特許 7460643 遺伝子へのＤＮＡの標的化挿入のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-25

(45)【発行日】2024-04-02

(54)【発明の名称】遺伝子へのＤＮＡの標的化挿入のための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240326BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240326BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240326BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240326BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240326BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240326BHJP

   A61P 25/00 20060101ALN20240326BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/864 100Z

C12N15/861 Z

A61K35/76

A61K48/00

A61P25/00

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2021546192

(86)(22)【出願日】2019-10-14

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-02-07

(86)【国際出願番号】 US2019056083

(87)【国際公開番号】W WO2020081438

(87)【国際公開日】2020-04-23

【審査請求日】2022-10-12

(31)【優先権主張番号】62/746,497

(32)【優先日】2018-10-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/830,654

(32)【優先日】2019-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/864,432

(32)【優先日】2019-06-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】521162883

【氏名又は名称】ブルーアレル， エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】バルテス， ニコラス

【審査官】中野 あい

(56)【参考文献】

【文献】特表２０２０－５３０７６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】Sci Rep，2017年06月23日， vol. 7, no. 1，article no. 4159 (pp. 1-11)

【文献】"Supra-therapeutic levels of transgene expression achieved in vivo by CRISPR/Cas9 mediated targeted gene insertion"，26th Annual Congress of the European Society of Gene and Cell Therapy on 18 OCT 2018，2018年10月18日，pp. 1-15，Scientific Publications & Presentations [online], Intellia Therapeutics, <URL: https://www.intelliatx.com/wp-content/uploads/Intellia_ESGCT_Insertion_FINAL2_10.18.2018.pdf >，[retrieved on 01 OCT 2023] which retrieved from the internet: <URL: https://www.intelliatx.com/our-science/publications-and-presentations/ >

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

導入遺伝子であって、前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスアクセプター配列、
ｉｉ．第１および第２のコード配列、ならびに
ｉｉｉ．第１および第２のターミネーター、
を含み、前記導入遺伝子が、５’から３’の方向へ、前記第１のスプライスアクセプター配列、前記第１のコード配列、前記第１のターミネーター、逆相補の前記第２のターミネーター、逆相補の前記第２のコード配列、および逆相補の前記第２のスプライスアクセプター配列を含み、
前記第１のコード配列が、アミノ酸配列をコードし、前記第２のコード配列が、前記第１のコード配列と同じアミノ酸配列をコードする、導入遺伝子。

【請求項2】

前記導入遺伝子が、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する、請求項１に記載の導入遺伝子。

【請求項3】

前記導入遺伝子が、前記第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右の相同アームをさらに含む、請求項１に記載の導入遺伝子。

【請求項4】

前記導入遺伝子が、前記１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する、請求項３に記載の導入遺伝子。

【請求項5】

前記第１および第２の標的部位が、前記第１および第２の相同アームに隣接する、請求項４に記載の導入遺伝子。

【請求項6】

前記導入遺伝子が、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０によって産生されるペプチドをコードする第１および第２のコード配列を含む、請求項１に記載の導入遺伝子。

【請求項7】

前記導入遺伝子が、非病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４７によって産生されるペプチドをコードする第１および第２のコード配列を含む、請求項１に記載の導入遺伝子。

【請求項8】

前記第１および第２のコード配列が、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードする、請求項１に記載の導入遺伝子。

【請求項9】

前記導入遺伝子が、ベクターに保有され、前記ベクターの形式が、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される、請求項１に記載の導入遺伝子。

【請求項10】

前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される、請求項９に記載の導入遺伝子。

【請求項11】

前記導入遺伝子が、４．７ｋｂ以下のサイズである、請求項１０に記載の導入遺伝子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の参照
本出願は、先の出願および同時係属出願である２０１８年１０月１６日に出願されたＵＳＳＮ６２／７４６，４９７、２０１９年４月８日に出願されたＵＳＳＮ６２／８３０，６５４、および２０１９年６月２０日に出願されたＵＳＳＮ６２／８６４，４３２の利益を主張し、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。当該ＡＳＣＩＩコピーは、２０１９年１０月１４日に作成され、ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＢＡ２０１８－４ＷＯ＿Ｐ１２９８７ＷＯ００．ｔｘｔという名前で、５１７，０３６バイトのサイズである。

【0003】

本文書は、ゲノム編集の分野である。より具体的には、本文書は、レアカッティング（ｒａｒｅ－ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼまたはトランスポザーゼを使用した内因性遺伝子の標的化修飾に関する。

【背景技術】

【0004】

単一遺伝子障害（ｍｏｎｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）は、その例としては鎌状赤血球症（ヘモグロビン－β遺伝子）、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通伝導調節因子遺伝子）、およびテイ・サックス病（β－ヘキソサミニダーゼＡ遺伝子）が挙げられる、単一の遺伝子における１つ以上の変異によって引き起こされる。単一遺伝子障害は、欠陥遺伝子を機能性コピーで置き換えることが治療上の利益をもたらす可能性があるため、遺伝子治療に対する関心が高まってきた。しかしながら、効果的な療法を生み出す上での１つの妨げとしては、遺伝子の機能性コピーのサイズが挙げられる。ウイルスを使用するものを含む多くの送達方法には、サイズ制限があり、大きな導入遺伝子の送達を妨げる。さらに、多くの遺伝子は、複数のタンパク質をコードする単一の遺伝子をもたらす、選択的スプライシングパターンを有する。欠陥遺伝子の部分領域を修正する方法は、単一遺伝子障害を治療するための代替手段を提供し得る。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

遺伝子編集は、遺伝性障害に見出される変異を修正するために有望であるが、機能獲得変異によって引き起こされるもの、または正確な修復が必要な場合を含む、個々の障害に対する効果的な療法を創出する上で多くの課題が残されている。これらの課題は、遺伝子の３’末端における機能獲得変異（拡張トリヌクレオチド反復）によって引き起こされる、脊髄小脳失調症３および脊髄小脳失調症６などの障害で見られる。

【0006】

本明細書に記載の方法は、遺伝子の３’末端で見出される変異を修正するための新規のアプローチを提供する。本明細書における開示は、複数の修復経路を通した組み込みに適合するバイモジュール（ｂｉｍｏｄｕｌｅ）導入遺伝子の設計に少なくとも部分的に基づく。本明細書に記載の導入遺伝子は、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ、ＨＲ）経路、非相同末端結合（ｎｏｎ－ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）経路、または相同組換えと非相同末端結合経路との両方によって、あるいは転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を通して、遺伝子に組み込むことができる。さらに、任意の場合における組み込みの結果（ＨＲ、ＮＨＥＪフォワード、ＮＨＥＪリバース、フォワード転位、またはリバース転位）は、標的遺伝子のタンパク質産物の正確な修正（ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）／改変をもたらし得る。本明細書に記載の導入遺伝子を使用して、目的の遺伝子の３’領域の変異を修正（ｆｉｘ）または導入することができる。これらの方法は、遺伝子の正確な編集が必要な場合、または標的とされる変異した内因性遺伝子が、標準的なベクターまたはウイルスベクターのサイズ容量を超えているために合成コピーによって「置き換える」ことができない場合に、特に有用である。本明細書に記載の方法は、応用研究（例えば、遺伝子治療）または基礎研究（例えば、動物モデルの創出、または遺伝子機能の理解）のために使用することができる。

【0007】

本明細書に記載の方法は、現在のインビボ送達ビヒクル（例えば、アデノ随伴ウイルスベクターおよび脂質ナノ粒子）と適合性があり、遺伝子産物の正確な改変を達成することで、いくつかの課題に対処する。

【0008】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むための方法を特徴とする。本方法は、導入遺伝子の送達を含むことができ、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のターミネーターを保有する。一部の実施形態では、第１および第２のターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。本方法は、内因性遺伝子内の部位を標的とする１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することをさらに含み、導入遺伝子は、次いで内因性遺伝子に組み込まれる。導入遺伝子は、イントロン内の部位、またはイントロン－エキソン接合部の部位を標的とすることができる。第１および第２の部分コード配列は、ＮＨＥＪによる導入遺伝子のいずれかの方向（すなわち、フォワードまたはリバース）への組み込みが遺伝子のタンパク質産物の正確な改変をもたらすことができるように、尾対尾配向（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に配向することができる。他の実施形態では、導入遺伝子は、ＨＲによる組み込みを可能にするための左右の相同アームを含み得る。これらの導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）内に保有され得、導入遺伝子は、ＨＲを介して（相同アームを介して）、またはＮＨＥＪフォワード方向もしくはＮＨＥＪリバース方向によって（標的二本鎖切断内のＡＡＶベクターの直接的な組み込みを介して）組み込まれ得る。一実施形態では、第１および第２のコード配列ならびに左右の相同アームを有するベクターは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断のための第１および第２の部位をさらに含むことができる。１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断は、ＨＲまたはＮＨＥＪを介してゲノムに組み込むことができる相同アームを有する直鎖導入遺伝子の遊離をもたらし得る。別の実施形態では、第１および第２のコード配列を有するベクターは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断のための第１および第２の部位に隣接することができる。１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断は、ＮＨＥＪを介してゲノムに組み込むことができる直鎖導入遺伝子の遊離をもたらすことができる。別の実施形態では、第１および第２のコード配列を有するベクターは、左右のトランスポゾン末端に隣接することができる。ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ（例えば、ＴｎｉＱ、ＴｎｓＡ、ＴｎｓＢ、およびＴｎｓＣと共にＣａｓ６／７／８）の送達は、転位を介した導入遺伝子の組み込みをもたらすことができる。

【0009】

これらの方法を使用して、内因性遺伝子によって産生されたタンパク質のＣ末端を改変することができる。一部の実施形態では、内因性遺伝子は、ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子を含み得る。ＡＴＸＮ３は、酵素アタキシン－３をコードする遺伝子である。アタキシン－３は、過剰または損傷したタンパク質の破壊を促進するユビキチンプロテアソーム系のメンバーである。脊髄小脳失調症３型は、ＡＴＸＮ３遺伝子の３’末端内のトリヌクレオチド反復の拡張によって引き起こされる遺伝性障害である。ＣＡＣＮＡ１Ａは、カルシウムチャネルの形成に関与するタンパク質をコードする遺伝子である。脊髄小脳失調症６型は、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝子障害である。ＳＣＡ６を引き起こす変異としては、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の３’末端におけるトリヌクレオチド反復の拡張が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に提供される方法は、内因性ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の３’末端を改変するために使用することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子の組み込みの標的は、ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン４６であり得る。

【0010】

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する当業者によって通常理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用して本発明を実施することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、あらゆる目的のために、それらの全体が参照により援用される。矛盾する場合、定義を含めて、本明細書が優先する。加えて、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、限定することを意図するものではない。

【0011】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】内因性遺伝子への標的化挿入のための導入遺伝子の図である。ＴＳ１：標的部位１、ＳＡ１：スプライスアクセプター部位１、ＣＤＳ１：コード配列１、Ｔ１：ターミネーター１、ＴＳ２：標的部位２、ＳＡ２：スプライスアクセプター部位２、ＣＤＳ２：コード配列２、Ｔ２：ターミネーター２、ＨＡ１：相同アーム１、ＨＡ２：相同アーム２、ＢＴ１：双方向ターミネーター１、ＡＳ１：追加配列１、ＡＳ２：追加配列２。

【図2】例示的な遺伝子への導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスアクセプター配列、２つのコード配列（３．１および３．２）、ならびに２つのターミネーター（Ｔ）を含む。組み込みは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して進行する。

【図3】例示的な遺伝子への導入遺伝子の組み込みを示す図である。導入遺伝子は、２つの相同アーム、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位、２つのスプライスアクセプター配列、２つのコード配列（３．１および３．２）、ならびに２つのターミネーターを含む。組み込みは、相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）のいずれかを介して進行する。

【図4】ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４６、イントロン４６およびイントロン４７の図である。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子に組み込むためのｐＢ１０１１－Ｄ１導入遺伝子も示される。

【図5】ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内のｐＢ１０１１－Ｄ１導入遺伝子の組み込み結果の図である。

【図6】ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン９、イントロン９、エキソン１０、イントロン１０、およびエキソン１１の図である。ＡＴＸＮ３遺伝子に組み込むためのｐＢ１０１２－Ｄ１導入遺伝子もまた示される。

【図7】ＡＴＸＮ３遺伝子内のｐＢ１０１２－Ｄ１導入遺伝子の組み込み結果の図である。

【図8】ＡＴＸＮ３遺伝子への導入遺伝子の組み込みを検出するゲルの画像である。１：１，５１７ｂｐで泳動するトップバンドを有する１００ｂｐラダー、２：ｐＢＡ１１３５の５’接合部、３：ｐＢＡ１１３６の５’接合部、４：ｐＢＡ１１３７の５’接合部、５：ｐＢＡ１１３５の３’接合部、６：ｐＢＡ１１３６の３’接合部、７：ｐＢＡ１１３７の３’接合部、８：５００ｂｐ、１，０００ｂｐ、および３，０００ｂｐで泳動するより濃いバンドを有する１ｋｂラダー、９：５００ｂｐ、１，０００ｂｐ、および３，０００ｂｐで泳動するより濃いバンドを有する１ｋｂラダー、１０：ｐＢＡ１１３５の逆位５’接合部、１１：５００ｂｐ、１，０００ｂｐ、および３，０００ｂｐで泳動するより濃いバンドを有する１ｋｂラダー、１２：ｐＢＡ１１３６の逆位５’接合部、１３：５００ｂｐ、１，０００ｂｐ、および３，０００ｂｐで泳動するより濃いバンドを有する１ｋｂラダー、１４：プライマー対のｏＮＪＢ１５６＋ｏＮＪＢ１１３、１５：プライマー対の１１４＋１６２、１６：プライマー対のｏＮＪＢ１１６＋ｏＮＪＢ１１３、１７：プライマー対のｏＮＪＢ１１４＋ｏＮＪＢ１７０、１８：プライマー対のｏＮＪＢ１６７＋ｏＮＪＢ１７０、１９：５００ｂｐで泳動するより濃いバンドを有する１００ｂpラダー、２０：ｐＢＡ１１３５およびヌクレアーゼによるトランスフェクション由来のゲノムＤＮＡ、２１：ｐＢＡ１１３６およびヌクレアーゼによるトランスフェクション由来のゲノムＤＮＡ、２２：ｐＢＡ１１３７およびヌクレアーゼによるトランスフェクション由来のゲノムＤＮＡ、２３：水によるトランスフェクション由来のゲノムＤＮＡ、２４：ＤＮＡなしの対照。

【発明を実施するための形態】

【0013】

内因性遺伝子のコード配列を修飾するための方法および組成物が本明細書に開示される。一部の実施形態では、方法は、導入遺伝子を内因性遺伝子に挿入することを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子のコード配列を置換する部分コード配列を提供する。

【0014】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法を特徴とし、本方法は、導入遺伝子を投与することであって、導入遺伝子が、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２の部分コード配列、ならびに１つの双方向ターミネーターまたは第１および第２のターミネーターを含む、導入遺伝子を投与することと、内因性遺伝子内の部位を標的とする１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することと、を含み、導入遺伝子が、内因性遺伝子内に組み込まれる。本方法は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプターと、第２の部分コード配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプターとを有するように、導入遺伝子を設計することを含み得る。また、配置は、第１のターミネーターに作動可能に連結された第１の部分コード配列と、第２のターミネーターに作動可能に連結された第２の部分コード配列とを有することを含み得る。一実施形態では、２つのターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。一実施形態では、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２の部分コード配列、ならびに第１および第２のターミネーターを有する導入遺伝子は、尾対尾配向で配向され得る。配列の尾対尾配向を有する導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含むことができ、標的部位は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する。別の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右の相同アームを含むことができる。この実施形態では、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され得る。別の実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含むことができ、標的部位は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する。第１および第２の標的部位は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内に、またはイントロン－エキソン接合部で組み込まれ得る。導入遺伝子は、ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。導入遺伝子は、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができ、病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９またはイントロン９－エキソン１０接合部を標的とすることができる。導入遺伝子は、非病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４７によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができ、病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン４６またはイントロン４６－エキソン４７接合部を標的とすることができる。特定の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼであり得る。第１および第２の部分コード配列は、同じアミノ酸をコードする。一実施形態では、第１および第２のコード配列は、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードすることができる。導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターを含むことができる。本明細書に記載の方法は、４．７ｋｂ以下の導入遺伝子と共に使用することができる。導入遺伝子は、標的内因性遺伝子によって産生される機能性タンパク質由来の部分ペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。標的内因性遺伝子は、異常であり得る。

【0015】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２の部分コード配列、１つの双方向ターミネーターまたは第１および第２のターミネーター、任意選択的に、第１および第２の相同アーム、ならびに任意選択的に、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、を有するＤＮＡポリヌクレオチドを提供する。ＤＮＡポリヌクレオチドは、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプターと、第２のコード配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプターとを有する設計を含むことができる。また、配置は、第１のターミネーターに作動可能に連結された第１の部分コード配列と、第２のターミネーターに作動可能に連結された第２の部分コード配列とを有することを含み得る。一実施形態では、２つのターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。一実施形態では、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列、ならびに第１および第２のターミネーターを有するＤＮＡポリヌクレオチドは、尾対尾配向で配向され得る。配列の尾対尾配向を有するＤＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み得、標的部位は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する。別の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右の相同アームを含むことができる。この実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され得る。別の実施形態では、ＤＮＡポリヌクレオチドは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含むことができ、標的部位は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する。第１および第２の標的部位は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のイントロン内に、またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。ＤＮＡポリヌクレオチドは、非病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４７によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。第１および第２の部分コード配列は、同じアミノ酸をコードする。一実施形態では、第１および第２のコード配列は、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードすることができる。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択され得る。本明細書に記載のＤＮＡポリヌクレオチドは、４．７ｋｂ以下であり得る。

【0016】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法を特徴とし、本方法は、導入遺伝子を投与することであって、導入遺伝子が、左右のトランスポゾン末端、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２の部分コード配列、ならびに１つの双方向ターミネーターまたは第１および第２のターミネーターを含む、導入遺伝子を投与することと、内因性遺伝子内を標的とするトランスポザーゼを投与することと、を含み、導入遺伝子が、内因性遺伝子内に組み込まれる。本方法は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプターと、第２のコード配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプターとを有するように、導入遺伝子を設計することを含み得る。また、配置は、第１のターミネーターに作動可能に連結された第１の部分コード配列と、第２のターミネーターに作動可能に連結された第２の部分コード配列とを有することを含み得る。一実施形態では、２つのターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。一実施形態では、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列、ならびに第１および第２のターミネーターを有する導入遺伝子は、尾対尾配向で配向され得る。配列の尾対尾配向を有する導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右のトランスポゾン末端をさらに含み得る。実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内に、またはイントロン－エキソン接合部で組み込まれ得る。導入遺伝子は、ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。導入遺伝子は、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができ、病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９またはイントロン９－エキソン１０接合部を標的とすることができる。導入遺伝子は、非病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４７によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができ、病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン４６またはイントロン４６－エキソン４７接合部を標的とすることができる。トランスポザーゼは、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼであってもよく、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼは、Ｃａｓ１２ｋまたはＣａｓ６タンパク質を含む。第１および第２の部分コード配列は、同じアミノ酸をコードする。一実施形態では、第１および第２のコード配列は、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードすることができる。導入遺伝子は、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターを含むことができる。本明細書に記載の方法は、４．７ｋｂ以下の導入遺伝子と共に使用することができる。左の末端は、配列番号４１に示される配列を含み得、右の末端は、配列番号１３に示される配列を含み得る。

【0017】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２の部分コード配列、１つの双方向ターミネーターまたは第１および第２のターミネーター、ならびに左右のトランスポゾン末端を有するＤＮＡポリヌクレオチドを提供する。ＤＮＡポリヌクレオチドは、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプターと、第２のコード配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプターとを有する設計を含むことができる。また、配置は、第１のターミネーターに作動可能に連結された第１の部分コード配列と、第２のターミネーターに作動可能に連結された第２の部分コード配列とを有することを含み得る。一実施形態では、２つのターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。一実施形態では、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列、ならびに第１および第２のターミネーターを有するＤＮＡポリヌクレオチドは、尾対尾配向で配向され得る。配列の尾対尾配向を有するＤＮＡポリヌクレオチドは、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右のトランスポゾン末端をさらに含み得る。実施形態では、本明細書に記載のＤＮＡポリヌクレオチドは、内因性遺伝子のイントロン内に、またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれ得る。ＤＮＡポリヌクレオチドは、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。ＤＮＡポリヌクレオチドは、非病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４７によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含むことができる。第１および第２の部分コード配列は、同じアミノ酸をコードする。一実施形態では、第１および第２のコード配列は、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードすることができる。ＤＮＡポリヌクレオチドは、ベクターに保有され得、ベクターの形式は、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択され得る。本明細書に記載のＤＮＡポリヌクレオチドは、４．７ｋｂ以下であり得る。左の末端は、配列番号４１に示される配列を含み得、右の末端は、配列番号１３に示される配列を含み得る。

【0018】

一実施形態では、本文書は、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法を特徴とし、本方法は、導入遺伝子を投与することを含み、導入遺伝子が、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、１つの双方向ターミネーターまたは第１および第２のターミネーター、ならびに第１および第２の相同アームを含み、導入遺伝子は、内因性遺伝子内に組み込まれる。本方法は、第１の部分コード配列に作動可能に連結された第１のスプライスアクセプターと、第２のコード配列に作動可能に連結された第２のスプライスアクセプターとを有するように、導入遺伝子を設計することを含み得る。また、配置は、第１のターミネーターに作動可能に連結された第１の部分コード配列と、第２のターミネーターに作動可能に連結された第２の部分コード配列とを有することを含み得る。一実施形態では、２つのターミネーターは、単一の双方向ターミネーターで置き換えることができる。相同アームは、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、１つの双方向ターミネーターまたは第１および第２のターミネーターに隣接し得る。コード配列は、完全コード配列または部分コード配列をコードすることができる。一実施形態では、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列、ならびに第１および第２のターミネーターを有する導入遺伝子は、尾対尾配向で配向され得る。配列の尾対尾配向を有する導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含むことができ、標的部位は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する。別の実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右の相同アームを含むことができる。この実施形態では、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルスベクター内に保有され得る。別の実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含むことができ、標的部位は、第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する。第１および第２の標的部位は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、内因性遺伝子のイントロン内に、またはイントロン－エキソン接合部で組み込まれ得る。

【0019】

本方法の実施は、本明細書に開示される組成物の調製および使用に加えて、別段の指示がない限り、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡ、ならびに当該技術分野内の関連分野における従来の技術を使用する。これらの技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９および２００１の第３版、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７および定期更新、シリーズのＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、ならびにＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，“Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９を参照されたい。

【0020】

本明細書で使用される場合、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され得る。核酸およびポリヌクレオチドは、直鎖または環状の立体構造、ならびに一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかで、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指すことができる。これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定的なものとして解釈されるべきではない。この用語は、天然ヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖、および／またはリン酸部分で修飾されるヌクレオチドを包含することができる。

【0021】

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、共に共有結合されたアミノ酸残基を指すために互換的に使用され得る。この用語はまた、１つ以上のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学類似体または修飾誘導体であるタンパク質にも適用される。

【0022】

「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、互換的に使用され、２つ以上の構成要素（配列要素など）の近位を指し、両方の構成要素が正常に機能し、構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに作用する機能を媒介し得る可能性を可能にするように、構成要素が配置される。例示として、転写調節配列（例えば、プロモーター）は、転写調節配列が、１つ以上の転写調節因子の有無に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写調節配列は、概してコード配列とシスで作動可能に連結されるが、コード配列に直接隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していないにもかかわらず、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。さらに、例として、スプライスアクセプターがイントロンの３’境界の描写を可能にする場合、得られた成熟ｍＲＮＡの翻訳が部分コード配列によってコードされるペプチド配列の最終タンパク質産物への組み込みをもたらす場合、スプライスアクセプターは、部分コード配列に作動可能に連結され得る。

【0023】

本明細書で使用される場合、「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は、核酸分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、限定されないが、ホスホジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含む様々な方法によって開始され得る。切断は、一本鎖ニック（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｉｃｋ）および二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｂｒｅａｋ）の両方を指すことができる。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖ニックの結果として生じ得る。核酸切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの産生をもたらし得る。特定の実施形態では、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、標的の二本鎖または一本鎖ＤＮＡの切断のために使用される。

【0024】

「外因性」分子は、小分子（例えば、糖、脂質、アミノ酸、脂肪酸、フェノール化合物、アルカロイド）、または高分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖）、もしくは上記分子の任意の修飾誘導体、あるいは細胞の外側で生成もしくは存在するか、または通常は細胞内に存在しない、上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体を指し得る。外因性分子は、細胞に導入され得る。細胞への外因性分子の導入方法または「投与」方法としては、脂質媒介性輸送、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子衝撃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性輸送、およびウイルスベクター媒介性輸送が挙げられる。本明細書で定義されるように、「投与」は、外因性分子の細胞への送達、提供、または導入を指すことができる。導入遺伝子またはレアカッティングエンドヌクレアーゼが細胞に投与される場合、導入遺伝子またはレアカッティングエンドヌクレアーゼが細胞内に送達、提供、または導入される。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、精製タンパク質、核酸、または精製タンパク質と核酸の混合物として投与することができる。核酸（すなわち、ＲＮＡまたはＤＮＡ）は、レアカッティングエンドヌクレアーゼ、またはレアカッティングエンドヌクレアーゼ（例えば、ｇＲＮＡ）の一部をコードすることができる。投与は、脂質媒介性輸送、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子注入、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介性輸送、ウイルスベクター媒介性輸送、あるいは精製タンパク質もしくは核酸、または精製タンパク質および核酸の混合物を細胞に送達するのに好適な任意の手段などの方法を通して達成することができる。

【0025】

「内因性」分子は、特定の環境条件下の、特定の発生段階の、特定の細胞に存在する分子である。内因性分子は、核酸、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸であり得る。追加の内因性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含み得る。

【0026】

本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を含む、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域を指す。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、および遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「野生型遺伝子」は、特定の集団において最も高い頻度で存在する遺伝子の形態を指す。

【0027】

「内因性遺伝子」は、遺伝子産物をコードする特定の細胞内に通常存在するＤＮＡ領域、ならびに遺伝子産物の産生を調節する全てのＤＮＡ領域を指す。

【0028】

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれる情報を遺伝子産物に変換することを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物であり得る。例えば、遺伝子産物は、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含まれる。

【0029】

「コードする（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」は、核酸に含まれる情報を産物に変換することを指し、産物は、核酸配列の直接転写産物から生じ得る。例えば、産物は、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ－リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含まれる。

【0030】

「標的部位」または「標的配列」は、結合のために十分な条件が存在する場合、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼが結合する核酸の一部を定義する。

【0031】

本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを指す。「相同組換え（ＨＲ）」という用語は、例えば、二本鎖切断の修復中に起こり得る組換えの特殊形態を指す。相同組換えは、「ドナー」分子上に存在するヌクレオチド配列相同性を必要とする。ドナー分子は、二本鎖切断の修復のための鋳型として、細胞によって使用され得る。二本鎖切断部位、またはその近傍におけるゲノム配列とは異なるドナー分子内の情報は、細胞のゲノムＤＮＡに安定的に組み込まれ得る。

【0032】

本明細書で使用される場合、「組み込む（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）」という用語は、ＤＮＡをＤＮＡの標的領域に添加するプロセスを指す。本明細書に記載されるように、組み込みは、非相同末端結合、相同組換え、または標的化転位を含む、いくつかの異なる手段によって促進され得る。例として、ユーザ提供ＤＮＡ分子の標的遺伝子への組み込みは、非相同末端結合によって促進され得る。ここで、標的遺伝子内で標的二本鎖切断がなされ、ユーザ提供ＤＮＡ分子が投与される。ユーザ提供ＤＮＡ分子は、非相同末端結合による標的遺伝子の修復中の捕捉を促進するために、露出したＤＮＡ末端を含むことができる。露出した末端は、投与時（すなわち、直鎖ＤＮＡ分子の投与時）にＤＮＡ分子上に存在し得るか、または細胞への投与時に創出され得る（すなわち、レアカッティングエンドヌクレアーゼが、細胞内でユーザ提供ＤＮＡ分子を切断して、末端を露出する）。さらに、ユーザ提供ＤＮＡ分子は、アデノ随伴ウイルスベクターを含むウイルスベクター上に保有され得る。別の例では、組み込みは、相同組換えを介して生じる。ここで、ユーザ提供ＤＮＡは、左右の相同アームを保有し得る。別の例では、組み込みは、転位を介して生じる。ここで、ユーザ提供ＤＮＡは、トランスポゾンの左右の末端を保有する。

【0033】

本明細書で使用される場合、「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」という用語は、生物または細胞に輸送され得る核酸の配列を指す。導入遺伝子は、標的生物内または標的細胞内に通常存在しない遺伝子または核酸配列を含み得る。さらに、導入遺伝子は、標的生物または細胞内に通常存在する遺伝子または核酸配列のコピーを含んでいてもよい。導入遺伝子は、標的細胞の細胞質または核に導入された外因性ＤＮＡ配列であり得る。一実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、部分コード配列を含み、部分コード配列は、宿主細胞内の遺伝子によって産生されるタンパク質の一部をコードする。

【0034】

本明細書で使用される場合、「病原性」という用語は、疾患を引き起こし得る全てのものを指す。病原性変異は、疾患を引き起こす遺伝子における修飾を指し得る。病原性遺伝子は、疾患を引き起こす修飾を含む遺伝子を指す。例えば、脊髄小脳失調症３の患者における病原性ＡＴＸＮ３遺伝子は、拡張ＣＡＧトリヌクレオチド反復を有するＡＴＸＮ３遺伝子を指し、拡張ＣＡＧトリヌクレオチド反復は、疾患を引き起こす。

【0035】

本明細書で使用される場合、「尾対尾（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ）」という用語は、反対かつリバース方向の２つのユニットの配向を指す。２つのユニットは、各配列の３’末端が互いに隣接して配置されている、単一核酸分子上の２つの配列であり得る。例えば、５’から３’方向へ、エレメント［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］を有する第１の核酸、およびエレメント［スプライスアクセプター２］－［部分コード配列２］－［ターミネーター２］を有する第２の核酸を、尾対尾配向で配置することができ、［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］が得られる（ＲＣは逆相補（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を指す）。

【0036】

「イントロン－エキソン接合部」という用語は、遺伝子内の特定の位置を指す。この特定の位置は、イントロンの最後のヌクレオチドと、それに続くエキソンの最初のヌクレオチドとの間にある。本明細書に記載の導入遺伝子を組み込む場合、導入遺伝子は、「イントロン－エキソン接合部」内に組み込まれ得る。導入遺伝子がカーゴ（ｃａｒｇｏ）を含む場合、カーゴは、イントロンの最後のヌクレオチドの直後に組み込まれる。場合によっては、イントロン－エキソン接合部内に導入遺伝子が組み込まれると、エキソン内の配列の除去（例えば、ＨＲを介した組み込み、およびエキソン内の配列の導入遺伝子内のカーゴへの置き換え）をもたらし得る。

【0037】

本明細書で使用される場合、「相同」という用語は、核酸またはアミノ酸の第２の配列と類似性を有する、核酸またはアミノ酸の配列を指す。一部の実施形態では、相同配列は、互いに、少なくとも８０％の配列同一性（例えば、８１％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性）を有し得る。

【0038】

本明細書で使用される「部分コード配列（ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、部分タンパク質（ｐａｒｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする核酸の配列を指す。部分コード配列は、野生型タンパク質または機能性タンパク質と比較して、１つ以下のアミノ酸を含むタンパク質をコードすることができる。部分コード配列は、野生型タンパク質または機能性タンパク質と相同性を有する部分タンパク質をコードすることができる。ＡＴＸＮ３を指す場合、「部分コード配列」という用語は、部分ＡＴＸＮ３タンパク質をコードする核酸配列を指す。部分ＡＴＸＮ３タンパク質は、野生型ＡＴＸＮ３タンパク質と比較して、１つ以下のアミノ酸を有する。遺伝子の３’末端を修飾する場合、１つ以下のアミノ酸は、タンパク質のＮ末端からであり得る。ＡＴＸＮ３遺伝子が１１個のエキソンを有する場合、部分コード配列は、エキソン２～１１、または３～１１、または４～１１、または５～１１、または６～１１、または７～１１、または８～１１、または９～１１、または１０～１１、または１１によって産生されるペプチドをコードする配列を含むことができる。

【0039】

本文書に記載の方法および組成物は、カーゴ配列を有する導入遺伝子を使用することができる。「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」という用語は、遺伝子の完全コード配列または部分コード配列、ＷＴまたは改変標的と比較して一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）を保有する遺伝子の部分配列、スプライスアクセプター、ターミネーター、転写調節エレメント、精製タグ（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）、マルトース結合タンパク質、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｍｙｃタグ、ＡｖｉＴａｇ、ＨＡタグ、またはキチン結合タンパク質）、またはレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｌａｃＺ、ｃａｔ、ルシフェラーゼ、ｐｕｒｏ、ネオマイシン）などのエレメントを指し得る。本明細書で定義される場合、「カーゴ」は、標的部位に組み込まれる導入遺伝子内の配列を指し得る。例えば、「カーゴ」は、２つの相同アーム間、２つのレアカッティングエンドヌクレアーゼの標的部位間、または左右のトランスポゾン末端間の導入遺伝子上の配列を指し得る。

【0040】

「相同配列」（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）という用語は、第２の核酸に対する相同性を含む核酸の配列を指す。相同配列は、例えば、「相同のアーム（ａｒｍ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「相同アーム（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｒｍ）」としてドナー分子上に存在し得る。相同アームは、第２の核酸との相同組換えを促進するドナー分子内の核酸の配列であり得る。本明細書で定義されるように、相同アームは「アーム（ａｒｍ）」とも称され得る。２つの相同アームを有するドナー分子では、相同アームは、「アーム１」および「アーム２」と称され得る。一態様では、カーゴ配列は、第１および第２の相同アームに隣接することができる。

【0041】

「双方向ターミネーター（ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）」という用語は、センス方向またはアンチセンス方向のいずれかでＲＮＡポリメラーゼの転写を終結させることができるターミネーターを指す。尾対尾配向の２つの一方向ターミネーターとは対照的に、双方向ターミネーターは、ＤＮＡの非キメラ配列を含み得る。双方向ターミネーターの例としては、ＡＲＯ４、ＴＲＰ１、ＴＲＰ４、ＡＤＨ１、ＣＹＣ１、ＧＡＬ１、ＧＡＬ７、およびＧＡＬ１０ターミネーターが挙げられる。

【0042】

核酸分子の５’または３’末端は、核酸の方向性および化学的配向を指す。本明細書で定義されるように、「遺伝子の５’末端」は、開始コドンを有するエキソンを含み得るが、停止コドンを有するエキソンは含まない。本明細書で定義されるように、「遺伝子の３’末端」は、停止コドンを有するエキソンを含み得るが、開始コドンを有するエキソンは含まない。

【0043】

「ＡＴＸＮ３」遺伝子という用語は、酵素アタキシン－３をコードする遺伝子を指す。ＡＴＸＮ３遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８１９８．２、および対応する配列番号４２に見出され得る。エキソンとイントロンの境界は、配列番号４２に提供される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、１～５４の配列を含む。エキソン２は、９７４５～９９０９の配列を含む。エキソン３は、１０４４６～１０４９０の配列を含む。エキソン４は、１２７５２～１２８３７の配列を含む。エキソン５は、１３２６５～１３３３１の配列を含む。エキソン６は、１７７６６～１７８５３の配列を含む。エキソン７は、２３３２５～２３４５７の配列を含む。エキソン８は、２４１１７～２４２８３の配列を含む。エキソン９は、２５５２２～２５６１８の配列を含む。エキソン１０は、３５５３０～３５６４８の配列を含む。エキソン１１は、４２１６９～４８０３１の配列を含む。イントロン１は、５５～９７４４の配列を含む。イントロン２は、９９１０～１０４４５の配列を含む。イントロン３は、１０４９１～１２７５１の配列を含む。イントロン４は、１２８３８～１３２６４の配列を含む。イントロン５は、１３３３２～１７７６５の配列を含む。イントロン６は、１７８５４～２３３２４の配列を含む。イントロン７は、２３４５８～２４１１６の配列を含む。イントロン８は、２４２８４～２５５２１の配列を含む。イントロン９は、２５６１９～３５５２９の配列を含む。イントロン１０は、３５６４９～４２１６８の配列を含む。

【0044】

「ＣＡＣＮＡ１Ａ」遺伝子という用語は、カルシウム電位依存性チャネルサブユニットα１Ａタンパク質をコードする遺伝子を指す。ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の代表的な配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１１５６９．１および対応する配列番号４３に見出すことができる。エキソンとイントロンの境界は、配列番号４３に提供される配列で定義することができる。具体的には、エキソン１は、１～５２９の配列を含む。エキソン２は、５１２４９～５１３５４の配列を含む。エキソン３は、５３４４６～５３５８５の配列を含む。エキソン４は、１３４６８２～１３４７７３の配列を含む。エキソン５は、１４０９９２～１４１１４４の配列を含む。エキソン６は、１４６６６２～１４６８５５の配列を含む。エキソン７は、１７０５５２～１７０６５５の配列を含む。エキソン８は、１７１９６８～１７２０８３の配列を含む。エキソン９は、１７３５３６～１７３５９２の配列を含む。エキソン１０は、１７６１２５～１７６２１７の配列を含む。エキソン１１は、１８９１４０～１８９３４９の配列を含む。エキソン１２は、１９３６８０～１９３７９２の配列を含む。エキソン１３は、１９７９３３～１９８０４５の配列を含む。エキソン１４は、１９８２１０～１９８３４１の配列を含む。エキソン１５は、１９８６０７～１９８６７９の配列を含む。エキソン１６は、２０２５７７～２０２６９４の配列を含む。エキソン１７は、２０２８４８～２０２９１５の配列を含む。エキソン１８は、２０５８０５～２０５９１１の配列を含む。エキソン１９は、２０７１０８～２０７９１７の配列を含む。エキソン２０は、２１９４９５～２１９９５８の配列を含む。エキソン２１は、２２１２５５～２２１３９３の配列を含む。エキソン２２は、２２３０６５～２２３１９４の配列を含む。エキソン２３は、２２９３３３～２２９３９２の配列を含む。エキソン２４は、２３０５０５～２３０６１１の配列を含む。エキソン２５は、２４３６２８～２４３７２７の配列を含む。エキソン２６は、２４４８５１～２４５０１１の配列を含む。エキソン２７は、２４６７６０～２４６８９７の配列を含む。エキソン２８は、２４８９１０～２４９１１１の配列を含む。エキソン２９は、２５１２０２～２５１３６６の配列を含む。エキソン３０は、２５３３６０～２５３４７０の配列を含む。エキソン３１は、２６１１９６～２６１２７９の配列を含む。エキソン３２は、２７０７３１～２７０８４７の配列を含む。エキソン３３は、２７１１８７～２７１２５２の配列を含む。エキソン３４は、２７１４２５～２７１５４０の配列を含む。エキソン３５は、２７４６０１～２７４７５１の配列を含む。エキソン３６は、２７６２５２～２７６３７９の配列を含む。エキソン３７は、２７７６６６～２７７７６２の配列を含む。エキソン３８は、２８１６８９～２８１７９４の配列を含む。エキソン３９は、２９１８５３～２９１９６０の配列を含む。エキソン４０は、２９２１２８～２９２２２８の配列を含む。エキソン４１は、２９３７２１～２９３８３０の配列を含む。エキソン４２は、２９３９３９～２９４０７７の配列を含む。エキソン４３は、２９４２４５～２９４３５８の配列を含む。エキソン４４は、２９５８０９～２９５８４４の配列を含む。エキソン４５は、２９６９６３～２９７１４９の配列を含む。エキソン４６は、２９７４５２～２９７７０５の配列を含む。エキソン４７は、２９８４１３～３０００１９の配列を含む。イントロン１は、５３０～５１２４８の配列を含む。イントロン２は、５１３５５～５３４４５の配列を含む。イントロン３は、５３５８６～１３４６８１の配列を含む。イントロン４は、１３４７７４～１４０９９１の配列を含む。イントロン５は、１４１１４５～１４６６６１の配列を含む。イントロン６は、１４６８５６～１７０５５１の配列を含む。イントロン７は、１７０６５６～１７１９６７の配列を含む。イントロン８は、１７２０８４～１７３５３５の配列を含む。イントロン９は、１７３５９３～１７６１２４の配列を含む。イントロン１０は、１７６２１８～１８９１３９の配列を含む。イントロン１１は、１８９３５０～１９３６７９の配列を含む。イントロン１２は、１９３７９３～１９７９３２の配列を含む。イントロン１３は、１９８０４６～１９８２０９の配列を含む。イントロン１４は、１９８３４２～１９８６０６の配列を含む。イントロン１５は、１９８６８０～２０２５７６の配列を含む。イントロン１６は、２０２６９５～２０２８４７の配列を含む。イントロン１７は、２０２９１６～２０５８０４の配列を含む。イントロン１８は、２０５９１２～２０７１０７の配列を含む。イントロン１９は、２０７９１８～２１９４９４の配列を含む。イントロン２０は、２１９９５９～２２１２５４の配列を含む。イントロン２１は、２２１３９４～２２３０６４の配列を含む。イントロン２２は、２２３１９５～２２９３３２の配列を含む。イントロン２３は、２２９３９３～２３０５０４の配列を含む。イントロン２４は、２３０６１２～２４３６２７の配列を含む。イントロン２５は、２４３７２８～２４４８５０の配列を含む。イントロン２６は、２４５０１２～２４６７５９の配列を含む。イントロン２７は、２４６８９８～２４８９０９の配列を含む。イントロン２８は、２４９１１２～２５１２０１の配列を含む。イントロン２９は、２５１３６７～２５３３５９の配列を含む。イントロン３０は、２５３４７１～２６１１９５の配列を含む。イントロン３１は、２６１２８０～２７０７３０の配列を含む。イントロン３２は、２７０８４８～２７１１８６の配列を含む。イントロン３３は、２７１２５３～２７１４２４の配列を含む。イントロン３４は、２７１５４１～２７４６００の配列を含む。イントロン３５は、２７４７５２～２７６２５１の配列を含む。イントロン３６は、２７６３８０～２７７６６５の配列を含む。イントロン３７は、２７７７６３～２８１６８８の配列を含む。イントロン３８は、２８１７９５～２９１８５２の配列を含む。イントロン３９は、２９１９６１～２９２１２７の配列を含む。イントロン４０は、２９２２２９～２９３７２０の配列を含む。イントロン４１は、２９３８３１～２９３９３８の配列を含む。イントロン４２は、２９４０７８～２９４２４４の配列を含む。イントロン４３は、２９４３５９～２９５８０８の配列を含む。イントロン４４は、２９５８４５～２９６９６２の配列を含む。イントロン４５は、２９７１５０～２９７４５１の配列を含む。イントロン４６は、２９７７０６～２９８４１２の配列を含む。

【0045】

特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号によって参照される配列との間のパーセント配列同一性は、以下のように決定される。まず、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロンバージョンからのＢＬＡＳＴ２配列（Ｂｌ２配列）プログラムを使用して、特定の配列識別番号で示される配列と比較する。このスタンドアロンバージョンのＢＬＡＳＴＺは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからオンラインで入手することができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法については、ＢＬＡＳＴＺに付属するｒｅａｄｍｅファイルに見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して、２つの配列間の比較を行う。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用され、一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。２つの核酸配列を比較するために、オプションは、以下のように設定される：－ｉは、比較される第１の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され、－ｊは、比較される第２の核酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され、－ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定され、－ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され、－ｑは、－１に設定され、－ｒは、２に設定され、他の全てのオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを使用して、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる：Ｃ：Ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｃ：ｓｅｑ１．ｔｘｔ－ｊ ｃ：ｓｅｑ２．ｔｘｔ－ｐ ｂｌａｓｔｎ－ｏ ｃ：ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ－ｑ－１－ｒ２。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のように設定される：－ｉは、比較される第１のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：ｓｅｑ１．ｔｘｔ）に設定され、－ｊは、比較される第２のアミノ酸配列を含むファイル（例えば、Ｃ：ｓｅｑ２．ｔｘｔ）に設定され、－ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定され、－ｏは、任意の所望のファイル名（例えば、Ｃ：ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）に設定され、他の全てのオプションは、デフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを使用して、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成することができる：Ｃ：Ｂｌ２ｓｅｑ－ｉ ｃ：ｓｅｑ１．ｔｘｔ－ｊ ｃ：ｓｅｑ２．ｔｘｔ －ｐ ｂｌａｓｔｐ－ｏ ｃ：ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較配列が相同性を共有する場合、次いで、指定された出力ファイルは、それらの相同性の領域を整列配列として提示する。２つの比較配列が相同性を共有しない場合、指定された出力ファイルは整列配列を提示しない。

【0046】

整列すると、一致の数は、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に提示されている位置の数をカウントすることによって決定される。パーセント配列同一性は、一致の数を、特定された配列に示される配列の長さで除算するか、または繋がった長さ（例えば、特定された配列に示される配列からの１００個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで除算し、続いて、得られた値に１００を乗算することによって決定される。パーセント配列同一性の値は、最も近い１０分の１に四捨五入される。

【0047】

一実施形態では、本文書は、内因性遺伝子が、２つのコードエキソン間に少なくとも１つのイントロンを有する、内因性遺伝子の３’末端を修飾するための方法を特徴とする。イントロンは、通常のメッセンジャーＲＮＡプロセシング機構によって前駆体メッセンジャーＲＮＡから除去される任意のイントロンであり得る。イントロンは、２０ｂｐ～５００ｋｂ超であり得、スプライスドナー部位、分岐配列、およびアクセプター部位を含むエレメントを含む。内因性遺伝子の３’末端の修飾のために本明細書に開示される導入遺伝子は、レアカッティングエンドヌクレアーゼの標的部位、相同アーム、スプライスアクセプター配列、コード配列、および転写ターミネーターを含む複数の機能性エレメントを含むことができる（図１）。

【0048】

一実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの２つの標的部位を含む。標的部位は、レアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断に好適な配列および長さであり得る。標的部位は、ＣＲＩＳＰＲ系、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ系、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、あるいは任意の他の部位特異的ヌクレアーゼの組み合わせによる切断に適し得る。標的部位は、レアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断がベクターから導入遺伝子の遊離をもたらすように位置付けることができる。ベクターは、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ベクター）または非ウイルスベクター（例えば、プラスミド、ミニサークルベクター）を含むことができる。導入遺伝子が２つの標的部位を含む場合、標的部位は、同じ配列であり得るか（すなわち、同じレアカッティングエンドヌクレアーゼが標的とする）、またはそれらは、異なる配列であり得る（すなわち、２つ以上の異なるレアカッティングエンドヌクレアーゼが標的とする）。

【0049】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２の相同アームと共に、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位を含む。第１および第２の相同アームは、所望の組み込み部位で、またはその近傍で、ゲノム配列と相同的な配列を含むことができる。相同アームは、所望の組み込み部位の配列、またはその近傍の配列との相同組換えに関与するための好適な鎖長であり得る。各相同アームの鎖長は、２０ｎｔ～１０，０００ｎｔ（例えば、２０ｎｔ、３０ｎｔ、４０ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔ、６００ｎｔ、７００ｎｔ、８００ｎｔ、９００ｎｔ、１，０００ｎｔ、２，０００ｎｔ、３，０００ｎｔ、４，０００ｎｔ、５，０００ｎｔ、６，０００ｎｔ、７，０００ｎｔ、８，０００ｎｔ、９，０００ｎｔ、１０，０００ｎｔ）であり得る。一実施形態では、相同アームは、レアカッティングエンドヌクレアーゼおよび／またはスプライスアクセプター配列の標的部位を含む機能性エレメントを含むことができる。一実施形態では、第１の相同アーム（例えば、左の相同アーム）は、標的となるイントロンのスプライスアクセプター部位を含む、標的となるイントロンに相同的な配列を含むことができる。別の実施形態では、第２の相同アームは、標的となるイントロンの下流にあるゲノム配列に相同的な配列（例えば、エキソン配列、３’ＵＴＲ配列）を含むことができる。しかしながら、第２の相同アームは、逆相補の方向にスプライスアクセプター機能を有してはならない。配列がスプライスアクセプター機能を含むかどうかを決定するために、インシリコ分析および実験的な試験を含むいくつかのステップを行うことができる。スプライスアクセプター機能の可能性があるかどうかを決定するために、第２の相同アームに望まれる配列を、コンセンサス分岐配列（例えばＹＴＲＡＣ）およびスプライスアクセプター部位（例えばＹリッチＮＣＡＧＧ）について検索することができる。分岐またはスプライスアクセプター配列が存在する場合、機能を破壊するために一塩基多型を導入するか、またはそのような配列を含まない異なるが隣接する配列を選択することができる。好ましくは、第２の相同アームに使用することができる配列のウィンドウは、組み込みの標的となるイントロンの１ｂｐ～１０ｋｂ下流に伸長する。第２の相同性がスプライスアクセプター機能を有するかどうかを実験的に決定するために、レポーター遺伝子内のイントロン内に第２の相同アームを含む合成構築物を構築することができる。次いで、構築物を適切な細胞型に投与し、スプライシング機能についてモニタリングすることができる。

【0050】

一実施形態では、導入遺伝子は、２つのスプライスアクセプター配列を含み、本明細書では、第１および第２のスプライスアクセプター配列と称される。第１および第２のスプライスアクセプター配列は、導入遺伝子内で反対方向（すなわち、尾対尾配向）、かつ隣接する内部配列（すなわち、コード配列およびターミネーター）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向にイントロンに組み込まれると、スプライスアクセプター配列は、ｍＲＮＡプロセシング中に隣接する／上流のイントロン配列の除去を促進する。第１および第２のスプライスアクセプター配列は、同じ配列または異なる配列であり得る。片方または両方のスプライスアクセプター配列は、導入遺伝子が組み込まれるイントロンのスプライスアクセプター配列であり得る。片方または両方のスプライスアクセプター配列は、合成スプライスアクセプター配列または異なる遺伝子由来のイントロンからのスプライスアクセプター配列であり得る。

【0051】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプター配列に作動可能に連結された第１および第２のコード配列を含む。第１および第２のコード配列は、導入遺伝子内で反対方向に（すなわち、尾対尾配向）位置付けられる。導入遺伝子がフォワードまたはリバース方向に内因性遺伝子に組み込まれると、第１または第２のコード配列が内因性遺伝子のプロモーターによってｍＲＮＡに転写される。コード配列は、欠陥のあるコード配列を修正する、変異を導入する、または新規のペプチド配列を導入するように設計することができる。第１および第２のコード配列は、同じ核酸配列であり、かつ同じタンパク質をコードしてもよい。あるいは、第１および第２のコード配列は、異なる核酸配列であり、かつ同じタンパク質をコードしてもよい（すなわち、コドンの縮重を使用する）。コード配列は、精製タグ（例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）、マルトース結合タンパク質、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｍｙｃタグ、ＡｖｉＴａｇ、ＨＡタグ、またはキチン結合タンパク質）またはレポータータンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｌａｃＺ、ｃａｔ、ルシフェラーゼ、ｐｕｒｏ、ネオマイシン）をコードすることができる。一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプター配列に作動可能に連結された第１および第２の部分コード配列を含み、導入遺伝子は、プロモーターを含まない。

【0052】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２のコード配列に作動可能に連結された、双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含むことができる。双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターは、導入遺伝子内に反対方向（すなわち、尾対尾配向）に位置付けられる。導入遺伝子がフォワード方向またはリバース方向に内因性遺伝子に組み込まれると、双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターは、内因性遺伝子のプロモーターからの転写を終結させる。第１および第２のターミネーターは、同一のターミネーターまたは異なるターミネーターであり得る。

【0053】

一実施形態では、本文書は、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、非相同末端結合および代替非相同末端結合を含む非相同性依存的方法を介して、またはマイクロホモロジー媒介末端結合によって、内因性遺伝子に組み込むことができる。一態様では、導入遺伝子は、内因性遺伝子内のイントロンに組み込まれる（図２）。

【0054】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む導入遺伝子を提供する。導入遺伝子は、相同性に依存的な方法（例えば、合成依存性鎖アニーリングおよびマイクロホモロジー媒介末端結合）および相同性に非依存的な方法（例えば、非相同末端結合および代替非相同末端結合）の両方を介して、内因性遺伝子に組み込むことができる。一態様では、導入遺伝子は、内因性遺伝子内のイントロンに組み込まれる（図３）。別の態様では、導入遺伝子は、イントロンの末端または下流のエキソンの開始部に組み込まれる（図３）。

【0055】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のコード配列、第１および第２のスプライスアクセプター配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む導入遺伝子を提供する（図１）。別の実施形態では、本文書は、第１および第２のコード配列、第１および第２のスプライスアクセプター配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む導入遺伝子を提供する。

【0056】

別の実施形態では、本文書は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のコード配列、第１および第２のスプライスアクセプター配列、１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター、ならびに第１および第２の追加の配列を含む導入遺伝子を提供する（図１）。特定の実施形態では、追加の配列は、導入遺伝子の５’末端部および３’末端部に存在する任意の追加の配列であってもよいが、追加の配列は、スプライスアクセプターとして機能する任意のエレメントを含むべきではない。追加の配列は、例えば、ウイルスゲノムの逆位末端反復であり得る。追加の配列は、直鎖形式を有する導入遺伝子上に存在することができる。直鎖形式は、ＮＨＥＪによる組み込みを可能にする。例えば、追加の配列が逆位末端反復であるアデノ随伴ウイルスベクターに保有されている導入遺伝子は、レアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断後に標的部位でＮＨＥＪによって直接組み込むことができる（すなわち、導入遺伝子のプロセシングは必要ない）。別の例では、追加の配列は、左右のトランスポゾン末端である。

【0057】

別の実施形態では、本文書は、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含むウイルスベクター内の導入遺伝子を提供し、導入遺伝子は、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む。ウイルスベクターの逆位末端反復により、導入遺伝子はまた、第１および第２の追加の配列を含む。

【0058】

別の実施形態では、本文書は、アデノ随伴ウイルスおよびアデノウイルスを含むウイルスベクター内の導入遺伝子を提供し、導入遺伝子は、第１および第２の相同アーム、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、ならびに１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターを含む。ウイルスベクターの逆位末端反復により、導入遺伝子はまた、第１および第２の追加の配列を含む。

【0059】

一部の実施形態では、本明細書で提供される導入遺伝子は、トランスポザーゼにより組み込まれ得る。トランスポザーゼには、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼが含まれ得る（Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｘ９１８１，２０１９、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１３２３－ｚ，２０１９）。トランスポザーゼは、第１および第２のスプライスアクセプター配列、第１および第２のコード配列、１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター（図１）、ならびにトランスポゾンの左右の末端を含む導入遺伝子と組み合わせて使用することができる。ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼは、タンパク質ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、およびｔｎｉＱと共に、ＴｙｐｅＶ－Ｕ５、Ｃ２Ｃ５ ＣＲＩＳＰＲタンパク質、Ｃａｓ１２ｋを含み得る。一部の実施形態では、Ｃａｓ１２ｋは、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｈｏｆｍａｎｎｉ（配列番号３０）またはＡｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ（配列番号３１）由来であり得る。一実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、トランスポゾンの左末端（配列番号３２）および右末端（配列番号３３）を含み、ＳｈＣａｓ１２ｋ、ｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ＴｎｉＱ、およびｇＲＮＡ（配列番号１４）と共に細胞に送達することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲトランスポザーゼは、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、およびＴｎｉＱを含むヘルパータンパク質と共に、Ｃａｓ６タンパク質を含み得る。一実施形態では、本明細書に記載のトランスポゾンの左末端（配列番号４１）および右末端（配列番号１３）を含む導入遺伝子は、Ｃａｓ６（配列番号３７）、Ｃａｓ７（配列番号３７）、Ｃａｓ８（配列番号３７）、ＴｎｉＱ（配列番号３７）、ＴｎｓＡ（配列番号３７）、ＴｎｓＢ（配列番号３７）、ＴｎｓＣ（配列番号３７）、およびｇＲＮＡ（配列番号１２）と共に真核細胞に送達され得る。タンパク質は、精製タンパク質として細胞に直接投与され得るか、ＲＮＡまたはＤＮＡにコードされ得る。ＲＮＡまたはＤＮＡにコードされる場合、配列は、真核細胞内での発現のためにコドンが最適化され得る。ｇＲＮＡ（配列番号１２）をＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターの下流に配置し、ポリ（Ｔ）ターミネーターで終結させることができる。

【0060】

一部の実施形態では、本明細書に記載の導入遺伝子は、スプライスアクセプター、部分コード配列、ターミネーター、相同アーム、左右のトランスポザーゼ末端、ならびにレアカッティングエンドヌクレアーゼによる切断部位を含むエレメントの組み合わせを有し得る。一実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］であり得る（ＲＣは逆相補を意味する）。この組み合わせは、直鎖ＤＮＡ分子またはＡＡＶ分子上に保有され得、標的遺伝子の標的化切断を介してＮＨＥＪによって組み込まれ得る。別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］であり得る。別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［相同アーム１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位２］であり得る。この組み合わせでは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼを使用して、ＨＲおよびＮＨＥＪを促進することができる。例えば、単一のレアカッティングヌクレアーゼは、標的遺伝子（すなわち、所望のイントロン）を切断することができ、相同アームに隣接する切断部位は、イントロン内の同じ標的配列であるように設計することができる。別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［相同アーム１＋レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］であり得る。この組み合わせでは、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＨＲおよびＮＨＥＪを促進することができる。例えば、単一のレアカッティングヌクレアーゼは、相同アーム１内、相同アーム２の下流、およびゲノム標的部位（すなわち、相同アーム１の配列と相同性を有する部位）で切断することができる。別の実施形態では、組み合わせは、５’から３’へ、［トランスポザーゼの左の末端］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［トランスポザーゼの右の末端］であり得る。全ての実施形態では、スプライスアクセプター１およびスプライスアクセプター２は、同一または異なる配列であってもよく、部分コード配列１および部分コード配列２は、同一または異なる配列であってもよく、ターミネーター１およびターミネーター２は、同一または異なる配列であってもよい。

【0061】

実施形態では、構造［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［相同アーム１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位２］を含む導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの送達を介してＤＮＡに組み込まれ得る。１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼが送達される場合、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１および２での切断によって導入遺伝子を遊離することができる。さらに、同じレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＨＲまたはＮＨＥＪを介した挿入をシミュレートする、標的遺伝子内の切断を創出することができる。

【0062】

他の実施形態では、構造［相同アーム１＋レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］－［スプライスアクセプター１］－［部分コード配列１］－［ターミネーター１］－［ターミネーター２ ＲＣ］－［部分コード配列２ ＲＣ］－［スプライスアクセプター２ ＲＣ］－［相同アーム２］－［レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１］を含む導入遺伝子は、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼのＤＮＡ完全送達に組み込まれ得る。１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼが送達される場合、レアカッティングエンドヌクレアーゼは、レアカッティングエンドヌクレアーゼ切断部位１および２での切断によって導入遺伝子を遊離することができる。さらに、同じレアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＨＲまたはＮＨＥＪを介した挿入をシミュレートする、標的遺伝子内の切断を創出することができる。ＨＲによる組み込みは、切断が組み込み部位の上流（すなわち、相同アーム内）にあるときに生じ得る。

【0063】

実施形態では、導入遺伝子の組み込みのための位置は、イントロンまたはイントロン－エキソン接合部であり得る。イントロンを標的とする場合、部分コード配列は、内因性遺伝子内のそれに続くエキソンによって産生されるペプチドをコードする配列を含むことができる。例えば、導入遺伝子が、１１個のエキソンを有する内因性遺伝子のイントロン９に組み込まれるように設計される場合、部分コード配列は、内因性遺伝子のエキソン１０および１１によって産生されるペプチドをコードする配列を含むことができる。イントロン－エキソン接合部を標的とする場合、導入遺伝子は、当該イントロンの３’に相同な配列を有する相同アームを含むように設計することができる。

【0064】

一部の実施形態では、部分コード配列は、完全コード配列であり得る。完全コード配列は、内因性遺伝子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、もしくはＩＮＳ）、またはレポーター遺伝子（例えば、ＲＦＰ、ＧＦＰ、ｃａｔ、ｌａｃＺ、ルシフェラーゼ）をコードすることができる。完全コード配列は、スプライスアクセプターおよびターミネーターに作動可能に連結され、尾対尾配向で導入遺伝子内に配置され得る。

【0065】

本明細書に提供される方法および組成物は、細胞内の内因性遺伝子を修飾するために内部で使用することができる。内因性遺伝子としては、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）、フォン・ヴィレブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン（フィッツジェラルド因子）、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ因子、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン、α２－抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤－２、グルコセレブロシダーゼ（ＧＢＡ）、α－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）、イズロン酸スルファターゼ（ＩＤＳ）、イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、酸性スフィンゴミエリナーゼ（ＳＭＰＤ１）、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＡＤＨＣ（Ｃ２ｏｒｆ２５）、ＭＴＲＲ、ＬＭＢＲＤ１、ＭＴＲ、プロピオニルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＰＣＣ）（ＰＣＣＡ、および／もしくはＰＣＣＢサブユニット）、グルコース－６－リン酸トランスポーター（Ｇ６ＰＴ）タンパク質またはグルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）、ＡｐｏＢ、ＬＤＬＲＡＰ－１、ＰＣＳＫ９、ミトコンドリアタンパク質（ＮＡＧＳ（Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素）、ＣＰＳ１（カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ）、およびＯＴＣ（オルニチントランスカルバミラーゼ）など）、ＡＳＳ（アルギニノコハク酸合成酵素）、ＡＳＬ（アルギニノスクシナーゼ酸リアーゼ）および／もしくはＡＲＧ１（アルギナーゼ）、ならびに／または溶質担体ファミリー２５（ＳＬＣ２５Ａ１３、アスパラギン酸／グルタミン酸担体）タンパク質、ＵＧＴ１Ａ１もしくはＵＤＰグルクロンシルトランスフェラーゼポリペプチドＡ１、フマリルアセト酢酸ヒドロリアーゼ（ＦＡＨ）、アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＸＴ）タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ／ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ（ＧＲＨＰＲ）タンパク質、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ）タンパク質、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）タンパク質、ＵＳＨ２Ａタンパク質、ＡＴＸＮタンパク質、ならびにリポタンパク質リアーゼ（ＬＰＬ）タンパク質、が挙げられる。

【0066】

導入遺伝子は、遺伝性疾患を有する対象において、欠損、非機能的、または機能獲得変異を有するポリペプチドをコードする配列を修飾するための配列を含み得、遺伝性疾患としては、限定されないが、軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、α１アンチトリプシン欠損症、αサラセミア、アンドロゲン不感性症候群、パート症候群、不整脈源性右室異形成、毛細血管拡張性運動失調症、バース症候群、βサラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症、脆弱Ｘ症候群、ガラクトース血症、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス（例えば、ＧＭ１）、ヘモクロマトーシス、β－グロビン（ＨｂＣ）の６番目のコドンにおけるヘモグロビンＣ変異、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群、クラッベ病、ランガー・ギディオン症候群、白血球粘着不全症、白質ジストロフィー、ＱＴ延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症（ＭＰＳ）、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症、神経線維腫症、ニーマン・ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー・ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン・テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、シュワックマン症候群、鎌状赤血球症（鎌状赤血球貧血）、スミス・マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ・サックス病、血小板減少－橈骨欠損（ＴＡＲ）症候群、トリーチャー・コリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット・アルドリッチ症候群、Ｘ連鎖リンパ球増殖症候群、リソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病、ＧＭ１、ファブリー病、およびテイ・サックス病）、ムコ多糖症（例えば、ハンター病、ハーラー病）、異常ヘモグロビン症（例えば、鎌状赤血球症、ＨｂＣ、αサラセミア、βサラセミア）、および血友病が挙げられる。

【0067】

標的化組み込みによって治療することができる追加の疾患としては、フォン・ヴィレブランド病、アッシャー症候群、多発性嚢胞腎疾患、脊髄小脳失調症３型、および脊髄小脳失調症６型が挙げられる。

【0068】

一実施形態では、ゲノム修飾は、内因性ＣＡＣＮＡ１Ａゲノム配列中の導入遺伝子の挿入である。導入遺伝子は、ＣＡＣＮＡ１Ａタンパク質の合成および部分コード配列を含み得る。部分コード配列は、野生型ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内のコード配列、または野生型ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の機能性バリアント、または野生型ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子の変異体と相同であり得る。一実施形態では、部分ＣＡＣＮＡ１Ａタンパク質をコードする導入遺伝子は、イントロン４６またはエキソン４７の開始部に挿入される。

【0069】

別の実施形態では、ゲノム修飾は、内因性ＡＴＸＮ３ゲノム配列への導入遺伝子の挿入である。導入遺伝子は、ＡＴＸＮ３タンパク質の合成および部分コード配列を含み得る。部分コード配列は、野生型ＡＴＸＮ３遺伝子内のコード配列、または野生型ＡＴＸＮ３遺伝子の機能性バリアント、または野生型ＡＴＸＮ３遺伝子の変異体と相同であり得る。一実施形態では、部分ＡＴＸＮ３タンパク質をコードする導入遺伝子は、イントロン９またはエキソン１０の開始部に挿入される。

【0070】

一実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物を使用して、内因性遺伝子の３’末端を修飾することにより、内因性遺伝子によってコードされるタンパク質のＣ末端の修飾をもたらすことができる。内因性遺伝子のコード配列の３’末端の修飾は、最終コードエキソン（すなわち、停止コドンを含むエキソン）の置き換えを含み、開始コードを有するエキソンと最終エキソンとの間にあるエキソンまで含み得る。本明細書で定義される場合、「置き換え（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」は、ＤＮＡの遺伝子への挿入を指し、挿入されたＤＮＡは、１個以上のエキソンのｍＲＮＡおよびタンパク質を産生するための情報を提供する。置き換えは、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むことによって生じ得、導入遺伝子は、スプライスアクセプターに作動可能に連結された１つ以上のコード配列を含む。挿入は、内因性遺伝子内の配列の欠失（例えば、イントロンおよびエキソンの欠失）をもたらし得るか、またはもたらさない場合がある。例えば、遺伝子が７２個のエキソンを含み、開始コドンがエキソン１内にある場合、修飾は、エキソン２～７２、３～７２、４～７２、５～７２、６～７２、７～７２、８～７２、９～７２、１０～７２、１１～７２、１２～７２、１３～７２、１４～７２、１５～７２、１６～７２、１７～７２、１８～７２、１９～７２、２０～７２、２１～７２、２２～７２、または２３～７２、または２４～７２、または２５～７２、または２６～７２、または２７～７２、または２８～７２、または２９～７２、または３０～７２、または３１～７２、または３２～７２、または３３～７２、または３４～７２、または３５～７２、または３６～７２、または３７～７２、または３８～７２、または３９～７２、または４０～７２、または４１～７２、または４２～７２、または４３～７２、または４４～７２、または４５～７２、または４６～７２、または４７～７２、または４８～７２、または４９～７２、または５０～７２、または５１～７２、または５２～７２、または５３～７２、または５４～７２、または５５～７２、または５６～７２、または５７～７２、または５８～７２、または５９～７２、または６０～７２、または６１～７２、または６２～７２、または６３～７２、または６４～７２、または６５～７２、または６６～７２、または６７～７２、または６８～７２、または６９～７２、または７０～７２、または７１～７２、または７２の置き換えを含むことができる。一実施形態では、内因性遺伝子のエキソンは、導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込むことによって置き換えることができ、導入遺伝子は、第１および第２の部分コード配列を含み、第１および第２の部分コード配列は、内因性遺伝子エキソンによって産生されたペプチドをコードする。例えば、導入遺伝子の第１および第２のコード配列は、内因性遺伝子のエキソン２～７２、３～７２、４～７２、５～７２、６～７２、７～７２、８～７２、９～７２、１０～７２、１１～７２、１２～７２、１３～７２、１４～７２、１５～７２、１６～７２、１７～７２、１８～７２、１９～７２、２０～７２、２１～７２、２２～７２、または２３～７２、または２４～７２、または２５～７２、または２６～７２、または２７～７２、または２８～７２、または２９～７２、または３０～７２、または３１～７２、または３２～７２、または３３～７２、または３４～７２、または３５～７２、または３６～７２、または３７～７２、または３８～７２、または３９～７２、または４０～７２、または４１～７２、または４２～７２、または４３～７２、または４４～７２、または４５～７２、または４６～７２、または４７～７２、または４８～７２、または４９～７２、または５０～７２、または５１～７２、または５２～７２、または５３～７２、または５４～７２、または５５～７２、または５６～７２、または５７～７２、または５８～７２、または５９～７２、または６０～７２、または６１～７２、または６２～７２、または６３～７２、または６４～７２、または６５～７２、または６６～７２、または６７～７２、または６８～７２、または６９～７２、または７０～７２、または７１～７２、または７２によって産生されるペプチドをコードすることができる。導入遺伝子は、イントロンの上流の内因性遺伝子内、または導入遺伝子の部分コード配列内の第１のエキソンに対応するエキソンの開始部に組み込むことができる（図２）。導入遺伝子は、４．７ｋｂ以下であるように設計され、ＡＡＶベクターおよび粒子に組み込まれ、インビボで標的細胞に送達され得る。

【0071】

一実施形態では、導入遺伝子は、第１および第２の部分コード配列を保有するＤＮＡの配列であり、部分コード配列は、部分タンパク質をコードし、部分タンパク質は、野生型遺伝子から産生される機能性タンパク質中の対応する領域に相同である。宿主遺伝子または内因性遺伝子は、タンパク質の発現が異常、言い換えれば、発現されない、低レベルで発現される、あるいは発現されるが、ｍＲＮＡもしくはタンパク質産物もしくはその一部が、機能しない、機能低下する、または機能獲得を有し、宿主において障害をもたらす遺伝子である。

【0072】

本明細書に記載されるように、ドナー分子は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター内にあり得る。ベクターは、環状または直鎖の二本鎖または一本鎖のＤＮＡの形態であり得る。ドナー分子は、安定性または細胞更新（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｄａｔｅ）を促進する試薬とコンジュゲートまたは会合することができる。試薬は、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、ＤＥＡＥ－デキストラン、デンドリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、細胞膜透過性ペプチド、ガス封入マイクロバブル、または磁気ビーズであり得る。ドナー分子は、ウイルス粒子に組み込むことができる。ウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、単純ヘルペス、ポックスウイルス、ハイブリッドアデノウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルス、レンチウイルス、または単純ヘルペスウイルスであり得る。

【0073】

特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶベクターは、任意のＡＡＶに由来し得る。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、欠陥および非病原性のパルボウイルス科アデノ随伴２型ウイルス由来である。かかるベクターは全て、導入遺伝子の発現カセットに隣接するＡＡＶの１４５ｂｐ逆位末端反復のみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組み込みによる効率的な遺伝子輸送および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特徴である。（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３５１：９１１７ １７０２－３，１９９８；Ｋｅａｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：７４８－５５，１９９６）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶｒｈ．１０、ならびに任意の新規のＡＡＶ血清型を含む他のＡＡＶ血清型も、本発明に従って使用することができる。一部の実施形態では、キメラＡＡＶが使用され、ウイルス核酸の長鎖末端反復（ＬＴＲ）配列のウイルス起源は、カプシド配列のウイルス起源に対して異種である。非限定的な例としては、ＡＡＶ２に由来するＬＴＲと、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９に由来するカプシド（すなわち、それぞれＡＡＶ２／５、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／８、およびＡＡＶ２／９）とを有するキメラウイルスが挙げられる。

【0074】

また、本明細書に記載の構築物は、アデノウイルスベクター系に組み込むこともできる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターにより、高力価および高レベルの発現を得ることができる。

【0075】

本明細書に記載の方法および組成物は、ゲノム修飾を通して生物を改変することが所望される任意の真核生物に適用可能である。真核生物としては、植物、藻類、動物、真菌、および原生生物が挙げられる。また、真核生物は植物細胞、藻類細胞、動物細胞、真菌細胞、および原生生物細胞を含むこともできる。

【0076】

例示的な哺乳動物細胞としては、卵母細胞、Ｋ５６２細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＰ－Ｇ２細胞、ＢａＦ－３細胞、シュナイダー細胞、ＣＯＳ細胞（ＳＶ４０のＴ－抗原を発現するサル腎臓細胞）、ＣＶ－１細胞、ＨｕＴｕ８０細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＮＢ４細胞、ＨＬ－６０細胞、およびＨｅＬａ細胞、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９を参照されたい）、およびＳＰ２またはＮＳ０のような骨髄腫細胞（例えば、Ｇａｌｆｒｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（Ｂ）：３ ４６を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。また、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはＴ細胞も使用することができ、同様に、胚幹細胞および成体幹細胞も使用することができる。例えば、使用可能な幹細胞としては、胚幹細胞（ＥＳ）、人工誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、造血幹細胞、肝臓幹細胞、皮膚幹細胞、および神経幹細胞が挙げられる。

【0077】

本発明の方法および組成物は組換え生物（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の産生に使用することができる。組換え生物は、小型哺乳動物、伴侶動物、家畜、および霊長類であり得る。げっ歯類の非限定的な例としては、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、およびモルモットが挙げられ得る。伴侶動物の非限定的な例としては、ネコ、イヌ、ウサギ、ハリネズミ、およびフェレットが挙げられ得る。家畜の非限定的な例としては、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラマ、アルパカ、およびウシが挙げられ得る。霊長類の非限定的な例としては、オマキザル、チンパンジー、キツネザル、マカクザル、マーモセット、タマリン、クモザル、リスザル、およびベルベットモンキーが挙げられ得る。本発明の方法および組成物は、ヒトに使用することができる。

【0078】

本明細書に記載の方法を使用して修飾することができる例示的な植物および植物細胞としては、限定されないが、単子葉植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ、サトウキビ）、双子葉植物（例えば、ダイズ、ジャガイモ、トマト、アルファルファ）、果実作物（例えば、トマト、リンゴ、セイヨウナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根野菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉野菜作物（例えば、レタス、ホウレンソウ）、消費用の植物作物（例えば、ダイズおよび他のマメ科植物、カボチャ、ピーマン、ナス、セロリなど）、顕花植物（例えば、ペチュニア、バラ、キク）、針葉樹およびマツ（例えば、マツ、モミ、スプルース）、ポプラ樹（例えば、Ｐ．ｔｒｅｍｕｌａ×Ｐ．ａｌｂａ）、繊維作物（ワタ、ジュート、アマ、タケ）、フィトレメディエーションに使用される植物（例えば、重金属集積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、ナタネ）、および実験目的で使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）が挙げられる。本明細書に開示される方法は、アスパラガス属、カラスムギ属、アブラナ属、柑橘属、スイカ属、トウガラシ属、カボチャ属、ニンジン属、ムカシヨモギ属、ダイズ属、ワタ属、オオムギ属、アキノノゲシ属、ドクムギ属、トマト属、リンゴ属、キャッサバ属、タバコ属、ショカツサイ属、イネ属、ワニナシ属、インゲン属、エンドウ属、ナシ属、サクラ属、ダイコン属、ライムギ属、ナス属、モロコシ属、コムギ属、ブドウ属、ササゲ属、およびトウモロコシ属内で使用することができる。植物細胞という用語は、単離された植物細胞、ならびに種子、カルス、葉、および根などの全植物または全植物の一部を含む。また、本開示は、上に記載の植物の種子も包含し、本明細書に記載の組成物および／または方法を使用して、種子が修飾される。本開示は、上に記載のトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞株または細胞をさらに包含し、当該子孫、クローン、細胞株または細胞は、導入遺伝子または遺伝子構築物を有する。例示的な藻類種としては、微細藻類、珪藻類、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クロレラ属、ドナリエラ・テルチオレクタ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｔｅｒｔｉｏｌｅｃｔａ）、グラシレリア属（Ｇｒａｃｉｌｅｒｉａ）、プレウロクリシス・カルテレ（Ｐｌｅｕｒｏｃｈｒｙｓｉｓ ｃａｒｔｅｒａｅ）、ソルガスム属、およびアオサ属が挙げられる。

【0079】

本文書に記載の方法は、導入遺伝子分子の内因性遺伝子への相同組換えまたは非相同組み込みを刺激するためのレアカッティングエンドヌクレアーゼの使用を含むことができる。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、または亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、広範なＰＡＭ能力（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５５６，５７－６３，２０１８；Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ＤＯＩ：１０．１１２６，２０１８）、またはより高いオンターゲット結合もしくは切断活性（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５２９：４９０－４９５，２０１６）を示すバリアントを含むことができる。遺伝子編集試薬は、ヌクレアーゼ（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３－８２６，２０１３、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７－７６１，２０１０）、ニッカーゼ（Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９－８２３，２０１３、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １：２６１－２６６，２０１４）、ＣＲＩＳＰＲ－ＦｏｋＩ二量体（Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：５６９－５７６，２０１４）、またはＣＲＩＳＰＲ・ニッカーゼ対（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５４：１３８０－１３８９，２０１３）の形式であり得る。

【0080】

本文書に記載の方法および組成物は、内因性遺伝子のコード配列の３’末端を修飾することが所望される状況で、使用することができる。例えば、ＳＣＡ３またはＳＣＡ６を有する患者は、それぞれ、エキソン１０（最後から２番目のエキソン）およびエキソン４７（最後のエキソン）で拡張されたＣＡＧ反復を有する。ＳＣＡ３またはＳＣＡ６を有する患者は、それぞれ、エキソン１０～１１およびエキソン４７の置き換えから利益を得ることができる。他の例では、内因性遺伝子の３’末端内の機能喪失変異に起因する遺伝性障害を有する患者は、当該遺伝子の最終エキソンの置き換えから利益を得ることができる。

【0081】

本発明は、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定しない以下の実施例でさらに説明される。

【実施例】

【0082】

実施例１ＡＴＸＮ３遺伝子におけるＤＮＡの標的化組み込み
ヒト細胞内のＡＴＸＮ３遺伝子に組み込むように設計された導入遺伝子を用いて、３つのプラスミドを構築した。全ての導入遺伝子は、ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９またはイントロン９とエキソン１０との接合部内に挿入されるように設計され、全ての導入遺伝子は、ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０およびエキソン１１に対して少なくとも１つのスプライスアクセプターおよび少なくとも１つの機能的コード配列を挿入するように設計された。第１のプラスミド（ｐＢＡ１１３５と称される）は、イントロン９の３’末端およびイントロン１０の５’末端に相同な配列を有する左右の相同アームを含んだ（すなわち、遺伝子標的化が成功すると、エキソン１０が除去され、ｐＢＡ１１３５内のカーゴ配列で置き換えられる）。相同アーム間は、５’から３’へ、スプライスアクセプター（ＡＴＸＮ３のイントロン９由来のスプライスアクセプター）、ＡＴＸＮ３のエキソン１０および１１のコード配列、ＳＶ４０ターミネーター、ＢＧＨターミネーター（リバース）、エキソン１０および１１のコード配列（リバース、コドン調整）、ならびにスプライスアクセプター（リバース）であった。ｐＢＡ１１３５導入遺伝子の配列を、配列番号１７に示す。対応するＣａｓ９ヌクレアーゼを、ｉ）ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９内、ｉｉ）ｐＢＡ１１３５の左の相同アーム内、およびｉｉｉ）ｐＢＡ１１３５の右の相同アームの３’末端で、切断するように設計した。プラスミドの切断に成功すると、導入遺伝子が遊離されると予想された。それによって、配列が、ＨＲのための鋳型、またはＮＨＥＪを介した組み込みのための鋳型として、使用されることが可能になる。Ｃａｓ９ ｇＲＮＡ標的部位を、配列番号１８に示す。ｐＢＡ１１３５内の個々の要素を、配列番号４４～５１に示す。配列番号４４は、左の相同アーム、ヌクレアーゼ標的部位、およびスプライスアクセプターを含む。配列番号４５は、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子の部分コード配列（エキソン１０および１１）を含む。配列番号４６は、ＳＶ４０ｐ（Ａ）ターミネーター配列を含む。配列番号４７は、逆相補で、ＢＧＨターミネーターを含む。配列番号４８は、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子の逆相補でコドン調整された部分コード配列（エキソン１０および１１）を含む。配列番号４９は、スプライスアクセプターの配列を含む。配列番号５０は、右の相同アームの配列を含む。配列番号５１は、ヌクレアーゼの標的部位配列を含む。ｐＢＡ１１３６と命名された第２のプラスミドは、ｐＢＡ１１３５と同じカーゴを含むが、相同アームが除去されている。ヌクレアーゼ標的部位は保持され、プラスミドからの導入遺伝子の遊離を促進した。プラスミドの切断に成功することで、導入遺伝子が遊離され、それによってＮＨＥＪによるＡＴＸＮ３遺伝子への組み込みに配列が使用されることが可能になると予想された。ｐＢＡ１１３６の配列を、配列番号１９に示す。ｐＢＡ１１３７と命名された第３のプラスミドは、リバース配列およびヌクレアーゼ標的部位（すなわち、リバースのターミネーター、リバースのコード配列、およびリバースのスプライスアクセプター）を除いて、ｐＢＡ１１３５と同じ配列を含んだ。プラスミドｐＢＡ１１３７を、従来のＨＲベース方法に対する対照として使用した。ｐＢＡ１１３７の配列を、配列番号２０に示す。

【0083】

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、トランスフェクションを行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２ｕｇのドナー、２ｕｇのガイドＲＮＡ（ＲＮＡ形式）、および２ｕｇのＣａｓ９（ＲＮＡ形式）でトランスフェクトした。エレクトロポレーションを使用して、トランスフェクションを行った。トランスフェクションの７２時間後、ゲノムＤＮＡを単離し、組み込み事象について評価した。組み込みまたはゲノムＤＮＡを検出するために使用したプライマーのリストを、表１に示す。

【表1】

【0084】

ｐＢＡ１１３５、ｐＢＡ１１３６およびｐＢＡ１１３７の組み込みを検出するために、ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行った。ｐＢＡ１１３７に関して、導入遺伝子は、ＨＲにより正確に組み込まれるように設計された。したがって、エキソン１０への正確な挿入を示す５’および３’の接合部のＰＣＲにおいて、バンドが検出された（図８レーン４および７）。予想されたバンドサイズは、５’接合部では１，５２０ｂｐ、３’接合部では７８６ｂｐであった。プライマーのｏＮＪＢ１１３およびｏＮＪＢ１１６を、５’接合部のＰＣＲに使用した。プライマーのｏＮＪＢ１６７およびｏＮＪＢ１７０を、３’接合部のＰＣＲに使用した。ｐＢＡ１１３６に関して、相同アームが存在しなかったため、導入遺伝子は、ＮＨＥＪ挿入を介して挿入されることが予測された。導入遺伝子がフォワード方向およびリバース方向に組み込まれている、適切なサイズのバンドが観察された。フォワード方向への組み込みは、図８のレーン３（予想サイズ約１，５２０ｂｐ）およびレーン６（予想サイズ約１，５１９ｂｐ）で見ることができる。リバース方向への組み込みは、図８のレーン１２（約１，５２０ｂｐの予想サイズ）で見ることができる。プライマーのｏＮＪＢ１１３およびｏＮＪＢ１１６を、５’接合部のＰＣＲに使用した。プライマーのｏＮＪＢ１１４およびｏＮＪＢ１７０を、３’接合部のＰＣＲに使用した。プライマーのｏＮＪＢ１１６およびｏＮＪＢ１１４を、インバース５’接合部のＰＣＲに使用した。ｐｐＢＡ１１３５に関して、相同アームおよびヌクレアーゼ切断部位の両方が導入遺伝子に存在した。ＨＲによる組み込みは、５’および３’の接合部のＰＣＲにおけるバンドを検出することによって観察された（図８のレーン２および５）。さらに、ＮＨＥＪによる組み込みは、インバース５’接合部のＰＣＲにおけるバンドを検出することによって観察された（図８のレーン１０）。５’接合部のＰＣＲの予想サイズは、１，５２０ｂｐであった。３’接合部のＰＣＲの予想サイズは、１，１５７ｂｐであった。インバース５’接合部のＰＣＲの予想されるサイズは、約１，５２０ｂｐであった。プライマーのｏＮＪＢ１１３およびｏＮＪＢ１１６を、５’接合部のＰＣＲに使用した。プライマーのｏＮＪＢ１１４およびｏＮＪＢ１７０を、３’接合部のＰＣＲに使用した。プライマーのｏＮＪＢ１１６およびｏＮＪＢ１１４を、インバース５’接合部のＰＣＲに使用した。

【0085】

結果は、双方向の部分コード配列を含む記載の導入遺伝子が、複数の異なる修復経路を介してゲノムＤＮＡに組み込まれ得ることを示している。

【0086】

実施例２：ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子におけるＤＮＡの標的化組み込み
ＣＡＣＮＡ１Ａを標的とする導入遺伝子が、ＣＡＣＮＡ１Ａコード配列の３’末端を置き換えるように設計される。プラスミドは、ＷＴコード配列をイントロン４６またはエキソン４７の開始部に組み込むように設計された導入遺伝子を用いて構築される（図４）。導入遺伝子は、イントロン４６内のスプライスドナー部位の直後の配列と相同な第１の相同アームを含む。第１の相同アームはまた、ヌクレアーゼ（配列番号９）の標的部位およびスプライスアクセプター配列を含む。第１の相同アームの後には、ＣＡＣＮＡ１Ａのエキソン４７および非拡張ＣＡＧ反復配列（配列番号３）を含む第１のコード配列が続く。第１のコード配列に続いて、ＳＶ４０ポリ（Ａ）終端配列（配列番号４）がある。尾対尾配向では、第２のセットの機能性エレメントが存在する。第２のセットのエレメントの開始部は、ヌクレアーゼ（配列番号９）の標的部位、続いて第２の相同アームを含む。第２の相同アームは、４４６ｂｐを保有し、コード停止直後の配列に相同である（配列番号８）。この配列は、インシリコ分析を介して、コンセンサス分岐配列またはスプライスアクセプター配列を含まないと決定された。続いて、第２の相同アームは、コイβアクチンのイントロン１由来の第２のスプライスアクセプターである（配列番号７）。スプライスアクセプターに続いて、ＣＡＣＮＡ１Ａのエキソン４７（配列番号６）のコドン最適化バージョンおよびｂＧＨポリ（Ａ）ターミネーター（配列番号５）がある。

【0087】

対応するＣａｓ１２ａヌクレアーゼは、プラスミドのトランスフェクション後に、３つの二本鎖切断：ｉ）内因性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン４６内の切断、２）ｐＢＡ１０１１－Ｄ１導入遺伝子の第１の相同アーム内の切断、および３）ｐＢＡ１０１１－Ｄ１導入遺伝子の第２の相同アームの後の切断を創出するように設計される。Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼの標的配列は、配列番号９に示される。

【0088】

導入遺伝子およびＣＲＩＳＰＲベクターの機能の確認は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって達成される。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、ＤＮＡを抽出し、ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子内の変異および標的化挿入について評価する。ヌクレアーゼ活性は、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用するか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ標的配列を含むアンプリコンのディープ配列決定によって分析される。導入遺伝子の組み込みの成功を、ＰＣＲを使用して分析する（図５）。

【0089】

実施例３：ＡＴＸＮ３遺伝子におけるＤＮＡの標的化組み込み
ＡＴＸＮ３を標的とする導入遺伝子が、ＡＴＸＮコード配列（エキソン１０および１１）の３’末端を置き換えるように設計される。プラスミドは、ＷＴコード配列をイントロン９またはエキソン１０の開始部に組み込むように設計された導入遺伝子を用いて構築される（図５）。導入遺伝子は、イントロン９（配列番号１０）の配列と相同である第１の相同アームを含む。第１の相同アームはまた、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼの標的部位およびスプライスアクセプター配列を含む。第１の相同アームの後に、ＡＴＸＮ３エキソン１０および１１、ならびに非拡張ＣＡＧ反復配列を含む第１のコード配列が続く。第１のコード配列に続いて、ＳＶ４０ポリ（Ａ）終端配列がある。尾対尾配向では、第２のセットの機能性エレメントが存在する。第２のエレメントのセットの開始部は、Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼの標的部位、続いて第２の相同アームを含む。第２の相同アームは、３７９ｂｐを保有し、エキソン１０の末端（すなわち、イントロン１０の開始部）の直後の配列に相同である。この配列は、インシリコ分析で、限られた数の潜在的な分岐配列またはスプライスアクセプター配列を有すると決定された。第２の相同アームに続いて、コイβアクチンのイントロン１由来の第２のスプライスアクセプターがある。スプライスアクセプターに続いて、ＡＴＸＮ３のエキソン１０および１１のコドン最適化バージョン、ならびにｂＧＨポリ（Ａ）ターミネーターがある。

【0090】

対応するＣａｓ１２ａヌクレアーゼは、プラスミドのトランスフェクション後に、ｉ）内因性ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９内、２）ｐＢＡ１０１２－Ｄ１導入遺伝子の第１の相同アーム内、および３）ｐＢＡ１０１２－Ｄ１導入遺伝子の第２の相同アームの後の３つの二本鎖切断を創出するように設計される。Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼの標的配列を配列番号１１に示す。

【0091】

導入遺伝子およびＣＲＩＳＰＲベクターの機能の確認は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって達成される。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、ＤＮＡを抽出し、ＡＴＸＮ３遺伝子内の変異および標的化挿入について評価する。ヌクレアーゼ活性は、Ｃｅｌ－Ｉアッセイを使用するか、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａ標的配列を含むアンプリコンのディープ配列決定によって分析される。導入遺伝子の組み込みの成功を、ＰＣＲを使用して分析する（図７）。

【0092】

実施例４：Ｃａｓ１２ｋトランスポザーゼを使用したＡＴＸＮ３遺伝子におけるＤＮＡの標的化組み込み
ＡＴＸＮ３を標的とする導入遺伝子が、ＡＴＸＮのコード配列（エキソン１０および１１）の３’末端を置き換えるように設計される。プラスミドは、ＷＴコード配列をイントロン９またはエキソン１０の開始部に組み込むように設計された導入遺伝子を用いて構築される。導入遺伝子は、トランスポゾンの左右の末端、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列（エキソン１０および１１からのアミノ酸をコードする）、ならびに第１および第２のターミネーターを含む。トランスポゾンの左右の末端間の配列を、配列番号１７に示す。

【0093】

プラスミドは、真核生物プロモーターを使用して、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｈｏｆｍａｎｎｉのｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ｔｎｉＱ、およびＣａｓ１２ｋ（配列番号３０）を発現するように操作される。第２のプラスミドは、対応するＣａｓ１２ｋガイドＲＮＡ（配列番号１４）を発現するように操作される。ガイドＲＮＡの標的化配列：ＣＣＧＣＣＣＧＡＣＣＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣ（配列番号１５）。Ｃａｓ１２ｋトランスポゾンプラスミドは、ＡＴＸＮ３を標的とする導入遺伝子を保有するプラスミドと共に、ＨＥＫ２９３細胞に共形質転換される。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、ＤＮＡを抽出し、ＡＴＸＮ３遺伝子内の標的化挿入について評価する。導入遺伝子の組み込みを、ＰＣＲを使用して分析する。

【0094】

実施例５：ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子におけるＤＮＡの標的化組み込み
ＣＡＣＮＡ１Ａを標的とする導入遺伝子が、ＣＡＣＮＡ１Ａのコード配列の３’末端を置き換えるように設計される。プラスミドは、ＷＴコード配列をイントロン４６またはエキソン４７の開始部に組み込むように設計された導入遺伝子を用いて構築される。導入遺伝子は、トランスポゾンの右左の末端、第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列（エキソン４７由来のアミノ酸をコードする）、ならびに第１および第２のターミネーターを含む。

【0095】

プラスミドは、真核生物プロモーターを使用して、Ｓｃｙｔｏｎｅｍａ ｈｏｆｍａｎｎｉのｔｎｓＢ、ｔｎｓＣ、ｔｎｉＱ、およびＣａｓ１２ｋ（配列番号３０）を発現するように操作される。第２のプラスミドは、対応するＣａｓ１２ｋガイドＲＮＡ（配列番号１４）を発現するように操作される。ガイドＲＮＡは、配列ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＧＡＣＣ（配列番号１６）を標的とするように設計される。Ｃａｓ１２ｋトランスポゾンプラスミドは、ＡＴＸＮ３を標的とする導入遺伝子を保有するプラスミドと共に、ＨＥＫ２９３細胞に共形質転換される。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％のペニシリンストレプトマイシン（ＰＳ）溶液（×１００）が補充され、Ｌ－グルタミンとピルビン酸ナトリウムとを含まないＤＭＥＭ高グルコース培地中で、３７℃、５％ＣＯ_２で維持する。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００を使用して、プラスミド構築物およびそれらの組み合わせの各々でトランスフェクトする。トランスフェクションの２日後、ＤＮＡを抽出し、ＡＴＸＮ３遺伝子内の標的化挿入について評価する。導入遺伝子の組み込みを、ＰＣＲを使用して分析する。

【0096】

他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて説明されているが、上述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図するものであり、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、および変更は、以下の特許請求の範囲内にある。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスアクセプター配列、
ｉｉ．第１および第２の部分コード配列、ならびに
ｉｉｉ．１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター、を含む、導入遺伝子を投与することと、
ｂ．前記内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目２）
前記第１のスプライスアクセプターが、前記第１の部分コード配列に作動可能に連結され、前記第２のスプライスアクセプターが、前記第２の部分コード配列に作動可能に連結される、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記第１の部分コード配列が、前記第１のターミネーターに作動可能に連結され、前記第２の部分コード配列が、前記第２のターミネーターに作動可能に連結される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記第１および第２の部分コード配列が、前記双方向ターミネーターに作動可能に連結される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記第１および第２のスプライスアクセプター、第１および第２のコード配列、ならびに第１および第２のターミネーターが、尾対尾配向（ｔａｉｌ－ｔｏ－ｔａｉｌ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）で配向される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記導入遺伝子が、１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記導入遺伝子が、前記第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する左右の相同アームをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
前記導入遺伝子がアデノ随伴ウイルスベクター内に保有される、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記導入遺伝子が、前記１つ以上のレアカッティングエンドヌクレアーゼの第１および第２の標的部位をさらに含み、前記標的部位が、前記第１および第２のスプライスアクセプターに隣接する、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記第１および第２の標的部位が、前記第１および第２の相同アームに隣接する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子のイントロン内、またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれる、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記導入遺伝子が、ＡＴＸＮ３遺伝子またはＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン内またはイントロン－エキソン接合部に組み込まれる、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記導入遺伝子が、非病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のエキソン１０によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含み、病原性ＡＴＸＮ３遺伝子のイントロン９またはイントロン９－エキソン１０接合部を標的とする、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記導入遺伝子が、非病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のエキソン４７によって産生されるペプチドをコードする第１および第２の部分コード配列を含み、病原性ＣＡＣＮＡ１Ａ遺伝子のイントロン４６またはイントロン４６－エキソン４７接合部を標的とする、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２ａヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記第１および第２の部分コード配列が、同じアミノ酸をコードする、項目１に記載の方法。
（項目１７）
前記第１および第２のコード配列が、核酸配列において異なるが、同じアミノ酸をコードする、項目１に記載の方法。
（項目１８）
前記導入遺伝子が、ベクターに保有され、前記ベクターの形式が、二本鎖直鎖ＤＮＡ、二本鎖環状ＤＮＡ、またはウイルスベクターから選択される、項目１に記載の方法。
（項目１９）
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクターから選択される、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記導入遺伝子が、４．７ｋｂ以下である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記内因性遺伝子が、前記部分コード配列の野生型遺伝子である、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記内因性遺伝子が、異常であり、前記部分コード配列が、前記内因性遺伝子の機能性バージョン由来の部分タンパク質をコードする、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
ＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ａ．第１および第２のスプライスアクセプター配列と、
ｂ．第１および第２の部分コード配列と、
ｃ．１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーターと、
ｄ．任意選択的に、第１および第２の相同アームと、
ｅ．任意選択的に、第１および第２のレアカッティングエンドヌクレアーゼ標的部位と、を含む、ＤＮＡポリヌクレオチド。
（項目２４）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．左右のトランスポゾン末端、
ｉｉ．第１および第２のスプライスアクセプター配列、
ｉｉｉ．第１および第２の部分コード配列、ならびに
ｉｖ．１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター、を含む、導入遺伝子を投与することと、
ｂ．トランスポザーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目２５）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスアクセプター配列、
ｉｉ．第１および第２のコード配列、ならびに
ｉｉｉ．１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター、を含む、導入遺伝子を投与することと、
ｂ．前記内因性遺伝子内の部位を標的とする少なくとも１つのレアカッティングエンドヌクレアーゼを投与することと、を含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。
（項目２６）
導入遺伝子を内因性遺伝子に組み込む方法であって、
ａ．導入遺伝子を投与することであって、前記導入遺伝子が、
ｉ．第１および第２のスプライスアクセプター配列、
ｉｉ．第１および第２のコード配列、
ｉｉｉ．１つの双方向ターミネーター、または第１および第２のターミネーター、ならびに
ｉＶ．第１および第２の相同アーム、を含む、導入遺伝子を投与することを含み、
前記導入遺伝子が、前記内因性遺伝子内に組み込まれる、方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【配列表】

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