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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-25
(45)【発行日】2024-04-02
(54)【発明の名称】ｃ－ＫＩＴ陽性腫瘍特異的抗体断片
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240326BHJP
A61K 31/409 20060101ALI20240326BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240326BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240326BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20240326BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240326BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240326BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68 ZNA
A61K31/409
A61K39/395 L
A61K39/395 T
A61K49/00
A61K41/00
A61P35/00
C07K16/28
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2023543774
(86)(22)【出願日】2022-08-02
(86)【国際出願番号】 JP2022029636
(87)【国際公開番号】W WO2023026791
(87)【国際公開日】2023-03-02
【審査請求日】2023-10-24
(31)【優先権主張番号】P 2021139380
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【早期審査対象出願】
(73)【特許権者】
【識別番号】399032282
【氏名又は名称】株式会社 免疫生物研究所
(73)【特許権者】
【識別番号】304020292
【氏名又は名称】国立大学法人徳島大学
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】清藤 勉
(72)【発明者】
【氏名】瀬川 辰也
(72)【発明者】
【氏名】清水 衞
(72)【発明者】
【氏名】高山 哲治
(72)【発明者】
【氏名】六車 直樹
(72)【発明者】
【氏名】藤本 将太
(72)【発明者】
【氏名】樫原 孝典
【審査官】榎本 佳予子
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０２０／１７９７４９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】FUJIMOTO S. et al.，A Novel Theranostic Combination of Near-infrared Fluorescence Imaging and Laser Irradiation Targetin，Theranostics，2018年，Vol. 8, Issue 9，2313-2328
【文献】MAO C. et al.，P-glycoprotein Targeted Photodynamic Therapy of Chemoresistant Tumors using Recombinant Fab Fragment，Biomaterials Science，2018年，Vol.6, No.11，3063-3074
【文献】WEI D. et al.，Selective Photokilling of Colorectal Tumors by Near-Infrared Photoimmunotherapy with a GPA33-Targete，molecular pharmaceutics，2020年，17，2508-2517
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｋ ３１／００－３３／４４
Ａ６１Ｋ ３９／３９５
Ａ６１Ｋ ４９／００－４９／２２
Ａ６１Ｋ ４１／００－４１／１７
Ａ６１Ｐ １／００－４３／００
Ｃ０７Ｋ １６／２８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列からなる抗体重鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号４又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなる抗体軽鎖におけるＣＤＲを有する抗体の抗原結合性断片と、それに結合するＩＲ７００とを有する複合体であって、
前記抗原結合性断片が、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’） ２ である、複合体。
【請求項2】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖におけるＣＤＲが、以下の（ａ）または（ｂ）である、請求項１に記載の複合体。（ａ）重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）１が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＨ２が、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＨ３が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる
（ｂ）ＣＤＲＨ１が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＨ２が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＨ３が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる。
【請求項3】
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲが、以下の（ａ’）または（ｂ’）である、請求項１に記載の複合体。（ａ’）軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）１が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＬ２が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＬ３が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる
（ｂ’）ＣＤＲＬ１が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列ＧＩＳからなり、かつ、
ＣＤＲＬ３が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなる。
【請求項4】
抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）が１～１０である、請求項１に記載の複合体。
【請求項5】
前記抗体断片が更に別の標識物質と結合することにより標識化されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項6】
前記抗原結合性断片が、ヒト化抗体の断片である、請求項１に記載の複合体。
【請求項7】
複数の請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の複合体を有する組成物であって、当該組成物中の該複合体の抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）の平均値が１～１０である、組成物。
【請求項8】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する、がん検出用組成物。
【請求項9】
請求項８に記載のがん検出用組成物であって、当該組成物の投与から６時間以内にがんを検出するために用いられる、組成物。
【請求項10】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する、診断用組成物。
【請求項11】
がんの診断用である、請求項１０に記載の診断用組成物。
【請求項12】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する、治療用組成物。
【請求項13】
がん治療用である、請求項１２に記載の治療用組成物。
【請求項14】
請求項１２に記載の治療用組成物であって、当該組成物の投与後に、当該組成物の集積部位に近赤外光が照射される組成物。
【請求項15】
請求項１４に記載の治療用組成物であって、当該組成物の投与から１時間後以降１２時間後以内に近赤外光が照射される、組成物。
【請求項16】
請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する、診断および治療の両方に用いられるための組成物。
【請求項17】
がんの診断および治療用である、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｃ－ＫＩＴ陽性腫瘍である消化管間質腫瘍の診断および治療の分野に関する。
【背景技術】
【0002】
消化管間質腫瘍（Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒ：ＧＩＳＴ）は消化管の粘膜下の間葉系細胞から由来する腫瘍で、通常は正常な粘膜に覆われているため、一般的な内視鏡では他のタイプの粘膜下腫瘍と区別することが困難である。
【0003】
最近、ＥＵＳ－ＦＮＡ（Ｅｎｄｏｓｃｏｐｉｃ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ－ｇｕｉｄｅｄ ｆｉｎｅ ｎｅｅｄｌｅ ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ）超音波内視鏡穿刺吸引細胞診が開発されＧＩＳＴの診断が可能になった。しかし、これは非常に高度な技術を要し、特に２ｃｍ以下の場合ＥＵＳ－ＦＮＳでも実施が困難で、組織学的診断が出来ないまま、経時的にフォローアップしている状態である。また、２ｃｍ以下のＧＩＳＴでも肝臓への転移や早い腫瘍増殖が見られる等が報告され、もっとシンプルで効果的な診断技術と治療法が待望されている。
【0004】
ＰＥＴ（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）ポジトロン放射断層撮影がＧＩＳＴ等でも診断に利用されているが、リンパ腫や平滑筋肉腫等を含む他の悪性腫瘍や、炎症性の病巣との区別が困難であるうえに、患者が高用量の放射線を被爆するという問題もある。
【0005】
また、ＰＤＴ（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ）光力学療法では、光線の特異的な波長によって活性化される光感受性物質を利用して、様々なタイプのがんで治療が試みられたが、腫瘍細胞を死滅させる一方で、非がん細胞をも傷めるために重大な副作用が見られる。
【0006】
一方、ＧＩＳＴの標的分子ｃ－ＫＩＴを利用し、抗ｃ－ＫＩＴ抗体にＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（ＡＦ４８８）を結合してＧＩＳＴのモデルマウスを用いて、腹腔鏡検査の開発が行われた。しかし、その目論見は、正常組織の自家蛍光が強すぎ、擬陽性の比率が高すぎるため実用化されなかった。
【0007】
そこで考えられたのが、ＮＩＲ（Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ）近赤外線である。ＮＩＲは、生体において自家蛍光が非常に低く、可視光線よりもっと深く組織へ透過できるため、ＧＩＳＴの内視鏡分子イメージングとして最も的確な戦略である。近年、腫瘍特異的な分子に対する抗体に光感受性物質を結合して、診断や治療が出来る、ＰＩＴ（Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）光免疫療法が発見された。これは、ＰＤＴの新しいタイプの利用法として高い選択性が報告されている。この方法は、特異抗体と色素の結合物とのみに反応する細胞（腫瘍細胞）だけに障害をもたらすため、副作用が最小化されるというがん治療法である。この療法は、がん細胞の標的分子に対する特異的な抗体が鍵である。
【0008】
ＧＩＳＴの腫瘍細胞は表面にｃ－ＫＩＴを発現していて、患者の９０％以上が陽性であることが知られている。そこで、本発明者らは、ｃ－ＫＩＴを標的分子として、この分子に対する抗体にＩＲ７００色素を結合させ、近赤外線照射によるＧＩＳＴの診断および治療を試みた（非特許文献１）。しかし、この方法では、蛍光が最大値に達する、すなわち抗体が集積するまでに２４時間が必要であり、Ｓ／Ｎ比が最大値に達するまでには１２０時間必要なことなど、投与から検出までに時間を要することが問題であった。また、９０Ｙ標識したｃ－ＫＩＴ抗体を用いた研究が報告されており、この場合も治療効果を奏するまでに数日要している（非特許文献２）。更に、それ以前に抗ｃ－ＫＩＴ抗体のＦａｂ断片を用いて６４Ｃｕ標識させることが試みられているが、ヌードマウスを用いた実験では取り込みまでに６～１２時間を要している（非特許文献３、Ｔａｂｌｅ３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0009】
【文献】Ｓｈｏｔａ Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ（２０１８）８（９）：２３１３－２３２８．
【文献】Ｃｈｉｓａｔｏ Ｙｏｓｈｉｄａら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ（２０１３）８（３）ｅ５９２４８．
【文献】Ｃｈｉｓａｔｏ Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）３８：３３１－３３７．
【発明の概要】
【0010】
そこで、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで早期に腫瘍内に取り込まれるｃ－ＫＩＴを標的分子とする標識剤および治療薬を提供することを課題とする。
【0011】
本発明者らは、ｃ－ＫＩＴ特異的に結合する分子種および当該分子種と結合させる標識剤および治療剤について検討した結果、抗ｃ－ＫＩＴ抗体のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片とＩＲ７００とを組み合わせることにより、投与から数時間という短時間で腫瘍に集積させ、検出できることを見出した。
【0012】
また、抗ｃ－ＫＩＴ抗体のＦａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片とＩＲ７００と複合体を腫瘍に集積させた後に、ＰＩＴ処理を施すことにより、検出と同じ複合体を用いて治療も行うことができることも見出した。
【0013】
よって、本発明は、抗ｃ－ＫＩＴ抗体の抗原結合性断片とＩＲ７００との複合体に関し、また当該複合体を有効成分として含有する検出薬および治療薬に関する。
（１） 配列番号２又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号４又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲを有する抗体の抗原結合性断片と、ＩＲ７００とを有する複合体。
（２） 抗体の抗原結合性断片が、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２である、（１）に記載の複合体。
（３） 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖におけるＣＤＲが、以下の（ａ）または（ｂ）である、（１）または（２）に記載の複合体。
（ａ）重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）１が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＨ２が、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＨ３が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる
（ｂ）ＣＤＲＨ１が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＨ２が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＨ３が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる。
（４） 配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲが、以下の（ａ’）または（ｂ’）である、（３）に記載の複合体。
（ａ’）軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）１が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＬ２が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＬ３が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる
（ｂ’）ＣＤＲＬ１が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列ＧＩＳからなり、かつ、
ＣＤＲＬ３が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなる。
（５） 抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）が１～１０である、（１）～（４）のいずれかに記載の複合体。
（６） 前記抗体断片が更に別の標識物質と結合することにより標識化されている、（１）～（５）のいずれかに記載の複合体。
（７） 複数の（１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有する組成物であって、当該組成物中の該複合体の抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）の平均値が１～１０である、組成物。
（８） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、がん検出用組成物。
（９） （８）に記載のがん検出用組成物であって、当該組成物の投与から６時間以内にがんを検出するために用いられる、組成物。
（１０） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、がん治療用組成物。
（１１） がんの診断用である、（１０）に記載の診断用組成物。
（１２） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、治療用組成物。
（１３） がん治療用である、（１２）に記載の治療用組成物。
（１４） （１２）又は（１３）に記載の治療用組成物であって、当該組成物の投与後に、当該組成物の集積部位に近赤外光が照射される組成物。
（１５） （１４）に記載の治療用組成物であって、当該組成物の投与から１時間後以降１２時間後以内に近赤外光が照射される、組成物。
（１６） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、診断および治療の両方に用いられるための組成物。
（１７） がんの診断および治療用である、（１６）に記載の組成物。
（１８） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を投与することを含む、がんを検出する方法。
（１９） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を投与することを含む、がんを治療する方法。
（２０） がんの治療において使用するための、（１）～（６）のいずれかに記載の複合体。
（２１） がんを治療する医薬の製造における、（１）～（６）のいずれかに記載の複合体の使用。
（１） 配列番号２又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号４又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲを有する抗体の抗原結合性断片と、ＩＲ７００とを有する複合体。
（２） 抗体の抗原結合性断片が、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２である、（１）に記載の複合体。
（３） 配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖におけるＣＤＲが、以下の（ａ）または（ｂ）である、（１）または（２）に記載の複合体。
（ａ）重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ）１が、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＨ２が、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＨ３が、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる
（ｂ）ＣＤＲＨ１が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＨ２が、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＨ３が、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなる。
（４） 配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲが、以下の（ａ’）または（ｂ’）である、（３）に記載の複合体。
（ａ’）軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ）１が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＬ２が、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなり、かつ、
ＣＤＲＬ３が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなる
（ｂ’）ＣＤＲＬ１が、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなり、
ＣＤＲＬ２が、アミノ酸配列ＧＩＳからなり、かつ、
ＣＤＲＬ３が、配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなる。
（５） 抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）が１～１０である、（１）～（４）のいずれかに記載の複合体。
（６） 前記抗体断片が更に別の標識物質と結合することにより標識化されている、（１）～（５）のいずれかに記載の複合体。
（７） 複数の（１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有する組成物であって、当該組成物中の該複合体の抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）の平均値が１～１０である、組成物。
（８） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、がん検出用組成物。
（９） （８）に記載のがん検出用組成物であって、当該組成物の投与から６時間以内にがんを検出するために用いられる、組成物。
（１０） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、がん治療用組成物。
（１１） がんの診断用である、（１０）に記載の診断用組成物。
（１２） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、治療用組成物。
（１３） がん治療用である、（１２）に記載の治療用組成物。
（１４） （１２）又は（１３）に記載の治療用組成物であって、当該組成物の投与後に、当該組成物の集積部位に近赤外光が照射される組成物。
（１５） （１４）に記載の治療用組成物であって、当該組成物の投与から１時間後以降１２時間後以内に近赤外光が照射される、組成物。
（１６） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、診断および治療の両方に用いられるための組成物。
（１７） がんの診断および治療用である、（１６）に記載の組成物。
（１８） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を投与することを含む、がんを検出する方法。
（１９） （１）～（６）のいずれかに記載の複合体を投与することを含む、がんを治療する方法。
（２０） がんの治療において使用するための、（１）～（６）のいずれかに記載の複合体。
（２１） がんを治療する医薬の製造における、（１）～（６）のいずれかに記載の複合体の使用。
【発明の効果】
【0014】
本発明の複合体は、投与後数時間という短時間で腫瘍に集積することから、腫瘍検出までの時間を短縮化することができる。更に、本発明の複合体は、集積した腫瘍に対してＰＩＴ処理を行うことにより、腫瘍を殺傷する効果を有することからがん治療に用いることができる。特に、同じ複合体を検出と治療に用いることもできることから、１種類の薬剤投与で検出から治療までを行うことも可能である。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】実施例２の各抗体における共焦点顕微鏡による細胞イメージングの結果を表す写真である。左上はＩＲ７００と結合したＩｇＧ（ＩＲ７００－ＩｇＧ，ネガティブコントロール）、右上はＩＲ７００と結合した完全長の１２Ａ８抗体（ＩＲ７００－１２Ａ８ Ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）、左下はＩＲ７００と結合した１２Ａ８抗体のＦａｂ断片（ＩＲ７００－１２Ａ８ Ｆａｂ）、右下はＩＲ７００と結合した１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片（ＩＲ７００－１２Ａ８ Ｆ（ａｂ’）２）の結果を示す。
【図2】図１で測定された蛍光強度をグラフにしたものである。縦軸は平均蛍光強度（ｃｐｓ／ｃｅｌｌ）を示す。ＩｇＧ１（ＮＣ）はネガティブコントロールＩｇＧ、Ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙは完全長の１２Ａ８抗体、Ｆ（ａｂ’）２は１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂは１２Ａ８抗体のＦａｂ断片の結果を表す。
【図3】担がんヌードマウスモデルにおける各抗体の蛍光イメージングの結果を示す。Ｗｈｏｌｅ ＩｇＧは完全長の１２Ａ８抗体、Ｆ（ａｂ’）２は１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂは１２Ａ８抗体のＦａｂ断片の結果を表す。各写真の下は、標識化抗体又は標識化抗原結合性断片投与からの経過時間（ｈ）を表す。
【図5】担がんヌードマウスモデルにおける各抗体のＳ／Ｎ比を示すグラフである。縦軸はシグナルノイズ比（ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）、横軸は標識化抗体又は標識化抗原結合性断片投与からの経過時間（ｈ）を表す。
【図6】Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＩＴ（Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）治療試験の概略図である。
【図7】担がんヌードマウスを用いたＰＩＴ治療の前後を比較した写真である。左は、ＰＩＴ処理を受けていない陰性対照のマウスの写真であり、１２Ａ８抗体のＦａｂ断片投与マウス（Ｆａｂ Ｖｅｈｉｃｌｅ）（上）、１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片投与マウス（Ｆ（ａｂ’）２ Ｖｅｈｉｃｌｅ）（下）の写真である。右はＰＩＴ処理群のマウスの写真であり、１２Ａ８抗体のＦａｂ断片投与＋ＰＩＴ処理（Ｆａｂ ＰＩＴ後）（上）、１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片投与＋ＰＩＴ処理（Ｆ（ａｂ’）２ ＰＩＴ後）（下）のマウスの写真である。
【図8】担がんヌードマウスを用いたＰＩＴ治療前後の蛍光標識抗ｃ－ＫＩＴ抗体による蛍光強度を比較した写真である。左は、ＰＩＴ処理を受けていない陰性対照のマウスの写真であり、１２Ａ８抗体のＦａｂ断片投与マウス（Ｆａｂ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｖｅｈｉｃｌｅ））（上）、１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片投与マウス（Ｆ（ａｂ’）２ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｖｅｈｉｃｌｅ））（下）の写真である。右はＰＩＴ処理群のマウスの写真であり、１２Ａ８抗体のＦａｂ断片投与＋ＰＩＴ処理（Ｆａｂ ＰＩＴ後）（上）、１２Ａ８抗体のＦ（ａｂ’）２断片投与＋ＰＩＴ処理（Ｆ（ａｂ’）２ ＰＩＴ後）（下）のマウスの写真である。
【図9】担がんヌードマウスを用いたＰＩＴ治療試験における腫瘍サイズの経時変化を示すグラフである。縦軸は腫瘍サイズ（ｍｍ３）を示し、横軸は腫瘍移植後の経過日数を示す。ＰＩＴ処理は腫瘍移植から２８日後に行った。
【図10-1】ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の重鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図10-2】ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の重鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図11】ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の軽鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図12】ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦａｂ Ｈ鎖のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を示す図である。
【図13】ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体発現ベクターの構造を示す図である。
【図14】ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体の発現解析結果を示すウェスタンブロット写真である。一次抗体として、Ｍｏｃｋ（レーン１）、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体（レーン２）を用いた。二次抗体として、ＡではＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を用い、ＢではＨＲＰ標識抗ヒトＫａｐｐａ抗体を用いた。
【図15】ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体の発現解析結果を示すウェスタンブロット写真である。一次抗体として、Ｍｏｃｋ（レーン１）、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体（レーン２）およびヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体（レーン３）を用いた。二次抗体として、ＡではＨＲＰ標識抗ヒトＦｄ抗体を用い、ＢではＨＲＰ標識抗ヒトＫａｐｐａ抗体を用いた。
【図16】ＥＩＡによって、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体の反応性を確認した図である。
【図17】フローサイトメトリーによって、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）の反応性を確認した図である。
【図18】担がんヌードマウスモデルにおける各抗体の蛍光イメージングの結果を示す写真である。１２Ａ８（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）はＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体、ヒト化ｗｈｏｌｅ ＩｇＧは抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体、ヒト化Ｆａｂは抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を示す。各写真の下は、標識化抗体又は標識化抗原結合性断片投与からの経過時間（ｈ）を表す。
【図19】ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体による、マウスにおける異種移植腫瘍の蛍光強度の経時的変化を示す図である。縦軸は蛍光強度を示し、横軸は標識化抗原結合性断片投与からの経過時間（ｈ）を表す。
【図20】ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を用いたときの、マウス腫瘍領域におけるＳ／Ｎ比の経時的変化を示す図である。縦軸はＳ／Ｎ比を示し、横軸は標識化抗原結合性断片投与からの経過時間（ｈ）を表す。
【図21】担がんマウスを用いた光免疫治療スケジュールの概略図である。
【図22】ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を用いたときの、腫瘍の蛍光イメージングを示す写真である。
【図23】ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を用いたときの、光免疫治療の効果を示す蛍光イメージングを示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
（抗原結合性断片）
本明細書の抗原結合性断片は、配列番号２又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号４又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲを有する抗体の断片である。配列番号２及び４はマウス由来の抗原結合断片におけるアミノ酸配列を示し、配列番号１９及び配列番号２１はヒト化した抗原結合断片におけるアミノ酸配列を示す。
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号１に記載の塩基配列によってコードされるものであってよく、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号３に記載の塩基配列によってコードされるものであってよく、配列番号１９に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号１８に記載の塩基配列によってコードされるものであってよく、配列番号２１に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号２０に記載の塩基配列によってコードされるものであってよい。また、当該抗原結合性断片は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＦａｂ Ｈ鎖における相補性決定領域を有するものであってよく、配列番号６に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号５に記載の塩基配列によってコードされるものであってよい。また、当該抗原結合性断片は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＦａｂ Ｈ鎖における相補性決定領域を有するものであってよく、配列番号２３に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号２２に記載の塩基配列によってコードされるものであってよい。ここで、ＣＤＲの決定方法として、Ｋａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｍａｒｔｉｎら、Ｇｅｌｄａｎｄら、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｉｎｄｅｘ／ＣＤＲ．ｐｈｐ）、Ｈｏｎｎｅｒｇｅｒら（ＡＨｏ’ｓ）などの方法が報告されている（Ｌａｒｓ Ｎｉｅｂａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １０（４）：４３５－４４４（１９９７））が、当該ＣＤＲを有する抗体断片がｃ－ＫＩＴと特異的に結合する限り、ＣＤＲはいずれの定義によって決定されたものであってもよい。
本明細書の抗原結合性断片は、配列番号２又は配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する抗体重鎖における相補性決定領域（ＣＤＲ）、および配列番号４又は配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有する抗体軽鎖におけるＣＤＲを有する抗体の断片である。配列番号２及び４はマウス由来の抗原結合断片におけるアミノ酸配列を示し、配列番号１９及び配列番号２１はヒト化した抗原結合断片におけるアミノ酸配列を示す。
なお、配列番号２に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号１に記載の塩基配列によってコードされるものであってよく、配列番号４に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号３に記載の塩基配列によってコードされるものであってよく、配列番号１９に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号１８に記載の塩基配列によってコードされるものであってよく、配列番号２１に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号２０に記載の塩基配列によってコードされるものであってよい。また、当該抗原結合性断片は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＦａｂ Ｈ鎖における相補性決定領域を有するものであってよく、配列番号６に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号５に記載の塩基配列によってコードされるものであってよい。また、当該抗原結合性断片は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＦａｂ Ｈ鎖における相補性決定領域を有するものであってよく、配列番号２３に記載のアミノ酸配列は、例えば配列番号２２に記載の塩基配列によってコードされるものであってよい。ここで、ＣＤＲの決定方法として、Ｋａｂａｔら、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｍａｒｔｉｎら、Ｇｅｌｄａｎｄら、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｉｎｄｅｘ／ＣＤＲ．ｐｈｐ）、Ｈｏｎｎｅｒｇｅｒら（ＡＨｏ’ｓ）などの方法が報告されている（Ｌａｒｓ Ｎｉｅｂａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， １０（４）：４３５－４４４（１９９７））が、当該ＣＤＲを有する抗体断片がｃ－ＫＩＴと特異的に結合する限り、ＣＤＲはいずれの定義によって決定されたものであってもよい。
【0017】
例えば、本明細書における抗原結合性断片が有する重鎖ＣＤＲとしては、配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、および配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、あるいは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、および、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を挙げることができる。また、本明細書における抗原結合性断片が有する軽鎖ＣＤＲとしては、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、および配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＤＲＬ３、あるいは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＩＳ（すなわち、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｓｅｒ）からなるＣＤＲＬ２、および配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を挙げることができる。例えば、本明細書における抗原結合性断片は、（ｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、配列番号１０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、および配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるＤＲＬ３を有するか、あるいは（ｉｉ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、アミノ酸配列ＧＩＳからなるＣＤＲＬ２、および配列番号１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を有していてもよい。
【0018】
本明細書において、「抗原結合性断片」とは、抗体の断片であって、当該抗体の抗原への結合性を保持する断片を意味する。例えば、抗原結合性断片としては、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆａｂ３、一本鎖Ｆｖ（以下、「ｓｃＦｖ」という）、（タンデム）バイスペシフィック一本鎖Ｆｖ（ｓｃ（Ｆｖ）２）、一本鎖トリプルボディ、ナノボディ、ダイバレントＶＨＨ、ペンタバレントＶＨＨ、ミニボディ、（二本鎖）ダイアボディ、タンデムダイアボディ、バイスペシフィックトリボディ、バイスペシフィックバイボディ、デュアルアフィニティリターゲティング分子（ＤＡＲＴ）、トリアボディ（又はトリボディ）、テトラボディ（又は［ｓｃ（Ｆｖ）２］２）、若しくは（ｓｃＦｖ－ＳＡ）４）ジスルフィド結合Ｆｖ（以下、「ｄｓＦｖ」という）、コンパクトＩｇＧ、重鎖抗体、又はそれらの重合体）を挙げることができる。
【0019】
本発明の複合体の一部を構成する抗原結合性断片は、ｃ－ＫＩＴと特異的に結合する。本明細書において、抗原結合性断片が「特異的に」認識する（結合する）とは、その抗原結合性断片が他のタンパク質やペプチドに対する親和性よりも、ｃ－ＫＩＴに対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性で結合する」とは、所望の測定装置または方法によって、目的とする特定のタンパク質やペプチドを他のタンパク質やペプチドから区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味する。例えば、実質的に高い親和性は、ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡにより検出された強度（例えば、蛍光強度）として、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、１００倍以上であることを意味していてもよい。
【0020】
本明細書において、抗原結合性断片とｃ－ＫＩＴとの結合における結合速度定数（Ｋａ１）としては、例えば、１×１０４Ｍｓ－１以上、１×１０５Ｍｓ－１以上、５×１０５Ｍｓ－１以上を挙げることができる。また、抗原結合性断片とｃ－ＫＩＴとの結合における解離速度定数（Ｋｄ１）としては、例えば、１×１０－３以下、１×１０－４以下が挙げられる。抗原結合性断片とｃ－ＫＩＴとの結合における結合定数（ＫＤ）としては、例えば、１×１０－８（Ｍ）以下、５×１０－８（Ｍ）以下、１×１０－９（Ｍ）以下、５×１０－９（Ｍ）以下であり得る。本明細書における抗原結合性断片の結合速度定数（Ｋａ１）、解離速度定数（Ｋｄ１）、及び結合定数（ＫＤ）はＢＩＡＣＯＲＥ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社，ＢＩＡＣＯＲＥ－Ｘ１００）を用いて、製造者提供のマニュアルに従い、ＳＡチップにビオチン化ｃ－ＫＩＴを固定後、被検抗体を流し、結合速度定数Ｋａ１、解離速度定数Ｋｄ１を測定し、ｂｉｖａｌｅｎｔフィッティングを用いて結合定数ＫＤ値を決定することができる。
【0021】
抗原結合性断片は、非ヒト動物の抗原結合性断片、非ヒト動物のアミノ酸配列とヒト由来のアミノ酸配列を有する抗原結合性断片を包含する。例えば、抗原結合性断片は、ヒト化抗原結合性断片であってもよい。ヒト化抗原結合性断片とは、ヒト抗体のＨ鎖とＬ鎖をコードする遺伝子をベースとして、その６つのＣＤＲの一次構造部分を、非ヒト動物由来の抗ｃ－ＫＩＴ抗体のＨ鎖（３カ所）とＬ鎖（３か所）のＣＤＲの一次構造と遺伝子工学的に置換した抗体の断片のことである。例えば、本発明の抗体を治療、予防、又は体内に投与することにより用いる診断に使用する場合には、本発明の抗体として好ましくは、ヒト化抗体の断片である。
【0022】
本発明の複合体は、更に１種類以上の他の異なる抗体の抗原結合性断片を有していてもよく、それにより、モノスペシフィック、バイスペシフィック（二重特異性）、トリスペシフィック（三重特異性）、又はマルチスペシフィック（多重特異性）であってもよい。
【0023】
本明細書において、アミノ酸は一文字表記で表される。具体的には、Ａはアラニン、Ｌはロイシン、Ｒはアルギニン、Ｋはリシン、Ｎはアスパラギン、Ｍはメチオニン、Ｄはアスパラギン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｃはシステイン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｓはセリン、Ｅはグルタミン酸、Ｔはトレオニン、Ｇはグリシン、Ｗはトリプトファン、Ｈはヒスチジン、Ｙはチロシン、Ｉはイソロイシン、Ｖはバリンを表す。
【0024】
ＩＲ７００は、フタロシアニンとも呼ばれ、以下の構造を有する化合物を意味する。
【0025】
【化1】
【0026】
本明細書において複合体に含まれるＩＲ７００は上記構造を有する限り、その誘導体であってもよい。例えば、ＩＲ７００がアミノ基またはカルボキシル基と反応する置換基を有し、該置換基と抗原結合性断片のアミノ基またはカルボキシル基との反応により、抗原結合性断片とＩＲ７００とを結合させることができる。例えば、本明細書におけるＩＲ７００として、以下の構造を有するＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ（ＬＩ－ＣＯＲ社）を用いることができる。この場合、製造者提供のプロトコルに従い、抗原結合性断片とＩＲ７００とを結合させることができる。
【0027】
【化2】
【0028】
抗原結合性断片とＩＲ７００との結合比は、例えば、抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）が１～１０、１～５、１～３であってもよい。また、複数の本発明の複合体を有する組成物である場合、当該組成物中の該複合体の抗体の抗原結合性断片１分子当たりに結合するＩＲ７００分子の数（Ｆ／Ｐ比）の平均値は１～１０、１～５、１～３、または１．５～３．０であってもよい。
【0029】
本発明の複合体はＩＲ７００を有することから、その蛍光を測定することにより検出および診断に用いることができる。よって、別の態様において、本発明は、上記複合体を有効成分として含有する、がん検出／診断用組成物に関する。また、本発明は、ｃ－ＫＩＴを発現する全てのがん細胞を検出／診断する方法であって、がんを有する対象に本発明の複合体を投与すること、および該対象における該複合体の集積箇所を検出することを含む方法に関する。
本明細書において、「がん」は、宿主生物にとって病原体となるような悪性形質転換を受けた細胞を意味する。本明細書中において、がんは、原発性がんのみならず、転移がん、およびがん細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株も含む。がんは、例えば、血液細胞などの腫瘍である造血器腫瘍であってもよく、例えば、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病などの白血病；多発性骨髄腫などの骨髄腫;リンパ腫などが挙げられる。
がんとしては、これらに限定されるものではないが、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、エイズ関連リンパ腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）、胆道癌、肝外胆管がん、肝内胆管癌、膀胱癌、骨や関節の癌、骨肉腫と悪性線維組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、神経膠腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫、頭頸部癌、転移性扁平上皮頸部癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、神経系リンパ腫、中枢神経系の癌、中枢神経系リンパ腫、神経芽細胞腫、小児癌、Ｓｅｚｉａｒｙ症候群、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼の癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、口腔癌、口腔空洞癌、口腔咽頭癌、口腔癌、舌の癌、食道がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門直腸癌、肛門癌、胚細胞腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、咽頭癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、副鼻腔および鼻腔癌、咽喉癌、膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、膵臓癌、副甲状腺癌、肝臓癌、胆嚢癌、虫垂癌、腎臓癌、尿道癌、腎盂と尿管の移行上皮癌および他の泌尿器の癌、扁平上皮癌、陰茎癌、精巣癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、乳癌、子宮癌、子宮肉腫、子宮頸癌、子宮内膜がん、子宮体がん、膣がん、外陰癌、およびウィルムス腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、ヘアリー細胞白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒａｍのマクログロブリン血症、髄芽腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（黒色腫）、褐色細胞腫、メルケル細胞皮膚癌、中皮腫、悪性中皮腫、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、松果体芽腫および下垂体腫瘍、形質細胞腫、胸膜肺芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、ユーイング腫瘍のファミリー、軟組織肉腫、軟組織肉腫、菌状息肉腫、カポジ肉腫が含まれる。さらに、本発明はｃ－ＫＩＴを発現する、前がん病変を含めた良性腫瘍の検出（診断）と治療にも有効である。
本明細書において、「がん」は、宿主生物にとって病原体となるような悪性形質転換を受けた細胞を意味する。本明細書中において、がんは、原発性がんのみならず、転移がん、およびがん細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株も含む。がんは、例えば、血液細胞などの腫瘍である造血器腫瘍であってもよく、例えば、慢性骨髄性白血病または急性骨髄性白血病などの白血病；多発性骨髄腫などの骨髄腫;リンパ腫などが挙げられる。
がんとしては、これらに限定されるものではないが、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連癌、エイズ関連リンパ腫、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）、胆道癌、肝外胆管がん、肝内胆管癌、膀胱癌、骨や関節の癌、骨肉腫と悪性線維組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫、神経膠腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視経路および視床下部神経膠腫、頭頸部癌、転移性扁平上皮頸部癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、神経系リンパ腫、中枢神経系の癌、中枢神経系リンパ腫、神経芽細胞腫、小児癌、Ｓｅｚｉａｒｙ症候群、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼の癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、唾液腺癌、口腔癌、口腔空洞癌、口腔咽頭癌、口腔癌、舌の癌、食道がん、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、小腸癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、肛門直腸癌、肛門癌、胚細胞腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、喉頭癌、咽頭癌、下咽頭癌、鼻咽頭癌、副鼻腔および鼻腔癌、咽喉癌、膵島細胞腫瘍（内分泌膵臓）、膵臓癌、副甲状腺癌、肝臓癌、胆嚢癌、虫垂癌、腎臓癌、尿道癌、腎盂と尿管の移行上皮癌および他の泌尿器の癌、扁平上皮癌、陰茎癌、精巣癌、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺癌、前立腺癌、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣低悪性度腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、乳癌、子宮癌、子宮肉腫、子宮頸癌、子宮内膜がん、子宮体がん、膣がん、外陰癌、およびウィルムス腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性疾患、ヘアリー細胞白血病、原発性中枢神経系リンパ腫、慢性骨髄増殖性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒａｍのマクログロブリン血症、髄芽腫、皮膚癌（非メラノーマ）、皮膚癌（黒色腫）、褐色細胞腫、メルケル細胞皮膚癌、中皮腫、悪性中皮腫、多発性内分泌腫瘍症候群、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、松果体芽腫および下垂体腫瘍、形質細胞腫、胸膜肺芽細胞腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、ユーイング腫瘍のファミリー、軟組織肉腫、軟組織肉腫、菌状息肉腫、カポジ肉腫が含まれる。さらに、本発明はｃ－ＫＩＴを発現する、前がん病変を含めた良性腫瘍の検出（診断）と治療にも有効である。
【0030】
本発明の複合体は、がん細胞と接触後、あるいは、がんを有する生体内に投与後、すみやかにがん細胞に蓄積される。よって、本発明のがん検出用組成物は、当該組成物の投与から２４時間以内、１２時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内にがんを検出するために用いることができる。短時間で検出するという観点からは、４時間以内、３時間以内、２時間以内、または１時間以内にがんを検出するために用いることが好ましい。
【0031】
また、本発明の複合体はＩＲ７００分子を有することから、ＰｈｏｔｏＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ（ＰＩＴ）によりがん細胞を殺傷することができる（Ｍｉｔｓｕｎａｇａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．（２０１１）１７（１２）：１６８５－９１．）。よって、本発明のがん治療用組成物を対象に投与し、がんに当該組成物を集積させる時間の経過後に、がん局所、すなわち、当該組成物の集積局所に近赤外光を照射することにより、がん治療効果を発揮させることができる。よって、本発明は上記複合体を有効成分として含有する、がん治療用組成物に関する。本明細書では、主にがんの治療用に用いられる組成物や複合体が、近赤外光と組み合わせて使用されるためのものである。また、本発明は、がんを有する対象に本発明の複合体を投与すること、および該対象における該複合体の集積箇所に近赤外光を照射することを含む、がんの治療方法に関する。
【0032】
近赤外光としては、６５０～９００ｎｍの波長の光を用いることができ、好ましくは、６５０～７５０ｎｍ、より好ましくは約７００ｎｍである。がんに当該組成物を集積させる時間は、当該組成物の投与から１時間後～２４時間後、１時間後～１２時間後、１時間後～６時間後、２時間後～６時間後、２時間後～４時間後、２時間後～３時間後、または３時間後～４時間後とすることができる。
【0033】
本発明の抗体断片を更に標識物質と結合させることもできる。例えば４８０～６５０ｎｍなどの可視光領域の波長の蛍光物質や光感受性物質と結合させて複合体を作り、がんの診断や治療に応用することも可能である。当該標識としては、放射能標識、酵素、蛍光標識、生物発光標識、化学発光標識、金属等の検出可能な標識を用いることができる。このような標識としては、これに限定されるものではないが例として、３２Ｐ、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４Ｃ、トリチウム等の放射能標識；β－ガラクトオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；ＦＡＤ、ＦＭＮ、ＡＴＰ、ビオチン、ヘム等の補酵素又は補欠分子族；フルオレセイン誘導体（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインチオフルバミル等）、ローダミン誘導体（テトラメチルローダミン、トリメチルローダミン（ＲＩＴＣ）、テキサスレッド、ローダミン１１０等）、Ｃｙ色素（Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、Ｃｙ－クロム、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、プロピジウムイオダイド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ－フィコエリスリン（Ｒ－ＰＥ）等の蛍光標識；ルシフェラーゼ等の生物発光標識；あるいは、ルミノール、イソルミノール、Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノースエステル等のルミノール誘導体、Ｎ－メチルアクリジニウムエステル、Ｎ－メチルアクリジニウムアシルスルホンアミドエステル等のアクリジニウム誘導体、ルシゲニン、アダマンチルジオキセタン、インドキシル誘導体、ルテニウム錯体等の化学発光標識；金コロイド等の金属等の検出可能な標識を挙げることができる。
【0034】
以上のように、本発明の組成物は、がんの検出用（診断用）として使用することができると共に、そのまま治療用としても用いることができる。すなわち、本発明は、本発明の組成物を対象に投与すること、投与された該組成物中のＩＲ７００が発する蛍光により、対象におけるがんの位置や大きさを検出／診断すること、および当該検出／診断されたがんに対して近赤外光を照射することにより、当該がんを殺傷することを含む、がんの検出／診断及び治療方法を含む。また、本発明は、前記複合体を有効成分として含有する、がんの検出と治療の両方に用いられる組成物（検出および治療用組成物）であってもよい。
【0035】
その他、本発明は、前記がんの検出用組成物、がんの治療用組成物、または、がんの検出および治療用組成物を製造するための、本発明の複合体の使用に関する。また、本発明は、がんの検出、がんの治療、または、がんの検出および治療のための、本発明の複合体に関する。
【0036】
本発明の組成物は、目的のがんに到達させることができる限り、経口および非経口のいかなる製剤を採用してもよい。非経口投与には、静脈内投与以外にも、例えば内視鏡観察下に鉗子孔から消化管粘膜などに散布投与する方法も含まれる。本発明の組成物は、好ましくは医療用であり、よって、医療用に適した製剤が好ましい。非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、点鼻剤、坐剤等を挙げることができる。好ましくは、注射剤（静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、硝子体内注射剤、点滴注射剤などの液剤又は凍結乾燥製剤など）である。注射用の水性液としては、例えば、リン酸塩等の緩衝材；生理食塩水、ブドウ糖、ショ糖、マンニトール、塩化ナトリウム、グリセリン等の等張化剤；例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ＨＣＯ－５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）〕、エチレンジアミン等の溶解補助剤、亜硫酸塩等の安定剤、フェノール等の保存剤、リドカイン等の無痛化剤等の添加物を添加することができる。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などを用いることができ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を添加することができる（必要に応じて、「医薬品添加物事典」薬事日報社、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）。注射剤は、公知の方法に従って、例えば、複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製することができる。凍結乾燥製剤の場合、用時、注射用水、生理食塩水などで溶解して注射液とすることもできる。また、本発明の組成物を注射剤として使用する場合、保存容器としては、アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ、ペン型注射器用カートリッジ、及び、点滴用バッグ等を挙げることができる。なお、一般的にタンパク質の経口投与は消化器により分解されるため困難とされるが、消化器系のがんを対象とする場合など、経口投与の可能性もある。経口投与の製剤としては、例えば、カプセル剤、錠剤、シロップ剤、顆粒剤等を挙げることができる。
【0037】
本発明の組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好適である。このような投薬単位の剤形としては、注射剤（アンプル、バイアル、プレフィルドシリンジ）が例示され、投薬単位剤形当たり通常１～１０００ｍｇ、５～２５０ｍｇ、１０～１００ｍｇの本発明の複合体を含有していても良い。
【0038】
本発明の組成物の投与は、局所的であってもよく、全身的であってもよい。投与方法には特に制限はなく、上述のとおり非経口的又は経口的に投与される。非経口的投与経路としては、眼内、皮下、腹腔内、血中（静脈内、若しくは動脈内）又は脊髄液への注射又は点滴等が挙げられ、好ましくは、血中への投与である。本発明の組成物の投与は、１回のみであってもよいし、複数回であってもよく、また、一時的であってもよいし、持続的又は断続的であってもよい。好ましくは、１～数回を短期間（数時間以内、数日以内、１～２週間以内など）に投与する。例えば、１回のＰＩＴ治療でがんが完全に治療できない場合には、がんのＰＩＴ治療を期間を開けて複数回行うこともできる。この場合には、治療毎に、近赤外照射前に１～数回前記組成物を投与する。また、本発明の複合体は、単独で投与されてもよいし、他の薬剤と共に併用により投与されてもよい。
【0039】
本発明の組成物の投与量は、所望の治療効果又は検出／診断効果が得られる投与量であれば特に限定は無く、症状、性別、年齢等により適宜決定することができる。本発明の組成物の投与量は、例えば、がんの治療効果を指標として決定することができる。例えば、がん治療のために使用する場合には、本発明の組成物の有効成分の１回量として、０．０１～２０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、０．１～５ｍｇ／ｋｇ体重を、１～数回程度、静脈注射により投与する。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量または投与回数（治療回数）を増加させてもよい。
【実施例】
【0040】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【0041】
（実施例１）ＩＲ７００で標識化されたマウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体（ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙのＩｇＧ抗体＝以下ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）、ならびに、そのＦ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片の調製
（１）抗原の調整
ＧＩＳＴの標的分子として、ヒトｃ－ＫＩＴ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ―０００２２２．３）を用いた。抗原は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子の細胞外領域（１－５０４アミノ酸）とマウスＩｇＧ２ａの定常領域（Ｆｃ部分）との融合タンパク質（ｃ－ＫＩＴ－Ｆｃ）をコードするｃＤＮＡを発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）へ常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い組み込み、さらにその組み換えベクターをチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして作製した。ｃ－ＫＩＴ－Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞を無血清培地であるＴＩＬ培地（株式会社免疫生物研究所）中で培養後、その培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥヘルスケア）にて精製することにより得た。
（１）抗原の調整
ＧＩＳＴの標的分子として、ヒトｃ－ＫＩＴ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ―０００２２２．３）を用いた。抗原は、ｃ－ＫＩＴ遺伝子の細胞外領域（１－５０４アミノ酸）とマウスＩｇＧ２ａの定常領域（Ｆｃ部分）との融合タンパク質（ｃ－ＫＩＴ－Ｆｃ）をコードするｃＤＮＡを発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）へ常法（例えば、「分子生物学基礎実験法」、南江堂）に従い組み込み、さらにその組み換えベクターをチャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞にトランスフェクションして作製した。ｃ－ＫＩＴ－Ｆｃ発現ＣＨＯ細胞を無血清培地であるＴＩＬ培地（株式会社免疫生物研究所）中で培養後、その培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥヘルスケア）にて精製することにより得た。
【0042】
（２）モノクローナル抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウスに（１）で作製した抗原を４回免疫後、脾臓の単核球細胞と融合パートナー細胞のＸ６３－Ａｇ８－６５３をポリエチレングリコールにて融合し、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３７２１－３７２８に記載の方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固相化したｃ－ＫＩＴ－Ｆｃに反応する抗体を産生する細胞をクローニングすることにより行い、ハイブリドーマ１２Ａ８を分離した。クローン１２Ａ８は培養上清中にＩｇＧ１を産生し、その抗体は、ｃ－ＫＩＴを発現するＳＣＬＣ（小細胞肺がん）の細胞株ＳＹやＧＩＳＴの細胞株ＧＩＳＴ－Ｔ１に強い反応を示した。
ＢＡＬＢ／ｃマウスに（１）で作製した抗原を４回免疫後、脾臓の単核球細胞と融合パートナー細胞のＸ６３－Ａｇ８－６５３をポリエチレングリコールにて融合し、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３７２１－３７２８に記載の方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固相化したｃ－ＫＩＴ－Ｆｃに反応する抗体を産生する細胞をクローニングすることにより行い、ハイブリドーマ１２Ａ８を分離した。クローン１２Ａ８は培養上清中にＩｇＧ１を産生し、その抗体は、ｃ－ＫＩＴを発現するＳＣＬＣ（小細胞肺がん）の細胞株ＳＹやＧＩＳＴの細胞株ＧＩＳＴ－Ｔ１に強い反応を示した。
【0043】
（３）マウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体１２Ａ８の抗原決定基（エピトープ）
１２Ａ８抗体が認識する抗原決定領域をエピトープマッピングで決定した。ヒトｃ－ＫＩＴの細胞外領域（１－５０４アミノ酸）及び当該領域のＣ末端から欠失させた各種欠失変異体とマウスＩｇＧ２ａの定常領域との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製し、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）に組み込んだ。作製した欠失変異体は、ヒトｃ－ＫＩＴ１－１０６アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ１０６－Ｆｃ）、１－２０５アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ２０５－Ｆｃ）、１－３０５アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ３０５－Ｆｃ）、１－４０６アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ４０６－Ｆｃ）をコードしている。
１２Ａ８抗体が認識する抗原決定領域をエピトープマッピングで決定した。ヒトｃ－ＫＩＴの細胞外領域（１－５０４アミノ酸）及び当該領域のＣ末端から欠失させた各種欠失変異体とマウスＩｇＧ２ａの定常領域との融合タンパク質をコードする遺伝子を作製し、発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．１）に組み込んだ。作製した欠失変異体は、ヒトｃ－ＫＩＴ１－１０６アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ１０６－Ｆｃ）、１－２０５アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ２０５－Ｆｃ）、１－３０５アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ３０５－Ｆｃ）、１－４０６アミノ酸（ｃ－ＫＩＴ４０６－Ｆｃ）をコードしている。
【0044】
これらの遺伝子を保持する各発現ベクターをＣＯＳ１細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１６５０）にトランスフェクションし、無血清のＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＭＥＭ（株式会社免疫生物研究所）で２日間培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清を１０倍濃度まで限外ろ過にて濃縮し、ＰＶＤＦ膜（株式会社ミリポア、ＩＰＶＨ０００１０）にドットブロットした。ブロットしたＰＶＤＦ膜をブロッキング処理後、マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体と反応させ、さらに抗マウスＩｇκ 鎖ＨＲＰ標識抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１０５０－０５）を反応させた。検出はＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ（Ｃｙｔｉｖａ，ＲＰＮ２１０６）を用いて、化学発光検出を実施した。
【0045】
各種ドットした融合タンパク質には全てにマウスＩｇＧ２ａＦｃが含まれるため、抗マウスＩｇＧ抗体（ａ－Ｍｏｕｓｅ ＨＲＰ）に対しすべて陽性を示したが、抗マウスＩｇκ鎖ＨＲＰ（ａ－ｍｏｕｓｅ ｋａｐｐａ ＨＲＰ）には全く反応しなかった。マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ａ－ｃ－ＫＩＴ １２Ａ８）は、抗原に用いたＣ末欠失のないｃ－ＫＩＴ５０４－Ｆｃにのみ反応し、他のＣ末欠失変異体融合タンパク質とは反応が見られないことから、ｃ－ＫＩＴの細胞外領域である４０７－５０４アミノ酸領域にエピトープが存在することが明らかとなった。
【0046】
（４）抗体の生産
１２Ａ８ハイブリドーマは高密度培養フラスコＣＥＬＬＩＮＥ ＣＬ－１０００（Ａｒｇｏｓ ＢＭＡ－９０００５）を無血清ＴＩＬ培地（株式会社免疫生物研究所）で、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製し、１２Ａ８（ＩｇＧ１）抗体を得た。
１２Ａ８ハイブリドーマは高密度培養フラスコＣＥＬＬＩＮＥ ＣＬ－１０００（Ａｒｇｏｓ ＢＭＡ－９０００５）を無血清ＴＩＬ培地（株式会社免疫生物研究所）で、３７℃のＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製し、１２Ａ８（ＩｇＧ１）抗体を得た。
【0047】
（５）抗体の分解
得られた１２Ａ８抗体を０．１Ｍ／Ｌ酢酸ソーダ緩衝液（Ｐｈ３．８）で調整し、ペプシンにて室温２時間消化処理してその後、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ４４ カラム）にて精製して、１２Ａ８ Ｆ（ａｂ’）２を得た。
得られた１２Ａ８抗体を０．１Ｍ／Ｌ酢酸ソーダ緩衝液（Ｐｈ３．８）で調整し、ペプシンにて室温２時間消化処理してその後、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ４４ カラム）にて精製して、１２Ａ８ Ｆ（ａｂ’）２を得た。
【0048】
Ｆａｂは１２Ａ８抗体を０．１Ｍ／Ｌ酢酸ソーダ緩衝液（Ｐｈ５．５）で調整し、パパインにて室温３時間消化処理後、ゲル濾過クロマトグラフィー（ＵｌｔｒｏｇｅｌＡｃＡ４４ カラム）にて精製し、さらにＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラムを通してＦｃ断片を除去して得た。
【0049】
（６）ＩＲ－７００の標識
抗体は、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉｎｃｏｌｎ， ＮＥ）を使用し、メーカーの使用説明書に従ってＩＲＤｙｅ７００で標識化した。１２Ａ８抗体のｗｈｏｌｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂの分子量を、それぞれ、１５０，０００、１１０，０００、および５０，０００と見なした。抗体とＩＲＤｙｅ７００は、モル比で１：５の割合で混合し、室温２時間インキュベーションして結合させた。抗体量は２８０ｎｍ、色素は６８９ｎｍの吸光度で求め、Ｆ／Ｐを算出した。
抗体は、ＩＲＤｙｅ７００ＤＸ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ＫＩＴ（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｌｉｎｃｏｌｎ， ＮＥ）を使用し、メーカーの使用説明書に従ってＩＲＤｙｅ７００で標識化した。１２Ａ８抗体のｗｈｏｌｅ ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦａｂの分子量を、それぞれ、１５０，０００、１１０，０００、および５０，０００と見なした。抗体とＩＲＤｙｅ７００は、モル比で１：５の割合で混合し、室温２時間インキュベーションして結合させた。抗体量は２８０ｎｍ、色素は６８９ｎｍの吸光度で求め、Ｆ／Ｐを算出した。
【0050】
その結果、それぞれのＩＲ７００－１２Ａ８の結合物のＦ／Ｐは、Ｗｈｏｌｅ ＩｇＧが２．４、Ｆ（ａｂ’）２が２．６、Ｆａｂが１．９、陰性対照ＩｇＧ１（ｃ－ＫＩＴに反応しない）が３．８であった。
【0051】
各結合物は、使用時モル濃度が同一（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では０．０５ｎＭ（表１）、Ｉｎ ｖｉｖｏ試験では０．５ｎＭ（表２））となるように希釈用Ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢＳ）で調整した。
【0052】
（実施例２）ＩＲ７００で標識化されたマウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体及びその断片のＧＩＳＴへのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合とその蛍光強度
実施例１で作製したＩＲ７００で標識化されたマウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体（ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙのＩｇＧ抗体＝以下ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）、ならびに、そのＦ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片を用いてＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株のＬｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇを行い、蛍光濃度に差があるかを確認した。
実施例１で作製したＩＲ７００で標識化されたマウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体（ｗｈｏｌｅ ｂｏｄｙのＩｇＧ抗体＝以下ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）、ならびに、そのＦ（ａｂ’）２断片およびＦａｂ断片を用いてＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株のＬｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍａｇｉｎｇを行い、蛍光濃度に差があるかを確認した。
【0053】
【表1】
【0054】
得られた各ＩＲ７００標識結合抗体は、少量ずつ分注して－２０度℃で使用時まで保管した。
【0055】
ＲＰＭＩ ＲＰＭＩ１６４０培地（ｐｈｅｎｏｌ ｒｅｄ非含有）（４３ｍＬ）に１Ｍ
ＨＥＰＥＳ １．２５ｍＬ及びＦＢＳ ５ｍＬを添加したものを培地として使用した。
ＨＥＰＥＳ １．２５ｍＬ及びＦＢＳ ５ｍＬを添加したものを培地として使用した。
【0056】
ＧＩＳＴの培養細胞株ＧＩＳＴ－Ｔ１（Ｄｒ．Ｔｇｕｃｈｉ Ｔ．，Ｋｏｕｃｈｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｏｕｃｈｉ，Ｊａｐａｎ）は、上記ＲＰＭＩ１６４０培地を加えて、１０ｃｍ ｄｉｓｈ（グライナー社、ＣＥＬＬＳＴＴＡＲ ６６４１６０－０１３）を用い、培養して殖やした。
【0057】
ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞８×１０４細胞／ｄｉｓｈをｇｌａｓｓ ｂｏｔｔｏｍｄｉｓｈ（グライナー社、ＣＥＬＬｖｉｅｗ ６２７９６５）５枚に播種し、２４時間培養後、上清を除去して、ブロッキングバッファー（ＤａＫｏ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌｏｃｋ ｓｅｒｕｍａ－ｆｒｅｅ、Ｘ０９０９）１ｍＬ加え室温で１５分間インキュベーションした。表１に記載の各ＩＲ７００標識サンプルは、抗体希釈バッファー（０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ）にて使用濃度に調整し、１５分後ブロッキングバッファーを廃棄し、１２Ａ８結合物および対照結合物（ＩＲ７００－ＩｇＧ１）をそれぞれ５００μＬ加えた。ＩＲ７００－１２Ａ８標識サンプルのうち、ｗｈｏｌｅ ＩｇＧとＦ（ａｂ’）２は終濃度０．０５ｎＭとしたが、抗原結合部位が１価のＦａｂは結合部位数を合わせるために、２倍の終濃度０．１ｎＭとした。さらに、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２溶液（１ｍｇ／ｍｌ，ＤＯＪＩＮＣＯ Ｈ３４２）を５μＬずつ添加して、氷上で１時間インキュベーションした。
【0058】
その後、ＩＲ７００標識サンプル含有抗体希釈バッファーを除去して、抗体希釈バッファーで３回洗浄後、ＰＢＳを１ｍｌずつ加え、共焦点顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）にて以下の波長で蛍光観察を行った。
ＩＲ７００ λｅｘ：６２０ｎｍ，λｅｍ：７００ｎｍ
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ λｅｘ：３６０ｎｍ，λｅｍ：４６０ｎｍ
ＩＲ７００ λｅｘ：６２０ｎｍ，λｅｍ：７００ｎｍ
Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２ λｅｘ：３６０ｎｍ，λｅｍ：４６０ｎｍ
【0059】
図１に示すようにＩＲ７００－１２Ａ８の各抗体は強い蛍光強度を示したが、陰性対象物ＩＲ７００－ＩｇＧ１では反応が見られなかった。また、図１で測定された蛍光強度をグラフにしたものを図２に示す。１２Ａ８フラグメントＦ（ａｂ’）２は、細胞イメージングにおいてｗｈｏｌｅ ＩｇＧと同様の蛍光強度を示し、１２Ａ８フラグメントＦａｂは、細胞イメージングにおいてｗｈｏｌｅ ＩｇＧより優れた蛍光強度を示した。
【0060】
（実施例３）１２Ａ８ ｆｒａｇｍｅｎｔ を用いたＭｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｔｕｍｏｒの蛍光イメージング（Ｉｎ ｖｉｖｏによる試験）
無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ．，東京，日本）１０匹に免疫抑制剤ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（０．２ｍｇ／ｇ体重）を投与した。ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞をＰＢＳにて１×１０７細胞／５０μＬに調整し、解凍したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）と氷上にて１：１の割合で懸濁した。免疫抑制剤投与の２日後、懸濁させたＧＩＳＴ－Ｔ１細胞を１００μＬずつ免疫抑制剤処理したヌードマウスの右大腿部皮下に移植した。腫瘍が８ｍｍになった際に抗体を投与して観察を行った。
無胸腺ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ＣＬＥＡ Ｊａｐａｎ Ｉｎｃ．，東京，日本）１０匹に免疫抑制剤ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（０．２ｍｇ／ｇ体重）を投与した。ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞をＰＢＳにて１×１０７細胞／５０μＬに調整し、解凍したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，ＵＳＡ）と氷上にて１：１の割合で懸濁した。免疫抑制剤投与の２日後、懸濁させたＧＩＳＴ－Ｔ１細胞を１００μＬずつ免疫抑制剤処理したヌードマウスの右大腿部皮下に移植した。腫瘍が８ｍｍになった際に抗体を投与して観察を行った。
【0061】
移植２８日目、抗体投与前に励起６７５ｎｍ、発光７２０ｎｍでＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｉｎｃ． ，Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）にて自家蛍光を観察した。
【0062】
次に、ＩＲ７００－１２Ａ８（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）、ＩＲ７００－１２Ａ８（Ｆａｂ）、およびＩＲ７００－１２Ａ８（Ｆ（ａｂ’）２）の３種類の標識化抗体又は標識化抗体断片を、それぞれ６０μｇ、４０μｇ、および４４μｇずつ尾静脈より投与し、１時間、２時間、３時間、６時間、９時間、１２時間、２４時間、および４８時間後に、励起６７５ｎｍ、発光７２０ｎｍでＩＶＩＳにて蛍光観察を行った。
【0063】
その結果は、図３、４に示した。１２Ａ８のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）抗体はｉｎ ｖｉｖｏモデルにおいてｗｈｏｌｅ ＩｇＧと比較して、投与後１時間、２時間、３時間と早期の腫瘍集積と代謝を示した。また、ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおける蛍光強度のピーク値はｗｈｏｌｅ ＩｇＧより高い傾向が得られた。
【0064】
また、Ｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＳ／Ｎ比（ｓｉｇｎａｌ ｔｏ ｎｏｉｓｅ ｒａｔｉｏ）を図５に示す。１２Ａ８フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）のＳ／Ｎ比はＷｈｏｌｅ ＩｇＧと同程度であった。この結果から、蛍光色素に結合したＧＩＳＴ特異的抗体（１２Ａ８）のフラグメントを利用することにより、抗体を生体に投与後、短時間（３時間以内）にＧＩＳＴを診断することが可能であることが示された。
【0065】
【表2】
【0066】
（実施例４）Ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＩＴ（Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）治療試験
免疫抑制剤を投与したヌードマウスにＧＩＳＴ－Ｔ１を移植して２８日後、腫瘍の大きさが近似した４匹を選択し、イソフラボンで鎮静化してＩＲ７００－１２Ａ８Ｆａｂ、ＩＲ７００－１２Ａ８Ｆ（ａｂ’）２をそれぞれ７９μｇ、６６μｇずつ尾静脈投与し、約２時間後に腫瘍にレーザーを１時間照射（７３５Ｊ）した。実験スキームの概略図を図６に示す。腫瘍サイズを４週間観察し、移植後５５日目に、Ａｌｅｘａ Ｆｒｕｏｒ ６４７を標識したマウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）を尾静脈投与し、４８時間後にＩＶＩＳにて観察した。
免疫抑制剤を投与したヌードマウスにＧＩＳＴ－Ｔ１を移植して２８日後、腫瘍の大きさが近似した４匹を選択し、イソフラボンで鎮静化してＩＲ７００－１２Ａ８Ｆａｂ、ＩＲ７００－１２Ａ８Ｆ（ａｂ’）２をそれぞれ７９μｇ、６６μｇずつ尾静脈投与し、約２時間後に腫瘍にレーザーを１時間照射（７３５Ｊ）した。実験スキームの概略図を図６に示す。腫瘍サイズを４週間観察し、移植後５５日目に、Ａｌｅｘａ Ｆｒｕｏｒ ６４７を標識したマウス抗ｃ－ＫＩＴ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＵＳＡ）を尾静脈投与し、４８時間後にＩＶＩＳにて観察した。
【0067】
その結果、図７に示すように陰性対照であるＦａｂ（Ｖｅｈｉｃｌｅ）、Ｆ（ａｂ’）２（Ｖｅｈｉｃｌｅ）マウスは共に腫瘍の大きさが示指頭大であるが、７３５Ｊのレーザー照射を施したマウスではＩＲ７００－１２Ａ８のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２共に、腫瘍が消失していた。
【0068】
ＩＶＩＳにて観察した結果、図８及び図９に示すように、対照マウスは激しい蛍光を発しているが、ＰＩＴを施されたマウスには蛍光が確認されなかった。ＧＩＳＴの特異的抗体１２Ａ８のフラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）と色素ＩＲ７００を結合させることにより、難病ＧＩＳＴを早期に診断できること、そして、抗体投与後早期に治療開始が可能であり、短期間で腫瘍を消失させることも可能であることが判明した（図７～９）。
【0069】
（実施例５）ＩＲ７００－ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）の作製
ヒトの消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の診断用組成物及び／又は治療用組成物として安全に利用するため、マウス由来の抗ｃ－ＫＩＴ モノクローナル抗体１２Ａ８クローンの遺伝子配列をヒト化抗体遺伝子に置換した。具体的な方法は以下の通りである。
ヒトの消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）の診断用組成物及び／又は治療用組成物として安全に利用するため、マウス由来の抗ｃ－ＫＩＴ モノクローナル抗体１２Ａ８クローンの遺伝子配列をヒト化抗体遺伝子に置換した。具体的な方法は以下の通りである。
【0070】
（１）ヒト化遺伝子の合成
マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子のデータベース（ＮＢＣＴ）上で、可変領域のホモロジー検索を行った。その結果、重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：ＨＣ）はヒトのＩＧＨＶ１－３と高い相同性があり、また軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ＬＣ）はヒト配列のＩＧＫＶ２－２９と高い相同性があった。そこで、マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の遺伝子配列の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を保持したまま、それ以外のフレームワークを相同性が高かったヒト配列に置換して、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）配列を構築した。この遺伝子配列情報から人工遺伝子合成を行い、ＶＨおよびＶＬの遺伝子を作製した。
マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の遺伝子配列をヒト抗体遺伝子のデータベース（ＮＢＣＴ）上で、可変領域のホモロジー検索を行った。その結果、重鎖（Ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：ＨＣ）はヒトのＩＧＨＶ１－３と高い相同性があり、また軽鎖（Ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ＬＣ）はヒト配列のＩＧＫＶ２－２９と高い相同性があった。そこで、マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の遺伝子配列の相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ）を保持したまま、それ以外のフレームワークを相同性が高かったヒト配列に置換して、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の可変領域重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）配列を構築した。この遺伝子配列情報から人工遺伝子合成を行い、ＶＨおよびＶＬの遺伝子を作製した。
【0071】
（２）発現ベクターの構築
合成したヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の可変領域遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）と天然のヒトＩｇＧ１遺伝子を用いて、オーバーラップＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりヒト化抗体遺伝子の重鎖（ＨＣ）（図１０、配列番号１８）および軽鎖（ＬＣ）（図１１、配列番号２０）を作製した。
ＨＣはヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＶＨとヒトＩｇＧ定常領域（Ｆｃ）を融合し、ＬＣはヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＶＬとヒトＫａｐｐａ鎖定常領域（ＫＣ）を融合した。
また、Ｆａｂフラグメントの発現に用いるために、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＨＣ遺伝子を鋳型とし、ヒンジ領域の直前に停止コドンを挿入した遺伝子（Ｆａｂ ＨＣ）（図１２、配列番号２２）をＰＣＲで増幅して作製した。
ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＨＣ遺伝子、ＬＣ遺伝子およびＦａｂ ＨＣ遺伝子をそれぞれ哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＣＸＮ２－ＭＣＳ、株式会社免疫生物研究所）（図１３）に挿入し、３種類の抗体遺伝子発現ベクター、（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１（ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１）ベクター、（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκ（ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκ）ベクター、（ｉｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈ（ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈ）ベクターを作製した。
合成したヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の可変領域遺伝子（ＶＨおよびＶＬ）と天然のヒトＩｇＧ１遺伝子を用いて、オーバーラップＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によりヒト化抗体遺伝子の重鎖（ＨＣ）（図１０、配列番号１８）および軽鎖（ＬＣ）（図１１、配列番号２０）を作製した。
ＨＣはヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＶＨとヒトＩｇＧ定常領域（Ｆｃ）を融合し、ＬＣはヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＶＬとヒトＫａｐｐａ鎖定常領域（ＫＣ）を融合した。
また、Ｆａｂフラグメントの発現に用いるために、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＨＣ遺伝子を鋳型とし、ヒンジ領域の直前に停止コドンを挿入した遺伝子（Ｆａｂ ＨＣ）（図１２、配列番号２２）をＰＣＲで増幅して作製した。
ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＨＣ遺伝子、ＬＣ遺伝子およびＦａｂ ＨＣ遺伝子をそれぞれ哺乳動物細胞発現ベクター（ｐＣＸＮ２－ＭＣＳ、株式会社免疫生物研究所）（図１３）に挿入し、３種類の抗体遺伝子発現ベクター、（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１（ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１）ベクター、（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκ（ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκ）ベクター、（ｉｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈ（ｈｕｍａｎａｉｚｅｄ ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈ）ベクターを作製した。
【0072】
（３）ＣＨＯ－Ｋ１細胞による発現
ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の完全なＩｇＧ１（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）の抗体を発現させるために、（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１ベクターと（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターを混合し、リポフェクタミン２０００（サーモフィッシャー社）をマニュアルに従って用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフィクションした。また、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦａｂフラグメントを発現させるために、（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターと（ｉｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈベクターを混合、リポフェクタミン２０００にてＣＨＯ－Ｋ１細胞へトランスフィクションした。
培養は抗生物質Ｇ－４１８（メルク社）を添加した培地を用いた。得られた培養上清に対して酵素免疫定量法（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）やＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、陽性細胞を選択した。その後陽性コロニーを限界希釈法にて培養し、陽性クローンを選択した。その結果を図１４および図１５に示す。
ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の完全なＩｇＧ１（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）の抗体を発現させるために、（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１ベクターと（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターを混合し、リポフェクタミン２０００（サーモフィッシャー社）をマニュアルに従って用いてＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフィクションした。また、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦａｂフラグメントを発現させるために、（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターと（ｉｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈベクターを混合、リポフェクタミン２０００にてＣＨＯ－Ｋ１細胞へトランスフィクションした。
培養は抗生物質Ｇ－４１８（メルク社）を添加した培地を用いた。得られた培養上清に対して酵素免疫定量法（ＥＩＡ：ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）やＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）を行い、陽性細胞を選択した。その後陽性コロニーを限界希釈法にて培養し、陽性クローンを選択した。その結果を図１４および図１５に示す。
【0073】
完全なＩｇＧ１（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）の抗体を発現させるために（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１ベクターと（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターを混合してトランスフェクションして得られたＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養上清を、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ＩＢＬ社）とＨＲＰ標識抗ヒトＫａｐｐａ抗体（サザンバイオテック社）により確認した。
その結果、図１４に示すように、非還元状態で両方の標識抗体に反応する同一バンドが確認できた。このバンドは、ｗｈｏｌｅ ＩｇＧのＭｗ（重量平均分子量）とほぼ同じ大きさで重鎖（Ｈ）２分子と軽鎖（Ｌ）２分子に相当する。また、還元処理した場合、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体で反応しているバンドは、ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１の重鎖（ＨＣ）のＭｗに相当し、ＨＲＰ標識抗Ｋａｐｐａ抗体では、ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκの軽鎖（ＬＣ）のＭｗに相当した。
その結果、図１４に示すように、非還元状態で両方の標識抗体に反応する同一バンドが確認できた。このバンドは、ｗｈｏｌｅ ＩｇＧのＭｗ（重量平均分子量）とほぼ同じ大きさで重鎖（Ｈ）２分子と軽鎖（Ｌ）２分子に相当する。また、還元処理した場合、ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ（Ｆｃ）抗体で反応しているバンドは、ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１の重鎖（ＨＣ）のＭｗに相当し、ＨＲＰ標識抗Ｋａｐｐａ抗体では、ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκの軽鎖（ＬＣ）のＭｗに相当した。
【0074】
また、Ｆａｂフラグメントを発現させるために（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターと（ｉｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ Ｈベクターを混合してトランスフェクションして得られたＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養上清を、ＨＲＰ標識抗ヒトＦｄ抗体（サザンバイオテック社）とＨＲＰ標識抗ヒトＫａｐｐａ抗体により確認した。
その結果、図１５に示すように、Ｈ鎖を認識する抗ＦｄおよびＬ鎖を認識する抗Ｋａｐｐａ抗体ともに、非還元状態でＦａｂフラグメントのＭｗに相当するバンドが確認できた。当然ながらｗｈｏｌｅ ＩｇＧ相当の高分子量のバンドは両ＨＲＰ標識抗体で確認されなかった。また、還元処理した場合には、ＨＲＰ標識抗Ｆｄ抗体でヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ ＨのＭｗに相当するバンドが確認でき、ＨＲＰ標識抗Ｋａｐｐａ抗体ではヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκの軽鎖（ＬＣ）のＭｗに相当するバンドが確認できた（図１５）。
尚、図１５のレーン３は（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１ベクターと（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターで作製したｗｈｏｌｅ ＩｇＧの抗体であり、ＨＲＰ標識抗Ｆｄ抗体、ＨＲＰ標識抗Ｋａｐｐａ抗体では還元、非還元状態のいずれにもＦａｂのＭｗに相当する分子は確認できなかった
以上より、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体およびヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦａｂフラグメント（以下、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体とも称する）の作製が確認された。
その結果、図１５に示すように、Ｈ鎖を認識する抗ＦｄおよびＬ鎖を認識する抗Ｋａｐｐａ抗体ともに、非還元状態でＦａｂフラグメントのＭｗに相当するバンドが確認できた。当然ながらｗｈｏｌｅ ＩｇＧ相当の高分子量のバンドは両ＨＲＰ標識抗体で確認されなかった。また、還元処理した場合には、ＨＲＰ標識抗Ｆｄ抗体でヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ ＨのＭｗに相当するバンドが確認でき、ＨＲＰ標識抗Ｋａｐｐａ抗体ではヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκの軽鎖（ＬＣ）のＭｗに相当するバンドが確認できた（図１５）。
尚、図１５のレーン３は（ｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１ベクターと（ｉｉ）ヒト化ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｉｇκベクターで作製したｗｈｏｌｅ ＩｇＧの抗体であり、ＨＲＰ標識抗Ｆｄ抗体、ＨＲＰ標識抗Ｋａｐｐａ抗体では還元、非還元状態のいずれにもＦａｂのＭｗに相当する分子は確認できなかった
以上より、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体およびヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦａｂフラグメント（以下、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体とも称する）の作製が確認された。
【0075】
（４）ＥＩＡによる確認
抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の抗原認識部位はヒトｃ－ＫＩＴタンパク質の細胞外領域なので、ＥＩＡ用抗原としてｃ－ＫＩＴ細胞外領域とマウス抗体のＦｃ領域の融合タンパク質（ｃ－ＫＩＴ－Ｆｃ）を用いた。陰性コントロールとしてヒトＦＬＴ４タンパク質の細胞外領域とマウス抗体Ｆｃを融合した（ＦＬＴ４－Ｆｃ）を利用した。
それぞれを９６ウェルプレートに固相後、ＢＳＡ溶液でブロッキングして洗浄し、十分乾燥させてから使用時まで冷蔵保存した。ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体産生クローン培養上清を２倍から６４倍まで倍々希釈し、抗原固相プレートおよび陰性コントロールプレートに添加して一次反応を行った。同様にヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体も同様に行った。一次反応は室温で一時間行い、その後リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で各ウェルを洗浄した。二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＫａｐｐａ鎖抗体を加え、室温で３０分反応した。その後ＰＢＳで各ウェルを洗浄し、基質ＯＰＤ（シグマ・アルドリッチ社）を添加して呈色後、１Ｎの硫酸を加え反応を停止して４９０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、図１６に示すように、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体とも抗原ｃ－ＫＩＴ－ＦＣに反応し、陰性コントロールＦＬＴ４－Ｆｃには反応しなかった。また、ＭＯＣＫ（空ベクター）をＣＨＯ－Ｋ１に発現して用いた陰性コントロールでも反応は認めなかった。
以上のことから、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体およびヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体は抗原特異性を有していることが確認できた。それぞれの培養上清は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ、ｉｎ－ｖｉｖｏの試験に使用するため、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体はプロティンＡカラムで、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体はＫａｎ Ｃａｐ Ｇ（ＫＡＮＥＫＡ社）でそれぞれ精製した。
抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体の抗原認識部位はヒトｃ－ＫＩＴタンパク質の細胞外領域なので、ＥＩＡ用抗原としてｃ－ＫＩＴ細胞外領域とマウス抗体のＦｃ領域の融合タンパク質（ｃ－ＫＩＴ－Ｆｃ）を用いた。陰性コントロールとしてヒトＦＬＴ４タンパク質の細胞外領域とマウス抗体Ｆｃを融合した（ＦＬＴ４－Ｆｃ）を利用した。
それぞれを９６ウェルプレートに固相後、ＢＳＡ溶液でブロッキングして洗浄し、十分乾燥させてから使用時まで冷蔵保存した。ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体産生クローン培養上清を２倍から６４倍まで倍々希釈し、抗原固相プレートおよび陰性コントロールプレートに添加して一次反応を行った。同様にヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体も同様に行った。一次反応は室温で一時間行い、その後リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で各ウェルを洗浄した。二次抗体としてＨＲＰ標識抗ヒトＫａｐｐａ鎖抗体を加え、室温で３０分反応した。その後ＰＢＳで各ウェルを洗浄し、基質ＯＰＤ（シグマ・アルドリッチ社）を添加して呈色後、１Ｎの硫酸を加え反応を停止して４９０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、図１６に示すように、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体とも抗原ｃ－ＫＩＴ－ＦＣに反応し、陰性コントロールＦＬＴ４－Ｆｃには反応しなかった。また、ＭＯＣＫ（空ベクター）をＣＨＯ－Ｋ１に発現して用いた陰性コントロールでも反応は認めなかった。
以上のことから、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体およびヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体は抗原特異性を有していることが確認できた。それぞれの培養上清は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏ、ｉｎ－ｖｉｖｏの試験に使用するため、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体はプロティンＡカラムで、ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体はＫａｎ Ｃａｐ Ｇ（ＫＡＮＥＫＡ社）でそれぞれ精製した。
【0076】
（実施例６）ＩＲ７００－ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）のフローサイトメトリーによる反応性検討（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）とＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株を用いてフローサイトメトリーを行い、ヒト化抗体の反応性を確認した。
ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）とＧＩＳＴ－Ｔ１細胞株を用いてフローサイトメトリーを行い、ヒト化抗体の反応性を確認した。
【0077】
（１）ＧＩＳＴ細胞の調整
ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞をトリプシンにて回収し（ｏｎ ｉｃｅ)、細胞を１×１０６ずつ１．５mLチューブに分注した。ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅ １ｍＬで３回洗浄した。４℃に冷やした４％パラホルムアルデヒド１ｍＬを添加し、ｏｎ ｉｃｅで穏やかにピペッティングにて混和した。室温に戻し１５分間静置した（以降は室温にて作業した）。ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅ １ｍＬで３回洗浄した。
ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞をトリプシンにて回収し（ｏｎ ｉｃｅ)、細胞を１×１０６ずつ１．５mLチューブに分注した。ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅ １ｍＬで３回洗浄した。４℃に冷やした４％パラホルムアルデヒド１ｍＬを添加し、ｏｎ ｉｃｅで穏やかにピペッティングにて混和した。室温に戻し１５分間静置した（以降は室温にて作業した）。ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅ １ｍＬで３回洗浄した。
【0078】
（２）抗体の反応
ＩＲ７００で各種抗体を標識し、得られた以下の抗体を用いた。なお、図１８中、ＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体を１２Ａ８（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）とも称し、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体をヒト化（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）とも称し、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体をヒト化（Ｆａｂ）とも称する。
ＩＲ７００で各種抗体を標識し、得られた以下の抗体を用いた。なお、図１８中、ＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体を１２Ａ８（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）とも称し、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体をヒト化（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧ）とも称し、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体をヒト化（Ｆａｂ）とも称する。
【0079】
【表3】
【0080】
ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅで調整した抗体溶液１００μＬをＧＩＳＴ－Ｔ１細胞のペレットに添加し、混和した。それぞれＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体１０μｇ、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体１０μｇ、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体１０μｇを含むように調整した。アルミホイルで暗所にし、室温（２０～２５℃）で６０分間反応させた（以降はなるべく暗所にて作業した）。ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅを１ｍＬ添加することによる洗浄を３回行った。ＰＢＳ－ＢＳＡ－Ａｚｉｄｅを５００μＬ添加して混和し、フィルター（ナイロンメッシュ；アズワン，４２μｍ)を通した。ＦＡＣＳ（ＣｙｔｏＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｌｔｅｒ））により、６３８ｎｍで励起させ、７１２／２５ＢＰで測定した。その結果を、図１７に示す。なお、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体は、１０μｇ添加したが、添加するＩＲ７００量を他の抗体と揃えるためには、６．６７μｇを添加する必要があった。６．６７μｇを添加した場合、添加したＩＲ７００量が約２／３倍になるため、ＭＦＩも約２／３倍になると考えられる。
ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体のＭＦＩは、ＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体を用いたときと同様の値であった。ＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦ／Ｐ比が４．４と高いことを考えると、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体のｃ－ＫＩＴとの反応性が良いことが示された。ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体に関しても、当モル（６．６７μｇ）を投与すれば、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体と同程度のＭＦＩになると考えられるので、反応性が良いことが示唆される。以上の結果をふまえ、小動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの実験を行った。
ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体のＭＦＩは、ＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体を用いたときと同様の値であった。ＩＲ７００標識マウス抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体のＦ／Ｐ比が４．４と高いことを考えると、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体のｃ－ＫＩＴとの反応性が良いことが示された。ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体に関しても、当モル（６．６７μｇ）を投与すれば、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体と同程度のＭＦＩになると考えられるので、反応性が良いことが示唆される。以上の結果をふまえ、小動物を用いたｉｎ ｖｉｖｏでの実験を行った。
【0081】
（実施例７）ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）を用いたマウスにおける異種移植腫瘍の蛍光イメージング
【0082】
（１）材料
使用したＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）は、実施例６で使用した抗体と同じである。
使用したＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）抗体（ｗｈｏｌｅ ＩｇＧおよびＦａｂ）は、実施例６で使用した抗体と同じである。
【0083】
（２）方法
ヌードマウス９匹（日本クレア，ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１－ｎｕ／ｎｕ，５週齢，メス）にｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（０．２ｍｇ／ｇ体重）を投与して免疫抑制処理を行った。２日後、マウス９匹のそれぞれに１×１０７ｃｅｌｌｓずつ、１００μＬ（Ｃｅｌｌ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ＝５０：５０）の体積となるよう調製したＧＩＳＴ－Ｔ１を移植した。具体的には、Ｍａｔｒｉｇｅｌをｏｎ ｉｃｅにて解凍し、細胞を剥がして細胞数をカウントし、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞：１×１０７ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるようＰＢＳに懸濁した。Ｏｎ ｉｃｅにて、細胞液：Ｍａｔｒｉｇｅｌ＝１：１の割合で、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌに懸濁して右大腿部に皮下移植した。
腫瘍が８ｍｍになったときに、尾静脈から各種抗体を投与し、その後ＩＶＩＳ（λｅｘ：６７５、λｅｍ：７２０）で投与直後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、９時間後、１２時間後、２４時間後に蛍光観察を行った（各種抗体：ｎ＝３）。
ヌードマウス９匹（日本クレア，ＢＡＬＢ／ｃＡＪｃ１－ｎｕ／ｎｕ，５週齢，メス）にｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ（０．２ｍｇ／ｇ体重）を投与して免疫抑制処理を行った。２日後、マウス９匹のそれぞれに１×１０７ｃｅｌｌｓずつ、１００μＬ（Ｃｅｌｌ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ＝５０：５０）の体積となるよう調製したＧＩＳＴ－Ｔ１を移植した。具体的には、Ｍａｔｒｉｇｅｌをｏｎ ｉｃｅにて解凍し、細胞を剥がして細胞数をカウントし、ＧＩＳＴ－Ｔ１細胞：１×１０７ｃｅｌｌｓ／５０μＬとなるようＰＢＳに懸濁した。Ｏｎ ｉｃｅにて、細胞液：Ｍａｔｒｉｇｅｌ＝１：１の割合で、細胞をＭａｔｒｉｇｅｌに懸濁して右大腿部に皮下移植した。
腫瘍が８ｍｍになったときに、尾静脈から各種抗体を投与し、その後ＩＶＩＳ（λｅｘ：６７５、λｅｍ：７２０）で投与直後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、９時間後、１２時間後、２４時間後に蛍光観察を行った（各種抗体：ｎ＝３）。
【0084】
その結果、図１８～１９に示すように、Ｉｎ ｖｉｖｏでマウスモデルにＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を投与した後の蛍光イメージングでは、腫瘍領域（ＲＯＩ）における蛍光強度は３～４時間後にピークに達し、以後漸減した。一方、腫瘍細胞を投与していない反対側（左大腿部）における対照ＲＯＩの蛍光強度は１～６時間後にピークとなり、以後漸減した。また、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）ＩｇＧ１抗体を投与した後の蛍光イメージングでは、投与後１～４時間では蛍光はほとんど確認できず、確認できたとしても蛍光強度は弱いものであった。
また、図２０に示すように、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を投与した後の腫瘍領域（ＲＯＩ）におけるＳ／Ｎ比は、３～４時間後にピークに達し、以後漸減した。
以上の結果より、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体は、短時間で腫瘍に集積させることができるので、ＧＩＳＴの短時間での診断に適していることが示された。続いて小動物を用いた治療実験を行った。
また、図２０に示すように、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を投与した後の腫瘍領域（ＲＯＩ）におけるＳ／Ｎ比は、３～４時間後にピークに達し、以後漸減した。
以上の結果より、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体は、短時間で腫瘍に集積させることができるので、ＧＩＳＴの短時間での診断に適していることが示された。続いて小動物を用いた治療実験を行った。
【0085】
（実施例８）ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を用いたマウスにおける異種移植腫瘍の光免疫治療（ｉｎ ｖｉｖｏ）
【0086】
（１）材料と方法
実施例７で用いたマウスと同様に免疫抑制処理およびＧＩＳＴ－Ｔ１移植を行ったマウスのうち、腫瘍サイズが近似したマウス４匹を選択しイソフルランで鎮静した。ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を８０μｇ投与し（ｎ＝２）、それぞれ約３時間後に腫瘍に対してレーザーを１時間（７３５Ｊ）照射した。その後腫瘍を治療しないコントロール群（生食投与群）とともに腫瘍サイズを３週間観察した。治療スケジュールを図２１に示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ｃ－ＫＩＴ抗体を尾静脈投与し、４８時間後にＩＶＩＳを用いて観察した（ｎ＝２）。
その結果、図２２に示すように、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を投与してから１～３時間の時間経過に伴い、蛍光強度が増加した。そして、図２３に示すように、当該抗体を投与してから３時間後に６８５ｎｍのレーザーを照射した結果、腫瘍が消失することが示された。
実施例７で用いたマウスと同様に免疫抑制処理およびＧＩＳＴ－Ｔ１移植を行ったマウスのうち、腫瘍サイズが近似したマウス４匹を選択しイソフルランで鎮静した。ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を８０μｇ投与し（ｎ＝２）、それぞれ約３時間後に腫瘍に対してレーザーを１時間（７３５Ｊ）照射した。その後腫瘍を治療しないコントロール群（生食投与群）とともに腫瘍サイズを３週間観察した。治療スケジュールを図２１に示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識抗ｃ－ＫＩＴ抗体を尾静脈投与し、４８時間後にＩＶＩＳを用いて観察した（ｎ＝２）。
その結果、図２２に示すように、ＩＲ７００標識ヒト化抗ｃ－ＫＩＴ（１２Ａ８）Ｆａｂ抗体を投与してから１～３時間の時間経過に伴い、蛍光強度が増加した。そして、図２３に示すように、当該抗体を投与してから３時間後に６８５ｎｍのレーザーを照射した結果、腫瘍が消失することが示された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【配列表】