特許 7462777 新規キメラ抗原受容体とその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-28

(45)【発行日】2024-04-05

(54)【発明の名称】新規キメラ抗原受容体とその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240329BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240329BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240329BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240329BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240329BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240329BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240329BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240329BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240329BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

A61K31/7088

A61K35/12

A61K35/76

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

C07K16/28

C07K19/00

C12N5/10

C12N15/62 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/863 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

【請求項の数】 17

(21)【出願番号】P 2022549898

(86)(22)【出願日】2021-02-24

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-04-05

(86)【国際出願番号】 CN2021077580

(87)【国際公開番号】W WO2021169977

(87)【国際公開日】2021-09-02

【審査請求日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】202010128134.7

(32)【優先日】2020-02-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】523087364

【氏名又は名称】バイオヘン セラピューティクス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＨＥＮＧ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ

【住所又は居所原語表記】Ｓｕｉｔｅ ＃４－２１０， Ｇｏｖｅｒｎｏｒｓ Ｓｑｕａｒｅ， ２３ Ｌｉｍｅ Ｔｒｅｅ Ｂａｙ Ａｖｅｎｕｅ， ＰＯ Ｂｏｘ ３２３１１， Ｇｒａｎｄ Ｃａｙｍａｎ ＫＹ１－１２０９ （ＫＹ）

(74)【代理人】

【識別番号】110000497

【氏名又は名称】弁理士法人グランダム特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】周亜麗

(72)【発明者】

【氏名】呉長順

(72)【発明者】

【氏名】姜小燕

(72)【発明者】

【氏名】陳功

【審査官】西澤 龍彦

(56)【参考文献】

【文献】中国特許出願公開第１１０６１５８４３（ＣＮ，Ａ）

【文献】特表２０１９－５１６３５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１８－５３２４０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１４－５０７１１８（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０７Ｋ

Ａ６１Ｋ

Ａ６１Ｐ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

キメラ抗原受容体であって、
抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及びγｃ鎖の細胞内ドメインから構成され、
前記共刺激ドメインと前記細胞内シグナル伝達ドメインは、互いに異なる種類のドメインであり、
前記γｃ鎖の細胞内ドメインは、前記共刺激ドメインと異なる種類のドメインであり、かつ、前記細胞内シグナル伝達ドメインと異なる種類のドメインであり、
前記キメラ抗原受容体は、ＩＬ２Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒａ、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ２１Ｒａの細胞内ドメインを含まず、
細胞膜に近い方から、前記共刺激ドメイン、前記細胞内シグナル伝達ドメイン、及び前記γｃ鎖の細胞内ドメインの順に配置されている
キメラ抗原受容体。

【請求項2】

前記γｃ鎖の細胞内ドメインのアミノ酸配列が配列番号１６に示される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項3】

前記抗原結合ドメインは、ｓｄＡｂ、ナノボディ、抗原結合リガンド、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、及びＤＡＲＰＩＮから選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項4】

前記抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体及びキメラ抗体から選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項5】

前記抗原結合ドメインが結合する標的は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ－Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ－１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項6】

前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項8】

前記キメラ抗原受容体は、１つ又は複数の共刺激ドメインを含み、
前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７３（ＰＤ－Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ－Ｌ１）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０のタンパク質の共刺激シグナル伝達ドメインから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸。

【請求項10】

請求項９に記載の核酸を含むベクター。

【請求項11】

請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項９に記載の核酸、又は請求項１０に記載のベクターを含む免疫細胞。

【請求項12】

前記ベクターは、線状核酸分子、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ポリオーマウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ファージ、コスミド又は人工染色体である、請求項１１に記載の免疫細胞。

【請求項13】

前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択される、請求項１１又は１２に記載の免疫細胞。

【請求項14】

前記免疫細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞及びαβ－Ｔ細胞の、Ｔ細胞から選択される、請求項１３に記載の免疫細胞。

【請求項15】

前記免疫細胞は、さらに、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７ζ、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ、ＰＤ１及びＣＴＬＡ－４のいずれかの免疫チェックポイント遺伝子の、不活化遺伝子から選択される少なくとも１つを含む、請求項１１に記載の免疫細胞。

【請求項16】

請求項１～８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項９に記載の核酸、請求項１０に記載のベクター又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の免疫細胞と、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項17】

前記医薬組成物は、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がん、ＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸癌、直腸がん、結合組織がん、胃腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓腫瘍、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮又は子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がん及びその他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）から選択されるがんを治療するものである、請求項１６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞性免疫療法の分野に関し、特にサイトカイン受容体の共通γ鎖（γｃ鎖とも呼ばれる）又はその細胞内ドメインを含む新規キメラ抗原受容体及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

近年、がん免疫療法技術は急速に発展し、特にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）関連の免疫療法は、血液腫瘍の治療において優れた臨床効果をもたらす。ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、腫瘍抗原を認識できるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の遺伝子改変が行われ、一定数に増殖させた後、患者の体内に戻してがん細胞を消滅させ、腫瘍治療の目的を達成する。

【0003】

現在、技術の進歩に伴い、４世代の異なるＣＡＲ構造が登場している。第１世代のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインには、ＣＤ３ζのような一次シグナル伝達ドメインしか含まれていないため、ＣＡＲを含む細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）の活性は悪く、体内の生存期間は短くなる。第２世代のＣＡＲには、ＣＤ２８又は４－１ＢＢのような共刺激ドメインが導入され、細胞を持続的に増殖させたので、抗腫瘍活性を高めた。第３世代のＣＡＲには、２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２８＋４－１ＢＢ）が含まれる。第４世代のＣＡＲは、サイトカイン又は共刺激リガンドを組み込んでＴ細胞応答をさらに強化するか、自殺遺伝子を組み込んで、必要に応じてＣＡＲ－Ｔ細胞を自己破壊させる。現在、臨床研究では、主に第２世代のＣＡＲ構造が使用されている。

【0004】

しかしながら、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法の臨床使用には、例えば、血液腫瘍の治療で腫瘍の再発が多く、固形腫瘍の治療での奏効率は高くないなど、まだいくつかの問題がある。これらの問題は、複雑な腫瘍微小環境、ＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇などの要因によって引き起こされる可能性がある。

【0005】

したがって、体内のＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進し、腫瘍微小環境の免疫抑制効果を低減し、腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の全体的な治療効果を改善するために、既存のＣＡＲ－Ｔ細胞療法を改良する必要である。

【発明の概要】

【0006】

第１の態様において、本発明は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び追加のシグナル伝達ドメインを含む新規キメラ抗原受容体を提供する。前記追加のシグナル伝達ドメインは、γｃ鎖又はその細胞内ドメインから構成される。好ましい実施形態において、γｃ鎖のアミノ酸配列は配列番号１４に示され、その細胞内ドメインのアミノ酸配列は配列番号１６に示されている。

【0007】

一実施形態において、前記共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び追加のシグナル伝達ドメインは、細胞膜に近い順に配置されている。

【0008】

一実施形態において、前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、シグナルドメイン抗体、ナノボディ、抗原結合リガンド、組換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、及びＤＡＲＰＩＮから選択される。好ましくは、前記抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、シグナルドメイン抗体、及びナノボディから選択される。

【0009】

一実施形態において、前記抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体及びキメラ抗体から選択される。

【0010】

一実施形態において、前記抗原結合ドメインが結合する標的は、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。好ましくは、前記標的は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0011】

一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及びＣＤ１５４のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。好ましくは、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、及びＣＤ２７８の膜貫通ドメインから選択される。

【0012】

一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される。好ましくは、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζを含むシグナル伝達ドメインである。

【0013】

一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０の、タンパク質から選択される１つ又は複数の共刺激シグナル伝達ドメインである。好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、又はＣＤ２７８の共刺激シグナル伝達ドメインである。

【0014】

第２の態様において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードする配列を含む核酸、前記核酸を含むベクター、及び前記核酸又はベクターを含む免疫細胞をさらに提供する。

【0015】

一実施形態において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードする配列を含む核酸を提供する。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡである。

【0016】

一実施形態において、本発明は、上記の核酸を含むベクターを提供する。具体的には、前記ベクターは、線状核酸分子、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ポリオーマウイルス及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ファージ、ファージミド、コスミド又は人工染色体から選択される。いくつかの実施形態において、該ベクターは、さらに、免疫細胞における自律複製のための起点、選択マーカー、制限酵素切断部位、プロモーター、ポリアデニル化テール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペロン、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグなどのエレメントも含む。特定の実施形態において、前記ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたベクターである。

【0017】

一実施形態において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体を発現することができる、本発明の核酸又はベクターを含む免疫細胞を提供する。特定の実施形態において、前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択される。好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞又はαβ－Ｔ細胞である。

【0018】

第３の態様において、本発明は、上記で定義された本発明のキメラ抗原受容体、それをコードする核酸、ベクター又はそれらを含む免疫細胞と、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。

【0019】

第４の態様において、本発明は、有効量の本発明によるキメラ抗原受容体、免疫細胞、又は医薬組成物を被験者に投与することを含む、がんに罹患している被験者を治療する方法を提供する。

【0020】

一実施形態において、前記がんは、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がん及びＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸癌及び直腸がん、結合組織がん、胃腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、白血病、肝臓腫瘍、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮又は子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がん及びその他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）から選択される。好ましくは、本発明のキメラ抗原受容体、核酸、ベクター、免疫細胞又は医薬組成物で治療することができる疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳神経膠腫、膵臓がん、胃がんなどから選択される。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】図１は、フローサイトメトリーによって決定されたＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＡＲ発現レベルを示す。

【図2】図２は、標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果を示す。二元配置分散分析で分析を行い、Ｔ検定で統計分析を行う。＊は、Ｐ値が０．０５未満であり、有意水準に達していることを示す。

【図3】図３は、ＣＡＲ－Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞及び非標的細胞と共培養したＩＬ－２（Ａ）及びＩＦＮγ（Ｂ）の放出レベルを示す。

【図4】図４は、受容されたマウスの時間経過に伴う腫瘍負荷量の変を示す。

【図5】図５は、２１日目のマウス体内のＣＤ３＋（Ａ）、ＣＤ８＋（Ｂ）、及びＣＤ４＋（Ｃ）Ｔ細胞の増殖レベルを示す。

【図6】図６は、受容されたマウスの時間経過に伴う生存率の変化を示す。

【図7】図７は、標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果を示す。二元配置分散分析で分析を行い、Ｔ検定で統計分析を行う。＊は、Ｐ値が０．０５未満であり、有意水準に達していることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0022】

特に断りがない限り、本明細書で使用されるすべての科学的用語及び技術的用語は、本発明が属する当業者が通常認識している意味を有する。

【0023】

キメラ抗原受容体
本明細書において、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、抗原結合ドメイン（例えば、抗体の抗原結合部分）、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む基本構造を有する人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを指す。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用して、Ｔ細胞及びその他の免疫細胞の特異性と反応性を、ＭＨＣ非拘束的な方法で選択された標的に再方向付けする能力を有する。ＭＨＣ非拘束性の抗原認識は、ＣＡＲを発現しているＴ細胞に、抗原プロセッシングとは無関係に抗原を認識することで、腫瘍回避の主なメカニズムをバイパスする能力を与える。そのうえ、ＣＡＲは、Ｔ細胞内で発現すると、有利には内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα鎖及びβ鎖と二量体化しない。本発明の新規キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む基本構造を有するとともに、γｃ鎖又はその細胞内ドメインからなる追加的なシグナル伝達ドメインも含まれる。

【0024】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」は、抗原に結合可能な任意の構造又はその機能的変異体を指す。抗原結合ドメインは、抗体構造であってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体及びその機能的フラグメントを含むが、これらに限定されない。例えば、抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、単鎖抗体（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、シグナルドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ Ｄｏｍａｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）、ナノボディ（Ｎａｎｏｂｏｄｙ、Ｎｂ）、抗原結合リガンド、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ、及びＤＡＲＰＩＮなどを含むが、これらに限定されない。好ましくは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、及びナノボディから選択されるものである。本発明において、抗原結合ドメインは、一価又は二価のものであってもよく、単特異性、二重特異性又は多重特異性の抗体であってもよい。他の実施形態において、抗原結合ドメインは、特定タンパク質の特異的結合ポリペプチド又は受容体構造であってもよい。前記特定タンパク質は、例えばＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、及びＮＫＧ２Ｄである。

【0025】

「Ｆａｂ」は、免疫グロブリン分子がパパインで切断されてなる２つの同一のフラグメントのいずれかを指し、ジスルフィド結合しているインタクトな軽鎖及び重鎖のＮ末端部分からなり、重鎖のＮ末端部分は、重鎖可変領域とＣＨ１を含む。インタクトなＩｇＧと比較して、Ｆａｂは、Ｆｃフラグメントを含まず、移動度と組織浸透性が高く、抗体のエフェクター機能を媒介することなく抗原に一価で結合できる。

【0026】

「単鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーで繋がれた抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）から構成される抗体である。リンカーの最適な長さ及び／又はアミノ酸組成を選択することが可能である。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折りたたみ方と相互作用のし方に大きく影響し得る。実際、短いリンカーが用いられる場合（例えば、５－１０アミノ酸の間）、鎖内の折り畳みが防ぐことができる。リンカーのサイズと構成の選択については、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒｅｔ ａｌ．，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８；米国特許出願公開第２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、並びにＰＣＴ出願公開ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照されたい。それらは、参照することによって本明細書に組み込まれる。

【0027】

「シグナルドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と２つの従来のＣＨ２及びＣＨ３領域のみを含む、天然で軽鎖を欠く抗体を指し、「重鎖抗体」とも呼ばれる。

【0028】

「ナノボディ」又は「Ｎｂ」は、元の重鎖抗体と同じの構造安定性及び抗原結合活性を有し、個別にクローン化され及び発現されたＶＨＨ構造を指し、標的抗原に結合可能なものとして知られている最小の単位である。

【0029】

「機能的バリアント」又は「機能的フラグメント」は、親のアミノ酸配列を実質的に含み、また親のアミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾（即ち、置換、欠失又は挿入）を含む変異体を指し、変異体が親のアミノ酸配列の生物学的活性を保持していることを条件とする。一実施形態において、前記アミノ酸修飾は、好ましくは保存的修飾である。

【0030】

本明細書で使用される「保存的修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体又は抗体フラグメントの結合特徴に顕著な影響を与えないか、または変更しないアミノ酸修飾を指す。これらの保存的修飾は、アミノ酸置換、追加、及び欠失を含む。修飾は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当分野で公知の標準的な技術によって、本発明のキメラ抗原受容体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。アミノ酸残基のファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β－分枝側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有する。保存的修飾は、例えば、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、及び／又は関与する残基の両親媒性の性質の類似性に基づいて選択することができる。

【0031】

したがって、「機能的バリアント」又は「機能的フラグメント」は、親のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一であり、好ましくは、少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、親のアミノ酸の生物学的活性、例えば、結合活性を保持する。

【0032】

本明細書で使用される「配列同一性」は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列がアラインメントの同じ位置に同一の残基を有する程度を指し、通常、パーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全長にわたって決定される。したがって、まったく同じである配列の２つのコピーは、１００％同一性を有する。当業者は、配列の同一性の決定のため、例えばＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）、及びＣｌｕｓｔａｌＷなどのいくつかのアルゴリズムを、標準的なパラメータを使用して利用可能であることを認識しているであろう。

【0033】

抗原結合ドメインは、特定の病患状態に関する標的細胞上の細胞表面マーカー、例えば、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原を識別して選択され得る。したがって、一実施形態において、本発明の抗原結合ドメインは、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐ１００、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ １７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸のカルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、及びそれらの任意の組み合わせから選択される１つまたは複数の標的に結合する。好ましくは、前記標的が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される。本発明のＣＡＲは、標的とされる抗原に応じて、その抗原に対する特異的な抗原結合ドメインを含むように設計することができる。例えば、ＣＤ１９が標的となる抗原である場合、ＣＤ１９抗体を本発明の抗原結合ドメインとして使用することができる。

【0034】

本明細書で使用される「膜貫通ドメイン」は、免疫細胞（例えば、リンパ球、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞）の表面でキメラ抗原受容体を発現可能にし、標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を導くポリペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然又は合成で得られ、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来し得る。膜貫通ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドが標的抗原に結合するときにシグナル伝達することができる。とても適する本発明の膜貫通ドメインは、例えば、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４とその機能的フラグメントに由来し得る。または、膜貫通ドメインは、合成で得られるものであり、ロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含み得る。好ましくは、前記膜貫通ドメインが、ヒトＣＤ８α鎖に由来し、配列番号４に示されるアミノ酸配列と、又は配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0035】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、さらに、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジ領域を含み得る。本明細書で使用される「ヒンジ領域」は、膜貫通ドメインを抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、抗原結合ドメインへより大きな柔軟性とアクセス性を提供するためのものである。ヒンジ領域は、最大３００アミノ酸を含み得る。好ましくは、１０～１００アミノ酸を含み、最も好ましくは、２５～５０アミノ酸を含む。ヒンジ領域は、全体又は一部が天然分子に由来し得、例えば、全体又は一部がＣＤ８、ＣＤ４、又はＣＤ２８の細胞外領域に由来し、又は全体又は一部が抗体定常領域に由来し得る。または、ヒンジ領域は、天然に存在するヒンジ配列に対応する合成配列であるか、又は完全に合成されたヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＩｇＧ４、又はＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含む。より好ましくは、ＣＤ８αヒンジであり、それは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、又は配列番号１１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0036】

本明細書において、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞に特定な機能を実行するように指示する、タンパク質の部分を指す。細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原結合ドメインでの抗原結合後の細胞内の一次シグナル伝達に関与することで、免疫細胞の活性化と免疫応答をもたらす。言い換えれば、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現している免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも１つを活性化する役割を果たす。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性又はヘルパー活性であり得る。

【0037】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体及び補助受容体の細胞質配列であり得る。それらは、抗原受容体結合に一緒に作用して、一次シグナル伝達、ならびにこれらの配列の任意の誘導体又は変異体、及び同じ又は類似の機能的を有する任意の合成配列を開始する。細胞内シグナル伝達ドメインは、多数の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ，ＩＴＡＭ）を含み得る。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄに由来するものが含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。このシグナル伝達ドメインは、配列番号８に示されるアミノ酸配列又は配列番号７に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0038】

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、１つ又は複数の共刺激ドメインを含む。共刺激ドメインは、共刺激分子の細胞内部分全体を含む共刺激分子からの細胞内機能的シグナル伝達ドメイン、又はその機能的フラグメントであり得る。「共刺激分子」は、Ｔ細胞上の共刺激リガンドに特異的に結合し、それによってＴ細胞の共刺激応答（例えば、増殖）を媒介する同族の結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。本発明の共刺激ドメインの非限定的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１８（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、及びＺＡＰ７０のタンパク質に由来する共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明ＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢ及び／又はＣＤ２８フラグメントであり、より好ましくは、配列番号６に示されるアミノ酸配列又は配列番号５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

【0039】

一態様において、シグナル伝達に使用される共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに加えて、本発明のキメラ抗原受容体は、γｃ鎖又はその細胞内ドメイン組成物から構成される少なくとも１つの追加のシグナル伝達ドメインを含む。つまり、本発明のキメラ抗原受容体の細胞内ドメイン（即ち、シグナル伝達のための構造）は、共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及びγｃ鎖又はその細胞内ドメインの３つのシグナル伝達ドメインから構成される。これは、本発明のキメラ抗原受容体が、例えば、ＩＬ－２Ｒａ、ＩＬ２Ｒａ、ＩＬ２Ｒｂ、ＩＬ４Ｒａ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＬ９Ｒａ、ＩＬ１５Ｒａ、ＩＬ２１Ｒａなどの細胞内ドメインのような他のサイトカインのシグナル伝達ドメインである第４のシグナル伝達構造を含まないことを意味する。

【0040】

本明細書において、「γｃ鎖」という用語は、サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１の受容体によって共有されるγ鎖を指す。γｃ鎖は、最初にＩＬ－２受容体で同定され、その後、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１などの受容体の組成に関与していることがわかり、したがって、共通γ鎖とも呼ばれる。例えば、ＩＬ－２受容体は、３つの形態を有し、α鎖（ＩＬ－２Ｒαとも称する）、β鎖（ＩＬ－２Ｒβとも称する）、及びγｃ鎖（ＩＬ－２Ｒγ又はＩＬ－２Ｒｇとも称する）のさまざまな組み合わせからなる。３つの鎖すべてを含むＩＬ－２受容体は、他の組み合わせに比べて、ＩＬ－２サイトカインに対して最も高い親和性を示す。ＩＬ－２受容体の３つの鎖は、細胞膜に固定されており、ＩＬ－２との結合により生化学的シグナルを細胞に伝達させる。これらのγ鎖依存性サイトカインのうち、サイトカイン受容体特異的成分、例えばＩＬ－２Ｒβ、ＩＬ－４Ｒα、ＩＬ－７Ｒα、ＩＬ－９Ｒα、ＩＬ－２１ＲなどはＪＡＫ１への結合に関与し、γｃ鎖がＪＡＫ３に結する。これらのサイトカイン受容体がサイトカインに結合すると、ＭＡＰキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路などの３つの主要なシグナル伝達経路が活性化され、さらに、Ｔ細胞とＮＫ細胞の生存と増殖が制御される。

【0041】

γｃ鎖は、分子量６４ｋＤの糖タンパク質であり、２３２個のアミノ酸の細胞外ドメイン、２９個のアミノ酸の膜貫通ドメイン、８６個のアミノ酸の細胞内ドメインを含む３４７個のアミノ酸で構成されている。細胞内ドメインにはＳｒｃ相同性領域が含まれており、これは、細胞増殖と、ＩＬ－２によって媒介されるｃ－ｍｙｃ、ｃ－ｆｏｓ、ｃ－ｊｕｎなどの遺伝子の発現を促進するために不可欠である。一実施形態において、本発明に利用されるγｃ鎖は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列又は配列番号１３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。一実施形態において、本発明に利用されるγｃ鎖細胞内ドメインは、配列番号１６に示されるアミノ酸配列又は配列番号１５に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましくは、本発明のγｃ鎖は配列番号１４からなり、その細胞内ドメインは配列番号１６からなる。

【0042】

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、さらに、Ｔ細胞などの細胞で発現される場合、新生タンパク質が小胞体に導かれ、続いて細胞表面に導かれるシグナルペプチドを含む。シグナルペプチドのコアは、単一のα－ヘリックスを形成する傾向がある長い疎水性アミノ酸セグメントを含む。シグナルペプチドの末端には、通常、シグナルペプチダーゼによって認識及び切断されるアミノ酸のセグメントがある。シグナルペプチダーゼは、転座中又は転座後に切断して、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質を生成することができる。次に、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼによって消化される。本発明に使用されるシグナルペプチドは、周知のものであり、例えば、ＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲαなどに由来するものである。

【0043】

好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、及びγｃ鎖又はその細胞内ドメインを含む。より好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジ領域及び／又はＣＤ２８共刺激ドメインをさらに含む。

【0044】

好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体において、共刺激ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン、及び追加のシグナル伝達ドメインは、細胞膜に近い順に配置されている。即ち、共刺激ドメインは、細胞膜に最も近く、追加のシグナル伝達ドメインは、最も遠い。

【0045】

核酸
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードする配列を含む核酸をさらに提供する。

【0046】

本明細書において、「核酸」という用語は、それぞれ一本鎖及び／又は二本鎖形態、線状又は環状、又はそれらの混合物（ハイブリッド分子を含む）である、修飾又は非修飾のＲＮＡ又はＤＮＡなどのリボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの配列を含む。したがって、本発明の核酸は、ＤＮＡ（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）、それらの組み合わせ又は誘導体（例えば、ＰＮＡ）を含む。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、より好ましくはｍＲＮＡである。

【0047】

核酸は、通常のホスホジエステル結合又は非通常の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に発見するアミド結合）を含み得る。本発明の核酸は、例えば、トリチル化塩基及び滅多に見られない塩基（例えば、イノシン）などの１つ又は複数の修飾された塩基をさらに含む。本発明の多鎖ＣＡＲがポリヌクレオチドから発現され得ば、化学的、酵素的、又は代謝的修飾を含む他の修飾も考えられる。核酸は、単離された形で提供することができる。一実施形態において、核酸は、転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロンなどの調節配列を、さらに含む。

【0048】

本発明の核酸配列は、所望の宿主細胞（例えば、免疫細胞）において最適な発現を行い、又は細菌、酵母、又は昆虫細胞での発現に使用するように、コドン最適化される。コドン最適化は、ターゲット配列に存在する、特定の種の高発現遺伝子でまれなコドンを、その種の高発現遺伝子で一般的なコドンで置き換え、置換前後のコドンが同じアミノ酸をコードすることを指す。したがって、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用嗜好によって決められる。

【0049】

ベクター
本発明は、本発明に記載されるような１つ以上の核酸を含むベクターをさらに提供する。

【0050】

本明細書において、「ベクター」という用語は、（外因性）遺伝物質を宿主細胞に移すためのビヒクルとして使用される核酸分子であり、核酸分子が、該宿主細胞において、例えば、複製及び／又は発現され得る。

【0051】

ベクターは、通常、ターゲティングベクターと発現ベクターを含む。「ターゲティングベクター」は、例えば、相同組換えによって、又は特定部位の配列を特異的に標的とするハイブリッドリコンビナーゼを使用することによって、単離された核酸を細胞の内部に送達する培地である。「発現ベクター」は、適切な宿主細胞における異種核酸配列（例えば、本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする配列）の転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に使用されるベクターである。本発明に適するベクターは、当分野の既知のものであり、多くの市販のものを利用可能である。一実施形態において、本発明のベクターは、線状核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）、プラスミド、ウイルス（例えばレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ、ポリオーマウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）など）、ファージ、ファージミド、コスミド、及び人工染色体（ＢＡＣ、及びＹＡＣを含む）を含むが、これらに限定されない。ベクター自体は、通常、ヌクレオチド配列であり、インサート（導入遺伝子）を含むＤＮＡ配列と、ベクターの「バッバックボーン」として機能するより大きな配列とを含むことが一般的である。操作されたベクターは、通常、宿主細胞における自律複製のための起点（ポリヌクレオチドの安定発現が望まれる場合）、選択マーカー、及び制限酵素切断部位（例えば、マルチクローニング部位、ＭＣＳ）をさらに含む。ベクターは、プロモーター、ポリアデニル化テール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペロン、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグなどのエレメントもさらに含む。具体的な実施形態において、前記ベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたベクターである。

【0052】

操作された免疫細胞とその調製方法
本発明は、キメラ抗原受容体又はそれらをコードする核酸を含む操作された免疫細胞を提供する。

【0053】

本明細書において、「免疫細胞」という用語は、１つ又は複数のエフェクター機能（例えば、細胞毒性細胞死滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫系の任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞であり得る。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、例えば初代Ｔ細胞のようなｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞、又はＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などのようなｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞系からのＴ細胞、又は被験者から得られたＴ細胞などの任意のＴ細胞であり得る。被験者は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種を含む。Ｔ細胞は、様々な供給源から入手可能であり、末梢血単球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸膜滲出液、脾臓組織、腫瘍を含む。Ｔ細胞は、濃縮又は精製されることも可能である。Ｔ細胞は、任意の種類の、任意の発達段階にあるものであってもよく、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１、及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞毒性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞などを含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、免疫細胞は、ヒトＴ細胞である。Ｔ細胞は、フィコール分離などの当業者で知られる様々な技術を使用して、被験者の血液から得ることができる。本発明において、免疫細胞は、キメラ抗原受容体ポリペプチドを発現するように操作されたものである。

【0054】

当分野で公知の方法（例えば、形質導入、トランスフェクション、形質転換など）で、キメラ抗原受容体ポリペプチドをコードする核酸配列を免疫細胞に導入して、本発明のキメラ抗原受容体ポリペプチドを発現させることができる。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。例えば、ＲＮＡトランスフェクションの場合、ＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルス法に使用される。「形質導入」という用語は、通常、ウイルスを介した核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するために使用される。動物細胞のトランスフェクションは、通常、細胞膜に一過性の細孔又は「穴」を開いて、物質の取り込みを可能にすることに関するものである。トランスフェクションは、リン酸カルシウムを使用して、エレクトロポレーションにより、細胞を圧搾することにより、または、カチオン性脂質を材料と混合してリポソーム（細胞膜と融合し、その運搬物を内部に沈着させる）を製造することにより、実施することができる。真核生物宿主細胞をトランスフェクトするための例示的な技術には、脂質小胞媒介取り込み、熱ショック媒介取り込み、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈殿）、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーション穿孔が含まれる。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）の、細菌への、又は非動物の真核細胞（植物細胞を含む）への、非ウイルス性転写を説明するために使用される。したがって、形質転換とは、細菌又は非動物の真核細胞の、その周囲からの細胞膜を介した直接取り込み、それに続く外因性遺伝物質（核酸分子）の取り込みから生じる遺伝学的変化である。形質転換は、人工的手段で実現される。形質転換が起こるためには、細胞又は細菌がコンピテンスの状態になければならない。原核生物の形質転換の技術に、熱ショック媒介取り込み、傷細胞との細菌プロトプラストと無融合、マイクロインジェクション、及びエレクトロポレーションを含み得る。

【0055】

さらに別の実施形態において、本発明の免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ２４７ζ、ＨＬＡ－Ｉ、ＨＬＡ－ＩＩ遺伝子、並びにＰＤ１及びＣＴＬＡ－４などの免疫チェックポイント遺伝子から選択される少なくとも１つの不活化遺伝子をさらに含む。より具体的には、免疫細胞の少なくともＴＣＲα又はＴＣＲβ遺伝子が不活性化されている。この不活性化により、ＴＣＲは、細胞内で機能的しなくなる。該方法は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）に対してとても有効である。遺伝子を不活性化する方法は、当分野で公知のものであり、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ酵素媒介によるＤＮＡフラグメント化によって、行われる。

【0056】

医薬組成物
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体、核酸、ベクター又は活性剤とする操作された免疫細胞と、１つ又は複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を、さらに提供する。また、本発明は、医薬組成物又は医薬品の調整におけるキメラ抗原受容体、核酸、ベクター又は操作された免疫細胞の使用をさらに提供する。

【0057】

本明細書において、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、被験者及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合する（即ち、望ましくない局所的又は全身的作用を引き起こすことなく所望の治療効果を引き出すことができる）ベクター及び／又は賦形剤を意味し、当分野で公知のものである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）。薬学的に許容される賦形剤の例として、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、付着防止剤、流動促進剤、抗酸化剤、香味剤、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤、安定剤及び張性調整剤を含むが、これに限定されない。当業者であれば、本発明の所望の医薬組成物を調製するために、適切な賦形剤を選択することができる。本発明の医薬組成物に使用される例示的な賦形剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース及び水を含む。通常、適切な賦形剤の選択は、使用される活性剤、治療される疾患、及び医薬組成物の所望の剤形により決められる。

【0058】

本発明による医薬組成物は、様々な経路による投与に適する。通常、投与は、非経口的に達成される。非経口送達方法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下又は鼻腔内の投与を含む。

【0059】

本発明による医薬組成物は、さらに、固形剤、液剤、気体剤形、若しくは凍結乾燥剤形などの様々な剤形で調製することができる。特に、軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、散剤、錠剤、液剤、エアロゾル、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳化剤、カプセル剤、シロップ剤、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤または液体エキス剤抽出物の剤形で、又は所望の投入方法に特に適切な剤形で製剤化され得る。医薬品を生産するの本発明の公知のプロセスは、例えば、慣用的な混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封鎖、又は凍結乾燥プロセスを含み得る。本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は、通常、液剤で提供され、好ましくは薬学的に許容される緩衝液を含む。

【0060】

本発明による医薬組成物は、さらに、疾患の治療及び／又は予防に適した１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与され得る。組み合わせに適した薬剤の好ましい例として、次のものが挙げられる。
・公知の抗がん剤、例えば、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラケルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーソディウムホトフィリンII（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロマイド、トポテカン、トリメトレキサートグルクロネート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、オーリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチン及びドキソルビシン；
・ペプチド細胞毒素、例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス細菌外毒素Ａ、ＤＮａｓｅ、及びＲＮａｓｅなど；
・放射性核種、例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５、及びアスタチン２１３；
・プロドラッグ、例えば、抗体指向酵素プロドラッグなど；
・免疫賦活剤、例えば、ＩＬ－２；
・ケモカイン、例えば、ＩＬ－８、血小板第４因子、黒色腫増殖刺激タンパク質など；
・抗体又はそのフラグメント、例えば、抗ＣＤ３抗体又はそのフラグメント；
・補体活性化物質；
・異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性ペプチド。
また、本発明の医薬組成物は、化学療法及び放射線療法などの１つ又は複数の他の治療方法と組み合わせて使用することができる。

【0061】

操作された免疫細胞を調製する方法
本発明は、さらに操作された免疫細胞を調製する方法を提供し、免疫細胞が本発明のキメラ抗原受容体を発現するように、本発明のキメラ抗原受容体又はそのコードする核酸配列を免疫細胞に導入することを含む。

【0062】

一実施形態において、前記免疫細胞は、ヒト免疫細胞、より好ましくはヒトＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞である。

【0063】

核酸又はベクターを免疫細胞に導入し、それらを発現する方法は、当分野で公知のものである。例えば、核酸又はベクターを、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション、電気穿孔などの物理的方法によって免疫細胞に導入することができる。また、化学的方法、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズのようなコロイド分散系、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームのような脂質ベースのシステムによって、核酸又はベクターを導入することができる。また、生物学的方法によって核酸又はベクター導入することもできる。例えば、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えばヒトの細胞に挿入するために広く使用される方法である。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどに由来することができる。

【0064】

当業者は、核酸又はベクターが免疫細胞に導入された後、公知の技術によって、得られた免疫細胞を増殖及び活性化することができる。

【0065】

治療への応用
本発明は、有効量の免疫細胞又は本発明の医薬組成物を被験者に投与することを含む、がんに罹患している被験者を治療する方法をさらに提供する。

【0066】

一実施形態において、有効量の本発明の免疫細胞及び／又は医薬組成物が被験者に直接投与される。

【0067】

他の実施形態において、本発明の治療方法は、エクスビボ治療である。具体的には、この方法は、免疫細胞を含む被験者のサンプルを提供するステップ（ａ）と、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明のキメラ抗原受容体を免疫細胞に導入し、改変された免疫細胞を得るステップ（ｂ）と、改変された免疫細胞を被験者に投与するステップ（ｃ）とを含む。好ましくは、ステップ（ａ）における免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞から選択され、また、当分野で公知の方法によって被験者のサンプル（特に血液サンプル）から得るものである。なお、本発明のキメラ抗原受容体を発現し、本明細書に記載の所望の生物学的エフェクター機能を発揮できる他の免疫細胞も使用することができる。また、免疫細胞として、通常、被験者の免疫系と適合するものが選択され、即ち、好ましくは、免疫原性応答を誘発しないものを選ぶ。例えば、「遍在的なレシピエント細胞」、即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで成長及び増殖することができる所望の生物学的エフェクター機能を発揮する遍在的な適合性のリンパ球を使用することができる。そのような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を入手及び／又は提供する必要性がない。ステップ（ｃ）のエクスビボ導入は、エレクトロポレーションを介して、本明細書に記載の核酸又はベクターを免疫細胞に導入することにより、又は上記のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターで免疫細胞を感染させることにより実施することができる。他の考えられる方法としては、リポソームなどのトランスフェクション試薬の使用、又は一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用が挙げられる。

【0068】

一実施形態において、前記免疫細胞は、自己細胞又は同種異系細胞、好ましくはＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞であり、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。

【0069】

本明細書において、「自己」という用語は、任意の材料であって、後にそれが再導入される個体と同じ個体由来のものを指す。

【0070】

本明細書において、「同種異系」という用語は、任意の材料であって、同じ種の異なる動物、または該材料が導入される個体と異なる患者由来のものを指す。遺伝子が１つ以上の遺伝子座で同一ではない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。いくつかの態様において、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。

【0071】

本明細書において、「被験者」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、癌の動物モデルを表す被験者として有利に使用することができる。好ましくは、被験者は、ヒトである。

【0072】

一実施形態において、前記疾患は、抗原結合ドメインと結合された標的の発現に関連するがんである。例えば、前記がんは、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、基底細胞がん、胆道がん、膀胱がん、骨肉腫、脳がん及びＣＮＳがん、乳がん、腹膜がん、子宮頸がん、絨毛がん、結腸癌及び直腸がん、結合組織がん、消化器系のがん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、頭頸部がん、胃がん（胃腸がんを含む）、神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ）、肝臓がん、肝細胞腫瘍、上皮内腫瘍、腎臓がん、喉頭がん、肝臓腫瘍、肺がん（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、腺がん、扁平上皮がん）、リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、メラノーマ、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔がん（例えば、唇、舌、口、咽頭）、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸がん、呼吸器系のがん、唾液腺がん、皮膚がん、扁平細胞がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮又は子宮内膜がん、泌尿器系の悪性腫瘍、外陰がん及びその他のがんと肉腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度の小さな非切断細胞ＮＨＬ、大きなしこりＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、Ｔ細胞急性リンパ性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、Ｂ細胞前リンパ性白血病、形質細胞様樹状細胞腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、慢性骨髓性白血病（ＣＭＬ）、悪性リンパ増殖性疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、有毛細胞白血病、辺縁帯リンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症、形質芽球性リンパ腫、前白血病、形質細胞様樹状細胞腫瘍、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、及び標的発現に関連する他の疾患が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明の操作された免疫細胞又は医薬組成物で治療することができる疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳神経膠腫、膵臓がん、胃がんなどから選択される。

【0073】

一実施形態において、前記方法は、さらに、１つ又は複数の追加の化学療法剤、生物学的薬剤、薬物又は治療を前記被験者に投与することを含む。この実施形態において、化学療法剤、生物学的薬剤、薬物又は治療は、放射線療法、外科手術、抗体剤及び／又は小分子、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択される。

【0074】

以下、添付の図面を参照しながら例を挙げて本発明を詳細に説明する。なお、当業者であれば、添付の図面および実施例は、例示的なものにすぎず、本発明を限定するものではないと理解される。本出願の実施例および実施例の特徴は、矛盾がない限り、互いに組み合わせることができる。

【0075】

以下の実施例で使用される配列が表１に示される。

【0076】

表１ 本発明で使用される配列

【表1】

【0077】

本発明のすべての実施例で使用されるＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ロット番号１７－５４４２－０２）による白血球アフェレーシスを使用して健康なドナーから単離された初代ヒトＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であった。Ｎａｌｍ６腫瘍細胞はＮａｎｊｉｎｇＪｉｃｕｉＹａｏｋａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入した。

【0078】

実施例１ ＣＡＲＴ細胞の構築
ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号９）、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号１）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号１１）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号３）、４－１ＢＢ共刺激ドメイン（配列番号５）、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン（配列番号７）のコード配列を合成し、それらをｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ロット番号Ａ１３６０）に順にクローニングし、従来のｂｂｚ－ＣＡＲプラスミドを獲得し、シーケンシングによってターゲット配列が正しく挿入されていることを確認した。同じ方法でｂｂｚｇ－ＣＡＲプラスミドを獲得した。ｂｂｚ－ＣＡＲプラスミドとの唯一の違いは、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインに結合したガンマ鎖細胞内ドメイン（配列番号１５）も含まれていることである。ｂｂｚｇ－ＣＡＲプラスミドでは、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン、γ鎖細胞内ドメインが細胞膜に近い順に配列されている。

【0079】

３ｍｌ Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、ロット番号３１９８５－０７０）を滅菌チューブに入れ上記のプラスミドを希釈した後、プラスミド：ウイルスパッケージングベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１の比例でパッケージングベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ、ロット番号１２２６０）及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ、ロット番号１２２５９）を加えた。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、ロット番号０６３６６２３６００１）を加え、均一に混合して、室温で１５分間インキュベートし、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試薬混合物を２９３Ｔ細胞のフラスコに滴下した。ウイルスを２４時間及び４８時間で収集し、プールし、超遠心分離（２５０００ｇ、４°Ｃ、２．５時間）して、濃縮レンチウイルスを得た。

【0080】

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，ロット番号４０２０３Ｄ）でＴ細胞を活性化し、３７℃、５％ＣＯ_２で１日間培養した。そして、濃縮レンチウイルスを添加して３日間培養した後、ＣＤ１９を標的とする従来のｃＡＲ Ｔ細胞（対照用）及び本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞を得た。

【0081】

３７℃、５％ＣＯ_２で１１日間インキュベートした後、一次抗体としてＢｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ、ロット番号１１５－０６５－０７２）を用い、二次抗体としてＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ロット番号５５４０６１）を用い、Ｆｉｔｅ－ＣＡＲ Ｔ細胞でのｓｃＦｖの発現レベルをフローサイトメトリーで検出した。その結果が図１に示される（ＮＴは、未修飾の野生型Ｔ細胞である）。

【0082】

以上の結果から分かるように、本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｓｃＦｖを効果的に発現することができ、その発現レベルが従来のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞よりもわずか高く、γ鎖の細胞内ドメインの追加がＣＡＲ構造の表面発現に影響を与えないことを示している。

【0083】

実施例２ 標的細胞に対するＣＡＲＴ細胞の殺傷効果とサイトカイン放出
２．１ 標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果

【0084】

Ｔ細胞が標的細胞を殺すと、標的細胞の数が減少する。ルシフェラーゼを発現する標的細胞とＴ細胞を共培養した後、標的細胞の数が減少するとともに、分泌されるルシフェラーゼも減少した。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化的ルシフェリンへの変換を触媒するものである。酸化中に生物発光が生成され、この発光の強度は、標的細胞によって発現されるルシフェラーゼのレベルに依存する。したがって、検出された蛍光の強度は、標的細胞に対するＴ細胞の殺傷能力を反映することができる。

【0085】

標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を検出するために、まず、フルオレセイン遺伝子を運ぶＮａｌｍ６標的細胞を１×１０^４／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングし、そして、ｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞、Ｃｏｎ－ＣＡＲ Ｔ細胞（ポジティブコントロール）、及びトランスフェクトされていないＴ細胞（ネガティブコントロール）を、３２：１のエフェクター対ターゲット比（即ち、エフェクターＴ細胞と標的細胞の比）で９６ウェルプレートで共培養し、１６～１８時間後にマイクロプレートリーダーで蛍光値を測定した。（標的細胞の蛍光の平均値－サンプルの蛍光の平均値）／標的細胞の蛍光の平均値×１００％の式によって、殺傷効率を計算した。その結果が図２に示される。

【0086】

以上の結果からわかるように、ＮＴに比べて、標的細胞に対する本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷効果は、従来のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞よりも著しく高い。

【0087】

２．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン放出
Ｔ細胞が標的細胞を殺すと、標的細胞の数が減少するとともに、ＩＬ２、及びＩＦＮ－γなどのサイトカインも放出される。Ｆｉｔｅ－ＣＡＲＸ Ｔ細胞が標的細胞を殺傷するときに放出されるサイトカインＩＬ２、及びＩＦＮγのレベルを、以下の手順に従って酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で測定した。

【0088】

（１）細胞共培養上清の収集
標的細胞（Ｎａｌｍ６、及びＲａｊｉ）及び非標的細胞（１９３Ｆ）を、それぞれ１×１０^５／ウェルで９６ウェルプレートにプレーティングした後、ｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ、ｃｏｎ－ＣＡＲ Ｔ（ポジティブコントロール）及びＮＴ細胞（ネガティブコントロール）をそれぞれ１：１の比例で標的細胞又は非標的細胞と共培養し、１８～２４時間後に細胞共培養上清を収集した。

【0089】

（２）ＥＬＩＳＡによる上清におけるＩＦＮγ分泌量の検出
捕捉抗体Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号５０６５０２）を用いて９６ウェルプレートに播種し、４℃で一晩インキュベートした。その後、抗体溶液を除去し、２５０μＬの２％ＢＳＡ（ｓｉｇｍａ、ロット番号Ｖ９００９３３－１ｋｇ）を含むＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）溶液を加え、３７℃で２時間インキュベートした。その後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。５０μＬの細胞共培養上清又は標準液を各ウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、各ウェルに５０μＬの検出抗体Ａｎｔｉ－Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ抗体[ＭＤ－１]（Ｂｉｏｔｉｎ）（ａｂｃａｍ、ロット番号ａｂ２５０１７）を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）で３回洗浄した。さらにＨＲＰ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ロット番号４０５２１０）を加え、３７℃で３０分間インキュベートした後、上清を捨て、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎを含む１ＸＰＢＳ）を加え、５回洗浄した。５０μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに加えた。室温で暗所で３０分間反応させた後、５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ_２ＳＯ_４を各ウェルに加えて反応を停止させた。反応を停止してから３０分以内に、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍでの吸光度を検出し、標準曲線（標準の読み取り値と濃度に従って描画されたもの）によって、サイトカインの含有量を算出した。その結果が図３に示される。

【0090】

以上の結果から分かるように、非標的細胞２９３ＦではいずれもＩＦＮγ放出も検出されなかった。これは、ｂｂｚ－ＣＡＲＴ細胞とｂｂｚｇ－ＣＡＲＴ細胞の両方による殺傷が特異的であることを示している。さらに、標的細胞を殺す場合、ｂｂｚｇ－ＣＡＲＴ細胞のＩＬ２放出レベルが従来のＣＡＲＴ細胞よりも著しく低かったが、ＩＦＮ－γの放出レベルは従来のＣＡＲＴ細胞よりも著しく高かった。全体として、本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞と同等であった。

【0091】

実施例３ ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍抑制効果の検証
腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抑制効果は、マウスモデルで検証された。

【0092】

２０匹の８週齢の健康な雌ＮＣＧマウスを、ＰＢＳグループ、ＮＴグループ（ネガティブコントロール）、ｂｂｚ－ＣＡＲＴグループ（陽性対照）、及びｂｂｚｇ－ＣＡＲＴグループの４つのグループに分けた。０日目（Ｄ０）に、１×１０^６個のＮａｌｍ６細胞を各マウスの尾静脈に注射した。７日後（Ｄ７）、対応グループの各マウスにＰＢＳ溶液、２×１０^６ＮＴ細胞、ｃｏｎ－ＣＡＲＴ細胞又はｂｂｚｇ－ＣＡＲＴ細胞を尾静脈に注射した。マウスの生存率と腫瘍負荷量の変化を毎週評価した。

【0093】

ｉｎｖｉｖｏ光学イメージング技術を使用して、各グループのマウスの腫瘍負荷量の変化を評価した。マウスの腫瘍負荷量は、Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１、Ｄ２８、Ｄ３５、Ｄ４２、及びＤ４９で検出され、光子／秒で表された。その結果が図４に示される。

【0094】

以上の結果から分かるように、ＰＢＳ群とＮＴ群では、マウスの腫瘍負荷量が急速に進行し、Ｄ２１（即死）で最高値に達した。ｂｂｚ－ＣＡＲグループのマウスをＣＡＲ－Ｔ細胞で処置した後、腫瘍負荷量は急速に減少したが、Ｄ２８又はＤ３５で徐々に回復した。一方、ｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔグループのマウスは、治療後に腫瘍負荷量が急速な減少するとともに、再発することなくＤ４９まで低レベルを維持した。これは、本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍増殖を効果的に阻害することができ、その効果が従来のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞よりも著しく優れていることを示している。

【0095】

発明者らは、ｂｂｚ－ＣＡＲＴ細胞及びｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された２つのグループのマウスの２１日目のＴ細胞の増殖をさらにモニターした。具体的には、Ｄ２１でマウスの顎下静脈から採血し、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ ＦＡＣＳ分析（ｈＣＤ３、ｈＣＤ８、ｈＣＤ４の発現量）を行った。その結果が図５に示される。

【0096】

以上の結果から分かるように、Ｔ細胞の増殖は、ｂｂｚ－ＣＡＲＴマウスとｂｂｚｇ－ＣＡＲＴマウスの両方で検出された。ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖は、類似していたが、ｂｂｚｇ－ＣＡＲグループのＣＤ３＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖は、ｂｂｚ－ＣＡＲＴグループよりも著しく高かった。したがって、２１日目の腫瘍負荷量は２つのグループ間で類似していたが（図４）、ｂｂｚｇ－ＣＡＲ ＴグループにおいてＴ細胞の増殖が著しく多く、腫瘍負荷量を低レベルに保つことができた。一方、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔグループのマウスの腫瘍負荷量は、Ｔ細胞の増殖が少なく、枯渇が続いたため、その後回復した。

【0097】

さらに、発明者らは、されに、実験の終了時（即ち、腫瘍細胞Ｎａｌｍ６の接種後１０５日目）までに各群のマウスの生存率を算出した（図６）。そのうち、ＰＢＳ及びＮＴグループのすべてのマウスが死亡し、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞で治療されたマウスのうちの１匹（２０％）のみが生存し、ｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞で治療されたマウスの６０％が生存した。これも、本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍を効果的に阻害し、生存率を改善することができることを示している。

【0098】

以上により、従来のＣＡＲ Ｔ細胞に比べて、本発明のｂｂｚｇ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、サイトカイン受容体の共通γ鎖の導入によりＴ細胞の増殖を大幅に促進するので、腫瘍細胞の継続的な殺傷を改善し、体内の腫瘍抑制効果を改善し、マウスの生存率を向上させることができる。

【0099】

実施例４．異なる構造を持つＣＡＲ－Ｔセルの調製とそれらの機能の検証
γｃ鎖細胞内ドメイン（配列番号１５）を、ｂｂｚ－ＣＡＲプラスミドの４－１ＢＢ共刺激ドメインとＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインの間に挿入して、ｂｂｇｚ－ＣＡＲプラスミドを得た。ｂｂｇｚ－ＣＡＲプラスミドとｂｂｚｇ－ＣＡＲプラスミドとの相違点は、γｃ鎖細胞内ドメイン内の位置が異なる。実施例１の調整方法で、ｂｂｇｚ－ＣＡＲプラスミドを調整した。

【0100】

実施例２に記載された方法で、標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷効果を検出した。その結果が図７に示される。以上の結果から分かるように、標的細胞に対するｂｂｇｚ－ＣＡＲＴ細胞の殺傷効果は、従来のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞と同等であったが、両方ともｂｂｚｇ－ＣＡＲＴ細胞よりも著しく低かった。これは、ＣＡＲ構造内の追加のシグナル伝達ドメイン（即ち、γｃ鎖又はその細胞内ドメイン）の位置が、ＣＡＲＴ細胞の殺傷活性に重要な影響を与えることを示している。

【0101】

なお、上記は、本発明の好ましい実施形態にすぎず、本発明を限定することを意図するものではないことに留意されたい。当業者にとって、本発明は、様々な変化及び変更を有し得る。本発明の精神及び原理の範囲内で行われる変更、均等置換、改良などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれることが当業者であれば理解できる。

【配列表フリーテキスト】

【0102】

配列番号1：CD19 scFv
配列番号2：CD19 scFv
配列番号3：CD8α膜貫通ドメイン
配列番号4：CD8α膜貫通ドメイン
配列番号5：4-1BB共刺激ドメイン
配列番号6：4-1BB共刺激ドメイン
配列番号7：CD3ζシグナル伝達ドメイン
配列番号8：CD3ζシグナル伝達ドメイン
配列番号9：CD8αシグナルペプチド
配列番号10：CD8αシグナルペプチド
配列番号11：CD8αヒンジ領域
配列番号12：CD8αヒンジ領域
配列番号13：γc鎖
配列番号14：γc鎖
配列番号15：γc鎖細胞内ドメイン
配列番号16：γc鎖細胞内ドメイン

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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