特許 7461950 ＣＤ３抗体およびその医薬用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-27

(45)【発行日】2024-04-04

(54)【発明の名称】ＣＤ３抗体およびその医薬用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240328BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240328BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240328BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240328BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240328BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240328BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240328BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240328BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240328BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240328BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240328BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240328BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240328BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240328BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C07K16/30

C07K16/46

C12N5/10

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K48/00

A61P29/00

A61P35/00

A61P37/02

A61P37/04

【請求項の数】 18

(21)【出願番号】P 2021531235

(86)(22)【出願日】2019-12-06

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-01-26

(86)【国際出願番号】 CN2019123548

(87)【国際公開番号】W WO2020114478

(87)【国際公開日】2020-06-11

【審査請求日】2022-11-15

(31)【優先権主張番号】201811491781.3

(32)【優先日】2018-12-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】510166892

【氏名又は名称】ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．，ＬＴＤ．

(73)【特許権者】

【識別番号】508209602

【氏名又は名称】シャンハイ ヘンルイ ファーマスーティカル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100175477

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 林太郎

(72)【発明者】

【氏名】イン ファ

(72)【発明者】

【氏名】チャン リン

(72)【発明者】

【氏名】ヤン シャオイン

(72)【発明者】

【氏名】グォ フー

(72)【発明者】

【氏名】タオ ウェイカン

【審査官】藤山 純

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１２－５０４４０２（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５１６２４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５２３６８６（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １／００－４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号４８、４９および５０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、かつ
前記重鎖可変領域は、配列番号３７、４０および４２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む、
ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

配列番号３６に示される軽鎖可変領域、および／または
配列番号３１に示される重鎖可変領域
を含む、請求項２に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

抗体軽鎖定常領域および／または重鎖定常領域をさらに含み；
前記軽鎖定常領域は、ヒトκ、λ鎖またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域であり、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域である、請求項３に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二量体化Ｖ領域（ダイアボディ）およびジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

請求項１～３のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域および前記重鎖可変領域を含む、一本鎖抗体。

【請求項7】

請求項６に記載の一本鎖抗体であって、当該一本鎖抗体の配列は、配列番号５７または６４に示されるとおりである、一本鎖抗体。

【請求項8】

ヒトＣＤ３および腫瘍関連抗原に特異的に結合する多重特異性抗体であって、
前記多重特異性抗体は、請求項６もしくは７に記載の一本鎖抗体または請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含み、二重特異性抗体である、多重特異性抗体。

【請求項9】

前記腫瘍関連抗原は、ＡＦＰ、ＡＬＫ、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＧＥタンパク質（ＢＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＲＣ５、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂ１、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、ＣＡ１２５、炭酸脱水酵素ＩＸ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ）、カスパーゼ－８（ｃａｓｐａｓｅ－８）、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２）、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（ＧＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒα２、ＬＭＰ２、κ－Ｌｉｇｈｔ、ＬｅＹ、ＭＡＧＥタンパク質（ＭＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン（Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＯｖ－γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、ＣＡ－１２５、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥタンパク質（ＲＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ウロプラキン－３（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ－３）および５Ｔ４からなる群から選択される、請求項８に記載の多重特異性抗体。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項６もしくは７に記載の一本鎖抗体、または請求項８もしくは９に記載の多重特異性抗体の治療有効量と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項11】

請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするか、請求項６または７に記載の一本鎖抗体をコードするか、請求項８または９に記載の多重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子。

【請求項12】

請求項１１に記載の単離された核酸分子を含む、組換えベクター。

【請求項13】

請求項１２に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞および真核細胞から選択される、宿主細胞。

【請求項14】

真核細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。

【請求項15】

前記真核細胞は哺乳動物細胞または昆虫細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。

【請求項16】

請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項６もしくは７に記載の一本鎖抗体、または請求項８もしくは９に記載の多重特異性抗体を産生する方法であって、請求項１３～１５に記載の宿主細胞を培養培地中で培養して、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項６もしくは７に記載の一本鎖抗体、または請求項８もしくは９に記載の多重特異性抗体を形成および蓄積することと、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメント、前記一本鎖抗体または前記多重特異性抗体を前記培養物から回収することを含む、方法。

【請求項17】

対象における疾患または障害の処置のための医薬組成物であって、
前記医薬組成物は、請求項１～５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、請求項６もしくは７に記載の一本鎖抗体、請求項８もしくは９に記載の多重特異性抗体、または請求項１１に記載の単離された核酸分子を含み、
前記医薬組成物は前記対象のＴ細胞を活性化するために使用される、医薬組成物。

【請求項18】

前記疾患または前記障害は、癌、自己免疫疾患または炎症性疾患である、請求項１７に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ヒト化ＣＤ３抗体などのＣＤ３抗体、ならびにＣＤ３および腫瘍関連抗原に同時に結合する多重特異性抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

本明細書の説明は、本発明に関する背景情報を提供するに過ぎず、必ずしも先行技術を構成するものではない。

【0003】

ＣＤ３は、４つの異なる鎖から構成されるＴ細胞共受容体である（Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｇ， ＫＷ ｅｔ ａｌ． （２０１０年） Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ： Ｉｎｓｉｇｈｔｓ Ｉｎｔｏ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ， Ｌｉｇａｎｄ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ． Ｐｅｒｓｐｅｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２（４）：Ａ００５１４０；１－１４頁； Ｃｈｅｔｔｙ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． （１９９４年） ＣＤ３：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ａｎｄ Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ Ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １７３（４）：３０３－３０７頁； Ｇｕｙ， Ｃ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２００９年） Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｘｉｍａｌ Ｓｉｇｎａｌ Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ ＴＣＲ：ＣＤ３ Ｃｏｍｐｌｅｘ， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２３２（１）：７－２１頁）。

【0004】

哺乳動物では、ＣＤ３マルチサブユニットによって形成される複合体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）分子と会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する（Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎ， ＪＥ ｅｔ ａｌ． （２００９年） Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：５９１－６１９頁）。ＣＤ３の非存在下では、ＴＣＲは適切にアセンブルされることも分解されることもできない（Ｔｈｏｍａｓ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２０１０年） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｓｓｏｎｓ Ｆｒｏｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２９（２）： １７０－１７７頁）。研究によると、ＣＤ３はすべての成熟Ｔ細胞の膜に結合し、他の細胞型にはほとんど結合しない（Ｊａｎｅｗａｙ， Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２００５年）： Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，第６版， Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＮＹ， ２１４－２１６頁； Ｓｕｎ， Ｚ．Ｊ． ｅｔ ａｌ．（２００１年） Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｎｇ ｔｏ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ３ε： γ Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ， Ｃｅｌｌ １０５ （７）： ９１３－９２３頁； Ｋｕｈｎｓ， Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ． （２００６年） Ｄｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｆｏｒｍ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＣＲ／ＣＤ３ Ｃｏｍｐｌｅｘ， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２００６年２月， ２４（２）： １３３－１３９頁）。

【0005】

Ｔ細胞上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の定常ＣＤ３εシグナル伝達成分は、Ｔ細胞と腫瘍細胞の間の免疫シナプスの形成を促進するための標的として使用されてきた。ＣＤ３と腫瘍抗原の共結合（ｃｏ－ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）はＴ細胞を活性化し、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞の溶解をもたらす（Ｂａｅｕｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ． （２０１１年） Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｎｇａｇｅｒ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｉｎ： Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ， Ｒ．Ｅ．（編） Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ； ２０１１年：２７３－２８７頁）。この方法により、二重特異性抗体は、腫瘍細胞に対するのと同じくらい高い特異性でＴ細胞コンパートメントと完全に相互作用することができ、この方法は、さまざまな細胞表面腫瘍抗原に広く適用可能である。

【0006】

Ｂ７Ｈ３はＢ７ファミリーのメンバーであり、Ｉ型膜貫通タンパク質に属する。それは、アミノ末端のシグナルペプチド、細胞外免疫グロブリン様可変領域（ＩｇＶ）、定常領域（ＩｇＣ）、膜貫通領域、および４５アミノ酸を含む細胞質尾部領域を含有する（Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ． ２００７年８月； ７０ （２）： ９６－１０４頁）。現在、Ｂ７Ｈ３には主にＢ７Ｈ３ａとＢ７Ｈ３ｂの２種類のスプライシングフォームがある。Ｂ７Ｈ３ａの細胞外セグメントは、２ＩｇＢ７Ｈ３としても知られる２つの免疫グロブリンドメインＩｇＶ－ＩｇＣから構成されているが、Ｂ７Ｈ３ｂの細胞外セグメントは、４ＩｇＢ７Ｈ３としても知られる４つの免疫グロブリンドメインＩｇＶ－ＩｇＣ－ＩｇＶ－ＩｇＣから構成されている。

【0007】

Ｂ７Ｈ３タンパク質は、正常な組織および細胞には存在しないか、正常な組織および細胞に極めて低いレベルで発現している；しかし、Ｂ７Ｈ３タンパク質は、さまざまな腫瘍組織で高度に発現しており、腫瘍の進行、患者の生存および予後と密接に関連している。Ｂ７Ｈ３は、さまざまな癌種、特に非小細胞肺癌、腎臓癌、尿路上皮癌、結腸直腸癌、前立腺癌、多形性膠芽腫、卵巣癌および膵臓癌で過剰発現していることが臨床的に報告されている（Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ． ２００９年１１月； ６６（２）： ２４５－２４９頁； Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００８年８月１５日； １４（１６）： ５１５０－５１５７頁）。さらに、Ｂ７Ｈ３の発現強度は、前立腺癌の臨床病理学的悪性度（腫瘍体積、前立腺を越える浸潤またはグリソンスコアなど）と正の相関があり、癌の進行度とも相関することが文献で報告されている（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００７年８月１５日； ６７ （１６）： ７８９３－７９００頁）。同様に、Ｂ７Ｈ３の発現は、多形性膠芽腫のイベントフリー生存と負の相関があり、Ｂ７Ｈ３の発現は膵臓癌のリンパ節転移および病理学的進行と相関する。したがって、Ｂ７Ｈ３は、新規な腫瘍マーカおよび潜在的な治療標的と見なされている。

【発明の概要】

【0008】

本開示は、ヒトＣＤ３に特異的に結合することができる抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0009】

一態様において、本開示は、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、
前記軽鎖可変領域は、配列番号４８、４９および５０にそれぞれ示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、かつ
前記重鎖可変領域は、以下のｉ）～ｖ）：
ｉ）配列番号３７、３８および３９にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｉｉ）配列番号３７、４０および４１にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｉｉｉ）配列番号３７、４０および４２にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；
ｉｖ）配列番号３７、４０および４３にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；ならびに
ｖ）配列番号３７、４７および４５にそれぞれ示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域
からなる群から選択されるいずれか１つである、ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

【0010】

いくつかの実施形態では、前記ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはその抗原結合フラグメントである。

【0011】

いくつかの実施形態では、前記ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３６の軽鎖可変領域、および／または、配列番号２９、３０、３１、３２および３５からなる群から選択されるいずれか１つに示される重鎖可変領域を含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、前記ヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗体軽鎖定常領域および／または重鎖定常領域をさらに含み；任意に、前記軽鎖定常領域は、ヒトκ、λ鎖またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域であり、前記重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域である。

【0013】

いくつかの実施形態では、前記抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二量体化Ｖ領域（ダイアボディ）およびジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）から選択される。

【0014】

別の態様において、本開示は、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域および前記重鎖可変領域を含む、一本鎖抗体を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、前記一本鎖抗体の配列は、配列番号５５、５６、５７、５８、６１、６２、６３、６４、６５または６８に示されるとおりである。

【0016】

別の態様において、本開示は、ヒトＣＤ３および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的に結合する多重特異性抗体であって、上記の一本鎖抗体またはヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含む、多重特異性抗体を提供する。

【0017】

前記多重特異性抗体のいくつかの実施形態において、前記腫瘍関連抗原は、ＡＦＰ、ＡＬＫ、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＧＥタンパク質（ＢＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＲＣ５（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂ１、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、ＣＡ１２５、炭酸脱水酵素ＩＸ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ）、カスパーゼ－８（ｃａｓｐａｓｅ－８）、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２）、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（ＧＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＡＧＥ－１、－２など）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒα２、ＬＭＰ２、κ－Ｌｉｇｈｔ、ＬｅＹ、ＭＡＧＥタンパク質（ＭＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６、－１２など）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＯｖ－γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、ＲＡＧＥタンパク質（ＲＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ウロプラキン－３（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ－３）および５Ｔ４（トロホブラスト糖タンパク質（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））からなる群から選択される。好ましくは、前記腫瘍関連抗原は、Ｂ７Ｈ３、ＢＣＭＡ、ＣＥＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、クローディン１８．２（Ｃｌａｕｄｉｎ １８．２）、ＰＳＭＡおよびメソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）からなる群から選択される。

【0018】

別の態様において、本開示は、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、または多重特異性抗体の治療有効量と、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、緩衝液または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、治療有効量とは、前記組成物が上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、または多重特異性抗体の単位用量０．１～３０００ｍｇ（より好ましくは１～１０００ｍｇ）を含むことを意味する。

【0019】

別の態様において、本開示は、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするか、上記の一本鎖抗体をコードするか、上記の多重特異性抗体をコードする、単離された核酸分子を提供する。

【0020】

別の態様において、本開示は、上記の単離された核酸分子を含む、組換えベクターを提供する。

【0021】

別の態様において、本開示は、上記の組換えベクターで形質転換された宿主細胞であって、前記宿主細胞は、原核細胞および真核細胞から選択され、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞または昆虫細胞である、宿主細胞を提供する。

【0022】

別の態様において、本開示は、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、または多重特異性抗体を産生する方法であって、上記の宿主細胞を培養培地中で培養して、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、または多重特異性抗体を形成および蓄積することと、前記抗体もしくはその抗原結合フラグメント、前記一本鎖抗体または前記多重特異性抗体を前記培養物から回収することを含む、方法を提供する。

【0023】

別の態様において、本開示は、薬剤としての、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、多重特異性抗体、医薬組成物、または単離された核酸分子を提供する。いくつかの実施形態では、前記薬剤は、Ｔ細胞の活性化のための薬剤である；いくつかの実施形態では、前記薬剤は、癌、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置のための薬剤である。

【0024】

別の態様において、本開示は、Ｔ細胞の活性化のための薬剤の調製における、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、多重特異性抗体、医薬組成物、または単離された核酸分子の使用を提供する。

【0025】

別の態様において、本開示は、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、多重特異性抗体、医薬組成物、または単離された核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含む、Ｔ細胞を活性化するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、上記の多重特異性抗体の単位用量０．１～３０００ｍｇ（より好ましくは１～１０００ｍｇ）を含む組成物、または上記の医薬組成物、または単離された核酸分子を対象に投与することを含む。

【0026】

別の態様において、本開示は、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、多重特異性抗体、医薬組成物、または単離された核酸分子の治療有効量を対象に投与することを含む、癌、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置のための方法を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、上記の多重特異性抗体の単位用量０．１～３０００ｍｇ（より好ましくは１～１０００ｍｇ）を含む組成物、または上記の医薬組成物、または単離された核酸分子を対象に投与することを含む。

【0027】

別の態様において、本開示は、癌、自己免疫疾患または炎症性疾患の処置のための薬剤の調製における、上記のヒトＣＤ３に特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント、一本鎖抗体、多重特異性抗体、医薬組成物、または単離された核酸分子の使用を提供する。

【0028】

いくつかの実施形態では、上記の癌は、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病およびリンパ系悪性腫瘍からなる群から選択されるいずれか１つである。癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｏｃｙｔｅ－ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、多発性骨髄腫、ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｍｃｌ－１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化器（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、胃癌、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫瘍、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、腎明細胞癌（ＲＣＣ）、頭頸部癌、咽頭喉頭癌、肝胆道癌、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、精巣癌、および皮膚癌が含まれる。いくつかの実施形態では、癌は、Ｂ７－Ｈ３陽性細胞関連癌であり、好ましくは乳癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、腎臓癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、結腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、胆嚢癌、膠芽腫または黒色腫である。

【0029】

いくつかの実施形態では、上記の自己免疫疾患または炎症性疾患は、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶後の自己免疫性溶血性貧血、小水疱性類天疱瘡（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、天疱瘡および悪性貧血からなる群から選択されるいずれか１つである。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】図１Ａおよび図１Ｂ：図１Ａは二価二重特異性抗体の概略図であり、図１Ｂは一価二重特異性抗体の概略図である。

【図2】図２Ａ～図２Ｄ：対応する抗原の発現を伴うまたは伴わない細胞に結合する活性についてのフローサイトメトリーによる抗体の検出。図２Ａは、ヒトＢ７Ｈ３を発現するＡ４９８細胞に結合するさまざまな抗体の活性の検出を示す；図２Ｂは、ヒトＢ７Ｈ３を過剰発現するＣＴ２６細胞に結合するさまざまな抗体の活性の検出を示す；図２Ｃは、ヒトＢ７Ｈ３を発現しないＣＴ２６細胞に結合するさまざまな抗体の活性の検出を示し、その結果は、いずれの抗体もヒトＢ７Ｈ３を発現しないＣＴ２６細胞に結合しないことを示す；図２Ｄは、ＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ組換え細胞に結合するさまざまな抗体の活性の検出を示す。図２Ａ～図２Ｄの縦軸は、蛍光シグナルの幾何平均を表す。

【図3】図３Ａ～図３Ｂ：Ａ４９８の殺傷におけるさまざまなＣＤ３ ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体の活性の検出。図３Ａは、Ｂ７Ｈ３一価二重特異性抗体の殺傷活性を示す。図３Ｂは、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体の殺傷活性を示す。Ａ４９８に対してより弱い殺傷活性を有する１５５、１５６、１８５および１８６を除いて、すべての二重特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３の一価または二価にかかわらず、明らかな殺傷活性を示す。

【図4】図４Ａ～図４Ｂ：同じＣＤ３ ｓｃＦｖを含むＢ７Ｈ３一価および二価二重特異性抗体間のＡ４９８に対する殺傷活性の比較。図４Ａは、ＨＲＨ１を含むＢ７Ｈ３一価（１８１）および二価（１３１）二重特異性抗体間の殺傷活性の比較を示す。図４Ｂは、ＨＲＨ７を含むＢ７Ｈ３一価（１８７）および二価（１７７）間の殺傷活性の比較を示す。ずべての実験結果は、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体がＢ７Ｈ３一価二重特異性抗体と比較してより明白なＡ４９８殺傷活性を有することを示す。同時に、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３一価二重特異性抗体よりも有意に強い殺傷活性を有する。

【図5】図５Ａ～図５Ｃ：同じＣＤ３重鎖可変領域を含むが、異なる配置順序を有するＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体のＡ４９８に対する殺傷活性の検出。図５Ａは、ＨＲＨ２を含有する第１のポリペプチド鎖を含むＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体の殺傷活性の比較を示し、ここで、当該第１のポリペプチド鎖は、さまざまな順序で配置されている（ＡＦＦ１、ＡＦＦ２、ＡＦＦ３、ＡＦＦ４）。図５Ｂは、ＨＲＨ２を含有する第２のポリペプチド鎖を含むＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体の殺傷活性の比較を示し、ここで、当該第２のポリペプチド鎖は、さまざまな順序で配置されている（ＡＦＦ３、ＡＦＦ３－Ｂ）。結果は、同じ配列を有するがＶＨとＶＬの配置が異なるすべてのＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体が有意なＡ４９８細胞殺傷活性を有し、異なる配置順序を有する分子は同様の殺傷活性を有することを示す。図５Ｃは、同じＢ７Ｈ３ ｓｃＦｖおよびＣＤ３ ｓｃＦｖを含むが、構造が異なる二重特異性抗体間の殺傷活性の比較を示す。３つの試験二重特異性抗体１２７、２０１および２０２はすべて、Ａ４９８腫瘍細胞を殺傷する能力を有し、そのうち二重特異性抗体１２７が、２０１および２０２よりも優れた殺傷活性示す。

【図6】図６Ａ～図６Ｂ：異なる抗体によるＪｕｒｋａｔ組換え細胞の活性化の検出。図６Ａは、Ａ４９８細胞の存在下における、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞の抗体を介したＢ７Ｈ３標的特異的活性化を示す；図６Ｂは、Ａ４９８細胞の非存在下における、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞の抗体を介した非Ｂ７Ｈ３標的特異的活性化を示す。同じ抗体レジェンドが図６Ａ～図６Ｂに示されている。

【図7】図７Ａ～図７Ｂ：同じＣＤ３ｓｃＦｖを含むが、異なる価数を有する二重特異性抗体によるＪｕｒｋａｔ組換え細胞の活性化の検出。図７Ａは、Ａ４９８細胞の存在下における、Ｂ７Ｈ３一価／二価二重特異性抗体によるＪｕｒｋａｔ組換え細胞の抗体を介したＢ７Ｈ３標的特異的活性化を示す；図７Ｂは、Ａ４９８細胞の非存在下における、Ｂ７Ｈ３一価／二価二重特異性抗体によるＪｕｒｋａｔ組換え細胞の抗体を介した非Ｂ７Ｈ３標的特異的活性化を示す。

【図8】図８Ａ～図８Ｃ：さまざまな抗体を、Ａ４９８細胞の存在下で、Ｂ７Ｈ３標的特異的サイトカイン分泌を産生するためのＰＢＭＣの刺激について試験する。図８Ａは、さまざまな抗体によって刺激されたＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌レベルの比較を示す；図８Ｂは、さまざまな抗体によって刺激されたＰＢＭＣからのＴＮＦα分泌レベルの比較を示す；図８Ｃは、さまざまな抗体によって刺激されたＰＢＭＣからのＩＬ－２分泌レベルの比較を示す。図８Ａ～図８Ｃは、抗体１１８、１２７および１３２がＰＢＭＣを有意に刺激して、Ｂ７Ｈ３標的特異的サイトカイン分泌を産生し得ることを示す。同じ抗体レジェンドが図８Ａ～図８Ｃに示されている。

【図9】図９Ａ～図９Ｃ：さまざまな抗体を、ＣＨＯＫ１細胞（Ｂ７Ｈ３の発現なし）の存在下で、非Ｂ７Ｈ３標的特異的サイトカイン分泌を産生するためのＰＢＭＣの刺激について試験する。図９Ａは、さまざまな抗体によって刺激されたＰＢＭＣから分泌されたＩＦＮγレベルの比較を示す；図９Ｂは、さまざまな抗体によって刺激されたＰＢＭＣから分泌されたＴＮＦαレベルの比較を示す；図９Ｃは、さまざまな抗体によって刺激されたＰＢＭＣから分泌されたＩＬ－２レベルの比較を示す。図９Ａ～図９Ｃは、抗体１１８、１２７および１３２がＰＢＭＣを刺激して非Ｂ７Ｈ３標的特異的サイトカイン分泌を産生することができず、より良好な安全性を有することを示す。同じ抗体レジェンドが図９Ａ～図９Ｃに示されている。

【図10】図１０Ａ～図１０Ｅ：ヒトＰＢＭＣで再構成したマウスＡ４９８モデルにおける二重特異性抗体の抗腫瘍効果の検出。図１０Ａは、低用量Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体の抗腫瘍活性の検出を示す。低用量抗体１１８および１１９はいずれも、依然として一定の抗腫瘍活性を示し、ある程度の用量依存性を示す。図１０Ｂは、０．３ｍｐｋおよび０．６ｍｐｋの用量でのＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体の抗腫瘍活性の検出を示す。抗体１１３は、ｉｎ ｖｉｖｏで用量依存的な腫瘍抑制活性を示す。図１０Ｃは、０．１２ｍｐｋおよび０．３６ｍｐｋの用量でのＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体の抗腫瘍活性の検出を示す。抗体１１８は、両方の用量で有意な抗腫瘍活性を示す。図１０Ｄは、０．３６ｍｐｋの用量でのＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体の抗腫瘍活性の検出を示す。抗体１２６、１２７および１２８はすべて有意な抗腫瘍活性を示す。図１０Ｅは、さまざまな用量およびさまざまな投与頻度での抗体１２７の抗腫瘍活性を示す。図１０Ａ～図１０Ｅにおいて、「ビヒクル」は、ＰＢＳを投与されたネガティブコントロール群を表す。

【図11】図１１Ａ～図１１Ｂ：ｈＣＤ３ ＫＩマウスモデルにおける二重特異性抗体の抗腫瘍効果。図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ、ｈＣＤ３ ＫＩマウスモデルにおける１１８および１３２の抗腫瘍効果を示す。

【発明の詳細な説明】

【0031】

用語（定義）

【0032】

本開示で使用されるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、Ｊ． ｂｉｏｌ． ｃｈｅｍ， ２４３， ３５５８頁（１９６８年）に記載されるとおりである。

【0033】

「多重特異性タンパク質分子」という用語は、２つ以上の標的抗原または標的抗原エピトープに特異的に結合することができるタンパク質分子を指す。２つの標的抗原または標的抗原エピトープに特異的に結合することができるタンパク質分子は、抗体または抗体の抗原結合フラグメント（一本鎖抗体など）を含む二重特異性タンパク質分子と呼ばれる。「二重特異性タンパク質分子」は、本明細書において「二重特異性抗体」と交換可能である。

【0034】

抗原の「結合領域」という用語は、多重特異性タンパク質分子または抗体分子中の抗原に特異的に結合することができる領域または部分を指す。抗原結合領域は、抗原に直接結合することができるリガンド結合ドメインであり得るか、または抗原に直接結合することができる抗体の可変領域を含むドメインであり得る。

【0035】

「抗体（Ａｂ）」という用語は、特定の抗原（例えば、ＣＤ３）に特異的に結合または相互作用する少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む任意の抗原結合分子または分子複合体を含む。「抗体」という用語は、ジスルフィド結合を介して互いに接続された４本のポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（以下、ＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および重鎖定常領域を含む。この重鎖定常領域は、３つの領域（ドメイン）、すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以下、ＬＣＶＲまたはＶＬと略記する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの領域（ドメイン、ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化でき、その中で、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在している。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。本開示のさまざまな実施形態において、抗ＣＤ３抗体（またはその抗原結合部分）、抗Ｂ７Ｈ３抗体（またはその抗原結合部分）、または他の標的抗原に対する抗体のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同じであり得るか、または自然もしくは人工的に改変され得る。抗体は、異なるサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブクラス）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体であり得る。

【0036】

「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントも包含する。本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に産生された、合成または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、任意の適切な標準技術、例えば、タンパク質分解消化または抗体可変領域および（任意に）定常領域をコードするＤＮＡの操作および発現を含む組換え遺伝子工学技術を使用することによって、完全な抗体分子から誘導することができる。ＤＮＡは既知であり、かつ／または、例えば、市販の供給源、ＤＮＡデータベース（例えば、ファージ抗体データベースを含む）から容易に入手することができるか、または合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、または分子バイオテクノロジーを使用することによって、例えば、１つ以上の可変領域および／または定常領域を適切な構成に配置することによって、またはコドンを導入することによって、システイン残基を生成することによって、アミノ酸の修飾、付加または欠失などによって、配列決定および操作することができる。

【0037】

抗原結合フラグメントの非限定的な例には、以下が含まれる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント。他の操作された分子、例えば、領域特異的抗体、単一ドメイン抗体、領域欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ（例えば、一価ナノボディ、二価ナノボディなど）、小モジュラー免疫医薬（Ｓｍａｌｌ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（ＳＭＩＰ））およびサメ可変ＩｇＮＡＲ領域（Ｓｈａｒｋ Ｖａｒｉａｂｌｅ ＩｇＮＡＲ ｒｅｇｉｏｎｓ）も、本明細書で使用される「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる。

【0038】

抗体の抗原結合フラグメントは、通常、少なくとも１つの可変領域を含む。可変領域は任意のサイズまたはアミノ酸組成の領域であり得、一般に、フレームワーク配列に隣接するまたはフレームワーク配列内にある１つ以上のＣＤＲを含む。ＶＬ領域と結合したＶＨ領域を有する抗原結合フラグメントにおいて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、任意の適切な配置で互いに対向して位置することができる。例えば、可変領域は二量体化することができ、ＶＨ－ＶＬまたはＶＬ－ＶＨ二量体を含む。

【0039】

いくつかの実施形態では、抗体の抗原結合フラグメントは可変領域および定常領域の任意の構成にあり、当該可変領域および定常領域は、互いに直接的に接続され得るか、あるいは完全または部分的なヒンジまたはリンカー領域を介して接続され得る。ヒンジ領域は、少なくとも２（例えば、５、１０、１５、２０、４０、６０またはそれよりも多く）のアミノ酸から構成され得、その結果、単一のポリペプチド分子内の隣接する可変領域および／または定常領域の間に柔軟または半柔軟（ｓｅｍｉ－ｆｌｅｘｉｂｌｅ）な接続が生成される。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、上記の可変領域および定常領域の任意の構成にあるホモ二量体またはヘテロ二量体（または他の多量体）を含むことができ、当該可変領域および定常領域は互いに非共有結合で接続され得、かつ／または１つ以上の単量体ＶＨまたはＶＬ領域に接続され得る（例えば、ジスルフィド結合を介して）。

【0040】

本明細書で使用される「マウス抗体」は、当技術分野の知識および技能に従って調製されたマウス由来のモノクローナル抗体を指す。その調製中に、試験対象に抗原を注射し、次いで、所望の配列または機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離する。注射された試験対象がマウスである場合、得られる抗体がマウス抗体になる。

【0041】

「キメラ抗体」は、マウス抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域と融合させることによる抗体であり、このような抗体は、マウス抗体によって誘導される免疫応答を軽減することができる。キメラ抗体を確立するために、特定のマウスモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを最初に確立し、可変領域遺伝子をマウスハイブリドーマからクローン化する。次に、必要に応じて、ヒト抗体から定常領域遺伝子をクローニングする。マウス可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子に接続してキメラ遺伝子を形成し、その後、これを発現ベクターに挿入することができる。最後に、キメラ抗体分子を真核生物または原核生物システムで発現させる。本開示の好ましい実施形態では、キメラ抗体の抗体軽鎖は、ヒトκ（カッパ）、λ（ラムダ）鎖またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含む。キメラ抗体の抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み、好ましくはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含むか、またはアミノ酸変異（ＹＴＥ変異または復帰変異、Ｌ２３４Ａおよび／またはＬ２３５Ａ変異、またはＳ２２８Ｐ変異など）を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域バリアントを含む。

【0042】

ＣＤＲ移植抗体を含む「ヒト化抗体」という用語は、動物由来の抗体、例えばマウス抗体のＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワーク（すなわちフレームワーク領域）に移植することによって生成される抗体を指す。ヒト化抗体は、多数の異種タンパク質成分を有するキメラ抗体によって誘導される異種応答を克服することができる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列をカバーする公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から入手することができる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の生殖細胞系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖細胞系列配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／で入手可能）およびＫａｂａｔ， ＥＡ， ｅｔ ａｌ． １９９１年 Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版に見出すことができる。免疫原性の低下によって引き起こされる活性の低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列を最小限の逆変異または復帰変異に供して、活性を維持することができる。本開示のヒト化抗体は、ファージディスプレイによってＣＤＲ親和性成熟が行われるヒト化抗体も含む。

【0043】

抗原と接触した残基のために、ＣＤＲの移植は、抗原と接触したフレームワーク残基のために、抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下をもたらし得る。このような相互作用は体細胞超変異から生じ得る。したがって、ドナーフレームワークのアミノ酸をヒト化抗体フレームワークに移植することが依然として必要であるかもしれない。抗原結合に関与し、非ヒト抗体またはその抗原結合フラグメントに由来するアミノ酸残基は、動物モノクローナル抗体可変領域の配列および構造をチェックすることによって同定することができる。生殖細胞系列とは異なるドナーＣＤＲフレームワークアミノ酸残基は、関連していると見なすことができる。最も密接に関連する生殖細胞系列を決定することが不可能な場合には、その配列は、サブタイプによって共有されるコンセンサス配列または高い類似性パーセンテージを有する動物抗体配列と比較され得る。まれなフレームワーク残基は、体細胞超変異の結果と考えられており、結合において重要な役割を果たす。

【0044】

本開示の一実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそれらのバリアントの軽鎖定常領域をさらに含み得るか、あるいはヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそれらのバリアントの重鎖定常領域をさらに含み得る。

【0045】

「ヒト抗体」および「ヒト由来の抗体」は交換可能に使用することができ、ヒト由来の抗体、または抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するように当技術分野で知られている任意の方法によって「操作」および産生された遺伝子改変生物から得られる抗体であり得る。いくつかの技術では、ヒトの重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、胚性幹細胞株に由来する生物の細胞株に導入され、これらの細胞株の内因性の重鎖および軽鎖遺伝子座が標的化されて破壊される。これらの細胞株に含まれる標的化された内因性の重鎖および軽鎖遺伝子座は破壊される。トランスジェニック生物は、ヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、この生物は、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを産生するために使用することができる。ヒト抗体はまた、重鎖および軽鎖が１つ以上のヒトＤＮＡ供給源に由来するヌクレオチド配列によってコードされるような抗体であり得る。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイテクノロジーによって構築され得るか、またはｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化されたＢ細胞から構築され得、これらはすべて当技術分野で知られている。

【0046】

「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、可能なバリアント抗体（例えば、天然に存在する変異またはモノクローナル抗体調製物の作製中に生成された変異を含むバリアントであり、該変異は通常最小限の量で存在する）を除いて、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合する。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、モノクローナル抗体調製物（製剤）の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られた抗体の特徴を示し、抗体を製造するための特定の方法を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、さまざまな技術（ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を使用する方法を含むが、これらに限定されない）によって調製することができる。このような方法およびモノクローナル抗体を調製するための他の例示的な方法は、本明細書中に記載されている。

【0047】

「全長抗体（ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「完全抗体（ｆｕｌｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」、「全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「完全抗体（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、以下に定義される抗原結合フラグメントとは区別される、実質的に完全な形態の抗体を指す。この用語は、具体的には、重鎖がＦｃ領域を含む抗体を指す。

【0048】

さらに、ＦｖフラグメントのＶＬドメインおよびＶＨドメインは２つの別々の遺伝子によってコードされるが、それらを組換え法を使用して合成リンカーによって連結して、ＶＬドメインとＶＨドメインのペアリングによって一価の分子が形成された単一のタンパク質鎖を生成することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）と呼ばれる；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８年）：４２３－４２６頁；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２、およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ８５：５８７９－５８８３頁を参照）。このような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図される。このような抗体フラグメントは、当該分野で知られている従来の技術を使用して得られ、インタクト抗体についてのものと同じ方法を使用することによって機能的フラグメントについてスクリーニングされる。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクト免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的破壊によって産生することができる。

【0049】

抗原結合フラグメントは、タンデムＦｖフラグメントのペア（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む一本鎖分子に組み込むこともでき、当該タンデムＦｖフラグメントのペアは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域のペアを形成する（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９５年 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）：１０５７－１０６２頁；および米国特許第５，６４１，８７０号）。

【0050】

Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子を（Ｈ鎖の位置２２４のアミノ酸残基を切断する）パパインで処理することによって得られる抗体フラグメントであり、該抗体フラグメントは約５０，０００Ｄａの分子量を有し、抗原結合活性を有し、Ｈ鎖のＮ末端側の約半分およびＬ鎖全体がジスルフィド結合を介して一緒に結合している。

【0051】

Ｆ（ａｂ’）２は約１００，０００Ｄａの分子量を有し、抗原結合活性を有し、ヒンジ位置で結合した２つのＦａｂ領域を含む抗体フラグメントであり、ＩｇＧヒンジ領域の２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシンで消化することによって産生することができる。

【0052】

Ｆａｂ’は約５０，０００Ｄａの分子量を有し、抗原結合活性を有する抗体フラグメントであり、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域でジスルフィド結合を切断することによって得られる。Ｆａｂ’は、抗原を特異的に認識して結合するＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理することによって産生することができる。

【0053】

さらに、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’をコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって産生することができる。

【0054】

「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって抗体軽鎖可変ドメイン（または領域；ＶＬ）に接続された抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨまたはＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨの一般構造を有する。従来技術における適切なリンカーは、繰り返しＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアント、例えば１～４回（１、２、３または４回を含む）の繰り返しを有するバリアントからなる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３年），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９０：６４４４－６４４８頁）。本開示に有用な他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５年），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：７２５－７３１頁、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２００１年），Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏ．３１：９４－１０６頁、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６年），Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３０５５－３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９９年），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２９３：４１－５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００１年），Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５０：５１－５９頁によって記載されている。

【0055】

「多重特異性抗体」は、２つ以上抗原結合ドメインを含み、２つ以上の異なるエピトープ（例えば、２つ、３つ、４つ以上の異なるエピトープ）に結合することができる抗体を指し、当該エピトープは同一または異なる抗原上に存在し得る。多重特異性抗体の例には、２つの異なるエピトープに結合する「二重特異性抗体」が含まれる。

【0056】

腫瘍関連抗原の「二価二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合領域が腫瘍関連抗原標的に対して向けられている二重特異性抗体を指す。例えば、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３を標的とする２つの抗原結合領域を含む二重特異性抗体を指す。「一価二重特異性抗体」という用語は、１つの抗原結合領域のみが特定の標的に対して向けられている二重特異性抗体を指す。例えば、Ｂ７Ｈ３一価二重特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３を標的とする１つの抗原結合領域を含む二重特異性抗体を指す。

【0057】

「リンカー」または「連結フラグメント」は、２つのタンパク質ドメインの間に位置する、当該２つのドメインを接続するための「Ｌ１」を指し、タンパク質ドメインを接続するために使用される接続ペプチド配列も指す。それは、通常、ある程度の柔軟性を有し、リンカーを使用してもタンパク質ドメインが元の機能を失うことはない。

【0058】

ダイアボディは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体フラグメントであり、二価抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。二価抗原結合活性において、２つの抗原は同じであっても異なっていてもよい。

【0059】

ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれの１つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、次に、その２つのシステイン残基間のジスルフィド結合を介して置換されたポリペプチドを接続することによって得られる。システイン残基で置換されるアミノ酸残基は、既知の方法に従って、抗体の三次元構造予測に基づいて選択することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４年））。

【0060】

本開示のいくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、以下のステップ：抗原を特異的に認識および結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよび／またはＶＬをコードするｃＤＮＡ、ならびに必要に応じてその他のドメインをコードするｃＤＮＡを得るステップ；抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを構築するステップ；該ＤＮＡを原核生物または真核生物発現ベクターに挿入するステップ；および、次いで該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して、抗原結合フラグメントを発現させるステップ、によって産生され得る。

【0061】

「Ｆｃ領域」は、天然に存在する配列またはバリアントＦｃ領域であり得る。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は可変であるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０のアミノ酸残基からカルボキシル末端にわたる領域として定義される。Ｆｃ領域における残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックス番号付けに従う（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、アメリカ公衆衛生局、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、１９９１年））。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、ＣＨ２およびＣＨ３の２つの定常ドメインを有する。ここで、「１番目のＦｃ」は「Ｆｃ１」とも呼ばれ、２番目のＦｃは「Ｆｃ２」とも呼ばれる。

【0062】

「Ｖ_ａ１－Ｌ１－Ｖ_ｂ１－Ｌ２－Ｖ_ｃ２－Ｌ２－Ｖ_ｄ２－Ｌ４－Ｆｃ１」および「Ｖ_ｅ３－Ｌ５－Ｖ_ｆ３－Ｌ６－Ｆｃ２」において、Ｖ_ａ１、Ｖ_ｂ１、Ｖ_ｃ２、Ｖ_ｄ２、Ｖ_ｅ３およびＶ_ｆ３は、抗体軽鎖可変領域または重鎖可変領域を表し、Ｖ_ａ１およびＶ_ｂ１は抗原の第１のエピトープに結合し、Ｖ_ｃ２およびＶ_ｄ２は抗原の第２のエピトープに結合し、Ｖ_ｅ３およびＶ_ｆ３は第３のエピトープに結合する。第１のエピトープ、第２のエピトープおよび第３のエピトープは、同じであってもよいし同じでなくてもよい。

【0063】

「ＶＨ_ＴＡＡ－Ｌ１－ＶＬ_ＴＡＡ－Ｌ２－ＶＨ_ＣＤ３－Ｌ３－ＶＬ_ＣＤ３－Ｌ４－Ｆｃ１」と同様に、ＶＨ_ＴＡＡおよびＶＬ_ＴＡＡは腫瘍関連抗原のエピトープに結合する抗体可変領域を表し、ＶＨ_ＣＤ３およびＶＬ_ＣＤ３はＣＤ３のエピトープに結合する抗体可変領域を表す。

【0064】

本開示において、「ノブ－Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に点変異Ｔ３６６Ｗを組み込むことによって形成されるノブ状の空間構造を指す。同様に、「ホール－Ｆｃ」は、抗体のＦｃ領域に点変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを組み込むことによって形成されるホール状の空間構造を指す。ノブ－Ｆｃおよびホール－Ｆｃは、立体障害のためにヘテロ二量体を形成する可能性が高くなる。ヘテロ二量体の形成をさらに促進するために、点変異Ｓ３５４ＣおよびＹ３４９Ｃをそれぞれノブ－Ｆｃおよびホール－Ｆｃに導入して、ジスルフィド結合を介したヘテロ二量体の形成をさらに促進することができる。一方、抗体Ｆｃによって引き起こされるＡＤＣＣ効果を排除または軽減するために、２３４Ａおよび２３５Ａの置換変異をＦｃに導入することもできる。例えば、本開示の好ましいノブ－Ｆｃおよびホール－Ｆｃは、それぞれ配列番号６９および７０に示されている。二重特異性抗体では、ノブ－Ｆｃまたはホール－Ｆｃは、第１のポリペプチド鎖のＦｃ領域または第２のポリペプチド鎖のＦｃ領域のいずれかとして使用され得る。単一の二重特異性抗体の場合、第１および第２のポリペプチド鎖のＦｃ領域が両方ともノブ－Ｆｃまたはホール－Ｆｃであることはできない。

【0065】

「アミノ酸差異」または「アミノ酸変異」という用語は、元のタンパク質またはポリペプチドと比較した場合のタンパク質またはポリペプチドバリアントにおけるアミノ酸の変化または変異を指し、元のタンパク質またはポリペプチドに基づく１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換を含む。

【0066】

抗体の「可変領域」とは、単独のまたは組み合わせた、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）または抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を指す。当該分野で知られているように、重鎖および軽鎖可変領域の各々は、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に接続された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）（超可変領域とも呼ばれる）からなる。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲによって緊密に一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの手法が存在する：（１）異種間配列変動に基づく方法（すなわち、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、１９９１年、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州））；および（２）抗原－抗体複合体の結晶学的研究に基づく方法（Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７－９４８頁（１９９７年））。本明細書で使用される場合、ＣＤＲは、２つの方法のいずれかまたは組み合わせによって決定されたものを指すことができる。

【0067】

「抗体フレームワーク」または「ＦＲ領域」という用語は、ＶＬまたはＶＨのいずれかの可変ドメインの一部を指し、この可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）のためのスキャフォールドとして機能する。基本的に、それはＣＤＲのない可変ドメインである。

【0068】

「ＣＤＲ」という用語は、主に抗原結合に寄与する、抗体可変ドメインに存在する６つの超可変領域のうちの１つを指す。６つのＣＤＲの最も一般的に使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ． ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２頁）によって与えられる。本明細書のいくつかの実施形態で使用される場合、ＣＤＲは、軽鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３）の定義のために、例えば、本開示のＣＤ３抗体のＣＤＲの定義のために、Ｋａｂａｔ基準（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、１９９１年、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州））に従って定義され得る。他の実施形態では、ＣＤＲはＩＭＧＴ基準などに従って定義することもできる。例えば、Ｂ７Ｈ３抗体のＣＤＲはＩＭＧＴ基準に従って定義される。

【0069】

「腫瘍抗原」という用語は、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」（腫瘍細胞で産生され、癌と対応する正常組織で差次的に発現されるタンパク質を指す）と「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」（腫瘍細胞で産生され、対応する正常組織と比較して癌で特異的に発現または異常に発現される腫瘍抗原を指す）を含む、腫瘍細胞によって産生される物質、任意にタンパク質を指す。

【0070】

「腫瘍関連抗原」の非限定的な例には、例えば、ＡＦＰ、ＡＬＫ、Ｂ７Ｈ３、ＢＡＧＥタンパク質（ＢＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢＣＭＡ、ＢＩＲＣ５（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）、ＢＩＲＣ７、β－カテニン、ｂｒｃ－ａｂ１、ＢＲＣＡ１、ＢＯＲＩＳ、ＣＡ９、ＣＡ１２５、炭酸脱水酵素ＩＸ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ ＩＸ）、カスパーゼ－８（ｃａｓｐａｓｅ－８）、ＣＡＬＲ、ＣＣＲ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤＫ４、ＣＥＡ、クローディン１８．２（ＣｌａｕｄＢｉｎ １８．２）、サイクリン－Ｂ１、ＣＹＰ１Ｂ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、Ｆｒａ－１、ＦＯＬＲ１、ＧＡＧＥタンパク質（ＧＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＡＧＥ－１、－２など）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧｌｏｂｏＨ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３、ＧＭ３、ｇｐ１００、Ｈｅｒ２、ＨＬＡ／Ｂ－ｒａｆ、ＨＬＡ／ｋ－ｒａｓ、ＨＬＡ／ＭＡＧＥ－Ａ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒα２、ＬＭＰ２、κ－Ｌｉｇｈｔ、ＬｅＹ、ＭＡＧＥタンパク質（ＭＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＡＧＥ－１、－２、－３、－４、－６、－１２など）、ＭＡＲＴ－１、メソテリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、ＭＬ－ＩＡＰ、ＭＯｖ－γ、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ２、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ４、Ｍｕｃ５、Ｍｕｃ１６（ＣＡ－１２５）、ＭＵＭ１、ＮＡ１７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＹ－ＢＲ１、ＮＹ－ＢＲ６２、ＮＹ－ＢＲ８５、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＯＸ４０、ｐ１５、ｐ５３、ＰＡＰ、ＰＡＸ３、ＰＡＸ５、ＰＣＴＡ－１、ＰＬＡＣ１、ＰＲＬＲ、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＭＡ（ＦＯＬＨ１）、Ｂタンパク質（ＲＡＧＥ ｐｒｏｔｅｉｎ）、Ｒａｓ、ＲＧＳ５、Ｒｈｏ、ＲＯＲ１、ＳＡＲＴ－１、ＳＡＲＴ－３、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＧＦ－β、ＴＭＰＲＳＳ２、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ－ｎｏｕｖｅｌｌｅ抗原（Ｔｎ）、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ウロプラキン－３（ｕｒｏｐｌａｋｉｎ－３）および５Ｔ４（トロホブラスト糖タンパク質（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ））が含まれる。

【0071】

「ＣＤ３」は、多分子Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の一部としてＴ細胞に発現する抗原を指し、４つの受容体鎖（ＣＤ３－ε、ＣＤ３－δ、ＣＤ３－ζおよびＣＤ３－γ）のうちの２つによって形成されるホモ二量体またはヘテロ二量体である。ヒトＣＤ３－ε（ｈＣＤ３ε）は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０７７６６．２に記載されるアミノ酸配列を含む。ヒトＣＤ３－δ（ｈＣＤ３δ）は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０４２３４．１に記載されるアミノ酸配列を含む。したがって、「ＣＤ３」という用語は、「マウスＣＤ３」、「サルＣＤ３」などの非ヒト種由来であることを特に示さない限り、ヒトＣＤ３を指す。

【0072】

「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位を指す。エピトープは、通常、固有の空間コンホメーションにおいて、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続または非連続アミノ酸を含む。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻、Ｇ．Ｅ． Ｍｏｒｒｉｓ編（１９９６年）を参照されたい。

【0073】

「特異的に結合する」、「選択的に結合する」、「選択的結合」または「特異的結合」という用語は、抗原上の所定のエピトープへの抗体の結合を指す。典型的には、抗体は、約１０^－８Ｍ未満、例えば、約１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍもしくは１０^－１１Ｍ未満またはそれ以下の親和性（ＫＤ）で結合する。

【0074】

「親和性」という用語は、単一のエピトープにおける抗体と抗原との間の相互作用の強さを指す。各抗原部位内で、抗体「アーム」の可変領域は、弱い非共有結合力を介して複数のアミノ酸部位で抗原と相互作用する；相互作用が大きいほど、親和性が強くなる。本明細書で使用される場合、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂフラグメント）の「高親和性」という用語は、一般に、１Ｅ^－９Ｍ以下のＫＤ（例えば、１Ｅ^－１０Ｍ以下のＫＤ、１Ｅ^－１１Ｍ以下のＫＤ、１Ｅ^－１２Ｍ以下のＫＤ、１Ｅ^－１３Ｍ以下のＫＤ、１Ｅ^－１４Ｍ以下のＫＤなど）を有する抗体または抗原結合フラグメントを指す。

【0075】

「ＫＤ」または「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用についての解離平衡定数を指す。典型的には、抗体は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される約１Ｅ^－８Ｍ未満（例えば、約１Ｅ^－９Ｍ、１Ｅ^－１０Ｍもしくは１Ｅ^－１１Ｍ未満またはそれ以下）の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合する。ＫＤ値が小さいほど、親和性は高くなる。

【0076】

「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を指す。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列と機能的な関係に置かれると「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている。

【0077】

「ベクター」という用語は、１つ以上の標的遺伝子または配列を送達することができ、好ましくは宿主細胞でそれらを発現することができる構築物を意味する。ベクターの例には、限定されるものではないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性凝固剤に関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームにカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、およびプロデューサー細胞などの特定の真核細胞が含まれる。

【0078】

抗体および抗原結合フラグメントを産生および精製するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、第５～８および１５章。例えば、マウスを抗原またはそのフラグメントで免疫化することができ、次いで、当技術分野で周知の従来の方法を使用することによって、得られた抗体を再生、精製、およびアミノ酸配列決定することができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法によって調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、１つ以上のヒトフレームワーク領域を、非ヒト抗体に由来するＣＤＲ領域に組み込むように操作される。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＭＯＥソフトウェアによりＩＭＧＴヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースに対してアラインメントすることによって、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから、またはＴｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ、２００１年、ＩＳＢＮ ０１２４４１３５１から取得することができる。

【0079】

「宿主細胞」という用語は、発現ベクターが導入された細胞を指す。宿主細胞には、細菌、微生物、植物または動物細胞が含まれ得る。容易に形質転換される細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはサルモネラ菌株などの腸内細菌科；枯草菌などのバチルス科；肺炎球菌；連鎖球菌およびインフルエンザ菌のメンバーが含まれる。好適な微生物としては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。好適な動物宿主細胞株には、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３Ｅ細胞などの非限定的な例）、およびＮＳ０細胞が含まれる。

【0080】

操作された抗体または抗原結合フラグメントは、従来の方法によって調製および精製することができる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列をクローニングし、ＧＳ発現ベクターに組み込むことができる。組換え免疫グロブリン発現ベクターは、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトすることができる。代替の先行技術として、哺乳動物発現系は、特にＦｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位において、抗体のグリコシル化をもたらし得る。抗原に特異的に結合する抗体を発現させることにより、安定なクローンが得られた。陽性クローンは、抗体産生のためにバイオリアクター内の無血清培養培地で増殖させることができる。抗体が分泌された培養培地は、従来の技術によって精製することができる。例えば、精製は、調整した緩衝液を含むＰｒｏｔｅｉｎ ＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムで行うことができる。非特異的結合成分は洗い流される。結合した抗体をｐＨ勾配で溶出し、抗体フラグメントをＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出した後、プールする。抗体は、一般的な技術を用いてろ過および濃縮することができる。サイズ排除またはイオン交換などの一般的な技術によって、可溶性混合物および多量体を効果的に除去することができる。得られた生成物は、－７０℃などで直ちに凍結するか、または凍結乾燥する必要がある。

【0081】

「投与」または「処置」は、動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、臓器、または生体液に適用される場合、外因性の医薬品、治療用薬剤、診断用薬剤、または組成物を動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器、または生体液と接触させることを指す。「投与」および「処置」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、および実験方法を指すことができる。細胞の処置（処理）は、試薬を細胞と接触させること、ならびに流体が細胞と接触している場合に試薬をその流体と接触させることを含む。「投与」または「処置」は、例えば、試薬、診断、結合化合物または別の細胞による、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの処置も意味する。「処置」は、ヒト、獣医、または研究対象に適用される場合、治療的処置、予防的または予防的措置（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ｏｒ ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ ｍｅａｓｕｒｅｓ）、研究および診断へのアプリケーションを指す。

【0082】

「処置する」とは、本開示の化合物のいずれかを含む組成物などの治療用薬剤を、該薬剤が既知の治療活性を有する１つ以上の疾患症状を持つ患者に、内部的にまたは外部的に投与することを意味する。典型的には、該薬剤は、任意の臨床的に測定可能な程度でそのような症状の退行を誘導することによって、またはその進行を抑制することによって、処置される患者または集団における１つ以上の疾患症状を軽減するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状を軽減するのに有効な治療用薬剤の量（「治療有効量」とも呼ばれる）は、患者の病状、年齢および体重、ならびに患者において所望の反応を誘発する薬物の能力などのさまざまな因子によって変動し得る。疾患症状が軽減されたかどうかは、その症状の重症度または進行状況を評価するために医師または他の熟練した医療提供者によって通常使用される任意の臨床計測によって評価することができる。本開示の実施形態（例えば、処置方法または製造品）は、すべての患者の標的疾患症状を軽減するのに効果的ではないかもしれないが、スチューデントのｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニー（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）によるＵ検定、クラスカル－ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール－タプストラ（Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ－Ｔｅｒｐｓｔｒａ）検定およびウィルコクソン検定などの当技術分野で既知の任意の統計的検定によって決定される統計的に有意な数の患者において、標的疾患症状を軽減するはずである。

【0083】

「アミノ酸保存的改変」または「アミノ酸保存的置換」は、タンパク質またはポリペプチドの生物学的活性または他の必要な特徴（例えば、抗原に対する親和性および／または特異性）に影響を与えることなく頻繁にその変更を行うことができるように、タンパク質またはポリペプチド中のアミノ酸を類似の特徴（例えば、電荷、側鎖サイズ、疎水性／親水性、主鎖コンホメーションおよび剛性など）を有する他のアミノ酸で置換することを意味する。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が生物学的活性を実質的に変化させないことを認識している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ， Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ出版社、２２４頁（第４版）を参照）。さらに、構造的または機能的に類似したアミノ酸による置換は、生物学的活性を破壊する可能性が低い。例示的な保存的置換は、以下の表「例示的なアミノ酸保存的置換」に記載されている。

【0084】

例示的なアミノ酸保存的置換

【表1】

【0085】

「有効量」または「有効用量」は、任意の１つ以上の有益なまたは所望の結果を得るために必要な薬剤、化合物または医薬組成物の量を指す。予防的適用の場合、有益なまたは所望の結果には、状態の生化学的、組織学的および行動的症状、その合併症、ならびに状態の進行中の中間の病理学的表現型を含む、リスクの排除または低減、重症度の低減、または疾患の発症の遅延が含まれる。治療的適用の場合、有益なまたは所望の結果には、臨床結果、例えば、本開示の標的抗原に関連するさまざまな状態の発生率の低下または状態の１つ以上の症状の改善、状態を処置するために必要な他の薬剤（ａｇｅｎｔｓ）の投与量の減少、別の薬剤（ａｇｅｎｔ）の効果の増強、および／または患者における本開示の標的抗原に関連する状態の進行の遅延が含まれる。

【0086】

「外因性」とは、状況に応じて、生物、細胞またはヒトの外部で生成される物質を指す。「内因性」とは、状況に応じて、細胞、生物または人体で生成される物質を指す。

【0087】

「相同性」および「同一性」は、本明細書では交換可能であり、２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。比較される２つの配列の両方のある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子の各々のある位置がアデニンによって占められている場合、それらの分子はその位置で相同である。２つの配列間の相同性のパーセンテージは、２つの配列によって共有される一致したまたは相同な位置の数を、比較する位置の数で割ってから、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列を最適にアラインメントしたときに、２つの配列中の１０個の位置のうち６個が一致または相同である場合、それらの２つの配列は６０％相同である；２つの配列中の１００個の位置のうち９５個が一致または相同である場合、それらの２つの配列は９５％相同である。一般に、２つの配列がアラインメントされているとき、比較は最大の相同性パーセテージを与えるように行われる。例えば、比較はＢＬＡＳＴアルゴリズムによって行うことができ、当該ＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、各参照配列の全長にわたって各配列間の最大の一致を与えるようにアルゴリズムのパラメータが選択される。

【0088】

以下の参考文献は、配列解析に頻繁に使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関する：ＢＬＡＳＴ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ）：Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０頁；Ｇｉｓｈ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．，（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２頁；Ｍａｄｄｅｎ， ＴＬ ｅｔ ａｌ．，（１９９６年）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ ｅｔ ａｌ．，（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２頁；Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．（１９９７年）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６頁。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴから利用可能なものなどの他の従来のＢＬＡＳＴアルゴリズムも当業者によく知られている。

【0089】

「単離された」とは、指定された分子が、核酸、タンパク質、脂質、炭水化物などの他の生体分子、または細胞残屑および増殖培地などの他の物質を実質的に含まない精製された状態を指す。一般に、「単離された」という用語は、本明細書に記載の化合物の実験的または治療的使用を著しく妨害する量で存在しない限り、これらの材料が完全に存在しないこと、または水、緩衝液もしくは塩が存在しないことを意味するものではない。

【0090】

「任意の」または「任意に」とは、続いて記載した出来事または状況が発生する可能性があるが、必ずしも発生するとは限らないことを意味し、その記載には、出来事または状況が発生する場合と発生しない場合が含まれる。例えば、「任意に、１～３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列を有する抗体重鎖可変領域が存在し得るが、存在する必要はないことを意味する。

【0091】

「医薬組成物」は、本開示による１つ以上の化合物またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグと、他の化学成分（生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤など）とを含む混合物を意味する。医薬組成物は、生物への投与を促進し、活性成分の吸収を促進し、それによって生物学的効果を発揮することを目的とする。

【0092】

「薬学的に許容される担体」という用語は、抗体または抗原結合フラグメントの送達のための製剤での使用に適した任意の不活性物質を指す。担体は、接着防止剤、接着剤、コーティング剤、崩壊剤、充填剤または希釈剤、防腐剤（抗酸化剤、抗菌剤または抗真菌剤など）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などであり得る。適切な薬学的に許容される担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、デキストロース、植物油（例えば、オリーブ油）、生理食塩水、緩衝液、緩衝生理食塩水（ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、および等張剤（例えば、糖、ポリオール、ソルビトールおよび塩化ナトリウム）が含まれる。

【0093】

「癌」、「癌性」または「悪性」という用語は、一般に無秩序な（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を指すか、または記述する。癌の例には、限定されるものではないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ系悪性腫瘍が含まれる。癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｔ細胞／組織球に富む大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（Ｔ－ｃｅｌｌ／ｈｉｓｔｏｃｙｔｅ－ｒｉｃｈ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、多発性骨髄腫、ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｍｃｌ－１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、消化器（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、胃癌、骨癌、ユーイング肉腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞腫瘍、乳癌、結腸癌、肝細胞癌（ＨＣＣ）、腎明細胞癌（ＲＣＣ）、頭頸部癌、肝胆道癌、中枢神経系癌、食道癌、悪性胸膜中皮腫、全身性軽鎖アミロイドーシス、リンパ形質細胞性リンパ腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、精巣癌、および皮膚癌が含まれる。

【0094】

「炎症性障害」は、過剰なまたは無秩序な（ｕｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ）炎症反応が過剰な炎症症状、宿主組織の損傷、または組織機能の喪失をもたらす、任意の疾患、障害または症候群を指す。「炎症性疾患」はまた、白血球または好中球の走化性プーリング（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｐｏｏｌｉｎｇ）によって媒介される病理学的状態を指す。

【0095】

「炎症」は、組織の損傷または破壊によって引き起こされる保護的局所反応を指し、有害物質および損傷組織を破壊、軽減または排除（分離）するのに役立つ。炎症は、白血球または好中球の走化性プーリング（ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ ｐｏｏｌｉｎｇ）と有意に関連している。炎症は、病原性微生物およびウイルス、ならびに、外傷、心筋梗塞後の再灌流、脳卒中、外来抗原に対する免疫応答、および自己免疫応答などの非感染性の原因によって引き起こされ得る。

【0096】

「自己免疫疾患」は、組織の損傷が体液性または細胞性免疫によって媒介される身体自身の成分に対する応答に関連している疾患の群を指す。自己免疫疾患の非限定的な例には、関節リウマチ、乾癬、クローン病、強直性脊椎炎、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、肝炎、心筋炎、シェーグレン症候群、移植拒絶反応による自己免疫性溶血性貧血、小水疱性類天疱瘡（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、グレーブス病、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、重症筋無力症、天疱瘡、悪性貧血などが含まれる。

【0097】

さらに、本開示の別の態様は、標的抗原の免疫検出または決定のための方法、標的抗原の免疫検出または決定のための試薬、標的抗原を発現する細胞の免疫検出または決定のための方法、および標的抗原陽性細胞に関連する疾患を診断するための診断用薬剤であって、標的抗原を特異的に認識および結合する本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを活性成分として含むものに関する。

【0098】

本開示において、標的抗原の量を検出または測定するための方法は、任意の既知の方法であり得る。例えば、それにはイムノアッセイまたは免疫検出法が含まれる。

【0099】

イムノアッセイまたは免疫検出法は、標識された抗原または抗体を用いて、抗体または抗原の量を検出または測定する方法である。イムノアッセイまたは免疫検出法の例には、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノアッセイ、ウェスタンブロッティング、物理化学的方法などが含まれる。

【0100】

標的抗原陽性細胞に関連する上記の疾患は、本開示の抗体または抗体フラグメントを用いて標的抗原発現細胞を検出または測定することによって診断することができる。

【0101】

ポリペプチドを発現する細胞は、既知の免疫検出法によって、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織染色などによって検出することができる。さらに、ＦＭＡＴ８１００ＨＴＳシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）による蛍光抗体染色法などの方法も利用できる。

【0102】

本開示において、標的抗原について検出または測定されるサンプルは、標的抗原を発現する細胞を含むことが可能である限り、特に限定されず、例えば、組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、糞便、組織液または培養培地である。

【0103】

必要な診断方法に応じて、本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを含む診断用薬剤は、抗原抗体反応を行うための試薬または当該反応を検出するための試薬も含み得る。抗原抗体反応を行うための試薬には、緩衝液、塩などが含まれる。検出のための試薬には、イムノアッセイまたは免疫検出法において一般に使用される薬剤、例えば、モノクローナル抗体、その抗体フラグメントまたはコンジュゲートを認識する標識二次抗体、およびその標識に対応する基質が含まれる。

【0104】

本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、上記の明細書に記載されている。好ましい方法および材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同一の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得る。本明細書および特許請求の範囲を通じて、本開示の他の特徴、目的および利点が明らかになるであろう。本明細書および特許請求の範囲において、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、単数形は複数の態様を含む。本明細書で明示的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書で引用されるすべての特許および刊行物は、参照により援用される。以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。これらの例は、いかなる方法でも本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、本開示の範囲は特許請求の範囲によって定義される。

【実施例】

【0105】

抗体の調製およびスクリーニング
モノクローナル抗体を作製する方法は、当該分野で知られている。使用できる方法の１つは、Ｋｏｈｌｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ． （１９７５年） “Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｆｕｓｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｏｆ Ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，” Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７頁に記載された方法またはその改変形態である。典型的には、モノクローナル抗体は、マウスなどの非ヒト種において生成される。一般的に、マウスまたはラットが免疫化のために使用されるが、ウサギおよびアルパカなどの他の動物も使用できる。抗体は、ヒトＣＤ３または他の標的抗原（ヒトＢ７Ｈ３など）を含む免疫原量の細胞、細胞抽出物、またはタンパク質調製物でマウスを免疫化することによって調製される。免疫原は、限定されるものではないが、初代細胞、培養細胞株、癌細胞、核酸または組織であり得る。

【0106】

一実施形態では、標的抗原に結合するモノクローナル抗体は、標的抗原を過剰発現する宿主細胞を免疫原として使用することによって得られる。そのような細胞には、例えば、限定されるものではないが、ヒトＴ細胞、ヒトＢ７Ｈ３を過剰発現する細胞が含まれる。

【0107】

抗体反応をモニターするために、少量の生物学的サンプル（例えば、血液）を動物から採取し、免疫原に対する抗体の力価を試験することができる。脾臓および／またはいくつかの大きなリンパ節を除去して、単一の細胞に解離させることができる。必要に応じて、脾臓細胞は、細胞懸濁液を抗原でコーティングされたプレートまたはウェルに適用することによって、（非特異的付着細胞が除去された後に）選択され得る。膜結合抗原特異的免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートに結合し、残りの懸濁液によって洗い流されることはない。続いて、得られたＢ細胞またはすべての解離した脾臓細胞を、骨髄腫細胞（例えば、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３およびＳａＩｋ研究所（サンディエゴ、カリフォルニア州）のＣｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒから入手可能な細胞）と融合させることができる。脾臓またはリンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することができる。次いで、ハイブリドーマを選択培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、別名「ＨＡＴ培地」と呼ばれる）で培養する。続いて、得られたハイブリドーマを限界希釈によってプレート上に播種し、免疫原に特異的に結合する抗体の産生を、例えば、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）または免疫組織化学（ＩＨＣ）スクリーニングを使用して分析する。続いて、選択されたモノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養フラスコまたは中空繊維リアクター内で）またはｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、マウスの腹水として）で培養する。

【0108】

細胞融合技術の別の代替法として、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞を使用して、本発明のモノクローナル抗体を調製することができる。必要に応じて、ハイブリドーマを増殖させ、サブクローン化し、上清の抗免疫原活性を従来の分析方法（例えば、ＦＡＣＳ、ＩＨＣ、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなど）によって分析する。

【0109】

別の代替法では、標的抗原（ＣＤ３、Ｂ７Ｈ３など）に対するモノクローナル抗体および他の任意の同等の抗体を、当技術分野で知られている任意の方法（例えば、ヒト化、トランスジェニックマウスを用いた完全ヒト抗体の調製、ファージディスプレイ技術など）によって配列決定および組換え的に調製することができる。一実施形態では、標的抗原（例えば、ＣＤ３、Ｂ７Ｈ３）に対するモノクローナル抗体が配列決定され、次いで、そのポリヌクレオチド配列が発現または増殖のためにベクターにクローニングされる。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター中で維持することができ、その後、宿主細胞を増殖させ、後で使用するために凍結することができる。

【0110】

抗ＣＤ３モノクローナル抗体および任意の他の同等の抗体のポリヌクレオチド配列を、「ヒト化」抗体を産生するための遺伝子操作に使用して、該抗体の親和性または他の特性を改善することができる。ヒト化抗体の一般的な原理は、抗体の抗原結合部分の基本配列を保持することを含み、一方、抗体の残りの非ヒト部分は、ヒト抗体配列で置換される。モノクローナル抗体のヒト化には、一般的に４つのステップが使用される。これらのステップは以下のとおりである：（１）元の抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を決定するステップ；（２）ヒト化抗体を設計するステップ、すなわち、ヒト化のプロセスにおいてどの抗体フレームワーク領域が使用されるかを決定するステップ；（３）実際のヒト化方法／技術；および（４）ヒト化抗体のトランスフェクションおよび発現。例えば、米国特許第４８１６５６７号、第５８０７７１５号、第５８６６６９２号、および第６３３１４１５号を参照されたい。

【0111】

１．Ｂ７Ｈ３抗体の調製およびスクリーニング

【0112】

ヒトＰＢＭＣ、脾臓、リンパ節組織を用いてＢ細胞を単離し、ＲＮＡを抽出して天然の一本鎖ファージ抗体のライブラリーを構築した。構築した天然の一本鎖ファージ抗体ライブラリーをパッケージングしてファージ粒子を形成し、これを液相法を用いたパニングによりスクリーニングした。ファージをビオチン化Ｂ７Ｈ３液相と会合させ、次いでストレプトアビジン磁気ビーズによって分離した。ヒトＢ７Ｈ３に結合する陽性配列を得るために、ビオチン化ヒトＢ７Ｈ３をパニングに使用した。いくつかのモノクローナルコロニーを採取し、ファージＥＬＩＳＡ試験のためにファージ一本鎖抗体にパッケージングした。モノクローナルファージのヒトＢ７Ｈ３およびマウスＢ７Ｈ３への結合能力をそれぞれ試験し、スクリーニング後にＢ７Ｈ３抗体を得た。

【0113】

検出に使用したＢ７Ｈ３関連抗原を以下に示す：

【0114】

検出用のヒトＢ７Ｈ３抗原
市販品（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号１１１８８－Ｈ０８Ｈ）
その配列は次のとおりである：

【化1】

【0115】

注：下線部分はＢ７Ｈ３の細胞外領域を表す；イタリックはＨｉｓタグを表す。

【0116】

検出用のサルＢ７Ｈ３抗原
市販品（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号９０８０６－Ｃ０８Ｈ）
その配列は次のとおりである：

【化2】

【0117】

注：下線部分はＢ７Ｈ３の細胞外領域を表す；イタリックはＨｉｓタグを表す。

【0118】

検出用のマウスＢ７Ｈ３抗原
市販品（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号５０９７３－Ｍ０８Ｈ）
その配列は次のとおりである：

【化3】

【0119】

注：下線部分はＢ７Ｈ３の細胞外領域を表す；イタリックはＨｉｓタグを表す。

【0120】

ヒトＢ７Ｈ３全長アミノ酸配列

【化4】

【0121】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２８）を表す；下線部分はＢ７Ｈ３の細胞外領域（細胞外ドメイン：２９－４６６）を表し、２９－１３９はＩｇ様Ｖ型１ドメインを指し、１４５－２３８はＩｇ様Ｃ２型１ドメインを指し、２４３－３５７はＩｇ様Ｖ型２ドメインを指し、３６３－４５６はＩｇ様Ｃ２型２ドメインを指す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：４６７－４８７）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：４８８－５３４）を表す。

【0122】

サルＢ７Ｈ３全長アミノ酸配列

【化5】

【0123】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２８）を表す；下線部分はＢ７Ｈ３の細胞外領域（細胞外ドメイン：２９－４６６）を表し、２９－１３９はＩｇ様Ｖ型１ドメインを指し、１４５－２３８はＩｇ様Ｃ２型１ドメインを指し、２４３－３５７はＩｇ様Ｖ型２ドメインを指し、３６３－４５６はＩｇ様Ｃ２型２ドメインを指す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：４６７－４８７）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：４８８－５３４）を表す。

【0124】

マウスＢ７Ｈ３全長アミノ酸配列

【化6】

【0125】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２８）を表す；下線部分はＢ７Ｈ３の細胞外領域（細胞外ドメイン：２９－２４８）を表す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：２４９－２６９）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：２７０－３１６）を表す。

【0126】

スクリーニングによって得られたＢ７Ｈ３抗体ｈ１７０２の場合、ＩＭＧＴ番号付け基準によって定義された配列およびＣＤＲ配列は次のとおりである：

【化7】

【0127】

注：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で配置され、イタリック体の配列はＦＲを表し、下線付きの配列はＣＤＲを表す。

【0128】

表１ Ｂ７Ｈ３抗体ｈ１７０２の軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列

【表2】

【0129】

二重特異性抗体の性能をさらに改善するために、システイン置換変異がＢ７Ｈ３抗体ｈ１７０２のＶＨおよびＶＬにおいて行われた。変異Ｇ１０３Ｃ（天然アミノ酸配列番号付けによる、配列番号１６の位置１０３）が軽鎖可変領域に導入され、変異Ｇ４４Ｃ（天然アミノ酸配列番号付けによる、配列番号１５の位置４４）が重鎖可変領域に導入され、一対のジスルフィド結合が形成された。該変異後の抗Ｂ７Ｈ３一本鎖抗体の重鎖および軽鎖可変領域は次のとおりである：

【化8】

【0130】

２．ＣＤ３抗体の調製およびスクリーニング
ヒト化ＣＤ３抗体は、変異、ライブラリー構築、ヒト化工学およびスクリーニングなどの方法によって、マウスＣＤ３抗体に基づいて取得することができる。

【0131】

ＣＤ３抗原関連配列情報は以下のとおりである：

【0132】

検出用のヒトＣＤ３抗原
市販品（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号ＣＴ０３８－Ｈ２５０８Ｈ）
その配列は次のとおりである：

【0133】

ヒトＣＤ３ε（Ｈｕｍａｎ ＣＤ３ε）

【化9】

【0134】

注：下線部分はＣＤ３εの細胞外領域（細胞外ドメイン：２３－１２６）を表す；イタリック体はＨｉｓタグを表す。

【0135】

ヒトＣＤ３δ

【化10】

【0136】

注：下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０５）を表す；イタリック体はＦｌａｇタグを表す。

【0137】

検出用のサルＣＤ３抗原
市販品（Ａｃｒｏ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ カタログ番号ＣＤＤ－Ｃ５２Ｗ４－１００ｕｇ）
その配列は次のとおりである：

【0138】

サルＣＤ３ε

【化11】

【0139】

注：下線部分はＣＤ３εの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１１７）を表す；イタリック体はＨｉｓタグを表す。

【0140】

サルＣＤ３δ

【化12】

【0141】

注：下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０５）を表す；イタリック体はＦｌａｇタグを表す。

【0142】

検出用のマウスＣＤ３抗原
市販品（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ カタログ番号ＣＴ０３３－Ｍ２５０８Ｈ）
その配列は次のとおりである：

【0143】

マウスＣＤ３ε

【化13】

【0144】

注：下線部分はＣＤ３εの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０８）を表す；イタリック体はＨｉｓタグを表す。

【0145】

マウスＣＤ３δ

【化14】

【0146】

注：下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０５）を表す；イタリック体はＦｌａｇタグを表す。

【0147】

ヒトＣＤ３ε全長アミノ酸配列

【化15】

【0148】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２８）を表す；下線部分はＣＤ３εの細胞外領域（細胞外ドメイン：２３－１２６）を表し、３２－１１２はＩｇ様ドメインを指す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：１２７－１５２）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：１５３－２０７）を表す。

【0149】

ヒトＣＤ３δ全長アミノ酸配列

【化16】

【0150】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２１）を表す；下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０５）を表す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：１０６－１２６）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：１２７－１７１）を表す。

【0151】

サルＣＤ３ε全長アミノ酸配列

【化17】

【0152】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２１）を表す；下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１１７）を表す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：１１８－１３８）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：１３９－１９８）を表す。

【0153】

サルＣＤ３δ全長アミノ酸配列

【化18】

【0154】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２１）を表す；下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０５）を表す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：１０６－１２６）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：１２７－１７１）を表す。

【0155】

マウスＣＤ３ε全長アミノ酸配列

【化19】

【0156】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２１）を表す；下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０８）を表す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：１０９－１３４）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：１３５－１８９）を表す。

【0157】

マウスＣＤ３δ全長アミノ酸配列

【化20】

【0158】

注：二重下線部分はシグナルペプチド（シグナルペプチド：１－２１）を表す；下線部分はＣＤ３δの細胞外領域（細胞外ドメイン：２２－１０５）を表す；点線は膜貫通領域（膜貫通ドメイン：１０６－１２６）を表す；イタリック体は細胞内領域（細胞質ドメイン：１２７－１７３）を表す。

【0159】

分析および最適化を繰り返した後、一連のヒト化抗ＣＤ３抗体配列が得られた。その重鎖可変領域配列は次のとおりである：

【0160】

表２ ＣＤ３ヒト化抗体の重鎖可変領域配列

【表3】

【0161】

その軽鎖可変領域配列は次のとおりである：

【化21】

【0162】

注：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で配置され、イタリック体の配列はＦＲを表し、下線付きの配列はＣＤＲを表す。本明細書および以下の表３に記載されているＣＤ３ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域ＣＤＲ（ＬＣＤＲ１～ＬＣＤＲ３およびＨＣＤＲ１～ＨＣＤＲ３）の番号および位置は、周知のＫａｂａｔ番号付け基準に準拠している。

【0163】

表３ ＣＤ３抗体のＣＤＲ配列

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【0164】

一本鎖抗体の構築および調製
Ｂ７Ｈ３に対するｓｃＦｖおよびＣＤ３に対するｓｃＦｖは、上記のＢ７Ｈ３抗体に由来する軽鎖および重鎖可変領域を接続することによって、ならびにＣＤ３抗体に由来する軽鎖および重鎖可変領域を接続することによってそれぞれ生成され、ここで、リンカーは当技術分野で周知のものから選択することができる。例示的なリンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＧＧＳ）ｎＧＧＧから選択され得、ここで、ｎは、１、２、３または４であり得る。

【0165】

例示的な抗Ｂ７Ｈ３ ｓｃＦｖは次のとおりである：

【0166】

表４ さまざまな抗Ｂ７Ｈ３一本鎖抗体（ｓｃＦｖｓ）の配列リスト

【表5】

【0167】

例示的な抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは次のとおりである：

【0168】

表５ さまざまな抗ＣＤ３一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の配列リスト

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【0169】

二重特異性抗体の構築および調製
Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体およびＢ７Ｈ３一価二重特異性抗体

【0170】

本開示のいくつかの実施形態では、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体の構造は図１Ａに示され、ここで、抗体のＣ末端はＨｉｓタグに標識されていてもよいし、標識されていなくてもよい。２つのＢ７Ｈ３抗原結合ドメインと１つのＣＤ３抗原結合ドメインは、２つのＦｃ含有鎖の設計された非対称構造に構成され、各Ｂ７Ｈ３抗原結合ドメインは２つの鎖のそれぞれにあり、抗原結合ドメインはすべてｓｃＦｖの形態である。Ｆｃ領域は、抗体に正常な半減期および良好な安定性を維持させることができる。２つの鎖の設計により、ミスマッチの可能性が大幅に減少し、サンプルの均一性および標的抗体の収率が向上する。二重特異性抗体の特定の分子構造（フォーマット）を以下の表６に示す。さらに、本開示のいくつかの実施形態で使用されるＢ７Ｈ３一価二重特異性抗体の分子構造は、抗原結合ドメインを伴わずに、第２のポリペプチド鎖にＦｃドメインのみを有する。そのような構造を図１Ｂに示す。

【0171】

表６ 二重特異性抗体の構造表示

【表7】

【0172】

注：この表では、第１または第２のポリペプチド鎖のカルボキシル末端は、Ｈｉｓタグに標識できることもできないこともある。Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、各抗原結合ドメインとＦｃ領域を接続するためのリンカーを表す。

【0173】

表７ リンカー配列の選択

【表8】

【0174】

ここで、ｎは、１、２、３または４から選択され；好ましくは、Ｌ１におけるｎは、２または３であり、より好ましくは３であり；Ｌ２におけるｎは、１または２であり、より好ましくは１であり；Ｌ３またはＬ５におけるｎは３である。任意に、抗原結合ドメインとＦｃ領域を接続するために使用されるリンカーは、抗体機能ドメインを接続するために使用され得る任意の他のリンカーから選択され得、上記の配列によって定義されるリンカーに限定されない。

【0175】

上記の表６に示されているＦｃ１およびＦｃ２は、同じ配列を有するＦｃであることも、それぞれノブ－Ｆｃおよびホール－Ｆｃ、またはそれぞれホール－Ｆｃおよびノブ－Ｆｃであることもできる。本発明のいくつかの実施形態では、ノブ－Ｆｃおよびホール－Ｆｃの配列は、好ましくは、表８に示されるとおりである：

【0176】

表８ さまざまなＦｃの配列リスト

【表9】

【0177】

上記の軽鎖および重鎖可変領域、一本鎖抗体、および二重特異性抗体について、ＶＨおよび／またはＶＬおよび他の必要なドメインをコードするｃＤＮＡに基づいて、上記のポリペプチドまたは抗原結合フラグメントをコードするＤＮＡを構築することができ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、次いでその発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して、ポリペプチドまたは抗原結合フラグメントを発現させる。

【0178】

例１．二重特異性抗体分子、ポジティブコントロール分子、およびネガティブコントロール分子の調製

【0179】

本開示の二重特異性抗体分子を設計するための方法に従って、特定の二重特異性抗体分子が設計および調製された。該分子の例示的なアミノ酸配列を以下の表９に示す：

【0180】

表９ 二重特異性抗体の配列リスト

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【表10-4】

【表10-5】

【表10-6】

【表10-7】

【表10-8】

【表10-9】

【表10-10】

【表10-11】

【表10-12】

【表10-13】

【0181】

注：上記の表に示されているＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体分子１１３、１１８、１１９、１２６、１２７、１２８、１３１、１３２、１５４、１５５、１５６、１６１、１６２、１７１、１７２および１７７の第２のポリペプチド鎖は、配列番号７１に示されるように、ＶＬ_Ｂ７Ｈ３－Ｌ５－ＶＨ_Ｂ７Ｈ３－Ｌ６－ホール－Ｆｃである；Ｂ７Ｈ３一価二重特異性抗体分子１８１～１８７の第２のポリペプチド鎖は、配列番号７０に示されるように、ホール－Ｆｃである。

【0182】

本発明で使用されるネガティブコントロール（ＮＣ１、ＮＣ２、ＮＣ３）およびポジティブコントロール（ＭＧＤ００９）二重特異性抗体のアミノ酸配列は以下のとおりである：

【0183】

ＮＣ１：Ｂ７Ｈ３結合ドメインは非関連抗体（抗フルオレセイン抗体、抗フルオレセイン）で置換されるが、ＣＤ３結合ドメインは保持される。そのアミノ酸配列についての参考文献は次のとおりである：Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｕｓｅｄ ｔｏ ｆｏｒｍ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＤＡＲＴ ｄｉａｂｏｄｙ ｗａｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ ４－４－２０（Ｇｒｕｂｅｒ． Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９４年））。

【化22】

【0184】

ＮＣ２：Ｂ７Ｈ３結合ドメインは保持され、ＣＤ３結合ドメインのみが非関連抗体である抗フルオレセインで置換される。

【化23】

【0185】

注：配置順序はＶＬ_Ｂ７Ｈ３－リンカー－ＶＨ_Ｂ７Ｈ３－リンカー－Ｆｃである。下線付きの配列はＢ７Ｈ３抗体配列を表し、イタリック体はホール－Ｆｃ配列を表す。

【0186】

ＮＣ３

【化24】

【0187】

ポジティブコントロールＭＧＤ００９は３つの鎖を含み、その調製およびアミノ酸配列は、公開された特許出願ＷＯ２０１７０３０９２６Ａ１に見出すことができる。そのアミノ酸配列は次のとおりである：

【化25-1】

【化25-2】

【化25-3】

【化25-4】

【0188】

例２．ＣＤ３－Ｂ７Ｈ３二重特異性抗体の発現および精製

【0189】

ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に二重特異性抗体を発現するプラスミド（鎖１：鎖２が１：１である）をトランスフェクトし、６日後に発現上清を回収し、高速遠心分離により不純物を除去した。清澄化した上清をＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｅｘｃｅｌカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。Ａ２８０の読み取り値がベースラインに低下するまでカラムをＰＢＳで洗浄し、次いで、カラムをＰＢＳ＋１０ｍＭイミダゾールで洗浄して非特異的に結合した不純物タンパク質を除去し、流出液を収集した。最後に、３００ｍＭイミダゾールを含むＰＢＳ溶液で標的タンパク質を溶出し、溶出ピークを収集した。溶出液サンプルを適切に濃縮した後、５５０緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．５、１３５ｍＭ ＮａＣｌ）で予め平衡化したゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）でさらに精製した。標的ピークを収集した。サンプルを、脱塩カラムまたは限外ろ過遠心チューブを介して５５９緩衝液（１０ｍＭ酢酸、ｐＨ５．５、９％スクロース）に対して平衡化し、分注して－８０℃で保存した。

【0190】

試験例１．ＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより検出されたＢ７Ｈ３およびＣＤ３に対する二重特異性抗体の親和性

【0191】

Ｂ７Ｈ３およびＣＤ３に対する抗体親和性の検出は、捕捉抗体の形で行われた。ＢｓＡｂは、ＣＭ５バイオセンサチップ（カタログ番号ＢＲ－１００５－３０、ＧＥ）またはＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（カタログ番号２９１２７５５６、ＧＥ）バイオセンサチップと抗ヒトＩｇＧ抗体（カタログ番号ＢＲ－１００８－３９、ロット番号１０２６０４１６、ＧＥ）を組み合わせて捕捉され、次いで、各抗原がチップの表面を通って流れた。反応シグナルを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００装置を用いてリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を得た。各実験サイクルの解離が完了した後、チップを洗浄し、再生緩衝液Ｇｌｙｃｉｎｅ１．５（カタログ番号ＢＲ１００３５４、ＧＥ）または３Ｍ ＭｇＣｌ_２（ヒト抗体捕捉キット、カタログ番号ＢＲ１００８３９、ＧＥ）で再生した。ＧＥ Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．０ソフトウェアを使用して、データを（１：１）Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルにフィッティングさせ、親和性値を取得した。

【0192】

ＣＤ３抗体ＶＨの配列が変化した場合、配置順序は不変のままで、ＣＤ３に対する二重特異性抗体の親和性がわずかに変化した。ＨＲＨ‐６およびＨＲＨ‐５配列を用いた場合、ＣＤ３に対する抗体の親和性が最も弱く、ＣＤ３への結合はＢｉａｃｏｒｅでは検出できなかった。

【0193】

表１０ ＡＦＦ３構造を有する二重特異性抗体の抗原結合親和性のＢｉａｃｏｒｅアッセイ結果

【表11】

【0194】

一例として、ＣＤ３抗原結合ドメインの重鎖可変領域としてＨＲＨ３を含む抗体をアッセイのために選択した。選択された抗体の中で、試験抗体１１８、１２７および１３２は、１０^－９および１０^－８ＭのレベルでそれぞれヒトＢ７Ｈ３およびヒトＣＤ３に対する親和性を有し、これらはＭＧＤ００９のレベルに匹敵する。これらの抗体はすべて、サル（ｃｙｎｏ）Ｂ７Ｈ３およびヒトＣＤ３の両方に対して強い交差結合活性を有する。

【0195】

表１１ 異なる順序で配置されたＨＲＨ３を含む二重特異性抗体の抗原結合親和性のＢｉａｃｏｒｅアッセイ結果

【表12】

【0196】

試験例２．細胞レベルでの抗体結合能力の測定

【0197】

二重特異性抗体が細胞表面抗原に結合する能力を、ＦＡＣＳ法によって検出した。Ａ４９８（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ－４４）、ＣＴ２６／ｈＢ７Ｈ３（マウス細胞ＣＴ２６においてヒトＢ７Ｈ３を過剰発現する組換え細胞株（自社で構築）、ＣＴ２６は中国科学院の細胞バンク、ＴＣＭ３７から入手した）、およびＪｕｒｋａｔ組換え細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞はＡＴＣＣ、ＰＴＳ－ＴＩＢ－１５２から入手した；組換え細胞株は、ルシフェラーゼ遺伝子を過剰発現させ、当該遺伝子の上流にＮＦＡＴ応答エレメントを挿入することにより、Ｊｕｒｋａｔ細胞を基に得られた）は、細胞表面の抗原Ｂ７Ｈ３およびＣＤ３への結合のために別々に使用された。

【0198】

ＦＡＣＳ緩衝液（９８％ＰＢＳ、２％ＦＢＳ）を９６ウェルＵ字型ボトムプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、３７９５）に添加して細胞を再懸濁し、段階希釈した抗体を加え、４℃で１時間インキュベートし、そしてプレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次に、ＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４０９３０６、１：５０希釈）を各ウェルに添加し、４℃で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、細胞をＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、最後にＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ）によって蛍光シグナル値を読み取った。

【0199】

その結果、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体１１８、１２７および１３２ならびに（Ｂ７Ｈ３結合ドメインを保持し、ＣＤ３結合ドメインを非関連抗体に置換した）ネガティブコントロール抗体ＮＣ２は、（Ｂ７Ｈ３を高発現する）Ａ４９８細胞株に結合でき（図２Ａ参照）、ＭＧＤ００９よりも強い結合能力を有し、Ｂ７Ｈ３標的に特異的な勾配依存性効果を示すことが示された。（Ｂ７Ｈ３結合ドメインを非関連抗体に置換したが、ＣＤ３結合ドメインを保持した）ネガティブコントロール抗体ＮＣ１は、Ａ４９８に結合しない。同様に、二重特異性抗体１１８、１２７および１３２、ＭＧＤ００９ならびにＮＣ２は、ＣＴ２６／ｈＢ７Ｈ３に強く結合するが（図２Ｂ参照）、Ｂ７Ｈ３を発現しないＣＴ２６細胞株には結合せず（図２Ｃ参照）、このことはまた、試験二重特異性抗体が細胞膜表面上のＢ７Ｈ３標的に特異的に結合することを完全に実証している。抗体１１８、１２７および１３２はＭＧＤ００９とは異なる結合能力を示し、そのような結合能力の差はＡ４９８細胞株よりもＢ７Ｈ３過剰発現ＣＴ２６／ｈＢ７Ｈ３細胞株ではるかに有意であり、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体がＢ７Ｈ３高発現細胞への結合に関してより著しい利点を有し、Ｂ７Ｈ３一価二重特異性抗体ＭＧＤ００９と比較してより優れた安全ウィンドウを有するであろうことを示している。

【0200】

二重特異性抗体１１８、１２７および１３２ならびにネガティブコントロール抗体ＮＣ１は、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞株に結合することができ（図２Ｄ参照）、勾配依存性の効果を示す。これらの抗体の中で、１１８およびＮＣ１はＭＧＤ００９と同等のＪｕｒｋａｔ組換え細胞結合能力を有するが、１２７および１３２はわずかに弱い結合能力を示す。これは、ＣＤ３結合ドメインがＢ７Ｈ３結合ドメインとＦＣの間に位置しており、特定の立体障害がＪｕｒｋａｔ組換え細胞への結合に影響を与える可能性があるためであり得る。ＣＤ３結合ドメインのないネガティブコントロール抗体ＮＣ２はＪｕｒｋａｔ組換え細胞に結合せず、Ｊｕｒｋａｔに対する二重特異性抗体の結合がＣＤ３標的に特異的であることを示している。

【0201】

試験例３．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣ殺傷アッセイ

【0202】

腫瘍細胞に対する二重特異性抗体媒介ＰＢＭＣ殺傷アッセイは、細胞増殖を定量的に検出することによって達成された。細胞においてＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏを用いることにより、生細胞の代謝の指標であり、培養中の細胞数に正比例するＡＴＰの含有量を検出した。

【0203】

Ｂ７Ｈ３の発現レベルが異なる３つの腫瘍細胞株（Ａ４９８、Ｕ８７（中国科学院細胞バンク、ＴＣＨｕ１３８）、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－１３８））およびＢ７Ｈ３を発現しない１つのネガティブコントロール細胞株ＣＨＯＫ１（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）を含む４つの異なる標的細胞（Ｔ）を用いた。エフェクター細胞（Ｅ）は健康なボランティアから得たＰＢＭＣであった。標的細胞を９６ウェルプレートに播種し、一晩培養し、翌日、等量の新たに抽出したＰＢＭＣおよび段階希釈した試験二重特異性抗体（最高最終濃度３００ｎＭであり、１：３に希釈）、またはＰＢＳ（コントロール、エフェクター細胞および標的細胞を含む、抗体を含まない）を各ウェルに添加した。ブランクコントロール（ブランク、培地のみ、細胞または抗体なし）を設定した。Ｅ：Ｔの比率は、Ａ４９８、Ｕ８７、Ｄｅｔｒｏｉｔ５６２およびＣＨＯＫ１細胞について、それぞれ１０：１、５：１、５：１および５：１であった。細胞を４８時間インキュベートし、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－ｇｌｏで検出した（取扱説明書を参照）。シグナル値をマイクロプレートリーダーで読み取り、最終的に抑制率に変換した。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５を使用して、データを処理および分析した。

【0204】

抑制率％（抑制％）＝１００％－（シグナル値_サンプル－シグナル値_ブランク）／（シグナル値_{コントロール}－シグナル値_ブランク）

【0205】

３．１ さまざまな親和性を有する異なるＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体の比較

【0206】

異なる親和性を有するＣＤ３ ｓｃＦｖを使用して、異なるｉｎ ｖｉｔｒｏ標的細胞殺傷効果を示すさまざまな二重特異性抗体を構築した（図３Ａおよび図３Ｂを参照）。ＨＲＨ５およびＨＲＨ６を含む二重特異性抗体１５５、１５６、１８５および１８６はそれぞれ、最も弱い殺傷効果を示し、これは、Ｂｉａｃｏｒｅ親和性アッセイの結果と一致している。

【0207】

３．２ Ｂ７Ｈ３一価および二価二重特異性抗体の比較

【0208】

構造ＡＦＦ３（１３１および１７７をこの構造の例示的な抗体として使用した）およびＡＦ３（１８１および１８７をこの構造の例示的な抗体として使用した）の比較は、異なる抗ＣＤ３抗体重鎖可変領域を含むｓｃＦｖから構築された二重特異性抗体の実例として行われた（図４Ａおよび図４Ｂを参照）。ＣＤ３－Ｂ７Ｈ３のＡＦＦ３構造を有するＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体は、ＡＦ３構造を有するＢ７Ｈ３一価二重特異性抗体と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞殺傷活性を大幅に増強している。このことは、異なるＣＤ３ ＶＨを含むすべての二重特異性抗体に適用される。

【0209】

表１２ 抗体配置順序

【表13】

【0210】

３．３ 腫瘍殺傷活性に対するＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体の異なる分子構造の効果

【0211】

同じ抗原結合ドメイン成分を共有するが配置順序が異なるＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体分子１６１、１６２、１１３および１２６（図５Ａ参照）ならびに１１３および１４３（図５Ｂ参照）を、腫瘍細胞殺傷活性についてパラレルに試験した。上記のすべての分子は、ＣＤ３抗原結合ドメインの重鎖可変領域としてＨＲＨ２を有する。結果は、異なる配置順序のＢ７Ｈ３二価特異的抗体分子がすべて、Ａ４９８細胞に対して有意な殺傷効果を有することを示す。これらの抗体の中で、１６１、１６２、１１３および１２６は、ＭＧＤ００９と同等またはわずかに優れた殺傷活性を有する。異なる構造の配置順序は、Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体の腫瘍細胞殺傷活性にほとんど影響を与えない。

【0212】

表１３ 異なる試験抗体の構造の比較

【表14】

【0213】

３．４ 二重特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３の発現レベルが異なる腫瘍細胞株に対して殺傷効果を有する

【0214】

３つの試験二重特異性抗体１１８、１２７および１３２を、Ａ４９８、Ｕ８７およびＤｅｔｒｏｉｔ５６２腫瘍細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷効果について試験した。殺傷効果はＢ７Ｈ３の発現レベルと正の相関がある。例えば、１１８は、Ａ４９８、Ｕ８７およびＤｅｔｒｏｉｔ５６２に対して、それぞれ０．３４、２．４および１４．５ｎＭのＥＣ５０を有する。３つの抗体分子すべてがこの傾向を示す。二重特異性抗体はいずれもＢ７Ｈ３－ネガティブコントロール細胞株ＣＨＯＫ１に対して殺傷効果を有さず、ネガティブコントロール二重特異性抗体ＮＣ１は、標的細胞株のいずれに対しても殺傷効果を有さなかった。合わせて、これらの２つの側面は、細胞殺傷が標的特異的な殺傷であり、二重特異性抗体によってエフェクター細胞をＢ７Ｈ３陽性標的細胞に向けてリダイレクトする（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ）必要があることを示している。

【0215】

表１４ 異なる標的細胞株の殺傷に向けた試験二重特異性抗体によって媒介されるＰＢＭＣのリダイレクト

【表15】

【0216】

３．５ Ａ４９８細胞に対する異なる構造を有する二重特異性抗体の殺傷効果の比較

【0217】

３つの試験二重特異性抗体１２７、２０１および２０２を、Ａ４９８腫瘍細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷効果について試験した。結果は、３つの構造を有する二重特異性抗体がすべて腫瘍殺傷活性を有し、その中で、二重特異性抗体１２７が２０１または２０２よりも優れた殺傷活性を有することを示す（図５Ｃ参照）。

【0218】

試験例４．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞活性化アッセイ

【0219】

Ｔ細胞上の二重特異性抗体の活性化機能を検出するために、Ｊｕｒｋａｔの活性化後のＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を、Ａ４９８腫瘍細胞株の存在下または非存在下で、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞株を用いて測定した。

【0220】

Ａ４９８細胞を９６ウェル細胞培養プレートに播種し（１×１０^５／ｍｌ、１００μＬ／ウェル）、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内に２０～２４時間置いた。翌日、細胞培養上清を除去した後、９０μｌのＪｕｒｋａｔ組換え細胞懸濁液（５．５×１０^５／ｍｌ）および１０μｌの段階希釈した試験二重特異性抗体（最高最終濃度５００ｎＭ、１：３勾配希釈）を各ウェルに添加し、ネガティブコントロール（Ａ４９８およびＪｕｒｋａｔ組換え細胞を有する、抗体なし）およびブランクコントロール（培地を有する、細胞または抗体なし）を設定し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで５～６時間インキュベートした。Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞の非腫瘍細胞特異的活性化のために、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞および試験抗体をブランク９６ウェル培養プレートに直接添加した。共培養後、１００μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ試薬（Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ２６２０）を各ウェルに添加し、室温で５～１０分間置き、化学発光シグナル値を多機能マイクロプレートで読み取った。蛍光増加倍数（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）を、次式に従って算出した：

【0221】

増加倍数（ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）＝（シグナル_サンプル－シグナル_ブランク）／（シグナル_{コントロール}－シグナル_ブランク）

【0222】

４．１ 配置順序が異なるＢ７Ｈ３二価分子はすべてＴ細胞を効果的に活性化することができる

【0223】

Ｂ７Ｈ３二価二重特異性抗体１１８、１２７および１３２を、Ａ４９８の存在下または非存在下でのＪｕｒｋａｔ組換え細胞の活性化について試験して、Ｔ細胞に対する二重特異性抗体の特異的および非特異的活性化効果を検証した。結果は、異なる配置順序を有するＢ７Ｈ３二価二重特異性抗体１１８、１２７および１３２が、腫瘍細胞株Ａ４９８の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞株を効果的に活性化し、ルシフェラーゼの発現を有意に誘導できることを示す（図６Ａ参照）。結果は、ネガティブコントロール抗体ＮＣ１はルシフェラーゼの発現を誘導できないので、Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞の活性化はＢ７Ｈ３標的に特異的であることを示している。Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞の活性化には、ＣＤ３を発現するＪｕｒｋａｔ組換え細胞とＢ７Ｈ３を発現する腫瘍細胞の両方を、二重特異性抗体を介して共動員（ｃｏ－ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）する必要がある。Ｊｕｒｋａｔ組換え細胞がＡ４９８細胞の非存在下で単独で存在する場合（図６Ｂ参照）、ルシフェラーゼの発現は非常に低く、いくつかの最も高い抗体濃度ポイントでわずかな弱いシグナルのみが検出され得る。

【0224】

表１５ 抗体配置順序

【表16】

【0225】

４．２ Ｂ７Ｈ３一価および二価二重特異性抗体の比較

【0226】

二価ＣＤ３－Ｂ７Ｈ３二重特異性抗体は、Ｂ７Ｈ３一価二重特異性抗体と比較して有意に増強された標的特異的Ｔ細胞活性化を有し、これは、試験例３に示されるようなＢ７Ｈ３一価分子と比較して増強されたＢ７Ｈ３二価分子のｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍殺傷能力と一致している。一方、非標的特異的Ｔ細胞活性化は変化しないままである。したがって、Ｂ７Ｈ３二価分子（１３１）はＢ７Ｈ３一価分子（１８１）よりも強い効果を有するが（図７Ａ参照）、Ｔ細胞の非特異的活性化によって引き起こされる副作用は増強されない（図７Ｂ参照）。

【0227】

表１６ 抗体構造

【表17】

【0228】

試験例５．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ サイトカイン分泌アッセイ

【0229】

エフェクター細胞は、二重特異性抗体の媒介下で標的細胞に対してリダイレクトされ、標的細胞を殺傷しながらサイトカインを放出する。サイトカイン分泌は、細胞培養上清中のサイトカイン（ＩＬ２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαを含む）の含有量をＥＬＩＳＡで定量的に検出することによって分析された。

【0230】

実験デザインおよび使用した抗体は、試験例４に記載したものと同じであった。細胞培養上清をｉｎ ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイの最後に回収し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３７９５）に添加し、後で使用するために－２０℃で保存した。ＥＬＩＳＡアッセイには、凍結培養上清を取り出し、室温で解凍し、３５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清をＥＬＩＳＡアッセイ用に回収した。ＥＬＩＳＡの手順は、キット（ヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット、ヒトＴＮＦ－α ＥＬＩＳＡキット、Ｎｅｏｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号ＥＨＣ００３．９６、ＥＨＣ１０２ｇ．９６、ＥＨＣ１０３ａ．９６）に含まれている説明書に従った。

【0231】

結果は、試験二重特異性抗体がＰＢＭＣおよびＢ７Ｈ３陽性標的細胞Ａ４９８の両方の存在下でＩＬ２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαを分泌するようにＰＢＭＣを効果的に誘導でき（図８Ａ～８Ｃ参照）、これらの抗体の中で、ＭＧＤ００９および１１８が最も高いサイトカインの分泌レベルを誘導し、１２７および１３２がそれに続き、ネガティブコントロール抗体ＮＣ１が検出感度の範囲を超えるレベルでサイトカインの分泌を誘導することを示す。ＭＧＤ００９は、ＰＢＭＣおよびＢ７Ｈ３陰性細胞ＣＨＯＫ１の両方の存在下、３つの最も高い濃度ポイントでＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出を有意に誘導できるが（図９Ａ－図９Ｃを参照）、３つの試験二重特異性抗体１１８、１２７および１３２はＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出を誘導できず、非標的特異的サイトカインの分泌に関して、３つの試験二重特異性抗体がＭＧＤ００９よりも優れた安全性を有することを示している。

【0232】

試験例６．ヒトＰＢＭＣで再構築したマウスＡ４９８モデルにおける薬力学試験

【0233】

この試験例では、マウスにおける本発明の試験ＣＤ３－Ｂ７Ｈ３二重特異性抗体の抗腫瘍効果を、ヒトＰＢＭＣで再構築されたＮＯＧマウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）Ａ４９８モデル（ＡＴＣＣ）を用いて評価した。

【0234】

５×１０^６細胞／マウス／１００μｌ（５０％マトリゲルを含む）のＡ４９８細胞を、ＮＯＧマウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍保有マウスの腫瘍体積が約１３０～１５０ｍｍ^３に達したとき、マウスをランダムに群化し、１群あたり５～６匹の動物とし、群化の日を実験の０日と定義した。０日目または１日目に、２人のボランティアから新たに抽出したＰＢＭＣを１：１の比率で混合し、５×１０^６細胞／１００μｌをＮＯＧマウスに腹腔内注射し、各抗体を週２回、合計６回腹腔内注射した。腫瘍体積および動物の体重を週に２回モニターし、データを記録した。ビヒクルは、抗体の代わりにＰＢＳ緩衝液を投与したネガティブコントロール群を意味する。

【0235】

抗体１１８および１１９は、低用量で一定の抗腫瘍効果を示し（図１０Ａ）、用量依存的な効果を示した。抗体１１８は、実験終了時（２０日目）に、０．０１ｍｐｋおよび０．０３ｍｐｋの用量でそれぞれ２２．１７％および６０．３９％の腫瘍抑制率（ＴＧＩ）を示した。

【0236】

抗体１１３は１４日目に一定の抗腫瘍効果を示し、０．６ｍｐｋおよび０．３ｍｐｋ用量群の腫瘍抑制率はそれぞれ７０．０５％（ｐ＜０．０５）および６０．７８％（ｐ＜０．０５）に達した（図１０Ｂ）。２０日目に、抗腫瘍効果は用量依存的に増加し続け、抗腫瘍率はそれぞれ１００％（ｐ＜０．００１）超および７７．９２％（ｐ＜０．０５）である。

【0237】

０．１２ｍｐｋおよび０．３６ｍｐｋの投与条件下（図１０Ｃ）では、抗体１１８は、１２日目に０．１２ｍｐｋおよび０．３６ｍｐｋの用量でそれぞれ３９．１８％および５７．４４％（ｐ＜０．００１）の腫瘍抑制率を示し、腫瘍抑制率は２１日目にそれぞれ８１．７２％（ｐ＜０．０１）および１００％超（ｐ＜０．００１）に達した。結果の中で、０．３６ｍｐｋの用量で、１匹のマウスは完全な腫瘍退縮さえ示した（１／６）。

【0238】

０．３６ｍｐｋの用量（図１０Ｄ）では、抗体１２６は２１日目に４７．７８％の腫瘍抑制率を示した（ｐ＜０．０１）。抗体１２８は１９日目に有意な抗腫瘍効果を示した（ＴＧＩ＝５６．３７％）。２１日目までに、腫瘍抑制率は６９．２８％に増加した（ｐ＜０．００１）。抗体１２７は１２日目に７６．２０％の腫瘍抑制率を示し（ｐ＜０．００１）、２１日目に腫瘍抑制効果は増加し続け、腫瘍抑制率は１００％超である（ｐ＜０．００１）。５匹中３匹では、群化の日と比較して腫瘍体積が退縮し、他の２匹の腫瘍体積は完全に退縮した。

【0239】

抗体１２７の抗腫瘍活性は別の実験で繰り返された（図１０Ｅ）。腫瘍抑制率は１４日目に９０．６％に達し（ｐ＜０．００１）、１７日目に９５．８０％に増加した（ｐ＜０．００１）。１２７は低用量（０．１２ｍｐｋ）および低投与頻度（週１回、１２７－０．３６ｍｐｋ－ｑｗ）でも有効であり、１７日目の腫瘍抑制率はそれぞれ５１．３７％（ｐ＜０．００１）および９６．２０％（ｐ＜０．００１）に達した。

【0240】

試験例７．ｈＣＤ３ ＫＩマウスモデルにおける薬力学試験

【0241】

この実験では、Ｂａｌｂ／ｃ－ｈＣＤ３マウスにＣＴ２６－ｈＢ７Ｈ３腫瘍細胞株（ＣＴ２６細胞は中国科学院の細胞バンク、ＴＣＭ３７に由来し、ＣＴ２６－ｈＢ７Ｈ３細胞はｈＢ７Ｈ３を発現させることによって得られた）を皮下接種して、マウスの腫瘍成長に対する本発明のＣＤ３－Ｂ７Ｈ３二重特異性抗体の抑制効果を評価した。

【0242】

雌のｈＣＤ３Ｅ Ｂａｌｂ／ｃトランスジェニックマウスは、南京大学のモデル動物研究センター（証明書番号２０１８０１３７４／５／６、ライセンスＳＣＸＫ（江蘇）２０１５－０００１）から購入した。

【0243】

８×１０^５細胞／マウス／１００μｌのＣＴ２６－ｈＢ７Ｈ３細胞を、ｈＣＤ３マウスの右側腹部に皮下接種した。腫瘍保有マウスの腫瘍体積が約８０～１２０ｍｍ^３に達したとき、マウスをランダムに異なる群に分け、１群あたり７匹のマウスとした。群化の日を実験の０日目と定義し、各抗体の腹腔内注射を週２回、計５回行った。腫瘍体積および動物の体重を週に２回モニターし、データを記録した。ビヒクルは、抗体の代わりにＰＢＳ緩衝液を投与したネガティブコントロール群を意味する。

【0244】

結果は、抗体１１８が１ｍｐｋの用量での最初の投与後に強い効果を示し（図１１Ａ）、腫瘍抑制率が１３日目に３８．３４％に達した（ｐ＜０．０５）ことを示す。

【0245】

抗体１３２は３．６ｍｐｋの用量で腫瘍成長を抑制する傾向を有し（図１１Ｂ）、腫瘍抑制率は１３日目に２６．３５％に達した。

【0246】

試験例８．ラットにおけるＰＫ実験

【0247】

この実験では、ＣＤ３－Ｂ７Ｈ３二重特異性抗体をＳＤラットの尾静脈に注射し、さまざまな時点でのラット血清中の抗体濃度を検出して、ＳＤラットにおけるＣＤ３－Ｂ７Ｈ３二重特異性抗体の代謝を評価した。

【0248】

試験薬をラットの尾静脈に３ｍｇ／ｋｇで注射し、投与量は５ｍＬ／ｋｇであった。採血をさまざまな時点、すなわち、投与前と投与後５分、８時間、１日、２日、４日、７日、１０日、１４日、２１日、２８日に行った。血清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡ法により検出した。Ｂ７Ｈ３抗原（１μｇ／ｍＬ）またはＣＤ３抗原（１μｇ／ｍＬ）をプレーティングし、抗ヒトＦｃ－ＨＲＰ（ａｂｃａｍ、ａｂ９８６２４）を二次抗体として使用する２つの異なるＥＬＩＳＡ法を用いた。試験薬の薬物動態パラメータはＷｉｎｎｏｌｉｎソフトウェアを使用して算出され、得られた主な薬物動態パラメータは表１７に示されている。

【0249】

抗体１１８、１２７および１３２は、Ｂ７Ｈ３抗原結合領域に関して４．９～８．１日の半減期を有し、これはＭＧＤ００９の半減期よりもわずかに長く、通常のＩｇＧ抗体のレベルに達し、ＣＤ３抗原結合領域に関して３．２～５．６日の半減期を有する。ここで、抗体１１８におけるＢ７Ｈ３およびＣＤ３の２つの異なる抗原結合領域の速度論的パラメータはそれほど異ならないため、ｉｎ ｖｉｖｏでの分子の完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）は良好であり、半減期はそれぞれ４．９日および４．４日である。抗体１２７は、Ｂ７Ｈ３およびＣＤ３の２つの異なる抗原結合領域に関して、それぞれ４．９日および３．２日の半減期を有する。曝露量（ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｍｏｕｎｔ）およびクリアランス率の違いは明らかで、ＣＤ３部分はＢ７Ｈ３部分より劣る。これは、ＣＤ３部分が分子構造の内部にあるため、分子の破壊ではなく、ＣＤ３の結合能力の弱化が原因である可能性が高い。抗体１３２は、抗体１２７の分子配列に基づいて、一対のジスルフィド結合をＢ７Ｈ３ ｓｃＦｖに組み込むことによって得られた。この変更により、分子の半減期が大幅に増加し（６５～７５％）、曝露量（ｅｘｐｏｓｕｒｅ ａｍｏｕｎｔ）およびクリアランス率も大幅に向上する。

【0250】

表１７ ラットにおける主な薬物動態パラメータ

【表18】

【図1A】

【図1B】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】