特許 7460850 多重標的化組換えヘルペスシンプルレックスウイルス及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-25

(45)【発行日】2024-04-02

(54)【発明の名称】多重標的化組換えヘルペスシンプルレックスウイルス及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/869 20060101AFI20240326BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240326BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240326BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240326BHJP

【ＦＩ】

C12N15/869 Z ZNA

C12N7/01

A61K35/763

A61P35/00

【請求項の数】 37

(21)【出願番号】P 2023509359

(86)(22)【出願日】2021-02-19

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-06-01

(86)【国際出願番号】 KR2021002155

(87)【国際公開番号】W WO2021251589

(87)【国際公開日】2021-12-16

【審査請求日】2022-10-25

(31)【優先権主張番号】10-2020-0072979

(32)【優先日】2020-06-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(31)【優先権主張番号】10-2020-0071873

(32)【優先日】2020-06-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】522418495

【氏名又は名称】ジェンセルメッド インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】クウォン、ヒチョン

(72)【発明者】

【氏名】ベク、ヒョンジョン

【審査官】福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２０１０／０２３３７５８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】国際公開第２０２０／１１３１５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Viruses，2018年，Vol.10, No.7:352，pp.1-29

【文献】Molecular Therapy，2011年，Vol.19, No.3，pp.507-514

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、癌細胞標的分子に特異的に結合する標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質が多重に発現可能にその融合タンパク質のアダプター発現カセットが二つ以上挿入されている、多重標的化組換えヘルペスシンプレックスウイルスであって、
前記融合タンパク質のアダプター発現カセットが、前記ウイルスのゲノム中のＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、又はＵＳ１とＵＳ２遺伝子の間に挿入されている、上記多重標的化組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項2】

前記融合タンパク質のアダプター発現カセットは、２個以上の融合タンパク質遺伝子を含み、これらの遺伝子の間にＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）又は２Ａペプチドを暗号化する核酸配列が位置するポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有する、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項3】

前記融合タンパク質のアダプター発現カセットは、モノシトロン（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有し、２個以上の発現カセットが前記ウイルスゲノムに挿入されている、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項4】

前記多重に発現する融合タンパク質は、（ｉ）いずれも同一の標的分子に特異的に結合する標的化領域を有するか、（ｉｉ）互いに異なる標的分子に特異的に結合する互いに異なる標的化領域を有することを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項5】

前記ＨＶＥＭの細胞外ドメインは、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ８２、配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ８７、配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ１０２、又は配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ１０７であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項6】

前記融合タンパク質は、その癌細胞標的化領域とそのＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）の細胞外ドメインが、１～３０個のアミノ酸を含むリンカーペプチドによって連結されている融合タンパク質であり、
前記リンカーペプチドのアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びＴｈｒのうち一つ以上のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項7】

前記標的分子は、癌細胞でのみ発現する或いは正常細胞に比べて癌細胞で過発現する癌細胞表面の抗原又は受容体であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項8】

前記抗原又は受容体は、ＥＧＦＲｖIII、ＥＧＦＲ、メタスチン受容体（Ｍｅｔａｓｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、チロシンキナーゼ－１８－受容体（ｃ－Ｋｉｔ）、ＨＧＦ受容体ｃ－Ｍｅｔ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、エンドテリン－Ａ受容体、ＰＰＡＲ－δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ）、ＰＤＧＦＲ－α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）、ＣＤ１３３、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＧＤ２（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ＧＰＣ３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ ３）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ－７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２）、ＧＤ３（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ）、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ １）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ １）、ＬＭＰ１（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＴＲＡＩＬＲ２（ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ２（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ４４又はＣＤ１６６であることを特徴とする、請求項７に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項9】

前記標的分子は、ＨＥＲ２であり、
前記標的化領域は、配列番号４のＶＨと配列番号５のＶＬがリンカーペプチドを媒介にしてＶＨ、リンカーペプチド、ＶＬの順に連結されたｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項10】

前記標的分子は、ＥｐＣＡＭであり、
前記標的化領域は、配列番号６のＶＬと配列番号７のＶＨがリンカーペプチドを媒介にしてＶＬ、リンカーペプチド、ＶＨの順に連結されたｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項11】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、配列番号１６のｇＤ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）のアミノ酸配列の２２２番位置のアルギニン（Ｒ）と２２３番位置のフェニルアラニン（Ｆ）がそれぞれアスパラギン（Ｎ）とイソロイシン（Ｉ）に置換されたことを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項12】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、組換えＨＳＶ－１ウイルス、組換えＨＳＶ－２ウイルス、又はＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２キメラウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項13】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、ＨＳＶ－１ＫＯＳ菌株に由来する組換えＨＳＶ－１であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項14】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスにはヘルペスシンプレックスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、（ｉ）サイトカイン、（ｉｉ）ケモカイン、（ｉｉｉ）免疫関門（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）に対する拮抗剤、（ｉｖ）免疫細胞の活性化を誘導可能な補助刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、（ｖ）癌細胞に対する免疫反応を抑制するＴＧＦβに対する拮抗剤、（ｖｉ）固形癌腫瘍微細環境を構成するヘパランサルフェートプロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）を分解可能なヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、（ｖｉｉ）血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ－２（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）の機能を阻害可能な拮抗剤、及び（ｖｉｉｉ）プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を癌細胞に毒性を示す薬物（ｄｒｕｇ）に転換させるプロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）から選ばれるものを発現するアダプター発現カセットがさらに挿入されていることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項15】

前記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２４などのインターロイキン、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなどのインターフェロン、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ及びＦＬＴ３Ｌのうち一つ以上であり、
前記ケモカインは、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０及びＸＣＬ－１のうち一つ以上であり、
前記免疫関門は、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ－Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＤ２７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７）、ＣＤ２８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２８）、ＣＤ７０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７０）、ＣＤ８０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０）、ＣＤ８６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８６）、ＣＤ１３７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １３７）、ＣＤ２７６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７６）、ＫＩＲ（ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＩＴＲＬ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ）及びＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｎ－４）のうち一つ以上であり、
前記補助刺激因子は、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共同刺激因子）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εのうち一つ以上であり、
前記プロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）は、シトシンデアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ラットシトクロムＰ４５０（ｒａｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，ＣＹＰ２Ｂ１）、カルボキシルエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）、細菌ニトロリダクターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及び大腸菌から分離されたＰＮＰ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）のうち一つ以上であることを特徴とする、請求項１４に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項16】

二つ以上のアダプター発現カセットの挿入位置が異なることを特徴とする、請求項１４に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項17】

前記融合タンパク質は、ＮＨ_２－癌細胞標的化領域－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である或いはその逆順であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項18】

前記融合タンパク質は癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインがリンカーペプチドを媒介にして連結され、前記融合タンパク質は、ＮＨ_２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である或いはその逆順であることを特徴とする、請求項１に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項19】

ヘルペスシンプレックスウイルスの増殖を阻害することなく（ｉ）そのゲノムに、癌細胞標的分子に特異的に結合する標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを発現可能な発現カセットが一つ以上挿入されており、また（ｉｉ）その糖タンパク質に、癌細胞標的分子に特異的に結合する標的化領域が挿入されて融合しており、
前記糖タンパク質はｇＨであり、
前記糖タンパク質に挿入されて融合している標的化領域は、Ｎ末端から２９番アミノ酸の次の位置に挿入されて融合しており、
前記融合タンパク質のアダプター発現カセットが、前記ウイルスのゲノム中のＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、又はＵＳ１とＵＳ２遺伝子の間に挿入されている、多重標的化組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項20】

前記融合タンパク質の標的化領域と前記挿入されて融合している標的化領域は、（ｉ）いずれも同一の標的分子に特異的に結合する標的化領域を有するか、（ｉｉ）互いに異なる標的分子に特異的に結合する互いに異なる標的化領域を有することを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項21】

前記ＨＶＥＭの細胞外ドメインは、配列番号８又は９のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ８２、配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ８７、配列番号１２又は１３のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ１０２、又は配列番号１４又は１５のアミノ酸配列を含むＨｖｅＡ１０７であることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項22】

前記融合タンパク質は、その癌細胞標的化領域とそのＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）の細胞外ドメインが１～３０個アミノ酸を含むリンカーペプチドによって連結されている融合タンパク質であり、
前記リンカーペプチドのアミノ酸は、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ及びＴｈｒのうち一つ以上のアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項23】

前記標的分子は、癌細胞でのみ発現する或いは正常細胞に比べて癌細胞で過発現する癌細胞表面の抗原又は受容体であることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項24】

前記抗原又は受容体は、ＥＧＦＲｖIII、ＥＧＦＲ、メタスチン受容体（Ｍｅｔａｓｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、チロシンキナーゼ－１８－受容体（ｃ－Ｋｉｔ）、ＨＧＦ受容体ｃ－Ｍｅｔ、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ７、エンドテリン－Ａ受容体、ＰＰＡＲ－δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ）、ＰＤＧＦＲ－α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）、ＣＤ１３３、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＧＤ２（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ＧＰＣ３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ ３）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）、ＴＡＧ－７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２）、ＧＤ３（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、ＨＬＡ－ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ）、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ １）、ＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ １）、ＬＭＰ１（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、ＴＲＡＩＬＲ２（ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＶＥＧＦＲ２（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、ＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＤ４４又はＣＤ１６６であることを特徴とする、請求項２３に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項25】

前記糖タンパク質に挿入されて融合する標的化領域が特異的に結合する標的分子は、ＨＥＲ２であり、
前記糖タンパク質に挿入されて融合する標的化領域は、配列番号４のＶＨと配列番号５のＶＬがリンカーペプチドを媒介にしてＶＨ、リンカーペプチド、ＶＬの順に連結されたｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項26】

前記糖タンパク質に挿入されて融合する標的化領域が特異的に結合する標的分子は、ＥｐＣＡＭであり、
前記標的化領域は、配列番号６のＶＬと配列番号７のＶＨがリンカーペプチドを媒介にしてＶＬ、リンカーペプチド、ＶＨの順に連結されたｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項27】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、配列番号１６のｇＤ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ）のアミノ酸配列の２２２番位置のアルギニン（Ｒ）と２２３番位置のフェニルアラニン（Ｆ）がそれぞれアスパラギン（Ｎ）とイソロイシン（Ｉ）に置換されたことを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項28】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、組換えＨＳＶ－１ウイルス、組換えＨＳＶ－２ウイルス、又はＨＳＶ－１及びＨＳＶ－２キメラウイルスであることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項29】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスは、ＨＳＶ－１ＫＯＳ菌株に由来する組換えＨＳＶ－１であることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項30】

前記組換えヘルペスシンプレックスウイルスにはヘルペスシンプレックスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、（ｉ）サイトカイン、（ｉｉ）ケモカイン、（ｉｉｉ）免疫関門（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）に対する拮抗剤、（ｉｖ）免疫細胞の活性化を誘導可能な補助刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、（ｖ）癌細胞に対する免疫反応を抑制するＴＧＦβに対する拮抗剤、（ｖｉ）固形癌腫瘍微細環境を構成するヘパランサルフェートプロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）を分解可能なヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、（ｖｉｉ）血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ－２（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）の機能を阻害可能な拮抗剤、及び（ｖｉｉｉ）プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を癌細胞に毒性を示す薬物（ｄｒｕｇ）に転換させるプロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）から選ばれるものを発現する発現カセットがさらに挿入されていることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項31】

前記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２４などのインターロイキン、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなどのインターフェロン、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ及びＦＬＴ３Ｌのうち一つ以上であり、
前記ケモカインは、ＣＣＬ２、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０及びＸＣＬ－１のうち一つ以上であり、
前記免疫関門は、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ－Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＤ２７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７）、ＣＤ２８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２８）、ＣＤ７０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７０）、ＣＤ８０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０）、ＣＤ８６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８６）、ＣＤ１３７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １３７）、ＣＤ２７６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７６）、ＫＩＲ（ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＩＴＲＬ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ）及びＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｎ－４）のうち一つ以上であり、
前記補助刺激因子は、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共同刺激因子）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εのうち一つ以上であり、
前記プロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）は、シトシンデアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、ラットシトクロムＰ４５０（ｒａｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，ＣＹＰ２Ｂ１）、カルボキシルエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）、細菌ニトロリダクターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）及び大腸菌から分離されたＰＮＰ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）のうち一つ以上であることを特徴とする、請求項３０に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項32】

前記融合タンパク質の発現カセットは、前記ウイルスゲノムに、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、ＵＳ１とＵＳ２遺伝子の間に挿入されていることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項33】

前記融合タンパク質は、ＮＨ_２－癌細胞標的化領域－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である或いはその逆順であることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項34】

前記融合タンパク質は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインがリンカーペプチドを媒介にして連結され、前記融合タンパク質はＮＨ_２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である或いはその逆順であることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項35】

前記融合タンパク質の発現カセットは、２個以上の融合タンパク質遺伝子を含み、これらの遺伝子の間にＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）又は２Ａペプチドを暗号化する核酸配列が位置するポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有し、１個の発現カセットが挿入されていることを特徴とする、請求項１９に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルス。

【請求項36】

請求項１～３５のいずれか一項に記載の組換えヘルペスシンプレックスウイルスを有効成分として含む癌を治療するための医薬組成物。

【請求項37】

癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとが融合した組換えアダプター分子をさらに含む、請求項３６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、多重標的化組換えヘルペスシンプルレックスウイルス及びその用途に関する。

【背景技術】

【0002】

癌の治療には、現在まで、手術療法、抗癌化学療法、放射線療法などが広く用いられているが、その大部分が副作用を伴い、不完全な治療効果、癌の再発及び転移などの問題点を抱えている。このため、新しくて効果的な癌治療法の開発への要求が続いており、ここ数年、抗癌ウイルス、ＣＡＲ－Ｔ細胞治療法（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）などの抗癌免疫療法において急速な発展があった。

【0003】

抗癌免疫療法のうち、抗癌ウイルスは、生きているウイルスの遺伝子を操作して癌細胞で選択的に増殖して癌細胞を溶解する特性を有するウイルスであり、正常細胞での増殖は制限的である。癌細胞を溶解して放出されたウイルスは、周辺の癌細胞を継続して感染させるので、持続的で相乗的な治療効果を奏することができる。また、抗癌ウイルスは、癌細胞を溶解する過程で免疫原性を持つ腫瘍抗原が放出され、人体の免疫反応を刺激して抗癌効果を高めることができ、また、このような抗癌効果は、サイトカイン、ケモカインなどを発現するように人為的に操作することによって増進してもよい。

【0004】

現在、開発されている抗癌ウイルスは、アデノウイルスとヘルペスシンプルレックスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、ワクシニアウイルスを含めて１０種以上に分類され、このうち、ＨＳＶは、１５２ｋｂサイズの線状の二本鎖ＤＮＡを含む多面体性ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ ｖｉｒｉｏｎ）であり、ＨＳＶ－１型とＨＳＶ－２型に分けられる。ＨＳＶは、多くの非必須遺伝子（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ）を有しており、ゲノムのサイズが大きいので、外部遺伝子の操作や運搬が容易であり、複製周期が短く、感染効率が高く、細胞付着と感染に関与する糖タンパク質の操作が容易であることにより、癌細胞に対する標的化を改善させることができる。

【0005】

２０１５年１０月米国ＦＤＡの承認を受けたＴ－ＶＥＣ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ、製品名：イムリジック）は、ＨＳＶ－１を用いた悪性黒色腫に対する抗癌ウイルス治療剤である。Ｔ－ＶＥＣは病原性を弱化させるためにＩＣＰ３４．５とＩＣＰ４７遺伝子が欠失しており、人体免疫反応を促進させるためのＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を発現する弱化した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ＨＳＶ－１型ウイルスである。しかし、Ｔ－ＶＥＣは、一の部遺伝子が消失することによってウイルス増殖が制限され、治療効能が低いという限界点を有する。

【0006】

ＨＳＶは、外皮（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を持つウイルスであり、ＨＳＶの細胞進入は、外皮に存在する糖タンパク質ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ／ｇＬ及びｇＣの複雑な相互作用によってなされる。まず、ｇＢとｇＣが細胞表面の３－Ｏ－Ｓ ＨＳ（３－Ｏ－ｓｕｌｆａｔｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ）に付着すると、ｇＤが細胞受容体であるＨＶＥＭ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ，ＨｖｅＡ）、ネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１，ＨｖｅＣ）、ネクチン－２（ｎｅｃｔｉｎ－２，ＨｖｅＢ）のうち少なくとも一つの受容体に結合してウイルスと細胞膜間の融合を誘導することによってＨＳＶが細胞に進入する（Ｈｉｒｏａｋｉ Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ）－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ Ｍｕｔａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＨＶＥＭ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｓｃｕｅ ｎｅｃｔｉｎ－１ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００９ Ａｐｒ；８３（７）：２９５１－６１）。

【0007】

２０１５年１０月に米国ＦＤＡの承認を受けたＴ－ＶＥＣ（Ｔａｌｉｍｏｇｅｎｅ Ｌａｈｅｒｐａｒｅｐｖｅｃ，製品名：イムリジック）は、ＨＳＶ－１を用いた悪性黒色腫に対する抗癌ウイルス治療剤である。Ｔ－ＶＥＣは、病原性を弱化させるためにＩＣＰ３４．５とＩＣＰ４７遺伝子が欠失しており、人体免疫反応を促進させるためのＧＭ－ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）を発現する弱化した（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）ＨＳＶ－１型ウイルスである。しかし、Ｔ－ＶＥＣは、一部の遺伝子が消失することにより、ウイルス増殖が制限され、治療効能が低いという限界点がある。

【0008】

このような限界を克服するために、ウイルスを弱化させることなくＨＳＶの細胞進入に関与する外皮糖タンパク質ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＣを操作して癌細胞を特異的に標的化するための再標的化（ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）が試みられた。このような再標的化は、癌細胞標的分子に対する標的化ドメインを暗号化する外因性配列を糖タンパク質ｇＤ、ｇＢ、ｇＨ、ｇＣ配列に導入することであり、野生型糖タンパク質に代えて、糖タンパク質に外因性配列の標的化ドメイン（リガンドともいう。）が挿入されているキメラ糖タンパク質を有する組換えウイルスを用いる方法である。このような組換えウイルスは、標的化領域が特異的に認識して結合する標的分子を有する癌細胞への進入が可能である。このような標的化領域は、一般に、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）が使用され、現在、再標的化が試みられた標的分子は、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）などであり、糖タンパク質としてｇＢ、ｇＨ、ｇＣなどの修飾がなされた。

【0009】

一方、ＨＳＶの細胞受容体のうちＨＶＥＭは、腫瘍壊死因子受容体タンパク質ファミリー（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ，ＴＮＦＲ ｆａｍｉｌｙ）に属し、主にＴ、Ｂリンパ球、マクロファージＤＣ細胞、感覚神経細胞（ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎ）、粘膜上皮細胞（ｍｕｃｏｓａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）で発現するが（Ｓｈｕｉ ＪＷ，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ．２０１３．Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ４（２）：１４６－１５１）、Ｂ、Ｔリンパ腫、黒色腫、直膓癌（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣の腸液腺癌種（ｏｖａｒｉａｎ ｓｅｒｏｕｓ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、透明腎細胞癌（ｃｌｅａｒ ｒｅｎａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）のような様々な腫瘍組織でも多く発現することが知られている（Ｐａｓｅｒｏ Ｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２．２（４）：４７８－８５，Ｍａｌｉｓｓｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＮＣＯＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ ２０１９，ＶＯＬ．８（１２）：ｅ１６６５９７６）ＨＶＥＭは、ＴＮＦＲファミリーの特徴である４個のＣＲＤ（ｃｙｓｔｅｉｎ－ｒｉｃｈ ｄｏｍａｉｎ）を有し、このうち２個のＣＲＤがＨＳＶのｇＤと結合してＨＳＶ－１とＨＳＶ－２の細胞進入を誘導するとされている（Ｓａｒａｈ Ａ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｏｎ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ ＨｖｅＡ（ＨＶＥＭ）。Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００２ Ｎｏｖ；７６（２１）：１０８９４－９０４．）。

【0010】

本発明者らは、ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）に対するｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）とＨＳＶ細胞表面受容体の一つであるＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質（ＣＥＡｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）を作製し、その融合タンパク質をＨＳＶと共にＣＥＡを発現する細胞株に処理する場合、その融合タンパク質がアダプター（ａｄａｐｔｅｒ）として作用し、ＨＳＶが当該細胞株を標的して感染させるように誘導することを既に報告したことがある（韓国登録特許第１０－０９３７７７４号及び米国登録特許第８３１８６６２号参照）。

【0011】

本発明者らは、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）又はＥｐＣＡＭを標的化できるアダプターである融合タンパク質（ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ、ＥｐＣＡＭ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）を暗号化する遺伝子をＨＳＶのゲノムに発現可能に挿入して、その融合タンパク質がＨＳＶに感染された細胞内で発現するようにする場合に、その融合タンパク質がＨＳＶを、ＨＥＲ２又はＥｐＣＡＭを発現する細胞株を標的して感染させるように誘導することを確認し、さらに、アダプターによる多重標的化が可能なように、ＨＥＲ２に対する標的化機能を有するアダプターである融合タンパク質（ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ）を発現できるその発現カセットとＥｐＣＡＭに対する標的化機能を有するアダプターである融合タンパク質（ＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡ）を発現できるその発現カセットをＨＳＶのゲノムに多重（ｄｕａｌ）に挿入して、これらの融合タンパク質がＨＳＶに感染された細胞内で発現するようにする場合に、これらの融合タンパク質がＨＳＶビリオンを、ＨＥＲ２及び／又はＥｐＣＡＭを発現する細胞株に対して多重に標的して感染させるように誘導することを確認する一方で、このようなアダプターの発現カセットをＨＳＶのゲノムに挿入し、さらに糖タンパク質を修飾してＨＥＲ２及び／又はＥｐＣＡＭに対する再標的化を可能にした組換えＨＳＶが、ＨＥＲ２及び／又はＥｐＣＡＭを発現する細胞株に対して多重に標的して感染させることを確認した。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

したがって、本発明の目的は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを多重に発現することによって多重標的化が可能な組換えＨＳＶを提供することにある。

【0013】

本発明の他の目的は、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを発現できる他にも再標的化が可能なように修飾された糖タンパク質を有することによって多重標的化が可能な組換えＨＳＶを提供することにある。

【0014】

本発明の他の目的は、前記組換えＨＳＶを有効成分として含む抗癌治療用薬剤学的組成物を提供することにある。

【0015】

本発明のさらに他の目的は、前記薬剤学的組成物を有効量で患者などの対象体に投与する癌予防又は治療方法を提供することにある。

【0016】

本発明の他の目的又は具体的な目的は、以下に提示されるであろう。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明は、多重標的化が可能な組換えＨＳＶに関し、本発明の多重標的化が可能な組換えＨＳＶは、一側面において、ヘルペスシンプルレックスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、癌細胞標的化領域（すなわち、癌細胞表面の標的分子に特異的に結合するドメインである。）とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質（すなわち、アダプター）を２個以上多重に発現させ得るようにその融合タンパク質発現カセットが１個以上挿入された構成を有することによって多重標的化が可能な組換えＨＳＶと把握できる。

【0018】

このような本発明の多重標的化組換えＨＳＶから２個以上、すなわち多重に融合タンパク質が発現することにより、その多重に発現した融合タンパク質は、その標的化領域が同一標的分子を多重に標的化する或いは互いに異なる標的分子を多重に標的化するものであってよい。前記標的分子は、融合タンパク質の標的化領域が特異的に認識して結合する癌細胞の表面に存在する任意の抗原又は任意の受容体のことを指すが、本発明の組換えＨＳＶは、一つの標的分子として、例えばＨＥＲ２を標的化できる融合タンパク質を多重に発現できる発現カセットが１個以上そのゲノムに挿入されたものであるか、或いは互いに異なる標的分子として、例えばＨＥＲ２とＥｐＣＡＭをそれぞれ標的化できる融合タンパク質を発現できる発現カセットが１個以上そのゲノムに挿入されたものであってよい。

【0019】

本発明の組換えＨＳＶが、癌細胞である標的細胞を感染させて標的細胞内に入ると、ＨＳＶが増殖されると共に２個以上の多重の融合タンパク質であるアダプターが細胞内で発現し、細胞溶解によって増殖されたＨＳＶビリオンと共に細胞外部に放出されるか、アダプターがリーダ配列を有する場合には細胞溶解によるビリオン放出前にも放出されるが、その場合、この細胞外部に放出された多重のアダプターはＨＳＶビリオンを、アダプターの癌細胞標的化領域が認識する標的分子を発現する周辺癌細胞に感染を多重に誘導することによって、単一標的化組換えＨＳＶ（すなわち、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質を発現できる発現カセットを一つのみ含む組換えＨＳＶ）に比べてその感染効率をより高め、周辺癌細胞への持続した拡散効率をより高める働きをする。これは、結果的に、より効果的な癌細胞の死滅につながる。

【0020】

他の側面において、本発明の多重標的化が可能な組換えＨＳＶは、（ｉ）ヘルペスシンプルレックスウイルスの増殖を阻害することなくそのゲノムに、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを発現できる発現カセットが１個以上挿入されており、また（ｉｉ）その糖タンパク質に癌細胞標的化領域が挿入されて融合することによって多重標的化が可能な組換えＨＳＶと把握されてよい。

【0021】

このような本発明の多重標的化組換えＨＳＶは、癌細胞標的化領域が挿入されて融合することによって再標的化が可能な修飾された糖タンパク質を有することにより、アダプターによる標的化の他にも、糖タンパク質によって追加の標的化が可能になる。このような多重標的化組換えＨＳＶも、前述した多重のアダプター発現カセットを有する組換えＨＳＶど同様に、ビリオンの癌細胞の感染効率やビリオンの周辺癌細胞への持続した拡散効率、癌細胞死滅効率においてより効果的である。

【0022】

一般に、組換えＨＳＶは、野生型ＨＳＶウイルスと比較して、人為的な突然変異が導入されることによって（すなわち、一部の核酸配列が欠失、置換又は挿入されることによって）一定機能が喪失又は変更されるか或いは意図した目的タンパク質を発現できるように遺伝的に操作されたＨＳＶを意味するが、本発明において組換えＨＳＶは、ＨＳＶゲノムに、ＨＳＶの増殖を阻害することなく、アダプターの発現カセット（ａｄａｐｔｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ）（すなわち、アダプター遺伝子がその発現を可能にするプロモーター配列及びポリアデニル化シグナル配列と作動可能に連結された構成体）を導入（すなわち、挿入）することにより、その組換えＨＳＶが感染された癌細胞内でアダプターを発現させることができ、また再標的化のために修飾された糖タンパク質を有するＨＳＶを意味する。

【0023】

このようなウイルスの遺伝子操作とビリオンの生産などの組換えウイルス製造技術は、当業界によく公知されており、具体的には、文献［Ｓａｎｄｒｉ－Ｇｏｌｄｉｎ ＲＭ ｅｔ ａｌ，Ａｌｐｈａ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００６］、文献［Ｒｏｂｉｎ Ｈ Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．２００４ Ａｕｇ；８５（４）：１７７－１９０］などを参照できる。当該文献を含めて本明細書で引用される文献はいずれも本明細書の一部として見なされる。

【0024】

本発明の組換えＨＳＶは、特に、このようなアダプターを発現するように操作される他に、進入受容体（ｅｎｔｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としてネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１）を通して細胞内に進入できず、単にＨＶＥＭ受容体を通してのみ細胞内に進入するようにさらに操作されてよい。本発明は、下の実施例においてＨＳＶ糖タンパク質（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）ｇＤの配列を操作して、ＨＶＥＭ受容体を通してのみＨＳＶが細胞内に進入するようにした。具体的には、ｇＤの２２２番位置のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）と２２３番位置のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｍｅ，Ｆ）をそれぞれアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）とイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）に置換させてｇＤの機能が変更されるように操作し、このようなｇＤ機能が変更された組換えＨＳＶは、単にＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）受容体を通してのみ宿主細胞内に入ることができる（Ｈｉｒｏａｋｉ Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＨＶＥＭ）－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ１Ｍｕｔａｎｔ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ＨＶＥＭ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｔｈａｔ Ｒｅｓｃｕｅ ｎｅｃｔｉｎ－１Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００９ Ａｐｒ；８３（７）：２９５１－６１）。ＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）受容体は、正常細胞にはほとんど存在しなく、リンパ腫などにのみ存在するのに対し、ネクチン－１は大部分が正常細胞に存在するので、ＨＶＥＭ受容体を通してのみ細胞進入が可能で、ネクチン－１受容体を通しては細胞進入が不可能な、前記ｇＤ機能が変更された組換えＨＳＶは、正常細胞を感染させることができず、安全性側面で有利な特性を有する。

【0025】

また、本発明の組換えＨＳＶは、アダプターによる標的化の他にも、糖タンパク質への癌細胞標的化領域の挿入及び融合によって追加の標的化が可能なように操作されるが、追加の標的化に使用可能な糖タンパク質としては、ｇＢ、ｇＣ、ｇＨなどが使用されてよく、糖タンパク質への癌細胞標的化領域が挿入・融合されたＨＳＶは、その糖タンパク質遺伝子が一部欠失する又は欠失しなく、癌細胞の標的化領域に対する遺伝子がオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）に挿入されることによって製造されてよい。このような糖タンパク質遺伝子に癌細胞標的化領域の遺伝子が挿入される場合に、癌細胞標的化領域は、糖タンパク質に融合した形態で組換えＨＳＶが細胞内で生産される際にビリオンの外皮に統合される。

【0026】

癌細胞標的化領域の糖タンパク質への挿入と融合は、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＨなどの糖タンパク質に、その糖タンパク質のアミノ酸配列が欠失することなくそのアミノ酸配列の任意の位置でなされる、一部の長さ（特に、１個のアミノ酸～４０個の連続したアミノ酸）のアミノ酸配列が欠失してその欠失した位置でなされる、或いは一部の長さのアミノ酸配列が欠失、置換されるが、欠失、置換されていないアミノ酸配列の任意の位置でなされてよい。ここで、一部の長さのアミノ酸の欠失、置換は、糖タンパク質の特定細胞受容体、例えば、ＨＶＥＭ、ネクチン－１などとの結合部位を不活性化させるためになされてよい。

【0027】

ｇＢ糖タンパク質に癌細胞標的化領域が挿入されて融合する場合に、Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を含む任意の位置であってよく、ＨＳＶ－１において好ましい位置は、ｇＢのアミノ酸配列（配列番号１，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７７７９）において、アミノ酸９番～８９６番領域内の任意の位置であってよい。また、好ましい位置は、アミノ酸３１番～７８番領域内の任意の位置、アミノ酸８０番～３６３番領域内の任意の位置、又はアミノ酸４０８番～８９６番領域内の任意の位置であってよい。また、好ましい位置は、ｇＢの４３番アミノ酸の次の位置、５２番アミノ酸の次の位置、７０番アミノ酸の次の位置、７６番アミノ酸の次の位置、８０番アミノ酸の次の位置、８１番アミノ酸の次の位置、９５番アミノ酸の次の位置、１００番アミノ酸の次の位置、１３７番アミノ酸の次の位置、１８５番アミノ酸の次の位置、１８７番アミノ酸の次の位置、２４１番アミノ酸の次の位置、２６１番アミノ酸の次の位置、２６５番アミノ酸の次の位置、３０４番アミノ酸の次の位置、３３４番アミノ酸の次の位置、３６１番アミノ酸の次の位置、４０８番アミノ酸の次の位置、４１９番アミノ酸の次の位置、４３０番アミノ酸の次の位置、４５８番アミノ酸の次の位置、４７０番アミノ酸の次の位置、４８１番アミノ酸の次の位置、４９５番アミノ酸の次の位置、４９７番アミノ酸の次の位置、５４６番アミノ酸の次の位置、６０８番アミノ酸の次の位置、６３０番アミノ酸の次の位置、６６３番アミノ酸の次の位置、６６４番アミノ酸の次の位置、６６５番アミノ酸の次の位置、６７１番アミノ酸の次の位置、６７３番アミノ酸の次の位置、６９０番アミノ酸の次の位置、７２５番アミノ酸の次の位置、７３０番アミノ酸の次の位置、７３２番アミノ酸の次の位置、７４２番アミノ酸の次の位置、７７２番アミノ酸の次の位置、８６８番アミノ酸の次の位置、８６９番アミノ酸の次の位置、８８６番アミノ酸の次の位置、８９３番アミノ酸の次の位置、８９４番アミノ酸の次の位置、８９５番アミノ酸の次の位置であってよい。前記位置はｇＢの配列番号１のアミノ酸配列を基準にしたが、ｇＢの配列において一部相違がある変異菌株においてはそれに相応する相同配列（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を基準にする。

【0028】

ｇＣ糖タンパク質に細胞標的化領域がさらに挿入されて融合する場合も、そのＮ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）を含む任意の位置であってよく、ＨＳＶ－１において好ましい位置は、ｇＣのアミノ酸配列（配列番号２，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７７９６）において、アミノ酸１番～４４２番領域内の任意の位置、より好ましい位置は、アミノ酸３３番～１５４番領域内の任意の位置であってよい。さらに好ましい位置は、、ｇＣの３３番アミノ酸の次の位置、８２番アミノ酸の次の位置、１４８番アミノ酸の次の位置、１４９番アミノ酸の次の位置、１５３番アミノ酸の次の位置であってよい。前記位置は、ｇＣの配列番号３のアミノ酸配列を基準にしたが、ｇＣの配列において一部相違がある変異菌株においてはそれに相応する相同配列（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を基準にする。

【0029】

ｇＨ糖タンパク質に癌細胞標的化領域が挿入されて融合する場合に、Ｎ末端（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ）、Ｈ１ＡドメインのＮ末端などを含む任意の位置であってよく、ＨＳＶ－１において好ましい位置は、ｇＨのアミノ酸配列（配列番号３，ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７７７３）において、アミノ酸１２番～８８番領域内の位置、アミノ酸１１６番～１３７番領域内の位置、又はアミノ酸２０９番～８３９番領域内の位置であってよい。また、好ましい位置は、アミノ酸１２番～４９番領域内の位置又はアミノ酸１１６番～１３７番領域内の位置であってよい。また、好ましい位置は、１２番アミノ酸の次の位置、２２番アミノ酸の次の位置、２３番アミノ酸の次の位置、２９番アミノ酸の次の位置、８３番アミノ酸の次の位置、１１６番アミノ酸の次の位置、２０９番アミノ酸の次の位置、２１５番アミノ酸の次の位置、２２５番アミノ酸の次の位置、２７７番アミノ酸の次の位置、３８６番アミノ酸の次の位置、４３７番アミノ酸の次の位置、４４７番アミノ酸の次の位置、４７２番アミノ酸の次の位置、６３６番アミノ酸の次の位置、６３７番アミノ酸の次の位置、６６６番アミノ酸の次の位置、７３１番アミノ酸の次の位置、７６３番アミノ酸の次の位置、７６４番アミノ酸の次の位置、７７５番アミノ酸の次の位置、８０６番アミノ酸の次の位置、８２４番アミノ酸の次の位置、８３８番アミノ酸の次の位置であってよい。前記位置はｇＨの配列番号３のアミノ酸配列を基準にしたが、ｇＨの配列において一部相違がある変異菌株においてはそれに相応する相同配列（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を基準にする。

【0030】

糖タンパク質の好ましい挿入位置に関連するより詳細は、文献［ＪＯＨＮ Ｒ．ＧＡＬＬＡＧＨＥＲ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ ｇＢ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｇＢ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｆｏｒｅ ａｎｄ ａｆｔｅｒ Ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｆｕｓｉｏｎ，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ，２０１４，Ｓｅｐ １８，１０（９）：ｅ１００４３７３］、文献［Ｇａｔｔａ Ｖ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｇａｎｄ ｉｎ ｇＨ Ｃｏｎｆｅｒｓ ｔｏ ＨＳＶ ａｎ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｔｒｏｐｉｓｍ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｇＤ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ Ｉｔｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１５ Ｍａｙ ２１；１１（５）：ｅ１００４９０７］、文献［Ｔｉｎａ Ｍ．Ｃａｉｒｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ ｇＤ ａｎｄ ｇＨ－ｇＬ：Ｃｌｕｅｓ ｆｒｏｍ ｇＤｇＨ Ｃｈｉｍｅｒａｓ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｊｕｎｅ ２００３，ｐ．６７３１－６７４２］、文献［Ｅ．Ｕ．Ｌｏｒｅｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ－Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ １ Ｍｕｔａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎ Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ ２００１；４４：２３２－２４２］、文献［Ｑｉｎｇ Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ １ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ（ｇＢ）Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ Ｗｈｅｔｈｅｒ ａ ｇＤ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｒ ａ ｇＢ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｓ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ａｕｇ．２００９，８３（１５）：７３８４－７３９０］、文献［Ｅｒｉｃｋ Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｎｄｏｍ ｌｉｎｋｅｒ－ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ａｕｇ．２００７，１０４（３２）：１３１４０－１３１４５］、文献［Ｊｕｌｉａ Ｏ．Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ １ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｈ Ｒｅｄｕｃｅ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｌｏｗ ｔｈｅ Ｒａｔｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ，ｏｒ Ａｂｒｏｇａｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｆｕｓｉｏｎ ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｅｎｔｒｙ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ，Ｆｅｂ．２０１０，８４（４）：２０３８－２０４６］、文献［Ｇｕｏｙｉｎｇ Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １ ｉｓ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ＩＬ１３Ｒ＊２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｃｅｌｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．Ｎｏｖ．２００２，９９（２３）：１５１２４－１５１２９］、文献［ＡＲ Ｆｒａｍｐｔｏｎ Ｊｒ ｅｔ ａｌ．，ＨＳＶ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００５，１２：８９１－９０１］、文献［Ｐａｏｌａ Ｇｒａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，ＨＳＶ－１Ｖｉｒｉｏｎｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＴＨＥＲＡＰＹ，Ｍａｒ．２００４，９（３）：４１９－４２７］、文献［Ｗｉｌｌｉａｍ Ｆ Ｇｏｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ（ＨＳＶ）Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｖｉｒｏｌ，２０１６Ｄｅｃ，２１：９３－１０１］、文献［Ｘｉａｏｄａｎ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ｎｉｇｒｏｓｔｒｉａｔａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｂｙ ｈｅｌｐｅｒ ｖｉｒｕｓ－ｆｒｅｅ ＨＳＶ－１ ｖｅｃｔｏｒ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔａｉｎ ｅｉｔｈｅｒ ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ＨＳＶ－１ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ－ＧＤＮＦ ｏｒ ａ ｇＣ－ＢＤＮＦ ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．２００５ Ｓｅｐ，１３９（１）：８８－１０２］などを参照できる。

【0031】

糖タンパク質に癌細胞標的化領域が挿入されて融合する場合にその癌細胞標的化領域のＮ末端とＣ末端にはリンカーペプチドが存在してよい。このようなリンカーペプチドは、糖タンパク質に融合する癌細胞標的化領域が糖タンパク質と融合することによってその固有３次元構造を形成する上で妨害を受けないように、癌細胞標的化領域と糖タンパク質との間に距離を置くためのものであり、それの標的分子との特異的な結合能力を有させる限り、任意の長さ、任意の配列のリンカーペプチドであってよい。リンカーは、柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）、溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、蛋白分解に対する抵抗性などの側面で、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒなどのアミノ酸のうち１種以上のアミノ酸からなることが好ましく、長さは、１～３０個アミノ酸、好ましくは３～２５個アミノ酸、より好ましくは８～２０個アミノ酸であってよい。

【0032】

本発明の組換えＨＳＶは、ＨＳＶの増殖（すなわち、生存と複製）に不要な非必須遺伝子（ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅｓ）が欠失する或いは機能を発揮しないように（すなわち、転写や翻訳が妨害を受けるように）突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）されてもよい。具体的には、そのような非必須遺伝子は、ＵＬ３遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８３０．１参照）、ＵＬ４遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８３１．１参照）、ＵＬ１４遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４１．１）、ＵＬ１６遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４３．１参照）、ＵＬ２１遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４８．１参照）、ＵＬ２４遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８５１．１参照）、ＵＬ３１遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８５９．１参照）、ＵＬ３２遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８６０．１参照）、ＵＳ３遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８９１．１参照）、ＵＬ５１遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８８０．１参照）、ＵＬ５５遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８８４．１参照）、ＵＬ５６遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８８５．１参照）、ＵＳ２遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８９０．１）、ＵＳ１２遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２９０１．１；すなわち、ＩＣＰ４７遺伝子参照）、ＬＡＴ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１参照）、ｇＢ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ７３４７７１．１の５２９９６と５５７１０との間の配列）、ｇＬ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８２８．１参照）、ｇＨ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８４９．１参照）、ｇＤ遺伝子（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦＥ６２８９４．１参照）などを挙げることができる。

【0033】

ＨＳＶウイルスの非必須遺伝子に関連するより詳細は、文献［ＤＭ Ｋｎｉｐｅ ａｎｄ ＰＭ Ｈｏｗｌｅｙ（ｅｄ．）Ｆｉｅｌｄｓ ｖｉｒｏｌｏｇｙ（ｖｏｌ．２）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．２００１．ｐ．２３９９－２４６０）］、文献［Ｓｕｂａｋ－Ｓｈａｒｐｅ Ｊ Ｈ，Ｄａｒｇａｎ Ｄ Ｊ ＨＳＶ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ：ｇｅｎｅｒａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ，１９９８，１６（３）：２３９－２５１］、文献［Ｔｒａｖｉｓ Ｊ．Ｔａｙｌｏｒ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｅｐａｉｒ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ＩＣＰ８，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００４ Ｊｕｎ；７８（１１）：５８５６－５８６６］などを参照できる。

【0034】

本発明の組換えＨＳＶは、組換えＨＳＶ－１ウイルス、組換えＨＳＶ－２ウイルス、又はＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２キメラウイルス（すなわち、ゲノムがＨＳＶ－１に由来するＤＮＡ及びＨＳＶ－２に由来するＤＮＡの両方を含む組換えＨＳＶウイルス）であってよく、好ましくは組換えＨＳＶ－１ウイルス、より好ましくはＨＳＶ－１ＫＯＳ菌株に由来する組換えＨＳＶ－１である。ＨＳＶ－１ＫＯＳ菌株はＡＴＣＣ（Ｃａｔ Ｎｏ ＶＲ－１４９３ＴＭ）から購入可能であり、その菌株のゲノム配列は全体配列分析が完了してＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に提示されている（Ｓｔｕａｒｔ Ｊ Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ １ Ｓｔｒａｉｎ ＫＯＳ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ；８６（１１）：６３７１－２）。

【0035】

ＨＳＶ－１ウイルスのゲノムは、総８４個の遺伝子を暗号化する１５２ｋｂの二本鎖の線形ＤＮＡで構成されており、これは、互いに連結された２つの断片、すなわち、長い断片（Ｌ領域）と短い断片（Ｓ領域）で構成される。長い断片（Ｌ領域）はゲノムの約８２％を占め、短い断片（Ｓ領域）はゲノムの約１８％を占め、長い断片と短い断片は、接合領域である２個のＩＲＬ（（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって結合し、各断片の末端にはＴＲＬ（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｇｍｅｎｔ）が存在する。Ｌ領域（ＵＬ）には、５６個のＵＬ１～ＵＬ５６遺伝子と１０個の遺伝子（ＵＬ８．５、９．５、１０．５、１２．５、１５．５、２０．５、２６．５、２７．５、４３．５、４９．５）が存在し、Ｓ領域（ＵＳ）には、１２個のＵＳ１～ＵＳ１２遺伝子と２個の遺伝子（ＵＳ１．５、８．５）が存在し、接合領域である２個のＩＲＬに４個の遺伝子（ＩＣＰ４、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ０及びＬＡＴ）が含まれている。

【0036】

本発明において、アダプター発現カセットは、アダプター遺伝子がそれの発現を可能にするためのプロモーター配列と転写終結信号配列であるポリアデニル化シグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）配列と作動可能に連結されて構成される。ここで、“作動可能に連結される”とは、発現するアダプター遺伝子の転写及び／又は翻訳が可能なように連結されるという意味である。例えば、あるプロモーターがそれに連結されたアダプター遺伝子の転写に影響を与えるとすれば、そのプロモーターはそのアダプター遺伝子に作動可能に連結されたものである。

【0037】

一般に、プロモーターは、ある遺伝子の転写開始点を基準に上位（５’側）に位置し、ＤＮＡ依存ＲＮＡ重合酵素に対する結合部位、転写開始点、転写因子結合部位などを含む、一つ以上の遺伝子の転写を制御する機能を有する核酸配列を意味する。このようなプロモーターは、真核生物由来の場合は、転写開始点上位にあるＴＡＴＡボックス（通常、転写開始点（＋１）－２０～－３０位置に存在）、ＣＡＡＴボックス（通常、転写開始部位と比較して略－７５位置に存在）、エンハンサー、転写因子結合部位などを含む。

【0038】

プロモーターはそれに連結された目的遺伝子を発現し得るプロモーターであれば、構成的プロモーター（常時的に遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、誘導性プロモーター（特定外部刺激に反応して目的遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、組織特異性プロモーター（特徴組織や細胞で遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、組織非特異的プロモーター（全ての組織や細胞で遺伝子の発現を誘導するプロモーター）、内人性プロモーター（ウイルスが感染される細胞に由来するプロモーター）、外因性プロモーター（ウイルスが感染される細胞以外の細胞に由来するプロモーター）のいずれも使用可能である。このようなプロモーターは、当業界に多数が公知されており、公知のものからいずれかを適切に選択して使用することができる。例えば、ＣＭＶ（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＲａｕＳＥ肉腫ウイルス（ＲＳＶ，ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）ＴＫ（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）プロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター、ＣＤ４５プロモーター（造血母細胞特異的プロモーター）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞特異的プロモーター）、サバイビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ミドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ）、ＴＥＲＴ、ＣＸＣＲ４などの癌細胞特異的プロモーター（ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）などを使用することができる。特に、癌細胞特異的プロモーターを使用する場合に、癌細胞でのみアダプターの発現を誘導することによって、アダプターが正常細胞で発現することを抑制し、本発明の組換えＨＳＶの安全性を高めることができる。

【0039】

前記アダプター発現カセットは、プロモーターの他にも転写終結信号配列を含んで構成されるが、転写終結信号配列は、ｐｏｌｙ（Ａ）添加信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）として作用する配列であり、転写の完結性及び効率性を高めるためのものである。多くの転写終結信号配列が当業界に公知されており、この中から適切なもの、一例えば、ＳＶ４０転写終結信号配列、ＨＳＶ ＴＫ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）の転写終結信号配列などを選択して使用することができる。

【0040】

前記アダプター発現カセットは、ＨＳＶの増殖を阻害することなくＨＳＶゲノムに発現可能なように挿入されるが、そのような挿入は、ＨＳＶゲノムの欠失無しで挿入されるか、又はＨＳＶゲノムのうち非必須遺伝子が一部又は全部欠失してその欠失した位置に挿入されてよい。アダプター発現カセットがＨＳＶゲノムの欠失無しで挿入される場合に、各遺伝子間に挿入されてよいが、挿入される位置として好ましい位置は、例えば、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、ＵＳ１とＵＳ２遺伝子の間などを挙げることができる。

【0041】

アダプター発現カセットが、ＨＳＶゲノムに非必須遺伝子が一部又は全部欠失してその欠失した位置に挿入される場合に、欠失する非必須遺伝子は、先に例示した任意の非必須遺伝子であってよい。

【0042】

アダプターを多重に発現するために、ポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有するアダプター発現カセットが１個以上ＨＳＶゲノムに挿入されるか、モノシストロン（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有するアダプター発現カセットが２個以上ＨＳＶゲノムに挿入されてよい。

【0043】

ポリシストロン構成を有するアダプター発現カセットは、プロモーターと転写終結信号配列の他にもその間に２個以上のアダプター遺伝子を含み、それら遺伝子の間にはそれぞれタンパク質が発現し得るようにＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ、内部リボソーム流入部位）や２Ａペプチド暗号化する核酸配列が位置する。ここで、２Ａペプチドは、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、昆虫ウイルス、類型Ｃロタウイルス（Ｔｙｐｅ Ｃ ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）から確認されたものであり、好ましい２Ａペプチドは、トセアアシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ ｖｉｒｕｓ）の２Ａ（Ｔ２Ａ）、ブタテスコウイルス－１（Ｐｏｃｉｎｅ Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１）の２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＥＲＡＶ（Ｅｑｕｉｎｅ Ｒｈｉｎｉｔｉｓ Ａ Ｖｉｒｕｓ）の２Ａ（Ｅ２Ａ）、ＦＭＤＶ（Ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ）の２Ａ（Ｆ２Ａ）などが例示されてよい。ＩＲＥＳや２Ａペプチドに対してのより詳細は、文献［Ｅｄｉｔｈ Ｒｅｎａｕｄ－Ｇａｂａｒｄｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ－ｂａｓｅｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．２０１５Ｆｅｂ２０；５（１）：１１－２０］、文献［Ｓｚｙｍｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒｓ，（２００５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：６２７－６３８］、文献［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａ ２Ａ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅｓ，Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ａｎｄ Ｍｉｃｅ，（２０１１）ＰＬｏｓＯＮＥ６（４）：ｅ１８５５６］などを参照できる。

【0044】

アダプターを多重に発現するために、アダプター発現カセットがモノシストロン構成を有する場合に、そのようなアダプター発現カセットはＨＳＶゲノムに２個以上挿入されるが、この場合２個以上のアダプター発現カセットは、ＨＳＶゲノムで同一位置に連続して挿入されるか、それぞれ異なる位置に挿入されてよい。例えば、ＨＥＲ２を標的分子とするアダプター発現カセットとＥｐＣＡＭを標的分子とするアダプター発現カセットが両方とも、同一位置であるＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間に挿入されるか、或いは互いに異なる位置として、ＨＥＲ２を標的分子とするアダプターはＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間に挿入され、ＥｐＣＡＭを標的分子とするアダプターはＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間に挿入されてよい。２個以上挿入されるアダプター発現カセットが同一位置に連続して挿入される場合に、発現カセット間には非暗号領域が介在されてよい。このような非暗号領域は、２個以上の発現カセットが互いその発現（転写及び／又は翻訳）に妨害を受けないようにするためのものであり、このような非暗号領域は３～６０個ヌクレオチドからなってよい。

【0045】

本発明において、３種類の以上のアダプターを多重に発現する必要があるとき、２種類のアダプターを発現できるポリシストロン（ｐｏｌｙｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有するアダプター発現カセットと、残りのアダプターを発現できるモノシストロン（ｍｏｎｏｃｉｓｔｒｏｎ）構成を有するアダプター発現カセットが共にＨＳＶのゲノムの同一位置又は異なる位置に挿入されてよい。

【0046】

本発明の組換えＨＳＶにおいて、アダプターの癌細胞標的化領域は、標的細胞である癌細胞の標的分子を特異的に認識して結合する部分であり、このような癌細胞標的化領域が認識する標的分子は、癌細胞の表面に存在する任意の抗原又は任意の受容体である。

【0047】

このような抗原又は受容体は、好ましくは癌細胞でのみ発現する或いは正常細胞に比べて癌細胞で過発現する抗原又は受容体のことを指す。例えば、膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）で発現するＥＧＦＲｖIII（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔIII）、未分化甲状腺癌や乳癌、肺癌、神経膠腫（ｇｌｉｏｍａ）などに過発現するＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、乳頭性甲状腺癌（ｐａｐｉｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ）などで過発現するタスチン受容体（Ｍｅｔａｓｔｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、乳癌などで過発現するＥｒｂＢ系列の受容体チロシンキナーゼ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ）、乳癌、膀胱癌、胆嚢癌（Ｇａｌｌｂｌａｄｄｅｒ ｃａｎｃｅｒｓ）、胆管癌（Ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、胃食道接合部癌（ｅｓｏｐｈａｇｏｇａｓｔｒｉｃ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｃａｎｃｅｒｓ）などで過発現するＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、肉腫様腎癌などで過発現するチロシンキナーゼ－１８－受容体（ｃ－Ｋｉｔ）、食道腺癌などで過発現するＨＧＦ受容体ｃ－Ｍｅｔ、乳癌などで過発現するＣＸＣＲ４又はＣＣＲ７、前立腺癌で過発現するエンドテリン－Ａ受容体、直膓癌などで過発現するＰＰＡＲ－δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ δ）、卵巣癌などで過発現するＰＤＧＦＲ－α（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ α）、肝癌、多発性骨髄腫などで過発現するＣＤ１３３、肺癌、大腸癌、胃癌、膵癌、乳癌、直膓癌、結腸癌、甲状腺髄質癌などで過発現するＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、肝癌、胃癌、大腸癌、膵癌、乳癌などで過発現するＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、肺癌、乳癌、膵癌、卵巣癌などで過発現するＭＳＬＮ（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、神経芽細胞腫などで過発現するＧＤ２（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、肝細胞癌などで過発現するＧＰＣ３（Ｇｌｙｐｉｃａｎ ３）、前立腺癌などで過発現するＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）、卵巣癌、乳癌、結腸癌、肺癌、膵癌などで過発現するＴＡＧ－７２（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ７２）、黒色腫などで過発現するＧＤ３（ｄｉｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）、血液癌、固形癌などで過発現するＨＬＡ－ＤＲ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－ＤＲ）、進行性固形癌などで過発現するＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ １）、進行性肺癌（ａｄｖａｎｃｅｄ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ－ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）などで過発現するＮＹ－ＥＳＯ－１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ １）、鼻咽頭腫瘍（Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｎｅｏｐｌａｓｍｓ）などで過発現するＬＭＰ１（Ｌａｔｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、肺癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、結腸癌、大腸癌、膵癌などで過発現するＴＲＡＩＬＲ２（ｔｕｍｏｒ－ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｌｉｇａｎｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ２（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）、肝細胞癌などで過発現するＨＧＦＲ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）などが標的分子であってよく、また、癌幹細胞の表面抗原であるＣＤ４４、ＣＤ１６６なども標的分子であってよい。当業界には正常細胞に比べて癌細胞で過発現する多くの標的分子が知られており、前記例示された標的分子以外のものに関連するより詳細は、文献［Ａｎｎｅ Ｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００５ Ｄｅｃ １；６５（２３）：１０９４６－５１］、文献［Ｃｈｅｎｗｅｉ Ｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｆｅｂ １；６７（３）：１０３０－７］、文献［Ｓｈｕｏ Ｍａ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ．２０１９ Ｓｅｐ ７；１５（１２）：２５４８－２５６０］、文献［Ｄｈａｖａｌ Ｓ Ｓａｎｃｈａｌａ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｓｔｒｉｄｅ Ｔｏｗａｒｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１７ Ｍａｙ １６；８：２７０］などを参照できる。

【0048】

特に、本発明において、標的分子は、好ましくはＨＥＲ２又はＥｐＣＡＭである。

【0049】

本発明の組換えＨＳＶがアダプターによって標的化する標的細胞は、本発明におけるアダプターの癌細胞標的化領域が標的できる標的分子を有する任意の癌細胞である。癌細胞であれば、食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸癌、子宮内膜体癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、黒色腫、膀胱癌、腎臓癌、肝癌、膵癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳癌、甲状腺癌、白血病、ホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）疾患、リンパ腫、多発性骨髄腫、血液癌など、癌腫を問わない。

【0050】

本発明において、アダプターの細胞標的化領域は、標的分子と特異的結合能を有する完全な抗体の他にも、抗体誘導体、抗体類似体であってよい。抗体誘導体は、標的分子と特異的結合能を有する抗体可変領域を少なくとも一つ含む完全な抗体の断片又は修飾抗体を意味する。このような抗体誘導体としては、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ＶｈＨ、ＶＨ、ＶＬなどの抗体断片、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、ミニボディ、ジアボディ、トリボディ、テトラボディ、ビス－ｓｃＦｖなどの多価性又は多重特異的修飾抗体などを挙げることができる。抗体類似体は、抗体と同様に、標的分子と特異的結合能を有するが、構造上抗体とは違っており、一般的に抗体に比べて低い分子量を有する人為的ペプチド又はポリペプチドを意味する。このような抗体類似体として、ＡＢＤ、アディロン（ａｄｈｉｒｏｎ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎ）、アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｙ）、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、アルマジロ（ａｒｍａｄｉｌｌｏ）反復タンパク質、センチリン（ｃｅｎｔｙｒｉｎ）、ダルピン（ＤＡＲＰｉｎ）、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒ）、Ｋｕｎｉｔｚ領域、プロネクチン（ｐｒｏｎｅｃｔｉｎ）、リピボディ（ｒｅｐｅｂｏｄｙ）などを挙げることができる。

【0051】

このような抗体、抗体誘導体、抗体類似体、その製造と関連しては当業界に相当多い文献が蓄積されており、それらの文献としては、例えば、文献［Ｒｅｎａｔｅ Ｋｕｎｅｒｔ ＆ Ｄａｖｉｄ Ｒｅｉｎｈａｒｔ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１６ Ａｐｒ；１００（８）：３４５１－６１］、文献［Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ１，Ｈｕｄｓｏｎ ＰＪ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｉｓｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５ Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６－３６］、文献［Ｘｉａｏｗｅｎ Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｅｙｏｎｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｓ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐａｒｔｎｅｒｓ：Ｔｈｅ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，１０：２９３－３２０］、文献［Ａｂｄｕｌ Ｒａｓｈｅｅｄ Ｂａｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｉｍｅｔｉｃｓ：ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ａｎｉｍａｌ－ｓｏｕｒｃｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，３６：２６８－２７５］などを挙げることができる。

【0052】

本発明において、アダプターの細胞標的化領域は、好ましくはｓｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）である。ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）の可変領域と軽鎖（ＶＬ）の可変領域の短いリンカーペプチドを媒介にして連結された一本鎖抗体のことを指す。ｓｃＦｖでＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端と連結されるか、又はＶＬのＣ末端はＶＨのＮ末端と連結される。ｓｃＦｖでリンカーペプチドは重鎖と軽鎖の固有３次元構造を妨害しないとともにそれら重鎖と軽鎖が空間的に隣接して標的分子との特異的な結合能力を有させる限り、任意の長さ、任意の配列のリンカーペプチドであってよい。好ましくは、リンカーは柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）、溶解性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、蛋白分解に対する抵抗性などの側面で、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒなどのアミノ酸のうち１種以上のアミノ酸からなることが好ましく、長さは１～３０個アミノ酸、好ましくは３～２５個アミノ酸、より好ましくは８～２０個アミノ酸であってよい。

【0053】

本発明において、特に、ｓｃＦｖは、標的分子をＨＥＲ２又はＥｐＣＡＭとし、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖは配列番号４のＶＨと配列番号５のＶＬがリンカーペプチドを媒介にしてＶＨ、リンカーペプチドＶＬの順に連結されたこと（すなわち、ＶＨのＣ末端がＶＬのＮ末端とリンカーペプチドを媒介にして連結されたこと）が好ましく、ＥｐＣＡＭに対するｓｃＦｖは、配列番号６のＶＬと配列番号７のＶＨがリンカーペプチドを媒介にしてＶＬ、リンカーペプチド、ＶＨの順に結合したこと（すなわち、ＶＬのＣ末端がＶＨのＮ末端とリンカーペプチドを媒介にして連結されたこと）が好ましい。

【0054】

本発明において、ＨＶＥＭの細胞外ドメインは、下の実施例で用いられた、配列番号８のＨｖｅＡ８２（リーダ配列まで含まれたＨｖｅＡ８２配列は配列番号９に開示されている。）の他に、韓国登録特許第１０－０９３７７７４号及び米国登録特許第８３１８６６２号（本文献は本明細書の一部として見なされる。）が開示する配列番号１０のＨｖｅＡ８７（リーダ配列まで含まれたＨｖｅＡ８７配列は配列番号１１に開示されている。）、配列番号１２のＨｖｅＡ１０２（リーダ配列まで含まれたＨｖｅＡ１０２配列は配列番号１３に開示されている。）又は配列番号１４のＨｖｅＡ１０７（リーダ配列まで含まれたＨｖｅＡ１０７配列は配列番号１５に開示されている。）であってもよい。配列番号９、１１、１３及び１５の配列に含まれたリーダ配列は、ＨｖｅＡの信号ペプチド配列である。ＨｖｅＡ８７、ＨｖｅＡ１０２、ＨｖｅＡ１０７はそれぞれ、ＨｖｅＡ８２に比べて５、２０、２５個アミノ酸をさらに含んでおり、前記韓国登録特許及び米国登録特許でいずれもアダプターのＨＳＶレセプターとして使用可能であることを確認したことがある。

【0055】

また、本発明において、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの間にリンカー配列が介在されてよいが、このリンカー配列は、それらのアダプターの各ドメインの機能を阻害しない限り、任意の長さ、任意の配列のリンカーであってよい。好ましくは、リンカーは、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒの４つのアミノ酸のうち１種以上のアミノ酸からなってよく、長さは１～３０個アミノ酸、好ましくは３～２５個アミノ酸、より好ましくは８～２０個アミノ酸であってよい。

【0056】

また、本発明のアダプターは、ＮＨ_２－癌細胞標的化ドメイン－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である或いはその逆順の構成を有することができる。リンカーペプチドが媒介される場合は、ＮＨ_２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である或いはその逆順の構成であってよい。

【0057】

本発明のアダプターは、そのＮ末端に、具体的には、アダプターの構成がＮＨ_２－癌細胞標的化領域－リンカーペプチド－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－ＣＯＯＨの順である場合は癌細胞標的化ドメインのＮ末端（ｓｃＦｖが使用される場合にＶＨやＶＬのＮ末端）に、アダプターの構成がＮＨ_２－ＨＶＥＭ細胞外ドメイン－リンカーペプチド－癌細胞標的化ドメイン－ＣＯＯＨの順である場合にはＨＶＥＭ細胞外ドメインのＮ末端にリーダ配列（すなわち、分泌誘導信号配列）がさらに含まれてよい。リーダ配列は、細胞質で発現されたタンパク質が細胞膜を透過して細胞外部に分泌されるように誘導する機能を有する配列であり、通常、約１５～３０個の連続した疎水性アミノ酸残基を含む。使用可能なリーダ配列は、特に限定されないが、ＨｖｅＡのリーダ配列、抗体可変部ＶＬ（ｋａａｐａ）のリーダ配列、ｔ－ＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）のリーダ配列、血清アルブミンのリーダ配列、ラクトフェリンのリーダ配列、α－カゼインのリーダ配列、ヒト成長ホルモンを含む様々なホルモンのリーダ配列、酵母や細菌から分泌されるポリペプチドのリーダ配列など、細胞膜外部に分泌されるタンパク質のＮ末端に存在する任意の配列であってよい。

【0058】

このようなリーダ配列は、標的細胞でアダプターが発現されて細胞外にアダプターが流出されるように誘導する作用をする配列であり、標的細胞が溶解されてＨＳＶウイルスが放出された後になってこそ、アダプターがＨＳＶウイルスを隣接標的細胞に感染されるように誘導する作用をするので、省略されてもよい。

【0059】

また、本発明において、細胞標的化領域に標的分子に対するｓｃＦｖを使用する場合にはＶＨとＶＬの間に、ＶＨとＶＬの間にリンカーペプチドが媒介される場合にはＶＨ又はＶＬとリンカーペプチドの間、ｓｃＦｖとＨＶＥＭの間に、ｓｃＦｖとＨＶＥＭの間にリンカーペプチドが媒介される場合にはｓｃＦｖとリンカーの間、リンカーとＨＶＥＭの間に、クローニングを容易にするために任意の制限酵素作用部位に該当するアミノ酸が介在されてよい。例えば、制限酵素ＥｃｏＲＩが作用するＥＦ（塩基配列：ＧＡＡＴＴＣ）、ＢａｍＨＩが作用するＧＳ（（塩基配列：ＧＧＡＴＣＣ）、ＸｈｏＩが作用するＬＥＥＬ（塩基配列：ＣＴＣＧＡＧＧＡＧＣＴＣ）などが介在されてよい。

【0060】

本発明において、組換えＨＳＶは、癌細胞に対する免疫反応を誘導又は増進させるための因子を単独で又は任意の組合せで発現するように当該因子に対する遺伝子がＨＳＶゲノムに挿入されてよい。それらの因子は、サイトカイン、ケモカイン、免疫関門（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）に対する拮抗剤（例えば、抗体、抗体誘導体又は抗体類似体、特に、ｓｃＦｖ）、免疫細胞（Ｔ細胞又はＮＫ細胞）の活性化を誘導できる補助刺激因子（ｃｏ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、癌細胞に対する免疫反応を抑制するＴＧＦβの機能を阻害できる拮抗剤（例えば、抗体、抗体誘導体又は抗体類似体、特にｓｃＦｖ）、固形癌腫瘍微細環境を構成するヘパランサルフェートプロテオグリカン（ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）を分解できるヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）、血管新生因子受容体であるＶＥＧＦＲ－２（ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－２）の機能を阻害できる拮抗剤（例えば、抗体、抗体誘導体又は抗体類似体、特にｓｃＦｖ）などを発現するように操作されてよい。

【0061】

サイトカインは、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２４などのインターロイキン、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγなどのインターフェロン、ＴＮＦαなどの腫瘍壊死因子、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３Ｌなどのコロニー刺激因子などが単独で又は２以上の任意の組合せで組換えＨＳＶで発現するように使用されてよい。

【0062】

ケモカインは、例えば、ＣＣＬ２（Ｃ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２０、ＸＣＬ－１（（Ｘ－Ｃ Ｍｏｔｉｆ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ Ｌｉｇａｎｄ１））などが単独で又は組合せで組換えＨＳＶで発現するように使用されてよい。

【0063】

免疫関門に対する抗体は、ＰＤ－１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－１）、ＰＤ－Ｌ１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈｌｉｇａｎｄ １）、ＰＤ－Ｌ２（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ－ｌｉｇａｎｄ ２）、ＣＤ２７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７）、ＣＤ２８（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２８）、ＣＤ７０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ７０）、ＣＤ８０（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８０）、ＣＤ８６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ８６）、ＣＤ１３７（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １３７）、ＣＤ２７６（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ２７６）、ＫＩＲｓ（ｋｉｌｌｅｒ－ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＬＡＧ３（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ ３）、ＧＩＴＲ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＩＴＲＬ（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ＴＮＦＲ－ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｇａｎｄ）、ＣＴＬＡ－４（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｎ－４）などに対する拮抗剤が単独で又は組合せで組換えＨＳＶで発現するように使用されてよい。

【0064】

補助刺激因子は、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＬＦＡ－１（リンパ球機能関連抗原－１）、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共同刺激因子）、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εなどが単独で又は組合せで組換えＨＳＶで発現するように使用されてよい。

【0065】

本発明において、組換えＨＳＶは、プロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）を癌細胞に毒性を示す薬物（ｄｒｕｇ）に転換させるプロドラッグ活性化酵素（ｐｒｏｄｒｕｇ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ）を発現するように操作されてよい。このようなプロドラッグ活性化酵素としては、プロドラッグである５－ＦＣ（５－ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）を５－ＦＵ（５－ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）である薬物に転換させるシトシンデアミナーゼ（Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ）、プロドラッグであるＣＰＡ（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）をＰＭ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ ｍｕｓｔａｒｄ）である薬物に転換させるラットシトクロムＰ４５０（ｒａｔ ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０，ＣＹＰ２Ｂ１）、プロドラッグであるイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ，ＳＮ－３８１５０）をＳＮ－３８である薬物に転換させるカルボキシルエステラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ）、プロドラッグであるＢＣ１９５４をＤＮＡ交差結合剤である４－ヒドロキシアミン１５１（４－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ １５１）に転換させる細菌ニトロリダクターゼ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、プロドラッグである６－メチルプリン－２’－デオキシリボシド（６－ｍｅｔｈｙｐｕｒｉｎｅ－２’－ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｉｄｅ）を６－メチルプリン（６－ｍｅｔｈｙｌｐｕｒｉｎｅ）に転換させる大腸菌から分離されたＰＮＰ（ｐｕｒｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）などを挙げることができる。

【0066】

また、本発明において、組換えＨＳＶは、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｌｉｇａｎｄ）を発現するように操作されてよい。ＴＲＡＩＬは、癌細胞で過発現するそれの受容体に結合して癌細胞の死滅を誘導すると知られている（Ｋａｏｒｕ Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｍｕｌｔｉｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ Ｖｉｒｕｓ Ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｔｕｍｏｒｓ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０ １３ Ｊａｎ；２１（１）：６８－７７）。

【0067】

このような免疫反応を誘導又は増進させるための因子やプロドラッグ活性化酵素の使用に関連するより詳細は、文献［Ｍｉｃｈｅｌｅ Ａｒｄｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｊ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５ Ａｕｇ １４；６（２３）：］、文献Ｂｅｒｎｈａｒｄ Ｈｏｍｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ：Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２ Ｍａｒ；２（３）：１７５－８４］、文献［Ｍａｒｉａｎｅｌａ Ｃａｎｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ，Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏａｐｏｔｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ ｔｏ ｕｓｅ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｆｌｔ３Ｌ ｉｎ ａｎ ｉｍｍｕｎｅ－ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ（ＧＢＭ）、Ｊ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，２００８，２２：１０７７１３］、文献［Ｄａｎｎｙ Ｎ Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ，ＣＡＲｓ ａｎｄ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２０１６ Ｍａｙ；１３（５）：２７３－９０］、文献［Ｐａｕｌ Ｅ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６ Ｊｕｌ；３７（７）：４６２－４７６］、文献［Ｃｏｌｅ Ｐｅｔｅｒｓ １，Ｓａｍｕｅｌ Ｄ Ｒａｂｋｉｎ，Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ．２０１５；２：１５０１０］などを参照できる。

【0068】

本発明において、免疫反応を誘導又は増進させるための因子やプロドラッグ活性化酵素は、前述したアダプターにおけると同様に、その遺伝子の発現カセット（すなわち、その遺伝子がその発現を可能にするプロモーター配列及びポリアデニル化シグナル配列と作動可能に連結された構成体）がＨＳＶの増殖を阻害しないでＨＳＶゲノムに挿入されるが、そのような挿入は、ＨＳＶゲノムの欠失無しで、又はＨＳＶゲノムのうち非必須遺伝子が一部又は全部欠失し、その欠失した位置に挿入されてよい。このとき、ＨＳＶゲノムの欠失無しで挿入される場合に、各遺伝子間に挿入されてよく、好ましい挿入位置は、例えば、ＵＬ３とＵＬ４遺伝子の間、ＵＬ２６とＵＬ２７遺伝子の間、ＵＬ３７とＵＬ３８遺伝子の間、ＵＬ４８とＵＬ４９遺伝子の間、ＵＬ５３とＵＬ５４遺伝子の間、ＵＳ１とＵＳ２の間などを挙げることができる。非必須遺伝子が欠失し、その欠失した位置に挿入されるか或いは非必須遺伝子の欠失無しでその遺伝子中に挿入される場合に、そのような非必須遺伝子は、前述した任意の非必須遺伝子から選択されてよい。

【0069】

他の側面において、本発明は、前述した組換えＨＳＶを有効成分として含む抗癌用薬剤学的組成物に関する。

【0070】

本発明の薬剤学的組成物は、組換えＨＳＶが発現するアダプターの標的化領域が標的する標的分子を発現する癌腫に対して抗癌用途を有する。このような癌腫は、先に標的分子と関連して説明した通りである。

【0071】

特に、本発明の組成物は、ＨＥＲ２又はＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞を有する癌腫に対して抗癌用途を有することが好ましい。例えば、ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞は、乳癌細胞、卵巣癌細胞、胃癌細胞、肺癌細胞、頭頸部癌細胞、骨肉腫細胞、多形成神経膠芽腫細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）、唾液腺腫瘍（ｓａｌｉｖａｒｙ ｇｌａｎｄ ｔｕｍｏｒ）細胞などを挙げることができる。また、例えば、ＥｐＣＡＭを発現する腫瘍細胞は、肝癌細胞、前立腺癌細胞、乳癌細胞、大腸癌細胞、肺癌細胞、胆嚢癌細胞、膵癌細胞、胃癌細胞などを挙げることができる。

【0072】

本発明において、抗癌は、癌細胞の死滅、癌細胞の生存能低下、癌細胞の増殖抑制による癌が有する病理的症状の抑制や遅延、そのような病理的症状の発病抑制や遅延、癌転移抑制、癌再発抑制を含む意味である。

【0073】

本発明の薬剤学的組成物は、有効成分である前述した組換えＨＳＶの他に、組換えアダプター分子をさらに含むことができる。組換えアダプター分子は、前述した組換えＨＳＶが発現するアダプター、すなわち、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質と同一に癌細胞標的化領域を有する融合タンパク質が組換え方法で製造されたものを指す。ここで、組換えＨＳＶが発現するアダプターと同一に癌細胞標的化領域を有するということは、ＨＳＶが発現するアダプターの癌細胞標的化領域がＨＥＲ２を標的分子とする場合に、アダプター分子の癌細胞標的化領域もＨＥＲ２を標的分子とするということを意味する。組換え方法によって意図する目的タンパク質の製造方法は、一般に、目的タンパク質を発現できる発現ベクトルを製造し、大腸菌、酵母、動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、Ｓｐ２細胞、ＨＥＫ－２９３細胞）などの宿主細胞に形質転換させ、培養後に目的タンパク質を分離する段階などからなるが、このような組換え方法による目的タンパク質の製造方法は当業界によく公知されており（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２００１））、特に、本発明に用いられる組換えアダプター分子の製造と関連しては韓国登録特許第１０－０９３７７７４号及び米国登録特許第８３１８６６２号を参照できる。本発明の薬剤学的組成物にこのような組換えアダプター分子をさらに含む場合に、本発明の有効成分である組換えＨＳＶと組換えアダプター分子が共に患者に投与されると、組換えＨＳＶの癌細胞初期感染効率が増加する効果がある。

【0074】

また、本発明の薬剤学的組成物は、許可された抗癌剤と併用又は混合して使用されてよい。そのような抗癌剤には、代謝拮抗剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ拮抗剤、微小管拮抗剤、植物由来アルカロイドなど、癌細胞に細胞毒性を示す任意の抗癌剤、任意のサイトカイン医薬品、任意の抗体医薬品、任意の免疫関門抑制剤医薬品、任意の細胞治療剤（ｃａｒ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｒｐｙ，ｃａｒ－ＮＫ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）医薬品などを含む。具体的には、タキソール、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、ゼピチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、シスプラチン、リツキシマブ、エロチニブ、ソラフェニブ、ＩＬ－２医薬品、ＩＮＦ－α医薬品、ＩＮＦ－γ医薬品、トラスツズマブ、ブリナツモマブ、イフィリムマブ、ペプブロリズマブ、ニボリズマブ、アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）、デュルバルマブ（Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ベバシズマブ、セツキシマブ、チサゲンレクロイセル（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ，キムリア）、アキシカブタゲンシロルユーセル（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅ Ｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌ，イエスカルタ）などが例示されてよく、これらの例示された抗癌剤の他にも当業界に公知のいかなる抗癌剤も本発明の薬剤学的組成物と混合又は併用で使用されてよい。

【0075】

本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体又は賦形剤を含み、投与経路によって、当業界に公知の通常の方法で経口用剤形又は非経口用剤形とすることができる。

【0076】

そのような薬剤学的に許容可能な担体又は賦形剤は、人体に特に毒性を有しないと共に、薬物の活性や特性を阻害しないものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水（例えば、、食塩水及び滅菌水）、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、リンゲル液、緩衝剤、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、デキストラン、アルブミン、又はこれらの任意の組合せであってよい。特に、本発明の薬剤学的組成物が液状溶液として製剤化される場合に、適切な担体又は賦形剤としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールなどの成分から一つ以上の成分を単独又は混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の医薬品添加剤などを添加して使用することもできる。

【0077】

本発明の薬剤学的組成物が経口投与剤として製剤される場合には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー、サスペンション、シロップ、ウエハーなどの形態で製造でき、非経口投与剤、特に注射剤として製剤化する場合には、単位投薬アンプル又は多回投薬の形態で製造できる。本発明の薬剤学的組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤などの形態にも製造化可能である。

【0078】

本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的分野において通常の方法によって患者の身体内投与に適合な単位投与型の製剤形態に剤形化させ、当業界で通常使用する投与方法を用いて経口投与経路、又は、皮膚、病変内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔、心室内、肺、経皮、皮下、腹内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内、直腸経路などの非経口投与経路によって投与されてよい。

【0079】

本発明の薬剤学的組成物の投与量（有効量）は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々に処方されてよく、当業者であれば、これらの要因を考慮して投与量を適切に決定できる。好ましい態様において、本発明の薬剤学的組成物は、単位容量形態の注射剤として製造され、単位容量形態の注射剤として製造される場合に、本発明の薬剤学的組成物の単位容量当たりに含まれる組換えＨＳＶウイルスの量は、１０^２～１０^１４ｐｆｕの範囲、特に１０^４～１０^１１ｐｆｕの範囲であってよい。

【0080】

他の態様において、本発明は、前述した組換えＨＳＶを含む薬剤学的組成物を有効量で患者などの対象体に投与する段階を含む癌治療又は予防方法（すなわち、腫瘍治療又は予防方法）に関する。

【0081】

このような癌治療方法は、組換えＨＳＶがそのアダプターの癌細胞標的化領域が標的する標的分子を持つ癌細胞を溶解して死滅させることによって可能になる。したがって、本発明の治療方法は、そのような標的分子を持つ任意の癌腫に対して適用可能である。特に、本発明の治療方法は、ＨＥＲ２又はＥｐＣＡＭを発現する癌腫に適用されることが好ましい。

【0082】

本発明の治療方法は、前記他の癌治療法と制限なく併用されてよい。例えば、先に例示された細胞毒性抗癌剤、サイトカイン医薬品、抗体医薬品、免疫関門抑制剤医薬品、細胞治療剤（ｃａｒ－Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｒｐｙ，ｃａｒ－ＮＫ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）医薬品、放射線治療療法、手術療法などが、本発明の薬剤学的組成物の投与前後や同時投与方式で併用されてよい。

【0083】

本発明の治療方法において、有効量は、その適用対象である患者などに医療専門家などの提言による投与期間に本発明の薬剤学的組成物が投与されるとき、癌治療又は予防効果などの意図した医学的効果を示し得る、本発明の薬剤学的組成物が投与される量のことを指す。このような有効量は、前述したように、患者の年齢、体重、性別、病的状態などによって医療専門家などの当業者が適切に決定できる。

【0084】

本発明の治療方法において、その薬剤学的組成物は、好ましくは、患者などに注射剤で、非経口投与経路によって、例えば病変内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ、腫瘍内）、静脈内、筋肉内、動脈内などに投与されてよい。

【発明の効果】

【0085】

前述したように、本発明によれば、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを多重に発現することによって多重標的化が可能な組換えＨＳＶを提供でき、また、癌細胞標的化領域とＨＶＥＭの細胞外ドメインとの融合タンパク質であるアダプターを発現できる他にも再標的化が可能なように修飾された糖タンパク質を有することによって多重標的化が可能な組換えＨＳＶを提供できる。

【0086】

また、本発明によれば、前記多重標的化が可能な組換えＨＳＶを有効成分として含む抗癌治療又は予防用薬剤学的組成物、及び当該薬剤学的組成物を有効量で患者などの対象体に投与する癌予防又は治療方法を提供できる。

【0087】

本発明の多重標的化が可能な組換えＨＳＶは、単一標的化ＨＳＶに比べて癌細胞に対して高い感染効率と高い死滅機能を有する。

【図面の簡単な説明】

【0088】

【図1】ＫＯＳ－３７ＢＡＣゲノム構造の概要図である。

【0089】

【図2】ＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１ウイルスのゲノム構造の概要図である。

【0090】

【図3】ＥｍＧＦＰを発現するＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１ウイルスのゲノム構造の概要図である。

【0091】

【図4】ＥｍＧＦＰを発現するＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１ウイルスの蛍光発現及びＨＶＥＭ受容体を有する細胞への特異点感染を示す結果である。

【0092】

【図5】ＨＥＲ２標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルス、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルス、及びＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルスのゲノム構造の概要図である。

【0093】

【図6】ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターの全体配列及び当該配列の構成を示す図である。

【0094】

【図7】（ｉ）ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有する単一標的化ウイルスと（ｉｉ）ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、且つＨＥＲ２標的化アダプターを発現するＨＥＲ２二重標的化ＨＳＶ－１ウイルスのゲノム構造の概要図である。

【0095】

【図8】ｇＨに挿入・融合されたＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドの全体アミノ酸配列及び当該配列の構成を示す図である。

【0096】

【図9】（ｉ）ＥｐＣＡＭ標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有する単一標的化ウイルスと（ｉｉ）ＥｐＣＡＭ標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、且つＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＥｐＣＡＭ二重標的化ＨＳＶ－１ウイルスのゲノム構造の概要図である。

【0097】

【図10】ｇＨに挿入・融合されたＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドの全体アミノ酸配列及び当該配列の構成を示す図である。

【0098】

【図11】Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞とＳＫ－ＯＶ－３細胞において、蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）の拡散を測定した結果である。

【0099】

【図12】Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞において、蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）の増幅を測定した結果である。

【0100】

【図13】Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞とＳＫ－ＯＶ－３細胞において、蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）のＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現程度を測定した結果である。

【0101】

【図14】蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）の、ＳＫ－ＯＶ－３細胞などでのＨＥＲ２の発現有無による特異的感染を示す結果である。

【0102】

【図15】蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）の、ＳＫ－ＯＶ－３細胞などでのＨＥＲ２の発現有無による特異的細胞死滅を示す結果である。

【0103】

【図16】動物実験におい、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）による腫瘍抑制を示す結果である。

【0104】

【図17】蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＥＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＥｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを有し、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄ）の、ＢＴ－４７４細胞などでのＥｐＣＡＭの発現有無による特異的感染を示す結果である。

【0105】

【図18】蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルス（ｇＤｍ）、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルス（ＥＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを有するウイルス（ＥｇＨ－Ｓ）、ｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを有し、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄ）の、ＢＴ－４７４細胞などでのＥｐＣＡＭの発現有無による特異的細胞死滅を示す結果である。

【0106】

【図19】ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現する二重（ｄｕａｌ）標的化ＨＳＶ－１ウイルス（ＥＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）のゲノム構造の概要図である。

【0107】

【図20】ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現する二重（ｄｕａｌ）標的化ＨＳＶ－１ウイルス（ＥＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）がＣＨＯ－Ｋ１細胞などでＨＥＲ２とＥｐＣＡＭの発現有無によって二重標的化が可能であることを示す結果である。

【0108】

【図21】ＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルス（ＥＡＤａ－ＨＡＤａ－Ｄ）がＣＨＯ－Ｋ１細胞などでＨＥＲ２とＥｐＣＡＭの発現有無によって二重標的化が可能であるを示す結果である。

【発明を実施するための形態】

【0109】

以下、本発明を実施例を参照して説明する。

【0110】

ただし、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

【0111】

＜実施例１＞ＨＶＥＭ制限ＨＳＶ－１（ＨＶＥＭ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＨＳＶ－１）ウイルス作製

【0112】

ＨＳＶ－１遺伝子は約１５２ｋｂにも至る大きな遺伝子で構成されており、外来遺伝子を挿入する又は特定位置での変異を挿入するためにＫＯＳ－３７／ＢＡＣ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＭＦ１５６５８３）（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）を使用した。ＨＳＶ－１ＫＯＳストレイン（ＨＳＶ－１ＫＯＳ ｓｔｒａｉｎ）はその特性がよく知られており、遺伝子の機能及び病因調査に有用で、実験室で主に使用されるＨＳＶ－１ストレインの一種である（Ｓｍｉｔｈ ＫＯ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９６４．１１５：８１４－８１６）。ＫＯＳゲノムにＢＡＣプラスミド挿入によって作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣは、ＤＨ１０Ｂバクテリア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によってバクテリアレベルでクローニングを可能にする（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）。ＫＯＳ－３７／ＢＡＣは、ＨＳＶ－１ＫＯＳゲノムのＵＬ３７とＵＬ３８間の位置にＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ）が両側にＬｏｘＰサイトと一緒に挿入されている。将来、Ｃｒｅ－Ｌｏｘシステムを用いてＢＡＣ遺伝子を除去できるように作製された。その概要図を図１に示す。

【0113】

ＨＶＥＭ細胞受容体を通してのみ細胞進入するＨＶＥＭ制限ＨＳＶ－１を作製するために、ＨＳＶ－１ｇＤアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７８１８、配列番号１６）の２２２番位置のアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ｒ）と２２３番位置のフェニルアラニン（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｍｅ，Ｆ）をそれぞれアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）とイソロイシン（ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ，Ｉ）に置換したｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＨＳＶ－１ウイルスを作製した。

【0114】

このような突然変異によって作られたｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＨＳＶ－１ウイルスは、細胞感染受容体（ｅｎｔｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）としてネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１）を使用できず、単にＨＶＥＭ（ＨｖｅＡ）を通してのみ宿主細胞内に感染が可能なので（Ｕｃｈｉｄａ Ｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００９．８３（７）：２９５１－２９６１）、ネクチン－１（ｎｅｃｔｉｎ－１）受容体を有する正常細胞を感染させることがなく、安全性においても有利である。

【0115】

ＨＶＥＭ制限ＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスのゲノム構造の概要図を図２に示す。

【0116】

ＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＨＳＶ－１ウイルスをの作製のために、カウンターセレクションＢＡＣ修飾キット（Ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてメーカーのプロトコルにしたがってＫＯＳ－３７／ＢＡＣのｇＤ部分にＲ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ突然変異を導入した。

【0117】

具体的には、ＫＯＳ－３７／ＢＡＣが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を果たし得るＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現できるｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ｇＤに突然変異を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーｇＤ－ｒｐｓＬ Ｆｏｒ：配列番号１７、逆方向プライマーｇＤ－ｒｐｓＬ Ｒｅｖ：配列番号１８）を用いてｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットは、挿入する位置のｇＤ相同領域とストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）に敏感性を有させる選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｒｋｅｒ）であるｒｐｓＬ遺伝子と、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）抵抗性を有させるｎｅｏ／ｋａｎ遺伝子で構成される。ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットが挿入されると、ｒｐｓＬ遺伝子によってストレプトマイシン抗生剤に敏感になり、ｎｅｏ／ｋａｎ遺伝子によってカナマイシン抵抗性を有するＥ．ｃｏｌｉが作られる。ＫＯＳ－３７／ＢＡＣとｐＲｅｄ／ＥＴが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させ、相同組換えが可能なようにＲｅｃＥとＲｅｃＴの発現を誘導した後（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）、作製したｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）した。相同組換えによってｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがＫＯＳ－３７／ＢＡＣのｇＤ位置に挿入される。ＫＯＳ－３７／ＢＡＣにｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断された状態である。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉはｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最終的な遺伝子を挿入する段階に進行した。ＫＯＳ３７－ＢＡＣ ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎクローンがあるＥ．ｃｏｌｉにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加してｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させ、相同組換えが可能なようにＲｅｃＥとＲｅｃＴの発現を誘導した後、ｇＤにおいて２２２番位置のＲ及び２２３番位置のＦでそれぞれＮ及びＩを置換したオリゴヌクレオチドであるＲ２２２Ｎ＿Ｆ２２３Ｉ＿ｍｕｔａｎｔ（配列番号１９）を１００ｐｍｏｌ入れて形質転換した。既存ｇＤ－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと挿入されたオリゴヌクレオチドが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ｇＤにおいて２２２番位置及び２２３番位置でそれぞれＮ及びＩが導入されたか否かをＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）とＤＮＡシーケンシングによって確認した。

【0118】

次に、ウイルス作製は、前記完成されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡをラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、２×１０^５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ １ｕｇを形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。ＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，Ｗｅｌｌｇｅｎ）を用いて細胞培養をした。前記Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株は、Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ細胞株（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）にＨＶＥＭ遺伝子を挿入させてＨＶＥＭタンパク質発現を誘導した細胞株である。Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭを使用した理由は、細胞のＣｒｅ組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を用いてＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩのＢＡＣ遺伝子を除去することができ、またＨＶＥＭ過発現によるＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの感染が効果的である点から、将来、ウイルス大量生産がしやすいためである。遺伝子導入３～４日経過後に、プラーク（ｐｌａｑｕｅ）の形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を取り入れて３回のｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）によって最終的にＫＯＳ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを獲得した。

【0119】

＜実施例２＞ＥｍＧＦＰを発現するＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１ウイルス作製

【0120】

ＥｍＧＦＰを発現するＨＶＥＭ－制限ＨＳＶ－１の作製のために、前記実施例１で作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡのＵＬ２６／ＵＬ２７位置に、ＥｍＧＦＰ（Ｅｍｅｒａｌｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を発現できる発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を挿入した（Ｔｉｆｆａｎｙ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５．２３１：１８－２５）。これは、マーカーとしてＥｍＧＦＰを用いてウイルスの生産と感染程度の観察を容易にするためである。ＥｍＧＦＰカセット作製には、ｐＣＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。

【0121】

ＥｍＧＦＰを発現するＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉのゲノム概要図は図３に示した。

【0122】

ＥｍＧＦＰ発現のために、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）の遺伝子プロモーターであるｐＣＭＶとＨＳＶ ＴＫ（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）のポリアデニレーションシグナル（ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）であるｔｋｐＡを用いてｐＣＭＶ－ＥｍＧＦＰ－ｔｋｐＡをＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡに挿入した。

【0123】

全ての挿入方法は、前記実施例１のように、カウンターセレクションＢＡＣ修飾キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがって進行した。

【0124】

具体的には、ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉが入っているクローンに相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を果たし得るＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現できるｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ＵＬ２６とＵＬ２７間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ＿Ｆｏｒ：配列番号２０、逆方向プライマーＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ＿Ｒｅｖ：配列番号２１）を用いてＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとｐＲｅｄ／ＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、作製したＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換した。このような相同組換えによってＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがＫＯＳ－３７／ＢＡＣのＵＬ２６／２７位置に挿入される。ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断された状態である。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉはＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。

【0125】

ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉにｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導し、その後、ＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶカセット２００ｎｇを形質転換した。ＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶカセットはｐＣＤＮＡ６．２－ＧＷ／ＥｍＧＦＰ－ｍｉＲプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用し、正方向プライマーＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ＿Ｆｏｒ（配列番号２２）と逆方向プライマーＵＬ２６／２７－ｐＣＭＶ＿Ｒｅｖ（配列番号２３）を用いて作製したものである。

【0126】

既存ＵＬ２６／２７－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと挿入されたＵＬ２６／２７－ｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８ １４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ＵＬ２６／２７でｔｋｐＡ－ＥｍＧＦＰ－ｐＣＭＶの導入されたか否かを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理とＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）によって確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。

【0127】

蛍光タンパク質の正常な発現とウイルスの生産のために実験を行った。完成されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡをラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、Ｃｒｅ組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を用いてＢＡＣ遺伝子を除去するために２×１０^５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入３日後、ＥｍＧＦＰタンパク質の発現を蛍光顕微鏡を用いて観察し、Ｃｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞のプラーク（ｐｌａｑｅ）形成によってウイルス生産を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を取り入れて３回のｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を用いてＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ｇＤｍ）獲得した。

【0128】

ＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスの感染と蛍光発現は、ＨＶＥＭがない細胞株（Ｊ１及びＪ－Ｎｅｃｔｉｎ）とＨＶＥＭが発現する細胞株（Ｊ－ＨＶＥＭ）を使用した。Ｊ１細胞は、仔ハムスター腎臓細胞株であり、ウイルスＨＳＶ－１レセプターであるＨＶＥＭとＮｅｃｔｉｎ－１が欠乏している細胞株である（Ｐｅｔｒｏｖｉｃ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１９；１３（４）：ｅ１００６３５２）。Ｊ－Ｎｅｃｔｉｎ、Ｊ－ＨＶＥＭ細胞株は、Ｊ１細胞にそれぞれＮｅｃｔｉｎ－１とＨＶＥＭを過発現する細胞株である（Ｐｅｔｒｏｖｉｃ Ｂ ｅｔ ａｌ．，２０１７．ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．１９；１３（４）：ｅ１００６３５２）。各細胞株は、ＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ）に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて培養した。１×１０^４の細胞に、前記得られたＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスを１０ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）で感染させ、２４時間後に、蛍光タンパク質発現及びウイルス感染程度を蛍光顕微鏡を用いて観察した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。

【0129】

その結果として、図４に、蛍光顕微鏡モードで撮影した写真と光学顕微鏡モードで撮影した写真をそれぞれ上下に示した。図４の上の蛍光顕微鏡写真を参照すると、ＪＩ細胞株とＪ－Ｎｅｃｔｉｎ細胞株は感染されず、Ｊ－ＨＶＥＭ細胞株のみが感染されたことが分かる。

【0130】

このような結果から、意図した通り、ＫＯＳ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ｇＤｍ）が蛍光タンパク質の発現によってウイルス増殖の観察が容易であり、進入経路としてＮｅｃｔｉｎ－１を使用できず、ＨＶＥＭを通してのみ進入することを確認した。

【0131】

＜実施例３＞ＨＥＲ２標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１、及びＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルスの作製

【0132】

前記実施例２で作製された、ＥｍＧＦＰ発現カセット（ｐＣＭＶ－ＥｍＧＦＰ－ｔｋｐＡ）が挿入されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡのＵＬ３／ＵＬ４位置に、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセット、ＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡアダプター発現カセット、及びＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡとＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡを共に発現するアダプター発現カセット挿入した。

【0133】

ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセットであるｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが挿入されたＫＯＳ－ＵＬ３／４－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要図、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセットであるｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが挿入されたＫＯＳ－ＵＬ３／４－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要図、及びＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡとＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡを共に発現するアダプター発現カセットｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが挿入されたＫＯＳ－ＵＬ３／４－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要図を図５に示し、また、図６に、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターの全体配列と当該配列の構成を示した。

【0134】

ここで、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖは、配列番号４のＶＨと配列番号５のＶＬが配列番号２４のリンカーペプチドを媒介にして連結された構成であり、ＥｐＣＡＭに対するｓｃＦｖは、配列番号６のＶＬと配列番号７のＶＨが配列番号２５のリンカーペプチドを媒介にして連結された構成であり、ＨｖｅＡは、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター及びＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターにおいて配列番号８のＨｖｅＡ８２が使用された。また、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター及びＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターにおいてはそのＮ末端、すなわちＨＥＲ２ｓｃＦｖのＶＨの前部とＥｐＣＡＭｓｃＦｖのＶＬ前部に配列番号２６のリーダ配列が含まれている。

【0135】

ＨＥＲ２又はＥｐＣＡＭに対するｓｃＦｖ配列とＨｖｅＡ配列のリンカー配列であるＮＨ_２－ＧＧＧＧＳ配列の次には、クローニングを容易にするための制限酵素ＥｃｏＲＩ作用部位であるＥＦ（塩基配列：ＧＡＡＴＴＣ）が追加されている。そして、ｐＣＭＶは、前記サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）の遺伝子プロモーターであり、ｂＧＨ－ｐＡは、ｂＧＨ－ＰｏｌｙＡ（ｂｏｖｉｎｅ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）シグナル配列であり、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡとＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡを共に発現するアダプター発現カセットｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡにおいてＰ２Ａはブタテスコウイルス－１（Ｐｏｃｉｎｅ Ｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ－１）の２Ａ（Ｐ２Ａ）である。

【0136】

本実施例で使用された、リーダ配列まで含むＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター全長のアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号２７と配列番号２８に開示されており、また、リーダ配列まで含むＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター全長のアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号２９と配列番号３０に開示されている。

【0137】

ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセット、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現カセット及びＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡデュアル（ｄｕａｌ）アダプター発現カセットの挿入は、前記実施例１及び２と同様に、カウンターセレクションＢＡＣ修飾キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがって進行した。

【0138】

具体的には、前記実施例２で作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ誘電体が入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を行うＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現するｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ＵＬ３とＵＬ４との間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｆｏｒ：配列番号３１、逆方向プライマーＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｒｅｖ：配列番号３２）を用いてＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩとｐＲｅｄＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、前記作製したＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換する。このような相同組換えによってＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩのＵＬ３／４位置に挿入される。ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断される。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉはＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。

【0139】

ＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉにｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット２００ｎｇを形質転換させた。前記ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡカセット及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡは、ｐＣＤＮＡ３．１－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡプラスミド、ｐＣＤＮＡ３．１－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡプラスミド及びｐＣＤＮＡ３．１－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４；Ｃａｒｔｅｒ．ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２，１５；８９（１０）：４２８５－９，Ｗｉｌｌｕｄａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９，１５；５９（２２）：５７５８－６７）を鋳型とし、正方向プライマーＵＬ３／４＿ｐＣＭＶ＿Ｆｏｒ（配列番号３３）と逆方向プライマーＵＬ３／４＿ｂＧＨ＿ｐｏｌｙ＿Ｒ（配列番号３４）を用いて作製した。

【0140】

既存挿入されたＵＬ３／４－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット、先に挿入されたＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡ、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡ及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ＵＬ３／４においてＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡ、ＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡ及びＵＬ３／４－ｐＣＭＶ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｂＧＨｐＡの導入されたか否かを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理とＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）によって確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。

【0141】

完成されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ、ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ及びＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡを、ラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いてＢＡＣ遺伝子を除去するために２×１０^５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入３日後、蛍光顕微鏡を用いてＥｍＧＦＰタンパク質の蛍光発現と細胞のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を取り入れて３回のｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を用いて、ＨＥＲ２標的化アダプターを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＥＡＤａ－Ｓ）及びＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化アダプターを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－Ｐ２Ａ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＥＡＤａ－ＨＡＤａ－Ｄ）を獲得した。

【0142】

＜実施例４＞ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有するＨＳＶ－１と、ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、ＨＥＲ２標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルス作製

【0143】

特定癌で発現する標的分子を標的化できる再標的化ＨＳＶの作製のために、ＨＳＶ－１の糖タンパク質であるｇＨアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７７７３、配列番号３）の２９番と３０番のアミノ酸の間に、癌細胞に特異的に発現するＨＥＲ２を認知するリガンド（ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を挿入した。前記実施例２、３で作製された、ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡにある糖タンパク質ｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間に、ＨＥＲ２ｓｃＦｖを発現できる遺伝子を挿入した。

【0144】

ＨＳＶ－１のｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドが挿入されたＫＯＳ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）とＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）ゲノム概要図を図７に示し、また、図８に、ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドの全体配列と当該配列の構成を示した。ここで、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖは、配列番号４のＶＨと配列番号５のＶＬが配列番号２４のリンカーペプチドを媒介にして連結された構成であり、このｓｃＦｖのＮ末端に配列番号３５のリンカーペプチドが連結されており、またＣ末端に配列番号３６のリンカーペプチドが連結されている。

【0145】

本実施例で使用された全長のＨＥＲ２ｓｃＦｖのアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号３７と配列番号３８に開示されている。

【0146】

ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドの挿入は、前記実施例１、２、３と同様に、カウンターセレクションＢＡＣ修飾キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがって進行した。

【0147】

具体的には、前記実施例２、３で作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を行うＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現するｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｆｏｒ：配列番号３９、逆方向プライマーｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｒｅｖ：配列番号４０）を用いてｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。それぞれのＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡにｐＲｅｄ／ＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、前記作製したｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換する。このような相同組換えによってｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間の位置に挿入される。ｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断される。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉはｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。

【0148】

ｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉにｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、ｇＨ２９／３０－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンド２００ｎｇを形質転換した。前記ｇＨ２９／３０－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドはｐＣＡＧＧＳＭＣＳ－ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖプラスミドを鋳型とし、正方向プライマーｇＨ２９／３０－ｓｃＦｖ＿Ｆｏｒ（配列番号４１）と逆方向プライマーｇＨ２９／３０－ｓｃＦｖ＿Ｒｅｖ（配列番号４２）を用いて作製した。前記ｐＣＡＧＧＳＭＣＳ－ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖプラスミドは、ｐＣＡＧＧＳＭＣＳプラスミド（Ａｔａｎａｓｉｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１３，Ｎｏｖ．８７（２１）：１１３３２－１１３４５）にＨＥＲ２ｓｃＦｖを挿入して作製したものであり、具体的には、ｐＣＡＧＧＳＭＣＳプラスミドとＰＣＲで増幅したＨＥＲ２ｓｃＦｖ（Ｃａｒｔｅｒ．ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９９２，１５；８９（１０）：４２８５－９）にＮｏｔＩ制限酵素（ＮＥＢ，Ｒ３１８９）を処理し、ＮｏｔＩで切られたｐＣＡＧＧＳＭＣＳプラスミドとＨＥＲ２ｓｃＦｖをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，Ｍ０２０２）を用いて結合させて作製した。

【0149】

既存挿入されたｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと先に挿入されたｇＨ２９／３０－ＨＥＲ２ｓｃＦｖが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ｇＨ２９／３０においてＨＥＲ２ｓｃＦｖの導入されたか否かを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理とＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）によって確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。

【0150】

完成されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡを、ラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、Ｃｒｅ組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を用いてＢＡＣ遺伝子を除去するために、２×１０^５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれのＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入３日後、蛍光顕微鏡を用いてＥｍＧＦＰタンパク質の蛍光発現と細胞のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を取り入れて３回のｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を用いてＫＯＳ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）とＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）を獲得した。

【0151】

＜実施例５＞ＥｐＣＡＭ標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有するＨＳＶ－１と、ＥｐＣＡＭ標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１ウイルス作製

【0152】

特定癌で発現する標的分子を標的化できる再標的化ＨＳＶの作製のために、ＨＳＶ－１の糖タンパク質であるｇＨアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７７７３、配列番号３５）の２９番と３０番のアミノ酸の間に、癌細胞に特異的に発現するＥｐＣＡＭを認知するリガンド（ＥｐＣＡＭ ｓｃＦｖ）を挿入した。前記実施例２と３で作製された、ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ（ＥＡＤａ－Ｓ）ＤＮＡにある糖タンパク質ｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間に、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖを発現できる遺伝子を挿入した。

【0153】

ＨＳＶ－１のｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドが挿入されたＫＯＳ－ｇＨ／ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＥｇＨ－Ｓ）とＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄ）ゲノム概要図を図９に示し、また、図１０に、ｇＨ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドの全体配列と当該配列の構成を示した。ここで、ＥｐＣＡＭに対するｓｃＦｖは、配列番号６のＶＬと配列番号７のＶＨが配列番号２５のリンカーペプチドを媒介にして連結された構成であり、このｓｃＦｖのＮ末端に配列番号４３のリンカーペプチドとＣ末端に配列番号４４のリンカーペプチドが連結されている。

【0154】

本実施例で使用されたＨＥＲ２ｓｃＦｖのアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号４５と配列番号４６に開示されている。

【0155】

ｇＨ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドの挿入は、前記実施例４と同様に、カウンターセレクションＢＡＣ修飾キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがって進行した。

【0156】

具体的には、前記実施例２と３で作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を行うＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現するｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｆｏｒ：配列番号４０、逆方向プライマーｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｒｅｖ：配列番号４１）を用いてｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。それぞれのＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡにｐＲｅｄ／ＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、前記作製したｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換する。このような相同組換えによってｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間に挿入される。ｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断される。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉはｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。

【0157】

ｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉにｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、ｇＨ２９／３０－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンド２００ｎｇを形質転換した。前記ｇＨ２９／３０－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドは、ｐＣＡＧＧＳＭＣＳ－ｇＨ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖプラスミドを鋳型とし、正方向プライマーｇＨ２９／３０－ｓｃＦｖ＿Ｆｏｒ（配列番号４１）と逆方向プライマーｇＨ２９／３０＿ｓｃＦｖ＿Ｒｅｖ（配列番号４２）を用いて作製した。前記ｐＣＡＧＧＳＭＣＳ－ｇＨ－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖプラスミドは、ｐＣＡＧＧＳＭＣＳプラスミド（Ａｔａｎａｓｉｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１３，Ｎｏｖ．８７（２１）：１１３３２－１１３４５）にＥｐＣＡＭｓｃＦｖを挿入して作製したものであり、具体的には、ｐＣＡＧＧＳＭＣＳプラスミドとＰＣＲで増幅したＥｐＣＡＭｓｃＦｖ（Ｗｉｌｌｕｄａ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９，１５；５９（２２）：５７５８－６７）にＮｏｔＩ制限酵素（ＮＥＢ，Ｒ３１８９）を処理し、ＮｏｔＩで切られたｐＣＡＧＧＳＭＣＳプラスミドとＥｐＣＡＭｓｃＦｖをＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ，Ｍ０２０２）を用いて結合させて作製した。

【0158】

既存挿入されたｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと先に挿入されたｇＨ２９／３０－ＥｐＣＡＭｓｃＦｖが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ｇＨ２９／３０においてＥｐＣＡＭｓｃＦｖの導入されたか否かを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理とＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）によって確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。

【0159】

完成されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＨ＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３ＩとＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡをラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、Ｃｒｅ組換え酵素（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を用いてＢＡＣ遺伝子を除去するために、２×１０^５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれのＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入２日後、蛍光顕微鏡を用いてＥｍＧＦＰタンパク質の蛍光発現と細胞のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を取り入れて３回のｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を用いてＫＯＳ－ｇＨ／ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＥｇＨ－Ｓ）とＫＯＳ－ｇＨ／ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄ）を獲得した。

【0160】

＜実施例６＞ＨＥＲ２二重標的化抗癌ウイルスの活性測定

【0161】

前記実施例３，４で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖを発現するＫＯＳ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルス（ＨｇＨ－Ｓ）、及びＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）二重標的化（ｄｏｕｂｌｅ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ウイルスのウイルス拡散及び増幅、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプター発現量を確認するために、次のように実験を行った。

【0162】

ウイルス拡散実験を行うために、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞とＳＫ－ＯＶ－３細胞を２．０×１０^５で１２ウェルプレートに敷いた。

【0163】

ＨＳＶ－１野生型ウイルス（ＫＯＳ）と、実施例２で製造された蛍光タンパク質ＥｍＧＦＰを発現し、細胞受容体としてＨＶＥＭのみを使用して進入するウイルスｇＤｍ、実施例３で製造されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するウイルスＨＡＤａ－Ｓ、実施例４で製造されたｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有するウイルスＨｇＨ－Ｓ、実施例４で製造されたｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを有し、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現する二重標的化ウイルスＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄを、一つのウェルに２０～５０個になるようにウイルスを希釈して感染させた。９０分後、残留する初期ウイルスを除去し、ウイルスの拡散を防止するために、０．２％メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）が入っている培地に交替した。３日後、蛍光顕微鏡を用いてウイルスプラーク（ｐｌａｑｕｅ）のサイズからウイルス拡散を測定した。

【0164】

結果を図１１に示した。図１１から確認されるように、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株では野生型ウイルス（ＫＯＳ）に比べて、ｇＤｍ、ＨｇＨ－Ｓ、ＨＡＤａ－Ｓ及びＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄのプラーク（ｐｌａｑｕｅ）サイズがそれぞれ１８％、４９％、４％、２９％小さく形成された。ＨＥＲ２発現細胞株であるＳＫ－ＯＶ－３細胞では、野生型ウイルス（ＫＯＳ）に比べてＨｇＨ－Ｓのプラーク（ｐｌａｑｕｅ）サイズが５３％減少したが、ＨＡＤａ－ＳとＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルスはそれぞれ２０％、１９％増加したことを観察した。ＨｇＨ－Ｓのプラーク（ｐｌａｑｕｅ）サイズが減少したことは、ｇＤが進入受容体（ｅｎｔｒｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に結合すれば、ｇＨがこのような結合によって活性シグナルをｇＢに伝達して細胞融合を誘導する働きをし、また、インテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）と結合してエンドシトシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を誘導するが、ｇＨにｓｃＦｖが挿入されながら構造的な変化によるこのようなシグナル伝達又はエンドシトシスに影響を与え、ウイルス拡散や複製が阻害されるものと判断される。

【0165】

ウイルス複製実験を行うために、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞を１．０×１０^４で９６ウェルプレートに敷いた。ｇＤｍ、ｇＨに、ＨＥＲ２ｓｃＦｖをリガンド発現するＨｇＨ－Ｓ、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＨＡＤａ－Ｓ、及び二重標的化ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルス０．１ＭＯＩを感染させた。９０分後、残留する初期ウイルスを除去するために新しい培地に交替した。感染後、３、２４、４８時間にウイルス培養液を獲得し、培養液にあるウイルスの数を測定した。

【0166】

結果を図１２に示した。図１２から確認されるように、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株に対するｇＤｍ、ＨＡＤａ－Ｓ及びＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄのウイルス増殖活性は類似しているが、図１１の結果のように、ウイルス拡散能力の減少によってＨｇＨ－Ｓでウイルスの増殖活性が減少することを確認した。

【0167】

アダプターの発現量を測定する実験を行うために、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭとＳＫ－ＯＶ－３細胞を２．０×１０^５で１２ウェルプレートに敷いた。ｇＤｍ、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを発現するＨｇＨ－Ｓ、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＨＡＤａ－Ｓ、及び二重標的化ウイルスであるＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルス０．１ＭＯＩを感染させた。９０分後、残留する初期ウイルスを除去するために、ＦＢＳがない新しい培地に交替した。感染４８時間後、ウイルス培養液を獲得し、培養液にあるアダプターを測定するために、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）によってタンパク質発現量を測定した。

【0168】

結果を図１３に示した。図１３から確認されるように、Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞株では、ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ二重標的化ウイルスがアダプターのみ発現するＨＡＤａ－Ｓウイルスに比べて３倍以上のアダプターを発現した。しかし、アダプターがないｇＤｍとＨｇＨ－Ｓウイルス培養液では、アダプターが測定されなかった。ＨＥＲ２を発現するＳＫ－ＯＶ－３細胞ではＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ二重標的化ウイルスのアダプターのみが検出された。このような理由は、ＨＡＤａ－Ｓウイルスに比べてＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ二重標的化ウイルスが、ＨＥＲ２を発現する細胞株への感染率が高いので、比例してアダプターの発現が高いためである。

【0169】

要するに、ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ二重標的化ウイルスは、ウイルス拡散及び増幅とアダプター発現量において他のウイルスと比較して相対的に向上した能力を確認した。

【0170】

＜実施例７＞ＨＥＲ２二重標的化抗癌ウイルスを用いたＨＥＲ２発現癌細胞の感染及び細胞毒性

【0171】

前記実施例２、３、４で作製されたｇＤｍ、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを発現するＨｇＨ－Ｓ、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＨＡＤａ－Ｓ、及びＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを全て発現する二重標的化ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルスを、ＨＥＲ２を発現する癌細胞株で実験を行った。それぞれのウイルスが糖タンパク質ｇＨで発現するＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンド又はアダプターによって周辺の癌細胞へのウイルスの感染を誘導するか否か、感染後細胞毒性を誘導するか否かを確認するために、次のように実験を行った。

【0172】

実験に使用された細胞株は、ＨＥＲ２を発現しない細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）とＨＥＲ２を発現する細胞株（ＳＫ－ＯＶ－３、ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＢＴ－４７４）である。乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２６）、ＭＣＦ－７（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２２）、ＢＴ－４７４（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２０）、卵巣癌細胞株であるＳＫ－ＯＶ－３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－７７）は、ＤＭＥＭ培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳを用いて培養し、乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－１３１）ＲＰＭＩ１６４０培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳを用いて培養した。

【0173】

ＨＥＲ２特異的ウイルス感染実験のために、８×１０^３のＳＫ－ＯＶ－３とＭＤＡ－ＭＢ－２３１、４．０×１０^４のＭＣＦ－７、８．０×１０^４のＭＤＡ－ＭＢ－４５３、７．０×１０^４のＢＴ－４７４細胞株は２ＭＯＩで、ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを発現するＨｇＨ－Ｓ、ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＨＡＤａ－Ｓ、二重標的化ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルス、及び対照群として、ＨＥＲ２標的化されないｇＤｍウイルスを感染させた。９０分後、残留する初期ウイルスを除去するために、新しい培地に交替した。感染２日後、各細胞株でウイルス感染をＥｍＧＦＰ蛍光発現によって確認した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。また、感染後、４日間細胞毒性を測定するために、ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ（ＤｏＧｅｎＢｉｏ）試薬を使用し、生きている細胞でのみ形成される発色物質であるホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）の発色程度を、ＥＬＩＳＡリーダ機を用いて吸光度４５０ｎｍで測定した。吸光度を数値化してそれぞれのウイルスによる癌細胞株の細胞毒性を測定した。

【0174】

結果を図１４に示した。図１４から確認されるように、アダプターを発現するＨＡＤａ－Ｓウイルスは、ＳＫ－ＯＶ－３とＭＣＦ７細胞で感染率が高いが、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３とＢＴ－４７４で低い感染率を観察した。ｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを発現するＨｇＨ－Ｓウイルスは、ＳＫ－ＯＶ－３とＭＣＦ７及びＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞で感染率が高いが、ＢＴ－４７４で低い感染率を観察した。リガンドとアダプターをそれぞれ一つずつ発現するウイルスとは違い、二重標的化ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルスは、ＨＥＲ２を発現する全ての細胞で高い感染率を観察した。しかし、ｇＤｍウイルスは、ＨＥＲ２標的化されないため、癌細胞株に感染されなかったし、対照群であるＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ではいずれのウイルスの感染も観察されなかった。前記ＭＤＡ－ＭＢ－４５３とＢＴ－４７４での低い感染率は、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３とＢＴ－４７４の細胞形態及び特性とそれによるＨＡＤａ－Ｓウイルスの低い初期感染に起因するものと判断される。

【0175】

また、図１５には、感染後、４日間ウイルスによる癌細胞の細胞毒性を観察した結果を示した。ＨｇＨ－Ｓ、ＨＡＤ－Ｓ ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルスは、ＳＫ－ＯＶ－３で４１％、２７％、２５％の細胞生存率を、ＭＣＦ－７では６１％、５２％、３９％の細胞生存率を、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３では４９％、１００％、２３％の細胞生存率が観察された。ＨＥＲ２を発現する３つの細胞株で二重標的化ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルス感染による細胞毒性が最も高いことを観察した。しかし、ｇＤｍウイルスはＨＥＲ２標的化されないので、細胞毒性が観察できず、ＨＥＲ２が発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１でも感染されないので、３つのウイルスが細胞毒性に関与しないことを観察した。ＭＤＡ－ＭＢ－４５３細胞の生存率に影響がなかった理由は、ＨＡＤａ－Ｓウイルスが初期感染が他のウイルスに比べて顕著に低かったためと見られる。

【0176】

＜実施例８＞マウスにおいてＨＥＲ２二重標的化抗癌ウイルスによる腫瘍細胞の生長抑制

【0177】

前記実施例４で作製された二重標的化ＨＡＤａ－ＨｇＨ－ＤウイルスがマウスにおいてＨＥＲ２を発現する癌細胞成長の抑制を誘導するか否かを確認するために、次のように実験を行った。

【0178】

５週齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（オリエントバイオ）の皮下に５×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅのＳＫ－ＯＶ－３を注入した後、腫瘍のサイズが１００ｍｍ^３になるまで観察した。腫瘍が生成されたマウス５匹に、ＨＥＲ２ダブルターゲッティングＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルスを２×１０^７ｐｆｕ／ｍｏｕｓｅで腫瘍内注入（Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、対照群も同様、５匹のマウスにＰＢＳを注入した。ウイルス注入後、２８日間マウスに生成された腫瘍のサイズを観察した。

【0179】

図１６に、２８日間腫瘍のサイズをグラフで示した。ＰＢＳを入れた対照群は、初期１１６．４６±１１．２１ｍｍ^３から８１５．２８±１４１．３６ｍｍ^３へと腫瘍が成長したが、ＨＥＲ２ダブルターゲッティングＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄウイルスを注入したマウスでは、初期１０８．８５±１５．５４ｍｍ^３から１１０．０２±５５．４４ｍｍ^３へと腫瘍が成長し、対照群と比較して抑制されることを観察した。

【0180】

＜実施例９＞ＥｐＣＡＭ二重標的化抗癌ウイルスを用いたＥｐＣＡＭ発現癌細胞の感染及び細胞毒性

【0181】

前記実施例３、５で作製されたＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＥＡＤａ－Ｓウイルス、ｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを発現するＥｇＨ－Ｓウイルス、及びＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとｇＨの両方にＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを発現する二重標的化ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄウイルスを用いて、癌細胞株で実験を行った。

【0182】

各ウイルスが糖タンパク質ｇＨに発現するＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンド又はアダプターによって周辺の癌細胞にウイルスの感染を誘導するか否か、感染後に細胞毒性を誘導するか否かを確認するために、次のように実験を行った。

【0183】

実験に使用された細胞株は、ＥｐＣＡＭを発現しない細胞株（Ｍｉａ－ＰａＣａ－２）とＥｐＣＡＭを発現する細胞株（ＭＣＦ－７、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＢＴ－４７４）である。乳癌細胞株であるＭＣＦ－７（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２２）、ＢＴ－４７４（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－２０）、膵癌細胞株であるＭｉａ－ＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ－１４２０）は、ＤＭＥＭ培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ））と１０％ ＦＢＳを用いて培養し、乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ－４５３（ＡＴＣＣ，ＨＴＢ－１３１）は、ＲＰＭＩ培地に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳを用いて培養した。

【0184】

ＥｐＣＡＭ特異的ウイルス感染実験のために、４．０×１０^４のＭＣＦ－７、８．０×１０^４のＭＤＡ－ＭＢ－４５３、７．０×１０^４のＢＴ－４７４細胞株は１ＭＯＩで、前記実施例３で作製されたＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＥＡＤａ－Ｓ、実施例４で作製されたｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドを発現するＥｇＨ－Ｓウイルス、アダプターとリガンドが共に発現する二重標的化ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄウイルス、及び対照群として、実施例２で作製されたＥｐＣＡＭ標的化されないｇＤｍウイルスを感染させた。９０分後、残留する初期ウイルスを除去するために新しい培地に交替した。感染２日後、各細胞株でウイルス感染をＥｍＧＦＰ蛍光発現によって確認した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。また、感染後、５日間細胞毒性を測定するために、ＥＺ－Ｃｙｔｏｘ（ＤｏＧｅｎＢｉｏ）試薬を使用し、生きている細胞でのみ形成される発色物質であるホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）の発色程度を、ＥＬＩＳＡリーダ機を用いて吸光度４５０ｎｍで測定した。吸光度を数値化してそれぞれのウイルスによる癌細胞株の細胞毒性を測定した。

【0185】

結果を図１７に示した。図１７から確認されるように、ＢＴ－４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３及びＭＣＦ７細胞でＥｐＣＡＭ－ＨｖｅＡアダプターのみが発現するＥＡＤａ－Ｓウイルス、ｇＨにＥｐＣＡＭｓｃＦｖリガンドが発現するＥｇＨ－Ｓウイルス、アダプターとリガンドが共に発現する二重標的化ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄウイルスがいずれも細胞を感染させることを蛍光で観察したが、二重標的化ＥＡＤａ－ＥｇＨ－ＤウイルスにおいてＥＡＤａ－Ｓ、ＥｇＨ－Ｓウイルスと比較して高い感染率を観察した。ｇＤｍウイルスはＥｐＣＡＭ標的化されないため、癌細胞株に感染されなかったし、ＥｐＣＡＭを発現しないＭｉａ－ＰａＣａ－２細胞ではウイルスが感染されないことを観察した。

【0186】

また、図１８に、感染後、５日間ウイルスによる癌細胞の細胞毒性を観察した結果を示した。ＥｇＨ－Ｓ、ＥＡＤ－Ｓ ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄウイルスは、ＢＴ－４７４で３５％、３４％、２６％の細胞生存率を、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３では２２％、１９％、１７％の細胞生存率を、ＭＣＦ－７では３６％、３１％、２０％の細胞生存率を観察した。ＥｐＣＡＭを発現する３つの細胞株においてＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄダブルターゲッティングウイルス感染による細胞毒性が最も高いことを観察した。しかし、ｇＤｍウイルスはＥｐＣＡＭ標的化されないため、細胞毒性が観察できず、ＥｐＣＡＭを発現しないＭｉａ－ＰａＣａ－２でも感染されないため、両ウイルスとも細胞毒性に関与しないことを観察した。

【0187】

＜実施例１０＞ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１作製

【0188】

特定癌で発現する２種の標的分子（ＨＥＲ２／ＥｐＣＡＭ）を二重で標的化できるＨＳＶの作製のために、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ（ＥＡＤａ－Ｓ）ウイルス糖タンパク質であるｇＨアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＳＭ４７７７３、配列番号３５）の２９番と３０番のアミノ酸の間に、癌細胞に特異的に発現するＨＥＲ２を認知するリガンド（ＨＥＲ２ｓｃＦｖ）を挿入した。

【0189】

前記実施例３で作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ（ＥＡＤａ－Ｓ）ＤＮＡにある糖タンパク質ｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間に、ＨＥＲ２ｓｃＦｖを発現できる遺伝子を挿入した。

【0190】

ＨＳＶ－１のｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドが挿入されたＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ／Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉウイルスゲノム概要図を図１９に示し、また、ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドの全体配列と当該配列の構成は図８に示されている。ここで、ＨＥＲ２に対するｓｃＦｖは、配列番号４のＶＨと配列番号５のＶＬが配列番号２４のリンカーペプチドを媒介にして連結された構成であり、このｓｃＦｖのＮ末端に配列番号３６のリンカーペプチドが連結されており、また、Ｃ末端に配列番号３７のリンカーペプチドが連結されている。

【0191】

本実施例で使用された全長のＨＥＲ２ｓｃＦｖのアミノ酸配列と遺伝子配列はそれぞれ、配列番号３８と配列番号３９に開示されている。

【0192】

ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドの挿入は、前記実施例４と同様に、カウンターセレクションＢＡＣ修飾キット（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ＢＡＣ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ；ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ．Ｉｎｃ）を用いてメーカーのプロトコルにしたがって進行した。

【0193】

具体的には、前記実施例３で作製されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡが入っているＥ．ｃｏｌｉクローンに、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）機能を行うＲｅｃＥとＲｅｃＴを発現するｐＲｅｄ／ＥＴプラスミドを形質転換した（Ｍｕｙｒｅｒｓ ＪＰ ｅｔ ａｌ．；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９９．２７（６）：１５５５－１５５７）。ｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間にターゲット遺伝子を導入しようとする位置を含む相同領域のプライマー（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒ）セット（正方向プライマーｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｆｏｒ：配列番号４０、逆方向プライマーｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ＿ｒｅｖ：配列番号４１）を用いてｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット（ｃａｓｓｅｔｔｅ）を作製した。

【0194】

ＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡとｐＲｅｄ／ＥＴが入っているクローンにＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、前記作製したｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセット２００ｎｇを形質転換した。このような相同組換えによってｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがｇＨのアミノ酸２９番と３０番の間に挿入される。ｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたＥ．ｃｏｌｉは、カナマイシン抵抗性を有しているが、ストレプトマイシン抵抗性はｒｐｓＬ遺伝子によって遮断される。カナマイシン培地から選別されたＥ．ｃｏｌｉはｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎが挿入されたと判断し、最後の段階であるターゲット遺伝子を挿入する段階に進行した。

【0195】

ｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットがあるＥ．ｃｏｌｉにｐＲｅｄ／ＥＴの機能を活性化させるＬ－アラビノース（Ｌ－ａｒａｂｉｎｏｓｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が可能なように誘導した後、ｇＨ２９／３０－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンド２００ｎｇを形質転換した。前記ｇＨ２９／３０－ＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドはｐＣＡＧＧＳＭＣＳ－ｇＨ－ＨＥＲ２ｓｃＦｖプラスミドを鋳型とし、正方向プライマーｇＨ２９／３０－ｓｃＦｖ＿Ｆｏｒ（配列番号４２）と逆方向プライマーｇＨ２９／３０ｓｃＦｖ＿Ｒｅｖ（配列番号４３）を用いて作製した。

【0196】

既存挿入されたｇＨ２９／３０－ｒｐｓＬ－ｎｅｏ／ｋａｎカセットと先に挿入されたｇＨ２９／３０－ＨＥＲ２ｓｃＦｖが交替されながらｒｐｓＬによって遮断されたストレプトマイシン抵抗性が活性化される原理を用いて、候補群をストレプトマイシン培地から選別した（Ｈｅｅｒｍａｎｎ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ．２００８．１４：．ｄｏｉ：１０．１１８６）。選別された候補群は、ＤＮＡ ｐｒｅｐ方法を用いてＤＮＡ分離をし（Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈ ＢＣ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９９．３０６：３３７－３５２）、ｇＨ２９／３０においてＨＥＲ２ｓｃＦｖの導入されたか否かを、制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ処理とＰＣＲ（ｐｌｏｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅｃａｔｉｏｎ）によって確認し、ＰＣＲ産物をシーケンシングして正確な遺伝子配列を確認した。

【0197】

完成されたＫＯＳ－３７／ＢＡＣ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ ＤＮＡをラージコンストラクトＤＮＡ分離キット（Ｌａｒｇｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて抽出した後、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いてＢＡＣ遺伝子を除去するために、２×１０^５のＣｒｅ－Ｖｅｒｏ－ＨＶＥＭ細胞にリポフェクタミン２０００試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００ ｒｅａｇｅｎｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてそれぞれのＤＮＡ １ｕｇを形質注入した。形質注入３日後、蛍光顕微鏡を用いてＥｍＧＦＰタンパク質の蛍光発現と細胞のプラーク（ｐｌａｑｕｅ）形成を観察した。プラークの形成を確認した後、ウイルスが含まれた細胞を取り入れて３回のｆｒｅｅｚｅ－ｔｈａｗ方法（Ｇｉｅｒａｓｃｈ ＷＷ ｅｔ ａｌ．；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６．１３５：１９７～２０６）と超音波破砕（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を用いて、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ＿ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉ二重（ｄｕａｌ）標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）を獲得した。

【0198】

＜実施例１１＞ＨＥＲ２標的化修飾された糖タンパク質ｇＨを有し、ＥｐＣＡＭ標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１の二重標的化効果実験

【0199】

前記実施例１０で作製されたＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとｇＨにＨＥＲ２ｓｃＦｖリガンドを発現するＫＯＳ－ＵＬ３／４＿ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡ－ｇＨ／ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＥｍＧＦＰ－ｇＤ－Ｒ２２２Ｎ／Ｆ２２３Ｉデュアルターゲッティングウイルス（ＥＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）が、ＨＥＲ２とＥｐＣＡＭタンパク質を発現する細胞に感染を誘導するか否かを確認するために、次のように実験を行った。

【0200】

実験に使用された細胞株は、ＨＥＲ２とＥｐＣＡＭを発現しない細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１）、ＨＥＲ２を発現する細胞株（ＣＨＯ－ＨＥＲ２）及びＥｐＣＡＭを発現する細胞株（ＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ）である。中国ハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２、ＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９１．７４：１０１３２－１０１４１）は、ＨａＭ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ））に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて培養した。

【0201】

特異的ウイルス感染のために２．５×１０^４のＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２、ＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ細胞株を９６ウェルプレートに敷いた。２４時間が過ぎた後、前記実施例４で作製されたＨＥＲ２二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）、前記実施例５で作製されたＥｐＣＡＭ二重標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄ）及び前記実施例１０で作製されたＨＥＲ２／ＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）をそれぞれ５ＭＯＩで感染させた。９０分後、残留する初期ウイルス及びアダプターを除去するために新しい培地に交替した。感染２日後、蛍光発現によって、各細胞株のウイルス感染を蛍光顕微鏡で観察した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。

【0202】

結果を図２０に示した。図２０に、それぞれのウイルスが細胞株に感染された現象を蛍光顕微鏡で撮影した写真で示した。ＨＥＲ２とＥｐＣＡＭが発現しないＣＨＯ－Ｋ１細胞株にはいずれのウイルスも感染されていないことを観察した。ＨＥＲ２二重標的化ウイルス（ＨＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）は、ＣＨＯ－ＨＥＲ２にのみ感染され、ＥｐＣＡＭ二重標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＥｇＨ－Ｄ）はＣＨＯ－ＥｐＣＡＭでのみ感染された。しかし、ＨＥＲ２／ＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＨｇＨ－Ｄ）は、ＣＨＯ－ＨＥＲ２とＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ細胞の両方で感染を確認した。この結果から、２種の標的分子を共に標的化できるウイルスによる２種以上の標的分子を標的化する戦略の可能性を確認することができた。

【0203】

＜実施例１２＞ＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化アダプターを発現するＨＳＶ－１の二重標的化効果実験

【0204】

前記実施例３で作製されたＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを共に発現するＨＥＲ２及びＥｐＣＡＭ二重（ｄｕａｌ）標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＨＡＤａ－Ｄ）が、ＨＥＲ２とＥｐＣＡＭタンパク質を発現する細胞に感染を誘導するか否かを確認するために、次のように実験を行った。

【0205】

実験に使用された細胞株は、ＨＥＲ２とＥｐＣＡＭを発現しない細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１）、ＨＥＲ２を発現する細胞株（ＣＨＯ－ＨＥＲ２）及びＥｐＣＡＭを発現する細胞株（ＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ）である。中国ハムスター卵巣細胞株であるＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２、ＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ（Ｋｕｒｏｋｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９１．７４：１０１３２－１０１４１）は、ＨａＭ’ｓ Ｆ－１２Ｋ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ））に１００Ｕ／ｍｌペニシリン／１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）と１０％ ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）を用いて培養した。

【0206】

特異的ウイルス感染のために、２．５×１０^４のＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＨＥＲ２、ＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ細胞株を９６ウェルプレートに敷いた。２４時間が過ぎた後、前記実施例３で作製されたＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターのみを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターのみを発現するウイルス（ＥＡＤａ－Ｓ）、及びＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを共に発現する二重標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＨＡＤａ－Ｄ）をそれぞれ、５ＭＯＩで感染させた。９０分後、残留する初期ウイルス及びアダプターを除去するために新しい培地に交替した。感染２日後、蛍光発現によって、各細胞株のウイルス感染を蛍光顕微鏡で観察した（ＢａｅＫ ＨＪ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１．１９（３）：５０７－５１４）。

【0207】

その結果として、図２１に、それぞれのウイルスが細胞株に感染された現象を蛍光顕微鏡で撮影した写真を示した。ＨＥＲ２とＥｐＣＡＭが発現しないＣＨＯ－Ｋ１細胞株にはいずれのウイルスも感染されないことを観察した。ＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターのみを発現するウイルス（ＨＡＤａ－Ｓ）は、ＣＨＯ－ＨＥＲ２にのみ感染され、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターのみを発現するウイルス（ＥＡＤａ－Ｓ）はＣＨＯ－ＥｐＣＡＭでのみ感染された。しかし、ＥｐＣＡＭｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターとＨＥＲ２ｓｃＦｖ－ＨｖｅＡアダプターを共に発現する二重標的化ウイルス（ＥＡＤａ－ＨＡＤａ－Ｄ）は、ＣＨＯ－ＨＥＲ２とＣＨＯ－ＥｐＣＡＭ細胞の両方で感染を確認した。

【0208】

この結果から、２種の標的分子を共に標的化できるアダプターを発現するウイルスによる２種の以上の標的分子を標的化する戦略の可能性を確認することができた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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