＦＰ）、レクチン応答性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異性抗原（ｐｒｏｓｔａｔａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン（Ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ（ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インシュリン成長因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異性ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチン・エクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）、ならびにＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）からなる群から選択される。
【0022】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、モノクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、シングルドメイン抗体、抗体単鎖可変領域、およびこれらの抗原結合性断片から選択される。
【0023】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、メソテリン、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに対するｓｃＦｖを含む。
【0024】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。
【0025】
別の態様では、本発明は、がんの処置のための医薬の製造における、本発明の改変Ｔ細胞の使用を提供する。
【0026】
別の態様では、本発明は、がんを処置するための医薬組成物であって、本発明の改変Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【0027】
本発明の様々な態様の実施形態において、がんは、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎がん、膀胱がん、乳がん、肝がん、リンパ腫、血液系腫瘍、頭頸部がん、グリア系腫瘍、胃がん、上咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、および骨肉腫からなる群から選択される。本発明の方法または医薬組成物で処置できる他のがんの例には、骨がん、膵がん、皮膚がん、前立腺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮体がん、腟がん、腟がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂腎がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、およびアスベスト誘発性がんを含めた環境誘発性がん、ならびにこれらのがんの組合せが含まれる。好ましくは、がんは固形腫瘍がんである。一部の実施形態では、がんは、肺扁平上皮癌などの肺がんである。一部の特定の実施形態では、がんは、卵巣がんである。一部の特定の実施形態では、がんは、結腸がんである。
【0028】
別の態様では、本発明は、改変Ｔ細胞を調製するための、本発明の方法で使用されるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図3】図３は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＴＩＧＩＴ遺伝子ノックアウトを有するＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図5】図５は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＢＴＬＡ遺伝子ノックアウトを有するＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図7】図７は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＣＤ１６０遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図9】図９は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、２Ｂ４遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図10】図１０は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、２Ｂ４遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉおよびＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉに及ぼす効果を示す。
【図11】図１１は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＣＤ２００ＲがノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図12】図１２は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＣＤ２００ＲがノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉおよびＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉに及ぼす効果を示す。
【図13】図１３は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＢＡＴＦ遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図14】図１４は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＢＡＴＦ遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉおよびＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉに及ぼす効果を示す。
【図15】図１５は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＧＡＴＡ３遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図16】図１６は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＧＡＴＡ３がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、標的細胞ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉおよびＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉに及ぼす効果を示す。
【図18】図１８は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、Ａ２ａＲがノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図23】図２３は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＬＡＹＮ遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞による、標的細胞ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉの特異的溶解を示す。
【図24】図２４は、様々なエフェクター：標的比および処置時間における、ＬＡＹＮ遺伝子がノックアウトされたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞が標的細胞ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉおよびＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉに及ぼす効果を示す。
【図33】図３３は、ＴＧＦβ１が、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の機能に負の影響を及ぼすことを示す。Ａ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が培養培地に添加されているまたは添加されていない、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＲＬ５８２６腫瘍細胞特異的溶解能力。Ｂ～Ｃ：ＣＲＬ５８２６細胞と共に２４時間インキュベーションした後に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が培養培地に添加された場合または添加されていない場合における、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞によって放出されたＩＬ－２（Ｂ）およびＩＦＮ－γ（Ｃ）の濃度。Ｔ：Ｔ細胞；Ｐ４：Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＣＲＬ：ＣＲＬ５８２６。
【図34】図３４は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞が機能的なＴｒｅｇに変わるのを、ＴＧＦβ１が誘導することができることを示す。Ａ：ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞と共に３日間インキュベートした後、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培養培地に添加するまたは添加しない、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞上でのＦＯＸＰ３の発現。Ｂ：Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を抑制するＴＧＦβ１の能力。５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培地に添加してまたは添加せずに、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞と共に３日間培養した。増殖抑制アッセイの前に、ＧＦＰ陽性のＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＡＣＳでソーティングした。Ｃ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培養培地に添加するかまたは添加せずに、ＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞と共に３日間培養したＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解能力。細胞溶解能力の決定の前に、ＧＦＰ陽性のＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソーティングした。
【図35】図３５は、抗原によって誘導される増殖能力およびＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞状態にＴＧＦβ１が影響を及ぼすことを示す。Ａ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が培養培地に添加された場合または添加されていない場合において、腫瘍細胞は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を誘導した。Ｂ：培地に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加した、または添加しなかった後における、ＣＲＬ５８２６とのインキュベーションの４日後のＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の典型的な画像。Ｐ４：Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞。
【図36】図３６は、ＴＧＦＢＲ ＩＩ ｓｇＲＮＡ選択を示す。Ａ：エレクトロポレーションでｓｇＲＮＡ－１／４／５／８を導入したＨｅｐＧ２におけるＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウト（ＫＯ）の効率を、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）およびＴＩＤＥで検出した。Ｂ：条件を最適化させた後、エレクトロポレーションでｓｇＲＮＡ－８を導入したＨｅｐＧ２におけるＴＧＦＢＲ ＩＩのＫＯ効率を、ＦＣＭおよびＴＩＤＥで試験した。
【図37】図３７は、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３をノックアウトすると、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果が改善されることを示す。Ａ：Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞特異的溶解能力；０、２．５、５または１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培養培地に添加した。エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）は、０．２５：１である。Ｂ～Ｃ：腫瘍細胞との培養２４時間後における、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培地に添加したまたは添加していない、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞によって放出されたＩＬ－２（Ｂ）およびＩＦＮ－γ（Ｃ）の濃度。
【図38】図３８は、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３をノックアウトすると、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果が改善されることを示す。Ａ：培養培地に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加して、または添加しないで、腫瘍細胞と３日間インキュベートした後における、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現。Ｂ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培養培地に添加して、または添加しないで、ＣＲＬ５８２６腫瘍細胞と共に３日間培養したＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞溶解性能力。細胞溶解アッセイの前に、ＧＦＰ陽性のＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソーティングした。
【図39】図３９は、ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトが、ＴＧＦβ１の存在下で、抗原によって誘導された増殖能力およびＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞状態を有意に改善したことを示す。Ａ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が培養培地に添加された場合または添加されていない場合における、腫瘍細胞によって誘導されたＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖。Ｂ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含むまたは含まない培養培地で腫瘍細胞と４日間インキュベートした後における、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の典型的な画像。ＦＫＯ：ＦＯＸＰ３ノックアウト；ＴＫＯ：ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウト。
【図40】図４０は、遺伝子を編集されたＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の成長曲線、ＧＦＰ陽性細胞の比率、およびＴ細胞サブポピュレーションの分析を示す。Ａ：インビトロ培養後におけるＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ Ｐ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞の成長曲線。Ｂ：インビトロ培養後におけるＰ４ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＧＦＰ陽性細胞の割合。Ｃ：エレクトロポレーションの６日後および１５日後におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞ならびにＴＧＦＢＲＩＩ ＫＯ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞中のＴ細胞サブセットの分析。Ｐ４：Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞；ＦＫＯ：ＦＯＸＰ３ノックアウト；ＴＫＯ：ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウト。
【図41】図４１は、ＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３ノックアウトがＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を改善することを示す。Ａ：０、１．２５、５、および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培養培地に添加した場合のＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞特異的溶解能力。エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）は１：１である。Ｂ：培地に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含む場合または含まない場合における、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＦＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞特異的溶解能力。エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）は、１：１である。Ｃ～Ｆ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含むまたは含まない培地で腫瘍細胞と３日間インキュベーションした後における、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＦＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３（Ｃ）、ＩＬ－２（Ｄ）、ＩＦＮ－γ（Ｅ）、およびＧＺＭＢ（Ｆ）の相対ｍＲＮＡ発現レベル。ｍＲＮＡ抽出前にＧＦＰ陽性のＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソーティングした。ｃｔｒｌ：対照；ＦＫＯ：ＦＯＸＰ３ ＫＯ；ＴＫＯ：ＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ；ＣＲＬ：ＣＲＬ５８２６；ｗ／ｏ：無添加。
【図42】図４２は、ＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３ノックアウトが、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を改善することを示す。Ａ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加したまたは添加していない培地で腫瘍細胞と４８時間インキュベーションした後における、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって放出されたＩＬ－２（左）およびＩＦＮ－γ（右）の濃度。Ｂ：培地に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含む場合または含まない場合における、腫瘍細胞によって誘導されたＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖。Ｃ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含むまたは含まない培地での腫瘍細胞とのインキュベーション８日目における、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的溶解能力。ｃｔｒｌ：対照；ＦＫＯ：ＦＯＸＰ３ ＫＯ；ＴＫＯ：ＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ；ＣＲＬ：ＣＲＬ５８２６。
【図43】図４３は、ＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３ノックアウトがＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を改善することを示す。Ａ：０、１．２５、５、および１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を培養培地に添加した場合における、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞特異的溶解能力。エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）は１：１である。Ｂ：培地に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含む場合または含まない場合における、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＦＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍細胞特異的溶解能力。エフェクター：標的比（Ｅ：Ｔ）は１：１である。Ｃ～Ｆ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含むまたは含まない培地で腫瘍細胞と３日間インキュベーションした後における、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＦＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＩＬ－２（Ｃ）、ＩＦＮ－γ（Ｄ）、ＧＺＭＢ（Ｅ）、およびＧＺＭＢ（Ｆ）の相対ｍＲＮＡ発現レベル。ｍＲＮＡ抽出の前に、ＧＦＰ陽性のＣＡＲ－Ｔ細胞をＦＡＣＳによってソーティングした。ｃｔｒｌ：対照；ＦＫＯ：ＦＯＸＰ３ ＫＯ；ＴＫＯ：ＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ；ＣＲＬ：ＣＲＬ５８２６；ｗ／ｏ：無添加。
【図44】図４４は、ＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３ノックアウトがＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を改善することを示す。Ａ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１ありまたはなしで腫瘍細胞と４８時間インキュベーションした後における、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって放出されたＩＬ－２（左）およびＩＦＮ－γ（右）の濃度。Ｂ：培地に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含む場合または含まない場合における、腫瘍細胞によって誘導されたＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖。Ｃ：５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含むまたは含まない培地での腫瘍細胞とのインキュベーション８日目における、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞およびＴＧＴＢＲ ＩＩ／ＦＯＸＰ３ ＫＯ ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的溶解能力。ｃｔｒｌ：対照；ＦＫＯ：ＦＯＸＰ３ ＫＯ；ＴＫＯ：ＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ；ＣＲＬ：ＣＲＬ５８２６。
【発明を実施するための形態】
【0030】
Ｉ．定義
本発明において、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、他に明記しない限り、当業者によって通常に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語および検査法は、当該分野で広く使用されている用語および慣例ステップのものである。例えば、本発明で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン技術は、当業者によく知られており、以下の文書：Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称する）により完全に記載されている。一方、本発明のよりよい理解のために、関連用語の定義および説明を以下に示す。
本発明において、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、他に明記しない限り、当業者によって通常に理解される意味を有する。また、本明細書で使用されるタンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学、免疫学に関連する用語および検査法は、当該分野で広く使用されている用語および慣例ステップのものである。例えば、本発明で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローン技術は、当業者によく知られており、以下の文書：Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989（以下、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と称する）により完全に記載されている。一方、本発明のよりよい理解のために、関連用語の定義および説明を以下に示す。
【0031】
本明細書で使用する場合、「ゲノム」は、核に存在する染色体ＤＮＡだけでなく、細胞の細胞内構成要素（例えば、ミトコンドリア、色素体）に存在するオルガネラＤＮＡも包含する。
【0032】
配列に関する「外因性」は、異なる種に由来する配列を意味するか、同じ種に由来する場合、意図的なヒト介入によって組成および／または位置がその天然形態から有意に変化している配列を指す。
【0033】
「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、または「核酸断片」は、互換的に使用され、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖のＲＮＡポリマーまたはＤＮＡポリマーである。ヌクレオチドは、それらの一文字名によって以下の通りに表される。「Ａ」は、アデノシンまたはデオキシアデノシン（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡに対応する）であり、「Ｃ」は、シチジンまたはデオキシシチジンを意味し、「Ｇ」は、グアノシンまたはデオキシグアノシンを意味し、「Ｕ」は、ウリジンを表し、「Ｔ」は、デオキシチミジンを意味し、「Ｒ」は、プリン（ＡまたはＧ）を意味し、「Ｙ」は、ピリミジン（ＣまたはＴ）を意味し、「Ｋ」は、ＧまたはＴを意味し、「Ｈ」は、ＡまたはＣまたはＴを意味し、「Ｉ」はイノシンを意味し、「Ｎ」は任意のヌクレオチドを意味する。
【0034】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに、本発明で互換的に使用される。これらの用語は、天然存在のアミノ酸ポリマーと同様に、１個または複数アミノ酸残基が、対応する天然存在のアミノ酸の人工の化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「アミノ酸配列」、および「タンパク質」は、修飾された形態も含むことができ、修飾された形態には、グリコシル化、脂質ライゲーション、硫酸化、グルタミン酸残基のγカルボキシル化、およびＡＤＰリボシル化が含まれるが、これらに限定されない。
【0035】
本発明で使用される場合、「発現コンストラクト」は、生物における目的のヌクレオチド配列の発現に適した組換えベクターなどのベクターを指す。「発現」は、機能的な産物の生成を指す。例えば、ヌクレオチド配列の発現は、ヌクレオチド配列の転写（例えば、ｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡを生成する転写）および／またはＲＮＡから前駆体または成熟タンパク質への翻訳を指すことができる。
【0036】
本発明の「発現コンストラクト」は、直鎖核酸断片でも、環状プラスミドでも、ウイルスベクターでも、または、一部の実施形態では、翻訳が可能なＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）でもよい。
【0037】
本発明の「発現コンストラクト」は、様々な起源に由来する調節配列および目的のヌクレオチド配列、または同じ供給源に由来するが、自然界で通常に存在するものと異なるように配置された調節配列および目的のヌクレオチド配列を含むことができる。
【0038】
「調節配列」および「調節エレメント」は、上流（５’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列、コード配列の中または下流（３’非コード配列）を指すのに互換的に使用され、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング、または安定性もしくは翻訳に影響を及ぼす。
【0039】
調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を含むことができるが、これに限定されない。
【0040】
「プロモーター」は、別の核酸断片の転写を制御することができる核酸断片を指す。本発明の一部の実施形態では、プロモーターは、それがその細胞に由来するか否かに関係なく、細胞で遺伝子の転写を制御することができるプロモーターである。
【0041】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結する」という用語は、調節エレメント（例えば、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写終結配列など）を核酸配列（例えば、コード配列またはオープンリーディングフレーム）に、ヌクレオチド配列の転写が転写調節エレメントによって制御および調節されるように連結することを指す。核酸分子に調節エレメント領域を作動可能に連結するための技術は、当技術分野で知られている。
【0042】
ゲノム編集としても知られている「遺伝子編集」は、生物のゲノムでＤＮＡを挿入するか、欠失するか、または置き換えるのに工学的に操作されたヌクレアーゼ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）または「分子はさみ」を用いる。遺伝子編集は、ゲノム中の所望の位置に、部位特異的な二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらし、次いで、ＤＳＢを修復する過程で、所望のＤＮＡ挿入、欠失、または置換を導入する。典型的には、メガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＣＲＩＳＰＲシステムが遺伝子編集に使用される。
【0043】
「メガヌクレアーゼ」は、通常は任意の所与のゲノムあたり１つしかない大きな認識部位（１２～４０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ配列）を有するデオキシリボヌクレアーゼ酵素の１クラスである。例えば、メガヌクレアーゼＩ－ＳｃｅＩによって同定される１８ｂｐ配列は、ヒトゲノムより２０倍より大きいゲノムで平均１回の頻度で、時おり、存在する。
【0044】
「Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ」は、ＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって調製される人工の制限酵素である。ＺＦＮが１つのＺｎフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、個々のＺｎフィンガーの３～６回の反復を含有し、そのそれぞれが、例えば３ｂｐの配列を同定することができる。
【0045】
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」は、特定のＤＮＡ配列を切断するように工学的に操作することができる制限酵素であって、典型的には、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）のＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって調製される制限酵素である。ＴＡＬＥは、ほとんどいかなるものであっても所望のＤＮＡ配列に結合するように工学的に操作することができる。
【0046】
「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）」は、短い反復を含有する原核生物ＤＮＡセグメントである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、例えばプラスミドおよびファージ中に存在するものなどの外来の遺伝エレメントに対する抵抗性を与える原核生物免疫システムであり、この抵抗性が獲得免疫をもたらす。このシステムでは、Ｃａｓタンパク質または類似のタンパク質が、ＲＮＡの誘導の下、外来の核酸を切断する。
【0047】
本明細書で使用する場合、用語「ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ」は、一般に天然存在のＣＲＩＳＰＲシステムに存在するヌクレアーゼ、およびそれらの改変型、変異型（ニッカーゼ突然変異体を含む）、または触媒活性断片を指す。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡおよび適宜ｔｒａｃｒＲＮＡなどのガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡのような人工のｇＲＮＡと相互作用することによって、標的核酸を同定および／または切断することができる。この用語は、細胞内での遺伝子編集を可能にするＣＲＩＳＰＲシステムに基づくいかなるヌクレアーゼも包含する。
【0048】
「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」および「Ｃａｓ９」は、本明細書で互換的に使用され、Ｃａｓ９タンパク質またはその断片（例えば、Ｃａｓ９の活性ＤＮＡ切断ドメインおよび／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含むタンパク質）を含むＲＮＡ依存性ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９は、ガイドＲＮＡの誘導に従ってＤＮＡ標的配列を標的にし、切断して、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を形成するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートおよびそれらの関連システム）ゲノム編集システムの構成要素である。
【0049】
「ガイドＲＮＡ」および「ｇＲＮＡ」は、本明細書で互換的に使用され、一般に、部分的に相補して複合体を形成するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子からなり、ｃｒＲＮＡは、標的配列とハイブリッド形成するのに十分に標的配列と相補的である配列を含み、標的配列に特異的に結合するようにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓ９＋ｃｒＲＮＡ＋ｔｒａｃｒＲＮＡ）を方向付ける。しかし、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの特徴を同時に含有するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を設計することが、当技術分野で知られている。
【0050】
Ｔ細胞抗原受容体としても知られている「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」は、Ｔ細胞が抗原ペプチド－ＭＨＣ分子を特異的に同定し、それに結合するのに使用する分子構造を指し、通常は、ＣＤ３分子との複合体形態でＴ細胞表面にある。ほとんどのＴ細胞のＴＣＲは、アルファ鎖およびベータペプチド鎖からなり、少数のＴ細胞のＴＣＲは、ガンマ鎖とデルタペプチド鎖からなる。
【0051】
人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られている「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、免疫エフェクター細胞に特定の特性を与えることができる人工的に設計された受容体である。一般に、この技術は、腫瘍面抗原を特異的に認識する能力をＴ細胞に与えるのに使用される。このようにして、腫瘍を標的にする多数の細胞を生成することができる。
【0052】
本明細書で使用する場合、「対象」は、本発明の方法または医薬組成物によって処置することができる疾患（例えば、がん）を有するかまたは罹患しやすい生物を指す。非限定的な例には、ヒト、ウシ、ラット、マウス、イヌ、サル、ヤギ、ヒツジ、ウシ、シカ、および他の非哺乳動物が含まれる。好ましい実施形態では、対象がヒトである。
【0053】
ＩＩ．改変Ｔ細胞を調製する方法
第１の態様では、本発明は、改変Ｔ細胞を調製するための方法であって、Ｔ細胞における少なくとも１種の抑制タンパク質の発現を低減（ノックダウン）または消失（ノックアウト）させるステップを含む方法を提供する。
第１の態様では、本発明は、改変Ｔ細胞を調製するための方法であって、Ｔ細胞における少なくとも１種の抑制タンパク質の発現を低減（ノックダウン）または消失（ノックアウト）させるステップを含む方法を提供する。
【0054】
本明細書で使用する場合、Ｔ細胞の「抑制タンパク質」は、Ｔ細胞活性の抑制に関係するタンパク質を指す。一部の実施形態では、抑制タンパク質は、Ｔ細胞表面抑制受容体またはＴ細胞疲弊関連タンパク質から選択される。
【0055】
一部の実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体が、腫瘍細胞または周囲の間質細胞の表面に発現されるリガンドを認識するＴ細胞表面受容体であってもよい。そのような受容体の例には、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、ＲＡＲＡ、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0056】
一部の他の実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体が、腫瘍微小環境中に存在する、アデノシンおよびエピネフリンなどの分泌物またはＩＬ－１０およびＴＧＦβなどのサイトカインを認識する受容体でもよい。そのような分泌物またはサイトカインは、Ｔ細胞の腫瘍殺滅効果に影響を及ぼす可能性がある。そのような受容体の例には、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＴＧＦＢＲＩＩ、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0057】
本発明者らは、驚くべきことに、ＴＧＦβシグナリング経路を抑制することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用のＴ細胞の腫瘍殺滅能力を強化できることを見出した。そのため、一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体がＴＧＦβ受容体である。一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体が、ＴＧＦＢＲＩＩなど、抑制的なサイトカインＴＧＦβ１を認識するＴ細胞受容体である。加えて、本発明は、Ｔ細胞のＦＯＸＰ３など、ＴＧＦβシグナリング経路に関係するタンパク質の発現の低減（ノックダウン）または消失（ノックアウト）も包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）および／またはＦＯＸＰ３の発現を低減（ノックダウン）または消失（ノックアウト）させる。
【0058】
一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質が、Ｔ細胞疲弊に関係する転写因子、例えば、疲弊したＴ細胞中でその発現が有意に上方制御されている転写因子である。そのような転写因子の例には、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0059】
疲弊したＴ細胞のエピジェネティクスは、疲弊していないＴ細胞のものとは有意に異なることが報告された。したがって、一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質は、エピジェネティック関連タンパク質（例えばメチル基転移酵素）である。一部の実施形態では、メチル基転移酵素がＤＮＭＴ３Ａである。
【0060】
近年になって現れた単細胞配列決定技術によって、疲弊したＴ細胞で高度に発現されるタンパク質の新しいクラスが得られたが、それらがＴ細胞機能にどのような影響を与えているかはまだ不明である。疲弊したＴ細胞で高度に発現されるそのようなタンパク質も、本発明の範囲に含まれる。例えば、一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質がＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、またはこれらの組合せから選択される。
【0061】
一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質は、Ｔ細胞アポトーシスに関係するタンパク質など、Ｔ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係するタンパク質である。Ｔ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係するそのようなタンパク質の例は、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの組合せを含むが、これに限定されるものではない。
【0062】
一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞の上記抑制タンパク質のうちの少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または５種以上の発現を低減または消失させることを含み、抑制タンパク質が、例えば、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、およびＦａｓＬから選択される。
【0063】
一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞におけるＰＤ１発現を低減または消失させることをさらに含む。一部の実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）およびＰＤ１の発現を低減または消失させることを含む。
【0064】
本発明のＴ細胞は、抗原特異的なＴ細胞を増殖させることによって、または遺伝子操作を介したＴ細胞のリダイレクションによって生成される養子免疫治療用のＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、対象から単離される初代Ｔ細胞であってもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞が外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞である。一部の他の実施形態では、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ４＋ Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0065】
一部の実施形態では、上記方法が、対象から単離される改変されていないＴ細胞を用意する工程と、改変されていないＴ細胞にＴＣＲまたはＣＡＲを導入する工程とをさらに含む。一部の実施形態では、改変されていないＴ細胞にＴＣＲまたはＣＡＲを導入する工程が、Ｔ細胞における抑制タンパク質の発現を低減または消失させる工程の前もしくは後またはそれと同時に行われる。
【0066】
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメインなどの腫瘍関連抗原に対する抗原結合ドメインを含む。
【0067】
腫瘍関連抗原には、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－胎児グロブリン（ＡＦＰ）、レクチン応答性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インシュリン成長因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異性ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）、ならびにＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）が含まれるが、これらに限られていない。好ましい実施形態では、抗原がメソテリンである。
【0068】
本発明によると、抗原結合性ドメインが、例えば、モノクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、シングルドメイン抗体、抗体単鎖可変領域、およびこれらの抗原結合性断片であってもよい。
【0069】
好ましい実施形態では、抗原結合ドメインがメソテリンに対するモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗原結合ドメインがメソテリンに対するｓｃＦｖである。好ましい実施形態では、抗原結合ドメインが、メソテリンに対するｓｃＦｖ Ｐ４、例えば、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖである。
【0070】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、好ましくは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通構造などの膜貫通ドメインを含む。
【0071】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にヒンジ領域をさらに含み、例えば、ヒンジ領域が、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８ヒンジ領域など、ＣＤ８ヒンジ領域である。
【0072】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、Ｔ細胞活性化に使用することができるシグナル伝達ドメイン、例えば、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるシグナル伝達ドメインを含む。一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなど、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0073】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、４－１ＢＢ、および４－１ＢＢＬからなる群から選択される１個または複数の共刺激ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＣＤ２８共刺激ドメイン、例えば、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激ドメインを含む。
【0074】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＧＦＰタンパク質など、ＣＡＲ発現を表示またはトラッキングするためのリポーター分子をさらに含んでもよい。
【0075】
本発明の一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲが、メソテリンに対するｓｃＦｖ Ｐ４、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ＧＦＰタンパク質を含んでもよい。本発明の一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲが、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。
【0076】
細胞でタンパク質発現を低減または消失させるためのいくつかの方法が当技術分野で知られている。一部の実施形態では、Ｔ細胞における抑制タンパク質の発現が、アンチセンスＲＮＡ、アンタゴミル、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡによって低減または消失している。他の実施形態では、Ｔ細胞の抑制タンパク質の発現が、遺伝子編集の方法によって、例えばメガヌクレアーゼ、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲシステムによって低減または消失している。本発明の方法の好ましい実施形態では、Ｔ細胞で抑制タンパク質の発現を低減または消失させるのにＣＲＩＳＰＲシステムが使用される。
【0077】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムで使用されるヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ）を、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５．、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３もしくはＣ２ｃ２タンパク質、またはこれらのヌクレアーゼの機能的な変異体からなる群から選択することができる。
【0078】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが、配列番号１～２１および２８～３１からなる群から選択される細胞内のヌクレオチド配列の１つまたは複数を標的とする。
【0079】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステムをインビトロでアセンブルし、Ｔ細胞内に導入する。一部の実施形態では、ＣＲＩＰＳＲシステムのすべてのエレメントをコードする発現コンストラクトでＴ細胞を形質転換する。一部の実施形態では、ＣＲＩＰＳＲシステムのエレメントの一部をコードする発現コンストラクトおよび転写または翻訳される他のエレメントをＴ細胞内に導入する。
【0080】
本発明は、以下のｉ）～ｖ）のうち少なくとも１つを含む、改変Ｔ細胞を調製するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムも提供する。
ｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および少なくとも１種のガイドＲＮＡ；
ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、および少なくとも１種のガイドＲＮＡ；
ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および少なくとも１種のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、および少なくとも１種のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｖ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列および少なくとも１種のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト。
上記において、少なくとも１種のガイドＲＮＡは、Ｔ細胞で抑制タンパク質をコードしている遺伝子を標的にし、前記抑制タンパク質は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの組合せなど、Ｔ細胞表面抑制受容体またはＴ細胞疲弊関連タンパク質から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１種のガイドＲＮＡが、Ｔ細胞でＰＤ１をコードする遺伝子を標的にするガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のガイドＲＮＡが、Ｔ細胞でＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）をコードする遺伝子およびＰＤ１をコードする遺伝子を標的にするガイドＲＮＡを含む。
ｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および少なくとも１種のガイドＲＮＡ；
ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、および少なくとも１種のガイドＲＮＡ；
ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、および少なくとも１種のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト、および少なくとも１種のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト；
ｖ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列および少なくとも１種のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクト。
上記において、少なくとも１種のガイドＲＮＡは、Ｔ細胞で抑制タンパク質をコードしている遺伝子を標的にし、前記抑制タンパク質は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの組合せなど、Ｔ細胞表面抑制受容体またはＴ細胞疲弊関連タンパク質から選択される。一部の実施形態では、少なくとも１種のガイドＲＮＡが、Ｔ細胞でＰＤ１をコードする遺伝子を標的にするガイドＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１種のガイドＲＮＡが、Ｔ細胞でＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）をコードする遺伝子およびＰＤ１をコードする遺伝子を標的にするガイドＲＮＡを含む。
【0081】
一部の特定の実施形態では、少なくとも１種のガイドＲＮＡが、配列番号１～２１および２８～３１から選択される１つまたは複数のヌクレオチド配列をＴ細胞で標的にする。
【0082】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、例えば、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、ＧＳＵ００５４、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃａｓ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｆ１、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ３、もしくはＣ２ｃ２タンパク質またはこれらのヌクレアーゼの機能的な変異体からなる群から選択することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼまたはその機能的な変異体である。
【0083】
本発明の方法の一部の実施形態では、Ｔ細胞への本発明のＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムの導入が含まれる。一部の実施形態では、本発明のＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムは、Ｔ細胞に導入した後、標的タンパク質の発現の低減または消失（ノックダウンまたはノックアウト）をもたらす。
【0084】
本発明のＣＲＩＳＰＲシステムは、リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルス感染（例えばバキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、および他のウイルス）など、当技術分野で知られている方法によって、Ｔ細胞に形質転換することができる。
【0085】
本発明の改変Ｔ細胞を遺伝的改変の前または後に活性化し、増殖させてもよい。Ｔ細胞は、インビトロで増殖させても、インビボ増殖させてもよい。一般に、本発明のＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞表面のＣＤ３ ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激する薬剤と接触させて、Ｔ細胞活性化シグナルを生じさせることによって、増殖させることができる。Ｔ細胞活性化シグナルを生じさせるのに、例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール １２－ミリスタート １３－アセタート（ＰＭＡ）などの化学物質またはフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）などの有糸分裂レクチンを使用することができる。一部の実施形態では、インビトロで、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、または表面に固定された抗ＣＤ２抗体を接触させることによって、またはカルシウムイオノフォア担体と共に、プロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ｍｏｓｓ阻害剤）を接触させることによって、Ｔ細胞集団を活性化することができる。例えば、Ｔ細胞増殖を刺激するのに適した条件で、Ｔ細胞集団が抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触していてもよい。Ｔ細胞培養に適した条件には、増殖および生存能に必要な因子を含有してもよい適した培養培地（最小必須培地もしくはＲＰＭＩ Ｍｅｄｉａ １６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ ５（Ｌｏｎｚａ））が含まれ、必要な因子には、血清（ウシ胎仔血清またはヒト血清など）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インシュリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ、または当業者に知られている細胞成長用の添加物が含まれる。細胞増殖のための他の添加物には、界面活性剤、ヒト血漿タンパク質粉末、ならびにＮ－アセチルシステインおよび２－メルカプト酢酸などの還元剤が含まれるが、これらに限定されない。培養培地には、無血清の、またはＴ細胞の成長および増殖に十分な、適した量の血清（または血漿）もしくは特定のセットのホルモンで補足された、ＲＰＭＩ １６４０、Ａ１Ｍ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １、およびＸ－Ｖｉｖｏ ２０、オプティマイザー、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミン、および／または特定の量のサイトカインを含めることができる。標的細胞は、適切な温度（例えば、３７℃）および環境（例えば、空気＋５％ＣＯ２）など、成長を支えるのに必要な条件で維持することができる。
【0086】
ＩＩＩ．改変Ｔ細胞
別の態様では、本発明は、改変Ｔ細胞であって、改変Ｔ細胞の抑制タンパク質の発現が、改変されていないＴ細胞と比較して低減または消失している、改変Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞が、本発明の方法によって調製される。
別の態様では、本発明は、改変Ｔ細胞であって、改変Ｔ細胞の抑制タンパク質の発現が、改変されていないＴ細胞と比較して低減または消失している、改変Ｔ細胞を提供する。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞が、本発明の方法によって調製される。
【0087】
一部の実施形態では、抑制タンパク質がＴ細胞表面抑制受容体またはＴ細胞疲弊関連タンパク質から選択される。
【0088】
一部の実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体が、腫瘍細胞または周囲の間質細胞の表面に発現されるリガンドを認識するＴ細胞表面受容体であってもよい。そのような受容体の例には、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、ＲＡＲＡ、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0089】
一部の他の実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体が、腫瘍微小環境中に存在する、アデノシンおよびエピネフリンなどの分泌物またはＩＬ－１０およびＴＧＦβなどのサイトカインを認識する受容体でもよい。そのような分泌物またはサイトカインは、Ｔ細胞の腫瘍殺滅効果に影響を及ぼす可能性がある。そのような受容体の例には、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＴＧＦＢＲＩＩ、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0090】
本発明者らは、驚くべきことに、ＴＧＦβシグナリング経路を抑制することによって、ＣＡＲ－Ｔ細胞などの治療用のＴ細胞の腫瘍殺滅能力を強化できることを見出した。したがって、一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体がＴＧＦβ受容体である。一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞表面抑制受容体が、ＴＧＦＢＲＩＩなど、抑制的なサイトカインＴＧＦβ１を認識するＴ細胞受容体である。加えて、本発明は、Ｔ細胞のＦＯＸＰ３など、ＴＧＦβシグナリング経路に関係するタンパク質の発現の低減（ノックダウン）または消失（ノックアウト）も包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｔ細胞におけるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）および／またはＦＯＸＰ３の発現を低減（ノックダウン）または消失（ノックアウト）させる。
【0091】
一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質が、Ｔ細胞疲弊に関係する転写因子、例えば、疲弊したＴ細胞中でその発現が有意に上方制御されている転写因子である。そのような転写因子の例には、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0092】
疲弊したＴ細胞のエピジェネティクスは、疲弊していないＴ細胞のものとは有意に異なることが報告された。したがって、一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質がエピジェネティック関連タンパク質（例えばメチル基転移酵素）である。一部の実施形態では、メチル基転移酵素がＤＮＭＴ３Ａである。
【0093】
近年になって現れた単細胞配列決定技術によって、疲弊したＴ細胞で高度に発現されるタンパク質の新しいクラスが得られたが、それらがＴ細胞機能にどのような影響を与えているかはまだ不明である。疲弊したＴ細胞で高度に発現されるそのようなタンパク質も、本発明の範囲に含まれる。例えば、一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質が、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、またはこれらの組合せから選択される。
【0094】
一部の実施形態では、Ｔ細胞疲弊関連タンパク質が、Ｔ細胞アポトーシスに関係するタンパク質など、Ｔ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係するタンパク質である。Ｔ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係するそのようなタンパク質の例には、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。
【0095】
一部の実施形態では、改変されていないＴ細胞と比較して、本発明の改変Ｔ細胞の少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、または５種以上の上記の抑制タンパク質の発現が低減または消失しており、抑制タンパク質が、例えば、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、およびＦａｓＬから選択される。一部のさらなる実施形態では、改変されていないＴ細胞と比較して、本発明の改変Ｔ細胞のＰＤ１の発現が低減または消失している。一部のさらなる実施形態では、改変されていないＴ細胞と比較して、本発明の改変Ｔ細胞のＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）の発現が低減または消失している。
【0096】
一部の実施形態では、例えば、本発明の遺伝子編集システムを導入することによって、抑制タンパク質をコードする遺伝子がＴ細胞でノックアウトされる。
【0097】
本発明によると、改変Ｔ細胞は、免疫抑制、抗腫瘍活性、特に固形腫瘍細胞を抑制または殺滅する活性などが軽減されているため、改変されていないＴ細胞に相当する増殖能力および類似の免疫学的特性を有し、その生物活性が強化されている。
【0098】
一部の実施形態では、Ｔ細胞が外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞である。一部の他の実施形態では、Ｔ細胞がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞である。一部の好ましい実施形態では、Ｔ細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞である。
【0099】
一部の実施形態では、ＴＣＲまたはＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメインなどの腫瘍関連抗原に対する抗原結合ドメインを含む。
【0100】
腫瘍関連抗原には、ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲ変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアリルガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、神経膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α－胎児グロブリン（ＡＦＰ）、レクチン応答性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺アーゼ特異性抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生存およびテロメラーゼ、前立腺ガン腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インシュリン成長因子（ＩＧＦ１）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソテリン、腫瘍特異性ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲ１、Ｎｋｐ３０、ＮＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）およびエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、テネイシン－Ｃ Ａ１ドメイン（ＴｎＣ Ａ１）、線維芽細胞関連タンパク質（ｆａｐ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、Ｆｏｘｐ３、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ、サイトカイン受容体、内皮因子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＴＮＦＲＳＦ１７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ０２２２３）、ＳＬＡＭＦ７（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＱ２５）、ＧＰＲＣ５Ｄ（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＺＤ１）、ＦＫＢＰ１１（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ９ＮＹＬ４）、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｐ５３７０８）、ならびにＦＣＲＬ５（ＵＮＩＰＲＯＴ Ｑ６８ＳＮ８）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、抗原がメソテリンである。
【0101】
本発明によると、抗原結合性ドメインが、例えば、モノクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、シングルドメイン抗体、抗体単鎖可変領域、およびこれらの抗原結合性断片であってもよい。
【0102】
好ましい実施形態では、抗原結合ドメインがメソテリンに対するモノクローナル抗体である。好ましい実施形態では、抗原結合ドメインがメソテリンに対するｓｃＦｖである。好ましい実施形態では、抗原結合ドメインが、メソテリンに対するｓｃＦｖ Ｐ４、例えば、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するｓｃＦｖである。
【0103】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＣＤ８膜貫通ドメインまたはＣＤ２８膜貫通ドメイン、好ましくは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、例えば、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ２８膜貫通構造などの膜貫通ドメインを含む。
【0104】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間にヒンジ領域をさらに含み、例えば、ヒンジ領域が、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ８ヒンジ領域など、ＣＤ８ヒンジ領域である。
【0105】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、Ｔ細胞活性化に使用することができるシグナル伝達ドメイン、例えば、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるシグナル伝達ドメインを含む。一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ３ζシグナル伝達ドメインなど、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【0106】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ１２７、４－１ＢＢ、および４－１ＢＢＬからなる群から選択される１個または複数の共刺激ドメインをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＣＤ２８共刺激ドメイン、例えば、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有するＣＤ２８共刺激ドメインを含む。
【0107】
一部の実施形態では、ＣＡＲが、ＧＦＰタンパク質など、ＣＡＲ発現を表示またはトラッキングするためのリポーター分子をさらに含んでもよい。
【0108】
本発明の一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲが、メソテリンに対するｓｃＦｖ Ｐ４、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、ＧＦＰタンパク質を含んでもよい。本発明の一部の好ましい実施形態では、ＣＡＲが、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。
【0109】
本発明の特定の実施形態では、改変Ｔ細胞が、配列番号２７で示されるアミノ酸配列のＣＡＲを含むＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦＢＲＩＩなど）、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＤ２００Ｒ、Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、ＡＤＲＢ２、ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、ＲＡＲＡ、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２、ＳＨＰ１から選択される少なくとも１種の抑制タンパク質または抑制タンパク質の組合せの発現が低減または消失している。ＤＧＫａ、Ｆａｓ、ＦａｓＬ、またはこれらの任意の組合せが低減または消失している。
【0110】
本発明の細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めた多くの非限定的な供給源から、様々な非限定的な方法によって得ることができる。一部の実施形態では、細胞が、健康なドナーまたはがんと診断された患者に由来するものでもよい。一部の実施形態では、細胞が、様々な表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部でもよい。一部の実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ４＋ Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞がＣＤ８＋ Ｔ細胞である。
【0111】
本発明の様々な態様の一部の実施形態では、Ｔ細胞が、対象の自家組織の細胞に由来する。本明細書で使用する場合、「自家組織」は、対象を処置するのに使用される細胞、細胞系、または細胞集団が対象自体に由来することを指す。一部の実施形態では、Ｔ細胞が、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と適合するドナーからのものなど、同種異系細胞に由来する。ドナーからの細胞を非アロ反応性細胞に変え、必要に応じて細胞を増殖させて、１または複数の患者に投与することができる細胞を生じさせるのに、標準的なスキームを使用することができる。
【0112】
本発明のＣＡＲ Ｔ細胞またはＴＣＲ Ｔ細胞は、当技術分野で知られている様々な手段で調製することができる。例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲまたはＴＣＲコード配列を含む発現コンストラクトでＴ細胞に形質導入することによって得ることができる。当業者であれば、ウイルスベクターなど、タンパク質発現に適した発現コンストラクトを容易に構築することができる。
【0113】
ＩＶ．医薬組成物および適用
別の態様では、本発明は、がんを処置するための医薬組成物であって、本発明の改変Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、がんの処置のための医薬の製造における、本発明の改変Ｔ細胞の使用も提供する。
別の態様では、本発明は、がんを処置するための医薬組成物であって、本発明の改変Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、がんの処置のための医薬の製造における、本発明の改変Ｔ細胞の使用も提供する。
【0114】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、生理的に適合性であるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌性剤、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、表皮投与（例えば、注射または輸液による）に適したものである。
【0115】
本発明は、別の態様では、がんを処置するための方法であって、治療有効量の本発明の改変Ｔ細胞または本発明の医薬組成物を、必要のある対象に投与することを含む方法も提供する。
【0116】
一部の実施形態では、上記方法は、対象に放射線療法および／または化学療法および／または追加の腫瘍標的薬（例えば、他の抗原を標的にするモノクローナル抗体または小分子化合物）を投与することをさらに含む。
【0117】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「治療有効用量」または「有効量」は、少なくとも対象に投与した後で治療効果を生むのに十分である、物質、化合物、材料、または細胞の量を指す。したがって、それは、疾患または状態の症状を予防、治癒、寛解、抑止、または部分的に抑止するのに必要な量である。
【0118】
例えば、本発明の細胞または医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、疾患の症状の重症度の低減、疾患の無症状期の頻度および期間の増大、または疾患によって引き起こされる損傷もしくは障害の予防をもたらす。例えば、腫瘍の処置に関する場合、本発明の細胞または医薬組成物の「有効量」は、好ましくは、処置を受けていない対象と比較して、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、腫瘍細胞成長または腫瘍成長を抑制する。腫瘍成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測するのに使用できる動物モデルシステムで評価することができる。代わりに、それは、腫瘍細胞成長を抑制する能力を調べることによって評価することもでき、腫瘍細胞成長を抑制する能力は、当業者によく知られているアッセイでインビトロ測定することができる。
【0119】
本発明の医薬組成物中の細胞の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、および投与方法について、患者への毒性なしで、所望の治療応答を実現するのに有効な細胞の量を得るように変えることができる。選択される投薬レベルは、使用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、処置の期間、使用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、健康状態、および病歴、ならびに医術においてよく知られている同様の因子を含めた、様々な薬物動態学的因子に依存することになる。
【0120】
驚くべきことに、本発明の改変Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞（細胞内で抑制タンパク質の発現が低減または消失していない）よりも低用量で、より優れた治療効果を実現できる。これは、高用量投与と関連する副作用を低減しながら、調製の時間および費用を低減するのに特に有利である。
【0121】
例えば、本発明の改変Ｔ細胞は、細胞内で抑制タンパク質の発現が低減または消失していない対照Ｔ細胞の約２分の１、約３分の１、約４分の１、約５分の１、約６分の１、約７分の１、約８分の１、約９分の１、約１０分の１、約１５分の１、約２０分の１、約３０分の１、約４０分の１、約５０分の１、約１００分の１、約１５０分の１、および約２００分の１以下の用量で投与される。
【0122】
本発明の細胞または医薬組成物によって処置することができるがんの非限定的な例には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、直腸がん、黒色腫、腎がん、膀胱がん、乳がん、肝がん、リンパ腫、血液系腫瘍、頭頸部がん、グリア系腫瘍、胃がん、上咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮体部腫瘍、および骨肉腫が含まれる。本発明の方法または医薬組成物で処置できる他のがんの例には、骨がん、膵がん、皮膚がん、前立腺がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、肛門がん、精巣がん、卵管がん、子宮体がん、腟がん、腟がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性または急性白血病（急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、および慢性リンパ性白血病を含む）、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎または尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹部神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、表皮癌、扁平上皮癌、Ｔ細胞リンパ腫、およびアスベスト誘発性がんを含めた環境誘発性がん、ならびにこれらのがんの組合せが含まれる。好ましくは、がんが固形腫瘍がんである。一部の実施形態では、がんが、肺扁平上皮癌などの肺がんである。一部の特定の実施形態では、がんが卵巣がんである。一部の特定の実施形態では、がんが結腸がんである。
【0123】
Ｖ．キット
本発明は、本明細書に記載の改変Ｔ細胞を調製するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムと、遺伝子編集システムを細胞に導入するのに適した試薬とを含む、本発明の改変Ｔ細胞を調製する方法で使用するためのキットも提供する。
本発明は、本明細書に記載の改変Ｔ細胞を調製するためのＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システムと、遺伝子編集システムを細胞に導入するのに適した試薬とを含む、本発明の改変Ｔ細胞を調製する方法で使用するためのキットも提供する。
【0124】
一部の実施形態では、キットがＣａｓ９タンパク質などのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、キットが、１種または複数のｓｇＲＮＡを含み、例えば、ｓｇＲＮＡが、配列番号１～２１および２８～３１中の任意の１つまたは複数の標的配列を標的にする。一部の他の実施形態では、キットが、ｓｇＲＮＡのインビトロ転写のための試薬を含有する。
【0125】
キットは、Ｔ細胞を検出する、Ｔ細胞を単離する、Ｔ細胞を活性化する、および／またはＴ細胞を増殖させるための試薬をさらに含んでもよい。キットは、ＣＡＲまたはＴＣＲをＴ細胞に導入するための試薬、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現している細胞を検出および／または単離するための試薬をさらに含んでもよい。キットは、本発明の方法を実行するための指示も含有してもよい。
【実施例】
【0126】
本明細書に記載の例を参照することによって、本発明のさらなる理解を得ることができる。ただし、それらは、本発明の範囲の限定を意図するものではない。本発明の精神を逸脱せずに、本発明に様々な改変および変更を加えることができ、かかる改変および変更も本発明の範囲に含まれることは明らかである。
【0127】
材料と方法
１．ｓｇＲＮＡのインビトロ転写
まず、バイオテクノロジー会社によって、Ｔ７プロモーターおよび２０ｂｐの標的配列（ｓｇＲＮＡ）を含有するフォワードプライマーが合成された。次いで、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３）をＰＣＲテンプレートとして用いて、Ｔ７－ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物をインビトロで増幅させ、ＰＣＲ精製キットを用いてＰＣＲ産物を精製した。次いで、精製されたＴ７－ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｓｇＲＮＡをインビトロで転写し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でｓｇＲＮＡを回収し、ｓｇＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの脱イオン水に溶解させ、別々に凍結させるか、以降の使用のために貯蔵した。
１．ｓｇＲＮＡのインビトロ転写
まず、バイオテクノロジー会社によって、Ｔ７プロモーターおよび２０ｂｐの標的配列（ｓｇＲＮＡ）を含有するフォワードプライマーが合成された。次いで、ｐＸ３３０プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃４２２３）をＰＣＲテンプレートとして用いて、Ｔ７－ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物をインビトロで増幅させ、ＰＣＲ精製キットを用いてＰＣＲ産物を精製した。次いで、精製されたＴ７－ｓｇＲＮＡ ＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてｓｇＲＮＡをインビトロで転写し、ＭＥＧＡｃｌｅａｒカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でｓｇＲＮＡを回収し、ｓｇＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの脱イオン水に溶解させ、別々に凍結させるか、以降の使用のために貯蔵した。
【0128】
【表1】
【0129】
２．Ｃａｓ９タンパク質とｓｇＲＮＡの複合体
まず、適量の対応ｓｇＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＥＰチューブに添加し、次いで、Ｃａｓ９タンパク質をゆっくり添加し、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートして、以降の使用のためのＲＮＰを形成させた。
まず、適量の対応ｓｇＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＥＰチューブに添加し、次いで、Ｃａｓ９タンパク質をゆっくり添加し、穏やかに混合し、室温で１５分間インキュベートして、以降の使用のためのＲＮＰを形成させた。
【0130】
３．エレクトロポレーション形質転換
１）Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｋｉｔを用いた。
２）１．５ｍｌ／ウェルの完全培地を１２ウェルプレートに添加し、３７℃で３０分間超予熱した。同時に、１５ｍｌの遠心分離機チューブ内の培地を予熱した。５０ｍｌのＰＢＳを予熱した。
３）対応ｓｇＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＥＰチューブに添加し、次いで、対応量のＣａｓ９タンパク質をゆっくり添加し、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成させた。
４）電気回転バッファー（ｅｌｅｃｔｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の調製：１００ｕｌ系中に、８２μｌ Ｎｕｃｌｅｐｆｅｃｔｏｒ溶液＋１８μｌサプリメント。
５）ｓｇＲＮＡとｃａｓ９タンパク質のインキュベーション中に、エレクトロポレーションに必要とされる細胞を同時調製した。
６）３日間活性化させたＴ細胞を収集し、計数し、必要量の細胞（３ｅ６細胞／試料）を取り出した。
７）溶液を、室温で５分間、２００ｇで遠心処理した。
８）上清を除去し、予熱したＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次いで、室温で５分間、２００ｇで遠心処理した。
９）上清を除去し、残留液を、さらに、できるだけ多く取り除いた。
１０）細胞を予め調製したエレクトロポレーションバッファーで再懸濁し、穏やかに混合した。
１１）２００μｌ／試料（二連のウェルを含む）を再懸濁細胞から取り出し、インキュベートされたＲＮＰの中に入れ、穏やかに混合し、次いで、１００μｌ／試料の混合物をエレクトロポレーションキュベットに添加した。
１２）エレクトロポレーション用のプログラムは、刺激されたＴ細胞（ＥＯ－１１５）である。
１３）エレクトロポレーションの後、５００μｌの予熱された培地をキュベットに迅速に添加し、ピペットで穏やかに混合し、細胞懸濁液を予熱された１２ウェルプレート内にピペットで移し、インキュベーターに入れ、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
１４）エレクトロポレーションの６時間後に、半分の培地を新たにし、震とうさせないように慎重に細胞をインキュベーターから取り出し、ウェル壁に沿って１ｍｌ／ウェルの培地をピペットから慎重に出し、次いで、１ｍｌの予熱されたＴ細胞培養培地を各ウェルに添加した。
１５）その後、細胞成長の状態に応じて、時間通りに継代接種を行い、細胞密度を１ｅ６細胞／ｍｌに維持した。
１）Ｐ３ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｘ Ｋｉｔを用いた。
２）１．５ｍｌ／ウェルの完全培地を１２ウェルプレートに添加し、３７℃で３０分間超予熱した。同時に、１５ｍｌの遠心分離機チューブ内の培地を予熱した。５０ｍｌのＰＢＳを予熱した。
３）対応ｓｇＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＥＰチューブに添加し、次いで、対応量のＣａｓ９タンパク質をゆっくり添加し、穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートして、ＲＮＰ複合体を形成させた。
４）電気回転バッファー（ｅｌｅｃｔｒｏｒｏｔａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）の調製：１００ｕｌ系中に、８２μｌ Ｎｕｃｌｅｐｆｅｃｔｏｒ溶液＋１８μｌサプリメント。
５）ｓｇＲＮＡとｃａｓ９タンパク質のインキュベーション中に、エレクトロポレーションに必要とされる細胞を同時調製した。
６）３日間活性化させたＴ細胞を収集し、計数し、必要量の細胞（３ｅ６細胞／試料）を取り出した。
７）溶液を、室温で５分間、２００ｇで遠心処理した。
８）上清を除去し、予熱したＰＢＳで細胞を１回洗浄し、次いで、室温で５分間、２００ｇで遠心処理した。
９）上清を除去し、残留液を、さらに、できるだけ多く取り除いた。
１０）細胞を予め調製したエレクトロポレーションバッファーで再懸濁し、穏やかに混合した。
１１）２００μｌ／試料（二連のウェルを含む）を再懸濁細胞から取り出し、インキュベートされたＲＮＰの中に入れ、穏やかに混合し、次いで、１００μｌ／試料の混合物をエレクトロポレーションキュベットに添加した。
１２）エレクトロポレーション用のプログラムは、刺激されたＴ細胞（ＥＯ－１１５）である。
１３）エレクトロポレーションの後、５００μｌの予熱された培地をキュベットに迅速に添加し、ピペットで穏やかに混合し、細胞懸濁液を予熱された１２ウェルプレート内にピペットで移し、インキュベーターに入れ、５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートした。
１４）エレクトロポレーションの６時間後に、半分の培地を新たにし、震とうさせないように慎重に細胞をインキュベーターから取り出し、ウェル壁に沿って１ｍｌ／ウェルの培地をピペットから慎重に出し、次いで、１ｍｌの予熱されたＴ細胞培養培地を各ウェルに添加した。
１５）その後、細胞成長の状態に応じて、時間通りに継代接種を行い、細胞密度を１ｅ６細胞／ｍｌに維持した。
【0131】
４．ＣＤ３＋細胞の単離とＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
末梢血または臍帯血をリンパ球セパレーター（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７）で単核細胞（ＰＢＭＣ）にソーティングした後、次いで、ＥａｓｙＳｅｑヒトＴ細胞濃縮キットを用いて、ＰＢＭＣをＣＤ３＋細胞から分離した。ＣＤ３＋細胞を得た後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を得るために、ＣＡＲレンチウイルス感染を行った。
末梢血または臍帯血をリンパ球セパレーター（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７）で単核細胞（ＰＢＭＣ）にソーティングした後、次いで、ＥａｓｙＳｅｑヒトＴ細胞濃縮キットを用いて、ＰＢＭＣをＣＤ３＋細胞から分離した。ＣＤ３＋細胞を得た後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を得るために、ＣＡＲレンチウイルス感染を行った。
【0132】
その後、上述のように、各ＲＮＰを、エレクトロポレーションでＣＡＲ－Ｔ細胞に導入し、標的遺伝子をノックアウトし、遺伝子編集されたＣＡＲ－Ｔ細胞を得た。
【0133】
５．腫瘍細胞系
腫瘍細胞ＣＲＬ５８２６（ＮＣＩ－Ｈ２２６ヒト肺扁平上皮細胞系）、ＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣がん細胞）、およびＨＣＴ１１６（ヒト結腸がん細胞）は、ＡＴＣＣから購入した。これらはすべて、メソテリンという抗原を発現する。ルシフェラーゼを発現するように、細胞系をウイルスに感染させて、ルシフェラーゼを安定して発現する細胞系（ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉ、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉ、ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉ）を得た。これに基づいて、ＰＤＬ１を発現するウイルスをトランスフェクションし、ＰＤＬ１の発現が高い細胞系（ＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉ）を得た。
腫瘍細胞ＣＲＬ５８２６（ＮＣＩ－Ｈ２２６ヒト肺扁平上皮細胞系）、ＯＶＣＡＲ３（ヒト卵巣がん細胞）、およびＨＣＴ１１６（ヒト結腸がん細胞）は、ＡＴＣＣから購入した。これらはすべて、メソテリンという抗原を発現する。ルシフェラーゼを発現するように、細胞系をウイルスに感染させて、ルシフェラーゼを安定して発現する細胞系（ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉ、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉ、ＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉ）を得た。これに基づいて、ＰＤＬ１を発現するウイルスをトランスフェクションし、ＰＤＬ１の発現が高い細胞系（ＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉ）を得た。
【0134】
６．ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺滅
腫瘍細胞を、１０４／１００ｕｌの密度で、９６ウェルマイクロアッセイプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）に入れた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を正確に計数し、エフェクター細胞：標的細胞の様々な比率に応じて希釈し、対応するウェルに１００ｕｌを添加した。対照群用に、１００ｕｌの培養培地を添加した。指定された時点に、１０ｕｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ＝をすべてのウェルに添加し、５分後にマイクロプレートリーダーで読みとった。読取り値を得た後に、次のように殺滅の百分率を計算した。殺滅（％）＝１００－（実験群の読取り値／対照群の読取り値）×１００。
腫瘍細胞を、１０４／１００ｕｌの密度で、９６ウェルマイクロアッセイプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）に入れた。ＣＡＲ－Ｔ細胞を正確に計数し、エフェクター細胞：標的細胞の様々な比率に応じて希釈し、対応するウェルに１００ｕｌを添加した。対照群用に、１００ｕｌの培養培地を添加した。指定された時点に、１０ｕｌのＳｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ＝をすべてのウェルに添加し、５分後にマイクロプレートリーダーで読みとった。読取り値を得た後に、次のように殺滅の百分率を計算した。殺滅（％）＝１００－（実験群の読取り値／対照群の読取り値）×１００。
【実施例1】
【0135】
様々なＣＡＲ構造を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の効果
図１に構造を示し、図中、Ｐ４が抗メソテリンｓｃＦｖである、４タイプのＣＡＲ（Ｐ４－ｚ、Ｐ４－ＢＢｚ、Ｐ４－２８ｚ、およびＰ４－２８ＢＢｚ）を設計し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。
図１に構造を示し、図中、Ｐ４が抗メソテリンｓｃＦｖである、４タイプのＣＡＲ（Ｐ４－ｚ、Ｐ４－ＢＢｚ、Ｐ４－２８ｚ、およびＰ４－２８ＢＢｚ）を設計し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。
【0136】
１：１のエフェクター細胞：標的細胞比で、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞とＨ２２６細胞を２０時間共培養し、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の放出を測定した。
【0137】
２：１のエフェクター細胞：標的細胞比で、得られたＣＡＲ－Ｔ細胞を、ルシフェラーゼを発現するＨ２２６細胞（Ｈ２２６－ｌｕｃｉ）と３日間共培養し、残存腫瘍細胞のルシフェラーゼ活性を測定することによって、標的細胞溶解百分率を計算した。
【0138】
図２に示すように、Ｐ４－ｚ、Ｐ４－ＢＢｚ、およびＰ４－２８ＢＢｚと比較して、Ｐ４－２８ｚは、高放出のＩＦＮ－γおよびＩＬ－２（図２Ａ）および高い特異的細胞溶解（図２Ｂ、＊はＰ＜０．０５を意味し、＊＊＊＊はＰ＜０．０００１を意味する）を示した。
【0139】
Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞と呼ばれる、Ｐ４－２８ｚを含有するＣＡＲ－Ｔ細胞を、以下の実験すべてで用いた。
【実施例2】
【0140】
ＣＡＲ－Ｔ細胞で抑制受容体を編集することが腫瘍殺滅に及ぼす効果
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における抑制受容体ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＣＤ２００Ｒを、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における抑制受容体ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、２Ｂ４、およびＣＤ２００Ｒを、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
【0141】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＴＩＧＩＴノックアウト群は、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対して、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図３）
【0142】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＴＩＧＩＴノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図４）
【0143】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＢＴＬＡノックアウト群は、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対して、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図５）
【0144】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＢＴＬＡノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図６）。
【0145】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＣＤ１６０ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図７）。
【0146】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＣＤ１６０ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図８）
【0147】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、２Ｂ４ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない殺滅を示した。（図９）
【0148】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、２Ｂ４ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図１０）
【0149】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＣＤ２００Ｒノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図１１）
【0150】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＣＤ２００Ｒノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強い殺滅を示した。（図１２）
【実施例3】
【0151】
ＣＡＲ－Ｔ細胞でＴ細胞疲弊関連転写因子を編集することが腫瘍殺滅に及ぼす効果
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊関連転写因子ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、およびＲＡＲＡを、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊関連転写因子ＢＡＴＦ、ＧＡＴＡ３、ＩＲＦ４、およびＲＡＲＡを、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
【0152】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＢＡＴＦノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より有意に強い殺滅を示した。（図１３）
【0153】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＢＡＴＦノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より有意に強い殺滅を示した。（図１４）
【0154】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＧＡＴＡ３ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない殺滅を示した。（図１５）。
【0155】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＧＡＴＡ３ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない殺滅を示した。（図１６）
【0156】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＲＡＲＡノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＲＡＲＡノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図１７）
【0157】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＩＲＦ４ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＩＲＦ４ノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図４５）
【実施例4】
【0158】
ＣＡＲ－Ｔ細胞で腫瘍微小環境関連受容体を編集することが腫瘍殺滅に及ぼす効果
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における腫瘍微小環境関連受容体Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、およびＡＤＲＢ２を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における腫瘍微小環境関連受容体Ａ２ａＲ、ＩＬ１０ＲＡ、およびＡＤＲＢ２を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
【0159】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、Ａ２ａＲノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意に強い殺滅を示した。（図１８）
【0160】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、Ａ２ａＲノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより強い殺滅を示した。（図１９）
【0161】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＩＬ１０ＲＡノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＩＬ１０ＲＡノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２０）
【0162】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＡＤＲＢ２ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＡＤＲＢ２ノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２１）
【実施例5】
【0163】
ＣＡＲ－Ｔ細胞でＴ細胞疲弊関連のエピジェネティック遺伝子を編集することが腫瘍殺滅に及ぼす効果
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における、メチル基転移酵素ＤＮＭＴ３ＡなどのＴ細胞疲弊関連のエピジェネティック遺伝子を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における、メチル基転移酵素ＤＮＭＴ３ＡなどのＴ細胞疲弊関連のエピジェネティック遺伝子を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
【0164】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＤＮＭＴ３Ａノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＤＮＭＴ３Ａノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２２）
【実施例6】
【0165】
ＣＡＲ－Ｔ細胞における疲弊したＴ細胞で過剰発現される遺伝子を編集することが腫瘍殺滅に及ぼす効果
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における疲弊したＴ細胞で高度に発現される未知の機能を有するいくつかの遺伝子を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。これらの遺伝子には、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２が含まれる。
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における疲弊したＴ細胞で高度に発現される未知の機能を有するいくつかの遺伝子を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。これらの遺伝子には、ＬＡＹＮ、ＭＹＯ７Ａ、ＰＨＬＤＡ１、ＲＧＳ１、ＲＧＳ２が含まれる。
【0166】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＬＡＹＮノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉおよびＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない殺滅を示した。（図２３）
【0167】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＬＡＹＮノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃｉおよびＨＣＴ１１６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。長期および低エフェクター：標的比の殺滅については、それは、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより強い殺滅を示した。（図２４）。
【0168】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＰＨＬＤＡ１ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目、特に７日目におけるＰＨＬＤＡ１ノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２５）
【0169】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＲＧＳ１ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＲＧＳ１ノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２６）
【0170】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＲＧＳ２ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＲＧＳ２ノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２７）
【0171】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＭＹＯ７Ａノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＭＹＯ７Ａノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２８）
【実施例7】
【0172】
ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＴ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係する遺伝子を編集することが腫瘍殺滅に及ぼす効果
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、およびＦａｓＬなどのＴ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係する遺伝子を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
この例では、ＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＳＨＰ１、ＤＧＫａ、Ｆａｓ、およびＦａｓＬなどのＴ細胞疲弊の内因性メカニズムに関係する遺伝子を、遺伝子編集を介してノックアウトし、それらが腫瘍殺滅に及ぼす効果を研究した。
【0173】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、Ｆａｓノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＦａｓノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図２９）
【0174】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＦａｓＬノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＦａｓＬノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図３０）
【0175】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＳＨＰ１ノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＳＨＰ１ノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞よりはるかに強かった。（図３１）
【0176】
高エフェクター：標的比（１：１）および短期（２４ｈ、４８ｈ）では、ＤＧＫａノックアウト群は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、ＣＲＬ５８２６－ｌｕｃｉに対する殺滅効果を示した。０．２：１という、より低いエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより低くない、７０％超に達した。０．１：１まで低減されたエフェクター：標的比では、４日目および７日目におけるＤＧＫａノックアウト群の殺滅が、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞より強かった。（図３２）
【実施例8】
【0177】
ＴＧＦβシグナリング経路の抑制による、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の効果の改善
１．ＴＧＦβ１は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を負に調節し、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞を誘導して、機能的な調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に変えることができる。
ＴＧＦβ１がＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効果に影響を及ぼすかどうか確かめるために、本発明者らは、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加したまたは添加しない培養系で、メソテリンを標的とするＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＲＬ５８２６中皮腫細胞と１：１の比率でインキュベートした。結果は、２４時間の共インキュベーションの後、ＴＧＦβ１群におけるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的指向殺滅能力が、非添加群のものより有意に低かったことを示した（図３３Ａ）。ＴＧＦβ１群におけるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力が低減している理由を、最初に探索する目的で、培養培地中のＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出を検出した。Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＲＬ５８２６と共にインキュベートしたときに、大量のＩＬ－２およびＩＦＮ－γが産出されたことが見出された。しかし、ＴＧＦβ１が添加されたときには、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出が約５０％低減した（図３３ ＢおよびＣ）。
１．ＴＧＦβ１は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を負に調節し、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞を誘導して、機能的な調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に変えることができる。
ＴＧＦβ１がＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効果に影響を及ぼすかどうか確かめるために、本発明者らは、５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加したまたは添加しない培養系で、メソテリンを標的とするＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＲＬ５８２６中皮腫細胞と１：１の比率でインキュベートした。結果は、２４時間の共インキュベーションの後、ＴＧＦβ１群におけるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的指向殺滅能力が、非添加群のものより有意に低かったことを示した（図３３Ａ）。ＴＧＦβ１群におけるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力が低減している理由を、最初に探索する目的で、培養培地中のＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出を検出した。Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＣＲＬ５８２６と共にインキュベートしたときに、大量のＩＬ－２およびＩＦＮ－γが産出されたことが見出された。しかし、ＴＧＦβ１が添加されたときには、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出が約５０％低減した（図３３ ＢおよびＣ）。
【0178】
ＴＣＲ活性化の条件下およびＴＧＦβ１の存在下で、Ｔ細胞を誘導性Ｔｒｅｇに変えることができることが報告された。本発明者らは、メソテリンを強く発現するＰ４－ＣＡＲ－ＴおよびＯＶＣＡＲ－３細胞の共インキュベーション系に５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加して、Ｔｒｅｇの産生を誘導できるかどうか観察した。合計３日間のインキュベーションの後、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞を選別し、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＦＯＸＰ３の発現レベルがＴＧＦβ１群で有意に増大したことが見出された（図３４Ａ）。これらのＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞を、バイオレット標識されたＣＤ４＋ ＣＤ２５レスポンダー細胞と２：１および１：１の比率でインキュベートし、ＴＧＦβ１群に添加されたＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞が、レスポンダー細胞の増殖を有意に抑制できたことが見出された（図３４Ｂ）。この実験は、ＴＧＦβ１の存在下で、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、増殖を抑制する能力を有する機能的なＴｒｅｇに変えることができることを示す。これらのＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞をＯＶＣＡＲ－３と再びインキュベートし、ＴＧＦβ１群におけるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力が、非ＴＧＦβ１群のものより有意に低かったことが見出された（図３４Ｃ）。
【0179】
加えて、抗原によって誘導されるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖に及ぼすＴＧＦβ１の影響を観察した。ＩＬ－２を含まないＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞培養系において、ＣＲＬ５８２６腫瘍細胞を２日毎に添加して、ＴＧＦβ１の添加有りまたは無しで、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を誘導する。ＣＲＬ５８２６は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の有意な増殖を誘導できるが、ＴＧＦβ１群において、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞は、基本的に増殖しなかったことをみることができる（図３５Ａ）。同時に、ＴＧＦβ１群では、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の状態も、ＴＧＦβ１群のものより有意に悪かったことが観察された（図３５Ｂ）。
２．ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の影響を改善することができる。
２．ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の影響を改善することができる。
【0180】
上記のように、ＴＧＦβ１は、実際、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の影響を負に調節できることが観察された。この実験では、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞上のＴＧＦβ１結合受容体またはＴｒｅｇによって産生される重要な転写因子であるＦＯＸＰ３をノックアウトした。ＴＧＦβ１存在におけるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果に対する影響を研究した。本発明者らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いて、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞のＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３をノックアウトした。
【0181】
図３６に示すように、ＴＧＦＢＲ ＩＩの４つの異なる標的配列：ｓｇＲＮＡ－１（標的配列：ＴＧＣＴＧＧＣＧＡＴＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣ、配列番号２８）、ｓｇＲＮＡ－４（標的配列：ＣＣＡＴＧＧＧＴＣＧＧＧＧＧＣＴＧＣＴＣ、配列番号２９）、ＳｇＲＮＡ－５（標的配列：ＣＧＡＧＣＡＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＣＡＴ、配列番号３０）、ｓｇＲＮＡ－８（標的配列：ＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＡＣＣＣＡ、配列番号３１）に対するｓｇＲＮＡを試験した。これらの４つのｓｇＲＮＡは、すべて、ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトを達成することができる（図３６Ａ）。それらのうち、ｓｇＲＮＡ－８が最高効率を有する。最適化の後、ノックアウト効率は、８０％超に達することができる。同様に、ＦＯＸＰ３をノックアウトした。
【0182】
ＴＧＦＢＲ ＩＩをノックアウトした後では、たとえ１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を添加しても、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効果は、いかなる形の影響も受けず、さらに、ＦＯＸＰ３ノックアウトは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅効果を部分的に改善することもできたことが見出された（図３７Ａ）。また、ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトは、ＴＧＦβ１の存在下で、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞からのＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出を有意に増大することができることが見出された。しかし、ＦＯＸＰ３のノックアウトは、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞からのＩＬ－２およびＩＦＮ－γの放出を増大させなかった（図３７ＢおよびＣ）。加えて、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞における、ＴＧＦβ１添加によるＴＣＲ活性化およびＦＯＸＰ３発現を有意に低減することができ（図３８Ａ）、腫瘍細胞に対するＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力を有意に改善できることが見出された（図３８Ｂ）。加えて、ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトは、ＴＧＦβ１の存在下で抗原によって誘導されるＰ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および生存を有意に改善することができる。しかし、ＦＯＸＰ３ノックアウトは、ＴＧＦβ１の存在下で抗原によって誘導される、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖および生存を有意に改善しなかった（図３９ＡおよびＢ）。ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能、ＣＡＲの発現、およびＴ細胞サブセットの分布に影響を及ぼさなかったことは言及に値する（図４０）。
【0183】
３．ＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を改善することができる
この実験は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ４およびＣＤ８サブグループにＴＧＦβ１が及ぼす効果を調査した。ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＲＬ５８２６の共インキュベーション系で、様々な濃度のＴＧＦβ１を添加した。５または１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が添加したとき、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的指向殺滅能力を有意に抑制できたことが見出された（図４１Ａ）が、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力を有意に改善することができた（図４１Ｂ）。また、ＴＧＦβ１は、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞で、ＦＯＸＰ３の上方制御ならびにＩＬ－２およびＩＦＮ－γの下方制御など、多くの遺伝子の発現を転写レベルで調節できることが見出された。ＴＧＢＲ ＩＩをノックアウトした後、ＦＯＸＰ３が低減され、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γが上方制御された（図４１Ｃ～Ｅ）。しかし、ＧＺＭＢの発現は、ＴＧＦβ１によって有意に影響を受けなかった（図４１Ｆ）。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの発現における類似の変化が、タンパク質レベルでも観察された（図４２Ａ）。加えて、ＴＧＦβ１は、抗原によって誘導されるＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を有意に抑制できることも観察された。ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトは、この現象を有意に改善することができるが、ＦＯＸＰ３ノックアウトの効果は明らかでない（図４２Ｂ）。また、複数ラウンドの抗原刺激の後にＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３がノックアウトされたＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力は、編集されていないＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意によかった（図４２Ｃ）。
この実験は、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＣＤ４およびＣＤ８サブグループにＴＧＦβ１が及ぼす効果を調査した。ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＲＬ５８２６の共インキュベーション系で、様々な濃度のＴＧＦβ１を添加した。５または１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１が添加したとき、Ｐ４－ＣＡＲ－Ｔ細胞の標的指向殺滅能力を有意に抑制できたことが見出された（図４１Ａ）が、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力を有意に改善することができた（図４１Ｂ）。また、ＴＧＦβ１は、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞で、ＦＯＸＰ３の上方制御ならびにＩＬ－２およびＩＦＮ－γの下方制御など、多くの遺伝子の発現を転写レベルで調節できることが見出された。ＴＧＢＲ ＩＩをノックアウトした後、ＦＯＸＰ３が低減され、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γが上方制御された（図４１Ｃ～Ｅ）。しかし、ＧＺＭＢの発現は、ＴＧＦβ１によって有意に影響を受けなかった（図４１Ｆ）。ＩＬ－２およびＩＦＮ－γの発現における類似の変化が、タンパク質レベルでも観察された（図４２Ａ）。加えて、ＴＧＦβ１は、抗原によって誘導されるＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を有意に抑制できることも観察された。ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトは、この現象を有意に改善することができるが、ＦＯＸＰ３ノックアウトの効果は明らかでない（図４２Ｂ）。また、複数ラウンドの抗原刺激の後にＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３がノックアウトされたＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力は、編集されていないＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意によかった（図４２Ｃ）。
【0184】
４．ＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３のノックアウトは、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の効果を改善することができる
ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＲＬ５８２６の共インキュベーション系で、様々な濃度のＴＧＦβ１を添加した。添加される濃度が増大するにつれて、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺滅能力の抑制が、より明らかになる（図４３Ａ）が、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３ノックアウトは、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力を有意に改善できることが見出された（図４３Ｂ）。また、ＴＧＦβ１は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞で、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＧＺＭＡ、およびＧＺＭＢの下方制御など、多くの遺伝子の発現を転写レベルで調節できることが見出された。ＴＧＢＲ ＩＩをノックアウトした後、これらの遺伝子の発現を上方制御することができる（図４３Ｃ～Ｆ）。本発明者らは、タンパク質レベルでも、ＩＦＮ－γ発現の類似の変化を観察した（図４４Ａ）。しかし、ＴＧＢＲ ＩＩがノックアウトされているＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞における明らかなＩＬ－２発現を除いて、他のすべての群は、明らかな発現を示さなかった（図４４Ａ）。加えて、ＴＧＦβ１は、抗原によって誘導されるＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を有意に抑制できることも観察された。ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトは、この現象を有意に改善することができるが、ＦＯＸＰ３ノックアウトの効果は明らかでない（図４４Ｂ）。また、複数ラウンドの抗原刺激の後にＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３がノックアウトされたＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力は、編集されていないＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意によかった（図４４Ｃ）。しかし、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原刺激性増殖能および複数ラウンドの殺滅能力が、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意に弱いことは言及に値する。
ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞とＣＲＬ５８２６の共インキュベーション系で、様々な濃度のＴＧＦβ１を添加した。添加される濃度が増大するにつれて、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍殺滅能力の抑制が、より明らかになる（図４３Ａ）が、ＴＧＦＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３ノックアウトは、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力を有意に改善できることが見出された（図４３Ｂ）。また、ＴＧＦβ１は、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞で、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＧＺＭＡ、およびＧＺＭＢの下方制御など、多くの遺伝子の発現を転写レベルで調節できることが見出された。ＴＧＢＲ ＩＩをノックアウトした後、これらの遺伝子の発現を上方制御することができる（図４３Ｃ～Ｆ）。本発明者らは、タンパク質レベルでも、ＩＦＮ－γ発現の類似の変化を観察した（図４４Ａ）。しかし、ＴＧＢＲ ＩＩがノックアウトされているＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞における明らかなＩＬ－２発現を除いて、他のすべての群は、明らかな発現を示さなかった（図４４Ａ）。加えて、ＴＧＦβ１は、抗原によって誘導されるＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖能を有意に抑制できることも観察された。ＴＧＦＢＲ ＩＩノックアウトは、この現象を有意に改善することができるが、ＦＯＸＰ３ノックアウトの効果は明らかでない（図４４Ｂ）。また、複数ラウンドの抗原刺激の後にＴＧＢＲ ＩＩまたはＦＯＸＰ３がノックアウトされたＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺滅能力は、編集されていないＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意によかった（図４４Ｃ）。しかし、ＣＤ８＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原刺激性増殖能および複数ラウンドの殺滅能力が、ＣＤ４＋ ＣＡＲ－Ｔ細胞のものより有意に弱いことは言及に値する。
【実施例9】
【0185】
ＴＧＦＢＲ ＩＩ／ＰＤ１二重編集ＣＡＲ－Ｔ細胞は、固形腫瘍に対する改善された治療効果を有する
９．１ ＴＧＦβ１は、ＰＤ１を上方制御することによってＣＡＲ－Ｔ細胞消耗を加速する
Ｔ細胞シグナリングの連続的活性化によって消耗がもたらされる。消耗したＴ細胞は、増殖能力およびエフェクター機能が低減しており、免疫チェックポイント遺伝子（例えばＰＤ１）の過剰発現を有する。ＴＧＦβ１添加の後、Ｍ２８ｚにおけるＰＤ１ ｍＲＮＡの発現が有意に増大したことが観察され（図４６）、複数ラウンドの抗原刺激アッセイを用いて、ＴＧＦβ１がＣＡＲ－Ｔ細胞消耗を加速するかどうかさらに調査した。ＴＧＦβ１は、複数回の腫瘍細胞攻撃の後、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖に有意に影響を及ぼしたことが見出された。４回目のチャレンジでは、ＴＧＦβ１の存在下で、ほとんどすべてのＣＡＲ－Ｔ細胞が死滅したが、対照細胞は良好に生存した。ＴＧＦＢＲ ＩＩのノックアウトは、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＧＦβ１効果に対して非応答性にし、対照群のものに類似した生存をもたらした（図４７Ａおよび４７Ｂ）。ＴＧＦβ１の存在下では、２回のチャレンジの後、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍溶解活性がゼロまで低減したが、Ｍ２８ｚ－ＴＫＯ（ＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ）細胞は、活性のままだった（図４７Ｃ）。したがって、３ラウンドの腫瘍チャレンジの後、ＴＧＦβ１の添加は、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現を有意に増大させ、ＴＧＦＢＲ ＩＩのノックアウトは、この効果を低減した。一方、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、およびＣＴＬＡ４の発現では、ＴＧＦβ１に対する反応が、より弱く、これは、ＰＤ１が、ＴＧＦβ１駆動のＣＡＲ－Ｔ消耗によって誘導される主な標的であることをさらに示している（図４７Ｄ）。Ｍ２８ｚ－ＴＫＯに、有意な数のＰＤ１発現細胞がまだあることは留意するに値する。これは、それらがＴＧＦβ１シグナリングに応答しないが、ＴＭＥ（腫瘍微小環境）内で、対応するリガンドによって抑制される傾向があることを示している。
９．１ ＴＧＦβ１は、ＰＤ１を上方制御することによってＣＡＲ－Ｔ細胞消耗を加速する
Ｔ細胞シグナリングの連続的活性化によって消耗がもたらされる。消耗したＴ細胞は、増殖能力およびエフェクター機能が低減しており、免疫チェックポイント遺伝子（例えばＰＤ１）の過剰発現を有する。ＴＧＦβ１添加の後、Ｍ２８ｚにおけるＰＤ１ ｍＲＮＡの発現が有意に増大したことが観察され（図４６）、複数ラウンドの抗原刺激アッセイを用いて、ＴＧＦβ１がＣＡＲ－Ｔ細胞消耗を加速するかどうかさらに調査した。ＴＧＦβ１は、複数回の腫瘍細胞攻撃の後、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖に有意に影響を及ぼしたことが見出された。４回目のチャレンジでは、ＴＧＦβ１の存在下で、ほとんどすべてのＣＡＲ－Ｔ細胞が死滅したが、対照細胞は良好に生存した。ＴＧＦＢＲ ＩＩのノックアウトは、ＣＡＲ－Ｔ細胞をＴＧＦβ１効果に対して非応答性にし、対照群のものに類似した生存をもたらした（図４７Ａおよび４７Ｂ）。ＴＧＦβ１の存在下では、２回のチャレンジの後、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍溶解活性がゼロまで低減したが、Ｍ２８ｚ－ＴＫＯ（ＴＧＦＢＲ ＩＩ ＫＯ）細胞は、活性のままだった（図４７Ｃ）。したがって、３ラウンドの腫瘍チャレンジの後、ＴＧＦβ１の添加は、ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現を有意に増大させ、ＴＧＦＢＲ ＩＩのノックアウトは、この効果を低減した。一方、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、およびＣＴＬＡ４の発現では、ＴＧＦβ１に対する反応が、より弱く、これは、ＰＤ１が、ＴＧＦβ１駆動のＣＡＲ－Ｔ消耗によって誘導される主な標的であることをさらに示している（図４７Ｄ）。Ｍ２８ｚ－ＴＫＯに、有意な数のＰＤ１発現細胞がまだあることは留意するに値する。これは、それらがＴＧＦβ１シグナリングに応答しないが、ＴＭＥ（腫瘍微小環境）内で、対応するリガンドによって抑制される傾向があることを示している。
【0186】
ＰＤ１の上方制御がどのようにＴＧＦβの抑制効果に寄与するのかを評価する目的で、ＰＤ１ ＫＯ（Ｍ２８ｚ－ＰＫＯ）およびＰＤ１／ＴＧＦＢＲ ＩＩ二重ＫＯ（Ｍ２８ｚ－ＤＫＯ）ＣＡＲ－Ｔ細胞を作製し、ＰＤＬ１も過剰発現させて、より大きな阻害効果ＴＭＥをモデル化した。ＴＧＦβ１によって誘導されたＭ２８ｚにおけるＰＤ１の上方制御と比較して、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯおよび－ＤＫＯ細胞におけるＰＤ１の発現は、基底レベルまで低減した。これは、この遺伝子編集が有効であることを示している。複数回の腫瘍チャレンジにおいて、ＰＤ１をノックアウトすることによって、ＣＡＲ－Ｔ増殖が改善したが、これは依然として、ＴＫＯおよびＤＫＯよりは悪かった（図４７Ｆ）。ＴＧＦβ１およびＰＤＬ１の過剰発現存在下では、Ｍ２８ｚの腫瘍溶解能力が、第２ラウンドで低減し、第３ラウンドでは、完全に失われた。第３ラウンドでは、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯは、９０％超の腫瘍溶解を達成することができ、第４ラウンドでは、その有効性を失った。一方、Ｍ２８ｚ－ＴＫＯは、第４ラウンドにおいて、腫瘍溶解能力の約６０％を維持することができた（図４７Ｇ）。これらのデータは、すべて、ＰＤ１の上方制御がＴＧＦβの負の調節に部分的に寄与することを示している。他方、一部のＴＫＯ細胞は、依然としてＰＤ１を発現し、それゆえ、ＰＤＬ１によって抑制されるので、ＴＧＦβシグナリングは、ＰＤ１発現の理由の一部でしかない。ＤＫＯ ＣＡＲ－Ｔ細胞が、最高のパフォーマンスを有し、第４ラウンドで腫瘍の約９０％を消失させる（図４７Ｇ）。これは、ＴＧＦβおよびＰＤ１シグナリングの両方を遮断することで、抑制的なＴＭＥに対するＣＡＲ－Ｔの抵抗をさらに改善することができることを示している。
【0187】
９．２ ＴＧＦＢＲ ＩＩ／ＰＤ１二重編集ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＰＤＬ１過剰発現を有するＣＤＸモデルに対する改善された腫瘍排除効果を有する
ＴＧＦβ１およびＰＤＬ１の二重免疫抑制に対するＣＡＲ－Ｔ細胞へのＴＧＦＢＲ ＩＩおよびＰＤ１の二重ＫＯの相乗効果をインビトロで確認した後、ＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１ ＣＤＸモデルにおけるＭ２８ｚ－ＤＫＯのインビボ腫瘍排除における利点をさらに論じた（図４８Ａおよび４８Ｂ）。ＰＢＳ群における急速な増大およびＭ２８ｚ群における遅い増大と比較して、腫瘍体積は、基底レベルに制御され、Ｍ２８ｚ－ＴＫＯ群では、腫瘍の２０％が除去された。しかし、実験の終わりには、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯ群および－ＤＫＯ群の腫瘍の８０％が、それぞれ完全に消失した（図４８Ｃ）。腫瘍サイズおよび腫瘍重量でも同じ傾向が検出された（図４８Ｄおよび４８Ｅ）。ＧｖＨＤ症状を有するマウスが観察されず、すべてのマウスが良好な体重を維持したことは留意するに値する（図４８Ｆ）。末梢血分析は、ｈＣＤ３陽性およびＧＦＰ陽性の細胞の割合が低く、それらが、Ｍ２８ｚ群と比較して、編集ＣＡＲ－Ｔ細胞処置群では増大したが、有意には増大しなかったことを示した（図４８Ｇ）。
ＴＧＦβ１およびＰＤＬ１の二重免疫抑制に対するＣＡＲ－Ｔ細胞へのＴＧＦＢＲ ＩＩおよびＰＤ１の二重ＫＯの相乗効果をインビトロで確認した後、ＣＲＬ５８２６－ＰＤＬ１ ＣＤＸモデルにおけるＭ２８ｚ－ＤＫＯのインビボ腫瘍排除における利点をさらに論じた（図４８Ａおよび４８Ｂ）。ＰＢＳ群における急速な増大およびＭ２８ｚ群における遅い増大と比較して、腫瘍体積は、基底レベルに制御され、Ｍ２８ｚ－ＴＫＯ群では、腫瘍の２０％が除去された。しかし、実験の終わりには、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯ群および－ＤＫＯ群の腫瘍の８０％が、それぞれ完全に消失した（図４８Ｃ）。腫瘍サイズおよび腫瘍重量でも同じ傾向が検出された（図４８Ｄおよび４８Ｅ）。ＧｖＨＤ症状を有するマウスが観察されず、すべてのマウスが良好な体重を維持したことは留意するに値する（図４８Ｆ）。末梢血分析は、ｈＣＤ３陽性およびＧＦＰ陽性の細胞の割合が低く、それらが、Ｍ２８ｚ群と比較して、編集ＣＡＲ－Ｔ細胞処置群では増大したが、有意には増大しなかったことを示した（図４８Ｇ）。
【0188】
腫瘍負荷がＭ２８ｚ－ＤＫＯの排除利点を示すのに十分でないという可能性を考慮して、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯおよび－ＤＫＯ群で、腫瘍除去されたマウスに同じＣＤＸを対側に再接種した。対照群における急速な成長と比較して、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯと－ＤＫＯ群では、再接種の２８日後に腫瘍が再び根絶された（図４８Ｉ、左パネル）。同時に、いずれのマウスもＧｖＨＤ症状を発症せず、良好な体重を維持し（図４８Ｉ、右パネル）、ｈＣＤ３陽性およびＧＦＰ陽性の細胞の比率は、わずか約２％であった（図４８Ｊ）。しかし、Ｍ２８ｚ－ＰＫＯ群では、対側の再接種腫瘍の消失の後、根絶の１０週間後に、原発腫瘍の５０％が再発した（図４８Ｈ）。これらのデータは、Ｍ２８ｚ－ＤＫＯが、インビボで長期にわたる腫瘍排除能力を有するという長所があることを示しており、これは、インビトロでより良好な抗消耗能力をそれが有することと一貫している。
【0189】
実験結果は、本発明の１つまたは複数の抑制タンパク質がノックアウトされているＣＡＲ－Ｔ細胞が、高エフェクター：標的比の非ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞に匹敵する効果を有することを示している。予想外に、低エフェクター：標的比およびより長期の作用の下では、本発明のノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞は、非ノックアウトＣＡＲ－Ｔ細胞より優れている。これは、費用の低減、調製時間の短縮、および高用量投与によって引き起こされる副作用の軽減に特に有益である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【配列表】