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特許7460782癌及び／又は脳疾患バイオマーカーであるＥＤＢ－ＦＮ及びこれを標的とするナノ薬物伝達体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-25
(45)【発行日】2024-04-02
(54)【発明の名称】癌及び／又は脳疾患バイオマーカーであるＥＤＢ－ＦＮ及びこれを標的とするナノ薬物伝達体
(51)【国際特許分類】
A61K 47/44 20170101AFI20240326BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20240326BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240326BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240326BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240326BHJP
A61K 31/337 20060101ALI20240326BHJP
C07K 14/00 20060101ALN20240326BHJP
【ＦＩ】
A61K47/44
A61K9/107
A61P35/00
A61P25/00
A61K45/00
A61K31/337
C07K14/00 ZNA
【請求項の数】
8
(21)【出願番号】P 2022547050
(86)(22)【出願日】2021-02-17
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-05
(86)【国際出願番号】 KR2021002008
(87)【国際公開番号】W WO2021167339
(87)【国際公開日】2021-08-26
【審査請求日】2022-08-01
(31)【優先権主張番号】10-2020-0020537
(32)【優先日】2020-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0018153
(32)【優先日】2021-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】510273880
【氏名又は名称】コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション
【氏名又は名称原語表記】ＫＯＲＥＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＢＵＳＩＮＥＳＳ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(73)【特許権者】
【識別番号】514291196
【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティチュート オブ サイエンス アンド テクノロジー
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100196977
【弁理士】
【氏名又は名称】上原 路子
(72)【発明者】
【氏名】チョン キュハ
(72)【発明者】
【氏名】フェイ エル サウ
(72)【発明者】
【氏名】イ チョンソル
【審査官】伊藤 幸司
(56)【参考文献】
【文献】米国特許出願公開第２０１５／０１４８４２８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】BAOJ Pharm Sci，2015年，1(1)，001
【文献】J. Mater. Chem. B，2013年，1，pp.4723-4726
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）システイン残基を含むＡＰＴＥＤＢ及びＭａｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥを有機溶媒に１：２モル比で混合して重合反応を誘導する工程、（２）前記（１）工程の混合溶液からＡＰＴＥＤＢ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥポリマーを得る工程、
（３）前記ＡＰＴ ＥＤＢ ‐ＰＥＧ ２０００ －ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ ２０００ －ＤＳＰＥ重合脂質を超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）で再水化した後、溶媒をＰＢＳに変更してミセル構造体形成を誘導する工程、及び
（４）前記（３）工程の混合溶液を濾過し、ミセル構造体を精製する工程、
を含む脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法であって、
前記（１）工程のＡＰＴＥＤＢは、フィブロネクチンエキストラドメインＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３５）に特異的な結合力を示すアプチドであり、
前記（３）工程で、ＰＥＧ ２０００ －ＤＳＰＥ重合脂質１００重量部基準でＡＰＴ ＥＤＢ －ＰＥＧ ２０００ －ＤＳＰＥポリマーを１～２．５重量部を混合することを特徴とする、製造方法。
【請求項2】
前記（１）工程の有機溶媒は、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、トルエン、キシレン及びヘキサンからなる群から選択される１種以上であることを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法。
【請求項3】
前記（１）工程は、常温で１２時間、不活性条件保持下で実行されることを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法。
【請求項4】
前記（２）工程は、液体クロマトグラフィーを使用して混合溶液からＡＰＴＥＤＢ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥポリマーを得ることを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法。
【請求項5】
前記（３）工程は、ＡＰＴＥＤＢ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ重合脂質とを溶媒に再水化し、音波破砕を行って水和させてミセル構造体形成を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法。
【請求項6】
前記（４）工程は、０．０２５～０．１μｍの膜で混合溶液を濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーを介してミセル構造体を精製することを特徴とする、請求項１に記載の脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法。
【請求項7】
請求項１の（１）～（４）工程を含み、前記（３）工程は、ＡＰＴＥＤＢ－ＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥポリマー及びＰＥＧ２０００－ＤＳＰＥ重合脂質が溶解した溶液に抗癌剤をさらに混合することによりミセル構造体形成を誘導するものである、脳腫瘍治療用の薬剤の製造方法。
【請求項8】
前記抗癌剤を最終濃度が５０ｇ／ｍＬになるように混合することを特徴とする、請求項７に記載の脳腫瘍治療用の薬剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、脳腫瘍で過剰発現するフィブロネクチンエキストラドメインＢ（ｅｘｔｒａｄｏｍａｉｎ Ｂ ｏｆ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＥＤＢ－ＦＮ）を標的とするナノ薬物伝達体などに関する。
【背景技術】
【0002】
悪性神経膠腫（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇｌｉｏｍａ、ＭＧ）は、積極的な治療によっても良くなりにくい恐ろしい腫瘍のうちの１つである。多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ、ＧＢＭ）は、最も悪性でありふれた神経膠腫であり、外科的及び内科的治療においても生存期間の平均値が２年以下である。悪性神経膠腫は、急速に増殖し、侵襲性が高いだけでなく、血液脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ）との細胞異質性（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）及び脳血管腫瘍障壁（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢＢＴＢ）により、治療が困難である。上記の限界を克服するために、脳腫瘍分類に対する分子的、遺伝的な研究がより重要とされる実状である。これは、病理学的分類に分子生物学を融合し、診断的、治療的戦略を改善することに影響を与えた。
【0003】
現在利用されている代表的な表現型・遺伝子型の診断マーカーは、以下の通りである。Ｏ6－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮＡ）ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ＭＧＭＴ）ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－１（ＩＤＨ－１）ｍｕｔａｔｉｏｎ、及びｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ １ｐ／１９ｑ ｄｅｌｅｔｉｏｎ。上記のマーカーを評価することは、患者一人一人に合った治療を提案し、予後を予測するのに大きな影響を与える。また、ａｌｐｈａ－ｔｈａｌａｓｓｅｍｉａ／ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ、及びｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓなどの他の多くのバイオマーカーはまだ検証中であり、上記のマーカーの有効性は、盛んに立証されている。しかし、これまでのところ、ほとんどのバイオマーカーは、悪性神経膠腫で評価及び立証され、治療剤として発展することができない実状である。従って、効果的な診断及び治療を提供することのできるバイオマーカーの発掘が依然として必要とされている。
【0004】
フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）は、細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ）及び原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）で主に発見される糖タンパク質（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。これは、インテグリン、コラーゲン、及びフィブリンなどの様々な細胞外基質タンパク質に結合しながら細胞移動及び接着を調節する。フィブロネクチン単量体は、反復するユニットに応じて３つのタイプの類型（タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ）に分類される。フィブロネクチン遺伝子の３つの領域で製造された選択的スプライシングドメインは、一定のスプライシングパターンを有する。生成された同型タンパク質（ｉｓｏｆｏｒｍ）は、タイプＩＩＩの反復ユニットに位置するスプライシング部位に従って命名される。フィブロネクチンのエキストラドメインＡ（ｅｘｔｒａ－ｄｏｍａｉｎ Ａ、ＥＤＡ－ＦＮ）、エキストラドメインＢ（ｅｘｔｒａ－ｄｏｍａｉｎ Ｂ、ＥＤＢ－ＦＮ）、及びタイプＩＩＩの接続の部分（ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｃｏｎｎｅｃｔｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔ、ＩＩＩＣＳ－ＦＮ）。ＥＤＢ－ＦＮは、腫瘍胎児性抗原（ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）である。ＥＤＢ－ＦＮは、非小細胞肺癌（ｎｏｎ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、ホジキンリンパ種（Ｈｏｄｇｋｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、及び前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）などの様々なヒト癌で過剰発現する。また、ＥＤＢ－ＦＮは、頭頸部癌（ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ）の新血管新生マーカーとして活用される。脳におけるフィブロネクチンの役割にもかかわらず、ＥＤＢ－ＦＮは、患者の主要な多形性膠芽腫を診断するための追跡ツールとして活用できることはもちろん、げっ歯類モデルにおける多形性膠芽腫治療及び神経膠腫放射免疫治療（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）の新規標的として提案された。ＥＤＢ－ＦＮに対する研究が盛んに行われているにもかかわらず、ＥＤＢ－ＦＮの役割はまだ明らかにされていない。
【0005】
従来、全ての主要臓器の癌におけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルを比較する研究は行われておらず、生物情報学データセットを用いたＥＤＢ－ＦＮ発現による予後予測を含む研究はまだ行われていない。
【0006】
従来、ＥＤＢ－ＦＮを標的とする特異的なサイズが３４ｎｍサイズの無機物超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、ＳＰＩＯＮｓ）ナノ薬物伝達体、又は１１５±１３ｎｍサイズのリポソーム構造の薬物伝達体に関する研究が行われたが、１２ｎｍ以上のサイズのナノ薬物伝達体の場合、血液脳関門及び脳血管腫瘍障壁の限界に至り、前臨床から薬物伝達に限界を示した結果が報告された。従って、本発明者らは、悪性神経膠腫に対する潜在的な診断バイオマーカーとしてＥＤＢ－ＦＮを研究し、これを標的とする１２ｎｍ以下のサイズを有するマイセル構造のナノ薬物伝達体を開発することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明が達成しようとする技術的課題は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質及びＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを含むマイセル構造の薬物伝達体を提供することにあり、前記ＡＰＴEDBは、フィブロネクチンエキストラドメインＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）遺伝子（ＦＮ１、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３５）に特異的な結合力を示すアプチドである。
【0008】
また、本発明の他の目的は、薬物がロードされた前記薬物伝達体を有効成分として含む脳腫瘍診断又は治療用の医薬組成物を提供することにある。
【0009】
また、本発明の他の目的は、以下の工程を含む脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法を提供することにある。
（１）システイン残基を含むＡＰＴEDB及びＭａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを有機溶媒に１：２モル比で混合して重合反応を誘導する工程、
（２）前記（１）工程の混合溶液からＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを得る工程、
（３）水、ＰＢＳ、ＨＢＳ、及びＨＢＧからなる群から１種以上選択される溶媒に、前記ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質とを混合してマイセル構造体形成を誘導する工程、及び
（４）前記（３）工程の混合溶液を濾過し、マイセル構造体を精製する工程。
（１）システイン残基を含むＡＰＴEDB及びＭａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを有機溶媒に１：２モル比で混合して重合反応を誘導する工程、
（２）前記（１）工程の混合溶液からＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを得る工程、
（３）水、ＰＢＳ、ＨＢＳ、及びＨＢＧからなる群から１種以上選択される溶媒に、前記ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質とを混合してマイセル構造体形成を誘導する工程、及び
（４）前記（３）工程の混合溶液を濾過し、マイセル構造体を精製する工程。
【0010】
また、本発明の他の目的は、前記（１）～（４）工程を含み、前記（３）工程は、ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマー及びＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質が溶解した溶液に抗癌剤をさらに混合することによりマイセル構造体形成を誘導するものである、脳腫瘍治療用の薬剤の製造方法を提供することにある。
【0011】
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に限定されず、言及されていない他の課題は、下記記載によって当技術分野の当業者に明確に理解されよう。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記の課題を解決するために、本発明は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質及びＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを含むマイセル構造の薬物伝達体を提供する。
【0013】
本発明の一実施例として、前記ＡＰＴEDBは、フィブロネクチンエキストラドメインＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）遺伝子（ＦＮ１、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３５）に特異的な結合力を示すアプチドである。
【0014】
本発明の他の実現例として、前記薬物伝達体は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質１００重量部基準でＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを１から２．５重量部含むことができる。
【0015】
本発明のまた他の実現例として、前記薬物伝達体の直径は、５．０から１２．０ｎｍであり、ゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）は、－８．０から－１１．０であり得る。
【0016】
本発明のまた他の実現例として、前記薬物伝達体は、血液脳関門（ＢＢＢ）又は脳血管腫瘍障壁（ＢＢＴＢ）を通過して脳腫瘍細胞に特異的に薬物を送達してもよい。
【0017】
また、本発明は、薬物がロードされた前記薬物伝達体を有効成分として含む、脳腫瘍診断又は治療用の医薬組成物を提供する。
【0018】
また、本発明は、薬物がロードされた前記薬物伝達体を個体に投与することを含む、脳腫瘍予防又は治療方法を提供する。
【0019】
また、本発明は、脳腫瘍予防又は治療用の薬剤の製造のための前記薬物がロードされた薬物伝達体の用途を提供する。
【0020】
また、本発明は、薬物がロードされた前記薬物伝達体を個体に投与することを含む、脳腫瘍の診断方法を提供する。
【0021】
また、本発明は、脳腫瘍の診断用薬剤の製造のための前記薬物がロードされた薬物伝達体の用途を提供する。
【0022】
本発明の一実施例として、前記薬物は、造影剤又は抗癌剤であり、前記抗癌剤は、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、ハラベン（Ｈａｌａｖｅｎ）、ビンクリスチン（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ビンブラスチン（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（Ｖｉｎｏｒｅｌｖｉｎｅ）、パクリタキセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、エトポシド（Ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、トポテカン（Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン（Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、ダクチノマイシン（Ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（Ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、グリベック（ｇｌｅｅｖｅｃ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、バルルビシン（ｖａｌｒｕｂｉｃｉｎ）、フルタミド（ｆｌｕｔａｍｉｄｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ブレオマイシン（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、プロカルバジン（Ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、ロムスチン（Ｌｏｍｕｓｔｉｎｅ、ＣＣＮＵ；１－（２－ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－３－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－１－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ビンクリスチン及びカルムスチン（Ｃａｒｍｕｓｔｉｎｅ、ＢＣＮＵ）などからなる群から選択されるいずれか１つ以上であってもよい。
【0023】
本発明の他の実現例として、前記脳腫瘍は、星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、多形性膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、乏突起細胞腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｇｌｉｏｍａ）、乏突起星細胞腫（ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａ）、上衣細胞腫（ｅｐｅｎｄｙｍｏｍａ）、血管芽細胞腫（ｍｅｄｕｌｌｏｂｌａｓｔｏｍａ）、血管芽細胞腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）、髄膜腫（ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａ）、下垂体腺腫（ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ａｄｅｎｏｍａ）、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｉｏｍａ）、及び脈絡叢乳頭腫（ｃｈｏｒｏｉｄ ｐｌｅｘｕｓ ｐａｐｉｌｌｏｍａ）からなる群から選択されるいずれか１つ以上であってもよい。
【0024】
また、本発明は、以下の工程を含む脳腫瘍特異的薬物伝達体の製造方法を提供する。
（１）システイン残基を含むＡＰＴEDB及びＭａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを有機溶媒に１：２モル比で混合して重合反応を誘導する工程、
（２）前記（１）工程の混合溶液からＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを得る工程、
（３）水、ＰＢＳ、ＨＢＳ、及びＨＢＧからなる群から１種以上選択される溶媒に、前記ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質とを混合してマイセル構造体形成を誘導する工程、及び
（４）前記（３）工程の混合溶液を濾過し、マイセル構造体を精製する工程。
（１）システイン残基を含むＡＰＴEDB及びＭａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを有機溶媒に１：２モル比で混合して重合反応を誘導する工程、
（２）前記（１）工程の混合溶液からＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを得る工程、
（３）水、ＰＢＳ、ＨＢＳ、及びＨＢＧからなる群から１種以上選択される溶媒に、前記ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質とを混合してマイセル構造体形成を誘導する工程、及び
（４）前記（３）工程の混合溶液を濾過し、マイセル構造体を精製する工程。
【0025】
本発明の一実施例として、前記（１）工程の有機溶媒は、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、エタノール、メタノール、テトラヒドロフラン、トルエン、キシレン、及びヘキサンからなる群から選択される１種以上であってもよい。
【0026】
本発明の他の実現例として、前記（１）工程は、常温で１２時間、不活性条件保持下で実行されてもよい。
【0027】
本発明のまた他の実現例として、前記（２）工程は、液体クロマトグラフィーを使用して混合溶液からＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを得ることもできる。
【0028】
本発明のまた他の実現例として、前記（３）工程は、ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーとＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質とを溶媒に混合し、音波破砕を行って水和させてマイセル構造体形成を誘導することもできる。
【0029】
本発明のまた他の実現例として、前記（４）工程は、０．００２５～０．１μｍの膜（ｍｅｍｂｒａｎｅ）で混合溶液を濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーを介してマイセル構造体を精製することもできる。前記膜は、好ましくは０．１μｍの膜であり得る。
【0030】
また、本発明は、前記製造方法で製造された脳腫瘍特異的薬物伝達体として、５．０から１２．０ｎｍの直径を有し、－８．０から－１１．０のゼータ電位であるマイセル構造体であることを特徴とする、薬物伝達体を提供する。
【0031】
また、本発明は、前記製造方法の（１）～（４）工程を含み、前記（３）工程は、ＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマー及びＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質が溶解した溶液に抗癌剤をさらに混合することによりマイセル構造体形成を誘導するものである、脳腫瘍治療用の薬剤の製造方法を提供する。
【0032】
本発明の一実施例として、前記抗癌剤を最終濃度が５０ｇ／ｍＬになるように混合することもできる。
【0033】
本発明の他の実現例として、前記薬剤は、血液脳関門（ＢＢＢ）又は脳血管腫瘍障壁（ＢＢＴＢ）を通過して脳腫瘍内部に蓄積され、腫瘍細胞内部に陥入されてもよい。
【発明の効果】
【0034】
本発明は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質及びＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを含むマイセル構造の薬物伝達体及びその製造方法に関する。前記薬物伝達体は、脳腫瘍で過剰発現するフィブロネクチンエキストラドメインＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）を標的とし、血液脳関門（ＢＢＢ）又は脳血管腫瘍障壁（ＢＢＴＢ）を通過して脳腫瘍細胞に特異的に薬物を送達することができる。また、本発明は、薬物がロードされた前記薬物伝達体を有効成分として含む脳腫瘍診断又は治療用の医薬組成物を提供することができ、前記組成物は、脳腫瘍内部に蓄積され、腫瘍細胞内部に陥入されて特異的に腫瘍成長を抑制することができ、脳腫瘍診断又は治療に有用に活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【図1】ＥＤＢ－ＦＮの発現を立証するために、悪性神経膠腫細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの過剰発現を示したものである。（Ａ）は、様々な癌細胞株の２Ｄ培養におけるＥＤＢ－ＦＮ発現パターンを示している（スケールバー＝１００μｍ）。緑は、ＥＤＢ－ＦＮを示し、青は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を示す。（Ｂ）は、様々な癌の２Ｄ培養された細胞から総ＲＮＡを抽出した後、定量的なリアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）を使用してＥＤＢ－ＦＮ ｍＲＮＡ発現分析を行った結果を示したものである。２-ΔΔCtが使用され、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ ３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を内部対照群として設定した。３Ｄ培養で免疫蛍光染色によってＥＤＢ－ＦＮ発現パターンを確認した（スケールバー＝２００μｍ）。（Ｃ）は、皮下移植された癌組織を示している（スケールバー＝１００μｍ）。（Ｄ）は、悪性神経膠腫細胞株を示したものである。（Ｅ）は、Ｕ３７３ＭＧ細胞（２Ｄ単層培養）又はＵ８７ＭＧ細胞（２Ｄ単層培養、３Ｄ回転楕円体培養、及び皮下腫瘍組織）から抽出した総ＲＮＡを使用してｑＲＴ－ＰＣＲ分析を行った結果である。統計学的分析：ウェルチのｔ検定（Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｔ ｔｅｓｔ）。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：統計学的に有意ではない。上記の結果は、四重極型分析（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）の平均±標準偏差で示した。ＥＤＢ－ＦＮ：フィブロネクチンエキストラドメインＢ；ＭＧ：悪性神経膠腫。
【0036】
【図2】合成ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの特性分析を示したものである。（Ａ）は、Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥとｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ ＡＰＴEDBを用いた合成方法及びドセタキセルでカプセル化したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ）の代表的な製剤を示したものである。（Ｂ）は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（ＡＰＴEDB－ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）とＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓ（ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）の動的光散乱（ＤＬＳ）サイズ測定を示したものであり、両ナノ粒子は、１２ｎｍより小さかった（グループごとに３つの複製（３ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ））。（Ｃ）は、全てのナノ粒子製剤が負のゼータ電位（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有することを示したものである。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ濃度が増加するにつれて、ナノ－ＤＤＳのゼータ電位は、さらに負の方向になる。統計学的分析：ウェルチのｔ検定。＊ｐ＜０．０５、ｎｓ：統計学的に有意ではない。上記の結果は、四重極型分析（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）の平均±標準偏差で示した。ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ：ポリエチレングリコール（2000）－１、２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（アンモニウム塩（ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ））；Ｒｈ－ＤＳＰＥ：ＤＳＰＥ－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）。
【0037】
【図3】ＥＤＢ－ＦＮ発現によるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞の取り込みを示したものである。ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥの取り込み実験及び競合分析は、（Ａ）ＥＤＢ－ＦＮ高発現細胞（Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１）、及び（Ｂ）低発現細胞（ＭＣＦ７及びＢ１６Ｆ１）で行った。リン酸緩衝食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）を対照群と比較した。ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ、及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥは、ＡＰＴEDB処理又は処理なしで細胞株に添加し、ローダミンＢ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）－標識されたマイセルＤＤＳの取り込み（赤）を共焦点顕微鏡で確認した（スケールバー＝１００μｍ）。ＡＰＴEDB：ＥＤＢ－ＦＮ－特異的アプタマー類似ペプチド；ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ：ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ；ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ：ポリエチレングリコール（2000）－１、２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン。
【0038】
【図4】ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビトロＥＤＢ－ＦＮ－及び時間依存的細胞の取り込みを示したものである。（Ａ）は、ｑＲＴ－ＰＣＲを介してｓｉＲＮＡ－媒介ＥＤＢ－ＦＮのノックダウンを確認したものである。内部対照群としてＧＡＰＤＨ発現を使用した。統計学的分析：ウェルチのｔ検定。＊＊ｐ＜０．０１．上記の結果は、三重性決定（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）の平均±標準偏差で示した。（Ｂ）は、ＥＤＢ－ＦＮ発現によるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの細胞の取り込みを示したものである。染色画像上にｓｉＲＮＡ形質導入されたＵ８７細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ（緑）、ローダミンＢ－標識されたＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（赤）、及び細胞核（ｎｕｃｌｅｉ）（青）を示す。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）は、Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの時間依存的細胞の取り込みを示したものである。赤：ローダミンＢ－標識されたＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ、青：ＤＡＰＩ、スケールバー＝１００μｍ。ＮＰ：ナノ粒子。
【0039】
【図5】ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸマイセルナノ－ＤＤＳのインビトロ細胞の取り込み及び細胞毒性を示したものである。（Ａ）は、悪性神経膠腫におけるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥの濃度によるローダミンＢフルオロフォア－標識されたナノ－ＤＤＳｓの細胞の取り込みを示している（左）。赤：ナノ－ＤＤＳｓ、青：ＤＡＰＩ、スケールバー＝１００μｍ。ＩｍａｇｅＪによるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ細胞の取り込みの数量化分析（Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）を示している（右）。蛍光強度は、各細胞株のＤＡＰＩ信号で正規化した（四重極型分析（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ））。（Ｂ）は、Ｕ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧ細胞でＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビトロ細胞毒性を示したものである。ナノ－ＤＤＳ下のＯ．Ｄ．値をＰＢＳ処理下のＯ．Ｄ．値で割ることによって（ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、７つの複製（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、６つの複製）、Ｙ軸の％細胞生存率を算出した。（Ｃ）は、治療するのに用いたナノ粒子の種類によって算出した（ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、７つの複製、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、６つの複製）、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞におけるＩＣ50値を示したものである。統計学的分析：ウェルチのｔ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：統計学的に有意ではない。上記の結果は、平均±標準偏差で示した。Ａ．Ｕ：任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔ）。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ：ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ；ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ＤＴＸ－ｌｏａｄｅｄ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ；ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ＤＴＸ－ｌｏａｄｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ；ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ；ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ：ポリエチレングリコール（2000）－ＤＳＰＥ（アンモニウム塩）。
【0040】
【図6】Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植マウスモデルでＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）取り込み及び抗癌効果を示したものである。（Ａ）は、Ｕ８７ＭＧ異種移植腫瘍保持げっ歯類モデルにおける（ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ取り込みのＩＶＩＳローダミンＢリアルタイム画像を示したものである。スケールバー＝１０ｍｍ。（Ｂ）は、薬物治療によるＵ８７ＭＧ異種移植腫瘍成長曲線を示したものである。マウスにおける腫瘍のサイズを３日ごとに測定した（ｎ＝４ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。赤の矢印は、薬剤ＩＶ注入スケジュール（ｄｒｕｇ ＩＶ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｓｃｈｅｄｕｌｅ）を示したものである。（Ｃ）は、マイセルナノ－ＤＤＳの抗癌効果を示したものである。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ、又は塩分（ｓａｌｉｎｅ）処理による腫瘍サイズの変化を示し、塩分を陰性対照群と比較した（ｎ＝４ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。（Ｄ）は、異種移植モデルから切開した腫瘍の代表的な画像を示したものである。薬物処理したマウスを各々７、１０、１４、及び１７日目に犠牲にした（ｎ＝１ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。スケールバー＝１０ｍｍ。Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植マウスモデルにおいて、（Ｅ）は、同所モデルの実験スケジュールを示したものであり、（Ｆ）は、悪性脳腫瘍でマイセルナノ－ＤＤＳの阻害効果を示している（ｎ＝４ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。各検体において最も大きい腫瘍体積の脳スライスを選別して分析した。（Ｇ）は、脳腫瘍のサイズの比較を示した代表的な画像である。マウス脳は、２０μｍの厚さに切断し、脳腫瘍はＨ＆Ｅ染色で示した。スケールバー＝１ｍｍ。統計学的分析：ウェルチのｔ検定。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ｎｓ：統計学的に有意ではない。上記の結果は、平均±標準偏差で示した。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ；ＤＤＳ：ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ；ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ；ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ；ｎａｎｏ ＤＤＳ Ｔｘ：ｎａｎｏ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ。
【0041】
【図7】ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビボ生体適合性を示したものである。（Ａ）は、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの癌標的能力を示したものである。各Ｕ８７ＭＧ脇腹異種移植マウスに（ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを注入し、予め指定された時間（６、１２、２４、及び４８時間）に、ＩＶＩＳインビボ画像システムを使用してローダミンＢ－標識されたマイセルの腫瘍取り込みを比較した。スケールバー＝１ｃｍ。（Ｂ）は、正常主要臓器に及ぼすマイセルナノ－ＤＤＳの最小毒性を示したものである。実験最後に（１７日、腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ3の時）、Ｕ８７ＭＧ脇腹異種移植モデルから心臓、肝臓、脾臓、肺臓、及び腎臓を抽出し、Ｈ＆Ｅ染色を行った。スケールバー＝１００μｍ。（Ｃ）は、Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植モデルで（左、ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）、マウス体重に及ぼすマイセルナノ－ＤＤＳの最小毒性を示したものである。実験では、マウスの体重を毎日測定し、マウスの初期及び最終体重をグラフで示した。統計学的分析：ウェルチのｔ検定。＊ｐ＜０．０５．上記の結果は、平均±標準偏差で示した。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ；ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ。
【0042】
【図8】同所異種移植モデルにおけるＥＤＢ－ＦＮ発現を示したものである。より具体的には、同所異種移植された脳腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮの発現を示したものである。モデルマウスに塩分（対照群）、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ、又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸマイセルナノ－ＤＤＳを２週間注入した。マウス脳は２０μｍの厚さに切開した。（Ａ）は、ＥＤＢ－ＦＮ（緑）及び細胞核（ｎｕｃｌｅｉ）（青）でＩＨＣ画像を示した。スケールバー＝１ｍｍ。（Ｂ）は、腫瘍部位の拡大画像を示したものである。スケールバー＝１００μｍ。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ；ＤＳＰＥ－ＤＴＸ：ｄｏｃｅｔａｘｅｌ－ｌｏａｄｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ ｍｉｃｅｌｌａｒ ｎａｎｏ－ＤＤＳ。
【0043】
【図9】ＥＤＢ－ＦＮの潜在的バイオマーカーとして臨床的重要性及び悪性神経膠腫の標的配位子として実現の可能性を示したものである。
【発明を実施するための形態】
【0044】
本発明者らは、脳腫瘍で過剰発現するフィブロネクチンエキストラドメインＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）に対して鋭意研究した結果、ＥＤＢ－ＦＮを標的とするナノ薬物伝達体を開発し、本発明を完成した。
【0045】
より具体的には、重合脂質であるＰＥＧ2000－ＤＳＰＥで形成されたマイセルナノ製剤より、ＡＰＴEDB：ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ＝１：２で含むＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ製剤がＥＤＢ－ＦＮ親和力が高く、脳腫瘍における細胞の取り込み率がより高く、腫瘍内に多く蓄積することができる点、ナノ製剤が１２ｎｍ以下として脳血管腫瘍障壁を容易に透過できること、ナノ製剤を含むナノ薬物伝達体は、腫瘍抑制効果が高く、正常組織及び他の器官に影響を与えず、抗癌効果が高いことを確認した。
【0046】
本発明において、「アプチド（ａｐｔｉｄｅ）」という用語は、標的に対する親和性を保ちながら、安定性が改善されたアプタマー類似ペプチド（ａｐｔａｍｅｒ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を意味する。アプチドは、環状のβ－ヘアピンベースのペプチドバインダで構成されたスキャフォールドとスキャフォールドの両端にｎ個のアミノ酸とを含む構成であり、これは、特定の生物学的標的と結合することができる。アプチドは、様々なライブラリ構築が可能な標的結合部位（ｔａｒｇｅｔ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含んでもよい。アプチドは、Ｌ－アミノ酸及びＤ－アミノ酸からなる群から選択されるいずれか１つ以上のアミノ酸で構成されてもよい。「安定性」という用語は、アプチドの物理的、化学的、及び生物学的安定性を含むことができ、具体的には、生物学的安定性を意味し得る。即ち、生物学的に安定したアプチドは、生体内でタンパク質分解酵素の作用に対する耐性を有し得る。
【0047】
本発明によるアプチドは、ＥＤＢ－ＦＮ遺伝子（Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３５）に特異的に結合するアプチドであり、具体的には配列番号１として記載されるアミノ酸配列で構成することができる。アミノ酸配列は、リシン（Ｋ）にシステイン（Ｃ）残基が付いていることを特徴とすることができる（図２Ａ）。ＥＤＢ－ＦＮに対するアプチドは、３ｋＤａのサイズで安定しており、ＥＤＢ－ＦＮに対して＜１００ｎＭの高い親和性で結合することができる。
【0048】
【表1】
【0049】
アプチドは、本発明によるアプチドの構造及び活性に影響を及ぼさない範囲内でアミノ酸残基の欠失、挿入、置換、又はこれらの組み合わせによって異なる配列を有するアプチドの変異体又は断片であり得る。分子の活性を全体的に変化させないタンパク質又はペプチドにおけるアミノ酸交換は、当技術分野において公知である。場合によっては、リン酸化、硫化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化などに修飾することができる。アプチドは、配列番号１として記載されるアミノ酸配列と７０、８０、８５、９０、９５、又は９８％の相同性を有し得る。
【0050】
本発明において、「薬物伝達体」という用語は、標的細胞、組織、又は器官に活性成分（例えば、薬物）と化学的又は物理的に結合した複合体であり、活性成分を運搬及び伝達するのに適した担体又はビヒクルを意味する。電気化学的結合は、化学反応による化学結合を意味し、物理的な結合は、吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、凝集（ｃｏｈｅｉｓｏｎ）、絡み付き（ｅｎｔａｎｇｌｅｍｅｎｔ）、捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）などの物理的固定だけでなく、ファンデルワールス結合のような電気的相互作用が、単独で又は物理的固定と共に作用して発生する非化学的固定を含む概念である。
【0051】
本発明において、「ナノ薬物伝達体」という用語は、薬物伝達体が約１ナノメートル（ｎｍ）～約１０００ｎｍサイズの範囲を有することを意味する。ナノ薬物伝達体は、薬学的に許容可能な担体であり得る。
【0052】
用語「薬物」は、薬理活性を有するものであり、ポリペプチド、タンパク質などを含み、本発明では、好ましくは造影剤又は抗癌剤を意味する。抗癌剤の具体的な例としては、ドセタキセル、ハラベン、ビンクリスチン、シスプラチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、エトポシド、トポテカン、イリノテカン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、マイトマイシン、グリベック、カルボプラチン、バルルビシン、フルタミド、ゲムシタビン、ブレオマイシン、テモゾロミド、プロカルバジン、ロムスチン（ＣＣＮＵ；１－（２－ｃｈｌｏｒｏｅｔｈｙｌ）－３－ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ－１－ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）、ビンクリスチン、又はカルムスチン（ＢＣＮＵ）などを含むが、これらに限定されることはない。
【0053】
本発明において、「予防」という用語は、本発明の組成物の投与による癌の発生、拡散、又は再発を抑制又は遅延させる全ての行為を意味し、「治療」とは、本発明の組成物の投与による疾患の症状が好転又は有利に変更される全ての行為を意味する。
【0054】
本発明において、「診断」とは、特定の疾病又は疾患に対するある個体の感受性を判定すること、ある個体が特定の疾病又は疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定の疾病又は疾患にかかったある個体の予後を判定すること、又はセラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療の有効性に関する情報を提供するために個体の状態を監視すること）を含む。
【0055】
本発明において、「医薬組成物」という用語は、疾病の予防又は治療を目的として製造されたものを意味し、それぞれ通常の方法に従って様々な形態で製剤化して使用され得る。例えば、酸剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップなどの経口製剤に製剤化することができ、外用剤、坐剤、及び滅菌注射用溶液の形態で製剤化して使用され得る。
【0056】
本発明において、「有効成分として含む」とは、所望の生物学的効果を実現するために必要又は十分な量で該当成分が含まれることを意味する。実際の適用において有効成分として含まれる量の決定は、対象疾病を治療するための量として、他の毒性を引き起こさない事項を考慮して決定することができ、例えば、治療される疾病又は病態、投与される組成物の形態、被験体の大きさ、又は疾病又は病態の重症度などの様々な要因に応じて変化し得る。本発明が属する分野で通常の技術を有する技術者であれば、過度の実験を伴わずに個々の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【0057】
本発明の組成物は、所望の方法に従って薬学的に有効な量で経口又は非経口投与することができ、本発明の用語「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な利益／リスク比で疾患を治療するのに充分かつ副作用を起こさない程度の量を意味し、有効用量レベルは、患者の健康状態、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路、及び排出率、治療期間、配合又は同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野で周知の要素に応じて決定され得る。
【0058】
従って、本発明の医薬組成物を個体に投与して脳腫瘍を予防、治療、及び／又は診断することができ、「脳腫瘍」は、悪性であるか陽性であるかにかかわらず全ての新生細胞の成長及び増殖を示す全ての前癌細胞及び癌細胞を指し、好ましくは悪性神経膠腫を意味する。非限定的な例としては、星状細胞腫、多形性膠芽腫、乏突起細胞腫、乏突起星細胞腫、上衣細胞腫、血管芽細胞腫、血管芽細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、又は脈絡叢乳頭腫であってもよい。
【0059】
本発明における用語「個体」は、ネズミ、家畜、マウス、ヒトなどの哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトであり得る。
【0060】
本発明の医薬組成物は、個体への投与のための様々な形態で製剤化することができ、非経口投与用の製剤の代表的なものは注射用製剤であり、等張性水溶液又は懸濁液が好ましい。注射用製剤は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して当技術分野で周知の技術によって製造することができる。例えば、各成分を食塩水又は緩衝剤に溶解させて注射用に製剤化してもよい。また、経口投与用の製剤としては、例えば、摂取型錠剤、頬側錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、及びウェハなどが挙げられるが、これらの製剤は、有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、及び／又はグリシン）と滑沢剤（例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、及びそのマグネシウム又はカルシウム塩、及び／又はポリエチレングリコール）を含んでもよい。錠剤は、マグネシウムアルミニウムケイ酸塩、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、及び／又はポリビニルピロリジンなどの結合剤を含んでもよく、場合によっては、デンプン、寒天、アルギン酸又はそのナトリウム塩などの崩壊剤、取り込み剤、着色剤、香味剤及び／又は甘味剤をさらに含んでもよい。製剤は、通常の混合、顆粒化、又はコーティング方法によって製造され得る。
【0061】
また、本発明の医薬組成物は、防腐剤、水和制、乳化促進剤、浸透圧の調節のための塩、又は緩衝剤などの補助剤、及びその他の治療的に有用な物質をさらに含むことができ、通常の方法によって製剤化され得る。
【0062】
本発明による医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈、又は筋肉を含むいくつかの経路を介して投与することができ、活性成分の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別、体重、及び患者の重症度などの様々な要因に応じて適切に選択され得る。また、本発明の組成物は、所望の効果を高めることができる周知の化合物とも並行して投与してもよい。
【0063】
本発明において、「動物モデル」という用語は、ヒトの疾病と非常に類似した形態の疾病を有する動物を指す。ヒトの疾病の研究において疾患モデル動物が意味を有するのは、ヒトと動物との間の生理的又は遺伝的な類似性による。疾病の研究において生体医学疾患モデル動物は、疾病の様々な原因と発症過程及び診断に対する研究用材料を提供し、疾患モデル動物の研究を通じて疾病に関連する遺伝子を調べ、遺伝子間の相互作用を理解できるようにし、開発された新薬候補物質の実際の有効性及び毒性検査によって実用化の可能性があるか否かを判断する基礎資料を得ることができる。「動物」又は「実験動物」という用語は、ヒト以外の任意の哺乳動物を意味する。動物は、胚子、胎児、新生児、及び成人を含む全ての年齢の動物を含む。本発明で使用するための動物は、例えば、商業用ソースから利用することができる。これらの動物は、実験用動物又は他の動物、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ネズミ、ハムスター、アレチネズミ、及びモルモット）、牛、羊、豚、ヤギ、馬、犬、猫、鳥（例えば、鶏、七面鳥、鴨、ガチョウ）、霊長類（例えば、チンパンジー、猿、赤毛猿）を含むがこれらに限定されない。
【0064】
本発明において、「培養」という用語は、生物体や生物体の一部（器官、組織、細胞など）を適宜人工的に調節した環境条件で生育させることであって、この場合、外的条件として、温度、湿度、光、気相の組成（二酸化炭素や酸素の分圧）などが重要であり、他に培養される生物体に最も重要な直接的な影響を与えるのは培地（培養基）であり、その生物体の直接的な環境であると同時に生存や増殖に必要な各種栄養素の供給場である。
【0065】
本発明において、「体外培養」という用語は、細胞などが体内で成長する状態と区分される方法で、実験室のインキュベーター（ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で体内の環境と同様の条件で培養する一連の実験室の過程を意味するものである。
【0066】
本発明において、「培地」又は「培地組成物」という用語は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長及び増殖などに必須の要素を含む生体外での細胞などの成長及び増殖のための混合物をいう。
【実施例】
【0067】
本発明は、様々な変換を加えることができて、様々な実施形態を有することができるが、以下に特定の実施形態を図面に例示し、詳細な説明で詳しく説明する。しかし、これは本発明を特定の実施形態に限定することを意味するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものと理解されるべきである。本発明の説明において、関連する公知技術に対する具体的な説明が本発明の要旨をぼかし得ると判断される場合、その詳細な説明は省略する。
【0068】
実施例１．遺伝子発現プロファイル（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ）及び生存分析（ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）
全ての遺伝子発現プロファイルは、Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎから得ることができ、ＥＤＢ－ＦＮ関連データは、ＦＮ又はＥＤ－Ｂとしても知られているフィブロネクチン１（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ＦＮ１、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３５）を研究することによって収集した。ＦＮ１遺伝子の変異体は、ＣｌｉｎＶａｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ）を用いて調べ、１２６個の変異体が確認された。悪性神経膠腫における発現レベルをスクリーニングするために、トランスクリプトミクスデータベース分析を行ったため、変異体の分析は本発明で実行されなかった。ＥＤＢ－ＦＮのトランスクリプトミクス発現レベルは、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｒａｙ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｅｘＰｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｄｅｓ（ＳＣＡＮ．ＵＰＣ）ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ Ｒで正規化し、ＵＰＣ値で表した。より具体的には、Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎデータのために単一サンプル正規化方法を使用し、全てのサンプルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０（ＧＰＬ５７０ ｏｒ Ａ－ＡＦＦＹ－４４）ｐｌａｔｆｏｒｍから受け取った。発現値は、０．０から１．０で表され、１．０は、完全に転写活性化した場合を示す。正常細胞に対する癌細胞の比率（ｃａｎｃｅｒ－ｔｏ－ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｉｏ）は、癌細胞における発現値を正常細胞における平均発現値で割って算出した。生存分析のために、発現プロファイル及び患者予後情報を含む脳腫瘍データセットを収集した後、３０個以下のサンプルを分析から除外した。全ての遺伝子発現値は、データセットによってクオンタイル正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）した。Ｚ値は、各データセットでログランク検定（ｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）して算出し、体重として各データセットの患者数の平方根を用いてＬｉｐｔａｋ ｍｅｔｈｏｄで平均を出した。
全ての遺伝子発現プロファイルは、Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎから得ることができ、ＥＤＢ－ＦＮ関連データは、ＦＮ又はＥＤ－Ｂとしても知られているフィブロネクチン１（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ １、ＦＮ１、Ｅｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３３５）を研究することによって収集した。ＦＮ１遺伝子の変異体は、ＣｌｉｎＶａｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｌｉｎｖａｒ）を用いて調べ、１２６個の変異体が確認された。悪性神経膠腫における発現レベルをスクリーニングするために、トランスクリプトミクスデータベース分析を行ったため、変異体の分析は本発明で実行されなかった。ＥＤＢ－ＦＮのトランスクリプトミクス発現レベルは、Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｎｎｅｌ Ａｒｒａｙ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｅｘＰｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｄｅｓ（ＳＣＡＮ．ＵＰＣ）ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ Ｒで正規化し、ＵＰＣ値で表した。より具体的には、Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎデータのために単一サンプル正規化方法を使用し、全てのサンプルは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｕ１３３ Ｐｌｕｓ ２．０（ＧＰＬ５７０ ｏｒ Ａ－ＡＦＦＹ－４４）ｐｌａｔｆｏｒｍから受け取った。発現値は、０．０から１．０で表され、１．０は、完全に転写活性化した場合を示す。正常細胞に対する癌細胞の比率（ｃａｎｃｅｒ－ｔｏ－ｎｏｒｍａｌ ｒａｔｉｏ）は、癌細胞における発現値を正常細胞における平均発現値で割って算出した。生存分析のために、発現プロファイル及び患者予後情報を含む脳腫瘍データセットを収集した後、３０個以下のサンプルを分析から除外した。全ての遺伝子発現値は、データセットによってクオンタイル正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）した。Ｚ値は、各データセットでログランク検定（ｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）して算出し、体重として各データセットの患者数の平方根を用いてＬｉｐｔａｋ ｍｅｔｈｏｄで平均を出した。
【0069】
実施例２．患者組織マイクロアレイ（ｔｉｓｓｕｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ、ＴＭＡ）サンプル製造及び解釈
患者組織サンプルは、手術及び病理学的診断の後、パラフィンブロック（ｐａｒａｆｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）に保管され、患者は、成人２１人で、年齢１８歳から７５歳であり、多形性膠芽腫と診断された。各患者別に、３～４種類の他の腫瘍部位から合計６５個の組織サンプルを含む組織マイクロアレイスライドを製造した。組織コア（ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｒｅ）は、直径２ｍｍで各ブロック別に４５個の孔を含む被移植者パラフィンブロック（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｐａｒａｆｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）で移植された。パラフィンで満たされたブロックを３μｍの厚さに切り、スライド上に置いた。その後、組織を後述する免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）部分に記載したように染色した。免疫染色後、病理学者から盲検レビュー（ｂｌｉｎｄ ｒｅｖｉｅｗ）を介してＥＤＧ－ＦＮの存在及びレベルに対する読み取りを受けた。染色強度は、ｎｏｎｅ又は「１＋」（非常に弱い陽性）から「４＋」（非常に強い陽性）で表した。本発明において、「１＋」及び「２＋」は、低発現群（ｌｏｗ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）に、「３＋」及び「４＋」は、高発現群（ｈｉｇｈ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）で分類した。ＥＤＢ－ＦＮ発現と患者の予後予測との間の相関関係を分析するために、患者組織マイクロアレイにおけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルの結果と各患者の臨床データとを結びつける作業を行った。変数として無進行生存期間（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＦＳ）及び全生存期間（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）を使用して患者予後を分析した。
患者組織サンプルは、手術及び病理学的診断の後、パラフィンブロック（ｐａｒａｆｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）に保管され、患者は、成人２１人で、年齢１８歳から７５歳であり、多形性膠芽腫と診断された。各患者別に、３～４種類の他の腫瘍部位から合計６５個の組織サンプルを含む組織マイクロアレイスライドを製造した。組織コア（ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｒｅ）は、直径２ｍｍで各ブロック別に４５個の孔を含む被移植者パラフィンブロック（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｐａｒａｆｆｉｎ ｂｌｏｃｋ）で移植された。パラフィンで満たされたブロックを３μｍの厚さに切り、スライド上に置いた。その後、組織を後述する免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）部分に記載したように染色した。免疫染色後、病理学者から盲検レビュー（ｂｌｉｎｄ ｒｅｖｉｅｗ）を介してＥＤＧ－ＦＮの存在及びレベルに対する読み取りを受けた。染色強度は、ｎｏｎｅ又は「１＋」（非常に弱い陽性）から「４＋」（非常に強い陽性）で表した。本発明において、「１＋」及び「２＋」は、低発現群（ｌｏｗ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）に、「３＋」及び「４＋」は、高発現群（ｈｉｇｈ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）で分類した。ＥＤＢ－ＦＮ発現と患者の予後予測との間の相関関係を分析するために、患者組織マイクロアレイにおけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルの結果と各患者の臨床データとを結びつける作業を行った。変数として無進行生存期間（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ－ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＰＦＳ）及び全生存期間（ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ、ＯＳ）を使用して患者予後を分析した。
【0070】
実施例３．材料（ｍａｔｅｒｉａｌｓ）
ポリエチレングリコール（2000）－１、２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（アンモニウム塩）（ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ）、ＤＳＰＥ－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（Ｒｈ－ＤＳＰＥ）、及びＮ－マレイミド－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ（アンモニウム塩）（Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＥＤＢ－ＦＮ－特異的ペプチドＮ’－ＣＳＳＰＩＱＧＳＷＴＷＥＮＧＫ（Ｃ）ＷＴＷＧＩＩＲＬＥＱ－Ｃ’は、Ａｎｙｇｅｎ社（光州、大韓民国）で注文製造した。マウス抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＥＤＢ－ＦＮ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－コンジュゲート二次抗体（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、アブカム社（Ａｂｃａｍ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。ドセタキセル（ＤＴＸ）及びセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ－４Ｂカラムは、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、封入液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入し、アラマーブルーアッセイキット（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全ての試薬は、ラボラトリグレード（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｒａｄｅ）であり、提供されたとおり使用した。
ポリエチレングリコール（2000）－１、２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（アンモニウム塩）（ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ）、ＤＳＰＥ－Ｎ－（リサミンローダミンＢスルホニル）（アンモニウム塩）（Ｒｈ－ＤＳＰＥ）、及びＮ－マレイミド－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ（アンモニウム塩）（Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＥＤＢ－ＦＮ－特異的ペプチドＮ’－ＣＳＳＰＩＱＧＳＷＴＷＥＮＧＫ（Ｃ）ＷＴＷＧＩＩＲＬＥＱ－Ｃ’は、Ａｎｙｇｅｎ社（光州、大韓民国）で注文製造した。マウス抗－ＥＤＢ－ＦＮ抗体（ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ＥＤＢ－ＦＮ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、及び抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）－コンジュゲート二次抗体（ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、アブカム社（Ａｂｃａｍ）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。ドセタキセル（ＤＴＸ）及びセファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ＣＬ－４Ｂカラムは、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、封入液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）は、Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から購入し、アラマーブルーアッセイキット（Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全ての試薬は、ラボラトリグレード（ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｇｒａｄｅ）であり、提供されたとおり使用した。
【0071】
実施例４．細胞培養
Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、ＭＣＦ－７、ＰＣ３、Ｂ１６Ｆ１０、及びＢ１６Ｆ１細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＶＡ、ＵＳＡ）で購入した。全ての細胞は、湿度５％のＣＯ2環境で３７℃を保持した。細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ）を添加して基礎培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＣＦ－７）、ＲＰＭＩ（ＰＣ３、Ｂ１６Ｆ１０、Ｂ１６Ｆ１）、又はダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ）で培養した。全ての細胞培養培地は、Ｇｉｂｃｏで購入した。
Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ、ＭＣＦ－７、ＰＣ３、Ｂ１６Ｆ１０、及びＢ１６Ｆ１細胞は、アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＶＡ、ＵＳＡ）で購入した。全ての細胞は、湿度５％のＣＯ2環境で３７℃を保持した。細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ）、及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）（Ｇｉｂｃｏ）を添加して基礎培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＣＦ－７）、ＲＰＭＩ（ＰＣ３、Ｂ１６Ｆ１０、Ｂ１６Ｆ１）、又はダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、Ｕ３７３ＭＧ）で培養した。全ての細胞培養培地は、Ｇｉｂｃｏで購入した。
【0072】
実施例５．インビトロ３Ｄ回転楕円体培養（ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）
３Ｄ回転楕円体培養のために、全ての３つの悪性神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、ａｎｄ Ｕ３７３ＭＧ）をウェル（ｗｅｌｌ）当たり１～５×１０3細胞（ｃｅｌｌ）でＮｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６－ｗｅｌｌ ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培養した。プレート（ｐｌａｔｅ）を２分間２００ｘｇで遠心分離した後、３７℃、５％ＣＯ2培養基に置いた。細胞は、６日間培養し、３日目に培地の半分を変更した。画像化のために、形成された回転楕円体を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｗａｋｏ、ＶＡ、ＵＳＡ）で固定された８－ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄ ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に移し、後述する免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が実行された。
３Ｄ回転楕円体培養のために、全ての３つの悪性神経膠腫細胞株（Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、ａｎｄ Ｕ３７３ＭＧ）をウェル（ｗｅｌｌ）当たり１～５×１０3細胞（ｃｅｌｌ）でＮｕｎｃｌｏｎ Ｓｐｈｅｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ９６－ｗｅｌｌ ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で培養した。プレート（ｐｌａｔｅ）を２分間２００ｘｇで遠心分離した後、３７℃、５％ＣＯ2培養基に置いた。細胞は、６日間培養し、３日目に培地の半分を変更した。画像化のために、形成された回転楕円体を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）（Ｗａｋｏ、ＶＡ、ＵＳＡ）で固定された８－ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄ ｃｏｖｅｒｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に移し、後述する免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）が実行された。
【0073】
実施例６．インビボＥＤＢ－ＦＮ免疫細胞化学のための悪性神経膠腫脇腹異種移植（ＭＧ ｆｌａｎｋ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデル
脇腹皮下異種移植（ｆｌａｎｋ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）マウスモデル（ｎ＝１ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）を形成するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹にマウス当たり５×１０6細胞で、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、及びＵ３７３ＭＧ細胞を注入した。腫瘍が８０～１２０ｍｍ3の体積になると、マウスを犠牲にして、切り出した腫瘍の免疫細胞化学を行った。
脇腹皮下異種移植（ｆｌａｎｋ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）マウスモデル（ｎ＝１ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）を形成するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹にマウス当たり５×１０6細胞で、Ｕ８７ＭＧ、Ｕ２５１ＭＧ、及びＵ３７３ＭＧ細胞を注入した。腫瘍が８０～１２０ｍｍ3の体積になると、マウスを犠牲にして、切り出した腫瘍の免疫細胞化学を行った。
【0074】
実施例７．リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔｉｖｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）
細胞を収集して、ＲＮＡアイソレーションキット（ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）を使用してＲｉｂｏＥｘでリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＲＮＡ）を抽出した。各サンプルから合計１μｇのＲＮＡを使用して逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）を合成した。その結果、以下の遺伝子が推定された。ＥＤＢ－ＦＮ遺伝子（順方向プライマー：５’－ＡＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴ－３’；逆方向プライマー：５’－ＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧ－３’）；及びグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素遺伝子（順方向プライマー：５’－ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡ－３’；逆方向プライマー：５’－ＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡ－３’）。ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルは、以下の通りである。９４℃で５分間の最初の変性工程（ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）；９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のプライマー結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、及び７２℃で２分間の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を３０回繰り返す工程、及び７２℃で７分間の最終の伸長をする工程。４μＬの超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）に１μｇのｃＤＮＡを添加し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｑｉａｇｅｎ社、東京、日本）を実施する前に５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｔａｋａｒａ社、東京、日本）を添加した。２-ΔΔCt ｍｅｔｈｏｄを使用して各遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）レベルを定量化し、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素のメッセンジャーＲＮＡで正規化した。
細胞を収集して、ＲＮＡアイソレーションキット（ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ＧｅｎｅＡｌｌ、ソウル、大韓民国）を使用してＲｉｂｏＥｘでリボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ、ＲＮＡ）を抽出した。各サンプルから合計１μｇのＲＮＡを使用して逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって相補的ＤＮＡ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ、ｃＤＮＡ）を合成した。その結果、以下の遺伝子が推定された。ＥＤＢ－ＦＮ遺伝子（順方向プライマー：５’－ＡＡＣＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡＡＧＣＴＴＴ－３’；逆方向プライマー：５’－ＣＧＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＣＡＧＴＧＴＡＧ－３’）；及びグリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素遺伝子（順方向プライマー：５’－ＡＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡ－３’；逆方向プライマー：５’－ＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＧＡＣＧＴＡＣＴＣＡ－３’）。ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルは、以下の通りである。９４℃で５分間の最初の変性工程（ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）；９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のプライマー結合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、及び７２℃で２分間の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を３０回繰り返す工程、及び７２℃で７分間の最終の伸長をする工程。４μＬの超純水（ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ｗａｔｅｒ）に１μｇのｃＤＮＡを添加し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（Ｑｉａｇｅｎ社、東京、日本）を実施する前に５μＬのＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｔａｋａｒａ社、東京、日本）を添加した。２-ΔΔCt ｍｅｔｈｏｄを使用して各遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ）レベルを定量化し、グリセルアルデヒド３－リン酸脱水素酵素のメッセンジャーＲＮＡで正規化した。
【0075】
実施例８．細胞及び組織染色（ｃｅｌｌ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
８．１．免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
７つの異なる細胞株を２Ｄ染色するために、染色前に８－ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄカバーガラススライドに２４時間、１０，０００個の細胞を培養した。３Ｄ染色のために、回転楕円体（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を培養皿から８－ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄカバーガラススライドに移した。培養された細胞は、冷リン酸緩衝食塩水（ｃｏｌｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ社、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、大韓民国）で３回洗浄した後、室温で１５分間４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ａｍｒｅｓｃｏ社、ＰＡ、ＵＳＡ）／ＰＢＳで１０分間透過し、４℃で一晩中１％（ｗ／ｖ）ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡ、ＵＳＡ）／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで、ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＥＤＢ－ＦＮ（ａｂ１５４２１０、１：５００ ｆｏｒ ２Ｄ、１：１００ ｆｏｒ ３Ｄ；Ａｂｃａｍ）で培養した。ＰＢＳで洗浄した後、免疫標識されたタンパク質を、蛍光標識二次抗体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を室温で６０分間処理して可視化した。細胞は、ＰＢＳで洗浄した後、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）で封入し、カバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐｓ）で封止した後、共焦点レーザ走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＬＳＭ ７００；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して検査した。
８．１．免疫細胞化学（ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
７つの異なる細胞株を２Ｄ染色するために、染色前に８－ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄカバーガラススライドに２４時間、１０，０００個の細胞を培養した。３Ｄ染色のために、回転楕円体（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を培養皿から８－ｗｅｌｌ ｃｈａｍｂｅｒｅｄカバーガラススライドに移した。培養された細胞は、冷リン酸緩衝食塩水（ｃｏｌｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ社、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、大韓民国）で３回洗浄した後、室温で１５分間４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ａｍｒｅｓｃｏ社、ＰＡ、ＵＳＡ）／ＰＢＳで１０分間透過し、４℃で一晩中１％（ｗ／ｖ）ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＭＡ、ＵＳＡ）／０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳで、ｐｒｉｍａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ＥＤＢ－ＦＮ（ａｂ１５４２１０、１：５００ ｆｏｒ ２Ｄ、１：１００ ｆｏｒ ３Ｄ；Ａｂｃａｍ）で培養した。ＰＢＳで洗浄した後、免疫標識されたタンパク質を、蛍光標識二次抗体（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）を室温で６０分間処理して可視化した。細胞は、ＰＢＳで洗浄した後、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＣＡ、ＵＳＡ）で封入し、カバースリップ（ｃｏｖｅｒ ｓｌｉｐｓ）で封止した後、共焦点レーザ走査顕微鏡（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＬＳＭ ７００；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して検査した。
【0076】
８．２．パラフィン添加された組織マイクロアレイ及び動物サンプルの免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
ＥＤＢ－ＦＮの染色程度は、患者組織サンプルに対して組織マイクロアレイを、皮下異種移植動物組織サンプルに対して免疫組織化学を適用して分析した。組織マイクロアレイスライドを５５℃で３０分間加熱して蜜蝋を除去した後、５分間３回洗浄して、１００、９５、及び８０％（ｖ／ｖ）のエタノールで５分間洗浄して連続的に純粋な蒸留水になるように再水化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した。１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）（ｐＨ ６．０）で９５℃、３０分間、区間を加熱することによって抗原回収（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）した。３％（ｗ／ｖ）の過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）で３０分間培養することによって内因性ペルオキシダーゼ活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を阻害した。室温で３０分間ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｅｒｕｍ（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して基本反応性（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を除去した。スライドにＥＤＢ－ＦＮに特異的な抗体（ｏｒｂ２２７９８１、１：５０；Ｂｉｏｒｂｙｔ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を処理して１時間培養した後、ビオチン標識二次抗体（ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理して３０分間培養した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して開発した。ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を処理して少し対照染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、顕微鏡観察のためにスライドを脱水し、カバースリップで封入した。
ＥＤＢ－ＦＮの染色程度は、患者組織サンプルに対して組織マイクロアレイを、皮下異種移植動物組織サンプルに対して免疫組織化学を適用して分析した。組織マイクロアレイスライドを５５℃で３０分間加熱して蜜蝋を除去した後、５分間３回洗浄して、１００、９５、及び８０％（ｖ／ｖ）のエタノールで５分間洗浄して連続的に純粋な蒸留水になるように再水化（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した。１０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）（ｐＨ ６．０）で９５℃、３０分間、区間を加熱することによって抗原回収（ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）した。３％（ｗ／ｖ）の過酸化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ）で３０分間培養することによって内因性ペルオキシダーゼ活性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を阻害した。室温で３０分間ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｅｒｕｍ（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して基本反応性（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を除去した。スライドにＥＤＢ－ＦＮに特異的な抗体（ｏｒｂ２２７９８１、１：５０；Ｂｉｏｒｂｙｔ社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を処理して１時間培養した後、ビオチン標識二次抗体（ｂｉｏｔｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄｓｅｃｏｎｄａｒｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を処理して３０分間培養した。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（Ｄａｋｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を使用して開発した。ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）を処理して少し対照染色（ｃｏｕｎｔｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、顕微鏡観察のためにスライドを脱水し、カバースリップで封入した。
【0077】
実施例９．活性ＥＤＢ－ＦＮ標的マイセルナノ－ＤＤＳの合成
９．１．ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの合成
追加のシステイン残基を含む（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ＥＤＢ－ＦＮ－特異的アプタマー類似ペプチド（ａｐｔａｍｅｒ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＡＰＴEDB、Ａｎｙｇｅｎ社）をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に溶解し、Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥをクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に溶解した。ＡＰＴEDB：Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥのモル比を１：２とし、不活性条件において周辺温度（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１２時間コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）反応を行った。ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ（ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法／イオン化飛行時間質量分析（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いてコンジュゲーション効率を決定した。コンジュゲーションされていないペプチドを除去するために、透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して分子量３．５ｋＤａに基づいて透析を行った。４８時間後、コンジュゲーションを減圧下で凍結乾燥した。
９．１．ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの合成
追加のシステイン残基を含む（ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ）ＥＤＢ－ＦＮ－特異的アプタマー類似ペプチド（ａｐｔａｍｅｒ－ｌｉｋｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＡＰＴEDB、Ａｎｙｇｅｎ社）をジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に溶解し、Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥをクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）に溶解した。ＡＰＴEDB：Ｍａｌ－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥのモル比を１：２とし、不活性条件において周辺温度（ａｍｂｉｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で１２時間コンジュゲーション（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）反応を行った。ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ（ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ）を逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｅｖｅｒｓｅｄ－ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製し、マトリックス支援レーザ脱離イオン化法／イオン化飛行時間質量分析（ｍａｔｒｉｘ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｆｌｉｇｈｔ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を用いてコンジュゲーション効率を決定した。コンジュゲーションされていないペプチドを除去するために、透析膜（ｄｉａｌｙｓｉｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用して分子量３．５ｋＤａに基づいて透析を行った。４８時間後、コンジュゲーションを減圧下で凍結乾燥した。
【0078】
９．２．様々な重量パーセントのＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したマイセルナノ－ＤＤＳの製造
原液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）から２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの陰イオン脂質膜（ａｎｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ）を製造した。蛍光標識されたマイセルナノ－ＤＤＳを製造するために、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に０．５ｗｔ％のローダミンＢフルオロフォアで標識されたＲｈ－ＤＳＰＥを添加した。製剤に１．０、２．５、又は５．０ｗｔ％の濃度でＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを添加した。例えば、１．０ｗｔ％のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥの活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を形成するために、０．５ｗｔ％のＲｈ－ＤＳＰＥを含むＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ溶液の２ｍｇ／ｍＬに２０μｇのＡＰＴEDB－ＤＳＰＥコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を添加した。陰性対照群として、受動的／非標的（ｐａｓｓｉｖｅ／ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（ＡＰＴEDB－ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を合成した。全ての成分をガラスバイアルに入れ、真空下で乾燥し、一晩中減圧した後に凍結乾燥して残ったクロロホルムを全て除去した。最終的に２ｍｇ／ｍＬの濃度のマイセル溶液を得るために、再水化の間、脂質膜に１ｍＬの超純水（Ｗｅｌｇｅｎｅ）を添加した。均一なサイズのマイセルを形成するために、毎分１，０００回転（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の一定の撹拌下で再水化を行った。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ１５遠心式フィルタ（Ｕｌｔｒａ－１５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ）３ｋＤａ Ｕｎｉｔｓ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マイセルを溶解した溶液をＰＢＳバッファに変えた。超過サイズのナノ粒子又は凝集体を除去するために、溶液を０．１μｍの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＬ－４Ｂ ｃｏｌｕｍｎ；Ｍｅｒｃｋ社）で精製した。製造後、ＰＢＳで全てのマイセル製剤のサイズ及びゼータ電位を動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）及びゼータ電位分析（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で分析した。２ｍｇ／ｍＬマイセルの１ｍＬを透明なキューベット（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｃｕｖｅｔｔｅ）に移し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して各マイセルの流体力学的直径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）及びゼータ電位を測定した。
原液（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）から２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥの陰イオン脂質膜（ａｎｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｆｉｌｍ）を製造した。蛍光標識されたマイセルナノ－ＤＤＳを製造するために、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ溶液（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に０．５ｗｔ％のローダミンＢフルオロフォアで標識されたＲｈ－ＤＳＰＥを添加した。製剤に１．０、２．５、又は５．０ｗｔ％の濃度でＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを添加した。例えば、１．０ｗｔ％のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥの活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を形成するために、０．５ｗｔ％のＲｈ－ＤＳＰＥを含むＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ溶液の２ｍｇ／ｍＬに２０μｇのＡＰＴEDB－ＤＳＰＥコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を添加した。陰性対照群として、受動的／非標的（ｐａｓｓｉｖｅ／ｎｏｎｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ（ＡＰＴEDB－ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）を合成した。全ての成分をガラスバイアルに入れ、真空下で乾燥し、一晩中減圧した後に凍結乾燥して残ったクロロホルムを全て除去した。最終的に２ｍｇ／ｍＬの濃度のマイセル溶液を得るために、再水化の間、脂質膜に１ｍＬの超純水（Ｗｅｌｇｅｎｅ）を添加した。均一なサイズのマイセルを形成するために、毎分１，０００回転（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）の一定の撹拌下で再水化を行った。Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ウルトラ１５遠心式フィルタ（Ｕｌｔｒａ－１５ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｆｉｌｔｅｒ）３ｋＤａ Ｕｎｉｔｓ（Ｍｅｒｃｋ社、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、マイセルを溶解した溶液をＰＢＳバッファに変えた。超過サイズのナノ粒子又は凝集体を除去するために、溶液を０．１μｍの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＣＬ－４Ｂ ｃｏｌｕｍｎ；Ｍｅｒｃｋ社）で精製した。製造後、ＰＢＳで全てのマイセル製剤のサイズ及びゼータ電位を動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）及びゼータ電位分析（ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）で分析した。２ｍｇ／ｍＬマイセルの１ｍＬを透明なキューベット（ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｃｕｖｅｔｔｅ）に移し、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）を使用して各マイセルの流体力学的直径（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ ｄｉａｍｅｔｅｒ）及びゼータ電位を測定した。
【0079】
９．３．ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの合成及び開発
受動的／非標的ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（ＡＰＴEDB－ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）及び活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）は、従来に開示された方法を適用して開発された（Ｃｈｏｎｇ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）．２０１３；４９：１１４７６－８）。先ず、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ脂質（ｌｉｐｉｄ）を得るために、ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ ＡＰＴEDBをＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ脂質（ｌｉｐｉｄ）のマレイミド基（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）とコンジュゲートした。ＤＴＸをロードするために、ＤＴＸをクロロホルムに溶解し、再水化の間に最終的な濃度が５０ｇ／ｍＬになるようにマイセル脂質膜に添加した。本発明において、ＤＴＸ－ロードされたＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳをそれぞれ「ＤＳＰＥ－ＤＴＸ」及び「ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ」と命名した。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＰＳＥ－ＤＴＸを０．１μｍの膜で濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。
受動的／非標的ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（ＡＰＴEDB－ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）及び活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（ＡＰＴEDB－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）は、従来に開示された方法を適用して開発された（Ｃｈｏｎｇ Ｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）．２０１３；４９：１１４７６－８）。先ず、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ脂質（ｌｉｐｉｄ）を得るために、ｃｙｓｔｅｉｎｙｌａｔｅｄ ＡＰＴEDBをＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ脂質（ｌｉｐｉｄ）のマレイミド基（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｇｒｏｕｐ）とコンジュゲートした。ＤＴＸをロードするために、ＤＴＸをクロロホルムに溶解し、再水化の間に最終的な濃度が５０ｇ／ｍＬになるようにマイセル脂質膜に添加した。本発明において、ＤＴＸ－ロードされたＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳをそれぞれ「ＤＳＰＥ－ＤＴＸ」及び「ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ」と命名した。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＰＳＥ－ＤＴＸを０．１μｍの膜で濾過し、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。
【0080】
実施例１０．ＡＰＴEDB－コンジュゲートマイセルナノ粒子を使用して悪性神経膠腫の治療標的としてＥＤＢ－ＦＮ検証
１０．１．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビトロ細胞の取り込み（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ）
ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの細胞の取り込み効率は、ＥＤＢ－ＦＮ－陽性Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞に各マイセル製剤を処理することによって決定した。Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞は、５，０００細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）において９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で培養した。細胞を殺菌されたカバースリップにおいてコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で培養した後、細胞をＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを１．０、２．５、又は５．０ｗｔ％の濃度で処理し、１００μｇ／ｍＬのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓと共に１時間３７℃で培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、ｎｕｃｌｅａｒ ｄｙｅ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）で対照染色した後、ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅｓで封入し、ローダミンＢ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）－標識されたマイセルの取り込み率を確認するために、共焦点レーザ走査顕微鏡で確認した。
１０．１．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビトロ細胞の取り込み（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ）
ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの細胞の取り込み効率は、ＥＤＢ－ＦＮ－陽性Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞に各マイセル製剤を処理することによって決定した。Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞は、５，０００細胞／ウェル（ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）において９６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）で培養した。細胞を殺菌されたカバースリップにおいてコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で培養した後、細胞をＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを１．０、２．５、又は５．０ｗｔ％の濃度で処理し、１００μｇ／ｍＬのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓと共に１時間３７℃で培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定し、ｎｕｃｌｅａｒ ｄｙｅ ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）で対照染色した後、ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅｓで封入し、ローダミンＢ（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）－標識されたマイセルの取り込み率を確認するために、共焦点レーザ走査顕微鏡で確認した。
【0081】
１０．２．競合分析（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）
ＥＤＢ－ＦＮ高発現細胞（Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ）及びＥＤＢ－ＦＮ低発現細胞（ＭＣＦ－７及びＢ１６Ｆ１）を約８０％の合流点（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまでガラスカバースリップに培養した。細胞を様々な濃度（１００μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ）の自由ＡＰＴEDBペプチドで３０分間前処理した。その後、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）標識されたＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを添加し、細胞をさらに３０分間培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した後、共焦点顕微鏡下で見るために顕微鏡スライドに封入した。
ＥＤＢ－ＦＮ高発現細胞（Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ）及びＥＤＢ－ＦＮ低発現細胞（ＭＣＦ－７及びＢ１６Ｆ１）を約８０％の合流点（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に達するまでガラスカバースリップに培養した。細胞を様々な濃度（１００μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ）の自由ＡＰＴEDBペプチドで３０分間前処理した。その後、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）標識されたＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを添加し、細胞をさらに３０分間培養した。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した後、共焦点顕微鏡下で見るために顕微鏡スライドに封入した。
【0082】
１０．３．ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）の形質導入
ＥＤＢ－ＦＮ特異的ｓｉＲＮＡ及びスクランブル対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）は、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）から購入した。ＲＮＡ干渉に使用されるＥＤＢ－ＦＮ ｓｉＲＮＡの標的配列は、以下の通りである。ｓｅｎｓｅ；ＡＣＡＧＵＣＣＣＡＧＡＵＣＡＵＧＧＡＧ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；ＣＵＣＣＡＵＧＡＵＣＵＧＧＧＡＣＵＧＵ。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を形質導入するために、細胞を一晩中成長させた後、６０～７０％の合流点（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で９６ウェル又は６ウェルプレートで培養した。製造業者の説明に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｓｉＲＮＡ複合体を製造した。形質導入有効性は、４８時間後に分析した。
ＥＤＢ－ＦＮ特異的ｓｉＲＮＡ及びスクランブル対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ）は、Ｂｉｏｎｅｅｒ社（Ｄａｅｊｅｏｎ、大韓民国）から購入した。ＲＮＡ干渉に使用されるＥＤＢ－ＦＮ ｓｉＲＮＡの標的配列は、以下の通りである。ｓｅｎｓｅ；ＡＣＡＧＵＣＣＣＡＧＡＵＣＡＵＧＧＡＧ、ａｎｔｉｓｅｎｓｅ；ＣＵＣＣＡＵＧＡＵＣＵＧＧＧＡＣＵＧＵ。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を形質導入するために、細胞を一晩中成長させた後、６０～７０％の合流点（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）で９６ウェル又は６ウェルプレートで培養した。製造業者の説明に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ－ｓｉＲＮＡ複合体を製造した。形質導入有効性は、４８時間後に分析した。
【0083】
１０．４．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビトロ細胞の取り込み（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ）
ＥＤＢ－ＦＮ発現量に応じた細胞内取り込みを確認するために、Ｕ８７ＭＧ細胞に上述した対照群ｓｉＲＮＡ又はＥＤＢ－ＦＮ ｓｉＲＮＡを形質導入した。形質導入した細胞に１００μｇ／ｍＬのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを１．０ｗｔ％の濃度で処理し、１時間３７℃で培養した。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥは、ＥＤＢ－ＦＮに対抗する抗体を使用して免疫細胞化学によって染色し、ＤＡＰＩを含む封入液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で封入した。時間依存的細胞の取り込みを確認するために、Ｕ８７ＭＧ細胞に１．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥで１００μｇ／ｍＬのＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを５分、１５分、３０分、１時間、及び４時間処理した。
ＥＤＢ－ＦＮ発現量に応じた細胞内取り込みを確認するために、Ｕ８７ＭＧ細胞に上述した対照群ｓｉＲＮＡ又はＥＤＢ－ＦＮ ｓｉＲＮＡを形質導入した。形質導入した細胞に１００μｇ／ｍＬのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを１．０ｗｔ％の濃度で処理し、１時間３７℃で培養した。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥは、ＥＤＢ－ＦＮに対抗する抗体を使用して免疫細胞化学によって染色し、ＤＡＰＩを含む封入液（ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で封入した。時間依存的細胞の取り込みを確認するために、Ｕ８７ＭＧ細胞に１．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥで１００μｇ／ｍＬのＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを５分、１５分、３０分、１時間、及び４時間処理した。
【0084】
１０．５．Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞でＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビトロ細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）
悪性神経膠腫の分子標的としてＥＤＢ－ＦＮの有用性及び価値を決定するために、上述した方法でＤＴＸをＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓの中心にカプセル化した。２４時間、各ナノ－ＤＤＳ製剤を段階的に希釈して細胞と共培養した。製剤を除去した後、細胞をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、ＣＡ、ＵＳＡ）の前にさらに２４時間培養した。各製剤のＩＣ50値は、プロビット分析（ＰｒｏＢｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定した。
悪性神経膠腫の分子標的としてＥＤＢ－ＦＮの有用性及び価値を決定するために、上述した方法でＤＴＸをＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳｓの中心にカプセル化した。２４時間、各ナノ－ＤＤＳ製剤を段階的に希釈して細胞と共培養した。製剤を除去した後、細胞をＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社、ＣＡ、ＵＳＡ）の前にさらに２４時間培養した。各製剤のＩＣ50値は、プロビット分析（ＰｒｏＢｉｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定した。
【0085】
１０．６．皮下異種移植モデル（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）でＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビボ取り込み（ｕｐｔａｋｅ）
インビボ異種移植モデルで、ＡＰＴEDB－ＤＰＳＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込みを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）の右脇腹に５×１０6細胞／マウスにＵ８７ＭＧ細胞を注入した。３週間後、腫瘍成長を測定し、この時点で腫瘍体積は８０～１２０ｍｍ3であった。その後、２００μｇのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ ｉｎ ＰＢＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ ｉｎ ＰＢＳを各マウスに注入し、予め指定された時間（１５、３０、６０、及び１２０分）に、ＩＶＩＳ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してローダミンＢ－標識されたマイセルの腫瘍取り込みを比較した。
インビボ異種移植モデルで、ＡＰＴEDB－ＤＰＳＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込みを評価するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）の右脇腹に５×１０6細胞／マウスにＵ８７ＭＧ細胞を注入した。３週間後、腫瘍成長を測定し、この時点で腫瘍体積は８０～１２０ｍｍ3であった。その後、２００μｇのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ ｉｎ ＰＢＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ ｉｎ ＰＢＳを各マウスに注入し、予め指定された時間（１５、３０、６０、及び１２０分）に、ＩＶＩＳ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してローダミンＢ－標識されたマイセルの腫瘍取り込みを比較した。
【0086】
１０．７．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥのインビボ取り込み及び毒性
ＡＰＴEDB－ＤＰＳＥマイセルナノ－ＤＤＳインビボ組織取り込みを評価するために、Ｕ８７ＭＧ細胞を５×１０6の細胞／マウスでＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に注入した（ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。３週間後、腫瘍成長を測定し、腫瘍体積は、８０～１２０ｍｍ3に決定した。その後、２００μｇのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを各マウスに注入し、予め指定された時間（６、１２、２４、及び４８時間）に、ＩＶＩＳインビボ画像システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してローダミンＢ－標識されたマイセルの腫瘍取り込みを比較した。
ＡＰＴEDB－ＤＰＳＥマイセルナノ－ＤＤＳインビボ組織取り込みを評価するために、Ｕ８７ＭＧ細胞を５×１０6の細胞／マウスでＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に注入した（ｎ＝３ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。３週間後、腫瘍成長を測定し、腫瘍体積は、８０～１２０ｍｍ3に決定した。その後、２００μｇのＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳを各マウスに注入し、予め指定された時間（６、１２、２４、及び４８時間）に、ＩＶＩＳインビボ画像システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用してローダミンＢ－標識されたマイセルの腫瘍取り込みを比較した。
【0087】
ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥの安全性を検証するために、実験前後マウスの体重を確認した。実験の最後に、Ｈ＆Ｅ染色のために主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺臓、及び腎臓）を収集するためにマウスを安楽死した。
【0088】
１０．８．皮下異種移植モデルの凍結サンプルの免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
スライドガラスに取り付けられた皮下異種移植モデルの脳スライスを冷ＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキングした後、ブロッキングバッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ａｎｄ ２％ ＢＳＡ）で１時間透過できるようにした。ＥＤＢ－ＦＮに特異的な主要抗体（ａｂ１５４２１０ Ａｂｃａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）をブロッキングバッファで１：１００に希釈し、組織と共に４℃で一晩中培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ブロッキングバッファで１：２００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート二次抗体（Ａ１１００１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を処理し、室温で１時間培養した。組織を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＮＹ、ＵＳＡ）で対照染色し、カバースライドで覆った後、共焦点レーザ走査顕微鏡及びスライドスキャナ（Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
スライドガラスに取り付けられた皮下異種移植モデルの脳スライスを冷ＰＢＳで２回洗浄し、ブロッキングした後、ブロッキングバッファ（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（ＰＢＳ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ａｎｄ ２％ ＢＳＡ）で１時間透過できるようにした。ＥＤＢ－ＦＮに特異的な主要抗体（ａｂ１５４２１０ Ａｂｃａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）をブロッキングバッファで１：１００に希釈し、組織と共に４℃で一晩中培養した。ＰＢＳで洗浄した後、ブロッキングバッファで１：２００に希釈したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８コンジュゲート二次抗体（Ａ１１００１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を処理し、室温で１時間培養した。組織を、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＮＹ、ＵＳＡ）で対照染色し、カバースライドで覆った後、共焦点レーザ走査顕微鏡及びスライドスキャナ（Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１；Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ社、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して分析した。
【0089】
１０．９．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビボ抗癌効果
脇腹皮下異種移植マウスモデルを製造するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に５×１０6の細胞／マウスでＵ８７ＭＧ細胞を注入した。腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ3になると、マウスに塩分を５ｍｇ／ｋｇのＤＴＸ濃度で（代表的な腫瘍組織摘出のためのｎ＝１ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐを含み、ｎ＝５ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）ＤＰＳＥ－ＤＴＸ ｉｎ ＰＢＳ、又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ ｉｎ ＰＢＳを静脈注射した。以前の研究プロトコルに基づいて、各製剤を２日ごとに３回静脈注射した。腫瘍のサイズは、摘出するまで３日に１回測定した。以下の式を使用して腫瘍体積を算出した。（長さ×幅×高さ）×０．５。以下の式を使用して腫瘍抑制率を算出した。［１－｛（ＴDayE－ＴDay1）／ＴDay1×ＣDay1／（ＣDayE－ＣDay1）｝］＝１００（ＴDayE＝実験群の最終腫瘍体積；ＴDay1＝実験群の最初（１日）の腫瘍体積；ＣDayE＝対照群の最終腫瘍体積；ＣDay1＝対照群の最初の腫瘍体積）。
脇腹皮下異種移植マウスモデルを製造するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に５×１０6の細胞／マウスでＵ８７ＭＧ細胞を注入した。腫瘍体積が８０～１２０ｍｍ3になると、マウスに塩分を５ｍｇ／ｋｇのＤＴＸ濃度で（代表的な腫瘍組織摘出のためのｎ＝１ ｍｏｕｓｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐを含み、ｎ＝５ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）ＤＰＳＥ－ＤＴＸ ｉｎ ＰＢＳ、又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ ｉｎ ＰＢＳを静脈注射した。以前の研究プロトコルに基づいて、各製剤を２日ごとに３回静脈注射した。腫瘍のサイズは、摘出するまで３日に１回測定した。以下の式を使用して腫瘍体積を算出した。（長さ×幅×高さ）×０．５。以下の式を使用して腫瘍抑制率を算出した。［１－｛（ＴDayE－ＴDay1）／ＴDay1×ＣDay1／（ＣDayE－ＣDay1）｝］＝１００（ＴDayE＝実験群の最終腫瘍体積；ＴDay1＝実験群の最初（１日）の腫瘍体積；ＣDayE＝対照群の最終腫瘍体積；ＣDay1＝対照群の最初の腫瘍体積）。
【0090】
同所異種移植マウスモデル（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ）を製造するために、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの頭部を定位固定装置（ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）で固定し、Ｏｚａｗａ及びＪａｍｅｓの方法によって頭頂点（ｂｒｅｇｍａ）から２ｍｍ側面及び冠状縫合（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｕｔｕｒｅ）から１ｍｍ前面に高速ドリルで小型バーホール（ｂｕｒｒ ｈｏｌｅ）を施術した。２２－ｇａｕｇｅ ｎｅｅｄｌｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ社、ＮＶ、ＵＳＡ）を使用して、３×１０5の細胞／マウスで頭蓋骨の内側皮質骨（ｉｎｎｅｒ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｂｏｎｅ）から３ｍｍの深さにＵ８７ＭＧ細胞を注入した。７日後、マウスに１回塩分、１０ｍｇ／ｋｇのＤＴＸの濃度でＤＳＰＥ－ＤＴＸ、又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを１回静脈注射した（ｎ＝４ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。移植後の２１日目に腫瘍のサイズ分析のためにマウスを犠牲にした。１０％（ｖ／ｖ）のホルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を散布した後、各脳を除去し、ＯＣＴコンパウンド（ｏｐｔｉｍａｌ ｃｕｔｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社、東京、日本）に挟んで入れた。脳サンプルを凍結し、ｃｒｙｏｓｔａｔ ｓｅｃｔｉｏｎｉｎｇを使用して２０μｍにスライスした。脳スライスをヘマトキシリン・エオジン染色キット（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ）（ＳｃｙＴｅｋ社、ＵＴ、ＵＳＡ）を使用して染色し、以下の式を使用して腫瘍体積を算出した。（長さ×幅×幅）×０．５．最も長い寸法を長さに設定し、最も長い垂直直径を幅に設定した。
【0091】
実施例１１．画像化及び統計学的分析
ＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して画像プロセッシング及びデータ分析を行った。全てのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析し、ｍｅａｎｓ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒｓ（ｓｔｄ．ｅｒｒｏｒｓ）で示すＩＣ50値を除いて、ｍｅａｎｓ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ｓｔｄ．ｄｅｖｓ．）で示した。群間の比較は、主に正規分布データの場合、対応のない２標本ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）ｗｉｔｈ Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ（ウェルチのｔ検定）、非正規分布データの場合、マン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ）を行った。Ｐ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ＜０．０５は、統計的に有意であるとみなされ、以下のように表示された。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、及びｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）。
ＩｍａｇｅＪ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して画像プロセッシング及びデータ分析を行った。全てのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ社、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して分析し、ｍｅａｎｓ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒｓ（ｓｔｄ．ｅｒｒｏｒｓ）で示すＩＣ50値を除いて、ｍｅａｎｓ±ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎｓ（ｓｔｄ．ｄｅｖｓ．）で示した。群間の比較は、主に正規分布データの場合、対応のない２標本ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｔ ｔｅｓｔ）ｗｉｔｈ Ｗｅｌｃｈ’ｓ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ（ウェルチのｔ検定）、非正規分布データの場合、マン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ ｔｅｓｔ）を行った。Ｐ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ＜０．０５は、統計的に有意であるとみなされ、以下のように表示された。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）、ｐ＜０．００１（＊＊＊）、及びｐ＜０．０００１（＊＊＊＊）。
【0092】
実施例１２．倫理的承認（Ｅｔｈｉｃａｌ ａｐｐｒｏｖａｌ）
動物実験のために全ての適用可能な国際、国内、及び／又は機関のガイドラインを遵守した。本発明における動物に関する全ての実験は、ＫＡＩＳＴ動物実験倫理委員会（ＫＡＩＳＴ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及び高麗大学医科大学（Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＩＡＣＵＣ Ｎｏ．ＫＡ２０１３－１３及びＫＯＲＥＡ－２０１９－０１２３）の倫理的基準に準拠する。患者サンプル研究は、高麗大学九老病院機関監査委員会（Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｕｒｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）（ＩＲＢ Ｎｏ．２０１７ＧＲ０３３０）で承認されたガイドライン及びプロトコルを遵守した。
動物実験のために全ての適用可能な国際、国内、及び／又は機関のガイドラインを遵守した。本発明における動物に関する全ての実験は、ＫＡＩＳＴ動物実験倫理委員会（ＫＡＩＳＴ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）及び高麗大学医科大学（Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（ＩＡＣＵＣ Ｎｏ．ＫＡ２０１３－１３及びＫＯＲＥＡ－２０１９－０１２３）の倫理的基準に準拠する。患者サンプル研究は、高麗大学九老病院機関監査委員会（Ｋｏｒｅａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｇｕｒｏ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄ）（ＩＲＢ Ｎｏ．２０１７ＧＲ０３３０）で承認されたガイドライン及びプロトコルを遵守した。
【0093】
［実験結果］
本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮが様々な癌に対してマーカーであり、標的として実現可能であるかを評価するために、正規化されたビッグデータ及びＥＤＢ－ＦＮ発現レベルの患者組織サンプルを分析した。さらに、正常細胞に対する癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現率が最も高い癌の１つである悪性神経膠腫の診断マーカーであり、薬物伝達標的としてＥＤＢ－ＦＮの有用性を検証した。
本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮが様々な癌に対してマーカーであり、標的として実現可能であるかを評価するために、正規化されたビッグデータ及びＥＤＢ－ＦＮ発現レベルの患者組織サンプルを分析した。さらに、正常細胞に対する癌細胞におけるＥＤＢ－ＦＮの発現率が最も高い癌の１つである悪性神経膠腫の診断マーカーであり、薬物伝達標的としてＥＤＢ－ＦＮの有用性を検証した。
【0094】
実験結果１．癌細胞株におけるＥＤＢ－ＦＮ発現
様々なヒト癌細胞株におけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルを決定するためにスクリーニングを行った。乳癌細胞株ＭＣＦ７、前立腺癌細胞株ＰＣ３、黒色種細胞株Ｂ１６Ｆ１及びＢ１６Ｆ１０、及び悪性神経膠腫細胞株Ｕ３７３ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、及びＵ２５１ＭＧが実験に使用された。ＥＤＢ－ＦＮタンパク質の発現パターンは、２Ｄ単層培養（ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）中に定量的分析によって確認した（図１Ａ）。ＰＣ３細胞株及びＵ３７３ＭＧ細胞株では、ＥＤＢ－ＦＮ発現が弱いと検出されたが、Ｕ８７ＭＧ細胞株では、明確な発現が観察された。また、ＥＤＢ－ＦＮ発現の定量的分析のためにｍＲＮＡを抽出することによって、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った（図１Ｂ）。その結果（ＭＣＦ７、４７．８±７．９；ＰＣ３、１２．１±２．１；Ｂ１６Ｆ１、０．６±０．５；Ｂ１６Ｆ１０、２３．３±１．４；Ｕ３７３ＭＧ、２．６±０．８；Ｕ２５１ＭＧ、６４３．０±３１．０；Ｕ８７ＭＧ、１４３０．３±６１．４）、Ｕ２５１ＭＧ細胞株において統計学的にかなりの過剰発現が観察され（ｐ＜０．００１、他の全ての細胞株に対して、ウェルチのｔ検定）、最も高い発現は、Ｕ８７ＭＧ細胞株で観察された（ｐ＜０．００１、他の全ての細胞株に対して、ウェルチのｔ検定）。上記の結果を通して、他の癌に比べて悪性神経膠腫においてＥＤＢ－ＦＮが過剰発現されたことを確認した。
様々なヒト癌細胞株におけるＥＤＢ－ＦＮ発現レベルを決定するためにスクリーニングを行った。乳癌細胞株ＭＣＦ７、前立腺癌細胞株ＰＣ３、黒色種細胞株Ｂ１６Ｆ１及びＢ１６Ｆ１０、及び悪性神経膠腫細胞株Ｕ３７３ＭＧ、Ｕ８７ＭＧ、及びＵ２５１ＭＧが実験に使用された。ＥＤＢ－ＦＮタンパク質の発現パターンは、２Ｄ単層培養（ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）中に定量的分析によって確認した（図１Ａ）。ＰＣ３細胞株及びＵ３７３ＭＧ細胞株では、ＥＤＢ－ＦＮ発現が弱いと検出されたが、Ｕ８７ＭＧ細胞株では、明確な発現が観察された。また、ＥＤＢ－ＦＮ発現の定量的分析のためにｍＲＮＡを抽出することによって、ｑＲＴ－ＰＣＲを行った（図１Ｂ）。その結果（ＭＣＦ７、４７．８±７．９；ＰＣ３、１２．１±２．１；Ｂ１６Ｆ１、０．６±０．５；Ｂ１６Ｆ１０、２３．３±１．４；Ｕ３７３ＭＧ、２．６±０．８；Ｕ２５１ＭＧ、６４３．０±３１．０；Ｕ８７ＭＧ、１４３０．３±６１．４）、Ｕ２５１ＭＧ細胞株において統計学的にかなりの過剰発現が観察され（ｐ＜０．００１、他の全ての細胞株に対して、ウェルチのｔ検定）、最も高い発現は、Ｕ８７ＭＧ細胞株で観察された（ｐ＜０．００１、他の全ての細胞株に対して、ウェルチのｔ検定）。上記の結果を通して、他の癌に比べて悪性神経膠腫においてＥＤＢ－ＦＮが過剰発現されたことを確認した。
【0095】
腫瘍微小環境（ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）を作るために、３Ｄで悪性脳膠腫細胞株を培養して、悪性神経膠腫脇腹異種移植動物モデルを作製した。免疫染色を用いたＥＤＢ－ＦＮ発現の定量的分析の結果、３Ｄ培養の間Ｕ８７ＭＧ細胞株においてＵ２５１ＭＧ及びＵ３７３ＭＧ細胞株よりもＥＤＢ－ＦＮがさらに過剰発現された（図１Ｃ）。異種移植マウスモデルでは、Ｕ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧ細胞株がＵ３７３ＭＧ細胞株より相対的に高い発現パターンを示した（図１Ｄ）。ｍＲＮＡ ｑＲＴ－ＰＣＲによる定量的分析の結果（図１Ｅ）、２Ｄ培養されたＵ３７３ＭＧ細胞株と比較してＵ８７ＭＧ細胞株においてＥＤＢ－ＦＮがかなり発現した（ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）。上記の結果と比較して、腫瘍微小環境を模倣した３Ｄ培養されたＵ８７ＭＧ細胞株でより高いＥＤＢ－ＦＮ発現を示し（ｐ＜０．００１、２Ｄ培養されたＵ８７ＭＧ細胞株と比較して、ウェルチのｔ検定）、異種移植動物モデルで最も高いＥＤＢ－ＦＮ発現を示した（ｐ＜０．０００１、３Ｄ培養されたＵ８７ＭＧ細胞株と比較して、ウェルチのｔ検定）。上記の結果は、悪性神経膠腫におけるＥＤＢ－ＦＮ発現と腫瘍微小環境類似性との間の線形の相関関係を示唆し、これは、ＥＤＢ－ＦＮを悪性神経膠腫のバイオマーカーとして使用できることを示している。
【0096】
最終的に、悪性神経膠腫細胞において他の癌細胞よりもＥＤＢ－ＦＮがより過剰発現し、悪性神経膠腫細胞株中にゆっくり増殖するＵ３７３ＭＧ細胞においてＥＤＢ－ＦＮが相対的に低い発現を示した。積極的に増殖することが知られているＵ８７ＭＧ細胞株は、最も高いＥＤＢ－ＦＮ発現レベルを示し、多形性膠芽腫幹細胞のような特徴を有するＵ２５１ＭＧ細胞株がその次に該当した。上記の結果に基づいて、後述する研究ではＵ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞株を使用した。
【0097】
実験結果２．合成ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの特性分析（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ）
マイセルの動的光散乱（ＤＬＳ）分析の結果、１１．５±１．９ｎｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳに対して、１１．５±１．９ｎｍの直径、１．０、２．５、及び５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳに対して、各々８．２±１．３ｎｍ、１０．５±１．９ｎｍ、及び１０．３±１．３ｎｍの直径を示した（図２Ａ及びＢ）。ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳと比較してＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのＤＬＳ－測定のサイズが減少したことと、１．０ｗｔ％の濃度で同じＤＤＳと比較して２．５及び５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥにおいてＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの測定されたサイズが増加したことは、マイセルの外面にＡＰＴEDBの存在がマイセルナノ－ＤＤＳにおいて形態学的変化に影響を及ぼすことを示した。各ナノ－ＤＤＳのゼータ電位（ナノ粒子の表面電荷を推定することができる）を測定した。ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのゼータ電位は、－９．３±１．１ｍＶであり、１．０、２．５、及び５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのゼータ電位は、各々－９．５±０．７ｍＶ、－１０．４±１．３ｍＶ、及び－１２．１±０．７ｍＶであった（図２Ｃ）。
マイセルの動的光散乱（ＤＬＳ）分析の結果、１１．５±１．９ｎｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳに対して、１１．５±１．９ｎｍの直径、１．０、２．５、及び５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳに対して、各々８．２±１．３ｎｍ、１０．５±１．９ｎｍ、及び１０．３±１．３ｎｍの直径を示した（図２Ａ及びＢ）。ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳと比較してＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのＤＬＳ－測定のサイズが減少したことと、１．０ｗｔ％の濃度で同じＤＤＳと比較して２．５及び５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥにおいてＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの測定されたサイズが増加したことは、マイセルの外面にＡＰＴEDBの存在がマイセルナノ－ＤＤＳにおいて形態学的変化に影響を及ぼすことを示した。各ナノ－ＤＤＳのゼータ電位（ナノ粒子の表面電荷を推定することができる）を測定した。ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのゼータ電位は、－９．３±１．１ｍＶであり、１．０、２．５、及び５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのゼータ電位は、各々－９．５±０．７ｍＶ、－１０．４±１．３ｍＶ、及び－１２．１±０．７ｍＶであった（図２Ｃ）。
【0098】
実験結果３．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ密度による細胞の取り込み
最適化された標的配位子密度を決定するために、脂質膜形成前に、１．０、２．５、及び５．０ｗｔ％の濃度でＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを混合したＲｈ－ＤＳＰＥのクロロホルム溶液にＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを添加した。全ての条件下で、癌細胞における活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込み効力（ｕｐｔａｋｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ）は、消極的／非標的ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込み効力よりも高かった（図４Ａ）。興味深いことに、２．５ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、Ｕ２５１ＭＧ細胞で最も高い細胞の取り込みを示した（ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ、４４．５±９．６；１．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、７６．４±８．１；２．５％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、１２８．８±１２．１；５．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、５３．４±５．１）、一方、１．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、Ｕ８７ＭＧ細胞で最も高い細胞の取り込みを示した（ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ、６．８±５．１；１．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、１６５．７±３．７；２．５％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、９３．２±６．７；５．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、５６．７±７．９）。ＡＰＴＥＢＤ－ＤＳＰＥの濃度が増加するにつれてより負の方向にあり（図２Ｃ）、５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの減少した細胞の取り込みは、ナノ－ＤＤＳにおける負電荷によって部分的に説明可能である。しかし、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞の両方が悪性神経膠腫細胞であり、同じ標的配位子が使用されたにもかかわらず、最も高い細胞の取り込み効力を有するＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ濃度が細胞株ごとに異なった。従って、配位子密度は、細胞株及び細胞型によって異なり、それによって細胞の取り込みも異なることが分かった。
最適化された標的配位子密度を決定するために、脂質膜形成前に、１．０、２．５、及び５．０ｗｔ％の濃度でＰＥＧ2000－ＤＳＰＥを混合したＲｈ－ＤＳＰＥのクロロホルム溶液にＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを添加した。全ての条件下で、癌細胞における活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込み効力（ｕｐｔａｋｅ ｅｆｆｉｃａｃｙ）は、消極的／非標的ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込み効力よりも高かった（図４Ａ）。興味深いことに、２．５ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、Ｕ２５１ＭＧ細胞で最も高い細胞の取り込みを示した（ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ、４４．５±９．６；１．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、７６．４±８．１；２．５％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、１２８．８±１２．１；５．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、５３．４±５．１）、一方、１．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、Ｕ８７ＭＧ細胞で最も高い細胞の取り込みを示した（ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ、６．８±５．１；１．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、１６５．７±３．７；２．５％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、９３．２±６．７；５．０％ ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ、５６．７±７．９）。ＡＰＴＥＢＤ－ＤＳＰＥの濃度が増加するにつれてより負の方向にあり（図２Ｃ）、５．０ｗｔ％の濃度のＡＰＴEDB－ＤＳＰＥを処理したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの減少した細胞の取り込みは、ナノ－ＤＤＳにおける負電荷によって部分的に説明可能である。しかし、Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞の両方が悪性神経膠腫細胞であり、同じ標的配位子が使用されたにもかかわらず、最も高い細胞の取り込み効力を有するＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ濃度が細胞株ごとに異なった。従って、配位子密度は、細胞株及び細胞型によって異なり、それによって細胞の取り込みも異なることが分かった。
【0099】
ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのＥＤＢ－ＦＮを標的とする能力を立証するために、ＥＤＢ－ＦＮ高発現及び低発現細胞をＥＤＢ－ＦＮを標的とするアプチド（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｐｔｉｄｅ）とＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳで同時に処理することによって、競合分析を行った。ＥＤＢ－ＦＮ高発現細胞であるＵ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧにおけるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込みは、ＥＤＢ－ＦＮを標的とするアプチドの濃度が増加するにつれて減少した。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥの取り込みが最小であったにもかかわらず、ＥＤＢ－ＦＮ低発現細胞であるＭＣＦ－７及びＢ１６Ｆ１においてもＥＤＢ－ＦＮの妨害効果が示された（図３Ａ及びＢ）。
【0100】
活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳがＥＤＢ－ＦＮ発現に依存することを確認するために、Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮをノックダウン（ｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎ）した。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＥＤＢ－ＦＮ発現は、ＥＤＢ－ＦＮ－ｓｉＲＮＡ処理後にかなり減少した。一方、対照群ｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｉＲＮＡ、１．００±０．０８；ＥＤＢ－ＦＮ ｓｉＲＮＡ、０．４５±０．０１；ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）を処理した細胞のＥＤＢ－ＦＮ発現は一定であった（図４Ａ）。ｓｉＲＮＡを処理した後、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ残量の取り込みにも変化はなかった。しかし、ＥＤＢ－ＦＮ発現が抑制された細胞では、活性標的ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの取り込みは減少した（図４Ｂ）。さらに、Ｕ８７細胞におけるＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの時間依存的取り込みも４時間観察した。５分間の処理後、細胞内ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ濃度を徐々に増加させ、１時間から４時間内に飽和に達した（図４Ｃ）。
【0101】
上記の結果は、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、ＥＤＢ－ＦＮ発現依存的及び時間依存的に、細胞によって取り込まれることを示唆し、より明確に標的配位子密度が実際にはナノ粒子の細胞の取り込みにとって重要であることを示している。
【0102】
実験結果４．ＥＤＢ－ＦＮを標的にすることによる癌標的及び抗癌効果の向上
４．１．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビトロ毒性
ＥＤＢ－ＦＮの悪性神経膠腫の分子標的として価値及び有用性を決定するために、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの中心にＤＴＸをカプセル化した。各マイセルナノ－ＤＤＳのローディング能力は１０ｗｔ％、カプセル化有効性は約９５％で算出した。細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを用いて評価した（図５Ｂ）。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸシステムにおいて、ＤＴＸがＵ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧ細胞の生存率を阻害するにもかかわらず、阻害の程度は異なった。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＩＣ50値は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、８７．３８±６．８７ｎＭ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、２３．１５±１．６７ｎＭであり、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸがＤＳＰＥ－ＤＴＸより約３．８倍低かった（ｐ＜０．０００１、ウェルチのｔ検定）。Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＩＣ50値は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、４３．１６±７．０５ｎＭ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、２６．２０±１．５３ｎＭであり、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸがＤＳＰＥ－ＤＴＸより約１．６倍低かった（ｐ＜０．０５、ウェルチのｔ検定）（図５Ｃ）。Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞におけるインビトロ細胞毒性データは、優れた癌標的能力を暗示し、薬物の取り込みの増加は、消極的／非標的に比較してＥＤＢ－ＦＮ活性標的によって達成できると考えられる。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのＩＣ50値の有意な差がＵ８７ＭＧ細胞で観察されたが、Ｕ８７ＭＧ細胞をインビボモデリング及び悪性神経膠腫の分子標的としてＥＤＢ－ＦＮを評価するために使用することにより選別した。
４．１．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビトロ毒性
ＥＤＢ－ＦＮの悪性神経膠腫の分子標的として価値及び有用性を決定するために、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの中心にＤＴＸをカプセル化した。各マイセルナノ－ＤＤＳのローディング能力は１０ｗｔ％、カプセル化有効性は約９５％で算出した。細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを用いて評価した（図５Ｂ）。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸシステムにおいて、ＤＴＸがＵ２５１ＭＧ及びＵ８７ＭＧ細胞の生存率を阻害するにもかかわらず、阻害の程度は異なった。Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＩＣ50値は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、８７．３８±６．８７ｎＭ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、２３．１５±１．６７ｎＭであり、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸがＤＳＰＥ－ＤＴＸより約３．８倍低かった（ｐ＜０．０００１、ウェルチのｔ検定）。Ｕ２５１ＭＧ細胞におけるＩＣ50値は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、４３．１６±７．０５ｎＭ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの場合、２６．２０±１．５３ｎＭであり、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸがＤＳＰＥ－ＤＴＸより約１．６倍低かった（ｐ＜０．０５、ウェルチのｔ検定）（図５Ｃ）。Ｕ８７ＭＧ及びＵ２５１ＭＧ細胞におけるインビトロ細胞毒性データは、優れた癌標的能力を暗示し、薬物の取り込みの増加は、消極的／非標的に比較してＥＤＢ－ＦＮ活性標的によって達成できると考えられる。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのＩＣ50値の有意な差がＵ８７ＭＧ細胞で観察されたが、Ｕ８７ＭＧ細胞をインビボモデリング及び悪性神経膠腫の分子標的としてＥＤＢ－ＦＮを評価するために使用することにより選別した。
【0103】
４．２．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳのインビボ取り込み
Ｕ８７ＭＧ脇腹異種移植マウスモデルにおけるリアルタイムＩＶＩＳ画像の研究の結果、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、消極的／非標的ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳと比較して腫瘍局在化（ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）のかなりの増加を示した。腫瘍局在化の増加は、１５分から１２０分の間持続的に観察された（図６Ａ）。１５分で、最小のナノ粒子蓄積が観察された。３０分後、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ群でより高い蓄積が開始された。６０分後、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ群は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ群より腫瘍部位でより多くの蓄積を示した。また、ＤＤＳが腫瘍より他の器官に影響を与えるか否かを決定するために、マイセルナノ－ＤＤＳの組織取り込みを４８時間測定した（図７Ａ）。消極的／非標的ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、徐々に４８時間内に体内全般に拡散した。しかし、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、安定的かつ限定された腫瘍部位として残った。上記の結果は、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの安定性及び高い悪性神経膠腫標的能力を示す。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥが高いＥＤＢ－ＦＮ標的能力を有することで、高い親和性でＥＤＢ－ＦＮに結合することにより、悪性神経膠腫で非常に増加したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を示し、それにより、増加した腫瘍における薬物の生物学的利用の可能性を有した。
Ｕ８７ＭＧ脇腹異種移植マウスモデルにおけるリアルタイムＩＶＩＳ画像の研究の結果、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、消極的／非標的ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳと比較して腫瘍局在化（ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）のかなりの増加を示した。腫瘍局在化の増加は、１５分から１２０分の間持続的に観察された（図６Ａ）。１５分で、最小のナノ粒子蓄積が観察された。３０分後、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ群でより高い蓄積が開始された。６０分後、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ群は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳ群より腫瘍部位でより多くの蓄積を示した。また、ＤＤＳが腫瘍より他の器官に影響を与えるか否かを決定するために、マイセルナノ－ＤＤＳの組織取り込みを４８時間測定した（図７Ａ）。消極的／非標的ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、徐々に４８時間内に体内全般に拡散した。しかし、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳは、安定的かつ限定された腫瘍部位として残った。上記の結果は、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの安定性及び高い悪性神経膠腫標的能力を示す。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥが高いＥＤＢ－ＦＮ標的能力を有することで、高い親和性でＥＤＢ－ＦＮに結合することにより、悪性神経膠腫で非常に増加したＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの保持時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ）を示し、それにより、増加した腫瘍における薬物の生物学的利用の可能性を有した。
【0104】
４．３．ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸのインビボ抗癌効果
インビボ抗癌効果は、Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植動物モデルで検証した。有効性は、経時的な対照群、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群における腫瘍成長の傾向を比較することによって評価した（図６Ｂ）。対照群では、腫瘍体積は、１６日内（１７日）に初日（１日）より約５．９倍増加した（１日：９１．５±７．４ｍｍ3対１７日：５３８．０±１１５．９ｍｍ3；ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを処理することによって腫瘍成長を著しく阻害した。上述のように、腫瘍阻害のパーセントを算出した結果、ＤＳＰＥ－ＤＴＸが腫瘍成長を約５４．８％抑制した（１日：８７．９±１２．６ｍｍ3対１７日：２８１．７±２９．４ｍｍ3；ｐ＜０．００１、ウェルチのｔ検定）、一方、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸは、腫瘍成長を約９７．６％にかなり抑制することを確認した（１日：８７．５±１２．６ｍｍ3対１７日：９７．８±２．６ｍｍ3；ｐ＜０．２０、ウェルチのｔ検定）。初日、腫瘍体積は群間に有意な差はなかった。しかし、ナノ－ＤＤＳを３回服用した２日目、４日目、及び６日目に、群間の腫瘍体積の差は、時間が経つにつれて顕著となった（図６Ｃ及びＤ）。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群は、対照群と比較して７日目からかなりの腫瘍抑制を示し（ｐ＜０．００１、ウェルチのｔ検定）、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群と比較した場合、１７日目から差があった（ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）。
図７Ｂに示すように、マイセルナノ－ＤＤＳを体内投与した結果、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、及び腎臓などの主要臓器では何の副作用も観察されず、実験が終了するまでマウスの体重には大きな変化がなかった（１日、対照群＝２０．４±０．６ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２１．４±０．２ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝１８．９±０．６ｇ；１７日、対照群＝１９．８±１．６ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２０．７±１．２ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝１９．５±０．９ｇ）（図７Ｃ）。これは、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳが毒性をほどんど有さず、生体適合性を有することを示している。
インビボ抗癌効果は、Ｕ８７ＭＧ皮下異種移植動物モデルで検証した。有効性は、経時的な対照群、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群における腫瘍成長の傾向を比較することによって評価した（図６Ｂ）。対照群では、腫瘍体積は、１６日内（１７日）に初日（１日）より約５．９倍増加した（１日：９１．５±７．４ｍｍ3対１７日：５３８．０±１１５．９ｍｍ3；ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）。ＤＳＰＥ－ＤＴＸ又はＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを処理することによって腫瘍成長を著しく阻害した。上述のように、腫瘍阻害のパーセントを算出した結果、ＤＳＰＥ－ＤＴＸが腫瘍成長を約５４．８％抑制した（１日：８７．９±１２．６ｍｍ3対１７日：２８１．７±２９．４ｍｍ3；ｐ＜０．００１、ウェルチのｔ検定）、一方、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸは、腫瘍成長を約９７．６％にかなり抑制することを確認した（１日：８７．５±１２．６ｍｍ3対１７日：９７．８±２．６ｍｍ3；ｐ＜０．２０、ウェルチのｔ検定）。初日、腫瘍体積は群間に有意な差はなかった。しかし、ナノ－ＤＤＳを３回服用した２日目、４日目、及び６日目に、群間の腫瘍体積の差は、時間が経つにつれて顕著となった（図６Ｃ及びＤ）。ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群は、対照群と比較して７日目からかなりの腫瘍抑制を示し（ｐ＜０．００１、ウェルチのｔ検定）、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群と比較した場合、１７日目から差があった（ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）。
図７Ｂに示すように、マイセルナノ－ＤＤＳを体内投与した結果、心臓、肝臓、脾臓、肺臓、及び腎臓などの主要臓器では何の副作用も観察されず、実験が終了するまでマウスの体重には大きな変化がなかった（１日、対照群＝２０．４±０．６ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２１．４±０．２ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝１８．９±０．６ｇ；１７日、対照群＝１９．８±１．６ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２０．７±１．２ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝１９．５±０．９ｇ）（図７Ｃ）。これは、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳが毒性をほどんど有さず、生体適合性を有することを示している。
【0105】
４．４．同所脳腫瘍マウスモデルでＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸの抗癌効果
脳腫瘍の治療標的として、その実現の可能性を評価するために、Ｕ８７ＭＧ同所異種移植動物モデルを作製した。図６Ｅに示すように、塩分（ｓａｌｉｎｅ）を対照群として、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを細胞移植後に７日間静脈注射により注入した（ｎ＝４ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。２週間後、脳を抽出し、各群の腫瘍体積を比較した。Ｈ＆Ｅ染色を使用してスライスされた脳組織の正常及び腫瘍部位の局在化（ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行い、各モデルにおける最も大きい腫瘍のスライスに基づいて腫瘍のサイズを測定した（図６Ｆ及びＧ）。その結果、ＥＤＢ－ＦＮ標的マイセルナノ－ＤＤＳ処理により腫瘍成長が著しく阻害されることが分かった。対照群と比較して（１１６．９±２１．０ｍｍ3）、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（８６．７±２８．７ｍｍ3）及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（４６．５±２７．０ｍｍ3）群は、各々２５．８％（ｐ＜０．１５、ウェルチのｔ検定）及び６０．２％（ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）の腫瘍成長を抑制した。統計学的に大きな差が見られなかったが、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群（ｐ＜０．０９、ウェルチのｔ検定）より約３４．４％さらに高い腫瘍成長抑制を示した。実験中、全ての群でかなりの体重変化が観察されることはなかった（１日、対照群＝２２．７±１．３ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２３．３±２．５ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２３．３±１．６ｇ；２１日、対照群＝２４．５±１．３ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２５．１±１．７ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２５．５±１．５ｇ）（図８Ｃ）。上記の結果は、本発明のＥＤＢ－ＦＮ－標的マイセルナノ－ＤＤＳが悪性神経膠腫を治療する潜在力を有し、ＥＤＢ－ＦＮが薬物治療のための有用な標的であることを示している。
脳腫瘍の治療標的として、その実現の可能性を評価するために、Ｕ８７ＭＧ同所異種移植動物モデルを作製した。図６Ｅに示すように、塩分（ｓａｌｉｎｅ）を対照群として、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸを細胞移植後に７日間静脈注射により注入した（ｎ＝４ ｍｉｃｅ ｐｅｒ ｇｒｏｕｐ）。２週間後、脳を抽出し、各群の腫瘍体積を比較した。Ｈ＆Ｅ染色を使用してスライスされた脳組織の正常及び腫瘍部位の局在化（ｔｕｍｏｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行い、各モデルにおける最も大きい腫瘍のスライスに基づいて腫瘍のサイズを測定した（図６Ｆ及びＧ）。その結果、ＥＤＢ－ＦＮ標的マイセルナノ－ＤＤＳ処理により腫瘍成長が著しく阻害されることが分かった。対照群と比較して（１１６．９±２１．０ｍｍ3）、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（８６．７±２８．７ｍｍ3）及びＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ（４６．５±２７．０ｍｍ3）群は、各々２５．８％（ｐ＜０．１５、ウェルチのｔ検定）及び６０．２％（ｐ＜０．０１、ウェルチのｔ検定）の腫瘍成長を抑制した。統計学的に大きな差が見られなかったが、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群は、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群（ｐ＜０．０９、ウェルチのｔ検定）より約３４．４％さらに高い腫瘍成長抑制を示した。実験中、全ての群でかなりの体重変化が観察されることはなかった（１日、対照群＝２２．７±１．３ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２３．３±２．５ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２３．３±１．６ｇ；２１日、対照群＝２４．５±１．３ｇ、ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２５．１±１．７ｇ、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ＝２５．５±１．５ｇ）（図８Ｃ）。上記の結果は、本発明のＥＤＢ－ＦＮ－標的マイセルナノ－ＤＤＳが悪性神経膠腫を治療する潜在力を有し、ＥＤＢ－ＦＮが薬物治療のための有用な標的であることを示している。
【0106】
悪性神経膠腫同所マウスモデルで移植されたＵ８７ＭＧ細胞がＥＤＢ－ＦＮを過剰発現するという点を確認するために、全ての群で腫瘍を含むマウス脳スライスを用いた免疫組織化学分析を実行した。マウス脳組織の正常部位と比較して、全ての群の腫瘍部位でＥＤＢ－ＦＮがより高く発現した（図８Ａ）。興味深いことに、腫瘍におけるＥＤＢ－ＦＮ発現は、対照群及びＤＳＰＥ－ＤＴＸ群と比較してＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸ群でわずかに減少し（図８Ｂ）、これは、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥ－ＤＴＸが腫瘍でＥＤＢ－ＦＮ発現レベルに影響を与える可能性があることを示唆する。
【0107】
［考察］
本発明は、癌細胞の表面及び細胞外基質内に位置するＥＤＢ－ＦＮに関する。より具体的には、表面及び細胞外基質内のタンパク質は、薬物伝達体（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＤＳｓ）のための有用な標的だけでなく、癌診断バイオマーカーとして活用することができる。
本発明は、癌細胞の表面及び細胞外基質内に位置するＥＤＢ－ＦＮに関する。より具体的には、表面及び細胞外基質内のタンパク質は、薬物伝達体（ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＤＳｓ）のための有用な標的だけでなく、癌診断バイオマーカーとして活用することができる。
【0108】
上記の結果を考慮するとき、本発明者らは、検証のために皮下異種移植動物モデル実験を含むインビトロ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験を行った。細菌などの中枢神経系の侵入を防止するために発達したＢＢＢが適用されたＢＢＴＢは、１２ｎｍより小さい微細な生理学的孔のサイズを有するため、はるかに小さいサイズのナノ－ＤＤＳを使用することがＢＢＴＢを介した容易な透過を保障することができる。従って、本発明者は、薬物伝達を向上させるために、ＤＳＰＥ高分子を使用して超小型マイセル（～１２ｎｍ）を開発し、マイセルの表面にＡＰＴEDBを接着することにより、悪性神経膠腫の診断及び治療に使用することのできるシステムを作製した。従来には、薬物伝達体が約１１５±１３ｎｍサイズのリポソーム又は３４ｎｍサイズの超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）を含む非常に大きな方であったが、本発明は、小型の１２ｎｍマイセルにかなり減少した（図２）。
【0109】
本発明者らは、ＥＤＢ－ＦＮ発現レベルと患者の予後間の相関関係とを定量的に比較し（図２）、悪性神経膠腫におけるＥＤＢ－ＦＮ標的の有用性を検証した（図５及び図６）。ＥＤＢ－ＦＮの過剰発現及びＥＤＢ－ＦＮ標的ＤＤＳによる向上した薬物伝達は、単一層細胞培養だけでなく、同所異種移植モデルでも確認されており、これは、ＥＤＢ－ＦＮが悪性神経膠腫細胞及び組織において発現し、ナノ－ＤＤＳがＥＤＢ－ＦＮ標的を介して悪性神経膠腫と接続又は基盤を置いていることを示唆する（図９）。同所異種移植動物モデルのためのＤＴＸ服用量が、ＤＴＸの神経毒性を考慮して脇腹異種移植動物モデルのための１５ｍｇ／ｋｇより３３％少ない合計１０ｍｇ／ｋｇに決定されたにもかかわらず、異種移植モデルにおける脇腹モデルで表れた顕著な抗癌効果が示された。ＢＢＴＢの限界にもかかわらず、製造されたＥＤＢ－ＦＮ標的マイセルナノ－ＤＤＳは、統計学的に顕著な抗癌効果がない非標的マイセルナノ－ＤＤＳと比較してかなりの治療効果を示した。ＡＰＴEDBの悪性神経膠腫細胞に対する特異的な結合は、ＡＰＴEDB－ＤＳＰＥマイセルナノ－ＤＤＳの腫瘍保持時間を効率的に増加させ、優れた抗癌効果を示した。ＥＤＢ－ＦＮは、悪性神経膠腫組織において特異的に高い発現を示したが、隣接する正常組織及び正常脳組織では最小限に発現した。特性は、悪性神経膠腫治療のための標的配位子としてＥＤＢ－ＦＮ使用における実現の可能性を高めるのに役立つ。
【0110】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当技術分野の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な技術は、単に好ましい実施様態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかであろう。従って、本発明の実質的な範囲は、添付する特許請求の範囲とそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【0111】
本発明は、ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥ重合脂質及びＡＰＴEDB－ＰＥＧ2000－ＤＳＰＥポリマーを含むマイセル構造の薬物伝達体に関し、薬物伝達体は、脳腫瘍（ｂｒａｉｎ ｔｕｍｏｒ）で過剰発現するフィブロネクチンエキストラドメインＢ（ＥＤＢ－ＦＮ）を標的とし、血液脳関門（ＢＢＢ）又は脳血管腫瘍障壁（ＢＢＴＢ）を通過して脳腫瘍細胞に特異的に薬物を送達することができる。従って造影剤、抗癌剤などの薬物がロードされた本発明の薬物伝達体を有効成分として含む組成物は、脳腫瘍内部に蓄積され、腫瘍細胞内部に陥入されることがあり、脳腫瘍診断及び治療分野で有用に利用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】