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特許7461674食道扁平上皮癌の上皮細胞用の培養培地、培養方法、及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-27
(45)【発行日】2024-04-04
(54)【発明の名称】食道扁平上皮癌の上皮細胞用の培養培地、培養方法、及びその用途
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20240328BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240328BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240328BHJP
C07D 475/00 20060101ALN20240328BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
C12Q1/02
G01N33/15 Z
C07D475/00
【請求項の数】
17
(21)【出願番号】P 2022562624
(86)(22)【出願日】2020-04-23
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-25
(86)【国際出願番号】 CN2020086374
(87)【国際公開番号】W WO2021208130
(87)【国際公開日】2021-10-21
【審査請求日】2022-12-13
(31)【優先権主張番号】202010293661.3
(32)【優先日】2020-04-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522178669
【氏名又は名称】合肥中科普瑞昇生物医▲薬▼科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】100122471
【弁理士】
【氏名又は名称】籾井 孝文
(74)【代理人】
【識別番号】100150212
【弁理士】
【氏名又は名称】上野山 温子
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ 青松
(72)【発明者】
【氏名】胡 ▲潔▼
(72)【発明者】
【氏名】王 文超
(72)【発明者】
【氏名】▲陳▼ 程
(72)【発明者】
【氏名】任 涛
(72)【発明者】
【氏名】王 黎
【審査官】平林 由利子
(56)【参考文献】
【文献】中国特許出願公開第１０５８０１５８２（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－ ３３／９８
Ｃ０７Ｄ ４５１／００－５２１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
初代食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ）の上皮細胞を培養するための初代細胞培養培地であって、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とＲＯＣＫキナーゼ阻害剤とを含むことを特徴とし、前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、式（Ｉ）：
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、並びに１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニルから選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ３アルキルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、及びＣ４～Ｃ８シクロアルキルアルキルから選択され、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含み、前記ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤は、Ｙ２７６３２である、初代細胞培養培地。
【請求項2】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、式（Ｉａ）：【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニルから選択され、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、
Ｒ６は、独立して、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む、請求項１に記載の初代細胞培養培地。
【請求項3】
Ｒ１が１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルであり、Ｒ５が水素であり、
Ｒ６ がフルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである、請求項２に記載の初代細胞培養培地。
【請求項4】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤が、以下の化合物又はその薬学的に許容され得る塩から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の初代細胞培養培地。【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【請求項5】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、０．３μＭ～１０μＭであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項6】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、０．７５μＭ～６μＭであることを特徴とする、請求項５に記載の初代細胞培養培地。
【請求項7】
前記ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量が、２μＭ～６μＭであることを特徴とする、請求項５に記載の初代細胞培養培地。
【請求項8】
前記培養培地中の前記ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量が、０．３μＭ～２０μＭであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項9】
前記培養培地中の前記ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量が、２．５μＭ～１５μＭであることを特徴とする、請求項８に記載の初代細胞培養培地。
【請求項10】
前記培養培地中の前記ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量が、７．５μＭ～１２．５μＭであることを特徴とする、請求項８に記載の初代細胞培養培地。
【請求項11】
上皮成長因子；インスリン－トランスフェリン－セレン複合体；Ｂ２７添加剤又はＮ２添加剤；肝細胞成長因子；Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８、ＬＹ３６４９４、及びＳＪＮ２５１１の少なくとも１つから選択されるＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤；並びにＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、ＶＸ－７０２、ＶＸ－７４５、ＰＤ１６９３１６、ＲＯ４４０２２４７、及びＢＩＲＢ７９６の少なくとも１つから選択されるＰ３８／ＭＡＰＫ阻害剤の１つ以上の因子を更に含有することを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項12】
前記上皮成長因子の量が、１２．５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、前記インスリン－トランスフェリン－セレン複合体中のインスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量が、それぞれ２．５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであり、
前記Ｂ２７添加剤又はＮ２添加剤の体積濃度が、１：２５～１：２００であり、
前記肝細胞成長因子の量が、２．５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌであり、
前記ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤の量が、１２５ｎＭ～５００ｎＭであり、
前記Ｐ３８／ＭＡＰＫ阻害剤の量が、１２５ｎＭ～５００ｎＭであることを特徴とする、請求項１１に記載の初代細胞培養培地。
【請求項13】
前記上皮成長因子の量が、５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、
前記インスリン－トランスフェリン－セレン複合体中のインスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量が、それぞれ５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであり、
前記Ｂ２７添加剤又はＮ２添加剤の体積濃度が、１：２５～１：５０であり、
前記肝細胞成長因子の量が、１０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌであり、
前記ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤の量が、２５０ｎＭ～５００ｎＭであり、
前記Ｐ３８／ＭＡＰＫ阻害剤の量が、２５０ｎＭ～５００ｎＭであることを特徴とする、請求項１１に記載の初代細胞培養培地。
【請求項14】
血清、ウシ下垂体抽出物、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ＢＭＰ阻害剤、ニコチンアミド、又はＮ－アセチルシステインを含まないことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項15】
前記初代ＥＳＣＣ上皮細胞が、ＥＳＣＣ腫瘍細胞、正常ＥＳＣＣ上皮細胞、及びＥＳＣＣ上皮幹細胞から選択されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地。
【請求項16】
初代ＥＳＣＣ上皮細胞を培養する方法であって、（１）請求項１～１５のいずれか一項に記載の初代細胞培養培地を調製する工程と、
（２）細胞外マトリックスゲル希釈剤で培養容器をコーティングする工程と、
（３）ＥＳＣＣ組織から分離した初代ＥＳＣＣ上皮細胞を前記コーティングされた培養容器に接種し、工程（１）の前記初代細胞培養培地を用いて培養する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項17】
ＥＳＣＣ疾患を治療するための薬剤を評価又はスクリーニングする方法であって、（１）請求項１６に記載される前記培養方法により、前記ＥＳＣＣ上皮細胞を培養する工程と、
（２）試験する前記薬剤を選択し、種々の薬剤濃度勾配に希釈する工程と、
（３）工程（１）で得られた前記ＥＳＣＣ上皮細胞に、勾配に希釈した前記薬剤を添加し、細胞生存率を検出する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医療技術分野に関し、特に食道扁平上皮癌の初代上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養又は増殖させるための培養培地及び培養方法、更には培養細胞を薬効評価及び薬物スクリーニングに用いる方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
食道癌は、世界で最も多く見られる消化器系の悪性腫瘍の一つである。国立癌センターの最新統計によると、悪性腫瘍の発生率トップ１０のうち、食道癌は男性で６位、女性で２位となっている。世界の多くの地域で、局所発生率が上昇しているが、中国は食道癌の高発生地域であり、年間罹患数は２４６０００人、年間平均死亡者数は約１５００００人で全国の癌死亡数の２１．８％を占め、最も死亡数の多い癌の中で第４位である（国立癌センター、２０１９年のデータ）。近年、食道癌の分子タイピング及び病態形成の研究が幾らか進んでいるが、食道癌の分子タイピングが中国と外国では異なるため、特に進行期の食道扁平上皮癌（ＥＳＣＣ：esophageal squamous cell carcinoma）に対する治療手段はまだ限られており、個人に合わせた的確な投薬指導はできていない。ＥＳＣＣは腺癌と異なり、比較的明確な分子標的がないため、分子診断及び遺伝子診断に基づくだけでは実際に臨床薬の効果を予測することは困難である。
【0003】
機能的試験とは、癌患者の細胞に対する抗腫瘍薬の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法を指す。この方法を適用する鍵となるのは、短い成長周期を有し、ＥＳＣＣ患者の生物学的特徴を表し得る腫瘍細胞モデルを開発することである。さらに、癌患者に適時に精密投薬指導を与えるには、この細胞モデルは、臨床投薬の有効性を迅速かつ効率的に予測する操作が容易であるべきである。しかしながら、癌患者の初代腫瘍細胞からの細胞モデルのｉｎ ｖｉｔｒｏでの樹立の成功率が通常低いこと、成長周期が長いこと、及び間葉系細胞（例えば、線維芽細胞等）の過剰増殖等の問題は全て、この分野における開発を制限する。現在、腫瘍細胞の機能的試験の分野において比較的成熟している初代上皮／幹細胞を培養する技術は２つ存在する。一方は、照射されたフィーダー細胞及びＲＯＣＫキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を使用して初代上皮細胞の成長を促進し、個別の患者の薬物感受性を調査することであり、つまり、条件付き細胞リプログラミング技術である（非特許文献１）。もう一方の技術は、成体幹細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで３Ｄ培養して、組織及び器官に類似したオルガノイドを得ることである（非特許文献２）。
【0004】
しかしながら、どちらの技術にも或る特定の制限がある。細胞リプログラミングは、患者の自己初代上皮細胞をマウス由来のフィーダー細胞と共培養する技術である。これらのマウス由来の細胞の存在は、患者の初代細胞に対する薬物感受性試験の間に、患者の自己初代細胞の薬物感受性試験の結果に干渉する可能性があり、一方で、マウス由来のフィーダー細胞がノックアウトされると、患者の自己初代細胞がリプログラミング環境から外れる可能性があり、細胞増殖速度及び細胞内シグナル伝達経路が大幅に変化する可能性があることから（非特許文献３、非特許文献４）、薬物に対する患者の自己初代細胞の奏効が大きく影響されるという結果がもたらされる。オルガノイド技術は、３Ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養用の細胞外マトリックス内に患者の自己初代上皮細胞を埋め込むフィーダー細胞を必要としない技術であるため、マウス由来のフィーダー細胞の干渉の問題はない。しかしながら、オルガノイド技術の培養培地には、様々な特定の成長因子（例えば、Ｗｎｔタンパク質、及びＲ－スポンジンファミリータンパク質等）を加える必要があることから、これは高価であり、臨床における広範な使用には適していない。さらに、培養過程全体を通して、オルガノイドは細胞外マトリックスゲル内に埋め込まれている必要があり、細胞接種、継代、及び薬物感受性試験の播種工程は、２Ｄ培養操作と比較して面倒で時間がかかる。さらに、この技術によって形成されるオルガノイドのサイズを制御することは困難であり、一部のオルガノイドは大きくなりすぎて内部壊死を引き起こす可能性がある。したがって、オルガノイド技術は２Ｄ培養技術よりも操作性及び適用性に劣っている。これには専門の技術者が操作する必要があるため、臨床におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物感受性試験のための広範囲かつ幅広い使用には適していない（非特許文献５）。
【0005】
上記の技術の制限に鑑みて、外因性細胞からの干渉なしに、短い培養期間、抑制可能なコスト、及び簡便な操作をもたらし得る、臨床における初代ＥＳＣＣ上皮細胞用の培養技術を開発することが必要とされている。この技術を適用して初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞モデルを構築すると、培養ＥＳＣＣ腫瘍細胞は、ＥＳＣＣ患者の生物学的特徴を表し得る。個別の癌患者に由来する細胞モデルにおいて抗腫瘍薬の感受性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することにより、抗腫瘍薬の奏効率を臨床において改善することができ、不適切な薬物によって患者に引き起こされる痛み及び医療資源の浪費を減らすことができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【文献】Liu et al., Am J Pathol, 180: 599-607, 2012
【文献】Hans Clevers et al., Cell, 11; 172(1-2): 373-386, 2018
【文献】Liu et al., Am J Pathol, 183(6): 1862-1870, 2013
【文献】Liu et al., Cell Death Dis., 9(7): 750, 2018
【文献】Nick Barker, Nat Cell Biol, 18(3): 246-54, 2016
【発明の概要】
【0007】
従来技術の不足に鑑みて、本発明は、初代ＥＳＣＣ上皮細胞を培養する培養培地、及び該培養培地を使用して初代ＥＳＣＣ上皮細胞を培養する方法を提供することを意図している。本発明の初代ＥＳＣＣ上皮細胞培養培地及び培養方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養期間が短く、コストを抑制可能であり、操作が簡便であり、外因性細胞からの干渉がないという目標を達成することができる。この技術を適用して初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞モデルを構築すると、ＥＳＣＣ患者の生物学的特徴を有する初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を得ることができ、これらを新薬スクリーニング及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物感受性試験において適用することができる。
【0008】
本発明の一態様は、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とＲＯＣＫキナーゼ阻害剤とを含む、初代ＥＳＣＣ上皮細胞を培養するための初代細胞培養培地を提供することであり、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は式（Ｉ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含み、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤はＹ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２からなる群から選択される少なくとも１つである。
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、Ｃ２～Ｃ６スピロシクロアルキル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリール（例えば、フェニル及びナフチル等）、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたアリールＣ１～Ｃ６アルキル（例えば、フェニルメチル等）、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたヘテロアリール（例えば、チエニル等）から選択され、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１～Ｃ６アルキル、好ましくはＣ１～Ｃ３アルキル、より好ましくはメチルから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ４～Ｃ８シクロアルキルアルキル、ヒドロキシルＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６ハロアルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキルアミノＣ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルコキシＣ１～Ｃ６アルキル及びＣ３～Ｃ６ヘテロシクリルＣ１～Ｃ６アルキル（ヘテロシクリルは、例えば、ピペリジル、テトラヒドロピラニル等から選択される）から選択され、
Ｒ６は、ハロゲン（好ましくはフルオロ及びクロロ、より好ましくはフルオロ）、Ｃ１～Ｃ６アルキル（好ましくはメチル）、Ｃ１～Ｃ６アルコキシ（好ましくはメトキシ）、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキル（好ましくはトリフルオロメチル）から選択される）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含み、ＲＯＣＫキナーゼ阻害剤はＹ２７６３２、ファスジル及びＨ－１１５２からなる群から選択される少なくとも１つである。
【0009】
好ましい実施の形態において、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、式（Ｉａ）：
（式中、
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ６アルキル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニル、１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたチエニル、及び１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルメチルから選択され、より好ましくは、Ｒ１は１個～２個のＲ６で任意に独立して置換されたフェニルであり、
Ｒ５は、水素、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ３～Ｃ６シクロアルキルから選択され、より好ましくは、Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、ハロゲン、Ｃ１～Ｃ６アルキル、及びＣ１～Ｃ６ハロアルキルから独立して選択され、より好ましくは、Ｒ６は、フルオロ、メチル又はトリフルオロメチルである）の化合物、又はその薬学的に許容され得る塩若しくは溶媒和物を含む。
【0010】
好ましくは、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、以下の化合物又はその薬学的に許容され得る塩、若しくは溶媒和物から選択される少なくとも１つである：
【0011】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【0012】
最も好ましくは、本発明のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は化合物１であり、本発明のＲＯＣＫキナーゼ阻害剤はＹ２７６３２であることが好ましい。
【0013】
本発明の実施の形態において、培養培地中のＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の量は、通常０．３μＭ～１０μＭ、好ましくは０．７５μＭ～６μＭ、より好ましくは２μＭ～６μＭである。さらに、培養培地中のＲＯＣＫキナーゼ阻害剤の量は、通常、０．３μＭ～２０μＭ、好ましくは２．５μＭ～１５μＭ、より好ましくは７．５μＭ～１２．５μＭである。
【0014】
好ましくは、本発明の初代細胞培養培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）；インスリン－トランスフェリン－セレン複合体；Ｂ２７添加剤又はＮ２添加剤；肝細胞成長因子（ＨＧＦ）；Ａ８３－０１、ＳＢ４３１５４２、Ｒｅｐｓｏｘ、ＳＢ５０５１２４、ＳＢ５２５３３４、ＳＤ２０８、ＬＹ３６４９４、及びＳＪＮ２５１１の少なくとも１つから選択されるＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤；並びにＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、ＶＸ－７０２、ＶＸ－７４５、ＰＤ１６９３１６、ＲＯ４４０２２４７、及びＢＩＲＢ７９６の少なくとも１つから選択されるＰ３８／ＭＡＰＫ阻害剤の１つ以上の因子を更に含有する。
【0015】
好ましい実施の形態において、ＥＧＦの量は、１２．５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体中のインスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムのそれぞれの量は、それぞれ２．５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはそれぞれ５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌであり、培養培地中のＢ２７添加剤又はＮ２添加剤の体積濃度は、１：２５～１：２００、より好ましくは１：２５～１：５０であり、ＨＧＦの量は、２．５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌであり、ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤は、好ましくはＡ８３－０１であり、ＴＧＦβ Ｉ型受容体阻害剤の量は、１２５ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは２５０ｎＭ～５００ｎＭであり、Ｐ３８／ＭＡＰＫ阻害剤は、好ましくはＳＢ２０２１９０であり、Ｐ３８／ＭＡＰＫ阻害剤の量は、１２５ｎＭ～５００ｎＭ、好ましくは２５０ｎＭ～５００ｎＭである。
【0016】
条件付き細胞リプログラミング培地及びＥＳＣＣ上皮細胞オルガノイド培地と比較すると、この培地の組成には、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とＲＯＣＫキナーゼ阻害剤（特に好ましいのは化合物１とＹ２７６３２）の組合せが添加されているが、血清、ウシ下垂体抽出物等の不確定成分、Ｗｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ＢＭＰ阻害剤等、オルガノイド培養に必要なニッチ因子（niche factors）を含有せず、またニコチンアミド及びＮ－アセチルシステインを含まないことにより、培地の費用を大幅に削減し、培地調製の操作プロセスを簡略化し、コスト制御が可能で、操作性の良い初代ＥＳＣＣ上皮細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養を実現する。
【0017】
本発明においては、初代ＥＳＣＣ上皮細胞は、ＥＳＣＣ腫瘍細胞、正常ＥＳＣＣ上皮細胞、及びＥＳＣＣ上皮幹細胞から選択され得る。
【0018】
本発明の一態様は、以下の工程を含む、初代ＥＳＣＣ上皮細胞を培養する方法を提供することである：
【0019】
（１）本発明の初代細胞培養培地を上記組成に従って調製する工程。
【0020】
（２）培養容器を細胞外マトリックスゲル希釈剤でコーティングする工程。
【0021】
具体的には、細胞外マトリックスゲルとしては、低成長因子型の細胞外マトリックスゲルを使用することができ、例えば、市販のＭａｔｒｉｇｅｌ（Corningから購入）又はＢＭＥ（Trevigenから購入）を使用することができる。より詳細には、細胞外マトリックスゲルは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Corningから購入）であり得る無血清培地で希釈される。細胞外マトリックスゲルの希釈比は、１：５０～１：４００、好ましくは１：１００～１：２００である。コーティング法は、希釈された細胞外マトリックスゲルを培養容器に加えて、培養容器の底部を完全に覆い、３０分間以上放置し、好ましくはコーティングを３７℃で３０分～６０分間放置することを含む。コーティングが完了した後に、余分な細胞外マトリックスゲル希釈剤を廃棄することで、培養容器は後続使用の準備が整う。
【0022】
（３）初代ＥＳＣＣ上皮細胞をＥＳＣＣ組織から分離する工程。
【0023】
初代ＥＳＣＣ上皮細胞は、例えば、ＥＳＣＣ組織試料及び傍癌組織試料から取得され得る。例えば、ＥＳＣＣ組織試料は、説明を受けた上で同意したＥＳＣＣ患者の癌組織から外科的切除によって取得され、傍癌組織試料は、食道組織から少なくとも５ｃｍ離れたＥＳＣＣ組織から採集される。上述の組織試料の採集は、外科的摘除又は生検から３０分以内に行われる。より詳細には、滅菌環境において、非壊死部位からの組織試料を０．５ｍｍ３を超える体積で切り取った後に、組織試料を予冷した１０ｍＬ～１５ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に入れ、これを蓋付きのプラスチック製滅菌遠心分離チューブ内に入れて、氷上で研究室に輸送する。ここでは、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、１体積％～２体積％のペニシリン、ストレプトマイシン、及び／又は０．２体積％～０．４体積％のプリモシン（Primocin）を含有する（以下、組織輸送液と称する）。ストレプトマイシン／ペニシリンを用いる場合、ストレプトマイシンの濃度範囲は２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは２００μｇ／ｍＬであり、ペニシリンの濃度範囲は２５Ｕ／ｍＬ～４００Ｕ／ｍＬ、好ましくは５０Ｕ／ｍＬ～２００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは２００Ｕ／ｍＬであり、プリモシンを用いる場合、濃度範囲は２５μｇ／ｍＬ～４００μｇ／ｍＬ、好ましくは５０μｇ／ｍＬ～２００μｇ／ｍＬ、より好ましくは１００μｇ／ｍＬである。
【0024】
生物学的安全キャビネット内で、組織試料を細胞培養ディッシュに移した後に、これを輸送液ですすぎ、組織試料の表面上の血球を洗い流す。すすいだ組織試料を別の新しい培養ディッシュに移し、１ｍＬ～３ｍＬの輸送液を加え、滅菌メス刃及び鉗子を使用して組織試料を体積３ｍｍ３未満の組織片に分ける。
【0025】
組織試料片を遠沈管に移し、卓上遠心機（Sigma、３－１８Ｋ）にて１５００ｒｐｍで３分～５分間遠心分離を行う。上清を捨てた後、組織輸送液と組織消化液を１：１の割合で加える（投与量は、組織１０ｍｇ当たり組織消化液約５ｍＬであり、組織消化液の調製方法は、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ、１ｍｇ／ｍＬ～２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ、５０Ｕ／ｍＬ～１００Ｕ／ｍＬデオキシリボ核酸Ｉ、０．５ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ、０．１ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬ塩化カルシウム、５ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンをＨＢＳＳ及びＲＰＭＩ－１６４０に体積比１：１の条件で溶解させることを含む）。次いで、試料に番号を付け、シールフィルムで封をし、そして３７℃、２００回転～３００回転の恒温式振盪機（Zhichu Instrument ＺＱＬＹ－１８０Ｎ）で消化する。消化が完了したかどうかを１時間ごとの観察により判断する。明らかな組織ブロックが見つからない場合は、消化を終了することができ、そうでなければ、４時間～８時間の範囲の消化時間で、十分な消化が行われるまで消化を続ける。消化後、未消化の組織ブロックを細胞フィルタースクリーン（細胞スクリーンのメッシュサイズは、例えば７０μｍである）で濾過する。フィルタースクリーン上の組織ブロックを組織輸送液ですすぎ、残留細胞を遠沈管にすすぎ入れ、卓上遠心機で１５００ｒｐｍ、３分～５分間遠心分離を行う。上清を捨てた後、残った細胞塊を観察して血球が残っているかどうかを判断する。血球があれば血球溶解液（Sigmaから購入）３ｍＬを加えた後よく混ぜ、５分に１回よく振って混ぜながら４℃で１０分～２０分間溶解する。溶解後に得られたものを取り出して１５００ｒｐｍで３分～５分間遠心分離する。上清を捨てた後、本発明の初代細胞培養培地を加えて再懸濁する。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd.）で計数し、細胞の総数を求める。
【0026】
（４）工程（３）で分離された初代ＥＳＣＣ上皮細胞をコーティングされた培養容器に接種し、工程（１）で得られた初代細胞培養培地を用いて培養する工程。
【0027】
より具体的には、初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を６ウェルプレートの１ウェルに２×１０４細胞／ｃｍ２～８×１０４細胞／ｃｍ２の密度（例えば、４×１０４細胞／ｃｍ２）で接種する。２ｍＬ～３ｍＬの初代上皮細胞培養培地を加えた後、細胞インキュベーター内で、例えば３７℃、５％ＣＯ２の条件下で８日～１６日間培養する。培養中４日ごとに新鮮な初代細胞培養培地を使用して交換する。初代ＥＳＣＣ上皮細胞が、６ウェルプレート底面積の約８０％～９０％を占める細胞密度に成長したら消化及び継代を行う。
【0028】
この接種工程はフィーダー細胞の使用を必要とせず、条件付き細胞リプログラミング技術と比較して、フィーダー細胞を培養及び照射する操作工程が省略される。オルガノイド技術と比較して、この工程は、初代細胞とマトリックスゲルとを氷上で均一に混合して、ゲル液滴を形成し、ゲル液滴の固化を待ってから培地を添加することを必要としない。事前にコーティングされた培養容器を、初代細胞の接種に直接的に使用することができる。さらに、培養容器をコーティングするのに少量の希釈された細胞外マトリックスゲルしか必要とされないため、オルガノイド技術と比較して、高価な細胞外マトリックスゲルの節約となるとともに、操作工程の簡素化がもたらされる。
【0029】
任意に、接種した初代ＥＳＣＣ上皮細胞を８日～１６日間培養した後、培養容器内に形成された細胞クローンが底面積の８０％を覆うように収束したら、上清を捨て、１ｍＬ～２ｍＬの０．０５％トリプシン（Thermo Fisherから購入）を加え細胞消化を行い、次いで室温で５分～２０分間インキュベートする。消化された細胞は、例えば５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有する２ｍＬ～４ｍＬの培養液に再懸濁し、１５００ｒｐｍで３分～５分間遠心分離する。消化された単一細胞を、本発明の初代細胞培養培地を使用して再懸濁し、得られた細胞懸濁液を、細胞外マトリックスゲルでコーティングされたＴ２５細胞培養フラスコに入れて連続培養する。Ｔ２５細胞培養フラスコのコーティング操作は、工程（２）における操作と同じである。
【0030】
増殖したＥＳＣＣ上皮細胞は２Ｄで成長することから、不均一なサイズのオルガノイドが避けられ、オルガノイド技術を使用した増殖において起こり得る過剰成長したオルガノイドの内部壊死が回避される。
【0031】
別の態様において、本発明の初代ＥＳＣＣ上皮細胞の培養方法によって培養したＥＳＣＣ上皮細胞、特にＥＳＣＣ腫瘍細胞を、以下の工程を含む薬効評価及び薬物スクリーニングに使用することができる：
【0032】
（１）初代ＥＳＣＣ上皮細胞を得て、より好ましくは、ＥＳＣＣ患者に由来する癌組織試料又は生検癌組織試料を得て、初代ＥＳＣＣ上皮細胞を分離し、上記初代ＥＳＣＣ上皮細胞を培養する方法に従って初代ＥＳＣＣ上皮細胞（特に初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞）を少なくとも１０５個の大きさ、好ましくは少なくとも１０６個の大きさの細胞数まで培養して増殖させる工程。
【0033】
（２）試験する薬物を選択する工程。
【0034】
（３）基準として薬物の最大血漿濃度Ｃｍａｘに基づき、初期濃度としてＣｍａｘの２倍～５倍を取り、薬物を種々の濃度勾配、例えば５個～１０個の薬物濃度勾配、好ましくは６個～８個の薬物濃度勾配へと希釈する工程。
【0035】
（４）工程（１）において培養したＥＳＣＣ上皮細胞を消化して単一細胞懸濁液にし、フローイメージングカウンターで細胞数を計数し、本発明の初代細胞培養培地で単一細胞懸濁液を希釈し、希釈された細胞懸濁液を１ウェル当たり２０００個～４０００個の細胞の密度でマルチウェルプレートに一様に、例えば１ウェル当たり５０μＬの細胞希釈液で加え、一晩付着させる工程。
【0036】
この工程により、フィーダー細胞の存在が初代細胞の計数及びその後の初代細胞生存率アッセイに干渉し得るという細胞リプログラミング技術の問題が避けられ、オルガノイド技術でのようなマトリックスゲルを含む細胞懸濁液を氷上で混合し、埋め込み、その後に播種するという面倒な工程の必要性が排除されることから、操作法が大幅に簡易化され、技術の操作性及び実用性が向上する。接種される細胞はオルガノイドのような３Ｄ構造ではなく単一細胞懸濁液であるため、この技術では、オルガノイド技術と比較して、播種細胞数がより均一になり、ウェル間の細胞数の変動がより小さくなり得ることから、その後の高スループット薬物スクリーニング操作により適したものとなる。
【0037】
（５）高スループット自動ワークステーションを使用して、工程（４）において得られた付着細胞に、従来の化学療法薬、標的薬、抗体薬、又はそれらの組合せ等の選択された候補薬物を勾配希釈で添加する工程。
【0038】
（６）薬物を添加した数時間後、例えば７２時間後に、Ｃｅｌｌ－Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ発光細胞生存率検出キット（Promegaから購入）を使用してＥＳＣＣ上皮細胞の生存率を検出して、薬物活性をスクリーニングする工程。
【0039】
詳細には、各ウェルに、例えば１０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬（Promegaから購入）を加え、均一に振盪した後に、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて各ウェルの化学発光強度を測定する。横軸として薬物濃度を取り、縦軸として蛍光強度を取ることで、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、測定値に基づいて薬物用量－効果曲線を作成し、試験された細胞の増殖に対する薬物の阻害強度を計算する。
【0040】
本発明の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を薬物スクリーニング及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬物感受性試験において使用する場合に、これは細胞共培養システムではないため、細胞リプログラミング技術におけるフィーダー細胞が試験結果に干渉するという現象が起こることはない。細胞の２Ｄ成長のため、薬物との相互作用もオルガノイド技術における薬物試験時間より迅速である（オルガノイド技術における平均投与時間は６日である）。
【0041】
本発明の有益な効果としては、以下のことも挙げられる：
【0042】
（１）初代ＥＳＣＣ上皮細胞の培養の成功率は、８０％超の成功率で改善され得る。
【0043】
（２）ｉｎ ｖｉｔｒｏで初代培養したＥＳＣＣ上皮細胞は、初代細胞の由来患者の病理学的表現型及び異種性を再現することを確実にし得る。
【0044】
（３）培養される初代ＥＳＣＣ上皮細胞は、線維芽細胞によって干渉されない純粋なＥＳＣＣ上皮細胞である。
【0045】
（４）培地の組成には血清が含まれていないため、様々なバッチからの血清の質及び量によって影響されない。
【0046】
（５）ＥＳＣＣ上皮細胞は高効率で増殖することができ、ここで、１０４個レベルの開始細胞数から約２週間以内に１０６個の規模のＥＳＣＣ上皮細胞の増殖に成功し、増殖したＥＳＣＣ上皮細胞は継続的な継代能力を有する。
【0047】
（６）氷上で操作する必要がなく、継代工程においてマトリックスゲルを解離させる必要がなく、細胞の消化及び継代を１０分～１５分以内に完了することができる。
【0048】
（７）初代ＥＳＣＣ培養培地は、高価なＷｎｔアゴニスト、Ｒ－スポンジンファミリータンパク質、ＢＭＰ阻害剤等の因子を必要としないため、培養するコストを抑制可能であり、したがって、これは初代ＥＳＣＣ上皮細胞用の既存のオルガノイド培養培地の簡易化及び改善となり、細胞接種には、初代細胞と混合してゲル液滴を形成するためにより高濃度の細胞外マトリックスを使用する必要がなく、その代わりに少量の細胞外マトリックスゲル希釈液しか必要とされないことから、コストのかかる細胞外マトリックスの量が節約される。
【0049】
（８）操作が簡便である：条件付きリプログラミング技術と比較して、本技術はフィーダー細胞を培養又は照射する必要がないことから、様々なバッチからのフィーダー細胞の質及び量が初代細胞培養の効率に影響を与え得るという問題が回避され、薬物スクリーニングにおける播種及び試験の対象は初代ＥＳＣＣ上皮細胞だけであり、条件付き細胞リプログラミング技術において記載されるような共培養システムにおけるフィーダー細胞の干渉はなく、オルガノイド技術と比較して、本発明において採用される細胞外マトリックスゲルをコーティングする方法において、培養容器を事前に準備することができ、オルガノイド技術でのようにマトリックスゲル内に細胞を埋め込む必要がなく、操作工程は簡単かつ容易である。
【0050】
（９）本技術は、ＥＳＣＣ上皮細胞を大量に培養して高い均一性で提供することができることから、新しい候補化合物の高スループットスクリーニング及び患者に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの高スループット薬物感受性機能的試験に適している。
【0051】
この実施形態の細胞培養培地を使用して、ＥＳＣＣ腫瘍細胞、正常食道上皮細胞、ＥＳＣＣ上皮幹細胞、又はこれらの細胞の少なくともいずれかを含む組織を含む、ヒト又は他の哺乳動物に由来するＥＳＣＣ上皮細胞を培養することができる。同時に、本発明の培養培地を使用して、初代ＥＳＣＣ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖培養するためのキットを開発することも可能である。
【0052】
さらに、この実施形態の培養方法により得られた細胞を、再生医療、ＥＳＣＣ上皮細胞の基礎医学研究、薬物奏効のスクリーニング、及びＥＳＣＣ疾患に関する新薬の開発等において使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0053】
【図1-1】図１Ａ～図１Ｅは、培養培地中の異なる因子が初代ＥＳＣＣ細胞の増殖に及ぼす影響を示し、図１Ｆは、化合物１とＹ２７６３２の組合せを異なる濃度で含有する培養培地が、初代ＥＳＣＣ細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図2】培養培地中の因子の増加が初代ＥＳＣＣ細胞の増殖に及ぼす影響を示す図である。
【図4】図４Ａ及び図４Ｂは、１つの臨床ＥＳＣＣ組織試料（番号０Ｆ００６２）から分離した細胞を、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて、それぞれ４日目及び１２日目まで培養し、倒立顕微鏡下で撮影したＥＳＣＣ腫瘍細胞の写真である。
【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、１つのＥＳＣＣ組織（番号０Ｆ００６５）に由来する初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を、細胞外マトリックスゲルＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングした条件及びＭａｔｒｉｇｅｌでコーティングしない条件で、それぞれ１１日目まで培養した細胞の顕微鏡写真である。
【図7】６つの外科的に切除したＥＳＣＣ試料（番号０Ｆ００５６、０Ｆ００６０、０Ｆ００６１、０Ｆ００６２、０Ｆ００７１、０Ｆ００７５）から分離した細胞を５種類の異なる培養培地の条件下で１６日間培養して得られた細胞増殖効果の比較図である。
【図8】１つの臨床ＥＳＣＣ組織試料（番号０Ｆ００７５）から分離した細胞を、５種類の異なる培養培地の条件下で培養して得られた細胞成長曲線の比較図である。
【図10】図１０Ａ及び図１０Ｂは、それぞれ、１つの外科的に切除したＥＳＣＣ試料（番号０Ｆ００５３）と、該試料（番号０Ｆ００５３）から分離した細胞を本発明の培養培地ＦＥＭで培養して得たＥＳＣＣ腫瘍細胞の免疫組織化学的結果の比較図である。
【図11-1】図１１Ａ～図１１Ｄは、それぞれ、外科的に切除した１つのＥＳＣＣ試料（番号０Ｆ００２５）と、該試料（番号０Ｆ００２５）から分離した細胞を本発明の培養培地ＦＥＭで培養して得られた異なる継代のＥＳＣＣ腫瘍細胞のコピー数変動分析結果の比較図である。
【図12】１つの臨床ＥＳＣＣ組織試料（番号０Ｆ００６１）から分離した細胞を、本発明の培養培地ＦＥＭ、及び種々の成分を減じて得た培養培地の条件下でそれぞれ培養して得られた細胞成長曲線の比較図である。
【発明を実施するための形態】
【0054】
本明細書では、上皮細胞は、上皮組織から得られた分化した上皮細胞及び上皮幹細胞を含む。「上皮幹細胞」とは、上皮細胞に分化し得る長期自己複製能を有する細胞であり、上皮組織由来の幹細胞である。上皮組織の例としては、角膜、口腔粘膜、皮膚、結膜、膀胱、腎尿細管、腎臓、消化器（食道、胃、十二指腸、小腸（空腸及び回腸含む）、大腸（結腸含む））、肝臓、膵臓、乳腺、唾液腺、涙腺、前立腺、毛根、気管、肺等が挙げられる。中でも、本実施形態の細胞培養培地は、食道由来の上皮細胞用の培養培地であることが好ましい。
【0055】
さらに、本明細書では、「上皮性腫瘍細胞」とは、上述の上皮組織に由来する細胞の腫瘍化によって得られる細胞を指す。
【0056】
本明細書では、「オルガノイド」とは、制御された空間内で細胞が自発的に高密度に組織化及び凝集して形成された３次元の器官様細胞組織を指す。
【0057】
［ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤の調製例］
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
本明細書では、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤とは、直接的又は間接的にＭＳＴ１／２シグナル伝達を負に制御するあらゆる阻害剤を指す。一般に、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１／２キナーゼに結合することにより、ＭＳＴ１／２キナーゼの活性を低下させる。ＭＳＴ１とＭＳＴ２は構造が似ているため、ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＳＴ１又はＭＳＴ２に結合してその活性を低下させる化合物であってもよい。
【0058】
１．ＭＳＴ１／２キナーゼ阻害剤化合物１の調製
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド１
【化3】
【0059】
メチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ２）：２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）酢酸（２．０ｇ）、次いでメタノール（３０ｍｌ）を丸底フラスコに加え、続いて塩化チオニル（１．２ｍｌ）を氷浴下で滴下して加えた。反応系を８５℃で一晩反応させた。反応終了後、この系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られた白色固体をそのまま次の工程に使用した。
【0060】
メチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（Ａ３）：丸底フラスコにメチル２－アミノ－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２ｇ）、次いでアセトン（３０ｍｌ）及び炭酸カリウム（２．２ｇ）を加え、次いで氷塩浴で系を－１０℃に冷却した後、アセトン中の２，４－ジクロロ－５－ニトロピリミジン（３．１ｇ）の溶液をゆっくりと加えた。反応系を室温で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、濾液から減圧下で溶剤を除去し、残渣を加圧シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、化合物Ａ３を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３５９．０。
【0061】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ４）：丸底フラスコにメチル２－（（２－クロロ－５－ニトロピリミジン－４－イル）アミノ）－２－（２，６－ジフルオロフェニル）アセテート（２．５ｇ）、次いで酢酸（５０ｍｌ）及び鉄粉（３．９ｇ）を加えた。反応系を６０℃で２時間撹拌した。反応終了後、反応系を減圧下で蒸発させて溶剤を乾燥させ、得られたものを飽和炭酸水素ナトリウム溶液でアルカリ性に中和し、酢酸エチルで抽出した。有機相を水と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ４を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ２９７．０。
【0062】
２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（Ａ５）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（２ｇ）及びＮ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（１０ｍｌ）を加え、－３５℃に冷却し、続いてヨードメタン（０．９ｍｌ）、次いで水素化ナトリウム（６１５ｍｇ）を加え、反応系を２時間撹拌した。反応終了後、反応混合物を水でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機相をそれぞれ水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機相を濾過し、減圧下で蒸発乾固させて、粗生成物を得た。粗生成物をジエチルエーテルで洗浄し、化合物Ａ５を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ３２５．０。
【0063】
４－（（７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－６－オキソ－５，６，７，８－テトラヒドロプテリジン－２－イル）アミノ）ベンズスルファミド（１）：丸底フラスコに２－クロロ－７－（２，６－ジフルオロフェニル）－５，８－ジメチル－７，８－ジヒドロプテリジン－６（５Ｈ）－オン（１００ｍｇ）、スルファニルアミド（５３ｍｇ）、ｐ－トルエンスルホン酸（５３ｍｇ）及びｓｅｃ－ブタノール（５ｍｌ）を加えた。反応系を１２０℃で一晩撹拌した。反応終了後、反応混合物を濾過し、メタノール及びジエチルエーテルで洗浄し、化合物１を得た。ＬＣ／ＭＳ：Ｍ＋Ｈ ４６１．１。
【0064】
２．本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物の調製
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
本発明の他のＭＳＴ１／２阻害剤化合物を化合物１と同様の方法で合成し、それらの構造及び質量スペクトルデータを以下の表に示す。
【0065】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【表2-4】
【表2-5】
【0066】
［実施例１］
ヒト初代ＥＳＣＣ上皮細胞の分離
ＥＳＣＣ組織試料、すなわち試料番号０Ｆ００６０、０Ｆ００６１及び０Ｆ００６２は、インフォームドコンセントを得た３人のＥＳＣＣ癌患者の癌組織から外科的切除により得られたものである。以下、試料の１つ（番号０Ｆ００６０）について説明する。
ヒト初代ＥＳＣＣ上皮細胞の分離
ＥＳＣＣ組織試料、すなわち試料番号０Ｆ００６０、０Ｆ００６１及び０Ｆ００６２は、インフォームドコンセントを得た３人のＥＳＣＣ癌患者の癌組織から外科的切除により得られたものである。以下、試料の１つ（番号０Ｆ００６０）について説明する。
【0067】
上述の組織試料を、外科的摘除又は生検の後３０分以内に収集した。より具体的には、無菌環境下で、非壊死部位の組織試料を０．５ｃｍ３超の体積で切り出し、あらかじめ冷却した４ｍＬの組織輸送液（表１に示す具体的な処方）に入れた。輸送液は５ｍＬの蓋付きプラスチック製滅菌凍結保存チューブ（Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd.から購入）に入れ、コールドチェーン（０℃～１０℃）で実験室に運んだ。
【0068】
【表3】
【0069】
【表4】
【0070】
生物学的安全キャビネット内で、組織試料（番号０Ｆ００６０）を１００ｍｍの細胞培養ディッシュ（NESTから購入）に移した。この組織試料を組織輸送液ですすいだ。組織試料の表面上の残留した血液を洗い流した。組織試料の表面上の脂肪等の余分な組織を取り除いた。すすいだ組織試料を別の新しい１００ｍｍの培養ディッシュに移し、２ｍＬの輸送液を加え、滅菌メス刃及び鉗子を使用して、組織試料を体積３ｍｍ３未満の組織片に分けた。
【0071】
組織試料片を１５ｍＬ遠沈管に移し、卓上遠心機（Sigma、３－１８Ｋ）で１５００ｒｐｍ、４分間遠心分離した。上清を捨てた後、組織輸送液と組織消化液を１：１の比で加えた（投与量は組織１０ｍｇに対して組織消化液約５ｍＬであり、具体的な処方を表２に示した）。次いで、試料に番号を付けてシールフィルムで封をした後、３７℃、３００回転の恒温式振盪機（Zhichu Instrument ＺＱＬＹ－１８０Ｎ）で消化した。消化が完了したかどうかを１時間ごとの観察により判断した。
【0072】
消化後、未消化の組織ブロックを７０μｍのフィルタースクリーンで濾過した。フィルタースクリーン上の組織ブロックを組織輸送液ですすぎ、残留した細胞を遠沈管にすすぎ入れ、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離を行った。
【0073】
上清を捨てた後、残った細胞塊を観察して血球が残っているかどうかを判断した。血球があれば血球溶解液（Sigmaから購入）３ｍＬを加えた後よく混ぜ、５分に１回よく振って混ぜながら４℃で１５分間溶解した。溶解後に得られたものを取り出して１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した。上清を捨て、消化及び分離された初代ＥＳＣＣ細胞を提供し、これに基礎培地（ＢＭ）を加えて再懸濁した。基礎培地は、市販のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に０．２体積％のプリモシン（Invivogenから購入、濃度５０ｍｇ／ｍＬ）を加え、最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd．）で計数して得た総細胞数は２２８００００個であった。
【0074】
他の２つのＥＳＣＣ腫瘍組織試料を上記と同じ方法に従って分離し、総細胞数はそれぞれ１４７００００個（０Ｆ００６１）及び２６８００００個（０Ｆ００６２）であった。
【0075】
［実施例２］
初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地の最適化
（１）異なる因子による影響
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciences製）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して、細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに５００μｌ／ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地の最適化
（１）異なる因子による影響
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciences製）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して、細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに５００μｌ／ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
【0076】
基礎培地（ＢＭと略記する）の調製：ＢＭを、市販のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地に０．２体積％のプリモシン（Invivogenから購入、濃度５０ｍｇ／ｍＬ）を加え、最終濃度１００μｇ／ｍＬとなるように調製した。
【0077】
次に、基礎培地（ＢＭ）に異なる種類と濃度の添加剤因子（表３）を加え、種々の添加剤成分を含有するＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地を調製した。
【0078】
【表5】
【0079】
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）でコーティングした４８ウェルプレートに、種々の成分を含む培養培地を５００μｌ／ウェルの容量で添加した。実施例１に記載されるものと同じ方法に従ってＥＳＣＣ組織から分離したＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６４）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆４８ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種した。表面消毒後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）内にプレートを置き、同数の分離したてのＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６４）を異なる培地処方の下で培養するようにした。培養開始後、４日ごとに培養培地を一新した。１２日間の培養後、細胞計数を行った。実験コントロールとして、添加物を一切含まない基礎培地（ＢＭ）を使用した。結果を図１Ａ～図１Ｅに示した。各図の縦軸は、基礎培地ＢＭでの培養後に得られた細胞数に対する、異なる培地での培養後に得られた細胞数の比を表す。図に示すように、ＢＭに表３に示す種々の濃度の異なる因子を添加すると、細胞増殖に異なる影響を与えることがわかる。中でも、Ｂ２７添加物、Ｎ２添加物、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体、上皮成長因子、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子１、化合物１、及びＹ２７６３２は或る特定の濃度範囲で細胞増殖に対して促進効果を有する。
【0080】
（２）Ｙ２７６３２と化合物１の組み合わせの効果
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciencesから購入）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに５００μｌ／ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciencesから購入）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに５００μｌ／ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
【0081】
基礎培地ＢＭに種々の濃度のＹ２７６３２及び化合物１（表４）を加え、種々の添加剤成分を含有するＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地を調製した。
【0082】
【表6】
【0083】
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）でコーティングした４８ウェルプレートに、種々の成分を含む培養培地を５００μｌ／ウェルの容量で添加した。実施例１に記載の方法に従ってＥＳＣＣ組織から分離したＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６３）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆４８ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種した。表面消毒後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）内にプレートを置き、同数の分離したてのＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６３）を異なる培地処方の下で培養するようにした。培養開始後、４日ごとに培養培地を一新した。１２日間の培養後、細胞計数を行った。実験コントロールとして、基礎培地ＢＭを使用した。結果を図１Ｆに示した。図に示すように、Ｙ２７６３２と化合物１の種々の濃度の組合せは、細胞増殖に対して一定の相乗効果を示し、１０μＭのＹ２７６３２と３μＭの化合物１の濃度の組合せが、最も好ましい効果を有する。
【0084】
（３）本発明の方法により得られた初代ＥＳＣＣ細胞の増殖に及ぼす培養培地中の増加因子の影響
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciencesから購入）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに５００μｌ／ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciencesから購入）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに５００μｌ／ウェルで加えて、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
【0085】
基礎培地ＢＭにそれぞれ種々の低分子、添加剤、及び成長因子（表５）を順に添加し、種々の添加剤成分を含有するＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地を調製した。
【0086】
【表7】
【0087】
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）でコーティングした４８ウェルプレートに、種々の成分を含む培養培地を５００μｌ／ウェルの容量で添加し、同時にＢＭ培地を実験コントロールとして使用した。実施例１に記載の方法に従ってＥＳＣＣ組織から分離したＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６５）をＭａｔｒｉｇｅｌ被覆４８ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で接種した。表面消毒後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Thermo Fisherから購入）内にプレートを置き、同数の分離したてのＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６５）を異なる培地処方の下で培養するようにした。１０日間の培養後、細胞計数を行った。結果を図２に示した。図に示すように、本特許において、初代ＥＳＣＣ細胞の培養及び増殖に最も好ましい培養培地は番号８（以下、ＦＥＭと略記する）であると決定した。これに基づいて、いくつかの因子又は低分子阻害剤を更に添加しても、細胞増殖の促進に大きな効果は得られないことがわかった。
【0088】
（４）本発明で得られた初代ＥＳＣＣ細胞の増殖に及ぼす異なる濃度の添加剤因子の影響
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciences製）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに２００μｌ／ウェルで加え、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
細胞外マトリックスゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標））（BD Biosciences製）を無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中に１：１００で希釈して細胞外マトリックス希釈液を調製し、これを４８ウェル培養プレートに２００μｌ／ウェルで加え、培養プレートのウェルの底部を完全に覆った。得られたものを３７℃のインキュベーター内で１時間放置した。１時間後、細胞外マトリックス希釈液を除去し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆プレートを得た。
【0089】
本発明の初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地（ＦＥＭと略記する）の調製：基礎培地（ＢＭ）に、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子ＥＧＦ、最終濃度１０ｎｇ／ｍｌの肝細胞成長因子ＨＧＦ、１：５０の希釈比のインスリン－トランスフェリン－セレン複合体（ＩＴＳ）ストック溶液（ＦＥＭ培地中、最終濃度１０μｇ／ｍｌのインスリン、最終濃度５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、及び最終濃度５ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム）、希釈比１：５０のＢ２７添加剤、最終濃度３μＭの化合物１、最終濃度１０μＭのＹ２７６３２、最終濃度５００ｎＭのＴＧＦβ１阻害剤Ａ８３－０１、及び最終濃度５００ｎＭのＰ３８／ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０２１９０を加え、初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地を調製した。
【0090】
ＥＳＣＣ患者の癌組織（試料番号０Ｆ００６５）から、実施例１と同様の方法を使用して癌組織に由来するＥＳＣＣ上皮細胞を分離し、取得した。次に、癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数し、総細胞数を求めた。次いで、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）被覆１２ウェルプレートに、４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。調製した初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを２ｍＬ、１２ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、１２ウェルプレート内の培地上清を捨て、５００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）を加え細胞消化を行った。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）で観察したところ、細胞は完全に消化されていた。その後、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１ｍｌを用いて消化を終了させた。得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を捨てた。遠心分離した細胞沈殿物を基礎培地ＢＭに再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数して総細胞数を求めた。得られた細胞を、以下の培養実験に用いた。
【0091】
次に、種々の処方の以下の８種類の培養培地を調製し、実験を行った。
【0092】
製剤１：Ｂ２７添加剤を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤２：インスリン－トランスフェリン－セレン複合体を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤３：上皮成長因子を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤４：肝細胞成長因子を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤５：Ｙ２７６３２を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤６：化合物１を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤７：Ａ８３－０１を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤８：ＳＢ２０２１９０を含まないＦＥＭ培地組成。
製剤２：インスリン－トランスフェリン－セレン複合体を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤３：上皮成長因子を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤４：肝細胞成長因子を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤５：Ｙ２７６３２を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤６：化合物１を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤７：Ａ８３－０１を含まないＦＥＭ培地組成；
製剤８：ＳＢ２０２１９０を含まないＦＥＭ培地組成。
【0093】
消化された細胞懸濁液を上記製剤１～製剤８でそれぞれ希釈し、４８ウェルプレートに１ウェル当たり１００００細胞及び２５０μＬの容量で蒔いた。
【0094】
製剤１の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、Ｂ２７添加剤の最終濃度がそれぞれ１：２００、１：１００、１：５０、及び１：２５になるように調製したＢ２７添加剤を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤１の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0095】
製剤２の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体ストック溶液の最終濃度がそれぞれ１：２００、１：１００、１：５０、及び１：２５になるように（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ２．５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ；５μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ；１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ；及び２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌに対応する）調製したインスリン－トランスフェリン－セレン複合体を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤２の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0096】
製剤３の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、上皮成長因子の最終濃度がそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、２５ｎｇ／ｍＬ、及び１２．５ｎｇ／ｍＬとなるように調製した上皮成長因子を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤３の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0097】
製剤４の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、肝細胞成長因子の最終濃度がそれぞれ２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、及び２．５ｎｇ／ｍＬとなるように調製した肝細胞成長因子を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤４の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0098】
製剤５の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、Ｙ２７６３２の最終濃度がそれぞれ２０μＭ、１５μＭ、１２．５μＭ、１０μＭ、７．５μＭ、５μＭ、及び２．５μＭとなるように調製したＹ２７６３２を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤５の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0099】
製剤６の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、化合物１の最終濃度がそれぞれ６μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１．５μＭ、及び０．７５μＭとなるように調製した化合物１を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤６の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0100】
製剤７の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、Ａ８３－０１の最終濃度がそれぞれ１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、及び１２５ｎＭとなるように調製したＡ８３－０１を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤７の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0101】
製剤８の培地を使用する場合、初代細胞を接種した４８ウェルプレートに、ＳＢ２０２１９０の最終濃度がそれぞれ１０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、及び１２５ｎＭとなるように調製したＳＢ２０２１９０を１ウェル当たり２５０μＬ添加した。製剤８の培地をコントロールウェル（ＢＣ）として使用した。
【0102】
４８ウェルの約８５％まで細胞を増殖させた後、細胞を消化して計数し、コントロールウェル（ＢＣ）の細胞数を参照して比を算出し、結果を図３Ａ～図３Ｈに示した。図３Ａ～図３Ｈのそれぞれにおいて、比は、各培養培地を用いることにより培養された１回目の継代の細胞数と、対応するコントロールウェルにより培養された１回目の継代の細胞数との比を表す。この比が１より大きい場合は、異なる濃度の因子又は低分子化合物を含有する調製培地の増殖促進効果が、コントロールのウェル培地の増殖促進効果よりも好ましいことを示し、この比が１より小さい場合は、異なる濃度の因子又は低分子化合物を含有する調製培地の増殖促進効果が、コントロールのウェル培地の増殖促進効果よりも悪いことを示す。
【0103】
図３Ａ～図３Ｈの結果によれば、培養培地中のＢ２７添加剤の体積濃度は、好ましくは１：２５～１：２００、より好ましくは１：２５～１：５０であり、インスリン－トランスフェリン－セレン複合体の体積濃度は、好ましくは１：２５～１：２００、より好ましくは１：２５～１：１００（インスリン／トランスフェリン／亜セレン酸ナトリウムの最終濃度は、それぞれ２．５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、１．２５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくはそれぞれ５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、２．５μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ～１０ｎｇ／ｍｌに相当する）であり、上皮成長因子の量は、好ましくは１２．５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５０ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、肝細胞成長因子の量は、好ましくは２．５ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ～２０ｎｇ／ｍｌであり、Ｙ２７６３２の量は、好ましくは２．５μＭ～１５μＭ、より好ましくは７．５μＭ～１２．５μＭであり、化合物１の量は、好ましくは０．７５μＭ～６μＭ、より好ましくは２μＭ～６μＭであり、Ａ８３－０１の量は、好ましくは１２５ｎＭ～５００ｎＭであり、より好ましくは２５０ｎＭ～５００ｎＭであり、ＳＢ２０２１９０の量は、好ましくは１２５ｎＭ～５００ｎＭ、より好ましくは２５０ｎＭ～５００ｎＭである。
【0104】
［実施例３］
ヒト初代ＥＳＣＣ上皮細胞の培養
（１）ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の培養
ＥＳＣＣ患者の癌組織（試料番号０Ｆ００６２）から、実施例１と同様の方法を使用して癌組織に由来するＥＳＣＣ上皮細胞を分離し、取得した。次に、癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数し、総細胞数を求めた。その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）被覆１２ウェルプレートに、４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。調製した初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを２ｍＬ、１２ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。
ヒト初代ＥＳＣＣ上皮細胞の培養
（１）ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の培養
ＥＳＣＣ患者の癌組織（試料番号０Ｆ００６２）から、実施例１と同様の方法を使用して癌組織に由来するＥＳＣＣ上皮細胞を分離し、取得した。次に、癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞をフローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数し、総細胞数を求めた。その後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）被覆１２ウェルプレートに、４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した。調製した初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを２ｍＬ、１２ウェルプレートに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。
【0105】
図４Ａは、本実施例によるＭａｔｒｉｇｅｌ被覆１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種後４日目まで培養した細胞の顕微鏡画像（４０倍倒立位相差顕微鏡で撮影）である。顕微鏡で観察したところ、癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍培養細胞は純度が高く、線維芽細胞を含んでいないことを示した。図４Ｂは、本実施例により接種後１２日目まで培養した細胞の顕微鏡画像（４０倍倒立位相差顕微鏡で撮影）である。図４Ａ及び図４Ｂから、分離した初代ＥＳＣＣ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで４日間培養すると、明らかなクローンの形成を顕微鏡下で確認することができ、１２日間増殖させると細胞数が有意に拡大され、本発明の技術はＥＳＣＣ上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖する効率的な技術であることを示唆した。
【0106】
（２）細胞外マトリックスゲルコーティングあり及びなしの条件下でのＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の培養成績の比較
実施例１と同様の方法を使用して、ＥＳＣＣ患者１名の癌組織から癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６５）を分離した。次に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）被覆１２ウェルプレートと、何も処理をしていない１２ウェルプレートに、それぞれ同数（４×１０４細胞／ｃｍ２）の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞０Ｆ００６５を接種した。調製した初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを２ｍＬ、１２ウェルプレートに加え、消毒後３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング条件及びＭａｔｒｉｇｅｌをコーティングしない条件で１１日目まで培養したＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞０Ｆ００６５の顕微鏡画像（１００倍倒立位相差顕微鏡で撮影）である。図から、図５Ａ（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングあり）の細胞密度及び細胞数は、図５Ｂ（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングなし）のものよりも高くなっていることがわかる。同時に、図５Ａでは細胞の老化が見られないのに、図５Ｂでは少数の老化した細胞（細胞体が大きくなった細胞）が見られた。したがって、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆培養プレートは、何も処理しない培養プレートに比べて、ＥＳＣＣ腫瘍細胞の増殖に有利であることが確認できる。
実施例１と同様の方法を使用して、ＥＳＣＣ患者１名の癌組織から癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６５）を分離した。次に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）被覆１２ウェルプレートと、何も処理をしていない１２ウェルプレートに、それぞれ同数（４×１０４細胞／ｃｍ２）の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞０Ｆ００６５を接種した。調製した初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを２ｍＬ、１２ウェルプレートに加え、消毒後３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。図５Ａ及び図５Ｂは、それぞれ、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング条件及びＭａｔｒｉｇｅｌをコーティングしない条件で１１日目まで培養したＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞０Ｆ００６５の顕微鏡画像（１００倍倒立位相差顕微鏡で撮影）である。図から、図５Ａ（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングあり）の細胞密度及び細胞数は、図５Ｂ（Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングなし）のものよりも高くなっていることがわかる。同時に、図５Ａでは細胞の老化が見られないのに、図５Ｂでは少数の老化した細胞（細胞体が大きくなった細胞）が見られた。したがって、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆培養プレートは、何も処理しない培養プレートに比べて、ＥＳＣＣ腫瘍細胞の増殖に有利であることが確認できる。
【0107】
［実施例４］
ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の増殖促進に対する種々の培養培地の影響
（１）種々の培養培地が初代細胞のクローン形成及び初代細胞の増殖効果に及ぼす影響の比較
実施例２と同様の方法で初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを調製し、コントロールとして基礎培地ＢＭを調製した。また、別のコントロールとして、条件付き細胞リプログラミング技術用培養培地ＦＭを追加で調製した。調製工程については、Liu et al., Nat Protoc., 12(2):439-451, 2017を参照されたい。培養培地の処方を表６に示す。同時に、追加のコントロールとして、初代食道癌細胞用培養培地ＫＭを調製した。調製工程については、Karin J. Purdie et al., Cancer Cell Culture:Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 731, 151-159, 2011を参照されたい。培養培地の処方は表７に示す通りである。さらに、追加のコントロールとして、Stemcellから市販の培地ＥｐｉＣｕｌｔ（商標）Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ＥＰＩ培地」ともいう）を購入し、培養培地の処方を表８に示す。
ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の増殖促進に対する種々の培養培地の影響
（１）種々の培養培地が初代細胞のクローン形成及び初代細胞の増殖効果に及ぼす影響の比較
実施例２と同様の方法で初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを調製し、コントロールとして基礎培地ＢＭを調製した。また、別のコントロールとして、条件付き細胞リプログラミング技術用培養培地ＦＭを追加で調製した。調製工程については、Liu et al., Nat Protoc., 12(2):439-451, 2017を参照されたい。培養培地の処方を表６に示す。同時に、追加のコントロールとして、初代食道癌細胞用培養培地ＫＭを調製した。調製工程については、Karin J. Purdie et al., Cancer Cell Culture:Methods and Protocols, Second Edition, Methods in Molecular Biology, vol. 731, 151-159, 2011を参照されたい。培養培地の処方は表７に示す通りである。さらに、追加のコントロールとして、Stemcellから市販の培地ＥｐｉＣｕｌｔ（商標）Ｐｌｕｓ Ｍｅｄｉｕｍ（以下、「ＥＰＩ培地」ともいう）を購入し、培養培地の処方を表８に示す。
【0108】
【表8】
【0109】
【表9】
【0110】
【表10】
【0111】
実施例１と同様の方法を使用して、ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６０）を取得した。次に、以下の５つの培養条件で、同じ密度（４×１０４細胞／ｃｍ２）で細胞の培養を行った。
【0112】
Ａ．本発明の技術：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciences製）でコーティングした２４ウェルプレートに初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、２ｍＬの本発明の初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを用いて培養を行った。
【0113】
Ｂ．条件付き細胞リプログラミング技術：γ線照射されたマウス線維芽細胞系統Ｊ２細胞（Kerafastから購入）に初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、２４ウェルプレートにおいて条件付き細胞リプログラミング培地ＦＭ（詳細な手順は、非特許文献３を参照）を用いて培養を行った。
【0114】
Ｃ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciences製）被覆２４ウェルプレートに初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、２ｍＬの培養培地ＫＭを用いて２４ウェルプレート内で培養を行った。
【0115】
Ｄ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciences製）被覆２４ウェルプレートに初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、２ｍＬの市販の培地ＥＰＩを用いて２４ウェルプレート内で培養を行った。
【0116】
Ｅ．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（BD Biosciences製）被覆２４ウェルプレートに初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、２ｍＬの基礎培地ＢＭを用いて２４ウェルプレート内で培養を行った。
【0117】
上記の５つの培養において、５つの培養条件下で培地を４日ごとに一新して細胞を培養した。同時に、２４ウェルプレートでの各培地の培養下での細胞クローン形成及び細胞増殖状態を観察し、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）で細胞成長状態を撮影することにより記録した。
【0118】
本発明の技術で培養した初代ＥＳＣＣ癌細胞（番号０Ｆ００６０）に対して、培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、２４ウェルプレート内の培地上清を捨て、５００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）を加え細胞消化を行った。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）で観察したところ、細胞は完全に消化されていた。その後、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１ｍｌを用いて消化を終了させた。得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を捨てた。遠心分離した細胞沈殿物を本発明の培養培地に再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数して総細胞数を求めたところ、３６４０００個であった。他の４つの培養条件で培養した細胞は、上記と同様の操作プロセスで消化し、計数した。ＦＭ、ＫＭ、ＥＰＩ、及びＢＭの培地を使用して培養した細胞の総数は、それぞれ３１５０００個、９１０００個、９８０００個、及び８４０００個であった。
【0119】
図６Ａ～図６Ｅの細胞写真は、５種類の異なる培養条件で１４日目まで培養した試料番号０Ｆ００６０の顕微鏡写真（４０倍倒立位相差顕微鏡下）である。このうち、図６Ａは、基礎培地ＢＭを使用して１４日目まで培養した０Ｆ００６０の顕微鏡写真であり、図６Ｂは、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて１４日目まで培養した０Ｆ００６０の顕微鏡写真であり、図６Ｃは、培養培地ＫＭを用いて１４日目まで培養した０Ｆ００６０の顕微鏡写真であり、図６Ｄは、市販の培地ＥＰＩを使用して１４日目まで培養した０Ｆ００６０の顕微鏡写真であり、図６Ｅは、条件付き細胞リプログラミング培地ＦＭを用いて１４日目まで培養した０Ｆ００６０の顕微鏡写真である。図からわかるように、試料０Ｆ００６０は、基礎培地ＢＭ（図６Ａ）で１４日間培養しても、細胞クローンを形成できず、ＫＭ（図６Ｃ）及びＥＰＩ（図６Ｄ）の培養培地で１４日間培養しても、数個の細胞クローンが形成されるだけで、細胞の状態は悪く、条件付きリプログラミング培地ＦＭ（図６Ｅ）で１４日間培養した細胞は或る程度増殖したが、細胞密度及び細胞数は、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて得られたものと比較にならなかった。
【0120】
図７は、６つのＥＳＣＣ患者試料から分離した初代ＥＳＣＣ細胞（番号０Ｆ００５６、０Ｆ００６０、０Ｆ００６１、０Ｆ００６２、０Ｆ００７１、０Ｆ００７５）を実施例１に従って５種類の異なる培養培地の条件下で１６日間培養して得られた細胞増殖効果の比較図であり、図中、√は中程度のクローン形成能及び増殖促進効果を表し、√√は有意なクローン形成能及び増殖促進効果を表し、×はクローン形成がないことを表し、ＮＴは試験していないことを表す。図より、本発明の培養培地は、ＥＳＣＣ組織由来初代細胞の培養において、クローン形成能及び細胞増殖促進効果の点で、他の４つの培養条件に対して有意に優れていることを確認できる。
【0121】
（２）初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の種々の培養培地における連続培養及び成長曲線
この実施例の（１）と同様の方法を使用して、初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭと、コントロールとしての培養培地ＢＭ、ＫＭ、ＦＭ及びＥＰＩを得た。
この実施例の（１）と同様の方法を使用して、初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭと、コントロールとしての培養培地ＢＭ、ＫＭ、ＦＭ及びＥＰＩを得た。
【0122】
ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００７５）を５種類の培養培地で培養した後、この実施例の（１）と同様の方法を使用して消化、継代及び計数した。
【0123】
継代した細胞が培養プレート内で再びプレートの底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、上記の操作方法に従って培養細胞を消化、収集及び計数した。細胞を再び４×１０４細胞／ウェルの密度で接種し、連続培養を行った。
【0124】
以下は、異なる培養条件下での初代ＥＳＣＣ上皮細胞の細胞集団倍加数の算出式である。
集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化された細胞の総数／初回接種時の細胞数）、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化された細胞の総数／初回接種時の細胞数）、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
【0125】
図８は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって描かれた、５種類の異なる培養条件下での０Ｆ００７５細胞の成長曲線を示す。横軸は細胞培養日数を表し、縦軸は累積細胞増殖の倍数、すなわち培養期間中の細胞増殖の倍数を表す。値が大きいほど、一定時間内に細胞が何倍にも増殖しており、すなわち、より多くの細胞が増殖している。傾きは、細胞の増殖速度を表す。図より、本発明の培養培地ＦＥＭで培養したＥＳＣＣ上皮細胞の増殖速度が他の４つの培養条件より優れていることが確認でき、本発明の技術により、初代ＥＳＣＣ上皮細胞を連続培養することができ、３０日間増幅しても増殖速度に変化がないことも確認できる。
【0126】
図９Ａ及び図９Ｃの細胞の写真は、それぞれＦＥＭ及びＥＰＩ培養条件で１回目の継代まで培養した０Ｆ００７５の顕微鏡写真（４０倍倒立位相差顕微鏡下）である。図９Ｂ及び図９Ｄの細胞の写真は、それぞれＦＥＭ及びＥＰＩ培養条件で９回目の継代まで培養した０Ｆ００７５の顕微鏡写真（４０倍倒立位相差顕微鏡下）である。図より、本発明の技術によって、初代ＥＳＣＣ上皮細胞を連続培養することができ、複数回継代して連続培養した後の細胞の形態は、継代前と比較して大きく変化していないことが確認できた。しかしながら、市販の培地ＥＰＩで９回目の継代まで細胞を培養したところ、細胞の形態が大きく変化し、初代ＥＳＣＣ上皮細胞の連続培養の要件を満たすことができなかった。
【0127】
［実施例５］
癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の同定
（１）初代ＥＳＣＣ組織及び継代培養後のＥＳＣＣ細胞の免疫組織化学的同定
ＥＳＣＣ患者の外科的切除試料からほぼ大豆大の癌組織（試料番号０Ｆ００５３）を採取し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドに浸漬した。残りの癌組織から、実施例１と同様の方法でＥＳＣＣ上皮細胞（試料番号０Ｆ００５３）を得た。試料０Ｆ００５３は、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて、実施例３の方法に従い、６回目の継代まで連続培養した。
癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の同定
（１）初代ＥＳＣＣ組織及び継代培養後のＥＳＣＣ細胞の免疫組織化学的同定
ＥＳＣＣ患者の外科的切除試料からほぼ大豆大の癌組織（試料番号０Ｆ００５３）を採取し、１ｍＬの４％パラホルムアルデヒドに浸漬した。残りの癌組織から、実施例１と同様の方法でＥＳＣＣ上皮細胞（試料番号０Ｆ００５３）を得た。試料０Ｆ００５３は、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて、実施例３の方法に従い、６回目の継代まで連続培養した。
【0128】
免疫組織化学アッセイを使用して、試料０Ｆ００５３の元の組織及び６回目の継代まで連続培養して得た初代細胞の重要なＥＳＣＣ関連バイオマーカーの発現を検出した。組織は４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋後、ミクロトームで厚さ４μｍの組織切片に切り出した。その後、通例の免疫組織化学的検出を行った（詳細な手順については、Li et al., Nature Communication, (2018) 9:2983を参照されたい）。使用した一次抗体は、サイトケラチン（ＣＫ）抗体（CSTから購入）、ｐ６３抗体（CSTから購入）、ｐ５３抗体（CSTから購入）、及びＫｉ６７抗体（R&Dから購入）であった。
【0129】
図１０Ａ及び図１０Ｂにより、本発明の技術によってＥＳＣＣ腫瘍細胞（試料番号０Ｆ００５３）から６回目の継代まで培養した細胞上でのＥＳＣＣ関連バイオマーカーの発現が、細胞の由来元の組織切片上のマーカーの発現と一致していたことが確認される。これは、本発明の技術によって培養した細胞が、ＥＳＣＣ患者の癌組織の元の病理学的特徴を維持していることを示唆している。
【0130】
（２）ＥＳＣＣ組織及び癌組織から消化及び培養したＥＳＣＣ細胞のコピー数変動分析
ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００２５）を、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて、実施例３の方法に従って連続培養を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで１回目、２回目、及び３回目と培養及び継代したＥＳＣＣ腫瘍細胞（それぞれＰ１、Ｐ２、Ｐ３）及びＥＳＣＣ患者から手術で直接得た癌組織について、ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ＆ ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（QIAGEN製）を用いて細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。同じ患者から正常食道組織を収集し、同じ方法でゲノムＤＮＡを抽出し、これをバックグラウンドコントロールとして使用した。次に、細胞試料及び組織試料のゲノムＤＮＡに対して全エクソームシーケンスを行い（詳細な操作手順については、非特許文献２を参照されたい）、シーケンス結果を参照ゲノムと比較した。ＣＮＶｋｉｔソフトウェアを使用して比較結果を分析した。全ゲノムの遺伝子コピー数解析にはＣＢＳセグメンテーション（サーキュラーバイナリセグメンテーションアルゴリズム（circular binary segmentation algorithm））を用い、ローリングメジアン（rolling median）ソフトウェアにより、位置及びコピー数の変化が類似した領域の特徴を抽出し、結果を染色体順位に従ってプロットした。図１１Ａ～図１１Ｄから、本発明の技術によって培養された癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞のコピー数の変動は、患者の元の癌組織におけるコピー数の変動と実質的に一致していたことが確認される。
ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００２５）を、本発明の培養培地ＦＥＭを用いて、実施例３の方法に従って連続培養を行った。ｉｎ ｖｉｔｒｏで１回目、２回目、及び３回目と培養及び継代したＥＳＣＣ腫瘍細胞（それぞれＰ１、Ｐ２、Ｐ３）及びＥＳＣＣ患者から手術で直接得た癌組織について、ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ＆ ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（QIAGEN製）を用いて細胞のゲノムＤＮＡを抽出した。同じ患者から正常食道組織を収集し、同じ方法でゲノムＤＮＡを抽出し、これをバックグラウンドコントロールとして使用した。次に、細胞試料及び組織試料のゲノムＤＮＡに対して全エクソームシーケンスを行い（詳細な操作手順については、非特許文献２を参照されたい）、シーケンス結果を参照ゲノムと比較した。ＣＮＶｋｉｔソフトウェアを使用して比較結果を分析した。全ゲノムの遺伝子コピー数解析にはＣＢＳセグメンテーション（サーキュラーバイナリセグメンテーションアルゴリズム（circular binary segmentation algorithm））を用い、ローリングメジアン（rolling median）ソフトウェアにより、位置及びコピー数の変化が類似した領域の特徴を抽出し、結果を染色体順位に従ってプロットした。図１１Ａ～図１１Ｄから、本発明の技術によって培養された癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞のコピー数の変動は、患者の元の癌組織におけるコピー数の変動と実質的に一致していたことが確認される。
【0131】
［実施例６］
初代ＥＳＣＣ細胞の連続的な増殖に対する培養培地からの単一因子又は因子の組み合わせの除去の影響
実施例２と同様の方法で、初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを調製した。コントロールとして、実施例２と同様の方法を使用して基礎培地（以下、「ＢＭ」とも称する）を調製した。さらに、表９に従ってその他６種類の異なる培養培地を調製した。
初代ＥＳＣＣ細胞の連続的な増殖に対する培養培地からの単一因子又は因子の組み合わせの除去の影響
実施例２と同様の方法で、初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを調製した。コントロールとして、実施例２と同様の方法を使用して基礎培地（以下、「ＢＭ」とも称する）を調製した。さらに、表９に従ってその他６種類の異なる培養培地を調製した。
【0132】
【表11】
【0133】
実施例１と同様の方法を使用して、ＥＳＣＣ組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６１）を得た。次に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciences製）被覆２４ウェルプレートに、初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞を４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種した。本発明の初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地（ＦＥＭ）１ｍＬを用い、これを次いで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養を行った。
【0134】
培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、２４ウェルプレート内の培地上清を捨て、４００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）を加え細胞消化を行った。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）で観察したところ、細胞は完全に消化されていた。その後、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液８００μＬを用いて消化を終了させた。得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を捨てた。遠心分離した細胞沈殿物を本発明の培養培地に再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数して総細胞数を求めた。細胞外マトリックスゲルでコーティングした別の２４ウェル培養プレートに２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種し、更に培養を続けた。細胞外マトリックスゲルでコーティングした２４ウェル培養プレートに、他の７種類の異なる培養培地を用いて同じ密度で細胞を接種し、培養した。
【0135】
継代した細胞が培養プレート内で再びプレートの底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、上記の操作方法に従って培養細胞を消化し、収集し、計数した。細胞を再び２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種し、異なる組成を有するそれぞれの培養培地を用いて連続培養を行った。
【0136】
以下は、異なる培養条件下での初代ＥＳＣＣ上皮細胞の細胞集団倍加数の算出式である。
集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化された細胞の総数／初回接種時の細胞数）、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
集団倍加（ＰＤ）＝３．３２×ｌｏｇ１０（消化された細胞の総数／初回接種時の細胞数）、Chapman et al., Stem Cell Research & Therapy 2014, 5:60を参照されたい。
【0137】
図１２は、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによって描かれた、８種類の異なる培養条件下での細胞の成長曲線を示す。横軸は細胞培養日数を表し、縦軸は累積細胞増殖の倍数、すなわち培養期間中の細胞増殖の倍数を表す。値が大きいほど、一定時間内に細胞が何倍にも増殖しており、すなわち、より多くの細胞が増殖している。傾きは、細胞の増殖速度を表す。
【0138】
【0139】
図１２及び図１３の結果からわかるように、本発明の培養培地から化合物１、Ｙ２７６３２、Ａ８３－０１若しくはＳＢ２０２１９０の単独、又は化合物１とＹ２７６３２の組合せ、又はＡ８３－０１とＳＢ２０２１９０の組合せを除くと、細胞の増殖作用は著しく減衰した。中でも、化合物１とＹ２７６３２の複合成分を除いた後は、細胞の増殖速度が著しく低下したことから、本発明の培養培地中の化合物１とＹ２７６３２の複合成分が、細胞の増殖及び連続培養に必要であることが示唆された。
【0140】
［実施例７］
癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞のマウスでの異種移植による腫瘍形成実験
病理診断されたＥＳＣＣ患者１名の癌組織から、実施例１と同様の方法を使用してＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００５６）を分離し、取得した。０Ｆ００６５を実施例３の方法に従って本発明の培養培地ＦＥＭを用いて培養し、ＥＳＣＣ腫瘍細胞数が１×１０７に達した時点で、実施例４と同様の方法を使用してＥＳＣＣ腫瘍細胞を消化し、収集した。本発明のＥＳＣＣ腫瘍細胞用培養培地ＦＥＭとＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）を１：１の割合で混合し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した培養培地１００μＬを用いて５×１０６個のＥＳＣＣ腫瘍細胞を再懸濁し、得られたものを６週齢の雌性高度免疫不全マウス（ＮＣＧ）（Nanjing Model Animal Research Centerから購入）のＥＳＣＣ脂肪パッドと右前肢の腋下にそれぞれ注入した。ＥＳＣＣ腫瘍細胞から生成されたマウスにおける腫瘍の体積及び成長速度を３日ごとに観察して写真撮影した。
癌組織由来の初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞のマウスでの異種移植による腫瘍形成実験
病理診断されたＥＳＣＣ患者１名の癌組織から、実施例１と同様の方法を使用してＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００５６）を分離し、取得した。０Ｆ００６５を実施例３の方法に従って本発明の培養培地ＦＥＭを用いて培養し、ＥＳＣＣ腫瘍細胞数が１×１０７に達した時点で、実施例４と同様の方法を使用してＥＳＣＣ腫瘍細胞を消化し、収集した。本発明のＥＳＣＣ腫瘍細胞用培養培地ＦＥＭとＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）を１：１の割合で混合し、Ｍａｔｒｉｇｅｌと混合した培養培地１００μＬを用いて５×１０６個のＥＳＣＣ腫瘍細胞を再懸濁し、得られたものを６週齢の雌性高度免疫不全マウス（ＮＣＧ）（Nanjing Model Animal Research Centerから購入）のＥＳＣＣ脂肪パッドと右前肢の腋下にそれぞれ注入した。ＥＳＣＣ腫瘍細胞から生成されたマウスにおける腫瘍の体積及び成長速度を３日ごとに観察して写真撮影した。
【0141】
腫瘍細胞接種後１５日目にマウスの２つの腫瘍細胞接種部位の両方において腫瘍形成を観察することができる。１５日目から３０日目まで、マウスにおける腫瘍増殖は明らかであった。これは、本発明の培養方法により培養した癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞がマウスにおいて腫瘍形成性を有することを示している。
【0142】
［実施例８］
癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞の薬物感受性機能的試験
ＥＳＣＣ患者の外科的切除試料を例に取ると、患者由来のＥＳＣＣ腫瘍試料から培養したＥＳＣＣ腫瘍細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験することができることが確認される。
癌組織由来のＥＳＣＣ腫瘍細胞の薬物感受性機能的試験
ＥＳＣＣ患者の外科的切除試料を例に取ると、患者由来のＥＳＣＣ腫瘍試料から培養したＥＳＣＣ腫瘍細胞を使用して、様々な薬物に対する患者の腫瘍細胞の感受性を試験することができることが確認される。
【0143】
１．初代ＥＳＣＣ腫瘍細胞の播種：実施例１の方法に従って得られた分離ＥＳＣＣ腫瘍細胞（番号０Ｆ００６０及び番号０Ｆ００６２）の細胞懸濁液を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（BD Biosciencesから購入）被覆１２ウェルプレートに４×１０４細胞／ｃｍ２の密度で接種した。２ｍＬの調製した初代ＥＳＣＣ上皮細胞用培養培地ＦＥＭを１２ウェルプレートに加え、次いで３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター（Thermo Fisherから購入）に入れ、培養した。培養プレート内の細胞が底面積の約８０％を覆うように成長した時点で、１２ウェルプレート内の培地上清を捨て、５００μＬの０．０５％トリプシン（Gibcoから購入）を加え細胞消化を行った。細胞を３７℃で１０分間インキュベートし、顕微鏡（ＥＶＯＳ Ｍ５００、Invitrogen）で観察したところ、細胞は完全に消化されていた。その後、５％（体積／体積）ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液１ｍＬを用いて消化を終了させた。得られたものを１５ｍＬの遠沈管に収集し、１５００ｒｐｍで４分間遠心分離した後、上清を捨てた。遠心分離した細胞沈殿物を培養培地ＦＥＭに再懸濁し、フローイメージングカウンター（ＪＩＭＢＩＯ ＦＩＬ、Jiangsu Jimbio Technology Co., Ltd）で計数して総細胞数を求めたところ、それぞれ８３００００個及び７６８０００個であった。２０００細胞／ウェル～４０００細胞／ウェルの密度で３８４ウェルプレートに細胞を接種し、一晩細胞を接着させた。
【0144】
２．薬物勾配実験：
（１）薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した：１０μＬの試験される薬物ストック溶液（薬物ストック溶液の濃度は、人体における薬物の最大血中濃度Ｃｍａｘの２倍に基づいて決定された）をそれぞれ取り、２０μＬのＤＭＳＯを含む０．５ｍＬのＥＰチューブに加え、上記のＥＰチューブからの１０μＬの溶液を、２０μＬのＤＭＳＯを入れた２つ目の０．５ｍＬのＥＰチューブへとピペットで移した。つまり、薬物を１：３の比率で希釈した。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる７個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を３８４ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のＤＭＳＯを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。この実施例では、試験する薬物は、ボルテゾミブ（MCEから購入）、マイトマイシン（MCEから購入）、ヒドロキシカンプトテシン（MCEから購入）、及びエルロチニブ（MCEから購入）であった。
（１）薬物貯蔵プレートを勾配希釈法によって調製した：１０μＬの試験される薬物ストック溶液（薬物ストック溶液の濃度は、人体における薬物の最大血中濃度Ｃｍａｘの２倍に基づいて決定された）をそれぞれ取り、２０μＬのＤＭＳＯを含む０．５ｍＬのＥＰチューブに加え、上記のＥＰチューブからの１０μＬの溶液を、２０μＬのＤＭＳＯを入れた２つ目の０．５ｍＬのＥＰチューブへとピペットで移した。つまり、薬物を１：３の比率で希釈した。上記の方法を繰り返して段階的に希釈し、投薬に必要とされる７個の濃度を得た。異なる濃度の薬物を３８４ウェルの薬物貯蔵プレートに加えた。等容量のＤＭＳＯを、コントロールとして溶剤コントロール群の各ウェルに加えた。この実施例では、試験する薬物は、ボルテゾミブ（MCEから購入）、マイトマイシン（MCEから購入）、ヒドロキシカンプトテシン（MCEから購入）、及びエルロチニブ（MCEから購入）であった。
【0145】
（２）高スループット自動ワークステーション（JANUS、Perkin Elmer）を使用して、３８４ウェルの薬物貯蔵プレートにおける様々な濃度の薬物及び溶剤コントロールを、ＥＳＣＣ腫瘍細胞が播種された３８４ウェルの細胞培養プレートに加えた。薬物群及び溶剤コントロール群を、それぞれ３つの反復実験ウェルで配置した。各ウェルに加えた薬物の容量は１００ｎＬであった。
【0146】
（３）細胞生存率の試験：投与７２時間後に、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイキット（Promegaから購入）を使用して、薬物投与後に培養細胞の化学発光値を検出した。化学発光値の大きさは、細胞生存率及び細胞生存率に対する薬物の効果を反映している。調製された１０μＬのＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ検出液を各ウェルに加え、マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Perkin Elmer）を使用して、混合後に化学発光値を検出した。
【0147】
（４）細胞生存率の試験：細胞生存率（％）＝薬物ウェルの化学発光値／コントロールウェルの化学発光値×１００％の式により、種々の薬物で処理した細胞の細胞生存率を算出した。グラフはＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて作成し、半数阻害率ＩＣ５０を算出した。
【0148】
（５）薬物感受性試験結果を図１４に示す。
【0149】
図１４Ａ及び図１４Ｂは、それぞれ、２人の異なるＥＳＣＣ患者の外科的に切除した癌組織試料（試料番号０Ｆ００６０及び試料番号０Ｆ００６２）から培養したＥＳＣＣ腫瘍細胞の、２種類の化学療法剤マイトマイシン及びヒドロキシカンプトテシン、並びに標的薬ボルテゾミブ及びエルロチニブに対する感受性を表す。具体的には、図１４Ａは試料番号０Ｆ００６０から培養したＥＳＣＣ細胞の４剤に対する感受性の結果を示し、図１４Ｂは試料番号０Ｆ００６２から培養したＥＳＣＣ細胞の４剤に対する感受性の結果を示す。これらの結果は、同じ患者からの細胞が異なる薬物に対して異なる感受性を有し、異なる患者からの細胞も同じ薬物に対して異なる感受性を有することを示している。
【産業上の利用可能性】
【0150】
本発明は、初代ＥＳＣＣ上皮細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養又は増殖させるための培養培地及び培養方法を提供する。この培養細胞を、薬効評価及び薬物スクリーニングに利用することができる。したがって、本発明は産業界に適用可能である。
【0151】
以上、本発明を詳細に説明したが、本発明はこれに限定されるものではなく、当業者であれば本発明の原理に従って改変を加えることが可能である。したがって、本発明の原理に従って行われる全ての改変は、本発明の保護範囲に含まれると解釈されるべきである。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図13-3】
【図13-4】
【図14】
