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▶ ナノガップ スブ−エネエメ−パウダー ソシエダッド アノニマの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-27
(45)【発行日】2024-04-04
(54)【発明の名称】精製された原子量子クラスターの調製方法
(51)【国際特許分類】
B22F 9/00 20060101AFI20240328BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240328BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240328BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240328BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240328BHJP
A61K 33/38 20060101ALI20240328BHJP
A61K 33/242 20190101ALI20240328BHJP
A61K 33/34 20060101ALI20240328BHJP
A61K 33/243 20190101ALI20240328BHJP
A61K 31/282 20060101ALI20240328BHJP
A61K 31/175 20060101ALI20240328BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20240328BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20240328BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20240328BHJP
B22F 1/00 20220101ALI20240328BHJP
【ＦＩ】
B22F9/00 B
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A61P35/00
A61P35/04
A61K45/00
A61K33/38
A61K33/242
A61K33/34
A61K33/243
A61K31/282
A61K31/175
A61K31/704
A61K31/7068
A61K41/00
B22F1/00 K
【請求項の数】
29
(21)【出願番号】P 2020569110
(86)(22)【出願日】2019-06-11
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-21
(86)【国際出願番号】 ES2019070403
(87)【国際公開番号】W WO2019238995
(87)【国際公開日】2019-12-19
【審査請求日】2022-05-20
(31)【優先権主張番号】18177210.4
(32)【優先日】2018-06-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】512136651
【氏名又は名称】ナノガップ スブ－エネエメ－パウダー ソシエダッド アノニマ
(74)【代理人】
【識別番号】100120031
【弁理士】
【氏名又は名称】宮嶋 学
(74)【代理人】
【識別番号】100120617
【弁理士】
【氏名又は名称】浅野 真理
(74)【代理人】
【識別番号】100126099
【弁理士】
【氏名又は名称】反町 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100172557
【弁理士】
【氏名又は名称】鈴木 啓靖
(72)【発明者】
【氏名】ダビド、ブセタ、フェルナンデス
(72)【発明者】
【氏名】フェルナンド、ドミンゲス、プエンテ
(72)【発明者】
【氏名】マヌエル、アルトゥーロ、ロペス、キンテラ
【審査官】瀧口 博史
(56)【参考文献】
【文献】欧州特許出願公開第０２４５７５７２（ＥＰ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１４９４２６（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２００９－５０７９９６（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１０４５８８６４５（ＣＮ，Ａ）
【文献】Angewandte Chemie International Edition，ドイツ，2015年05月12日，Volume 54, Issue 26，p.7612-7616
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｂ２２Ｆ
Ｓｃｏｐｕｓ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
３個以下のゼロ価の銀原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を精製する方法であって、以下の工程：ｉ）ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用する工程であって、前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合するか、あるいは３個以下のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合する工程；および
ｉｉ）３個以下のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを単離する工程
を含んでなる方法。
【請求項2】
前記方法がクロマトグラフィー法であり、前記分離媒体が固相であり、前記ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液が移動相である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合し、前記方法が、非結合溶液から３個以下のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを分離することを含んでなり、
前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合する官能基を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記官能基がチオール基である、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記分離媒体が、チオール化樹脂を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記３個以下のゼロ価の銀原子からなる単離されたＡＱＣを、第２の分離媒体に適用し、３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを単離することをさらに含んでなる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の分離媒体が、３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合する官能基を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合する官能基が、芳香族基である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記第２の分離媒体が二本鎖ＤＮＡを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを放出させるために、前記第２の分離媒体を加熱し、前記放出された３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを前記第２の分離媒体から単離するために、洗浄溶液を適用する、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記分離媒体が、３個以下のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合し、前記方法が、非結合溶液中の３個より多いゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを廃棄すること、および前記分離媒体から３個以下のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを単離することを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項12】
前記分離媒体が、３個以下のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣに結合する官能基を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記分離媒体が二本鎖ＤＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項14】
前記分離媒体が３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣのみに結合するように、洗浄溶液を適用して３個未満のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを除去することを含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを放出させるために、前記ＤＮＡを変性させることを含んでなるプロセスによって単離することを含んでなる、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項16】
前記変性させたＤＮＡから、前記放出された３個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを単離するために、第２の洗浄溶液を適用することを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
３個以下のゼロ価の銀原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含んでなる組成物であって、３個より多いゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを実質的に含まない、前記組成物。
【請求項18】
２個のゼロ価の銀原子からなるＡＱＣを実質的に含まない、請求項１７に記載の組成物。
【請求項19】
抗増殖剤と組み合わせて細胞増殖性障害を処置するための医薬組成物であって、請求項１７または１８に記載の組成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項20】
前記細胞増殖性障害が、腫瘍および／または癌である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項21】
前記癌が、肺癌、乳癌、結腸癌または脳癌から選択される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項22】
抗増殖剤と組み合わせてもよい、癌のリンパ節転移を予防するための医薬組成物であって、請求項１７または１８に記載の組成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項23】
抗増殖剤と組み合わせてもよい、癌のリンパ節転移を処置するための医薬組成物であって、請求項１７または１８に記載の組成物を含んでなる医薬組成物。
【請求項24】
前記抗増殖剤が、ＤＮＡ結合剤、ＤＮＡインターカレート剤、アルキル化剤およびヌクレオシド類似体から選択される、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項25】
前記抗増殖剤が、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、カルムスチンおよびドキソルビシンから選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項26】
前記抗増殖剤が、ゲムシタビンである、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項27】
前記組成物および抗増殖剤が同時投与される、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項28】
前記組成物および抗増殖剤が順次投与される、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項29】
放射線療法と組み合わせて細胞増殖性障害を処置するための医薬組成物であって、請求項１７～２８のいずれか一項に記載の組成物を含んでなる医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、原子量子クラスター（atomic quantum cluster）を精製する方法、精製された組成物、および該組成物の使用に関する。
【背景技術】
【0002】
金属の原子量子クラスター（ＡＱＣ）の合成および単離のための新しい方法の出現は、生物学的、触媒的、電子的および光学的なアプリケーションの広い範囲で有望になっている。これらのナノ構造の付加的な利点は、そのサイズが小さく、毒性が比較的低いことにあり、様々な分野、例えば、生物学的ラベルおよびバイオイメージングにおいて、これらのナノ構造を非常に魅力的にしている。
【0003】
ごく最近まで、強い結合リガンドを使用せずに小さな裸の金属クラスター（すなわち、原子数が少なく、およそ１ｎｍよりも小さいＡＱＣ）を化学合成することは、これらの非常に小さな種は非常に反応性が高いと仮定されていたために、実質的に不可能であると考えられていた。しかしながら、これらのクラスターは、フェルミ準位でのＨＯＭＯ－ＬＵＭＯギャップを誘発する強い量子封じ込めにより、予想外に高い安定性を有することが示された。このギャップは、クラスターのサイズが小さくなるにつれて大きくなり、同時に、反応性が低下するため、２原子のみのクラスターはほとんど反応しなくなる。このようなギャップの出現は、バルク（またはナノ）材料とは著しく異なる幾何学的／電子的構造をもたらし、その結果、クラスターに新しい特性、例えば、発光および触媒作用などをもたらす。さらに、小さなクラスター（原子数が１５～２０個程度以下）では、大きなバンドギャップを有することで、高い耐酸化性が得られる。したがって、小さなクラスターの自然な状態は無電荷である。
【0004】
ＥＰ１９１４１９６には、ＡＱＣと命名されたゼロ価の金属クラスター類を得るプロセスが記載されている。それは、ＡＱＣが「金属的」な振る舞いを止め、その振る舞いが事実上の分子的なものになることを見出した。このようにして、ナノ粒子、微粒子またはバルク金属材料では観察されない新しい特性が、これらのクラスターで見られる。この出願では、例えば、２～２７原子のサイズの範囲で安定なＡＱＣを製造するための速度論的に制御された方法が記載されている。
【0005】
ＷＯ２０１２／０５９５７２およびＥＰ２４５７５７２には、細胞増殖性障害の予防および／または処置のための１種以上のＡＱＣと、１種以上の抗悪性腫瘍剤との組み合わせが記載されている。この出願には、癌細胞株に対して細胞毒性および抗増殖作用を有する２～２５個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが記載されており、したがって、細胞増殖性障害を処置するために抗悪性腫瘍剤と組み合わせて、このＡＱＣを使用することができることが記載されている。
【0006】
Buceta et al., Angew. Chemie Int. Ed. 2015, 54: 7612には、３原子の銀クラスター（Ａｇ３－ＡＱＣ）がインターカレーションを介して二本鎖ＤＮＡと相互作用することが報告されている。このインターカレーションは、クラスター内の原子数に厳密に依存し、二重らせんの塩基対の種類（ＡＴまたはＧＣ）に依存しない。しかしながら、Buceta et al.（2015）で試験されたサンプルは、精製されておらず、３原子未満のＡＱＣのみが存在することを保証していなかった。より大きな銀クラスターは、チオール酸化のための強力な触媒活性を示し、細胞死をもたらす。したがって、生物学的活性をマスキングし得る界面活性剤またはその他の強力な結合リガンドを含まない、３原子を有する純粋で高濃度のＡＱＣを得ることが望まれており、これは、実質的な課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、ＡＱＣの精製組成物および精製組成物を調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
第１の態様において、本発明は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を精製する方法であって、以下の工程：
ｉ）ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用する工程であって、前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合するか、あるいは３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する工程；および
ｉｉ）３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離する工程
を含んでなる方法を提供する。
ｉ）ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用する工程であって、前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合するか、あるいは３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する工程；および
ｉｉ）３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離する工程
を含んでなる方法を提供する。
【0009】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の方法によって精製された組成物であって、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない、前記組成物を提供する。
【0010】
別の態様において、本発明は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含んでなる組成物であって、３個より多いのゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない、前記組成物を提供する。
【0011】
別の態様において、本発明は、抗増殖剤と組み合わせて細胞増殖性障害の処置に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。
【0012】
別の態様において、本発明は、場合により抗増殖剤と組み合わせて癌のリンパ節転移の予防に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。
【0013】
別の態様において、本発明は、抗増殖剤と組み合わせて癌のリンパ節転移の処置に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。
【0014】
別の態様では、本発明は、放射線療法と組み合わせて細胞増殖性障害の処置に使用するための本明細書に記載の組成物を提供する。
【0015】
これらの態様およびその他の態様は、以下の説明においてさらに詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】図１は、Ａｇ３クラスター（Ａｇ３－ＡＱＣ）の合成および精製を示す図である。Ａｇ３－ＡＱＣの電気化学的合成法（左）およびチオール化樹脂を使用した精製法（右）のスキームを示す。挿入図：ＤＦＴ計算により、Ａｇ３－ＡＱＣとチオールとの相互作用はエネルギー的に不利であることが示された。
【図6】図６は、ジュリウムアプローチ（Jellium approach）に従った、異なるサイズのいくつかのＡｇクラスターについてのＨＯＭＯ－ＬＵＭＯギャップとＨＯＭＯ－ＬＵＭＯレベルの位置とを示す図である。
【図9】図９は、ヒトトポイソメラーゼの活性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果を示す図である。（ａ）ヒトトポイソメラーゼＩ活性。スーパーコイルＤＮＡ ｐＢＲ３２２は分解された（レーン１）。酵素の作用によって生成された弛緩型ＤＮＡ種は、トポイソメラーゼのＧａｕｓｓｉａｎ分布として存在した（レーン２）。Ａｇ３－ＡＱＣによるＤＮＡの前処理は、用量依存的に酵素の作用を阻害した（レーン３～９）。（ｂ）ヒトトポイソメラーゼＩＩのデカテネーション活性。トポイソメラーゼＩＩはニックの入った（ＮＯＣ）ＤＮＡと、閉環状（ＣＣＣ）ＤＮＡとを生成した（レーン１）。このＤＮＡをＡｇ３－ＡＱＣでプレインキュベートすると、用量依存的に酵素が阻害される（レーン２～７）。ドキソルビシン（ＤＯＸＯ）を阻害剤のポジティブコントロールとして使用した（レーン８）。ｋＤＮＡネットワークは大きすぎてゲルに入らない。画像は、３回の独立した実験の代表である。
【図10】図１０は、Ａｇ３－ＡＱＣはヌクレオソームの不安定化を誘導することを示す図である。（ａ）単一ヌクレオソームを、エトポシド（６０μＭ）、ドキソルビシン（２０μＭ）またはＤＭＳＯ（ビヒクル）で室温４時間、またはＡｇ３－ＡＱＣ（ＡＱＣ、８３ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理した。各反応液から、サンプルの半分を非変性条件下で電気泳動し、ゲルを臭化エチジウム（左、上パネル）および銀（左、下パネル）で染色した。サンプルの残りの部分を分析し、すべての場合に等量のヒストンがロードされていることを確認した（右パネル）。非結合ＤＮＡ、組み立てられたヌクレオソームおよびヒストンの位置を示す。（ｂ）ヌクレオソームを、（ａ）のようにエトポシドもしくはドキソルビシン、または示されたＡｇ３－ＡＱＣ希釈液（初期濃度、ＡＱＣ １：１０＝８３ｎｇ／ｍＬ）でインキュベートした。サンプルをネイティブポリアクリルアミド電気泳動によって分析し、ゲルを臭化エチジウム（上）で最初に染色し、次いで、ヒストンを可視化するために銀（下）で染色した。この画像は、２つの独立した実験の代表である。
【図12】図１２は、Ａｇ３－ＡＱＣ／Ｈ系に対して測定されたＣＤスペクトル曲線を示す図である。（ａ）スペクトル曲線、（ｂ）等温線と、データ対に対して式２をフィッティングさせた線との結合。Ｃ０Ｈ＝２６．７μＭ、ＣＡｇ３－ＡＱＣ／ＣＨ＝０－０．０２。
【図13】図１３は、ＳＴＯＲＭ超解像顕微鏡を使用したクロマチンアクセス性の直接可視化を示す図である。（ａ）従来の顕微鏡（スケールバー４μｍ）およびＳＴＯＲＭ超解像（スケールバー２μｍ）の両方を使用してイメージングされた蛍光ＥｄＵを含む核の代表的な画像。（ｂ～ｄ）未処理条件（ｂ）、Ａｇ３－ＡＱＣで処理した後（ｃ）と遊離銀カチオンで処理した後（ｄ）での細胞内のクロマチンの代表的な再構築ＳＴＯＲＭ画像。（ｅ）クロマチンでカバーされている核面積の割合の定量。（ｆ）クロマチン密度の定量。
【図14】図１４は、Ａｇ３－ＡＱＣはクロマチンへのアクセス性を増加させることを示す図である。（ａ）クロマチンアクセシビリティアッセイの手順の模式図。（ｂ～ｅ）増殖細胞（ｂ）、血清欠乏させたＡ５４９細胞（ｃ）、肺腫瘍サンプル（ｄ）、および腎臓サンプル（ｅ）のΔＣｔグラフ。
【図15】図１５は、Ａｇ３－ＡＱＣおよびシスプラチン（ＣＤＤＰ）の併用投与により、Ａ５４９増殖細胞およびマウスの肺腫瘍において、ＤＮＡに結合している白金の量が増加し、その結果、細胞死亡率が上昇したことを示す図である。（ａ）ＣＤＤＰ単独またはＡｇ３－ＡＱＣまたはＤＯＸとの組み合わせで処理された増殖しているＡ５４９細胞または血清欠乏されたＡ５４９細胞におけるＤＮＡに結合している白金の質量分析による定量。（ｂ）ＣＤＤＰ単独またはＡｇ３－ＡＱＣとの組み合わせで処理されたマウスの臓器におけるＤＮＡに結合している白金の質量分析による定量。（ｃ～ｅ）Ａｇ３－ＡＱＣ単独またはＣＤＤＰ単独またはそれらの組み合わせで処理した増殖しているＡ５４９細胞（ｃ）および血清欠乏させたＡ５４９細胞（ｄ）の細胞生存率のフローサイトメトリー測定。（ｅ）Ａｇ３－ＡＱＣで処理し、２４時間後にＣＤＤＰで処理したＡ５４９増殖細胞。なお、（ｄ）および（ｅ）では、ＣＤＤＰ作用に対するＡｇ３－ＡＱＣ増強効果が失われている。
【図16】図１６は、Ａｇ３－ＡＱＣおよびＣＤＤＰの併用投与は、膠芽腫（Ｕ８７）細胞株（ａ）および乳腺癌（ＭＣＦ７）細胞株（ｂ）において、ＤＮＡに結合している白金の量を増加させることを示す図である。細胞をＡｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で１時間処理し、ＣＤＤＰ（５０μＭ）でさらに２４時間処理した。次いで、細胞を回収し、ＤＮＡを抽出し、質量分析法により白金の量を定量した。データは、１回の実験につき３つのレプリケートで２回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。マンホイットニー検定（（＊）ｐ＜０．０１）。
【図17】図１７は、Ａｇ３－ＡＱＣおよびＤＮＡ作用薬の併用投与を示す図である。Ａ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間後（増殖細胞）（ａ）または７２時間後（非増殖細胞）（ｂ）に、１）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間、さらに完全培地中で２４時間処理し、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間、さらに異なる用量のＣＤＤＰ（ＥＣ５：５μＭ、ＥＣ２５：１０μＭ、ＥＣ５０：５０μＭ、ＥＣ７５：１００μＭ）で２４時間処理した。その後、細胞を溶解し、ブラッドフォード比色法を使用してタンパク質量を定量し、Ｌｕｍａｔ ＢＬ ９５０７ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用して発光を測定した。結果は、抽出されたタンパク質１μｇ当たりの相対発光ユニット（ＲＬＵ）として表された。（ｃ）Ａｇ３－ＡＱＣ併用投与による細胞死の割合を、ＣＤＤＰ単独が１００％（対照）であると見なして評価した。データは、１回の実験につき３つのレプリケートで、２回の独立した実験の平均±ＳＤを示す。マンホイットニー検定（（＊）ｐ＜０．０１）。（ｄ）実験の別のセットにおいて、ＣＤＤＰをカルボプラチン（ＥＣ５：０．２５μＭ、ＥＣ２５：０．５μＭ、ＥＣ５０：１μＭおよびＥＣ７５：２μＭ）またはオキサリプラチン（ＥＣ５：２．５μＭ、ＥＣ２５：１２．５μＭ、ＥＣ５０：５０μＭおよびＥＣ７５：２００μＭ）に置き換え、ＣＤＤＰについて同様の結果が得られた。
【図18】図１８は、培地またはＡｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で１時間前処理し、２４時間後にＣＤＤＰ（５０μＭ）でさらに２４時間処理した細胞培養物におけるＤＮＡに結合しているＣＤＤＰの質量分析定量を示す図である。
【図19】図１９は、Ａｇ３－ＡＱＣとＤＮＡ結合剤との併用投与は、細胞の死亡率を増加させることを示す図である。Ａ５４９細胞を培地またはＡｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で１時間プレインキュベートし、オキサリプラチン（ＯＸＡ）５０μＭ（ａ）、カルボプラチン（ＣＢＣＤＡ）１ｍＭ（ｂ）、ゲムシタビン（ＧＥＭ）１００μＭ（ｃ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）４００μＭ（ｄ）およびドキソルビシン（ＤＯＸ）７．５μＭ（ｅ）で２４時間処理した。次いで、フローサイトメトリーで細胞生存率を測定した。データは、１回の実験につき３つのレプリケートで、３回の独立した実験の平均値±ＳＤを示す。マンホイットニー検定（（＊）ｐ＜０．０１）。（ｆ）細胞内ＤＯＸ取り込み測定。左：ＤＯＸ（７．５μＭ）で４時間処理したＡ５４９細胞、またはＡｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で３０分間前処理し、ＤＯＸ（７．５μＭ）で４時間処理したＡ５４９細胞のフローサイトメトリープロファイル。右：３０分間ＤＯＸ（３．７５μＭおよび７．５μＭ）で処理したＡ５４９細胞、または３０分間Ａｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で前処理し、さらに３０分間ＤＯＸ（３．７５μＭおよび７．５μＭ）で処理したＡ５４９細胞の蛍光顕微鏡像。
【図20】図２０は、Ａｇ３－ＡＱＣはＡ５４９細胞においてＤＮＡ損傷を誘導しないことを示す図である。（ａ）エトポシド（１２．５μＭ）で１時間処理した後のγ－Ｈ２ＡＸリン酸化、Ａｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理した後のγ－Ｈ２ＡＸリン酸化、あるいは、Ａｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理した後、エトポシド（１２．５μＭ）で１時間処理した後のγ－Ｈ２ＡＸリン酸化のフローサイトメトリー測定。インセットは陽性細胞を示し、データは、１回の実験につき３つのレプリケートで、３回の独立した実験の平均±ＳＤを表す。（ｂ）Ａｇ３－ＡＱＣ（８３ｎｇ／ｍＬ）での１時間の処理後のＡ５４９細胞のコメットアッセイはまた、ＤＮＡ損傷の不在を示す。Ｈ２Ｏ２は陽性対照として含まれていた。
【発明を実施するための形態】
【0017】
定義
本明細書を通して使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
本明細書を通して使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。
【0018】
本明細書を通して、任意の量に関する「約」という用語の使用は、その量を含むことが企図される。
【0019】
本明細書を通して、文脈が別段の要求しない限り、「含んでなる（comprise）」という用語およびそのバリエーション（例えば、“comprises”および“comprising”）は、記載された整数、工程、整数のグループまたは工程のグループを包含することを意味するが、その他のいかなる整数、工程、整数のグループまたは工程のグループを除外することを意味しないものと理解されるであろう。
【0020】
本明細書を通して、文脈が別段の要求をしない限り、「からなる（consisting of）」という用語およびそのバリエーション（例えば、“consists of”）は、記載された整数、工程、整数のグループまたは工程のグループを包含し、その他のいかなる整数、工程、整数のグループまたは工程のグループを除外することを意味するものと理解されるであろう。
【0021】
本明細書で使用される「原子量子クラスター」または「ＡＱＣ」という用語は、２～５００個のゼロ価の遷移金属原子、例えば、２～２００個、２～１００個、２～５０個または２～２５個の遷移金属原子のグループ／クラスターであって、２ｎｍ未満、例えば、１ｎｍ未満のサイズを有する該グループ／クラスターを意味する。ＡＱＣは、同一の（単核クラスター(mononuclear clusters)）または異なる（異核クラスター(heteronuclear clusters)）遷移金属のゼロ価の遷移金属原子を含んでなってもよい。この用語は、金属イオンを含まないことが理解されるであろう。
【0022】
「３個より多く」のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣへの言及は、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを指す（すなわち、この用語は、３個の金属原子を有するＡＱＣを包含しない）ことが理解されるであろう。したがって、この用語は「４以上」と互換的に使用することができる。
【0023】
「３個以下」のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣへの言及は、２または３個のゼロ価の遷移金属原子を有するＡＱＣを指すことが理解されるであろう。また、「３個」のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣへの言及は、３個のゼロ価の遷移金属原子のみを有するＡＱＣを指すことが理解されるであろう。
【0024】
用語「遷移金属」は、遷移金属として知られている周期表の元素を指すものと理解されるが、該元素の電気的挙動を指すものではない。ＡＱＣにおける電子の閉じ込めは、ＥＰ１９１４１９６で報告されているように、これらの材料の特性に重要な変化をもたらすエネルギー準位の量子分離に起因する。したがって、本明細書に記載されたＡＱＣ中の金属原子は、半導体様挙動、または絶縁体様挙動さえも有することができる。
【0025】
用語「実質的に含まない（substantially free of）」は、その後に具体的に言及される実体（例えば、３個より多いゼロ価の遷移金属原子を有するＡＱＣ）をほとんどまたは完全に含まないか、あるいは、少なくとも実体が組成物の有効性、保存性、必要な安全性の懸念に関する使用性、および／または安定性に影響を与えるような量で実体を含まない組成物を指すために使用することができる。
【0026】
本明細書で使用される「精製された」という用語は、望ましくない数のゼロ価の遷移金属原子からなる実質的にすべてのＡＱＣが除去された組成物を指す。特に、本明細書に記載の方法は、３個より多くのゼロ価の遷移金属原子からなる実質的に全ての（好ましくは全ての）ＡＱＣを除去することにより、組成物の純度の程度を増加させる。
【0027】
用語「分離媒体」の言及は、混合物から実体を分離する能力を有する材料を指す。本出願において、分離媒体は、より大きなクラスター（すなわち、４個以上のゼロ価の遷移金属原子）を含むＡＱＣの混合物から、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを選択的に精製する能力を有する。そのような媒体の例が本明細書に提供される。
【0028】
用語「チオール」は、炭素結合スルフヒドリル（Ｒ-ＳＨ）基（ここで、Ｒはアルキルまたはその他の有機置換基を表す）を指すと理解されるであろう。
【0029】
用語「芳香族基」は、当技術分野でよく知られており、共鳴結合の環を有する（または含んでなる）環状かつ平面的な分子または部位を指す。これには、ベンゼン（すなわち、Ｃ６Ｈ６）およびその誘導体が含まれる。ほとんどの芳香族基は、ベンゼン誘導体である。しかしながら、この用語はまた、ヘテロ芳香族基（すなわち、芳香環中の原子の１個以上が、炭素以外の元素のものである）、例えば、ピリジン、ピラジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、チオフェンおよびそれらのベンゼンを付加された類似体（benzannulated analogues）を含むことができる。
【0030】
「ＤＮＡ」（デオキシリボ核酸）への言及は、実質的に対になって二重らせんを形成する２本のポリデオキシリボヌクレオチド鎖を含む分子を指す。ポリヌクレオチド鎖は、ヌクレオチドで構成されており、各ヌクレオチドは、塩基、糖（デオキシリボース）およびリン酸基を含んでなる。これらのヌクレオチドは、あるヌクレオチドの糖と、次のヌクレオチドのリン酸基との間の共有結合によって鎖状に互いに結合しており、その結果、糖－リン酸基のバックボーンが形成されている。塩基は、天然に存在する塩基（すなわち、シトシン［Ｃ］、グアニン［Ｇ］、アデニン［Ａ］またはチミン［Ｔ］）または非天然に存在する塩基を含んでなってもよい。２つの別々のポリヌクレオチド鎖の塩基は、塩基対形成規則（ＡはＴと、ＣはＧと）に従って水素結合によって結合し、二本鎖ＤＮＡを形成する。この定義には、３原子のＡＱＣがインターカレートすることができるように二重らせんが形成されることを条件に、例えば、非天然に存在する塩基または修飾されたバックボーンを含むように修飾されたＤＮＡが含まれる。
【0031】
精製方法
本発明の一態様によれば、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を精製する方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用する工程であって、前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合するか、あるいは３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する工程；および
（ｉｉ）３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離する工程
を含んでなる方法が提供される。
本発明の一態様によれば、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を精製する方法であって、以下の工程：
（ｉ）ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用する工程であって、前記分離媒体が、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合するか、あるいは３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する工程；および
（ｉｉ）３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離する工程
を含んでなる方法が提供される。
【0032】
本発明は、ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用し、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離することを含んでなる、原子量子クラスター（ＡＱＣ）を精製する方法を提供する。本明細書に記載されるように、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣ（特に、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣ）の特性に関する研究は、該クラスターを精製する方法を提供する必要性を強調している。以前は、例えば、ＥＰ１９１４１９６を参照して、ＡＱＣが合成され、クラスターの所望のサイズに達すると、選択的沈殿によって分離されていた。しかしながら、この方法では、優勢なサイズのクラスターが存在したとしても、依然として、異なるサイズのＡＱＣの混合物が存在することになる。複数のサイズのＡＱＣを有する組成物のコンタミネーションは、組成物の挙動および特性に影響を与え得る。
【0033】
したがって、本発明は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを選択的に精製する方法を提供する。
【0034】
一実施形態において、分離媒体は、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合し、本方法は、非結合溶液から３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離することを含んでなる。「非結合溶液」への言及は、分離媒体に結合していない成分を含む溶液を指す。そのような分離媒体の例は、本明細書で提供される。当業者であれば、当技術分野で知られている方法を使用して、分離媒体が３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合することができるか否かを判断することができるであろう。例えば、当業者は、サンプルが分離媒体を通過した後に、溶出液を試験し、蛍光分光法を使用して溶出液中に存在するＡＱＣの種類を決定することができる。蛍光分光法と組み合わせて、または蛍光分光法の代替として使用可能なその他の特性評価方法が実施例に記載されている。
【0035】
一実施形態において、分離媒体は、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する官能基を有する。
【0036】
一実施形態において、官能基はチオール基である。さらなる実施形態において、分離媒体は、チオール化樹脂、例えば、チオール化シリカを含む。
【0037】
意外なことに、Ａｇ３－ＡＱＣは、Ａｇイオンとは異なり、チオールに結合しないことが判明したので、合成されたクラスターからＡｇイオンを選択的に分離するために、チオール化樹脂を使用した効率的な精製手順が本明細書で確立された（図１）。さらに、驚くことにＡｇ３－ＡＱＣよりも大きなクラスターはチオール化樹脂と相互作用することが見出された。これにより、この精製手順では、より大きなクラスターによるコンタミネーションがないことも保証されている。
【0038】
理論に拘束されるものではないが、水性のＡｇ３－ＡＱＣサンプル中の溶存酸素の量は、Ａｇ３－ＡＱＣとチオールとの相互作用を排除するのに十分であると思われ、図１の挿入図で見られるように、Ａｇ３－ＡＱＣへのメチルチオールの結合は好ましくない（正の結合エネルギーによって特徴付けられる）。サンプル中のＡｇ３－ＡＱＣ以外の唯一の種はＡｇ２－ＡＱＣである。しかしながら、本明細書で説明するように、そのようなクラスターは、その非反応性のために、単なる傍観者（spectator）に過ぎない。さらに、そのようなＡｇ２－ＡＱＣは、本明細書に記載される手順によってＡｇ３－ＡＱＣから分離可能である。
【0039】
一実施形態において、ＡＱＣの混合物は、水溶液中に存在する。さらなる実施形態において、水溶液は、溶存酸素、例えば、混合物中に存在するＡＱＣの濃度（特に、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣの濃度）の少なくとも２倍、または少なくとも３倍の溶存酸素を含んでなる。
【0040】
本発明の別の態様において、分離媒体は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合し、本方法は、非結合溶液中の３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを廃棄し、分離媒体から３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離することからなる。さらなる実施形態において、本方法は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを放出させるために、分離媒体を処理（例えば加熱）するプロセスによって単離することを含んでなる。
【0041】
一実施形態において、分離媒体は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する官能基を有する。
【0042】
あるいは、一実施形態において、分離媒体はＤＮＡを含む。さらなる実施形態において、分離媒体は、実質的に二本鎖である（すなわち、二重らせんが形成されるように）ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、完全に二本鎖（すなわち、平滑末端）であってもよいし、実質的に二本鎖であってもよい（すなわち、ＤＮＡ中のヌクレオチドの１個以上が塩基対で存在せず、例えば、一本鎖の付着末端を形成する場合）。
【0043】
３個の金属原子のクラスターは、インターカレーションによってＤＮＡと相互作用することが示されている。このインターカレーションは、クラスター内の原子の数に厳密に依存し、二重らせんの塩基対の種類（ＡＴまたはＧＣ）に依存しない。したがって、任意のポリヌクレオチド配列が、本発明のＤＮＡ分離媒体に使用され得ることが理解されるであろう。また、分離媒体中のＤＮＡは、実質的に二本鎖であり、二重らせんを形成するのに十分な長さを有することが理解されるであろう。
【0044】
一実施形態において、ＤＮＡは、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態において、ＤＮＡは、１５以上、例えば、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または１００以上のヌクレオチド長である。これらの実施形態は、各ストランドのヌクレオチドの数は同じであっても異なっていてもよいが（例えば、ＤＮＡが実質的に二本鎖である場合）、二本鎖ＤＮＡの各ストランドのヌクレオチドの数に言及していることが理解されるであろう。
【0045】
使用されるＤＮＡは、ＤＮＡを分離媒体として使用することを可能にするために、すなわち、溶液中で結合しないままである３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣから分離可能であり、該溶液から単離可能であるように、十分なサイズ／長さであることが理解されるであろう。例えば、該ＤＮＡが透析法で使用される場合、該ＤＮＡは、透析装置の半透膜を通過することが妨げられるような十分なサイズである（これは、使用される膜の細孔サイズに依存するであろう）。したがって、一実施形態において、ＤＮＡの分子量（ＭＷ）は、使用される半透膜の細孔サイズよりも大きい。例えば、一実施形態において、ＤＮＡの分子量（ＭＷ）は、３．５ｋＤａよりも大きく、例えば、約４ｋＤａ以上である。当業者ならば、適切な長さのＤＮＡを設計し、合成する方法を知っているであろう。
【0046】
本明細書で提供される実施例に示されるように、ＤＮＡを使用して、３個のゼロ価の金属原子からなるＡＱＣを選択的に精製することができる。これは、３個のゼロ価の金属原子からなるＡＱＣが、ＤＮＡにインターカレートする唯一のサイズのクラスターであるためである。より大きなサイズのクラスターは、ＤＮＡと相互作用せず、２個のゼロ価の金属原子からなるＡＱＣは、ＤＮＡ二重らせんの外側に緩く結合しているのみであるため、容易に洗い流す（例えば、透析して洗い流す（dialysed away））ことができる。
【0047】
したがって、一実施形態において、本方法は、分離媒体が３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣのみに結合するように、洗浄溶液を適用して３個未満のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣ（すなわち、２個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣ）を除去することを含んでなる。
【0048】
一実施形態において、本方法は、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを放出させるためにＤＮＡを変性させることを含んでなるプロセスによって単離することを含んでなる。本方法は、変性したＤＮＡから３個のゼロ価の遷移金属原子からなる放出されたＡＱＣを、例えば、透析によって単離するために、第２の洗浄溶液を適用することをさらに含んでなってもよい。
【0049】
変性させる方法は、当業者に周知であり、例えば、熱または化学剤（例えば、ホルムアミド、グアニジン、サリチル酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコールおよび尿素）の適用による方法である。一実施形態において、ＤＮＡは、加熱、例えば、約９６℃まで加熱することによって変性される。ＤＮＡが変性されると、洗浄溶液を使用して、３個のゼロ価の遷移金属原子からなる放出されたＡＱＣを単離することができる。ＤＮＡが透析法で使用される場合、本実施形態は、変性されたＤＮＡと３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣとを含む透析装置を洗浄溶液中に入れ、（洗浄溶液中に通過した）３個のゼロ価の遷移金属原子からなる放出されたＡＱＣを単離することを包含することが理解されるであろう。
【0050】
３原子からなるＡＱＣの精製方法
３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが単離されると、２個または３個のゼロ価の遷移金属原子のいずれかからなるＡＱＣの溶液を得るために、該ＡＱＣを分離することが望ましい場合がある。したがって、一実施形態において、本方法は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる単離されたＡＱＣを第２の分離媒体に適用して、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離することをさらに含んでなる。これにより、３個の原子からなるＡＱＣを、第２の分離媒体に結合しない２個の原子からなるＡＱＣから分離することができる。
３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが単離されると、２個または３個のゼロ価の遷移金属原子のいずれかからなるＡＱＣの溶液を得るために、該ＡＱＣを分離することが望ましい場合がある。したがって、一実施形態において、本方法は、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる単離されたＡＱＣを第２の分離媒体に適用して、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離することをさらに含んでなる。これにより、３個の原子からなるＡＱＣを、第２の分離媒体に結合しない２個の原子からなるＡＱＣから分離することができる。
【0051】
一実施形態において、第２の分離媒体は、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを結合させ、本方法は、非結合溶液中の３個未満のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣ（すなわち、２個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣ）を廃棄し、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを第２の分離媒体から単離することを含んでなる。さらなる実施形態において、本方法は、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを放出させるために第２の分離媒体を処理（例えば、加熱）するプロセスによって単離することを含んでなる。
【0052】
一実施形態において、第２の分離媒体は、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する官能基を有する。
【0053】
２個の金属原子を含んでなるＡＱＣおよび３個の金属原子を含んでなるＡＱＣの混合物において、３個の金属原子のＡＱＣが芳香族基に選択的に結合することにより、３個の原子のＡＱＣを２個の原子のＡＱＣから分離することができることが見出された。したがって、一実施形態において、官能基は、芳香族基、例えば、環状芳香族基および多環式芳香族基である。該芳香族基は、さらに、１以上の置換基、例えば、アルキル（例えば、メチル）基、アルケニル（例えば、アリル）基、ハロゲン（例えば、クロロ）基などを有していてもよい。
【0054】
一実施形態において、芳香族基はベンゼン環を構成してもよい。該ベンゼン環は、ポリベンゼン構造、例えば、ナフタレン（一対のベンゼン環の結合）；アントラセンまたはフェナントレン（３個のベンゼン環の結合）；テトラセン、クリセン、トリフェニレンまたはピレン（４個のベンゼン環の結合）；ペンタフェンまたはベンゾ［ａ］ピレン（５個のベンゼン環の結合）で存在していてもよい。特定の実施形態において、芳香族基はピレン環を構成してもよい。さらに、ベンゼン環は、１以上の付加的な置換基、例えば、トルエンまたはスチレン（エテニルベンゼン、ビニルベンゼンまたはフェニルエタンとしても知られている）を含んでいてもよい。
【0055】
一実施形態において、芳香族基は、ピリジン基を構成してもよい。さらなる実施形態において、芳香族基は、ベンゼンおよびピリジンからなるリストから選択されてもよい。
【0056】
芳香族基は、より大きな構造、例えば、グラフェン、カーボンナノチューブ、フラーレンまたはカーボン量子ドットの一部であってもよく、これは、第２の分離媒体において使用可能である。
【0057】
別の実施形態において、第２の分離媒体は、二本鎖ＤＮＡを含む。ＤＮＡを使用して、３個のゼロ価の遷移金属原子のみからなるＡＱＣを精製することができるため、ＤＮＡは、分離媒体として単独で使用されてもよいし、第２の分離媒体として上記のプロセスと組み合わせて使用されてもよいことが理解されるであろう。後者のオプションは、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが精製可能であることを保証する。例えば、本方法は、以下の工程：（ｉ）ＡＱＣの混合物を、チオール化樹脂を含む分離媒体に適用する工程；（ｉｉ）３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる非結合溶液を回収する工程；および（ｉｉｉ）この溶液を、二本鎖ＤＮＡを含む第２／追加の分離媒体に適用する工程を含んでなってもよい。
【0058】
一実施形態において、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを放出させるために第２の分離媒体を加熱し、放出された３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを第２の分離媒体から、例えば、クロマトグラフィーまたは透析により単離するために洗浄溶液を適用することによって、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離する。例えば、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを放出させるために、第２の分離媒体を約１００℃に加熱してもよい。次いで、３個のゼロ価の遷移金属原子からなる放出されたＡＱＣを単離するために、洗浄溶液を使用してもよい。
【0059】
本明細書に開示された精製方法のうちの１以上を１回以上繰り返してもよいことが理解されるであろう。精製方法を複数回実施することは、サンプルの精製度を増加させ、所望の精製を達成することを可能にする。
【0060】
クロマトグラフィーおよび透析
一実施形態において、分離媒体はクロマトグラフィー法で使用される。クロマトグラフィーは、混合物を含んでなる移動相を、固定相（例えば、本明細書に記載の分離媒体を備える）に通すことにより、混合物を分離するために使用される方法である。混合物は、移動相の構成要素が固定相とどのように相互作用するかに基づいて分離される。分離媒体が３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを保持する場合、溶出液（３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる）が回収されることが理解されるであろう。あるいは、分離媒体が３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを保持する場合、溶出液（３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる）は廃棄される。一実施形態において、分離媒体は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。そのようなクロマトグラフィーカラムは市販されている。クロマトグラフィーカラムは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む様々なクロマトグラフィー法の一部として使用することができる。
一実施形態において、分離媒体はクロマトグラフィー法で使用される。クロマトグラフィーは、混合物を含んでなる移動相を、固定相（例えば、本明細書に記載の分離媒体を備える）に通すことにより、混合物を分離するために使用される方法である。混合物は、移動相の構成要素が固定相とどのように相互作用するかに基づいて分離される。分離媒体が３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを保持する場合、溶出液（３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる）が回収されることが理解されるであろう。あるいは、分離媒体が３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを保持する場合、溶出液（３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる）は廃棄される。一実施形態において、分離媒体は、クロマトグラフィーカラム中に存在する。そのようなクロマトグラフィーカラムは市販されている。クロマトグラフィーカラムは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む様々なクロマトグラフィー法の一部として使用することができる。
【0061】
一実施形態において、本方法は、分離媒体が固相であり、ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液が移動相であるクロマトグラフィー法である。さらなる実施形態において、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが固相に結合し、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが移動相から分離される。別の実施形態において、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが結合され、次いで、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣが固相から単離される。この実施形態において、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる移動相は、廃棄され、次いで、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを放出させるために分離媒体を処理（例えば、加熱）し、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる放出されたＡＱＣを単離するために第２の移動相（例えば洗浄溶液）が分離媒体に適用される。
【0062】
一実施形態において、分離媒体は、透析法で使用される。透析は、半透膜を介した拡散速度に基づいて分子を分離する方法である。例えば、ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用し、次いで、透析装置（例えば、透析カセットまたは透析チューブ）に入れることができる。そのような透析カセット、透析チューブまたは透析装置は市販されている。透析膜は、分離の必要条件に応じて（例えば、分離媒体に使用されるＤＮＡの分子量に応じて）選択される分子量カットオフを有するように選択され得る。
【0063】
したがって、一実施形態において、本方法は、ＡＱＣの混合物を含んでなる溶液を分離媒体に適用し、次いで、半透膜、例えば、３．５ＫＤａ膜を備える透析装置内に混合物を入れることを含んでなる。該半透膜は、分離媒体および分離媒体に結合したものの通過を阻止する。分離媒体が３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する場合、半透膜を通過した溶液（３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる）は単離されることが理解されるであろう。あるいは、分離媒体が３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣに結合する場合、半透膜を通過した溶液（３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる）は廃棄される。
【0064】
原子量子クラスター（ＡＱＣ）
一実施形態において、金属原子は、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、パラジウム（Ｐｄ）、ニッケル（Ｎｉ）、ロジウム（Ｒｈ）、鉛（Ｐｂ）、イリジウム（Ｉｒ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、コバルト（Ｃｏ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。さらなる実施形態において、金属原子は、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。さらなる実施形態において、金属原子はＡｇである。
一実施形態において、金属原子は、銀（Ａｇ）、金（Ａｕ）、銅（Ｃｕ）、白金（Ｐｔ）、鉄（Ｆｅ）、クロム（Ｃｒ）、パラジウム（Ｐｄ）、ニッケル（Ｎｉ）、ロジウム（Ｒｈ）、鉛（Ｐｂ）、イリジウム（Ｉｒ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、コバルト（Ｃｏ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。さらなる実施形態において、金属原子は、Ａｇ、Ａｕ、Ｃｕ、Ｐｔ、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。さらなる実施形態において、金属原子はＡｇである。
【0065】
本明細書に記載のＡＱＣは、安定であり、すなわち、原子の数を保存し、したがって、その特性を時間の経過とともに保存し、その他の任意の化学化合物と同様に単離および操作が可能である。ＡＱＣは、外部の安定化剤を必要とせずに、数ヶ月、さらには数年にわたって保存可能である。
【0066】
ＡＱＣの混合物は、当技術分野で知られている様々な方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＥＰ１９１４１９６またはＢｕｃｅｔａ ｅｔ ａｌ．２０１５に記載されている方法によって合成可能である。
【0067】
また、本明細書の実施例１に記載された方法を使用して、混合物を合成してもよい。より具体的には、参照電極としての水素電極と、対電極および作用電極としての２個の銀電極とを備える３電極電気化学セル内でこの合成方法を実施することを含んでなる銀ＡＱＣの合成方法であって、銀電極は、５ｃｍ２より大きい表面積、例えば、１０ｃｍ２より大きい表面積、例えば、約１７ｃｍ２より大きい表面積を備え、４Ｖより大きい定電圧、例えば、約６Ｖより大きい定電圧を、約２５℃で少なくとも３，０００秒、例えば、約３，６００秒かけて印加することを含んでなる合成方法を提供する。銀電極は、合成に先立って研磨されてもよく、例えば、サンドペーパーおよび／またはアルミナを使用して研磨されてもよい。本方法は、精製された脱気された水、例えば、脱気されたＭｉｌｌｉＱ水の中で実施されてもよい。場合により、過剰なＡｇ＋イオンは、ＮａＣｌの添加およびその後の沈殿および濾過によって除去されてもよい。
【0068】
本明細書で使用されるＡＱＣへの言及は、水和物の形態のもの、すなわち、非共有結合を介してクラスターに結合した水分子を有するものを含む。
【0069】
組成物
本発明の一態様によれば、本明細書に記載されるような方法によって精製された組成物が提供され、この組成物は、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない。
本発明の一態様によれば、本明細書に記載されるような方法によって精製された組成物が提供され、この組成物は、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない。
【0070】
３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる組成物の治療的用途の可能性が、本明細書に記載される。このような組成物は、それ自体では真核細胞に対する細胞毒性効果を有さないが、ＤＮＡ作用性薬物と組み合わせた場合に驚くべき相乗効果を提供することが見出された。このメカニズムは、このサイズのクラスターに特有のものである。したがって、本出願は、組成物が３個以下のゼロ価の遷移金属原子を有するＡＱＣのみからなるようにＡＱＣを精製する動機を初めて提供する。小さいサイズのＡＱＣを含んでなる組成物が以前に合成されているにもかかわらず、例えば、Ｂｕｃｅｔａ ｅｔ ａｌ．２０１５を参照されたいが、これらの報告では、分析に先立って、ＡＱＣが精製されていないことを示している。したがって、これらの固有の特性は、より大きなクラスターを有するＡＱＣの存在のために覆い隠されていた。本発明の組成物は、以前に記載された組成物よりも高純度の組成物を提供し、したがって、単独で投与した場合に真核細胞に対する細胞毒性効果を有さないという特徴的な特性を有する（例えば、実施例８を参照）。
【0071】
したがって、本発明の一態様によれば、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなる原子量子クラスター（ＡＱＣ）を含んでなる組成物が提供され、この組成物は、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない。
【0072】
本発明のこの実施形態において、組成物は、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない。例えば、組成物は、約１０モル％未満（組成物の全ＡＱＣ含有量に基づくモル％）、例えば、約７モル％未満、約５モル％未満、約２モル％未満、約１モル％未満、または約０．５モル％未満の３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでいてもよい。
【0073】
一実施形態において、組成物は、２個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない。本明細書に記載の方法によって示されるように、３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣの単離は、例えば、ＤＮＡを分離媒体として使用して達成され得る。本明細書に記載された組成物は、精製された組成物と呼ばれることがある。
【0074】
本発明のこの実施形態において、組成物は、２個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない。例えば、組成物は、約１０モル％未満（組成物の全ＡＱＣ含有量に基づくモル％）、例えば、約７モル％未満、約５モル％未満、約２モル％未満、約１モル％未満、または約０．５モル％未満の２個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでいてもよい。
【0075】
３個より多いゼロ価の遷移金属原子および２価のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない組成物（すなわち、組成物は、実質的に３個のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣからなる）において、組成物は、約１０モル％未満（組成物の全ＡＱＣ含有量に基づくモル％）、例えば、約７モル％未満、約５モル％未満、約２モル％未満、約１モル％未満、または約０．５モル％未満の３個より多いゼロ価の遷移金属原子および２価のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでもよい。
【0076】
「３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない」と見なすことができる組成物の特性は、それ自体で投与された場合、すなわち、抗増殖剤の存在下ではなく、かつ／あるいは、より大きなクラスターを有するＡＱＣが存在しない場合には、細胞毒性効果を有さないことである。この特性は、このような組成物を同定するために使用可能である。
【0077】
一実施形態において、組成物は、金属イオンを実質的に含まない。金属イオンは、ＡＱＣの合成中に頻繁に生じる副生成物である。これらは、例えば、ＮａＣｌまたは本明細書に記載の精製方法を使用して除去可能である。金属イオンへの言及は、ＡＱＣに含まれる遷移金属のイオンに関するものであることが理解されるであろう。
【0078】
一実施形態において、組成物は、約２０モル％未満、例えば、約１５モル％未満、約１０モル％未満、約５モル％未満、約２モル％未満、約１モル％未満、または約０．５モル％未満の金属イオン（すなわち、ＡＱＣを合成するために使用された遷移金属の遊離イオン）を含む。
【0079】
組成物の用途
本明細書で議論された新規な精製アプローチは、クロマチン、特に、ヒトの肺および乳腺の癌細胞株および膠芽腫細胞株、ならびに癌を有するマウスにおけるクロマチンに対する、これらのＡＱＣの作用を調べるために、十分な量の３原子金属ＡＱＣを得ることを可能にした。
本明細書で議論された新規な精製アプローチは、クロマチン、特に、ヒトの肺および乳腺の癌細胞株および膠芽腫細胞株、ならびに癌を有するマウスにおけるクロマチンに対する、これらのＡＱＣの作用を調べるために、十分な量の３原子金属ＡＱＣを得ることを可能にした。
【0080】
ＤＮＡの標的化は、腫瘍細胞を比較的強力かつ選択的に破壊することが証明されている（Cheung-Ong et al. Chem. Biol. 2013, 20: 648およびGurova, Future Oncol. 2009, 5: 1685）。しかしながら、耐性メカニズムは、それらの有効性を妨げる。例えば、十分な量のシスプラチン（ＣＤＤＰ）がＤＮＡに到達することができないことがある（Kelland, Nat. Rev. Cancer. 2007, 7: 573）。今回、ＣＤＤＰとＡｇ３－ＡＱＣとの併用投与は、ＤＮＡに結合するＣＤＤＰの量だけでなく、ＣＤＤＰの細胞毒性も増加させることが判明した。Ａｇ３－ＡＱＣが腫瘍組織と健康な組織との間に示す異なる効果を考慮すると、Ａｇ３－ＡＱＣの併用投与は、化学療法の治療指標を増加させる。したがって、これらの結果は、化学療法薬の効果を増加させるためにクロマチンの凝縮を標的とすることの重要性を強調する（Davey et al. Nature Comm. 2017, 8, 1575およびPalermo et al. Chem. Med. Chem. 2016 11: 1199）。これらの知見は共に、ナノ材料の最も低いスケールでの精密なサイズ制御を提供することができる効率的な合成手順の開発にも依存する目標である、クラスターの治療可能性を立証する。
【0081】
したがって、本発明の一態様によれば、抗増殖剤と組み合わせて細胞増殖性障害の処置に使用するための本明細書に記載されるような組成物が提供される。
【0082】
本明細書に記載されるように、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣは、真核細胞において、それ自体の細胞増殖抑制特性または細胞毒性特性を有していない。これは、ＷＯ２０１２／０５９５７２およびＥＰ２４５７５７２の教示（ＷＯ２０１２／０５９５７２およびＥＰ２４５７５７２の実施例３および実施例４を参照）と矛盾しており、同文献にＡｇ３として記載されている材料は、精製されたＡｇ３ではなく、その他の生物学的に活性のあるコンタミネーション物質を含んでいるに違いないことを示している。しかしながら、３個のゼロ価の遷移金属原子からなる精製されたＡＱＣを抗増殖剤、特にＤＮＡ結合剤と組み合わせて投与すると、驚くべき相乗効果がある。理論に拘束されるものではないが、この驚くべき相乗効果は、少なくとも部分的には、３個の原子からなるＡＱＣによって示される独特の作用機序に起因すると考えられる。さらに、この効果は、増殖性細胞においてのみ増強されることが示されたため、増殖性障害の影響を受けた異常増殖する細胞を選択的に標的とすることができる。
【0083】
「細胞増殖性障害」への言及は、細胞の新たな異常増殖もたらす障害、または生理的制御のない異常な細胞の増殖を指す。これは、不定形の腫瘤、すなわち腫瘍をもたらし得る。一実施形態において、細胞増殖性障害は、腫瘍および／または癌である。
【0084】
癌には、以下のもの：脾臓癌、大腸癌および／または結腸癌、結腸癌、卵巣癌、卵巣癌、乳癌、子宮癌、肺癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、骨癌、皮膚癌、肉腫、カポジ肉腫、脳腫瘍、筋肉腫、神経芽腫、リンパ腫および白血病、メラノーマ、神経膠腫、髄芽腫および頭頸部癌が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、癌は、肺癌、乳癌、結腸癌または脳癌（特に膠芽腫）から選択される。さらなる実施形態において、癌は、脳癌、例えば、膠芽腫である。
【0085】
本発明の一態様によれば、場合により抗増殖剤と組み合わせて癌のリンパ節転移を予防に使用するための本明細書に記載の組成物が提供される。本発明の別の態様によれば、抗増殖剤と組み合わせて癌のリンパ節転移の処置に使用するための本明細書に記載の組成物が提供される。
【0086】
さらなる実施形態において、リンパ節は、縦隔リンパ節である。該縦隔リンパ節は、身体の胸腔内に位置するリンパ節群である。
【0087】
癌の転移を予防することは、続発性癌および再発を予防するために癌処置の要所である。本明細書に提示された結果に示されるように、Ａｇ３-ＡＱＣの投与は、縦隔リンパ節における腫瘍量を減少させることができる。さらに、シスプラチンをＡｇ３－ＡＱＣと一緒に投与することは、シスプラチン単独よりもリンパ節浸潤を減少させるのに有意に効果があった（実施例１７および図２１参照）。したがって、驚くべきことに、本発明の組成物は、癌のリンパ節転移を処置し、予防するという追加の有益な効果を有することが見出された。
【0088】
一実施形態において、抗増殖剤は、ＤＮＡ結合剤、ＤＮＡインターカレート剤、アルキル化剤およびヌクレオシド類似体から選択される。抗増殖剤は、細胞の増殖、分裂増殖および増殖を阻害または抑制するように作用するものである。通常、急速に分裂する細胞、すなわち、細胞増殖性障害の影響を受ける細胞を殺すことによって作用する。
【0089】
ＤＮＡ結合性の細胞障害性薬剤は、多くの癌の処置における第一選択である。化学療法の耐性の大きな要因は、不十分な量の薬剤がＤＮＡに到達する可能性があることであり、クロマチンはＤＮＡへのアクセス性を制限する大きな障壁である。これまでは、その他の関連する効果を伴わずにクロマチンに作用することができる薬剤がなかったことが主な理由で、化学療法のＤＮＡ結合剤の作用に影響を与えるクロマチンの凝縮の重要性を評価することができなかった。わずか３原子の荷電していない金属クラスターを使用して、本出願は、化学療法の治療指標を高めるためにクロマチンの凝縮を標的とすることの意義を示す証拠を提供する。
【0090】
一実施形態において、抗増殖剤は、ＤＮＡ結合剤であり、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、カルムスチンまたはドキソルビシンである。さらなる実施形態において、抗増殖剤はシスプラチンである。別の実施形態において、抗増殖剤はシスプラチンではない。
【0091】
一実施形態において、抗増殖剤は、ヌクレオシド類似体、例えば、ゲムシタビンである。
【0092】
本発明の組成物は、複数の抗増殖剤、例えば、少なくとも1種、例えば、２種、３種、４種またはそれ以上の抗増殖剤と一緒に投与されてもよい。
【0093】
一実施形態において、組成物および抗増殖剤は同時投与される。この実施形態において、２種の薬剤は、同一の時にまたは実質的に同一の時に投与される。それらはまた、同一経路で、そして場合により、同一組成物中に含んで投与されてもよい。あるいは、それらは、異なる経路、すなわち、別個に、しかしながら、同一の時にまたは実質的に同一の時に投与されてもよい。
【0094】
別の実施形態において、組成物および抗増殖剤は、順次投与される。この実施形態において、２種の薬剤は、２種の薬剤のうちの１種が第２の薬剤の前に投与されるように、異なる時間に投与される。それらは、同一の経路で投与されてもよいし、異なる経路で投与されてもよい。
【0095】
一実施形態において、組成物は、抗増殖剤の前に投与される。理論に拘束されるものではないが、組成物中のＡＱＣは、クロマチンの脱凝縮を誘発し、一度投与された抗増殖剤の効果を増大させると考えられる。したがって、薬剤が別個に投与される場合、抗増殖剤は、組成物がまだ有効である間に投与され、すなわち、組成物および抗増殖剤は、患者への投与時に相乗効果を発揮する時間枠内に投与される。
【0096】
さらなる実施形態において、組成物は、抗増殖剤を投与する前の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間以内に投与される。特定の実施形態において、組成物は、抗増殖剤を投与する前の約１５、２０、３０もしくは４５分以内、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間以内に投与される。
【0097】
一実施形態において、組成物は、抗増殖剤を投与する前の０～２４時間、例えば、０～２０時間、０～１０時間、０～６時間、０～４時間、０～２時間または０～１時間に投与される。この実施形態には、同時（すなわち、０時間）投与および順次投与が含まれる。
【0098】
一実施形態において、組成物および抗増殖剤は、結果として得られる組成物が患者への投与時に相乗効果を発揮するような重量比で存在する。適切な重量比は、当業者に周知の方法によって決定可能である。
【0099】
本発明の一態様によれば、放射線療法と組み合わせて細胞増殖性障害、例えば、癌の処置に使用するための本明細書に記載の組成物が提供される。したがって、一実施形態において、３個より多いゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを実質的に含まない３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを含んでなる本発明の組成物は、場合により抗増殖剤と組み合わせて、放射線療法と組み合わせて使用される。
【0100】
本明細書に記載されるように、本発明の組成物は、ＤＮＡにインターカレートし、クロマチンの脱凝縮をもたらす能力を有する。したがって、これを使用して、処置された細胞の放射線に対する感受性を増加させることにより、放射線療法の効果を向上させることができる。
【0101】
放射線療法（放射線治療とも呼ばれる）は、高線量の放射線を使用して、細胞のＤＮＡを傷害し、その結果、癌細胞を死滅させ、腫瘍を退縮させる。このような療法は、外部からのビームの形態で行われることもあれば、内部放射線療法として行われることもある。放射線療法の選択は、癌の種類、腫瘍のサイズおよび腫瘍の位置に加えて、その他の要因、例えば、患者の年齢、一般的な健康状態および病歴、ならびに使用されるその他の癌処置の種類に依存し得る。
【0102】
一実施形態において、組成物および放射線療法が同時適用される。別の実施形態において、組成物および放射線療法は、順次適用される。
【0103】
一実施形態において、本発明の組成物は、障害の処置のための抗増殖剤または放射線療法単独の効果と比較して、抗増殖剤または放射線療法の効果を少なくとも２倍、例えば、３倍に向上させることができる。
【0104】
本発明の一態様によれば、本明細書に記載される組成物を含んでなる医薬組成物が提供される。医薬組成物は、抗増殖剤をさらに含んでいてもよい（例えば、それらが同時投与されることになる場合）。両方の薬剤が医薬組成物中に存在する場合、それらは、混合物の形態であってもよく、あるいは空間的に互いに分離された形態であってもよく、同一の剤形の一部を形成してもよく、あるいは構成要素のキット（kit of parts）としてもよい。
【0105】
組成物、および適切な場合にはその組み合わせは、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を任意に含んでなる医薬組成物として調合されてもよい。薬学的に許容される担体の例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせの１種以上を含むことができる。適切な薬学的担体、賦形剤または希釈剤は、E. W. Martin著「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。薬学的に許容される担体は、本発明の組成物の保存性または有効性を高める少量の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤またはバッファーをさらに含んでいてもよい。医薬組成物はまた、抗付着剤、結合剤、コーティング剤、崩壊剤、香料、着色料、潤滑剤、吸着剤、防腐剤、甘味料、凍結乾燥賦形剤（凍結乾燥保護剤を含む）または圧縮補助剤を含んでいてもよい。
【0106】
本発明の医薬組成物は、複数の医薬的投与形態、例えば、固体（例えば、錠剤、丸薬、カプセル剤、顆粒剤など）または液体（例えば、溶液、懸濁液、シロップ、軟膏、クリーム、ゲルまたは乳剤など）で投与可能である。
【0107】
本発明の医薬組成物は、治療上有効な量を含んでなり得る。対象に投与可能な治療上有効な量（すなわち、処置されるべき障害の治癒または障害からの回復を補助する効果をもたらす量）は、複数の要因、例えば、疾患状態、個体の年齢、個体の性別および個体の体重、ならびに個体における所望の応答を引き出すための医薬組成物の能力に依存するであろう。治療上有効な量はまた、本発明の医薬組成物の任意の毒性または有害な効果が、治療上有益な効果を上回る量である。
【0108】
本発明の一態様によれば、抗増殖剤と組み合わせての使用であって、細胞増殖性障害の処置のための、本明細書に記載の組成物の使用が提供される。
【0109】
本発明の一態様によれば、抗増殖剤と組み合わせての使用であって、癌のリンパ節転移を処置するための、本明細書に記載の組成物の使用が提供される。本発明の別の態様によれば、場合により抗増殖剤と組み合わせての使用であって、癌のリンパ節転移を予防するための、本明細書に記載の組成物の使用が提供される。
【0110】
本発明の一態様によれば、放射線療法と組み合わせての使用であって、細胞増殖性障害の処置のための、本明細書に記載の組成物の使用が提供される。
【0111】
本発明の一態様によれば、細胞増殖性障害の処置のための医薬の製造における、本明細書に記載の組成物の使用が提供される。場合により、組成物は、抗増殖剤および／または放射線と組み合わせて使用することができる。
【0112】
処置法
本発明の一態様によれば、細胞増殖性障害を有する患者を処置する方法であって、抗増殖剤および／または放射線療法と組み合わせて本明細書に記載の組成物を投与することを含んでなる方法が提供される。組成物について本明細書に先に記載された実施形態は、該処置法に適用可能である（例えば、投与のタイミング、組成物の調合など）。
本発明の一態様によれば、細胞増殖性障害を有する患者を処置する方法であって、抗増殖剤および／または放射線療法と組み合わせて本明細書に記載の組成物を投与することを含んでなる方法が提供される。組成物について本明細書に先に記載された実施形態は、該処置法に適用可能である（例えば、投与のタイミング、組成物の調合など）。
【0113】
本発明の一態様によれば、本明細書に記載の組成物を、任意に抗増殖剤および／または放射線療法と組み合わせて投与することを含んでなる、癌のリンパ節転移を予防する方法が提供される。本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の組成物を、任意に抗増殖剤および／または放射線療法と組み合わせて投与することを含んでなる、癌のリンパ節転移を処置する方法が提供される。
【0114】
患者は、疾患に罹患している任意の対象であり得る。一実施形態において、患者は哺乳動物である。さらなる実施形態において、哺乳動物は、ヒトまたはマウスから選択される。
【0115】
一実施形態において、組成物（および場合により抗増殖剤を含んでなる組成物）は、任意の適切な送達様式、例えば、静脈内投与、動脈内投与、心臓内投与、皮内投与、皮下投与、経皮投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経口投与、経口投与、舌側投与、舌下投与、頬内投与、直腸内投与され、あるいは浣腸によって投与される。
【0116】
局所適用も可能である（例えば、メラノーマの治療のため）。局所適用の特定の形態は、組成物（および任意に抗増殖剤）をキャリアシステム、特に薬物送達システムに導入し、該キャリアシステムを癌性組織に移植することからなり、該キャリアシステムは、次いで、該組成物（および任意に薬剤）を癌性組織の部位に特異的に放出する。このようにして、全身投与の場合に起こり得るような副作用を回避することが可能であり、すなわち、身体への全体的な負担を軽減することができる。
【0117】
キット
本発明の一態様によれば、ＡＱＣの混合物を精製する方法（すなわち、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離するための方法）で使用するための、本明細書に記載の分離媒体を含んでなり、場合により、本明細書に記載の精製方法に従って該キットを使用するための使用説明書を含んでなるキットを提供する。
本発明の一態様によれば、ＡＱＣの混合物を精製する方法（すなわち、３個以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを単離するための方法）で使用するための、本明細書に記載の分離媒体を含んでなり、場合により、本明細書に記載の精製方法に従って該キットを使用するための使用説明書を含んでなるキットを提供する。
【0118】
本発明の一態様によれば、構成要素のキットであって、（ｉ）組成物および（ｉｉ）抗増殖剤を含んでなるキットが提供される。成分（ｉ）および（ｉｉ）の両方は、薬学的に許容されるアジュバント、希釈剤または担体との混和物であってもよい。本発明のこの態様に従ったキットは、細胞増殖性障害の処置に使用することができる。
【実施例】
【0119】
次いで、本発明を以下の非限定的な例で例示する。
【0120】
略語
本明細書で使用されるすべての単位は、例えば、キロを意味する「ｋ」、ミリを意味する「ｍ」、マイクロを意味する「μ」およびナノを意味する「ｎ」のような認識されている接頭辞を含む、当技術分野で知られているそれらの標準的な定義（別段の指定がない限り）で理解されるべきである。
本明細書で使用されるすべての単位は、例えば、キロを意味する「ｋ」、ミリを意味する「ｍ」、マイクロを意味する「μ」およびナノを意味する「ｎ」のような認識されている接頭辞を含む、当技術分野で知られているそれらの標準的な定義（別段の指定がない限り）で理解されるべきである。
【0121】
Ａ５４９：ヒト肺腺癌細胞株
ＡＦＭ：原子間力顕微鏡
Ａｇ：銀
Ａｇ２：２個の銀原子
Ａｇ３：３個の銀原子
ＡｇＮＯ３：硝酸銀
ＡＮＯＶＡ：分散分析
ＡＱＣ：原子量子クラスター
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
Ａｕ：金
ＢＣＮＵ：カルムスチン
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
ＣＢＤＣＡ：カルボプラチン
ＣＤ：円偏光二色性
ＣＤＤＰ：シスプラチン
ＣＯ２：二酸化炭素
ＤＦＴ：密度汎関数理論
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＤＯＸ：ドキソルビシン
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＡｄ：吸着エネルギー
ＥＢ：臭化エチジウム
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥｄＵ：５－エチニル－２’－デオキシウリジン
ＥＧＴＡ：エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化質量分析法
ＥＳＩ－ＴＯＦ：エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法
ＦＢＳ：牛胎児血清
ＦＤＲ：誤発見率
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＦＷＨＭ：半値全幅
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＥＭ：ジェムシタビン
Ｈ２Ｏ２：過酸化水素
ＨＣｌ：塩酸塩
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＯＭＯ：最高被占軌道
ＨＮＯ３：硝酸
ＩＣ：阻害濃度
ＩＣＰ－ＭＳ：誘導結合プラズマ質量分析法
ＩＨＣ：免疫組織化学
ＩＰ：ヨウ化プロピジウム
ＩＴＣ：等温滴定熱量計
ＫＣｌ：塩化カリウム
ＫＯＨ：水酸化カリウム
Ｌｕｃ：北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子
ＬＵＭＯ：最低空軌道
ＭＣＦ７：ヒト乳腺癌細胞株
ＭｅＳＨ：メチルチオール
ＭｇＣｌ２：塩化マグネシウム
Ｎ２：窒素
ＮａＦ：フッ化ナトリウム
ＮＨ４Ｃｌ：塩化アンモニウム
Ｏ２：酸素
ＯＸＡ：オキサリプラチン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ｐＨ２ＡＸ：リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ
ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオライド
Ｐｔ：白金
ｑＰＣＲ：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＮ：ＲＮＡ完全性数（RNA Integrity Number）
ＲＬＵ：相対発光ユニット
ＲＮＡ：リボ核酸
ＲＴ：室温
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＴＯＲＭ：確率論的光学再構築顕微鏡
ＴＡＥ：トリス／酢酸／ＥＤＴＡ緩衝液
ＴＢＥ：トリス／ボレート／ＥＤＴＡ緩衝液
ＴＥ：トリス／ＥＤＴＡ緩衝液
Ｔｏｐｏ Ｉ：ヒトトポイソメラーゼＩ
Ｔｏｐｏ ＩＩ：ヒトトポイソメラーゼＩＩ
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｕ：酵素単位
Ｕ８７：ヒト膠芽腫多形細胞株
ＵＶ－ｖｉｓ：紫外可視分光法
ＡＦＭ：原子間力顕微鏡
Ａｇ：銀
Ａｇ２：２個の銀原子
Ａｇ３：３個の銀原子
ＡｇＮＯ３：硝酸銀
ＡＮＯＶＡ：分散分析
ＡＱＣ：原子量子クラスター
ＡＴＰ：アデノシン三リン酸
Ａｕ：金
ＢＣＮＵ：カルムスチン
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
ＣＢＤＣＡ：カルボプラチン
ＣＤ：円偏光二色性
ＣＤＤＰ：シスプラチン
ＣＯ２：二酸化炭素
ＤＦＴ：密度汎関数理論
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＮＡ：デオキシリボ核酸
ＤＯＸ：ドキソルビシン
ＤＴＴ：ジチオスレイトール
ＥＡｄ：吸着エネルギー
ＥＢ：臭化エチジウム
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥｄＵ：５－エチニル－２’－デオキシウリジン
ＥＧＴＡ：エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化質量分析法
ＥＳＩ－ＴＯＦ：エレクトロスプレーイオン化飛行時間型質量分析法
ＦＢＳ：牛胎児血清
ＦＤＲ：誤発見率
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＦＷＨＭ：半値全幅
ＧＡＰＤＨ：グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ
ＧＥＭ：ジェムシタビン
Ｈ２Ｏ２：過酸化水素
ＨＣｌ：塩酸塩
ＨＥＰＥＳ：４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＯＭＯ：最高被占軌道
ＨＮＯ３：硝酸
ＩＣ：阻害濃度
ＩＣＰ－ＭＳ：誘導結合プラズマ質量分析法
ＩＨＣ：免疫組織化学
ＩＰ：ヨウ化プロピジウム
ＩＴＣ：等温滴定熱量計
ＫＣｌ：塩化カリウム
ＫＯＨ：水酸化カリウム
Ｌｕｃ：北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子
ＬＵＭＯ：最低空軌道
ＭＣＦ７：ヒト乳腺癌細胞株
ＭｅＳＨ：メチルチオール
ＭｇＣｌ２：塩化マグネシウム
Ｎ２：窒素
ＮａＦ：フッ化ナトリウム
ＮＨ４Ｃｌ：塩化アンモニウム
Ｏ２：酸素
ＯＸＡ：オキサリプラチン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ｐＨ２ＡＸ：リン酸化ヒストンＨ２ＡＸ
ＰＭＳＦ：フェニルメタンスルホニルフルオライド
Ｐｔ：白金
ｑＰＣＲ：リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ＲＩＮ：ＲＮＡ完全性数（RNA Integrity Number）
ＲＬＵ：相対発光ユニット
ＲＮＡ：リボ核酸
ＲＴ：室温
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＳＴＯＲＭ：確率論的光学再構築顕微鏡
ＴＡＥ：トリス／酢酸／ＥＤＴＡ緩衝液
ＴＢＥ：トリス／ボレート／ＥＤＴＡ緩衝液
ＴＥ：トリス／ＥＤＴＡ緩衝液
Ｔｏｐｏ Ｉ：ヒトトポイソメラーゼＩ
Ｔｏｐｏ ＩＩ：ヒトトポイソメラーゼＩＩ
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｕ：酵素単位
Ｕ８７：ヒト膠芽腫多形細胞株
ＵＶ－ｖｉｓ：紫外可視分光法
【0122】
材料および方法
別段の指定のない限り、すべての試薬は、シグマアルドリッチ社（スペイン）から購入した。銀シート（９９％）は、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ社（ハンティンドン、英国）から購入した。アルミナナノ粒子（平均サイズ≒５０ｎｍ）および布パッドは、Ｂｕｅｈｌｅｒ社（デュッセルドルフ、ドイツ）から購入した。
別段の指定のない限り、すべての試薬は、シグマアルドリッチ社（スペイン）から購入した。銀シート（９９％）は、Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ社（ハンティンドン、英国）から購入した。アルミナナノ粒子（平均サイズ≒５０ｎｍ）および布パッドは、Ｂｕｅｈｌｅｒ社（デュッセルドルフ、ドイツ）から購入した。
【0123】
サンドペーパー（１，０００グリット）は、Ｗｏｌｆｃｒａｆｔ Ｅｓｐａｎａ Ｓ．Ｌ（スペイン）から供給された。すべての水溶液を、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｂｅｒｉｃａ Ｓ．Ａ．、マドリッド、スペイン）製のＤｉｒｅｃｔ－Ｑ８ＵＶシステムを使用して、ＭｉｌｌｉＱグレードの水で調製した。チオール基含有シリカ粒子（ＳｉｌｉａＭｅｔＳ（登録商標）チオール、４０～６３μｍ、６０Å）は、Ｔｅｋｎｏｋｒｏｍａ Ａｎａｌｉｔｉｃａ Ｓ．Ａ．社（バルセロナ、スペイン）から購入した。マイカシート（グレードＶ－１ Ｍｕｓｃｏｖｉｔｅ）は、ＳＰＩ Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（ウェストチェスター、ペンシルベニア州、米国）から購入した。コアヒストンは、シグマアルドリッチ社から入手し、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含むｐＨ＝７のリン酸緩衝液で希釈してストック溶液を調製した。ＵＶランプおよびウルトラフィルター（ＶＷＲ）を備えたＰｕｒａｎｉｔｙ ＴＵシステム（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｕｒｏｌａｂ Ｓ．Ｌ．、バルセロナ、スペイン）からの二重脱イオン水で緩衝液を調製し、コンバインドガラス電極（combined glass electrode）と液体接触部として３Ｍ ＫＣｌ溶液とを有するＭｅｔｒｏｈｍ（Ｍｅｔｒｏｈｍ ＡＧ、ヘリザウ、スイス）１６ ＤＭＳ Ｔｉｔｒｉｎｏ ｐＨメーターを使用して、ｐＨを調製した。
【0124】
特性評価
紫外可視および蛍光分光法
ＵＶ-ｖｉｓおよび蛍光分光実験はいずれも、パス長１ｃｍのヘルマ石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ．，ミュルヘイム、ドイツ）を使用して室温で実施された。ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、ダイオードアレイ検出器を備えたＡｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ Ｓｐｅｃｏｒｄ Ｓ６００分光計（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＡＧ，イェーナ、ドイツ）を使用して記録し、蛍光スペクトルは、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｖａｒｉａｎ蛍光計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｐａｉｎ Ｓ．Ｌ．，マドリッド、スペイン）を使用して記録した。
紫外可視および蛍光分光法
ＵＶ-ｖｉｓおよび蛍光分光実験はいずれも、パス長１ｃｍのヘルマ石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．ＫＧ．，ミュルヘイム、ドイツ）を使用して室温で実施された。ＵＶ－ｖｉｓスペクトルは、ダイオードアレイ検出器を備えたＡｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ Ｓｐｅｃｏｒｄ Ｓ６００分光計（Ａｎａｌｙｔｉｋ Ｊｅｎａ ＡＧ，イェーナ、ドイツ）を使用して記録し、蛍光スペクトルは、Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｖａｒｉａｎ蛍光計（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓｐａｉｎ Ｓ．Ｌ．，マドリッド、スペイン）を使用して記録した。
【0125】
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）
ＸＥ－１００装置（パークシステムズ、水原、韓国）を非接触モードで使用して、通常雰囲気条件下でＡＦＭ測定を行った。ＡＦＭチップは、３２５ｋＨｚの共振周波数を有するパークシステムズ社製のアルミニウムコーティングシリコンＡＣＴＡであった。ＡＦＭイメージングのために、Ａｇ３－ＡＱＣ希釈サンプルの一滴を劈開したばかりのマイカシート（グレードＶ－１ Ｍｕｓｃｏｖｉｔｅ）（パークシステムズ、水原、韓国）上に載置し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で十分に洗浄し、窒素流下で乾燥させた。
ＸＥ－１００装置（パークシステムズ、水原、韓国）を非接触モードで使用して、通常雰囲気条件下でＡＦＭ測定を行った。ＡＦＭチップは、３２５ｋＨｚの共振周波数を有するパークシステムズ社製のアルミニウムコーティングシリコンＡＣＴＡであった。ＡＦＭイメージングのために、Ａｇ３－ＡＱＣ希釈サンプルの一滴を劈開したばかりのマイカシート（グレードＶ－１ Ｍｕｓｃｏｖｉｔｅ）（パークシステムズ、水原、韓国）上に載置し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で十分に洗浄し、窒素流下で乾燥させた。
【0126】
質量分析
負イオン化モードで動作するＥＳＩソースを装備したＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ウォルシャム、米国）を使用して、ＥＳＩ質量スペクトルを取得した。ＥＳＩ源の条件は、電源電圧－４．５ｋＶ、加熱キャピラリー温度２７５℃、キャピラリー電圧－３５Ｖ、ならびにシースガスおよび補助ガス ５および２（Ｎ２、任意の単位）であった。フルスキャンＭＳ解析のために、１スキャン／ｓのスキャン速度で１００～２，０００ｍ／ｚの範囲でスペクトルを記録した。質量分解能を３０，０００ＦＷＨＭに設定した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置は、製造業者の使用説明書に従って校正液を使用して校正した。クラスターの検出のための最大感度を得るために、モニタリング実験を行った。溶液を、１ｍＭ ＮＨ４Ｃｌおよび０．１％ギ酸を含むアセトニトリル溶液と１対１で混合した後、セルに直接注入した。
負イオン化モードで動作するＥＳＩソースを装備したＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ウォルシャム、米国）を使用して、ＥＳＩ質量スペクトルを取得した。ＥＳＩ源の条件は、電源電圧－４．５ｋＶ、加熱キャピラリー温度２７５℃、キャピラリー電圧－３５Ｖ、ならびにシースガスおよび補助ガス ５および２（Ｎ２、任意の単位）であった。フルスキャンＭＳ解析のために、１スキャン／ｓのスキャン速度で１００～２，０００ｍ／ｚの範囲でスペクトルを記録した。質量分解能を３０，０００ＦＷＨＭに設定した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ装置は、製造業者の使用説明書に従って校正液を使用して校正した。クラスターの検出のための最大感度を得るために、モニタリング実験を行った。溶液を、１ｍＭ ＮＨ４Ｃｌおよび０．１％ギ酸を含むアセトニトリル溶液と１対１で混合した後、セルに直接注入した。
【0127】
イオンメーター
事前に校正されたｐＨ＆イオンメーターＧＬＰ ２２（Ｃｒｉｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．、バルセロナ、スペイン）を使用して、２５℃の一定温度でサンプルに２：１００の割合で安定化溶液（５Ｍ 硝酸ナトリウム）を添加することによって、イオン濃度を測定した。
事前に校正されたｐＨ＆イオンメーターＧＬＰ ２２（Ｃｒｉｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｓ．Ａ．、バルセロナ、スペイン）を使用して、２５℃の一定温度でサンプルに２：１００の割合で安定化溶液（５Ｍ 硝酸ナトリウム）を添加することによって、イオン濃度を測定した。
【0128】
炎原子吸収分光法
クラスターサンプル中の全Ａｇ含有量を、パーキンエルマー（マドリッド、スペイン）製のＡｇ中空陰極ランプＬｕｍｉａを備えたパーキンエルマー３１１０（電流１０ｍＡ）を使用して行った炎原子吸収分光法によって分析した。
クラスターサンプル中の全Ａｇ含有量を、パーキンエルマー（マドリッド、スペイン）製のＡｇ中空陰極ランプＬｕｍｉａを備えたパーキンエルマー３１１０（電流１０ｍＡ）を使用して行った炎原子吸収分光法によって分析した。
【0129】
細胞株
ヒト肺腺癌細胞株（Ａ５４９）およびヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ７）は、ＤＭＳＺ（ライプニッツＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクション、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手した。ＣＭＶプロモーターから発現される北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定なトランスフェクションによるＡ５４９細胞由来のルシフェラーゼ発現細胞株（Ａ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８ Ｂｉｏｗａｒｅ（登録商標）細胞株）は、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、マサチューセッツ州、米国）から入手した。ヒト膠芽腫多形細胞株（Ｕ８７－Ｌｕｃ）は、Ｖａｌｌ ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ（ＶＨＩＯ）（バルセロナ、スペイン）のＪｏａｎ Ｓｅｏａｎｅ氏のご厚意により提供された。すべての細胞株は、単層として接着して増殖する。Ａ５４９およびＡ５４９－Ｌｕｃ細胞株は、ダルベッコの改変イーグル培地（低グルコース、Ｄ６０４６、シグマ）で維持され、ＭＣＦ７およびＵ８７－Ｌｕｃ細胞株は、ダルベッコの改変イーグル培地（高グルコース）（Ｄ５６７１、シグマ）で維持された。培地には、１０％牛胎児血清および１％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）が補充された。改変細胞株の場合、培地にピューロマイシン（Ａ５４９－Ｌｕｃの場合は１．３μｇ／ｍＬ、ならびにＵ８７－Ｌｕｃの場合は５μｇ／ｍＬ）を添加して、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターでインキュベートし、１００ｍｍの培養ディッシュで約７０～８０％のコンフルエントになるまで増殖させた。サブカルチャーのために、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞剥離を誘導した。最後に、細胞を培養培地に懸濁し、１：５または１：１０の比率で新しい培養ディッシュに継代した。必要に応じて、ノイバウェル血球計算板を使用して細胞を計数した。層流フード内の無菌条件下で、すべての手順を実施した。液体窒素気化温度で１０％ＤＭＳＯ（シグマ、Ｄ２６５０）を補充した完全増殖培地で、すべての細胞株を凍結保存した。
ヒト肺腺癌細胞株（Ａ５４９）およびヒト乳腺癌細胞株（ＭＣＦ７）は、ＤＭＳＺ（ライプニッツＤＳＭＺ・ドイツ微生物細胞培養コレクション、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手した。ＣＭＶプロモーターから発現される北米ホタルルシフェラーゼ遺伝子の安定なトランスフェクションによるＡ５４９細胞由来のルシフェラーゼ発現細胞株（Ａ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８ Ｂｉｏｗａｒｅ（登録商標）細胞株）は、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、マサチューセッツ州、米国）から入手した。ヒト膠芽腫多形細胞株（Ｕ８７－Ｌｕｃ）は、Ｖａｌｌ ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ（ＶＨＩＯ）（バルセロナ、スペイン）のＪｏａｎ Ｓｅｏａｎｅ氏のご厚意により提供された。すべての細胞株は、単層として接着して増殖する。Ａ５４９およびＡ５４９－Ｌｕｃ細胞株は、ダルベッコの改変イーグル培地（低グルコース、Ｄ６０４６、シグマ）で維持され、ＭＣＦ７およびＵ８７－Ｌｕｃ細胞株は、ダルベッコの改変イーグル培地（高グルコース）（Ｄ５６７１、シグマ）で維持された。培地には、１０％牛胎児血清および１％（ｖ／ｖ）Ｌ－グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）が補充された。改変細胞株の場合、培地にピューロマイシン（Ａ５４９－Ｌｕｃの場合は１．３μｇ／ｍＬ、ならびにＵ８７－Ｌｕｃの場合は５μｇ／ｍＬ）を添加して、安定的にトランスフェクトされた細胞を選択した。細胞を、５％ＣＯ２、３７℃の加湿インキュベーターでインキュベートし、１００ｍｍの培養ディッシュで約７０～８０％のコンフルエントになるまで増殖させた。サブカルチャーのために、培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して細胞剥離を誘導した。最後に、細胞を培養培地に懸濁し、１：５または１：１０の比率で新しい培養ディッシュに継代した。必要に応じて、ノイバウェル血球計算板を使用して細胞を計数した。層流フード内の無菌条件下で、すべての手順を実施した。液体窒素気化温度で１０％ＤＭＳＯ（シグマ、Ｄ２６５０）を補充した完全増殖培地で、すべての細胞株を凍結保存した。
【0130】
動物
８～１２週齢で体重約２０～２５グラムの雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ、フランス）をｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用した。動物は、実験の少なくとも１週間前から順化させ、通気性のあるポリプロピレン製ケージに収容し、平均温度２２℃で、毎日１２時間の光および１２時間の暗闇への曝露を行った。すべてのマウスは、食物および水の自由飲食で標準的な実験室の食事を受けた。実験は、サンティアゴデコンポステーラ大学生命倫理委員会の規則に従い、スペインの国内法（ＲＤ ５３／２０１３）に従う実験動物ケアの原則に準拠して行われた。
８～１２週齢で体重約２０～２５グラムの雌の胸腺欠損ヌードマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ－Ｓａｉｎｔ－Ｉｓｌｅ、フランス）をｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用した。動物は、実験の少なくとも１週間前から順化させ、通気性のあるポリプロピレン製ケージに収容し、平均温度２２℃で、毎日１２時間の光および１２時間の暗闇への曝露を行った。すべてのマウスは、食物および水の自由飲食で標準的な実験室の食事を受けた。実験は、サンティアゴデコンポステーラ大学生命倫理委員会の規則に従い、スペインの国内法（ＲＤ ５３／２０１３）に従う実験動物ケアの原則に準拠して行われた。
【0131】
同所性肺癌モデル
縦隔リンパ節に転移する同所性肺癌モデルにおいて、Ａｇ３－ＡＱＣの抗腫瘍効果を評価した。このモデルは、Cui et al. Cancer Res. Treat. 2006, 38: 234から適応されたBorrajo et al. J. Control. Release 2016, 238: 263に記載のプロトコルに従って開発された。ＰＢＳ（５０μＬ）中の１×１０６個の非小細胞性肺癌ルシフェラーゼ発現細胞（Ａ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８ Ｂｉｏｗａｒｅ（登録商標）細胞株）の懸濁液を、胸腺欠損ヌードマウスの左肺に肋間腔を通して注射した。この手順の間、４％イソフルラン吸入を使用してマウスを麻酔した。腫瘍の成長を観察するために、イメージングの約５分前に、ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内に注射した。半定量的な方法で原発腫瘍の成長と癌細胞の伝播との両方のモニタリングを可能にしたＩＶＩＳ（登録商標）リビングイメージ（登録商標）システム（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、マサチューセッツ州、米国）を使用して、ルシフェラーゼ生物発光を気化イソフラン麻酔下で画像化した。数日間（最大３７日間）のｉｎ ｖｉｖｏイメージング後、マウスを屠殺し、ルシフェラーゼ活性を定量するために、タンパク質抽出物をさまざまな臓器から得た。簡潔に記載すると、組織ホモジナイザーを使用して、臓器をＤＩＰバッファー（５０ｍＭ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１０ｍＭ β－グリセロリン酸塩、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＰＭＳＦ、０．１Ｍ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ））中でホモジナイズした。１５分間の高速遠心分離後、ブラッドフォード比色法を使用して上清を定量し、Ｌｕｍａｔ ＢＬ ９５０７ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．、バート・ヴィルトバート、ドイツ）を使用して発光を測定した。結果は、抽出されたタンパク質１μｇ当たりの相対発光ユニット（ＲＬＵ）として表された。
縦隔リンパ節に転移する同所性肺癌モデルにおいて、Ａｇ３－ＡＱＣの抗腫瘍効果を評価した。このモデルは、Cui et al. Cancer Res. Treat. 2006, 38: 234から適応されたBorrajo et al. J. Control. Release 2016, 238: 263に記載のプロトコルに従って開発された。ＰＢＳ（５０μＬ）中の１×１０６個の非小細胞性肺癌ルシフェラーゼ発現細胞（Ａ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８ Ｂｉｏｗａｒｅ（登録商標）細胞株）の懸濁液を、胸腺欠損ヌードマウスの左肺に肋間腔を通して注射した。この手順の間、４％イソフルラン吸入を使用してマウスを麻酔した。腫瘍の成長を観察するために、イメージングの約５分前に、ルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腹腔内に注射した。半定量的な方法で原発腫瘍の成長と癌細胞の伝播との両方のモニタリングを可能にしたＩＶＩＳ（登録商標）リビングイメージ（登録商標）システム（Ｃａｌｉｐｅｒ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、ホプキントン、マサチューセッツ州、米国）を使用して、ルシフェラーゼ生物発光を気化イソフラン麻酔下で画像化した。数日間（最大３７日間）のｉｎ ｖｉｖｏイメージング後、マウスを屠殺し、ルシフェラーゼ活性を定量するために、タンパク質抽出物をさまざまな臓器から得た。簡潔に記載すると、組織ホモジナイザーを使用して、臓器をＤＩＰバッファー（５０ｍＭ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０、１０ｍＭ β－グリセロリン酸塩、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、０．１Ｍ ＰＭＳＦ、０．１Ｍ ＮａＦ、プロテアーゼインヒビターカクテル（シグマ））中でホモジナイズした。１５分間の高速遠心分離後、ブラッドフォード比色法を使用して上清を定量し、Ｌｕｍａｔ ＢＬ ９５０７ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．、バート・ヴィルトバート、ドイツ）を使用して発光を測定した。結果は、抽出されたタンパク質１μｇ当たりの相対発光ユニット（ＲＬＵ）として表された。
【0132】
静止状態の誘導およびフローサイトメトリーの検証
細胞周期のＧ０／Ｇ１期で細胞を停止させるために、Ａ５４９細胞を１０％ ＦＢＳを含む培地中で２０，０００細胞／ディッシュで播種した。２４時間後、培地を０．０５％ ＦＢＳを補充した培地に交換し、細胞を７２時間培養した。細胞を回収し、細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーで分析し、Ｇ０／Ｇ１期（静止状態）の細胞の割合を評価した。細胞を７０％エタノールで一晩固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍＬのヨウ化プロピジウム（０．１ｍｇ／ｍＬ）中で３０分間、暗所でインキュベートした。ＩｎＣｙｔｅプログラム（ミリポア、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ，マドリッド、スペイン）を使用するＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを使用して、染色した細胞を分析した。一度の検証後、本研究における静止細胞（血清飢餓）によるすべての実験で、このプロトコルを使用した。
細胞周期のＧ０／Ｇ１期で細胞を停止させるために、Ａ５４９細胞を１０％ ＦＢＳを含む培地中で２０，０００細胞／ディッシュで播種した。２４時間後、培地を０．０５％ ＦＢＳを補充した培地に交換し、細胞を７２時間培養した。細胞を回収し、細胞周期プロファイルをフローサイトメトリーで分析し、Ｇ０／Ｇ１期（静止状態）の細胞の割合を評価した。細胞を７０％エタノールで一晩固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍＬのヨウ化プロピジウム（０．１ｍｇ／ｍＬ）中で３０分間、暗所でインキュベートした。ＩｎＣｙｔｅプログラム（ミリポア、Ｍｅｒｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓ．Ａ，マドリッド、スペイン）を使用するＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターを使用して、染色した細胞を分析した。一度の検証後、本研究における静止細胞（血清飢餓）によるすべての実験で、このプロトコルを使用した。
【0133】
クロマチンアクセシビリティアッセイ
Ａ５４９細胞株と、Ａ５４９細胞由来の同所性肺腫瘍を有するマウスからの組織とでＡｇ３－ＡＱＣ処理後のクロマチンアクセス性を測定した。まず、５×１０５個のＡ５４９細胞を６０ｍｍ培養ディッシュに播種し、２４時間後（増殖細胞）または７２時間後（血清飢餓細胞）に無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）で１時間処理した。次いで、培地を完全培地に交換し、細胞を３時間培養し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、溶解バッファーに懸濁した。Ａ５４９細胞由来の同所性肺腫瘍を有するマウスに、Ａｇ３－ＡＱＣ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。２４時間後、動物を屠殺し、肺および腎臓を摘出した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して、腫瘍（肺）および腎臓の小片（１～２ｍｍ３）をホモジナイズし、溶解バッファーに懸濁した。この時点から、細胞および組織を同様に処理した。すなわち、クロマチンを単離し、ＥｐｉＱｕｉｃｋ（商標）クロマチンアクセシビリティアッセイキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ、ファーミングデール、ニューヨーク、米国）を使用して、製造業者から提供された使用説明書に従ってヌクレアーゼミックスで処理した。次いで、ＤＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、スペイン）およびＧＡＰＤＨ用の遺伝子特異的プライマー（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を使用して増幅した。
Ａ５４９細胞株と、Ａ５４９細胞由来の同所性肺腫瘍を有するマウスからの組織とでＡｇ３－ＡＱＣ処理後のクロマチンアクセス性を測定した。まず、５×１０５個のＡ５４９細胞を６０ｍｍ培養ディッシュに播種し、２４時間後（増殖細胞）または７２時間後（血清飢餓細胞）に無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）で１時間処理した。次いで、培地を完全培地に交換し、細胞を３時間培養し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、溶解バッファーに懸濁した。Ａ５４９細胞由来の同所性肺腫瘍を有するマウスに、Ａｇ３－ＡＱＣ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。２４時間後、動物を屠殺し、肺および腎臓を摘出した。Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して、腫瘍（肺）および腎臓の小片（１～２ｍｍ３）をホモジナイズし、溶解バッファーに懸濁した。この時点から、細胞および組織を同様に処理した。すなわち、クロマチンを単離し、ＥｐｉＱｕｉｃｋ（商標）クロマチンアクセシビリティアッセイキット（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ、ファーミングデール、ニューヨーク、米国）を使用して、製造業者から提供された使用説明書に従ってヌクレアーゼミックスで処理した。次いで、ＤＮＡを単離し、リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、スペイン）およびＧＡＰＤＨ用の遺伝子特異的プライマー（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ）を使用して増幅した。
【0134】
細胞サンプルおよびマウス臓器のＤＮＡ中の白金の定量
ＤＮＡ結合白金をComenge et al. PLoS One 2012, 7: e47562に以前に記載されたように評価した。簡潔に記載すると、５×１０５個のＡ５４９、ＭＣＦ７またはＵ８７－ｌｕｃ細胞を、直径６０ｍｍのプレートに播種した。２４時間後（または静止細胞の場合は７２時間後）、細胞を、１）ＣＤＤＰ ５０μＭを完全培地中で６時間処理、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理、または３）両方の処理の組み合わせ：Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間、次いで、完全培地中でＣＤＤＰ ５０μＭで５時間処理した。処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを－２０℃で一晩保存した。マウス臓器内の白金を定量する手順は以下の通りであった。腫瘍を有するヌードマウスに、１）１００μＬのＣＤＤＰ（４ｍｇ／ｋｇ）または２）５０μＬのＣＤＤＰ（４ｍｇ／ｋｇ）および５０μＬのＡｇ３－ＡＱＣ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。２４時間後、動物を屠殺し、臓器を摘出した。メスを使用して、腫瘍（肺）およびその他の臓器（心臓、肝臓、腎臓、脾臓、脳および骨髄）の小片（１～２ｍｍ３）を分離した。この時点から、ＤＮＡ抽出のための工程は、細胞および組織のサンプルと共通である。一晩凍結した後、細胞または組織のペレットを、３００μＬの溶解バッファー（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８；１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５％ ＳＤＳ）および１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０μｇ／μＬ）に懸濁した。細胞ペレット／組織を針で５回刺し、５６℃のウォーターバスで細胞は２時間、組織は一晩インキュベートした。インキュベート後、３Ｍ 酢酸ナトリウムおよびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（０．１および１．０体積当量）を添加し、１分間穏やかにボルテックスした。サンプルを１６，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。ＤＮＡの沈殿のため、コールドエタノール１０－１０％を２倍体積添加し、懸濁液を１６，０００×ｇで４℃、１０分間遠心した。遠心分離後、上清を捨て、ペレットに７０％コールドエタノール１ｍＬを加え、５秒間穏やかにボルテックスし、１６，０００×ｇで４℃、１０分間遠心した。ペレットを室温で乾燥させ、０．１ｍＬのＴＥバッファーに再懸濁した。ナノドロップ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、スペイン）を使用してＤＮＡ濃度を測定した。次いで、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して、０．１ｍＬのＴＥバッファーを除去し、０．２ｍＬの６５％ＨＮＯ３にＤＮＡを再懸濁した。最後に、低流速ガラスマイクロミストネブライザーと、ペルチェ冷却（３℃）および石英トーチを備えたダブルパススプレーチャンバーとを備えたＩＣＰ－ＭＳ ＢＲＵＣＫＥＲ ８２０－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐ．，ビレリカ、マサチューセッツ、米国）を使用する質量分析によって、白金の量を決定した。
ＤＮＡ結合白金をComenge et al. PLoS One 2012, 7: e47562に以前に記載されたように評価した。簡潔に記載すると、５×１０５個のＡ５４９、ＭＣＦ７またはＵ８７－ｌｕｃ細胞を、直径６０ｍｍのプレートに播種した。２４時間後（または静止細胞の場合は７２時間後）、細胞を、１）ＣＤＤＰ ５０μＭを完全培地中で６時間処理、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理、または３）両方の処理の組み合わせ：Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間、次いで、完全培地中でＣＤＤＰ ５０μＭで５時間処理した。処理後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トリプシン処理し、遠心分離した。上清を除去し、細胞ペレットを－２０℃で一晩保存した。マウス臓器内の白金を定量する手順は以下の通りであった。腫瘍を有するヌードマウスに、１）１００μＬのＣＤＤＰ（４ｍｇ／ｋｇ）または２）５０μＬのＣＤＤＰ（４ｍｇ／ｋｇ）および５０μＬのＡｇ３－ＡＱＣ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を注射した。２４時間後、動物を屠殺し、臓器を摘出した。メスを使用して、腫瘍（肺）およびその他の臓器（心臓、肝臓、腎臓、脾臓、脳および骨髄）の小片（１～２ｍｍ３）を分離した。この時点から、ＤＮＡ抽出のための工程は、細胞および組織のサンプルと共通である。一晩凍結した後、細胞または組織のペレットを、３００μＬの溶解バッファー（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８；１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８；１００ｍＭ ＮａＣｌ；０．５％ ＳＤＳ）および１０μＬのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（２０μｇ／μＬ）に懸濁した。細胞ペレット／組織を針で５回刺し、５６℃のウォーターバスで細胞は２時間、組織は一晩インキュベートした。インキュベート後、３Ｍ 酢酸ナトリウムおよびフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（０．１および１．０体積当量）を添加し、１分間穏やかにボルテックスした。サンプルを１６，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を回収した。ＤＮＡの沈殿のため、コールドエタノール１０－１０％を２倍体積添加し、懸濁液を１６，０００×ｇで４℃、１０分間遠心した。遠心分離後、上清を捨て、ペレットに７０％コールドエタノール１ｍＬを加え、５秒間穏やかにボルテックスし、１６，０００×ｇで４℃、１０分間遠心した。ペレットを室温で乾燥させ、０．１ｍＬのＴＥバッファーに再懸濁した。ナノドロップ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、スペイン）を使用してＤＮＡ濃度を測定した。次いで、ＳｐｅｅｄＶａｃを使用して、０．１ｍＬのＴＥバッファーを除去し、０．２ｍＬの６５％ＨＮＯ３にＤＮＡを再懸濁した。最後に、低流速ガラスマイクロミストネブライザーと、ペルチェ冷却（３℃）および石英トーチを備えたダブルパススプレーチャンバーとを備えたＩＣＰ－ＭＳ ＢＲＵＣＫＥＲ ８２０－ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐ．，ビレリカ、マサチューセッツ、米国）を使用する質量分析によって、白金の量を決定した。
【0135】
細胞生存率
フローサイトメトリー測定
Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ミリポア）を使用したフローサイトメトリーにより、細胞生存率を定量した。Ａ５４９細胞（６×１０４）を１２ウェルディッシュに播種し、２４時間後（増殖細胞）または７２時間後（静止細胞）に、１）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、次いで、完全培地中で２４時間処理した；２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、次いで、種々の薬剤（ＣＤＤＰ ５０μＭ、ＯＸＡ ５０μＭ、ＣＢＤＣＡ １００ｍＭ、ＧＥＭ １００μＭ、ＢＣＮＵ ４００μＭまたはＤＯＸ ７．５μＭ）で２４時間処理した；３）種々の薬剤（ＣＤＤＰ ５０μＭ、ＯＸＡ ５０μＭ、ＣＢＤＣＡ １００ｍＭ、ＧＥＭ １００μＭ、ＢＣＮＵ ４００μＭまたはＤＯＸ ７．５μＭ）で２４時間処理した；または４）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地で１時間処理し、無処理の完全培地で２４時間、次いで、ＣＣＤＰ ５０μＭで２４時間処理した。処理後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＰＢＳに懸濁させた。染色サンプルを調製するために、細胞懸濁液を製造業者の使用説明書に従ってＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ミリポア）と混合した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔソフトウェアを使用してＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（ミリポア）で、染色された細胞を分析した。
フローサイトメトリー測定
Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ミリポア）を使用したフローサイトメトリーにより、細胞生存率を定量した。Ａ５４９細胞（６×１０４）を１２ウェルディッシュに播種し、２４時間後（増殖細胞）または７２時間後（静止細胞）に、１）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、次いで、完全培地中で２４時間処理した；２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、次いで、種々の薬剤（ＣＤＤＰ ５０μＭ、ＯＸＡ ５０μＭ、ＣＢＤＣＡ １００ｍＭ、ＧＥＭ １００μＭ、ＢＣＮＵ ４００μＭまたはＤＯＸ ７．５μＭ）で２４時間処理した；３）種々の薬剤（ＣＤＤＰ ５０μＭ、ＯＸＡ ５０μＭ、ＣＢＤＣＡ １００ｍＭ、ＧＥＭ １００μＭ、ＢＣＮＵ ４００μＭまたはＤＯＸ ７．５μＭ）で２４時間処理した；または４）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地で１時間処理し、無処理の完全培地で２４時間、次いで、ＣＣＤＰ ５０μＭで２４時間処理した。処理後、細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、５００μＬのＰＢＳに懸濁させた。染色サンプルを調製するために、細胞懸濁液を製造業者の使用説明書に従ってＧｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ（ミリポア）と混合した。Ｇｕａｖａ ＶｉａＣｏｕｎｔソフトウェアを使用してＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーター（ミリポア）で、染色された細胞を分析した。
【0136】
発光アッセイ
５×１０３個のＡ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間後（増殖細胞）または７２時間後（血清飢餓細胞）に、１）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、完全培地中で２４時間処理した；２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、異なる用量のＣＤＤＰ（ＩＣ５：５μＭ、ＩＣ２５：１０μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：１００μＭ）、ＯＸＡ（ＩＣ５：２．５μＭ、ＩＣ２５：１２．５μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：２００μＭ）またはＣＢＤＡ（ＩＣ５：０．２５μＭ、ＩＣ２５：０．５μＭ、ＩＣ５０：１ｍＭおよびＩＣ７５：２ｍＭ）で２４時間処理した；３）異なる用量のＣＤＤＰ（ＩＣ５：５μＭ、ＩＣ２５：１０μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：１００μＭ）、ＯＸＡ（ＩＣ５：２．５μＭ、ＩＣ２５：１２．５μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：２００μＭ）またはＣＢＤＣＡ（ＩＣ５：０．２５μＭ、ＩＣ２５：０．５μＭ、ＩＣ５０：１ｍＭおよびＩＣ７５：２ｍＭ）で２４時間処理した。その後、処理物を除去し、２０μＬのリシスバッファー（プロメガ）をウェルに添加し、３０分間振盪しながらインキュベートした。次いで、溶解物を１．５ｍＬのチューブに移し、高速で１５分間遠心した。上清を回収し、ブラッドフォード比色法を使用してタンパク質の量を定量し、Ｌｕｍａｔ ＢＬ ９５０７ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して発光を測定した。結果は、抽出されたタンパク質のμｇ当たりの相対発光ユニット（ＲＬＵ）として表された。
５×１０３個のＡ５４９ Ｌｕｃ－Ｃ８細胞を９６ウェルプレートに播種し、２４時間後（増殖細胞）または７２時間後（血清飢餓細胞）に、１）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、完全培地中で２４時間処理した；２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）を無血清培地中で１時間処理し、異なる用量のＣＤＤＰ（ＩＣ５：５μＭ、ＩＣ２５：１０μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：１００μＭ）、ＯＸＡ（ＩＣ５：２．５μＭ、ＩＣ２５：１２．５μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：２００μＭ）またはＣＢＤＡ（ＩＣ５：０．２５μＭ、ＩＣ２５：０．５μＭ、ＩＣ５０：１ｍＭおよびＩＣ７５：２ｍＭ）で２４時間処理した；３）異なる用量のＣＤＤＰ（ＩＣ５：５μＭ、ＩＣ２５：１０μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：１００μＭ）、ＯＸＡ（ＩＣ５：２．５μＭ、ＩＣ２５：１２．５μＭ、ＩＣ５０：５０μＭおよびＩＣ７５：２００μＭ）またはＣＢＤＣＡ（ＩＣ５：０．２５μＭ、ＩＣ２５：０．５μＭ、ＩＣ５０：１ｍＭおよびＩＣ７５：２ｍＭ）で２４時間処理した。その後、処理物を除去し、２０μＬのリシスバッファー（プロメガ）をウェルに添加し、３０分間振盪しながらインキュベートした。次いで、溶解物を１．５ｍＬのチューブに移し、高速で１５分間遠心した。上清を回収し、ブラッドフォード比色法を使用してタンパク質の量を定量し、Ｌｕｍａｔ ＢＬ ９５０７ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して発光を測定した。結果は、抽出されたタンパク質のμｇ当たりの相対発光ユニット（ＲＬＵ）として表された。
【0137】
マイクロアレイ
Ａ５４９（５×１０５）細胞を６０ｍｍ培養ディッシュに播種した。２４時間後、細胞を無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣ（４１．５ｎｇ／ｍＬ）で１時間処理した。次いで、培地を除去し、完全培地と交換し、０時間、４時間または２４時間培養した。これらの時点で、細胞を回収し、キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＡＲＮ（マッハライ・ナーゲル、デューレン、ドイツ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、それらのＲＮＡを単離した。分光光度計（ナノドロップ２０００）を使用して、ＲＮＡ濃度を定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ キットおよびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、米国）を使用して、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）を測定して品質を評価した。ＲＩＮ＞７のサンプルのみを許容可能とした。使用まで－８０℃でサンプルを保存した。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ２．１ ＳＴ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、米国）を製造者の使用説明書に従って使用して、ヒトサンプルをハイブリダイズした。Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣｏｎｓｏｌｅおよびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、バックグラウンド補正、正規化、プローブサマライゼーションおよびデータ解析を行った。
Ａ５４９（５×１０５）細胞を６０ｍｍ培養ディッシュに播種した。２４時間後、細胞を無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣ（４１．５ｎｇ／ｍＬ）で１時間処理した。次いで、培地を除去し、完全培地と交換し、０時間、４時間または２４時間培養した。これらの時点で、細胞を回収し、キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＡＲＮ（マッハライ・ナーゲル、デューレン、ドイツ）を製造業者の使用説明書に従って使用して、それらのＲＮＡを単離した。分光光度計（ナノドロップ２０００）を使用して、ＲＮＡ濃度を定量し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ キットおよびＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、米国）を使用して、ＲＮＡ完全性数（ＲＩＮ）を測定して品質を評価した。ＲＩＮ＞７のサンプルのみを許容可能とした。使用まで－８０℃でサンプルを保存した。Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ ２．１ ＳＴ Ａｒｒａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、米国）を製造者の使用説明書に従って使用して、ヒトサンプルをハイブリダイズした。Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＣｏｎｓｏｌｅおよびＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｃｏｎｓｏｌｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して、バックグラウンド補正、正規化、プローブサマライゼーションおよびデータ解析を行った。
【0138】
ＤＮＡ損傷アッセイ
リン酸化されたＨ２ＡＸの評価
Muslimovic, et al. Nat. Protoc. 2008, 3: 1187に記載されたように、リン酸化Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）の評価を行った。簡潔に記載すれば、Ａ５４９細胞（４．５×１０４）を６ウェルディッシュに播種した。２４時間後、細胞を無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣおよびエトポシドで１時間処理した。細胞を回収し、コールドＰＢＳで２回洗浄した。上清を捨て、ペレットを５０μＬの固定バッファー中で光から保護しながら５分間固定した。次いで、０．６μｇ／ｍＬの抗ｐＨ２ＡＸ（ｓｅｒ１３９）ＦＩＴＣコンジュゲート（１６－２０２Ａ、ミリポア）を含むＢｌｏｃｋ－９バッファー１５０μＬを添加し、光から保護しながら細胞を４℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１ｍＬのヨウ化プロピジウム（０．０１ｍｇ／ｍＬ）で、暗所で一晩インキュベートした。ＩｎＣｙｔｅプログラム（ミリポア）を使用してＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターで、染色された細胞を分析した。
リン酸化されたＨ２ＡＸの評価
Muslimovic, et al. Nat. Protoc. 2008, 3: 1187に記載されたように、リン酸化Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）の評価を行った。簡潔に記載すれば、Ａ５４９細胞（４．５×１０４）を６ウェルディッシュに播種した。２４時間後、細胞を無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣおよびエトポシドで１時間処理した。細胞を回収し、コールドＰＢＳで２回洗浄した。上清を捨て、ペレットを５０μＬの固定バッファー中で光から保護しながら５分間固定した。次いで、０．６μｇ／ｍＬの抗ｐＨ２ＡＸ（ｓｅｒ１３９）ＦＩＴＣコンジュゲート（１６－２０２Ａ、ミリポア）を含むＢｌｏｃｋ－９バッファー１５０μＬを添加し、光から保護しながら細胞を４℃で３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．１ｍＬのヨウ化プロピジウム（０．０１ｍｇ／ｍＬ）で、暗所で一晩インキュベートした。ＩｎＣｙｔｅプログラム（ミリポア）を使用してＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターで、染色された細胞を分析した。
【0139】
コメットアッセイ
Ａ５４９細胞（５×１０５）を６０ｍｍプレートディッシュに播種し、２４時間後に無血清培地で１時間Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）または陽性対照であるＨ２Ｏ２（１００μＭ）で処理した。次いで、細胞をトリプシン処理によって回収し、氷冷ＰＢＳ（Ｃａ２ ＋およびＭｇ２ ＋フリー）で一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳ中に懸濁し（１×１０５細胞／ｍＬ）、製造業者（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，ゲイザースバーク、米国）から提供された使用説明書に従ってアルカリコメットアッセイを行った。オリンパスＤＰ７２カメラおよびＣｅｌｌＳｅｎｓイメージングソフトウェア（オリンパス、東京、日本）を搭載したオリンパスＩＸ５１顕微鏡を使用して、画像を取得した。
Ａ５４９細胞（５×１０５）を６０ｍｍプレートディッシュに播種し、２４時間後に無血清培地で１時間Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）または陽性対照であるＨ２Ｏ２（１００μＭ）で処理した。次いで、細胞をトリプシン処理によって回収し、氷冷ＰＢＳ（Ｃａ２ ＋およびＭｇ２ ＋フリー）で一度洗浄した。次いで、細胞を氷冷ＰＢＳ中に懸濁し（１×１０５細胞／ｍＬ）、製造業者（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ，ゲイザースバーク、米国）から提供された使用説明書に従ってアルカリコメットアッセイを行った。オリンパスＤＰ７２カメラおよびＣｅｌｌＳｅｎｓイメージングソフトウェア（オリンパス、東京、日本）を搭載したオリンパスＩＸ５１顕微鏡を使用して、画像を取得した。
【0140】
ＤＯＸ分析
核内ＤＯＸ含有
蛍光顕微鏡を使用して、ＤＯＸの核内取り込みを判定した。Ａ５４９細胞（５×１０５）を１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、１）ＤＯＸ（７．５μＭ）で３０分間処理した、あるいは、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）で３０分間、次いで、ＤＯＸ（７．５μＭ）でさらに３０分間処理した。オリンパスＤＰ７２カメラおよびＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを搭載したオリンパスＩＸ５１顕微鏡を使用して画像を取得した。
核内ＤＯＸ含有
蛍光顕微鏡を使用して、ＤＯＸの核内取り込みを判定した。Ａ５４９細胞（５×１０５）を１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、１）ＤＯＸ（７．５μＭ）で３０分間処理した、あるいは、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）で３０分間、次いで、ＤＯＸ（７．５μＭ）でさらに３０分間処理した。オリンパスＤＰ７２カメラおよびＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを搭載したオリンパスＩＸ５１顕微鏡を使用して画像を取得した。
【0141】
ＤＯＸ蓄積のフローサイトメトリー測定
Ａｇ３－ＡＱＣの存在下におけるＤＯＸの細胞内取り込みを定量するために、Ａ５４９細胞（５×１０５）を１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、１）ＤＯＸ（７．５μＭ）で４時間処理した、あるいは、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理し、次いで、ＤＯＸ（７．５μＭ）で４時間処理した。その後、細胞を回収し、コールドＰＢＳで洗浄し、０．２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で５分間固定した。次いで、サンプルを、２００μＬのＰＢＳに懸濁し、ＩｎＣｙｔｅプログラムを使用してＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターで分析した。
Ａｇ３－ＡＱＣの存在下におけるＤＯＸの細胞内取り込みを定量するために、Ａ５４９細胞（５×１０５）を１２ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、１）ＤＯＸ（７．５μＭ）で４時間処理した、あるいは、２）Ａｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）で３０分間処理し、次いで、ＤＯＸ（７．５μＭ）で４時間処理した。その後、細胞を回収し、コールドＰＢＳで洗浄し、０．２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で５分間固定した。次いで、サンプルを、２００μＬのＰＢＳに懸濁し、ＩｎＣｙｔｅプログラムを使用してＧｕａｖａ ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメーターで分析した。
【0142】
組織学的解析
マウスの肺を２４時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。厚さ４ｍｍの切片を、ＦＬＥＸ ＩＨＣ顕微鏡スライド（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）にマウントし、６０℃のオーブンで１時間加熱した。免疫組織化学的手法は、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ ４８（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して自動的に行った。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ抗原賦活液（高ｐＨ）中での脱パラフィン化およびエピトープ賦活化を９７℃で２０分間行った後、スライドをＰＴ Ｌｉｎｋ中で６５℃まで冷却し、次いで、室温（ＲＴ）のＤａｋｏ洗浄バッファー中で５分間放置した。免疫染色のプロトコルには、（１）ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）で５分間；（２）すぐに使用できるＦＬＥＸ一次抗体（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）抗ＣＫ７（クローンＯＶ－ＴＬ １２／３０）で２０分間；（３）ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ／ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼとアフィニティ単離されたヤギ抗マウス免疫グロブリンとを結合させたデキストランポリマー、および西洋ワサビペルオキシダーゼとアフィニティ単離されたヤギ抗ウサギ免疫グロブリンとを結合させたデキストランポリマー）で２０分間；（４）基質作用溶液（ミックス）（３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸クロモゲン溶液）（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）を１０分間；および（５）ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸヘマトキシリン（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）を９分間でのＲＴでのインキュベーションが含まれた。オリンパスＤＰ７０カメラを装備したオリンパスＰＲＯＶＩＳ ＡＸ７０顕微鏡を使用して、切片を試験し、撮影した。
マウスの肺を２４時間、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。厚さ４ｍｍの切片を、ＦＬＥＸ ＩＨＣ顕微鏡スライド（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）にマウントし、６０℃のオーブンで１時間加熱した。免疫組織化学的手法は、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ ４８（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して自動的に行った。ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ抗原賦活液（高ｐＨ）中での脱パラフィン化およびエピトープ賦活化を９７℃で２０分間行った後、スライドをＰＴ Ｌｉｎｋ中で６５℃まで冷却し、次いで、室温（ＲＴ）のＤａｋｏ洗浄バッファー中で５分間放置した。免疫染色のプロトコルには、（１）ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸペルオキシダーゼブロッキング試薬（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）で５分間；（２）すぐに使用できるＦＬＥＸ一次抗体（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）抗ＣＫ７（クローンＯＶ－ＴＬ １２／３０）で２０分間；（３）ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸ／ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼとアフィニティ単離されたヤギ抗マウス免疫グロブリンとを結合させたデキストランポリマー、および西洋ワサビペルオキシダーゼとアフィニティ単離されたヤギ抗ウサギ免疫グロブリンとを結合させたデキストランポリマー）で２０分間；（４）基質作用溶液（ミックス）（３，３’－ジアミノベンジジン四塩酸クロモゲン溶液）（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）を１０分間；および（５）ＥｎＶｉｓｉｏｎ ＦＬＥＸヘマトキシリン（Ｄａｋｏ－Ａｇｉｌｅｎｔ）を９分間でのＲＴでのインキュベーションが含まれた。オリンパスＤＰ７０カメラを装備したオリンパスＰＲＯＶＩＳ ＡＸ７０顕微鏡を使用して、切片を試験し、撮影した。
【0143】
統計解析
Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を適用して、ＣＤＤＰ処置に対するＣＤＤＰおよびＡｇ３－ＡＱＣ処置の生物学的分布および有効性試験における差を検討した。平均±標準偏差（ＳＤ）を各治療群について決定した。差は、＊ｐ＜０．０５については有意であり、＊ｐ＜０．０１については非常に有意であると見なした。ＳＴＯＲＭ分析については、一方向ＡＮＯＶＡを使用して有意性を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，米国）を使用して、すべての統計解析を実施した。
Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を適用して、ＣＤＤＰ処置に対するＣＤＤＰおよびＡｇ３－ＡＱＣ処置の生物学的分布および有効性試験における差を検討した。平均±標準偏差（ＳＤ）を各治療群について決定した。差は、＊ｐ＜０．０５については有意であり、＊ｐ＜０．０１については非常に有意であると見なした。ＳＴＯＲＭ分析については、一方向ＡＮＯＶＡを使用して有意性を計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，米国）を使用して、すべての統計解析を実施した。
【0144】
ヒトトポイソメラーゼＩ（Ｔｏｐｏ Ｉ）リラクゼーションアッセイ
活性は、製造業者（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ，ノリッジ、英国）に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して評価した。簡潔に記載すれば、以下の条件：３５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２４ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、１．８ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰ、６．５％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡの反応液３０ｍＬ中でＡｇ３－ＡＱＣとともに、弛緩したｐＢＲ３２２ ＤＮＡの０．５ｍｇを室温で３０分間プレインキュベートした。次いで、ヒトＴｏｐｏ Ｉを１Ｕ添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続した。３０ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールおよび６ｍＬのローディングバッファーを添加して反応を停止させ、次いで、臭化エチジウムを含まないＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファー中でアガロースゲル（１％：ｗ／ｖ）にロードした。
活性は、製造業者（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ，ノリッジ、英国）に従って、Ｈｕｍａｎ Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用して評価した。簡潔に記載すれば、以下の条件：３５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２４ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、１．８ｍＭ スペルミジン、１ｍＭ ＡＴＰ、６．５％（ｗ／ｖ）グリセロールおよび０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡの反応液３０ｍＬ中でＡｇ３－ＡＱＣとともに、弛緩したｐＢＲ３２２ ＤＮＡの０．５ｍｇを室温で３０分間プレインキュベートした。次いで、ヒトＴｏｐｏ Ｉを１Ｕ添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続した。３０ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールおよび６ｍＬのローディングバッファーを添加して反応を停止させ、次いで、臭化エチジウムを含まないＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）バッファー中でアガロースゲル（１％：ｗ／ｖ）にロードした。
【0145】
ヒトトポイソメラーゼＩＩ（Ｔｏｐｏ ＩＩ）デカテネーションアッセイ
ヒトトポＩＩ活性は、市販のキット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ，ノリッジ、英国）を使用して評価した。簡潔に記載すれば、全反応液量３０ｍＬにおいて、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよび５０ｍｇ／ｍＬ アルブミン中で、様々な濃度のＡｇ３－ＡＱＣとともに、２００ｎｇのｋＤＮＡを室温で５分間プレインキュベートした。次いで、１ＵのＴｏｐｏ ＩＩを添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続した。３０ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールおよび６ｍＬのローディングバッファーを添加して反応を停止し、ボルテックスし、短時間（５～１０秒ずつ）遠心し、次いで、ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でアガロースゲル（１％：ｗ／ｖ）にローディングした。
ヒトトポＩＩ活性は、市販のキット（Ｉｎｓｐｉｒａｌｉｓ，ノリッジ、英国）を使用して評価した。簡潔に記載すれば、全反応液量３０ｍＬにおいて、４０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ グルタミン酸カリウム、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよび５０ｍｇ／ｍＬ アルブミン中で、様々な濃度のＡｇ３－ＡＱＣとともに、２００ｎｇのｋＤＮＡを室温で５分間プレインキュベートした。次いで、１ＵのＴｏｐｏ ＩＩを添加し、３７℃で３０分間インキュベーションを継続した。３０ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールおよび６ｍＬのローディングバッファーを添加して反応を停止し、ボルテックスし、短時間（５～１０秒ずつ）遠心し、次いで、ＴＡＥ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中でアガロースゲル（１％：ｗ／ｖ）にローディングした。
【0146】
実施例１：Ａｇ３－ＡＱＣ合成法
以前にBuceta et al., Angew. Chemie Int. Ed. 2015, 54: 7612で報告されている電気化学的な方法を新たに発展させた方法によってＡｇ３－ＡＱＣを合成し、本試験で必要とされる多量のＡｇ３－ＡＱＣを動物実験のために得ることができた。実質的な修正は、電極面積を７倍に増加させ、反応の電圧および時間を３倍に増加させることで構成された。これらの改良を行うために、以前に使用されていた白金の対極を銀電極に置き換えた。これは、Ｐｔ電極上でのＨ２の発生により、高電圧の使用が不可能になり、それによって合成収率が低下するためである。さらに、Ｐｔを対電極として使用すると、より複雑な洗浄プロセスを必要とし、より高価になるためである。Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ＶＭＰ３００ポテンショスタット（Ｓｅｙｓｓｉｎｅｔ－Ｐａｒｉｓｅｔ、フランス）を使用して、合成を行った。水素電極を基準電極として、２枚のＡｇ箔（表面積１７．５ｃｍ２）を対向電極および作業電極として備えるメトローム熱絶縁３電極電気化学セルを使用した。これらの電極は互いに向かい合っており、３ｃｍの距離で離隔している。２５℃で６Ｖの定電圧を３６００秒間印加した。合成に先立ち、両方の銀電極をサンドペーパー、次いで、アルミナ（≒５０ｎｍ）で研磨し、ＭｉｌｌｉＱ水で徹底的に洗浄し、超音波処理した。
以前にBuceta et al., Angew. Chemie Int. Ed. 2015, 54: 7612で報告されている電気化学的な方法を新たに発展させた方法によってＡｇ３－ＡＱＣを合成し、本試験で必要とされる多量のＡｇ３－ＡＱＣを動物実験のために得ることができた。実質的な修正は、電極面積を７倍に増加させ、反応の電圧および時間を３倍に増加させることで構成された。これらの改良を行うために、以前に使用されていた白金の対極を銀電極に置き換えた。これは、Ｐｔ電極上でのＨ２の発生により、高電圧の使用が不可能になり、それによって合成収率が低下するためである。さらに、Ｐｔを対電極として使用すると、より複雑な洗浄プロセスを必要とし、より高価になるためである。Ｂｉｏｌｏｇｉｃ ＶＭＰ３００ポテンショスタット（Ｓｅｙｓｓｉｎｅｔ－Ｐａｒｉｓｅｔ、フランス）を使用して、合成を行った。水素電極を基準電極として、２枚のＡｇ箔（表面積１７．５ｃｍ２）を対向電極および作業電極として備えるメトローム熱絶縁３電極電気化学セルを使用した。これらの電極は互いに向かい合っており、３ｃｍの距離で離隔している。２５℃で６Ｖの定電圧を３６００秒間印加した。合成に先立ち、両方の銀電極をサンドペーパー、次いで、アルミナ（≒５０ｎｍ）で研磨し、ＭｉｌｌｉＱ水で徹底的に洗浄し、超音波処理した。
【0147】
実施例２：ＤＮＡを使用したＡｇ３－ＡＱＣ精製
小さなサイズの銀クラスターの水性分散液を実施例１に記載したように合成した。Ａｇカチオンおよび小さなサイズ（１０原子未満）のクラスターを含有するサンプルをＤＮＡ付加体の調製および透析手順のために使用した。ＡＦＭおよびＵＶ-Ｖｉｓによる特性評価によって、サンプルが主にＡｇ２およびＡｇ３クラスターを含むことが示された。
小さなサイズの銀クラスターの水性分散液を実施例１に記載したように合成した。Ａｇカチオンおよび小さなサイズ（１０原子未満）のクラスターを含有するサンプルをＤＮＡ付加体の調製および透析手順のために使用した。ＡＦＭおよびＵＶ-Ｖｉｓによる特性評価によって、サンプルが主にＡｇ２およびＡｇ３クラスターを含むことが示された。
【0148】
ＤＮＡおよびＡｇ－ＡＱＣサンプルの水溶液を計算された量で混合し、次いで、室温で１２時間の間、穏やかに攪拌することによって、インキュベーション混合物であるＤＮＡ／Ａｇ－ＡＱＣ（質量比１：１）を調製した。このステップの後、混合物を３．５ＫＤａ膜を有する透析カセットに移した。
【0149】
分離プロセスに沿って、３つの異なる透析手順が行われた。最初のステップでは、カセットをＭｉｌｌｉＱ水に２４時間浸漬した。２回目の透析では、１回目の透析ステップ後に少量の不純物として存在する銀カチオンの痕跡を除去する目的で、より高いイオン強度の溶液（ＮａＣｌ １Ｍ）を使用した。
【0150】
３回目の透析の前に、ＤＮＡ／Ａｇ－ＡＱＣの混合物を９６℃で８時間加熱し、ＤＮＡを変性させてインターカレートされているクラスターの分離を可能にし、すぐに０℃に冷却して再生を防止した。最後の透析は、ＭｉｌｌｉＱ水で０℃２４時間行った。
【0151】
次いで、分離効率を蛍光分光法で試験した。高い感度および簡便性から、透析抽出物の特性評価ツールとして蛍光分光法を選択した。最初の透析後に得られた結果を図２２に示す。これによると、Ａｇ２の存在に関連する３００ｎｍのバンドのみの存在を見ることができる。これは、同じ図のスキームで表されるように、最初のクラスターサンプルからＡｇ２の効果的な分離を示している。後続の透析では、元のサンプルからＡｇ２の完全な分離（最初の透析ステップ）を示す類いの証拠は示されていない。ＤＮＡの変性（９６℃で８時間）後の最後の透析抽出は、図２３に示されている。これによると、Ａｇ３に起因する３５０ｎｍの主要なバンドの存在を見ることができ、前の透析ステップの後でのＡｇ３クラスターの分離を確認することができる。
【0152】
得られた結果は、Ａｇ３クラスターがＤＮＡ鎖の間にインターカレートする傾向があることを示す以前の報告（Ｂｕｃｅｔａら２０１５）を裏付けるが、Ａｇ２クラスターは、より緩く螺旋の外側に結合していることが考えられる。このことは、ＤＮＡに結合していないＡｇ２が、最初の透析ステップで非常に容易に溶出する理由を説明している。
【0153】
この試験では、ＤＮＡに対する結合特性の差を利用して、たった１原子の違いだけであらかじめ形成された小さな裸のクラスターを分離する可能性があることを示した。この相互作用の高い特異性により、両種を含有するクラスターサンプル中のＡｇ２およびＡｇ３の選択的分離に効率的に利用することができる。さらに、開発された方法では、Ａｇ３－ＡＱＣの精製（主に合成の副産物であるＡｇイオンからの精製）も可能である。
【0154】
実施例３：チオール化樹脂を使用したＡｇ３－ＡＱＣの精製
合成後のサンプルからの（クラスター合成後に常に存在する）Ａｇイオンの除去は、以前はＮａＣｌを添加することによって行われていた。しかしながら、この方法では、銀の析出物と一緒にかなりの数のクラスターが除去されてしまうため、効率が悪い。チオール化樹脂を使用して銀イオンを選択的に分離すると、精製ステップの結果が大幅に改善された（図１参照）。この新しい手順は、Ａｇイオンとは対照的に、Ａｇ３－ＡＱＣが予想外にチオールに結合しないという観察に基づいている。したがって、チオールに対する親和性において、クラスターとイオンとの間で大きな差が観察されたことに基づいて、市販のチオール官能性のシリカ粒子を使用して銀イオンを除去した。この方法はまた、予想外に、３原子よりも大きいＡＱＣを除去することも見出された。したがって、この方法はまた、３つ以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを選択的に精製するためにも使用された。
合成後のサンプルからの（クラスター合成後に常に存在する）Ａｇイオンの除去は、以前はＮａＣｌを添加することによって行われていた。しかしながら、この方法では、銀の析出物と一緒にかなりの数のクラスターが除去されてしまうため、効率が悪い。チオール化樹脂を使用して銀イオンを選択的に分離すると、精製ステップの結果が大幅に改善された（図１参照）。この新しい手順は、Ａｇイオンとは対照的に、Ａｇ３－ＡＱＣが予想外にチオールに結合しないという観察に基づいている。したがって、チオールに対する親和性において、クラスターとイオンとの間で大きな差が観察されたことに基づいて、市販のチオール官能性のシリカ粒子を使用して銀イオンを除去した。この方法はまた、予想外に、３原子よりも大きいＡＱＣを除去することも見出された。したがって、この方法はまた、３つ以下のゼロ価の遷移金属原子からなるＡＱＣを選択的に精製するためにも使用された。
【0155】
手順は、約１Ｌの合成反応液に４００ｍｇのチオール化シリカ粒子を添加することからなっていた。混合物を一晩撹拌し、次いで、シリカ粒子を分離した。イオン選択性電極を使用して、Ａｇ＋イオンの除去を確認し、様々な技術を使用して、最終サンプル中のＡｇクラスターの特性評価を実施した（Huseyinova et al., J. Phys. Chem. 2000, 104: 2630およびBuceta et al., 2015に以前に報告されているように、ならびに、本明細書に記載されているように）。ロータリーエバポレーター（Ｂｕｃｈｉ Ｒｏｔａｖａｐｏｒ Ｒ－２１０、圧力２ｍｂａｒ）（Ｍａｓｓｏ Ａｎａｌｉｔｉｃａ Ｓ．Ａ．、バルセロナ、スペイン）を使用して、精製されたサンプルを３５℃で最終的に、炎原子吸収分光法によって決定される最終濃度約３０ｍｇ／Ｌまで濃縮した。
【0156】
実施例４：Ａｇ３－ＡＱＣ特性評価
クラスターサンプルは、ＵＶ－Ｖｉｓおよび蛍光分光法、ＡＦＭならびにＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価された。サンプルの分光学的特性は、Lin et al. ACS Nano 2009, 3: 395においてＡｇ３－ＡＱＣについて以前に報告されたものと非常によく一致している。図２は、Ａｇ３－ＡＱＣの水分散体のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを示している。Ａｇプラズモンバンド（約４００ｎｍ）の不存在は、量子サイズ閉じ込めに起因する自由電子の不存在を示し、これはクラスターにおいて観察されている（Philip et al. Nano Lett. 2012, 12: 4661を参照）。Buceta et al. 2015において以前に報告された裸のＡｇ３－ＡＱＣサンプルのＵＶ－Ｖｉｓと比較すると、この新規合成法で得られたＡｇ３－ＡＱＣ濃度の増加に起因して、２５０ｎｍ～３００ｎｍの吸収強度の増加が明確に見られる。量子サイズ閉じ込めにより、フェルミ準位でのエネルギー準位の分裂と、バンドギャップの出現とが起こり、このバンドギャップはクラスターサイズが小さくなるにつれて大きくなる。このバンドギャップは、その他のクラスターについて以前に行われたように（Huseyinova et al., J. Phys. Chem. 2016, 120: 15902、Attia et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136: 1182およびBuceta et al., 2015を参照）、蛍光発光を測定することによって決定することができる。図３は、Ａｇ３－ＡＱＣが、３０５ｎｍ付近で唯一の発光ピークを提示していることを示しており、これは、Huseyinova et al., 2000において以前に得られた結果と非常に一致している。このバンドは、ジュリウムモデルの近似を使用して、２個または３個の原子のみを含むクラスターに関連付けることができる。任意の励起波長に対して単一のピークのみが存在することは、サンプルの高い単分散性を示しており（そのような高濃度のクラスターであっても）、本研究で開発された合成および精製方法の高効率性を裏付けている。
クラスターサンプルは、ＵＶ－Ｖｉｓおよび蛍光分光法、ＡＦＭならびにＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析によって特性評価された。サンプルの分光学的特性は、Lin et al. ACS Nano 2009, 3: 395においてＡｇ３－ＡＱＣについて以前に報告されたものと非常によく一致している。図２は、Ａｇ３－ＡＱＣの水分散体のＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを示している。Ａｇプラズモンバンド（約４００ｎｍ）の不存在は、量子サイズ閉じ込めに起因する自由電子の不存在を示し、これはクラスターにおいて観察されている（Philip et al. Nano Lett. 2012, 12: 4661を参照）。Buceta et al. 2015において以前に報告された裸のＡｇ３－ＡＱＣサンプルのＵＶ－Ｖｉｓと比較すると、この新規合成法で得られたＡｇ３－ＡＱＣ濃度の増加に起因して、２５０ｎｍ～３００ｎｍの吸収強度の増加が明確に見られる。量子サイズ閉じ込めにより、フェルミ準位でのエネルギー準位の分裂と、バンドギャップの出現とが起こり、このバンドギャップはクラスターサイズが小さくなるにつれて大きくなる。このバンドギャップは、その他のクラスターについて以前に行われたように（Huseyinova et al., J. Phys. Chem. 2016, 120: 15902、Attia et al., J. Am. Chem. Soc. 2014, 136: 1182およびBuceta et al., 2015を参照）、蛍光発光を測定することによって決定することができる。図３は、Ａｇ３－ＡＱＣが、３０５ｎｍ付近で唯一の発光ピークを提示していることを示しており、これは、Huseyinova et al., 2000において以前に得られた結果と非常に一致している。このバンドは、ジュリウムモデルの近似を使用して、２個または３個の原子のみを含むクラスターに関連付けることができる。任意の励起波長に対して単一のピークのみが存在することは、サンプルの高い単分散性を示しており（そのような高濃度のクラスターであっても）、本研究で開発された合成および精製方法の高効率性を裏付けている。
【0157】
ＥＳＩ質量分析法は非常にソフトなイオン化を利用し、これにより、フラグメント化を避けることができ、小さな金属クラスターの特性評価に理想的であるため（Lu & Chen, Anal. Chem. 2015, 87: 10659およびGonzalez et al., Nanoscale 2012, 4: 7632を参照）、ＥＳＩ質量分析法を使用した。４つのピークがネガティブモードで得られ、それらの決定は、Ａｇの同位体分布によって促進される：m/z = 266.8 (Ag2-AQC)、m/z = 440.76, m/z = 498.65およびm/z = 556.61 (Ag3-AQC)。図４では、理論的なシミュレーションと同位体分布との一致を見ることができ、また、以前の公開文献（例えば、Buceta et al., 2015のsupporting informationの図２）とも一致を見ることができる。したがって、結果は、以前の特性評価方法と非常によい一致を示し、Ａｇ２－ＡＱＣおよびＡｇ３－ＡＱＣのみの存在を示している。
【0158】
追加の特性評価を非接触ＡＦＭによって行った。この目的のために、低濃度のサンプルをマイカ上に載置した（平均二乗粗さ約１５０ｐｍ）。図５は、２Ｄサイズクラスターに対応する約３００ｐｍの高い島を示し、したがって、理論モデルから予測されるように、約７～１０原子よりも小さい原子数のクラスターの存在を確認した（Lee et al., J. Phys. Chem. 2003, 107: 9994を参照）。これはまた、残りの特性評価技術の結果とも、Buceta et al., 2015に以前に報告されたＡｇ ＡＦＭ試験とも一致している。
【0159】
実施例５：ＤＮＡとのＡｇ２-ＡＱＣの非反応性
Ａｇ２－ＡＱＣはサンプル中に存在するが、それらの存在は報告された結果に影響を与えない。以前の公開文献では、ＤＮＡ－Ａｇ２複合体の形成のための実験的証拠も、ＤＮＡの歪みも、これらの種で検出することができなかった（Buceta et al., 2015, page 7725、右欄参照）。さらに、理論上の計算では、インターカレート相互作用を示すＡｇ３－ＡＱＣとは対照的に、Ａｇ２－ＡＱＣはＤＮＡにインターカレートしないことを明確に示している。さらに、Ａｇ２－ＡＱＣは、電子的に閉じたシェル構造（１Ｓ２）を有しているはずであり、これは非常に安定で非反応的な挙動を示している（Akola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2008,105: 9157参照）。この事実は、このようなクラスターに期待される大きなバンドギャップ（約４．３ｅＶ）と、対応するＨＯＭＯレベル（＋２．８Ｖ ｖｓ ＲＨＥ）およびＬＵＭＯレベル（－１．５Ｖ ｖｓ ＲＨＥ）の位置とともに（図６参照）、Ａｇ２－ＡＱＣはほとんど非反応性であることを示している。
Ａｇ２－ＡＱＣはサンプル中に存在するが、それらの存在は報告された結果に影響を与えない。以前の公開文献では、ＤＮＡ－Ａｇ２複合体の形成のための実験的証拠も、ＤＮＡの歪みも、これらの種で検出することができなかった（Buceta et al., 2015, page 7725、右欄参照）。さらに、理論上の計算では、インターカレート相互作用を示すＡｇ３－ＡＱＣとは対照的に、Ａｇ２－ＡＱＣはＤＮＡにインターカレートしないことを明確に示している。さらに、Ａｇ２－ＡＱＣは、電子的に閉じたシェル構造（１Ｓ２）を有しているはずであり、これは非常に安定で非反応的な挙動を示している（Akola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 2008,105: 9157参照）。この事実は、このようなクラスターに期待される大きなバンドギャップ（約４．３ｅＶ）と、対応するＨＯＭＯレベル（＋２．８Ｖ ｖｓ ＲＨＥ）およびＬＵＭＯレベル（－１．５Ｖ ｖｓ ＲＨＥ）の位置とともに（図６参照）、Ａｇ２－ＡＱＣはほとんど非反応性であることを示している。
【0160】
実施例６：Ｏ２およびＭｅＳＨとのＡｇ３－ＡＱＣの相互作用
密度汎関数理論（ＤＦＴ）の計算
実施例３で観察された、Ａｇ３-ＡＱＣがチオールに結合しないという予想外の結果を理解するために、Ａｇ３-ＡＱＣ上に吸着した酸素の存在を示すＤＦＴ計算を実施した。
密度汎関数理論（ＤＦＴ）の計算
実施例３で観察された、Ａｇ３-ＡＱＣがチオールに結合しないという予想外の結果を理解するために、Ａｇ３-ＡＱＣ上に吸着した酸素の存在を示すＤＦＴ計算を実施した。
【0161】
吸着された酸素分子の存在下での吸着エネルギーを計算するために、Ａｇ３－ＡＱＣ上に吸着され得る最大量の酸素を決定するために、一連のＤＦＴ計算を予備的に実行した。例えば、Ａｇ３－ＡＱＣ上の３個の酸素分子の吸着とみなした場合（図７）、見出された３個の最も低いエネルギーの異性体は、その他の可能なＡｇ－Ｏ結合様式と比較して、１，２ブリッジング（1,2 bridging）が最も安定した構造を生成することを示している。Ａｇ３－ＡＱＣの周囲への３個より多い酸素分子の存在は、常に、追加の酸素分子が、緩く吸着されているだけの、例えば、Ａｇ３－ＡＱＣ平面の上および下に緩く吸着されているだけの構造を生成する。これは、例えば、５個、７個および９個の酸素分子とＡｇ３－ＡＱＣとの相互作用について見出された最も低いエネルギーの異性体によって示されている（図８）。結果として、水溶液中および好気性条件下でのＡｇ３－ＡＱＣへのメチルチオール（ＭｅＳＨ）の吸着を模倣するための適切なモデルは、３個のＯ２分子が１，２ブリッジ位置（1,2-bridge position）において吸着され、２個のＯ２分子がＡｇ３－ＡＱＣ平面の下および上に緩く相互作用している図８の左の構造であった。このモデルを基に、Ａｇ原子の１個にＭｅＳＨを結合させて、酸素存在下での吸着を模倣した。最適化された構造では、Ａｇ３－ＡＱＣクラスター上のＭｅＳＨの吸着エネルギー（ＥＡｄ）は以下の式：
によって決定された。図１の挿入図に示すようなエネルギー最小構造を見出したが、吸着エネルギーが正であり、安定系ではないことを示している。構造については、３個の酸素分子のそれぞれが２個のＡｇ原子にブリッジされたままであり、ＭｅＳＨおよび残りの２個の酸素分子はクラスターと緩く相互作用している。この結果は、チオール誘導体がＡｇ３－ＡＱＣに結合しないという経験的観測を説明することができる。より大きなクラスター（Ａｇ（ｎ）－ＡＱＣ、ｎ＞３からｎ＝９）に対して同様の計算を行ったところ、Ａｇ３－ＡＱＣとは逆に、チオール誘導体の吸着が有利であることがわかった。
【数1】
【0162】
計算の詳細
水溶液中かつ酸素分子存在下でのＡｇ３－ＡＱＣとチオールとの結合を模倣するために、Ｂ３ＬＹＰ関数を使用してＤＦＴ計算を行った。小さなＡｕクラスターを含む系について最近報告されているように（Corma et al., Nat. Chem. 2013, 5: 775）、６－３１Ｇ（ｄ，ｐ）基底関数をＯ、Ｓ、ＣおよびＨ原子に使用し、Ｌａｎｌ２ｄｚ基底関数をＡｇ原子に使用した。「導体様分極連続体モデル（“conductor-like polarized continuum model）」（Barone & Cossi, J. Phys. Chem. 1998, 102: 1995）を使用して、考慮された系のジオメトリ（geometry）を黙示的な水溶媒の存在下で完全に最適化した。調和近似内で振動数の計算を実行して、最適化されたジオメトリがポテンシャルエネルギー面の最小値を表すことを確認した。
水溶液中かつ酸素分子存在下でのＡｇ３－ＡＱＣとチオールとの結合を模倣するために、Ｂ３ＬＹＰ関数を使用してＤＦＴ計算を行った。小さなＡｕクラスターを含む系について最近報告されているように（Corma et al., Nat. Chem. 2013, 5: 775）、６－３１Ｇ（ｄ，ｐ）基底関数をＯ、Ｓ、ＣおよびＨ原子に使用し、Ｌａｎｌ２ｄｚ基底関数をＡｇ原子に使用した。「導体様分極連続体モデル（“conductor-like polarized continuum model）」（Barone & Cossi, J. Phys. Chem. 1998, 102: 1995）を使用して、考慮された系のジオメトリ（geometry）を黙示的な水溶媒の存在下で完全に最適化した。調和近似内で振動数の計算を実行して、最適化されたジオメトリがポテンシャルエネルギー面の最小値を表すことを確認した。
【0163】
実施例７：組換えヒトトポイソメラーゼのＡｇ３－ＡＱＣ阻害
ＤＮＡの巻き戻しと、それに続く二重らせんの伸長とに対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は非常に強い（Buceta et al., 2015）。ＤＮＡの形態上の変容の結果として、Ａｇ３－ＡＱＣは、ＤＮＡ配列特異的結合タンパク質のＤＮＡへの結合と、ＤＮＡ形態依存性の結合タンパク質、例えば、細菌のトポイソメラーゼＩＶおよびＤＮＡジャイレースのＤＮＡへの結合を阻害する（Neissa et al. Chem. Sci. 2015, 6: 6717）。現在、ヒトトポイソメラーゼの阻害剤は、抗がん剤として使用されている（Pommier et al. Chem. Biol. 2010, 17: 421）。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣがヒト組換えトポイソメラーゼＩおよびＩＩにも影響を与えるか否かを試験した。図９に示すように、ヒトＴｏｐｏ Ｉリラクゼーションｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびヒトＴｏｐｏ ＩＩデカテネーションｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、これが当てはまることを実証した。
ＤＮＡの巻き戻しと、それに続く二重らせんの伸長とに対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は非常に強い（Buceta et al., 2015）。ＤＮＡの形態上の変容の結果として、Ａｇ３－ＡＱＣは、ＤＮＡ配列特異的結合タンパク質のＤＮＡへの結合と、ＤＮＡ形態依存性の結合タンパク質、例えば、細菌のトポイソメラーゼＩＶおよびＤＮＡジャイレースのＤＮＡへの結合を阻害する（Neissa et al. Chem. Sci. 2015, 6: 6717）。現在、ヒトトポイソメラーゼの阻害剤は、抗がん剤として使用されている（Pommier et al. Chem. Biol. 2010, 17: 421）。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣがヒト組換えトポイソメラーゼＩおよびＩＩにも影響を与えるか否かを試験した。図９に示すように、ヒトＴｏｐｏ Ｉリラクゼーションｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイおよびヒトＴｏｐｏ ＩＩデカテネーションｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、これが当てはまることを実証した。
【0164】
実施例８：単一ヌクレオソームの不安定化におけるＡｇ３－ＡＱＣの作用
予想外に、Ａｇ３－ＡＱＣは、Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞に投与した場合、細胞毒性を示さなかった（例えば、図１５ｃ－ｅを参照のこと）。真核生物のＤＮＡは、クロマチンに凝縮されており、ＤＮＡ結合因子によって克服されなければならない物理的障壁を提示する（Skene et al. Elife 2014, 3: e02042）。したがって、クロマチンが真核細胞におけるＡｇ３－ＡＱＣの効果に影響を与え得るか否かを検討した。
予想外に、Ａｇ３－ＡＱＣは、Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞に投与した場合、細胞毒性を示さなかった（例えば、図１５ｃ－ｅを参照のこと）。真核生物のＤＮＡは、クロマチンに凝縮されており、ＤＮＡ結合因子によって克服されなければならない物理的障壁を提示する（Skene et al. Elife 2014, 3: e02042）。したがって、クロマチンが真核細胞におけるＡｇ３－ＡＱＣの効果に影響を与え得るか否かを検討した。
【0165】
ヌクレオソームはクロマチンの基本単位である（Kornberg & Lorch, Cell 2016, 98: 285）。ヌクレオソームアセンブリ（nucleosome assembly）は、ＤＮＡ分子内のねじれに依存する。ＤＮＡのねじれを変更するドキソルビシン（ＤＯＸ）は、ヌクレオソームに影響を与える（Yang et al. Curr. Biol. 2013, 23: 782およびPang et al. Nat. Commun. 2013, 4: 1908）。そこで、ＤＯＸをモデルとして、Ａｇ３－ＡＱＣがヌクレオソームアセンブリに影響を与えるか否かを試験した。ＤＯＸと同様に、Ａｇ３－ＡＱＣは単一ヌクレオソームの調製物を解離させるのに十分であった（図１０）。
【0166】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの単一ヌクレオソーム調製物に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果の試験は、Pang et al. 2013に基づいていた。単一ヌクレオソームの調製物をＡｇ３－ＡＱＣに曝露し、電気泳動により分析した。
【0167】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの単一ヌクレオソームアセンブリ
エピマークヌクレオソームアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ、米国）を使用して、製造者からの低濃度アセンブリプロトコルに従って単一ヌクレオソームの調製物を得た。
エピマークヌクレオソームアセンブリキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ、米国）を使用して、製造者からの低濃度アセンブリプロトコルに従って単一ヌクレオソームの調製物を得た。
【0168】
ゲルシフトアッセイ
ゲルシフトアッセイ用に、ＴＢＥバッファーを使用して５％非変性ポリアクリルアミドゲルを調製した。１００Ｖで１時間のプレラン後、ヌクレオソームを含む反応液をＤＮＡローディングバッファーと混合し、１００Ｖで２時間電気泳動を行った。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを可視化して、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ ｓｙｓｔｅｍ （バイオラッド）でシグナルを捕捉した。ヒストンを検出するために、次いで、ＰｌｕｓＯｎｅ銀染色キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、バルセロナ、スペイン）を使用して、ゲルを銀で染色した。
ゲルシフトアッセイ用に、ＴＢＥバッファーを使用して５％非変性ポリアクリルアミドゲルを調製した。１００Ｖで１時間のプレラン後、ヌクレオソームを含む反応液をＤＮＡローディングバッファーと混合し、１００Ｖで２時間電気泳動を行った。ゲルを臭化エチジウムで染色し、ＤＮＡを可視化して、Ｇｅｌ Ｄｏｃ ＸＲ ｓｙｓｔｅｍ （バイオラッド）でシグナルを捕捉した。ヒストンを検出するために、次いで、ＰｌｕｓＯｎｅ銀染色キット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ、バルセロナ、スペイン）を使用して、ゲルを銀で染色した。
【0169】
データ分析
ヌクレオソームは、ネイティブゲル上の遊離ＤＮＡよりもゆっくり移動し、ＤＮＡの臭化エチジウム染色（図１０ａ、左、上のパネル）またはヒストンの銀染色（図１０ａ、左、下のパネル）のいずれかによって検出された。同一のサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに続く銀染色によって分析したところ、すべての場合に等量のヒストンがロードされていることが示された（図１０ａ、右パネル）。ヌクレオソームを解離させるドキソルビシン（ＤＯＸ）と、影響を及ぼさないエトポシドとを対照として使用した（Banerjee et al. FEBS Open Bio 2014, 4: 251）。Ａｇ３－ＡＱＣはヌクレオソームを解離させるのに十分であった（図１０ａ）。さらに、ヌクレオソームの安定性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は用量依存的である（図１０ｂ）。
ヌクレオソームは、ネイティブゲル上の遊離ＤＮＡよりもゆっくり移動し、ＤＮＡの臭化エチジウム染色（図１０ａ、左、上のパネル）またはヒストンの銀染色（図１０ａ、左、下のパネル）のいずれかによって検出された。同一のサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥに続く銀染色によって分析したところ、すべての場合に等量のヒストンがロードされていることが示された（図１０ａ、右パネル）。ヌクレオソームを解離させるドキソルビシン（ＤＯＸ）と、影響を及ぼさないエトポシドとを対照として使用した（Banerjee et al. FEBS Open Bio 2014, 4: 251）。Ａｇ３－ＡＱＣはヌクレオソームを解離させるのに十分であった（図１０ａ）。さらに、ヌクレオソームの安定性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は用量依存的である（図１０ｂ）。
【0170】
実施例９：コアヒストンオクタマ－とＡｇ３－ＡＱＣとの相互作用
実施例８に引き続き、ヒストンオクタマーとＡｇ３－ＡＱＣとの反応を蛍光測定および円偏光二色性測定により試験した（図１１、１２）。これらの試験から、Ａｇ３－ＡＱＣは、ヒストンオクタマーの二次構造を変化させ、その解離を引き起こすことによりヒストンオクタマーに作用することが示された。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてヌクレオソームアセンブリに作用すると結論づけられた。
実施例８に引き続き、ヒストンオクタマーとＡｇ３－ＡＱＣとの反応を蛍光測定および円偏光二色性測定により試験した（図１１、１２）。これらの試験から、Ａｇ３－ＡＱＣは、ヒストンオクタマーの二次構造を変化させ、その解離を引き起こすことによりヒストンオクタマーに作用することが示された。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣはｉｎ ｖｉｔｒｏモデルにおいてヌクレオソームアセンブリに作用すると結論づけられた。
【0171】
円偏光二色性（ＣＤ）滴定
１．０ｃｍのパス長のセルを使用して、ＭＯＳ－４５０ Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ ｄｉｃｈｒｏｇｒａｐｈ（Ｓｅｙｓｓｉｎｅｔ－Ｐａｒｉｓｅｔ、フランス）でＣＤスペクトルを測定した。コアヒストン溶液（２６．７μＭ）を含むセルへのＡｇ３－ＡＱＣの添加量を増加させることによって、ＣＤ滴定を２５℃で実施した。
１．０ｃｍのパス長のセルを使用して、ＭＯＳ－４５０ Ｂｉｏ－Ｌｏｇｉｃ ｄｉｃｈｒｏｇｒａｐｈ（Ｓｅｙｓｓｉｎｅｔ－Ｐａｒｉｓｅｔ、フランス）でＣＤスペクトルを測定した。コアヒストン溶液（２６．７μＭ）を含むセルへのＡｇ３－ＡＱＣの添加量を増加させることによって、ＣＤ滴定を２５℃で実施した。
【0172】
蛍光滴定
λｅｘｃ＝２７８ｎｍおよびλｅｍ＝５００ｎｍにおいて、ＦＬＳ９８０フォトルミネッセンス分光計（エジンバラ研究所、リビングストン、英国）で蛍光スペクトルを測定した。Ａｇ３－ＡＱＣをマイクロ量で増加させながら、１３．４μＭコアヒストン溶液を含むセルに直接添加した。
λｅｘｃ＝２７８ｎｍおよびλｅｍ＝５００ｎｍにおいて、ＦＬＳ９８０フォトルミネッセンス分光計（エジンバラ研究所、リビングストン、英国）で蛍光スペクトルを測定した。Ａｇ３－ＡＱＣをマイクロ量で増加させながら、１３．４μＭコアヒストン溶液を含むセルに直接添加した。
【0173】
速度論的試験および熱力学的試験
ｐＨ７．０におけるリン酸緩衝媒体中での蛍光測定および円偏光二色性（ＣＤ）測定によって、コアヒストンオクタマ－とＡｇ３－ＡＱＣとの間の反応を試験した。図１１ａは、１３．４μＭのヒストン（Ｈ）溶液にＡｇ３－ＡＱＣを添加することによって測定された蛍光スペクトル曲線を示す。すなわち、式１：
に従ってＡｇ３－ＡＱＣ／Ｈ複合体の形成に起因する消光効果が観察される。図１１ｂは、測定された等温滴定曲線の減少を示しており、濃度比ＣＡｇ３－ＡＱＣ／ＣＨ＝０．０９に対応する０．８μＭのＡｇ３－ＡＱＣ含有量で飽和に達する。ヒストンへのＡｇ３－ＡＱＣのこの高い親和性はまた、等温線のデータ対に式２：
をフィッティングすることによって得られる大きな平衡定数、Ｋ＝（２．４±０．４）×１０７Ｍ－１によっても反映されている。蛍光の結果は、測定されたＣＤスペクトルによって補強された。図１２ａは、Ａｇ３－ＡＱＣ添加の結果としてのコアヒストンのモル楕円度の減少を示す。クラスターは、ＣＤの効果を表さなかった。２２０ｎｍで観察された挙動の分析（図１２ｂ）によって、Ａｇ３－ＡＱＣ／Ｈ複合体の形成を説明する等温線が得られる。ΔＦをΔ［θ］に置き換え、ΔφをΔθに置き換えて、データ対を式２で分析した。得られた値、Ｋ＝（７．５±２．１）×１０６Ｍ－１は、蛍光測定から得られた値よりもやや低いだけである。ΔＦおよびΔ［θ］は、それぞれ、滴定中の蛍光およびモル円偏光二色性の変化を表す。ΔＦ＝Ｆ－φＨＣＨおよびφＨ＝Ｆ０／ＣＨであり、ここで、Ｆ０は純ヒストン溶液の蛍光を表す。Δφ＝φＡｇ３／Ｈ－φＨの最初の推定値は、滴定曲線の振幅から得られる。ΔφおよびＫの最終値は、反復手順によって得られた。同様の手順を、Δ［θ］＝［θ］－θＨＣＨ（ここで、［θ］＝３２９８．２（εＬ－εＲ）（ｄｅｇ×ｃｍ２×ｍｏｌ－１）であり、εＬおよびεＲは、それぞれ左円偏光および右円偏光の吸光度であり；θＨ＝［θ］０／ＣＨであり、［θ］０は純ヒストン溶液の［θ］の値であり；およびΔθ＝θＡｇ３／Ｈ－θＨである）にも適用した。
ｐＨ７．０におけるリン酸緩衝媒体中での蛍光測定および円偏光二色性（ＣＤ）測定によって、コアヒストンオクタマ－とＡｇ３－ＡＱＣとの間の反応を試験した。図１１ａは、１３．４μＭのヒストン（Ｈ）溶液にＡｇ３－ＡＱＣを添加することによって測定された蛍光スペクトル曲線を示す。すなわち、式１：
【数2】
【数3】
【0174】
この結果は、Ａｇ３－ＡＱＣが二重の挙動：一方ではＤＮＡにインターカレートし、他方ではヒストンと相互作用することを示すことを明らかにしている。この特徴は、低分子を扱う場合には非常にまれである。古典的に認識されているインターカレーターである臭化エチジウム（ＥＢ）およびヨウ化プロピジウム（ＩＰ）と、Ａｇ３－ＡＱＣとを比較することは興味深いものであった（Banerjee et al. 2014）。Ａｇ３－ＡＱＣとＥＢとの比較は、両方の種が近い親和定数、ＫＥＢ／ＤＮＡ＝（１．４±０．４）×１０５Ｍ－１およびＫＡｇ３－ＡＱＣ／ＤＮＡ＝（７．９±０．７）×１０４Ｍ－１（それぞれMeyer-Almes & Porschke, Biochemistry 1993, 32: 4246およびBuceta et al., 2015を参照）でＤＮＡにインターカレートすることを強調する。ここで、２つの定数は、ストップトフロー測定によって同様の条件で得られている。ＩＴＣおよび蛍光測定によってモニターされたヒストンとの相互作用について、これらは、ＥＢ／オクタマーおよびＩＰ／オクタマー複合体の２５℃での形成定数を計算し、ＫＥＢ／オクタマー＝１．９×１０５Ｍ－１およびＫＩＰ／オクタマー＝１．４×１０５Ｍ－１であり、低イオン強度および高イオン強度に対する値の間に無視できるほどの差しかなかった。これらの定数は、Ａｇ３－ＡＱＣ／オクタマー系の定数よりも２桁低い値であり、オクタマーとの相互作用は異なる性質を有している可能性があることを示している。
【0175】
Ａｇ３－ＡＱＣと同様に、オクタマーによって示される蛍光は、ＥＢおよびＩＰの添加時に消光された。しかしながら、オクタマーへのＥＢの添加によっては（ＩＰでは示されていない）、ＥＢがヒストンに関して１２倍過剰である条件、すなわち、ＣＥＢ／ＣＨ＝１２であっても、オクタマーのＣＤスペクトルは変化しない。このような挙動は、ＥＢは、ヒストンタンパク質オクタマーの二次構造の乱れを引き起こさないという事実に起因していた。図１２ａは、ごく少量のＡｇ３－ＡＱＣの添加（ＣＡｇ３－ＡＱＣ／ＣＨ≒０．０２で飽和に達した）によって引き起こされるヒストンのＣＤスペクトル曲線の強い変化を明らかにした。これは、オクタマー上のＡｇ３－ＡＱＣの効果が非常に大きいことを示している。ＥＢと比較すると、おそらくＡｇ３－ＡＱＣと形成されるフラグメントとの高い親和性のために、Ａｇ３－ＡＱＣはオクタマーの二次構造を変化させ、解離させることにより、ヒストンのコアに影響を与えていることを推論することができる。
【0176】
実施例１０：クロマチン構造におけるＡｇ３－ＡＱＣの効果のイメージング
実施例８および９で示された結果が真核細胞に対して同様の効果を有するか否かを調べるために、Ａ５４９増殖細胞の無傷の核に対する超解像ＳＴＯＲＭ（確率論的光学再構築顕微鏡）を、Ａ５４９でのクロマチン構造におけるＡｇ３－ＡＱＣの効果を直接可視化するために実施した。連続した画像セットに対してナノメートル精度で別個の蛍光体の位置をローカライズすることにより、ＳＴＯＲＭは、約２０ｎｍの有効分解能を提供することができる（Rust et al. Nat. Methods 2006, 3: 793）。この手法を使用して、いくつかの研究グループは、単一細胞レベルでのクロマチンの複雑性および組織化を可視化してきた（Zessin et al. J. Struct. Biol. 2012, 177: 344; Ricci et al. Cell 2015, 160: 1145; Lakadamyali & Cosma, FEBS Lett. 2015, 589: 3023;およびBoettiger et al. HHS Public Access 2016, 529: 418）。ＥｄＵ－ＡＦ６４７２で標識された新たに複製されたＤＮＡ（図１３ａ）を、Ａｇ３－ＡＱＣの存在下および非存在下、ならびにブランクとして遊離銀カチオン（ＡｇＮＯ３）の存在下で可視化した（図１３ｂ－ｄ）。ＳＴＯＲＭ画像は、Ａｇ３－ＡＱＣ添加時のクロマチン凝縮の顕著な変化を示している。コントロール細胞のクロマチンは高度に凝縮された領域（灰色の斑点）に含まれている（図１３ｂ）のに対し、Ａｇ３－ＡＱＣの添加は、これらの領域の大規模な脱凝縮につながる（図１３ｃ）。複数の細胞に対するＳＴＯＲＭ画像の定量は、クロマチンの脱凝縮と一致して、クロマチンが核領域のより大きな割合を占めていること（図１３ｅ）、クロマチン密度がＡｇ３－ＡＱＣ処理の結果として減少すること（図１３ｆ）を示している。銀カチオンを使用したブランクは、クロマチン凝縮に影響を与えなかったため、これらの差は、Ａｇ３－ＡＱＣ処理に特異的であった（図１３ｄ－ｆ）。
実施例８および９で示された結果が真核細胞に対して同様の効果を有するか否かを調べるために、Ａ５４９増殖細胞の無傷の核に対する超解像ＳＴＯＲＭ（確率論的光学再構築顕微鏡）を、Ａ５４９でのクロマチン構造におけるＡｇ３－ＡＱＣの効果を直接可視化するために実施した。連続した画像セットに対してナノメートル精度で別個の蛍光体の位置をローカライズすることにより、ＳＴＯＲＭは、約２０ｎｍの有効分解能を提供することができる（Rust et al. Nat. Methods 2006, 3: 793）。この手法を使用して、いくつかの研究グループは、単一細胞レベルでのクロマチンの複雑性および組織化を可視化してきた（Zessin et al. J. Struct. Biol. 2012, 177: 344; Ricci et al. Cell 2015, 160: 1145; Lakadamyali & Cosma, FEBS Lett. 2015, 589: 3023;およびBoettiger et al. HHS Public Access 2016, 529: 418）。ＥｄＵ－ＡＦ６４７２で標識された新たに複製されたＤＮＡ（図１３ａ）を、Ａｇ３－ＡＱＣの存在下および非存在下、ならびにブランクとして遊離銀カチオン（ＡｇＮＯ３）の存在下で可視化した（図１３ｂ－ｄ）。ＳＴＯＲＭ画像は、Ａｇ３－ＡＱＣ添加時のクロマチン凝縮の顕著な変化を示している。コントロール細胞のクロマチンは高度に凝縮された領域（灰色の斑点）に含まれている（図１３ｂ）のに対し、Ａｇ３－ＡＱＣの添加は、これらの領域の大規模な脱凝縮につながる（図１３ｃ）。複数の細胞に対するＳＴＯＲＭ画像の定量は、クロマチンの脱凝縮と一致して、クロマチンが核領域のより大きな割合を占めていること（図１３ｅ）、クロマチン密度がＡｇ３－ＡＱＣ処理の結果として減少すること（図１３ｆ）を示している。銀カチオンを使用したブランクは、クロマチン凝縮に影響を与えなかったため、これらの差は、Ａｇ３－ＡＱＣ処理に特異的であった（図１３ｄ－ｆ）。
【0177】
ＳＴＯＲＭイメージングサンプルの調製
１．５×１０４Ａ５４９細胞を８ウェルＬａｂ－ｔｅｋカバーガラスチャンバー（Ｎｕｎｃ）に播種し、２４時間後に０．８ｍＭヒドロキシウレア（Ｈ－８６２７、シグマ）を培養培地に添加してＳ期に同期させた。一晩培養した後、細胞を無血清培地で２回洗浄し、無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）またはＡｇＮＯ３（５μＭ）とともに３０分間インキュベートした。培地を除去し、ＥｄＵ（２０μＭ）を含む完全培地に交換し、２時間培養した。次いで、細胞を固定し、２０℃で１０分間メタノール－アセトン（１：１）溶液で透過処理し、室温で１時間ブロッキング（３％ＢＳＡ＋０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）した。最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、製造業者（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標） ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が提供する使用説明書に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で染色した。
１．５×１０４Ａ５４９細胞を８ウェルＬａｂ－ｔｅｋカバーガラスチャンバー（Ｎｕｎｃ）に播種し、２４時間後に０．８ｍＭヒドロキシウレア（Ｈ－８６２７、シグマ）を培養培地に添加してＳ期に同期させた。一晩培養した後、細胞を無血清培地で２回洗浄し、無血清培地中でＡｇ３－ＡＱＣ（５５．６１ｎｇ／ｍＬ）またはＡｇＮＯ３（５μＭ）とともに３０分間インキュベートした。培地を除去し、ＥｄＵ（２０μＭ）を含む完全培地に交換し、２時間培養した。次いで、細胞を固定し、２０℃で１０分間メタノール－アセトン（１：１）溶液で透過処理し、室温で１時間ブロッキング（３％ＢＳＡ＋０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）した。最後に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、製造業者（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標） ＥｄＵ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ４８８ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が提供する使用説明書に従って、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７で染色した。
【0178】
ＳＴＯＲＭイメージング
クロマチンは、Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製の市販の顕微鏡システム（ＮＳＴＯＲＭ）を使用してイメージングした。まず、最大出力密度で６４７ｎｍレーザー光を１５分間使用して、ＥｄＵに結合しているＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子の大部分を暗状態にした。次いで、連続的な６４７ｎｍのレーザー励起を使用して直接ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を励起し、５０，０００フレームの画像シーケンスを取得し、同時に４０５ｎｍのレーザー光（５％、３０μＷ）を使用して蛍光状態に染料を再活性化した（ｄＳＴＯＲＭ）。イメージングは、先に記載したイメージングバッファー（システアミンＭＥＡ［シグマアルドリッチ、＃３００７０－５０Ｇ］、Ｇｌｏｘ溶液：０．５ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、４０ｍｇ／ｍＬカタラーゼ［すべてシグマ］、１０％グルコースのＰＢＳ溶液）を使用して行った（Bates et al. Science 2007, 317: 1749を参照）。従来の顕微鏡およびＳＴＯＲＭ超解像の両方を使用して、蛍光ＥｄＵを含む核の代表的な画像を撮影した。従来の顕微鏡画像において（図１３ａ）、正方形は、ＳＴＯＲＭイメージングのズームイン画像のサイズと典型的な位置とを表す。再構築されたＳＴＯＲＭ画像において、マゼンタのスポットは、単一のｘ－ｙ局在を表し、暗領域は、クロマチンのない領域に対応している。すべての画像は、図１３ａの黄色の四角で示されるように、典型的には核の約１／３を表すサイズである５０μｍ２であり、クロマチンアクセス性における差の信頼性の高い視覚的な測定を可能にする同数の局在が含まれている。
クロマチンは、Ｎｉｋｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製の市販の顕微鏡システム（ＮＳＴＯＲＭ）を使用してイメージングした。まず、最大出力密度で６４７ｎｍレーザー光を１５分間使用して、ＥｄＵに結合しているＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７分子の大部分を暗状態にした。次いで、連続的な６４７ｎｍのレーザー励起を使用して直接ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７を励起し、５０，０００フレームの画像シーケンスを取得し、同時に４０５ｎｍのレーザー光（５％、３０μＷ）を使用して蛍光状態に染料を再活性化した（ｄＳＴＯＲＭ）。イメージングは、先に記載したイメージングバッファー（システアミンＭＥＡ［シグマアルドリッチ、＃３００７０－５０Ｇ］、Ｇｌｏｘ溶液：０．５ｍｇ／ｍＬグルコースオキシダーゼ、４０ｍｇ／ｍＬカタラーゼ［すべてシグマ］、１０％グルコースのＰＢＳ溶液）を使用して行った（Bates et al. Science 2007, 317: 1749を参照）。従来の顕微鏡およびＳＴＯＲＭ超解像の両方を使用して、蛍光ＥｄＵを含む核の代表的な画像を撮影した。従来の顕微鏡画像において（図１３ａ）、正方形は、ＳＴＯＲＭイメージングのズームイン画像のサイズと典型的な位置とを表す。再構築されたＳＴＯＲＭ画像において、マゼンタのスポットは、単一のｘ－ｙ局在を表し、暗領域は、クロマチンのない領域に対応している。すべての画像は、図１３ａの黄色の四角で示されるように、典型的には核の約１／３を表すサイズである５０μｍ２であり、クロマチンアクセス性における差の信頼性の高い視覚的な測定を可能にする同数の局在が含まれている。
【0179】
データ解析
ＳＴＯＲＭ画像は、Bates et al. 2007に以前に記載されているように分析し、レンダリングされた。簡単に記載すると、単一分子画像内のスポットを、閾値に基づいて特定し、Ｇａｕｓｓｉａｎにフィッティングさせてｘおよびｙの位置を特定した。すべての５０，０００フレームにわたってこのアプローチを適用すると、すべての蛍光色素分子のローカライズされた位置に対応するｘ－ｙ座標のリストからなる生のＳＴＯＲＭデータを得ることができる。ｘ－ｙ座標から再構築された画像を、ドリフト補正後、Ｉｎｓｉｇｈｔ３を使用して表示した。
ＳＴＯＲＭ画像は、Bates et al. 2007に以前に記載されているように分析し、レンダリングされた。簡単に記載すると、単一分子画像内のスポットを、閾値に基づいて特定し、Ｇａｕｓｓｉａｎにフィッティングさせてｘおよびｙの位置を特定した。すべての５０，０００フレームにわたってこのアプローチを適用すると、すべての蛍光色素分子のローカライズされた位置に対応するｘ－ｙ座標のリストからなる生のＳＴＯＲＭデータを得ることができる。ｘ－ｙ座標から再構築された画像を、ドリフト補正後、Ｉｎｓｉｇｈｔ３を使用して表示した。
【0180】
ＥｄＵのラベリング密度が非常に高かったため、最終的な再構築画像で使用するフレーム数を変化させることによって、すべての画像を核のμｍ２当たり同数の局在に大まかに正規化した。次いで、再構築画像の非ゼロピクセルの割合をＩｍａｇｅＪで計算し、ＥｄＵによってカバーされた核領域の割合も計算した。クロマチンでカバーされた領域で局在の数（記録された各核について同じ）を除算することによって、μｍ２当たりのクロマチン密度を抽出した。
【0181】
実施例１１：クロマチンアクセシビリティアッセイを使用したＡｇ３－ＡＱＣの効果の検討
ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの領域にわたるリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ（Rao et al. J. Immunol. 2001, 167: 4494）と組み合わせたヌクレアーゼ過感受性アプローチ（nuclease-hypersensitive approach）（Gross & Garrard, Annu. Rev. Biochem. 1988, 57: 159）を使用して、Ａｇ３－ＡＱＣが細胞においてだけでなく多細胞生物においても効果を有するか否かをさらに検討した。ヌクレオソームの存在は、外因性ヌクレアーゼに対するＤＮＡのアクセス性に基づいて特定することができる（Kornberg & Lorch 2016）。ヌクレオソームによって保護されたＤＮＡは、外因性ヌクレアーゼにアクセスすることができず、その後のｑＰＣＲ増幅に利用可能となり、消化されたサンプルと消化されていないサンプルとの間の閾値サイクル（Ｃｔ）のシフトは有意性がない。Ｃｔは、ｑＰＣＲ反応における標的の濃度の相対的な尺度である。対照的に、ヌクレオソーム外のＤＮＡはヌクレアーゼにアクセス可能で、消化の影響を受けやすく、このＤＮＡはｑＰＣＲには利用できなくなり、消化されたサンプルと消化されていないサンプルとの間でＣｔが大きくシフトする。採用した実験的アプローチの模式図は、図１４ａに概説されている。Ａ５４９増殖細胞において、外部のヌクレアーゼに対するクロマチンアクセス性が上昇していることが示された。これは、処理細胞と未処理細胞との間のＣｔシフトによって示されている（図１４ｂ）。Ａｇ３－ＡＱＣ処理した細胞および対照細胞からのヌクレアーゼ消化対非消化ＤＮＡサンプルの間のＣｔの差（ΔＣｔ）も評価した。サンプルが消化されていない場合、Ａｇ３－ＡＱＣ処理細胞および対照細胞は同様のＣｔ値を有し；消化後のＡｇ３－ＡＱＣ処理細胞は有意に高いＣｔ値を有し、ΔＣｔを増加させ（図１４ｂ）、Ａｇ３－ＡＱＣがクロマチンの脱凝縮を誘導し、ヌクレアーゼ消化を促進するという見解を支持した。さらに、ヌクレアーゼ過感受性アプローチおよびＳＴＯＲＭ画像からは、ヌクレアーゼ過感受性アプローチがクロマチン構造を研究するための有効な方法であることを裏付ける結果が得られた。
ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの領域にわたるリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）アッセイ（Rao et al. J. Immunol. 2001, 167: 4494）と組み合わせたヌクレアーゼ過感受性アプローチ（nuclease-hypersensitive approach）（Gross & Garrard, Annu. Rev. Biochem. 1988, 57: 159）を使用して、Ａｇ３－ＡＱＣが細胞においてだけでなく多細胞生物においても効果を有するか否かをさらに検討した。ヌクレオソームの存在は、外因性ヌクレアーゼに対するＤＮＡのアクセス性に基づいて特定することができる（Kornberg & Lorch 2016）。ヌクレオソームによって保護されたＤＮＡは、外因性ヌクレアーゼにアクセスすることができず、その後のｑＰＣＲ増幅に利用可能となり、消化されたサンプルと消化されていないサンプルとの間の閾値サイクル（Ｃｔ）のシフトは有意性がない。Ｃｔは、ｑＰＣＲ反応における標的の濃度の相対的な尺度である。対照的に、ヌクレオソーム外のＤＮＡはヌクレアーゼにアクセス可能で、消化の影響を受けやすく、このＤＮＡはｑＰＣＲには利用できなくなり、消化されたサンプルと消化されていないサンプルとの間でＣｔが大きくシフトする。採用した実験的アプローチの模式図は、図１４ａに概説されている。Ａ５４９増殖細胞において、外部のヌクレアーゼに対するクロマチンアクセス性が上昇していることが示された。これは、処理細胞と未処理細胞との間のＣｔシフトによって示されている（図１４ｂ）。Ａｇ３－ＡＱＣ処理した細胞および対照細胞からのヌクレアーゼ消化対非消化ＤＮＡサンプルの間のＣｔの差（ΔＣｔ）も評価した。サンプルが消化されていない場合、Ａｇ３－ＡＱＣ処理細胞および対照細胞は同様のＣｔ値を有し；消化後のＡｇ３－ＡＱＣ処理細胞は有意に高いＣｔ値を有し、ΔＣｔを増加させ（図１４ｂ）、Ａｇ３－ＡＱＣがクロマチンの脱凝縮を誘導し、ヌクレアーゼ消化を促進するという見解を支持した。さらに、ヌクレアーゼ過感受性アプローチおよびＳＴＯＲＭ画像からは、ヌクレアーゼ過感受性アプローチがクロマチン構造を研究するための有効な方法であることを裏付ける結果が得られた。
【0182】
ＤＮＡ複製時にはゲノム全体のクロマチン構造が変化するため（Groth et al. Cell 2007, 128: 721）、Ａｇ３－ＡＱＣの効果が複製に影響されるか否かを試験した。そのために、７２時間血清を欠乏させて、細胞周期のＳ期の前で停止させた細胞で実験を繰り返した。特筆すべきことに、Ａｇ３－ＡＱＣ処理細胞と非処理細胞との間に見られた差はなくなり（図１４ｃ）、クロマチンアクセス性についてのＡｇ３－ＡＱＣ媒介性の上昇が増殖細胞に限定されていることを示している（より詳細な議論については、実施例１３を参照）。
【0183】
マウスにおけるＡｇ３－ＡＱＣの作用を調べるために、活発に増殖している細胞がＡｇ３－ＡＱＣ処理後にクロマチンアクセス性の上昇を示した場合、Ａｇ３－ＡＱＣは、細胞がほとんど静止している正常組織よりも腫瘍においてより活性であると推論された。その可能性を試験するために、マウスに同所性肺腫瘍を誘導し、Ａｇ３－ＡＱＣ投与の２４時間後に肺腫瘍および腎臓サンプルのクロマチンアクセス性を測定した。特筆すべきことに、クロマチンアクセス性は、腫瘍サンプルでは処置後に有意に増加したが（図１４ｄ）、腎臓では増加しなかった（図１４ｅ）。
【0184】
実施例１２：Ａｇ３－ＡＱＣとシスプラチンとの組み合わせ
クロマチンアクセス性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果を確認するために、異なる実験的アプローチを使用した。シスプラチン（ＣＤＤＰ）とのＡｇ３－ＡＱＣの併用投与の効果を試験した。細胞内ＣＤＤＰの約１％しか核内ＤＮＡに結合せず（Gonzalez et al. Mol. Pharmacol. 2001, 59: 657）、アクセス性が低いことが示されている。したがって、クロマチンアクセス性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は、ＣＤＤＰのＤＮＡへの結合を増強するために使用され得ると推論された。Ａｇ３－ＡＱＣの併用投与は、Ａ５４９細胞のＤＮＡに結合するＣＤＤＰの量を約３倍に増加させることが見出された（図１５ａ）。さらに、この効果は、増殖細胞には存在したが、血清欠乏させた非増殖細胞には存在しなかった（図１５ａ）。したがって、それ自体がＡｇ３－ＡＱＣによって媒介されるクロマチンアクセス性の上昇によって媒介されていることを示している。興味深いことに、ヒストン除去を誘導するＤＯＸは、ＤＮＡへのＣＤＤＰ結合を増加させなかった（図１５ａ）。
クロマチンアクセス性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果を確認するために、異なる実験的アプローチを使用した。シスプラチン（ＣＤＤＰ）とのＡｇ３－ＡＱＣの併用投与の効果を試験した。細胞内ＣＤＤＰの約１％しか核内ＤＮＡに結合せず（Gonzalez et al. Mol. Pharmacol. 2001, 59: 657）、アクセス性が低いことが示されている。したがって、クロマチンアクセス性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は、ＣＤＤＰのＤＮＡへの結合を増強するために使用され得ると推論された。Ａｇ３－ＡＱＣの併用投与は、Ａ５４９細胞のＤＮＡに結合するＣＤＤＰの量を約３倍に増加させることが見出された（図１５ａ）。さらに、この効果は、増殖細胞には存在したが、血清欠乏させた非増殖細胞には存在しなかった（図１５ａ）。したがって、それ自体がＡｇ３－ＡＱＣによって媒介されるクロマチンアクセス性の上昇によって媒介されていることを示している。興味深いことに、ヒストン除去を誘導するＤＯＸは、ＤＮＡへのＣＤＤＰ結合を増加させなかった（図１５ａ）。
【0185】
ＤＮＡへのＣＤＤＰ結合を増加させるＡｇ３－ＡＱＣの効果を、その他のヒト細胞株、例えば、膠芽腫（Ｕ８７）および乳腺癌（ＭＣＦ７）で確認した（図１６）。
【0186】
また、肺腫瘍を有する動物においても、Ａｇ３－ＡＱＣの効果を調べた。肺（腫瘍を含む）およびその他のマウス臓器（望ましくないＣＤＤＰの副作用の標的となる可能性があることによって選択された）におけるＤＮＡに結合しているＣＤＤＰの量に関するＣＤＤＰの単独投与またはＡｇ３－ＡＱＣとの併用投与の効果を比較した。Ａｇ３－ＡＱＣと組み合わせたＣＤＤＰの腫瘍保有マウスへの単回投与は、同用量のＣＤＤＰ単独投与と比較して、その他の臓器でのＤＮＡに結合しているＣＤＤＰの量に影響を与えることなく、肺でのみＤＮＡに結合しているＣＤＤＰの量を５．５倍増加させた（図１５ｂ）。
【0187】
ＣＤＤＰは、絡み合ったシグナル伝達経路を介して抗がん作用を発揮するが（Galluzzi et al. Cell Death Dis. 2014, 5: e1257およびGalluzzi et al. Oncogene 2012, 31: 1869）、それでも、ＤＮＡ結合は、腫瘍細胞の死滅の理由となる主なメカニズムであると考えられている（Hall et al. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2008, 48: 495）。Ａｇ３－ＡＱＣおよびＣＤＤＰの併用投与が細胞死に影響を及ぼすか否かを確認するために、細胞生存率を評価したところ、ＣＤＤＰを単独投与またはＡｇ３－ＡＱＣと併用投与した場合には、増殖細胞では、受ける影響が異なり（図１５ｃ）、血清欠乏させた非増殖細胞では受ける影響が異ならないことが見出された（図１５ｄ）。この結果は、Ａｇ３－ＡＱＣの作用は、ＣＤＤＰへのクロマチンアクセス性の上昇によって媒介されることを示している。さらに、Ａｇ３－ＡＱＣの作用は、細胞周期特異的であり、ＣＤＤＰ濃度に依存する（実施例１３および図１７も参照）。
【0188】
遺伝子発現およびＤＮＡ損傷に対するＡｇ３-ＡＱＣの効果の欠如（実施例１５および１６参照）は、細胞内でのＡｇ３-ＡＱＣの効果が短い結果である可能性がある。残念ながら、生体サンプル中でＡｇ３－ＡＱＣを定量することを可能にする利用可能な技術は存在しないため、薬物動態学的研究は不可能であるが、Ａｇ３－ＡＱＣの効果の持続時間は、Ａｇ３－ＡＱＣの効果のサロゲートマーカーとしてＣＤＤＰへのクロマチンアクセス性の増加を使用して間接的に推定することができる。Ａｇ３－ＡＱＣは、ＣＤＤＰとＡｇ３－ＡＱＣを同時に投与した場合、ＣＤＤＰのＤＮＡへの取り込みを増加させたが、Ａｇ３－ＡＱＣ投与の２４時間後にＣＤＤＰの投与を遅らせた場合には増加させなかった。これらより、Ａｇ３－ＡＱＣの効果が一過性であることが示された（図１８）。同様の結果は、ＤＮＡに結合しているＣＤＤＰの代わりに、細胞生存率をエンドポイントとして使用した場合にも得られた（図１５ｅ）。したがって、細胞内でのＡｇ３－ＡＱＣの作用は一過性であると結論づけることができる。
【0189】
実施例１３：Ａｇ３－ＡＱＣの作用は細胞周期に特異的であり、ＣＤＤＰ濃度に依存する。
２つの補完的な理由により、Ａｇ３－ＡＱＣがＣＤＤＰと一緒に投与されたときに、一部の細胞のみの死亡率を増加させることを説明することができる（図１５ｃ）。一つは、細胞内に存在するＣＤＤＰの量に依存する。細胞の死亡率は、細胞内ＣＤＤＰレベルに依存し、したがって、細胞は、３つのグループ：１）Ａｇ３－ＡＱＣの存在とは無関係に死亡するのに十分なＣＤＤＰを有する細胞；２）Ａｇ３－ＡＱＣの存在下でのみ死亡するＣＤＤＰの中間レベルを有する細胞；および３）いずれの場合であっても生存するＣＤＤＰのごく低いレベルを有する細胞に区分されることが見出すことができる。もう一つの理由は、Ａｇ３－ＡＱＣが細胞周期の期、この場合はＳ期でのみ作用することに依存している。適切な期にあるそれらの細胞だけがＡｇ３－ＡＱＣでの処置から利益を得ることができる。両方の説明を確認するために、複数の濃度のＣＤＤＰを単独でまたはＡｇ３－ＡＱＣとともに、増殖および非増殖Ａ５４９細胞に与えた。示されているように、非増殖細胞はＡｇ３－ＡＱＣの恩恵を受けず、Ａｇ３－ＡＱＣの効果はＣＤＤＰのより高い用量でより強くなり（図１７ａ～ｃ参照）、したがって、Ａｇ３－ＡＱＣの作用が細胞周期特異的であり、ＣＤＤＰ濃度に依存していることを支持する。
２つの補完的な理由により、Ａｇ３－ＡＱＣがＣＤＤＰと一緒に投与されたときに、一部の細胞のみの死亡率を増加させることを説明することができる（図１５ｃ）。一つは、細胞内に存在するＣＤＤＰの量に依存する。細胞の死亡率は、細胞内ＣＤＤＰレベルに依存し、したがって、細胞は、３つのグループ：１）Ａｇ３－ＡＱＣの存在とは無関係に死亡するのに十分なＣＤＤＰを有する細胞；２）Ａｇ３－ＡＱＣの存在下でのみ死亡するＣＤＤＰの中間レベルを有する細胞；および３）いずれの場合であっても生存するＣＤＤＰのごく低いレベルを有する細胞に区分されることが見出すことができる。もう一つの理由は、Ａｇ３－ＡＱＣが細胞周期の期、この場合はＳ期でのみ作用することに依存している。適切な期にあるそれらの細胞だけがＡｇ３－ＡＱＣでの処置から利益を得ることができる。両方の説明を確認するために、複数の濃度のＣＤＤＰを単独でまたはＡｇ３－ＡＱＣとともに、増殖および非増殖Ａ５４９細胞に与えた。示されているように、非増殖細胞はＡｇ３－ＡＱＣの恩恵を受けず、Ａｇ３－ＡＱＣの効果はＣＤＤＰのより高い用量でより強くなり（図１７ａ～ｃ参照）、したがって、Ａｇ３－ＡＱＣの作用が細胞周期特異的であり、ＣＤＤＰ濃度に依存していることを支持する。
【0190】
結果は、クロマチンへのアクセスに対するＡｇ３－ＡＱＣの効果が細胞周期に依存することを明確に示している。実際には、それはＳ期に限定されている。この効果は、ヌクレオソームに対するＡｇ３－ＡＱＣの直接的な作用によって単純に説明される。ＤＮＡ複製の間、ゲノムにわたるすべてのヌクレオソームは、複製フォークが通過するときに破壊され、再構成されなければならない（Rhind & Gilbert, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013, a010132）。したがって、Lucchini et al. EMBO J. 2001, 20: 7294に記載されているように、「機会の窓」は、複製フォークの通過後に開始し、最初に配置されるヌクレオソームの配置まで持続する。その間、ＤＮＡはヌクレオソームから解放されている。Ａｇ３－ＡＱＣはＤＮＡがヌクレオソームから解放されている時間的な窓を広げ、それによって、ＤＮＡ結合剤の結合を促進すると推測されていた。この仮説は、ヌクレオソームアセンブリがＤＮＡ分子のねじれに依存するという事実に基づいている（Gupta et al. Biophys. J. 2009, 97: 3150およびYang et al. Biochim. Biophys. Acta. 2014, 1845: 84）。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣのインターカレーションによって引き起こされるＤＮＡの拡張およびその後の歪み、ならびにコアヒストンとの相互作用は、ヌクレオソームアセンブリに影響を与え、それらの配置を遅らせる。クロマチンアセンブリファクターＩ複合体（複製ＤＮＡ上にヒストンテトラマーを会合させる核複合体）を破壊する場合、プロモーター周辺のヌクレオソームの位置は変化しないが、新たに複製されたクロマチン内のヌクレオソームの位置は劇的に影響を受ける（Ramachandran & Henikoff, Cell 2016, 165, 580）。以上のことから、今回のデータは、複製開始点付近のヌクレオソームがＡｇ３－ＡＱＣの標的であり、Ａｇ３－ＡＱＣの作用は細胞周期のＳ期に限定されていることを示している。
【0191】
実施例１４：その他のＤＮＡ作用薬に対するＡＱＣの効果
クロマチンアクセス性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は、その他のＤＮＡ作用薬にも有効であると推論された。この目的のために、ＣＤＤＰに関連する薬剤、例えば、オキサリプラチン（ＯＸＡ）およびカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）を試験したところ、Ａｇ３－ＡＱＣはまた、それらの細胞毒性をも増加させることが見出された（図１７ｄ、１９ａ、ｂ）。ＤＮＡと相互作用し得るその他の抗がん剤、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびドキソルビシン（ＤＯＸ）も影響を受けた（図１９ｄ、ｅ）。さらに、ＤＯＸの蛍光を使用して、Ａｇ３－ＡＱＣが核内のＤＯＸ蓄積を増強したことを確認し、Ａｇ３－ＡＱＣの併用投与がＤＮＡへの薬剤のアクセス性を増強するという観察を支持した（図１９ｆ）。
クロマチンアクセス性に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果は、その他のＤＮＡ作用薬にも有効であると推論された。この目的のために、ＣＤＤＰに関連する薬剤、例えば、オキサリプラチン（ＯＸＡ）およびカルボプラチン（ＣＢＤＣＡ）を試験したところ、Ａｇ３－ＡＱＣはまた、それらの細胞毒性をも増加させることが見出された（図１７ｄ、１９ａ、ｂ）。ＤＮＡと相互作用し得るその他の抗がん剤、例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびドキソルビシン（ＤＯＸ）も影響を受けた（図１９ｄ、ｅ）。さらに、ＤＯＸの蛍光を使用して、Ａｇ３－ＡＱＣが核内のＤＯＸ蓄積を増強したことを確認し、Ａｇ３－ＡＱＣの併用投与がＤＮＡへの薬剤のアクセス性を増強するという観察を支持した（図１９ｆ）。
【0192】
興味深いことに、伸長しているＤＮＡ鎖に組み込まれるヌクレオシドアナログであるゲムシタビン（ＧＥＭ）は、Ａｇ３－ＡＱＣと併用投与された場合、細胞死に大きな効果を示し（図１９ｃ）、Ａｇ３－ＡＱＣは、新しく合成されたＤＮＡへのＧＥＭの組み込みを促進するために複製が進行している箇所（replication foci）の近傍に作用していることを支持している。
【0193】
実施例１５：遺伝子発現の解析
ヌクレオソームアセンブリおよびヌクレオソームのダイナミクスの乱れは、ゲノム機能の障害、例えば、異常な遺伝子発現につながっている（Gross & Garrard, 1988）。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣが遺伝子発現に影響を与えるか否かを知ることが急務であった。この目的のために、高密度マイクロアレイ解析を行い、Ａｇ３－ＡＱＣ処理後０時間、４時間、２４時間後の遺伝子発現レベルを測定した（材料の節を参照）。個々の遺伝子発現には、処置群および未処置群、または異なる時間の同一群間で有意差は認められなかった（ＦＤＲ（偽発見率）のｐ値が０．０５未満の場合に有意とした）。まとめると、これらの結果は、Ａｇ３－ＡＱＣが遺伝子発現に有意な影響を与えないことを示している。
ヌクレオソームアセンブリおよびヌクレオソームのダイナミクスの乱れは、ゲノム機能の障害、例えば、異常な遺伝子発現につながっている（Gross & Garrard, 1988）。したがって、Ａｇ３－ＡＱＣが遺伝子発現に影響を与えるか否かを知ることが急務であった。この目的のために、高密度マイクロアレイ解析を行い、Ａｇ３－ＡＱＣ処理後０時間、４時間、２４時間後の遺伝子発現レベルを測定した（材料の節を参照）。個々の遺伝子発現には、処置群および未処置群、または異なる時間の同一群間で有意差は認められなかった（ＦＤＲ（偽発見率）のｐ値が０．０５未満の場合に有意とした）。まとめると、これらの結果は、Ａｇ３－ＡＱＣが遺伝子発現に有意な影響を与えないことを示している。
【0194】
実施例１６：ＤＮＡ損傷の解析
それでも、Ａｇ３－ＡＱＣがＤＮＡ損傷を引き起こし得るか否かという疑問が生じる。これを調査するために、細胞内のＡｇ３－ＡＱＣがＤＮＡ鎖切断を誘発するか否かを試験した。この目的のために、フローサイトメトリーを使用して、ＤＮＡ損傷のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）発現に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果を評価した（Sharma et al., in DNA Repair Protocols, (Ed: L. Bjergbaek), Springer Science, New York, 2012, Ch. 40）。Ａｇ３－ＡＱＣは、対照レベルよりもｐＨ２ＡＸを増加させなかった（図２０ａ）。しかし、ＤＯＸについて記載されているように（Pang et al. 2013）、Ａｇ３－ＡＱＣがｐＨ２ＡＸの除去を誘導し、したがって、ＤＮＡ損傷作用をマスキングすることができることが指摘された。その結果がこの事例でないことを確認するために、Ａｇ３－ＡＱＣをよく特徴付けられているＤＮＡ損傷剤（Pommier et al. 2010）であるエトポシドと併用投与した。得られたｐＨ２ＡＸの発現は、Ａｇ３－ＡＱＣがｐＨ２ＡＸ発現を減少させることは見出されないと評価された（図２０ａ）。したがって、ｐＨ２ＡＸ発現に対してＡｇ３－ＡＱＣが効果を示さないことは、ｐＨ２ＡＸのより大きな除去ではなく、むしろＤＮＡ損傷がないことによるものである。ＤＮＡ損傷を試験する別の方法であるＤＮＡコメットアッセイを使用して（Collins, Mol. Biotechnol. 2004, 26: 249）、Ａｇ３－ＡＱＣがＤＮＡ損傷に影響を及ぼさないことが見出された（図２０ｂ）。
それでも、Ａｇ３－ＡＱＣがＤＮＡ損傷を引き起こし得るか否かという疑問が生じる。これを調査するために、細胞内のＡｇ３－ＡＱＣがＤＮＡ鎖切断を誘発するか否かを試験した。この目的のために、フローサイトメトリーを使用して、ＤＮＡ損傷のマーカーであるリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）発現に対するＡｇ３－ＡＱＣの効果を評価した（Sharma et al., in DNA Repair Protocols, (Ed: L. Bjergbaek), Springer Science, New York, 2012, Ch. 40）。Ａｇ３－ＡＱＣは、対照レベルよりもｐＨ２ＡＸを増加させなかった（図２０ａ）。しかし、ＤＯＸについて記載されているように（Pang et al. 2013）、Ａｇ３－ＡＱＣがｐＨ２ＡＸの除去を誘導し、したがって、ＤＮＡ損傷作用をマスキングすることができることが指摘された。その結果がこの事例でないことを確認するために、Ａｇ３－ＡＱＣをよく特徴付けられているＤＮＡ損傷剤（Pommier et al. 2010）であるエトポシドと併用投与した。得られたｐＨ２ＡＸの発現は、Ａｇ３－ＡＱＣがｐＨ２ＡＸ発現を減少させることは見出されないと評価された（図２０ａ）。したがって、ｐＨ２ＡＸ発現に対してＡｇ３－ＡＱＣが効果を示さないことは、ｐＨ２ＡＸのより大きな除去ではなく、むしろＤＮＡ損傷がないことによるものである。ＤＮＡ損傷を試験する別の方法であるＤＮＡコメットアッセイを使用して（Collins, Mol. Biotechnol. 2004, 26: 249）、Ａｇ３－ＡＱＣがＤＮＡ損傷に影響を及ぼさないことが見出された（図２０ｂ）。
【0195】
実施例１７：ｉｎ ｖｉｖｏでの抗がん作用
インビボでの抗がん作用については、Ａ５４９の同所性肺がんモデルにおけるＡｇ３－ＡＱＣの有効性を評価した。腫瘍細胞の注入時から注入後３７日目までの腫瘍細胞の生物発光を測定することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長を観察した。対照動物は、実験終了まで緩やかな腫瘍成長を示した。尾静脈内に注射したＣＤＤＰ（４ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍の成長を有意に減少させ；Ａｇ３－ＡＱＣ（０．０１ｍｇ／ｋｇ）との併用投与は、この効果を増強した（図２１ａ）。Ａｇ３－ＡＱＣが動物の体重に影響を与えず、したがって、重度の毒性を除外し、クラスターが併用投与されたときにＣＤＤＰの毒性を増加させなかったことを示したことは注目に値する（図２１ｂ）。３７日目に、動物を屠殺し、肺および縦隔結節からタンパク質を抽出し、腫瘍細胞にのみ存在するルシフェラーゼ活性を測定した。ＣＤＤＰは対照群と比較して、肺および縦隔結節のルシフェラーゼレベルを有意に低下させた。再び、Ａｇ３－ＡＱＣとＣＤＤＰとの併用投与は、最も強い効果を有していた（図２１ｃ）。マウス肺を、ヒトサイトケラチンに対するモノクローナル抗体で染色した。ヒト由来のＡ５４９腫瘍細胞のみを染色した（図２１ｄ）。特筆すべきことに、Ａｇ３－ＡＱＣとＣＤＤＰとの併用投与は、腫瘍病巣のサイズを減少させる最も強い効果を有し、ルシフェラーゼレベルに関連する所見を確認した。
インビボでの抗がん作用については、Ａ５４９の同所性肺がんモデルにおけるＡｇ３－ＡＱＣの有効性を評価した。腫瘍細胞の注入時から注入後３７日目までの腫瘍細胞の生物発光を測定することにより、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍成長を観察した。対照動物は、実験終了まで緩やかな腫瘍成長を示した。尾静脈内に注射したＣＤＤＰ（４ｍｇ／ｋｇ）は、腫瘍の成長を有意に減少させ；Ａｇ３－ＡＱＣ（０．０１ｍｇ／ｋｇ）との併用投与は、この効果を増強した（図２１ａ）。Ａｇ３－ＡＱＣが動物の体重に影響を与えず、したがって、重度の毒性を除外し、クラスターが併用投与されたときにＣＤＤＰの毒性を増加させなかったことを示したことは注目に値する（図２１ｂ）。３７日目に、動物を屠殺し、肺および縦隔結節からタンパク質を抽出し、腫瘍細胞にのみ存在するルシフェラーゼ活性を測定した。ＣＤＤＰは対照群と比較して、肺および縦隔結節のルシフェラーゼレベルを有意に低下させた。再び、Ａｇ３－ＡＱＣとＣＤＤＰとの併用投与は、最も強い効果を有していた（図２１ｃ）。マウス肺を、ヒトサイトケラチンに対するモノクローナル抗体で染色した。ヒト由来のＡ５４９腫瘍細胞のみを染色した（図２１ｄ）。特筆すべきことに、Ａｇ３－ＡＱＣとＣＤＤＰとの併用投与は、腫瘍病巣のサイズを減少させる最も強い効果を有し、ルシフェラーゼレベルに関連する所見を確認した。
【0196】
本明細書で言及されているすべての特許および特許出願は、その全体が参照により組み込まれる。さらに、本明細書に記載されたすべての実施形態は、本発明のすべての態様に適用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11a】
【図11b】
【図12a】
【図12b】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16a】
【図16b】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
