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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-25
(45)【発行日】2024-04-02
(54)【発明の名称】ラメラ形成促進剤
(51)【国際特許分類】
A61K 8/60 20060101AFI20240326BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240326BHJP
A61K 31/7016 20060101ALI20240326BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240326BHJP
【ＦＩ】
A61K8/60
A61Q19/00
A61K31/7016
A61P17/00
【請求項の数】
2
(21)【出願番号】P 2020021673
(22)【出願日】2020-02-12
(65)【公開番号】P2021127307
(43)【公開日】2021-09-02
【審査請求日】2023-01-19
(73)【特許権者】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】神谷 義之
(72)【発明者】
【氏名】吉野 崇
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 民恵
(72)【発明者】
【氏名】桜井 哲人
【審査官】田中 雅之
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１５－０２４９８５（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ８／００－ ８／９９
Ａ６１Ｑ １／００－９０／００
Ａ６１Ｋ ３１／３３－３３／４４
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
Ｍｉｎｔｅｌ ＧＮＰＤ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤。
【請求項2】
トレハンジェリン総量に対するトレハンジェリンＡの含有率が４０％以上８０％以下であることを特徴とする請求項１に記載のラメラ形成促進剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤に関する。
【背景技術】
【0002】
トレハンジェリンは、トレハロースの３，３’位のアンジェリカ酸ジエステル体である。本出願人は、トレハンジェリンの化粧品への適用について、皮膚老化抑制作用、美白作用、ＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９の産生抑制作用（特許文献１：特許第６４０６６３６号公報）、さらに光線過敏症抑制作用（特許文献２：特許第６２４９４１５号公報）を見出している。しかし、トレハンジェリンの角質層細胞間脂質のラメラ構造に与える影響については未だ検討されていない。
【0003】
一方、糖類がラメラ構造を保護し、肌のバリア機能を高め、うるおいを保持することが知られており、特許文献３（特許第５７０７０６２号公報）には、マンノシルエリスリトールリピッドとショ糖脂肪酸エステルからなるベシクルを含有する皮膚外用組成物が、角層下層とりわけ下層10層までの細胞間脂質のラメラ構造を回復させる技術が記載されている。特許文献４（特開２００６－４５１８６号公報）には、グルコース及び／又はラフィノースを含有する皮膚の角層細胞におけるラメラ構造再生剤、及びグルコースと少糖類を含有することを特徴とし、少糖類としてはラフィノース、メリビオース、トレハロース、スクロース、マルトース、セロビオース、ゲンチアノース、スタキオース、及びシクロデキストリンからなる群から選ばれる１種以上を含むラメラ構造再生剤の記載がある。このように、トレハンジェリンにラメラ形成促進能があることについては知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【文献】特許第６４０６６３６号公報
【文献】特許第６２４９４１５号公報
【文献】特許第５７０７０６２号公報
【文献】特開２００６－４５１８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、新規なラメラ形成促進剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
１．トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤。
２．トレハンジェリン総量に対するトレハンジェリンＡの含有率が４０％以上８０％以下であることを特徴とする１．記載のラメラ形成促進剤。
１．トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤。
２．トレハンジェリン総量に対するトレハンジェリンＡの含有率が４０％以上８０％以下であることを特徴とする１．記載のラメラ形成促進剤。
【発明の効果】
【0007】
本発明で用いるトレハンジェリンは、角質層細胞間脂質のラメラ構造の形成を促進し、肌のバリア機能を高め、うるおいを保持する効果がある。トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1】ラメラ形成促進能の評価結果
【図2】比較例１（水添加時のマルターゼクロス像）
【図3】比較例１１（トレハロース０．１％水溶液添加時のマルターゼクロス像）
【図4】実施例１（トレハンジェリン０．０１％水溶液添加時のマルターゼクロス像）
【図5】実施例２（トレハンジェリン０．１％水溶液添加時のマルターゼクロス像）
【図6】実施例３（トレハンジェリン１．０％水溶液添加時のマルターゼクロス像）
【図7】実施例４（トレハンジェリン１０％水溶液添加時のマルターゼクロス像）
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤に関する。本発明に用いるトレハンジェリンは、トレハロースの３，３’ 位のアンジェリカ酸ジエステル体の体系名称であり、北里大学生命化学研究所 微生物機能研究室の研究グループによって見出された新規物質である。本明細書において、「トレハンジェリン」とは、下記一般式で表される化合物及びその類縁体を意味する。
【0010】
【化1】
【0011】
本明細書におけるトレハンジェリンとしては、例えば、トレハンジェリンＡ 、トレハン
ジェリンＢ、及びトレハンジェリンＣを挙げることができる。トレハンジェリンＡは下記
式（１）で表される化合物である。
ジェリンＢ、及びトレハンジェリンＣを挙げることができる。トレハンジェリンＡは下記
式（１）で表される化合物である。
【0012】
【化2】
【0013】
本明細書において、トレハンジェリンＢとは、下記式（２）で表される化合物である。
【0014】
【化3】
【0015】
本明細書において、トレハンジェリンＣとは、下記式（３）で表される化合物である。
【0016】
【化4】
【0017】
本明細書において、トレハンジェリンＡ とは、以下の物性を有する化合物である：
（１） 性状： 透明あるいは白色粉末
（２） 分子量：５０６
（３） 分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ１３
（４） 高分解能質量分析による［ Ｍ＋Ｈ ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５０７．２０７８、実測値（ｍ／ｚ）５０７．２０８７
（５） 比旋光度：［α］Ｄ ２５．３＝＋１６７．１２° （ｃ＝０．１、メタノール）
（６） 紫外部吸収極大 λｍａｘ（メタノール中）：２１６ｎｍ
（７） 赤外部吸収極大 νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：=２９１９ｃｍ－１，１０３３ｃｍ－１に極大吸収を有する。
（８） １Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ ：６．１１（１Ｈ，ｍ），５．４８（１Ｈ，ｄｄ），５．２１（１Ｈ，ｄ），３．９２（１Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｄｄ），３．７３（１Ｈ，ｍ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ），３．５６（１Ｈ，ｄｄ），２．０１（３Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｍ）
（９） １３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：１６９．６，１３８．２，１２９．６，９５．１，７６．５，７３．９，７１．６，７０．０，６２．２，２０．８，１６．０
（１０） 溶剤に対する溶解性：エタノール、メタノール及び水に易溶。クロロホルムに難
溶。
（１） 性状： 透明あるいは白色粉末
（２） 分子量：５０６
（３） 分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ１３
（４） 高分解能質量分析による［ Ｍ＋Ｈ ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５０７．２０７８、実測値（ｍ／ｚ）５０７．２０８７
（５） 比旋光度：［α］Ｄ ２５．３＝＋１６７．１２° （ｃ＝０．１、メタノール）
（６） 紫外部吸収極大 λｍａｘ（メタノール中）：２１６ｎｍ
（７） 赤外部吸収極大 νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：=２９１９ｃｍ－１，１０３３ｃｍ－１に極大吸収を有する。
（８） １Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ ：６．１１（１Ｈ，ｍ），５．４８（１Ｈ，ｄｄ），５．２１（１Ｈ，ｄ），３．９２（１Ｈ，ｍ），３．８０（１Ｈ，ｄｄ），３．７３（１Ｈ，ｍ），３．７１（１Ｈ，ｄｄ），３．５６（１Ｈ，ｄｄ），２．０１（３Ｈ，ｍ），１．９５（３Ｈ，ｍ）
（９） １３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：１６９．６，１３８．２，１２９．６，９５．１，７６．５，７３．９，７１．６，７０．０，６２．２，２０．８，１６．０
（１０） 溶剤に対する溶解性：エタノール、メタノール及び水に易溶。クロロホルムに難
溶。
【0018】
又は、トレハンジェリンＡは下記式（１）で表される化合物である。
【0019】
【化5】
【0020】
本明細書において、トレハンジェリンＢ とは、以下の物性を有する化合物である：
（１） 性状：透明あるいは白色粉末
（２） 分子量：５０６
（３） 分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ１３
（４） 高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５０７．２０７８、実測値（ｍ／ｚ）５０７．２０７４
（５） 比旋光度：［α］Ｄ ２５．３＝＋１３．５°（ｃ＝０．１、メタノール）
（６） 紫外部吸収極大 λｍａｘ（メタノール中）：２１８ｎｍ
（７） 赤外部吸収極大 νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：=２９４２ｃｍ－１，１１４７ｃｍ－１に極大吸収を有する。
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：６．２２（１Ｈ，ｍ），６．１２（１Ｈ，ｍ），５．３７（１Ｈ，ｄ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ），５．１６（１Ｈ，ｄ），４．７６（１Ｈ，ｄｄ），４．１３（１Ｈ，ｄｄ），３．９３（１Ｈ，ｄｄｄ），３．８２（１Ｈ，ｄｄ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ），３．６８（１Ｈ，ｄｄ），３．６７（１Ｈ，ｄｄ），３．６４（１Ｈ，ｄｄ），３．６０（１Ｈ，ｍ），３．５９（１Ｈ，ｍ），３．４４（１Ｈ，ｄｄ），２．０８（３Ｈ，ｑｄ），２．００（３Ｈ，ｑｄ），１．９６（３Ｈ，ｄｄ），１．９４（３Ｈ，ｄｑ）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：１６９．６，１６８．８，１４１．２，１３８．５，１２９．６，１２８．５，９５．６，９２．８，７６．４，７４．３，７４．０，７３．９，７２．１，７２．０，７１．５，６９．０，６２．５，６１．６，２０．９，２０．８，１６．５，１６．０
（１０） 溶剤に対する溶解性：エタノール、メタノール及び水に易溶。クロロホルムに難
溶。
（１） 性状：透明あるいは白色粉末
（２） 分子量：５０６
（３） 分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ１３
（４） 高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５０７．２０７８、実測値（ｍ／ｚ）５０７．２０７４
（５） 比旋光度：［α］Ｄ ２５．３＝＋１３．５°（ｃ＝０．１、メタノール）
（６） 紫外部吸収極大 λｍａｘ（メタノール中）：２１８ｎｍ
（７） 赤外部吸収極大 νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：=２９４２ｃｍ－１，１１４７ｃｍ－１に極大吸収を有する。
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：６．２２（１Ｈ，ｍ），６．１２（１Ｈ，ｍ），５．３７（１Ｈ，ｄ），５．３０（１Ｈ，ｄｄ），５．１６（１Ｈ，ｄ），４．７６（１Ｈ，ｄｄ），４．１３（１Ｈ，ｄｄ），３．９３（１Ｈ，ｄｄｄ），３．８２（１Ｈ，ｄｄ），３．７２（１Ｈ，ｄｄ），３．６８（１Ｈ，ｄｄ），３．６７（１Ｈ，ｄｄ），３．６４（１Ｈ，ｄｄ），３．６０（１Ｈ，ｍ），３．５９（１Ｈ，ｍ），３．４４（１Ｈ，ｄｄ），２．０８（３Ｈ，ｑｄ），２．００（３Ｈ，ｑｄ），１．９６（３Ｈ，ｄｄ），１．９４（３Ｈ，ｄｑ）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：１６９．６，１６８．８，１４１．２，１３８．５，１２９．６，１２８．５，９５．６，９２．８，７６．４，７４．３，７４．０，７３．９，７２．１，７２．０，７１．５，６９．０，６２．５，６１．６，２０．９，２０．８，１６．５，１６．０
（１０） 溶剤に対する溶解性：エタノール、メタノール及び水に易溶。クロロホルムに難
溶。
【0021】
又は、トレハンジェリンＢ は下記式（２）で表される化合物である。
【0022】
【化6】
【0023】
本明細書において、トレハンジェリンＣ とは、以下の物性を有する化合物である：
（１） 性状：透明あるいは白色粉末
（２） 分子量：５０６
（３） 分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ１３
（４） 高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５０７．２０７８、実測値（ｍ／ｚ）５０７．２０７４
（５） 比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝＋１１．４°（ｃ＝０．１、メタノール）
（６） 紫外部吸収極大 λｍａｘ（メタノール中）：２１８ｎｍ
（７） 赤外部吸収極大 νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：＝２９２７ｃｍ－１，１１４９ｃｍ－１に極大吸収を有する。
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：６．１５（１Ｈ，ｍ），５．２０（１Ｈ，ｄ），４．９１（１Ｈ，ｄｄ），４．０７（１Ｈ，ｄｄｄ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ），３．６１（１Ｈ，ｄｄ），３．５９（１Ｈ，ｄｄ）３．５１（１Ｈ，ｄｄ），１．９９（３Ｈ，ｍ），１．９１（３Ｈ，ｍ）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：１６８．８，１３９．５，１２９．０，９５．１，７３．４，７２．４，７２．３，７２．０，６２．３，２０．７，１６．１
（１０） 溶剤に対する溶解性： エタノール、メタノール及び水に易溶。クロロホルムに難溶。
（１） 性状：透明あるいは白色粉末
（２） 分子量：５０６
（３） 分子式：Ｃ２２Ｈ３４Ｏ１３
（４） 高分解能質量分析による［Ｍ＋Ｈ］＋ 理論値（ｍ／ｚ）５０７．２０７８、実測値（ｍ／ｚ）５０７．２０７４
（５） 比旋光度：［α］Ｄ２５．３＝＋１１．４°（ｃ＝０．１、メタノール）
（６） 紫外部吸収極大 λｍａｘ（メタノール中）：２１８ｎｍ
（７） 赤外部吸収極大 νｍａｘ（ＫＢｒ錠）：＝２９２７ｃｍ－１，１１４９ｃｍ－１に極大吸収を有する。
（８）１Ｈ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：６．１５（１Ｈ，ｍ），５．２０（１Ｈ，ｄ），４．９１（１Ｈ，ｄｄ），４．０７（１Ｈ，ｄｄｄ），４．０２（１Ｈ，ｄｄ），３．６１（１Ｈ，ｄｄ），３．５９（１Ｈ，ｄｄ）３．５１（１Ｈ，ｄｄ），１．９９（３Ｈ，ｍ），１．９１（３Ｈ，ｍ）
（９）１３Ｃ ＮＭＲ（重メタノール中）δｐｐｍ：１６８．８，１３９．５，１２９．０，９５．１，７３．４，７２．４，７２．３，７２．０，６２．３，２０．７，１６．１
（１０） 溶剤に対する溶解性： エタノール、メタノール及び水に易溶。クロロホルムに難溶。
【0024】
又は、トレハンジェリンＣは下記式（３）で表される化合物である。
【0025】
【化7】
【0026】
（トレハンジェリン類縁体）
トレハンジェリンは水酸基を有することから、当業者に一般的に知られたアシル化反応を利用することによりエステル化合物であるプロドラッグを得ることができる。本発明のトレハンジェリンはこのようなトレハンジェリンのエステル化合物をも包含する。具体的には、トレハンジェリンの水酸基と飽和又は不飽和の低級脂肪酸又は高級脂肪酸とがエステル結合したエステル化合物を包含する。本発明のトレハンジェリンのエステル化合物を与える酸としては、クロトン酸、酢酸、ペンタン酸などの脂肪族カルボン酸； 安息香酸などのアリールカルボン酸； モノ又はジアルキルカルバミン酸； プロパンスルホン酸などの脂肪族スルホン酸； ベンゼンスルホン酸などのアリールスルホン酸； モルホリニルカルボン酸、オキサゾリジニルカルボン酸、アゼチジンカルボン酸などの複素環カルボン酸などを挙げることができる。
トレハンジェリンは水酸基を有することから、当業者に一般的に知られたアシル化反応を利用することによりエステル化合物であるプロドラッグを得ることができる。本発明のトレハンジェリンはこのようなトレハンジェリンのエステル化合物をも包含する。具体的には、トレハンジェリンの水酸基と飽和又は不飽和の低級脂肪酸又は高級脂肪酸とがエステル結合したエステル化合物を包含する。本発明のトレハンジェリンのエステル化合物を与える酸としては、クロトン酸、酢酸、ペンタン酸などの脂肪族カルボン酸； 安息香酸などのアリールカルボン酸； モノ又はジアルキルカルバミン酸； プロパンスルホン酸などの脂肪族スルホン酸； ベンゼンスルホン酸などのアリールスルホン酸； モルホリニルカルボン酸、オキサゾリジニルカルボン酸、アゼチジンカルボン酸などの複素環カルボン酸などを挙げることができる。
【0027】
（トレハンジェリンの生産）
本発明の化粧料等に用いられるトレハンジェリンは、放線菌に分類されるポリモーフォスポラ ルブラ（Polymorphospora rubra） K07-0510株（受託番号 NITE BP-01411）の脱脂コムギ胚芽培地で培養した培養液を各種の有機溶媒で抽出することにより得られる。
また、本発明のトレハンジェリンはこのように放線菌培養物から抽出したものであってもよいし、他の植物、微生物など自然界に存在するものから抽出したものであってもよいし、化学的に合成したものであってもよい。なお、自然界に存在するものから抽出する場合、その精製度は本発明の化粧料としての効果を示す程度であればよく、その限度において不純物を含む粗精製の抽出物であってもよい。
本発明の化粧料等に用いられるトレハンジェリンは、放線菌に分類されるポリモーフォスポラ ルブラ（Polymorphospora rubra） K07-0510株（受託番号 NITE BP-01411）の脱脂コムギ胚芽培地で培養した培養液を各種の有機溶媒で抽出することにより得られる。
また、本発明のトレハンジェリンはこのように放線菌培養物から抽出したものであってもよいし、他の植物、微生物など自然界に存在するものから抽出したものであってもよいし、化学的に合成したものであってもよい。なお、自然界に存在するものから抽出する場合、その精製度は本発明の化粧料としての効果を示す程度であればよく、その限度において不純物を含む粗精製の抽出物であってもよい。
【0028】
（トレハンジェリン産生菌）
本発明のトレハンジェリンは、トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中にトレハンジェリンを蓄積せしめ、該培養物からトレハンジェリンを採取（ 分離・抽出・精製） することにより製造することができる。
「トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」は、放線菌に属する菌であって、トレハンジェリンを生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
本発明のトレハンジェリンの製造方法に用いることのできる菌株には、上記菌株の他、その変異株をはじめ、放線菌に属するトレハンジェリを生産する能力を有する菌すべてが含まれる。微生物が「トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」は、例えば、下記のスクリーニング方法により得ることができる。
本発明のトレハンジェリンは、トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培地で培養し、培養物中にトレハンジェリンを蓄積せしめ、該培養物からトレハンジェリンを採取（ 分離・抽出・精製） することにより製造することができる。
「トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」は、放線菌に属する菌であって、トレハンジェリンを生産する能力を有する微生物であれば特に限定されない。
本発明のトレハンジェリンの製造方法に用いることのできる菌株には、上記菌株の他、その変異株をはじめ、放線菌に属するトレハンジェリを生産する能力を有する菌すべてが含まれる。微生物が「トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物」は、例えば、下記のスクリーニング方法により得ることができる。
【0029】
（スクリーニング方法）
放線菌に属する微生物を培地で培養し、該培養物を分析し、トレハンジェリンが存在すれば当該微生物はトレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物であると決定することができる。
培養方法としては、例えば、スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン０．３％、カツオエキス０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ７．０）が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容三角フラスコに各１ｍＬずつ他候補となる放線菌を植菌し、２７℃ で３日間振盪培養後、得られた種培養液をスターチ２．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽１．０％、カツオ肉エキス０．３％、ドライ酵母０．３％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ７．０）が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容三角フラスコに各１ｍＬずつ植菌し、２７℃で９日間振盪培養する方法が挙げられる。
そして、上記培養方法により得られた培養物の中に、トレハンジェリンが存在すれば当該微生物はトレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物であると決定することができる。
このようなトレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物として好ましくは、ポリモーフォスポラ ルブラ（ Polymorphospora rubra） K07-0510株が挙げられる。
放線菌に属する微生物を培地で培養し、該培養物を分析し、トレハンジェリンが存在すれば当該微生物はトレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物であると決定することができる。
培養方法としては、例えば、スターチ２．４％、グルコース０．１％、ペプトン０．３％、カツオエキス０．３％、酵母エキス０．５％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ７．０）が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容三角フラスコに各１ｍＬずつ他候補となる放線菌を植菌し、２７℃ で３日間振盪培養後、得られた種培養液をスターチ２．０％、グリセロール０．５％、脱脂小麦胚芽１．０％、カツオ肉エキス０．３％、ドライ酵母０．３％、炭酸水素カルシウム０．４％からなる液体培地（ｐＨ７．０）が１００ｍＬ入った５００ｍＬ容三角フラスコに各１ｍＬずつ植菌し、２７℃で９日間振盪培養する方法が挙げられる。
そして、上記培養方法により得られた培養物の中に、トレハンジェリンが存在すれば当該微生物はトレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物であると決定することができる。
このようなトレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物として好ましくは、ポリモーフォスポラ ルブラ（ Polymorphospora rubra） K07-0510株が挙げられる。
【0030】
（ポリモーフォスポラ ルブラ（ Polymorphospora rubra） K07-0510株）
本菌株は、北里大学によりポリモーフォスポラ ルブラ（ Polymorphospora rubra) K07-0510として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに寄託されている（受託日２０１２年８月２８日、受託番号NITE BP-01411）。
本菌株は、北里大学によりポリモーフォスポラ ルブラ（ Polymorphospora rubra) K07-0510として、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許生物寄託センターに寄託されている（受託日２０１２年８月２８日、受託番号NITE BP-01411）。
【0031】
トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物を培養するための培地には、栄養源として、放線菌の栄養源として使用し得るものであればよい。また、トレハンジェリンを生産する能力を有する放線菌に属する微生物の培養は、生産菌が発育しトレハンジェリンを生産できる温度範囲（ 例えば、１０－４０℃、好ましくは、２５－３０℃）で数日～２週間振盪培養することにより行うことができる。培養条件は、本明細書の記載を参照しながら、使用するトレハンジェリンの生産菌の性質に応じて適宜選択して行なうことができる。
【0032】
トレハンジェリンの採取は、培養液より酢酸エチル等の水不混和性の有機溶媒を用いて抽出することにより行うことができる。本抽出法に加え、脂溶性物質の採取に用いられる公知の方法、例えば吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーよりのかき取り、遠心向流分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を適宜組合せるか、あるいは繰返すことによって純粋になるまで精製することができる。
【0033】
ところで、本願発明の発明者らは、上記トレハンジェリンが角質層細胞間脂質のラメラ構造の形成を促進し、肌のバリア機能を高め、うるおいを保持する効果があるという知見を得て、トレハンジェリンを含有するラメラ形成促進剤を完成させた。以下、本発明のラメラ形成促進剤について説明する。
【0034】
本発明のラメラ形成促進剤は、ラメラ形成促進を目的とする添加材として提供され、また、本発明のラメラ形成促進剤は、ラメラ形成促進作用を目的とする皮膚外用剤、化粧料、医薬部外品、医薬品として提供されるものであって、通常使用される製剤化方法にしたがって製造することができ、植物油のような油脂類、高級脂肪酸、高級アルコール、シリコーン、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤、防腐剤、糖類、金属イオン封鎖剤、水溶性高分子のような高分子、増粘剤、粉体成分、紫外線吸収剤、紫外線遮断剤、ヒアルロン酸のような保湿剤、香料、ｐＨ調整剤等を含有させることができる。ビタミン類、皮膚賦活剤、血行促進剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、抗炎症剤、美白剤、殺菌剤等の他の薬効成分、生理活性成分を含有させることもできる。
【0035】
本発明において、トレハンジェリン総量とは、上記トレハンジェリンＡ，Ｂ，Ｃ並びに類縁体の総量のことである。
【0036】
本発明のラメラ形成促進剤に含有されるトレハンジェリンは、トレハンジェリンＡ、Ｂ、Ｃ、又は類縁体が、それぞれ単独であっても、それらのうちいずれか２つ以上が共存した状態であってもよく、特に制限はされないが、トレハンジェリン総量に対するトレハンジェリンＡの含有率が、４０％以上８０％以下であることが好ましく、５０％以上７０％以下であることがさらに好ましい例として挙げられる。トレハンジェリン総量に対するトレハンジェリンＡ以外のトレハンジェリンＢ，Ｃ、又は類縁体の含有率は、２０％以上６０％以下であることが好ましく、３０％以上５０％以下であることがさらに好ましい例として挙げられる。
【0037】
本発明のラメラ形成促進剤は化粧料、医薬部外品、医薬品を含むものであって、化粧水、乳液、クリーム、ジェル等の、溶液状、乳化物状、高分子ゲル状製剤とすることができる。また、泡状製剤、多層状製剤、スプレー製剤、不織布等に含浸させたシートあるいはゲルパック製剤であってもよい。
【0038】
本発明のラメラ形成促進剤には、目的に応じて任意成分として保湿剤、界面活性剤、増粘剤、抗炎症剤、ビタミン類、抗酸化剤、血行促進剤、創傷治癒剤、抗菌性物質、皮膚賦活剤、常在菌コントロール剤、活性酸素消去剤、美白剤等の薬効成分を含有させることができる。
【0039】
薬効成分としては、従来、医薬品、医薬部外品、化粧品、衛生材料等で使用されていて、水中に溶解、または分散可能なものであれば特に限定されることなく使用することができる。具体的には、アシタバエキス、アボガドエキス、アマチャエキス、アルテアエキス、アルニカエキス、アンズエキス、アンズ核エキス、ウイキョウエキス、ウコンエキス、ウーロン茶エキス、エチナシ葉エキス、オウゴンエキス、オウバクエキス、オオムギエキス、オランダカラシエキス、オレンジエキス、海水乾燥物、加水分解エラスチン、加水分解コムギ末、加水分解シルク、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、甘草エキス、カルカデエキス、キウイエキス、キナエキス、キューカンバーエキス、グアノシン、クマザサエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、クレマティスエキス、酵母エキス、ゴボウエキス、コンフリーエキス、コラーゲン、コケモモエキス、サイコエキス、サイタイ抽出液、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンザシエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、ショウブ根エキス、シラカバエキス、スギナエキス、スイカズラエキス、セイヨウキズタエキス、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、ゼニアオイエキス、センブリエキス、タイソウエキス、タイムエキス、チョウジエキス、チガヤエキス、チンピエキス、トウヒエキス、ドクダミエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、パセリエキス、蜂蜜、パリエタリアエキス、ヒキオコシエキス、ビサボロール、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブッチャーブルームエキス、ブドウエキス、プロポリス、ヘチマエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、ホップエキス、マツエキス、マロニエエキス、ミズバショウエキス、ムクロジエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユズエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、リンゴエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス等を挙げることができる。
【0040】
また、アミノ酸、尿素、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、ベタイン、ホエイ、トリメチルグリシン等の保湿剤；スフィンゴ脂質、セラミド、コレステロール、コレステロール誘導体、リン脂質等の油性成分；ε－アミノカプロン酸、グリチルリチン酸、β－グリチルレチン酸、塩化リゾチーム、グアイアズレン、ヒドロコルチゾン等の抗炎症剤；ビタミンＡ，Ｂ２，Ｂ６，Ｄ，Ｅ、パントテン酸カルシウム、ビオチン、ニコチン酸アミド等のビタミン類；トコフェロール、カロチノイド、フラボノイド、タンニン、リグナン、サポニン等の抗酸化剤；γ－オリザノール、ビタミンＥ誘導体等の血行促進剤；レチノール、レチノール誘導体等の創傷治癒剤；デオキシリボ核酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、コラーゲン、エラスチン、キチン、キトサン、加水分解卵殻膜等の生体高分子；アラントイン、ジイソプロピルアミンジクロロアセテート、４－アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等の活性成分；セファランチン、トウガラシチンキ、ヒノキチオール、ヨウ化ニンニクエキス、塩酸ピリドキシン、ｄｌ－α－トコフェロール、酢酸ｄｌ－α－トコフェロール、ニコチン酸、ニコチン酸誘導体、Ｄ－パントテニルアルコール、アセチルパントテニルエチルエーテル、ビオチン、アラントイン、イソプロピルメチルフェノール、エストラジオール、エチニルエステラジオール、塩化カルプロニウム、塩化ベンザルコニウム、塩酸ジフェンヒドラミン、タカナール、カンフル、サリチル酸、ノニル酸バニリルアミド、ノナン酸バニリルアミド、ピロクトンオラミン、ペンタデカン酸グリセリル、モノニトログアヤコール、レゾルシン、γ－アミノ酪酸、塩化ベンゼトニウム、塩酸メキシレチン、オーキシン、女性ホルモン、カンタリスチンキ、シクロスポリン、ヒドロコルチゾン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン等も挙げられる。
【0041】
以下、本願発明者らが行った試験であって、該発明者らがトレハンジェリンに極めて優れたラメラ形成促進能があるとの知見を得た試験について説明する。
【実施例】
【0042】
＜ラメラ形成促進能の評価＞
（人工細胞間脂質の作成）
水相として、Ｃｅｒａｍｉｄｅ ＴＩＣ－００１（高砂香料工業（株））０．０４ｇ、Ｃｅｒａｍｉｄｅ３（Evonik Degussa社製、ドイツ）０．０４ｇ、Ｃｅｒａｍｉｄｅ４（Evonik Degussa社製、ドイツ）０．０４ｇ、硫酸コレステロール（シグマアルドリッチジャパン）０．０２ｇ、精製水２．５ｇを、油相としてステアリン酸（富士フィルム和光純薬（株））０．０８ｇ、コレステロール（富士フィルム和光純薬（株））０．０８ｇを、それぞれ８０℃で融解させた後、水相を油相へ添加して混合した。その後、１０℃で１０分間の超音波処理を行い、再度８０℃で融解、混合し、１０℃で１０分間、超音波処理を行ったものを人工細胞間脂質とした。
（人工細胞間脂質の作成）
水相として、Ｃｅｒａｍｉｄｅ ＴＩＣ－００１（高砂香料工業（株））０．０４ｇ、Ｃｅｒａｍｉｄｅ３（Evonik Degussa社製、ドイツ）０．０４ｇ、Ｃｅｒａｍｉｄｅ４（Evonik Degussa社製、ドイツ）０．０４ｇ、硫酸コレステロール（シグマアルドリッチジャパン）０．０２ｇ、精製水２．５ｇを、油相としてステアリン酸（富士フィルム和光純薬（株））０．０８ｇ、コレステロール（富士フィルム和光純薬（株））０．０８ｇを、それぞれ８０℃で融解させた後、水相を油相へ添加して混合した。その後、１０℃で１０分間の超音波処理を行い、再度８０℃で融解、混合し、１０℃で１０分間、超音波処理を行ったものを人工細胞間脂質とした。
【0043】
（評価検体の調製）
実施例として、トレハンジェリン０．０１，０．１，１．０，１０質量％水溶液を調製した。
トレハンジェリン総量に対して、トレハンジェリンＡの含有率が６３％、トレハンジェリンＢ、Ｃ及び類縁体の含有率が３７％であるトレハンジェリン生産品を使用した。
比較例として、トレハロースの０．０１，０．１，１．０質量％水溶液、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラフィノースの０．１，１．０質量％水溶液を調製した。なお、グルコースは単糖、トレハロースとスクロースは二糖、ソルビトールは糖アルコール、ラフィノースは三糖の代表例として用いた。人工細胞間脂質４０ｍｇに、調製した各糖水溶液並びに糖を含まない水（コントロール）を各々１０μLずつ添加した。８０℃のウォーターバスで１０分間加熱し、十分混合した。その後、１０℃で１０分間超音波処理し、８０℃のウォーターバスで10分間加熱することを２回繰り返すことで得られたラメラエマルションを評価検体とした。
実施例として、トレハンジェリン０．０１，０．１，１．０，１０質量％水溶液を調製した。
トレハンジェリン総量に対して、トレハンジェリンＡの含有率が６３％、トレハンジェリンＢ、Ｃ及び類縁体の含有率が３７％であるトレハンジェリン生産品を使用した。
比較例として、トレハロースの０．０１，０．１，１．０質量％水溶液、グルコース、スクロース、ソルビトール、ラフィノースの０．１，１．０質量％水溶液を調製した。なお、グルコースは単糖、トレハロースとスクロースは二糖、ソルビトールは糖アルコール、ラフィノースは三糖の代表例として用いた。人工細胞間脂質４０ｍｇに、調製した各糖水溶液並びに糖を含まない水（コントロール）を各々１０μLずつ添加した。８０℃のウォーターバスで１０分間加熱し、十分混合した。その後、１０℃で１０分間超音波処理し、８０℃のウォーターバスで10分間加熱することを２回繰り返すことで得られたラメラエマルションを評価検体とした。
【0044】
（観察と解析）
スライドガラスに評価検体２ｍｇを測りとり、カバーガラスで均一に広げた状態で偏光顕微鏡（オリンパス（株） ＢＸ５０、γ＝５３０ｎｍ、倍率２００倍、観察範囲１１０μｍ×８２μｍ）による観察を行い撮像した。撮像した画像を三谷商事（株）製 ＷｉｎＲＯＯＦを用いて、観察範囲中のマルターゼクロス像（ラメラ構造と同義）の面積と個数を測定した。水添加時ならびに各評価検体のマルターゼクロス像の平均面積を算出し、水添加時の平均面積を１とした場合と比較した各評価検体の平均面積の比を求め、ラメラ形成促進率とした。
スライドガラスに評価検体２ｍｇを測りとり、カバーガラスで均一に広げた状態で偏光顕微鏡（オリンパス（株） ＢＸ５０、γ＝５３０ｎｍ、倍率２００倍、観察範囲１１０μｍ×８２μｍ）による観察を行い撮像した。撮像した画像を三谷商事（株）製 ＷｉｎＲＯＯＦを用いて、観察範囲中のマルターゼクロス像（ラメラ構造と同義）の面積と個数を測定した。水添加時ならびに各評価検体のマルターゼクロス像の平均面積を算出し、水添加時の平均面積を１とした場合と比較した各評価検体の平均面積の比を求め、ラメラ形成促進率とした。
【0045】
（結果）
結果を表１、図１に示す。表１の結果を図示したものが図１である。
比較例に示した糖のラメラ形成促進率と比べて、トレハンジェリンのラメラ形成促進率は０．０１質量％の低濃度でも５．４１倍、０．１質量％では４．３３倍、１．０質量％では８．３９倍、１０質量％では９．３８倍であった。すなわち、トレハンジェリンには顕著なラメラ形成促進能があることが確認できた。
結果を表１、図１に示す。表１の結果を図示したものが図１である。
比較例に示した糖のラメラ形成促進率と比べて、トレハンジェリンのラメラ形成促進率は０．０１質量％の低濃度でも５．４１倍、０．１質量％では４．３３倍、１．０質量％では８．３９倍、１０質量％では９．３８倍であった。すなわち、トレハンジェリンには顕著なラメラ形成促進能があることが確認できた。
【0046】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
