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特許7460182フォールディングされたドメインおよびＲＮＡ顆粒会合タンパク質ドメインの光制御オリゴマー化および相分離のためのシステムおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-25
(45)【発行日】2024-04-02
(54)【発明の名称】フォールディングされたドメインおよびＲＮＡ顆粒会合タンパク質ドメインの光制御オリゴマー化および相分離のためのシステムおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240326BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240326BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240326BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240326BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240326BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240326BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12Q1/02
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021548686
(86)(22)【出願日】2020-02-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-05-17
(86)【国際出願番号】 US2020018758
(87)【国際公開番号】W WO2020172228
(87)【国際公開日】2020-08-27
【審査請求日】2022-01-13
(31)【優先権主張番号】62/807,459
(32)【優先日】2019-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】591003552
【氏名又は名称】ザ、トラスティーズ オブ プリンストン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100157923
【弁理士】
【氏名又は名称】鶴喰 寿孝
(72)【発明者】
【氏名】ブラングウィン，クリフォード・ピー
(72)【発明者】
【氏名】ブラチャ，ダン
(72)【発明者】
【氏名】ドレイク，ヴィクトリア
(72)【発明者】
【氏名】サンダース，デヴィッド・ダブリュー
【審査官】牧野 晃久
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１８／０２５１４９７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０３５５９７７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】Bracha et al., 2018, Cell 175, 1467-1480
【文献】ACS Synth. Biol.，2017年，Vol. 6，pp. 1086-1095，DOI: 10.1021/acssynbio.7b00022
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
Ｃ０７Ｋ １９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２つのオプトタンパク質を含むタンパク質システムであって、各オプトタンパク質が第二の領域に融合した第一の領域を含み、
該少なくとも２つのオプトタンパク質の第一のオプトタンパク質の第一の領域が（ｉ）ＢＬＵＦドメイン、ＬＯＶドメイン、ＵＶＲ８ドメイン、フィトクロム、またはクリプトクロムを含む第一の光感受性タンパク質、および（ｉｉ）自己集合するように設定された１つまたはそれより多いタンパク質を含む、
該少なくとも２つのオプトタンパク質の第二のオプトタンパク質の第一の領域が、（ｉ）該第一の光感受性タンパク質の第一の同族パートナー、および（ｉｉ）自己集合するように設定された１つまたはそれより多いタンパク質を含む、そして
該第一のオプトタンパク質の第二の領域、および該第二のオプトタンパク質の第二の領域が、それぞれ、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含む、
自己集合するように設定された１つまたはそれより多いタンパク質がフェリチンを含む、タンパク質システム。
【請求項2】
タンパク質システムが：第二の領域に融合した第一の領域を含む固定リンカータンパク質であって、固定リンカータンパク質の第一および第二の領域が各々、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、そして固定リンカータンパク質の第一および第二の領域が各々、少なくとも２つのオプトタンパク質のオプトタンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されている、前記固定リンカータンパク質
をさらに含む、請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項3】
タンパク質システムが：（Ｉ）第二の領域に融合した第一の領域を含む代替オプトタンパク質であって、代替オプトタンパク質の第一の領域が第二の光感受性タンパク質の第二の同族パートナーを含み、代替オプトタンパク質の第二の領域が、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、代替オプトタンパク質の第二の領域が少なくとも２つのオプトタンパク質の第一のオプトタンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されている、前記代替オプトタンパク質；ならびに
（ＩＩ）第二の領域に融合した第一の領域を含む代替コアタンパク質であって、代替コアタンパク質の第一の領域が第二の光感受性タンパク質を含み、そして代替コアタンパク質の第二の領域が、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、代替コアの第二の領域が自己集合するように適応されている、前記代替コアタンパク質
をさらに含む、請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項4】
システムがさらに、２つまたはそれより多いタンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）コアタンパク質を含み、各ＰＰＩコアタンパク質が第二の領域に融合した第一の領域を含み、ＰＰＩコアタンパク質の第一の領域が、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、ＰＰＩコアタンパク質の第二の領域が、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、各ＰＰＩコアタンパク質の第一の領域が少なくとも２つのオプトタンパク質のオプトタンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されており、そして各ＰＰＩコアタンパク質の第二の領域が自己集合するように適応されている、
請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項5】
請求項１記載のタンパク質システムであって、第三のオプトタンパク質であって、第一の領域が第二の光感受性タンパク質を含み、そして第二の領域が、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含む、前記オプトタンパク質をさらに含み、
第三のオプトタンパク質の第二の領域が、少なくとも２つのオプトタンパク質のオプトタンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されており、そして
少なくとも２つのオプトタンパク質のオプトタンパク質の第一の領域および第三のオプトタンパク質の第一の領域が、光に反応して、少なくとも２つの構成要素のオリゴマーに自己集合するように適応されている、
前記タンパク質システム。
【請求項6】
第一の光感受性タンパク質がフォールディングされたＲＢＤに融合し、そしてフォールディングされたＲＢＤが、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、Ｋ相同（ＫＨ）ドメイン、プミリオ（ＰＵＭ）ドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＤＥＡＤボックスヘリカーゼドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）、ｍ６Ａ ＲＮＡ結合ドメイン（ＹＴＨドメイン）、またはコールドショックドメイン（ＣＳＤ）である、第一の光感受性タンパク質が変性ＲＢＤに融合し、そして変性ＲＢＤがアルギニン－グリシン（ＲＧ）ドメイン、アルギニン－グリシン－グリシン（ＲＧＧ）ドメイン、セリン－アルギニン（ＳＲ）ドメイン、または塩基性－酸性ジペプチド（ＢＡＤ）ドメインである、または
第一の光感受性タンパク質が１つまたはそれより多いフォールディングされた、二量体化またはオリゴマー化ドメインを含む非ＲＢＤに融合している、
請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項7】
第一の光感受性タンパク質が操作されたタンパク質である、請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項8】
第一の領域が２つのＬＯＶ２－ｓｓｒＡタンパク質を含む、請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項9】
少なくとも２つのオプトタンパク質の少なくとも１つのオプトタンパク質が蛍光タグを含む、請求項１記載のタンパク質システム。
【請求項10】
請求項１のタンパク質システムを発現する細胞株または幹細胞由来細胞であって、タンパク質システムを発現するように適応された１つまたはそれより多くの遺伝子が、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、一過性トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアプローチを利用して、細胞に送達されており、前記細胞株または幹細胞由来細胞は、ヒト細胞、酵母細胞、培養ニューロン、虫（ｗｏｒｍ）細胞、ハエ（ｆｌｙ）細胞、齧歯類細胞、または霊長類細胞である、細胞株または幹細胞由来細胞。
【請求項11】
請求項１記載のタンパク質システムを発現するよう設定された１つまたはそれより多い遺伝子で、細胞をトランスフェクションするように設定された少なくとも１つの発現ベクターを含み、該タンパク質システムは、前記２つのオプトタンパク質を含む、発現ベクター系。
【請求項12】
二量体化またはオリゴマー化したタンパク質システムの相挙動を測定するための方法であって：ａ． 請求項１記載のタンパク質システムを提供し；
ｂ． 第一の光感受性タンパク質を、少なくとも１つの光波長に曝露することによって、フォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、または二量体化またはオリゴマー化ドメインを含むフォールディングされた非ＲＢＤドメインをオリゴマー化し；そして
ｃ． 状態図をマッピングし、相分離、凝縮、または凝集が起こっているかどうかを決定し、二量体化またはオリゴマー化したタンパク質システムの物質特性、タンパク質濃度、価、またはその組み合わせを測定することによって相挙動を測定する
工程を含む、前記方法。
【請求項13】
タンパク質システムが生存細胞内に位置する、請求項１２記載の方法。
【請求項14】
タンパク質システムが生存または死亡細胞の外に位置する、請求項１２記載の方法。
【請求項15】
オリゴマー化が細胞質リボ核タンパク質（ＲＮＰ）顆粒のゲル化を促進する、請求項１２記載の方法。
【請求項16】
タンパク質システムが、マルチウェルアレイ／プレートのウェル中にある、請求項１２記載の方法であって、１つまたはそれより多い化学剤をウェルに提供する工程をさらに含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願に対するクロスリファレンス
［０００１］本出願は、２０１９年２月１９日出願の米国仮出願第６２／８０７４５９号に優先権を請求し、該出願はその全体が本明細書に援用される。
技術分野
［０００２］本開示は、一般に、フォールディングされたドメインの相分離に関し、そしてより具体的には、薬剤に基づくスクリーニング適用の一部としての、フォールディングされたドメインのクラスターの誘導に関する。
［０００１］本出願は、２０１９年２月１９日出願の米国仮出願第６２／８０７４５９号に優先権を請求し、該出願はその全体が本明細書に援用される。
技術分野
［０００２］本開示は、一般に、フォールディングされたドメインの相分離に関し、そしてより具体的には、薬剤に基づくスクリーニング適用の一部としての、フォールディングされたドメインのクラスターの誘導に関する。
【発明の概要】
【0002】
［０００３］細胞は、オルガネラと呼ばれる反応中心において、生命に必要な多様な生化学プロセスを区画化する。オルガネラは古典的には、均一な細胞質ゾル溶液から隔離された膜封入区画として描写される。しかし、細胞はまた、その内容物を、膜を欠くオルガネラでも編成する。こうした区画は、真核細胞の核中に特に豊富であり、そしてこれには、リボソーム産生核小体ならびに機能がほとんど理解されていないＲＮＡ－タンパク質体（例えばカハール体、スペックル）が含まれる（ＺｈｕおよびＢｒａｎｇｗｙｎｎｅ、２０１５）。細胞質において、膜不含区画の存在は、通常、背景特異的であり、ポリソーム分解（すなわちストレス顆粒）（Ｉｖａｎｏｖら、２０１８；ＰｒｏｔｔｅｒおよびＰａｒｋｅｒ、２０１６）、または特異的細胞外シグナルの検出（例えばシグナロソーム、インフラマソーム）（ＧａｍｍｏｎｓおよびＢｉｅｎｚ、２０１８；ＷｕおよびＦｕｘｒｅｉｔｅｒ、２０１６）の結果として現れる。多くの場合、こうした巨視的集合が、特定の生化学反応を増大させるのか、または不活性隔離中心として受動的に存在するのかは不明確である（ＳｈｉｎおよびＢｒａｎｇｗｙｎｎｅ、２０１７）。
【0003】
［０００４］近年の研究によって、液体－液体相分離（ＬＬＰＳ）の物理は、これらの構造の集合を説明することが示唆されており、こうした構造は、次第に凝縮体と称されるようになっている（Ｂａｎａｎｉら、２０１７；Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅら、２００９；ＳｈｉｎおよびＢｒａｎｇｗｙｎｎｅ、２０１７）。細胞内ＬＬＰＳは、優先的な自己会合を通じた自由エネルギー最小化の結果として、飽和タンパク質／核酸濃度で起こる（Ｂｒａｎｇｗｙｎｎｅら、２０１５）。低複雑性／天然変性領域（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎ）（ＩＤＲ）または短い「粘着性（ｓｔｉｃｋｙ）」モチーフを含有するタンパク質間の弱い相互作用は、特定の系において細胞内ＬＬＰＳを仲介しうる（Ｅｌｂａｕｍ－Ｇａｒｆｉｎｋｌｅら、２０１５；Ｆｒｅｙら、２００６；Ｋａｔｏら、２０１２；Ｍｏｌｌｉｅｘら、２０１５；Ｍｕｒａｋａｍｉら、２０１５；Ｎｏｔｔら、２０１５；Ｐａｔｅｌら、２０１５）が、これらの付加的「多価」モチーフ反復が、核小体およびストレス顆粒のような一般的な巨視的生物学的凝縮物の形成に必須であるかどうかは不明である。そのようなＲＮＰ体において、低特異性ＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）を含有するタンパク質は、ＲＮＡに基づく架橋を伴う弱い相互作用のため、ＬＬＰＳには非常に重要である可能性もある（Ｃｈｏｎｇら、２０１８；Ｆｅｒｉｃら、２０１６；Ｌｅｅら、２０１６；Ｍｉｔｒｅａら、２０１８；Ｎｏｔｔら、２０１５；Ｖｅｒｎｏｎら、２０１８）。
【0004】
［０００５］多価の弱い相互作用の寄与に関して多数の研究がなされてきたにもかかわらず、多構成要素細胞性凝縮物が、選択的に相分離して、そして特定の基質を補充する一方、他のものを排除することを可能にする、特異的相互作用に関しては、それほど注意が払われてこなかった。必須凝縮物核形成タンパク質は、しばしば、オリゴマー化ドメイン、ＩＤＲ、および最も一般的なカテゴリーがＲＢＤである基質結合部分を含む、共有されたモジュラー構造を示す（Ａｏｋｉら、２０１８；ＨｅｂｅｒｔおよびＭａｔｅｒａ、２０００；Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６；Ｍａｔｓｕｋｉら、２０１３；Ｍｉｔｒｅａら、２０１８；２０１６；２０１４；Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅら、２００３）。これらのＲＢＤの多くは、特異的ＲＮＡモチーフに高アフィニティで結合するよくフォールディングされたＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、ならびにバルクＲＮＡおよび解離リボソームに低アフィニティで結合する末端ＲＧＧ領域の両方を特徴とする（Ｃｈｏｎｇら、２０１８；Ｍｉｔｒｅａら、２０１６；Ｔｈａｎｄａｐａｎｉら、２０１３）。例えば、Ｇ３ＢＰ（ストレス顆粒）、ＰＧＬ（Ｐ顆粒）、およびＮＰＭ１（核小体）は、各々、Ｎ末端にオリゴマー化ドメイン、そしてＣ末端に二部分（ｂｉ－ｐａｒｔｉｔｅ）ＲＢＤ（フォールディングされたＲＲＭ、変性（ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）ＲＧＧ）を有する（Ａｏｋｉら、２０１８；Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６；Ｍａｔｓｕｋｉら、２０１３；Ｍｉｔｒｅａら、２０１４；Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅら、２００３）。こうしたオリゴマー化ドメインおよびＲＢＤは重要であると考えられているが、定義された物質特性を伴う、凝縮物の相分離へのこれらの相対的な寄与の定量的な理解はされていない。
【0005】
［０００６］ストレス顆粒（ＳＧ）は、特に興味深い細胞質凝縮物に相当し、該顆粒は、細胞内相分離の一般的な原理を説明するための重要なモデルとして出現してきた（Ｉｖａｎｏｖら、２０１８；Ｋｅｄｅｒｓｈａら、１９９９；ＰｒｏｔｔｅｒおよびＰａｒｋｅｒ、２０１６）。ＳＧは、ミクロンサイズで液体様のＲＮＡ－タンパク質集合体であり、哺乳動物細胞において、翻訳抑止およびそれに続くポリソーム分解に反応して形成される（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、１９９９；２０１６；２００２；Ｋｒｏｓｃｈｗａｌｄら、２０１５；Ｍｏｌｌｉｅｘら、２０１５；Ｗｈｅｅｌｅｒら、２０１６；Ｗｉｐｐｉｃｈら、２０１３）。ＳＧ集合は、ＲＢＰ、リボソームサブユニット、およびＲＮＡと相互作用するネットワークを伴う（Ｂｏｕｎｅｄｊａｈら、２０１４；Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６；Ｍａｒｋｍｉｌｌｅｒら、２０１８；Ｙｏｕｎら、２０１８）。この相互作用のリッチなネットワークにもかかわらず、以前の研究は、ＳＧ凝縮に必須であるようであり（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６；Ｍａｔｓｕｋｉら、２０１３）、そして上述のカノニカルなモジュラー構築を特徴とする（Ｔｏｕｒｒｉｅｒｅら、２００３）、単一タンパク質、Ｇ３ＢＰの重要性を過小評価してきた。しかし、Ｇ３ＢＰがＳＧ生合成を制御する機構、およびそのモジュラー構築の生物物理的役割は、ほとんど理解されていないままである（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６；Ｍａｔｓｕｋｉら、２０１３；Ｐａｎａｓら、２０１５；Ｓｃｈｕｌｔｅら、２０１６；Ｓｏｌｏｍｏｎら、２００７；Ｗｕら、２０１６）。
【0006】
［０００７］ＳＧおよび他の凝縮物に関する以前の研究を妨げていた重要な障害は、特定の凝縮物核形成タンパク質に関する、ユニークな相互作用モジュールの相対的役割をｉｎ ｖｉｖｏで定量的に探査するツールが欠けていることであった。
【0007】
概要
［０００８］相分離／凝縮は、一般的に、相互作用する生体分子の連結されたネットワークの形成を必要とする。開示するシステムおよび方法は、光活性化に際して相分離を活性化するが、潜在的なタンパク質－タンパク質またはタンパク質－ＲＮＡ相互作用が起こっている場合のみに活性化する構築物を、当業者が操作することを可能にする。これは次に、連結された相互作用ネットワークが欠如しているために相分離／凝縮が起こらない条件を見出すことによって、前記相互作用を破壊する条件に関してスクリーニングすることを可能にする。
［０００８］相分離／凝縮は、一般的に、相互作用する生体分子の連結されたネットワークの形成を必要とする。開示するシステムおよび方法は、光活性化に際して相分離を活性化するが、潜在的なタンパク質－タンパク質またはタンパク質－ＲＮＡ相互作用が起こっている場合のみに活性化する構築物を、当業者が操作することを可能にする。これは次に、連結された相互作用ネットワークが欠如しているために相分離／凝縮が起こらない条件を見出すことによって、前記相互作用を破壊する条件に関してスクリーニングすることを可能にする。
【0008】
［０００９］細胞内凝縮物を読み出し情報として利用して、生体分子相互作用、例えばオリゴマー化、タンパク質－タンパク質相互作用、およびＲＮＡ結合を定量的に調べる、オプトジェネティックツールを提供するシステムおよび方法を開示する。フォールディングされたドメインの弱く架橋された複合体またはハブを用いて、液体－液体相分離の相境界を越えてもよい。これらのハブは、例えば、小分子ライブラリー、または生理学的タンパク質／基質由来の分子、例えば複合体の価数を減少させ、そしてそれによって、会合したタンパク質－ＲＮＡネットワークの相分離を仲介する能力を抑制するＵＳＰ１０によって破壊されてもよい。
【0009】
［００１０］本開示の第一の側面は、薬剤に基づくスクリーニング適用の一部として用いてもよいタンパク質システムに関する。該タンパク質システムは、１つまたはそれより多い第一の融合タンパク質を必要とし、第一の融合タンパク質には各々、第二の領域に融合した第一の領域が含まれる。第一の領域は、少なくとも１つの光感受性タンパク質または光感受性タンパク質の同族（ｃｏｇｎａｔｅ）パートナーを含み、一方、第二の領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含む。
【0010】
［００１１］随意に、第一の融合タンパク質の第一の領域に、第一の光感受性タンパク質の第一の同族パートナーが含まれる場合、システムには、やはり第二の領域に融合した第一の領域を含む、第二の融合タンパク質が含まれてもよい。第二の融合タンパク質の第一の領域には、第一の光感受性タンパク質が含まれる（適切な光条件下で、第一の融合タンパク質が、第二の融合タンパク質に連結されることを可能にする）。第二の融合タンパク質の第二の領域には、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせが含まれ、ここで、第二の融合タンパク質の第二の領域は、他の第二の融合タンパク質が近傍にある場合、自己集合が可能である（例えばホモ型およびヘテロ型相互作用を含めて、二量体、三量体、五量体、ｎ量体相互作用を通じて）。
【0011】
［００１２］さらに、こうしたシステムには、第三および第四の融合タンパク質も含まれてもよく、ここで、第二および第四の融合タンパク質は、コア構造に自己集合し、そして第一および第三の融合タンパク質は、互いに相互作用し、そしてそれぞれ第二および第四の融合タンパク質にオプトジェネティック的に付着可能であるように設定されている。第三の融合タンパク質には、第二の領域に融合した第一の領域が含まれる。第三の融合タンパク質の第一の領域は、第二の光感受性タンパク質の同族パートナーを含み、そして第三の融合タンパク質の第二の領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、ここで第三の融合タンパク質の第二の領域は、第一の融合タンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されている。第四の融合タンパク質には、第二の領域に融合した第一の領域が含まれ、第四の融合タンパク質の第一の領域は、第二の光感受性タンパク質を含み、そして第四の融合タンパク質の第二の領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、ここで第四の融合タンパク質の第二の領域は、他の第四の融合タンパク質または他の第二の融合タンパク質のいずれかと自己集合可能である。
【0012】
［００１３］あるいは、システムには、２つの領域を共に融合させている第三の融合タンパク質が含まれてもよく、各領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、そして第三の融合タンパク質の２つの領域は各々、第一の融合タンパク質の第二の領域と相互作用するために適応されている。
【0013】
［００１４］随意に、第一の融合タンパク質の第一の領域が、第一の光感受性タンパク質を含む場合、システムにはまた、第二の融合タンパク質および２つまたはそれより多い第三の融合タンパク質も含まれてもよい。第二の融合タンパク質には、第二の領域に融合した第一の領域が含まれ、ここで、第二の融合タンパク質の第一の領域は、第一の光感受性タンパク質の同族パートナーを利用し、そして第二の融合タンパク質の第二の領域は、第一の融合タンパク質の第二の領域と同一である。すなわち、第一および第二の融合タンパク質は、一方が光感受性タンパク質を有し、そしてもう一方が光感受性タンパク質の同族パートナーを有する以外、ほぼ同一である。２つまたはそれより多い第三の融合タンパク質には、各々、第二の領域に融合した第一の領域が含まれ、第三の融合タンパク質の２つの領域の各々には、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせが含まれ、第三の融合タンパク質の第二の領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含むが、第一の領域は、第一の融合タンパク質の第二の領域または第二の融合タンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されており、そして第三の融合タンパク質各々の第二の領域は、自己集合するように適応されている。
【0014】
［００１５］随意に、第一の融合タンパク質／オプトタンパク質（ｏｐｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）の第一の領域が、第一の光感受性タンパク質を含む場合、システムは、第二の領域に融合した第一の領域を含む第二の融合タンパク質を利用してもよい。第二の融合タンパク質の第一の領域には第一の光感受性タンパク質が含まれ、そして第二の融合タンパク質の第二の領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせを含み、ここで、第二の融合タンパク質各々の第二の領域は、第一の融合タンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されており、そして第一の融合タンパク質の第一の領域および第二の融合タンパク質の第一の領域は、光に反応して、少なくとも２つの構成要素のオリゴマーに自己集合するように適応されていてもよい。
【0015】
［００１６］開示するシステムのいくつかにおいて、光感受性タンパク質は、フォールディングされたＲＢＤに融合され、そしてフォールディングされたＲＢＤは、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、Ｋ相同（ＫＨ）ドメイン、プミリオ（ＰＵＭ）ドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＤＥＡＤボックスヘリカーゼドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）、ｍ６Ａ ＲＮＡ結合ドメイン（ＹＴＨドメイン）、またはコールドショックドメイン（ＣＳＤ）である。開示するシステムのいくつかにおいて、光感受性タンパク質は変性ＲＢＤに融合され、そして変性ＲＢＤはアルギニン－グリシン（ＲＧ）ドメイン、アルギニン－グリシン－グリシン（ＲＧＧ）ドメイン、セリン－アルギニン（ＳＲ）ドメイン、または塩基性－酸性ジペプチド（ＢＡＤ）ドメイン（例えばＲＤ、ＲＥ）である。開示するシステムのいくつかにおいて、光感受性タンパク質は、１つまたはそれより多くのフォールディングされた非ＲＢＤに融合される。
【0016】
［００１７］開示するシステムのいくつかにおいて、第一の領域はフェリチンを含む。
［００１８］随意に、少なくとも１つの光感受性タンパク質は、操作されたタンパク質、例えばＬＯＶ２－ｓｓｒＡである。随意に、少なくとも１つの光感受性タンパク質は、第二のＬＯＶ２－ｓｓｒＡに融合した第一のＬＯＶ２－ｓｓｒＡを含む。
［００１８］随意に、少なくとも１つの光感受性タンパク質は、操作されたタンパク質、例えばＬＯＶ２－ｓｓｒＡである。随意に、少なくとも１つの光感受性タンパク質は、第二のＬＯＶ２－ｓｓｒＡに融合した第一のＬＯＶ２－ｓｓｒＡを含む。
【0017】
［００１９］随意に、システム中の融合タンパク質の１つ、例えば第一の融合タンパク質は、蛍光タグを含む。
［００２０］本開示の第二の側面は、上述のタンパク質システムを発現する細胞株または幹細胞由来細胞に関する。随意に、タンパク質システムを発現するように設定された１つまたはそれより多い遺伝子を、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、一過性トランスフェクション（例えばリポソームまたはＤＮＡプラスミド導入のための専有（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配合物）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアプローチを利用して、細胞に送達した。随意に、細胞は、ヒト細胞、酵母細胞、培養ニューロン、または虫（ｗｏｒｍ）、ハエ（ｆｌｙ）、齧歯類、または霊長類モデルである。
［００２０］本開示の第二の側面は、上述のタンパク質システムを発現する細胞株または幹細胞由来細胞に関する。随意に、タンパク質システムを発現するように設定された１つまたはそれより多い遺伝子を、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、一過性トランスフェクション（例えばリポソームまたはＤＮＡプラスミド導入のための専有（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）配合物）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアプローチを利用して、細胞に送達した。随意に、細胞は、ヒト細胞、酵母細胞、培養ニューロン、または虫（ｗｏｒｍ）、ハエ（ｆｌｙ）、齧歯類、または霊長類モデルである。
【0018】
［００２１］本開示の第三の側面は、請求項１記載のタンパク質システムを発現するよう設定された１つまたはそれより多くの遺伝子で細胞をトランスフェクションするように設定された少なくとも１つの発現ベクターを含む、発現ベクター系に関する。随意に、発現ベクター系には、第一の融合タンパク質を発現可能である遺伝子を含む第一のプラスミドが含まれる。
【0019】
［００２２］本開示の第四の側面は、天然または操作された多構成要素膜不含オルガネラ／凝縮物の相挙動（すなわち、飽和濃度、完全バイノーダル相境界（ｆｕｌｌ ｂｉｎｏｄａｌ ｐｈａｓｅ ｂｏｕｎｄａｒｙ）等を含む、濃度依存性状態図）を測定するための方法に関する。該方法には、上述のタンパク質システムを提供し、光感受性タンパク質を、少なくとも１つの光波長に曝露することによって、フォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、またはフォールディングされた非ＲＢＤドメインをオリゴマー化し、そして状態図をマッピングし、相分離、凝縮、または凝集が起こっているかどうかを決定し、凝縮物物質特性、タンパク質濃度、価、またはその組み合わせを測定することによって相挙動を測定する工程が含まれる。
【0020】
［００２３］随意に、方法は、タンパク質システムが生存細胞内に、あるいは生存（または死んだ）細胞外にある場合であってもよい。随意に、タンパク質システムは、マルチウェルアレイ（またはプレート）中のウェル中にある。随意に、オリゴマー化は細胞質リボ核タンパク質（ＲＮＰ）顆粒のゲル化を促進する。
【0021】
［００２４］随意に、方法にはまた、１つまたはそれより多い化学剤をウェルに提供する工程も含まれる。
［００２５］随意に、方法にはまた、遺伝子ノックダウン（例えばＣＲＩＳＰＲ ＫＯ、ＣＲＩＳＰＲｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）または遺伝子上方制御（例えばＣＲＩＳＰＲａまたはＤＮＡプラスミドに基づく過剰発現）に基づく遺伝子スクリーニングの利用も含まれる。
［００２５］随意に、方法にはまた、遺伝子ノックダウン（例えばＣＲＩＳＰＲ ＫＯ、ＣＲＩＳＰＲｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）または遺伝子上方制御（例えばＣＲＩＳＰＲａまたはＤＮＡプラスミドに基づく過剰発現）に基づく遺伝子スクリーニングの利用も含まれる。
【0022】
［００２６］随意に、方法にはまた、遺伝子ノックダウンに基づく遺伝子スクリーニング、上方制御に基づく遺伝子スクリーニング、ウェルへの１つまたはそれより多い化学剤の添加、またはその組み合わせが有する影響を、測定された相挙動に基づいて決定する工程も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】［００２７］図１Ａは、本開示にしたがった第一の融合タンパク質の単純化された態様であり、融合タンパク質の第一および第二の領域を強調している。［００２８］図１Ｂは、本開示にしたがった第一の融合タンパク質の単純化された別の態様であり、融合タンパク質の第一および第二の領域を強調している。［００２９］図１Ｃは、第一の融合タンパク質の単一のタイプが自己集合可能である態様を例示する、単純化された図である。
【図5】［００３３］図５は、第二の融合タンパク質が自己集合し、第一の融合タンパク質が、特定の光波長下で、第二の融合タンパク質に付着可能であり、そして第三の融合タンパク質が第二の融合タンパク質と相互作用する態様を例示する、単純化された図である。
【図8】［００３６］図８は、第二および第四の融合タンパク質が自己集合し、第一の融合タンパク質が、特定の光波長下で、第二の融合タンパク質に付着可能であり、第三の融合タンパク質が第二の融合タンパク質と相互作用し、そして第三の融合タンパク質が、特定の光波長下で、第四の融合タンパク質に付着可能である態様を例示する、単純化された図である。
【図10】［００３８］図１０は、第六の融合タンパク質が自己集合し、第一の融合タンパク質の１つのタイプが第六の融合タンパク質と相互作用可能であり、第一の融合タンパク質の第二のタイプが、特定の光波長下で、第一の融合タンパク質の第一のタイプに付着可能であり、そして第一の融合タンパク質の第二のタイプが第六の融合タンパク質との相互作用に利用可能である態様を例示する、単純化された図である。
【図12】［００４０］図１２は、本出願の根底にある概念であるグラフ理論由来の概念が、ネットワークに基づく細胞凝縮のための機械的フレームワークをどのように提供するかを示す例示である；「価」（ｖ）は「粒子」と会合する相互作用部位の数を記載し（１～６で示される）、これは細胞において、個々のタンパク質またはタンパク質複合体であり（「キャップ」は、ｖ＝１の粒子を指し；「ブリッジ」はｖ＝２であり；「ノード」はｉ＞＞２である）、そして集合複合体は、個々の粒子間の連結から生じ、各々は、それ自体の価（示す通り）を特徴とする。より大きな複合体との相互作用を欠く粒子は「バイスタンダー」である（ｖ＝０）。孤立状態で見られる場合（例えばＲＢＰ複合体、ＲＮＡ不含）、複合体は、さらなる連結性のために利用可能な部位（例えばＲＮＡ結合ドメイン）の数を反映する全体の価（ここではｖ＝６）を特徴とする。Ｇ３ＢＰ仲介性ＳＧ（下部）の背景において、ストレスを受けていない細胞では、Ｇ３ＢＰ結合のために曝露されるｍＲＮＡの量は、典型的には低く（リボソーム占有率が高い）；亜ヒ酸ストレス誘導性ポリソーム分解後、ｍＲＮＡが曝露され、そしてＧ３ＢＰノードの高いＲＢＤ価によって、ネットワーク凝縮が仲介される。
【図13】［００４１］図１３は、Ｇ３ＢＰのフォールディングされたドメイン（ＮＴＦ２）を用いて、記載する技術によって予測される内因性タンパク質相互作用パートナーを検証する、ＧＦＰタグ化Ｇ３ＢＰドメイン欠失共免疫沈降からのウェスタンブロットであり、レジェンドは、Ｇ３ＢＰ１、Ｇ３ＢＰ２ＡおよびＧ３ＢＰ２Ｂ（１３０１、１３０２、１３０３）で同様に見られるような、Ｇ３ＢＰ（１３００）の多様なドメインを示す：オリゴマー化ドメイン（ＮＴＦ２（二量体化）：１～１４１（１３１０））；２つのＩＤＲドメイン（ＩＤＲ１（酸性）（１４２～２２４）（１３２０）およびＩＤＲ２（Ｐリッチ）（２２５～３３４）（１３３０））ならびに２つのＲＢＤドメイン（ＲＲＭドメイン（３３４～４０９）（１３４０）およびＲＧＧドメイン（４１０～４６６）（１３５０）（異なるアイソフォームが同じドメイン編成を有するが、異なるアミノ酸指定を有すると認識される））。ＮＴＦ２ドメインの欠失（１３０５）は、Ｇ３ＢＰ ＫＯにおいて、ＵＳＰ１０、ＣＡＰＲＩＮ１、およびＵＢＡＰ２ＬへのＧＦＰ－Ｇ３ＢＰのストレス非依存性高アフィニティ結合を無効にする（ＲＮアーゼ、ビーズのＲＩＰＡ洗浄）。３回の独立の実験に由来する代表的なウェスタンブロット。
【図14】［００４２］図１４Ａは、Ｇ３ＢＰ（１４００）における関心対象の５つのドメインの単純化された描写である：オリゴマー化ドメイン（ＮＴＦ２（二量体化）：１～１４１（１４０１））；２つのＩＤＲドメイン（ＩＤＲ１（酸性）（１４２～２２４）（１４０２）およびＩＤＲ２（Ｐリッチ）（２２５～３３４）（１４０３））ならびに２つのＲＢＤドメイン（ＲＲＭドメイン（３３４～４０９）（１４０４）およびＲＧＧドメイン（４１０～４６６）（１４０５））。［００４３］図１４Ｂは、ｓｓｐＢ－ＡＮＴＦ２（１４５０）の単純化された描写であり、ここで、Ｇ３ＢＰ（１４００）のＮＴＦ２ドメイン（１４０１）は、ｓｓｐＢ（１４５１）で置換されているが、その他は不変のままである。［００４４］図１４Ｃは、二量体化ドメイン（ＮＴＦ２）相互作用タンパク質のスクリーニング用であり、そしてその凝縮を調節する、４つのドメインを含有するタンパク質（１４６０）の単純化された描写である：オリゴマー化ドメイン（ＮＴＦ２（二量体化）：１～１４１（１４０１））；２つのＩＤＲドメイン（ＩＤＲ１（酸性）（１４２～２２４）（１４０２）およびＩＤＲ２（Ｐリッチ）（２２５～３３４）（１４０３））ならびにｓｓｐＢ（１４５１）。
【図15】［００４５］図１５Ａは、コア価、コア濃度、および基質（ＲＮＡ）利用可能性の間の相互作用を明らかにする細胞内状態図であり、ここで、非反応システムに関して、計算された最適相閾値を示し、システムは、図１４Ｂと同じｓｓｐＢ構築物を用い、そして実験はヒトＵ２０Ｓ細胞中で行われる。［００４６］図１５Ｂは、コア価、コア濃度、および基質（ＲＮＡ）利用可能性の間の相互作用を明らかにする細胞内状態図であり、ここで、亜ヒ酸塩で処理した（利用可能なＲＮＡが増加する）システムに関して、計算された最適相閾値を示し、システムは、図１４Ｂと同じｓｓｐＢ構築物を用い、そして実験はヒトＵ２０Ｓ細胞中で行われる。［００４７］図１５Ｃは、コア価、コア濃度、および基質利用可能性の間の相互作用を明らかにする細胞内状態図であり、ここで、亜ヒ酸塩およびシクロヘキシミド（亜ヒ酸誘導性ＲＮＡ増加をブロッキングする）で処理したシステムに関して、計算された最適相閾値を示し、システムは、図１４Ｂと同じｓｓｐＢ構築物を用い、そして実験はヒトＵ２０Ｓ細胞中で行われる。計算された最適相閾値は、非処理細胞のもの（図１５Ａ）とほぼ同一である。［００４８］図１５Ｄは、アクチノマイシンＤ（ＲＮＡ転写をブロッキングすることによって、利用可能なＲＮＡを減少させる）で処理した、図１４Ｂと同じｓｓｐＢ構築物を用いたシステムに関する細胞内状態図であり、アクチノマイシンＤの添加が、ヒトＵ２０Ｓ細胞において行われた実験において、ＳＧの形成を妨害したことを明らかにする。
【図16】［００４９］図１６Ａは、コア価およびコア濃度の間の相互作用を明らかにする細胞内状態図であり、ここで、計算された最適相閾値を示し、システムは、図１４Ｃと同じｓｓｐＢ構築物（すなわち、ＮＴＦ２タンパク質－タンパク質相互作用ドメインを特徴とするが、ＲＢＤを欠く）を用い、そして実験はヒトＵ２０Ｓ細胞中で行われる。［００５０］図１６Ｂは、コア価、コア濃度、およびＲＮＡ結合相互作用のネットワークを保持する、対照ＮＴＦ２相互作用性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＡＰＲＩＮＩ－ｍｉＲＦＰ６７０）の過剰発現の間の相互作用を明らかにする細胞内状態図であり、ここで、計算された最適相閾値を示し、システムは、図１４Ｃと同じｓｓｐＢ構築物を用い、そして実験はヒトＵ２０Ｓ細胞中で行われる。計算された最適相閾値は、蛍光タンパク質を発現しない細胞のもの（図１６Ａ）と類似である。［００５１］図１６Ｃは、コア価、コア濃度、およびＲＮＡ結合タンパク質相互作用のネットワークを遊離させ、そして相分離を阻害する、ＮＴＦ２相互作用タンパク質（ＵＳＰ１０－ｍｉＲＦＰ６７０）の過剰発現の間の相互作用を明らかにする細胞内状態図であり、ここで、計算された最適相閾値を示し、システムは、図１４Ｃと同じｓｓｐＢ構築物を用い、そして実験はヒトＵ２０Ｓ細胞中で行われる。
【図17】［００５２］図１７は、ネットワーク連結性がどのようにＰボディに付着したタンパク質複合体およびＲＮＡ形成ストレス顆粒を生じるかの例示（下部）を含めて、本開示における技術によって明らかにされた組成的に重複するストレス顆粒およびＰボディタンパク質構成要素のいくつかを図示する。
【発明を実施するための形態】
【0024】
［００５５］本開示は、特に薬剤に基づくスクリーニング適用のための、フォールディングされたドメインおよびＲＮＡ顆粒会合タンパク質ドメインの光制御オリゴマー化および相分離のためのシステムおよび方法に関する。
【0025】
［００５６］システムは、多数のタイプの融合タンパク質を伴ってもよく、これらのいずれかまたはすべてが蛍光タンパク質を含有してもよい。これらの融合タンパク質は、特定の光波長で照射された際、ともに働いて、オリゴマー化し、そしてともにネットワーク形成するように設定される。このオリゴマー化およびネットワーク形成（またはそれらの欠如）は、特定の相挙動を生じ、これを多様な条件および環境下（例えば多様な化学的または生物学的剤の添加時）で監視して、どのような条件または環境下で相挙動が修飾されうるかを決定してもよい。
【0026】
［００５７］システムのもっとも単純な型が、図１Ａ～１Ｃを参照するとわかる。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、システムは、時に「オプトタンパク質」と称される１つまたはそれより多い第一の融合タンパク質（１００、１０１）を必要とし、そして典型的には、これらの第一の融合タンパク質を複数必要とする。第一の融合タンパク質各々（１００、１０１）は、第二の領域（１２０）に融合した第一の領域（１１０）を含む。
【0027】
［００５８］第一の領域（１１０）は、少なくとも１つの光感受性タンパク質（１１５）または光感受性タンパク質の同族パートナー（１１６）を含む。これらの光感受性タンパク質（１１５）または同族パートナー（１１６）は、当業者に知られる任意の光感受性タンパク質または同族パートナーであってもよく、天然または操作されたタンパク質、例えばＢＬＵＦドメイン（例えばｂＰＡＣ）、フィトクロム（例えばＰｈｙ－ＰＩＦまたはＢｐｈＰ１－ＰｐｓＲ２）、クリプトクロム（例えばＬＡＲＩＡＴ、ＬＩＴＥ、ＯＰＴＯＳＴＩＭ、クリプトクロム２およびＣＩＢ１）、ＬＯＶドメイン（例えばＢＡＣＣＳ、ＬＡＤ、ＬＩＴＥＺ、ｉＬＩＤ［ＬＯＶ２－ＳｓｒＡ］／ＳｓｐＢ、ｐＤａｗｎ、およびｐＤｕｓｋ）、蛍光タンパク質ドメイン（例えばＤｒｏｎｐａに基づくシステムおよびＰｈｏＣ１）、およびＵＶＲ８ドメイン（例えばＵＶＲ８）が含まれる。１つの好ましい態様において、第一の融合タンパク質（１００）は、単一のＬＯＶ２－ＳｓｒＡタンパク質を用いる。別の態様において、第一の融合タンパク質（１００）は２つのＬＯＶ２－ＳｓｒＡタンパク質を用いる。
【0028】
［００５９］単純化された図でわかるように、同族パートナー（１１６）は、光感受性タンパク質が、少なくとも１つの光波長で照射された際、光感受性タンパク質と連結し、そして該タンパク質に付着するように適応されている。例えば、ｉＬＩＤシステムを用いて、ＬＯＶ２－ＳｓｒＡ（光感受性タンパク質）およびＳｓｐＢ（その同族パートナー）が細胞内で可動性である（すなわち、互いに相互作用可能な位置にある）場合、ＬＯＶ２－ＳｓｒＡは、最終的に、およそ４５０ｎｍの波長を有する光で照射された場合にのみ、ＳｓｐＢに付着するが、次いで、こうした光に照射されていない場合には離れるであろう。
【0029】
［００６０］第一の領域（１１０）は、随意に、自己集合するように設定されている領域であってもよい。例えば、いくつかの態様において、領域は、ホモ型およびヘテロ型相互作用を含めて、二量体、三量体、五量体、ｎ量体相互作用を通じて、自己集合を助長することが知られる１つまたはそれより多いタンパク質を含む。いくつかの態様において、領域はフェリチンを含み、フェリチンは、各々、２４の同一のサブユニットを含む、空洞のカゴのような構造に自己集合することが知られるタンパク質ファミリーである。
【0030】
［００６１］第二の領域（１２０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（１２５）を含む。フォールディングされたＲＢＤには、限定されるわけではないが、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）、Ｋ相同（ＫＨ）ドメイン、プミリオ（ＰＵＭ）ドメイン、ジンクフィンガードメイン、ＤＥＡＤボックスヘリカーゼドメイン、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）、ｍ６Ａ ＲＮＡ結合ドメイン（ＹＴＨドメイン）、またはコールドショックドメイン（ＣＳＤ）が含まれてもよい。変性ＲＢＤには、限定されるわけではないが、アルギニン－グリシン（ＲＧ）ドメイン、アルギニン－グリシン－グリシン（ＲＧＧ）ドメイン、セリン－アルギニン（ＳＲ）ドメイン、または塩基性－酸性ジペプチド（ＢＡＤ）ドメイン（例えばＲＤ、ＲＥ）が含まれてもよい。フォールディングされた非ＲＢＤは、限定されるわけではないが、二量体化またはオリゴマー化ドメイン（例えばＧ３ＢＰ ＮＴＦ２、ＮＰＭ１オリゴマー化ドメイン、ＨＳＦ１三量体化ドメイン、ＤＣＰＩＡ三量体化ドメイン等）であってもよく、これらはしばしば、生理学的生物学的凝縮物（例えばストレス顆粒、核小体、核ストレス体、Ｐボディ等）の形成に必須である。オリゴマー化または基質結合（例えばＲＮＡ結合）ドメインの既有知識なしに、全長タンパク質を用いてもよい。
【0031】
［００６２］第一の融合タンパク質（１００、１０１）が蛍光タンパク質を含有する場合、これは第一の領域（１１０）または第二の領域（１２０）のいずれに存在してもよいが、好ましくは、第一の領域中に存在する。
【0032】
［００６３］図１Ｃを参照すると、システムのこの基本型（１５０）が、多数の第一の融合タンパク質（１００、１０１）の第一の領域（１１０）の間の相互作用のため、（関与する特定の光感受性タンパク質に基づいて）あらかじめ決定された光波長での照射に際して、自己集合可能であることがわかる。図からわかるように、図１Ｃにおけるシステムは、第一の融合タンパク質の異種クラスターを有し、ここでは、第一の融合タンパク質の第一のタイプ（１００）とともに別のタイプ（１０１）の両方を含めて示される。他の態様において、システムは均一なクラスターを形成してもよい。
【0033】
［００６４］第一の融合タンパク質（１００、１０１）が、適切な光波長で照射された際に自己集合しない場合、より複雑なシステムが必要である。
［００６５］図２および３を参照すると、第一のオプションは、時に「コアタンパク質」と称される、第二の融合タンパク質（２００）を導入することである。第二の融合タンパク質（２００）にもまた、第二の領域（２２０）と融合した第一の領域（２１０）が含まれる。第一の領域（２１０）には、光感受性タンパク質（２１５）が含まれる。第二の領域（２２０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（２２５）を含み、第二の融合タンパク質の第二の領域は、ホモ型およびヘテロ型相互作用を含めて、二量体、三量体、五量体、またはｎ量体相互作用を通じて、自己集合するように適応されている。いくつかの態様において、領域はフェリチンを含み、フェリチンは、各々、２４の同一のサブユニットを含む、空洞のカゴのような構造に自己集合することが知られるタンパク質ファミリーである。
［００６５］図２および３を参照すると、第一のオプションは、時に「コアタンパク質」と称される、第二の融合タンパク質（２００）を導入することである。第二の融合タンパク質（２００）にもまた、第二の領域（２２０）と融合した第一の領域（２１０）が含まれる。第一の領域（２１０）には、光感受性タンパク質（２１５）が含まれる。第二の領域（２２０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（２２５）を含み、第二の融合タンパク質の第二の領域は、ホモ型およびヘテロ型相互作用を含めて、二量体、三量体、五量体、またはｎ量体相互作用を通じて、自己集合するように適応されている。いくつかの態様において、領域はフェリチンを含み、フェリチンは、各々、２４の同一のサブユニットを含む、空洞のカゴのような構造に自己集合することが知られるタンパク質ファミリーである。
【0034】
［００６６］図３は、第一（１０１）および第二（２００）の融合タンパク質を含むシステム（２５０）を例示する。複数の第二の融合タンパク質／コアタンパク質（２００）が、融合タンパク質が相互作用することを可能にするシステム中にある場合、第二の融合タンパク質／コアタンパク質（２００）の光感受性タンパク質（２１５）は、第一の融合タンパク質／オプトタンパク質（１０１）上に存在する光感受性タンパク質の同族パートナー（１１６）に付着可能である。
【0035】
［００６７］図４～５を参照すると、第二のオプションは、第三の融合タンパク質（３００）を導入することによって、第一のオプション上に構築されるものである。第三の融合タンパク質は、時に「固定リンカー」と称される。該リンカーは、図３におけるものと同様のシステムの型を連結して、有意により多い相互作用およびより大きなネットワークを可能にしうる。第三の融合タンパク質（３００）は、ともに融合した少なくとも２つの領域、第一および第二の領域（３１０、３２０）を含む。第三の融合タンパク質に関しては、各領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（３１５、３２５）を含み、そして第三の融合タンパク質の第一および第二の領域の各々（３１０、３２０）は、第一の融合タンパク質の第二の領域と相互作用するように適応されている。
【0036】
［００６８］図５を参照すると、提示するシステムの１つの好ましい態様は、相分離が起こるために相互作用するように適応されている内因性タンパク質の添加を必要とする、二量体化またはより高次のオリゴマー化ドメインである。例えば、Ｇ３ＢＰ ＮＴＦ２（二量体化ドメイン）の例において、こうした内因性タンパク質ＵＢＡＰ２Ｌであり、これは、Ｇ３ＢＰ二量体の間のさらなるネットワーク形成および凝縮を可能にする。ノックアウト、またはＮＴＦ２ドメインの同じ結合ポケットでの相互作用に関して競合するタンパク質ＵＳＰ１０の過剰発現を通じて、細胞から該タンパク質を除去すると、相分離が妨げられる。図１６Ａ～１６Ｃを比較することによって、これがわかる。図１６Ｃは、ＵＳＰ１０がＧ３ＢＰ ＮＴＦ２の凝縮物の形成を防止可能であることを例示する。類似の競合タンパク質－タンパク質相互作用が、他の生物学的凝縮物、例えばＤＤＸ６依存性Ｐボディの形成において役割を果たす可能性がある。これらのタイプの相互作用を破壊する小分子は、類似の影響を有し、すなわち相分離を防止するかまたはある場合には増進するであろう。
【0037】
［００６９］図５を参照すると、このシステム（３５０）は、図３に示すものと類似であるが、第三の融合タンパク質（３００）が添加されていることがわかり、第一の融合タンパク質（１０１）の第二の領域（１２５）が第三の融合タンパク質（３００）の第一の領域（３１５）と相互作用することが示される。理解を容易にするために、これらの相互作用領域は、ともに適合可能であるように模式的に示され、そしてまた、「＋」または「－」記号とともに示される。理解されるように、第三の融合タンパク質は、少なくとも２つの第一の融合タンパク質を連結し、システムが多様な自己集合コアを連結することを可能にし、そしてしたがって、大規模な相分離／凝縮を促進すると予期される。拡張された連結は、５つの融合タンパク質を必要とし、第二の融合タンパク質（２００）が第一の融合タンパク質（１０１）につながり、これが固定リンカー（３００）につながり、次いでリンカーが別の第一の融合タンパク質（１０１）につながり、これが次に、別の第二の融合タンパク質（２００）につながる。これらのシステムにおいて、多様な融合タンパク質間の連結および相互作用は同時に起こらない可能性があるが、付着の順序は比較的重要ではない。
【0038】
［００７０］図６～８を参照すると、第三のオプションは、第三および第四の融合タンパク質（４００、５００）を含めることにより、「タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）リンカー」と称されうるものを導入することによって、第一のオプション上に構築されるものである。これは、第一の融合タンパク質の変型に、「固定リンカー」の概念を取り込むことによって、第二のオプション中に見られる拡張連結を、５つの融合タンパク質から４つに短縮するが、システム（４５０）は、ここで、１つのみではなく、２つの異なる融合タンパク質を導入することを必要とする。
【0039】
［００７１］図６および８を参照すると、第三の融合タンパク質（４００）は、第一の融合タンパク質（１０１）のサブセットと見なされてもよく、そしてしたがって、時に「別のオプトタンパク質」と称される。第三の融合タンパク質（４００）は、第二の領域（４２０）に融合した第一の領域（４１０）を含み、第三の融合タンパク質（４００）の第一の領域（４１０）は、第二の光感受性タンパク質の第二の同族パートナー（４１５）を含む。第二の光感受性タンパク質は、第一の融合タンパク質／オプトタンパク質と同じ光感受性タンパク質（１１５）であってもよく、またはそうでなくてもよい。すなわち、第三の融合タンパク質（４００）は、第一の融合タンパク質（１０１）が結合するものと同じ光感受性タンパク質に結合するよう意図されてもよく、またはそのようにされていなくてもよい。
【0040】
［００７２］第三の融合タンパク質（４００）の第二の領域（４２０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（４２５）を含む。第三の融合タンパク質（４００）の第二の領域（４２０）は、第一の融合タンパク質（１００）の第二の領域（１２０）と相互作用するように適応されている。図８で見られるように、第三の融合タンパク質（４００）の１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（４２５）は、第一の融合タンパク質の１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（１２５）と相互作用する。
【0041】
［００７３］図７および８を参照すると、第四の融合タンパク質（５００）は、第二の融合タンパク質（２００）のサブセットと見なされてもよく、そしてしたがって、時に「別のコアタンパク質」と称される。第四の融合タンパク質（５００）は、第二の領域（５２０）に融合した第一の領域（５１０）を含む。第四の融合タンパク質（５００）の第一の領域（５１０）は、第二の光感受性タンパク質（５１５）を含み、この光感受性タンパク質に、第三の融合タンパク質（４００）中に存在する同族パートナー（４１５）または「別のオプトタンパク質」が結合するであろう（例えば図８を参照されたい）。第四の融合タンパク質（５００）の第二の領域（５２０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（５２５）を含み、そして第二の融合タンパク質（２００）と同様、自己集合するように適応されている。図８に見られるように、第二（２００）および第四（５００）の融合タンパク質は、自己集合しうる。自己集合は、異種として示される（第二および第四の融合タンパク質の両方が相互作用し、そしてともに集合する）が、均一な自己集合もまたあってもよい。
【0042】
［００７４］図９および１０を参照すると、別の代替オプションが見られる。このオプションは、第一のタンパク質の２つの型を用いて、「オプトリンカー」と称されうるものを形成し、このリンカーは次いで、タンパク質－タンパク質相互作用を通じて修飾コアタンパク質（「ＰＰＩコア」）に結合可能である。したがって、タンパク質システム（６５０）は、少なくとも２つの第一の融合タンパク質（１００、１０１）からなる。「オプトリンカー」中の第一の融合タンパク質（１００）の一方は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（１２５）に融合した、光感受性タンパク質（１１５）を含む。「オプトリンカー」中のもう一方の第一の融合タンパク質（１０１）は、同じ１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（１２５）に融合した、光感受性タンパク質の同族パートナー（１１６）を含む。正しい光波長で照射されると、これらの２つの融合タンパク質は結合し、２つの修飾コアタンパク質（６００）を連結可能である連結を形成する。システムは、一般的に、２つまたはそれより多い修飾コアタンパク質（６００）を有するであろう。
【0043】
［００７５］修飾コアタンパク質（６００）は、第二の領域（６２０）に融合した第一の領域（６１０）を含む第二の融合タンパク質である。第二の融合タンパク質（６００）の第一の領域（６１０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（６１５）を含む。この第一の領域（６１０）は、第一の融合タンパク質の第二の領域（１２５）と相互作用するように適応されている。第二の融合タンパク質（６００）の第二の領域（６２０）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（６２５）を含む。この第二の領域（６２０）は自己集合するように適応されている。
【0044】
［００７６］さらに別の代替は、図１１を参照するとわかる。ここで、システム（７５０）は、第一の融合タンパク質の２つの変型を含有することがわかる。１つの変型（１００）は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（１２５）を含む第二の領域に融合した第一の領域（１１０）を含み、第一の領域は第一の光感受性タンパク質を含む。第二の変型（７００）、または「オプトタンパク質変型」は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（７２５）を含む第二の領域（７２０、未表示）に融合した第一の領域（７１０）を含む。１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（７２５）を含む第二の領域は、１つまたはそれより多いフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、フォールディングされた非ＲＢＤドメイン、またはその組み合わせ（１２５）を含む第一の融合タンパク質（１００）の第二の領域（１２０）と相互作用するように適応されている。第二の変型（７００）の第一の領域（７１０）は、同じ第一の光感受性タンパク質を含み、そして両方の変型（１００、７００）の第一の領域は、光に反応して少なくとも２つの構成要素の１つのオリゴマーに自己集合するように適応されている。したがって、２つの変型間のタンパク質－タンパク質相互作用を通じて連結された多数の自己集合コアがどのように存在するかを想定することが可能である。
【0045】
［００７７］本開示の第二の側面は、上述のタンパク質システムの１つを発現する細胞株または幹細胞由来細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞、酵母細胞、培養ニューロン、または虫、ハエ、齧歯類、または霊長類モデルである。いくつかの態様において、タンパク質システムを発現するよう設定される１つまたはそれより多い遺伝子は、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、一過性トランスフェクション（例えばリポソームまたはＤＮＡプラスミド導入のための専有配合物）、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくアプローチを利用して、細胞に送達される。
【0046】
［００７８］本開示の第三の側面は、上述のタンパク質システムの１つを発現するよう設定された１つまたはそれより多くの遺伝子で細胞をトランスフェクションするように設定された少なくとも１つの発現ベクターを含む、発現ベクター系に関する。いくつかの態様において、発現ベクター系は、第一の融合タンパク質を発現可能な遺伝子を含む第一のプラスミドを含む。
【0047】
［００７９］本開示の第四の側面は、天然または操作された多構成要素凝縮物の相挙動を測定するための方法に関する。
［００８０］方法はまず、上述のタンパク質システムの１つを提供する必要がある。システムは、生存細胞内、あるいは死亡細胞内または死亡細胞外に存在してもよい。いくつかの態様において、システムは、マルチウェルアレイ（プレート）中のウェル中に存在する。
［００８０］方法はまず、上述のタンパク質システムの１つを提供する必要がある。システムは、生存細胞内、あるいは死亡細胞内または死亡細胞外に存在してもよい。いくつかの態様において、システムは、マルチウェルアレイ（プレート）中のウェル中に存在する。
【0048】
［００８１］次いで、方法は、光感受性タンパク質を少なくとも１つの光波長に曝露することによって、タンパク質システムにおいて、融合タンパク質のフォールディングされたＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）、変性ＲＢＤ、またはフォールディングされた非ＲＢＤドメインをオリゴマー化することを必要とする。例えば、ＬＯＶ２－ＳｓｒＡをＦＴＨ１に融合させると、ＬＯＶ２－ＳｓｒＡ分子によってコーティングされた２４量体フェリチン「コア」は、自発的に自己集合する。細胞内でＳｓｐＢ（その同族パートナー）とともに存在し、そして可動性である（すなわち互いに相互作用可能な位置にある）場合、ＬＯＶ２－ＳｓｒＡは、最終的に、およそ４５０ｎｍの波長を有する光で照射された場合にのみ、ＳｓｐＢに付着するが、次いで、こうした光に照射されていない場合には離れるであろう。２つの構成要素の相対濃度を変化させることによって（細胞における蛍光タンパク質濃度を決定するために用いられる較正方法論に関しては、図１８を参照されたい）、オリゴマー化状態（価）を変化させてもよく（０～２４）、そして細胞内状態図を定量化してもよく、これは化合物または遺伝学に基づくスクリーニング適用に受け入れられる。相分離／凝縮は、一般的に、相互作用する生体分子の連結されたネットワークの形成を必要とする。開示されるシステムおよび方法は、光活性化に際して相分離を活性化するが、潜在的なタンパク質－タンパク質またはタンパク質－ＲＮＡ相互作用が生じている場合のみに活性化する構築物を、当業者が操作することを可能にする。これは次に、相互作用の連結されたネットワークの喪失により、相分離／凝縮が起こらない条件を発見することによって、前記相互作用を破壊する条件に関してスクリーニングすることを可能にする。これは、図１４Ｃおよび図１６Ａ～１６Ｃを参照するとわかる。
【0049】
［００８２］システムはここで、「ＮＴＦ２コアレット（Ｃｏｒｅｌｅｔ）」と称されるものを使用する。コアは、ｉＬＩＤ分子によってコーティングされた２４量体フェリチン複合体で構成され（すなわちこれらは上述の第二の融合タンパク質または「コアタンパク質」と類似であり）、これは、青色光刺激されたｓｓｐＢ－ｉＬＩＤ相互作用によって仲介されるオリゴマー化プラットフォームとして働き、ここで、ｓｓｐＢ－ｉＬＩＤが、Ｇ３ＢＰのＩＤＲ領域およびフォールディングされたＮＴＦ２に融合する（すなわち、一般的に、上述の第一の融合タンパク質または「オプトタンパク質」にマッピングする）。２つの種の相対濃度を変化させることによって、オリゴマー化状態を、０～２４の間で変化させてもよい。
【0050】
［００８３］図１６Ａ～１６Ｃにおけるシステムは、ＮＴＦ２コアレット発現Ｕ２０Ｓ細胞を利用する。対照は図１６Ａに見られ、ここで、ＮＴＦ２コアレットは、関心対象以外の他のタンパク質とも同時発現されていない。ＮＴＦ２コアレットが、タンパク質およびＲＮＡ相互作用のネットワークを保持するＮＴＦ２相互作用タンパク質であるＣＡＰＲＩＮＩ－ｍｉＲＦＰ６７０（図１６Ｂを参照されたい）と同時発現される場合、相境界は類似である。しかし、ＮＴＦ２コアレットが、さらなるタンパク質－タンパク質相互作用およびＲＮＡ結合能を欠き、そしてしたがって相互作用のネットワークを遊離させるＵＳＰ１０－ｍｉＲＦＰ６７０（図１６Ｃを参照されたい）と同時発現される場合、凝縮物は形成されない。すなわち、ＣＡＰＲＩＮ１とは異なり、ＵＳＰ１０は、ＮＴＦ２コアレットの相分離を遮断する。
【0051】
［００８４］いくつかの態様において、オリゴマー化は、細胞質リボ核タンパク質（ＲＮＰ）顆粒のゲル化を促進する。
［００８５］方法は次いで、相挙動の測定を必要とする。これは、状態図をマッピングし（相境界のマッピングからなってもよい）、相分離、凝縮、または凝集が起きているかどうかを決定し、凝縮物材料特性、タンパク質濃度、価、またはそのいくつかの組み合わせを測定することによって、行われてもよい。
［００８５］方法は次いで、相挙動の測定を必要とする。これは、状態図をマッピングし（相境界のマッピングからなってもよい）、相分離、凝縮、または凝集が起きているかどうかを決定し、凝縮物材料特性、タンパク質濃度、価、またはそのいくつかの組み合わせを測定することによって、行われてもよい。
【0052】
［００８６］いくつかの態様において、方法はまた、１つまたはそれより多い化学的または生物学的剤をウェルに提供する工程を伴ってもよい。いくつかの態様において、方法はまた、遺伝子ノックダウン（例えばＣＲＩＳＰＲ ＫＯ、ＣＲＩＳＰＲｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）または遺伝子上方制御（例えばＣＲＩＳＰＲａまたはＤＮＡプラスミドに基づく過剰発現）に基づく遺伝子スクリーニングの利用も伴ってもよい。
【0053】
［００８７］好ましい態様において、方法にはさらに、遺伝子ノックダウンに基づく遺伝子スクリーニング、上方制御に基づく遺伝子スクリーニング、ウェルへの１つまたはそれより多い化学剤の添加、あるいはその組み合わせが有する影響を、測定された相挙動に基づいて決定する工程も含まれる。すなわち、既知のスクリーニング技術を用いて、相挙動における変化に基づき、影響を決定する。例えば、ＵＳＰ１０発現は、必須のタンパク質－タンパク質相互作用ネットワークを遊離させることによって、光に誘導されたＧ３ＢＰ ＮＴＦ２オリゴマーの凝縮を防止し；この結合ポケットをターゲティングする化合物は同様に作用するであろう。類似の凝縮物会合タンパク質（例えばＮＰＭ１、ＤＣＰＩＡ、ＨＳＦ１等）のホモ型およびヘテロ型オリゴマー化を破壊する化合物に基づく類似のアプローチが可能である。あるいは、凝縮に必須のＲＢＤ－ＲＮＡ相互作用を防止する化合物を同定することも可能である（図１５Ｄを参照されたい）。
【0054】
［００８８］方法の態様は、図１９を参照するとわかる。ここでは、方法（１９００）は、適切な細胞（１９１０）を提供することによって始まる。これらの細胞を次いで、プラスミド、レンチウイルス等を通じて、望ましいシステムに適した融合タンパク質でトランスフェクションし（１９２０）、安定細胞株（１９３０）を導く。
【0055】
［００８９］安定細胞株由来の細胞を、マルチウェルプレート（例えば９６または３８４ウェルプレート）（１９４０）に導入してもよい。
［００９０］この時点で、次いで、１つまたはそれより多いスクリーニング構成要素を、１つまたはそれより多いウェルに導入してもよい（１９５０）。スクリーニング構成要素は、化学的スクリーニング構成要素（例えば小分子ライブラリー由来の化合物）、遺伝子スクリーニング構成要素（例えばノックダウン、ノックアウト、過剰発現等）、またはそのいくつかの組み合わせであってもよい。典型的には、この時点で、スクリーニング構成要素がウェル（単数または複数）中の細胞と相互作用することを可能にする間、ある程度の遅延がある。
［００９０］この時点で、次いで、１つまたはそれより多いスクリーニング構成要素を、１つまたはそれより多いウェルに導入してもよい（１９５０）。スクリーニング構成要素は、化学的スクリーニング構成要素（例えば小分子ライブラリー由来の化合物）、遺伝子スクリーニング構成要素（例えばノックダウン、ノックアウト、過剰発現等）、またはそのいくつかの組み合わせであってもよい。典型的には、この時点で、スクリーニング構成要素がウェル（単数または複数）中の細胞と相互作用することを可能にする間、ある程度の遅延がある。
【0056】
［００９１］次いで、システムにおいて利用される特定の光感受性タンパク質に基づいて、適切な光波長でこれらを照射することによって、１つまたはそれより多いウェルを活性化する。この活性化は任意の時間続いてもよいが、好ましくは３０分またはそれ未満、より好ましくは２０分またはそれ未満、そしてさらにより好ましくは１０分またはそれ未満、起こる。照射は、レーザー、発光ダイオード（ＬＥＤ）アレイ、ＬＥＤランプ、または適切な光波長を生じるための任意のこうした方法論を用いて送達されてもよい。
【0057】
［００９２］ユーザーが、任意の適切な固定技術（例えばパラホルムアルデヒド、メタノール、エタノール等）を用いて細胞を固定しようと望む場合、活性化後に細胞を固定してもよい（１９７０）。
【0058】
［００９３］生存または死亡細胞を用いて、次いで、ユーザーは既知の顕微鏡技術（例えば共焦点、広視野、超解像等）を通じて、細胞の画像を捕捉してもよい（１９８０）。いくつかの態様において、例えば蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を迅速顕微鏡画像化と組み合わせた、当業者に知られる商業的に入手可能な装置を用いて、生存細胞をソーティングしながら、これらの画像を捕捉してもよい。
【0059】
［００９４］画像が捕捉されたら、画像を分析してもよい（１９９０）。これは、例えば、凝縮の度合いを決定するか、濃度を決定する（例えば測定された強度を検量線に比較することによって。図１８を参照されたい）か、または相境界を決定する工程を伴ってもよい。
【0060】
［００９５］理論およびパッチ状コロイド（ｐａｔｃｈｙ ｃｏｌｌｏｉｄ）（Ｂｉａｎｃｈｉら、２０１１）での実験から、相互作用する粒子が動的に連結されたネットワークに相分離するシステムに関して、各粒子は、その価、ｖを定義する、他の粒子と結合可能である十分な数の部位を持たなければならないことが知られており（図１Ｍ）：ここで、「粒子」（またはグラフ理論における「頂点（ｖｅｒｔｅｘ）」）は、個々のタンパク質またはＲＮＡ分子、あるいは安定な生体分子複合体に相当してもよい。一般的に言って、相分離のためにはｖ＞２が必要であり、価がより高ければ、相分離はより迅速に促進される。合成的に融合したＧ３ＢＰ二量体複合体の場合、２つの曝露されたＲＢＤによって与えられる２つのありうる相互作用界面しかなく、そしてしたがって、合成Ｇ３ＢＰ二量体は、２の全体価（すなわち２つのＲＢＤ－ＲＮＡ界面）を有する；本発明者らは、ｖ＝２粒子を「ブリッジ」と称し、該粒子は、ネットワークの異なる部分を連結可能であるが、それ自体で、空間に広がる相互作用ネットワークを形成することは不可能である（図１２を参照されたい）。
【0061】
［００９６］Ｇ３ＢＰのＮＴＦ２ドメインが、一般的な二量体化ドメインによって置換不能であることを考慮すると、ブリッジ（ｖ＝２）に相当するよりも、Ｇ３ＢＰ二量体は何らかの形でｖ≧３の粒子を体現しているはずであると推論されうる。ｖ≧３の物体は、「ノード」と称される（図１２を参照されたい）。天然Ｇ３ＢＰ二量体の場合、こうした価は、２つのＲＢＤに加えて、ＮＴＦ２ドメインとの少なくとも１つのヘテロ型タンパク質－タンパク質相互作用（ＰＰＩ）によって達成されるであろう。そうであれば、ＮＴＦ２は、さらなるノードに連結されて、ＳＧ凝縮に必要な価を増幅する、相互作用プラットフォームとして働きうる。
【0062】
［００９７］Ｇ３ＢＰに基づく複合体の全体価を増加させうるＳＧタンパク質に関してスクリーニングするため、コアを通じてシステムを増進させることによって、ＮＴＦ２の二量体化能を利用してもよい。ＮＴＦ２二量体は、コア間に安定なホモ型ブリッジ（架橋）を生成し、そしてヘテロ型ＮＴＦ２相互作用ブリッジ／ノードは、価を増やすことによって、分配し、そして成長を授与して、顕微鏡によるこうしたタンパク質の同定を可能にすると仮定された。
【0063】
［００９８］一団のＧＦＰタグ化ＳＧマーカータンパク質（Ｎ＝２０）およびＰボディタンパク質（Ｎ＝３）のうち、８つのＳＧタンパク質（ＵＳＰ１０、ＵＢＡＰ２Ｌ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＦＭＲ１、ＦＸＲ１、ＮＵＦＩＰ２、Ｇ３ＢＰ１、Ｇ３ＢＰ２Ａ）のみが、光誘導されたＧ３ＢＰ ＡＲＢＤコアレットに強く局在した。別のタンパク質、ＦＵＳ由来の自己会合ＩＤＲより形成される凝縮物がＦＵＳ ＡＮＬＳしか補充しないため、これらのタンパク質は、ＮＴＦ２相互作用に特異的である。
【0064】
［００９９］コアレットＮＴＦ２相互作用アッセイの結果と一致して、ＵＳＰ１０、ＣＡＰＲＩＮ１、およびＵＢＡＰ２ＬのＧ３ＢＰ仲介性共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）はすべて、ＮＴＦ２ドメインを必要とし、そして相互作用は、ＲＮアーゼ処理およびストリンジェントな洗浄工程の後でも保持される（図１３）。
【0065】
［０１００］これらの同定されたタンパク質は、Ｇ３ＢＰ相互作用ブリッジまたはノードとして働き、ＵＳＰ１０以外のすべてがＲＢＤを特徴とすることを考慮すると、ＳＧ凝縮のための全体価の要件に寄与することも可能である。ＵＳＰ１０、ＣＡＰＲＩＮ１、ＮＵＦＩＰ２、ＦＸＲ１／ＦＸＲ２／ＦＭＲ１（３ＫＯ）、またはＦＸＲ１／ＦＸＲ２／ＦＭＲ１／ＮＵＦＩＰ２（４ＫＯ）のノックアウトは、ＳＧ形成に影響がなく、これらの構成要素が全体価の増幅に限定された役割しか持たないことが示唆された。さらに、三重ＫＯ（Ｇ３ＢＰ１／Ｇ３ＢＰ２／ＵＳＰ１０、Ｇ３ＢＰ１／Ｇ３ＢＰ２／ＣＡＰＲＩＮ１）が、Ｇ３ＢＰ１／２二重ＫＯと比較して、レスキューのために実質的に異なる量のＧ３ＢＰを必要としないため、亜ヒ酸誘発相閾値は、ＵＳＰ１０またはＣＡＰＲＩＮ１の内因性レベルによって有意には調節されなかった。対照的に、ＵＢＡＰ２／２Ｌ二重ＫＯ細胞は、減少したサイズのＳＧを示し、これは、少数の細胞のみにおいて形成され；これらのデータは、ＵＢＡＰ２Ｌがさらなる非常に重要なノードとして作用しうる可能性を示唆する。これに関する裏付けは、Ｇ３ＢＰ中のミスセンス突然変異（Ｓ３８Ｆ）の偶然の発見から来ており、該突然変異は、ＷＴ Ｇ３ＢＰレスキュー閾値よりも＞１０倍高いレベルで発現された場合であっても、Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞におけるストレス顆粒形成をレスキューする能力を抑制することが見出された。Ｇ３ＢＰ Ｓ３８Ｆは、ホモ二量体化およびＵＳＰ１０結合能を保持し、そしてＷＴ Ｇ３ＢＰによって形成されるストレス顆粒内に強く分配される。しかし、ＣＡＰＲＩＮ１およびＵＢＡＰ２Ｌと高アフィニティ複合体を形成することは不可能であり、突然変異がＧ３ＢＰをｖ＞３ノードからｖ＝２ブリッジに変化させ、もはやＵＢＡＰ２Ｌからさらなる全体価をもたらすことが不可能であることが示唆される。逆に、以前記載された、ＵＳＰ１０またはＣＡＰＩＮ１に結合不能であるが、ＳＧ形成をレスキューするＧ３ＢＰ Ｆ３３Ｗ変異体は、ＵＢＡＰ２Ｌとの会合を通じてノード同一性を保持し、そしてレスキューに関して、ＷＴと類似の閾値濃度を示す。上記知見を総合すると、これらのデータは、Ｇ３ＢＰ二量体が、ＳＧ凝縮におけるその本質的な役割を満たすために、ＵＢＡＰ２Ｌに結合するノードとして働くはずであるという強い証拠を提供する。
【0066】
［０１０１］高い価のＧ３ＢＰ ＲＢＤノードは、付着したＰボディとともにストレス顆粒を形成するために十分である
［０１０２］該データは、十分に高い価であるＲＢＤ複合体が、ストレス顆粒形成に必要であるようであるが、このモデルの厳しい試験および凝縮に関する最小価の決定は、合成細胞内再構成アプローチを必要とした。ストレス顆粒形成に関する、ＲＢＤ価および閾値タンパク質複合体濃度の間の関係を定量的に調べるため、以前記載されたコアレットシステム（コアは、ｉＬＩＤ分子でコーティングされた２４量体フェリチン複合体で構成され、これは青色光刺激されたｓｓｐＢ－ｉＬＩＤ相互作用によって仲介されるオリゴマー化プラットフォームとして働き、ｓｓｐＢ－ｉＬＩＤがＧ３ＢＰのＩＤＲ領域およびＲＢＤに融合する）を利用して、価および濃度依存性状態図を定量的にマッピングしてもよい。
［０１０２］該データは、十分に高い価であるＲＢＤ複合体が、ストレス顆粒形成に必要であるようであるが、このモデルの厳しい試験および凝縮に関する最小価の決定は、合成細胞内再構成アプローチを必要とした。ストレス顆粒形成に関する、ＲＢＤ価および閾値タンパク質複合体濃度の間の関係を定量的に調べるため、以前記載されたコアレットシステム（コアは、ｉＬＩＤ分子でコーティングされた２４量体フェリチン複合体で構成され、これは青色光刺激されたｓｓｐＢ－ｉＬＩＤ相互作用によって仲介されるオリゴマー化プラットフォームとして働き、ｓｓｐＢ－ｉＬＩＤがＧ３ＢＰのＩＤＲ領域およびＲＢＤに融合する）を利用して、価および濃度依存性状態図を定量的にマッピングしてもよい。
【0067】
［０１０３］図１４Ａは、Ｇ３ＢＰにおける関心対象の５つのドメインを示す（１４００）：Ｇ３ＢＰの価増幅二量体化ドメイン（ＮＴＦ２）を合成価増幅ｓｓｐＢノードで置換すると（図１４Ａ、１４Ｂ）、非ストレス細胞は、凝縮を促進するために、非常に高い度合いのオリゴマー化を必要とする（０．１５μＭコアで、～２４の価）（図１５Ａを参照されたい）。しかし、亜ヒ酸処理に際して、凝縮ははるかにより低い濃度および価（０．１５ｐＭコアで、～８の価）で起こり（図１５Ｂを参照されたい）、そして生じた顆粒は非ストレス細胞に比較して、有意により大きい。この価依存性相分離は迅速に（数秒以内に）起こり、そして活性化時間（５対６０分）に関わりなく、完全に可逆性であり、多価ＲＮＡ結合接触が、ストレス顆粒の形成および維持の両方に必須であることを示す。さらに、これらの凝縮物は、曝露されたＲＮＡの流入に対する依存性、カノニカルＳＧタンパク質およびポリアデニル化ｍＲＮＡの補充、Ｐボディの付着、および内部構成要素の動的再編成での液体様融合を含めて、内因性ＳＧの特性を模倣することが見出されている。これらの構造は、オプトＳＧ（オプトジェネティックなストレス顆粒）と称される。
【0068】
［０１０４］亜ヒ酸処理後のＡＮＴＦ２コアレット・オプトＳＧ相閾値におけるシフトは、青色光活性化および脱活性化の連続５分間サイクルに曝露された細胞において、劇的に視覚化された。亜ヒ酸処理は、時間および価に依存する方式で、オプトＳＧのｄｅ ｎｏｖｏ集合を誘発し、集合したオプトＳＧは、ＷＴ細胞におけるＳＧ集合と一致して、時間規模構成要素で、進行性により大きくなる。オプトＳＧ状態図における亜ヒ酸促進シフトは、ポリソーム分解を遮断し、その後、翻訳を抑止するシクロヘキシミドでの前処理によって無効にされる（図１５Ｃを参照されたい）。さらに、アクチノマイシンＤによって誘導されるＲＮＡ産生の長期阻害は、オプトＳＧの形成を防止する（図１５Ｄを参照されたい）。ＲＮＡに結合する能力を欠く対照自己会合ＩＤＲ（ＦＵＳ ＩＤＲ）の場合に相閾値の類似のシフトが存在しないため、オプトＳＧ集合におけるこれらの薬剤依存性変化は、コアレットシステムのアーチファクトではない。
【0069】
［０１０５］これらのデータは、光誘発されたオプトＳＧの形成が、ポリソーム分解によって非常に増進されることを示し、ポリソーム分解は、非常に高い価を持つ核酸に基づくノード（すなわちＲＮＡ結合タンパク質用の結合部位またはブリッジ）として働くであろうＲＮＡを、周囲の細胞質にあふれ出させると予期される。どのＧ３ＢＰドメインがオプトＳＧ凝縮に必須であるかを調べるため、Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２の反復一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）をｓｓｐＢに融合させ、そしてコアレットシステムにおいて、光に対するその反応を調べた。ＳＧに分配されないことと一致して、Ｇ３ＢＰ ＩＤＲ１、ＩＤＲ２、およびＩＤＲ１／２コアレットが、薬剤処理に関わりなく、相分離を引き起こさないため、Ｇ３ＢＰの変性リンカーは有意な自己相互作用に関与しないようである。対照的に、すべての試験したＳＧマーカーを含有するポリＡ＋オプトＳＧは、ＩＤＲ２－ＲＢＤ（ＲＲＭおよびＲＧＧ）または単にＲＢＤを含有するコアレットによって集合される。さらに、コアレットシステムは、ＧＦＰタグ化一部切除変異体の発現と関連する非常に重要な特徴を反復する。
【0070】
［０１０６］第一に、ＡＮＴＦ２／ＡＩＤＲ２（すなわち局所静電反発力によって、ＲＮＡ結合能を有効に欠く、ＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１ ＡＩＤＲ２の類似体）は、試験したすべての条件下で、顆粒を形成するのに失敗する。第二に、ＡＮＴＦ２／ＡＩＤＲ１は、ＧＦＰ－ＡＩＤＲ１と類似の、より不規則な顆粒を形成する。第三に、ＲＢＤのみのコアレットに関する相閾値は、レスキューに必要なＧＦＰタグ化ＡＩＤＲ１／２発現がより高濃度であることと一致して、ＡＮＴＦ２（すなわちＩＤＲ１／２含有）と比較して、右にシフトする。第四に、ＡＮＴＦ２コアレットに比較して、すべてのＡＮＴＦ２／ＡＩＤＲ１コアレットは、同様にＳＧタンパク質およびポリＡ＋ ＲＮＡを補充し、そして亜ヒ酸処理後、連続明暗サイクルに際して、増進されてそして可逆的な相分離を示す。最後に、内因性ストレス顆粒と同様、すべてのＧ３ＢＰオプトＳＧは、ＤＤＸ６陽性Ｐボディを含む多相構造を形成し；重要なことに、これは、各場合で、高い価のＧ３ＢＰコアレットは、Ｐボディ相互作用ネットワークを伴う十分に好ましくない相互作用を与え、相非混和性を生じさせることを示唆する。しかし、ＧＦＰタグ化Ｇ３ＢＰ変異体とは異なり、オプトＳＧ形成は、ＲＢＤのＲＲＭおよびＲＧＧセグメント両方を必要とし、これは、緊密に並置されたコアの立体障害を反映しうる。
【0071】
［０１０７］付着したＰボディを含むストレス顆粒は、高い価のＲＢＤノードと関連するデフォルトの凝縮物である
［０１０８］高い価のＧ３ＢＰ ＲＢＤノードは、ポリソーム分解後、ストレス顆粒形成を誘導するのに十分である（が二量体性ブリッジはそうではない）が、これがＧ３ＢＰのユニークな特徴であるのか、またはＧ３ＢＰ ＮＴＦ２と相互作用するＲＮＡ結合ノードに一般的であるのかは明らかでない。本発明者らは、こうしたＮＴＦ２会合ＲＢＰが、本質的で付加的なＲＮＡ結合価を多タンパク質複合体に与えるならば、個々のＲＢＤに連結された合成高価ノードは、孤立状態のオプトＳＧに核形成する（すなわちＧ３ＢＰ ＲＢＤコアレットを模倣する）と推論した。これを試験するため、コアレットシステムを利用してＣＡＰＲＩＮ１およびＵＢＡＰ２ＬのＲＢＤをオリゴマー化し、そして非処理および亜ヒ酸曝露細胞の両方において、状態図をマッピングした。驚くべきことに、各々、単一ＲＧＧ領域しか含有しなかったにも関わらず、その相閾値は、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤ（１つのＲＲＭおよび１つのＲＧＧ）に比較して、より低い濃度およびコアレット価に向かってシフトし、ｍＲＮＰ凝縮を促進する傾向が増進されたことを示し；ＧＦＰタグ化キメラＧ３ＢＰタンパク質を用いたＳＧレスキュー実験は、こうしたＲＢＤが、類似の増進された傾向を伴って、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤに対して置換しうることを示すため、これらの結果はコアレットシステムのアーチファクトではない。さらに、各場合で、亜ヒ酸誘導性ポリソーム分解は、相閾値のシフトならびに可逆性ポリＡ＋オプトＳＧの成長を引き起こし、これはＳＧの１５のマーカー群に関して明確である。再び、これらのＲＢＤコアレット仲介性オプトＳＧは各々、Ｐボディに付着し、ＣＡＲＰＩＮ１およびＵＢＡＰ２Ｌ ＲＢＤが単独で、Ｐボディ相に非混和性を与えるために十分であることが示唆される。相閾値における亜ヒ酸誘導性シフトは、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤに比較して相対的に小さいことが注目され、これは、別個のＲＢＤが、損なわれていないポリソームに比較して、分解されたポリソーム基質に結合する能力に対して、ストレスが異なる影響を有するか、または特定のＲＢＤが相分離に寄与する本質的な自己相互作用を特徴としうることを示唆しうる。ＲＮＡ枯渇（アクチノマイシンＤ）が相分離を抑止するため、後者の可能性は、芳香族リッチＣＡＰＲＩＮ１ ＲＧＧに関しては排除された。さらに、スクランブル化されたＣＡＰＲＩＮＴ ＲＧＧ領域が相分離を妨げるため、ＲＧＧ仲介性凝縮は、単に、アルギニン残基の高い存在量によって与えられる純陽性電荷によるものではない。ＵＢＡＰ２Ｌと安定に会合する二量体ＲＢＰである、ＦＸＲ１のＲＢＤ（２つのＫＨおよび１つのＲＧＧ）もまた、予期されたＳＧマーカーおよび付着するＰボディを伴う、ストレス制御された可逆性のポリＡ＋オプトＳＧの集合が可能である。コアレットシステムに配置されたより多数のＲＢＤ群に基づいて、高いＲＢＤ価の合成ノードは、これらがＳＧまたはＰボディタンパク質と会合しているか、あるいはＧ３ＢＰ ＩＤＲに連結されているかどうかにかかわらず、ポリＡ＋ ＳＧに核形成するために十分である。にもかかわらず、ＰＰＩブリッジにおいてＰボディタンパク質と結合する能力を保持する全長Ｐボディタンパク質（ＤＣＰＩＡ）コアレットがさらなるＰボディマーカー群を補充するが、ＳＧタンパク質はそうではないため、異なるコアレットは、別の凝縮物形成相互作用ネットワークに差し込まれる可能性もある。さらに、凝縮物タンパク質組成、Ｐボディ付着、および相対相閾値は、ＲＮＡ結合モチーフのタイプまたは数によっては決定されない。したがって、非混和性ＰボディにカップリングしたポリＡ＋、ＳＧ様凝縮物は、多価ＲＢＤノードの「デフォルト」のオプションであり、そして凝縮物特異性は、特定のタンパク質－タンパク質相互作用ノードのネットワーク連結性によって決定づけられるようである。
［０１０８］高い価のＧ３ＢＰ ＲＢＤノードは、ポリソーム分解後、ストレス顆粒形成を誘導するのに十分である（が二量体性ブリッジはそうではない）が、これがＧ３ＢＰのユニークな特徴であるのか、またはＧ３ＢＰ ＮＴＦ２と相互作用するＲＮＡ結合ノードに一般的であるのかは明らかでない。本発明者らは、こうしたＮＴＦ２会合ＲＢＰが、本質的で付加的なＲＮＡ結合価を多タンパク質複合体に与えるならば、個々のＲＢＤに連結された合成高価ノードは、孤立状態のオプトＳＧに核形成する（すなわちＧ３ＢＰ ＲＢＤコアレットを模倣する）と推論した。これを試験するため、コアレットシステムを利用してＣＡＰＲＩＮ１およびＵＢＡＰ２ＬのＲＢＤをオリゴマー化し、そして非処理および亜ヒ酸曝露細胞の両方において、状態図をマッピングした。驚くべきことに、各々、単一ＲＧＧ領域しか含有しなかったにも関わらず、その相閾値は、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤ（１つのＲＲＭおよび１つのＲＧＧ）に比較して、より低い濃度およびコアレット価に向かってシフトし、ｍＲＮＰ凝縮を促進する傾向が増進されたことを示し；ＧＦＰタグ化キメラＧ３ＢＰタンパク質を用いたＳＧレスキュー実験は、こうしたＲＢＤが、類似の増進された傾向を伴って、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤに対して置換しうることを示すため、これらの結果はコアレットシステムのアーチファクトではない。さらに、各場合で、亜ヒ酸誘導性ポリソーム分解は、相閾値のシフトならびに可逆性ポリＡ＋オプトＳＧの成長を引き起こし、これはＳＧの１５のマーカー群に関して明確である。再び、これらのＲＢＤコアレット仲介性オプトＳＧは各々、Ｐボディに付着し、ＣＡＲＰＩＮ１およびＵＢＡＰ２Ｌ ＲＢＤが単独で、Ｐボディ相に非混和性を与えるために十分であることが示唆される。相閾値における亜ヒ酸誘導性シフトは、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤに比較して相対的に小さいことが注目され、これは、別個のＲＢＤが、損なわれていないポリソームに比較して、分解されたポリソーム基質に結合する能力に対して、ストレスが異なる影響を有するか、または特定のＲＢＤが相分離に寄与する本質的な自己相互作用を特徴としうることを示唆しうる。ＲＮＡ枯渇（アクチノマイシンＤ）が相分離を抑止するため、後者の可能性は、芳香族リッチＣＡＰＲＩＮ１ ＲＧＧに関しては排除された。さらに、スクランブル化されたＣＡＰＲＩＮＴ ＲＧＧ領域が相分離を妨げるため、ＲＧＧ仲介性凝縮は、単に、アルギニン残基の高い存在量によって与えられる純陽性電荷によるものではない。ＵＢＡＰ２Ｌと安定に会合する二量体ＲＢＰである、ＦＸＲ１のＲＢＤ（２つのＫＨおよび１つのＲＧＧ）もまた、予期されたＳＧマーカーおよび付着するＰボディを伴う、ストレス制御された可逆性のポリＡ＋オプトＳＧの集合が可能である。コアレットシステムに配置されたより多数のＲＢＤ群に基づいて、高いＲＢＤ価の合成ノードは、これらがＳＧまたはＰボディタンパク質と会合しているか、あるいはＧ３ＢＰ ＩＤＲに連結されているかどうかにかかわらず、ポリＡ＋ ＳＧに核形成するために十分である。にもかかわらず、ＰＰＩブリッジにおいてＰボディタンパク質と結合する能力を保持する全長Ｐボディタンパク質（ＤＣＰＩＡ）コアレットがさらなるＰボディマーカー群を補充するが、ＳＧタンパク質はそうではないため、異なるコアレットは、別の凝縮物形成相互作用ネットワークに差し込まれる可能性もある。さらに、凝縮物タンパク質組成、Ｐボディ付着、および相対相閾値は、ＲＮＡ結合モチーフのタイプまたは数によっては決定されない。したがって、非混和性ＰボディにカップリングしたポリＡ＋、ＳＧ様凝縮物は、多価ＲＢＤノードの「デフォルト」のオプションであり、そして凝縮物特異性は、特定のタンパク質－タンパク質相互作用ノードのネットワーク連結性によって決定づけられるようである。
【0072】
［０１０９］タンパク質－タンパク質相互作用ノード間の競合は、多相凝縮をエンコードする
［０１１０］会合するＲＢＤが合成高価型であることがＳＧを引き起こすために十分であるため、ＵＢＡＰ２Ｌ／ＦＸＲまたはＣＡＰＲＩＮ１／ＦＸＲ複合体は、個々のタンパク質がＧ３ＢＰノード（例えばネットワーク中心性）を模倣可能であり、そして類似のレベルで発現されているならば、Ｇ３ＢＰ ＫＯを相殺しうる。Ｇ３ＢＰとは異なり、ＣＡＰＲＩＮ１は、比較的高レベルでもレスキューせず、該タンパク質が、ＳＧネットワークにおいて、主にＲＮＡ結合ブリッジとして作用することを示唆する。逆に、ＵＢＡＰ２ＬまたはＦＸＲ１の穏やかな過剰発現（＜１μＭ）は、Ｇ３ＢＰの非存在下で、ポリＡ＋ ＳＧの形成に十分であり、２つのタンパク質は、ＳＧ凝縮のための十分なＲＢＤネットワーク価に関与するＳＧノードとして作用することが示唆される。Ｇ３ＢＰの場合から想起して、自己会合ドメインが、ノード同一性に必要な価（ｖ＞３）を与えると仮定された。以前の研究は、こうしたドメイン（二量体化）がＦＸＲ１に関して存在すると示していたが、ＵＢＡＰ２Ｌに関する自己会合界面はいまだに同定されていなかった。
［０１１０］会合するＲＢＤが合成高価型であることがＳＧを引き起こすために十分であるため、ＵＢＡＰ２Ｌ／ＦＸＲまたはＣＡＰＲＩＮ１／ＦＸＲ複合体は、個々のタンパク質がＧ３ＢＰノード（例えばネットワーク中心性）を模倣可能であり、そして類似のレベルで発現されているならば、Ｇ３ＢＰ ＫＯを相殺しうる。Ｇ３ＢＰとは異なり、ＣＡＰＲＩＮ１は、比較的高レベルでもレスキューせず、該タンパク質が、ＳＧネットワークにおいて、主にＲＮＡ結合ブリッジとして作用することを示唆する。逆に、ＵＢＡＰ２ＬまたはＦＸＲ１の穏やかな過剰発現（＜１μＭ）は、Ｇ３ＢＰの非存在下で、ポリＡ＋ ＳＧの形成に十分であり、２つのタンパク質は、ＳＧ凝縮のための十分なＲＢＤネットワーク価に関与するＳＧノードとして作用することが示唆される。Ｇ３ＢＰの場合から想起して、自己会合ドメインが、ノード同一性に必要な価（ｖ＞３）を与えると仮定された。以前の研究は、こうしたドメイン（二量体化）がＦＸＲ１に関して存在すると示していたが、ＵＢＡＰ２Ｌに関する自己会合界面はいまだに同定されていなかった。
【0073】
［０１１１］内部対照としてＣＡＰＲＩＮ１（予期されるブリッジ）由来の断片を用いて、ＦＵＳ ＩＤＲ（弱い自己会合）またはＮＴＦ２様（二量体化）特性を持つＵＢＡＰ２Ｌ領域に関して、断片スキャンコアレットスクリーニングを行った。試験した１３の断片のうち、ＵＢＡＰ２Ｌ ７８１～１０８７は、ストレス非依存性ポリＡ陰性小滴を形成する際にユニークであり、この特性は、この芳香族含有ＦＵＳ様領域をさらに一部切除しても保存された。コアレットドメインスクリーニングアプローチの予測力は、同定されたＣ末端がＧ３ＢＰ非依存性ＳＧ形成においてＵＢＡＰ２Ｌの役割に必須である（すなわち欠失により、ＵＢＡＰ２Ｌはノードからブリッジになる）点で明らかである。同定された自己会合ドメインを含めて非常に保存されているにもかかわらず、ＵＢＡＰ２Ｌは、そのオルソログＵＢＡＰ２と高アフィニティ複合体を形成しない。ＵＢＡＰ２／２Ｌ二重ＫＯ表現型の観点でこれを考慮すると、該領域は、別個の高アフィニティ複合体（例えばＦＸＲ１／ＵＢＡＰ２Ｌ、ＵＢＡＰ２Ｌ／Ｇ３ＢＰ）においてＵＢＡＰ２／２Ｌタンパク質間で弱い自己会合を形成し、したがって、ＳＧ凝縮のための本質的な価増倍因子（ｍｕｌｔｉｐｌｅｒ）として作用すると推測される。ＦＸＲ１およびＧ３ＢＰの両方を含有する高アフィニティＵＢＡＰ２Ｌ複合体は、まれであるかまたは存在しないため、本発明者らは、Ｇ３ＢＰおよびＦＸＲノードが、連結ノードＵＢＡＰ２Ｌの限定された量に関して競合し、そして内因性ＳＧにおいては、相対化学量論がその混合分布に非常に重要であると仮定した。これと一致して、ＦＸＲ１の異所性の過剰発現は、多相ＳＧを引き起こし、存続ＳＧにおけるＧ３ＢＰ１に対するＳＴＥＤ顕微鏡検査によって、慣用的な顕微鏡では見えない微小異種性が示されるため、これは、内因性システムにおいて役割を果たす可能性がある。逆に、ＵＢＡＰ２Ｌは、Ｇ３ＢＰを含む単一相ＳＧを形成する。３つのタンパク質すべての同時発現は、一定レベルのＵＢＡＰ２Ｌでは、ＦＸＲ１およびＧ３ＢＰノードの間の化学量論は、単一または多相区画が生じるかどうかを決定するために必須であり：相対的に高いＦＸＲ１は、両方の相に存在するＵＢＰ２ＬのＧ３ＢＰからの分離を引き起こし；逆に高いＧ３ＢＰは、３つのタンパク質すべての単相を生じる。したがって、連結ノード（ＵＢＡＰ２Ｌ）の限定された供給に対する、非隣接ノード（Ｇ３ＢＰ、ＦＸＲ１）の間の競合は、ネットワークが絡み合って単一の混和相を形成する度合いを決定するようである。予期せぬことに、本発明者らは、ＦＸＲ１およびＵＢＡＰ２Ｌの両方が、Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞において、小さなストレス非依存性顆粒に核形成し、これがストレス後に融合してそして成長することを観察した。
【0074】
［０１１２］細胞は最大の中心性を持つＳＧノードを欠くため、これらのＧ３ＢＰ非依存性凝縮物が、内因性ＳＧよりも、異なるＰＰＩネットワークに結びつけられると仮定された。実際、ＵＢＡＰ２Ｌ凝縮物は、ＳＧおよびＰボディタンパク質の両方を含有し、これは、ＵＢＡＰ２Ｌの必須（Ａｙａｃｈｅら、２０１５；Ｏｈｎら、２００８）ＰボディノードＤＤＸ６との高アフィニティ会合から生じる可能性がある。興味深いことに、ＤＤＸ６は、ＳＧに弱く補充される一方、ＥＤＣ３およびＤＣＰＩＡは遠ざけられ、これは、２つの非混和性ネットワークの１つに関する相対的な優先性を反映する。
【0075】
［０１１３］これらの研究および過去の研究は、連結性に関して重複するノードの連続体、例えばＧ３ＢＰおよびＦＸＲ１対ＵＢＡＰ２Ｌを裏付ける（この一連の実験によって裏付けられる相互作用ネットワークの図解要約に関しては、図１７を参照されたい）。本発明者らは、こうしたノードに基づく競合が、広範囲のＰボディおよびＳＧネットワークの再構築を引き起こし、これが相混和性の規模に関して観察可能であると仮定した。
【0076】
［０１１４］これを試験するため、中心ＳＧおよびＰボディノードを、Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞において、対で発現させ、ストレス後の多相パターン形成を調べた。ノード間のネットワーク距離に応じて、２つのタンパク質は、混和性であるか、多相であるか、または別個の凝縮物として存在することが観察された。単一相を形成する隣接ノード（例えばＧ３ＢＰおよびＵＢＡＰ２Ｌ、ＥＤＣ３およびＤＣＰＩＡ）とは対照的に、遠く離れたノード（例えばＧ３ＢＰおよびＤＣＰＩＡ）の上方制御は、ＰボディからＳＧを切り離す。こうした研究が、競合するＰＰＩネットワークが別個の多相凝縮物をコードするために十分であることを示唆する一方、ネットワーク基質相互作用が補助的な役割を果たす度合いは不明確である。好ましくない相互作用を持つＰＰＩネットワークが、ＳＧ／ＰＢ分離の主な仲介因子であるならば、本発明者らは、同じ基質優先性を共有する分断されたネットワークであっても非混和性であると予測する。これを試験する理想的なモデルは、内因性ＳＧに対して同一の特性を持つ凝縮物をコードするが、ＮＴＦ２ドメインが失われていることによって、ＰＰＩ連結性を欠く、合成Ｇ３ＢＰ／ＵＢＡＰ２Ｌ ＲＢＤノードである。
【0077】
［０１１５］原理の証明として、Ｇ３ＢＰ ＲＢＤオプトＳＧは、ストレス誘導性ＵＢＡＰ２Ｌ凝縮物の表面に形成され、そして成熟中、多相特性を保持する。非活性化に際して、オプトＳＧは溶解し、そして表面張力の消失が、ＵＢＡＰ２Ｌ相の個々の点への消散を導く。
【0078】
［０１１６］多相凝縮物は、Ｇ３ＢＰ／ＵＢＡＰ２Ｌ会合ＲＢＤノードおよびそのＦＬ対応物に関する同時発現ペア群に渡って同様に観察される；特に、ＵＢＡＰ２Ｌ ＲＢＤコアレットが、ＦＬ ＵＢＡＰ２Ｌとの顕著な多相凝縮物をどのように形成するかが注目されるが、こうした多相挙動はＦＬ Ｇ３ＢＰ１と同時発現されたＧ３ＢＰ ＲＢＤコアレットでは、回折限界スケールで、より明らかでない。ＮＴＦ２コアレットを用いた同一の実験では、普遍的に単相構造が生じるため、より短いネットワーク距離、すなわち直接タンパク質－タンパク質相互作用が混和性を促進する一方、より長いネットワーク距離、すなわちＲＮＡ中間物を通じた結合が多相挙動を促進すると結論付けられうる。
【0079】
［０１１７］方法の詳細
［０１１８］プラスミド構築
［０１１９］示されない限り（例えばｐＨＲレンチウイルスベクター、ＳＦＦＶプロモーター）、すべてのレンチウイルスＤＮＡプラスミドはＦＭ５レンチウイルスベクターを用い、該プラスミドはユビキチンＣプロモーターを特徴とする。関心対象の本発明者らのタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）とともにＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドは、ＩＤＴによって合成された。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて、望ましい直線化されたベクター内にＰＣＲ増幅断片を挿入し、これは、ハイスループットのクローニングを可能にするため、標準化されたリンカーおよび重複を特徴とした。挿入物の両端から配列決定する、ＧＥＮＥＷＩＺ配列決定によって、クローニング産物を確認した。すべてのｓｓｐＢ－ｍＣｈｅｒｒｙタグ化ＤＮＡ構築物に関して、２回目に、独立の研究者によって、配列決定が正しいことが確認された。２つの別個の研究室によって生成された、２つの異なる完全に配列決定されたＤＮＡ構築物（ＦＭ５－ｍＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１ Ｓ３８ＦおよびｐｃＤＮＡ４ ｔ／о－ＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１ Ｓ３８Ｆ）を用いて、Ｇ３ＢＰ Ｓ３８Ｆ突然変異体に関連するストレス顆粒（ＳＧ）レスキュー欠陥を確認した。
［０１１８］プラスミド構築
［０１１９］示されない限り（例えばｐＨＲレンチウイルスベクター、ＳＦＦＶプロモーター）、すべてのレンチウイルスＤＮＡプラスミドはＦＭ５レンチウイルスベクターを用い、該プラスミドはユビキチンＣプロモーターを特徴とする。関心対象の本発明者らのタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）とともにＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドは、ＩＤＴによって合成された。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いて、望ましい直線化されたベクター内にＰＣＲ増幅断片を挿入し、これは、ハイスループットのクローニングを可能にするため、標準化されたリンカーおよび重複を特徴とした。挿入物の両端から配列決定する、ＧＥＮＥＷＩＺ配列決定によって、クローニング産物を確認した。すべてのｓｓｐＢ－ｍＣｈｅｒｒｙタグ化ＤＮＡ構築物に関して、２回目に、独立の研究者によって、配列決定が正しいことが確認された。２つの別個の研究室によって生成された、２つの異なる完全に配列決定されたＤＮＡ構築物（ＦＭ５－ｍＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１ Ｓ３８ＦおよびｐｃＤＮＡ４ ｔ／о－ＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１ Ｓ３８Ｆ）を用いて、Ｇ３ＢＰ Ｓ３８Ｆ突然変異体に関連するストレス顆粒（ＳＧ）レスキュー欠陥を確認した。
【0080】
［０１２０］細胞培養
［０１２１］１％ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充し、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で細胞を培養し、そして加湿インキュベーター中、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。試験したすべての細胞株は、マイコプラズマ検査で陰性を示した。ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｍａｒｃ Ｄｉａｍｏｎｄ研究室（ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ）から厚意により寄贈された。ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから得た。Ｕ２０Ｓ細胞およびＵ２０Ｓ Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ細胞は以前記載された（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）。このノックアウト細胞株は、引用論文において詳細に特徴づけられ、そして多数の独立の研究室が、ストレス顆粒形成に対する耐性を検証している（私信）。Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ（以後、Ｇ３ＢＰ ＫＯと記載する）は、ウェスタンブロットによって内部検証された。
［０１２１］１％ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充し、１０％ＦＢＳ（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）中で細胞を培養し、そして加湿インキュベーター中、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。試験したすべての細胞株は、マイコプラズマ検査で陰性を示した。ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、Ｍａｒｃ Ｄｉａｍｏｎｄ研究室（ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ）から厚意により寄贈された。ＨｅＬａ細胞をＡＴＣＣから得た。Ｕ２０Ｓ細胞およびＵ２０Ｓ Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ細胞は以前記載された（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）。このノックアウト細胞株は、引用論文において詳細に特徴づけられ、そして多数の独立の研究室が、ストレス顆粒形成に対する耐性を検証している（私信）。Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ（以後、Ｇ３ＢＰ ＫＯと記載する）は、ウェスタンブロットによって内部検証された。
【0081】
［０１２２］レンチウイルス生成およびレンチウイルス形質導入
［０１２３］Ｇ３ＢＰノックアウトの光誘導性ｓｓｐＢ－／ｉＬＩＤ－ＡＮＴＦ２二量体仲介性レスキューを除いて、レンチウイルスで安定形質導入した細胞を用いて、すべての生存細胞画像化実験を行った（一過性トランスフェクションを参照されたい）。プラスミドを、ヘルパープラスミドＶＳＶＧおよびＰＳＰ（Ｍａｒｃ Ｄｉａｍｏｎｄ研究室、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎより）とともに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ－３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にトランスフェクションすることによって、所望の構築物を含有するレンチウイルスを産生した。トランスフェクション２～３日後にウイルスを収集し、そしてＷＴ Ｕ２０Ｓ、Ｇ３ＢＰ ＫＯ Ｕ２０Ｓ、またはＷＴ ＨＥＫ２９３細胞を感染させるために用いた。９６ウェルプレート中でレンチウイルス形質導入を行った。低集密度の細胞にレンチウイルスを適用した３日後、安定維持のために細胞を継代するか、または生存細胞顕微鏡検査のため、９６ウェルのフィブロネクチンコーティングしたガラス底プレートに直接移した。非コアレット実験に関しては、安定細胞を、８日を超える日数に渡って少なくとも３回継代した後に生存細胞画像化実験に用いて、関心対象の融合タンパク質を致死レベルで発現する細胞を除去した。すべての実験において、９０％＋の細胞は、ある濃度範囲（典型的には＜５μＭ；概算濃度を適切なように示す）の関心対象のタンパク質の発現を特徴とした。この特定のプロトコルは、液体に基づく一過性トランスフェクションで起こりうる、融合タンパク質のアーチファクトの傾向がある濃度を回避するために設計された。
［０１２３］Ｇ３ＢＰノックアウトの光誘導性ｓｓｐＢ－／ｉＬＩＤ－ＡＮＴＦ２二量体仲介性レスキューを除いて、レンチウイルスで安定形質導入した細胞を用いて、すべての生存細胞画像化実験を行った（一過性トランスフェクションを参照されたい）。プラスミドを、ヘルパープラスミドＶＳＶＧおよびＰＳＰ（Ｍａｒｃ Ｄｉａｍｏｎｄ研究室、ＵＴ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎより）とともに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ－３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にトランスフェクションすることによって、所望の構築物を含有するレンチウイルスを産生した。トランスフェクション２～３日後にウイルスを収集し、そしてＷＴ Ｕ２０Ｓ、Ｇ３ＢＰ ＫＯ Ｕ２０Ｓ、またはＷＴ ＨＥＫ２９３細胞を感染させるために用いた。９６ウェルプレート中でレンチウイルス形質導入を行った。低集密度の細胞にレンチウイルスを適用した３日後、安定維持のために細胞を継代するか、または生存細胞顕微鏡検査のため、９６ウェルのフィブロネクチンコーティングしたガラス底プレートに直接移した。非コアレット実験に関しては、安定細胞を、８日を超える日数に渡って少なくとも３回継代した後に生存細胞画像化実験に用いて、関心対象の融合タンパク質を致死レベルで発現する細胞を除去した。すべての実験において、９０％＋の細胞は、ある濃度範囲（典型的には＜５μＭ；概算濃度を適切なように示す）の関心対象のタンパク質の発現を特徴とした。この特定のプロトコルは、液体に基づく一過性トランスフェクションで起こりうる、融合タンパク質のアーチファクトの傾向がある濃度を回避するために設計された。
【0082】
［０１２４］一過性トランスフェクション
［０１２５］他の実験とは異なり（上記を参照されたい）、一過性トランスフェクションを用いて、Ｇ３ＢＰノックアウトの光誘導性ＡＮＴＦ２二量体仲介性レスキューを行った。レンチウイルスに基づく形質導入を用いて欠陥をレスキューする最初の試み（データ未提示）は、個々の融合タンパク質が高濃度（すなわちｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２およびｍＧＦＰ－ｉＬＩＤ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２の両方に関して＞５μＭ）に到達できなかったため、失敗した。したがって、Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞を含有する９６ウェルプレートの個々のウェルを、製造者の推奨にしたがって、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ－３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２およびｍＧＦＰ－ｉＬＩＤ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２の両方でトランスフェクションした。２４時間後、細胞質全体で拡散して発現された両方の融合タンパク質を特徴とする細胞が観察された。最終濃度４００ｐＭで亜ヒ酸塩を添加した。１時間後、細胞を画像化した。３回の生物学的複製実験を行った。両方の構成要素が非常に高濃度（各々、＞１０ｐＭ）であるまれな細胞では、青色光活性化の時間に関わらず、ストレス顆粒が観察された。これらの濃度での二量体に基づくレスキューの光非依存性は、ｉＬＩＤ－ｓｓｐＢに関して測定された４．３ｐＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ暗所状態Ｋｄと一致する（Ｇｕｎｔａｓら、２０１５）。こうした濃度で、ｉＬＩＤおよびｓｓｐＢは、暗所で強く会合すると予期される。ｉＬＩＤ－ｓｓｐＢに関するｉｎ ｖｉｔｒｏ明所状態Ｋｄは、０．２ｐＭ（または「コア」測定に関しては～１０ｎＭ。状態図データ収集を参照されたい）であり、これがアッセイの下限と設定される。
［０１２５］他の実験とは異なり（上記を参照されたい）、一過性トランスフェクションを用いて、Ｇ３ＢＰノックアウトの光誘導性ＡＮＴＦ２二量体仲介性レスキューを行った。レンチウイルスに基づく形質導入を用いて欠陥をレスキューする最初の試み（データ未提示）は、個々の融合タンパク質が高濃度（すなわちｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２およびｍＧＦＰ－ｉＬＩＤ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２の両方に関して＞５μＭ）に到達できなかったため、失敗した。したがって、Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞を含有する９６ウェルプレートの個々のウェルを、製造者の推奨にしたがって、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ－３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２およびｍＧＦＰ－ｉＬＩＤ－Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２の両方でトランスフェクションした。２４時間後、細胞質全体で拡散して発現された両方の融合タンパク質を特徴とする細胞が観察された。最終濃度４００ｐＭで亜ヒ酸塩を添加した。１時間後、細胞を画像化した。３回の生物学的複製実験を行った。両方の構成要素が非常に高濃度（各々、＞１０ｐＭ）であるまれな細胞では、青色光活性化の時間に関わらず、ストレス顆粒が観察された。これらの濃度での二量体に基づくレスキューの光非依存性は、ｉＬＩＤ－ｓｓｐＢに関して測定された４．３ｐＭのｉｎ ｖｉｔｒｏ暗所状態Ｋｄと一致する（Ｇｕｎｔａｓら、２０１５）。こうした濃度で、ｉＬＩＤおよびｓｓｐＢは、暗所で強く会合すると予期される。ｉＬＩＤ－ｓｓｐＢに関するｉｎ ｖｉｔｒｏ明所状態Ｋｄは、０．２ｐＭ（または「コア」測定に関しては～１０ｎＭ。状態図データ収集を参照されたい）であり、これがアッセイの下限と設定される。
【0083】
［０１２６］生存細胞共焦点顕微鏡検査
［０１２７］フィブロネクチンコーティングした９６ウェル・ガラス底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）上で細胞を画像化した。１．４の開口数の６０ｘ油浸レンズを用いて、Ｎｉｋｏｎ Ａ１レーザー走査型共焦点顕微鏡上で、共焦点画像を撮影した。顕微鏡ステージには、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に維持するためにインキュベーターが装備された。ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＥＹＦＰ、およびｍｉＲＦＰ６７０（ｉＲＦＰ）でタグ付けされたタンパク質は、それぞれ、５６０、４８８、４８８、および６４０ｎｍレーザーで画像化された。上記詳細は、ＳＴＥＤ超解像および広視野顕微鏡画像を除いて、文書中のすべての画像化データに当てはまる。詳細に関しては以下を参照されたい。
［０１２７］フィブロネクチンコーティングした９６ウェル・ガラス底プレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）上で細胞を画像化した。１．４の開口数の６０ｘ油浸レンズを用いて、Ｎｉｋｏｎ Ａ１レーザー走査型共焦点顕微鏡上で、共焦点画像を撮影した。顕微鏡ステージには、細胞を３７℃および５％ＣＯ２に維持するためにインキュベーターが装備された。ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧＦＰ（ＧＦＰ）、ＥＹＦＰ、およびｍｉＲＦＰ６７０（ｉＲＦＰ）でタグ付けされたタンパク質は、それぞれ、５６０、４８８、４８８、および６４０ｎｍレーザーで画像化された。上記詳細は、ＳＴＥＤ超解像および広視野顕微鏡画像を除いて、文書中のすべての画像化データに当てはまる。詳細に関しては以下を参照されたい。
【0084】
［０１２８］誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）超解像度顕微鏡検査
［０１２９］単一チャネルＳＴＥＤ画像に関しては、Ｉｍｓｐｅｃｔｏｒにおいて利用可能な「カスタム軸」オプションを用い、ＳＴＥＤ出力を増加させながら、連続画像セット（各細胞株は、ブリーチングアーチファクトに関して管理するため、ＳＴＥＤレーザーを伴いそして伴わずに同時に画像化された）を撮影した。二重チャネルＳＴＥＤ画像に関しては、第一のｍＧＦＰ ＳＴＥＤ出力を０％ＳＴＥＤ出力に設定し、第二の画像中で起こるｍｉＲＦＰ画像ブリーチングを回避して、ｍＧＦＰ（＋／－ＳＴＥＤ）およびｍｉＲＦＰ（＋／－ＳＴＥＤ）を画像化して、各細胞株で２つの連続画像セットを撮影した（再び、Ｉｍｓｐｅｃｔｏｒにおいて利用可能な「カスタム軸」オプションを用いた）。
［０１２９］単一チャネルＳＴＥＤ画像に関しては、Ｉｍｓｐｅｃｔｏｒにおいて利用可能な「カスタム軸」オプションを用い、ＳＴＥＤ出力を増加させながら、連続画像セット（各細胞株は、ブリーチングアーチファクトに関して管理するため、ＳＴＥＤレーザーを伴いそして伴わずに同時に画像化された）を撮影した。二重チャネルＳＴＥＤ画像に関しては、第一のｍＧＦＰ ＳＴＥＤ出力を０％ＳＴＥＤ出力に設定し、第二の画像中で起こるｍｉＲＦＰ画像ブリーチングを回避して、ｍＧＦＰ（＋／－ＳＴＥＤ）およびｍｉＲＦＰ（＋／－ＳＴＥＤ）を画像化して、各細胞株で２つの連続画像セットを撮影した（再び、Ｉｍｓｐｅｃｔｏｒにおいて利用可能な「カスタム軸」オプションを用いた）。
【0085】
［０１３０］広視野顕微鏡検査
［０１３１］いくつかの画像に関して、ＧＦＰ－ＵＢＡＰ２Ｌを安定して発現するＧ３ＢＰ ＫＯまたはＵＢＡＰ２Ｌ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞を、カバーガラス上で増殖させ、示した時点で４００μＭ亜ヒ酸塩でストレスを与え、そしてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した後、氷冷メタノール中で５分間、後固定／透過処理した。５％ウマ血清／ＰＢＳ中で細胞をブロッキングし、そして揺動しながら１時間、ブロッキング緩衝液中で、一次および二次インキュベーションを行った。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をポリビニルマウンティング媒体中でマウントし、そして視覚化した。６３ｘ Ｐｌａｎ Ａｐｏ対物レンズ（ＮＡ １．４）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡を用いて画像を捕捉し、そして水銀ランプならびにＤＡＰＩ（ＵＶ－２Ａ ３６０／４０；４２０ＬＰ）、Ｃｙ２（ＦＩＴＣ ＨＱ ４８０／４０；５３５／５０）、Ｃｙ３（Ｃｙ ３ＨＱ ５４５／３０；６１０／７５）、およびＣｙ５（Ｃｙ ５ＨＱ ６２０／６０；７００／７５）用の標準フィルターを用いて照射した。製造者のソフトウェアとともにＳＰＯＴ Ｐｕｒｓｕｉｔデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて画像を捕捉し、そして生のＴＩＦファイルをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３内にインポートした。明るさおよびコントラストの同一の調整を、所定の実験においてすべての画像に適用した。
［０１３１］いくつかの画像に関して、ＧＦＰ－ＵＢＡＰ２Ｌを安定して発現するＧ３ＢＰ ＫＯまたはＵＢＡＰ２Ｌ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞を、カバーガラス上で増殖させ、示した時点で４００μＭ亜ヒ酸塩でストレスを与え、そしてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて１５分間固定した後、氷冷メタノール中で５分間、後固定／透過処理した。５％ウマ血清／ＰＢＳ中で細胞をブロッキングし、そして揺動しながら１時間、ブロッキング緩衝液中で、一次および二次インキュベーションを行った。ＰＢＳで洗浄した後、細胞をポリビニルマウンティング媒体中でマウントし、そして視覚化した。６３ｘ Ｐｌａｎ Ａｐｏ対物レンズ（ＮＡ １．４）を備えたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００顕微鏡を用いて画像を捕捉し、そして水銀ランプならびにＤＡＰＩ（ＵＶ－２Ａ ３６０／４０；４２０ＬＰ）、Ｃｙ２（ＦＩＴＣ ＨＱ ４８０／４０；５３５／５０）、Ｃｙ３（Ｃｙ ３ＨＱ ５４５／３０；６１０／７５）、およびＣｙ５（Ｃｙ ５ＨＱ ６２０／６０；７００／７５）用の標準フィルターを用いて照射した。製造者のソフトウェアとともにＳＰＯＴ Ｐｕｒｓｕｉｔデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて画像を捕捉し、そして生のＴＩＦファイルをＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３内にインポートした。明るさおよびコントラストの同一の調整を、所定の実験においてすべての画像に適用した。
【0086】
［０１３２］コアレット活性化
［０１３３］示す融合タンパク質を安定に発現しているＧ３ＢＰ ＫＯ細胞の活性化前および活性化後の画像を、ｉＬＩＤ－ｍＧＦＰタグ化フェリチンコアとの光誘導性二量体化を誘発することなく、ｓｓｐＢ構成要素を視覚化するためにのみ、ｍＣｈｅｒｒｙ（５６０）チャネルで捕捉した。１％レーザー出力を用いて、４８８レーザーで細胞を活性化して、ｉＬＩＤおよびｓｓｐＢの二量体化を引き起こした。Ｎｙｑｕｉｓｔズームで、１２０ｘ１２０μｍ２（１０２４ｘ１０２４ピクセル）の領域に関して、６秒のフレーム間隔を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰチャネルを同時に画像化することによって、細胞の活性化を達成した。状態図データ収集もまた参照されたい。
［０１３３］示す融合タンパク質を安定に発現しているＧ３ＢＰ ＫＯ細胞の活性化前および活性化後の画像を、ｉＬＩＤ－ｍＧＦＰタグ化フェリチンコアとの光誘導性二量体化を誘発することなく、ｓｓｐＢ構成要素を視覚化するためにのみ、ｍＣｈｅｒｒｙ（５６０）チャネルで捕捉した。１％レーザー出力を用いて、４８８レーザーで細胞を活性化して、ｉＬＩＤおよびｓｓｐＢの二量体化を引き起こした。Ｎｙｑｕｉｓｔズームで、１２０ｘ１２０μｍ２（１０２４ｘ１０２４ピクセル）の領域に関して、６秒のフレーム間隔を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰチャネルを同時に画像化することによって、細胞の活性化を達成した。状態図データ収集もまた参照されたい。
【0087】
［０１３４］フォトブリーチング後の蛍光回復（ＦＲＡＰ）
［０１３５］示す融合タンパク質を安定発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞をまず、４８８レーザーに５分間、一貫して曝露することによって、広く活性化した（すなわちｉＬＩＤ－ｓｓｐＢ二量体化）。次いで、～１ｐｍ２領域中、高出力の５６０レーザーで、光活性化凝縮物をブリーチして、凝縮物のｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ構成要素の大部分をクエンチした。ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰチャネルの両方を６秒間のフレーム間隔で画像化しながら、蛍光回復を監視した。ブリーチングに対して管理するため、非ＦＲＡＰ化小滴に基づいて蛍光を標準化し、そしてプロット目的のため、蛍光強度を最初の画像に比較した。ポリソームを解離させるための亜ヒ酸塩での細胞処理。亜ヒ酸ナトリウムを４００μＭの濃度で細胞培地に添加することによって細胞を処理し、この濃度は、ポリソーム分解のための飽和濃度を超えている（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）。明暗サイクリング実験（以下を参照されたい）を行う以外は、亜ヒ酸処理後、５０分～２時間の間で（典型的には１時間）画像を捕捉した。６０～１２０分間の間で、レスキュー、相閾値シフト、ＳＧ阻害に関して相違は観察されなかった。ＳＧ数／サイズは、典型的には４５分までにピークとなり、そして１～２時間の時間ウィンドウを選択し、したがって、薬剤は最大効果に到達した。細胞は、典型的には処理後～６時間で死に始め、したがって毒性／致死性の混同を回避するため、示す１～２時間の時間枠を用いた。シクロヘキシミドを最終濃度１００ｐｇ／ｍＬで添加する前処理によってポリソーム分解を阻害した（Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞は、示す蛍光融合タンパク質を発現する）。インキュベーション３０分後、亜ヒ酸を４００μＭの濃度で添加した。１時間後、ストレス顆粒の形成に関して細胞を評価する（ＧＦＰ－Ｇ３ＢＰレスキュー）か、または活性化サイクルを行った（コアレット）。
［０１３５］示す融合タンパク質を安定発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞をまず、４８８レーザーに５分間、一貫して曝露することによって、広く活性化した（すなわちｉＬＩＤ－ｓｓｐＢ二量体化）。次いで、～１ｐｍ２領域中、高出力の５６０レーザーで、光活性化凝縮物をブリーチして、凝縮物のｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ構成要素の大部分をクエンチした。ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰチャネルの両方を６秒間のフレーム間隔で画像化しながら、蛍光回復を監視した。ブリーチングに対して管理するため、非ＦＲＡＰ化小滴に基づいて蛍光を標準化し、そしてプロット目的のため、蛍光強度を最初の画像に比較した。ポリソームを解離させるための亜ヒ酸塩での細胞処理。亜ヒ酸ナトリウムを４００μＭの濃度で細胞培地に添加することによって細胞を処理し、この濃度は、ポリソーム分解のための飽和濃度を超えている（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）。明暗サイクリング実験（以下を参照されたい）を行う以外は、亜ヒ酸処理後、５０分～２時間の間で（典型的には１時間）画像を捕捉した。６０～１２０分間の間で、レスキュー、相閾値シフト、ＳＧ阻害に関して相違は観察されなかった。ＳＧ数／サイズは、典型的には４５分までにピークとなり、そして１～２時間の時間ウィンドウを選択し、したがって、薬剤は最大効果に到達した。細胞は、典型的には処理後～６時間で死に始め、したがって毒性／致死性の混同を回避するため、示す１～２時間の時間枠を用いた。シクロヘキシミドを最終濃度１００ｐｇ／ｍＬで添加する前処理によってポリソーム分解を阻害した（Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞は、示す蛍光融合タンパク質を発現する）。インキュベーション３０分後、亜ヒ酸を４００μＭの濃度で添加した。１時間後、ストレス顆粒の形成に関して細胞を評価する（ＧＦＰ－Ｇ３ＢＰレスキュー）か、または活性化サイクルを行った（コアレット）。
【0088】
［０１３６］転写を阻害するためのアクチノマイシンＤでの細胞処理
［０１３７］５ｐｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に溶解したアクチノマイシンＤを用いて、示すコアレットを発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞を処理した。アクチノマイシンＤ処理の１２～１８時間後、画像を撮影し、これは、核小体が明視野観察でもはや現れず、そしてｍＲＮＡの大部分が分解すると予期される時間間隔であった。ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であった。亜ヒ酸を加えたアクチノマイシンＤ実験に関して、アクチノマイシンＤ処理の～１２時間後に４００μＭ濃度で亜ヒ酸を添加し、そして続いて、細胞を１～２時間画像化した。定性的な観察によって、示す濃度のアクチノマイシンＤの適用は、処理の～３０～３６時間後に致死性であると示唆された。薬剤による広範囲の致死性を伴わずに、処理からの時間を最大にするために（すなわち可能な限り多く細胞中のＲＮＡを減少させるために）時点を選択した。
［０１３７］５ｐｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に溶解したアクチノマイシンＤを用いて、示すコアレットを発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞を処理した。アクチノマイシンＤ処理の１２～１８時間後、画像を撮影し、これは、核小体が明視野観察でもはや現れず、そしてｍＲＮＡの大部分が分解すると予期される時間間隔であった。ＤＭＳＯの最終濃度は０．５％であった。亜ヒ酸を加えたアクチノマイシンＤ実験に関して、アクチノマイシンＤ処理の～１２時間後に４００μＭ濃度で亜ヒ酸を添加し、そして続いて、細胞を１～２時間画像化した。定性的な観察によって、示す濃度のアクチノマイシンＤの適用は、処理の～３０～３６時間後に致死性であると示唆された。薬剤による広範囲の致死性を伴わずに、処理からの時間を最大にするために（すなわち可能な限り多く細胞中のＲＮＡを減少させるために）時点を選択した。
【0089】
［０１３８］状態図データ収集
［０１３９］細胞内状態図のための正確な相閾値境界を決定するため、分析する細胞は、十分なコア濃度および価をサンプリングするため、ｓｓｐＢ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびｉＬＩＤ－ｍＧＦＰ化学量論に関して高い可変性を特徴としなければならない。両方の構成要素に関して、広い濃度範囲を達成するため、アレイ化レンチウイルスアプローチを用いて、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）中で、Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞を形質導入した。このプロトコルにおいて、横列は２～６０ｐＬ ｉＬＩＤ－ＧＦＰ－Ｆｅレンチウイルスで多様であり；縦列は、２～６０ｐＬ ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ－オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）／ＯＲＦ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢレンチウイルスであった。Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞をアレイ化レンチウイルスに直接プレーティングして、プラスチック支持体への続く付着に際して、～２５％集密度を達成した。７２時間後、集密時に、個々のコアレット条件と関連した１６のウェルすべてを、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、新鮮な培地でクエンチし、そして合わせて、したがって、非常に多様なｉＬＩＤ対ｓｓｐＢ比の多様な細胞集団であることを確実にした。フィブロネクチンコーティングしたガラス底９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）上に１：８希釈係数で細胞をプレーティングして、そして４８時間後、６０～９０％集密度で画像化した。
［０１３９］細胞内状態図のための正確な相閾値境界を決定するため、分析する細胞は、十分なコア濃度および価をサンプリングするため、ｓｓｐＢ－ｍＣｈｅｒｒｙおよびｉＬＩＤ－ｍＧＦＰ化学量論に関して高い可変性を特徴としなければならない。両方の構成要素に関して、広い濃度範囲を達成するため、アレイ化レンチウイルスアプローチを用いて、９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）中で、Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞を形質導入した。このプロトコルにおいて、横列は２～６０ｐＬ ｉＬＩＤ－ＧＦＰ－Ｆｅレンチウイルスで多様であり；縦列は、２～６０ｐＬ ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢ－オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）／ＯＲＦ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢレンチウイルスであった。Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞をアレイ化レンチウイルスに直接プレーティングして、プラスチック支持体への続く付着に際して、～２５％集密度を達成した。７２時間後、集密時に、個々のコアレット条件と関連した１６のウェルすべてを、ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、新鮮な培地でクエンチし、そして合わせて、したがって、非常に多様なｉＬＩＤ対ｓｓｐＢ比の多様な細胞集団であることを確実にした。フィブロネクチンコーティングしたガラス底９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）上に１：８希釈係数で細胞をプレーティングして、そして４８時間後、６０～９０％集密度で画像化した。
【0090】
［０１４０］状態図の生成に向けて収集したすべてのデータに関して、標準化画像化プロトコルを用いて、顕微鏡設定の改変に関連する混乱を回避した。蛍光相関分光法（ＦＣＳ）に基づく較正（蛍光対絶対濃度）に関して、同一の画像化設定を用いた（定量化および統計分析を参照されたい）。特に、秒あたり０．５フレームのスキャン速度、１０２４ｘ１０２４ピクセルフレーム、および１．７５ｘ Ｎｙｑｕｉｓｔズーム（６３ｘ油浸レンズ）を用いて画像を収集した。レーザー出力（１％４８８および１００％５４６）、強度、およびゲインは一定に保った。すべてのタイムラプスは長さ５分間であり、そしてフレーム獲得間の６秒間間隔を特徴とした。最後のフレーム後、４つのさらなるフレームに関してはレーザー強度を低下させ、その後、より高い相対レーザー強度で４つの最終画像を獲得した。
【0091】
［０１４１］広いダイナミックレンジを達成するため（例えば、より高いシグナル対ノイズを特徴とする、より低濃度の細胞の十分な解像度を達成するため）、そして高密度の例外的に明るい点を引き起こすコアレットの場合、ピクセル飽和を回避するため、このプロトコルを選択した。この標準化プロトコルを用いて、各５分間の獲得は、状態図に（平均して）１０のデータポイントを付加することが可能であった。したがって、この研究において用いられる平均状態図は、２０～３０視野の収集、または～２時間のデータ獲得時間を必要とした。典型的には、個々の状態図は、３～５の実験（すなわち異なる日の異なるレンチウイルス形質導入）の経過に渡って収集されたデータからコンパイルされた。しかし、特定の状態図は、有意により多くの実験からのデータを特徴とした（例えば、品質管理を確実にする、研究全体に渡る薬剤処理の効果に関する陽性対照として用いられる条件である、Ｇ３ＢＰ ＡＮＴＦ２コアレット）。
【0092】
［０１４２］研究期間全体で、薬剤反応、薬剤有効性、または蛍光強度測定に関して、体系的な変化の徴候はなかった。分析用の細胞を選択する際、完全に活性化された細胞（すなわち全細胞が視野内にある）のみを考慮して、局所活性化および拡散性捕捉に関する潜在的なアーチファクトを回避した（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）。第一のフレーム（すなわち関心対象のｓｓｐＢタグ化タンパク質への、コア上のｉＬＩＤの青色光仲介性二量体化の前）、および均一な蛍光を特徴とする細胞質領域（すなわち小胞体のような膜結合オルガネラが低密度である領域）における関心対象の４．５ｘ４．５ｐｍ平方領域（ＲＯＩ）の手動画像セグメント化を用いて、細胞に関する平均ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰ蛍光強度を決定した。次いで、前述のＦＣＳ検量線（図１８）を用いて、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰ濃度を決定した。ｍＧＦＰ濃度を２４（フェリチン複合体または「コア」あたりのサブユニット）で割り、コア濃度を決定した。ｍＣｈｅｒｒｙ値をコア値で割ることによって、個々の細胞に関して、価を決定した。
【0093】
［０１４３］これは、てこの原理（ｌｅｖｅｒ ｒｕｌｅ）に基づく非常に正確な測定である－「一構成要素」システム（すなわち、最小限の内因性タンパク質、核酸を特徴とするＦＵＳ ＩＤＲコアレット）では、最初の、希釈した、および凝縮された相の間での価の一貫性が信頼性を持って観察される。関心対象の細胞におけるコアレット仲介性相分離に関するバイナリー決定は、手動で決定された。状態図の続く自動化生成に用いたデータセットおよび状態図はコード化され、そして別個の個人に送られた。
【0094】
［０１４４］薬剤処理後のサイクリング実験
［０１４５］軽微な変化を加えて、状態図データ収集に記載するように、サイクリング実験を行った。示すｓｓｐＢ／ｉＬＩＤコアレットを発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞を亜ヒ酸塩（または示す薬剤）で処理した後、データ獲得を直ちに開始した。大部分の実験に関しては、５分間の活性化タイムラプスを各サイクルに関して獲得し、直後に脱活性化のための５分間のタイムラプスが続いた。本発明者らは、コアレットシステムにおける多様なタンパク質の研究に基づいて、この脱活性化時間が、完全な可逆性のために必要であるもの（すなわち典型的には３０～６０秒）をはるかに超えていることを決定した。示すサイクリングパラメータを６～８回反復した。特定の実験において、その代わり、１０分間の活性化タイムラプスの直後に、脱活性化のための５分間のタイムラプスが続いた。これを４回反復した。間隔は、６秒間で一定に維持された。標準的なコア濃度（０．２５μＭ）および所望の価に基づいて、代表的な細胞／視野をデータ分析のために選択した。
［０１４５］軽微な変化を加えて、状態図データ収集に記載するように、サイクリング実験を行った。示すｓｓｐＢ／ｉＬＩＤコアレットを発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞を亜ヒ酸塩（または示す薬剤）で処理した後、データ獲得を直ちに開始した。大部分の実験に関しては、５分間の活性化タイムラプスを各サイクルに関して獲得し、直後に脱活性化のための５分間のタイムラプスが続いた。本発明者らは、コアレットシステムにおける多様なタンパク質の研究に基づいて、この脱活性化時間が、完全な可逆性のために必要であるもの（すなわち典型的には３０～６０秒）をはるかに超えていることを決定した。示すサイクリングパラメータを６～８回反復した。特定の実験において、その代わり、１０分間の活性化タイムラプスの直後に、脱活性化のための５分間のタイムラプスが続いた。これを４回反復した。間隔は、６秒間で一定に維持された。標準的なコア濃度（０．２５μＭ）および所望の価に基づいて、代表的な細胞／視野をデータ分析のために選択した。
【0095】
［０１４６］Ｇ３ＢＰレスキュー競合、およびストレス顆粒阻害実験
［０１４７］Ｇ３ＢＰレスキュー競合実験のため、状態図データ収集において記載したものと同一のアレイ化レンチウイルスアプローチを用いた（すなわち、２～６０ｐＬ Ｇ３ＢＰｍＣｈｅｒｒｙおよび２～６０ｐＬ ｍＧＦＰ－ＯＲＦ、９６ウェルプレートのアレイ化４ウェルｘ４ウェル、総数１６ウェル）。Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞をレンチウイルス内にプレーティングし、次いで合わせ、そして７２時間後に継代した。
［０１４７］Ｇ３ＢＰレスキュー競合実験のため、状態図データ収集において記載したものと同一のアレイ化レンチウイルスアプローチを用いた（すなわち、２～６０ｐＬ Ｇ３ＢＰｍＣｈｅｒｒｙおよび２～６０ｐＬ ｍＧＦＰ－ＯＲＦ、９６ウェルプレートのアレイ化４ウェルｘ４ウェル、総数１６ウェル）。Ｇ３ＢＰ ＫＯ細胞をレンチウイルス内にプレーティングし、次いで合わせ、そして７２時間後に継代した。
【0096】
［０１４８］形質導入５日後に生存細胞共焦点顕微鏡検査を行った。各条件に関して（関心対象のＧＦＰタグ化タンパク質）、多数の技術的複製（視野）を伴い、別個の３日に、４回の別個の実験（各実験＝１ウェル／亜ヒ酸処理）を行った。亜ヒ酸処理の１～２時間後、生存共焦点画像化を行った。状態図に関するものと同様に、ｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰ濃度を決定し、そしてストレス顆粒非存在または存在の手動スコア付けを行った。類似のプロトコルを用いて、競合の非存在下でのレスキューを評価した。
【0097】
［０１４９］ストレス顆粒阻害実験に関して、ＹＢＸ１－ｍＣｈｅｒｒｙ（ＳＧマーカー）を安定発現するＷＴ Ｕ２０Ｓ細胞を、２５％集密で９６ウェルプレートにプレーティングし、そして示すｍＧＦＰタグ化タンパク質の２～６０μＬのレンチウイルスを、アレイ化形式で形質導入した。３日後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、合わせ、そして継代した。この３日後、細胞をフィブロネクチンでコーティングした９６ウェルプレート上に継代した。２日後（すなわち、レンチウイルス形質導入の８日後）、細胞が６０～８０％集密の際、生存細胞共焦点画像化を行った。亜ヒ酸処理の１～２時間後の間に画像を撮影した。実験あたり、多数の技術的複製（すなわち視野）を伴い、別個の２日に、各条件に関して、３～４回の独立の実験を行った。ｍＧＦＰタグ化タンパク質の濃度を決定し、ＳＧ形成をバイナリー方式で評価し、そしてすべてのデータをコード化し、次いで、定量的分析のため、別個の個人に送った。
【0098】
［０１５０］ストレス顆粒分配
［０１５１］ストレス顆粒分配実験に関して、ｍＧＦＰ－ＣＡＰＲＩＮ１またはｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＰＲＩＮ１を安定発現するＷＴ Ｕ２０Ｓ細胞を、２５％集密で９６ウェルプレートにプレーティングし、そして３０ｐＬの示すｍＣｈｅｒｒｙタグ化レンチウイルス（ｍＧＦＰ－ＣＡＰＲＩＮ１）またはｍＧＦＰタグ化レンチウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＰＲＩＮ１細胞）のいずれかを形質導入した。３日後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、ビンに入れ（ｂｉｎｎｉｎｇ）、そしてフィブロネクチンコーティングした９６ウェルプレート上に継代した。２日後、細胞が６０～８０％集密の際、画像化を行った。亜ヒ酸処理の１～２時間後の間に画像を撮影した。各条件に関して３回の独立の実験を行った。
［０１５１］ストレス顆粒分配実験に関して、ｍＧＦＰ－ＣＡＰＲＩＮ１またはｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＰＲＩＮ１を安定発現するＷＴ Ｕ２０Ｓ細胞を、２５％集密で９６ウェルプレートにプレーティングし、そして３０ｐＬの示すｍＣｈｅｒｒｙタグ化レンチウイルス（ｍＧＦＰ－ＣＡＰＲＩＮ１）またはｍＧＦＰタグ化レンチウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙ－ＣＡＰＲＩＮ１細胞）のいずれかを形質導入した。３日後、細胞を洗浄し、トリプシン処理し、ビンに入れ（ｂｉｎｎｉｎｇ）、そしてフィブロネクチンコーティングした９６ウェルプレート上に継代した。２日後、細胞が６０～８０％集密の際、画像化を行った。亜ヒ酸処理の１～２時間後の間に画像を撮影した。各条件に関して３回の独立の実験を行った。
【0099】
［０１５２］共局在コアレット研究は、「状態図データ収集」と類似のプロトコルにしたがったが、示すＧＦＰタグ化タンパク質を安定発現するＧ３ＢＰ ＫＯ細胞に対して、２つのレンチウイルスの同時形質導入（典型的なＧＦＰタグ化型の代わりに、非蛍光ｉＬＩＤ－Ｆｅで）を用いて行った。感染７２時間後、１：８の希釈係数で、フィブロネクチンコーティングしたガラス底９６ウェルプレート（Ｃｅｌｌｖｉｓ）上に継代した。４８時間後、亜ヒ酸塩（４００μＭ）で処理した。１時間後、加湿インキュベーターからプレートを取り出し、そして青色ＬＥＤ光発光装置（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＳａｆｅＩｍａｇｅｒ ２．０）に１０分間乗せて、コアレットを活性化した。直ちに、４パーセントＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、そして氷冷７０％メタノールで１０分間透過処理した。ＰＢＳでさらに２回洗浄し、次いで４℃で一晩置いた。翌日、固定細胞共焦点顕微鏡検査を行って、示すＧＦＰタグ化ＳＧ／ＰＢタンパク質とオプトＳＧの共局在を調べた。
【0100】
［０１５３］ＲＮＡ蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ組織化学
［０１５４］示す細胞を４パーセントＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷７０％エタノールで透過処理し、そして－４℃で一晩置いた。エタノールを洗浄緩衝液Ａ（Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ）で置換し、そして室温で５分間インキュベーションした。５ｐＭの５’－Ｃｙ５－オリゴｄ（Ｔ）２０（Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液（Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ）で置換し、そして暗所で１６時間インキュベーションして、ポリアデニル化ｍＲＮＡを探査した。洗浄緩衝液Ａにトランスファーし、３７℃で３０分置き、次いで洗浄緩衝液Ｂで置換し、室温でさらに５分間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄し、そして画像化した。
［０１５４］示す細胞を４パーセントＰＦＡで１０分間固定した。ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷７０％エタノールで透過処理し、そして－４℃で一晩置いた。エタノールを洗浄緩衝液Ａ（Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ）で置換し、そして室温で５分間インキュベーションした。５ｐＭの５’－Ｃｙ５－オリゴｄ（Ｔ）２０（Ｇｅｎｅ Ｌｉｎｋ）を含有するハイブリダイゼーション緩衝液（Ｓｔｅｌｌａｒｉｓ）で置換し、そして暗所で１６時間インキュベーションして、ポリアデニル化ｍＲＮＡを探査した。洗浄緩衝液Ａにトランスファーし、３７℃で３０分置き、次いで洗浄緩衝液Ｂで置換し、室温でさらに５分間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄し、そして画像化した。
【0101】
［０１５５］Ｇ３ＢＰ１／２レベルおよびノックアウトヒト細胞を評価するためのウェスタンブロット
［０１５６］６ウェルプレート由来のＵ２０Ｓ ＷＴ、Ｕ２０Ｓ Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ、ＨＥＫ２９３、またはＨｅＬａ細胞を洗浄し、トリプシン処理し、培地でクエンチし、そして５００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、そしてフラッシュ凍結した。溶解直前に、細胞を氷上で融解し、そして１５０μＬ ２ｘＮｕａｇｅ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液／還元剤中に再懸濁し、超音波処理し、そして１００℃で５分間煮沸した。５０ｎｇの以下の組換えタンパク質を、陽性対照としての細胞溶解物とともに用いた：Ｇ３ＢＰ１（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ１－５０９２５－５０ＵＧ）、Ｇ３ＢＰ２（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ１－７８８４３－１００ＵＧ）。
［０１５６］６ウェルプレート由来のＵ２０Ｓ ＷＴ、Ｕ２０Ｓ Ｇ３ＢＰ１／２ ＫＯ、ＨＥＫ２９３、またはＨｅＬａ細胞を洗浄し、トリプシン処理し、培地でクエンチし、そして５００ｘｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、そしてフラッシュ凍結した。溶解直前に、細胞を氷上で融解し、そして１５０μＬ ２ｘＮｕａｇｅ（登録商標）ＬＤＳ試料緩衝液／還元剤中に再懸濁し、超音波処理し、そして１００℃で５分間煮沸した。５０ｎｇの以下の組換えタンパク質を、陽性対照としての細胞溶解物とともに用いた：Ｇ３ＢＰ１（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ１－５０９２５－５０ＵＧ）、Ｇ３ＢＰ２（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ１－７８８４３－１００ＵＧ）。
【0102】
［０１５７］試料をＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ １０％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で泳動し、そして製造者のプロトコルの通りに、ＰＶＤＦプレカットブロッティング膜にトランスファーした。ＴＢＳＴ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｔｗｅｅｎ－２０）中の５％ＮＦＤＭ中で揺動しながら４℃で一晩、膜をブロッキングした。揺動しながら４℃で一晩、ブロッキング溶液中の以下の一次抗体で膜を探査した：Ｇ３ＢＰ１（マウスモノクローナル、ＡｂＣａｍ ａｂ８６１３５、１：３００）、Ｇ３ＢＰ２（ウサギポリクローナル、Ａｂｅａｍ ａｂ８６１３５、１：５０００）、ベータアクチン（ウサギポリクローナル、ＡｂＣａｍ ａｂ８２２７、１：１０，０００）。翌日、膜を多数回洗浄し、そして次いで揺動しながら室温で３０分間、ブロッキング溶液中の以下の二次抗体とインキュベーションした：ペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－０６２、１：１０，０００）、ペルオキシダーゼ－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、１１５－０３５－１４４、１：１０，０００）。続いて、多数回の洗浄を行った後、製造者の指示にしたがって、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌＴＭ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ化学発光基質を用いて、膜を現像した。
【0103】
［０１５８］免疫沈降
［０１５９］ほぼ集密な細胞の１５０ｍｍプレートを、示すように処理し、冷Ｈａｎｋｓ塩基性塩溶液で洗浄し、そして１ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ＥＤＴＡ不含）、ＨＡＬＴホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）、および２０ｐｇ／ｎＬ ＲＮアーゼＡを含有する溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ ０．５％ＮＰ－４０、１０％グリセロール）内に、４℃で掻き取って採取した。細胞を４℃で３０分間回転させ、遠心分離（５，０００ｒｐｍで５分間）によって清澄にし、そして上清を取り除き、次いで、４℃で連続回転しながら、Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ－ＧＦＰ－Ｔｒａｐ（登録商標）ビーズ（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベーションした。ビーズを５回洗浄し、そしてＲＮアーゼ処理で、ＳＤＳ－溶解緩衝液内に直接溶出させるか、または回転しながら４℃で１時間、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ＮＰ４０、０．５％ＤＯＣ、０．０５％ＳＤＳ）中に抽出した。ＲＩＰＡ緩衝液によって放出された物質を回収し、そして６０％アセトンで沈殿させた。ＲＩＰＡ抽出後のビーズは、「高アフィニティ」と示される結合した物質を含有し、これは還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ溶解緩衝液中で加熱することによって放出された。４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でタンパク質を分離し、そしてＴｒａｎｓｆｅｒ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏトランスファーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ニトロセルロース膜にトランスファーし、そして上述のような標準的方法を用いてブロッティングした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、化学発光を検出した。
［０１５９］ほぼ集密な細胞の１５０ｍｍプレートを、示すように処理し、冷Ｈａｎｋｓ塩基性塩溶液で洗浄し、そして１ｍＭ ＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ ＥＤＴＡ不含）、ＨＡＬＴホスファターゼ阻害剤（Ｐｉｅｒｃｅ）、および２０ｐｇ／ｎＬ ＲＮアーゼＡを含有する溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ ０．５％ＮＰ－４０、１０％グリセロール）内に、４℃で掻き取って採取した。細胞を４℃で３０分間回転させ、遠心分離（５，０００ｒｐｍで５分間）によって清澄にし、そして上清を取り除き、次いで、４℃で連続回転しながら、Ｃｈｒｏｍｏｔｅｋ－ＧＦＰ－Ｔｒａｐ（登録商標）ビーズ（Ａｌｌｅｌｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とインキュベーションした。ビーズを５回洗浄し、そしてＲＮアーゼ処理で、ＳＤＳ－溶解緩衝液内に直接溶出させるか、または回転しながら４℃で１時間、ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ ＴＲＩＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％ＮＰ４０、０．５％ＤＯＣ、０．０５％ＳＤＳ）中に抽出した。ＲＩＰＡ緩衝液によって放出された物質を回収し、そして６０％アセトンで沈殿させた。ＲＩＰＡ抽出後のビーズは、「高アフィニティ」と示される結合した物質を含有し、これは還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ溶解緩衝液中で加熱することによって放出された。４～２０％Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸプレキャストゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上でタンパク質を分離し、そしてＴｒａｎｓｆｅｒ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏトランスファーシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて、ニトロセルロース膜にトランスファーし、そして上述のような標準的方法を用いてブロッティングした。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、化学発光を検出した。
【0104】
［０１６０］Ｃａｓ９欠失細胞株
［０１６１］各ターゲット配列を対のＤＮＡオリゴ（センス／アンチセンス対）としてＩＤＴから購入し、アニーリングし、そしてｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）内に連結したが、ＵＢＡＰ２は例外であった。プラスミド挿入物を配列決定によって検証し、そしてピューロマイシン耐性をコードするｐＤｏｎｏｒ－Ｄ０９（Ｏｒｉｇｅｎｅ）とともに細胞内に同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、ピューロマイシン（２ｐｇ／ｍＬ）中の短時間（２４時間）選択に供し、そして２日間またはそれより長く回復させた後、示す抗体および免疫蛍光を用いて評価した。限界希釈によって細胞をクローニングし、そして免疫染色およびウェスタンブロッティングの両方を用いてクローンを検証した。単一ＫＯ株に関して、親細胞株は、ｔｅｔリプレッサーを発現するＵ２０Ｓであった（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）。以前特徴づけられた二重（Ｇ３ＢＰ１／Ｇ３ＢＰ２）ＫＯ細胞（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）において、ＣＡＰＲＩＮ１およびＵＳＰ１０を個々にノックアウトした。
［０１６１］各ターゲット配列を対のＤＮＡオリゴ（センス／アンチセンス対）としてＩＤＴから購入し、アニーリングし、そしてｐＣａｓ－Ｇｕｉｄｅ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）内に連結したが、ＵＢＡＰ２は例外であった。プラスミド挿入物を配列決定によって検証し、そしてピューロマイシン耐性をコードするｐＤｏｎｏｒ－Ｄ０９（Ｏｒｉｇｅｎｅ）とともに細胞内に同時トランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を、ピューロマイシン（２ｐｇ／ｍＬ）中の短時間（２４時間）選択に供し、そして２日間またはそれより長く回復させた後、示す抗体および免疫蛍光を用いて評価した。限界希釈によって細胞をクローニングし、そして免疫染色およびウェスタンブロッティングの両方を用いてクローンを検証した。単一ＫＯ株に関して、親細胞株は、ｔｅｔリプレッサーを発現するＵ２０Ｓであった（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）。以前特徴づけられた二重（Ｇ３ＢＰ１／Ｇ３ＢＰ２）ＫＯ細胞（Ｋｅｄｅｒｓｈａら、２０１６）において、ＣＡＰＲＩＮ１およびＵＳＰ１０を個々にノックアウトした。
【0105】
［０１６２］Ｕ２０ＳＡＦＦＦ細胞株を生成するため、ＦＸＲ２をまずノックアウトし、クローンを選択し、そして免疫蛍光およびウェスタンブロッティングによって、ＦＸＲ２タンパク質発現を評価した。次いで、クローン６を、ＦＸＲ１およびＦＭＲ１をターゲティングするガイドＲＮＡで同時トランスフェクションした。類似の方式で、クローンを選択し、そしてスクリーニングし、そして最後に三重ヌル株を得た。すべての遺伝子座を配列決定して、ＤＮＡ中の欠失を確認した。
【0106】
［０１６３］ＵＢＡＰ２／ＵＢＡＰ２Ｌ二重ＫＯの場合、検証されたＵＢＡＰ２Ｌ単一ＫＯ細胞を、９６ウェルプレート中、２００μＬのｐＣＲＩ８ＰＲｖ２－ＵＢＡＰ２ ｇＲＮＡ（プール、６つのｇＲＮＡ）または２００ｐＬのｐＣＲＩＳＰＲｖ２－非ターゲットｇＲＮＡ（Ｓｈａｌｅｍら、２０１４）にプレーティングした。７２時間後、集密細胞を洗浄し、トリプシン処理し、そして２００ｐＬの同じレンチウイルスを含有する新規ウェル内に継代した。
【0107】
［０１６４］細胞を３回継代し、そしてＫＯの成功に関して、ＵＢＡＰ２に対する２つの抗体で検証して調べ、～３０パーセントの細胞が非常に低いかまたは検出不能なレベルのＵＢＡＰ２を特徴とすることが示された（非ターゲット対照において、１００％の細胞がＬＩＢＡＰ２染色を示した）。９６ウェルから２４ウェル、次いで９６ウェルの連続継代によって、細胞を１週間に渡って増幅させた。９６ウェルで集密に到達したら、細胞を３つの別個の９６ウェルプレートに限界希釈で継代し、したがって、各ウェルは、細胞を受け取る～５０％の確率を特徴とした。１０日後、ウェルの～２０～３０％でコロニーが見られた。非ターゲット対照に関しては、６つのウェルを採取し、そして継代した；候補ＵＢＡＰ２／２Ｌ二重ＫＯ、５０の別個の株。
【0108】
［０１６５］さらに～２週間継代しそして増殖させた後、候補ＫＯ株（および非ターゲット対照）をフィブロネクチンで覆ったガラス（９６ウェルプレート）上にプレーティングした。２４時間後、細胞は～６０～８０％集密であった。細胞を４％ＰＦＡで固定し、氷冷メタノールで５分間透過処理し、そして免疫組織化学を行った（抗ＵＢＡＰ２、抗Ｇ３ＢＰ１）。非ターゲット対照において、大部分の細胞はＧ３ＢＰ陽性ストレス顆粒を特徴としたが、これらは対照条件（すなわち非ＵＢＡＰ２Ｌ ＫＯ）よりわずかに小さく、この結果は複数の研究室に渡って検証された（データ未提示）。４つの候補ＵＢＡＰ２／２Ｌ二重ＫＯ株は、免疫蛍光によってＵＢＡＰ２が検出不能であることを特徴とした。これらの例において、Ｇ３ＢＰ陽性ＳＧは、～３０％の細胞のみに存在し、そしてこれらは、ＷＴまたはＵＢＡＰ２Ｌ単一ＫＯにおけるよりもはるかにサイズが小さかった。ＵＢＡＰ２およびＵＢＡＰ２Ｌの二重ノックアウトをウェスタンブロットによって検証した。
【0109】
［０１６６］Ｃａｓ９突然変異細胞株の遺伝子型決定
［０１６７］コード配列におけるすべてのＫＯ細胞株のＣａｓ９誘導性突然変異を同定するため、特定のガイド配列によってターゲティングされる領域を取り巻く、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーセットを用いて、ゲノム増幅を行った。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＧＣリッチＤＮＡポリメラーゼ（緩衝液Ａ）を用いて、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲを行った。ＤＮＡをまず、９５℃で３分間変性させた後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、および７２℃で１分間伸長の３０サイクルを行った。最後の伸長を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲアンプリコンを直接配列決定した。多数配列（すなわち多数アレル）の証拠がある場合、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物をアデニル化し、そしてＰｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクター内にクローニングし；個々のクローンを得て、そして配列決定した。
［０１６７］コード配列におけるすべてのＫＯ細胞株のＣａｓ９誘導性突然変異を同定するため、特定のガイド配列によってターゲティングされる領域を取り巻く、入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーセットを用いて、ゲノム増幅を行った。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＡｃｃｕＰｒｉｍｅ ＧＣリッチＤＮＡポリメラーゼ（緩衝液Ａ）を用いて、ゲノムＤＮＡ ＰＣＲを行った。ＤＮＡをまず、９５℃で３分間変性させた後、９５℃で３０秒間変性、６０℃で３０秒間アニーリング、および７２℃で１分間伸長の３０サイクルを行った。最後の伸長を７２℃で１０分間行った。ＰＣＲアンプリコンを直接配列決定した。多数配列（すなわち多数アレル）の証拠がある場合、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲ産物をアデニル化し、そしてＰｒｏｍｅｇａ ｐＧＥＭ（登録商標）－Ｔ Ｅａｓｙベクター内にクローニングし；個々のクローンを得て、そして配列決定した。
【0110】
［０１６８］二重陽性Ｕ２０Ｓ安定細胞株
［０１６９］ｔｅｔリプレッサーを含有する（Ｇ３ＢＰ１／Ｇ３ＢＰ２）ＫＯ細胞内に、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｇ３ＢＰ１－Ｃ１をトランスフェクションすることによって、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｇ３ＢＰ１を恒常性に発現するクローン細胞株を作製し、Ｇ４１８（５００ｐｇ／ｍＬ）を用いて選択し、そしてクローニングした。この株を用いて、ｐｃＤＮＡ４ ｔ／ｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ｔｅｔ誘導性ＧＦＰタグ化タンパク質（Ｇ３ＢＰ１ ＷＴ、Ｇ３ＢＰ１ Ｓ３８Ｆ、Ｇ３ＢＰ１ Ｆ３３Ｗ、およびＵＢＡＰ２Ｌ ＷＴ）を発現する二重陽性細胞を作製し、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０ｐｇ／ｍＬ）を用いて選択した。
［０１６９］ｔｅｔリプレッサーを含有する（Ｇ３ＢＰ１／Ｇ３ＢＰ２）ＫＯ細胞内に、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｇ３ＢＰ１－Ｃ１をトランスフェクションすることによって、ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｇ３ＢＰ１を恒常性に発現するクローン細胞株を作製し、Ｇ４１８（５００ｐｇ／ｍＬ）を用いて選択し、そしてクローニングした。この株を用いて、ｐｃＤＮＡ４ ｔ／ｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ｔｅｔ誘導性ＧＦＰタグ化タンパク質（Ｇ３ＢＰ１ ＷＴ、Ｇ３ＢＰ１ Ｓ３８Ｆ、Ｇ３ＢＰ１ Ｆ３３Ｗ、およびＵＢＡＰ２Ｌ ＷＴ）を発現する二重陽性細胞を作製し、ゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０ｐｇ／ｍＬ）を用いて選択した。
【0111】
［０１７０］定量化および統計分析
［０１７１］蛍光相関分光法
［０１７２］軽微な修飾を伴い、以前記載されたように（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）行う蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いて、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光値を絶対濃度に変換した。３０秒間のＦＣＳ測定時間で、示す蛍光融合タンパク質の拡散および濃度に関するデータを得た。
［０１７１］蛍光相関分光法
［０１７２］軽微な修飾を伴い、以前記載されたように（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）行う蛍光相関分光法（ＦＣＳ）を用いて、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ蛍光値を絶対濃度に変換した。３０秒間のＦＣＳ測定時間で、示す蛍光融合タンパク質の拡散および濃度に関するデータを得た。
【0112】
［０１７３］別個にｉＬＩＤ－ｍＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢを発現するＵ２０Ｓ Ｇ３ＢＰ１／２二重ＫＯ細胞集団に対して測定を行い、融合タンパク質は、こうした非天然融合タンパク質が単量体であり、そして主要な内因性結合パートナーがないことを特徴とするという仮定に基づいて選択されるよう条件づけられる。油浸対物レンズ（Ｐｌａｎ Ａｐｏ ６０Ｘ／１．４開口数、Ｎｉｋｏｎ）を備えたＮｉｋｏｎ Ａ１レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いて、画像を撮影した。ＳｙｍＰｈｏＴｉｍｅソフトウェア（ＰｉｃｏＱｕａｎｔ）を用いて、すべての測定およびデータ分析を行った。
【0113】
［０１７４］単純拡散に関する自己相関関数は以下の通りである：
【0114】
【化1】
【0115】
［０１７５］上記等式中の変数は、以下のように定義される：Ｇ（０）は、短時間規模での度合いであり；τはラグタイムであり；τＤは半減衰時間であり；そしてκは測定体積の軸方向対径方向（ａｘｉａｌ ｔｏ ｒａｄｉａｌ）比であり、
【0116】
【化2】
【0117】
である。ここでωｘｙ＝０．１９ｐｍであり、そしてκ＝５．１であり、これは水中のフルオロフォア色素Ａｌｅｘａ ４８８によって決定される。パラメータτＤおよびＧ（０）は、適合するように最適化され、そして拡散係数
【0118】
【化3】
【0119】
および分子濃度
【0120】
【化4】
【0121】
を決定するために用いられる。
［０１７６］ＷＴおよびＧ３ＢＰ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰタグ化融合タンパク質の濃度を定量的に概算するすべての実験に関して、図１８に示す蛍光対濃度の検量線を用いた。こうしたＦＣＳ検量線は、こうした概算の正確性を裏付けるいくつかの知見を生じた：
［０１７７］（Ａ）独立に行われるｍＣｈｅｒｒｙ ＦＣＳ実験は、＜５％異なる濃度概算を生じた（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）。さらに、前述の研究は、自己触媒性Ｐ２Ａシステムを用いて、等モル比でｍＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを同時発現し、ＧＦＰ濃度を、ｍＣｈｅｒｒｙに関して決定されたＦＣＳ検量線から外挿した。この間接的に外挿された検量線はＧＦＰ濃度を予測し、これは本研究で用いた独立に得られた較正および概算から＜２０％の相違であった。
［０１７６］ＷＴおよびＧ３ＢＰ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰタグ化融合タンパク質の濃度を定量的に概算するすべての実験に関して、図１８に示す蛍光対濃度の検量線を用いた。こうしたＦＣＳ検量線は、こうした概算の正確性を裏付けるいくつかの知見を生じた：
［０１７７］（Ａ）独立に行われるｍＣｈｅｒｒｙ ＦＣＳ実験は、＜５％異なる濃度概算を生じた（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）。さらに、前述の研究は、自己触媒性Ｐ２Ａシステムを用いて、等モル比でｍＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙを同時発現し、ＧＦＰ濃度を、ｍＣｈｅｒｒｙに関して決定されたＦＣＳ検量線から外挿した。この間接的に外挿された検量線はＧＦＰ濃度を予測し、これは本研究で用いた独立に得られた較正および概算から＜２０％の相違であった。
【0122】
［０１７８］（Ｂ）Ｇ３ＢＰ欠損のレスキューに必要とされるＵＳＰ１０およびＧ３ＢＰの間の化学量論を定量化する傾斜は、驚くほど１に近く（～０．９８）、これは、そのＫｄよりはるかに大きい濃度で示される、こうした競合的阻害剤に関する予測値であり、そして異なる強い阻害剤（ＵＳＰ１０ ＮＩＭｘ１およびＣＡＰＲＩＮ１ １～３８６）に関するほぼ同等の傾斜によってさらに確認された；
［０１７９］（Ｃ）Ｕ２０Ｓ細胞におけるＧ３ＢＰ１／２の濃度は、レスキューのためのＧ３ＢＰ濃度（６２０ｎＭ）（別個の実験において確認された値は、この値の５０ｎＭ以内であった）およびＳＧ阻害のためのＵＳＰ１０（１５６０ｎＭ）を添加して、Ｕ２０Ｓ細胞の細胞質における～２１８０ｎＭ Ｇ３ＢＰ濃度を外挿することによって外挿された。この値は、ＨｅＬａ細胞において独立に得られた質量分析値（Ｈｅｉｎら、２０１５）とほぼ等しく、そしてウェスタンブロットは、２つの細胞株間で類似のレベルであることを確認する；
［０１８０］（Ｄ）ｍＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１およびＧ３ＢＰ１－ｍＣｈｅｒｒｙは、非常に類似のＳＧレスキュー濃度閾値（すなわち、互いの５０ｎＭ以内）を特徴とする。
［０１７９］（Ｃ）Ｕ２０Ｓ細胞におけるＧ３ＢＰ１／２の濃度は、レスキューのためのＧ３ＢＰ濃度（６２０ｎＭ）（別個の実験において確認された値は、この値の５０ｎＭ以内であった）およびＳＧ阻害のためのＵＳＰ１０（１５６０ｎＭ）を添加して、Ｕ２０Ｓ細胞の細胞質における～２１８０ｎＭ Ｇ３ＢＰ濃度を外挿することによって外挿された。この値は、ＨｅＬａ細胞において独立に得られた質量分析値（Ｈｅｉｎら、２０１５）とほぼ等しく、そしてウェスタンブロットは、２つの細胞株間で類似のレベルであることを確認する；
［０１８０］（Ｄ）ｍＧＦＰ－Ｇ３ＢＰ１およびＧ３ＢＰ１－ｍＣｈｅｒｒｙは、非常に類似のＳＧレスキュー濃度閾値（すなわち、互いの５０ｎＭ以内）を特徴とする。
【0123】
［０１８１］画像分析
［０１８２］手動画像セグメント化（ＩｍａｇｅＪ）、ＩｍａｇｅＪにおけるカスタム半自動化ワークフロー、およびＭＡＴＬＡＢ ２０１８ｂの組み合わせを用いて、すべての画像を分析した。すべての実験において、関心対象の領域をＩｍａｇｅＪ中で選択し、そして前述のＦＣＳ較正を用いて、平均細胞質強度を計算した。ストレス顆粒の存在は、サイクリング実験以外の場合、ストレスの非存在下では細胞質における拡散分布を特徴とする、ストレス顆粒のマーカーとの共局在に基づく手動スコア化によって決定された。
［０１８２］手動画像セグメント化（ＩｍａｇｅＪ）、ＩｍａｇｅＪにおけるカスタム半自動化ワークフロー、およびＭＡＴＬＡＢ ２０１８ｂの組み合わせを用いて、すべての画像を分析した。すべての実験において、関心対象の領域をＩｍａｇｅＪ中で選択し、そして前述のＦＣＳ較正を用いて、平均細胞質強度を計算した。ストレス顆粒の存在は、サイクリング実験以外の場合、ストレスの非存在下では細胞質における拡散分布を特徴とする、ストレス顆粒のマーカーとの共局在に基づく手動スコア化によって決定された。
【0124】
［０１８３］手動画像セグメント化
［０１８４］細胞に関するｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰの平均蛍光強度を用いて、会合する融合タンパク質の濃度を概算した。蛍光の均質な分布を特徴とする細胞質領域（すなわち小胞体のような膜結合オルガネラが低密度である領域）における４．５ｘ４．５ｐｍ平方ＲＯＩを描く手動画像セグメント化を用いることによって、これを決定した。次いで、前述のＦＣＳ検量線を用いて、タンパク質濃度を決定した。コアレットを伴わない実験に関して、ストレス顆粒の存在または非存在を手動で注釈付けした。状態図の目的のため、５分間の活性化時間経過（６秒間間隔）後に巨視的な点が形成されるかどうかを評価することによって、相分離を手動で注釈付けした。完全に活性化された細胞のみが、拡散に基づく捕捉に関連する混乱を回避すると見なされた（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）。
［０１８４］細胞に関するｍＣｈｅｒｒｙおよびｍＧＦＰの平均蛍光強度を用いて、会合する融合タンパク質の濃度を概算した。蛍光の均質な分布を特徴とする細胞質領域（すなわち小胞体のような膜結合オルガネラが低密度である領域）における４．５ｘ４．５ｐｍ平方ＲＯＩを描く手動画像セグメント化を用いることによって、これを決定した。次いで、前述のＦＣＳ検量線を用いて、タンパク質濃度を決定した。コアレットを伴わない実験に関して、ストレス顆粒の存在または非存在を手動で注釈付けした。状態図の目的のため、５分間の活性化時間経過（６秒間間隔）後に巨視的な点が形成されるかどうかを評価することによって、相分離を手動で注釈付けした。完全に活性化された細胞のみが、拡散に基づく捕捉に関連する混乱を回避すると見なされた（Ｂｒａｃｈａら、２０１８）。
【0125】
［０１８５］明暗サイクリング実験
［０１８６］タイムラプス全体で視野中に存続する個々の関心対象領域を手動で選択した。測定されたｍＣｈｅｒｒｙ強度から標準偏差を計算し、そして最初に撮影したフレームでの標準偏差によって標準化した。
［０１８６］タイムラプス全体で視野中に存続する個々の関心対象領域を手動で選択した。測定されたｍＣｈｅｒｒｙ強度から標準偏差を計算し、そして最初に撮影したフレームでの標準偏差によって標準化した。
【0126】
［０１８７］Ｇ３ＢＰ ＫＯ Ｕ２０Ｓ細胞におけるＧ３ＢＰレスキュー競合データ分析
［０１８８］以前記載されるように、手動画像セグメント化を通じて各細胞の濃度を決定し、そしてストレス顆粒の非存在または存在を注釈付けた。データから境界を決定するため、デフォルトソルバを用いて、ＭＡＴＬＡＢ統計および機械学習パッケージにおいて、ｆｉｔｃｓｖｍ（）関数を適用することによって、説明変数として２つの構成要素の濃度を、そして反応変数としてカテゴリー的なストレス顆粒状態を用いて、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を訓練した。簡潔には、サポートベクターマシンは、境界ポイント（「サポートベクター」）に基づいて、データが線形に分離可能であるという仮定で、線形識別境界を構築する。この２次元の場合、傾斜および切片のパラメータを抽出して、ストレス顆粒形成のための最小Ｇ３ＢＰ濃度、ならびに関心対象のタンパク質との相互作用の化学量論を計算した。
［０１８８］以前記載されるように、手動画像セグメント化を通じて各細胞の濃度を決定し、そしてストレス顆粒の非存在または存在を注釈付けた。データから境界を決定するため、デフォルトソルバを用いて、ＭＡＴＬＡＢ統計および機械学習パッケージにおいて、ｆｉｔｃｓｖｍ（）関数を適用することによって、説明変数として２つの構成要素の濃度を、そして反応変数としてカテゴリー的なストレス顆粒状態を用いて、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を訓練した。簡潔には、サポートベクターマシンは、境界ポイント（「サポートベクター」）に基づいて、データが線形に分離可能であるという仮定で、線形識別境界を構築する。この２次元の場合、傾斜および切片のパラメータを抽出して、ストレス顆粒形成のための最小Ｇ３ＢＰ濃度、ならびに関心対象のタンパク質との相互作用の化学量論を計算した。
【0127】
［０１８９］状態図および臨界価（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｖａｌｕｅ）の計算
［０１９０］各状態図に関して、ｉＬＩＤ－ＧＦＰ－ＦｅコアおよびｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢタグ化タンパク質両方の平均濃度を計算し、そしてストレス顆粒を持つかまたは持たないかのカテゴリーに割り当てた。自動化および非バイアス方式で、相閾値境界を決定するため、ＳＶＭリグレッサーを再び用い、カテゴリー的な反応変数としての相分離された構造の存在下で、説明変数としてのコア濃度およびｌｏｇ２変換価を用いた。しかし、データは線形に分離可能ではないため、度数２の多項式カーネルを用いて、相閾値の曲率を説明した。次いで、識別境界を計算するため、状態図の５０ｘ５０グリッドにおけるすべてのポイントで、ＳＶＭのスコアを計算し、そしてＭＡＴＬＡＢのｃｏｎｔｏｕｒＯ関数を用いて、０のスコアを持つポイントを連結して、相閾値に相当する輪郭線を引いた。次いで、ゼロスコア輪郭線を線形に解釈することによって、明記するコア濃度での臨界価に関する特定の値を計算した。
［０１９０］各状態図に関して、ｉＬＩＤ－ＧＦＰ－ＦｅコアおよびｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｐＢタグ化タンパク質両方の平均濃度を計算し、そしてストレス顆粒を持つかまたは持たないかのカテゴリーに割り当てた。自動化および非バイアス方式で、相閾値境界を決定するため、ＳＶＭリグレッサーを再び用い、カテゴリー的な反応変数としての相分離された構造の存在下で、説明変数としてのコア濃度およびｌｏｇ２変換価を用いた。しかし、データは線形に分離可能ではないため、度数２の多項式カーネルを用いて、相閾値の曲率を説明した。次いで、識別境界を計算するため、状態図の５０ｘ５０グリッドにおけるすべてのポイントで、ＳＶＭのスコアを計算し、そしてＭＡＴＬＡＢのｃｏｎｔｏｕｒＯ関数を用いて、０のスコアを持つポイントを連結して、相閾値に相当する輪郭線を引いた。次いで、ゼロスコア輪郭線を線形に解釈することによって、明記するコア濃度での臨界価に関する特定の値を計算した。
【0128】
［０１９１］ＷＴ Ｕ２０Ｓ細胞におけるストレス顆粒集合の阻害のための臨界濃度の概算
各実験に関して、各細胞に関する関心対象のタンパク質濃度を決定し、そしてストレス顆粒の存在をカテゴライズした。細胞がストレス顆粒を有する５０パーセントの確率を有する、関心対象のタンパク質濃度として、阻害またはレスキューの臨界濃度を定義した。特に、平方根数規則を用いて、濃度分布をビニングすることによって、確率密度を計算した。各ビン内で、ストレス顆粒を持つ細胞数をそのビンにおける細胞総数で割って、ストレス顆粒を有する確率を計算した。これは単調関数を生じる；次いで、０，５の確率での値を内挿して、阻害またはレスキューの閾値濃度を決定した。各複製に関してこれを反復し、そして複製間の平均の標準誤差を用いて、エラーバーを決定した。
各実験に関して、各細胞に関する関心対象のタンパク質濃度を決定し、そしてストレス顆粒の存在をカテゴライズした。細胞がストレス顆粒を有する５０パーセントの確率を有する、関心対象のタンパク質濃度として、阻害またはレスキューの臨界濃度を定義した。特に、平方根数規則を用いて、濃度分布をビニングすることによって、確率密度を計算した。各ビン内で、ストレス顆粒を持つ細胞数をそのビンにおける細胞総数で割って、ストレス顆粒を有する確率を計算した。これは単調関数を生じる；次いで、０，５の確率での値を内挿して、阻害またはレスキューの閾値濃度を決定した。各複製に関してこれを反復し、そして複製間の平均の標準誤差を用いて、エラーバーを決定した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
