7461323 改善された安定性および免疫原性を有するワクチン組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-26

(45)【発行日】2024-04-03

(54)【発明の名称】改善された安定性および免疫原性を有するワクチン組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/12 20060101AFI20240327BHJP

   A61K 47/69 20170101ALI20240327BHJP

   A61K 9/107 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240327BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240327BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240327BHJP

   A61K 39/39 20060101ALI20240327BHJP

   C07K 14/08 20060101ALN20240327BHJP

【ＦＩ】

A61K39/12

A61K47/69

A61K9/107

A61K47/26

A61P31/12

A61P37/04 ZNA

A61K47/02

A61K47/18

A61K39/39

C07K14/08 ZNA

【請求項の数】 17

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021112811

(22)【出願日】2021-07-07

(62)【分割の表示】P 2018087483の分割

【原出願日】2016-09-06

(65)【公開番号】P2021167337

(43)【公開日】2021-10-21

【審査請求日】2021-07-08

(31)【優先権主張番号】62/213,947

(32)【優先日】2015-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/255,786

(32)【優先日】2015-11-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/309,216

(32)【優先日】2016-03-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/350,973

(32)【優先日】2016-06-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】507301246

【氏名又は名称】ノババックス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】ゲイル スミス

(72)【発明者】

【氏名】イェ リウ

(72)【発明者】

【氏名】ジン－フイ ティアン

(72)【発明者】

【氏名】マイケル マサレ

(72)【発明者】

【氏名】サラティ ボッダパティ

(72)【発明者】

【氏名】エリカ シェーン

(72)【発明者】

【氏名】シンシア オリバー

(72)【発明者】

【氏名】グレゴリー グレン

【審査官】柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】PLoS One, (2012), 7, [11], Article.e50852<DOI:10.1371/journal.pone.0050852>

【文献】J. Pharm. Sci., (2005), 64, [7], p.1538-1551

【文献】Biochem. Eng. J., (2015), 100, p.50-58

【文献】AIDS Res. Hum. Retrovir., (2007), 23, [6], p.817-828

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ａ６１Ｋ ３９／００－３９／４４

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫原性組成物であって、
（ｉ）非イオン性界面活性剤コアおよびエボラウイルスウイルス糖タンパク質（ＧＰ）を含むナノ粒子であって、前記糖タンパク質（ＧＰ）が、ＧＰ１ドメインとＧＰ２ドメインとを含み、ＧＰ１ドメインが、前記非イオン性界面活性剤コアから外側に突出しており、ＧＰ２ドメインが、前記非イオン性界面活性剤コアと会合しており、前記糖タンパク質（ＧＰ）が三量体を形成している、ナノ粒子と、
（ｉｉ）薬学的に許容される緩衝液と、
を含み、
前記非イオン性界面活性剤がＰＳ８０である、免疫原性組成物。

【請求項2】

前記組成物が、分析用超遠心分離法によって決定される場合に、いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、請求項１に記載の免疫原性組成物。

【請求項3】

前記薬学的に許容される緩衝液が、
（ｉ）１５ｍＭから２５ｍＭのリン酸ナトリウム；
（ｉｉ）約１５０ｍＭのＮａＣｌ；
（ｉｉｉ）０．２５％から２％ｗ／ｖのヒスチジン
を含み、前記組成物のｐＨは、５．８から６．４の間である、請求項１又は２に記載の免疫原性組成物。

【請求項4】

前記薬学的に許容される緩衝液が、
（ｉ）約２２ｍＭのリン酸ナトリウム；
（ｉｉ）約１５０ｍＭのＮａＣｌ；
（ｉｉｉ）約１％のヒスチジン
を含み、前記組成物のｐＨは、約６．２である、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項5】

前記免疫原性組成物がアジュバントを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項6】

前記アジュバントが少なくとも２つのＩＳＣＯＭ粒子を含み、第１のＩＳＣＯＭ粒子が、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａを含み、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ｃを含まず、第２のＩＳＣＯＭ粒子が、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ｃを含み、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａを含まない、請求項５に記載の免疫原性組成物。

【請求項7】

２つのＩＳＣＯＭマトリクス粒子が、第１のＩＳＣＯＭ粒子の約７０％（ｗ／ｗ）および第２のＩＳＣＯＭ粒子の約３０％（ｗ／ｗ）の組成で存在する、請求項６に記載の免疫原性組成物。

【請求項8】

２つのＩＳＣＯＭマトリクス粒子が、第１のＩＳＣＯＭ粒子の約８５（ｗ／ｗ）および第２のＩＳＣＯＭ粒子の約１５％（ｗ／ｗ）の組成で存在する、請求項６に記載の免疫原性組成物。

【請求項9】

前記アジュバントが、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａと、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ｃとの混合物を含むＩＳＣＯＭマトリクス粒子を含む、請求項５に記載の免疫原性組成物。

【請求項10】

前記混合物が、約７０％（ｗ／ｗ）のＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａと、約３０％（ｗ／ｗ）のＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ｃとを含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項11】

前記混合物が、約８５％（ｗ／ｗ）のＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａと、約１５％（ｗ／ｗ）のＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ｃとを含む、請求項９に記載の免疫原性組成物。

【請求項12】

前記アジュバントがミョウバンアジュバントである、請求項５に記載の免疫原性組成物。

【請求項13】

前記糖タンパク質（ＧＰ）が、Ｍａｋｏｎａ、Ｓｕｄａｎ、Ｚａｉｒｅ又はＲｅｓｔｏｎのエボラウイルス株から単離されている、請求項１～１２のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項14】

前記糖タンパク質（ＧＰ）が、配列番号２９と少なくとも９０％同一である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項15】

前記糖タンパク質（ＧＰ）が、配列番号２９と少なくとも９５％同一である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項16】

前記糖タンパク質（ＧＰ）が、配列番号２９のポリペプチド配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。

【請求項17】

被験体の免疫応答を刺激するための薬剤の製造における、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年９月３日に出願された米国仮出願第６２／２１３，９４７号；２０１５年１１月１６日に出願された同第６２／２５５，７８６号、２０１６年３月１６日に出願された同第６２／３０９，２１６号および２０１６年６月１６日に出願された同第６２／３５０，９７３号の開示内容を、全ての目的のためにそれらの全体について取り込む。

【0002】

電子的に提出されたテキストファイルの説明
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参考として本明細書に援用される：配列表のコンピュータで読み込み可能な形式のコピー（ファイル名：ＮＯＶＶ＿０６０＿０３ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１６年９月６日；ファイルサイズ：９１キロバイト）。
技術分野
本開示は、免疫応答を刺激するために有用なナノ粒子に全般に関する。ナノ粒子は、界面活性剤コアと会合している抗原、例えば糖タンパク質抗原を提供し、典型的には組換えアプローチを使用して産生される。ナノ粒子は、安定性が改善され、エピトープ提示が増強されている。本開示は、ナノ粒子を含有する組成物、それらを産生するための方法および免疫応答を刺激する方法も提供する。

【背景技術】

【0003】

感染性疾患は、未だ全世界で課題となっている。一部の病原体に対するワクチン開発に進歩がある一方で、多くはヒトの健康にとって脅威のままである。最も悪名高いＨＩＶは、それに対するワクチンが未だに得られていない。ある種の病原体に対するワクチンを産生する試みが行われたが、さらなる病態を生じる失敗に終わった。伝染病として、特にアフリカで孤発性に生じ、人命の喪失および世界的な経済的影響を生じるエボラを含む他の病原体も課題のままである。インフルエンザウイルスは、既存のワクチンがいくらかの防御を提供しているものの、ウイルス産生において技術的障害があることが、季節性インフルエンザワクチンが不十分な防御を提供する場合があることを意味している、さらに別のウイルスである。

【0004】

有効なワクチンを展開することは、成果の組み合わせにかかっている。ワクチンは、有益となるのに十分な量によって、感染または疾患を低減する有効な免疫応答を刺激しなければならない。ワクチンは、冷蔵が利用可能でない場合がある困難な環境で使用するために十分安定でもなければならない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、世界中に公衆衛生の課題を示すウイルスに対するワクチンを産生することに継続的な関心があり、良好な安定性を有する有効なワクチンを産生することに継続的必要性がある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、病原体に対する免疫応答を誘導するために好適なナノ粒子を提供する。ナノ粒子は、安定性の改善、および有効な免疫原性を提供する。特定の態様では、病原体はウイルスであり、典型的には、ウイルス性ナノ粒子を産生するために使用される抗原は、ウイルス糖タンパク質である。

【0007】

一態様では、本開示は、安定性が増強されたウイルスタンパク質を含有するナノ粒子を提供する。一部の実施形態では、本開示は、非イオン性界面活性剤、ウイルス糖タンパク質および薬学的緩衝液を含むナノ粒子を含むワクチン組成物を含む。典型的な実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５およびＰＳ８０からなる群より選択されてよい。一部の実施形態では、組成物は、いかなる遊離の非イオン性界面活性剤も含まない。１つまたは複数の糖タンパク質抗原分子は非イオン性界面活性剤を含有する界面活性剤コアを囲み、これは免疫原性を促進し、抗原の分解を阻害するナノ粒子構造を提供する。

【0008】

一部の実施形態では、抗原は、ＲＳＶ Ｆタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。エボラを含む他の抗原も使用されてよい。典型的には抗原は、糖タンパク質である。

【0009】

任意選択でＲＳＶ Ｆタンパク質は、三量体ＲＳＶ Ｆタンパク質である。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、中和抗体の産生を誘導する。さらなる実施形態では、中和抗体は、融合後状態および／または融合前状態にあるＲＳＶ Ｆタンパク質を認識する。さらなる態様では、各ＰＳ８０粒子は、４個から７個の間のＲＳＶ Ｆタンパク質を含む場合がある。

【0010】

一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆ組成物は、リン酸ナトリウムを１５ｍＭから２５ｍＭの間の濃度で；ＮａＣｌを１２５ｍＭから１７５ｍＭの間の濃度で；ヒスチジンを０．２５％から２％ｗ／ｖの間で含んでよく；組成物のｐＨは５．８から７．２の間である。

【0011】

一部の実施形態では、ＨＡまたはＮＡインフルエンザ組成物は、リン酸ナトリウムを１５ｍＭから２５ｍＭの間の濃度で；ＮａＣｌを１２５ｍＭから３００ｍＭの間の濃度で；ヒスチジンを０．２５％から２％ｗ／ｖの間で含んでよく；組成物のｐＨはｐＨ６．８を超えており、典型的には約ｐＨ８．０未満である。

【0012】

一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。さらなる実施形態では、アジュバントは、ミョウバンまたはＭａｒｔｒｉｘ Ｍ（商標）である。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。

【0013】

一部の実施形態では、感染を予防する方法は、ワクチン組成物の１または複数用量を投与するステップを含む。方法の一部の実施形態では、単一用量の組成物は、投与され、防御免疫応答を誘導する。方法の一部の実施形態では、各用量は、約１００μｇから約１５０μｇの間のタンパク質抗原からなる。方法のさらなる実施形態では、１または複数用量は、皮下投与される。方法の一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含む。方法のさらなる実施形態では、アジュバントは、ミョウバンである。方法の一部の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まない。

【0014】

方法の一部の実施形態では、１または複数用量の組成物は、成人に投与される。方法のさらなる実施形態では、成人は女性であり、女性は妊娠している場合がある。方法のさらなる実施形態では、成人は、６５歳を超えている、または６０歳を超えている。方法の一部の実施形態では、１または複数用量の組成物は、小児に投与される。方法のさらなる実施形態では、小児は、新生児または乳児である。

【0015】

ＲＳＶワクチンについて、一部の実施形態では、組成物は、少なくとも３つのＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプの異種集団を含み、各ナノ粒子はＰＳ８０を含む界面活性剤含有コアを囲む少なくとも１つのＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を含み、ならびに第１のＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプは異方性ロッドを含み、第２のＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプは球状オリゴマーを含み、および第３のＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプは異方性ロッドと球状オリゴマーとの中間体を含む。

【0016】

一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質ナノ粒子を製造する方法は、第１の界面活性剤を使用して宿主細胞からＲＳＶ Ｆタンパク質抽出物を調製するステップ、および第１の界面活性剤を第２の界面活性剤に交換するステップを含み、第２の界面活性剤はＰＳ８０であり、ナノ粒子は安定性の増強を示す。方法のさらなる実施形態では、第１の界面活性剤は、ＮＰ－９である。方法の一部の実施形態では、安定性の増強は、プロテアーゼ耐性、酸化ストレス耐性、熱ストレス耐性、および撹拌への耐性から選択される。方法の一部の実施形態では、ＰＳ８０：ＲＳＶ Ｆタンパク質のモル比は約３５から約６５である。

【0017】

一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆナノ粒子は、ＰＳ８０界面活性剤コアと会合している１つまたは複数のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を含む。ＲＳＶ Ｆナノ粒子、ナノ粒子は、動的光散乱によって測定される約２０ｎｍから約６０ｎｍの平均直径を有する。ＲＳＶ
Ｆナノ粒子の一部の実施形態では、各ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体は、配列番号２の残基１３７～１４６に対応する１から１０アミノ酸の欠失を有するＲＳＶ Ｆタンパク質からなる群より選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質を含有する。ＲＳＶ Ｆナノ粒子の一部の実施形態では、各ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体は、配列番号２の残基１３７～１４６に対応する１から１０アミノ酸の欠失および不活性化主要融合切断部位を有するＲＳＶ Ｆタンパク質からなる群より選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質を含有する。

【0018】

ＲＳＶ Ｆナノ粒子の一部の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、残基１３７～１４６または配列番号２に対応する１０アミノ酸の欠失、ならびに１３３、１３５および１３６位のアルギニン残基のグルタミンへの変異による主要フューリン切断部位の不活性化を含む。ＲＳＶ Ｆナノ粒子のさらなる実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、成熟ペプチドである配列番号１９を含むまたはそれからなる。ＲＳＶ Ｆナノ粒子のある特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、配列番号８を含むまたはそれからなる。ＲＳＶ
Ｆナノ粒子を含有するワクチン製剤は、何らかの全長ペプチドを有する成熟ペプチド（配列番号８）から実質的になる。経時的に少量のトランケート型ＲＳＶ Ｆペプチドがタンパク質分解のために生じる場合がある。しかし有利には、本明細書に開示のＲＳＶ Ｆナノ粒子は、そのような分解を最小化し、長期の安定性を提供する。

【0019】

本出願は、熱安定性が増強されたインフルエンザナノ粒子も開示する。先行するインフルエンザナノ粒子とは異なり、本明細書で提供する方法および組成物は、トリプシンに対する耐性ならびに、熱安定性およびそれにより免疫原性の増強を示す。

【0020】

エボラについて、エボラウイルスナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアに付着したエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）三量体およびナノ粒子を含有するワクチン組成物を、任意選択でマトリクスＭサポニンアジュバントとの組み合わせで含む。加えて、本開示は、エボラウイルスナノ粒子およびサポニンアジュバントを含有する組成物を投与することによる、ヒトにおけるエボラウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。エボラ感染に対して防御する方法も提供される。

【0021】

同様に、インフルエンザタンパク質、ＨＡ、ＮＡのいずれかまたは両方を含有するナノ粒子が提供される。適切なフォールディングの指標、トリプシン耐性を示すＨＡナノ粒子が提供される。ワクチン製剤中にインフルエンザナノ粒子を使用するインフルエンザ感染に対して防御する方法も提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
（ｉ）非イオン性界面活性剤コアおよびウイルス糖タンパク質を含むナノ粒子であって、前記ウイルス糖タンパク質は、前記コアと会合しており、界面活性剤は、約０．０３％から約０．０５％で存在する、ナノ粒子；ならびに
（ｉｉ）薬学的に許容される緩衝液
を含むワクチン組成物であって、前記非イオン性界面活性剤は、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５およびＰＳ８０からなる群より選択される、ワクチン組成物。
（項目２）
前記ウイルス糖タンパク質が、ＲＳＶ Ｆタンパク質、エボラ糖タンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目３）
前記ウイルス糖タンパク質がＲＳＶ Ｆタンパク質であり、非イオン性界面活性剤のウイルス糖タンパク質に対するモル比が約３０：１から約６０：１である、項目２に記載のワクチン組成物。
（項目４）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１３７～１４６に対応する１０アミノ酸の欠失および配列番号２のアミノ酸１３１から１３６に対応する不活性化主要フューリン切断部位を含み、前記主要フューリン切断部位が変異によって不活性化されている、項目３に記載のワクチン組成物。
（項目５）
いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、項目４に記載のワクチン組成物。
（項目６）
前記ＲＳＶ－Ｆタンパク質が、配列番号１～１３、およびＮ末端シグナルペプチドの一部または全体を欠いている配列番号１～１３の改変体からなる群より選択される、項目４に記載のワクチン組成物。
（項目７）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、配列番号１９を含む、項目６に記載のワクチン組成物。（項目８）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が配列番号１９からなる、項目６に記載のワクチン組成物。（項目９）
前記非イオン性界面活性剤がＰＳ８０である、項目８に記載のワクチン組成物。
（項目１０）
前記モル比が約５０である、項目９に記載のワクチン組成物。
（項目１１）
前記薬学的に許容される緩衝液が、
（ｉ）１５ｍＭから２５ｍＭのリン酸ナトリウム；
（ｉｉ）約１５０ｍＭのＮａＣｌ；
（ｉｉｉ）０．２５％から２％ｗ／ｖのヒスチジン
を含み、前記組成物のｐＨは、５．８から６．４の間である、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目１２）
前記薬学的に許容される緩衝液が、
（ｉ）約２２ｍＭのリン酸ナトリウム；
（ｉｉ）約１５０ｍＭのＮａＣｌ；
（ｉｉｉ）約１％のヒスチジン
を含み、前記組成物のｐＨは、約６．２である、項目１１に記載のワクチン組成物。
（項目１３）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が前記タンパク質に連結された脂肪酸をさらに含む、項目１から１２のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目１４）
前記ナノ粒子が約２０ｎｍから約６０ｎｍのＺ平均直径を有する、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目１５）
ＲＳＶ Ｆタンパク質を約６０μｇ／ｍＬから約２９０μｇ／ｍＬの間の濃度で含む、項目２に記載のワクチン組成物。
（項目１６）
前記ナノ粒子の形状が球状オリゴマーまたは異方性ロッドである、項目１に記載のワクチン組成物。
（項目１７）
分析用超遠心分離法によって決定して、いかなる他の界面活性剤も実質的に含まない、項目１から１６のいずれかに記載のワクチン組成物。
（項目１８）
各ナノ粒子が４個から７個の間のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を含む、項目１０に記載のワクチン組成物。
（項目１９）
項目１から１８のいずれかに記載のワクチン組成物を被験体に投与するステップを含む、ウイルス感染を予防する方法。
（項目２０）
組成物が筋肉内投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
各用量が約３０μｇから約１５０μｇの間のＲＳＶ Ｆタンパク質からなる、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
単一用量の前記組成物が投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記被験体が、成人、年長の成人、妊娠中の女性、小児、新生児、および乳児からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記組成物がアジュバントを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記アジュバントがミョウバンアジュバントであり、前記アジュバントの少なくとも８０％が前記ナノ粒子に結合している、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記組成物が追加的アジュバントを含有しない、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
前記用量が約０．５ｍＬの体積である、項目２２に記載の方法。
（項目２８）
少なくとも３つのＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプの異種集団を含む組成物であって、各ナノ粒子が、ＰＳ８０を含む界面活性剤含有コアを囲む少なくとも１つのＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を含み；そして
第１のＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプが異方性ロッドを含み、
第２のＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプが球状オリゴマーを含み、そして
第３のＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプが異方性ロッドと球状オリゴマーとの中間体を含む、組成物。
（項目２９）
各ＲＳＶ Ｆ三量体が、配列番号２の残基１３７～１４６に対応する１から１０アミノ酸の欠失を有するＲＳＶ Ｆタンパク質およびその混合物からなる群より選択される、項目２８に記載の組成物。
（項目３０）
各ＲＳＶ Ｆ三量体が、（ｉ）配列番号２の残基１３７～１４６に対応する１から１０
アミノ酸の欠失および（ｉｉ）不活性化主要融合切断部位を有するＲＳＶ Ｆタンパク質ならびにその混合物を含む、項目２８に記載の組成物。
（項目３１）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、配列番号１～１３、およびＮ末端シグナルペプチドの一部または全体を欠いている配列番号１～１３の改変体から選択される、項目２９に記載の組成物。
（項目３２）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が配列番号１９を含む、項目３１に記載の組成物。
（項目３３）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が配列番号１９からなる、項目３１に記載の組成物。
（項目３４）
第１の界面活性剤を使用して宿主細胞からＲＳＶ Ｆタンパク質抽出物を調製するステップ、および前記第１の界面活性剤を第２の界面活性剤に交換するステップを含む、ＲＳＶ Ｆタンパク質ナノ粒子を製造する方法であって、前記第２の界面活性剤はＰＳ８０であり、約０．０３％から約０．０５％の量のＰＳ８０中で維持される場合に前記ナノ粒子は安定性の増強を示す、方法。
（項目３５）
前記第１の界面活性剤がＮＰ－９である、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記安定性の増強が、プロテアーゼ耐性、酸化ストレス耐性、熱ストレス耐性、および撹拌への耐性の１つまたは複数から選択される、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
前記ＰＳ８０が、前記ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するモル比約３０から約６０で存在する、項目３４に記載の方法。
（項目３８）
ＰＳ８０界面活性剤コアと会合したウイルスタンパク質三量体を含むナノ粒子であって、前記ＰＳ８０：前記ウイルスタンパク質三量体のモル比は、約３０から約６０、好ましくは約５０である、ナノ粒子。
（項目３９）
前記ウイルスタンパク質三量体がＲＳＶ Ｆタンパク質三量体である、項目３８に記載のナノ粒子。
（項目４０）
動的光散乱によって測定される約２０ｎｍから約６０ｎｍの平均直径（Ｚ平均）を有する、項目３８に記載のナノ粒子。
（項目４１）
各ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体が、配列番号２の残基１３７～１４６に対応する１から１０アミノ酸の欠失を有するＲＳＶ Ｆタンパク質からなる群より選択されるＲＳＶ Ｆタンパク質を含有する、項目３８に記載のナノ粒子。
（項目４２）
不活性化主要融合切断部位をさらに含む、項目４１に記載のナノ粒子。
（項目４３）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、配列番号１～１３のいずれか、またはＮ末端シグナルペプチドの一部もしくは全体を欠いている配列番号１～１３の配列を有する、項目３９に記載のナノ粒子。
（項目４４）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が、配列番号２の残基１３７～１４６に対応する１０アミノ酸の欠失ならびに１３３、１３５、および１３６位のアルギニン残基のグルタミンへの変異による主要フューリン切断部位の不活性化を含む、項目３９に記載のナノ粒子。
（項目４５）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が配列番号１９を含む、項目４４に記載のナノ粒子。
（項目４６）
前記ＲＳＶ Ｆタンパク質が配列番号１９からなる、項目４４に記載のナノ粒子。
（項目４７）
非イオン性界面活性剤コアを囲むタンパク質抗原を含むナノ粒子を産生する方法であって、
（ｉ）第１の界面活性剤を含むタンパク質抽出物をタンパク質精製カラムに結合させるステップ；
（ｉｉ）前記第１の界面活性剤を第２の界面活性剤で実質的に置き換えることによって界面活性剤交換を実施するステップ；および
（ｉｉｉ）前記第２の界面活性剤の存在下で前記カラムから前記タンパク質抽出物を溶出し、前記ナノ粒子を提供するステップ
を含み、
前記第２の界面活性剤：タンパク質のモル比が約３０から約６０であり；ならびに前記第２の界面活性剤が、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５およびＰＳ８０からなる群より選択される、
方法。
（項目４８）
前記タンパク質抗原がウイルス糖タンパク質である、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記非イオン性界面活性剤がＰＳ８０である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記第１の界面活性剤がＮＰ－９である、項目４７に記載の方法。
（項目５１）
前記タンパク質抗原がＲＳＶ－Ｆ糖タンパク質である、項目４７に記載の方法。
（項目５２）
前記モル比が約４５から約６０である、項目４７に記載の方法。
（項目５３）
前記モル比が約４５である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
（ｉｖ）前記ナノ粒子をミョウバンアジュバントと組み合わせ、組成物中の前記ナノ粒子の少なくとも８０％が前記ミョウバンに結合している、ナノ粒子を含む組成物を提供するステップをさらに含む、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記ナノ粒子の少なくとも９０％が前記ミョウバンに結合している、項目５４に記載の方法。
（項目５６）
前記タンパク質抽出物が、Ｓｆ９宿主細胞中に前記タンパク質を組換え発現させること、および前記宿主細胞を前記第１の界面活性剤で処理し、タンパク質抽出物を提供することを含むステップによって調製され、前記Ｓｆ９細胞がカテプシンＬもしくはキチナーゼについてシングルノックアウトである、またはカテプシンＬおよびキチナーゼの両方についてダブルノックアウトである、項目４７に記載の方法。
（項目５７）
前記タンパク質精製カラムがレンズマメレクチンカラムである、項目４７に記載の方法。
（項目５８）
非イオン性界面活性剤コアおよび少なくとも２つのウイルスタンパク質を含む組み合わせナノ粒子であって、各ウイルスタンパク質が前記コアと会合しており、非イオン性界面活性剤：少なくとも１つのウイルスタンパク質のモル比が約３０から約６０である、組み合わせナノ粒子。
（項目５９）
インフルエンザＨＡタンパク質およびＲＳＶ Ｆタンパク質を含む、項目５８に記載の組み合わせナノ粒子。
（項目６０）
インフルエンザＨＡタンパク質およびインフルエンザＮＡタンパク質を含む、項目５８に記載の組み合わせナノ粒子。
（項目６１）
前記ＨＡタンパク質および前記ＮＡタンパク質が、同じインフルエンザサブタイプ由来である、項目６０に記載の組み合わせナノ粒子。
（項目６２）
前記ＨＡタンパク質および前記ＮＡタンパク質が、異なるインフルエンザサブタイプ由来である、項目６０に記載の組み合わせナノ粒子。
（項目６３）
前記ＨＡタンパク質および前記ＮＡタンパク質の少なくとも１つが群１または群２インフルエンザ由来である、項目６０に記載の組み合わせナノ粒子。
（項目６４）
前記ＨＡタンパク質および前記ＮＡタンパク質の少なくとも１つがＢ型インフルエンザ由来である、項目６０に記載の組み合わせナノ粒子。
（項目６５）
項目１に記載の組成物を被験体に投与するステップを含む、免疫応答を誘導する方法。（項目６６）
前記被験体がヒト女性である、項目６５に記載の方法。
（項目６７）
前記ヒト女性が妊娠中である、項目６６に記載の方法。
（項目６８）
抗ＲＳＶ Ｆ抗体を保有する乳児に項目１に記載の組成物を投与するステップを含む、乳児において免疫応答をブーストする方法。
（項目６９）
組換えトリプシン耐性インフルエンザＨＡナノ粒子を調製する方法であって、
（ｉ）第１の界面活性剤を含むタンパク質抽出物をタンパク質精製カラムに結合させるステップ；
（ｉｉ）前記第１の界面活性剤を第２の界面活性剤で実質的に置き換えることによって界面活性剤交換を実施するステップ；および
（ｉｉｉ）前記第２の界面活性剤の存在下で前記カラムから前記タンパク質抽出物を溶出し、前記ナノ粒子を提供するステップ
を含み、
示差走査熱量測定によって測定される前記ナノ粒子の遷移中点（Ｔｍ）が少なくとも約６０であり、７．０未満のｐＨを有する緩衝液は調製中に使用されない、
方法。
（項目７０）
項目６９の方法により調製された組換えトリプシン耐性ＨＡナノ粒子。
（項目７１）
項目７０に記載のナノ粒子および薬学的に許容される担体を含むワクチン組成物。
（項目７２）
アジュバントを含む、項目７１に記載のナノ粒子を含むワクチン組成物。
（項目７３）
前記第１の界面活性剤の前記交換が、ＨＰＬＣによって検出されるＮＰ－９の量が約０．１％未満、約０．０１％未満、約０．００１％未満であるまたは検出不能であるように実質的に完了される、項目３５に記載の方法。
（項目７４）
非イオン性界面活性剤コアと会合したエボラウイルスＧＰ三量体を含むエボラウイルス
糖タンパク質（ＧＰ）ナノ粒子。
（項目７５）
前記コア中の非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート－８０（ＰＳ８０）を含む、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目７６）
平均直径約２０ｎｍから約４０ｎｍを有する、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目７７）
前記エボラウイルスＧＰ三量体の複数のコピーを含有する、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目７８）
１５個までの三量体を含有する、項目７７に記載のナノ粒子。
（項目７９）
Ｓｆ９細胞で産生される、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目８０）
前記エボラウイルスＧＰのアミノ酸配列が、配列番号２９と約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９７％同一または約９８％同一である、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目８１）
前記エボラウイルスＧＰのアミノ酸配列が配列番号２９を含む、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目８２）
前記エボラウイルスＧＰのアミノ酸配列が配列番号２９からなる、項目７４に記載のナノ粒子。
（項目８３）
項目７４から８２のいずれかに記載のナノ粒子およびサポニンアジュバントを含むワクチン組成物であって、前記サポニンアジュバントがマトリクスＡおよびマトリクスＣからなる、ワクチン組成物。
（項目８４）
前記マトリクスＡおよび前記マトリクスＣが８５：１５の比で存在する、項目８３に記載のワクチン組成物。
（項目８５）
ヒトにおけるエボラウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、
エボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）ナノ粒子およびサポニンアジュバントを含む組成物を前記ヒトに投与するステップを含み、
前記サポニンアジュバントは、マトリクスＡおよびマトリクスＣからなり、
前記ナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアに付着したエボラウイルスＧＰ三量体を含む、
方法。
（項目８６）
前記マトリクスＡサポニンアジュバントおよび前記マトリクスＣサポニンアジュバントが８５：１５の比で存在する、項目８５に記載の方法。
（項目８７）
前記エボラウイルスＧＰのアミノ酸配列が配列番号２９と約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９７％同一または約９８％同一である、項目８５に記載の方法。
（項目８８）
前記組成物が筋肉内投与される、項目８５に記載の方法。
（項目８９）
前記免疫応答が：ＩｇＧ１抗体の誘導、ＩｇＧ２ａ抗体の誘導、長命形質Ｂ細胞の形成、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）応答、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の１つまたは複数を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９０）
前記組成物が、ナノ粒子１個当たり２個から６個の三量体を有するＧＰナノ粒子の不均一な集団を含む、項目８５に記載の方法。
（項目９１）
項目８３に記載のワクチン組成物をヒトに筋肉内投与するステップを含む、前記ヒトにおけるエボラウイルス感染または疾患を予防する方法。
（項目９２）
配列番号２９を含むまたはそれからなるエボラタンパク質をコードする核酸。
（項目９３）
項目９２に記載の核酸を含むＳｆ９宿主細胞。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】図１Ａおよび１Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のタンパク質一次構造をポリペプチド配列と共に示す。図１Ａは、改変ＲＳＶ Ｆタンパク質のタンパク質一次構造に対する野生型ＲＳＶ Ａ２株のそれを示す。フューリン切断部位を、三角形で表示する。図１Ｂは、明るい影付きの文字列のＦ１ドメイン（残基１～８４）、暗い影付きの文字列のＦ２ドメイン（残基８５～５３９）、ジスルフィド結合を形成するシステインを接続する黒線を含む改変ＲＳＶ Ｆタンパク質（配列番号１９）のアミノ酸配列を示し；下線を引いたアスパラギンが、Ｎ連結グリコシル化部位を示し、明るい影付きの垂直な点線が、フューリン切断部位を示し、暗い影付きの垂直な点線が、主要切断部位を示す。

【図1B】図１Ａおよび１Ｂは、ＲＳＶ Ｆタンパク質のタンパク質一次構造をポリペプチド配列と共に示す。図１Ａは、改変ＲＳＶ Ｆタンパク質のタンパク質一次構造に対する野生型ＲＳＶ Ａ２株のそれを示す。フューリン切断部位を、三角形で表示する。図１Ｂは、明るい影付きの文字列のＦ１ドメイン（残基１～８４）、暗い影付きの文字列のＦ２ドメイン（残基８５～５３９）、ジスルフィド結合を形成するシステインを接続する黒線を含む改変ＲＳＶ Ｆタンパク質（配列番号１９）のアミノ酸配列を示し；下線を引いたアスパラギンが、Ｎ連結グリコシル化部位を示し、明るい影付きの垂直な点線が、フューリン切断部位を示し、暗い影付きの垂直な点線が、主要切断部位を示す。

【0023】

【図2】図２は、逆相ＨＰＬＣによるＲＳＶ Ｆタンパク質の分離ピークを示し、４つの主要な種が同定され、４つの主要なピークに対応する。最も低い分子量の種（およそ５１．２ｋＤａ～およそ５１．３ｋＤａ）を含むピークは、可溶性三量体であり；次のピークは脂肪酸を欠いている完全長三量体（およそ６４．５ｋＤａ）を含み、最後の２つの主要なピークは完全長三量体であり、その三量体はパルミトレイン酸（およそ６４．７ｋＤａ）およびパルミチン酸（６４．７８８ｋＤａ）をそれぞれ含む。

【0024】

【図3】図３は、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥにおけるＲＳＶ Ｆタンパク質の分離を示す。最大の分子量のタンパク質には、高分子量種、続いてＦ１およびＦ２ドメインを含む改変体、次いでＦ１ドメイン単独およびその改変体、続いてＦ２ドメイン単独が含まれる。

【0025】

【図4】図４は、ＲＳＶ Ｆタンパク質のタンパク質一次構造を含むアミノ酸の９０％を網羅するＬＣ－ＵＶペプチドマッピングのクロマトグラム出力を示す。早く溶出するペプチドを含めて、組み合わせた配列のカバレッジ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）は９８％であることが判明し、それによりＲＳＶ Ｆタンパク質のアミノ酸配列が確認された。

【0026】

【図5】図５は、蛍光検出（ＦＬＤ）と組み合わせたＨＰＬＣを使用する精製ＲＳＶ Ｆタンパク質の糖鎖解析を示す。検出された主要なグリカン構造は、フコシル化Ｍａｎ３グリカンである。

【0027】

【図6】図６は、ＰＳ８０のコアと会合したＲＳＶ Ｆタンパク質三量体とＲＳＶ Ｆナノ粒子の電子顕微鏡写真を特徴付ける。図は、Ｆ１およびＦ２ドメインの配向（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）、パリビズマブ抗体により認識される抗原性部位ＩＩ、ならびにパルミチン酸およびパルミトレイン酸などの脂肪酸をさらに含むＦ１ドメインのＣおよびＮ末端を特徴とする単一のＲＳＶ Ｆタンパク質三量体の特徴付けをさらに図示する。

【0028】

【図7】図７は、ＲＳＶ Ｆナノ粒子の粒子サイズの動的光散乱（ＤＬＳ）測定を示す。ＤＬＳ測定は、ナノ粒子のサイズが、利用可能なＰＳ８０とＲＳＶ Ｆ濃度の両方によりモジュレートされることを示す。一定濃度のＲＳＶ Ｆ濃度におけるＰＳ８０の増加は、平均ナノ粒子サイズ（Ｚ平均）の低下をもたらす。

【0029】

【図8】図８は、ナノ粒子の分子量に対する試料濃度の個々の分子量分布を示し、ＲＳＶ Ｆの濃度およびＰＳ８０の百分率が変動されている。ナノ粒子の最大シグナル強度は、０．２％ ＰＳ８０および１ｍｇ／ｍＬ ＲＳＶ Ｆで達成され、これはナノ粒子のより高い均一性を示唆しており、ＰＳ８０およびＲＳＶの濃度の組み合わせとして粒子サイズのモジュレーションが確認される。

【0030】

【図9A】図９Ａおよび９Ｂは、様々なＰＳ８０百分率およびＲＳＶ Ｆ濃度によって産生されるＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプの形状を示す。図９Ａから、０．２％ ＰＳ８０および０．２２ｍｇ／ｍＬ ＲＳＶ Ｆを使用する組成物が、３つの一次型、単量体／二量体異方性ロッド、球状オリゴマー、およびその中間体を産生することが明らかになる。図９Ｂから、０．０５％ ＰＳ８０および０．２２ｍｇ／ｍＬ ＲＳＶを使用する組成物は、単量体／二量体異方性ロッドが支配的な集団をもたらし、０．０５％ ＰＳ８０および１．０ｍｇ／ｍＬを使用する組成物は、球状オリゴマーが支配的な集団をもたらすことが明らかになる。

【図9B】図９Ａおよび９Ｂは、様々なＰＳ８０百分率およびＲＳＶ Ｆ濃度によって産生されるＲＳＶ Ｆナノ粒子タイプの形状を示す。図９Ａから、０．２％ ＰＳ８０および０．２２ｍｇ／ｍＬ ＲＳＶ Ｆを使用する組成物が、３つの一次型、単量体／二量体異方性ロッド、球状オリゴマー、およびその中間体を産生することが明らかになる。図９Ｂから、０．０５％ ＰＳ８０および０．２２ｍｇ／ｍＬ ＲＳＶを使用する組成物は、単量体／二量体異方性ロッドが支配的な集団をもたらし、０．０５％ ＰＳ８０および１．０ｍｇ／ｍＬを使用する組成物は、球状オリゴマーが支配的な集団をもたらすことが明らかになる。

【0031】

【図10】図１０は、還元Ｌｙｓ－Ｃペプチドマップにおいて対照と比較した相対的存在量で示される、ナノ粒子中のＲＳＶ Ｆタンパク質の特定の細区分に対するストレッサーの効果を示す。ストレッサーは、５０℃で２週間、２５℃でｐＨ３．７に１週間、２５℃でｐＨ１０に１週間、２５℃で過酸化水素によるタンパク質の酸化に１週間、および２５℃で撹拌１週間である。

【0032】

【図11】図１１は、様々なストレス条件に曝露された抗原性部位２（パリビズマブ部位）の安定性を例示する。百分率は、対照と比較した相対的存在量として示される。１００％により近いまたはそれを超える程、ストレス条件の観点で復元力がより大きい。データは、ナノ粒子が、優れた抗原性部位堅牢性を維持し、したがって、安定な免疫応答を生じることを示す。ＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫ／Ｋ；配列番号２０およびＬＭＳＮＮ（配列番号２１）は、抗原性部位ＩＩの部分である。

【0033】

【図12A】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、ナノ粒子組成物を環境ストレスに曝露した後のマウス免疫原性を示すことによるＲＳＶ Ｆナノ粒子組成物の安定性を示す。２１日目に、マウスを抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ、３５日目にＰＣＡ力価および３５日目にＲＳＶ／Ａ中和力価のためにサンプリングした。図１２Ａは、－７０℃対照の結果を示す。図１２Ｂは、組成物を、５０℃に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｃは、組成物を、２５℃でｐＨ１０に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｄは、組成物を２５℃で０．５％過酸化水素に１週間曝露した結果を示す。

【図12B】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、ナノ粒子組成物を環境ストレスに曝露した後のマウス免疫原性を示すことによるＲＳＶ Ｆナノ粒子組成物の安定性を示す。２１日目に、マウスを抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ、３５日目にＰＣＡ力価および３５日目にＲＳＶ／Ａ中和力価のためにサンプリングした。図１２Ａは、－７０℃対照の結果を示す。図１２Ｂは、組成物を、５０℃に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｃは、組成物を、２５℃でｐＨ１０に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｄは、組成物を２５℃で０．５％過酸化水素に１週間曝露した結果を示す。

【図12C】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、ナノ粒子組成物を環境ストレスに曝露した後のマウス免疫原性を示すことによるＲＳＶ Ｆナノ粒子組成物の安定性を示す。２１日目に、マウスを抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ、３５日目にＰＣＡ力価および３５日目にＲＳＶ／Ａ中和力価のためにサンプリングした。図１２Ａは、－７０℃対照の結果を示す。図１２Ｂは、組成物を、５０℃に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｃは、組成物を、２５℃でｐＨ１０に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｄは、組成物を２５℃で０．５％過酸化水素に１週間曝露した結果を示す。

【図12D】図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、ナノ粒子組成物を環境ストレスに曝露した後のマウス免疫原性を示すことによるＲＳＶ Ｆナノ粒子組成物の安定性を示す。２１日目に、マウスを抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ、３５日目にＰＣＡ力価および３５日目にＲＳＶ／Ａ中和力価のためにサンプリングした。図１２Ａは、－７０℃対照の結果を示す。図１２Ｂは、組成物を、５０℃に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｃは、組成物を、２５℃でｐＨ１０に２週間曝露した結果を示す。図１２Ｄは、組成物を２５℃で０．５％過酸化水素に１週間曝露した結果を示す。

【0034】

【図13】図１３は、より高いＰＳ８０を有するナノ粒子のプロテアーゼ耐性の増強を示す。１８カ月間を超えて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで評価して、より高いＰＳ８０百分率（０．０３％）の存在下で製剤化したＲＳＶ Ｆナノ粒子は、より低いＰＳ８０百分率（０．０１５％）の存在下で製剤化したＲＳＶ Ｆナノ粒子に対して一層低いプロテアーゼ分解を呈した。加えて、より少ない高分子量（ＨＭＷ）構造が、より高いＰＳ８０量で観察された。

【0035】

【図14】図１４は、ＲＳＶ Ｆナノ粒子に結合するｍＡｂのＲＳＶ Ｆ Ａ株ウイルスタンパク質に対する比較を示し、部位Ｉ、ＩＩおよびＩＶ抗体に対する平衡解離定数から、部位のそれぞれにおけるｍＡｂ抗体の結合が同程度であることが明らかになる。

【0036】

【図15】図１５は、競合結合アッセイの結果を示し、そのアッセイにおいてプラセボ条件、ＲＳＶ／Ａ感染、ホルムアルデヒド不活性化ＲＳＶ、ＲＳＶ Ｆナノ粒子、およびミョウバンを含むＲＳＶ Ｆナノ粒子に曝露したコットンラットの血清中に存在する抗体を、部位Ｉ、ＩＩおよびＩＶへの結合について互いに対して比較した。

【0037】

【図16】図１６は、本明細書において開示するナノ粒子を製作する方法の工程フローチャートを例示する。

【0038】

【図17】図１７は、本明細書において開示するＨＡナノ粒子を製作する方法のフローチャートを例示する。バキュロウイルス発現されるＨＡを含有するＳｆ９細胞を増殖させ、次いで、ＨＡを、非イオン性界面活性剤ＮＰ９を使用して抽出する。抽出物は、逐次的な精製およびレクチンアフィニティーカラムによる界面活性剤交換ステップを受け、次いで濾過され、バルク原薬へと製剤化される。

【0039】

【図18A】図１８Ａ～１８Ｆは、一例としてＨＡ糖タンパク質を使用するインフルエンザナノ粒子を産生するステップおよびその方法を使用して得られた結果を例示する。図１８Ａは、細胞溶解および精製ナノ粒子を得るために使用した３つのカラム（ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）、続いてレンズマメレクチン、続いて硫酸（ＳＯ３－）カラム）による、細胞感染からの逐次的な精製ステップを示す。図１８Ｂは、ＴＭＡＥカラムを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｃは、レンズマメレクチンカラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｄは、硫酸カラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラム段階のゲル（右上パネル）を示す。下パネルは、ゲルのウエスタンブロットを示す。レーンは、左上パネルに示した通りである。図１８Ｆは、Ｓ０３－カラムからの溶出液を含むゲルを示す。

【図18B】図１８Ａ～１８Ｆは、一例としてＨＡ糖タンパク質を使用するインフルエンザナノ粒子を産生するステップおよびその方法を使用して得られた結果を例示する。図１８Ａは、細胞溶解および精製ナノ粒子を得るために使用した３つのカラム（ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）、続いてレンズマメレクチン、続いて硫酸（ＳＯ３－）カラム）による、細胞感染からの逐次的な精製ステップを示す。図１８Ｂは、ＴＭＡＥカラムを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｃは、レンズマメレクチンカラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｄは、硫酸カラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラム段階のゲル（右上パネル）を示す。下パネルは、ゲルのウエスタンブロットを示す。レーンは、左上パネルに示した通りである。図１８Ｆは、Ｓ０３－カラムからの溶出液を含むゲルを示す。

【図18C】図１８Ａ～１８Ｆは、一例としてＨＡ糖タンパク質を使用するインフルエンザナノ粒子を産生するステップおよびその方法を使用して得られた結果を例示する。図１８Ａは、細胞溶解および精製ナノ粒子を得るために使用した３つのカラム（ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）、続いてレンズマメレクチン、続いて硫酸（ＳＯ３－）カラム）による、細胞感染からの逐次的な精製ステップを示す。図１８Ｂは、ＴＭＡＥカラムを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｃは、レンズマメレクチンカラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｄは、硫酸カラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラム段階のゲル（右上パネル）を示す。下パネルは、ゲルのウエスタンブロットを示す。レーンは、左上パネルに示した通りである。図１８Ｆは、Ｓ０３－カラムからの溶出液を含むゲルを示す。

【図18D】図１８Ａ～１８Ｆは、一例としてＨＡ糖タンパク質を使用するインフルエンザナノ粒子を産生するステップおよびその方法を使用して得られた結果を例示する。図１８Ａは、細胞溶解および精製ナノ粒子を得るために使用した３つのカラム（ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）、続いてレンズマメレクチン、続いて硫酸（ＳＯ３－）カラム）による、細胞感染からの逐次的な精製ステップを示す。図１８Ｂは、ＴＭＡＥカラムを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｃは、レンズマメレクチンカラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｄは、硫酸カラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラム段階のゲル（右上パネル）を示す。下パネルは、ゲルのウエスタンブロットを示す。レーンは、左上パネルに示した通りである。図１８Ｆは、Ｓ０３－カラムからの溶出液を含むゲルを示す。

【図18E】図１８Ａ～１８Ｆは、一例としてＨＡ糖タンパク質を使用するインフルエンザナノ粒子を産生するステップおよびその方法を使用して得られた結果を例示する。図１８Ａは、細胞溶解および精製ナノ粒子を得るために使用した３つのカラム（ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）、続いてレンズマメレクチン、続いて硫酸（ＳＯ３－）カラム）による、細胞感染からの逐次的な精製ステップを示す。図１８Ｂは、ＴＭＡＥカラムを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｃは、レンズマメレクチンカラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｄは、硫酸カラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラム段階のゲル（右上パネル）を示す。下パネルは、ゲルのウエスタンブロットを示す。レーンは、左上パネルに示した通りである。図１８Ｆは、Ｓ０３－カラムからの溶出液を含むゲルを示す。

【図18F】図１８Ａ～１８Ｆは、一例としてＨＡ糖タンパク質を使用するインフルエンザナノ粒子を産生するステップおよびその方法を使用して得られた結果を例示する。図１８Ａは、細胞溶解および精製ナノ粒子を得るために使用した３つのカラム（ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル）、続いてレンズマメレクチン、続いて硫酸（ＳＯ３－）カラム）による、細胞感染からの逐次的な精製ステップを示す。図１８Ｂは、ＴＭＡＥカラムを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｃは、レンズマメレクチンカラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｄは、硫酸カラム精製ステップを使用して得られたクロマトグラムを例示する。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラム段階のゲル（右上パネル）を示す。下パネルは、ゲルのウエスタンブロットを示す。レーンは、左上パネルに示した通りである。図１８Ｆは、Ｓ０３－カラムからの溶出液を含むゲルを示す。

【0040】

【図19A】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19B】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19C】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19D】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19E】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19F】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19G】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19H】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19I】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【図19J】図１９Ａ～１９Ｊは、異なるサブタイプおよび異なる昆虫細胞株を使用して産生されたＨＡナノ粒子の純度分析を例示する。図１９Ａは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｂは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９９．１％純粋であることを示す。図１９Ｃは、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｄは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９４．５％純粋であることを示す。図１９Ｅは、Ａ／香港／４８０１／２０１４ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。図１９Ｆは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９３．３％純粋であることを示す。図１９Ｇは、Ｓｆ９およびＳｆ２２ａ細胞におけるＢ／プーケット／３０７３／２０１３ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９５．４％純粋であることを示す。図１９Ｈは、Ｓｆ９細胞におけるＢ／ブリスベーン／６０／２００８ ＨＡを含有するＨＡナノ粒子に対するＨＡおよびｇｐ６４のゲル、ウエスタンブロットを示す。右パネルは、ＨＡバンドの定量化を示し、ＨＡが、デンシトメトリにより９６．７％純粋であることを示す。図１９Ｉは、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用してＨＡ純度を測定する。図１９Ｊは、３つのインフルエンザＡサブタイプおよび２つのインフルエンザＢサブタイプを使用したＨＡナノ粒子のデータを要約する。

【0041】

【図20】図２０は、電子顕微鏡写真におけるＨＡナノ粒子を示す。

【0042】

【図21A】図２１Ａおよび２１Ｂは、ｃｒｙｏＥＭ構造によるＨＡナノ粒子に対するＨＡ三量体（図２１Ａ）およびＨＡとＮＡタンパク質両方を含有するインフルエンザＶＬＰに対するそのＨＡ三量体（図２１Ｂ）のドッキングの比較を示す。

【図21B】図２１Ａおよび２１Ｂは、ｃｒｙｏＥＭ構造によるＨＡナノ粒子に対するＨＡ三量体（図２１Ａ）およびＨＡとＮＡタンパク質両方を含有するインフルエンザＶＬＰに対するそのＨＡ三量体（図２１Ｂ）のドッキングの比較を示す。

【0043】

【図22】図２２は、ＲＳＶ Ｆナノ粒子を含有する組み合わせナノ粒子組成物による研究およびＨＡナノ粒子の代表を例示する。

【0044】

【図23A】図２３Ａ～２３Ｆは、図２２の研究によって得られた結果を例示する。図２３Ａは、同種株に対するＨＡＩ力価を示す。図２３Ｂは、異種株に対する異種ＨＡＩ力価を示す。図２３Ｃは、パリビズマブ競合抗体を示す。図２３Ｄは、ＲＳＶ Ａ株に対する中和抗体を示す。図２３Ｅは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。マトリクスアジュバント化ナノ粒子で得られる応答が、顕著である。図２３Ｆは、インフルエンザタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。

【図23B】図２３Ａ～２３Ｆは、図２２の研究によって得られた結果を例示する。図２３Ａは、同種株に対するＨＡＩ力価を示す。図２３Ｂは、異種株に対する異種ＨＡＩ力価を示す。図２３Ｃは、パリビズマブ競合抗体を示す。図２３Ｄは、ＲＳＶ Ａ株に対する中和抗体を示す。図２３Ｅは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。マトリクスアジュバント化ナノ粒子で得られる応答が、顕著である。図２３Ｆは、インフルエンザタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。

【図23C】図２３Ａ～２３Ｆは、図２２の研究によって得られた結果を例示する。図２３Ａは、同種株に対するＨＡＩ力価を示す。図２３Ｂは、異種株に対する異種ＨＡＩ力価を示す。図２３Ｃは、パリビズマブ競合抗体を示す。図２３Ｄは、ＲＳＶ Ａ株に対する中和抗体を示す。図２３Ｅは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。マトリクスアジュバント化ナノ粒子で得られる応答が、顕著である。図２３Ｆは、インフルエンザタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。

【図23D】図２３Ａ～２３Ｆは、図２２の研究によって得られた結果を例示する。図２３Ａは、同種株に対するＨＡＩ力価を示す。図２３Ｂは、異種株に対する異種ＨＡＩ力価を示す。図２３Ｃは、パリビズマブ競合抗体を示す。図２３Ｄは、ＲＳＶ Ａ株に対する中和抗体を示す。図２３Ｅは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。マトリクスアジュバント化ナノ粒子で得られる応答が、顕著である。図２３Ｆは、インフルエンザタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。

【図23E】図２３Ａ～２３Ｆは、図２２の研究によって得られた結果を例示する。図２３Ａは、同種株に対するＨＡＩ力価を示す。図２３Ｂは、異種株に対する異種ＨＡＩ力価を示す。図２３Ｃは、パリビズマブ競合抗体を示す。図２３Ｄは、ＲＳＶ Ａ株に対する中和抗体を示す。図２３Ｅは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。マトリクスアジュバント化ナノ粒子で得られる応答が、顕著である。図２３Ｆは、インフルエンザタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。

【図23F】図２３Ａ～２３Ｆは、図２２の研究によって得られた結果を例示する。図２３Ａは、同種株に対するＨＡＩ力価を示す。図２３Ｂは、異種株に対する異種ＨＡＩ力価を示す。図２３Ｃは、パリビズマブ競合抗体を示す。図２３Ｄは、ＲＳＶ Ａ株に対する中和抗体を示す。図２３Ｅは、ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。マトリクスアジュバント化ナノ粒子で得られる応答が、顕著である。図２３Ｆは、インフルエンザタンパク質に対するＴ細胞応答を示す。

【0045】

【図24A】図２４Ａ～２４Ｃは、安定性を増強させたＨＡナノ粒子を得るための工程および結果を例示する。特に、この精製の間のｐＨ範囲は、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４の中性範囲である。図２４Ａは、ＨＡタンパク質を発現している解凍された細胞の使用からバルク原薬（ＢＤＳ）産物までの精製ステップを示す。図２４Ｂは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５株を使用する代表的なナノ粒子のクロマトグラムトレースを示す。カラムからのフロースルーを採集し、望ましくない産物を残す。図２４Ｃは、レンズマメレクチンカラムに対する界面活性剤交換ステップのクロマトグラムトレースを示す。このカラムからのフロースルーを、洗浄液と同様に捨てる。溶出は、０．０１％ ＰＳ８０で実施する。緩衝液は以下の通りである：Ａ１：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＰＳ８０、Ａ２：２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ９、Ａ３：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＳ８０、Ｂ１：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ。次いでＨＡナノ粒子を、図２４Ａに示すように濃縮し、０．０５％ ＰＳ８０緩衝液中に保存する。

【図24B】図２４Ａ～２４Ｃは、安定性を増強させたＨＡナノ粒子を得るための工程および結果を例示する。特に、この精製の間のｐＨ範囲は、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４の中性範囲である。図２４Ａは、ＨＡタンパク質を発現している解凍された細胞の使用からバルク原薬（ＢＤＳ）産物までの精製ステップを示す。図２４Ｂは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５株を使用する代表的なナノ粒子のクロマトグラムトレースを示す。カラムからのフロースルーを採集し、望ましくない産物を残す。図２４Ｃは、レンズマメレクチンカラムに対する界面活性剤交換ステップのクロマトグラムトレースを示す。このカラムからのフロースルーを、洗浄液と同様に捨てる。溶出は、０．０１％ ＰＳ８０で実施する。緩衝液は以下の通りである：Ａ１：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＰＳ８０、Ａ２：２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ９、Ａ３：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＳ８０、Ｂ１：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ。次いでＨＡナノ粒子を、図２４Ａに示すように濃縮し、０．０５％ ＰＳ８０緩衝液中に保存する。

【図24C】図２４Ａ～２４Ｃは、安定性を増強させたＨＡナノ粒子を得るための工程および結果を例示する。特に、この精製の間のｐＨ範囲は、ｐＨ７．０～ｐＨ７．４の中性範囲である。図２４Ａは、ＨＡタンパク質を発現している解凍された細胞の使用からバルク原薬（ＢＤＳ）産物までの精製ステップを示す。図２４Ｂは、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５株を使用する代表的なナノ粒子のクロマトグラムトレースを示す。カラムからのフロースルーを採集し、望ましくない産物を残す。図２４Ｃは、レンズマメレクチンカラムに対する界面活性剤交換ステップのクロマトグラムトレースを示す。このカラムからのフロースルーを、洗浄液と同様に捨てる。溶出は、０．０１％ ＰＳ８０で実施する。緩衝液は以下の通りである：Ａ１：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＰＳ８０、Ａ２：２５ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ９、Ａ３：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ ＰＳ８０、Ｂ１：２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１５０ｍＭ。次いでＨＡナノ粒子を、図２４Ａに示すように濃縮し、０．０５％ ＰＳ８０緩衝液中に保存する。

【0046】

【図25A】図２５Ａ～２５Ｄは、いくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子の精製の結果を示す。図２５Ａは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。図２５Ｂは、Ｂ型インフルエンザの代表株、Ｂ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡを示す。図２５Ｃは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。各場合において、データは、高レベルの産生および優れた純度を示す。図２５Ｄは、低ｐＨ、約ｐＨ６．０に曝露する工程を使用して産生したナノ粒子に対するトリプシン耐性ナノ粒子の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）比較を提供する。ＤＳＣデータは、中性ｐＨ工程で一層大きな熱安定性を示し、ナノ粒子中のＨＡタンパク質が適切にフォールドされたことが確立される。

【図25B】図２５Ａ～２５Ｄは、いくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子の精製の結果を示す。図２５Ａは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。図２５Ｂは、Ｂ型インフルエンザの代表株、Ｂ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡを示す。図２５Ｃは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。各場合において、データは、高レベルの産生および優れた純度を示す。図２５Ｄは、低ｐＨ、約ｐＨ６．０に曝露する工程を使用して産生したナノ粒子に対するトリプシン耐性ナノ粒子の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）比較を提供する。ＤＳＣデータは、中性ｐＨ工程で一層大きな熱安定性を示し、ナノ粒子中のＨＡタンパク質が適切にフォールドされたことが確立される。

【図25C】図２５Ａ～２５Ｄは、いくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子の精製の結果を示す。図２５Ａは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。図２５Ｂは、Ｂ型インフルエンザの代表株、Ｂ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡを示す。図２５Ｃは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。各場合において、データは、高レベルの産生および優れた純度を示す。図２５Ｄは、低ｐＨ、約ｐＨ６．０に曝露する工程を使用して産生したナノ粒子に対するトリプシン耐性ナノ粒子の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）比較を提供する。ＤＳＣデータは、中性ｐＨ工程で一層大きな熱安定性を示し、ナノ粒子中のＨＡタンパク質が適切にフォールドされたことが確立される。

【図25D】図２５Ａ～２５Ｄは、いくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子の精製の結果を示す。図２５Ａは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。図２５Ｂは、Ｂ型インフルエンザの代表株、Ｂ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡを示す。図２５Ｃは、Ｈ１Ｎ１サブタイプの代表株、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５を示す。各場合において、データは、高レベルの産生および優れた純度を示す。図２５Ｄは、低ｐＨ、約ｐＨ６．０に曝露する工程を使用して産生したナノ粒子に対するトリプシン耐性ナノ粒子の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）比較を提供する。ＤＳＣデータは、中性ｐＨ工程で一層大きな熱安定性を示し、ナノ粒子中のＨＡタンパク質が適切にフォールドされたことが確立される。

【0047】

【図26A】図２６Ａ～２６Ｃは、Ｓｆ９細胞において発現されるいくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子のトリプシン耐性の増強の結果を示す。Ｓｆ９昆虫細胞中で製作された精製ＨＡナノ粒子は、ＨＡ０である。トリプシンに曝露した場合、ＨＡ０は、Ｈ１中のＡｒｇ ＡＡ３４４でＨＡ１とＨＡ２に切断される。濃度を増加させたトリプシンとインキュベートした場合、正確にフォールドされたＨＡ三量体はさらなる切断に耐えることになる。図２６Ａは、中性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８がトリプシンに耐性であり、したがって正確にフォールドされており（左パネル）、一方で、酸性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡ１はトリプシン感受性であり、したがってミスフォールドされた（右パネル）ことを示す。図２６Ｂは、Ａ／香港／４８０１／２０１４から酸性で精製したが、中性で精製していないＨＡナノ粒子がミスフォールドされたことを示す。図２６Ｃは、中性ｐＨ Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５（Ｈ１Ｎ）ＨＡナノ粒子のトリプシン耐性を示す。対応する酸性ｐＨで精製したナノ粒子は、トリプシン感受性であった（図示せず）。

【図26B】図２６Ａ～２６Ｃは、Ｓｆ９細胞において発現されるいくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子のトリプシン耐性の増強の結果を示す。Ｓｆ９昆虫細胞中で製作された精製ＨＡナノ粒子は、ＨＡ０である。トリプシンに曝露した場合、ＨＡ０は、Ｈ１中のＡｒｇ ＡＡ３４４でＨＡ１とＨＡ２に切断される。濃度を増加させたトリプシンとインキュベートした場合、正確にフォールドされたＨＡ三量体はさらなる切断に耐えることになる。図２６Ａは、中性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８がトリプシンに耐性であり、したがって正確にフォールドされており（左パネル）、一方で、酸性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡ１はトリプシン感受性であり、したがってミスフォールドされた（右パネル）ことを示す。図２６Ｂは、Ａ／香港／４８０１／２０１４から酸性で精製したが、中性で精製していないＨＡナノ粒子がミスフォールドされたことを示す。図２６Ｃは、中性ｐＨ Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５（Ｈ１Ｎ）ＨＡナノ粒子のトリプシン耐性を示す。対応する酸性ｐＨで精製したナノ粒子は、トリプシン感受性であった（図示せず）。

【図26C】図２６Ａ～２６Ｃは、Ｓｆ９細胞において発現されるいくつかの株からのトリプシン耐性ナノ粒子のトリプシン耐性の増強の結果を示す。Ｓｆ９昆虫細胞中で製作された精製ＨＡナノ粒子は、ＨＡ０である。トリプシンに曝露した場合、ＨＡ０は、Ｈ１中のＡｒｇ ＡＡ３４４でＨＡ１とＨＡ２に切断される。濃度を増加させたトリプシンとインキュベートした場合、正確にフォールドされたＨＡ三量体はさらなる切断に耐えることになる。図２６Ａは、中性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８がトリプシンに耐性であり、したがって正確にフォールドされており（左パネル）、一方で、酸性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡ１はトリプシン感受性であり、したがってミスフォールドされた（右パネル）ことを示す。図２６Ｂは、Ａ／香港／４８０１／２０１４から酸性で精製したが、中性で精製していないＨＡナノ粒子がミスフォールドされたことを示す。図２６Ｃは、中性ｐＨ Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５（Ｈ１Ｎ）ＨＡナノ粒子のトリプシン耐性を示す。対応する酸性ｐＨで精製したナノ粒子は、トリプシン感受性であった（図示せず）。

【0048】

【図27】図２７は、市販の卵精製したインフルエンザワクチン（左パネル）および市販の組換えインフルエンザ（右パネル）のトリプシン感受性を示す。ＨＡ０は、左パネルにおいてＨＡ１とＨＡ２に切断される。しかしながら、適切にフォールドされたＨＡ１は、さらなるトリプシンに耐性である。対照的に、市販の組換えワクチンは、ＨＡ１がトリプシンにより分解されることを示し、このことはミスフォールドされたタンパク質が、ワクチン中に存在することを示す。

【0049】

【図28】図２８Ａ～２８Ｃは、抗体の誘導、および感染からの防御を示す。マウスを、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ５μｇ、ＡｌＰＯ４ ５０μｇでアジュバント化したＥＢＯＶ ＧＰ ５μｇ、またはマトリクスＭ ５μｇでアジュバント化したＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ５μｇで０、１４および２８日目にＳＣで免疫化した。２８日目に血清を得て、抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ＩｇＧ（図２８Ａ）または抗エボラウイルス中和抗体（図２８Ｂ）についてＥＬＩＳＡにより評価した。黒いバーは群ＧＭＴを表し、エラーバーはＧＭＴの９５％信頼区間を示す。４２日目に、マウスにマウス適応Ｚａｉｒｅエボラウイルス株１９７６ Ｍａｙｉｎｇａ １，０００ｐｆｕを感染させた。チャレンジ後、マウスを病的状態および死亡について２１日間毎日観察した。図２８Ｃは、感染したマウスのカプランマイアー生存曲線を示す。

【0050】

【図29】図２９Ａ～２９Ｃは、マトリクスＭが、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラスの応答を増強させたことを示す。０および２１日目に、マウスをＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ５μｇ単独であるいはマトリクスＭ ２．５もしくは５μｇまたはＡｌＰＯ４ ５０μｇのいずれかと組み合わせてＩＭで免疫化した。プラセボ対照としてマウスはＰＢＳを受けた。第１の注射後２１、２８および６０日目に、血清試料を採集し、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ－ＩｇＧ（図２９Ａ）、ＩｇＧ１（図２９Ｂ）およびＩｇＧ２ａ（図２９Ｃ）について試験した。結果は、２つの別々の実験の代表である。黒いバーは群ＧＭＴを表し、エラーバーはＧＭＴの９５％信頼区間を示す。

【0051】

【図30-1】図３０Ａ～３０Ｄは、マトリクスＭを含むエボラナノ粒子が強いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答ならびに多機能性Ｔ細胞を誘導したことを示す。脾臓細胞を、完全なＧＰ配列を網羅しているエボラ／Ｍａｋ ＧＰペプチドプールで刺激した。培養培地またはイオノマイシン（２００ｎｇ／ｍｌ）を加えたＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陰性および陽性対照として使用した。２８（図３０Ａ）および６０日目（図３０Ｂ）のＩＦＮγ陽性スポットを計数し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーおよび付随するソフトウェアで分析した。培地対照のバックグラウンド数を、ペプチド刺激したウェルの数から減算し、平均を３つ組から得た。２８日目に同じ群内のマウス５匹全ての細胞をプールし、ＢＤ Ｇｏｌｇｉ－ｓｔｏｐ／Ｇｏｌｇｉ－ｐｌｕｇの存在下で培地単独または、ＧＰペプチドプールもしくはＰＭＡ＋イオノマイシンのいずれかと３７℃で６時間インキュベートした。次いで細胞を採取し、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインに対して染色した。サイトカインの頻度を、ＣＤ３＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２－ＣＤ４＋生エフェクターメモリーＴ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２－ＣＤ８＋生エフェクターメモリーＴ細胞に対するゲート制御によりＦｌｏｗｊｏソフトウェアおよびＦｌｏｗｊｏブーリアン機能を使用して分析した。（図３０Ｃおよび３０Ｄ）単一サイトカイン、二重サイトカインまたは三重サイトカインに対する値は、３つのサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２）のうちいずれか１つ、３つのサイトカインのうちいずれか２つ、または３つ全てのサイトカインを発現している細胞の頻度の合計を表す。結果は、２つの別々の実験の代表である。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【図30-2】図３０Ａ～３０Ｄは、マトリクスＭを含むエボラナノ粒子が強いＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答ならびに多機能性Ｔ細胞を誘導したことを示す。脾臓細胞を、完全なＧＰ配列を網羅しているエボラ／Ｍａｋ ＧＰペプチドプールで刺激した。培養培地またはイオノマイシン（２００ｎｇ／ｍｌ）を加えたＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍｌ）を、陰性および陽性対照として使用した。２８（図３０Ａ）および６０日目（図３０Ｂ）のＩＦＮγ陽性スポットを計数し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーおよび付随するソフトウェアで分析した。培地対照のバックグラウンド数を、ペプチド刺激したウェルの数から減算し、平均を３つ組から得た。２８日目に同じ群内のマウス５匹全ての細胞をプールし、ＢＤ Ｇｏｌｇｉ－ｓｔｏｐ／Ｇｏｌｇｉ－ｐｌｕｇの存在下で培地単独または、ＧＰペプチドプールもしくはＰＭＡ＋イオノマイシンのいずれかと３７℃で６時間インキュベートした。次いで細胞を採取し、細胞表面マーカーおよび細胞内サイトカインに対して染色した。サイトカインの頻度を、ＣＤ３＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２－ＣＤ４＋生エフェクターメモリーＴ細胞またはＣＤ３＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２－ＣＤ８＋生エフェクターメモリーＴ細胞に対するゲート制御によりＦｌｏｗｊｏソフトウェアおよびＦｌｏｗｊｏブーリアン機能を使用して分析した。（図３０Ｃおよび３０Ｄ）単一サイトカイン、二重サイトカインまたは三重サイトカインに対する値は、３つのサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２）のうちいずれか１つ、３つのサイトカインのうちいずれか２つ、または３つ全てのサイトカインを発現している細胞の頻度の合計を表す。結果は、２つの別々の実験の代表である。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【0052】

【図31-1】図３１Ａ～３１Ｅは、マトリクスＭが胚中心（ＧＣ）細胞応答を増強させたことを示す。新鮮な脾細胞をＧＣ Ｂ細胞に対して染色し、データを材料および方法に記載の通り取得した。データを、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。死細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）ｆｉｘａｂｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｄｙｅにより分析から除外した。（図３１Ａ）、ＧＣ細胞を、Ｂ２２０＋Ｂ細胞ゲートにおけるＣＤ９５＋ＧＬ－７＋と定義し、代表的なマウスのドット－プロット中の数字は、２８日目における同じ群内のマウス５匹全てのＧＣ頻度の平均および標準偏差を示す。個々のマウスのＧＣ細胞頻度を、２８日目（図３１Ｂ）および６０日目について示す（図３１Ｃ）。２８（図３１Ｄ）および６０日目（図３１Ｅ）の脾臓当たりのＧＣ細胞の絶対数を、脾臓中の脾細胞の総数にＧＣ細胞の頻度を乗算することにより算出した。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【図31-2】図３１Ａ～３１Ｅは、マトリクスＭが胚中心（ＧＣ）細胞応答を増強させたことを示す。新鮮な脾細胞をＧＣ Ｂ細胞に対して染色し、データを材料および方法に記載の通り取得した。データを、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアで分析した。死細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）ｆｉｘａｂｌｅ ｙｅｌｌｏｗ ｄｙｅにより分析から除外した。（図３１Ａ）、ＧＣ細胞を、Ｂ２２０＋Ｂ細胞ゲートにおけるＣＤ９５＋ＧＬ－７＋と定義し、代表的なマウスのドット－プロット中の数字は、２８日目における同じ群内のマウス５匹全てのＧＣ頻度の平均および標準偏差を示す。個々のマウスのＧＣ細胞頻度を、２８日目（図３１Ｂ）および６０日目について示す（図３１Ｃ）。２８（図３１Ｄ）および６０日目（図３１Ｅ）の脾臓当たりのＧＣ細胞の絶対数を、脾臓中の脾細胞の総数にＧＣ細胞の頻度を乗算することにより算出した。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【0053】

【図32-1】図３２Ａ～３２Ｅは、マトリクスＭが、脾臓中のＴＦＨ細胞の頻度および絶対数を増強したことを示す。Ｂ２２０－ＣＤ４９ｂ－ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート内のＣＸＣＲ５＋ＰＤ－１＋Ｔ細胞と定義されるＴＦＨ細胞を、２８日目および６０日目に脾臓内に同定した。各群のＴＦＨ細胞分析の代表的なドット－プロットを示す（図３２Ａ）。ドット－プロット中の数字は、２８日目の平均頻度および標準偏差である。２８（図３２Ｂ）および６０日目（図３２Ｄ）のＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＴＦＨ細胞の頻度を示す。２８（図３２Ｃ）および６０日目（図３２Ｅ）の脾臓当たりのＴＦＨ細胞絶対数を、脾臓中の脾細胞の総数にＴＦＨ細胞の頻度を乗算することにより算出した。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【図32-2】図３２Ａ～３２Ｅは、マトリクスＭが、脾臓中のＴＦＨ細胞の頻度および絶対数を増強したことを示す。Ｂ２２０－ＣＤ４９ｂ－ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞ゲート内のＣＸＣＲ５＋ＰＤ－１＋Ｔ細胞と定義されるＴＦＨ細胞を、２８日目および６０日目に脾臓内に同定した。各群のＴＦＨ細胞分析の代表的なドット－プロットを示す（図３２Ａ）。ドット－プロット中の数字は、２８日目の平均頻度および標準偏差である。２８（図３２Ｂ）および６０日目（図３２Ｄ）のＣＤ４＋Ｔ細胞集団内のＴＦＨ細胞の頻度を示す。２８（図３２Ｃ）および６０日目（図３２Ｅ）の脾臓当たりのＴＦＨ細胞絶対数を、脾臓中の脾細胞の総数にＴＦＨ細胞の頻度を乗算することにより算出した。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【0054】

【図33】図３３Ａ～３３Ｂは、マトリクスＭが、骨髄において長命形質細胞を誘導したことを示す。脾臓および骨髄細胞を、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰコートしたＥＬＩＳＰＯＴプレート中で終夜インキュベートした。ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧスポットを、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰとインキュベートし、続いてスポットを発色させることにより検出した。スポット数を計数し、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーを使用して分析した。１００万個細胞当たりの抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の数を示す。（図３３Ａ）脾臓における６０日目のＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ－ＩｇＧ ＡＳＣ数；（図３３Ｂ）骨髄における６０日目のＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ－ＩｇＧ ＡＳＣ数。黒いバーは群平均を示し、エラーバーは標準偏差を表す。

【0055】

【図34A】図３４Ａ～３４Ｂは、エボラ糖タンパク質の特徴を示す。図３４Ａは、ドメイン構造を示す。図３４Ｂは、切断されるシグナルペプチドならびに成熟タンパク質のＮおよびＣ末端、ならびにフューリン切断配列を含むＧＰのアミノ酸配列を示す（配列番号２２）。

【図34B】図３４Ａ～３４Ｂは、エボラ糖タンパク質の特徴を示す。図３４Ａは、ドメイン構造を示す。図３４Ｂは、切断されるシグナルペプチドならびに成熟タンパク質のＮおよびＣ末端、ならびにフューリン切断配列を含むＧＰのアミノ酸配列を示す（配列番号２２）。

【0056】

【図35A】図３５Ａ～３５Ｃは、本開示のナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。図３５Ｂが、コアに付着した最大５コピーの三量体を含む非イオン性界面活性剤コアを例示することに注意すべきである。いくつかの場合において、追加の三量体は、表示する平面外にある。図３５Ｃは、顕微鏡写真のナノ粒子の上に重ねたＧＰ三量体によるドッキング研究を示す。

【図35B】図３５Ａ～３５Ｃは、本開示のナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。図３５Ｂが、コアに付着した最大５コピーの三量体を含む非イオン性界面活性剤コアを例示することに注意すべきである。いくつかの場合において、追加の三量体は、表示する平面外にある。図３５Ｃは、顕微鏡写真のナノ粒子の上に重ねたＧＰ三量体によるドッキング研究を示す。

【図35C】図３５Ａ～３５Ｃは、本開示のナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。図３５Ｂが、コアに付着した最大５コピーの三量体を含む非イオン性界面活性剤コアを例示することに注意すべきである。いくつかの場合において、追加の三量体は、表示する平面外にある。図３５Ｃは、顕微鏡写真のナノ粒子の上に重ねたＧＰ三量体によるドッキング研究を示す。

【0057】

【図36】図３６は、エボラナノ粒子を検出するための３つのモノクローナル抗エボラ抗体の能力を例示する。

【0058】

【図37】図３７は、エボラＧＰナノ粒子（配列番号２３～２５）のエピトープに対する抗体の結合に関する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）データを示す。

【0059】

【図38】図３８は、本開示のナノ粒子に対する１３Ｃ６抗体の結合の高い有効性を例示する。

【0060】

【図39】図３９は、ヒヒ免疫原性研究設計を例示する。群１は、アジュバントを含まないＧＰナノ粒子６０μｇであった。群２は、ＡｌＰＯ４アジュバント８００μｇを含むＧＰナノ粒子６０μｇであった。群３は、マトリクスＭアジュバント５０μｇを含むＧＰナノ粒子６０μｇであった。群４は、マトリクスＭアジュバント５０μｇを含むＧＰナノ粒子５μｇであった。

【0061】

【図40A】図４０Ａ～４０Ｂは、図３９におけるヒヒ免疫原性研究の結果を例示する。２１日目に、ＥＣ９０力価は群２および３で増加した。図４０Ａ。力価は、両方の群において、ならびにＭａｋｏｎａエボラウイルスおよびＭａｙｉｎｇａ株（エボラＺａｉｒｅ株の原型改変体である）の糖タンパク質を含有するナノ粒子に対してもおよそ同じであった。３１日目までに、免疫応答は、全ての場合において、特にＧＰおよびマトリクスＭアジュバントを含有する組成物で顕著であった。特に、低用量のＧＰ（５μｇ）は、高用量（６０μｇ）と同様に機能し、マトリクスＭによる用量節約効果を強調した。

【図40B】図４０Ａ～４０Ｂは、図３９におけるヒヒ免疫原性研究の結果を例示する。２１日目に、ＥＣ９０力価は群２および３で増加した。図４０Ａ。力価は、両方の群において、ならびにＭａｋｏｎａエボラウイルスおよびＭａｙｉｎｇａ株（エボラＺａｉｒｅ株の原型改変体である）の糖タンパク質を含有するナノ粒子に対してもおよそ同じであった。３１日目までに、免疫応答は、全ての場合において、特にＧＰおよびマトリクスＭアジュバントを含有する組成物で顕著であった。特に、低用量のＧＰ（５μｇ）は、高用量（６０μｇ）と同様に機能し、マトリクスＭによる用量節約効果を強調した。

【0062】

【図41】図４１は、ナノ粒子組成物により達成される永続的な免疫応答を例示する。データは、０日目および２１日目に投与した後のＩｇＧに対するＥＣ５０ ＧＭＴ応答を示す。ＧＰおよびマトリクスＭを含むナノ粒子は、ミョウバンアジュバントより優れた応答を示し、応答は、時間をわたり高いままである。

【0063】

【図42】図４２は、ＩＦＮγ放出細胞に関連する免疫応答の刺激を例示する。ＧＰナノ粒子５μｇと組み合わせたマトリクスＭは最大の応答を与え、次に高用量ＧＰナノ粒子（６０μｇ）が続いた。ミョウバンの使用により、ＩＦＮγを分泌する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、低いが、検出可能な増加が得られた。

【0064】

【図43】図４３は、本明細書に開示するＧＰナノ粒子を含有するワクチン組成物を投与されたヒヒから単離したＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγおよびＴＮＦα放出プロファイルを例示する。

【0065】

【図44】図４４は、本明細書に開示するＧＰナノ粒子を含有するワクチン組成物を投与されたヒヒから単離したＴ細胞のサイトカイン放出プロファイルを例示する。データは、マトリクスＭアジュバント化ＧＰナノ粒子組成物が、より広いサイトカイン放出プロファイルを有する免疫応答を刺激することを示す。

【0066】

【図45】図４５は、Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓにおいて実施したワクチン試験の設計を示す。０および２１日目に、動物にＧＰ ５μｇ＋マトリクスＭ ５０μｇのワクチン組成物を投与し、次いで４２日目にチャレンジした。動物３３３６０、３３３６２および３３３５５を、ワクチン組成物で処置した。動物３３３５６にプラセボを投与した。

【0067】

【図46】図４６は、Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ試験において得られたＩｇＧ力価を示す。２８日目までに、ＥＣ５０力価は１０５を超えた。

【0068】

【図47-1】図４７は、処置したマカクから単離したＩＦＮγ分泌ＰＢＭＣ細胞の誘導を示す。エボラＺａｉｒｅＧＰから得られるペプチドをプールし、アッセイに使用した。ＺａｉｒｅおよびＳｕｄａｎ株から得られるコンセンサスペプチドも試験した。示したデータは、０週目（上段パネル）、３週目（中段パネル）および５週目（下段パネル）におけるそれらペプチドに応答した細胞を例示する。プラセボで注射した対照動物は、基本的に応答を示さなかった。対照的に、ワクチン処置動物は、試験した様々なペプチドに応答して細胞放出ＩＦＮγの強い増加を示した。

【図47-2】図４７は、処置したマカクから単離したＩＦＮγ分泌ＰＢＭＣ細胞の誘導を示す。エボラＺａｉｒｅＧＰから得られるペプチドをプールし、アッセイに使用した。ＺａｉｒｅおよびＳｕｄａｎ株から得られるコンセンサスペプチドも試験した。示したデータは、０週目（上段パネル）、３週目（中段パネル）および５週目（下段パネル）におけるそれらペプチドに応答した細胞を例示する。プラセボで注射した対照動物は、基本的に応答を示さなかった。対照的に、ワクチン処置動物は、試験した様々なペプチドに応答して細胞放出ＩＦＮγの強い増加を示した。

【図47-3】図４７は、処置したマカクから単離したＩＦＮγ分泌ＰＢＭＣ細胞の誘導を示す。エボラＺａｉｒｅＧＰから得られるペプチドをプールし、アッセイに使用した。ＺａｉｒｅおよびＳｕｄａｎ株から得られるコンセンサスペプチドも試験した。示したデータは、０週目（上段パネル）、３週目（中段パネル）および５週目（下段パネル）におけるそれらペプチドに応答した細胞を例示する。プラセボで注射した対照動物は、基本的に応答を示さなかった。対照的に、ワクチン処置動物は、試験した様々なペプチドに応答して細胞放出ＩＦＮγの強い増加を示した。

【0069】

【図48】図４８は、マカクにおけるウイルス量および生存を示す。チャレンジ後７日目までにプラセボ動物はウイルス核酸の実質的な増加を呈し、これはエボラ感染を示した。９日目までにその動物を安楽死させた。ワクチン接種した動物全てが生存した。動物３３３６０だけはウイルス核酸の検出可能な増加を呈し、それはほぼ検出限界であった。１０日目までに、その唯一の動物においても、ウイルスＲＮＡレベルがＲＴ－ＰＣＲの検出能力以下に下落した。

【0070】

【図49】図４９は、追加のマカク研究のためのワクチン試験の設計を示す。動物に、生理食塩水またはＧＰ ５μｇ＋マトリクスＭ ５０μｇを投与した。群Ｆは、０および６週目にワクチンを受けた。群Ｇは、０および３週目にワクチンを受けた。両方の群を、ブーストワクチンの投与６週間後にチャレンジした。

【0071】

【図50】図５０は、第２の研究の結果を示す。両方の群において、抗エボラＧＰの実質的な増加が得られた。生ウイルスによるチャレンジ後１８日目に、生理食塩水対照動物の生存率は、０％であった。対照的に群ＦおよびＧそれぞれにおいて両方の動物が生存し、ワクチン組成物が防御的であると確立された。

【発明を実施するための形態】

【0072】

免疫応答を誘導するためのナノ粒子、それらを産生するおよび投与するための方法ならびにそれらを含有するワクチン組成物が本明細書で開示される。ナノ粒子は、多数の手段によって安定性の増強を提供している構造を生じる界面活性剤コアを囲み、会合している抗原を提供する。界面活性剤コアと抗原とは、抗原および界面活性剤の特性によって媒介される物理化学的相互作用を介して会合する。加えて、ナノ粒子は、理論に束縛されることなく、界面活性剤コアの周りの抗原の配向から生じると考えられている特に良好な抗原提示を免疫系に与える。

【0073】

一態様では、本開示は、組換えウイルス糖タンパク質ナノ粒子を含有する組成物を提供する。具体的な態様では、糖タンパク質は、好適な宿主細胞で組換え発現される。一実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。例示的実施形態では、昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。

【0074】

特定の態様では、本開示は、ナノ粒子構造中に１つまたは複数のウイルス糖タンパク質分子種を含む免疫原性組成物を提供し、ここで糖タンパク質は三量体の形態にあり、各ナノ粒子は非イオン性界面活性剤コアと会合している少なくとも１個の三量体を含有する。特定の態様では、ナノ粒子は、１つだけの病原体由来の、ウイルス糖タンパク質などの抗原からなる。

【0075】

ナノ粒子は、ウイルス感染の予防および／または処置のために使用できる。したがって別の態様では、本開示は、ウイルスに対する免疫応答を誘発するための方法を提供する。方法は、ナノ粒子を含有する組成物の免疫学的有効量を被験体に投与するステップを含む。

【0076】

本開示は、ナノ粒子を含むワクチン組成物を提供する。組成物は、複数の病原体由来の抗原を有するナノ粒子を含有できる。一部の態様では、ワクチン組成物は、同じウイルス種由来の１つより多いウイルス株由来の抗原を含むナノ粒子を含有できる。態様では、ワクチン組成物は、異なるウイルス種由来の抗原を含むナノ粒子を含有できる。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物の構成成分の１つまたは複数で満たされた１つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。

【0077】

別の実施形態では、本開示は、有効用量のナノ粒子を組成物に加えるステップを含む、
感染またはその少なくとも１つの疾患症状に対して哺乳動物に免疫を誘導するワクチン組成物を製剤化する方法を提供する。開示のナノ粒子は、感染性因子について免疫または実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物を調製するために有用である。したがって一実施形態では、本開示は、少なくとも一有効用量のナノ粒子を投与するステップを含む、被験体において感染またはその少なくとも１つの疾患症状に対して免疫を誘導する方法を提供する。

【0078】

一部の実施形態では、ナノ粒子は、アジュバントとともに投与される。他の態様では、ナノ粒子は、アジュバントを伴わずに投与される。一部の態様では、アジュバントは、非共有結合相互作用によってなどでナノ粒子に結合してよい。他の態様では、アジュバントは、ナノ粒子と同時投与されるが、アジュバントとナノ粒子とは実質的に相互作用しない。

【0079】

同様に、ナノ粒子およびワクチン組成物を製造する方法が本明細書で提供される。有利には方法は、バキュロウイルス／Ｓｆ９系におけるタンパク質の組換え発現に関連するタンパク質などの他のタンパク質の混入を実質的に含まないナノ粒子を提供する。

【0080】

定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他を示す場合を除いて複数の参照物を含む。それにより例えば「タンパク質（ａ ｐｒｏｔｅｉｎ）」を参照することは、１つのタンパク質またはそのようなタンパク質の混合物を指す場合があり、「方法（ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ）」を参照することは、当業者に公知の等価のステップおよび／または方法を参照することを含み、他も同様である。

【0081】

本明細書において使用される用語「アジュバント」は、免疫原との組み合わせで使用される場合、免疫原に対して誘導される免疫応答を増大させる、または他に変更するもしくは改変する化合物を指す。免疫応答の改変は、抗体および細胞性免疫応答のいずれかまたは両方の特異性を強化することまたは広げることを含んでよい。

【0082】

本明細書において使用される用語「約」または「およそ」は、数値に先行する場合、値のプラスマイナス１０％の範囲を示す。例えば「約１００」は、９０および１１０を包含する。

【0083】

本明細書において使用される用語「免疫原」、「抗原」および「エピトープ」は、免疫応答を誘発できる糖タンパク質を含むタンパク質およびペプチドなどの物質を指す。

【0084】

本明細書において使用される「免疫原性組成物」は、抗原を含む組成物であり、被験体への組成物の投与は抗原への液性および／または細胞性免疫応答の被験体における発達をもたらす。

【0085】

本明細書において使用される「サブユニット」組成物、例えばワクチンは、１つまたは複数の選択された抗原を含むが、全ての抗原が病原体由来ではない。そのような組成物は、インタクトなウイルスまたはそのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まず、病原体から少なくとも部分的に精製された、しばしば実質的に精製された免疫原性ポリペプチドから典型的には調製される。本明細書に開示のサブユニット組成物中の抗原は、組換えで、しばしばバキュロウイルス系を使用して典型的には調製される。

【0086】

本明細書において使用される「実質的に」は物質が、それが含有される試料で大部分のパーセントを形成するような物質（例えば化合物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
）の単離を指す。例えば試料中で、実質的に精製された構成成分は、試料の８５％、好ましくは８５％～９０％、より好ましくは少なくとも９５％～９９．５％および最も好ましくは少なくとも９９％を構成する。構成成分が実質的に置き換えられている場合、試料中の残存量は約０．５％から約１０％未満または等しい、好ましくは約０．５％から約１．０％未満である。

【0087】

本明細書において使用される用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、有益なまたは望ましい結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的のために、有益なまたは望ましい結果は、感染もしくは疾患の惹起もしくは進行を阻害することもしくは抑制すること；感染もしくは疾患の症状を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）もしくはその発生を低減すること；またはこれらの組み合わせを含んでよい。

【0088】

本明細書において使用される「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」と互換的に使用され、感染もしくは疾患の完全な予防、またはその感染もしくは疾患の症状の発生の予防；感染もしくは疾患またはその症状の発症の遅延；あるいはその後に発生する感染もしくは疾患またはその症状の重症度の減少を意味できる。

【0089】

本明細書において使用される「有効用量」または「有効量」は、病原体感染の少なくとも１つの症状を低減する免疫応答を誘導するために十分な免疫原の量を指す。有効用量または有効量は、例えばプラーク中和、補体結合、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）またはマイクロ中和アッセイによって例えば分泌および／または血清抗体を中和する量を測定することによって決定できる。

【0090】

本明細書において使用される用語「ワクチン」は、防御免疫（例えば、病原体の感染に対して被験体を防御するおよび／または病原体の感染によって生じる疾患もしくは状態の重症度を低減する免疫）を提供する、病原体に対する免疫応答を誘導するために使用される病原体由来の免疫原などの免疫原性組成物を指す。防御免疫応答は、抗体の形成および／または細胞媒介応答を含んでよい。内容に応じて、用語「ワクチン」は、防御免疫を産生するために脊椎動物に投与される免疫原の懸濁物または溶液を指す場合もある。

【0091】

本明細書において使用される用語「被験体」は、ヒトおよび他の動物を含む。典型的には被験体はヒトである。例えば被験体は、成人、ティーンエイジャー、小児（２歳から１４歳）、乳児（１カ月から２４カ月）または新生児（１カ月まで）であってよい。一部の態様では、成人は、約６５歳もしくはそれより年長のまたは約６０歳もしくはそれより年長の年長者である。一部の態様では、被験体は、妊娠中の女性または妊娠を意図している女性である。他の態様では、被験体は、ヒトではなく；例えば非ヒト霊長類；例えば、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラまたはマカクである。ある特定の態様では、被験体は、イヌまたはネコなどのペットであってよい。

【0092】

本明細書において使用される用語「薬学的に許容される」は、米国連邦政府もしくは州政府の規制機関によって認可されているまたは米国薬局方、欧州薬局方もしくは哺乳動物、より詳細にはヒトでの使用について他に一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。これらの組成物は、脊椎動物において防御免疫応答を誘導するためのワクチンおよび／または抗原性組成物として有用であり得る。

【0093】

本明細書において使用される用語「約」は、示される数値のプラスマイナス１０％を意味する。

【0094】

概要
病原体由来抗原は、安定性が改善され、優れた免疫原性を有する、界面活性剤コアを囲むナノ粒子を提供するために非イオン性界面活性剤と組み合わされる。本開示は、病原体に対して被験体にワクチン接種するための方法および組成物も提供する。特定の態様では、病原体は、ウイルスである。抗原は、典型的にはタンパク質、しばしば糖タンパク質である。同様に、ワクチン組成物としての使用が見出されたナノ粒子を含有する組成物が開示される。ナノ粒子を産生するおよびワクチン組成物を産生する方法も開示される。

【0095】

ナノ粒子構造および形態
本開示のナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアと会合している抗原を含む。図６上パネルは、界面活性剤コアと会合している複数のＲＳＶ Ｆ抗原の例を例示している。図３５は、エボラナノ粒子を示している。有利にはナノ粒子は、それらが安定性の増強を提供するように環境ストレスへの耐性が改善されている。

【0096】

特定の実施形態では、ナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアを囲む複数のタンパク質三量体から構成される。例えば各ナノ粒子は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１５個の三量体を含有する場合がある。典型的には各ナノ粒子は、２個から９個の三量体を含有する。特定の実施形態では、各ナノ粒子は、２個から６個の三量体を含有する。本明細書に開示の組成物は、異なる数の三量体を有するナノ粒子を含有してよい。例えば組成物は、三量体の数が２～９の範囲にあるナノ粒子を含有してよく；他の実施形態では、組成物中のナノ粒子は、２～６個の三量体を含有してよい。特定の実施形態では、組成物は、ナノ粒子１個当たり２個から６個の三量体、またはナノ粒子１個当たり２個から９個の三量体を有するナノ粒子の不均一な集団を含有する。他の実施形態では、組成物は、ナノ粒子の実質的に均一な集団を含有してよい。例えば集団は、約９５％が５個の三量体を有するナノ粒子を含有してよい。

【0097】

抗原は、ナノ粒子の非イオン性界面活性剤含有コアと会合する。典型的には界面活性剤は、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート－６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート－６５（ＰＳ６５）およびポリソルベート－８０（ＰＳ８０）から選択される。界面活性剤の存在は、抗原を組織化し提示するコアを形成することによってナノ粒子の形成を促進する。それによりある特定の実施形態では、ナノ粒子は、外側に突出したヘッド領域および疎水性領域を含み、ＰＳ８０界面活性剤が抗原によって囲まれた中央コアを形成している、マルチオリゴマー糖タンパク質－ＰＳ８０タンパク質－界面活性剤ナノ粒子にアセンブルした抗原を含有してよい。

【0098】

本明細書に開示のナノ粒子は、約２０ｎｍから約６０ｎｍ、約２０ｎｍから約５０ｎｍ、約２０ｎｍから約４５ｎｍまたは約２５ｎｍから約４５ｎｍのＺ平均サイズの範囲である。粒子サイズ（Ｚ平均）は、他に指定のない限りＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。

【0099】

いくつかのナノ粒子タイプが、本明細書に開示のワクチン組成物に含まれていてもよい。一部の態様では、ナノ粒子タイプは、二量体または単量体であってよい異方性ロッドの形態にある。他の態様では、ナノ粒子タイプは、球状オリゴマーである。さらに他の態様では、ナノ粒子は、最初の２つのタイプの中間の沈降特性を有する中間体ナノ粒子として記載されてよい。ナノ粒子タイプの形成は、産生工程の際の界面活性剤およびタンパク質の濃度を管理することによって制御できる。ナノ粒子タイプは、沈降係数を測定することによって決定できる。例えばＲＳＶ Ｆナノ粒子を示す図９Ａおよび９Ｂを参照されたい。同様に、界面活性剤およびタンパク質の濃度を調節することによってナノ粒子サイズを管理することを例示する図８も参照されたい。

【0100】

ナノ粒子産生
本開示のナノ粒子は、天然に存在しない産生物であり、その構成成分は天然では一緒には存在しない。一般に本明細書に開示の方法は、第１の界面活性剤がタンパク質を単離するために使用され、次いでその第１の界面活性剤がナノ粒子を形成するために第２の界面活性剤に交換される界面活性剤交換アプローチを使用する。

【0101】

ナノ粒子中に含有される抗原は、宿主細胞において組換え発現によって典型的には産生される。標準的な組換え技術が使用されてよい。典型的にはタンパク質は、バキュロウイルス系を使用して昆虫宿主細胞で発現される。好ましい実施形態では、バキュロウイルスは、カテプシン－Ｌノックアウトバキュロウイルスである。他の好ましい実施形態では、バキュロウイルス（ｂａｃｕｏｌｏｖｉｒｕｓ）は、キチナーゼノックアウトバキュロウイルスである。さらに他の好ましい実施形態では、バキュロウイルスは、カテプシン－Ｌおよびキチナーゼの両方についてダブルノックアウトである。高レベル発現は、昆虫細胞発現系において得ることができる。昆虫細胞の非限定的例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ
ｎｉ細胞、例えばハイファイブ細胞およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２細胞である。

【0102】

典型的トランスフェクションおよび細胞増殖方法は、細胞を培養するために使用できる。ベクター、例えば融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野において周知の方法により宿主細胞にトランスフェクトできる。例えば真核細胞に核酸を導入することは、リン酸カルシウム共沈殿、電気穿孔法、微量注入、リポフェクションおよびポリアミントランスフェクション試薬を用いるトランスフェクションによって達成できる。一実施形態では、ベクターは、組換えバキュロウイルスである。

【0103】

宿主細胞を増殖させる方法は、これだけに限らないが、バッチ、バッチ流加、連続および灌流細胞培養技術を含む。細胞培養は、細胞が繁殖し、精製および単離のためのタンパク質（例えば組換えタンパク質）を発現するバイオリアクター（発酵チャンバー）での細胞の増殖および繁殖を意味する。典型的には細胞培養は、バイオリアクター中で滅菌、管理された温度および大気条件下で実施される。バイオリアクターは、温度、大気、撹拌および／またはｐＨなどの環境条件がモニターできる、細胞を培養するために使用されるチャンバーである。一実施形態では、バイオリアクターは、ステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、バイオリアクターは、予め滅菌されたプラスチックバッグ（例えばＣｅｌｌｂａｇ（登録商標）、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．）である。他の実施形態では、予め滅菌されたプラスチックバッグは、約５０Ｌから３５００Ｌのバッグである。

【0104】

ナノ粒子の界面活性剤抽出および精製
宿主細胞の増殖後、タンパク質は界面活性剤および精製プロトコールを使用して宿主細胞から収集されてよい。宿主細胞が４８から９６時間増殖された後、細胞は培地から単離され、界面活性剤含有溶液が細胞膜を可溶化し、タンパク質を界面活性剤抽出物中に放出するために加えられる。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００および、ＮＰ－９としても公知のｔｅｒｇｉｔｏｌは、それぞれ抽出のための好ましい界面活性剤である。界面活性剤は、約０．１％から約１．０％の最終濃度で加えられてよい。例えば濃度は、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．５％、約０．７％、約０．８％または約１．０％であってよい。ある特定の実施形態では、範囲は、約０．１％から約０．３％であってよい。好ましくは濃度は約０．５％である。

【0105】

他の態様では、異なる第１の界面活性剤が宿主細胞からタンパク質を単離するために使用されてよい。例えば第１の界面活性剤は、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ノノキシノール－９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒ
ｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－デカノイル－Ｎ－メチルグルカミン、ｎ－デシルアルファ－Ｄグルコピラノシド、デシルベータ－Ｄ－マルトピラノシド、ｎ－ドデカノイル－Ｎ－メチルグルカミド、ｎドデシルアルファ－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルベータ－Ｄ－マルトシド、ｎ－ドデシルベータ－Ｄ－マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ－ヘキサデシルベータ－Ｄ－マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、イゲパルＣＡ－６３０、イゲパルＣＡ－６３０、メチル－６－０－（Ｎ－ヘプチルカルバモイル）－アルファ－Ｄ－グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ－ノナノイル－Ｎ－メチルグルカミン、Ｎ－ノナノイルＮ－メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル－ベータ－Ｄグルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ－１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアレート、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５プロピレングリコールステアレート、Ｑｕｉｌｌａｊａ属樹皮由来サポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－１２型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－３０型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－５型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－７型、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ１５－Ｓ－９型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－１０型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－４型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－４０型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－７型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ－９型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮ－１０型、ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮ－６型、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００またはこれらの組み合わせであってよい。

【0106】

次いでナノ粒子は、遠心分離を使用して細胞残渣から単離されてよい。一部の実施形態では、塩化セシウム、スクロースおよびイオジキサノールなどを使用する勾配遠心分離が使用される場合がある。例えば、イオン交換、アフィニティーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを含む標準的精製技術などの他の技術が、代替としてまたは追加で使用されてよい。

【0107】

例えば第１のカラムは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＴＭＡＥ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）などのイオン交換クロマトグラフィー樹脂であってよく、第２のカラムは、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチンアフィニティー樹脂であってよく、第３のカラムは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＳＯ３（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）樹脂などの陽イオン交換カラムであってよい。他の態様では、陽イオン交換カラムは、ＭＭＣカラムまたはＮｕｖｉａ Ｃ Ｐｒｉｍｅカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）であってよい。好ましくは本明細書に開示の方法は、界面活性剤抽出カラム；例えば疎水性相互作用カラムを使用しない。そのような
カラムは、精製の際に界面活性剤を除去するためにしばしば使用されるが、本明細書で開示の方法に悪影響を及ぼす場合がある。

【0108】

界面活性剤交換
ナノ粒子を形成するために、宿主細胞からタンパク質を抽出するために使用される第１の界面活性剤は、ナノ粒子構造に達する第２の界面活性剤で実質的に置き換えられる。ＮＰ－９は、好ましい抽出界面活性剤である。典型的にはナノ粒子は、ＨＰＬＣによって測定された場合検出可能なＮＰ－９を含有しない。第２の界面活性剤は、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５およびＰＳ８０からなる群より典型的には選択される。好ましくは第２の界面活性剤はＰＳ８０である。ナノ粒子製剤の安定性を維持するために、第２の界面活性剤とタンパク質との比は、ある特定の範囲内に維持される。

【0109】

特定の態様では、界面活性剤交換は、それらの炭水化物成分を介して糖タンパク質を結合させるアフィニティークロマトグラフィーを使用して実施される。例えばアフィニティークロマトグラフィーは、マメ科レクチンカラムを使用する場合がある。マメ科レクチンは、もともと植物で同定されたタンパク質であり、炭水化物残基と特異的、可逆的に相互作用することが見出されている。例えば、ＳｈａｒｏｎおよびＬｉｓ、「Ｌｅｇｕｍｅ ｌｅｃｔｉｎｓ－－ａ ｌａｒｇｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、ＦＡＳＥＢ Ｊ．１９９０年１１月；４号（１４巻）：３１９８～２０８頁；Ｌｉｅｎｅｒ、「Ｔｈｅ Ｌｅｃｔｉｎｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ， ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２０１２年を参照されたい。好適なレクチンは、コンカナバリンＡ（ｃｏｎ Ａ）、マメレクチン、イガマメレクチン（ｌｅｃｔ）およびレンズマメレクチンを含む。レンズマメレクチンは、その結合特性から界面活性剤交換のために好ましいカラムである。例えば実施例１０を参照されたい、レクチンカラムは、商業的に入手でき；例えば、カプトレンズマメレクチンは、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。ある特定の態様では、レンズマメレクチンカラムは、組換えレクチンを使用する場合がある。分子レベルでは、炭水化物成分がレンズマメレクチンに結合し、タンパク質のアミノ酸を遊離させ、界面活性剤の周囲に合体できるようにして界面活性剤コアの形成をもたらし、複数コピーの抗原、例えば界面活性剤に係留された二量体、三量体または四量体であってよい糖タンパク質オリゴマーを有するナノ粒子を提供すると考えられる。

【0110】

界面活性剤交換の際にナノ粒子を形成するようにタンパク質とインキュベートされる場合、界面活性剤は、初期精製ステップの際に約０．１％（ｗ／ｖ）までで存在してよく、この量は、最適な安定性を有する最終ナノ粒子を得るために下げられる。例えば非イオン性界面活性剤（例えば、ＰＳ８０）は、約０．０３％から約０．１％であってよい。好ましくは安定性の改善のためにナノ粒子は、約０．０３％から約０．０５％のＰＳ８０を含有する。製剤中約０．０３％未満の量のＰＳ８０は、良好な安定性を示さない。さらにＰＳ８０が約０．０５％を超えて存在する場合、凝集物が形成される。したがって約０．０３％から約０．０５％のＰＳ８０が、分解が低減されたナノ粒子の長期安定性を可能にする構造的および安定性の利益を提供する。

【0111】

界面活性剤交換は、上に考察したとおり精製され、精製され、保存のために凍結され、次いで界面活性剤交換のために解凍されたタンパク質で実施されてよい。

【0112】

ナノ粒子の安定性の増強および免疫原性の増強
理論に束縛されることなく、抗原を非イオン性界面活性剤コアと会合させることは、優れた安定性および抗原提示を提供すると考えられる。本明細書で開示のナノ粒子は、驚くほど良好な安定性および免疫原性を提供する。有利な安定性は、適切な保存ができない国
々で使用されるワクチンについて特に有用であり；例えばアフリカのある特定の場所では冷蔵できない場合があり、それによりエボラウイルスおよびＲＳＶなどの、保存条件の困難さに直面している地域で流行している疾患に対するワクチンは、安定性の改善が特に役立つ可能性がある。さらに中性ｐＨアプローチを使用して産生されたＨＡインフルエンザナノ粒子は、公知の組換えインフルエンザワクチンよりも優れたフォールディングを示す。

【0113】

注目すべきことに、ＣｏｌａｕらへのＵＳ２００４／００２８６９８に記載のものなどのスプリットワクチンを含むＲＳＶワクチンを産生するために界面活性剤を使用する先のアプローチは、有効な構造を産生できなかった。本明細書に開示の界面活性剤コアを囲むタンパク質を有するナノ粒子ではなく、Ｃｏｌａｕらの組成物は確認可能なウイルス構造を欠いているアモルファス材料を含有しており、免疫系にエピトープを効果的に提示できなかったと推定される。加えて、界面活性剤コアの周りの抗原、しばしば糖タンパク質の配向がタンパク質分解を生じる酵素および他の化学物質の接触を立体的に障害することから、開示のナノ粒子は安定性が特に増強されている。

【0114】

ナノ粒子は、様々なストレスへの曝露後に免疫原性を維持するそれらの能力によって決定されるとおり安定性が増強されている。安定性は、種々の方法で測定できる。１つのアプローチではペプチドマップが、厳しい保存条件を模倣することによってナノ粒子にストレスを与えるように設計された種々の処理後の抗原タンパク質の完全性を決定するために作成されてよい。それにより安定性の尺度は、ストレスを与えられた試料での抗原ペプチドの対照試料と比べた相対存在量である。図１２は、ＲＳＶ Ｆナノ粒子組成物への様々な異なるストレス後でさえ、強い免疫応答が達成されることを示している。図１３は、０．０１５％を超えるレベルでＰＳ８０を使用するナノ粒子によって提供されるプロテアーゼ耐性の改善を例示している。注目すべきことに１８カ月では、０．０３％のＰＳ８０は、０．０１５％ＰＳ８０と比べてトランケート型分子種の形成に５０％低減を示している。本明細書に開示のナノ粒子は、２～８℃で安定である。しかし有利にはそれらは、２５℃で少なくとも２カ月安定である。一部の実施形態では、組成物は、２５℃で少なくとも３カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１２カ月、少なくとも１８カ月または少なくとも２４カ月安定である。ＲＳＶ－Ｆナノ粒子について安定性は、図１３に示すとおりトランケート型Ｆ１タンパク質の形成を測定することによって決定できる。有利には本明細書に開示のＲＳＶ－Ｆナノ粒子は、図１２に示すとおり、ｐＨ（ｐＨ３．７）、高ｐＨ（ｐＨ１０）、温度上昇（５０℃、２週間）およびさらに過酸化物による酸化を含む種々のストレスへの応答において対照ＲＳＶ－Ｆタンパク質と比べてペプチドマッピングによって９０から１００％と測定される存在量でインタクトな抗原性部位ＩＩを有利に保持している。

【0115】

界面活性剤コアに係留された糖タンパク質の位置は、望ましくない相互作用を低減することによって安定性の増強を提供すると考えられる。例えばプロテアーゼベース分解に対する保護の改善は、本明細書に開示のモル比で糖タンパク質をコアに係留することがプロテアーゼのアクセスを遮断する立体的障害を生じる遮蔽効果を通じて達成され得る。

【0116】

したがって特定の態様では、２週間、５０℃でのインキュベーション、１週間、２５℃、ｐＨ３．７でのインキュベーション、１週間、ｐＨ１０でのインキュベーション、１週間、２５℃での撹拌、および過酸化水素などの酸化剤との１週間、２５℃でのインキュベーションからなる群より選択される１つまたは複数の処理への応答において未処理対照と比べて、インタクトな部位ＩＩペプチドの９０％から１００％を保持している、ＲＳＶ－Ｆナノ粒子、およびそれを含有する組成物が本明細書に開示される。追加的にそのような処理後、組成物の機能性は保持されている。図１２Ａ～１２Ｄを参照されたい。例えば中和抗体、抗ＲＳＶ ＩｇＧおよびＰＣＡ力価は、対照と比べて保存されている。

【0117】

免疫原性の増強は、インフルエンザナノ粒子によって達成される交差中和によって例示される。コアから突出しているインフルエンザ抗原の配向が免疫系へのエピトープのさらに有効な提示を提供していると考えられる。

【0118】

ナノ粒子抗原
典型的な実施形態では、ナノ粒子を産生するために使用される抗原は、ウイルスタンパク質である。一部の態様では、タンパク質は、改変されてよいが、天然ペプチドに対する免疫応答を刺激する能力を保持している。一部の態様では、タンパク質は、界面活性剤コアへのタンパク質の会合を促進する膜貫通ドメインを本質的に含有する、または含有するように適合されている。しばしばタンパク質は、天然の糖タンパク質である。

【0119】

ＲＳＶ抗原
一態様では、ウイルスは、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）であり、ウイルス抗原は融合（Ｆ）糖タンパク質である。ＲＳＶ Ｆタンパク質の構造および機能は、十分に特徴付けられている。野生型構造の例として図１を参照されたい。本明細書に記載の組成物における使用のために好適なＲＳＶ－Ｆタンパク質は、Ａ２、Ｌｏｎｇ、ＡＴＣＣ ＶＲ－２６、１９、６２６５、Ｅ４９、Ｅ６５、Ｂ６５、ＲＳＢ８９－６２５６、ＲＳＢ８９－５８５７、ＲＳＢ８９－６１９０およびＲＳＢ８９－６６１４などのＲＳＶ株由来であってよい。ある特定の実施形態では、ＲＳＶ Ｆタンパク質は、それらの天然改変体と比べて変異されている。これらの変異は、タンパク質発現の改善、免疫原性の増強などの望ましい特徴を付与する。ＲＳＶ－Ｆタンパク質構造を記載する追加的情報は、Ｓｗａｎｓｏｎら、Ａ Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｕｎｃｌｅａｖｅｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｆ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｔａｉｎｓ Ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２０１４年、８８巻、１１８０２～１１８１０頁、Ｊａｓｏｎ
Ｓ． ＭｃＬｅｌｌａｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＲＳＶ Ｆｕｓｉｏｎ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒｉｍｅｒ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ａ Ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１３年、３４０巻、１１１３～１１１７頁に見出すことができる。

【0120】

主要融合切断は、配列番号２に対応する残基１３１から１３６に位置している。主要融合切断部位の不活性化は、部位中の残基を変異させることによって達成でき、結果としてフューリンは、もはやコンセンサス部位を認識できない。例えば主要フューリン切断部位の不活性化は、野生型ＲＳＶ Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３、アルギニン１３５およびアルギニン１３６に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入することによって達成できる。特定の態様では、１個、２個または３個全てのアルギニンがグルタミンに変異される。他の態様では、不活性化は、次の配列：ＫＫＱＫＱＱ（配列番号１４）、ＱＫＱＫＱＱ（配列番号１５）、ＫＫＱＫＲＱ（配列番号１６）およびＧＲＲＱＱＲ（配列番号１７）の１つに野生型部位を変異させることによって達成される。

【0121】

特定の態様では、配列番号２の酸１３７から１４５に対応する１から１０アミノ酸は、下に示す好適なＲＳＶ Ｆタンパク質の具体例を含んで、欠失されてよい。各配列番号３～１３は、活性主要融合切断部位ＫＫＲＫＲＲ（配列番号１８）を含んで任意選択で調製されてよい。配列番号２中の野生型株は、配列番号３～１３では修正されている配列決定エラー（ＡからＰ、ＶからＩおよびＶからＭ）を有する。宿主細胞でのＲＳＶ－Ｆタンパク質の発現に続いて、Ｎ末端シグナルペプチドは、最終配列を提供するために切断される。典型的にはシグナルペプチドは、宿主細胞プロテアーゼによって切断される。しかし他の態様では、全長タンパク質は、宿主細胞から単離されてよく、続いてシグナルペプチドは切断される。Ｎ末端ＲＳＶ Ｆシグナルペプチドは、配列番号２６（ＭＥＬＬＩＬＫＡ
ＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）のアミノ酸からなる。したがって例えば、発現および精製の際の配列番号８からのシグナルペプチドの切断に続いて、配列番号１９の配列を有する成熟タンパク質が得られ、ＲＳＶ Ｆナノ粒子ワクチンを産生するために使用される。図１Ｂを参照されたい。任意選択で、１つまたは全てまでの複数のＲＳＶ Ｆシグナルペプチドアミノ酸は、欠失、変異されてよく、シグナルペプチド全体は欠失されてよく、発現を増強するために異なるシグナルペプチドで置き換えられてよい。開始メチオニン残基は、発現を開始するために維持される。

【表1】

【0122】

一部の態様では、本明細書に開示のＲＳＶ Ｆタンパク質は、任意選択で主要切断部位の不活性化を伴う融合ドメイン中の欠失によってだけで野生型株から変更される。他の態様では、ＲＳＶ Ｆタンパク質への追加的変更が作られる場合がある。典型的にはシステイン残基が変異される。典型的にはＮ連結グリコシル化部位は変異されない。図１Ｂを参照されたい。加えて、パリビズマブ抗体のこの部位に結合する能力のために本明細書においてパリビズマブ部位とも称される、抗原性部位ＩＩは、保存される。モタビズマブ抗体も部位ＩＩに結合する。参照により組み込まれる追加的に好適なＲＳＶ－Ｆタンパク質は、米国公開ＵＳ２０１１／０３０５７２７に見出され、その図１Ｃに開示される残基１００から１５０にわたる配列を含有するＲＳＶ－Ｆタンパク質を具体的には含む。

【0123】

ある特定の他の態様では、ＲＳＶ Ｆ１またはＦ２ドメインは、配列番号２に示す野生型株と比較して改変を有してよい。例えばＦ１ドメインは、変異または欠失であってよい１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の変更を有してよい。同様にＦ２ドメインは、変異または欠失であってよい１個、２個、３個、４個、５個
、６個、７個、８個、９個または１０個の変更を有してよい。Ｆ１およびＦ２ドメインは、野生型配列に少なくとも９０％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一性をそれぞれ独立に保持してよい。

【0124】

特定の例では、ＲＳＶナノ粒子薬物製品は、約０．０２５％から約０．０３％のＰＳ８０を約２７０μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬ、または約６０μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬの範囲のＲＳＶ Ｆと共に含有してよい。他の態様では、ナノ粒子薬物製品は、組成物中に約０．０３５％から約０．０４％のＰＳ８０を３００μｇ／ｍＬから約５００μｇ／ｍＬのＲＳＶ Ｆと共に含有してよい。さらに他の態様では、ナノ粒子薬物製品は、組成物中に約０．０３５％から約０．０４％のＰＳ８０を３５０～５００μｇ／ｍＬのＲＳＶ Ｆと共に含有してよい。

【0125】

抗原および界面活性剤の濃度は変化する場合があることから、それぞれの量は非イオン性界面活性剤：タンパク質のモル比として参照されてよい。例えば、ＰＳ８０のタンパク質に対するモル比は、ＰＳ８０濃度およびＥＬＩＳＡ／Ａ２８０によって測定された抗原のタンパク質濃度ならびにそれらそれぞれの分子量を使用して算出される。算出のために使用されるＰＳ８０の分子量は１３１０であり、ＲＳＶ Ｆを例として使用して、ＲＳＶ
Ｆの分子量は６５ｋＤである。モル比は、次のとおり算出される：（ＰＳ８０濃度×１０×６５０００）÷（１３１０×ＲＳＶ Ｆ濃度（ｍｇ／ｍＬ））。それにより例えば図１３に示すとおり、タンパク質によって測定されるナノ粒子濃度は、２７０μｇ／ｍＬであり、ＰＳ８０濃度は０．０１５％および０．０３％である。これらは、ＰＳ８０のＲＳＶ Ｆタンパク質に対するモル比、２７：１（すなわち、０．０１５×１０×６５０００／（１３１０×０．２７））および５５：１をそれぞれ有する。

【0126】

特定の態様では、モル比は、約３０：１から約８０：１、約３０：１から約７０：１、約３０：１から約６０：１、約４０：１から約７０：１または約４０：１から約５０：１の範囲である。しばしば置換非イオン性界面活性剤はＰＳ８０であり、モル比はＰＳ８０：タンパク質、約３０：１から約５０：１である。ＲＳＶ－Ｆ糖タンパク質について、３５：１から約６５：１の範囲のモル比、具体的には約４５：１の比を有するナノ粒子は特に安定である。

【0127】

インフルエンザ抗原
ナノ粒子プラットホームは、インフルエンザ抗原を被験体の免疫系に提示するために特に有用である。インフルエンザナノ粒子ワクチンを産生するための以前のアプローチは、界面活性剤を除去するために疎水性相互作用カラムを使用した、または産生物精製の際に生じる非特異的相互作用を低減するために最小量のみの界面活性剤を含有した。しかし、界面活性剤交換ステップを実施することによって、優れた特性を有する非イオン性界面活性剤コアを有するナノ粒子を産生できることがここに発見された。ナノ粒子は、環境ストレスによる分解への耐性によって証明される優れた安定性を示し、ワクチンのための特に有用な特性として長期の保存期間を可能にする。加えて、ナノ粒子構造は、抗原を特に有利な様式で提示するものである。

【0128】

インフルエンザナノ粒子は、それらが誘導する抗体が幅広い中和抗体を含有することから、ワクチンとして特に有用である。したがってある年に投与されたナノ粒子によって誘導される抗体は、その後数年間「ドリフト」工程から生じるインフルエンザウイルス株を中和できる。これらの幅広い中和抗体を誘導するこれらのエピトープは、先行するインフルエンザワクチンでは全く曝露されなかった、もしくは有効に曝露されなかった、またはエピトープは先行する製剤では十分に安定でなかったと考えられる。本明細書に開示のナノ粒子は、安定性が増強された非イオン性界面活性剤コアの周りに係留された交差防御的
エピトープを提示することによってこれらの課題を解決する。

【0129】

最後に本明細書に開示の方法は、良好な純度を有するインフルエンザナノ粒子を特に高い収量で提供し、これは一般に経済的に有利であり、パンデミックインフルエンザウイルスなど、多量の迅速な産生を必要とするウイルスのために特に重要である。

【0130】

ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、ＨＡまたはＮＡタンパク質を含有する場合がある。例えばナノ粒子は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６から選択されるＨＡタンパク質を含有する場合がある。ナノ粒子は、サブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９から選択されるＮＡタンパク質を含有する場合がある。系統学的にＨＡおよびＮＡタンパク質は、群に分けられる。ＨＡについて群１はＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３およびＨ１６を含有し、群２はＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５を含有する。ＮＡも２つの群を形成し：群１はＮ１、Ｎ４、Ｎ５およびＮ８を含有し、群２はＮ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７およびＮ９を含有する。ある特定の態様では、抗原は、天然インフルエンザＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質に少なくとも９０％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９７％同一性または少なくとも９９％を有してよい。

【0131】

ナノ粒子のために使用されるＨＡおよびＮＡタンパク質は、典型的には全長配列である。ある特定の態様では、Ｃ末端の一部が除去されてよい。

【0132】

有利には、インフルエンザを有する組成物は、本明細書に開示の追加的病原体ナノ粒子が同時投与される場合でも、インフルエンザの異種株に対する応答を誘導できる。異種インフルエンザ株に対する応答を誘導することによって、幅広い防御が達成される。それにより特定の態様では、マトリクスＭ－アジュバント化組成物で誘導された同種ＨＡＩ力価は、約８００から約２０００である。具体的な態様では、異種ＨＡＩ力価は約１３００である。特定の態様では、マトリクスＭ－アジュバント化組成物で誘導される異種ＨＡＩ力価は、約２００から約４００であり；例えば異種ＨＡＩ力価は約３００であってよい。

【0133】

ある特定の態様では、インフルエンザナノ粒子は、中性ｐＨ精製を使用して産生されたトリプシン耐性ナノ粒子である。トリプシン耐性は、ＨＡナノ粒子の精製および製剤化の際の６．８を超えて８．５までの中性ｐＨ範囲によって達成される。特定の態様では、ＨＡナノ粒子の精製および製剤化の際のｐＨ範囲は、７．０から８．５、７．０から７．５または７．２から７．５である。ＨＡナノ粒子安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって測定できる。ＤＳＣは、具体的には制御された様式で温度を変動させることによって試料溶液と適切な参照（緩衝液／溶媒）との間の熱エネルギー取り込みにおける差異を測定することによって、溶液中の高分子の熱力学的プロファイルを測定する。ＤＳＣは、タンパク質の半分が変性／アンフォールド、半分が非変性／フォールド状態にある温度として定義される遷移中点（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｉｄｐｏｉｎｔ）（Ｔｍ）としてデータを提供する。ある特定の態様では、本明細書のトリプシン耐性ＨＡナノ粒子は、約６０℃から７５℃の範囲内にＴｍピークを有し；例えばＴｍは、６０℃、６５℃、７０℃または７５℃であってよい。

【0134】

トリプシン耐性は、ＨＡタンパク質が適切にフォールドされ、それによりさらに良好な安定性および免疫原性を有するワクチン産生物を提供することを示す。ＨＡタンパク質の感受性は、株ごとに変化し、それにより本明細書に開示の中性ｐＨ産生は全ての株、特にｐＨ感受性株に関して免疫原性を最大化するための工程を提供する。理論に束縛されることなく、界面活性剤交換と中性ｐＨレベルとの組み合わせがプロテアーゼ、特にトリプシンに耐性にする構造にＨＡタンパク質を保つと考えられる。それにより、中性ｐＨ精製と
組み合わせて、ＨＡタンパク質を非イオン性界面活性剤コアの周りに会合させることによって、ＨＡタンパク質の特に良好な安定性および免疫原性が達成される。加えて、ナノ粒子を産生する方法は、ワクチンにおける使用のためのタンパク質の優れたレベルを提供する。特定の態様では、Ａ２８０によって、細胞培養物１Ｌ当たり約１０ｍｇから約３０ｍｇ、またはより高く、約２０ｍｇから約３０ｍｇと測定されるＨＡナノ粒子が産生される。

【0135】

トリプシン耐性ＨＡナノ粒子は、図２４に記載のとおり調製されてよい。簡潔には、界面活性剤交換を含む種々のステップは、ｐＨ７．０を超え；しばしば約ｐＨ７．２から約ｐＨ７．４の範囲の緩衝液で実施される。図２５Ｄは、トリプシン耐性ナノ粒子で達成されたより良好な熱安定性の例を提供する。ＴＦＦおよびＭＭＣ産生ロットは、中性ｐＨを使用して得られ、一方ミスフォールドした低ｐＨロットは、実質的に分解される、および／またはミスフォールドされる。

【0136】

エボラ抗原
本開示は、エボラウイルス感染および／または疾患を処置する、好転させる、または予防するための方法および組成物も提供する。具体的には組成物は、ワクチン組成物である。有利には本明細書に開示のワクチン組成物は、動物モデルにおける致死性チャレンジに１００％生存を提供する。組成物は、ウイルス核酸を検出するためにＲＴ－ＰＣＲを使用する場合、ほぼ検出限界またはそれ未満のウイルス量も維持する。

【0137】

一態様では、本開示は、組換えエボラウイルス糖タンパク質（ＧＰ）ナノ粒子をサポニンベースアジュバントと組み合わせて含有する組成物を提供する。

【0138】

特定の態様では、本開示は、ＧＰタンパク質が三量体の形態にあり、各ナノ粒子が非イオン性界面活性剤コアに付着した少なくとも１個の三量体を含有するナノ粒子構造中に１つまたは複数のエボラウイルスＧＰタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。

【0139】

エボラＧＰナノ粒子は、エボラ感染の予防および／または処置のために使用されてよい。別の態様では、本開示は、エボラＧＰナノ粒子を含む薬学的に許容されるワクチン組成物を提供する。一部の態様では、１個より多い株由来のナノ粒子がワクチン中にある。別の実施形態では、本開示は、１つまたは複数のワクチン製剤成分で満たされた１つまたは複数の容器を含む薬学的パックまたはキットを提供する。

【0140】

エボラ糖タンパク質
ナノ粒子を調製するために使用されるエボラ抗原は、典型的にはエボラ糖タンパク質（ＧＰ）抗原である。抗原は、様々な株由来であってよい。本明細書で開示の組成物は、１個、２個、３個、４個、５個または６個の別々のエボラ株由来のナノ粒子を含有してよい。例えば株は、Ｍａｋｏｎａ、Ｓｕｄａｎ、Ｚａｉｒｅ、Ｒｅｓｔｏｎであってよい。他の態様では、エボラＧＰは、１つまたは複数のこれらの株とアミノ酸または核酸同一性を共有してよい。例えばＧＰは、Ｍａｋｏｎａ、Ｓｕｄａｎ、ＺａｉｒｅまたはＲｅｓｔｏｎウイルス由来の１つまたは複数のＧＰと約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一、約９５％同一、約９７％同一、約９８％同一または約９９％同一であってよく、ここで同一性はタンパク質または核酸の全長にわたって測定される。一部の態様では、エボラＧＰは、配列番号２７もしくは２８またはこれらに同一性を有するタンパク質を含んでよいまたはこれらからなっていてもよい。

【0141】

代表的なＺａｉｒｅ株配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ８１００４（配列番号２７）に提供されている。最初の下線部分は、ＧＰ１タンパク質についてのＮ末端を示している。先行するシグナルペプチドは、精製およびワクチンへの製剤化に先立つ細胞での発
現に続くプロセシングの際に切断除去される。太字で示されているのはフューリン切断部位である。太字文字列に続いて、ＧＰ２タンパク質についてのＮ末端が示されている。図７Ａは、タンパク質構造の模式図を示している。

【化1】

【0142】

Ｍａｋｏｎａ分離菌配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪＧ４４１９２（配列番号２８）に提供されている。上記と同様に最初の下線部分は、ＧＰ１タンパク質についてのＮ末端を示している。先行するシグナルペプチドは、プロセシングの際に切断除去される。太字で示されているのはフューリン切断部位である。太字文字列に続いて、ＧＰ２タンパク質についてのＮ末端が示されている。図７Ｂも参照されたい。

【化2】

【0143】

免疫応答を刺激するワクチン組成物の能力は、３種の動物モデルで確認された。最初にマウスモデルが使用された。マトリクスＭ、ＡｌＰＯ_４または生理食塩水と共に製剤化された組換えＥＢＯＶ／Ｍａｋ全長ＧＰナノ粒子ワクチンが評価された。非アジュバント化またはＡｌＰＯ_４アジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰでのマウスの免疫化は、中程度の抗体および細胞性応答を誘導し；しかしマトリクスＭでアジュバント化された場合、精製ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰナノ粒子は、マウスチャレンジモデルにおいて高度に免疫原性および防御的であった。マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰでのマウスの免疫化は、抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ＩｇＧおよびエボラウイルス中和抗体の顕著な増加を生じた。マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰでの免疫化は、致死性エボラウイルスチャレンジからの１００％防御を付与した一方で、非アジュバント化Ｅ
ＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰは１０％防御だけであり、ＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウスでは防御は観察されなかった。したがって特定の態様では、本明細書で開示の組成物は、エボラ感染を予防する。

【0144】

ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰとマトリクスＭとの同時投与は、均衡のとれたＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブクラス応答の産生を誘導した。アジュバントの非存在またはＡｌＰＯ_４を伴う場合は、最小のＩｇＧ２ａ抗体が検出された。Ｂｌａｎｅｙら、Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｅｔｈａｌ Ｅｂｏｌａ
ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ｎｏｎｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｔｅｓ ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄ ｂｉｖａｌｅｎｔ
ｖａｃｃｉｎｅ． ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ．２０１３年；９巻（５号）：は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の狂犬病／ＥＢＯＶキメラワクチンモデルにおいて、抗体アイソタイプがウイルス中和およびエボラウイルスチャレンジに対する防御において役割を演じることを示した。マウスＩｇＧ２ａ抗体は、ＩｇＧ－Ｆｃ受容体（ＦｃγＲ）および補体（Ｃ１ｑ）に効率的に結合するヒトＩｇＧ１抗体の等価物であり（Ｂｒｕｈｎｓ， Ｐ． Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｍｏｄｅｌｓ Ｂｌｏｏｄ．２０１２年；１１９巻：５６４０～５６４９頁；Ｖｉｄａｒｓｓｏｎ Ｇ、Ｄｅｋｋｅｒｓ Ｇ、Ｒｉｓｐｅｎｓ Ｔ． ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ： ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４年；５巻：５２０頁）、例えば抗体依存性細胞媒介細胞傷害性を通じてウイルス感染の消散を助けることができる。ｉｎ ｖｉｖｏで完全に防御的であった全ての抗体は、ＩｇＧ２ａサブクラスであり；すなわちヒトＩｇＧ１と同じであった。したがって本明細書で開示の組成物は、防御免疫応答の一部としてＩｇＧ１抗体の産生を刺激する。

【0145】

マトリクスＭアジュバントの使用は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋サイトカイン分泌Ｔ細胞の頻度ならびに１種より多いサイトカインを産生する多機能性Ｔ細胞の数の用量依存的増加を提供した。致死性エボラウイルスチャレンジからの防御がマトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ群においてだけ観察されたという観察は、多機能性Ｔ細胞の産生の増強と関連した。

【0146】

マトリクスＭの使用は、脾臓中のＧＣ Ｂ細胞および骨髄中の長命形質細胞の頻度を増加させた。ＧＣは、Ｂ細胞分化、体細胞高頻度変異、抗体クラススイッチおよびメモリーＢ細胞の形成のための微小解剖学的位置である。ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰのサポニンアジュバントマトリクスＭとの同時投与は、ＧＣ Ｂ細胞分化および発生を促進するＴ_ＦＨ細胞の数の増加も生じた。マトリクスＭアジュバント化によって誘導されるＧＣおよびＴ_ＦＨ細胞の頻度の増加は、抗体応答の規模の増強およびより多数の長命形質細胞の誘導と関連し、マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰワクチンが特に永続的な抗体応答を誘導できることを示唆している。

【0147】

エボラＧＰの各用量は、アジュバントと組み合わされてよい。マトリクスＭアジュバントと共に精製ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰナノ粒子を投与することは、マウスモデルにおいて１００％防御効力を生じる抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ免疫応答の強い刺激を提供する。本明細書で開示の組成物および方法は、抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ＩｇＧおよびエボラウイルス中和抗体のさらに急速な発生、ＩｇＧ２ａの濃度の増加ならびに多機能性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔ_ＦＨ細胞、胚中心Ｂ細胞の頻度の増加ならびに骨髄でのＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的形質Ｂ細胞の持続を提供する。

【0148】

したがってマウス研究の分析は、本明細書で開示の組成物が完全防御を提供したことを
確認している。防御効果をさらに確立するために、研究は、２つの別々の非ヒト霊長類モデル：ヒヒおよびマカクで実施された。Ｐｅｒｒｙら、「Ｔｈｅ Ｂａｂｏｏｎ （Ｐａｐｉｏ ｓｐｐ．） ａｓ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｅｂｏｌａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１２年１０月２３日；４巻（１０号）：２４００～１６頁；Ｇｅｉｓｂｅｒｔら、「Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｅｂｏｌａ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｉｎ ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｅａｒｌｙ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．２００３年１２月；１６３巻（６号）：２３４７～７０頁を参照されたい。したがって本開示の一部の態様では、防御効果は、ウイルス曝露後約７日、約１０日、約１４日または約２１日後に検出するＲＴ－ＰＣＲの能力より低いウイルス量の低減を含む。

【0149】

非ヒト霊長類研究は、本明細書で開示の組成物が防御的であることをさらに確認した。エボラＧＰナノ粒子は、アジュバントを含まずに、およびミョウバンまたはマトリクスＭアジュバントのいずれかと共に評価された。実施例２３を参照されたい。ヒヒにおける免疫応答は、非常に強く、継続された。注目すべきことにマトリクスＭの含有は、ミョウバンより強い免疫応答をもたらした。マカクモデルでの結果は、特に予想外であった。実施例２４および２４を参照されたい。組成物は、生エボラワクチンでのチャレンジに対して防御的であっただけでなく、エボラＲＮＡの量は生ウイルスでのチャレンジ後１０日目で検出不能であった。図４８を参照されたい。注目すべきことに１体のマカク被験体では、小さなシグナルがおよそ７日目にあり；しかし１０日目までに、レベルは検出限界未満に戻った。対照的に未処置動物の生エボラウイルスへの曝露は、被験体が９日目に安楽死された感染および疾患を生じた。

【0150】

改変抗原
本明細書で開示の抗原は、これらの抗原の変種および変異体を包含する。ある特定の態様では、抗原は、開示の抗原に同一性を共有してよい。一般に、具体的に同定された抗原の内容において具体的に定義されない限り、同一性百分率は、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９８％であってよい。同一性百分率は、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／で入手可能なアラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して算出できる。次の初期設定パラメーターがペアワイズアラインメントのために使用されてよい：タンパク質重量マトリクス＝Ｇｏｎｎｅｔ；ギャップオープン＝１０；ギャップ伸長＝０．１。

【0151】

特定の態様では、ナノ粒子中に含有されるタンパク質は、そのタンパク質からなる。他の態様では、ナノ粒子中に含有されるタンパク質は、そのタンパク質を含む。タンパク質それ自体への添加は、種々の目的のためであってよい。一部の態様では、抗原は、Ｎ末端、Ｃ末端または両方で伸長されてよい。一部の態様では、伸長は、精製または検出などの機能のために有用なタグである。一部の態様では、タグは、エピトープを含有する。例えばタグは、ポリグルタミン酸タグ、ＦＬＡＧ－タグ、ＨＡ－タグ、ポリＨｉｓ－タグ（約５～１０個のヒスチジンを有する）、Ｍｙｃ－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ－タグ、緑色蛍光タンパク質－タグ、マルトース結合タンパク質－タグ、チオレドキシン－タグまたはＦｃ－タグであってよい。他の態様では、伸長は、発現を増強するためにタンパク質に融合されたＮ末端シグナルペプチドであってよい。そのようなシグナルペプチドは、細胞において発現の際にしばしば切断される一方で、一部のナノ粒子はインタクトなシグナルペプチドを有する抗原を含有する場合がある。それによりナノ粒子が抗原を含む場合、抗原は伸長を含有する可能性があり、それにより、ナノ粒子に組み込まれる際に融合タンパク質である可能性がある。配列との同一性を算出する目的のためには、伸
長は含まれない。

【0152】

一部の態様では、抗原は、トランケートされてよい。例えばＮ末端は、約１０アミノ酸、約３０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸または約２００アミノ酸だけトランケートされてよい。Ｃ末端は、Ｎ末端の代わりにまたは追加でトランケートされてよい。例えばＣ末端は、約１０アミノ酸、約３０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸または約２００アミノ酸だけトランケートされてよい。トランケーションを有するタンパク質との同一性を算出する目的のために、同一性はタンパク質の残余部分にわたって測定される。

【0153】

組み合わせナノ粒子
本明細書において使用される組み合わせナノ粒子は、２つまたはそれより多くの異なる病原体に対して免疫応答を誘導するナノ粒子を指す。特定の組み合わせに応じて病原体は、同じ種の異なる株もしくはサブタイプであってよく、または病原体は異なる種であってよい。組み合わせナノ粒子を調製するために複数の病原体由来の糖タンパク質は、界面活性剤交換段階でそれらを結合させることによって単一のナノ粒子に組み合わされてよい。カラムへの糖タンパク質の結合に続く界面活性剤交換は、複数の糖タンパク質タイプが界面活性剤コアの周りに形成し、組み合わせナノ粒子を提供することを可能にする。

【0154】

本開示は、それぞれが異なる病原体に対する応答を誘導する２つまたはそれより多くのナノ粒子を組み合わせることによって２つまたはそれより多くの異なる病原体に対する免疫応答を誘導するワクチン組成物も提供する。任意選択でワクチン組成物は、複数の病原体に対する免疫応答を最大化する一方で、被験体に投与されるワクチン組成物の数を減らす目的で１つまたは複数の組み合わせナノ粒子を単独でまたは追加的ナノ粒子と組み合わせて含有してよい。

【0155】

そのような組成物は、病原体が何らかの面で関係している場合に特に望ましい。一例では組成物は、特定の年の季節性インフルエンザを形成するとして当局から年ごとに同定された株に対するナノ粒子を含有してよい。典型的には季節性インフルエンザワクチンのためにワクチン組成物は、３個、４個または５個のインフルエンザサブタイプの株に対して免疫応答を誘導するＨＡおよび／またはＮＡナノ粒子を含有する。それにより、インフルエンザの異なる株がワクチン組成物中に組み合わされてよい。一部の態様では、組み合わせナノ粒子は、第１の株由来のＨＡタンパク質および第２の株由来のＮＡタンパク質を含有してよい。他の態様では、ナノ粒子は、同じまたは異なるサブタイプ由来の１つまたは複数のＨＡおよび１つまたは複数のＮＡタンパク質を含有してよい。例えばナノ粒子は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６から選択される１つもしくは複数のＨＡナノ粒子ならびに／またはサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９から選択される１つもしくは複数のＮＡナノ粒子を含有してよい。系統学的にＨＡおよびＮＡタンパク質は、群に分割される。ＨＡについて群１は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３およびＨ１６を含有し、群２はＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４およびＨ１５を含有する。ＮＡタンパク質も２個の群を形成する：群１はＮ１、Ｎ４、Ｎ５およびＮ８を含有し、群２はＮ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７およびＮ９を含有する。ある特定の態様では、抗原は、天然インフルエンザＨＡタンパク質におよび／またはＮＡタンパク質に少なくとも９０％同一性、少なくとも９５％同一性、少なくとも９７％同一性または少なくとも９９％を有する場合がある。

【0156】

別の例では、インフルエンザおよびＲＳＶの両方は呼吸器疾患を生じ、ＨＡ、ＮＡおよび／もしくはＲＳＶ Ｆは、したがって組み合わせナノ粒子に混合されてよく、または複数のナノ粒子は、ＲＳＶおよび１つもしくは複数のインフルエンザ株に対する応答を誘導
するためにワクチン組成物中に組み合わされてよい。

【0157】

ワクチン組成物
本明細書で開示の組成物は、予防的または治療的のいずれで使用されてもよいが、典型的には予防的である。したがって本開示は、感染を処置するまたは予防するための方法を含む。方法は、本開示の免疫原性組成物の治療的または予防的量を被験体に投与するステップを含む。好ましくは薬学的組成物は、防御効果を提供するワクチン組成物である。他の態様では、防御効果は、曝露集団の百分率での感染に関連する症状の好転を含んでよい。例えば病原体に応じて、組成物は、未処置被験体と比べて：発熱疲労、筋肉痛、頭痛、咽頭炎、嘔吐、下痢、皮疹、腎臓および肝臓の機能障害の症状、内出血ならびに外出血から選択される１つまたは複数のウイルス疾患症状を予防または低減できる。

【0158】

ナノ粒子は、種々の賦形剤、緩衝液などの存在下でワクチンとしての投与のために製剤化されてよい。例えばワクチン組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウムおよび／またはヒスチジンを含有してよい。リン酸ナトリウムは、約１０ｍＭから約５０ｍＭ、約１５ｍＭから約２５ｍＭまたは約２５ｍＭで存在してよく；特定の場合では約２２ｍＭリン酸ナトリウムが存在する。ヒスチジンは、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）または約２．５％（ｗ／ｖ）で存在してよい。存在する場合、塩化ナトリウムは、約１５０ｍＭであってよい。ある種の組成物、例えばインフルエンザワクチンでは、塩化ナトリウムは、約２００ｍＭ、約３００ｍＭまたは約３５０ｍＭを含むさらに多い量で存在してよい。

【0159】

ある特定のナノ粒子、具体的にはＲＳＶ Ｆナノ粒子は、わずかに酸性ｐＨレベルで安定性の改善を有する。例えば、ナノ粒子を含有する組成物についてのｐＨ範囲は、約ｐＨ５．８から約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．９から約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．０から約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．１から約ｐＨ６．４、約ｐＨ６．１から約ｐＨ６．３または約ｐＨ６．２であってよい。典型的にはＲＳＶ Ｆタンパク質ナノ粒子に関する組成物は、約ｐＨ６．２である。他のナノ粒子では組成物は、中性の傾向がある場合があり；例えばインフルエンザナノ粒子は約ｐＨ７．０からｐＨ７．４；しばしば約ｐＨ７．２であってよい。

【0160】

アジュバント
ある特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物は、免疫応答を増強するために１つまたは複数のアジュバントと組み合わされてよい。他の実施形態では、組成物は、アジュバントを含まずに調製され、それによりアジュバント不含有組成物として投与されるように利用可能である。有利には本明細書に開示のアジュバント不含有組成物は、単一用量として投与された場合に防御免疫応答を提供できる。強い免疫応答を誘導するミョウバン不含有組成物は、約６０歳およびそれより年長の成人で特に有用である。

【0161】

アルミニウムベースアジュバント
一部の実施形態では、アジュバントは、ミョウバン（例えばＡｌＰＯ_４またはＡｌ（ＯＨ）_３）であってよい。典型的にはナノ粒子は、ミョウバンに実質的に結合している。例えばナノ粒子は、ミョウバンに少なくとも８０％結合、少なくとも８５％結合、少なくとも９０％結合または少なくとも９５％結合してよい。しばしばナノ粒子は組成物中でミョウバンに９２％から９７％結合している。用量当たりに存在するミョウバンの量は、典型的には約４００μｇから約１２５０μｇの間の範囲にある。例えばミョウバンは、用量当たり約３００μｇから約９００μｇ、約４００μｇから約８００μｇ、約５００μｇから約７００μｇ、約４００μｇから約６００μｇまたは約４００μｇから約５００μｇの量で存在してよい。典型的にはミョウバンは、１２０μｇのタンパク質ナノ粒子の用量当たり約４００μｇで存在する。

【0162】

サポニンアジュバント
サポニンを含有するアジュバントは、本明細書で開示の免疫原と組み合わされてもよい。サポニンは、樹木Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの樹皮由来グリコシドである。典型的にはサポニンは、複数の画分をもたらす多ステップ精製工程を使用して調製される。本明細書において使用される用語「Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来サポニン画分」は、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの半精製もしくは規定のサポニン画分またはその実質的に純粋な画分を記載するために総称的に使用される。

【0163】

サポニン画分
サポニン画分を産生するためのいくつかのアプローチは好適である。画分Ａ、ＢおよびＣは、米国特許第６，３５２，６９７号に記載されており、次のとおり調製できる。Ｑｕｉｌ Ａ由来の親油性画分、粗水性Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ抽出物は、クロマトグラフィーによって分離され、親油性画分を回収するために水中７０％アセトニトリルで溶出される。次いでこの親油性画分は、酸性水中２５％から６０％アセトニトリルへの勾配を使用する溶出で半分取ＨＰＬＣによって分離される。本明細書で「画分Ａ」または「ＱＨ－Ａ」と称される画分は、およそ３９％アセトニトリルで溶出される画分である、またはこれに対応する。本明細書で「画分Ｂ」または「ＱＨ－Ｂ」と称される画分は、およそ４７％アセトニトリルで溶出される画分である、またはこれに対応する。本明細書で「画分Ｃ」または「ＱＨ－Ｃ」と称される画分は、およそ４９％アセトニトリルで溶出される画分である、またはこれに対応する。画分の精製に関する追加的情報は、米国特許第５，０５７，５４０号に見出される。本明細書に記載のとおり調製される場合、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの画分Ａ、ＢおよびＣは、定義できる特性を有して化学的に密接に関連する分子の群またはファミリーをそれぞれ表す。それらが得られたクロマトグラフィー条件は、溶出プロファイルおよび生物学的活性に関してバッチごとの再現性が高度に一致しているものである。

【0164】

他のサポニン画分は記載されている。画分Ｂ３、Ｂ４およびＢ４ｂはＥＰ０４３６６２０に記載されている。画分ＱＡ１～ＱＡ２２は、ＥＰ０３６３２２７９Ｂ２、Ｑ－ＶＡＣ（Ｎｏｒ－Ｆｅｅｄ，ＡＳ Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ
Ｍｏｌｉｎａ Ｓｐｉｋｏｓｉｄｅ（ｌｓｃｏｎｏｖａ ＡＢ、Ｕｌｔｕｎａａｌｌｅｎ ２Ｂ、７５６ ５１ Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に記載されている。ＥＰ０３６３２２７９Ｂ２の画分ＱＡ－１、ＱＡ－２、ＱＡ－３、ＱＡ－４、ＱＡ－５、ＱＡ－６、ＱＡ－７、ＱＡ－８、ＱＡ－９、ＱＡ－１０、ＱＡ－１１、ＱＡ－１２、ＱＡ－１３、ＱＡ－１４、ＱＡ－１５、ＱＡ－１６、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８、ＱＡ－１９、ＱＡ－２０、ＱＡ－２１およびＱＡ－２２、特にＱＡ－７、ＱＡ－１７、ＱＡ－１８およびＱＡ－２１は使用できる。それらは、ＥＰ０３６３２２７９Ｂ２に、特に６頁ならびに８および９頁の実施例１に記載のとおり得られる。

【0165】

本明細書に記載され、アジュバントを形成するために使用されるサポニン画分は、しばしば実質的に純粋な画分であり；すなわち画分は、他の材料由来の混入物が実質的に存在しない。特定の態様では、実質的に純粋なサポニン画分は、重量で４０％まで、重量で３０％まで、重量で２５％まで、重量で２０％まで、重量で１５％まで、重量で１０％まで、重量で７％まで、重量で５％まで、重量で２％まで、重量で１％まで、重量で０．５％まで、または重量で０．１％までの、他のサポニンまたは他のアジュバント材料などの他の化合物を含有する場合がある。

【0166】

ＩＳＣＯＭ構造
サポニン画分は、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体（Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎ
ｇ ＣＯＭｐｌｅｘ））と称されるケージ様粒子の形態で投与されてよい。ＩＳＣＯＭは、ＥＰ０１０９９４２Ｂ１、ＥＰ０２４２３８０Ｂ１およびＥＰ０１８０５４６Ｂ１に記載のとおり調製できる。特定の実施形態では、ＥＰ９６００６４７－３（ＰＣＴ／ＳＥ９７／００２８９）に記載のとおり輸送および／またはパッセンジャー抗原は使用されてよい。

【0167】

マトリクスアジュバント
一部の態様では、ＩＳＣＯＭは、ＩＳＣＯＭマトリクス複合体である。ＩＳＣＯＭマトリクス複合体は、少なくとも１つのサポニン画分および脂質を含む。脂質は、コレステロールなどの少なくとも１つのステロールである。特定の態様では、ＩＳＣＯＭマトリクス複合体は、リン脂質も含有する。ＩＳＣＯＭマトリクス複合体は、必ずしもグリコシドではない１つまたは複数の他の免疫調節性（アジュバント活性）物質も含有する場合があり、ＥＰ０４３６６２０Ｂ１に記載のとおり産生できる。

【0168】

他の態様では、ＩＳＣＯＭは、ＩＳＣＯＭ複合体である。ＩＳＣＯＭ複合体は、少なくとも１つのサポニン、少なくとも１つの脂質および少なくとも１種類の抗原またはエピトープを含有する。ＩＳＣＯＭ複合体は、抗原の一部が粒子に組み込まれる、界面活性剤処理によって会合した抗原を含有する。対照的にＩＳＣＯＭマトリクスは、抗原との混合物として製剤化されており、ＩＳＣＯＭマトリクス粒子と抗原との間の会合は、静電気的および／または疎水性相互作用によって媒介される。

【0169】

一実施形態により、ＩＳＣＯＭマトリクス複合体もしくはＩＳＣＯＭ複合体に組み込まれたサポニン画分、または同様にＩＳＣＯＭもしくはＩＳＣＯＭマトリクス複合体に組み込まれたもしくはそれと混合されている少なくとも１つの追加的アジュバントは、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの画分Ａ、画分Ｂもしくは画分Ｃ、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの半精製調製物、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａの精製調製物または任意の精製サブ画分、例えばＱＡ１～２１から選択される。

【0170】

特定の態様では、各ＩＳＣＯＭ粒子は、少なくとも２つのサポニン画分を含有する場合がある。異なるサポニン画分の重量％の任意の組み合わせが使用されてよい。任意の２つの画分の重量％の任意の組み合わせが使用されてよい。例えば粒子は、それぞれ、任意の重量％の画分Ａおよび任意の重量％の粗サポニン画分または画分Ｃなどの別のサポニン画分を含有してよい。したがって特定の態様では、各ＩＳＣＯＭマトリクス粒子または各ＩＳＣＯＭ複合体粒子は、１つのサポニン画分、例えば画分Ａを重量で０．１から９９．９、重量で５から９５％、重量で１０から９０％、重量で１５から８５％、重量で２０から８０％、重量で２５から７５％、重量で３０から７０％、重量で３５から６５％、重量で４０から６０％、重量で４５から５５％、重量で４０から６０％、または重量で５０％およびそれぞれの場合の別のサポニン、例えば任意の粗画分または任意の他の画分、例えば画分Ｃを残余１００％まで含有する場合がある。重量は、サポニン画分の総重量として算出される。ＩＳＣＯＭマトリクス複合体およびＩＳＣＯＭ複合体アジュバントの例は、米国特許出願公開第２０１３／０１２９７７０号に開示されている。

【0171】

特定の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリクスまたはＩＳＣＯＭ複合体は、１つの画分、例えば画分Ａを重量で５～９９％および別の画分、例えば粗サポニン画分または画分Ｃを残余１００％までの重量含む。重量は、サポニン画分の総重量として算出される。

【0172】

別の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリクスまたはＩＳＣＯＭ複合体は、１つの画分、例えば画分Ａを重量で４０％から９９％、および別の画分、例えば粗サポニン画分または画分Ｃを重量で１％から６０％含む。重量は、サポニン画分の総重量として算出される。

【0173】

さらに別の実施形態では、ＩＳＣＯＭマトリクスまたはＩＳＣＯＭ複合体は、１つの画分、例えば画分Ａを重量で７０％から９５％、および別の画分、例えば粗サポニン画分または画分Ｃを重量で３０％から５％含む。重量は、サポニン画分の総重量として算出される。他の実施形態では、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来サポニン画分は、ＱＡ１～２１のいずれか１つから選択される。

【0174】

サポニン画分の混合物を含有する粒子に加えて、ＩＳＣＯＭマトリクス粒子およびＩＳＣＯＭ複合体粒子は、１つだけのサポニン画分を使用してそれぞれ形成されてよい。本明細書で開示の組成物は、複数の粒子を含有してよく、ここで各粒子は１つだけのサポニン画分を含有する。すなわちある特定の組成物は、１つもしくは複数の異なるタイプのＩＳＣＯＭ－マトリクス複合体粒子および／または１つもしくは複数の異なるタイプのＩＳＣＯＭ複合体粒子を含有してよく、ここでそれぞれ個々の粒子は、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来の１つのサポニン画分を含有し、１個の複合体中のサポニン画分は他の複合体粒子中のサポニン画分とは異なっている。

【0175】

特定の態様では、１つのタイプのサポニン画分または粗サポニン画分は、１個のＩＳＣＯＭマトリクス複合体または粒子に組み込まれてよく、別のタイプの実質的に純粋なサポニン画分または粗サポニン画分は、別のＩＳＣＯＭマトリクス複合体または粒子に組み込まれてよい。組成物またはワクチンは、少なくとも２つのタイプの複合体または粒子を含んでよく、それぞれのタイプが物理的に異なる粒子に組み込まれた１つのタイプのサポニンを有する。

【0176】

組成物中で、ＩＳＣＯＭマトリクス複合体粒子および／またはＩＳＣＯＭ複合体粒子の混合物が使用され得、ここで、１つのサポニン画分Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａおよび別のサポニン画分Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａが異なるＩＳＣＯＭマトリクス複合体粒子および／またはＩＳＣＯＭ複合体粒子に別々に組み入れられる。

【0177】

それぞれ１つのサポニン画分を有するＩＳＣＯＭマトリクスまたはＩＳＣＯＭ複合体粒子は、任意の組み合わせの重量％で組成物中に存在してよい。特定の態様では、組成物は、第１のサポニン画分を含有するＩＳＣＯＭマトリクスまたは複合体を重量で０．１％から９９．９％、重量で５％から９５％、重量で１０％から９０％、重量で１５％から８５％、重量で２０％から８０％、重量で２５％から７５％、重量で３０％から７０％、重量で３５％から６５％、重量で４０％から６０％、重量で４５％から５５％、重量で４０から６０％または重量で５０％含有し、残余部分は異なるサポニン画分を含有するＩＳＣＯＭマトリクスまたは複合体からなってよい。一部の態様では、残余部分は、１つまたは複数のＩＳＣＯＭマトリクスまたは複合体であり、各マトリクスまたは複合体粒子は１つだけのサポニン画分を含有する。他の態様では、ＩＳＣＯＭマトリクスまたは複合体粒子は、１つより多いサポニン画分を含有してよい。

【0178】

特定の組成物では、第１のＩＳＣＯＭマトリクスまたはＩＳＣＯＭ複合体粒子中のサポニン画分は画分Ａであり、第２のＩＳＣＯＭマトリクスまたはＩＳＣＯＭ複合体粒子中のサポニン画分は、画分Ｃである。

【0179】

好ましい組成物は、画分Ａを含有する第１のＩＳＣＯＭマトリクスおよび画分Ｃを含有する第２のＩＳＣＯＭマトリクスを含み、ここで画分Ａ ＩＳＣＯＭマトリクスは総サポニンアジュバントの重量で約７０％を構成し、画分Ｃ ＩＳＣＯＭマトリクスは総サポニンアジュバントの重量で約３０％を構成する。別の好ましい組成物では、画分Ａ ＩＳＣＯＭマトリクスは総サポニンアジュバントの重量で約８５％を構成し、画分Ｃ ＩＳＣＯＭマトリクスは総サポニンアジュバントの重量で約１５％を構成する。それによりある特
定の組成物では、画分Ａ ＩＳＣＯＭマトリクスは組成物中のサポニンアジュバントの総重量の約７０％から約８５％の範囲で存在し、画分Ｃ ＩＳＣＯＭマトリクスは約１５％から約３０％の範囲で存在する。例示的ＱＳ－７およびＱＳ－２１画分、それらの産生ならびにそれらの使用は、その開示について参照により組み込まれる米国特許第５，０５７，５４０号；第６，２３１，８５９号；第６，３５２，６９７号；第６，５２４，５８４号；第６，８４６，４８９号；第７，７７６，３４３号および第８，１７３，１４１号に記載されている。

【0180】

他のアジュバント
一部の組成物では、追加でまたは代替として他のアジュバントが使用されてよい。全ての目的のためにその全体が本明細書に参照により組み込まれるＶｏｇｅｌら、「Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ａｎｄ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版）」に記載の任意のアジュバントの含有は、本開示の範囲内であると想定される。他のアジュバントは、完全フロイントアジュバント（死菌Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激因子）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントを含む。他のアジュバントは、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ｔｈｕｒ－ＭＤＰおよびｎｏｒ－ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ－ＰＥ）、脂質Ａ、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＭＦ－５９、細菌から抽出された３種の構成成分を含有するＲＩＢＩ、ＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）ならびに２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０乳剤中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）を含む。一部の実施形態では、アジュバントは、少層（ｐａｕｃｉｌａｍｅｌｌａｒ）脂質小胞；例えばＮｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）であってよい。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（登録商標）は、約１００ｎｍから約５００ｎｍの範囲の少層非リン脂質小胞である。それらは、Ｂｒｉｊ７２、コレステロール、オレイン酸およびスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅは、有効なアジュバントであることが示されている（米国特許第５，６２９，０２１号、第６，３８７，３７３号および第４，９１１，９２８号を参照されたい。

【0181】

投与および投与量
本明細書で開示の組成物は、全身性経路もしくは粘膜経路もしくは経皮的経路を介して、または特定の組織に直接投与されてよい。本明細書において使用される用語「全身性投与」は、非経口投与経路を含む。具体的には、非経口投与は、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内または胸骨内注射、静脈内または腎臓透析注入技術を含む。典型的には全身性、非経口投与は筋肉内注射である。本明細書において使用される用語「粘膜投与」は経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸管および眼への投与を含む。好ましくは投与は、筋肉内である。

【0182】

組成物は、単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールで投与されてよい。複数用量は、初回免疫化スケジュールで、またはブースター免疫化スケジュールで使用されてよい。複数用量スケジュールでは、種々の用量が、同じまたは異なる経路、例えば非経口プライムと粘膜ブースト、粘膜プライムと非経口ブーストなどによって与えられてよい。一部の態様では、続くブースト用量は、先行する用量の約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後または約６週間後に投与される。典型的には、しかし、本明細書で開示の組成物は、１回だけ投与され、それにもかかわらず防御免疫応答を提供する。

【0183】

一部の実施形態では、μｇで測定される用量は、溶質を含む用量の総重量、またはＲＳＶ Ｆナノ粒子の重量、またはＲＳＶ Ｆタンパク質の重量であってよい。用量は、Ａ２８０またはＥＬＩＳＡのいずれかのタンパク質濃度アッセイを使用して測定される。

【0184】

小児への投与のために含まれる抗原の用量は、約３０μｇから約３００μｇ、約９０μ
ｇから約２７０μｇ、約１００μｇから約１６０μｇ、約１１０μｇから約１５０μｇ、約１２０μｇから約１４０μｇまたは約１４０μｇから約１６０μｇの範囲であってよい。特定の実施形態では、用量は、約１２０μｇであり、ミョウバンとともに投与される。一部の態様では、小児用用量は、約３０μｇから約９０μｇの範囲であってよい。ある特定の集団は、アジュバントを含んでまたは含まずに投与されてよい。例えば年長者に投与する場合、好ましくはミョウバンは含まれない。ある特定の態様では、組成物は、追加のアジュバントを含まなくてよい。そのような環境では用量は、約１０％増加されてよい。

【0185】

一部の実施形態では、用量は、約０．１ｍＬから約１．５ｍＬ、約０．３ｍＬから約１．０ｍＬ、約０．４ｍＬから約０．６ｍＬまたは典型的な量である約０．５ｍＬの体積で投与されてよい。

【0186】

特定の実施形態では、ＲＳＶワクチンについて、用量は、約１７５μｇ／ｍＬから約３２５μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬから約３００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬから約２８０μｇ／ｍＬまたは約２４０μｇ／ｍＬから約２６０μｇ／ｍＬの濃度のＲＳＶ Ｆタンパク質を含んでよい。

【0187】

本開示に引用する全ての特許、特許出願、参考文献および学術論文は、全ての目的についてそれらの全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0188】

（実施例１）
ＲＳＶ Ｆタンパク質の発現および精製
配列番号８を有するＲＳＶ Ｆタンパク質をバキュロウイルス発現系において発現させ、ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現している組換えプラークを選び、確認した。次いで、組換えウイルスを、Ｓｆ９昆虫細胞の感染により増幅させた。昆虫細胞の培養物は、バキュロウイルスでおよそ３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスｆｆｕまたはｐｆｕ／細胞）で感染させた。培養物および上清を、感染４８～７２時間後に採取した。粗細胞採取物、およそ３０ｍＬを、およそ８００×ｇで１５分間の遠心分離により清澄化した。ＲＳＶ Ｆタンパク質を含有する、得られた粗細胞採取物を下記の通り精製した。

【0189】

非イオン性界面活性物質Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ－９（ノニルフェノールエトキシレート）を、膜タンパク質抽出プロトコールに使用した。粗抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンズマメレクチンアフィニティー／ＨＩＣおよび陽イオン交換クロマトグラフィーを通すことによりさらに精製した。洗浄した細胞を、界面活性剤処理により溶解し、次いでＢＶならびにＳｆ９宿主細胞のＤＮＡおよびタンパク質を沈殿させる低ｐＨ処理に供した。中和した低ｐＨ処理溶解物を清澄化し、第２の低ｐＨ処理を実施する前に陰イオン交換およびアフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製した。

【0190】

アフィニティークロマトグラフィーを使用して、Ｓｆ９／ＢＶタンパク質、ＤＮＡおよびＮＰ－９を除去し、ＲＳＶ Ｆタンパク質を濃縮した。簡潔には、レンズマメレクチンは、カルシウムおよびマンガンを含有する金属タンパク質であり、レンズマメレクチンは、多糖およびグルコースまたはマンノースを含有するグリコシル化タンパク質を可逆的に結合する。ＲＳＶ Ｆ含有陰イオン交換フロースルー画分を、レンズマメレクチンアフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ｃａｐｔｏ Ｌｅｎｔｉｌ Ｌｅｃｔｉｎ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。非グリコシル化タンパク質およびＤＮＡはカラムフロースルー中に除去されるが、グリコシル化ＲＳＶ Ｆタンパク質は、樹脂に選択的に結合する。弱く結合している糖タンパク質を、高塩および低モル濃度のメチルアルファ－Ｄ－マンノピラノシド（ＭＭＰ）を含有する緩衝液により除去した。

【0191】

加えて、カラム洗浄も使用して、ＮＰ－９界面活性剤を界面活性物質ポリソルベート８０（ＰＳ８０）で界面活性剤交換した。界面活性剤交換を実施するために、レンズマメレクチンカラムに対するＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の結合後に、カラムを０．１％ ＰＳ８０とインキュベートした。ＲＳＶ Ｆタンパク質を、高濃度のＭＭＰによってレンズマメレクチンカラムから溶出した。溶出後に、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体を、ＲＳＶ Ｆタンパク質三量体および界面活性剤コア中に含有されるＰＳ８０で構成されるミセルナノ粒子にアセンブルさせる。界面活性剤交換後に、低ｐＨ不活性化ステップがあり、続いて０．１％ ＰＳ８０を含む緩衝液の存在下に硫酸カラム上でインキュベーションした。

【0192】

溶出材料を、ＰＳ８０：ＲＳＶ Ｆタンパク質モル比約５０のバルク保存用原薬（ＤＳ）を得るのに適切なＰＳ８０を含有する溶液に希釈した。ＤＳの適切な組成物は、２２ｍＭリン酸ナトリウム、０．０３％ ＰＳ８０のリン酸緩衝液ｐＨ６．２を含む溶液にＲＳＶ Ｆナノ粒子を組み合わせることにより得られた。界面活性剤交換の間および後の各ステップにおいて、組成物中のＰＳ８０に対する抗原比を、モル比３５から６０に維持した。モル比を、ＥＬＩＳＡ／Ａ２８０およびそれぞれの分子量により測定されるＰＳ８０濃度およびＲＳＶ Ｆ濃度を使用して算出した。ＰＳ８０の分子量は、１３１０、ＲＳＶは６５ｋＤである。

【0193】

（実施例２）
ワクチン組成物の調製
投与するワクチン産物のためのナノ粒子を得るために、原薬を、ＰＳ８０：ＲＳＶタンパク質モル比約５０を持つ薬物製品に希釈した。原薬を解凍し、希釈し、投与前に２～８℃で保存するためにガラスバイアルまたは予備充填した注射器に充填した。ナノ粒子は、ミョウバンアジュバントに結合した。ミョウバンアジュバントを添加し、混合して、ナノ粒子の約９５％がミョウバンに結合していることを確実にし、このことは、０．５ｍＬ体積中でＲＳＶ Ｆナノ粒子の１２０μｇ用量当たり約０．４ｍｇであることを意味する。

【0194】

（実施例３）
ナノ粒子におけるＲＳＶ Ｆ糖タンパク質の特徴付け
様々な分析技術によりナノ粒子におけるタンパク質構造を分析した。図３は、産生されたＲＳＶ Ｆタンパク質の最も高いピークが、パルミトレイン酸を含有することを示す（ピーク２Ａ）。２番目に大きいピークは、パルミチン酸を含有する（ピーク２Ｂ）。残りのピークは、いずれの脂肪酸も欠き（ピーク５）および可溶型（ピーク１）で得られた。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでの分析により、Ｆ１＋２タンパク質、Ｆ１、Ｆ１Ａ、Ｆ１ＢおよびＦ１Ｃ部分ならびにＦ２を含めた追加の改変体が分離された。図４を参照のこと。ペプチド構造の分析を、ペプチドマッピングを使用して実施した。図５を参照のこと。ＲＳＶ
Ｆ糖タンパク質上のグリカン構造を評価するために、ＨＰＬＣ－ＦＬＤを実施した。結果は、主要なグリカン構造がフコシル化されていることを実証した。

【0195】

（実施例４）
電子顕微鏡検査によるＲＳＶ Ｆナノ粒子の検査
実施例１において調製したナノ粒子を、電子顕微鏡により可視化した。結果から、界面活性剤コアを囲むＲＳＶ Ｆ糖タンパク質を含有するナノ粒子の形成を確認した。界面活性剤コアの正確な組成は、不明なままである。図６は、得られたナノ粒子のタイプを例示する。ＲＳＶ Ｆタンパク質は、界面活性剤交換後でも三量体構造を維持した。三量体／ナノ粒子の数および形態が変動するいくつかのタイプのナノ粒子が得られた。図６は、複数の三量体を界面活性剤コアの周りに見ることができることを示す。強調された部分では、７つの三量体が、界面活性剤を囲んで示される。図６の主パネルは、産生された界面活性剤コアの周りの三量体の範囲を例示する。下段左パネルにおけるＲＳＶ Ｆタンパク質三量体の模式図構造は、界面活性剤コアと会合する底部を持つ三量体の配向を例示し、こ
れは、各ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質に付着している脂肪酸により促進される。

【0196】

（実施例５）
ＲＳＶ Ｆナノ粒子の粒子特徴付け
動的光散乱（ＤＬＳ）を活用して、ブラウン運動における粒子の光散乱パターンの変化を測定することによりナノ粒子のサイズ分布プロファイルを決定した。ナノ粒子サイズは、ＲＳＶ Ｆナノ粒子の濃度に対するイオン性界面活性剤の濃度の線形関数として決定することができた（図７および８を参照のこと）。

【0197】

分析用超遠心（ＡＵＣ）を使用して、適用した遠心場の結果として回転プロファイルの軸に対する試料濃度の経過を測定した。図８から、存在するナノ粒子の濃度に基づいてナノ粒子の主に２つの形状が現れることが明らかになる。得られたナノ粒子タイプには、単量体および二量体異方性ロッド、ならびに球状オリゴマーがある。これら２つのナノ粒子タイプの間の構造中間体は、異方性ロッドおよび球状オリゴマーをもたらす濃度間で形成される。図９は、ナノ粒子タイプが、ＲＳＶ Ｆタンパク質の濃度をモジュレートすることにより制御できることを示し、より高濃度（１ｍｇ／ｍＬ）は、球状オリゴマーが主たる集団をもたらし、一方でより低濃度（０．２２ｍｇ／ｍＬ）は、単量体／二量体異方性ロッドが主たる集団をもたらす。これらのデータは、界面活性剤の量およびＲＳＶ Ｆ濃度を制御して、ナノ粒子が２０ｎｍから６０ｎｍの特定の直径（ｚ平均）を有するに至り得ることを例示する。

【0198】

（実施例６）
ナノ粒子の安定性の増強：分子特徴付け
活用した５つのストレッサーは、５０℃で４８時間、１週間および２週間時点での熱ストレス；低ｐＨ（２５℃で３．７）４８時間、４日間および１週間時点；高ｐＨ（２５℃で１０）、２４時間、４８時間および１週間時点；２５℃で過酸化水素酸化、１２時間、４８時間および１週間時点；ならびに２５℃で物理的撹拌、４時間、２４時間および１週間時点であった。

【0199】

様々なストレス処理後に、一次構造の差異を評価した。図１０は、特定の領域が、対照と比較してどのようにストレスに耐えたかという比較を示す。データは、ナノ粒子が、タンパク質全体にわたって優れた安定性を有しており、過酸化水素を使用する特に厳しい酸化試験のみ、タンパク質を任意の特定の程度に分解できたことを示す。しかしながら、その処理でさえ、パリビズマブの標的である抗原性部位ＩＩの構造的完全性を減少させなかった。実際に、厳しい酸化でも、ＲＳＶ－Ｆタンパク質は、６３～８２位、２３７～２５８位および３６０～３６４位でしか構造的に悪化しなかった。したがって、厳しいストレスに供した後でも、ナノ粒子は実質的にインタクトなままであった。

【0200】

図１１は、抗原性部位ＩＩに関してナノ粒子安定性をさらに定量化する。データは、熱ストレス、低ｐＨ、高ｐＨおよび撹拌のそれぞれに応答して、抗原性部位ＩＩが、試料のそれぞれにおいて９０％程度にインタクトなままであったことを示す。

【0201】

（実施例７）
ナノ粒子の安定性の増強：維持された免疫原特性
実施例６に記載されるストレスを受けたワクチン組成物を、マウスモデルにおいて免疫原性について評価した。ワクチンを、ＲＳＶ Ｆタンパク質０．１５、０．４５、１．３、４および１２μｇ／ｍＬからなるＲＳＶ Ｆ用量の範囲にわたって２回の筋肉内注射によってマウスに投与した。以下の条件：５０℃で２週間、２５℃でｐＨ１０を１週間、２５℃で０．５％過酸化水素を１週間、でストレスを加えたＲＳＶ Ｆ組成物を、対照（－７０℃での保存から解凍した）を伴って投与した。

【0202】

免疫応答を、抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧの存在、ＰＣＡ力価およびＲＳＶ Ａ中和抗体の存在に関して評価した。物理および化学的ストレッサーは、ｉｎ ｖｉｖｏでＲＳＶ Ｆタンパク質免疫原性に有意な影響を及ぼさなかった。ストレスを受けた試料は、ストレスを受けていないＲＳＶ Ｆナノ粒子ワクチン組成物対照のそれと類似の抗ＲＳＶ Ｆ ＩｇＧ抗体力価ならびに同程度の機能性ＰＣＡおよびＲＳＶ Ａ中和力価を誘導した。（図１２Ａ～１２Ｄを参照のこと）。まとめると、これらの強制的な分解研究は、激しい環境ストレスに曝露してもナノ粒子が強力な免疫応答を誘導することを示す。

【0203】

（実施例８）
ナノ粒子のプロテアーゼ耐性
安定性が改善されたナノ粒子の形成は、ナノ粒子を産生するために使用するＰＳ８０の量に依存している。図１３は、ナノ粒子を、０．０３％ ＰＳ８０（すなわちモル比５５）で形成した場合の、０．０１５％（すなわちモル比２７）と比較した１８カ月までの安定性の劇的な改善を例示する。左パネルは、時間０に２つの濃度で産生したナノ粒子のＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。データは、参照調製物と類似の結果が、両方のナノ粒子調製物で得られたことを示す。特に、両方が、基本的に分解がないことを例示するＦ１およびＦ１＋２の強いシグナルを示す。次いで、各調製物のアリコートを、４℃で１８カ月間インキュベートし、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥを再び行った。右パネルおよび表のデータは、粒子中に０．０１５％だけ含有するナノ粒子が、トランケート型Ｆ１を生じたことを例示する。対照的に、粒子中に０．０３％で調製したナノ粒子は、プロテアーゼに対して優れた耐性を例示した。本発明者らは、界面活性剤およびタンパク質の正しい比を維持することにより、おそらくいくつかの立体障害メカニズムによって保護されるプロテアーゼ感受性部分を持つ糖タンパク質の配向を有するナノ粒子を得られると考える。本発明者らは、０．０６％またはそれを超えるＰＳ８０の濃度が、凝集物形成を増加させることをさらに観察した。総合すれば、データは、ナノ粒子安定性に対する最適ＰＳ８０レベルが、約０．０３％～約０．０５％であることを示す。

【0204】

（実施例９）
ＨＡナノ粒子の精製
ＴＭＡＥカラムを、流量：９１．７ｃｍ ３０ｍＬ／分で緩衝液Ａ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮＰ９）０．５ＣＶで前平衡化した。試料を、２０ｍＬ／分（滞在時間２５分間）でロードし、次いでＥＱ緩衝液Ａ１（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５、７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮＰ－９）で洗浄した。次いで精製試料を、１５％緩衝液Ｂ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０２％ ＮＰ９）１．２５ＣＶ、続いて１００％ Ｂ １．１ｃｖを使用して溶出した。代表的なクロマトグラムを、図１８Ｂに示す。ＴＭＡＥカラムからの産物を、緩衝液Ａ１１：２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＰＳ８０ ３ＣＶ（流量：１４７ｃｍ／時間 １３ｍＬ／分）で前平衡化したレンズマメレクチンアフィニティークロマトグラフィーカラムに加えた。試料を、滞在時間９．４分間、６．５ｍＬ／分、７３．５ｃｍ／時間でロードした。ロード後、高塩洗浄を、緩衝液Ａ１２（２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ－９）３ＣＶで実施した。第１の洗浄後に、界面活性剤交換を、緩衝液Ａ１１（２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＰＳ８０）６ＣＶでカラムを洗浄することにより実施した。次いでＰＳ８０を含有するナノ粒子を、１００％ Ｂ ３ＣＶ、Ｂ１：緩衝液Ｂ：２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．０、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＰＳ８０、５００ｍＭ メチル－アルファ－Ｄ－マンノピラノシドで溶出した。代表的なクロマトグラムトレースを、図１８Ｃに示す。レンズマメレクチンカラムからの産物を、緩衝液Ａ１（２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ６．０、１０ｍＭ
ＮａＣｌ、０．０５％ ＰＳ８０）３ＣＶで硫酸カラムに加え、緩衝液Ａ１ ２ＣＶで
洗浄し、次いで１００％緩衝液Ｂ１（２５ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．５、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ＰＳ８０）で溶出した。次いで溶出産物を、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ９と１：１で組み合わせ、濾過滅菌した。最終産物はｐＨ７．２であった。クロマトグラムを図１８Ｄに示す。図１８Ｅは、ＴＭＡＥおよびＬＬカラムからの精製工程の間に得られた様々な産物のゲルおよびウエスタンブロットを提供する。図１８ＦはＳ０３－カラムからの溶出液を示す。

【0205】

（実施例１０）
ＨＡナノ粒子純度の分析
ＨＡナノ粒子を、図１７および１８に概説するように調製した。様々な株から得られるＨＡ配列を使用して複数のＨＡナノ粒子調製物の純度を測定した（Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５、Ａ／スイス／９７１５２９３／２０１３、Ａ／香港／４８０１／２０１４、Ｂ／プーケット／３０７３／２０１３、およびＢ／ブリスベーン６０／２００８）。データは、全ての場合で高純度の調製物が得られたことを示した。ゲルデンシトメトリによる分析は、９３％を超え、９３％から９７％の範囲の純度を示した。図１９Ａ～１９Ｈを参照のこと。ＲＰ－ＨＰＬＣにより３つのＡサブタイプ株の純度も分析し、純度が８３％から８５％であることが判明した。図１９Ｉを参照のこと。加えて、ナノ粒子サイズを測定した。ナノ粒子は、２２．０ｎｍから２９．９ｎｍの直径を示した。図１９を参照のこと。

【0206】

（実施例１１）
ＨＡ超微細構造の分析
電子顕微鏡検査を実施して、ＨＡナノ粒子の構造を評価した。他の糖タンパク質のように、ＨＡ糖タンパク質が、ＰＳ８０界面活性剤コアと会合した三量体を形成することが判明した。各界面活性剤コアは、複数の三量体を含有した。図２０を参照のこと。ｃｒｙｏ－ＥＭ２次元クラス平均を使用して、ナノ粒子上へＨＡ三量体をドッキングさせた。図２１Ａは、これらのｉｎ ｓｉｌｉｃｏドッキング実験の結果を示す。上パネルは、第１のナノ粒子上へのＨＡ三量体のはめ込みを示す。下パネルは、ナノ粒子の別の軸（ｓｔａｌｋ）へのはめ込みを示す。

【0207】

比較のために、ＶＬＰにおけるドッキングを実施した。ＶＬＰは、ＨＡタンパク質が係留された脂質二重層を含有する。図２１Ｂを参照のこと。中央パネルは、二重層から放射状に伸びている軸の上に重ねたＨＡタンパク質構造を示す。右上および下パネルは、ＨＡ三量体上へまっすぐ下を向いている遊離ＨＡのＥＭ顕微鏡写真を、単独で（上パネル）および対応するＨＡ構造をＥＭ画像上に重ねて（下パネル）示す。

【0208】

（実施例１２）
ＲＳＶ Ｆナノ粒子と同時投与したＨＡナノ粒子の免疫原性分析
マウスモデルにおいてワクチン中のナノ粒子の免疫原性を評価した。２つの抗原（Ａ／スイスＨ３サブタイプ由来インフルエンザＨＡタンパク質およびＲＳＶ Ｆタンパク質）を含有するナノ粒子の組み合わせを投与した。また各ナノ粒子を別々に投与した。ワクチンを単独でまたはアジュバントＡｌＰＯ_４もしくはマトリクスＭサポニンアジュバントと共に投与した。図２２は、群１～１０に投与した処置を示す。群１０、対照は、処置しなかった。０および２１日目に処置を投与した。異種および同種チャレンジに対するＨＡＩを測定した。図２３Ａおよび２３Ｂを参照のこと。図２３Ａは、マトリクスアジュバント化ＨＡナノ粒子が、同種チャレンジに対して特に強い応答を刺激したことを示す。図２３Ｂは、マトリクスＭと投与した場合に強いＨＡＩ応答が、異種インフルエンザ株Ａ／テキサス／５０／２０１２に対しても得られたことを示し、この応答は、ＲＳＶ Ｆナノ粒子との同時投与による影響を受けなかった。

【0209】

パリビズマブと競合する抗体の形成を誘導するＲＳＶ Ｆナノ粒子成分の能力も測定した。図２３Ｃ。データは、単独で投与したＲＳＶ Ｆナノ粒子およびＡｌＰＯ４またはマトリクスＭのいずれかと共に投与したＲＳＶ Ｆナノ粒子が、８０μｇ／ｍＬからおよそ７００μｇ／ｍＬの実質的な抗体力価を誘導したことを示す。ＲＳＶ Ｆとインフルエンザナノ粒子の両方によって誘導した場合、アジュバントの非存在下またはＡｌＰＯ_４の存在下でおよそ２０μｇ／ｍＬから４０μｇ／ｍＬの低い応答が得られた。しかしながら、ＲＳＶ Ｆ単独またはＨＡナノ粒子と組み合わせて投与した場合、マトリクスＭの存在下でＲＳＶ Ｆ応答は強かった。ＲＳＶ中和抗体の測定は、ＰＣＡ抗体と類似のパターンを示した。図２３Ｄを参照のこと。

【0210】

抗体応答に加えて、ＲＳＶに対するおよびインフルエンザＡ／スイス／９７１５２９３／２０１３に対するワクチンにより誘導されたＴ細胞応答を測定した。図２３Ｅおよび２３Ｆ。マトリクスＭをアジュバントとして使用した場合、データは両方の標的に対してＩＦＮγの強い誘導を示す。

【0211】

（実施例１３）
トリプシン耐性ナノ粒子産生
インフルエンザを産生するための特定のアプローチにより、ＨＡタンパク質のトリプシン感受性を得ることができ、その感受性は、免疫原性の減少およびワクチン製剤の安定性をもたらすフォールディングを改変する。トリプシン耐性ＨＡナノ粒子を産生するために、中性ｐＨ緩衝液を利用する界面活性剤交換アプローチを使用した。図２４Ａ～Ｃを参照のこと。

【0212】

Ｓｆ９細胞を、ＨＡナノ粒子ＢＶベクターによりＭＯＩ＝０．１；３Ｅ６細胞／ｍｌで感染させた。３日目に細胞を採取し、緩衝した０．５％ ＮＰ９；ｐＨ７．５で溶解した。陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＴＭＡＥ；ＥＭＤ）を次に実施した。図２４Ｂは、例示的なクロマトグラムを示す。フロースルーは、ＨＡを含有する。陰イオン交換カラム後、界面活性剤交換を、０．０１％ ＰＳ８０；ｐＨ７．２を含有する高塩／界面活性剤洗浄液を使用し、Ｃａｐｔｏレンズマメレクチンカラム（ＧＥ）を使用して実施し、また０．０１％ ＰＳ８０に溶出した。図２４Ｃは、界面活性剤交換工程の例示的なクロマトグラムを示す。最後に、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）：５０ｋＤ ＭＷＣＯフィルター；ｐＨ７．２を使用して、産物を保存するために使用するバルク原薬（ＢＤＳ）を産生した。ＴＦＦ段階およびその後においては、ＰＳ８０をｐＨ７．２の緩衝液中で０．０５％に維持した。

【0213】

（実施例１４）
トリプシン耐性ナノ粒子分析
実施例１３に記載される工程および産生を使用する様々な株からのＨＡナノ粒子を評価した。図２５Ａは、株Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５（Ｈ１Ｎ１）の収量が約２０ｍｇ／Ｌであったことを示す。Ｂ株インフルエンザナノ粒子も、優れた生産性および純度を有した。図２５Ｂは、バルク原薬として評価したＢ株、Ｂ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡの収量および純度を示す。収量は、約３０ｍｇ／Ｌであった。図２５Ｃは、Ｈ３Ｎ２株の収量を示し、工程が純度約９６％および収量約２０ｍｇ／Ｌを与えたことを示す。

【0214】

熱力学的安定性分析
図２５Ｄは、実施例１３におけるトリプシン耐性中性ｐＨアプローチを使用して産生したＨＡナノ粒子と図１８に示すような低ｐＨ精製ステップを使用するアプローチとの熱力学的プロファイル比較を提供する。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）方法を使用して、特に、制御された様式で温度を変動させることによって試料溶液と適切な参照（緩衝液／溶媒）
との間の熱エネルギー取り込みの差異を測定することにより、溶液中の高分子の熱力学的プロファイルを決定した。Ｆｌｕ ＨＡ試料に関して、ＤＳＣにより、タンパク質の半分が変性／アンフォールド、半分が非変性／フォールド状態にある温度として定義される遷移中点（Ｔｍ）を可視化できた。

【0215】

加えて、ＤＳＣは、タンパク質コンフォメーションに関する情報を与え、推定される安定性プロファイルを、異なる工程条件を受けた各ＨＡ株に対しておおよそ外挿することができる。精製の間ｐＨ６．０にＨＡを曝露する工程ステップにより精製したＨＡと別のステップ（例えばＭＭＣ樹脂またはＴＦＦ膜）によって精製したＨＡとの差異を、一例としてＢ／ブリスベーンＨＡを使用して示す。データは、Ｔｍ値が強度においてより高いことを示し、主なピークおよびより鋭いピークに対するより高いＴｍの出現へのシフトを示し、別のステップにより精製した場合のＨＡの適切なフォールディングを示唆している。ｐＨ６．０に曝露したＨＡに関するデータは、しかしながら、強度においても大きく下落し、主なピークのＴｍについてより早い出現を示し、遅い非対称のアンフォールディングを示す著しく広がったピークを有し、ならびに／またはミスフォールドタンパク質およびより高い温度における凝集ピークを含有するＴｍ値を示す。類似のプロファイルが、他の株（Ａ／Ｃａｌ、Ａ／香港、Ａ／ニューハンプシャー）に観察された。ＤＳＣデータにおけるこれら３つの観察に基づいて、低ｐＨは、前述の通りナノ粒子を生じ、そのナノ粒子は特定の適用を有し得るが、中性ｐＨを使用する別の工程ステップ／条件が、有意により優れた熱力学的および潜在的に改善された安定性プロファイルを持つＨＡタンパク質を産すると結論付ける。

【0216】

トリプシン耐性
図２６は、ナノ粒子が、実施例１３に記載の通り産生された場合に得られるトリプシン耐性の改善を例示する。トリプシン感受性を試験するために、ＨＡ試料を、０．２４ｍｇ／ｍＬまで希釈し、３７℃で６０分間トリプシンを低下させてインキュベートした。トリプシン阻害剤を添加して消化を停止させ、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を実施した。図２６の左パネルと右パネルの比較は、トリプシン耐性の増強を例示する。Ｓｆ９昆虫細胞において製作した精製ＨＡナノ粒子は、ＨＡ０である。トリプシンに曝露した場合、ＨＡ０は、Ｈ１中のＡｒｇ ＡＡ３４４でＨＡ１とＨＡ２に切断される。正確にフォールドされたＨＡ三量体は、トリプシンの濃度を増加させてインキュベートした場合にさらなる切断に耐えることになる。中性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８はトリプシンに耐性であり、正確にフォールドされている（左パネル）。酸性ｐＨで精製したＢ／ブリスベーン／６０／０８ ＨＡ１は、トリプシン感受性であり、ミスフォールドしている（右パネル）。図２６Ｂおよび２６Ｃは、トリプシン耐性が様々な株に対して達成されることを例示する。図２６Ｂは、株Ａ／香港／４８０１／２０１４を示す。中性ｐＨで精製したＡ／香港／４８０１／２０１４（Ｈ３Ｎ２）はトリプシンに耐性であり、したがって正確にフォールドされている（左パネル）。酸性ｐＨで精製したＡ／香港／４８０１／２０１４の（Ｈ３Ｎ２）ＨＡ１は、トリプシン感受性であり、正確にフォールドされていない（右パネル）。

【0217】

類似のデータが、Ａ／ニューハンプシャー／１／２０１５およびＨ１Ｎ１サブタイプで得られた。他の株のように、酸精製したＨ１Ｎ１は、ミスフォールドしていた（データ不掲載）が、中性ｐＨで精製したタンパク質はトリプシン耐性であり正確にフォールドされていた。

【0218】

市販インフルエンザワクチンとの比較
組換えインフルエンザワクチンを産生するためのこれまでのアプローチは、幅広い成功を満たさなかった。卵産生または組換え産生インフルエンザワクチンが、トリプシン耐性を呈したかどうか調査するために、上記と同じプロトコールを使用して卵産生および組換
えワクチン（それぞれ、Ｆｌｕｚｏｎｅ（登録商標）およびＦｌｕｂｌｏｋ（登録商標））においてトリプシン感受性を比較した。特に、希釈していないワクチンを、様々な量のトリプシンと３７℃で６０分間インキュベートし、次いで、トリプシン阻害剤を添加し、２×試料緩衝液を添加し、ＳＤＳページの前に７０℃で１０分間加熱した。

【0219】

卵産生された改変体が、トリプシン耐性を示すことが判明した。特に、ＨＡ１およびＨＡ２およびＨＡ１に切断される市販の三価卵由来高用量Ｆｌｕｚｏｎｅワクチンは、トリプシン消化に耐性である。対照的に、市販の三価組換えＨＡ Ｆｌｕｂｌｏｋワクチンは、トリプシンに曝露した場合、ＨＡ１およびＨＡ２およびＨＡ１ポリペプチドに変換され、トリプシンに感受性である。図２７（右パネル）。これらの結果は、株のうち少なくとも１つが、おそらくｐＨ５．８９での精製により変性することを実証している（例えばＷａｎｇら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２４巻（２００６年）；２１７６頁を参照のこと）。

【0220】

したがって、市販の組換えインフルエンザワクチンは、低ｐＨ条件下での産生に起因し得るミスフォールディングに悩まされ、これがおそらく、少なくとも部分的には、免疫原性が不十分であり、現在まで広く採用されていないことの理由である。

【0221】

対照的に、本明細書に開示される方法により、少なくともｐＨ７．０の緩衝液を使用してＨＡナノ粒子を精製することによって、精製の間にＨＡタンパク質を酸性条件に曝露する場合に起こるＨＡタンパク質のミスフォールディングが減少または排除されることが確認される。

【0222】

（実施例１５）
エボラウイルス糖タンパク質ナノ粒子の構築
２０１４Ｍａｋｏｎａエボラウイルスの野生型、全長、無改変ＥＢＯＶ糖タンパク質（ＧＰ）遺伝子を、組換えバキュロウイルスにクローニングし、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９昆虫細胞において発現させた。発現後、Ｎ末端シグナルペプチドを切断し、成熟タンパク質を精製し、ナノ粒子を形成させる。精製エボラウイルスＧＰ（ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ）ナノ粒子は、球状粒子３６±４ｎｍ（動的光散乱により測定して）にアセンブルした複数のＧＰ三量体で構成される。組換えＧＰナノ粒子は、２～９または最高１５個の外側に広がる「杯様の」糖タンパク質１（ＧＰ１）三量体「付着サブユニット」と共に糖タンパク質２（ＧＰ２）「融合サブユニット」を含有するコア領域を有する。

【0223】

マトリクスＭを同時投与する場合、個別に形成したサイズ４０ｎｍのマトリクス粒子の２つの集団からなるサポニンベースアジュバントを使用した。使用したマトリクスＭは、８５％マトリクスＡおよび１５％マトリクスＣであった。マトリクス粒子を、コレステロールおよびリン脂質とＱｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ由来の精製サポニンとを製剤化することにより形成した。

【0224】

（実施例１６）
免疫化およびプロトコール
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６～８週齢；Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）を、１０匹の群で飼育し、皮下（ＳＣ）または筋肉内（ＩＭ）投与により免疫化した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）をプラセボとして使用した。血清のための血液試料を、後眼窩経路によって採集した。採血の前に、動物をイソフルランで麻酔した。

【0225】

０および２１日目に、マウス（群当たりｎ＝１０）を、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４（５０μｇ）もしくはマトリクスＭアジュバント（２．５μｇまたは５μ
ｇ）と混合してＩＭ投与（５０μｌ注射体積）により免疫化した。血液試料を、０、１４、２１、２８および６０日目に採集した。脾臓および骨髄試料を、２８および６０日目に採集した。脾臓および骨髄試料を、さらなる調製用として２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＰＢＳに懸濁した。

【0226】

２８日目の血清試料を、Ｕ．Ｓ． Ａｒｍｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、ＭＤで偽ビリオン中和レポータアッセイを使用して抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ中和抗体応答について評価した。バネで動くジェット式注射器を使用して送達されるハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）ＤＮＡワクチンは、ウサギおよび非ヒト霊長類において強力な中和抗体応答を引き起こす。Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２０１４年；１４巻：２００～２１０頁。このアッセイのために、水疱性口炎ウイルスＧタンパク質を除去し、ルシフェラーゼレポータと置き換えた。このＶＳＶルシフェラーゼ発現コアを、Ｚａｉｒｅエボラウイルス１９７６（Ｍａｙｉｎｇａ）ＧＰを発現するプラスミドｐＷＲＧ／ＥＢＯＶ－Ｚ７６（ｏｐｔ）を使用して偽型化した。偽型化エボラＧＰを得るために使用したプラスミドは、Ｚａｉｒｅエボラウイルス１９７６（Ｍａｙｉｎｇａ）ＧＰを発現するｐＷＲＧ／ＥＢＯＶ／Ｍａｋ－Ｚ７６（ｏｐｔ）であった。ＰｓＶｓを２９３Ｔ細胞において調製した。マウス血清を、５６℃で３０分間熱不活性化し、次いで最初の１：２０希釈物を調製し、続いて１０％（体積／体積）熱不活性化ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（ｃＥＭＥＭ）で補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に５倍段階希釈した。エボラＧＰ ＰｓＶｓを、ｃＥＭＥＭ中に希釈した。等体積の４×１０^３フォーカス形成単位を含有するＰｓＶｓ溶液および１０％モルモット補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を、最終的な開始希釈１：４０で血清希釈物に添加し、次いで４℃で終夜インキュベートした。透明底の黒色９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種した単層のベロ細胞に、各ＰｓＶｓ－血清混合物５０μｌを感染させ、次いで３７℃でさらに１８～２４時間インキュベートした。培地を捨て、細胞を溶解し、Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ＃Ｅ２８２０）のプロトコールに従ってルシフェラーゼ基質を添加した。フラッシュルシフェラーゼシグナルを、Ｔｅｃａｎ Ｍ２００マイクロプレートリーダを使用して測定した。生の値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．０４に転送し、データを無処置のＰｓＶｓシグナルに対してベースライン修正した。データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して４パラメーターロジスティック非線形回帰モデルに当てはめ、次いでＰｓＶＮＡ ５０％（ＰｓＶＮＡ５０）中和力価を各試料について曲線から補間した。各試料を、３つ組で分析した。アッセイ陽性対照は、ｐＷＲＧ／ＥＢＯＶ－Ｚ７６（ｏｐｔ）、Ｚａｉｒｅエボラウイルス１９７６ Ｍａｙｉｎｇａ ＧＰ ＤＮＡワクチンで３回ワクチン接種したウサギ由来の血清であった。

【0227】

ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的血清抗体を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により定量化した。簡潔には、ＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレートを、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ（Ｎｏｖａｖａｘ）２μｇ／ｍＬで、２～８℃で終夜コーティングした。反応していない表面を、ＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて室温（ＲＴ）で１時間ブロッキングした。プレートを、１：１００から開始する５倍段階希釈の血清試料（２時間）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（またはＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）（１時間）、ペルオキシダーゼ基質３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｓｉｇｍａ）（１０分間）、およびＴＭＢ Ｓｔｏｐ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｃｙ Ｔｅｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とＲＴで順次反応させた。ＨＲＰコンジュゲートおよびＴＭＢ試薬を添加する前に、プレートを、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で３回洗浄した。

【0228】

プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｐｌｕｓ プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で、４５０ｎｍで読み取った。ＳｏｆｔＭａｘプロソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、濃度応答を４パラメーター適合曲線に当てはめた。抗体力価を、５０％の最大抗体結合（ＥＣ_５０）応答がある最も高い希釈の逆数と定義した。血清ＩｇＧ力価が、低い検出範囲外にある場合、力価（開始希釈）＜１００を記録し、値５０を試料に割り当てて、群幾何平均力価（ＧＭＴ）を算出した。ＩＢＴ Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）からのマウス抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（４Ｆ３）を、陽性対照として使用した。

【0229】

ＩＦＮγおよびＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧ分泌細胞を評価するＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
単一細胞懸濁物を、注射器のプランジャを使用して組織を穏やかに粉砕することにより個々の脾臓から調製した。単一骨髄細胞懸濁物を、２１ゲージ針の注射器を使用して２％
ＦＢＳを含有するＰＢＳを骨に流すことにより調製した。細胞を、２％ ＦＢＳを含有するＰＢＳで２回洗浄し、計数した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを、製造業者の手順に従ってマウスＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実施した。簡潔には、抗ＩＦＮγ抗体（ＰＢＳ中に１５μｇ／ｍｌ）を使用して、ＥＬＩＳＰＯＴプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を１００μｌ／ウェルで、４℃で終夜コーティングした。プレートを、ＰＢＳで４回洗浄し、ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％ ＦＢＳを用いて室温で１～２時間ブロッキングした。体積２００μｌ中の合計３×１０^５個の脾細胞を、完全なＥＢＯＶ ＧＰ配列を網羅する１１個の重なり合ったアミノ酸を含む１５マーのＥＢＯＶ ＧＰペプチドプール（２．５μｇ／ｍｌ）で刺激した。イオノマイシン（２００ｎｇ／ｍｌ）を加えたホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照としておよび培地を陰性対照として使用した。各刺激条件を、３つ組で実施した。アッセイプレートを、５％ ＣＯ_２インキュベータ中で、３７℃で終夜インキュベートし、シグナルを、製造業者の指示に基づいて発色させた。スポットを、ＥＬＩＳＰＯＴリーダーおよびＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｔｄ．、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＯＨ）を使用して計数し、分析した。エボラＧＰ特異的スポット数を、ＧＰペプチド刺激したウェルから培地対照のバックグラウンド数を減算することにより得た。グラフに示すデータは、３つ組のウェルの平均である。ＧＰ特異的ＩｇＧ分泌細胞を測定するために、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ
ＧＰ（ＰＢＳ中に２．５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。プレートを洗浄し、上記の通りブロッキングした。ウェル当たり３～５×１０^５個の脾細胞または骨髄細胞の３つ組を平板培養し、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。２日目にプレートを洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを添加し、１．５時間インキュベートした。スポットを発色させ、上記の通り計数した。３つ組ウェルから平均スポット数を算出し、示した。

【0230】

細胞表現型に対する表面染色およびサイトカインに対する細胞内染色
表面染色の場合、細胞を、抗ＣＤ１６／３２抗体（クローン２．４Ｇ２）と最初にインキュベートして、Ｆｃ受容体をブロッキングした。胚中心細胞を特徴付けるために、新鮮な脾細胞１×１０^６個を、以下の抗体：Ｂ２２０－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１９－ＡＰＣ、ＧＬ７－ＢＶ４２１、ＣＤ９５－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）の混合物および黄色ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ）と４℃で３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、分析のために２％ ＦＢＳを含有するＰＢＳに懸濁した。濾胞性ヘルパーＴ細胞を染色するために、１×１０^６個の新鮮な脾細胞を、ＣＸＣＲ５－ビオチンとインキュベートし、２回洗浄し、次
いでＣＤ３－ＢＶ６５０、Ｂ２２０－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１、ＰＤ－１－ＡＰＣ、ＣＤ６９－ＦＩＴＣおよびＣＤ４９ｂ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ）を含む抗体の混合物ならびに黄色ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とインキュベートした。細胞を２回洗浄し、分析のために２％ ＦＢＳを含有するＰＢＳに懸濁した。

【0231】

サイトカインに対する細胞内染色のために、脾細胞をウェル当たり１×１０^６個細胞で、９６ウェルＵ底プレート中で培養した。ＥＬＩＳＰＯＴ培養について記載した通りにペプチド刺激を実施した。プレートを、ＢＤ ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）およびＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、３７℃で６時間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、ＣＤ３－ＢＶ ６５０、ＣＤ４－ＰｅｒＣＰ、ＣＤ８－ＦＩＴＣ、ＣＤ４４－ＡＰＣ－Ｃｙ７およびＣＤ６２Ｌ－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ
Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＣＡ）を含む細胞表面マーカーに対する抗体の混合物ならびに黄色ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＹ）と４℃で２０分間インキュベートした。２回の洗浄後、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により４℃で３０分間固定し、続いてＢＤ
Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で２回洗浄した。細胞を、ＩＦＮγ－ＡＰＣ、ＩＬ－２－ＢＶ ４２１およびＴＮＦα－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体と４℃で終夜インキュベートした。細胞を洗浄し、データ取得のために１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁した。全ての染色試料を、ＬＳＲ－Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して取得し、データをＦｌｏｗｊｏソフトウェアバージョンＸｖ１０（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で分析した。

【0232】

統計的分析を、ＳＡＳソフトウェアバージョン９．４を使用して実施した。ＡＮＯＶＡからのテューキー調整によるペアワイズ比較は、独立変数として群および従属変数として対数変換した力価結果を使用して、群間の有意性を決定した。

【0233】

（実施例１７）
ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ誘導抗体応答および防御効力
ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰナノ粒子ワクチンの免疫原性を、マウスモデルにおいて、アジュバントありおよびなしで評価した。０、１４および２８日目に、マウスを、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはマトリクスＭもしくはＡｌＰＯ_４アジュバント中に製剤化したＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ５μｇでＳＣ注射によりワクチン接種した。２８日目（第２の免疫化の１４日後）に得られた血清の分析は、マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰが、幾何平均力価（ＧＭＴ）２６，９９１でＭａｙｉｎｇａ ＧＰに対する高レベルの抗原特異的ＩｇＧ抗体を誘導したことを示した。マトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰによる免疫化後に得られた応答は、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独（ＧＭＴ＝２６６、ｐ＝０．００１）またはＡｌＰＯ_４でアジュバント化したＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ（ＧＭＴ＝４３６、ｐ＝０．０００１）により誘導されるそれより有意に高かった（図２８Ａ）。ＡｌＰＯ_４アジュバントは、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独との比較において抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ＩｇＧのわずかな増加しか提示しなかった。

【0234】

２８日目の血清の中和活性を、エボラＧＰ偽ビリオン（ＰｓＶｓ）を使用して分析した（図２８Ｂ）。アジュバントがない場合、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独で免疫化したマウス由来の血清における中和ＧＭＴ力価は１９７であり、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰをＡｌＰＯ_４でアジュバント化した場合、より低い力価が観察された（ＧＭＴ＝４９、ｐ＝０．１）。マトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の血清において観察された中和力価は、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独で得たそれより３２倍高い６，４６３のＧＭＴを有した。このアッセイにおいて、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ２０１４株ＧＰを発現
しているＰｓＶｓは利用できなかったので、ＥＢＯＶ １９７６ Ｍａｙｉｎｇａ株ＧＰを発現しているＰｓＶｓを使用した。したがって、アッセイは、Ｍａｙｉｎｇａ ＧＰに対する抗ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰの交差中和活性を測定している。

【0235】

２８日目に行った３回目のワクチン接種の２週間後の４２日目に、マウスを、マウス適応Ｚａｉｒｅエボラウイルス株１９７６ Ｍａｙｉｎｇａ １，０００ｐｆｕの腹腔内接種によりチャレンジした。対照マウスは３日後に感染のため死亡し始めたが、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４でアジュバント化したＥＢＯＢ／Ｍａｋ ＧＰでワクチン接種したマウスは、それぞれ５または６日目に死亡した。チャレンジ感染の２１日後に、マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰでワクチン接種したマウスの全ておよびＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独でワクチン接種したマウス１匹が、生存し、健康であった。対照的に、エボラウイルス感染により他の全てのマウスは死亡したまたは８日目までに安楽死された（図２８Ｃ）。

【0236】

（実施例１８）
エボラＧＰ ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答の動態
マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰに対する免疫応答をさらにより詳細に特徴付けるために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（１０匹／群）の２つの群を、マトリクスＭ
２．５または５μｇいずれかでアジュバント化したＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ ５μｇで注射した。ＰＢＳ、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで注射したマウスの群を対照として使用した。１４、２１、２８および６０日目に、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧおよびＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）を、ＥＬＩＳＡにより測定した。

【0237】

第１の注射の１４日後に、マトリクスＭ（２．５または５μｇ）を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで注射した全てのマウスが、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧで応答した（それぞれＧＭＴ＝７５５および１，４９９、データ不掲載）。ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ群およびＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ群中の１０匹のマウスのいずれも、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧを生成しなかった（データ不掲載）。２１日目までに、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰに対するＩｇＧ応答は、マトリクスＭ－アジュバント化群においてさらに増加した（図２９Ａ）。ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを与えた群において、応答はまだなかった。２１日目に全てのマウスが、第２の注射を受けた。２８日目に、マトリクスＭ（２．５または５μｇ）を受けたマウスにおいてそれぞれ３．０×１０^５および４．９×１０^５のＥＬＩＳＡ ＧＭＴ力価でＩｇＧ応答に強い増加があった（図２９Ａ）。２８および６０日目に、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独およびＡｌＰＯ_４を含む群において特異的ＩｇＧ応答が、数匹のマウスに検出されたが、マトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウスより著しく低かった（図２９Ａ）。６０日目までに、マトリクスＭ ２．５または５μｇを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰにより誘導された抗ＧＰ ＩｇＧ力価は、２８日目と比較して著しく減少せず、ＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ群よりそれぞれ６７倍および１３９倍高かった（図２９Ａ）。

【0238】

ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ応答も決定した。全ＩｇＧと類似して、マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰワクチンは、２８および６０日目に高い抗ＧＰ ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａレベルを誘導した（図２９Ｂおよび２９Ｃ）。対照的に、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独を与えられたマウス１０匹のうち１匹だけおよびＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを与えられたマウス１０匹のうちの４匹が、２８日目に低レベルのＩｇＧ１を産生した（図２９Ｂ）。６０日目に、抗原特異的ＩｇＧ１が、ＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを与えられた群内で残っているマウス５匹全てからの血清中に検出されたが、平均力価は、マトリクスＭ ２．５または５
．０μｇを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを与えられた群のそれぞれ５１分の１および４１分の１であった（図２９Ｂ）。さらに、２８および６０日目に、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独は、検出可能なＩｇＧ２ａ抗体を誘導しなかった。

【0239】

（実施例１９）
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋および多機能性Ｔ細胞応答
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰペプチドによる脾臓細胞のｅｘ ｖｉｖｏ刺激後のＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の数を測定することにより、異なるＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ製剤に対するＴ細胞応答を次に評価した。２８日目に、ＩＦＮγ分泌細胞は、マトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の脾臓においてマトリクスＭ用量依存的な様式で増加した（図３０Ａ、３０Ｂ）。マトリクスＭ ５．０および２．５μｇを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを受けた群におけるＩＦＮγ分泌細胞の平均数は、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独を受けた群よりそれぞれ１７倍および１０倍高く、ＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを受けた群よりそれぞれ８倍および５倍高かった（図３０Ａ）。

【0240】

６０日目までに、マトリクスＭ ５μｇを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の脾臓におけるＩＦＮγ分泌細胞の数は、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独で免疫化したマウス由来の脾臓よりなお１２倍高く、ＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の脾臓より３倍高かった（図３０Ｂ）。マトリクスＭ ２．５μｇを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の脾臓におけるＩＦＮγ分泌細胞の増加数も６０日目に維持されたが、マトリクスＭ ５μｇを含むそれより低レベルであった。

【0241】

細胞表面マーカーと組み合わせたサイトカインの細胞内染色により、マトリクスＭ誘導ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答をさらに評価した。２８日目に、フローサイトメトリーによる染色による脾細胞の分析は、マトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ群からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両方が、ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２を分泌することを示した（図３０Ｃおよび３０Ｄ）。サイトカイン分泌ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、対照マウス、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを受けたマウスにおいて観察されたベースラインまたは最小の応答よりマトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ群由来の脾臓において非常に高かった（図３０Ｃおよび３０Ｄ）。２つまたはそれよりも多いサイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦαおよびＩＬ－２）を同時に産生するＴ細胞の頻度も、２８日目に評価した。２つまたは３ついずれかのサイトカインを産生するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、マトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の脾臓においてだけ著しいレベルで検出された。

【0242】

（実施例２０）
胚中心および濾胞性ヘルパーＴ細胞応答
脾臓におけるＧＣ Ｂ細胞の頻度および絶対数を、フローサイトメトリーによる染色により分析した（図３１Ａ）。分析は、２８日目（第２のワクチン注射の７日後）に、マトリクスＭ ２．５および５μｇでアジュバント化したＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰが、プラセボ、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ（それぞれ、０．３８、０．４１および０．４４％）と比較してそれぞれ１．２２および２．１２％のＧＣ頻度で応答を誘導したことを示した（図３１Ｂ）。したがって、脾臓におけるＧＣ細胞絶対数も、マトリクスＭを受けた群で増加した（図３１Ｃ）。６０日目までに、頻度および絶対数は、バックグラウンドレベルに戻った（図３１Ｄおよび３１Ｅ）。

【0243】

２８日目におけるＴ_ＦＨ細胞頻度の分析は、マトリクスＭ ２．５または５μｇを含む
ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰが、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４を含むそれより高いＴ_ＦＨ細胞の頻度を誘導することを示した（図３２Ａおよび３２Ｂ）。したがって、Ｔ_ＦＨ細胞の絶対数もまた、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独またはＡｌＰＯ_４を含むそれと比較してマトリクスＭを含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰによって増強された（図３２Ｃ）。６０日目までに、Ｔ_ＦＨ細胞の頻度および絶対数は、バックグラウンドに近いレベルに後退した（図３２Ｄおよび３２Ｅ）。

【0244】

（実施例２１）
ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的形質細胞
ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的形質細胞に対するマトリクスＭの影響を評価するために、脾臓および骨髄中のＩｇＧ産生細胞の数を、免疫化後６０日目に分析した。６０日目における分析は、マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰワクチンで免疫化したマウス由来の脾臓中のごく少数のＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧ分泌細胞（＜６／１０^６個脾細胞）を実証した（図３３Ａ）。ＩｇＧ分泌細胞は、ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ単独およびＡｌＰＯ_４を含むＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰで免疫化したマウス由来の脾臓中には検出されなかった（図３３Ａ）。対照的に、多数のＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰ特異的ＩｇＧ分泌細胞が、マトリクスＭアジュバント化ＥＢＯＶ／Ｍａｋ ＧＰを受けたマウス由来の骨髄に見られ（図３３Ｂ）、長命形質Ｂ細胞の形成が実証された。

【0245】

（実施例２２）
ナノ粒子に対する抗体結合の特徴付け
ナノ粒子に結合するいくつかの抗エボラ抗体の能力を試験した。抗体は、１３Ｃ６、１３Ｆ６、６Ｄ８およびＫＺ５２である。ＥＣ５０曲線および値を図３６に示し、追加の結合動態データを図３７に示す。図３８は、参照として１３Ｃ６を使用した有効性データを示す。４つの抗体のうちの３つは、ＧＰに対して優れた結合を呈した。

【0246】

（実施例２３）
非ヒト霊長類研究：ヒヒ
非ヒト霊長類モデルにおいてマウスで得られた結果を確認するために、ヒヒ研究を実施した。研究を、図３９に示すように設計した。４つの群を形成した。群１は、対照であった。群２は、ＡｌＰＯ_４を含む抗原を受けた。群２および３は、５０μｇのマトリクスＭとともに抗原をそれぞれ６０μｇおよび５μｇ受けた。ヒヒを、０および２１日目に免疫化した。強い応答が、Ｍａｋｏｎａ ＧＰおよびＭａｙｉｎｇａ ＧＰ両方に対して得られた。図４０を参照のこと。追加の分析により、応答が長く続くことを確認した。図４１は、後の時点でのＭａｋｏｎａに対するＩｇＧのＥＣ５０値を示す。データは、応答が持続的であることを確立する。

【0247】

追加の研究により、ＩＦＮγレベルが、免疫化後に実質的に増加することが確認される。図４２は、ＧＰと組み合わせたマトリクスＭが、ミョウバンアジュバントと組み合わせるよりも一層増加させたことを示す。興味深いことに、低用量のＧＰ ５μｇが、ＩＦＮγレベルの一層顕著な増加をもたらした。Ｔ細胞におけるＴＮＦαおよびＩＦＮγ応答を図４３に示し、サイトカイン応答を図４４に示した。また応答は、各場合においてミョウバンよりＧＰおよびマトリクスＭで一層顕著である。これらのデータは、ヒヒモデルにおける開示した製剤の強い免疫応答を強調する。

【0248】

（実施例２４）
非ヒト霊長類研究：マカク研究１
ナノ粒子による防御効果をさらに確認するために、図４５に表示するようにマカク研究を実施した。示した通り０および２１日目にマカクをワクチンで筋肉内に免疫化し、４２日目にチャレンジした。抗ＧＰ応答を、０および２８日目に測定した。図４６が示すよう
に、免疫化したマカクは抗ＩｇＧ抗体の劇的な誘導を示した。免疫応答を、図４７に示すように特徴付けた。様々なペプチドプールに応答するＩＦＮγ分泌細胞を、０、３および５週目に測定した。結果は、免疫化されたマカクが、免疫化されたマカクにおいてＩＦＮγ分泌細胞を誘導したことを実証する。

【0249】

動物の生存は注目に値する。図４８。７日目までに、プラセボ処置マカクにおけるエボラウイルス量は、１０^７であった。９日目までに、プラセボ動物を安楽死させた。対照的に、処置した動物の１００％が生存した。注目すべきことに、免疫応答は、ほとんど全ての時点でほとんど全ての動物においてウイルス量をＲＴ－ＰＣＲによって検出不可能にすることができた。動物３３３６２は、７日目に検出可能限界を約１０％上回るウイルス量を示した。しかしながら、１０日目までに、レベルはそれを検出するアッセイの能力が及ばないレベルまで下落した。

【0250】

（実施例２５）
非ヒト霊長類研究：マカク研究２
第２の研究を、マカクにおいて実施した。０週目に、動物にＧＰ ５μｇ＋マトリクスＭ ５０μｇを投薬し、３週目または６週目のいずれかに追加のブーストを行った。次いで、免疫化した動物を、それぞれ９週目および１２週目に野生型エボラウイルスでチャレンジした。図４９。

【0251】

ＩｇＧに対するＥＬＩＳＡデータを、図５０に示す。左パネルは、第１の注射の３週間後に、高い力価が現れ、持続的であったことを示す。右パネルは、投与と投与の間に６週間の空きがある動物における結果を例示する。それらの動物は、第２のブースター投与の２週間後に実質的な増加を示し、プライムブーストアプローチの有益な効果を例示した。

【0252】

ワクチン組成物は、マカクにおいて完全に防御的であった。生ウイルスによるチャレンジの１８日後に、生理食塩水対照処置マウスは全て死亡した。対照的に、ワクチン組成物で免疫化したマカクの１００％が、チャレンジに耐えた。まとめると、これらのデータにより、ブースト投与が３週間以内または６週間以内にあるかどうかに関わらず、組成物により刺激された免疫応答は防御的であることが確認される。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図18C】

【図18D】

【図18E】

【図18F】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図19E】

【図19F】

【図19G】

【図19H】

【図19I】

【図19J】

【図20】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23A】

【図23B】

【図23C】

【図23D】

【図23E】

【図23F】

【図24A】

【図24B】

【図24C】

【図25A】

【図25B】

【図25C】

【図25D】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30-1】

【図30-2】

【図31-1】

【図31-2】

【図32-1】

【図32-2】

【図33】

【図34A】

【図34B】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40A】

【図40B】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47-1】

【図47-2】

【図47-3】

【図48】

【図49】

【図50】

【配列表】

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