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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-28
(45)【発行日】2024-04-05
(54)【発明の名称】糖尿病を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C07C 321/04 20060101AFI20240329BHJP
A61K 33/242 20190101ALI20240329BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240329BHJP
C07C 323/12 20060101ALI20240329BHJP
C07C 323/18 20060101ALI20240329BHJP
C07C 323/52 20060101ALI20240329BHJP
C07C 323/58 20060101ALI20240329BHJP
C07C 323/59 20060101ALI20240329BHJP
C07F 1/12 20060101ALI20240329BHJP
【ＦＩ】
C07C321/04
A61K33/242
A61P3/10
C07C323/12
C07C323/18
C07C323/52
C07C323/58
C07C323/59
C07F1/12
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022523035
(86)(22)【出願日】2020-10-15
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-12-22
(86)【国際出願番号】 CN2020121079
(87)【国際公開番号】W WO2021073563
(87)【国際公開日】2021-04-22
【審査請求日】2022-06-16
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2019/111962
(32)【優先日】2019-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】519000526
【氏名又は名称】深▲セン▼深見医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＥＮＺＨＥＮ ＰＲＯＦＯＵＮＤ ＶＩＥＷ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ ３３１１， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ９Ａ，Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ＩＩ，Ｓｈｅｎｚｈｅｎ Ｂａｙ Ｅｃｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐａｒｋ， Ｎｏ． ３６０９， Ｂａｉｓｈｉ Ｒｏａｄ， Ｈｉｇｈ－ｔｅｃｈ Ｚｏｎｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ， Ｙｕｅｈａｉ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｎａｎｓｈａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｈｅｎｚｈｅｎ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５１８０００ （ＣＮ）
(74)【代理人】
【識別番号】110001139
【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100130328
【弁理士】
【氏名又は名称】奥野 彰彦
(74)【代理人】
【識別番号】100130672
【弁理士】
【氏名又は名称】伊藤 寛之
(72)【発明者】
【氏名】スゥン、タオレイ
【審査官】鳥居 福代
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１８／０２４１１１（ＷＯ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０２１６５８８（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１１／００５４２０２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１８／０９５４２９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】ZHANG, Y. et al.，Gold nanoclusters for controlled insulin release and glucose regulation in diabetes，Nanoscale，2019年03月，No.11，pp.6471-6479
【文献】CHEN, H. et al.，Gold nanoparticles improve metabolic profile of mice fed a high-fat diet，Journal of Nanobiotechnology，2018年，16:11，12 pages
【文献】BARATHMANIKANTH, S. et al.，Anti-oxidant effect of gold nanoparticles restrains hyperglycemic conditions in diabetic mice，Journal of Nanobiotechnology，2010年，8:16，15 pages
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｃ
Ｃ０７Ｆ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
リガンド修飾金クラスター（ＡｕＣｓ）の製造方法であって、ＨＡｕＣｌ４溶液を提供することと、
前記ＨＡｕＣｌ４溶液に、第１のリガンドとＨＡｕＣｌ４とのモル比が１：１～２０：１の範囲となるように、順次に酸性溶液と第１のリガンドの溶液を加えて第１の混合溶液とすることと、
前記第１の混合溶液に、ＮａＢＨ４とＨＡｕＣｌ４とのモル比が１：１～１０：１の範囲となるように、ＮａＢＨ４溶液を加えて第２の混合溶液とすることと、
前記第２の混合溶液に非プロトン性極性溶媒を加えて反応を停止し、第３の混合溶液を得ることと、
前記第３の混合溶液を遠心して、固形沈殿物を回収することと、
第２のリガンドとＨＡｕＣｌ４とのモル比が１：１～２０：１の範囲となるように、回収された固形沈殿物を前記第２のリガンドの溶液に溶解して第４の混合溶液を得て、そして第４の混合溶液を一定時間維持することと、
前記第４の混合溶液を遠心して上澄み液を得ることと、
前記上澄み液を所定のカットオフ分子サイズを有する透析バッグで透析することと、
を含み、
前記金クラスターは、直径が３ｎｍ未満である金コアと、前記金コアを修飾するリガンドと、を含み、
前記第１のリガンド及び前記第２のリガンドは、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、方法。
【請求項2】
前記ＨＡｕＣｌ４溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジメチルスルホキシド、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる中性又は酸性溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記酸性溶液は、塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる酸から構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第１のリガンドの溶液及び前記第２のリガンドの溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＮａＢＨ４溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記非プロトン性極性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰ）、クロロホルム、四塩化炭素、ピリジン、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記第４の混合溶液を維持する時間は、３～２４時間の範囲にある、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
透析された上澄み液を凍結乾燥してＡｕＣｓ粉末を得ること、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
対象において糖尿病を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、金クラスター（ＡｕＣ）を含み、
前記ＡｕＣが、
金コアと
前記金コアを修飾するリガンド（ただし、リガンドにインスリンを含む場合を除く。）と、
を含み、
前記金コアは、直径が３ｎｍ未満であり、
前記リガンドは、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる、医薬組成物。
【請求項10】
前記金コアは、直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある、請求項９に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、糖尿病の技術分野に関し、特に糖尿病を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0002】
糖尿病（ＤＭとも呼ばれる）は、高血糖状態が長期にわたり持続することを特徴とし、代謝障害を伴う疾患群であり、世界中で何億人もの人々に影響を及ぼす。高血糖の症状には、排尿の増加（多尿症）、喉の渇き（多飲症）、空腹感（多食症）などが含まれる。治療せずに放置すると、糖尿病は、急性及び慢性の合併症を引き起こす。急性合併症としては、糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧高血糖状態、又は死亡があります。慢性合併症としては、心血管疾患、脳卒中、慢性腎臓病、足部潰瘍、及び眼の損傷があります。
【0003】
糖尿病の原因は、インスリン不足（すなわち、膵臓がインスリンをまったく産生しない、又は、産生した量が不十分である）又はインスリン抵抗性（すなわち、体内の細胞でのインスリンに対する反応が正常ではない）である。糖尿病は主に１型糖尿病、２型糖尿病及び妊娠糖尿病の３つのタイプに分類される。１型糖尿病は、β細胞の損失により膵臓が十分なインスリンを産生できなかったことを原因とする。１型糖尿病の治療法は、インスリン注射である。２型糖尿病は、インスリン抵抗性から始まり、細胞でのインスリン対する反応が正常ではない病気である。２型糖尿病は、インスリンの使用の有無にかかわらず、医薬で治療することが可能である。病気の進行は、インスリン不足を引き起こす可能性がある。妊娠糖尿病は、３番目の主要な形態であり、糖尿病の既往歴のない妊婦が高血糖になると妊娠糖尿病を発症する。
【0004】
利用可能な医薬は、血糖値を下げるのに役立つが、糖尿病を治療するための新しい医薬と方法が依然として強く求められている。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、糖尿病を治療するための医薬組成物及び方法を提供することを目的とする。
【0006】
特定の実施形態では、リガンド修飾金クラスター（ＡｕＣ）の製造方法は、ＨＡｕＣｌ４溶液を提供することと；順次に、第１のリガンドとＨＡｕＣｌ４とのモル比が１：１～２０：１の範囲となるように、酸性溶液と第１のリガンドの溶液をＨＡｕＣｌ４溶液に加えて第１の混合溶液とすることと；ＮａＢＨ４とＨＡｕＣｌ４とのモル比が１：１～１０：１の範囲となるように、ＮａＢＨ４溶液を第１の混合溶液に加えて第２の混合溶液とすることと；非プロトン性極性溶媒を第２の混合溶液に加えて反応を停止し、第３の混合溶液を得ることと；第３の混合溶液を遠心して下部の固形沈殿物を回収することと；第２のリガンドとＨＡｕＣｌ４とのモル比が１：１～２０：１の範囲となるように、回収された下部の固形沈殿物を第２のリガンドの溶液に溶解して第４の混合溶液を得て、そして第４の混合溶液を一定時間維持することと；第４の混合溶液を遠心して上澄み液を得ることと；上澄み液を所定のカットオフ分子サイズを有する透析バッグで透析することと、を含む。
【0007】
かかる方法の特定の実施形態では、ＨＡｕＣｌ４溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジメチルスルホキシド、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる中性又は酸性溶媒を含む。
【0008】
かかる方法の特定の実施形態では、酸性溶液は、塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる酸から構成される。
【0009】
かかる方法の特定の実施形態では、第１のリガンド及び第２のリガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン及びその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとこれらの誘導体；その他のチオール含有化合物；及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる。
【0010】
かかる方法の特定の実施形態では、第１のリガンドの溶液及び第２のリガンドの溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む。
【0011】
かかる方法の特定の実施形態では、ＮａＢＨ４溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む。
【0012】
かかる方法の特定の実施形態では、非プロトン性極性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰ）、クロロホルム、四塩化炭素、ピリジン、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる。
【0013】
かかる方法の特定の実施形態では、第４の混合溶液を維持する時間は、３～２４時間の範囲にある。
【0014】
特定の実施形態では、前記方法は、さらに、透析された上澄み液を凍結乾燥してＡｕＣ粉末を得ること、を含む。
【0015】
特定の実施形態では、本発明は、前記本発明の方法により製造される、ＡｕＣ粉末を提供する。
【0016】
本発明の特定の実施形態は、対象において糖尿病を治療するための医薬を製造するために、金コアと、前記金コアを修飾するリガンドとを含む、金クラスター（ＡｕＣ）を使用する。
【0017】
かかる使用の特定の実施形態では、金コアは、直径が３ｎｍ未満である。特定の実施形態では、金コアは、直径が０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0018】
かかる使用の特定の実施形態では、リガンドは、Ｌ－システインとその誘導体、Ｄ－システインとその誘導体、システイン含有オリゴペプチドとこれらの誘導体、及びその他のチオール含有化合物からなる群より選ばれる一つである。
【0019】
かかる使用の特定の実施形態では、Ｌ－システインとその誘導体は、Ｌ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれ、及び、Ｄ－システインとその誘導体は、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）からなる群より選ばれる。
【0020】
かかる使用の特定の実施形態では、システイン含有オリゴペプチドとこれらの誘導体は、システイン含有ジペプチド、システイン含有トリペプチド又はシステイン含有テトラペプチドである。
【0021】
かかる使用の特定の実施形態では、システイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－ヒスチジン－Ｌ－システインジペプチド（ＨＣ）、及びＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）からなる群より選ばれる。
【0022】
かかる使用の特定の実施形態では、システイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－リシン－Ｌ－システイン－Ｌ－プロリントリペプチド（ＫＣＰ）、及びＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）からなる群より選ばれる。
【0023】
かかる使用の特定の実施形態では、システイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）、及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）からなる群より選ばれる。
【0024】
かかる使用の特定の実施形態では、その他のチオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン（Ｄ－３－trolovol）、Ｎ－（２－メルカプトプロピオニル）－グリシン、及びドデシルメルカプタンからなる群より選ばれる。
【0025】
本発明の目的及び利点は、添付の図面に関連するその好ましい実施形態の以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【0026】
次に、本発明による好ましい実施形態を、同様の参照番号が同様の要素を示す図を参照して説明する。
【0027】
【図1】異なる粒子サイズを有するリガンドＬ－ＮＩＢＣ修飾金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰ）の紫外線可視光（ＵＶ）スペクトル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像及び粒子サイズ分布図を示す。
【0028】
【図2】異なる粒子サイズを有するリガンドＬ－ＮＩＢＣ修飾金クラスター（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）の紫外線可視光（ＵＶ）スペクトル、ＴＥＭ画像及び粒子サイズ分布図を示す。
【0029】
【図3】異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの赤外線スペクトルを示す。
【0030】
【図4】リガンドＣＲ修飾金クラスター（ＣＲ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、及び粒子サイズ分布図を示す。
【0031】
【図5】リガンドＲＣ修飾金クラスター（ＲＣ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、及び粒子サイズ分布図を示す。
【0032】
【図6】リガンド１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン（すなわち、Ｃａｐ）修飾金クラスター（Ｃａｐ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、及び粒子サイズ分布図を示す。
【0033】
【図7】リガンドＧＳＨ修飾金クラスター（ＧＳＨ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、及び粒子サイズ分布図を示す。
【0034】
【図8】リガンドＤ－ＮＩＢＣ修飾金クラスター（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）のＵＶ、赤外線、ＴＥＭ、及び粒子サイズ分布図を示す。
【0035】
【図9】膵臓のＨＥ染色結果を示す。（ａ）陰性対照群；異常な変化なし；（ｂ）モデル対照群；膵島数、膵島体積及び膵島細胞数、及び明らかな膵島へのリンパ球浸潤の重度な減少；（ｃ）陽性対照群；膵島数、膵島体積及び膵島細胞数の中等度な減少、及び明らかな膵島へのリンパ球浸潤；（ｄ）サンプル群；膵島数、膵島体積及び膵島細胞数の明らかな減少なし、及び膵島へのリンパ球浸潤なし。
【0036】
【図10】膵臓におけるインスリン免疫組織化学の結果を示す。（ａ）陰性対照群；正常なインスリン陽性膵島；（ｂ）モデル対照群；インスリン陽性膵島の重度な減少；（ｃ）陽性対照群；インスリン陽性膵島の有意な減少；（ｄ）サンプル群；インスリン陽性膵島の明らかな減少なし。
【0037】
【図11】膵島におけるインスリン免疫組織化学の結果を示す。（ａ）陰性対照群；正常な数のインスリン陽性細胞；（ｂ）モデル対照群；重度な減少された数のインスリン陽性細胞；（ｃ）陽性対照群；有意な減少された数のインスリン陽性細胞；（ｄ）サンプル群；明らかな減少なしの数のインスリン陽性細胞。
【0038】
【図12】本発明の特定の実施形態に係る前記ＡｕＣの製造方法のフローチャートを示す。
【0039】
【図13】正常な対照群とモデル対照群との比較を示す。（ａ）マウスの体重、脂肪及び赤身肉重量の相違；（ｂ）空腹時血糖指数及びインスリン血糖降下能力；（ｃ）耐糖能指数。
【0040】
【図14】（ａ）正常なマウス；（ｂ）モデルマウスにおけるＡ－０３薬物の急性血糖降下作用を示す。
【0041】
【図15】モデルマウスに対するＡ－０３薬物の作用を示す。（ａ）体重；（ｂ）脂肪、ここで（１）が正常対照群、（２）がモデル対照群、（３）がＡ－０３中用量投与群であり；（ｃ）筋肉組織、ここで（１）が正常対照群、（２）がモデル対照群、及び（３）がＡ－０３中用量投与群である。
【0042】
【図16】一か月投与後のＡ－０３薬物の血糖降下作用を示す。ここで（１）がモデル対照群；（２）が高用量投与群；（３）が中用量投与群；及び（４）が低用量投与群である。
【0043】
【図17】二か月投与後のＡ－０３薬物の血糖降下作用を示す。ここで（１）がモデル対照群；（２）が高用量投与群；（３）が中用量投与群；及び（４）が低用量投与群である。
【0044】
【図18】（ａ）耐糖能及び（ｂ）インスリン血糖降下作用Ａ－０３薬物の作用を示す（＊とは、Ｐ＜０．０５を意味する）。
【0045】
【図19】モデルマウスにおいて血中脂質に対する中用量及び高用量のＡ－０３薬物の作用を示す：（ａ）血漿非エステル化脂肪酸含有量（血漿ＮＥＦＡ）；（ｂ）血清トリグリセリド（血漿ＴＧ）；（ｃ）血清総コレステロール（血漿ＴＣ）、ここで（１）が正常対照群；（２）がモデル対照群；（３）がＡ－０３中用量投与群；（４）がＡ－０３高用量投与群である。
【0046】
【図20】（ａ）空腹時血糖値及び（ｂ）血中インスリン含有量に対するＡ－０３中用量投与の作用を示す、ここで（１）が正常対照群；（２）がモデル対照群；及び（３）がＡ－０３中用量投与群である。
【0047】
【図21】マウスの肝臓に対するＡ－０３中用量投与の作用を示す。（ａ）グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）の発現、ここで（１）が正常対照群、（２）がモデル対照群、（３）がＡ－０３中用量群であり；（ｂ）肝臓グリコーゲンの量、ここで（１）が正常対照群、（２）がモデル対照群、（３）がＡ－０３中用量群であり；（ｃ）グルコース代謝中の酸化的リン酸化における重要な分子の発現、ここで、各遺伝子では、左から右の列が、それぞれ、正常対照群、モデル対照群及びＡ－０３中用量群である。
【0048】
【図22】肝臓に対するＡ－０３薬物の作用を示す。（ａ）ウエスタンブロッティングは、ｐＳ４７３ ＰＫＢ、ＰＫＢ、ｐＴ３８９－Ｓ６ｋ及びＳ６Ｋの代表的なタンパク質バンドを示した。（ｂ）及び（ｃ）が、対応する発現の統計学的分析の結果であり、ここで、１～３が、正常対照群、モデル対照群及びＡ－０３中用量投与群であった。
【0049】
【図23】高脂肪食モデルマウスにおける（ａ）グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及び（ｂ）アラニンアミノトランスフェラーゼに対するＡ－０３投与の作用を示す。ここで、１～３が、正常対照群、モデル対照群及びＡ－０３中用量投与群であった。
【発明を実施するための形態】
【0050】
本発明は、本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解することができる。
【0051】
本発明に関係する最新技術をより完全に説明するために、本願に参考として援用される刊行物は、参照によってその開示全体が本願に組み込まれる。
【0052】
金クラスター（ＡｕＣｓ）は、金原子と金ナノ粒子の間にある特殊な形態の金である。ＡｕＣは、サイズが３ｎｍ未満であり、数個から数百個の金原子で構成されているため、金ナノ粒子の面心立方積層構造が崩壊する。その結果、ＡｕＣｓは、金ナノ粒子の持つ連続又は準連続のエネルギー準位とは異なり、違うＨＯＭＯ－ＬＵＭＯギャップを持つ分子のような離散化した電子構造を示す。これにより、従来の金ナノ粒子が持つ表面プラズモン共鳴効果と、ｕｖ－ｖｉｓスペクトルでの対応するプラズモン共鳴吸収帯（５２０±２０ｎｍ）が消失する。
【0053】
本発明は、リガンド修飾ＡｕＣを提供する。
【0054】
特定の実施形態では、リガンド修飾ＡｕＣは、リガンドと、直径が０．５～３ｎｍの範囲にある金コアとを含む。特定の実施形態では、金コアの直径は、０．５～２．６ｎｍの範囲にある。
【0055】
特定の実施形態では、リガンド修飾ＡｕＣのリガンドは、チオール含有化合物又はオリゴペプチドである。リガンドによりＡｕ－Ｓ結合を介して金コアを修飾し、リガンド修飾ＡｕＣを形成する。
【0056】
特定の実施形態では、リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、又はシステイン誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、システイン誘導体は、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、又はＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）である。
【0057】
特定の実施形態では、リガンドは、システイン含有オリゴペプチドとその誘導体であるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、このシステイン含有オリゴペプチドは、システイン含有ジペプチドである。特定の実施形態では、このシステイン含有ジペプチドは、Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、又はＬ－システイン－Ｌ－ヒスチジンジペプチド（ＣＨ）である。特定の実施形態では、このシステイン含有オリゴペプチドは、システイン含有トリペプチドである。特定の実施形態では、このシステイン含有トリペプチドは、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、又はＬ－グルタチオン（ＧＳＨ）である。特定の実施形態では、このシステイン含有オリゴペプチドは、システイン含有テトラペプチドである。特定の実施形態では、このシステイン含有テトラペプチドは、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）又はグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）である。
【0058】
特定の実施形態では、リガンドは、チオール含有化合物である。特定の実施形態では、チオール含有化合物は、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、又はドデシルメルカプタンである。
【0059】
本発明は、対象の糖尿病を治療するための医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、上記対象は、人である。特定の実施形態では、上記対象は、犬のような、ペットである。
【0060】
特定の実施形態では、上記医薬組成物は、上文で開示されたリガンド修飾ＡｕＣと、薬理学的に許容される賦形剤を含む。特定の実施形態では、上記賦形剤は、リン酸緩衝液、又は生理食塩水である。
【0061】
本発明は、対象の糖尿病を治療するための医薬の製造における上文で開示されたＡｕＣｓの使用を提供する。
【0062】
本発明は、対象の糖尿病を治療するための、上文で開示されたＡｕＣｓの使用、又は上文で開示されたＡｕＣｓを使用する、対象の糖尿病を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、前記治療方法は、薬理学的に有効な量のＡｕＣｓを前記対象に投与することを含む。前記薬理学的に有効な量は、通常な体内研究により確定されることができる。
【0063】
本発明は、リガンド修飾金クラスター（ＡｕＣｓ）の製造方法を提供する。図１２を参照しながら、本発明の特定の実施形態に係る方法のフローチャートが提供される。前記方法１２００は、以下のステップ１２１０～１２９０を含む。
【0064】
ステップ１２１０において、ＨＡｕＣｌ４溶液を提供する。上記ＨＡｕＣｌ４溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジメチルスルホキシド、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる中性又は酸性溶媒を含む。特定の実施形態では、前記溶媒は、メタノールである。特定の実施形態では、上記ＨＡｕＣｌ４溶液は、遮光しながらゆっくりと撹拌し、０℃以下に予め冷却されたものである。特定の実施形態では、上記ＨＡｕＣｌ４溶液中のＨＡｕＣｌ４の濃度は、１～２０ｇ／Ｌの範囲にあり、好ましくは２～１０ｇ／Ｌの範囲にある。特定の実施形態では、完全反応の合計体積が１体積部とされる場合、上記ＨＡｕＣｌ４溶液は、０．１～０．７体積部の範囲にあり、好ましくは０．２～０．５体積部の範囲にある。
【0065】
ステップ１２２０において、順次に、酸性溶液と第１のリガンドの溶液をＨＡｕＣｌ４溶液に加えて第１の混合溶液とする。特定の実施形態では、この酸性溶液は、塩酸、リン酸、硫酸、酢酸、プロピオン酸、ブタン酸、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる酸から構成される。特定の実施形態では、この酸性溶液は、０．０１～０．１体積部の範囲にある。特定の実施形態では、この酸性溶液は、反応がｐＨ＜５で、好ましくはｐＨが１～３の範囲で、最も好ましくはｐＨが１～２の範囲で行われることを確保する。特定の実施形態では、反応温度は、４℃未満である。特定の実施形態では、上記第１のリガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとこれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、ドデシルメルカプタンの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる。特定の実施形態では、第１のリガンドの溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む。特定の実施形態では、第１のリガンドの溶液中の第１のリガンドの濃度は、５～１５０ｇ／Ｌの範囲にあり、好ましくは２０～８０ｇ／Ｌの範囲にある。特定の実施形態では、第１のリガンドの溶液は、０．０１～０．６体積部の範囲にある。特定の実施形態では、第１のリガンドとＨＡｕＣｌ４とのモル比は、１：１～２０：１、好ましくは２：１～５：１の範囲にある。特定の実施形態では、第１の混合溶液の反応時間は、０．５～２時間である。
【0066】
ステップ１２３０において、第１の混合溶液にＮａＢＨ４溶液を加えて第２の混合溶液とする。特定の実施形態では、このＮａＢＨ４溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む。特定の実施形態では、このＮａＢＨ４溶液中のＮａＢＨ４の濃度は、１～１００ｇ／Ｌ、好ましくは１０～５０ｇ／Ｌの範囲にある。特定の実施形態では、このＮａＢＨ４溶液は、０．０１～０．６体積部の範囲にある。特定の実施形態では、ＮａＢＨ４とＨＡｕＣｌ４とのモル比は、１：１～１０：１、好ましくは１：１～５：１の範囲にある。特定の実施形態では、第２の混合溶液の反応時間は、５～１００分間の範囲にある。
【0067】
ステップ１２４０において、第２の混合溶液に非プロトン性極性溶媒を加えて反応を停止し、第３の混合溶液を得る。特定の実施形態では、この非プロトン性極性溶媒は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、ヘキサメチルホスホルアミド（ＨＭＰ）、クロロホルム、四塩化炭素、ピリジン、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれるものである。
【0068】
ステップ１２５０において、第３の混合溶液を遠心して、固形沈殿物を回収する。特定の実施形態では、遠心は、１,５００～６,０００ｇ、好ましくは２,０００～５,０００ｇの範囲にある。
【0069】
ステップ１２６０において、ステップ１２５０からの固形沈殿物を第２のリガンドの溶液に溶解して、第４の混合溶液を得て、そして第４の混合溶液を一定時間維持する。特定の実施形態では、第２のリガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとこれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）、及び、１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン、ドデシルメルカプタンの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる。特定の実施形態では、第２のリガンドの溶液は、水、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、ギ酸エチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸イソブチル、２－メチル－１－プロパノール、及びそれらの２種類以上の混合物からなる群より選ばれる溶媒を含む。特定の実施形態では、第１のリガンド及び第２のリガンドは、同じである。特定の実施形態では、第１のリガンドの溶液及び第２のリガンドの溶液における溶媒は、同じである。特定の実施形態では、第２のリガンドの溶液中の第２のリガンドの濃度は、５～１００ｇ／Ｌ、好ましくは２０～５０ｇ／Ｌの範囲にある。特定の実施形態では、第２のリガンドの溶液は、０．１～１０体積部、好ましくは１～２体積部の範囲にある。なお、ここでいう「体積部」は、上述した「体積部」と同じ意味である。特定の実施形態では、第２のリガンドとＨＡｕＣｌ４とのモル比は、１：１～２０：１、好ましくは２：１～５：１の範囲にある。特定の実施形態では、前記時間は、３～２４時間の範囲にある。
【0070】
ステップ１２７０において、第４の混合溶液を遠心して、上澄み液を得る。特定の実施形態では、遠心は、２,０００～８,０００ｇ、好ましくは３,０００～５,０００ｇの範囲にある。特定の実施形態では、遠心の時間は、３～５０分間、好ましくは５～１５分間の範囲にある。
【0071】
ステップ１２８０において、所定のカットオフ分子サイズを有する透析バッグで上記上澄み液を透析する。特定の実施形態では、上記カットオフ分子サイズは、５００～５,０００ダルトンの範囲にあり。特定の実施形態では、上記透析は、超純水に行われ、そしてこの水は、３～１０回交換される。
【0072】
ステップ１２９０において、透析された上澄み液を凍結乾燥してＡｕＣｓ粉末を得る。
【0073】
以下の実施例は、単に本発明の原理を説明することを目的として提供されたものである。それらは、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【0074】
実施例
【0075】
実施形態１． リガンド修飾ＡｕＣの調製
【0076】
１．１ ＨＡｕＣｌ４をメタノール、水、エタノール、ｎ－プロパノール、又は酢酸エチルに溶解して、ＨＡｕＣｌ４濃度０．０１～０．０３Ｍの溶液Ａを取得した。
【0077】
１．２ リガンドを溶媒に溶解して、リガンド濃度０．０１～０．１８Ｍの溶液Ｂを取得した。リガンドは、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、及び、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＡＣ）、及びＮ－アセチル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＡＣ）等のその他のシステイン誘導体；システイン含有オリゴペプチドとこれらの誘導体（Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンジペプチド（ＣＲ）、Ｌ－アルギニン－Ｌ－システインジペプチド（ＲＣ）、Ｌ－システイン－Ｌ－ヒスチジン（ＣＨ）、グリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＧＣＲ）、Ｌ－プロリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニントリペプチド（ＰＣＲ）、Ｌ－グルタチオン（ＧＳＨ）、グリシン－Ｌ－セリン－Ｌ－システイン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＳＣＲ）及びグリシン－Ｌ－システイン－Ｌ－セリン－Ｌ－アルギニンテトラペプチド（ＧＣＳＲ）等の、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド及びその他のシステイン含有ペプチドを含むが、これらに限定されない）；及び１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、チオフェノール、Ｄ-ペニシラミン及びドデシルメルカプタンのうちの一つ又は複数等のその他のチオール含有化合物を含むが、これらに限定されない。前記溶媒は、メタノール、酢酸エチル、水、エタノール、ｎ－プロパノール、ペンタン、ギ酸、酢酸、ジエチルエーテル、アセトン、アニソール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ペンタノール、酢酸ブチル、ｔ－ブチルメチルエーテル、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド、ギ酸エチル、酢酸イソブチル、酢酸メチル、２－メチル－１－プロパノール及び酢酸プロピルのうちの一つ又は複数であった。
【0078】
１．３ ＨＡｕＣｌ４とリガンドとのモル比が１：（０．０１～１００）となるように、溶液Ａと溶液Ｂを混合して、氷浴において０．１～４８時間撹拌し、０．０２５～０．８Ｍ ＮａＢＨ４の水、エタノール又はメタノール溶液を加えて、氷水浴において引き続き撹拌し、０．１～１２時間反応させた。ＮａＢＨ４とリガンドとのモル比は、１：（０．０１～１００）であった。
【0079】
１．４ 反応終了した後、ＭＷＣＯが３Ｋ～３０Ｋの限外ろ過チューブを使用して、８０００～１７５００ｒ／分の勾配で反応溶液を１０～１００分間遠心することにより、異なる平均粒子サイズを有するリガンド修飾ＡｕＣｓ沈殿を得た。異なるＭＷＣＯの限外ろ過チューブのろ過メンブレンの開口は、直接的に、前記メンブレンを通過できるリガンド修飾ＡｕＣのサイズを決定した。当該ステップは、任意に省略されてもよい。
【0080】
１．５ ステップ（１．４）で得られた異なる平均粒子サイズを有するリガンド修飾ＡｕＣｓ沈殿を水に溶解し、透析バッグに投入し、そして水において室温で１～７日間透析した。
【0081】
１．６ 透析後、リガンド修飾ＡｕＣｓを１２～２４時間凍結乾燥して、粉末状又は凝集状物質であるリガンド修飾ＡｕＣｓを得た。
【0082】
測定からわかるように、前記方法により得られた粉末状又は凝集状物質の粒子サイズは、３ｎｍ未満であった（全体的に、０．５～２．６ｎｍにわたって分布した）。５２０ｎｍで明らかな吸収ピークがなかった。得られた粉末又は凝集体はリガンド修飾ＡｕＣｓであることがわかった。
【0083】
実施形態２． 異なるリガンドにより修飾されたＡｕＣｓの調製及び同定
【0084】
２．１ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの調製
【0085】
リガンドであるＬ－ＮＩＢＣを例とし、Ｌ－ＮＩＢＣにより修飾されたＡｕＣｓの調製及び確認を以下で詳細に説明する。
【0086】
２．１．１ １．００ｇのＨＡｕＣｌ４を量り、１００ｍＬのメタノールに溶解して、０．０３Ｍの溶液Ａを得た。
【0087】
２．１．２ ０．５７ｇのＬ－ＮＩＢＣを量り、１００ｍＬの氷酢酸（酢酸）に溶解して、０．０３Ｍの溶液Ｂを得た。
【0088】
２．１．３ １ｍＬの溶液Ａを量り、０．５ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、又は５ｍＬの溶液Ｂとそれぞれ混合し（すなわち、ＨＡｕＣｌ４とＬ－ＮＩＢＣとのモル比が、それぞれ、１：０．５、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５であった。）、氷浴において撹拌しながら２時間反応させ、溶液が明るい黄色から無色になると、速やかに１ｍＬの新たに調製された０．０３Ｍ（１１．３ｍｇのＮａＢＨ４を量り、１０ｍＬのエタノールに溶解することにより調製された。）のＮａＢＨ４エタノール溶液を加えて、溶液が濃褐色になった後、引き続き３０分間反応し、そして１０ｍＬのアセトンを加えて反応を停止した。
【0089】
２．１．４ 反応後、反応溶液に対して勾配遠心を行い、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ粉末を得た。具体的な方法は以下のとおりである。即ち、反応完了後、反応溶液を３０ＫのＭＷＣＯ及び５０ｍＬの体積を有する限外ろ過チューブに転移し、１００００ｒ／分で２０分間を遠心し、そして内チューブ中の保持液（retentate）を超純水に溶解して、約２．６ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び１０ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１３,０００ｒ／分で３０分間を遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．８ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。その後、外チューブ中の混合液を５０ｍＬの体積及び３ＫのＭＷＣＯを有する限外ろ過チューブに転移し、１７,５００ｒ／分で４０分間を遠心した。内チューブ中の保持液を超純水に溶解して、約１．１ｎｍの粒子サイズを有する粉末を得た。
【0090】
２．１．５ 勾配遠心により得られた３つの異なる粒子サイズでの粉末を沈殿させ、それぞれ溶媒を除去し、粗生成物をＮ２でブロー乾燥させ、５ｍＬの超純水に溶解し、透析バッグ（ＭＷＣＯが３ＫＤａ）に置き、透析バッグを２Ｌの超純水に置き、一日おきに水を交換し、７日間透析し、凍結乾燥し、そして将来の使用のために保持した。
【0091】
２．２ Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣの同定
【0092】
上記で得られた粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣ）に対して同定実験は行われた。同時に、Ｌ－ＮＩＢＣ修飾金ナノ粒子（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓ）は、対照例として使用された。リガンドがＬ－ＮＩＢＣである金ナノ粒子の製造方法は、参考文献（Ｗ．Ｙａｎ、Ｌ．Ｘｕ、Ｃ．Ｘｕ、Ｗ．Ｍａ、Ｈ．Ｋｕａｎｇ、Ｌ．Ｗａｎｇ及びＮ．Ａ．Ｋｏｔｏｖ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１２、１３４、１５１１４；Ｘ．Ｙｕａｎ、Ｂ．Ｚｈａｎｇ、Ｚ．Ｌｕｏ、Ｑ．Ｙａｏ、Ｄ．Ｔ．Ｌｅｏｎｇ、Ｎ．Ｙａｎ及びＪ．Ｘｉｅ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１４、５３、４６２３）に参照する。
【0093】
２．２．１ 透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によるモルフォロジーの観察
【0094】
試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に２ｍｇ／Ｌになるまで溶解してサンプルとし、そして懸滴法により試験サンプルを製造した。より具体的に、５μＬのサンプルを超薄型カーボンフィルムに滴下し、水滴がなくなるまで自然蒸発させ、そしてＪＥＭ－２１００Ｆ ＳＴＥＭ／ＥＤＳ電界放出形高分解能ＴＥＭによりサンプルのモルフォロジーを観察した。
【0095】
【0096】
図２中の画像で示されるように、各Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルは、均一な粒子サイズ及び良好な分散性を有し、及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ１.１ｎｍ、１.８ｎｍ及び２.６ｎｍであり、図２のＣ、Ｆ及びＩ中の結果とよく一致した。これに対して、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルは、より大きい粒子サイズを有した。これらの平均直径（金コアの直径と指す）がそれぞれ３.６ｎｍ、６.０ｎｍ、１０.１ｎｍ及び１８.２ｎｍであり、図１のＣ、Ｆ、Ｉ及びＬ中の結果とよく一致した。
【0097】
２．２．２ 紫外線（ＵＶ）－可視光（ｖｉｓ）吸収スペクトル
【0098】
試験粉末（Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプル及びＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプル）を超純水に濃度が１０ｍｇ・Ｌ－１になるまで溶解し、室温でＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルが測定された。走査範囲が１９０～１１００ｎｍであり、サンプルセルが光路長１ｃｍの標準石英キュベットであり、参照セルが超純水により充填された。
【0099】
異なるサイズを有する４つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図１のＡ、Ｄ、Ｇ及びＪに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図１のＣ、Ｆ、Ｉ及びＬに示され、異なるサイズを有する３つのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルは、図２のＡ、Ｄ及びＧに示され、粒子サイズの統計学的分布は、図２のＣ、Ｆ及びＩに示される。
【0100】
図１で示されるように、表面プラズモン作用により、Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＮＰｓは、約５２０ｎｍで吸収ピークを有した。吸収ピークの位置は、粒子サイズに関連した。粒子サイズが３.６ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１６ｎｍで現れ、粒子サイズが６.０ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５１７ｎｍで現れ、粒子サイズが１０.１ｎｍである場合、ＵＶ吸収ピークが５２０ｎｍで現れ、粒子サイズが１８.２ｎｍである場合、吸収ピークが５２３ｎｍで現れた。４つのサンプルは、いずれも５６０ｎｍ以上で吸収ピークを有しなかった。
【0101】
図２で示されるように、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルのＵＶ吸収スペクトルでは、５２０ｎｍでの表面プラズモン作用による吸収ピークがなくなり、５６０ｎｍ以上で２つの明らかな吸収ピークが現れ、吸収ピークの位置がＡｕＣの粒子径により僅かな相違があった。これは、ＡｕＣが面心立方構造の崩壊により分子のような特性を示し、その結果、ＡｕＣの状態密度の不連続性、エネルギー準位の分裂、プラズモン共鳴効果の消失、及び長波方向の新しい吸収ピークの現れを引き起こすためである。上記で得られた異なる粒子サイズの３つの粉末サンプルは、いずれもリガンド修飾ＡｕＣｓであったと結論付けることができる。
【0102】
２．２．３ フーリエ変換赤外線分光法
【0103】
赤外線スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ製のＶＥＲＴＥＸ８０Ｖフーリエ変換赤外線分光計で固体粉末高真空全反射モードで測定された。走査範囲が、４０００～４００ ｃｍ－１であり、走査回数が６４であった。Ｌ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓサンプルを例とし、試験サンプルは、３つの異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ乾燥粉末であり、対照サンプルは、純粋なＬ－ＮＩＢＣ粉末であった。結果は、図３に示した。
【0104】
図３は、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓの赤外線スペクトルを示す。純粋なＬ－ＮＩＢＣ（下部の曲線）と比較すると、異なる粒子サイズを有するＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓのＳＨ伸縮振動は、全て、２５００～２６００ｃｍ－１で完全に消失したが、Ｌ－ＮＩＢＣの他の特徴的なピークは、依然として残っていて、Ｌ－ＮＩＢＣ分子がＡｕ－Ｓ結合を介してＡｕＣの表面に成功に固定されていたことが証明された。この図は、リガンド修飾ＡｕＣｓの赤外スペクトルがそのサイズとは無関係であることも示した。
【0105】
溶液Ｂの溶媒、ＨＡｕＣｌ４とリガンドとの仕込み比、反応時間及び添加されたＮａＢＨ４の量を小幅に調整した以外、上記方法と同じように、その他のリガンドにより修飾されたＡｕＣｓを製造した。例えば、Ｌ－システイン、Ｄ－システイン、Ｎ－イソブチリル－Ｌ－システイン（Ｌ－ＮＩＢＣ）又はＮ－イソブチリル－Ｄ－システイン（Ｄ－ＮＩＢＣ）がリガンドとして使用された場合、溶媒として酢酸が選択され、ジペプチドＣＲ、ジペプチドＲＣ又は１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンがリガンドとして使用された場合、溶媒として水が選択され、同様にし、その他のステップが同じようにするため、更なる詳細をここで省略する。
【0106】
本発明は、前述の方法により、一連のリガンド修飾ＡｕＣｓを製造して得た。リガンドと製造プロセスのパラメーターを表１に示す。
【0107】
【0108】
表１に挙げられたサンプルは、前記方法により確認された。５つの異なるリガンド修飾ＡｕＣの特性を図４（ＣＲ－ＡｕＣｓ）、図５（ＲＣ－ＡｕＣｓ）、図６（Ｃａｐ－ＡｕＣｓ）（Ｃａｐは１－［（２Ｓ）－２－メチル－３－チオール－１－オキソプロピル］－Ｌ－プロリンである）、図７（ＧＳＨ－ＡｕＣｓ）、及び図８（Ｄ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ）に示す。図４～図８は、ＵＶスペクトル（Ａ）、赤外線スペクトル（Ｂ）、ＴＥＭ画像（Ｃ）、及び粒子サイズ分布（Ｄ）を示す。
【0109】
その結果、表１から得られた異なるリガンドにより修飾されたＡｕＣｓの直径は、いずれも、３ｎｍ未満であることを示した。紫外線スペクトルは、５２０±２０ｎｍでのピークの消失、及び５６０ｎｍ以上での吸収ピークの出現も示した。この吸収ピークの位置のみが、リガンドと粒子サイズによりわずかに変化する。一方、フーリエ変換赤外スペクトルは、リガンドチオール赤外線吸収ピーク（図４～８のＢの点線の間）の消失も示したが、他の赤外特性ピークはいずれも保持されており、全てのリガンド分子がＡｕＣｓの表面に成功に固定されていて、本発明は、表１に記載されるリガンドにより修飾されたＡｕＣｓを取得することに成功したと示した。
【0110】
実施形態３
【0111】
３．１ 材料及び動物
【0112】
３．１．１ 試験サンプル
【0113】
３．１．１．１ コア直径１.５ｎｍのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓは、以下の流れに従って合成された。
【0114】
０．５体積部の５ｇ／Ｌ ＨＡｕＣｌ４メタノール溶液を反応容器に加えて、遮光しながら予め０℃まで冷却した。その後、ＨＡｕＣｌ４メタノール溶液をゆっくりと撹拌しながら０℃で維持した。０.０５体積部の酢酸（分析純度以上）及び０.１体積部の４０ｇ／Ｌ ＮＩＢＣメタノール溶液を順次に加えた。１時間反応後、回転数を上げて、０.３体積部の１５ｇ／Ｌ ＮａＢＨ４ エタノール溶液を加えた。溶液を引き続き３０分間反応させ、そして反応を十分なアセトンを加えることにより停止した。その後、溶液を４０００ｒ／分で１０分間遠心した。上澄み液を除去して、下部の固形沈殿物を回収した。その後、固形沈殿物に１体積部の３０ｇ／ＬのＮＩＢＣ水溶液を加えて、溶解及び密封して熟成させた。２４時間熟成後、溶液を４０００ｒ／分で１０分間遠心して、沈殿物を除去し、そして上澄み液を、分子量３０００かつ超純水が透析のために入れた透析バッグに入れた。５時間透析後、透析バッグにおける溶液を取り出し、そして粉末に凍結乾燥して、サンプルとされた。試験サンプルは、直径が１.５ｎｍで、ＴＥＭ画像（図２Ｋ）に示すように球形であった。試験サンプルのＵＶ－ｖｉｓ吸収スペクトルを図２Ｊに示し、粒子サイズの統計的分布を図２Ｌに示す。
【0115】
３．１．１．２ 規格：２５ｍｇ／バイアル；
【0116】
３．１．１．３ 特性：灰褐色粉末；
【0117】
３．１．１．４ 保管条件：２～８℃密封乾燥保存；
【0118】
３．１．２ 陽性対照サンプル
【0119】
３．１．２．１ 名称：塩酸ピオグリタゾン錠；
【0120】
３．１．２．２ バッチ番号：１８０９００１；
【0121】
３．１．２．３ 特性：白色又は近白色ピース；
【0122】
３．１．２．４ 規格／純度：ピオグリタゾン１５ｍｇ；
【0123】
３．１．２．５ 包装：アルミプラスチック包装、７ピース／箱；
【0124】
３．１．２．６ 製造日付：２０１８０９０１；
【0125】
３．１．２．７ 有効期限：２０２１０８；
【0126】
３．１．２．８ 製造者：Ｙａｎｔａｉ Ｚｈｅｎｇｆａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；
【0127】
３．１．２．９ 人に対する臨床的用量又は推薦用量：初期用量が１５ｍｇ又は３０ｍｇ、一日一回であってもよい。臨床的用量に十分に応答されていない場合、４５ｍｇ、一日一回まで追加する。
【0128】
３．１．２．１０ 保存条件：遮光、密封。
【0129】
３．１．３ 機器
【0130】
３．１．３．１ 電子分析天秤（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｙｏｕｓｈｅｎｇ Ｗｅｉｇｈｉｎｇ Ａｐｐａｒａｔｕｓ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｅｉｊｉｎｇ）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；
【0131】
３．１．３．２ 血糖計及び血糖測定ストリップ（Ｊｏｈｎｓｏｎ & Ｊｏｈｎｓｏｎ）；
【0132】
３．１．３．３ ＬＥＩＣＡ（登録商標）自動脱水機ＡＳＰ３００Ｓ；
【0133】
３．１．３．４ ＬＥＩＣＡ（登録商標）生物組織埋め込み機ＥＧ１１５０；
【0134】
３．１．３．４ ＬＥＩＣＡ（登録商標）回転式スライサーモデルＲＭ２２３５；
【0135】
３．１．３．５ ＬＥＩＣＡ（登録商標）スプレッダーＨＩ１２１０；
【0136】
３．１．３．６ ＬＥＩＣＡ（登録商標）乾燥機ＨＩ１２２０；
【0137】
３．１．３．７ ＬＥＩＣＡ（登録商標）自動染色機ＡｕｔｏＳｔａｉｎｅｒ－ＸＬ；
【0138】
３．１．３．８ ＯＬＹＭＰＵＳ（登録商標）生物顕微鏡ＢＸ４３；
【0139】
３．１．３．９ ＯＬＹＭＰＵＳ（登録商標）顕微鏡画像ソフトＣｅｌｌＳｅｎｓ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ；
【0140】
３．１．３．１０ Ｉｍａｇｅ－Ｐｒｏ（登録商標）画像解析ソフトＩｍａｇｅ－Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ６．０。
【0141】
３．１．４ 試薬
【0142】
３．１．４．１ 塩化ナトリウム溶液（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｋｅｌｕｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；
【0143】
３．１．４．２ カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｆｕｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒｙ）；（正確的に量った５．０ｇ ＣＭＣ－Ｎａを、ゆっくりと８００ｍＬの精製水に加えて、ビーカーにおいてマグネチック撹拌機により、溶解まで撹拌し、２～８℃一晩置き、翌日１０００ｍＬに希釈し；そして２～８℃で後の使用のために保存した。）
【0144】
３．１．４．３ グルコース（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｇｕａｎｇｈｕａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；（０．２５ｇ／ｍＬグルコース溶液は、７．５ｇのグルコースを、３０ｍＬの最終体積となるように、精製水に加えることにより製造され、０．１２５ｇ／ｍＬグルコース溶液は、７．５ｇのグルコースを、６０ｍＬの最終体積となるように、精製水に加えることにより製造された。）
【0145】
３．１．４．４ ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（ＭＰ Ｂｉｏ ｃｏｍｐａｎｙ）；（５ｍｇ／ｍＬ ＳＴＺ適用溶液は、０．１５ｇのＳＴＺを３０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液に溶解することにより製造された。）
【0146】
３．１．４．５ クエン酸一水和物、無水エタノール、９５％エタノール（Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｇｕａｎｇｈｕａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；クエン酸ナトリウム（Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｚｈｏｎｇｎａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；（０．１ｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝液は、２．１ｇのクエン酸一水和物を、１００ｍＬの最終体積となるように、脱イオン水に加えて、液体Ａとなり、２．９４ｇのクエン酸ナトリウムを、１００ｍＬの最終体積となるように脱イオン水に加えて、液体Ｂとなり、使用する際に、ＡとＢを１：１～１．２の比率で混合し、ｐＨを４．２～４．５まで調整し、２～８℃で保存することにより製造された。）
【0147】
３．１．４．６ パラフィン（Ｍａｏｍｉｎｇ Ｄａｃｈｕａｎ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｗａｘ Ｆａｃｔｏｒｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；
【0148】
３．１．４．７ 透明剤（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｏｎｇｚｉ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；
【0149】
３．１．４．８ 頬紅（水溶性）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）；及び
【0150】
３．１．４．９ Ｓｕ Ｍｕｓｕ（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ａｌａｄｄｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）。
【0151】
３．２ 動物実験
【0152】
３．２．１ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、糖尿病検査でより一般的に使用される。体重１８．８～２４．２ｇのＣ５７ＢＬ／６雄マウス（ＳＰＦレベル）９０匹実験の開始時に広東省医療研究所動物センターから購入した（実験動物生産ライセンス番号ＳＣＸＫ（Ｙｕｅ）２０１８－０００２；動物証明書番号４４００７２０００５９７５９）。
【0153】
３．２．２ 動物実験に関連する内容と手順は、実験動物の使用と管理を規制する関連法規制、及び動物福祉を確保するための施設内実験動物倫理委員会の関連規定に準拠した。
【0154】
３．２．３ 実験の最後に、マウスに３％ペントバルビタールナトリウム溶液を１ｍＬ／ｋｇ体重で腹腔内注射し、眼球と血液を採取して、頸椎脱臼により犠牲にした。
【0155】
３．２．４ マウスは、毎日の検査で４日間隔離された。
【0156】
３．２．５ マウスを１２時間：１２時間昼間／夜間照明付きの単一ケージに収容した。テスト結果の信頼性を確保するために、部屋の状態は常に安定していた。実験中、マウスは自由に食べたり飲んだりした。
【0157】
３．２．６ 用量設計及び群分け
【0158】
３．２．６．１ 用量設計：試験サンプルの投与量は１０ｍｇ／ｋｇ体重であった。塩酸ピオグリタゾン錠の臨床用量は、ヒトで４５ｍｇ／日である。つまり、成人の平均体重６０ｋｇに基づいて０.７５ｍｇ／ｋｇ体重である。試験用量は、ヒトの臨床用量の３０倍であった。したがって、陽性対照群は２２.５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与された；
【0159】
３．２．６．２ 群分け：動物検疫の終了後、約５時間絶食し、尾血を採取し、血糖値（０時間）を測定し、０.２５ｇ／ｍＬグルコース溶液を１０ｍＬ／ｋｇ体重で投与した。血糖値は０.５時間で測定された。血糖値が高すぎる又は低すぎる６匹のマウスを排除した。残りのマウスは、陰性対照群、モデル対照群、陽性対照群、及びサンプル群に１２匹のマウス／群で分けられた（表２）。
【0160】
表２． 群分け ｏｆ Ｍｉｃｅ
【0161】
【0162】
３．２．７ 方法
【0163】
３．２．７．１ 高エネルギー食
【0164】
ラード１０％、スクロース１５％、卵黄粉末１５％、カゼイン５％、コレステロール１.２％、コール酸ナトリウム０.２％、リン酸水素カルシウム０.６％、石粉０.４％、マウス維持材料５２.６％。
【0165】
３．２．７．２ サンプル調製：本発明の試験サンプルは、塩化ナトリウム注射液を、０.５ｍｇ／ｍＬの濃度となるように、サンプルバイアルに添加することにより調製された。その後、２～８℃で遮光しながら保管した。陽性対照サンプルは、１錠の塩酸ピオグリタゾン（規格１５ｍｇ／錠）を０.５％ＣＭＣ－Ｎａ溶液と混合し、均一に粉砕した後、０.５％ＣＭＣ－Ｎａ溶液を最終体積１３.３ｍＬとなるように添加して調製した。使用する前によく振動した。
【0166】
３．２．７．３ 糖尿病モデルの確立
【0167】
各群に１週間の維持飼料を与えた後、陰性対照群以外の群は３．１．７．１からの高エネルギー飼料に置き換えられた。３週間の給餌後、各群を２４時間絶食させた。陰性対照群以外の群には、２０ｍＬ／ｋｇ体重の用量で５ｍｇ／ｍＬのＳＴＺ溶液を腹腔内注射した。全ての群に４日間給餌した。５日目に空腹時血糖値と耐糖能を測定し、翌日試験を終了した。
【0168】
３．２．７．４ 試験サンプルと陽性対照サンプルの投与
【0169】
維持の給餌から飼料として、試験終了まで３４日間、サンプル群に試験サンプル溶液を１日１回２０ｍＬ／ｋｇ体重で腹腔内注射し、陰性対照群とモデル対照群に塩化ナトリウム溶液を腹腔内注射し、陽性対照群に、２０ｍＬ／ｋｇ体重の用量でピオグリタゾン塩酸塩溶液を胃内投与した。ＳＴＺの注射の日に、各群はＳＴＺ注射の４時間後に投与された。
【0170】
３．２．７．５ 最後空腹時血糖値及び耐糖能の測定、及び物質抽出
【0171】
ＳＴＺの腹腔内注射後５日目に、各マウス群に水を与えて約５時間絶食させた。空腹時血糖値を測定した後（０時間）、サンプル群と陽性対照群対応する薬剤を腹腔内注射した。陰性対照群及びモデル対照群には、塩化ナトリウム溶液を腹腔内注射した。２０分後、各群に２０ｍＬ／ｋｇ体重の０.１２５ｇ／ｍＬグルコース溶液を胃内投与し、グルコース溶液投与の０.５、１、１.５、２時間後に血糖値を測定した。翌日、各マウス群を投与後５時間絶食させた。マウスを１０ｍＬ／ｋｇ体重の３％ペントバルビタールナトリウム溶液で麻酔し、眼球と血液を採取した後に犠牲にした。血液サンプルを３０００ｒ／ｍｉｎで１０分間遠心分離し、血清インスリン、トリグリセリド、及び総コレステロールを検出するために血清を収集した。同時に、各動物の膵臓を収集した。各群の６匹の動物を、膵臓のＨＥ染色及びインスリン免疫組織化学的染色のために１０％パラホルムアルデヒドで固定した。残りの６匹の動物は、インスリン含有量の測定のために－８０℃で保存された。
【0172】
３．２．８ 検出インジケーター
【0173】
３．２．８．１ 一般的な臨床観察
【0174】
動物の一般的な臨床状態は、試験が終了するまで１日１回観察された。
【0175】
３．２．８．２ 体重
【0176】
試験開始時、試験終了時、及び試験中は週に１回体重を測定した。
【0177】
３．２．８．３ 飼料摂取量
【0178】
毎週、２日間の動物の飼料摂取量を、追加された飼料と翌日の残りの飼料を計量することにより１回測定した。
【0179】
３．２．８．４ 血糖降下率
【0180】
血糖降下率＝（実験前の血糖値－実験後の血糖値）／（実験前の血糖値）×１００％。
【0181】
３．２．８．５ 耐糖能血糖曲線下面積
【0182】
グルコース投与後０、０.５、１、１.５、２時間での血糖曲線下面積を計算した。式は次のとおりである。
【0183】
血糖曲線下面積：［（０時間血糖＋０.５時間血糖）×０.５］／２＋［（０.５時間血糖＋１時間血糖）×０.５］／２＋［（１時間血糖＋１.５時間）血糖値）×０.５］／２＋［（１.５時間血糖値＋２時間血糖値）×０.５］／２。
【0184】
３．２．８．６ 血清インスリン、コレステロール、及びトリグリセリド
【0185】
実験の終わりに、血清インスリン、トリグリセリド、及び総コレステロールを測定するために血清を収集した。インスリン抵抗性指数を計算した。
【0186】
インスリン抵抗性指数＝インスリン／２２.５ｅ－ｌｎ血中グルコース
【0187】
３．２．８．７ ＨＥ染色
【0188】
各群６匹の膵臓を１０％パラホルムアルデヒドで固定した後、ＨＥ染色により膵島の炎症を観察し、０～４のスケールで半定量的評価を行った。
【0189】
０：病理学的変化なし；
【0190】
１：末梢膵島の炎症：病理学的浸潤の兆候、病理学的変化は膵島の末梢に限定された；
【0191】
２：軽度の膵島の炎症：膵島の２５％未満が病理学的浸潤の変化を示した；
【0192】
３：中等度の膵島の炎症：膵島の２５％から７５％が病理学的浸潤の変化を示した；
【0193】
４：重度の膵島の炎症：膵島の７５％以上が病理学的浸潤の変化を示した。
【0194】
３．２．８．８ 免疫組織化学
【0195】
インスリン発現を検出するための免疫組織化学には、１０％パラホルムアルデヒド固定膵臓組織を使用した。
【0196】
３．２．８．９ 膵臓組織のインスリン含有量の測定
【0197】
各群の残りの６匹の動物の膵臓組織は、膵臓のインスリン含有量を検出するためのＥＬＩＳＡのために８０℃で保存された。
【0198】
３．２．９ 結果の評価
【0199】
３．２．９．１ 糖代謝障害モデルを確立するための条件
【0200】
モデル対照群は、０.５時間で１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上の血糖値があったか、０.５、１、１.５、及び２時間の任意の時点で血糖値又は血糖曲線下面積が陰性対照群に対して統計的に有意に増加した。
【0201】
３．２．９．２ 空腹時血糖指数
【0202】
グルコース代謝障害モデルの確立を前提として、モデル対照群と比較して、空腹時血糖値の低下又は血糖値の低下率が統計的に有意であり、試験サンプルの空腹時血糖指数は陽性であった。
【0203】
３．２．９．３ 耐糖能指数
【0204】
糖代謝障害モデルの確立を前提として、モデル対照群と比較して、試験サンプル群は、グルコース溶液を投与してから０、１、１.５、及び２時間後に統計的に有意であるか、０、０．５、１、１．５、及び２時間の血糖曲線下面積は統計的に有意であり、試験サンプルの耐糖能指数は陽性であった。
【0205】
３．２．１０ 統計分析
【0206】
統計分析にＳＰＳＳ２１.０ソフトウェアを使用して、全てのデータは、（）で表された。反復測定分散分析を使用して、試験後の体重、食物摂取量、空腹時血糖、耐糖能を分析し；ログ変換後の分散分析を使用して、試験前の空腹時血糖、ＴＣ含有量、血清インスリン、膵臓インスリンを分析した。膵臓インスリンの平均光学密度は、Ｔ検定により測定された。血糖降下の百分率、血糖曲線下面積、ＴＧ含有量をランクサム試験で分析した。カイ二乗検定を使用して、膵島炎症スコアの統計分析を行った。試験レベルはα＝０.０５であり、カイ二乗試験レベルはα＝０.００２４に修正された。
【0207】
３．３ 結果
【0208】
３．３．１ 観察
【0209】
ＳＴＺの腹腔内注射前の動物の一般的な臨床状況及び２番目の便に異常はなかった。ＳＴＺの腹腔内注射後、体重は減少した。
【0210】
３．３．２ 体重
【0211】
試験中、群間で体重に統計的差異はなかった（表３）。
【0212】
【0213】
３．３．３ 食物摂取量
【0214】
モデル対照群と比較して、陽性対照群は１週目で食物摂取量が増加し、サンプル群は１週目で食物摂取量が増加したが、２週目と５週目に食物摂取量が減少した（表４）。
【0215】
【0216】
３．３．４ 空腹時血糖指数
【0217】
陰性対照群と比較して、モデル対照群は空腹時血糖値が上昇した。空腹時血糖値の増加率の値は陰性であり、陰性対照群と比較して統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。モデル対照群と比較して、サンプル群及び陽性対照群の空腹時血糖値は有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。
【0218】
【0219】
３．３．５ 耐糖能指数
【0220】
陰性対照群と比較して、０.５時間、１時間、１.５時間、２時間でのモデル対照群の血糖値、及び血糖曲線下面積は統計的に有意であり（Ｐ＜０．０１）、グルコース代謝障害が確立された。モデル対照群と比較して、０.５時間、１時間、１.５時間、及び２時間でのサンプル群の血糖値は統計的に有意であった（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）。
【0221】
【0222】
３．３．６ 血清インスリン含有量
【0223】
陰性対照群と比較して、モデル対照群の血清インスリン含有量は統計的に減少した（Ｐ＜０．０１）。モデル対照群と比較して、陽性対照群の血清インスリン含有量は統計的に増加した（Ｐ＜０．０５）。
【0224】
３．３．７ 膵臓インスリン含有量
【0225】
陰性対照群と比較して、モデル対照群の膵臓インスリン含有量は統計的に減少した（Ｐ＜０．０１）。モデル対照群と比較して、陽性対照群の膵臓インスリン含有量増加したが、有意でなかった（Ｐ＞０．０５）。
【0226】
３．３．８ コレステロール（ＴＣ）含有量
【0227】
陰性対照群と比較して、モデル対照群のＴＣ含有量は統計的に増加した（Ｐ＜０．０１）。モデル対照群と比較して、サンプル群のＴＣ含有量は統計的に減少した（Ｐ＜０．０１）。
【0228】
３．３．９ トリグリセリド（ＴＧ）含有量
【0229】
陰性対照群と比較して、モデル対照群のＴＧ含有量は増加したが、統計的有意性はなかった（Ｐ＞０．０５）。陽性薬物群とサンプル群のＴＧ含有量は減少したが、有意性はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【0230】
【0231】
３．３．１０ ＨＥ染色結果
【0232】
陰性対照群（図９（ａ））と比較して、モデル対照群は、膵島数、膵島体積及び膵島細胞数の重度の減少、ならびに明らかな膵島へのリンパ球浸潤を示し（図９（ｂ））、陽性対照群は、膵島数、膵島体積及び膵島細胞数の適度な減少、及び明らかな膵島へのリンパ球浸潤を示した（図９（ｃ））が、サンプル群は、膵島数、膵島体積及び膵島細胞数の明らかな減少を示さず、膵島へのリンパ球浸潤を示さなかった（図９（ｄ））。
【0233】
３．３．１１ インスリン免疫組織化学結果
【0234】
陰性対照群（図１０（ａ）及び図１１（ａ））と比較して、モデル対照群は、インスリン陽性膵島の重度な減少及び膵臓細胞を示し（図１０（ｂ）及び図１１（ｂ））、陽性対照群は、インスリン陽性膵島の有意な減少及び膵臓細胞を示した（図１０（ｃ）及び図１１（ｃ））が、サンプル群は、インスリン陽性膵島及び膵臓細胞の明らかな減少を示さなかった（図１０（ｄ）及び図１１（ｄ））。
【0235】
実施形態４
【0236】
４．１ 試薬
【0237】
コレステロールテストキット、ＬａｂＡｓｓａｙＴＭ Ｃｈｏｌｅｓｔｒｏ、Ｂａｏｂａｉ Ｂｉｏ／Ｗａｋｏ
【0238】
トリグリセリド検出キット、ＬａｂＡｓｓａｙ トリグリセリド、Ｂａｏｂａｉ Ｂｉｏ／Ｗａｋｏ
【0239】
遊離脂肪酸検出キット、ＬａｂＡｓｓａｙ ＮＥＦＡ、Ｂａｏｂａｉ Ｂｉｏ／Ｗａｋｏ
【0240】
グルコーステストキット、ＬａｂＡｓｓａｙ グルコース、Ｂａｏｂａｉ／Ｗａｋｏ
【0241】
インスリンテストキット、ラット／マウスインスリンＥＬＩＳＡ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉｆｅｎｇ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
【0242】
ＧＯＴ、ＧＰＴキット、Ｎａｎｊｉｎｇ Ｊｉａｎｃｈｅｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ
【0243】
逆転写試薬、Ｎｏｖｏｚａｎ
【0244】
ＨｉｅｆｆＴＭ ｑＰＣＲ ＳＢＹＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｙ Ｍｉｘ、Ｅａｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．，Ｌｔｄ
【0245】
高脂肪食、研究食、カタログ番号Ｄ１２４９２
【0246】
４．２テスト薬物
【0247】
Ａ－０３：サイズ０．５～２．６ｎｍのＬ－ＮＩＢＣ－ＡｕＣｓ
【0248】
４．３ 動物試験方法
【0249】
マウスモデル：Ｂ６高脂肪マウスモデル。
【0250】
Ｂ６マウスは５つの群に分けられた：通常の対照群（Ｂ６マウスは通常実験を通して給餌された）。Ａ－０３薬物対照群（Ｂ６マウスは通常、実験全体を通して給餌され、生後５か月からＡ－０３高用量（１０ｍｇ／Ｋｇマウス体重）を腹腔内注射された）；モデル対照群（Ｂ６マウスに２か月齢から高脂肪食を与え、５か月齢から通常の生理食塩水を腹腔内注射した）；低用量群（Ｂ６マウスに２ヶ月齢から高脂肪食を与え、５ヶ月齢からＡ－０３低用量（１ｍｇ／Ｋｇマウス体重）を腹腔内注射した；中用量群（Ｂ６マウスは２ヶ月齢から高脂肪食を与えられ、５ヶ月齢からＡ－０３中用量（５ｍｇ／Ｋｇマウス体重）を腹腔内注射された；そして高用量群（Ｂ６マウスはから高脂肪食を与えられた２ヶ月齢で、５ヶ月齢からＡ－０３高用量（１０ｍｇ／Ｋｇマウス体重）を腹腔内注射した。
【0251】
４．４ 結果
【0252】
４．４．１ 糖尿病マウスモデルの確立
【0253】
高脂肪食により誘発された肥満マウスモデルを使用して、糖尿病に対するＡ－０３薬の治療効果を研究した。
【0254】
図１３ａは、正常対照群とモデル対照群との間の体重、脂肪及び赤身肉重量の比較を示す。正常対照群と比較して、モデル対照群の体重と脂肪重量は有意に増加した（Ｐ＜０．０５、＊）が、赤身の肉の含有量には有意な変化はなかった。
【0255】
図１３ｂは、正常対照群とモデル対照群の間の空腹時血糖指数とインスリン低血糖能力の比較を示す（すべて有意差あり；Ｐ＜０.０５、＊）。
【0256】
図１３ｃは、正常対照群とモデル対照群の耐糖能指数の比較を示す（すべて有意差あり、Ｐ＜０．０５、＊）。
【0257】
全ての治療群はモデル対照群と同じであった。結果として、モデルが成功に確立されたことを示した。
【0258】
４．４．２ 糖尿病マウスの血糖値に対するＡ－０３薬の作用
【0259】
２つの投与スキームが設定された。１つ目は急性薬物投与であった。つまり、薬物投与の３０分後に試験を実施した。２つ目は長期の薬剤投与であり、１日１回２ヶ月連続投与し、投与１ヶ月後と２ヶ月後に試験を行った。
【0260】
４．４．２．１ 急性薬物投与の結果
【0261】
正常マウス及びモデルマウスについては、Ａ－０３薬物（１０ｍｇ／ｋｇマウス体重）の急性投与の３０分後に、耐糖能に対するＡ－０３ｄ薬物の作用が検出された（正常及びモデルマウスの両方の対照として生理食塩水を注射した。）。Ａ－０３の高用量投与の３０分後、高脂肪食モデルマウスの耐糖能は有意に改善された（図１４ｂ、１５分及び３０分で、Ａ－０３高用量投与群の血糖は正常な生理食塩水対照群よりも有意に低かった、Ｐ＜０．０５、＊）が、正常なマウスでは有意な変化はなかった（図１４ａ）。
【0262】
４．４．２．２ 長期薬物投与の結果
【0263】
図１５ａは、モデル対照群と比較した、Ａ－０３低用量、中用量、及び高用量投与群の体重変化を示す。
【0264】
図１５ｂ及び１５ｃは、それぞれ、脂肪及び赤身肉に対する例示的な中用量のＡ－０３薬物の作用を示す。
【0265】
結論として、モデルマウスと比較して、Ａ－０３の３つの用量の長期薬物投与は、モデルマウスの体重及び体脂肪率に有意な影響を与えなかった。したがって、薬物毒性は最初に除外され、薬物の使用はマウスの食餌及び代謝消費に有意な影響を及ぼさないと説明することができた。
【0266】
投与１ヶ月後、モデル対照群及び各薬物投与群の血糖値をランダム食（飢餓なし）の条件下で測定した。図１６は、３つの濃度のＡ－０３薬が有意な血糖降下作用を有することを示す（Ｐ＜０．０５、＊）。
【0267】
投与２ヶ月後、一晩飢餓状態にした後、モデル対照群及び各薬物投与群の空腹時血糖を測定した。図１７は、血糖値に対するＡ－０３薬の有意な制御作用があることを示す（Ｐ＜０．０５、＊）。
【0268】
これらの結果は、Ａ－０３薬が血糖値に対して有意な抑制作用を持っていることを示す。
【0269】
さらなる実験は、低、中、高用量のＡ－０３薬が、高脂肪食により誘発される耐糖能とインスリン抵抗性を大幅に改善できたことを示す。図１８は、（ａ）耐糖能及び（ｂ）インスリン低血糖作用に対する例示的な中用量Ａ－０３薬物の作用を示す（＊はＰ＜０．０５を意味する）。
【0270】
４．４．３ モデルマウスの血漿総コレステロール含有量に対するＡ－０３薬の作用
【0271】
低血糖作用に加えて、薬物治療後に血中脂質が大幅に改善されることもわかった。ここで血中脂質とは、血清総コレステロール、トリグリセリド、及び非エステル化脂肪酸を指す。図１９は、血清非エステル化脂肪酸含有量（図１９ａ）、血清トリグリセリド（図１９ｂ）及び血清総コレステロール（図１９ｃ）に対する中用量及び高用量のＡ－０３薬物の作用を示し、ここで、１～４は、それぞれ、正常対照群、モデル対照群、Ａ－０３中用量投与群及びＡ－０３高用量投与群を示す。Ａ－０３の中用量及び高用量は、ＮＥＦＡ及びＴＧに有意な影響を与えなかったが、ＴＣを２４３.２±９.７ｍｇ／ｄＬ（モデル対照群）からそれぞれ１８８.４±９.４ｍｇ／ｄＬ及び１９７.１±１０.４ｍｇ／ｄＬに減少させ、差は有意であった（Ｐ＜０.０５、＊）。
【0272】
４．４．４ モデルマウスの血中インスリン含有量に対するＡ－０３薬の作用
【0273】
図２０は、絶食条件下でのモデルマウスにおける血糖（図２０ａ）及び血中インスリン含有量（図２０ｂ）に対する中用量薬物の２ヶ月間の投与後のＡ－０３薬物の作用を示す。ここで、１～３は、それぞれ、正常対照群、モデル対照群、及びＡ－０３中用量投与群を示す。空腹時血糖値は１０.３８±０.３９ｍｍから８.５５±０.４５ｍｍに減少した（Ｐ＜０.０５、＊）。対応する血中インスリン含有量は、６.０３±０.８５ｎｇ／ｍｌから３.８６±０.３８ｎｇ／ｍｌに減少した（Ｐ＜０.０５、＊）。
【0274】
４．４．５ 肝臓に対するＡ－０３薬の作用
【0275】
上記の長期薬物投与流れに従って、マウスにＡ－０３薬物を与えて投与し、薬物投与の期間は２．５ヶ月であった。
【0276】
４．４．５．１ 糖新生の主要な律速酵素であるＧ６Ｐａｓｅへの影響
【0277】
糖新生は、非グルコース前駆体が主に肝臓で発生するグルコースに変換されるプロセスである。グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）は、糖新生の重要な律速酵素である。Ｇ６Ｐａｓｅの発現は、グルコース産生の速度と直接相関している。図２１ａは、例示的な中用量のＡ－０３薬物が、Ｇ６Ｐａｓｅの遺伝子発現を有意に阻害できたことを示し（Ｐ＜０.０５、＊）、図２１ｂは、肝臓のグリコーゲン含有量が有意に減少したことを示す（Ｐ＜０.０５、＊）。図２１Ｃは、シトクロムｃオキシダーゼＩＶ（Ｃｏｘ４）、シトクロムｃオキシダーゼＶＩＩ（Ｃｏｘ７）、水素イオン輸送ＡＴＰａｓｅのミトコンドリアＦ１複合体のアルファペプチド（Ａｔｐ５ａ）、ミトコンドリアＤＮＡのシトクロムｃ（Ｃｙｃｓ）、シトクロムｂ遺伝子（Ｃｙｔｂ）、及びカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ａ（Ｃｔｐ１ａ）など、グルコース代謝における酸化的リン酸化の他の重要な分子の発現への影響を示す。酸化的リン酸化は増加しなかったが、Ｃｏｘ４、Ｃｏｘ７及びＡｔｐ５ａは有意に減少した（Ｐ＜０.０５、＊）ことがわかった。これは、血糖値の減少が、消費の増加ではなく、肝臓の糖新生の作用的な薬物制御による可能性があったことを示す。
【0278】
４．４．５．２ 肝内インスリン感受性への影響
【0279】
組織処理、タンパク質電気泳動分離、及びウエスタンブロッティングはよく知られた方法であり、ここでは説明しない。図２２は、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）及びリン酸化リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（Ｓ６Ｋ）を含む、インスリン感受性の主要な調節タンパク質のリン酸化に対する例示的な中用量のＡ－０３薬物の作用を示す。図２２ａは、ｐＳ４７３－ＰＫＢ、ＰＫＢ、ｐＴ３８９－Ｓ６Ｋ及びＳ６Ｋの代表的なタンパク質バンドを示し、図２２ｂ及び２２ｃは、対応する発現の統計分析の結果である（それらのうち、１～３は、順次に、正常対照群、モデル対照群及びＡ－０３中用量群を示す。）。高脂肪食は、総タンパク質中のリン酸化プロテインキナーゼＢの割合を大幅に減少させたことがわかった（ｐＳ４７３－ＰＫＢ／ＰＫＢ）。モデル対照群と比較して、Ａ－０３薬物投与は、ＰＫＢタンパク質のリン酸化を有意に増加させ（Ｐ＜０.０５、＊）、リン酸化リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ／リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ（ｐＴ３８９－Ｓ６Ｋ／Ｓ６Ｋ）のタンパク質比を有意に増加させた（Ｐ＜０.０５、＊）。結果として、Ａ－０３薬物がＰＫＢ－Ｓ６Ｋシグナル伝達経路を有意に活性化し、インスリンに対する標的細胞の感受性を高め、インスリン抵抗性を改善することを示した。
【0280】
４．４．５．３ 肥満糖尿病による肝機能障害の予防作用
【0281】
血液中のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ及びアラニンアミノトランスフェラーゼの検出方法はよく知られており、ここでは説明しない。マウスの血液中のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）とアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の含有量の検出は、ＡＳＴとＡＬＴの両方が高脂肪食モデルマウスで有意に増加したことを示した。Ａ－０３薬物治療後、非常に効果的な管理が達成された。図２３ａ及び図２３ｂは、それぞれＡＳＴ又はＧＯＴ及びＡＬＴ又はＧＰＴに対する中用量Ａ－０３薬物の作用を示す。ここで、ヒストグラムの１～３は、それぞれ、正常対照群、モデル対照群、及びＡ－０３中用量投与群を示す。Ａ－０３薬物投与後、ＡＳＴとＡＬＴが大幅に減少したことがわかった（Ｐ＜０.０５、＊）。これは、Ａ－０３薬物が肥満糖尿病による肝機能障害に対して有意な治療作用があることを示す。
【0282】
サイズの異なるその他のリガンド修飾ＡｕＣｓも同様の作用がある。ここでは詳しく説明しない。
【0283】
[産業上の利用可能性］
【0284】
ＡｕＣｓは、糖尿病の治療のために用いられる。それらは、産業的応用に適する。
【図1】
【図2】
【図 】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
