▶ メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-26
(45)【発行日】2024-04-03
(54)【発明の名称】ＭＡＧＥＡ１０特異的Ｔ細胞受容体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240327BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20240327BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240327BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240327BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240327BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240327BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240327BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/725 ZNA
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2022500846
(86)(22)【出願日】2020-07-08
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-10-17
(86)【国際出願番号】 EP2020069246
(87)【国際公開番号】W WO2021005108
(87)【国際公開日】2021-01-14
【審査請求日】2022-06-14
(31)【優先権主張番号】19185192.2
(32)【優先日】2019-07-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】517419917
【氏名又は名称】メディジーン イミュノテラピーズ ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100110663
【弁理士】
【氏名又は名称】杉山 共永
(72)【発明者】
【氏名】ゾンメルメイヤー，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】エリンガー，クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ブラヒャー，アリーネ
(72)【発明者】
【氏名】ムムメルト，クリスティアーネ
(72)【発明者】
【氏名】プラスマイヤー，ラウラ
(72)【発明者】
【氏名】プツハンメル，ラファエラ
(72)【発明者】
【氏名】ゼンメルマン，アレクサンドラ
【審査官】北田 祐介
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５３３６９８（ＪＰ，Ａ）
【文献】Cancer Biology & Therapy，2011年，11:4，395-400
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ０７Ｋ １４／００－１６／４６
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＡＧＥＡ１０に対して特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、並びに、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含み、
前記ＴＣＲは、他のＭＡＧＥＡファミリーのメンバーに対する交差反応性を有さない、前記単離されたＴＣＲ。
【請求項2】
アミノ酸配列である配列番号１またはその断片を特異的に認識する、請求項１に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項3】
配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する、請求項１または２に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項4】
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０４からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、請求項１から３のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項5】
配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む、請求項１から４のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項6】
請求項１から５のいずれかに記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、前記機能性部分が、配列番号２、３、４、５、６および７のアミノ酸配列を含み、前記機能性部分は、ＴＣＲの抗原への結合を媒介する、前記単離されたポリペプチド。
【請求項7】
請求項１から５のいずれかに記載のＴＣＲを少なくとも２つ含む多価ＴＣＲ複合体。
【請求項8】
ＩＦＮ－γ分泌が、前記ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列への結合によって誘導される、請求項４に記載の単離されたＴＣＲ。
【請求項9】
請求項１から５のいずれかに記載のＴＣＲをコードするかまたは請求項６に記載の単離されたポリペプチドをコードする核酸。
【請求項10】
請求項９に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項11】
請求項１から５のいずれかに記載のＴＣＲを発現する細胞。
【請求項12】
医薬として使用するための、請求項１１に記載の細胞であって、エフェクター細胞である、前記細胞。
【請求項13】
前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、肉腫および骨肉腫からなる群から選択されるがんの処置において使用するための、請求項１１に記載の細胞であって、エフェクター細胞である、前記細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＭＡＧＥＡ１０由来のペプチドに対して特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドに関する。さらに、多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、ＴＣＲを発現する細胞およびＴＣＲを含む医薬組成物に関する。本発明はまた、医薬として使用するためのＴＣＲ、特に、がんの処置において使用するためのＴＣＲに関する。
【背景技術】
【0002】
メラノーマ関連抗原１０とも呼ばれるＭＡＧＥＡ１０は、互いに高い相同性を有するいくつかのタンパク質をコードするＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーのメンバーである。ＭＡＧＥＡ抗原は、がん／精巣抗原（ＣＴＡ）のファミリーに属し、分子レベルで同定された最初のヒト腫瘍関連抗原であった（Science 1991. 254: 1643-1647/ republished in J. Immunol. 2007; 178:2617-2621）。ＭＡＧＥＡ遺伝子ファミリーは、第Ｘｐ２８染色体に位置する１２個の相同性の高い遺伝子を含む。これらの発現は、非小細胞肺がん、膀胱がん、食道、頭頚部がんおよび肉腫、ならびにメラノーマ、ある特定の種類の乳がんなどの様々な組織学的起源のがんにおいて、また生殖細胞において（Front Med (Lausanne). 2017; 4: 18.）、一貫して検出される。ＭＡＧＥＡ１０は、細胞質（cytosolic）／細胞質（cytoplasmic）タンパク質であり、ＭＡＧＥＡ１０タンパク質に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩバックグラウンドで、すなわち、ＨＬＡ分子上に提示される。より詳細には、ＭＡＧＥＡ１０由来のエピトープは、ＨＬＡ－Ａ２分子上に提示され、がん免疫療法に関する標的としてのそれらの適合性が示される。免疫療法の技術分野における複数の臨床試験が既に、ＭＡＧＥＡタンパク質を標的として行われている（clinicaltrials.gov）。ＭＡＧＥＡ１０は、Ｔ細胞媒介免疫療法に対する有望な標的である。養子細胞移入（ＡＣＴ）を使用するがん免疫療法の原理は、患者自身の免疫系を利用する高度に腫瘍特異的ながん処置を可能にする。ＡＣＴは、ＭＡＧＥＡ１０のような細胞内タンパク質に由来する既定のエピトープに対する特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作された、ｅｘ ｖｉｖｏで拡大された自己の（患者由来の）Ｔ細胞を使用する。よって、腫瘍特異的／拘束性抗原であるＭＡＧＥＡ１０のみを標的とし、したがって、がん免疫療法に対する並外れた可能性を有する効率性の高いＴＣＲに対する需要が依然として存在する。よって、ＭＡＧＥＡ１０を標的とするこのような特異的ＴＣＲに対する需要が存在する。
【発明の概要】
【0003】
本発明の１つの目的は、ＭＡＧＥＡ１０に対して特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の提供である。
【0004】
具体的な実施形態では、単離されたＴＣＲは、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖と、配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む。
【0005】
ＴＣＲは、アミノ酸配列である配列番号１またはその断片を特異的に認識する。具体的な実施形態では、ＴＣＲは、配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する。より詳細には、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０４からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識し、より好ましくは、ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する。
【0006】
断片は、この抗原に対して特異的な、すなわち、哺乳動物の、特にヒトの別のタンパク質またはペプチドでは生じない抗原の配列であり得る。断片は、抗原の配列よりも短くてもよく、例えば抗原よりも少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％短くてもよい。断片は、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５アミノ酸またはそれより多いアミノ酸の長さを有してもよい。
【0007】
好ましくは、ＴＣＲは、他のＭＡＧＥＡファミリーのメンバーに対する交差反応性を有さない。
【0008】
本発明の別の目的は、ＭＡＧＥＡ１０に対して特異的である機能性ＴＣＲを発現するＴ細胞の提供である。
【0009】
本発明によるＴＣＲは、単離および／または精製され、可溶性であるかまたは膜に結合してもよい。
【0010】
一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型に影響しない（phenotypically silent）置換を含んでもよい。さらに、本発明のＴＣＲを検出可能な標識で標識することができる。さらに、またはあるいは、アミノ酸配列は、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変され得る。治療剤は、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択されてもよい。免疫エフェクター分子は、例えば、サイトカインであってもよい。薬物動態改変部分は、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。
【0011】
ＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲの可溶性形態は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するかもしくは活性化するために、またはトランスジェニックＴＣＲ自体を遮断するかもしくは活性化するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本発明において予想される。
【0012】
薬物または治療実体、例えば、ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に対して小分子化合物を添加することも考えられる。
【0013】
ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。
【0014】
一部の実施形態では、ＴＣＲは一本鎖タイプのものであり、ここで、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結されている。
【0015】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列のうちの１つを含み、好ましくは、機能性部分が、配列番号２、３、４および５、６、７のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドを指す。
【0016】
具体的実施形態では、機能性部分は、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。
【0017】
具体的実施形態は、本明細書に記載されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を指す。より具体的な実施形態では、前記ＴＣＲのうちの少なくとも１つに、治療剤が付随する。
【0018】
一部の実施形態は、機能性ポリペプチドまたは機能性多価ポリペプチドとして、エフェクター細胞、特に免疫エフェクター細胞上に発現される本発明のＴＣＲを指し、ここで、ＩＦＮ－γ分泌は、アミノ酸配列である配列番号１のＨＬＡ－Ａ２結合形態に結合した際にＴＣＲを発現する前述のエフェクター細胞において誘導される。
【0019】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードするかまたは上記のポリペプチドをコードする核酸を指す。
【0020】
本発明のさらなる態様は、上記の本出願の核酸を含むプラスミドまたはベクターを指す。好ましくは、ベクターは、発現ベクターまたは細胞、特に真核生物の細胞の形質導入もしくはトランスフェクションに好適なベクターである。ベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマーレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであってもよい。
【0021】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。細胞は、単離された初代細胞であっても天然に存在しなくてもよい。
【0022】
本発明の別の態様は、上記の核酸または上記のプラスミドもしくはベクターを含む細胞を指す。より詳細には、細胞は：
ａ）少なくとも１つの上記の核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含んでもよい。
ａ）少なくとも１つの上記の核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含んでもよい。
【0023】
細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。典型的には、細胞は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞である。他の好適な細胞型は、改変されたかまたは未改変の、ガンマ－デルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【0024】
別の態様は、ＭＡＧＥＡ１０に対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。具体的な実施形態では、ＭＡＧＥＡ１０特異性を媒介するＴＣＲの部分は、配列番号４のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＭＡＧＥＡ１０特異性を媒介するＴＣＲの部分は、配列番号２、３、４および５、６、７のアミノ酸配列を含む。
【0025】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載されている核酸、本明細書に記載されているベクター、本明細書に記載されている細胞、または本明細書に記載されている抗体を含む医薬組成物を指す。
【0026】
典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。
【0027】
本発明の別の態様は、医薬として使用するための、特にがんの処置において使用するための、本明細書に記載されているＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、本明細書に記載されている核酸、本明細書に記載されているベクター、本明細書に記載されている細胞、または本明細書に記載されている抗体を指す。がんは、血液がんであっても固形腫瘍であってもよい。がんは、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】ＭＡＧＥ－Ａ１０反応性ＴＣＲを形質導入したＣＤ８＋Ｔ細胞のＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体結合を示す図である。ＣＤ８Ｔ細胞を健康なドナーのＰＢＭＣから単離し、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲおよびＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬを認識しなかった陰性対照ＴＣＲを形質導入した。形質導入したＣＤ８Ｔ細胞を、形質導入のためのマーカーとしてマウス定常ベータ領域を使用するＦＡＣＳによって濃縮した。これらの細胞の拡大後に、これらを、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体（ＳＬＬ－四量体）ならびにＣＤ８およびマウス定常ベータ領域（ｍＣβ）に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。
【図2】ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、ＨＬＡ－Ａ２に提示されるＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを認識することを示すグラフである。トランスジェニックＴ細胞をＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを外部から負荷したＴ２細胞と共培養した。対照ペプチドを負荷したＴ２細胞を陰性対照として使用した。標的細胞の認識は、標準的なＥＬＩＳＡによって、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによって分析した。図２は、対照ＴＣＲがＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬエピトープを認識しないことも示す。
【図3A-3B】腫瘍細胞株に提示されたＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬを認識するＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞の能力を示すグラフである。トランスジェニックＴ細胞を異なるＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ陽性腫瘍細胞株と共培養した。陰性対照として、ＭＡＧＥ－Ａ１０を発現しない２種の細胞株（Ｍｅｌ６２４．３８および６４７Ｖ）を使用した。（Ａ）標準的なＥＬＩＳＡによって、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによってサイトカイン放出を分析した。（Ｂ）蛍光マーカーを安定して形質導入した腫瘍細胞株に対する細胞傷害性は、ＩｎｃｕＣｙｔｅで測定した。
【図4】ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲによるＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの認識を示すグラフである。トランスジェニックＴ細胞を異なるＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーを発現するＫ５６２細胞と共培養した。標準的なＥＬＩＳＡによって、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによってサイトカイン放出を分析した。
【図5A-5B】ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲに関するＨＬＡ微細分類（HLA-fine-typing）およびＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲの潜在的なアロ反応性の分析を示すグラフである。（Ａ）ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを負荷したかまたは（Ｂ）負荷していない異なるＨＬＡ－Ａ型を発現するＬＣＬのライブラリーを、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞または陰性対照ＴＣＲのいずれかと共培養した。陽性対照として、Ｔ２細胞に、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを外的に負荷した。標準的なＥＬＩＳＡによって、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによってサイトカイン放出を分析した。
【図6】ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲによる正常細胞の認識の分析を示すグラフである。トランスジェニックＴ細胞を、正常細胞およびＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを外的に負荷した正常細胞と共培養した。標準的なＥＬＩＳＡによって、共培養上清中のＩＦＮ－γ濃度を測定することによってサイトカイン放出を分析した。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本発明の詳細な記載
本発明が、その好ましい実施形態のうちのいくつかについて詳細に説明される前に、以下の一般的定義を提供する。
本発明が、その好ましい実施形態のうちのいくつかについて詳細に説明される前に、以下の一般的定義を提供する。
【0030】
以下に例示的に記載されるように、本発明は、本明細書において具体的に開示されていないいずれかの要素（単数または複数）、制限（単数または複数）の非存在下で、好適に実践され得る。
【0031】
本発明は、特定の実施形態に関しておよび特定の図を参照して記載されるが、本発明はそれらにではなく特許請求の範囲によってのみ限定される。
【0032】
本記載および特許請求の範囲において用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が使用される場合、それは他の要素を排除しない。本発明の目的のために用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、用語「を構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｏｆ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、群が少なくとも一定数の実施形態を含むと定義される場合、これは、好ましくはこれらの実施形態だけからなる群を開示するとも理解される。
【0033】
本発明の目的のために用語「得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ）」は、用語「得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ）」の好ましい実施形態であると考えられる。以下で、例えば抗体が具体的な供給源から得ることができると定義される場合、これはこの供給源から得られる抗体を開示するとも理解される。
【0034】
不定冠詞または定冠詞が単数名詞、例えば「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」を参照して使用される場合、これは、他に具体的に述べられている場合を除いてその名詞の複数を含む。本発明の文脈において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者が問題となる特質の技術的効果をまだ確保すると理解する正確さの区間を記す。用語は、±１０％、好ましくは±５％の示された数値からの偏差を典型的には示す。
【0035】
技術的用語は、それらの一般的な意味または当業者にとっての意味で使用される。具体的な意味が特定の用語によって伝えられる場合、用語の定義は以下にその用語が使用される文脈において与えられる。
【0036】
ＴＣＲバックグラウンド
ＴＣＲは、２つの異なる、別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）鎖およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方の再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、これらの中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方は、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質側末端で終わる。
ＴＣＲは、２つの異なる、別々のタンパク質鎖、すなわちＴＣＲアルファ（α）鎖およびＴＣＲベータ（β）鎖から構成される。ＴＣＲα鎖は、可変（Ｖ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲβ鎖は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常（Ｃ）領域を含む。ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方の再配列Ｖ（Ｄ）Ｊ領域は、超可変領域（ＣＤＲ、相補性決定領域）を含有し、これらの中で、ＣＤＲ３領域は、特異的エピトープ認識を決定する。Ｃ末端領域において、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の両方は、疎水性膜貫通ドメインを含有し、短い細胞質側末端で終わる。
【0037】
典型的には、ＴＣＲは、１つのα鎖と１つのβ鎖のヘテロ二量体である。このヘテロ二量体は、ペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合し得る。
【0038】
本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲα領域」または「ＴＣＲα可変鎖」または「可変ドメイン」は、ＴＣＲα鎖可変領域を指す。本発明の文脈における用語「可変ＴＣＲβ領域」または「ＴＣＲβ可変鎖」は、ＴＣＲβ鎖可変領域を指す。
【0039】
ＴＣＲ遺伝子座および遺伝子は、国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）ＴＣＲ学名命名法（ＩＭＧＴデータベース、www. IMGT.org；Giudicelli, V., et al.,IMGT/LIGM-DB, the IMGT(登録商標) comprehensive database of immunoglobulin and T cell receptor nucleotide sequences, Nucl. Acids Res., 34, D781-D784 (2006). PMID: 16381979；T cell Receptor Factsbook, LeFranc and LeFranc, Academic Press ISBN 0-12- 441352-8）を使用して命名される。
【0040】
標的
本明細書に記載のＴＣＲに対する標的は、ＭＡＧＥＡ１０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０１１５４３．２）由来のペプチドＳＬＬ（配列番号１）である。
本明細書に記載のＴＣＲに対する標的は、ＭＡＧＥＡ１０（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００１０１１５４３．２）由来のペプチドＳＬＬ（配列番号１）である。
【0041】
ＴＣＲ特異的配列
一部の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関し、ここで、
－ ＴＣＲα鎖は、配列番号４の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
一部の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関し、ここで、
－ ＴＣＲα鎖は、配列番号４の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
－ ＴＣＲβ鎖は、配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む。
【0042】
具体的な実施形態は、
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む単離されたＴＣＲを指す。
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７の配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む単離されたＴＣＲを指す。
【0043】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【0044】
好ましい実施形態は、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含むＴＣＲに関する。
【0045】
実施例において使用される本発明のＴＣＲは、配列番号４の配列を有する相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含むＴＣＲα鎖および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖を含む。特に、本発明のＴＣＲは、配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域を含む。
【0046】
実施例を見ると分かるように、本発明によるＴＣＲは、ＭＡＧＥＡ１０に対して特異的であり、他のエピトープまたは抗原に対しては非常に低い交差反応性しか示さない。
【0047】
他の実施形態は、配列番号１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲに関する。
【0048】
具体的な実施形態は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖を含むＴＣＲを指す。よって、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１の配列番号１のＭＡＧＥＡ１０ペプチドとの複合体に対して特異的である本明細書に記載のＴＣＲは、ＴＲＡＶ２９／ＤＶ５遺伝子によってコードされたＶα鎖およびＴＲＢＶ２４－１遺伝子によってコードされたＶβ遺伝子を含む。
【0049】
他の実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む単離されたＴＣＲを指し、ここで、
－ 可変ＴＣＲα領域は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４に示されるＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるＣＤＲ３領域を含む。
－ 可変ＴＣＲα領域は、配列番号８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４に示されるＣＤＲ３領域を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域は、配列番号９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるＣＤＲ３領域を含む。
【0050】
複数の配列間のパーセント同一性の決定は、好ましくは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ａｄｖａｎｃｅ（商標） １０プログラム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、ＵＳＡ）のＡｌｉｇｎＸアプリケーションを使用して達成される。このプログラムは、改変Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを使用する（Thompson et al., 1994. Nucl Acids Res. 22: pp. 4673-4680；Invitrogen Corporation；Vector NTI AdvanceTM10 DNA and protein sequence analysis software. User's Manual, 2004, pp.389-662）。パーセント同一性の決定は、ＡｌｉｇｎＸアプリケーションの標準パラメーターを用いて実施される。
【0051】
本発明によるＴＣＲは、単離または精製される。「単離される」は、本発明の文脈において、ＴＣＲが、元々天然に存在した状況下で存在しないことを意味する。「精製される」は、本発明の文脈において、例えば、ＴＣＲが、他のタンパク質およびＴＣＲが元々由来する細胞の非タンパク質部分を含まないかまたは実質的に含まないことを意味する。
【0052】
一部の実施形態では、ＴＣＲのアミノ酸配列は、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含んでもよい。
【0053】
「表現型に影響しない置換」は、「保存的アミノ酸置換」とも称される。「保存的アミノ酸置換」の概念は、当業者によって理解されており、好ましくは、正電荷残基（Ｈ、Ｋ、およびＲ）をコードするコドンは、正電荷残基をコードするコドンで置換され、負電荷残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンは、負電荷残基をコードするコドンで置換され、中性極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、およびＹ）をコードするコドンは、中性極性残基をコードするコドンで置換され、中性非極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、およびＷ）をコードするコドンは、中性非極性残基をコードするコドンで置換されることを意味する。これらのバリエーションは、自発的に生じてもよく、ランダム突然変異誘発によって導入されてもよく、または定方向突然変異誘発によって導入されてもよい。これらの変化は、これらのポリペプチドの本質的な特性を破壊することなくなされ得る。当業者は、バリアントアミノ酸および／またはそれらをコードする核酸を容易かつ日常的にスクリーニングし、これらのバリエーションがリガンド結合能を実質的に低下させるかまたは破壊するかどうかを当技術分野で公知の方法によって決定することができる。
【0054】
当業者は、ＴＣＲをコードする核酸も改変され得ることを理解する。核酸配列全体における有益な改変は、配列のコドン最適化を含む。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において行うべきではない。
【0055】
本発明の一部の実施形態によれば、ＴＣＲのアミノ酸配列は、検出可能な標識、治療剤または薬物動態改変部分を含むように改変される。
【0056】
検出可能な標識に関する非限定的な例は、放射標識、蛍光標識、核酸プローブ、酵素および造影試薬である。ＴＣＲに付随し得る治療剤としては、放射性化合物、免疫調節薬、酵素または化学療法剤が挙げられる。治療剤は、化合物が標的部位でゆっくり放出され得るように、ＴＣＲに連結したリポソームによって封入され得る。このことによって、体内での輸送中の損傷が避けられ、ＴＣＲの関連する抗原提示細胞への結合後に、治療剤、例えば、毒素が最大の効果を有することが保障される。治療剤の他の例は、
【0057】
ペプチド細胞毒素、すなわちリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅなどの、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有するタンパク質またはペプチドである。小分子細胞毒性剤、すなわち７００ダルトン未満の分子量を有する、哺乳動物の細胞を殺滅する能力を有する化合物。このような化合物は、細胞毒性作用を有することが可能な毒性金属を含有し得る。さらに、これらの小分子細胞毒製剤は、プロドラッグ、すなわち細胞毒性剤を放出するために、生理的条件下で、崩壊されるかまたは変換される化合物も含むことが理解されるべきである。このような薬剤としては、例えば、ドセタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラシェルマイシン、カリチアマイシン、エトポシド、イフォスファミド、イリノテカン、ポルフィマーナトリウム フォトフリンＩＩ、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート、ミトキサントロン、オーリスタチンＥ、ビンクリスチンおよびドキソルビシン；放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５およびアスタチン２１３が挙げられる。例えば、キレート剤、免疫刺激薬としても知られる免疫賦活剤、すなわち、免疫応答を刺激する免疫エフェクター分子によって放射性核種をＴＣＲまたはその誘導体に付随させ得る。例示的な免疫賦活剤は、ＩＬ－２およびＩＦＮ－γなどのサイトカイン、抗Ｔ細胞またはＮＫ細胞決定基抗体（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８または抗ＣＤ１６）を含む抗体またはその断片；抗体様結合特性を有する代替タンパク質足場；スーパー抗原、すなわちポリクローナルＴ細胞活性化および大量のサイトカイン放出をもたらすＴ細胞の非特異的活性化を引き起こす抗原、およびその変異体；ＩＬ－８、血小板因子４、メラノーマ成長刺激タンパク質などのケモカイン、補体活性化因子；異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌タンパク質ドメイン、ウイルス／細菌ペプチドである。
【0058】
ヒトＴリンパ球における抗原受容体分子（Ｔ細胞受容体分子）は、細胞表面でＣＤ３（Ｔ３）分子複合体と非共有結合により会合している。この複合体の抗ＣＤ３モノクローナル抗体による撹乱により、Ｔ細胞活性化が誘導される。よって、一部の実施形態は、抗ＣＤ３抗体、または前記抗ＣＤ３抗体の機能性断片またはバリアントと会合した（通常は、アルファまたはベータ鎖のＮまたはＣ末端への融合により）本明細書に記載されているＴＣＲを指す。本明細書に記載の組成物および方法において使用するのに好適な抗体断片およびバリアント／アナログとしては、ミニボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ＜’＞）２断片、ｄｓＦｖおよびｓｃＦｖ断片、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、ラクダ科動物（例えば、ラクダまたはラマ）抗体に由来する合成単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインを含む分子）ならびにドメイン抗体（親和性成熟単一免疫グロブリン可変重鎖ドメインまたは免疫グロブリン可変軽鎖ドメイン（Ｄｏｍａｎｔｉｓ（Ｂｅｌｇｉｕｍ））を含む）またはアフィボディ（操作されたプロテインＡ足場アフィボディ（Ｓｗｅｄｅｎ）を含む）もしくはアンチカリン（操作されたアンチカリンＰｉｅｒｉｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む）などの抗体様結合特性を示す代替タンパク質足場が挙げられる。
【0059】
治療剤は、好ましくは、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択され得る。好ましくは、免疫エフェクター分子はサイトカインである。
【0060】
薬物動態改変部分は、例えば、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せであってもよい。少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基は、当業者に公知のいくつかの方法によって付随させ得る。好ましい実施形態では、ユニットはＴＣＲに共有結合により連結される。本発明によるＴＣＲは、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変されてもよい。特に、ＴＣＲの可溶性形態は、１つまたはいくつかの薬物動態改変部分によって改変される。薬物動態改変部分は、治療薬の薬物動態プロファイルに対する有益な変化、例えば、血漿中半減期の改善、免疫原性の低減または増強、および溶解度の改善を達成し得る。
【0061】
本発明によるＴＣＲは、可溶性であっても、または膜に結合していてもよい。用語「可溶性」は、例えば、治療剤を抗原提示細胞に送達するための標的化剤として使用するための、可溶性形態である（すなわち、膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインを有さない）ＴＣＲを指す。安定性のために、可溶性αβヘテロ二量体ＴＣＲは、好ましくは、例えば、国際公開第０３／０２０７６３号パンフレットに記載されているように、それぞれの定常ドメインの残基間に導入されたジスルフィド結合を有する。本発明のαβヘテロ二量体に存在する定常ドメインの一方または両方は、Ｃ末端（単数または複数）で、例えば、最大１５、または最大１０もしくは最大８もしくはそれより少ないアミノ酸で切断されてもよい。養子治療において使用するために、αβヘテロ二量体ＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインと膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされてもよい。ＴＣＲは、それぞれアルファ定常ドメインとベータ定常ドメインの間に天然に見られるものに対応するジスルフィド結合を含有してもよく、さらにまたはあるいは非天然ジスルフィド結合が存在してもよい。
【0062】
よって、ＴＣＲ、特に本発明によるＴＣＲの可溶性形態は、例えば、免疫原性を低下させる、流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）溶解度および／もしくは安定性を増加させる（例えば、タンパク質分解に対する保護を増強させることによって）ならびに／または血清中半減期を延長するために、追加の機能性部分を付加することによって改変され得る。
【0063】
他の有用な機能性部分および改変には、患者の体内で本発明のＴＣＲを有するエフェクター宿主細胞を遮断するために使用され得る「自殺」または「安全スイッチ」が含まれる。１つの例は、Gargett and Brown Front Pharmacol. 2014; 5: 235に記載された誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）「安全スイッチ」である。簡潔には、その二量体化がＡＰ１９０３／ＣＩＰなどの小分子二量体化薬に依存し、改変されたエフェクター細胞においてアポトーシスの急速な誘導をもたらすカスパーゼ９ドメインを発現させるために、エフェクター宿主細胞は周知の方法によって改変される。この系は、例えば、欧州特許第２１７３８６９号明細書に記載されている。他の「自殺」「安全スイッチ」に関する例は、当技術分野において公知であり、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、ＣＤ２０の発現とそれに続く抗ＣＤ２０抗体を使用する枯渇、またはｍｙｃタグ（Kieback et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Jan 15;105(2):623-8）がある。
【0064】
グリコシル化パターンが変更されたＴＣＲも本明細書において予想される。当技術分野で公知であるように、グリコシル化パターンは、アミノ酸配列に依存し（例えば、以下で議論される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または非存在）および／またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物に依存し得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ連結またはＯ連結されている。Ｎ連結は、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖への結合を指す。結合分子へのＮ連結グリコシル化部位の付加は、アスパラギン－Ｘ－セリンおよびアスパラギン－Ｘ－トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）から選択される１つまたは複数のトリペプチド配列を含有するように、アミノ酸配列を変更することによって、従来より達成されている。Ｏ連結グリコシル化部位は、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の出発配列への付加またはそれによる置換によって導入され得る。
【0065】
ＴＣＲのグリコシル化の別の手段は、グリコシドのタンパク質への化学的連結または酵素的連結によるものである。使用される連結方式によって、糖類は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えば、システインのスルフヒドリル基、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、例えば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのヒドロキシル基、（ｅ）芳香族残基、例えば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンの芳香族残基、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合され得る。同様に、脱グリコシル化（すなわち、結合分子上に存在する炭水化物部分の除去）は、例えば、ＴＣＲをトリフルオロメタンスルホン酸に曝露することによって化学的に、またはエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを用いることによって酵素的に達成され得る。
【0066】
小分子化合物などの薬物をＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態に付加することも考えられる。連結は、共有結合、または静電力によるなど非共有結合的相互作用によって達成され得る。当技術分野で公知の様々なリンカーは、薬物コンジュゲートを形成するために用いることができる。
【0067】
ＴＣＲ、特に本発明のＴＣＲの可溶性形態は、それぞれの分子（タグ）の特定、追跡、精製および／または単離を補助する追加のドメインを導入するためにさらに改変され得る。よって、一部の実施形態では、ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖は、エピトープタグを含むように改変されてもよい。
【0068】
エピトープタグは、本発明のＴＣＲに組み込むことができるタグの有用な例である。エピトープタグは、特異的抗体の結合を可能にし、したがって、患者の体内の可溶性ＴＣＲもしくは宿主細胞または培養（宿主）細胞の結合および移動の特定および追跡を可能にするアミノ酸の短いストレッチである。エピトープタグと、故にタグ付けされたＴＣＲの検出は、いくつかの異なる技法を使用して達成され得る。
【0069】
タグは、前記タグに対して特異的な結合分子（抗体）の存在下で細胞を培養することによって、本発明のＴＣＲを有する宿主細胞の刺激および増殖のためにさらに用いることができる。
【0070】
一般的に、ＴＣＲは、一部の事例では、ＴＣＲの標的抗原との親和性およびオフレートを改変する様々な変異で改変され得る。特に、変異は、親和性を増加させるおよび／またはオフレートを低下させる場合がある。よって、ＴＣＲの少なくとも１つのＣＤＲおよびその可変ドメインフレームワーク領域が変異し得る。
【0071】
しかし、好ましい実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲ領域は、改変されないかまたは実施例におけるＴＣＲ受容体に関するようにｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟を受けない。このことは、ＣＤＲ領域が天然に存在する配列を有することを意味する。これは有利であり得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟によって、ＴＣＲ分子に対する免疫原性がもたらされ得るからである。これより、治療効果および処置を低下または不活性化する抗薬物抗体の産生がもたらされ、ならびに／または有害作用が誘導される場合がある。
【0072】
変異は、１つまたは複数の置換、欠失または挿入であってもよい。これらの変異は、当技術分野で公知の任意の好適な方法、例えば、Example in Sambrook, Molecular Cloning - 4th Edition (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載されている、ポリメラーゼ連鎖反応、制限酵素に基づくクローニング、ライゲーションに依存しないクローニング手順によって導入され得る。
【0073】
交差反応性のリスクを伴う理論的に予測できないＴＣＲ特異性は、内因性ＴＣＲ鎖と外因性ＴＣＲ鎖の間の誤対合に起因して生じ得る。ＴＣＲ配列の誤対合を避けるために、組換えＴＣＲ配列は、いくつかの異なる形質導入されたＴＣＲ鎖の正しい対合を効率的に増強することが示された技術である、最低限のマウス化Ｃα領域およびＣβ領域を含有するように改変されてもよい。ＴＣＲのマウス化（すなわち、アルファおよびベータ鎖ヒト定常領域をそれらのマウスのカウンターパートによって交換すること）は、宿主細胞におけるＴＣＲの細胞表面での発現を改善するために通常適用される技法である。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、マウス化ＴＣＲは、ＣＤ３共受容体とより効率的に会合する；および／または優先的に互いに対合し、所望の抗原特異性のＴＣＲを発現するようｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変されているが、それらの「オリジナルの」ＴＣＲを依然として保持および発現するヒトＴ細胞上で混合ＴＣＲを形成しにくいと考えられる。
【0074】
マウス化ＴＣＲの発現の改善を代表する９つのアミノ酸が特定されており（Sommermeyer and Uckert, J Immunol. 2010 Jun 1; 184(11):6223-31）、ＴＣＲアルファおよび／またはベータ鎖定常領域におけるアミノ酸残基のうちの１つまたはすべてをそれらのマウスのカウンターパート残基で置換することが予測される。この技法は、「最低限のマウス化（minimal murinization）」とも称され、細胞表面の発現を増強するという利点をもたらすが、同時に、アミノ酸配列における「外来の」アミノ酸残基の数を低減し、それによって、免疫原性のリスクを低減する。
【0075】
一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲを指し、ＴＣＲは、一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リンカー配列によって連結している。
【0076】
好適な一本鎖ＴＣＲ形態は、可変ＴＣＲα領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合した可変ＴＣＲβ領域に対応するアミノ酸配列によって構成された第２のセグメント、および第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含む。あるいは、第１のセグメントは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよい。上記一本鎖ＴＣＲは、第１の鎖と第２の鎖の間にジスルフィド結合をさらに含んでもよく、リンカー配列の長さとジスルフィド結合の位置は、第１のセグメントと第２のセグメントの可変ドメイン配列が実質的にネイティブＴ細胞受容体におけるのと同様に変異によって配向されるようなものである。より具体的には、第１のセグメントは、ＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、第２のセグメントは、ＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合したＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成されていてもよく、かつジスルフィド結合は、第１の鎖と第２の鎖の間にもたらされてもよい。リンカー配列は、ＴＣＲの機能を損なわない任意の配列であってもよい。
【0077】
本発明の文脈において、「機能性」ＴＣＲαおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、例えば、少なくとも実質的な生物学的活性を維持する、アミノ酸の付加、欠失または置換によって改変されたＴＣＲまたはＴＣＲバリアントを意味することになる。ＴＣＲのαおよび／またはβ鎖の場合には、このことは、両方の鎖が、その生物学的機能、特に前記ＴＣＲの特異的ペプチド－ＭＨＣ複合体への結合、および／または特異的ペプチド：ＭＨＣ相互作用の際の機能的シグナル伝達を発揮するＴ細胞受容体（改変されていないαおよび／もしくはβ鎖を有するかまたは別の発明の融合タンパク質αおよび／またはβ鎖を有する）を形成することが可能なままであることを意味することになる。
【0078】
具体的実施形態では、ＴＣＲは、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるよう改変されてもよく、ここで、前記エピトープタグは、６から１５アミノ酸、好ましくは９から１１アミノ酸の長さを有する。別の実施形態では、ＴＣＲは、機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であるように改変されてもよく、ここで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質は、いずれも離れて配置されているかまたはタンデムに直接配置されている２つ以上のエピトープタグを含む。融合タンパク質の実施形態は、融合タンパク質がその生物学的活性（単数または複数）（「機能性」）を維持する限り、２、３、４、５またはさらに多くのエピトープタグを含有し得る。
【0079】
好ましいのは、本発明による機能性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αおよび／またはβ鎖融合タンパク質であり、ここで、前記エピトープタグは、以下に限定されないが、ＣＤ２０もしくはＨｅｒ２／ｎｅｕタグ、または他の従来のタグ、例えば、ｍｙｃ－タグ、ＦＬＡＧ－タグ、Ｔ７－タグ、ＨＡ（ヘマグルチニン）－タグ、Ｈｉｓ－タグ、Ｓ－タグ、ＧＳＴ－タグ、もしくはＧＦＰ－タグから選択され、ｍｙｃ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰタグは、既存の分子に由来するエピトープである。対照的に、ＦＬＡＧは、高い抗原性のために設計された合成エピトープタグである（例えば、米国特許第４，７０３，００４号明細書および同第４，８５１，３４１号明細書を参照されたい）。高品質の試薬をその検出に使用することが可能であるため、ｍｙｃタグが好ましくは使用され得る。エピトープタグは、当然のことながら、抗体による認識の他に、１つまたは複数の追加の機能を有してもよい。これらのタグの配列は文献に記載されており、当業者に周知である。
【0080】
ＴＣＲバリアント
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチドを指す。
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列のうちの少なくとも１つを含む、ポリペプチドを指す。
【0081】
機能性部分は、ＴＣＲの抗原への、特に抗原－ＭＨＣ複合体への結合を媒介し得る。
【0082】
一実施形態では、機能性部分は、本明細書に記載されているＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む。
【0083】
ＴＣＲバリアント分子、ＴＣＲ受容体の結合特性を有してもよいが、エフェクター細胞（Ｔ細胞以外）のシグナル伝達ドメイン、特にＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わされてもよい。したがって、一部の実施形態は、エフェクター細胞、例えば、ＮＫ細胞のシグナル伝達ドメインと組み合わせた、本明細書に記載されているＴＣＲの機能性部分を含むタンパク質を指す。
【0084】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されている少なくとも２つのＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体を指す。この態様の一実施形態では、少なくとも２つのＴＣＲ分子が、リンカー部分を介して連結し、多価複合体を形成する。好ましくは、複合体は水溶性であるため、リンカー部分はそれに従って選択されるべきである。リンカー部分は、形成された複合体の構造的多様性が最小限になるように、ＴＣＲ分子上の規定の位置に結合可能であることが好ましい。本態様の一実施形態は、本発明のＴＣＲ複合体によって提供され、ここで、ポリマー鎖またはペプチドリンカー配列は、ＴＣＲの可変領域配列内に位置していない各ＴＣＲのアミノ酸残基間に伸びている。本発明の複合体は、医学において使用するためのものであってもよく、リンカー部分は、それらの医薬適合性、例えば、それらの免疫原性に関して選択されるべきである。上記の望ましい基準を満たすリンカー部分の例は、当技術分野、例えば、抗体断片を連結する技術分野において公知である。
【0085】
リンカーの例は、親水性ポリマーおよびペプチドリンカーである。親水性ポリマーに関する１つの例は、ポリアルキレングリコールである。このクラスの最も一般的に使用されるものは、ポリエチレングリコールまたはＰＥＧに基づく。しかし、他のものは、他の好適な、必要に応じて置換された、ポリプロピレングリコールを含むポリアルキレングリコール、およびエチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体に基づく。ペプチドリンカーは、アミノ酸の鎖から構成され、単純なリンカー、またはその上にＴＣＲ分子が結合し得る多量体ドメインを生成するように機能する。
【0086】
一実施形態は、多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、前記ＴＣＲの少なくとも１つに、治療剤が付随している。
【0087】
サイトカインおよびケモカインの放出
一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、ＩＦＮ－γの分泌は、エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ＊０２結合形態への結合によって誘導される。
一部の実施形態は、本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、本明細書に記載されているポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体を指し、ここで、ＩＦＮ－γの分泌は、エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ＊０２結合形態への結合によって誘導される。
【0088】
エフェクター細胞上に発現された本発明のＴＣＲの配列番号１からなる群から選択されるアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ＊０２結合形態への結合によって誘導されるＩＦＮ－γの分泌は、５００ｐｇ／ｍｌより多くてもよく、より好ましくは１０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよく、最も好ましくは２０００ｐｇ／ｍｌより多くてもよい。ＩＦＮ－γの分泌は、無関係のペプチド（例えば、配列番号２２）のＨＬＡ－Ａ＊０２結合形態への結合と比較して、配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ＊０２結合形態への結合の場合には、少なくとも５倍、より高くてもよい。
【0089】
「エフェクター細胞」は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってもよい。典型的には、エフェクター細胞は、免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞である。他の好適な細胞型は、ガンマ－デルタＴ細胞およびＮＫ様Ｔ細胞を含む。
【0090】
本発明は、標的アミノ酸配列である配列番号１またはＨＬＡ－Ａ＊２、好ましくはまたはそのＨＬＡ－Ａ＊２：０１結合形態に結合するＴＣＲまたはその断片を同定するための方法であって、候補ＴＣＲまたはその抗原結合断片を配列番号１のアミノ酸配列またはＨＬＡ－Ａ＊２、好ましくはまたはそのＨＬＡ－Ａ＊２：０１結合形態と接触させることと、候補ＴＣＲまたはその抗原結合断片が標的に結合するおよび／または免疫応答を媒介するか否かを決定することとを含む方法にも関する。
【0091】
候補ＴＣＲまたはその抗原結合断片が免疫応答を媒介するかどうかは、例えば、サイトカイン分泌、例えば、ＩＦＮ－γ分泌の測定によって決定することができる。上述のように、サイトカイン分泌は、アミノ酸配列である配列番号１をコードするｉｖｔＲＮＡをトランスフェクトされたＨＬＡ－Ａ２を形質導入したＫ５６２細胞（またはＨＬＡ－Ａ２を形質導入した他のＡＰＣ）が、調査されるＴＣＲまたはＴＣＲの断片を含む分子を発現するＣＤ８＋濃縮ＰＢＭＣと共にインキュベートされるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって測定することができる。
【0092】
本発明のＴＣＲは、高い腫瘍細胞認識能を示すため、特に有用である。さらに、本明細書に記載されているＴＣＲは、高い腫瘍細胞殺滅能を示す。さらに、本発明のＴＣＲは、高い機能性アビディティを有する。
【0093】
さらに、ＴＣＲは、有効な腫瘍退縮に有利な、好ましいサイトカイン放出パターンを示す。
【0094】
核酸、ベクター
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または本明細書に記載されているＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸に関する。
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または本明細書に記載されているＴＣＲをコードするポリヌクレオチドをコードする核酸に関する。
【0095】
【表1】
【0096】
「核酸分子」は、一般的に、ＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味し、一本鎖または二本鎖であってもよく、天然源から合成または得られてもよく（例えば、単離および／または精製されてもよく）、天然、非天然または改変されたヌクレオチドを含有してもよく、および天然、非天然または改変されたヌクレオチド間の連結、例えば、未改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間に見られるホスホジエステルの代わりに、ホスホロアミデート連結またはホスホロチオエート連結などを含有してもよい。好ましくは、本明細書に記載の核酸は組換え体である。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然もしくは合成核酸セグメントを、生細胞中で複製し得る核酸分子に連結することによって、生細胞の外側で構築される分子、または（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されたものの複製から得られる分子を指す。本発明の目的として、複製は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ複製であっても、またはｉｎ ｖｉｖｏ複製であってもよい。核酸は、当技術分野で公知の、または市販の（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒおよび同様の会社からの）手順を使用して、化学合成および／または酵素的ライゲーション反応に基づいて構築され得る。例えば、Sambrook et al.を参照されたく、例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチドまたは分子の生物学的安定性を増加させるか、またはハイブリダイゼーションの際に形成される二本鎖の物理的安定性を高めるように設計された様々な改変ヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成され得る。核酸は、組換えＴＣＲ、ポリペプチド、もしくはタンパク質、またはその機能性部分もしくは機能性バリアントのいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含み得る。
【0097】
本開示は、単離または精製された核酸のバリアントであって、バリアント核酸が、本明細書に記載のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列と、少なくとも７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なヌクレオチド配列を含む、バリアントも提供する。このようなバリアントヌクレオチド配列は、ＭＡＧＥＡ１０を特異的に認識する機能性ＴＣＲをコードする。
【0098】
本開示は、本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列または本明細書に記載の核酸のいずれかのヌクレオチド配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む単離または精製された核酸も提供する。
【0099】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列は、好ましくは、高ストリンジェンシーな条件下でハイブリダイズする。「高ストリンジェンシーな条件」とは、ヌクレオチド配列が、非特異的ハイブリダイゼーションよりも検出可能な程度に濃い量で、標的配列（本明細書に記載のいずれかの核酸のヌクレオチド配列）に特異的にハイブリダイズすることを意味する。高ストリンジェンシーな条件には、ヌクレオチド配列に適合したほんの僅かな小さな領域（例えば、３～１０塩基）を偶然有するランダム配列から、正確に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、または散在する僅かな不適合を含有するに過ぎないポリヌクレオチドを区別する条件が含まれる。このような相補性の小領域は、１４～１７塩基またはそれより多い塩基の完全長の相補体よりも容易に融解し、高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションにより、それらの区別が容易になる。比較的高ストリンジェンシーな条件としては、例えば、約５０～７０℃の温度で、約０．０２～０．１ＭのＮａＣｌまたはそれと同等なものによって提供されるような、低塩条件および／または高温条件が挙げられる。このような高ストリンジェンシーな条件は、存在するとしても、ヌクレオチド配列と鋳型または標的鎖との間の不適合をほとんど許容せず、本明細書に記載のＴＣＲのいずれかの発現を検出するのに特に好適である。ホルムアミド添加量を増加させることによって、条件をよりストリンジェントにし得ることは一般的に認識されている。
【0100】
本明細書の他の箇所で既に記載されているように、ＴＣＲをコードする核酸は改変されてもよい。核酸配列全体における有用な改変は、コドン最適化であり得る。発現したアミノ酸配列内に保存的置換をもたらす変更がなされ得る。これらのバリエーションは、機能に影響を及ぼさないＴＣＲ鎖のアミノ酸配列の相補性決定領域および非相補性決定領域においてなされ得る。通常、付加と欠失は、ＣＤＲ３領域において起こらない。
【0101】
別の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸を含むベクターを指す。
【0102】
ベクターは、好ましくは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターである。
【0103】
「ベクター」は、核酸配列を、コードされたポリペプチドの合成が起こり得る好適な宿主細胞中に運ぶための能力を有する任意の分子または組成物である。典型的には、および好ましくは、ベクターは、所望の核酸配列（例えば、本発明の核酸）を組み込むために、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技法を使用して操作された核酸である。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよく、および／またはリポソームを含んでもよい。ベクターは、プラスミド、シャトルベクター、ファージミド、コスミド、発現ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクターもしくは粒子および／または遺伝子治療において使用されるベクターであってもよい。ベクターは、複製開始点として、宿主細胞における複製を可能とする核酸配列を含んでもよい。ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および当業者にとって公知の他の遺伝要素も含んでもよい。ベクターは、好ましくは、前記核酸の発現を可能にする配列に作動可能に連結した本発明による核酸を含む発現ベクターである。
【0104】
好ましくは、ベクターは発現ベクターである。より好ましくは、ベクターは、レトロウイルス、より具体的には、ガンマ－レトロウイルスまたはレンチウイルスのベクターである。
【0105】
細胞、細胞株
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを発現する細胞を指す。
【0106】
一部の実施形態では、細胞は、単離されるかまたは天然に存在しない。
【0107】
具体的実施形態では、細胞は、本明細書に記載されているＴＣＲをコードする核酸または前記核酸を含むベクターを含んでもよい。
【0108】
細胞中では、上記ＴＣＲをコードする核酸配列を含む上記ベクターが導入されてもよく、または前記ＴＣＲをコードするｉｖｔＲＮＡが導入されてもよい。細胞は、Ｔ細胞などの末梢血リンパ球であってもよい。ＴＣＲのクローニングおよび外因性発現の方法は、例えば、Engels et al.（Relapse or eradication of cancer is predicted by peptide-major histocompatibility complex affinity. Cancer Cell, 23(4), 516-26. 2013）に記載されている。一次ヒトＴ細胞のレンチウイルスベクターによる形質導入は、例えば、Cribbs "simplified production and concentration of lentiviral vectors to achieve high transduction in primary human T cells" BMC Biotechnol. 2013; 13: 98に記載されている。
【0109】
用語「トランスフェクション」と「形質導入」は交換可能であり、外因性核酸配列が、宿主細胞、例えば、真核宿主細胞に導入されるプロセスを指す。核酸配列の導入または移入は、上述の方法に限定されないが、電気穿孔、微量注射、遺伝子銃送達、リポフェクション、スーパーフェクションおよびレトロウイルスまたは形質導入またはトランスフェクションに好適な他のウイルスによる上述の感染を含む任意の数の手段よって達成され得る。
【0110】
一部の実施形態は、
ａ）本明細書に記載されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む細胞を指す。
ａ）本明細書に記載されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）本明細書に記載されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および本明細書に記載されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む細胞を指す。
【0111】
一部の実施形態では、細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。細胞は、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞であってもよい。好ましくは、細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞様メモリーＴ細胞である。
【0112】
幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）は、自己再生能および長期間存続する能力によって特徴付けられる、分化の程度の低いＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団である。ｉｎ ｖｉｖｏでこれらの細胞がそれらの抗原に遭遇すると、これらは、一部の静止したままのＴＳＣＭと共に、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）および最終分化エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ）へとさらに分化する（Flynn et al., Clinical & Translational Immunology (2014)）。これらの残っているＴＳＣＭ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで耐性免疫記憶を構築する能力を示し、したがって、養子Ｔ細胞療法に関する重要なＴ細胞亜集団であると考えられる（Lugli et al., Nature Protocols 8, 33-42 (2013) Gattinoni et al., Nat. Med. 2011 Oct; 17(10): 1290-1297）。幹細胞メモリーＴ細胞亜集団にＴ細胞プールを限定するために、免疫磁気選択を使用することができる。（Riddell et al. 2014, Cancer Journal 20(2): 141-44）を参照されたい。
【0113】
ＴＣＲを標的とする抗体
本発明の別の態様は、ＭＡＧＥＡ１０に対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。一実施形態では、ＭＡＧＥＡ１０に対する特異性を媒介するＴＣＲの一部は、配列番号４、および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。
本発明の別の態様は、ＭＡＧＥＡ１０に対する特異性を媒介する、本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を指す。一実施形態では、ＭＡＧＥＡ１０に対する特異性を媒介するＴＣＲの一部は、配列番号４、および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３を含む。
【0114】
抗体抗原結合断片は、ＴＣＲの活性をモジュレートし得る。抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲのＭＡＧＥＡ１０との結合をブロックする場合もあり、ブロックしない場合もある。抗体またはその抗原結合断片は、ＴＣＲの治療活性をモジュレートするため、または診断目的で使用され得る。
【0115】
医薬組成物、医学的処置およびキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを含む医薬組成物、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。
本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲを含む医薬組成物、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。
【0116】
本発明のこれらの活性成分は、好ましくは、許容される担体または担体材料と混合した用量で、このような医薬組成物によって、疾患が処置されるかまたは少なくとも緩和され得るように使用される。このような組成物は、（活性成分および担体に加えて）、当技術分野の公知の状態である充填材料、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤および他の材料を含み得る。
【0117】
用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生体活性の有効性を妨げない、非毒性材料を定義する。担体の選択は、適用に依存する。
【0118】
医薬組成物は、活性成分の活性を増強するかまたは処置を補う追加の成分を含有してもよい。このような追加の成分および／または因子は、相乗効果を達成するかまたは有害もしくは望ましくない作用を最小限にするための、医薬組成物の一部であり得る。
【0119】
本発明の活性成分の製剤化または調製および適用／薬物治療のための技法は、"Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに公開されている。適当な適用は、非経口適用、例えば、筋肉内、皮下、髄内注射および髄腔内、直接脳室内、静脈内、節内、腹腔内または腫瘍内注射である。静脈内注射は、患者にとって好ましい処置である。
【0120】
好ましい実施形態によれば、医薬組成物は、注入または注射である。
【0121】
注射用組成物は、少なくとも１つの有効成分、例えば、ＴＣＲを発現する増殖Ｔ細胞集団（例えば、処置される患者に対して自己であるかまたは同種間である）を含む薬学的に許容される流体組成物である。有効成分は、通常、生理的に許容される担体中に溶解されるかまたは懸濁され、さらに、組成物は、乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤などの少量の１つまたは複数の非毒性補助剤を含んでもよい。本開示の融合タンパク質と共に使用するのに有用な、このような注射用組成物は従来的なものであり、適当な製剤は、当業者に周知である。
【0122】
典型的には、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。
【0123】
したがって、本発明の別の態様は、本明細書に記載されているＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記ＴＣＲを含む細胞、または医薬として使用するための本明細書に記載されているＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体を指す。
【0124】
一部の実施形態は、本明細書に記載されているＴＣＲ、前記ＴＣＲの機能性部分を含むポリペプチド、本明細書に記載されている多価ＴＣＲ複合体、前記ＴＣＲをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、がんの処置において使用するための前記ＴＣＲを含む細胞を指す。
【0125】
一実施形態では、がんは、血液がんまたは固形腫瘍である。
【0126】
血液がんは、固形腫瘍を形成せず、したがって、体内に主に分散される血液のがんとも言われる。血液がんの例は、白血病、リンパ腫または多発性骨髄腫である。固形腫瘍には２つの主要なタイプ、すなわち肉腫および癌が存在する。肉腫は、例えば、血管、骨、脂肪組織、靭帯、リンパ管、筋肉または腱の腫瘍である。
【0127】
一実施形態では、がんは、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される。
【0128】
（ｉ）本明細書に記載されている単離されたＴＣＲ、（ｉｉ）組換えＴＣＲをコードする核酸を含むウイルス粒子、（ｉｉｉ）本明細書に記載されている組換えＴＣＲを発現するよう改変された、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞、（ｉｖ）本明細書に記載されている組換えＴＣＲをコードする核酸のうちの１つまたは複数を含有する医薬組成物およびキットも本明細書において企図されている。一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むレンチウイルスベクター粒子（または組換えＴＣＲを発現するよう、本明細書に記載のベクター粒子を使用して改変されたＴ細胞）を含む組成物を提供する。このような組成物は、本明細書にさらに記載されている本開示の方法において、対象に投与することができる。
【0129】
本明細書に記載されている改変Ｔ細胞を含む組成物は、公知の技法に従って、養子免疫療法のための方法および組成物において、または本開示に基づいて、当業者に明らかとなるそのバリエーションにおいて利用することができる。
【0130】
一部の実施形態では、細胞は、最初に、それらを培養培地から回収し、次いで、細胞を洗浄し、培地および投与に好適な容器系（「薬学的に許容される」担体）において、治療有効量で濃縮することによって製剤化される。好適な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には、通常生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）であってもよいが、水中５％のデキストロースまたは乳酸リンゲル液も利用することができる。注入培地にヒト血清アルブミンを補充してもよい。
【0131】
組成物中の有効治療のための細胞数は、典型的には、１０より多い細胞、かつ最大１０６、１０８または１０９以下の細胞であり、１０１０より多い細胞でもよい。細胞数は、組成物が、その中に含まれる細胞の種類に応じて意図される最終的用途に応じて変わることになる。本発明において提供される用途では、細胞は、一般的には１リットル以下の体積中にあり、５００ｍｌ以下、さらには２５０ｍｌまたは１００ｍｌ以下であってもよい。したがって、所望の細胞の密度は、典型的には１ｍｌ当たり１０６を超える細胞であり、一般的には１ｍｌ当たり１０７を超え、一般的には１ｍｌ当たり１０８を超える。臨床的に関連する数の免疫細胞は、１０９、１０１０または１０１１の細胞に累積的に等しいかまたはそれを超える複数の注入物中に配分され得る。本発明において提供される医薬組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉体、水性、または凍結乾燥形態であってもよい。好適な医薬担体の例は、当技術分野において公知である。このような担体および／または添加剤は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。安定化剤、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマーおよびキレート剤は、組成物を体内での分解から保護することができる。注射による投与が意図される組成物中には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤および等張剤のうちの１つまたは複数が含まれてもよい。
【0132】
本明細書に記載されている組換えＴＣＲ、または本発明において提供される組換えＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含むウイルスベクター粒子は、キットとしてパッケージングされてもよい。キットは、任意選択で、１つまたは複数の成分、例えば、使用説明書、デバイス、および追加の試薬、ならびに本方法を実践するためのコンポーネント、例えば、チューブ、容器およびシリンジを含んでもよい。例示的なキットは、組換えＴＣＲをコードする核酸、組換えＴＣＲポリペプチド、または本発明において提供されるウイルスを含んでもよく、任意選択で、使用説明書、対象においてウイルスを検出するためのデバイス、組成物を対象に投与するためのデバイス、および組成物を対象に投与するためのデバイスを含んでもよい。
【0133】
目的の遺伝子（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするポリヌクレオチドを含むキットも本明細書において企図されている。目的の配列（例えば、組換えＴＣＲ）をコードするウイルスベクターおよび任意選択で免疫チェックポイント阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含むキットも、本明細書において企図されている。
【0134】
本明細書において企図されるキットは、本明細書に開示されたＴＣＲのうちのいずれか１つまたは複数をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するための方法を実行するためのキットも含む。特に、このような診断キットは、適当な増幅プライマーおよび検出プライマーならびに本明細書に開示されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドを検出するために、ディープシーケンシングを実施するための他の関連試薬のセットを含んでもよい。さらなる実施形態では、本発明におけるキットは、抗体または他の結合分子などの、本明細書に開示されたＴＣＲを検出するための試薬を含んでもよい。診断キットは、本明細書に開示されたＴＣＲをコードするポリヌクレオチドの存在を決定するため、または本明細書に開示されたＴＣＲの存在を決定するための説明書も含有し得る。キットは、説明書を含有してもよい。説明書は、典型的には、キットに含まれる成分、対象の適切な状態を決定するための方法を含む投与のための方法、適切な投薬量、および適切な投与方法を説明する有形の表現を含む。説明書は、処置時間の持続期間にわたって対象をモニタリングするためのガイダンスも含み得る。
【0135】
本発明において提供されるキットは、本明細書に記載の組成物を対象に投与するためのデバイスも含み得る。医薬またはワクチンを投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかが、本発明において提供されるキットに含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットのウイルスを投与するためのデバイスは、キットのウイルスに対応するものであり、例えば、高圧注射用デバイスなどの無針注射用デバイスは、高圧注射によって損傷を受けなかったウイルスと共に、キット中に含まれてもよいが、典型的には、高圧注射によって損傷を受けたウイルスと共に、キット中に含まれることはない。
【0136】
本発明において提供されるキットは、化合物、例えば、Ｔ細胞活性化因子または刺激物質、またはＴＬＲアゴニスト、例えば、対象に対するＴＬＲ４アゴニストを投与するためのデバイスも含んでよい。医薬を対象に投与するための、当技術分野で公知の種々のデバイスのいずれかは、本発明において提供されるキット中に含まれてもよい。例示的なデバイスとしては、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射、以下に限定されないが、皮下注射針、静脈注射針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および液体ディスペンサー、例えば、点眼器が挙げられる。典型的には、キットの、化合物を投与するためのデバイスは、化合物投与の所望の方法に対応するものであろう。
【0137】
実験
【0138】
[実施例１]
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞はＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－多量体に結合する
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンを単離するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアプローチを使用した。プライミング系は、抗原提示細胞としてＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性ドナーの成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を、応答細胞として自己のＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞を使用した。ヒトＭＡＧＥ－Ａ１０遺伝子の３１個のアミノ酸（ＰＲＡＨＡＥＩＲＫＭＳＬＬＫＦＬＡＫＶＮＧＳＤＰＲＳＦＰＬ）をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）は、特異的抗原の供給源としての役割を果たした。ｍＤＣへの電気穿孔後に、ＭＡＧＥ－Ａ１０をコードするｉｖｔＲＮＡは、タンパク質へと翻訳され、次に、プロセシングされ、ｍＤＣ上にＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子によってペプチドとして提示された。同じドナーに由来するＴ細胞のｉｖｔＲＮＡがトランスフェクトされたｍＤＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養によって、抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ誘導がもたらされた。抗原特異的Ｔ細胞を、ＦＡＣＳに基づく単一細胞選別によって濃縮した。ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンのＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列は、次世代シーケンシングによって同定した。両方のＴＣＲ定常領域をそれらのマウスのカウンターパートと置き換えた。マウス化ＴＣＲのヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）アルゴリズム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してコドン最適化し、レトロウイルスベクターｐＥＳ．１２－６中にクローニングした。健康なドナーのＰＢＭＣをフィコール勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ８Ｔ細胞を陰性磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって濃縮し、非組織培養２４ウェルプレート中で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激した（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のレトロウイルスプラスミドと２種の発現プラスミドをコードする各ＴＣＲによるトランスフェクションによって、アンホトロピックレトロウイルス粒子を生成した。刺激後２日目に、ＣＤ８Ｔ細胞に形質導入し、１２日目に、形質導入に関するマーカーとしてマウス定常ベータ領域を使用するＦＡＣＳによって形質導入されたＣＤ８＋細胞を濃縮し、次いで、急速な拡大プロトコールによって拡大させた（Riddell SR, Science, 1992 Jul 10;257(5067):238-41）。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞はＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－多量体に結合する
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンを単離するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏプライミングアプローチを使用した。プライミング系は、抗原提示細胞としてＨＬＡ－Ａ＊０２：０１陽性ドナーの成熟樹状細胞（ｍＤＣ）を、応答細胞として自己のＣＤ８＋濃縮Ｔ細胞を使用した。ヒトＭＡＧＥ－Ａ１０遺伝子の３１個のアミノ酸（ＰＲＡＨＡＥＩＲＫＭＳＬＬＫＦＬＡＫＶＮＧＳＤＰＲＳＦＰＬ）をコードするｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ（ｉｖｔＲＮＡ）は、特異的抗原の供給源としての役割を果たした。ｍＤＣへの電気穿孔後に、ＭＡＧＥ－Ａ１０をコードするｉｖｔＲＮＡは、タンパク質へと翻訳され、次に、プロセシングされ、ｍＤＣ上にＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子によってペプチドとして提示された。同じドナーに由来するＴ細胞のｉｖｔＲＮＡがトランスフェクトされたｍＤＣとのｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養によって、抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ ｎｏｖｏ誘導がもたらされた。抗原特異的Ｔ細胞を、ＦＡＣＳに基づく単一細胞選別によって濃縮した。ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンのＴＣＲアルファ鎖およびＴＣＲベータ鎖の配列は、次世代シーケンシングによって同定した。両方のＴＣＲ定常領域をそれらのマウスのカウンターパートと置き換えた。マウス化ＴＣＲのヌクレオチド配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）アルゴリズム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してコドン最適化し、レトロウイルスベクターｐＥＳ．１２－６中にクローニングした。健康なドナーのＰＢＭＣをフィコール勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ８Ｔ細胞を陰性磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）によって濃縮し、非組織培養２４ウェルプレート中で抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激した（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のレトロウイルスプラスミドと２種の発現プラスミドをコードする各ＴＣＲによるトランスフェクションによって、アンホトロピックレトロウイルス粒子を生成した。刺激後２日目に、ＣＤ８Ｔ細胞に形質導入し、１２日目に、形質導入に関するマーカーとしてマウス定常ベータ領域を使用するＦＡＣＳによって形質導入されたＣＤ８＋細胞を濃縮し、次いで、急速な拡大プロトコールによって拡大させた（Riddell SR, Science, 1992 Jul 10;257(5067):238-41）。
【0139】
結果：
ＣＤ８Ｔ細胞に、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンから単離したＴＣＲおよびＭＡＧＥ－Ａ１０を認識しなかった対照ＴＣＲを形質導入した。これらを、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体ならびにＣＤ８およびマウス定常ベータ領域に対する抗体で染色した。ＴＣＲベータ鎖は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲに関してＣＤ８Ｔ細胞の７４％で、および陰性対照ＴＣＲに関して９６％で発現した。ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを形質導入した細胞の大多数（８４％）は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体に結合した。陰性対照ＴＣＲでは、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体染色は観察されなかった。これらの結果は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンから単離されたＴＣＲを、健康なドナーのＴ細胞において遺伝子導入により発現させることができることを示す（図１）。
ＣＤ８Ｔ細胞に、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンから単離したＴＣＲおよびＭＡＧＥ－Ａ１０を認識しなかった対照ＴＣＲを形質導入した。これらを、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体ならびにＣＤ８およびマウス定常ベータ領域に対する抗体で染色した。ＴＣＲベータ鎖は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲに関してＣＤ８Ｔ細胞の７４％で、および陰性対照ＴＣＲに関して９６％で発現した。ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを形質導入した細胞の大多数（８４％）は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体に結合した。陰性対照ＴＣＲでは、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＭＨＣ多量体染色は観察されなかった。これらの結果は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ反応性Ｔ細胞クローンから単離されたＴＣＲを、健康なドナーのＴ細胞において遺伝子導入により発現させることができることを示す（図１）。
【0140】
[実施例２]
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを認識する
遺伝子導入により発現した、組換えＴＣＲの機能性を確認するために、ＴＣＲを形質導入したエフェクターＴ細胞を、ペプチドを負荷したＴ２細胞（標的細胞）と共培養した。ＭＡＧＥ－Ａ１０由来のＳＬＬペプチド（配列番号１）１０－５Ｍを負荷したＴ２細胞は陽性標的としての役割を果たし、無関係のペプチド（配列番号２２）を負荷したＴ２細胞は陰性標的としての役割を果たした。エフェクター細胞として、ＣＤ８濃縮Ｔ細胞に形質導入して、組換えＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲまたは陰性対照ＴＣＲ（配列番号２２による無関係のペプチドに対して特異的なＴＣＲ）を安定して発現させた。エフェクター細胞と標的細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、２：１のＥ：Ｔで共培養させた。共培養の約２０時間後に、上清を回収し、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを認識する
遺伝子導入により発現した、組換えＴＣＲの機能性を確認するために、ＴＣＲを形質導入したエフェクターＴ細胞を、ペプチドを負荷したＴ２細胞（標的細胞）と共培養した。ＭＡＧＥ－Ａ１０由来のＳＬＬペプチド（配列番号１）１０－５Ｍを負荷したＴ２細胞は陽性標的としての役割を果たし、無関係のペプチド（配列番号２２）を負荷したＴ２細胞は陰性標的としての役割を果たした。エフェクター細胞として、ＣＤ８濃縮Ｔ細胞に形質導入して、組換えＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲまたは陰性対照ＴＣＲ（配列番号２２による無関係のペプチドに対して特異的なＴＣＲ）を安定して発現させた。エフェクター細胞と標的細胞を、９６ウェル丸底プレートにおいて、２：１のＥ：Ｔで共培養させた。共培養の約２０時間後に、上清を回収し、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。
【0141】
結果：
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを負荷したＴ２細胞と共に培養した際にのみＩＦＮ－γを分泌し、提示されたペプチド：ＭＨＣ複合体の特異的認識が示された。陰性標的である、対照ペプチドを負荷したＴ２細胞は、陰性対照ＴＣＲによってのみ認識された（図２）。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを負荷したＴ２細胞と共に培養した際にのみＩＦＮ－γを分泌し、提示されたペプチド：ＭＨＣ複合体の特異的認識が示された。陰性標的である、対照ペプチドを負荷したＴ２細胞は、陰性対照ＴＣＲによってのみ認識された（図２）。
【0142】
[実施例３]
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＭＡＧＥ－Ａ１０陽性腫瘍細胞株を認識し、死滅させる
ＴＣＲの有効性、特異性および臨床適用に対するその適合性を分析するために、腫瘍細胞株のセットを、ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞と共培養した際のＩＦＮ－γ分泌および細胞毒性を測定することによって、ＴＣＲ媒介性認識について試験した。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１／ＭＡＧＥ－Ａ１０陽性腫瘍細胞株を認識し、死滅させる
ＴＣＲの有効性、特異性および臨床適用に対するその適合性を分析するために、腫瘍細胞株のセットを、ＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞と共培養した際のＩＦＮ－γ分泌および細胞毒性を測定することによって、ＴＣＲ媒介性認識について試験した。
【0143】
ＩＦＮ－γ放出アッセイでは、エフェクター細胞にＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲまたは陰性対照ＴＣＲを形質導入し、異なる腫瘍細胞株と共培養した。細胞株Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５およびＵＡＣＣ－６２（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋）ならびにＨＬＡ－Ａ２をトランスフェクトした細胞株ＫＹＯ－１（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋）は、陽性標的としての役割を果たした。細胞株Ｍｅｌ６２４．３８および６４７－Ｖ（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０－）は陰性対照としての役割を果たした。細胞株のＨＬＡ－Ａ２発現をフローサイトメトリーによって分析し、ＭＡＧＥＡ１０発現データをｑＰＣＲを使用して作成するか、または当業者に公知の公的に利用可能なデータベースから抽出した（データは示さず）。エフェクター細胞と標的細胞を２：１のＥ：Ｔで９６ウェル丸底プレートに播種し、約２０時間の共培養後に上清を回収し、ＩＦＮ－γのレベルを標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって分析した。細胞毒性アッセイでは、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍデバイスを使用して、３日にわたって長期死滅アッセイを実施した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標）デバイスは、細胞のライブイメージングを可能にする顕微鏡に基づくシステムである。腫瘍細胞株のセット（ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋：Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５およびＵＡＣＣ－６２、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０－：Ｍｅｌ６２４．３８および６４７－Ｖ）を９６ウェル平底プレートのウェル中に播種し（ウェル当たり２０，０００個の細胞）、ＴＣＲを発現するエフェクターＴ細胞と共培養した（ウェル当たり１００，０００個の細胞）。腫瘍細胞株は、核に限定される赤色蛍光タンパク質ｍＫａｔｅ２を安定して発現し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（商標） Ｚｏｏｍシステムが、７２時間の総期間にわたり複数の時点で各ウェルにおける赤色蛍光細胞の量（ＲＣＵにおける全積分強度×μｍ２／イメージ、ＲＣＵ＝赤色較正単位）を決定することを可能にした。経時的に増加したウェル当たりの細胞数が腫瘍細胞の成長を示し、一方、ウェル当たりの細胞数の低下は、蛍光標的細胞のＴＣＲ媒介性細胞毒性を示すことになる。
【0144】
結果：
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋腫瘍細胞株Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５およびＫＹＯ－１と共培養した場合にＩＦＮ－γを放出したが、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０－細胞株Ｍｅｌ６２４．３８および６４７－Ｖには応答しなかった。また、Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋腫瘍細胞株ＵＡＣＣ６２は認識されなかった。陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞株のいずれも認識しなかった。ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋腫瘍細胞株Ａ３７５およびＮＣＩ－Ｈ１７５５は、ＭＡＧＥ－Ａ１０－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって死滅し、ＵＡＣＣ６２細胞の成長は阻害された。ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０－細胞株Ｍｅｌ６２４．３８および６４７－Ｖは死滅せず、陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞株のいずれも溶解しなかった。これらの結果は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、腫瘍細胞株において生理的レベルのＨＬＡ－Ａ＊０２のＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを認識することができ、これらの細胞に対する細胞毒性を媒介することができることを示す（図３Ａおよび４Ｂ）。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞は、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋腫瘍細胞株Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５およびＫＹＯ－１と共培養した場合にＩＦＮ－γを放出したが、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０－細胞株Ｍｅｌ６２４．３８および６４７－Ｖには応答しなかった。また、Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋腫瘍細胞株ＵＡＣＣ６２は認識されなかった。陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞株のいずれも認識しなかった。ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０＋腫瘍細胞株Ａ３７５およびＮＣＩ－Ｈ１７５５は、ＭＡＧＥ－Ａ１０－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞によって死滅し、ＵＡＣＣ６２細胞の成長は阻害された。ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥＡ１０－細胞株Ｍｅｌ６２４．３８および６４７－Ｖは死滅せず、陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞は、腫瘍細胞株のいずれも溶解しなかった。これらの結果は、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞が、腫瘍細胞株において生理的レベルのＨＬＡ－Ａ＊０２のＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを認識することができ、これらの細胞に対する細胞毒性を媒介することができることを示す（図３Ａおよび４Ｂ）。
【0145】
[実施例４]
他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの潜在的な交差認識の分析
ＭＡＧＥ－Ａファミリーの他のメンバーが、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドと非常に類似するペプチド配列を含有し得るため、他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの潜在的なＴＣＲ媒介性交差認識をさらに調査した。ＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの発現は、がんおよび精巣においてだけでなく、生命維持に必要な器官においても記載されており、タンパク質由来のペプチドの潜在的な交差認識が、臨床開発のためのＴＣＲに対する除外基準であるとする。
他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの潜在的な交差認識の分析
ＭＡＧＥ－Ａファミリーの他のメンバーが、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドと非常に類似するペプチド配列を含有し得るため、他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの潜在的なＴＣＲ媒介性交差認識をさらに調査した。ＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーの発現は、がんおよび精巣においてだけでなく、生命維持に必要な器官においても記載されており、タンパク質由来のペプチドの潜在的な交差認識が、臨床開発のためのＴＣＲに対する除外基準であるとする。
【0146】
他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーを起源とする内因的に処理され、提示されるペプチドの認識について調査するために、これらは、ＨＬＡ－Ａ２陽性Ｋ５６２細胞において組換え発現された。細胞株を共培養し、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するエフェクター細胞と共に組換えＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーを発現させることによって、ＭＡＧＥファミリーのメンバー由来のペプチドの潜在的な交差認識を分析した。
【0147】
ＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞に、以下のＭＡＧＥファミリーのメンバー：ＭＡＧＥ－Ａ１（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（受託）：ＮＭ＿００４９８８．５）、ＭＡＧＥ－Ａ２（ＮＭ＿００５３６１．３）、ＭＡＧＥ－Ａ３（ＮＭ＿００５３６２．４）、ＭＡＧＥ－Ａ４（ＮＭ＿００１０１１５４８．１）、ＭＡＧＥ－Ａ５（ＮＭ＿０２１０４９．４）、ＭＡＧＥ－Ａ６（ＮＭ＿００５３６３．３）、ＭＡＧＥ－Ａ８（ＮＭ＿００１１６６４００．１）、ＭＡＧＥ－Ａ９（ＮＭ＿００５３６５．４）、ＭＡＧＥ－Ａ１１（ＮＭ＿００５３６６．４）、ＭＡＧＥ－Ａ１２（ＮＭ＿００１１６６３８６．３）をコードする構築物を形質導入し、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲまたは陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞と共培養した。約２０時間の共培養後に上清を回収し、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによって分泌されたＩＦＮ－γを分析した。
【0148】
結果：
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１０陽性ＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞のみを認識したが、いずれかの他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーを形質導入したＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞は認識しなかった（図４）。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するＴ細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ１０陽性ＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞のみを認識したが、いずれかの他のＭＡＧＥ－Ａファミリーのメンバーを形質導入したＨＬＡ－Ａ２＋Ｋ５６２細胞は認識しなかった（図４）。
【0149】
[実施例５]
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲに関するＨＬＡ微細分類および潜在的なアロ反応性の分析
ＴＣＲは、ある種のＭＨＣ分子と組み合わせた場合にのみそれらの特異的ペプチドを認識するため、抗原の発現レベルだけでなく、標的細胞のＨＬＡ型も標的を陽性または陰性の標的であると規定する。ＨＬＡ型に依存して、ＴＣＲベースのＡＣＴに関する処置レジメンに患者を含めることも含めないこともある。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲに関するＨＬＡ微細分類および潜在的なアロ反応性の分析
ＴＣＲは、ある種のＭＨＣ分子と組み合わせた場合にのみそれらの特異的ペプチドを認識するため、抗原の発現レベルだけでなく、標的細胞のＨＬＡ型も標的を陽性または陰性の標的であると規定する。ＨＬＡ型に依存して、ＴＣＲベースのＡＣＴに関する処置レジメンに患者を含めることも含めないこともある。
【0150】
ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に加えて、どのＨＬＡ分子が、ＭＡＧＥＡ１０由来のＳＬＬペプチドを提示し得るか、かつＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬを発現するＴ細胞によって認識され得るかを評価するために、詳細な拘束性分析を実施した。したがって、ヨーロッパ人および北アメリカのコーカサス人において最も頻度の高いＨＬＡアロタイプを網羅する５３種のリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）を抗原提示細胞として使用した。ＴＣＲを発現するエフェクター細胞との共培養のために、これらを、ＳＬＬペプチドを負荷せずに、または負荷して使用した（１０－５Ｍ；配列番号１）。共培養は、９６ウェル丸底プレートにおいて２：１のＥ：Ｔで設定した。約２０時間後に上清を回収し、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γのレベルを分析した。
【0151】
結果：
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲの拘束性分析は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示される場合だけでなく、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４に提示される、そのＭＡＧＥＡ１０由来のエピトープをも認識するＴＣＲの能力を示す。負荷されていないＬＣＬは認識されなかったため、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するＴ細胞は、いずれのＨＬＡの交差認識も示さなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲの拘束性分析は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１に提示される場合だけでなく、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０４に提示される、そのＭＡＧＥＡ１０由来のエピトープをも認識するＴＣＲの能力を示す。負荷されていないＬＣＬは認識されなかったため、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するＴ細胞は、いずれのＨＬＡの交差認識も示さなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。
【0152】
[実施例６]
正常細胞の潜在的認識の分析
ＴＣＲの安全プロファイルを調査するために、異なる起源の健康な組織に由来する細胞のＴＣＲ媒介性認識が調査され、除外されなければならない。したがって、ＴＣＲを発現するエフェクターを、腎臓（腎皮質上皮細胞、ＨＲＣＥｐＣ）、肺（肺線維芽細胞、ＮＨＬＦ）、およびｉＰＳ由来の肝細胞、心筋細胞、星状細胞および内皮細胞（ＥＣ）に由来する正常細胞と共培養した。調査した細胞は、抗原ＭＡＧＥ－Ａ１０に対して内因的に陰性であり、したがって、潜在的なＭＡＧＥ－Ａ１０に関連しないオフターゲット毒性の特定が可能になった。正常細胞を解凍し、供給業者に指定されたように、共培養前の１週間培養した。細胞を９６ウェル平底プレートに播種し、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲまたは陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞と共培養した。標的細胞のＨＬＡ－Ａ２発現を、抗体染色およびフローサイトメトリーによって確認した（データは示さず）。標的細胞を未改変または陽性対照としてのＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドの過剰量（１０－５Ｍ）を負荷したかのいずれかで試験した。約２０時間の共培養後に、上清を回収し、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γのレベルを分析した。
正常細胞の潜在的認識の分析
ＴＣＲの安全プロファイルを調査するために、異なる起源の健康な組織に由来する細胞のＴＣＲ媒介性認識が調査され、除外されなければならない。したがって、ＴＣＲを発現するエフェクターを、腎臓（腎皮質上皮細胞、ＨＲＣＥｐＣ）、肺（肺線維芽細胞、ＮＨＬＦ）、およびｉＰＳ由来の肝細胞、心筋細胞、星状細胞および内皮細胞（ＥＣ）に由来する正常細胞と共培養した。調査した細胞は、抗原ＭＡＧＥ－Ａ１０に対して内因的に陰性であり、したがって、潜在的なＭＡＧＥ－Ａ１０に関連しないオフターゲット毒性の特定が可能になった。正常細胞を解凍し、供給業者に指定されたように、共培養前の１週間培養した。細胞を９６ウェル平底プレートに播種し、ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲまたは陰性対照ＴＣＲを発現するＴ細胞と共培養した。標的細胞のＨＬＡ－Ａ２発現を、抗体染色およびフローサイトメトリーによって確認した（データは示さず）。標的細胞を未改変または陽性対照としてのＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドの過剰量（１０－５Ｍ）を負荷したかのいずれかで試験した。約２０時間の共培養後に、上清を回収し、標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡによってＩＦＮ－γのレベルを分析した。
【0153】
結果：
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するＴ細胞は、すべてのＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを負荷した細胞に応答してＩＦＮ－γを放出した。これは、その細胞表面にＴＣＲのエピトープを適切に提示する標的細胞の能力を表す。未改変正常細胞は、トランスジェニックＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するエフェクターによって認識されず、調査されたＴＣＲの好ましい安全プロファイルを示した（図６）。
ＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するＴ細胞は、すべてのＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬペプチドを負荷した細胞に応答してＩＦＮ－γを放出した。これは、その細胞表面にＴＣＲのエピトープを適切に提示する標的細胞の能力を表す。未改変正常細胞は、トランスジェニックＭＡＧＥ－Ａ１０ＳＬＬ－ＴＣＲを発現するエフェクターによって認識されず、調査されたＴＣＲの好ましい安全プロファイルを示した（図６）。
【0154】
本出願は、以下の項目をさらに含む：
【0155】
項目１：ＭＡＧＥＡ１０に対して特異的な単離されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）。
【0156】
項目２：アミノ酸配列である配列番号１またはその断片を特異的に認識する、項目１に記載の単離されたＴＣＲ。
【0157】
項目３：配列番号１のアミノ酸配列のＨＬＡ－Ａ２結合形態を特異的に認識する、項目１および２に記載の単離されたＴＣＲ。
【0158】
項目４：ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１およびＨＬＡ－Ａ＊０２：０４からなる群から選択される遺伝子によってコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、先行する項目のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
【0159】
項目５：ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にコードされた分子によって提示される配列番号１のアミノ酸配列を特異的に認識する、先行する項目のいずれかに記載の単離されたＴＣＲ。
【0160】
項目６：
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
－ 配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号４のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲα鎖、
－ 配列番号５のアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号６のアミノ酸配列を有するＣＤＲ２および配列番号７のアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含むＴＣＲβ鎖
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0161】
項目７：配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0162】
項目８：配列番号８のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲα領域および配列番号９のアミノ酸配列を有する可変ＴＣＲβ領域
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
を含む、先行する実施形態のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0163】
項目９：配列番号１０と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号１１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0164】
項目１０：配列番号８または配列番号１０のアミノ酸配列を有するＴＣＲα鎖および配列番号９または配列番号１１のアミノ酸配列を有するＴＣＲβ鎖
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0165】
項目１１：ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含み、
－ 可変ＴＣＲα領域が、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域が、配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
－ 可変ＴＣＲα領域が、配列番号８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含み、
－ 可変ＴＣＲβ領域が、配列番号９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0166】
項目１２：精製されている、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0167】
項目１３：そのアミノ酸配列が、１つまたは複数の表現型に影響しない置換を含む、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0168】
項目１４：そのアミノ酸配列が、検出可能な標識、治療剤または薬物動態修飾部分を含むよう改変されている、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0169】
項目１５：治療剤が、免疫エフェクター分子、細胞毒性剤および放射性核種からなる群から選択される、項目１４に記載の単離されたＴＣＲ。
【0170】
項目１６：免疫エフェクター分子が、サイトカインである、項目１５に記載の単離されたＴＣＲ。
【0171】
項目１７：可溶性であるかまたは膜に結合している、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0172】
項目１８：薬物動態修飾部分が、少なくとも１つのポリエチレングリコール繰り返し単位、少なくとも１つのグリコール基、少なくとも１つのシアリル基またはそれらの組合せである、項目１４に記載の単離されたＴＣＲ。
【0173】
項目１９：一本鎖タイプのものであり、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖が、リンカー配列によって連結している、先行する項目のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0174】
項目２０：ＴＣＲα鎖またはＴＣＲβ鎖が、エピトープタグを含むように改変されている、項目１から１９のいずれか１つに記載の単離されたＴＣＲ。
【0175】
項目２１：項目１から２０のいずれかのＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチドであって、機能性部分が、配列番号４および７のアミノ酸配列の少なくとも１つを含む、単離されたポリペプチド。
【0176】
項目２２：機能性部分が、配列番号２、３、４、５、６、および７のアミノ酸配列を含む、項目１から２０のいずれかに記載のＴＣＲの機能性部分を含む単離されたポリペプチド。
【0177】
項目２３：機能性部分が、ＴＣＲα可変鎖および／またはＴＣＲβ可変鎖を含む、項目２１に記載の単離されたポリペプチド。
【0178】
項目２４：項目１から２０のいずれか１つで実現されているＴＣＲを含む多価ＴＣＲ複合体。
【0179】
項目２５：ＩＦＮ－γ分泌が、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１にコードされた分子によって提示される、配列番号１のアミノ酸配列に結合することによって誘導される、項目１から２０に記載の単離されたＴＣＲ、項目２１から２３に記載のポリペプチドならびに項目２４に記載の多価ＴＣＲ複合体。
【0180】
項目２６：項目１から２０のいずれか１つに記載のＴＣＲをコードするか、または項目２１から２３に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【0181】
項目２７：項目２６の核酸を含むベクター。
【0182】
項目２８：発現ベクターである、項目２７に記載のベクター。
【0183】
項目２９：レトロウイルスベクターである、項目２７または２８に記載のベクター。
【0184】
項目３０：レンチウイルスベクターである、項目２７または２８に記載のベクター。
【0185】
項目３１：項目１から２０に記載のＴＣＲを発現する細胞。
【0186】
項目３２：単離されるか、または天然に存在しない、項目３１に記載の細胞。
【0187】
項目３３：項目２６に記載の核酸または項目２７から３０に記載のベクターを含む、項目３１および３２に記載の細胞。
【0188】
項目３４：
ａ）項目２６で実現されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）項目１から２０のいずれか１つで実現されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および項目１から２０のいずれか１つで実現されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、項目３１から３３に記載の細胞。
ａ）項目２６で実現されている少なくとも１つの核酸を含む発現ベクター、または
ｂ）項目１から２０のいずれか１つで実現されているＴＣＲのアルファ鎖をコードする核酸を含む第１の発現ベクター、および項目１から２０のいずれか１つで実現されているＴＣＲのベータ鎖をコードする核酸を含む第２の発現ベクター
を含む、項目３１から３３に記載の細胞。
【0189】
項目３５：末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、項目３１から３４のいずれか１つに記載の細胞。
【0190】
項目３６：Ｔ細胞である、項目３１から３５のいずれか１つに記載の細胞。
【0191】
項目３７：ＭＡＧＥＡ１０に対する特異性を媒介する、項目１から２０に記載のＴＣＲの一部に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
【0192】
項目３８：ＭＡＧＥＡ１０特異性を媒介するＴＣＲの部分が、配列番号２、３、４、５、６、および７に示されるＣＤＲ、好ましくは配列番号４のアルファ鎖のＣＤＲ３および／または配列番号７のベータ鎖のＣＤＲ３、より好ましくは配列番号２、３および４に示されるアルファ鎖のＣＤＲおよび配列番号５、６および７のベータ鎖のＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、項目３７に記載の抗体。
【0193】
項目３９：項目１から２０に記載のＴＣＲを含む医薬組成物、項目２１から２３に記載のポリペプチド、項目２４に記載の多価ＴＣＲ複合体、項目２６に記載の核酸、項目２７から３０に記載のベクター、項目３１から３６のいずれか１つに記載の細胞、または項目３７から３８に記載の抗体。
【0194】
項目４０：少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、項目３９に記載の医薬組成物。
【0195】
項目４１：医薬として使用するための、項目１から２０に記載のＴＣＲ、項目２１から２３に記載のポリペプチド、項目２４に記載の多価ＴＣＲ複合体、項目２６に記載の核酸、項目２７から３０に記載のベクター、項目３１から３６のいずれか１つに記載の細胞、または項目３７から３８に記載の抗体。
【0196】
項目４２：がんの処置において使用するための、項目１から２０に記載のＴＣＲ、項目２１から２３に記載のポリペプチド、項目２４に記載の多価ＴＣＲ複合体、項目２６に記載の核酸、請求項２７から３０に記載のベクター、または項目３１から３６のいずれか１つに記載の細胞。
【0197】
項目４３：がんが、血液がんまたは固形腫瘍である、項目４２に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸、ベクターまたは細胞。
【0198】
項目４４：がんが、前立腺がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、腎がん、膵臓がん、卵巣がん、食道がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、扁平上皮癌、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、メラノーマ、肝細胞癌、頭頚部がん、胃がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、胃腺癌、胆管細胞癌、乳がん、膀胱がん、骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される、項目４２および４３に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸、ベクターまたは細胞。
【0199】
項目４５：がんが、好ましくは、肉腫または骨肉腫からなる群から選択される、項目４２および４３に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、多価ＴＣＲ複合体、核酸、ベクターまたは細胞。
【図1】
【図2】
【図3A-3B】
【図4】
【図5A-5B】
【図6】
【配列表】