特許 7462901 エンドトキシン吸着剤及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-03-29

(45)【発行日】2024-04-08

(54)【発明の名称】エンドトキシン吸着剤及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/26 20060101AFI20240401BHJP

   B01J 20/28 20060101ALI20240401BHJP

   B01J 20/30 20060101ALI20240401BHJP

   C08B 37/16 20060101ALI20240401BHJP

【ＦＩ】

B01J20/26 G

B01J20/28 A

B01J20/30

C08B37/16

【請求項の数】 10

(21)【出願番号】P 2020083257

(22)【出願日】2020-05-11

(65)【公開番号】P2021178270

(43)【公開日】2021-11-18

【審査請求日】2023-04-14

(73)【特許権者】

【識別番号】504159235

【氏名又は名称】国立大学法人 熊本大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000003506

【氏名又は名称】第一工業製薬株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110003395

【氏名又は名称】弁理士法人蔦田特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】坂田 眞砂代

(72)【発明者】

【氏名】北村 武大

(72)【発明者】

【氏名】森田 祐子

【審査官】小久保 勝伊

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１７／０１８５２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特開２０１６－０４９５２７（ＪＰ，Ａ）

【文献】Masayo Sakata,Sho Kinoshita, Natsumi Hagio，γ-cyclodextrin-immobilized cellulose adsorbent for removal of endotoxin，The 12th SPSJ International Polymer Conference，日本，2018年，446

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｂ０１Ｊ ２０／２６

Ｂ０１Ｊ ２０／２８

Ｂ０１Ｊ ２０／３０

Ｃ０８Ｂ ３７／１６

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

セルロース担体と、前記セルロース担体に結合したシクロデキストリンと、を備えるエンドトキシン吸着剤であって、アミノ基を有する前記セルロース担体にカルボキシ基を有する前記シクロデキストリンが前記アミノ基と前記カルボキシ基とからなるアミド結合を介して結合され、残存する前記アミノ基がマスキングされた、エンドトキシン吸着剤。

【請求項2】

前記アミノ基を有する前記セルロース担体が、カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させてなる、請求項１に記載のエンドトキシン吸着剤。

【請求項3】

前記セルロース担体が粒子状セルロースである、請求項１又は２に記載のエンドトキシン吸着剤。

【請求項4】

前記セルロース担体が繊維状セルロースである、請求項１又は２に記載のエンドトキシン吸着剤。

【請求項5】

前記繊維状セルロースの平均繊維径が１０ｎｍ未満である、請求項４に記載のエンドトキシン吸着剤。

【請求項6】

前記マスキングが前記アミノ基のアシル化である、請求項１～５のいずれか１項に記載のエンドトキシン吸着剤。

【請求項7】

アミノ基を有するセルロース担体にカルボキシ基を有するシクロデキストリンを前記アミノ基と前記カルボキシ基とからなるアミド結合を介して結合させる工程と、
前記シクロデキストリンが結合した前記セルロース担体における残存する前記アミノ基をマスキング剤でマスキングする工程と、
を含む、エンドトキシン吸着剤の製造方法。

【請求項8】

カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させることにより前記アミノ基を有する前記セルロース担体を得る工程を含む、請求項７に記載のエンドトキシン吸着剤の製造方法。

【請求項9】

前記セルロース担体に前記シクロデキストリンを結合させる工程において、前記カルボキシ基を有する前記シクロデキストリンを、活性エステル化法を用いて前記セルロース担体の前記アミノ基に対して反応させることで、前記アミド結合を介して前記セルロース担体に結合させる、請求項７又は８に記載のエンドトキシン吸着剤の製造方法。

【請求項10】

請求項１～６のいずれか１項に記載のエンドトキシン吸着剤と、エンドトキシンを含有する液体とを接触させることを含む、エンドトキシンの除去された液体の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、エンドトキシン吸着剤及びその製造方法、並びにエンドトキシン吸着剤を利用した液体の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

エンドトキシンは、グラム陰性菌の細胞壁を構成するリポ多糖（リポポリサッカライド：ＬＰＳ）であり、疎水性部分である脂質（リピドＡ）と親水性部分である多糖とが結合した構造を有する。リピドＡが毒性の原因部分であり、微量でもエンドトキシンが血中などの生体内に取り込まれると発熱などの生体反応を引き起こす。そのため、ワクチンや血液製剤などの注射用液中に微量に残存しているエンドトキシンを除去することが求められている。

【0003】

エンドトキシンを除去するための吸着剤として、例えばポリ（ε－リジン）固定化セルロース粒子等のカチオン性のエンドトキシン吸着剤が知られている。かかるカチオン性のエンドトキシン吸着剤は、エンドトキシンの構造中のリン酸基とイオン的相互作用を引き起こすカチオン基（例えばアミノ基）を有しており、核酸や酸性タンパク質等の酸性物質とのイオン的相互作用も同時に引き起こす。そのため、エンドトキシンの選択吸着能に劣っており、酸性物質の共存下でエンドトキシンを選択的に除去するのは困難である。従って、エンドトキシンを選択的に除去可能な吸着剤が求められている。

【0004】

エンドトキシンを選択的に除去可能な吸着剤として、例えば、エンドトキシンを選択的に捕捉可能なシクロデキストリンをセルロースやポリマー等の固体担体に固定化したものが知られている（特許文献１，２参照）。また、アミノ基を有するセルロースナノファイバーをエンドトキシン吸着剤として用いることが知られている（特許文献３参照）。更に、塩化トシルを用いてアミノ化したシクロデキストリンをエポキシ基が導入されたセルロース担体に反応させて固定化し、固定化後に残存するアミノ基をアセチル化によりマスキングしたエンドトキシン吸着剤が知られている（非特許文献１参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【文献】特表２００９－５０２９０５号公報

【文献】特開２０１６－０４９５２７号公報

【文献】国際公開第２０１７／０１８５２４号

【非特許文献】

【0006】

【文献】木之下聖、他４名、「エンドトキシン分離剤としてのシクロデキストリン修飾セルロース吸着剤の設計」、第65回高分子学会年次大会予稿集、Polymer Preprints, Japan Vol. 65, No.1, 3Pa095, 2016

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明の実施形態は、高い選択性及び吸着性を有するエンドトキシン吸着剤を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の実施形態に係るエンドトキシン吸着剤は、セルロース担体と、前記セルロース担体に結合したシクロデキストリンと、を備えるエンドトキシン吸着剤であって、アミノ基を有する前記セルロース担体にカルボキシ基を有する前記シクロデキストリンが前記アミノ基と前記カルボキシ基とからなるアミド結合を介して結合され、残存する前記アミノ基がマスキングされたものである。

【0009】

本発明の実施形態に係るエンドトキシン吸着剤の製造方法は、アミノ基を有するセルロース担体にカルボキシ基を有するシクロデキストリンを前記アミノ基と前記カルボキシ基とからなるアミド結合を介して結合させる工程と、前記シクロデキストリンが結合した前記セルロース担体における残存する前記アミノ基をマスキング剤でマスキングする工程と、を含む。

【0010】

上記実施形態において、前記アミノ基を有する前記セルロース担体は、カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させてなるものでもよい。

【0011】

上記実施形態においては、前記セルロース担体が粒子状セルロースでもよく、繊維状セルロースでもよい。また、前記繊維状セルロースは、平均繊維径１０ｎｍ未満の微細繊維状セルロースでもよい。

【0012】

上記実施形態においては、前記マスキングが前記アミノ基のアシル化であってもよい。

【0013】

上記実施形態に係る製造方法は、カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させることにより前記アミノ基を有する前記セルロース担体を得る工程を含んでもよい。

【0014】

上記実施形態に係る製造方法においては、前記セルロース担体に前記シクロデキストリンを結合させる工程において、前記カルボキシ基を有する前記シクロデキストリンを、活性エステル化法を用いて前記セルロース担体の前記アミノ基に対して反応させることで、前記アミド結合を介して前記セルロース担体に結合させてもよい。

【0015】

本発明の実施形態に係るエンドトキシンの除去された液体の製造方法は、上記エンドトキシン吸着剤と、エンドトキシンを含有する液体とを接触させることを含む。

【発明の効果】

【0016】

本発明の実施形態であると、高い選択性及び吸着性を有するエンドトキシン吸着剤を提供することができる。そのため、例えば核酸や酸性タンパク質等の酸性物質の共存下でもエンドトキシンを選択的に分離・除去することができ、酸性物質等の目的物質を含みかつエンドトキシンの除去された液体を製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】シクロデキストリンにカルボキシ基を導入する工程の一例を示す図

【図2】セルロース担体にアミノ基を導入する工程の一例を示す図

【図3】アミノ基を有するセルロース担体にカルボキシ基を有するシクロデキストリンを結合させる工程の一例を示す図

【図4】残存アミノ基をマスキングする工程の一例を示す図

【図5】（Ａ）は実施例２，（Ｂ）は比較例７についての、ＬＰＳを含むＤＮＡ水溶液からのＬＰＳ選択吸着能に及ぼすイオン強度の影響を示すグラフ

【発明を実施するための形態】

【0018】

本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤は、セルロース担体と、該セルロース担体に結合したシクロデキストリンとを備える。

【0019】

［セルロース担体］
セルロース担体は、シクロデキストリンを保持可能なセルロースからなる担体である。セルロース担体の形状としては、特に限定されず、繊維状、粒子状、シート状などが挙げられる。

【0020】

一実施形態において、セルロース担体は粒子状セルロースでもよい。粒子状セルロースとしては、例えば球状セルロース粒子でもよく、市販品として例えばＪＮＣ株式会社製の「セルファイン」が挙げられる。粒子状セルロースの平均粒径は、特に限定されず、例えば１～１０００μｍでもよく、１０～５００μｍでもよく、２０～２００μｍでもよく、５０～１５０μｍでもよい。

【0021】

本明細書において、平均粒径とは、レーザー回折・散乱法によって得られた粒度分布における積算値５０％での粒径をいう。

【0022】

一実施形態において、セルロース担体は繊維状セルロースでもよい。繊維状セルロースとしては、解繊処理によりミクロフィブリル化した微細繊維状セルロースが好ましく用いられる。微細繊維状セルロースとしては、例えば、平均繊維径が１０００ｎｍ未満であるセルロースナノファイバーを用いることが好ましい。微細繊維状セルロースの平均繊維径は、５００ｎｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ以下であり、更に好ましくは３０ｎｍ以下であり、特に好ましくは１０ｎｍ未満である。平均繊維径の小さい微細繊維状セルロースを用いることにより、比表面積を高めて、エンドトキシンの吸着率を高めることができる。微細繊維状セルロースの平均繊維径の下限は特に限定されないが、基本となるセルロースミクロフィブリルの幅が３ｎｍ程度であるため、通常は３ｎｍ以上である。

【0023】

微細繊維状セルロースとしては、天然セルロース繊維の結晶形であるセルロースＩ型結晶構造を有するものが好ましく用いられる。微細繊維状セルロースがＩ型結晶構造を有することは、例えば、広角Ｘ線回折像測定により得られる回折プロファイルにおいて、２θ＝１４°～１７°付近と、２θ＝２２°～２３°付近の２つの位置に典型的なピークをもつことから同定することができる。

【0024】

ここで、微細繊維状セルロースの平均繊維径は、次のようにして測定することができる。すなわち、固形分率で０．０５～０．１質量％の微細繊維状セルロースの水分散体を調製し、その水分散体を、親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストして、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の観察用試料とする。なお、大きな繊維径の繊維を含む場合には、ガラス上へキャストした表面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）像を観察してもよい。また、観察用試料は、例えば２％ウラニルアセテートでネガティブ染色してもよい。そして、構成する繊維の大きさに応じて５０００倍、１００００倍あるいは５００００倍のいずれかの倍率で電子顕微鏡画像による観察を行う。その際に、得られた画像内に縦横任意の画像幅の軸を想定し、その軸に対し、２０本以上の繊維が交差するよう、試料および観察条件（倍率等）を調節する。そして、この条件を満たす観察画像を得た後、この画像に対し、１枚の画像当たり縦横２本ずつの無作為な軸を引き、軸に交錯する繊維の繊維径を目視で読み取っていく。このようにして、最低３枚の重複しない表面部分の画像を、電子顕微鏡で撮影し、各々２つの軸に交錯する繊維の繊維径の値を読み取る（したがって、最低２０本×２×３＝１２０本の繊維径の情報が得られる）。このようにして得られた繊維径の相加平均を平均繊維径とする。

【0025】

微細繊維状セルロースの平均アスペクト比は、特に限定されず、例えば２～５０００でもよく、また、５０～１０００以上でもよく、１００～５００でもよい。

【0026】

ここで、微細繊維状セルロースの平均アスペクト比は、次のようにして測定することができる。すなわち、先に述べた方法に従い平均繊維径を算出する。また、同様の観察画像から微細繊維状セルロースの平均繊維長を算出する。詳細には、繊維の始点から終点までの長さ（繊維長）を最低１０本目視で読み取る。このようにして得られた繊維長の相加平均を算出し、平均繊維長とする。そして、これらの値を用いて平均アスペクト比を下記式に従い算出する。
平均アスペクト比＝平均繊維長（ｎｍ）／平均繊維径（ｎｍ）

【0027】

セルロース担体としては、アミノ基を有するセルロース担体が用いられる。アミノ基としては、一級アミノ基（－ＮＨ_２）が好ましい。アミノ基は、セルロース担体にシクロデキストリンを結合させるためにセルロース担体に導入されるものであり、シクロデキストリンのカルボキシ基と反応してアミド結合を形成する。このようにアミノ基はシクロデキストリンとの間で結合を形成するものであり、また結合を形成せずに残存するアミノ基も後述するようにマスキングされるため、マスキング後のシクロデキストリン固定化セルロース担体にはアミノ基は存在しなくてもよい。なお、一部のアミノ基がマスキングされずに残存してもよい。

【0028】

アミノ基を有するセルロース担体としては、例えば、（ア）カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させてなるもの、（イ）セルロース担体の水酸基を活性化して多価アミンと反応させてなるもの、（ウ）エポキシ基供与体のグラフト反応によりセルロース担体に導入したエポキシ基に多価アミンを反応させてなるものが挙げられる。これらの中でも、（ア）の実施形態が好ましく、カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させることで、セルロース担体にはアミド結合を介してアミノ基が導入される。なお、セルロース担体へのアミノ基の導入方法については、多価アミンの説明も含めて後述する。

【0029】

上記（ア）の実施形態において、カルボキシ基を有するセルロース担体としては、セルロース分子中のグルコースユニットの水酸基を酸化してなる酸化セルロースや、セルロース分子中のグルコースユニットの水酸基をカルボキシメチル化してなるカルボキシメチル化セルロースなどが挙げられる。

【0030】

なお、本明細書において、カルボキシ基は、酸型（－ＣＯＯＨ）だけでなく、塩型、即ちカルボン酸塩基（－ＣＯＯＸ、ここでＸはカルボン酸と塩を形成する陽イオン）も含む概念であり、酸型と塩型が混在してもよい。塩としては、特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。

【0031】

好ましい実施形態において、カルボキシ基を有するセルロース担体としては、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が選択的に酸化されてカルボキシ基に変性された酸化セルロースナノファイバーが挙げられる。該酸化セルロースナノファイバーは、木材パルプなどの天然セルロースをＮ－オキシル化合物の存在下、共酸化剤を用いて酸化させ、解繊（微細化）処理することにより得られる。Ｎ－オキシル化合物としては、一般に酸化触媒として用いられるニトロキシラジカルを有する化合物が用いられ、例えばピペリジンニトロキシオキシラジカルであり、特に２，２，６，６－テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）または４－アセトアミド－ＴＥＭＰＯが好ましい。ＴＥＭＰＯで酸化されたセルロースナノファイバーは、一般にＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー（ＴＯＣＮ）と称されている。

【0032】

［シクロデキストリン］
シクロデキストリン（ＣｙＤ）は、５～１２個のＤ－グルコースがα－１，４グリコシド結合により結合した環状オリゴ糖である。シクロデキストリンは、円錐台状の筒型構造を有し、その外側が親水性で、内側が疎水性である。そのため、シクロデキストリンは、その疎水性の内部空洞に、エンドトキシンのリピドＡの疎水性部分であるアルキル２本鎖を包接することで、エンドトキシンを捕捉する。一方、ＤＮＡ等の核酸や酸性タンパク質は一般に小さくとも２ｎｍ以上であるため、シクロデキストリンの内部空洞には入らない。そのため、エンドトキシンを選択的に捕捉することができる。

【0033】

シクロデキストリンとしては、例えば、グルコースが６個結合したα－シクロデキストリン（α－ＣｙＤ。空洞径：０．５～０．６ｎｍ）、グルコースが７個結合したβ－シクロデキストリン（β－ＣｙＤ。空洞径：０．７～０．８ｎｍ）、グルコースが８個結合したγ－シクロデキストリン（γ－ＣｙＤ。空洞径：０．９～１．０ｎｍ）が挙げられる。これらの中でもエンドトキシンの疎水性部分が入り込みやすいことから、γ－シクロデキストリンが好ましい。

【0034】

シクロデキストリンとしては、カルボキシ基を有するものが用いられる。カルボキシ基は、シクロデキストリンをセルロース担体に接合させるために導入されるものであり、セルロース担体のアミノ基と反応してアミド結合を形成する。このようにカルボキシ基はシクロデキストリンとの間で結合を形成するために導入されるものであるため、セルロース担体への結合後にはカルボキシ基は存在しなくてもよい。

【0035】

カルボキシ基を有するシクロデキストリンとしては、シクロデキストリンが本来有する水酸基をカルボキシメチル化してなるカルボキシメチル化シクロデキストリンが好ましく用いられる。その場合、シクロデキストリン分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基がカルボキシメチル化されたものが好ましい。カルボキシ基の導入量はシクロデキストリン1分子当たり１つ以上であればよく、通常は1つ導入すればよい。

【0036】

［エンドトキシン吸着剤］
本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤は、上記セルロース担体に上記シクロデキストリンが、セルロース担体の持つアミノ基とシクロデキストリンの持つカルボキシ基との反応により生じるアミド結合を介して結合され、更に残存するアミノ基がマスキングされたものである。シクロデキストリンがアミド結合を介してセルロース担体に導入されたことにより、アミド結合を持たないものに比べてエンドトキシンの吸着率を高めることができる。また、同吸着剤表面のシクロデキストリンの空孔内にエンドトキシンを捕捉することにより、エンドトキシンを選択的に吸着できる。さらに、同吸着剤は、イオン性相互作用により吸着能を発揮する残存アミノ基がマスキングされていることにより、試料溶液中のＤＮＡおよびタンパク質等の夾雑物をイオン性吸着することなく、エンドトキシンの選択吸着能を更に高めることができる。

【0037】

本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤において、シクロデキストリンの含有量は、所望のエンドトキシン吸着能が得られる限り、特に限定されない。例えば、吸着剤１ｇあたりで０．０５～０．７ｍｍｏｌ／ｇでもよく、０．１５～０．６ｍｍｏｌ／ｇでもよい。

【0038】

本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤において、マスキング後におけるアミノ基の含有量（即ち、マスキングされずに残存するアミノ基の含有量）は特に限定されないが、アニオン交換容量（ＡＥＣ）として、１．０ｍｅｑ／ｇ以下であることが好ましく、より好ましくは０．５ｍｅｑ／ｇ以下であり、更に好ましくは０．２ｍｅｑ／ｇ以下である。エンドトキシンの選択吸着能を高めるためにはイオン性相互作用による吸着をできるだけ少なくすることが好ましく、そのため、アミノ基の含有量はできるだけ少ないことが好ましい。

【0039】

セルロース担体に導入された全アミノ基を１００モル％として、そのうちシクロデキストリンが結合したアミノ基の比率は、１００モル％未満であれば特に限定されず、例えば４０～９０モル％でもよく、５０～８０モル％でもよい。また、該全アミノ基のうち、マスキング剤によりマスキングされたアミノ基の比率は０モル％よりも多ければ特に限定されず、例えば５～６０モル％でもよく、１５～４５モル％でもよい。

【0040】

［エンドトキシン吸着剤の製造方法］
本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤の製造方法は、アミノ基を有するセルロース担体にカルボキシ基を有するシクロデキストリンをアミド結合を介して結合させる工程と、得られたシクロデキストリン結合セルロース担体における残存するアミノ基をマスキングする工程と、を含む。詳細には、アミノ基を有するセルロース担体の調製工程とカルボキシ基を有するシクロデキストリンの調製工程も含めて、次の工程を含むことが好ましい。

【0041】

・工程１：シクロデキストリンにカルボキシ基を導入する工程
・工程２：セルロース担体にアミノ基を導入する工程
・工程３：セルロース担体にシクロデキストリンを結合させる工程
・工程４：残存するアミノ基をマスキングする工程

【0042】

工程１では、シクロデキストリンにカルボキシ基を導入することにより、カルボキシ基を有するシクロデキストリンを得る。カルボキシ基の導入方法は、特に限定されず、例えば、シクロデキストリンが本来有する水酸基をカルボキシメチル化してもよい。カルボキシメチル化する方法としては、シクロデキストリンをアルカリ水溶液に溶解させて、モノクロロ酢酸やモノブロモ酢酸などのハロ酢酸と反応させる方法が挙げられる。

【0043】

図１は、その一例として、γ－シクロデキストリンをモノクロロ酢酸と反応させてカルボキシメチル化シクロデキストリン（ＣＭ－ＣｙＤ）を得る工程を示したものである。

【0044】

工程２では、セルロース担体にアミノ基を導入することにより、アミノ基を有するセルロース担体を得る。なお、工程１と工程２の順序は逆でもよい。アミノ基の導入方法は、特に限定されず、例えば、（ア）カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させる方法でもよく、（イ）セルロース担体の水酸基を活性化した後、多価アミンと反応させる方法でもよく、（ウ）エポキシ基供与体のグラフト反応によりセルロース担体にエポキシ基を導入した後、該エポキシ基に多価アミンを反応させる方法でもよい。

【0045】

多価アミンとは、２つ以上のアミノ基を有するアミンである。多価アミンとしては、例えば、エチレンジアミン、テトラメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなどの脂肪族ジアミン、４，４’－ジアミノ－３，３’－ジメチルジシクロヘキシルメタン、ジアミンシクロヘキサン、イソホロンジアミン等の脂環族ジアミン、フェニレンジアミン、ジアミノナフタレン、キシリレンジアミン等の芳香族ジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、トリス（２－アミノエチル）アミン、トリス（３－アミノプロピル）アミン等の３価以上の脂肪族アミン、メラミン等の３価以上の芳香族アミン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のアミノ基を有するポリマーが挙げられる。これらはいずれか１種で又は２種以上組み合わせて用いることができる。

【0046】

上記（イ）の方法において、水酸基を活性化させる方法としては、例えば、エピクロロヒドリン、ｐ－トルエンスルホン酸クロリド、２－フルオロ－１－メチルピリジニウム等の活性化剤を用いる方法が挙げられる。

【0047】

上記（ウ）の方法において、エポキシ基供与体としては、例えば、メタクリル酸グリシジルやアクリル酸グリシジル等が挙げられる。

【0048】

好ましくは上記（ア）の方法である。その場合、カルボキシ基を有するセルロース担体と多価アミンとを直接反応させてもよいが、反応性を高めるために活性エステル化法を用いることが好ましい。すなわち、カルボキシ基を有するセルロース担体のカルボキシ基を、活性エステル化法を用いて多価アミンのアミノ基と反応させることにより、アミド結合を介してアミノ基を導入することが好ましい。

【0049】

活性エステル化法では、セルロース担体のカルボキシ基を活性化剤と縮合剤で活性化し、次いで活性化されたセルロース担体と多価アミンを縮合させることにより、セルロース担体にアミノ基が導入される。活性化エステル法における活性化および縮合は、適当な液体媒体中で実施することができる。液体媒体としては、例えば、水、水性緩衝液、有機溶媒が挙げられる。

【0050】

活性化剤としては、例えば、Ｎ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）、Ｎ－ヒドロキシ－５－ノルボルネン－２，３－ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）等のＮ－ヒドロキシ多価カルボン酸イミド類、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）等のＮ－ヒドロキシトリアゾール類、３－ヒドロキシ－４－オキソ－３，４－ジヒドロ－１，２，３－ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）等のＮ－ヒドロキシトリアジン類、２－ヒドロキシイミノ－２－シアノ酢酸エチルエステル、ペンタフルオロフェノールが挙げられる。

【0051】

縮合剤としては、例えば、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ・ＨＣｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等のカルボジイミド系縮合剤が挙げられる。

【0052】

カルボキシ基を有するセルロース担体に多価アミンを反応させてアミノ基を導入する場合、セルロース担体に存在する全てのカルボキシ基に対してアミノ基を導入してもよく、一部のカルボキシ基に対してアミノ基を導入してもよい。但し、カルボキシ基が残存すると、カチオン基を持つ塩基性物質に対してイオン的相互作用による吸着性を発揮することが考えられるため、残存カルボキシ基は少ない方が好ましい。エンドトキシン吸着剤における残存カルボキシ基の量は特に限定されないが、カチオン交換容量（ＣＥＣ）として、０．５ｍｅｑ／ｇ以下であることが好ましい。

【0053】

カチオン交換容量は、逆滴定および順滴定により測定される。詳細には、試料を精秤後三角フラスコに入れ、０．１ｍｏｌ／Ｌの塩酸をｐＨが２．５になるように試料溶液を撹拌しながら加える。溶液が白濁したのを確認したら遠心分離機で３０分、１４０００ｒｐｍで遠心する。上澄みとゲルをデカンテーションで分離し、上澄みを０．０５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液でフェノールフタレインを指示薬として滴定し、下記式によりＣＥＣ（カチオン交換容量）を算出する。
ＣＥＣ（ｍｅｑ／ｇ）＝（０．１×ｆａ×Ｖａ－０．０５×ｆｂ×Ｖｂ）÷Ｗ
ｆａ：使用した塩酸のファクター
ｆｂ：使用した水酸化ナトリウム水溶液のファクター
Ｖａ：塩酸の滴下量（ｍｌ）
Ｖｂ：水酸化ナトリウムの滴定量（ｍＬ）
Ｗ：試料の乾燥質量（ｇ）

【0054】

図２は、工程２の一例を示したものであり、セルロース担体としてＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー（ＴＯＣＮ）を用いて、ＴＯＣＮを緩衝液中に分散させ、ＴＯＣＮのカルボキシ基にＥＤＡＣ・ＨＣｌを反応させ、更にＮＨＳを反応させてカルボキシ基を活性エステル化する。これに多価アミンとしてエチレンジアミン（ＥＤＡ）を添加し反応させることにより、アミド結合を介してアミノ化されたＴＯＣＮ（ＥＤＡ－ＴＯＣＮ）を得ることができる。あるいはまた、活性エステル化したセルロース担体に多価アミンとしてポリアリルアミン（ＰＡＡ）を添加し反応させることにより、アミド結合を介してアミノ化されたＴＯＣＮ（ＰＡＡ－ＴＯＣＮ）を得ることができる。

【0055】

工程３では、アミノ基を有するセルロース担体に、カルボキシ基を有するシクロデキストリンを、アミノ基とカルボキシ基との反応により生じるアミド結合を介して結合（即ち、固定化）させる。これによりシクロデキストリンが固定化されたセルロース担体が得られる。

【0056】

工程３においては、アミノ基を有するセルロース担体とカルボキシ基を有するシクロデキストリンを直接反応させてもよいが、反応性を高めるために活性エステル化法を用いることが好ましい。すなわち、カルボキシ基を有するシクロデキストリンを、活性エステル化法を用いてセルロース担体のアミノ基に対して反応させることにより、アミド結合を介してセルロース担体に結合させることが好ましい。活性エステル化法では、シクロデキストリンのカルボキシ基を活性化剤と縮合剤で活性化し、次いで活性化されたシクロデキストリンとアミノ基を有するセルロース担体とを縮合させることにより、セルロース担体にアミド結合を介してシクロデキストリンが導入される。活性エステル化法を実施する際の液体媒体、活性化剤および縮合剤の具体例などは、工程２で上述したとおりである。

【0057】

工程３において、アミノ基を有するセルロース担体に対するカルボキシ基を有するシクロデキストリンの使用量は、所望のエンドトキシン吸着能が得られる限り、特に限定されない。例えば、アミノ基を有するセルロース担体１００質量部に対して、カルボキシ基を有するシクロデキストリンを１００～１００００質量部用いてもよく、２５０～８０００質量部用いても良く、５００～７０００質量部用いてもよい。

【0058】

工程３においてセルロース担体にシクロデキストリンを結合させた段階（即ち、工程４のマスキング前）でのアミノ基含有量は、特に限定されず、アニオン交換容量（ＡＥＣ）として、例えば０．００１～２．０ｍｅｑ／ｇでもよく、０．０１～１．０ｍｅｑ／ｇでもよく、０．１～０．５ｍｅｑ／ｇでもよい。

【0059】

図３は、工程３の一例を示したものであり、ＣＭ－ＣｙＤのカルボキシ基にＥＤＡＣ・ＨＣｌを反応させ、更にＮＨＳを反応させてカルボキシ基を活性エステル化する。これにＥＤＡ－ＴＯＣＮを反応させることにより、ＣＭ－ＣｙＤのカルボキシ基とＥＤＡ－ＴＯＣＮのアミノ基との反応により生じるアミド結合を介してＣｙＤがＴＯＣＮに結合した結合体（ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ）が得られる。あるいはまた、活性エステル化したＣＭ－ＣｙＤにＰＡＡ－ＴＯＣＮを反応させることにより、ＣＭ－ＣｙＤのカルボキシ基とＰＡＡ－ＴＯＣＮのアミノ基との反応により生じるアミド結合を介してＣｙＤがＴＯＣＮに結合した結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮ）が得られる。

【0060】

工程４では、シクロデキストリンが結合したセルロース担体における残存するアミノ基をマスキング剤でマスキングする。シクロデキストリンが結合せずに残存しているアミノ基をマスキングすることにより、残存アミノ基がイオン的相互作用により核酸や酸性タンパク質などの酸性物質を吸着してエンドトキシンの選択吸着能が低下することを抑制することができる。

【0061】

マスキング剤としては、アミノ基をマスキングすることができれば、特に限定されないが、アミノ基をアセチル化などのアシル化することができるアシル化剤を用いることができる。アシル化剤としては、例えば、無水酢酸、無水プロピオン酸などのカルボン酸無水物、塩化アセチルなどのカルボン酸ハロゲン化物などが挙げられる。好ましくは、無水酢酸を用いてアミノ基をアセチル化することである。

【0062】

マスキング剤の使用量は、特に限定されないが、シクロデキストリンが結合したセルロース担体における残存アミノ基の物質量（ｍｏｌ）以上の物質量で用いることが好ましい。なお、残存アミノ基を全てマスキングすることが好ましいが、全てのアミノ基をマスキングすることは困難であるため、本発明において残存するアミノ基がマスキングされたという場合、一部のアミノ基がマスキングされずに残存する場合も含まれる。

【0063】

図４は、工程４の一例を示したものであり、図４（Ａ）では上記ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮを無水酢酸でマスキングしている。多価アミンとしてＥＤＡのように２価アミンを用いる場合、ＣｙＤが結合した２価アミンには残存アミノ基はなく、ＣｙＤが結合していない２価アミンにアミノ基が残存している。そのため、該残存アミノ基（－ＮＨ_２）を無水酢酸によりアセチル化（－ＮＨ－ＣＯＣＨ_３）する。

【0064】

図４（Ｂ）は、上記ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮを無水酢酸でマスキングする工程を示している。多価アミンとしてＰＡＡのように３価以上のアミンを用いる場合、アミノ基は、ＣｙＤが結合していない多価アミンだけでなく、ＣｙＤが結合した多価アミンにも残存する場合がある。そのため、ＣｙＤが結合していない多価アミンの残存アミノ基だけでなく、ＣｙＤが結合した多価アミンに残存するアミノ基もマスキングされ得る。図４（Ｂ）では、後者、即ちＣｙＤが結合した多価アミンに残存するアミノ基が無水酢酸によりアセチル化された構造を示している。

【0065】

［エンドトキシン吸着剤の利用］
本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤は、エンドトキシンを除去するために用いることができる。エンドトキシン吸着剤と、エンドトキシンを含有する液体とを接触させることにより、エンドトキシンがエンドトキシン吸着剤に吸着されるので、エンドトキシンの除去された液体が得られる。そのため、一実施形態に係るエンドトキシンの除去された液体の製造方法は、本実施形態に係るエンドトキシン吸着剤と、エンドトキシンを含有する液体（以下、エンドトキシン含有液という。）とを接触させることを含む。

【0066】

エンドトキシンの除去された液体としては、例えば、エンドトキシンを除去することが求められるワクチンや血液製剤などの注射用液をはじめとする各種医療用液が挙げられる。そのため、処理対象とするエンドトキシン含有液には、エンドトキシンの他に、医療用液として含有されるべき目的物質が通常含まれる。よって、エンドトキシンの除去された液体の製造方法によれば、エンドトキシンの除去された目的物質を含有する液体が得られる。

【0067】

目的物質としては、特に限定されず、例えば、注射用液等の医療用液に含まれる有効成分が挙げられる。本実施形態では、酸性物質の共存下でエンドトキシンを選択的に除去することができるため、処理対象とするエンドトキシン含有液中でアニオン基（例えば、カルボキシル基、硫酸基、リン酸基等の酸性基）を有する物質を目的物質として含むことが好ましい。かかる酸性基を有する酸性物質としては、タンパク質、ペプチド、ホルモン、多糖類、核酸、脂質、ビタミンが挙げられる。例えば、酸性アミノ酸残基を含む酸性タンパク質や酸性ペプチドが挙げられる。また、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸が挙げられる。これらの目的物質は、いずれか１種含まれてもよく、２種以上含まれてもよい。

【0068】

処理対象とするエンドトキシン含有液において、エンドトキシン及び目的物質とともに含まれる液体としては、例えば、水、水溶液等の溶液、水性懸濁液等の懸濁液が挙げられる。

【0069】

エンドトキシン吸着剤は、そのままあるいは加工等した形態で、エンドトキシン含有液と接触させることができる。エンドトキシン吸着剤とエンドトキシン含有液とを接触させる方法は、特に限定されず、固体担体で液体試料を処理する公知の方法を適用することができ、例えばバッチ法や流動的分離法が挙げられる。

【0070】

バッチ法とは、容器内でエンドトキシン吸着剤とエンドトキシン含有液とを混合することで、エンドトキシン吸着剤とエンドトキシン含有液とを接触させる方法である。これにより、エンドトキシン吸着剤にエンドトキシンを吸着させることができるので、吸着後に混合液からエンドトキシン吸着剤を取り除くことで、エンドトキシンの除去された液体が得られる。

【0071】

流動的分離法とは、エンドトキシン吸着剤にエンドトキシン含有液を通液することにより、エンドトキシン吸着剤とエンドトキシン含有液とを接触させる方法である。例えば、エンドトキシン吸着剤を充填したカラムにエンドトキシン含有液を通す方法（カラム法）や、エンドトキシン吸着剤からなるフィルターにエンドトキシン含有液を通す方法（フィルター法）が挙げられ、カラムやフィルターでエンドトキシン吸着剤にエンドトキシンが吸着されることにより、エンドトキシン含有液からエンドトキシンが除去される。

【0072】

上記方法により得られるエンドトキシンの除去された液体は、処理対象であるエンドトキシン含有液と比較してエンドトキシンの含有量が低下していればよく、必ずしも全てのエンドトキシンが除去されたものには限定されない。例えば、エンドトキシンの除去された液体中のエンドトキシン含有量が、処理前のエンドトキシン含有液中のエンドトキシン含有量の２０％以下、１０％以下、または５％以下でもよい。また、エンドトキシンの除去された液体中のエンドトキシン含有量が２０ＥＵ／ｍＬ以下、１０ＥＵ／ｍＬ以下、または５ＥＵ／ｍＬ以下でもよい。

【0073】

また、エンドトキシンの除去された目的物質を含有する液体を得る場合、当該液体中における目的物質としての酸性物質の含有量は、処理対象とするエンドトキシン含有液中における酸性物質の含有量の９０％以上、９５％以上、９９％以上でもよい。

【実施例】

【0074】

以下、実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

【0075】

［実施例１：Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮの合成］
（１）工程１：カルボキシメチル化シクロデキストリンの調製
５００ｍＬの三ツ口フラスコに、γ－シクロデキストリン（γ－ＣｙＤ：東京化成工業株式会社）３０ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させたγ－ＣｙＤ水溶液と、水酸化ナトリウム３０．０８ｇを蒸留水１００ｍＬに溶解させた水酸化ナトリウム水溶液と、更に蒸留水１００ｍＬを加えて、攪拌機を用いて５０℃、３２０ｒｐｍで１０分間攪拌した。５０℃、３２０ｒｐｍの攪拌を続けながら、１．１５ｍｏｌ／Ｌモノクロロ酢酸水溶液（モノクロロ酢酸２．１８４８ｇを２０ｍＬの蒸留水に溶解させて調製）２０ｍＬを１時間かけて一滴ずつ添加した。その後、５０℃、３２０ｒｐｍの攪拌を２４時間続け、次いで、５００ｍＬビーカーに移し、室温まで２０分間冷却した。

【0076】

冷却後、塩酸で中和してから、エバポレータで濃縮した。濃縮は沈殿が生じ始めるくらいまで行い、中和後４５０ｍＬ程度であった水溶液を濃縮により２００ｍＬ程度にした。得られた濃縮液を貧溶媒であるアセトンにパスツールピペットを用いて一滴ずつ滴下することで沈殿させ、得られた沈殿物を風乾し、乾燥機で乾燥することにより白色沈殿物を得た。得られた白色沈殿物について、ＴＯＦ－ＭＳ及び１Ｈ－ＮＭＲにより、シクロデキストリン１分子あたり１つのカルボキシメチル基が導入された１置換体のカルボキシメチル化シクロデキストリン（ＣＭ－ＣｙＤ）が合成されたことを確認した。白色沈殿物は分離精製せず、次の工程に使用した。沈殿物の収量は６６ｄｒｙ－ｇ（乾燥状態での質量（以下同じ））、収率は６４乾燥質量％であった。

【0077】

（２）工程２：セルロース担体へのアミノ基の導入
セルロース担体としては、ＴＯＣＮ（ＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー：レオクリスタＩ－２ＳＸ、第一工業製薬株式会社製、セルロース濃度：２質量％、セルロースＩ型結晶構造：「あり」、平均繊維径：３ｎｍ、平均アスペクト比：２８０）を用いた。

【0078】

ＴＯＣＮ５０．３７ｗｅｔ－ｇ（湿潤状態での質量（以下同じ）。乾燥質量換算で１．０ｇ）を５００ｍＬビーカーに入れ、０．３ｍｏｌ／ＬのＮ－ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）溶液（３．４５３ｇのＮＨＳを２０ｍｍｏｌ／ＬのＭＥＳバッファー１００ｍＬに溶解して調製）６０ｍＬと、０．３ｍｏｌ／Ｌの１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ・ＨＣｌ）溶液（５．７５１ｇのＥＤＡＣ・ＨＣｌをＭＥＳバッファー１００ｍＬに溶解して調製）６０ｍＬを加えた。４００ｒｐｍ、室温で１時間攪拌した後、４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿物にｐＨ６．２０のＭＥＳバッファー１００ｍＬを加えて４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する操作を、ｐＨが６になるまで行った。これにより得られた活性エステル化されたＴＯＣＮを３００ｍＬ三角フラスコに移し、３３％エチレンジアミン（ＥＤＡ：和光純薬株式会社）溶液（エチレンジアミン５０ｍＬを蒸留水１００ｍＬで希釈して調製）を１５０ｍＬ添加し、２５℃、２００ｒｐｍで２４時間攪拌した。その後、４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間の遠心とデカンテーションによるＥＤＡの除去を、蒸留水を容器の７割ほど加えながら、上澄み液の色が無色透明になるまで繰り返して洗浄した。これにより、エチレンジアミンでアミノ化されたＴＯＣＮ（ＥＤＡ－ＴＯＣＮ）を得た。ＥＤＡ－ＴＯＣＮの収量は０．９５ｄｒｙ－ｇ、収率は９５乾燥質量％であった。また、ＥＤＡ－ＴＯＣＮのアミノ基含有量は２．１ｍｅｑ／ｇであった。

【0079】

（３）工程３：セルロース担体へのＣｙＤの結合
３００ｍＬの三ツ口フラスコに、ＣＭ－ＣｙＤ５０ｇをＭＥＳバッファー７０ｍＬに溶解させたＣＭ－ＣｙＤ水溶液、２．８ｇのＥＤＡＣ・ＨＣｌ、１．７ｇのＮＨＳを加えて、２５℃、２００ｒｐｍで１時間攪拌して活性エステル化を行った。これにＥＤＡ－ＴＯＣＮ２０ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．８ｇ）を加え、２５℃、２００ｒｐｍで２４時間攪拌した。その後、４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間の遠心とデカンテーションによるＥＤＡＣ・ＨＣｌとＮＨＳの除去を、蒸留水を加えながら行った。これにより、ＣｙＤ固定化ＥＤＡ－ＴＯＣＮ（ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ）を得た。ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮの収量は２２ｗｅｔ－ｇであった。また、ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮのアミノ基含有量は０．５ｍｅｑ／ｇに減少したことから、ＥＤＡ－ＴＯＣＮにＣｙＤが結合したことが確認できた。

【0080】

（４）工程４：アミノ基のマスキング
２００ｍＬの三角フラスコに、蒸留水１００ｍＬ、酢酸ナトリウム４．３４ｇ、炭酸水素ナトリウム８．３４ｇを加えて溶解させた。ここに、ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ１２ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．５ｇ）を入れ、無水酢酸５ｍＬをパスツールピペットを用いて一滴ずつ滴下し、２５℃、２００ｒｐｍで３時間振とうした。その後、４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間の遠心とデカンテーションによる無水酢酸の除去を、蒸留水を加えながら行った。これにより、無水酢酸で残存アミノ基がマスキングされたＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ（Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ）を得た。Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮの収量は８．４ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．４８ｇ）であった。また、Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮのアミノ基含有量は０．１ｍｅｑ／ｇに減少したことから、ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮの残存アミノ基がマスキングされたことが確認できた。

【0081】

［実施例２：Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮの合成］
実施例１の工程２において、３３％ＥＤＡ水溶液１５０ｍＬを添加して２５℃，２００ｒｐｍで２４時間攪拌する代わりに、１６．５％ポリアリルアミン塩酸塩（ＰＡＡ―ＨＣｌ－０１：ニットボーメディカル株式会社、平均分子量約１６００）溶液（３３％ＰＡＡ－ＨＣｌ溶液１００ｍＬに４ＭＮａＯＨ溶液１００ｍＬを加え、ｐＨ１１．０に調製）２００ｍＬを添加して４５℃，２００ｒｐｍで６時間攪拌し、その他は実施例１と同様にして、ＣｙＤがアミド結合を介してＴＯＣＮに結合した結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮ）の残存アミノ基をマスキングしてなるＭａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮを得た。Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮの収量は８．０ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．５ｇ）であった。

【0082】

［実施例３：Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－セルロース粒子の合成］
工程１：実施例１と同様に行った。

【0083】

工程２：セルロース担体としては、セルロース粒子（カルボキシメチルセルロースビーズ：Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｃ－５００、ＪＮＣ株式会社製、２０％エタノール懸濁液、粒径：４０～１３０μｍ）を用いた。

【0084】

セルロース粒子５０ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で４．５ｇ）をガラスフィルター１７Ｇに入れ、アスピレーターで吸引しながら４００ｍＬの蒸留水で洗浄し、２０％エタノール液から蒸留水に置換した。これを３００ｍＬの三角フラスコに移し、０．３ｍｏｌ／ＬのＮＨＳ溶液６０ｍＬと０．３ｍｏｌ／ＬのＥＤＡＣ溶液６０ｍＬを加え、２５℃、２００ｒｐｍで１時間撹拌した。撹拌後、ガラスフィルター１７Ｇに入れ、４００ｍＬの蒸留水で吸引ろ過洗浄した。活性エステル化されたセルロース粒子を３００ｍＬ三角フラスコに移し、１６．５％ＰＡＡ－ＨＣｌ溶液２００ｍＬを加えて、２５℃、２００ｒｐｍで１９時間攪拌した。撹拌後、ガラスフィルター１７Ｇに入れ、ｐＨ７．０付近になるまで蒸留水で吸引ろ過洗浄した。これにより、ＰＡＡ－ＨＣｌでアミノ化されたセルロース粒子（ＰＡＡ－セルロース粒子）を得た。

【0085】

工程３、４：実施例１の工程３、４において、４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離する代わりに、ガラスフィルター１７Ｇを用いてアスピレーターで吸引ろ過洗浄し、その他は実施例１と同様にして、ＣｙＤがアミド結合を介してセルロース粒子に結合した結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－セルロース粒子）の残存アミノ基をマスキングしてなるＭａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－セルロース粒子を得た。Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－セルロース粒子の収量は９．６７ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で１．２５ｇ）であった。

【0086】

［実施例４：Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦの合成］
工程１：実施例１と同様に行った。

【0087】

工程２：セルロース担体としては、微細繊維状セルロース（ＣＮＦ：セリッシュ ろか名人、ダイセルファインケム株式会社製、セルロース濃度：３３～３７質量％、セルロースＩ型結晶構造：「あり」、平均繊維径：５３ｎｍ、平均アスペクト比：２５０）を用いた。

【0088】

５００ｍＬセパラブルフラスコに蒸留水９０ｍＬ、水酸化ナトリウム９．９６ｇを加えて溶解させた。ここに、ＣＮＦ２５ｗｅｔ－ｇ（湿潤状態での質量、乾燥質量換算で８．２５ｇ）を入れ、水浴中で３０℃に保ちつつ３００ｒｐｍで１時間撹拌した。クロロメチルオキシラン１６０ｍＬを加え、更に３０℃で２時間撹拌した。ガラスフィルター１７Ｇに入れ、アスピレーターで吸引しながらアセトン、エタノール、蒸留水の順で、クロロメチルオキシラン特有の臭いが消えるまで洗浄し、エポキシ化ＣＮＦを得た。

【0089】

３００ｍｌ三角フラスコにＥＤＡ溶液１００ｍＬを添加して、２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液７８ｍＬを添加してｐＨ９にした。ここに、エポキシ化ＣＮＦを加え、４５℃で４時間撹拌した。ガラスフィルター１７Ｇに入れ、アスピレーターで吸引しながらアセトン、蒸留水、メタノールの順で洗浄し、ＥＤＡ－ＣＮＦを得た。

【0090】

工程３：５００ｍＬセパラブルフラスコに、ＣＭ－ＣｙＤ５２．７ｇをＭＥＳバッファー２００ｍＬに溶解させたＣＭ－ＣｙＤ水溶液、２．８ｇのＥＤＡＣ・ＨＣｌ、１．７ｇのＮＨＳ、ＥＤＡ－ＣＮＦ１７ｗｅｔ－ｇを加えて、２５℃、２００ｒｐｍで２４時間攪拌した。その後、ガラスフィルター１７Ｇに入れ、アスピレーターで吸引しながらアセトン、蒸留水、メタノールの順で洗浄し、ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦを得た。

【0091】

工程４：５００ｍＬの三角フラスコに、蒸留水２００ｍＬ、酢酸ナトリウム４．３４ｇ、炭酸水素ナトリウム８．３４ｇを加えて溶解させた。ここに、ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦ７ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．３ｇ）を入れ、無水酢酸５ｍＬをパスツールピペットを用いて一滴ずつ滴下し、２５℃、２００ｒｐｍで６時間振とうした。その後、ガラスフィルター１７Ｇに入れ、アスピレーターで吸引しながらアセトン、蒸留水、メタノールの順で洗浄し、Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ―ＥＤＡ－ＣＮＦを得た。Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦの収量は５．３ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．３ｇ）であった。

【0092】

［実施例５：Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＣＮＦの合成］
実施例４の工程２において、ＥＤＡ水溶液１００ｍｌを添加する代わりに、ＰＡＡ―ＨＣｌ溶液１２０ｍＬを添加した。その他は実施例４と同様にして、ＣｙＤがアミド結合を介してＣＮＦに結合した結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＣＮＦ）の残存アミノ基をマスキングしてなるＭａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＣＮＦを得た。Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦの収量は５．２ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．３ｇ）であった。

【0093】

［比較例１：ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ］
実施例１における工程３までで得られる、ＣｙＤがＥＤＡを介してＴＯＣＮに結合した結合体であり、残存アミノ基がマスキングされていない結合体（ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＴＯＣＮ）を用いた。

【0094】

［比較例２：ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮ］
実施例２における工程３までで得られる、ＣｙＤがＰＡＡを介してＴＯＣＮに結合した結合体であり、残存アミノ基がマスキングされていない結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＴＯＣＮ）を用いた。

【0095】

［比較例３：ＣｙＤ－ＰＡＡ－セルロース粒子］
実施例３における工程３までで得られる、ＣｙＤがＰＡＡを介してセルロース粒子に結合した結合体であり、残存アミノ基がマスキングされていない結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－セルロース粒子）を用いた。

【0096】

［比較例４：ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦ］
実施例４における工程３までで得られる、ＣｙＤがＥＤＡを介してＣＮＦに結合した結合体であり、残存アミノ基がマスキングされていない結合体（ＣｙＤ－ＥＤＡ－ＣＮＦ）を用いた。

【0097】

［比較例５：ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＣＮＦ］
実施例５における工程３までで得られる、ＣｙＤがＰＡＡを介してＣＮＦに結合した結合体であり、残存アミノ基がマスキングされていない結合体（ＣｙＤ－ＰＡＡ－ＣＮＦ）を用いた。

【0098】

［比較例６：Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＣＮＦ（塩化トシル使用）の合成］
（１）工程１：アミノ化シクロデキストリンの調製
グローブバッグ(GLOVE BAG、Glas-Col、S-20-20)に１Ｌ三口丸底フラスコ、１００ｍＬ滴下ロート、ピリジン試薬、ＣｙＤ試薬、セプタムキャップ、簡易天秤をいれ、減圧吸引と窒素通気を３回繰り返し行った。その後、グローブバッグ内で、フラスコ内にＣｙＤ５．０ｇをピリジン２７５ｍＬに溶かし、反応装置を組み立て、グローブバッグから取出した後ドラフトに移動させた。この時、滴下ロートには１００ｍＬのピリジンに塩化トシル７．５ｇを溶かし、フラスコに取り付けた。６５０ｒｐｍで撹拌を開始し、塩化トシル溶液を１滴ずつ１７分かけて滴下した。

【0099】

ＣｙＤのトシル化の様子を薄層クロマト（ＴＬＣ）により確認した。ＴＬＣの展開溶媒は、１－ブタノール：メタノール：水＝５：４：３で作成した。ＴＬＣはヨウ素で焼いたものに注目した。ＣｙＤについてＲｆ値０．４３８にスポットが現れ、塩化トシルとピリジンではヨウ素でスポットが確認できず、トシル１置換体はＲｆ値０．６１５、２置換体は０．６７１、３置換体は０．７１５のところにスポットが現れた。トシル置換体が合成され、原料のＣｙＤのスポットが確認されなくなったところでイオン交換水を反応系に加え、トシル化反応を停止させた。反応溶液を濃縮させ、１００倍量のアセトンで再沈殿し、遠心分離（１４００ｒｐｍ、３０分、４℃）で回収し、真空乾燥させてトシル化ＣｙＤを得た。

【0100】

３００ｍＬナスフラスコに、トシル化ＣｙＤ７．６５ｇ、ＥＤＡ１００ｍＬを加え、４０℃、４００ｒｐｍで２４時間反応させた。その後、エバポレータで反応液が約２０ｍＬになるまで濃縮させ、アセトンで再沈殿させた。ここで現れた結晶を遠心分離（１４００ｒｐｍ、３０分、４℃）で集め、水１３ｍＬとメタノール３９ｍＬの混合液に再溶解させた。その後、再びアセトンで再沈殿し、遠心分離で結晶を回収し、真空乾燥させてアミノ化ＣｙＤを得た。

【0101】

（２）工程２：セルロース担体へのエポキシ基の導入
２００ｍＬ三角フラスコに、ＣＮＦ１０ｗｅｔ－ｇと１０（ｗ/ｗ）％ＮａＯＨ水溶液を１２５ｍＬ加え、３０℃、５００ｒｐｍで１時間撹拌した。次にエピクロロヒドリンを６０ｍＬ加え、３０℃、５００ｒｐｍで１時間撹拌した。エピクロロヒドリンの臭いが消えるまで、蒸留水で吸引ろ過洗浄し、エポキシ化ＣＮＦを得た。

【0102】

（３）工程３：セルロース担体へのＣｙＤの結合
１００ｍＬ三角フラスコに、エポキシ化ＣＮＦ、アミノ化ＣｙＤ１．０ｇ、０．０１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム１００ｍＬを入れ、４５℃、５００ｒｐｍで４時間撹拌した。蒸留水、メタノールの順で吸引ろ過洗浄し、ＣｙＤ－ＣＮＦを得た。

【0103】

（４）工程４：アミノ基のマスキング
５００ｍＬの三角フラスコに、蒸留水２００ｍＬ、酢酸ナトリウム４．３４ｇ、炭酸水素ナトリウム８．３４ｇを加えて溶解させた。ここに、ＣｙＤ－ＣＮＦ４．０ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．４ｇ）を入れ、無水酢酸５ｍＬを滴下し、２５℃、２００ｒｐｍで６時間振とうした。その後、吸引ろ過洗浄し、Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＣＮＦを得た。Ｍａｓｋｅｄ－ＣｙＤ－ＣＮＦの収量は２．８ｗｅｔ－ｇ（乾燥質量換算で０．４ｇ）であった。

【0104】

［比較例７：ＰＡＡ－ＴＯＣＮ］
実施例２における工程２までで得られる、ＰＡＡが導入されたＴＯＣＮ（ＰＡＡ－ＴＯＣＮ）を用いた。

【0105】

［比較例８：ＰＡＡ－セルロース粒子］
実施例３における工程２までで得られる、ＰＡＡが導入されたセルロース粒子（ＰＡＡ－セルロース粒子）を用いた。

【0106】

実施例１～５及び比較例１～８で得られた各吸着剤について、アミノ基含有量およびシクロデキストリン含有量を求めるとともに、吸着性能を評価した。各評価方法は以下のとおりである。

【0107】

［アミノ基含有量］
アミノ基含有量は、アニオン交換容量（ＡＥＣ：Anion Exchange Capacity）として、逆滴定法により測定した。詳細には、試料を２４時間以上減圧乾燥し、精秤後三角フラスコに入れた。ファクター既知の０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸３０ｍＬを加え、振とう機を用いて２５℃、２００ｒｐｍで２時間振とうした。ろ紙を用いてろ過し、ろ液２０ｍＬを蒸留水で１００ｍＬに希釈した。希釈溶液１０ｍＬを別の三角フラスコにとり、ファクター既知の０．０５ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液でフェノールフタレインを指示薬として滴定し、下記式によりＡＥＣ（アミノ基含有量）を算出した。
ＡＥＣ（ｍｅｑ／ｇ）＝（0.1×ｆａ×30－0.05×ｆｂ×Ｖ×30／20）÷Ｗ
ｆａ：使用した塩酸のファクター
ｆｂ：使用した水酸化ナトリウム水溶液のファクター
Ｖ：滴定量（ｍＬ）
Ｗ：試料の乾燥質量（ｇ）

【0108】

［シクロデキストリン含有量］
上記で算出した、アミノ基導入（工程２）後のＡＥＣ値とＣｙＤ固定化（工程３）後のＡＥＣ値との差から、下記式によりＣｙＤ含有量を算出した。
（工程３のＡＥＣ値－工程２のＡＥＣ値）（ｍｍｏｌ）／１０００×１２９７（ｇ／ｍｏｌ）＝ＣｙＤ固定化量（ｇ）
ＣｙＤ固定化量／（ＣｙＤ固定化量＋セルロース担体１ｇ）＝ＣｙＤ含有量（ｇ／ｇ）
ＣｙＤ含有量／ＣｙＤ分子量×１０００＝ＣｙＤ含有量（ｍｍｏｌ／ｇ）

【0109】

［吸着性能評価］
吸着対象物として以下の物質を用い、これらが負に帯電する条件で吸着性能の評価を行った。
・ＤＮＡ：Ｄ３５３４、東京化成工業，ｐＫａ＜２、平均分子量約３０万
・ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ナカライテスク、ｐＩ＝４．９、分子量６９０００
・ＬＰＳ：エンドトキシン（リポポリサッカライド、大腸菌Ｏ５５：Ｂ５由来）、チャールス・リバー・ラボラトリーズ、ｐＫａ＜２

【0110】

各吸着剤をガラスフィルター上で、０．２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨｉｎ９５％ＥｔＯＨ４００ｍＬで洗浄した。滅菌済みの純水４００ｍＬでろ液が中性になるまで洗浄を繰り返したのち、少量のリン酸バッファーで洗浄した後、以下の吸着性能評価を行った。

【0111】

・ＤＮＡ吸着性能評価
２０ｍＬ三角フラスコに、洗浄した各吸着剤０．２ｗｅｔ－ｇと５０μｇ／ｍＬのＤＮＡ溶液（ＤＮＡ０．００５ｇを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ＝６．０）１００ｍＬに溶解させて調製）２ｍＬを入れて、インキュベーター内で２５℃、２００ｒｐｍで２時間振とうした。吸着剤を含む溶液をシリンジで吸い取り、０．８μｍメンブランフィルターでろ過した。分光光度計で波長２５０～２６０ｎｍのろ液の吸光度を測定し、残存ＤＮＡ量を算出した。仕込みのＤＮＡ量から差し引くことでＤＮＡ吸着率を算出した。

【0112】

・ＢＳＡ吸着性能評価
２０ｍＬ三角フラスコに、洗浄した各吸着剤０．２ｗｅｔ－ｇと１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（ＢＳＡ０．１ｇを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ＝６．０）１００ｍＬに溶解させて調製）２ｍＬを入れて、インキュベーター内で２５℃、２００ｒｐｍで２時間振とうした。吸着剤を含む溶液をシリンジで吸い取り、０．８μｍメンブランフィルターでろ過した。分光光度計で波長２６０～２８０ｎｍのろ液の吸光度を測定し、残存ＢＳＡ量を算出した。仕込みのＢＳＡ量から差し引くことでＢＳＡ吸着率を算出した。

【0113】

・ＬＰＳ吸着性能評価
ガラス器具や薬さじはオートクレーブに入れて、２５０℃で３時間滅菌して用いた。また、ガラスフィルターやリン酸バッファーは１２１℃で３０分蒸気滅菌して用いた。

【0114】

試料中のエンドトキシンの定量は、市販のエンドトキシン測定装置としてＥＧリーダーＳＶ－１２（生化学工業株式会社製）を用い、リムルス試薬としてエンドスペシーＥＳ－２４Ｓセット、凍結乾燥品（生化学工業株式会社製）を用いた比色法により行った。ＬＰＳ定量の直前に、リムルス試薬の入った専用チューブに、付属の希釈緩衝液０．２ｍＬを添加し溶解させたものをリムルス試薬溶液として用いた。

【0115】

２０ｍＬ三角フラスコに、洗浄した各吸着剤０．２ｗｅｔ－ｇと５０ＥＵ／ｍＬのＬＰＳ溶液（ＬＰＳ１μｇを０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸バッファー（ｐＨ＝６．０）１００ｍＬに溶解させて調製）２ｍＬを入れて、インキュベーター内で２５℃、２００ｒｐｍで２時間振とうした。吸着剤を含む溶液をシリンジで吸い取り、０．８μｍメンブランフィルターでろ過した。ろ液を大塚水（ＬＰＳフリーの蒸留水；大塚製薬株式会社製）で１００倍希釈したものを試料とする。同試料０．２ｍＬを上記リムルス試薬溶液の入ったＥＧリーダーＳＶ－１２専用チューブに加え、ボルテックスミキサーでよく混合した。チューブをＥＧリーダーＳＶ－１２に設置し、比色法により、ＬＰＳ残存濃度を測定した。仕込みのＬＰＳ濃度から差し引くことでＬＰＳ吸着率を算出した。

【0116】

・ＤＮＡ／ＬＰＳ混合溶液からのＬＰＳ吸着性能評価
２０ｍＬ三角フラスコに、洗浄した各吸着剤０．２ｗｅｔ－ｇとＤＮＡ／ＬＰＳ混合溶液（ＤＮＡ：１００μｇ／ｍＬ，ＬＰＳ：５０ＥＵ／ｍＬ，ｐＨ＝６．０，イオン強度（μ）＝０．０５～０．８）２ｍＬを入れて、インキュベーター内で２５℃、２００ｒｐｍで２時間振とうした。試料溶液のイオン強度は、塩化ナトリウムの濃度で調節した。吸着剤を含む溶液をシリンジで吸い取り、０．８μｍメンブランフィルターでろ過した。ろ液中の残存ＤＮＡ量およびＬＰＳ量を測定し、仕込みのＤＮＡ量およびＬＰＳ量から差し引くことでＤＮＡ吸着率およびＬＰＳ吸着率を算出した。

【0117】

【表1】

【0118】

結果は表１に示すとおりである。リガンドとしてのシクロデキストリンを導入していない比較例７，８では、エンドトキシンとＤＮＡのどちらに対しても高い吸着能を示しており、選択吸着性に劣っていた。比較例１～５では、シクロデキストリンを導入していたため、エンドトキシンに対する高い吸着性が認められたが、残存アミノ基をマスキングしていないため、酸性物質であるＤＮＡ及び／又はＢＳＡも吸着しており、選択吸着性に劣っていた。

【0119】

これに対し、アミノ基が導入されたセルロース担体にアミド結合を介してシクロデキストリンを導入し、残存アミノ基をマスキングした実施例１～５であると、エンドトキシンに対する高い吸着性が認められるとともに、ＤＮＡ及びＢＳＡに対しては吸着性を持たず、そのため選択吸着性に優れていた。実施例１～５の中で比較すると、微細繊維状セルロースを担体とする場合でも、平均繊維径がより小さいＴＯＣＮを用いた実施例１，２では、実施例４，５よりもシクロデキストリンの導入量が多く、エンドトキシンの吸着性により優れていた。また、実施例１，２は、セルロース担体としてセルロース粒子を用いた実施例３よりも、エンドトキシンの吸着性に優れていた。

【0120】

比較例６は、塩化トシルを用いてシクロデキストリンをアミノ化し、これをエポキシ化ＣＮＦと反応させることでＣＮＦにシクロデキストリンを導入したものであり、アミド結合を介してシクロデキストリンをセルロース担体に導入した実施例１～５とは異なる。実施例１～５及び比較例６ともに、セルロース担体のアミノ基又はエポキシ基に対してシクロデキストリンのカルボキシ基又はアミノ基が過剰になるように仕込んで反応させているにもかかわらず、実施例１～５は比較例６に対してシクロデキストリンの導入量が多かった。実施例１～５では、比較例６に対してエンドトキシンの吸着率が高く、エンドトキシン吸着剤として優れていることが分かった。

【0121】

ＬＰＳを含むＤＮＡ水溶液からのＬＰＳ選択吸着能に及ぼすイオン強度の影響を調べた結果を図５に示す。図５（Ｂ）に示すように、比較例７では、負に帯電するＬＰＳとＤＮＡの両方に対して高い吸着能を示しており、イオン強度の増加に伴って両方に対する吸着能が低下する傾向があった。一方、図５（Ａ）に示すように、実施例２では、幅広いイオン強度域で、ＤＮＡを吸着することなく、高いＬＰＳの吸着率を保っていた。そのため、実施例２の吸着剤は、ＣｙＤの内側キャビティの疎水性を利用してＬＳＰを疎水吸着していることがわかる。

【0122】

以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】