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特許7463000ヒトｃｌａｕｄｉｎ及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-03-29
(45)【発行日】2024-04-08
(54)【発明の名称】ヒトｃｌａｕｄｉｎ及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240401BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240401BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240401BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240401BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240401BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240401BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240401BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240401BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240401BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240401BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240401BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240401BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240401BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240401BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240401BHJP
A61K 51/00 20060101ALI20240401BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13 ZNA
C07K16/28
C07K16/46
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/63 Z
C12P21/08
A61P35/00
A61P35/02
A61P31/00
A61P37/02
A61P37/04
A61K39/395 N
A61K39/395 U
A61K51/00 200
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2023507848
(86)(22)【出願日】2021-04-25
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-05-30
(86)【国際出願番号】 CN2021089729
(87)【国際公開番号】W WO2021218874
(87)【国際公開日】2021-11-04
【審査請求日】2022-12-09
(31)【優先権主張番号】202010344676.8
(32)【優先日】2020-04-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】522419931
【氏名又は名称】啓愈生物技術（上海）有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ク，シャンドン
(72)【発明者】
【氏名】潘琴
(72)【発明者】
【氏名】金后聰
(72)【発明者】
【氏名】鄭翰
(72)【発明者】
【氏名】都業杰
【審査官】福間 信子
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１９－５２４６９３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１９／２４２５０５（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／２１９０８９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０２０／０２３６７９（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体を含み、
前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の三つの重鎖ＣＤＲ及び三つの軽鎖ＣＤＲが、
（Ｚ１）配列番号９３、９４、９５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号９０、９１、９２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ２）配列番号７５、７６、７７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、７４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ３）配列番号７９、８０、８１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、７８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ４）配列番号８３、８４、８５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、８２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ５）配列番号８７、８８、８９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、８６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３からなる群より選択され、
前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、単一ドメイン抗体であり、前記単一ドメイン抗体の三つの相補的決定領域ＣＤＲは、配列番号６９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号７０又は９６で示されるＨＣＤＲ２と配列番号７１で示されるＨＣＤＲ３を含むことを特徴とする、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体。
【請求項2】
前記二重特異性抗体は、二つの単量体からなる二量体であり、前記単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで式Ｉで表される構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性抗体。【化1】
（ここで、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して結合又はリンカーエレメントであり、
ＶＨはヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域を表し、
ＶＬはヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＨはヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖定常領域を表し、
ＣＬはヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨＨは抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を表し、
「－」はペプチド結合を表し、
「～」はジスルフィド結合又は共有結合を表す。）
【請求項3】
前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３、又は配列番号３４で示される通りであり、前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、又は配列番号３０で示される通りであり、
前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号５１、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号５４で示される通りであることを特徴とする、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
【請求項4】
前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号３１で示される通りであり、及び、前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２９で示される通りであり、及び、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号５１で示される通りである；または、前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号５で示される通りであり、及び、前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号１で示される通りであり、及び、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号５１で示される通りである；または、
前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号１７で示される通りであり、及び、前記ヒト化抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号１６で示される通りであり、及び、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号５１で示される通りであることを特徴とする、請求項３に記載の二重特異性抗体。
【請求項5】
前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は、配列番号６３で示され、及び、前記二重特異性抗体のＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号６４で示される通りである；または、前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は、配列番号５９で示され、及び、前記二重特異性抗体のＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号６０で示される通りである；または、
前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は、配列番号６１で示され、及び、前記二重特異性抗体のＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号６２で示される通りであることを特徴とする、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードすることを特徴とする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項7】
請求項６に記載のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする、ベクター。
【請求項8】
請求項７に記載のベクターを含有し、又は請求項６に記載のポリヌクレオチドをゲノムに組み込まれていることを特徴とする、遺伝子操作された宿主細胞。
【請求項9】
（ｉ）請求項８に記載の宿主細胞を適当な条件で培養して、前記二重特異性抗体を含有する混合物を得るステップ、（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた混合物を精製及び／又は分離して、前記二重特異性抗体を得るステップ、を含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の製造方法。
【請求項10】
（ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項11】
（ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、及び（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素からなる群より選択される共役部分を含むことを特徴とする、免疫複合体。
【請求項12】
腫瘍の増殖の阻害における使用のため、または、がん（又は腫瘍）、感染症又は免疫調節疾患の治療における使用のための、請求項１～５のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項13】
前記がん又は腫瘍は、結直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、前立腺がん、腎臓がん、子宮頸部がん、骨髄がん、リンパがん、白血病、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、鼻咽頭がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、基底細胞がん、扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、神経膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、と骨髄異形成症候群からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の使用のための二重特異性抗体。【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔技術分野〕
本発明はヒトｃｌａｕｄｉｎ及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用に関し、生物医学の分野に属する。
本発明はヒトｃｌａｕｄｉｎ及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用に関し、生物医学の分野に属する。
【0002】
〔背景技術〕
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は二重機能抗体とも呼ばれ、二つの異なる抗原とエピトープを同時に認識して結合し、二つの異なるシグナル伝達経路をブロックしてその役割を果たす。ＢｓＡｂは、通常の抗体と比較して特異的な抗原結合部位が一つ多いため、治療面で以下の利点を示す：
腫瘍に対する免疫細胞の殺傷を媒介する：二重特異性抗体の一つの重要な作用機序は免疫細胞の殺傷を媒介することであり、二重特異性抗体には２本の抗原結合アームがあり、その中の１本は標的抗原と結合し、もう１本はエフェクター細胞上の標識抗原と結合し、後者はエフェクター細胞を活性化して、腫瘍細胞を標的にして殺傷させることができる。
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は二重機能抗体とも呼ばれ、二つの異なる抗原とエピトープを同時に認識して結合し、二つの異なるシグナル伝達経路をブロックしてその役割を果たす。ＢｓＡｂは、通常の抗体と比較して特異的な抗原結合部位が一つ多いため、治療面で以下の利点を示す：
腫瘍に対する免疫細胞の殺傷を媒介する：二重特異性抗体の一つの重要な作用機序は免疫細胞の殺傷を媒介することであり、二重特異性抗体には２本の抗原結合アームがあり、その中の１本は標的抗原と結合し、もう１本はエフェクター細胞上の標識抗原と結合し、後者はエフェクター細胞を活性化して、腫瘍細胞を標的にして殺傷させることができる。
【0003】
二重標的シグナルブロッキングは、ユニーク又は重複した機能を果たし、薬剤耐性を効果的に防止する：同時に二重標的と結合し、二重シグナル伝達経路を遮断することは、二重特異性抗体のもう一つの重要な作用機序である。受容体チロシンキナーゼ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ、ＲＴＫｓ）は最大の酵素結合受容体であり、細胞増殖過程に重要な調節役割を果たし、例えば、Ｈｅｒファミリーなどである。ＲＴＫｓは腫瘍細胞表面で異常に高発現し、腫瘍細胞の悪性増殖を引き起こすため、腫瘍治療の重要な標的でもある。ＲＴＫｓに対する単一標的モノクローナル抗体は腫瘍治療に広く用いられているが、腫瘍細胞はシグナル伝達経路を切り替えるか、又はＨＥＲファミリーメンバー自身又は異なるメンバー間のホモダイマー又はヘテロダイマーによる細胞内シグナルを活性化することによって免疫回避をすることができる。従って、二つ以上のＲＴＫｓ又はそのリガンドを同時にブロックする二重特異性抗体薬物の使用は、腫瘍細胞の回避を低減し、治療効果を向上させることができる。
【0004】
より強い特異性、標的性を持ち、オフターゲットを低減させる：二重特異性抗体の二つの抗原結合アームを利用して異なる抗原と特徴的に結合することができ、二つの抗原結合アームはそれぞれがん細胞表面の２種類の抗原と結合して、がん細胞に対する抗体の結合特異性と標的性を効果的に増強し、オフターゲットなどの副作用を低減することができる。
【0005】
治療コストを効果的に下げる：ＢｉＴＥを例とすると、従来の抗体と比べ、組織透過性、腫瘍細胞の殺傷効率、オフターゲット率及び臨床適応症などの指標で強い競争力を持ち、臨床的メリットが有意である。特に使用量に関しては、その治療効果は従来の抗体の１００～１０００倍に達することができるため、使用量は最低で元の１／２０００であるため、薬物治療のコストを大幅に削減することができる。併用療法と比較し、二重特異性抗体のコストは、二つの単剤併用療法よりもはるかに低い。
【0006】
ＰＤ－１（ＣＤ２７９）は１９９２年に最初に報告され、ヒトＰＤ－１をコードする遺伝子ＰＤＣＤ１は２ｑ３７．３に位置し、全長は２０９７ｂｐであり、６つのエクソンからなり、翻訳産物は２８８アミノ酸からなるＰＤ－１前駆体タンパク質であり、最初の２０個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを切断して成熟タンパク質を得る。ＰＤ－１は細胞外免疫グロブリン可変領域ＩｇＶドメイン、疎水性膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、細胞内テールドメインＮ末端のＩＴＩＭモチーフは二つのリン酸化部位を含み、Ｃ末端は一つのＩＴＳＭモチーフである。ＰＤ－１には、ＣＤ２８免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜タンパク質であり、主に活性化後のＴ細胞表面で発現し、さらに胸腺のＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、活性化ＮＫ細胞及び単球において低存在量の発現する。ＰＤ－１は、Ｂ７タンパク質ファミリーのＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７－Ｈ１）及びＰＤ－Ｌ２（ＣＤ２７３、Ｂ７－ＤＣ）の二つのリガンドを有し、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２のアミノ酸配列は４０％同一である。両者の違いは主に発現パターンの違いにあり、ＰＤ－Ｌ１はＡＰＣｓ、非造血細胞（血管内皮細胞、膵島細胞など）及び免疫免除部位（胎盤、睾丸と目など）で構成的に低く発現し、Ｉ型とＩＩ型インターフェロン、ＴＮＦ－α及びＶＥＧＦなどの炎症性サイトカインはＰＤ－Ｌ１の発現を誘導することができる。ただし、ＰＤ－Ｌ２は、活性化されたマクロファージ及び樹状細胞でのみ発現する。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１は活性化されたＴ細胞で結合した後、ＰＤ－１のＩＴＳＭモチーフはチロシンリン酸化が発生し、さらに下流のプロテインキナーゼＳｙｋとＰＩ３Ｋの脱リン酸化を引き起こし、下流のＡＫＴ、ＥＲＫなどの経路の活性化を阻害し、最終的にＴ細胞活性化に必要な遺伝子とサイトカインの転写と翻訳を阻害し、Ｔ細胞活性に対して負の調節作用を発揮する。
【0007】
腫瘍細胞では、腫瘍細胞及び腫瘍微小環境は、ＰＤ－Ｌ１の発現を上昇させ、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞表面のＰＤ－１と結合することにより、Ｔ細胞活性を負に調節し、免疫応答を阻害する。腫瘍細胞は以下の４つの経路を通じてＰＤ－Ｌ１の発現を上昇させることができる：１．ＰＤ－Ｌ１をコードする遺伝子の増幅（９ｐ２４．１）、２．ＥＧＦＲ、ＭＡＰＫ、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信号経路の活性化、ＨＩＦ－１転写因子などを介した転写レベルでのＰＤ－Ｌ１の発現の引き上げ、３．ＥＢウイルスの誘導（ＥＢウイルス陽性の胃がんと鼻咽頭がんはＰＤ－Ｌ１の高発現を示す）、４．エピジェネティクスの制御。腫瘍微小環境では、ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γ等の炎症因子の刺激も同様にＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２の発現を誘導することができる。炎症因子は、マクロファージ、樹状細胞及び基質細胞を含む腫瘍微小環境における他の細胞のＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の発現を誘導することができ、腫瘍抗原を認識できる腫瘍浸潤性Ｔ細胞はｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－γを分泌でき、さらにＰＤ－Ｌ１発現の上昇を誘導することができ、当該プロセスは「適応性免疫抵抗」と呼ばれ、腫瘍細胞は当該メカニズムによって自己保護を実現することができる。腫瘍がＰＤ－１依存免疫阻害を使用して免疫回避することを示す証拠が増えている。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の高発現は、様々な固形腫瘍及び血液系悪性腫瘍種で発見されている。また、ＰＤ－Ｌｓの発現と食道がん、胃がん、腎がん、卵巣がん、膀胱がん、膵臓がん及びメラノーマなどの腫瘍細胞の予後不良との間には強い相関があることが明らかになった。
【0008】
過去数十年の間に、米国と多くの先進国で胃がんの発症率と死亡率は大幅に減少した。しかし、胃（ＧＣ）、食道、又は食道胃接合部がん（ＧＥＪ）を起源とするがんは、特に低・中所得国を含む世界的な主要な健康問題であり続けている。胃がんの世界的な発症率は広い地理的差を示しており、発症率の高い地域と低い地域の間の差は１５～２０倍である。世界的に、２０１８年には１０３万件の胃がんにより７８万人以上が死亡することが推定され、胃がんは世界で５番目の最も多く診断されるがん、３番目のがん関連死亡原因になったが、西ヨーロッパ、オーストラリア、北米では稀ながんの一つとなっている。２０１９年、米国では２７，５１０人が診断され、１１，１４０人がこの病気で死亡したと推定され、米国では１５番目の多く診断されるがんであり、１５番目のがん関連死亡原因となっている。胃がんの最も高い発症率は東アジア、南米、中米及び東欧で発生し、中でも東アジア３カ国（中国、日本及び韓国）での発症率が特に高い。中国では、胃がんは男性で最も一般的ながんであり、がん関連死亡率の主要な原因である。タイトジャンクションタンパク質の１８Ａ２（ｃｌａｕｄｉｎ１８．２）は近年、消化管腫瘍、特に胃がんの腫瘍特異性抗原と見なされ、ますます重視されている。
【0009】
タイトジャンクション（Ｔｉｇｈｔ ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＴＪ）は、細胞間の物質の流れに重要な役割を果たすとともに、膜タンパク質と膜脂質の放射状の拡散を遮断することで細胞の極性を維持し、さらに、細胞の増殖、分化及び移動を調節するシグナル伝達分子の動員に関与している。タイトジャンクションはタイトジャンクションタンパク質（ｃｌａｕｄｉｎ、ＣＬＤＮ）によって形成され、タイトジャンクションタンパク質ファミリーは２０種類以上のタンパク質分子からなり、そのメンバーはすべて４回膜貫通構造ドメインと類似のアミノ酸配列を含むが、組織分布は所定の特異性を有する。ＣＬＤＮは細胞バイパスの選択的浸透の調節に重要な役割を果たし、ＣＬＤＮ２とＣＬＤＮ１５は陽イオンチャネルと陽イオン孔の形成に関与し、ＣＬＤＮ４／７／１０は陰イオンチャネルと孔の形成に関与する。ＣＬＤＮタンパク質の差異発現は、複数のがんと関連していると考えられている。ＣＬＤＮ１とＣＬＤＮ７は侵襲性乳がん、前立腺がん及び食道がんでダウンレギュレートされ、ＣＬＤＮ３／４は子宮頸がん、結腸がん、食道がん、胃がんなど様々ながんで異なる程度でアップレギュレートされていることが認められた。Ｓａｈｉｎらは、正常組織においてＣＬＤＮ１８のｉｓｏｆｏｒｍ２サブタイプ（ｃｌａｕｄｉｎ１８．２）が胃粘膜の分化後の表皮細胞でのみ発現し、胃幹細胞領域では発現が見られなかったが、原発性胃がん及びその転移巣では異常に高い発現を認めた。膵臓がん、食道がん及び肺がんにおいてもｃｌａｕｄｉｎ１８．２の高発現が報告されている。ｃｌａｕｄｉｎ１８．２は細胞膜表面に位置しているため、その生物学的機能と特性は、理想的な治療標的であることを決定し、近年、当該標的に対するモノクローナル抗体が開発されている。
【0010】
〔発明の概要〕
本発明の目的は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用を提供することである。
本発明の目的は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体及びその使用を提供することである。
【0011】
本発明は、下記の技術的解決策を採用する。
【0012】
ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体であって：
抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体部分及び抗ＰＤ－Ｌ１の抗体部分を含む。
抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体部分及び抗ＰＤ－Ｌ１の抗体部分を含む。
【0013】
さらに、本発明のヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体は、配列が配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５又は配列番号６６で示される通りである。
【0014】
さらに、本発明のヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体では、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体部分はヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質の細胞外領域に結合し、抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体部分の配列は配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４で示される通りである。
【0015】
さらに、本発明のヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤＬ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の配列が配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号５４で示される通りである。
【0016】
がん、感染症又は免疫調節疾患を治療するための薬物の製造における、上記のいずれかに記載の二重特異性抗体の使用である。
【0017】
腫瘍の増殖を阻害するための薬物の製造における、上記のいずれかに記載の二重特異性抗体の使用である。
【0018】
さらに、前記がん又は腫瘍は、下記の群又は部位：結直腸、乳腺、卵巣、膵臓、胃、食道、前立腺、腎臓、子宮頸部、骨髄がん、リンパがん、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、鼻咽頭、精巣、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、基底細胞がん、扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、神経膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、及び骨髄異形成症候群から選択される。
【0019】
具体的には、本発明の一態様において、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体を提供し、前記二重特異性抗体は：
抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体部分及び抗ＰＤ－Ｌ１の抗体部分を含む。
抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２の抗体部分及び抗ＰＤ－Ｌ１の抗体部分を含む。
【0020】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２に対する結合活性とヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する結合活性の両方を有する。
【0021】
別の好ましい例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の相補的決定領域ＣＤＲは：
配列番号９３、７５、７９、８３又は８７で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号９４、７６、８０、８４又は８８で示されるＨＣＤＲ２、と
配列番号９５、７７、８１、８５又は８９で示されるＨＣＤＲ３、及び
配列番号９０又は７２で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号９１又は７３で示されるＬＣＤＲ２、と
配列番号９２、７４、７８、８２又は８６で示されるＬＣＤＲ３を含む。
配列番号９３、７５、７９、８３又は８７で示されるＨＣＤＲ１、
配列番号９４、７６、８０、８４又は８８で示されるＨＣＤＲ２、と
配列番号９５、７７、８１、８５又は８９で示されるＨＣＤＲ３、及び
配列番号９０又は７２で示されるＬＣＤＲ１、
配列番号９１又は７３で示されるＬＣＤＲ２、と
配列番号９２、７４、７８、８２又は８６で示されるＬＣＤＲ３を含む。
【0022】
別の好ましい例において、抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲは、以下の群：
（Ｚ１）配列番号９３、９４、９５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号９０、９１、９２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ２）配列番号７５、７６、７７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、７４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ３）配列番号７９、８０、８１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、７８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ４）配列番号８３、８４、８５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、８２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ５）配列番号８７、８８、８９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、８６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３から選択される。
（Ｚ１）配列番号９３、９４、９５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号９０、９１、９２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ２）配列番号７５、７６、７７で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、７４で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ３）配列番号７９、８０、８１で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、７８で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ４）配列番号８３、８４、８５で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、８２で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３、
（Ｚ５）配列番号８７、８８、８９で示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３、及び配列番号７２、７３、８６で示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３から選択される。
【0023】
別の好ましい例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の相補的決定領域ＣＤＲは、配列番号９３で示されるＨＣＤＲ１、配列番号９４で示されるＨＣＤＲ２と配列番号９５で示されるＨＣＤＲ３、及び配列番号９０で示されるＬＣＤＲ１、配列番号９１で示されるＬＣＤＲ２と配列番号９２で示されるＬＣＤＲ３を含む。
【0024】
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、単一ドメイン抗体である。
【0025】
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体の三つの相補的決定領域ＣＤＲは、配列番号６９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号７０又は９６で示されるＨＣＤＲ２と配列番号７１で示されるＨＣＤＲ３を含む。
【0026】
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体の三つの相補的決定領域ＣＤＲは、配列番号６９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号７０で示されるＨＣＤＲ２と配列番号７１で示されるＨＣＤＲ３を含む。
【0027】
別の好ましい例において、前記単一ドメイン抗体の三つの相補的決定領域ＣＤＲは、配列番号６９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号９６で示されるＨＣＤＲ２と配列番号７１で示されるＨＣＤＲ３を含む。
【0028】
別の好ましい例において、前記二重特異性抗体は、二つの単量体からなる二量体であり、前記単量体は、Ｎ末端からＣ末端まで式Ｉで表される構造を有する。
【0029】
【化1】
【0030】
ここで、
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して結合又はリンカーエレメントであり、
ＶＨは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域を表し、
ＶＬは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＨは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖定常領域を表し、
ＣＬは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨＨは抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を表す。
Ｌ１、Ｌ２及びＬ３は、それぞれ独立して結合又はリンカーエレメントであり、
ＶＨは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域を表し、
ＶＬは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域を表し、
ＣＨは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖定常領域を表し、
ＣＬは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖定常領域を表し、
ＶＨＨは抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を表す。
【0031】
「－」はペプチド結合を表す。
【0032】
「～」はジスルフィド結合又は共有結合を表す。もう一つの好ましい実施例において、前記Ｌ１及びＬ３は、それぞれ結合（例えばペプチド結合）である。もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号９３、７５、７９、８３又は８７で示されるＨＣＤＲ１、配列番号９４、７６、８０、８４又は８８で示されるＨＣＤＲ２と配列番号９５、７７、８１、８５又は８９で示されるＨＣＤＲ３を含む。
【0033】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、ヒト化ＦＲ領域をさらに含む。
【0034】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列は、配列番号３１、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４で示される通りである。
【0035】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号９０又は７２で示されるＬＣＤＲ１、配列番号９１又は７３で示されるＬＣＤＲ２と配列番号９２、７４、７８、８２又は８６で示されるＬＣＤＲ３を含む。
【0036】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ヒト化ＦＲ領域をさらに含む。
【0037】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列は、配列番号２９、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、又は配列番号３０で示される通りである。
【0038】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖定常領域（ＣＨ）は、ヒト由来又はマウス由来である。
【0039】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖定常領域（ＣＬ）は、ヒト由来又はマウス由来である。
【0040】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、配列番号６９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号７０で示されるＨＣＤＲ２と配列番号７１で示されるＨＣＤＲ３を含む。
【0041】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、配列番号６９で示されるＨＣＤＲ１、配列番号９６で示されるＨＣＤＲ２と配列番号７１で示されるＨＣＤＲ３を含む。
【0042】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）は、ヒト化ＦＲ領域をさらに含む。
【0043】
もう一つの好ましい実施例において、前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は、配列番号５１、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５３又は配列番号５４で示される通りである。
【0044】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＶＬのアミノ酸配列は配列番号２９で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号３１で示され、及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号５１で示される通りである。
【0045】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＶＬのアミノ酸配列は配列番号１に示し、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５に示し、及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号５１で示される。
【0046】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＶＬのアミノ酸配列は配列番号１６で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１７で示され、及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号５１で示される通りである。
【0047】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＶＬのアミノ酸配列は配列番号８で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１３で示され、及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号５１で示される通りである。
【0048】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＶＬのアミノ酸配列は配列番号２１で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２６で示され、及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号５１で示される通りである。
【0049】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は配列番号６３、配列番号５９、配列番号６１、又は配列番号６５で示され、及び前記二重特異性抗体のＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号６４、配列番号６０、配列番号６２、又は配列番号６６で示される通りである。
【0050】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は配列番号６３で示され、及びＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号６４で示される通りである。
【0051】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は配列番号５９で示され、及びＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号６０で示される通りである。
【0052】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は配列番号６１で示され、及びＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号６２で示される通りである。
【0053】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体のＬ鎖（ＶＬ－Ｌ３－ＣＬ）のアミノ酸配列は配列番号６５で示され、及びＨ鎖（ＶＨ－Ｌ１－ＣＨ－Ｌ２－ＶＨＨ）のアミノ酸配列は配列番号６６で示される通りである。
【0054】
もう一つの好ましい実施例において、前記二重特異性抗体は、部分的又は完全にヒト化された抗体である。
【0055】
本発明の第二態様は、単離されたポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体をコードする。
【0056】
もう一つの好ましい実施例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡを含む。
【0057】
本発明の第三態様は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第二態様に記載のポリヌクレオチドを含有する。
【0058】
もう一つの好ましい実施例において、前記発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクターから選択される。
【0059】
もう一つの好ましい実施例において、前記発現ベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、アデノウイルスなどの哺乳動物細胞ウイルス、アデノ随伴ウイルスＡＡＶ、レトロウイルス、又は他のベクターを含む。
【0060】
本発明の第四態様は、遺伝子操作された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第三態様に記載のベクターを含み、又は本発明の第二態様に記載のポリヌクレオチドをゲノムに組み込まれている。
【0061】
もう一つの好ましい実施例において、前記宿主細胞は原核細胞又は真核細胞を含む。
【0062】
もう一つの好ましい実施例において、前記宿主細胞は大腸菌、酵母細胞、哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【0063】
本発明の第五態様は、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体の製造方法を提供し：
（ｉ）本発明の第四態様に記載の宿主細胞を適当な条件で培養して、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体を含有する混合物を得るステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた混合物を精製及び／又は分離して、前記二重特異性抗体を得るステップを含む。
（ｉ）本発明の第四態様に記載の宿主細胞を適当な条件で培養して、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体を含有する混合物を得るステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で得られた混合物を精製及び／又は分離して、前記二重特異性抗体を得るステップを含む。
【0064】
もう一つの好ましい実施例において、前記精製は、タンパク質Ａアフィニティーカラムによる精製・分離して標的抗体を得ることができる。
【0065】
もう一つの好ましい実施例において、前記精製・分離した後の標的抗体の純度は９５％を超え、９６％を超え、９７％を超え、９８％を超え、９９％を超え、好ましくは、１００％である。
【0066】
本発明の第六態様は、医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は：
（ａ）本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体又は第七態様に記載のコンジュゲート、及び
（ｂ）薬学的に許容される担体を含む。
（ａ）本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体又は第七態様に記載のコンジュゲート、及び
（ｂ）薬学的に許容される担体を含む。
【0067】
もう一つの好ましい実施例において、前記医薬組成物は、がん（又は腫瘍）を治療するための他の薬物、例えば化学療法薬、をさらに含有する。
【0068】
もう一つの好ましい実施例において、前記医薬組成物は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との相互作用を遮断すると同時にｃｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質に結合するために使用される。
【0069】
もう一つの好ましい実施例において、前記医薬組成物は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質を発現する（即ち、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２陽性）がん（又は腫瘍）を治療するために使用される。
【0070】
もう一つの好ましい実施例において、前記医薬組成物は注射剤型である。
【0071】
本発明の第七態様は、免疫複合体を提供し、前記免疫複合体は：
（ａ）本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体、及び
（ｂ）以下の群：検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から選択される共役部分を含む。
（ａ）本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体、及び
（ｂ）以下の群：検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、又は酵素から選択される共役部分を含む。
【0072】
本発明の第八態様は、がん（又は腫瘍）、感染症又は免疫調節疾患を治療するための薬物の製造における、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体の使用を提供する。
【0073】
本発明の第九態様は、腫瘍の増殖を阻害するための薬物の製造における、本発明の第一態様に記載の二重特異性抗体の使用を提供する。
【0074】
もう一つの好ましい実施例において、前記がん又は腫瘍は、結直腸がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、胃がん、食道がん、前立腺がん、腎臓がん、子宮頸部がん、骨髄がん、リンパがん、白血病、甲状腺がん、子宮内膜がん、子宮がん、膀胱がん、神経内分泌がん、頭頸部がん、肝臓がん、鼻咽頭がん、精巣がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、基底細胞がん、扁平上皮がん、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞がん、神経膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫、と骨髄異形成症候群からなる群より選択される。
【0075】
本発明の主な有益な効果は、本発明は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びＰＤ－Ｌ１の両方を標的とする二重特異性抗体を提供し、当該二特異性抗体分子はｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びＰＤ－Ｌ１を高い効率で標的とすることができる。本発明は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現する腫瘍の治療効果を向上させることができる。当該二重特異性抗体は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質に結合すると同時に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合を阻害することができ、自然免疫でＮＫ細胞を活性化して腫瘍細胞を殺傷し、獲得免疫における腫瘍に対するキラーＴリンパ球の殺傷効果を促進することができ、相乗的な腫瘍殺傷効果を有する。当該二重特異性抗体は、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を単独で使用するよりも、優れた抗腫瘍効果を有する。
【0076】
〔図面の簡単な説明〕
図１は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体分子の構造模式図を示す。
図１は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体分子の構造模式図を示す。
【0077】
図２は、ＥＬＩＳＡによる第１群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0078】
図３は、ＥＬＩＳＡによる第２群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0079】
図４は、ＥＬＩＳＡによる第３群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0080】
図５は、ＥＬＩＳＡによる第４群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0081】
図６は、ＥＬＩＳＡによる第５群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0082】
図７は、ＦＡＣＳによる第１群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0083】
図８は、ＦＡＣＳによる第２群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0084】
図９は、ＦＡＣＳによる第３群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0085】
図１０は、ＦＡＣＳによる第４群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0086】
図１１は、ＦＡＣＳによる第５群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【0087】
図１２は、ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＡＤＣＣの結果を示す。
【0088】
図１３は、ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＣＤＣの結果を示す。
【0089】
図１４は、免疫不全マウスＣＢ．１７－ＳＣＩＤモデルにおけるヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の生体内薬力学的結果を示す。
【0090】
図１５は、ＥＬＩＳＡによるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の結合活性の同定結果を示す。
【0091】
図１６は、ＥＬＩＳＡによるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のブロッキング活性の同定結果を示す。
【0092】
図１７は、第１の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【0093】
図１８は、第２の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【0094】
図１９は、第３の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【0095】
図２０は、第４の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【0096】
図２１は、ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性の同定結果を示す。
【0097】
図２２は、ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の活性をブロックする結果を示す。
【0098】
図２３は、ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０の活性をブロックする結果を示す。
【0099】
図２４は、ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＣＬＤＮ１８．２に結合する活性の検出結果を示す。
【0100】
図２５は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＰＤ－Ｌ１の機能活性同定（混合リンパ球反応ＭＬＲにおける候補分子ＣＨＯ１４によるＴ細胞活性化後に産生されるサイトカインＩＦＮγの濃度依存結果）を示す。
【0101】
図２６は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＰＤ－Ｌ１の機能活性同定（混合リンパ球反応ＭＬＲにおける候補分子ＣＨＯ１４によるＴ細胞活性化後に産生されるサイトカインＩＬ－２の濃度依存結果）を示す。
【0102】
図２７は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＰＢＭＣが媒介した細胞殺傷実験の結果を示す。
【0103】
図２８は、免疫標的ヒト化トランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６－ｈＰＤＬ１モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内薬力学評価の結果を示す。
【0104】
図２９は、免疫系ヒト化マウスＰＢＭＣ移植－ＮＣＧモデルＨＣＣ８２７－ｈｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内薬力学評価の結果を示す。
【0105】
図３０は、Ｃ５７ＢＬ／６モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内相乗薬効の評価を示す。
【0106】
図３１は、Ｃ５７ＢＬ／６モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内相乗薬効の評価を示す。
【0107】
〔発明を実施するための形態〕
本発明者らは、広範かつ深く研究し、多量のスクリーニングにより、高い特異性と高い親和性を有する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を得、これに基づいてヒト化及び遺伝子組換えを行い、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１を同時に標的とする二重特異性抗体を得た。体外実験は、本発明の二重特異性抗体がヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１分子に特異的に結合し、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を組換えて発現し、ＰＤ－Ｌ１を自然発現するヒト肺がん細胞を殺傷することを証明した。生体内薬効実験は、本発明の二重特異性抗体が相乗的な作用を有し、ヒト化マウスモデルにおいてｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも優れた抗腫瘍活性を示すことを証明した。これに基づいて、本発明が完成された。
本発明者らは、広範かつ深く研究し、多量のスクリーニングにより、高い特異性と高い親和性を有する抗ＣＬＤＮ１８．２抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体を得、これに基づいてヒト化及び遺伝子組換えを行い、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１を同時に標的とする二重特異性抗体を得た。体外実験は、本発明の二重特異性抗体がヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１分子に特異的に結合し、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を組換えて発現し、ＰＤ－Ｌ１を自然発現するヒト肺がん細胞を殺傷することを証明した。生体内薬効実験は、本発明の二重特異性抗体が相乗的な作用を有し、ヒト化マウスモデルにおいてｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも優れた抗腫瘍活性を示すことを証明した。これに基づいて、本発明が完成された。
【0108】
〔用語〕
本開示をより容易に理解するために、まずはいくつかの用語を定義する。本明細書に使用される場合、本明細書で別段の明確的な規定がない限り、以下の用語の各々は以下で示される意味を有する。その他の定義は、出願全体にわたって説明されている。
本開示をより容易に理解するために、まずはいくつかの用語を定義する。本明細書に使用される場合、本明細書で別段の明確的な規定がない限り、以下の用語の各々は以下で示される意味を有する。その他の定義は、出願全体にわたって説明されている。
【0109】
本明細書で使用されるように、用語「本発明の二重特異性抗体」「本発明の二重抗体」、「抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体」は同じ意味を有し、いずれもｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びＰＤ－Ｌ１を特異的に認識し結合する二重特異性抗体を指す。
【0110】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、同じ構造的特徴を有する約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質（ｈｅｔｅｒｏｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）であり、二つの同じ軽鎖（Ｌ）と二つの同じ重鎖（Ｈ）からなる。各軽鎖は、共有ジスルフィド結合を介して重鎖に連結され、異なる免疫グロブリンアイソフォームの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖及び軽鎖は、規則的な間隔をあけた鎖内ジスルフィド結合を有する。軽鎖にはλ（ｌ）及びκ（ｋ）の２種類が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する主要な重鎖にはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥの５つのタイプ（又は同型）が存在する。それぞれの鎖には、異なる配列構造ドメインが含まれている。軽鎖は、可変構造領域（ＶＬ）及び定常構造領域（ＣＬ）という二つの構造ドメイン又は領域を含む。重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３、総称してＣＨと呼ばれる）という４つの構造ドメインを含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の可変領域は、いずれも抗原に対する結合認識及び特異性を決定する。軽鎖の定常領域（ＣＬ）及び重鎖の定常領域（ＣＨ）は、抗体鎖の結合、分泌、経胎盤の移動性、補体結合及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）との結合などの重要な生物学的特性を付与える。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、軽鎖及び重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定区間の構造的相補性に依存する。抗体結合部位は、主に高可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成される。場合によって、非高可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基は、ドメイン構造全体に影響を及ぼし、さらに結合部位にも影響を及ぼす。相補性決定領域又はＣＤＲとは、結合親和性及び天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の特異的アミノ酸配列を共通に限定することを意味する。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は、それぞれ３つのＣＤＲを有し、ＬＣＤＲ１（ＣＤＲ１－Ｌ）、ＬＣＤＲ２（ＣＤＲ２－Ｌ）、ＬＣＤＲ３（ＣＤＲ３－Ｌ）及びＨＣＤＲ１（ＣＤＲ１－Ｈ）、ＨＣＤＲ２（ＣＤＲ２－Ｈ）、ＨＣＤＲ３（ＣＤＲ３－Ｈ）と呼ばれる。従って、従来の抗体抗原結合部位は、各重鎖及び軽鎖ｖ領域からのＣＤＲの集合を含む、６つのＣＤＲを含む。
【0111】
本明細書で使用されるように、用語「単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨ」、「ナノ抗体」は同じ意味を有し、抗体の重鎖をクローニングする可変領域を指し、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である一つの重鎖可変領域のみからなるナノ抗体（ＶＨＨ）を構築する。通常、軽鎖及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）は自然に欠失した抗体を得た後、抗体重鎖の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなるナノ抗体（ＶＨＨ）を構築する。
【0112】
本明細書で使用されるように、用語「可変」は、抗体の可変領域の一部が配列上異なることを意味し、その特異的抗原に対する様々な特異的抗体の結合及び特異性を形成する。しかし、可変性は抗体可変領域全体に不均一に分布している。それは、軽鎖と重鎖の可変領域のうち、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域と呼ばれる３つのフラグメントに集中している。可変領域のうち、比較的に保守的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変領域には、それぞれ４つのＦＲ領域が含まれ、それらはほぼβフォールド構造形態をとり、連結リングを形成する３つのＣＤＲによって連結され、場合によっては部分的にβフォールド構造を形成することができる。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域を介して密接に結合し、他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ Ｐｕｂｌ． Ｎｏ． ９１－３２４２、巻Ｉ、６４７－６６９ページ（１９９１）を参照）。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体に依存する抗体細胞毒性に関与するなど、異なるエフェクター機能を示す。
【0113】
本明細書で使用されるように、用語「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列、即ち、単一種の異なる免疫グロブリン間で比較的保存された免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖可変領域の部分を指す。免疫グロブリンの軽鎖と重鎖はそれぞれ４つのＦＲを有し、それぞれＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ及びＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈと呼ばれる。従って、軽鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｌ）－（ＣＤＲ１－Ｌ）－（ＦＲ２－Ｌ）－（ＣＤＲ２－Ｌ）－（ＦＲ３－Ｌ）－（ＣＤＲ３－Ｌ）－（ＦＲ４－Ｌ）と呼ばれ、重鎖可変ドメインは、（ＦＲ１－Ｈ）－（ＣＤＲ１－Ｈ）－（ＦＲ２－Ｈ）－（ＣＤＲ２－Ｈ）－（ＦＲ３－Ｈ）－（ＣＤＲ３－Ｈ）－（ＦＲ４－Ｈ）と表すことができる。好ましくは、本発明のＦＲは、ヒト抗体ＦＲ又はその誘導体であり、前記ヒト抗体ＦＲの誘導体が天然に存在するヒト抗体ＦＲと実質的に同一であり、即ち、配列同一性は８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％に達する。
【0114】
ＣＤＲのアミノ酸配列を知ることにより、当業者はフレームワーク領域ＦＲ１－Ｌ、ＦＲ２－Ｌ、ＦＲ３－Ｌ、ＦＲ４－Ｌ及び／又はＦＲ１－Ｈ、ＦＲ２－Ｈ、ＦＲ３－Ｈ、ＦＲ４－Ｈを容易に決定することができる。
【0115】
本明細書で使用されるように、用語「ヒト化抗体」は、標的抗原に結合することができる非ヒト抗体由来の抗体分子であり、前記標的抗原が非ヒト由来の一つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びヒト免疫グロブリン分子由来のフレーム領域を有する。通常、ヒトフレームワーク領域内のフレーム残基は、ＣＤＲドナー抗体からの相応する残基に置換され、抗原の結合を変化させ、好ましくは改善することができる。これらのフレーム置換は、例えばＣＤＲとフレーム残基との相互作用をシミュレートして抗原結合に重要な役割を果たすフレーム残基を同定すること、及び配列比較によって特定の位置で異常なフレーム残基を同定することの、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。抗体のヒト化は、当技術分野で公知の様々な技術を用いることができ、例えばＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００、ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７、米国特許５，２２５，５３９、５，５３０，１０１、及び５，５８５，０８９）、装飾又はリモデリング（ＥＰ５９２，１０６、ＥＰ５１９，５９６、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ２８（４／５）：４８９－４９８（１９９１）、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４（１９９４）、Ｒｏｇｕｓｋａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：９６９－９７３（１９９４））、及び鎖置換（米国特許５，５６５，３３２）であり、その内容全体が引用により本明細書に組み込まれる。
【0116】
本明細書で使用されるように、用語「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同じ（約８５％以上であり、具体的には９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％の同一性である）フレームワーク領域である。
【0117】
本明細書で使用されるように、用語「リンカー」は、軽鎖及び重鎖の構造ドメインが交換された二重可変領域を有する免疫グロブリンに折り畳まれるために十分な可動性を提供するために、免疫グロブリンの構造ドメインに挿入された一つ又は複数のアミノ酸残基を指す。
【0118】
本発明は、完全な抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体のフラグメント又は抗体が他の配列と形成される融合タンパク質を含む。従って、本発明はまた、前記抗体のフラグメント、誘導体、及び類似体を含む。
【0119】
本明細書で使用されるように、用語「フラグメント」「誘導体」及び「類似体」は、本発明の抗体と実質的に同一の生物学的機能又は活性を維持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体又は類似体は、（ｉ）一つ又は複数の保存性又は非保存性アミノ酸残基（好ましくは保存性アミノ酸残基）が置換されたポリペプチドであり、このような置換アミノ酸残基は遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい、又は（ｉｉ）１つ又は複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、又は（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどのポリペプチドの半減期を延長する化合物）の融合によって形成されたポリペプチド、又は（ｉｖ）このポリペプチド配列に付加的なアミノ酸配列が融合して形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列又は分泌配列又は当該ポリペプチドを精製するために使用される配列又はプロトン配列、又は６Ｈｉｓタグによって形成される融合タンパク質）であってもよい。本明細書の教示によれば、これらのフラグメント、誘導体及び類似体は、当業者に周知の範囲に属する。
【0120】
本発明の抗体は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びＰＤ－Ｌ１タンパク質と結合する活性を有する二重抗体を指す。当該用語はまた、本発明の抗体と同じ機能を有し、同じＣＤＲ領域を含むポリペプチドの変異形態を含む。これらの変異形態には、一つ又は複数（通常は１～５０個、より好ましくは１～３０個、さらに好ましくは１～２０個、最も好ましくは１～１０個）のアミノ酸の欠失、挿入、及び／又は置換、及びＣ末端及び／又はＮ末端への一つ又は複数（通常は２０個以内、より好ましくは１０個以内、さらに好ましくは５個以内）のアミノ酸の添加が含まれる（ただし、これらに限定されない）。例えば、当該技術分野において、同程度又は類似の性能を有するアミノ酸で置換すると、通常、タンパク質の機能は変換されない。また、例えば、Ｃ末端及び／又はＮ末端に一つ又は複数のアミノ酸を添加しても、通常、タンパク質の機能を変換することはない。
【0121】
前記ポリペプチドの変異形態としては、相同配列、保存性変異体、等位変異体、自然変異体、誘導変異体、高い又は低い厳密度の条件下で本発明の抗体をコードするＤＮＡとハイブリダイズすることができるＤＮＡによってコードされるタンパク質、及び本発明の抗体の抗血清を利用して得られるポリペプチド又はタンパク質を含む。
【0122】
ここで、「保存性変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大１０個、より好ましくは最大８個、さらに好ましくは最大５個、最も好ましくは最大３個のアミノ酸が、類似又は同程度の特性を有するアミノ酸によって置換されてポリペプチドを形成することを意味する（特に、フレームワーク領域が類似又は同程度の特性を有するアミノ酸によって置換されてポリペプチドを形成する）。これらの保存性変異ポリペプチドは、表Ａに従ってアミノ酸置換を行って製造されることが好ましい。
【0123】
【表1】
【0124】
本発明はまた、前記抗体又はそのフラグメント、又はそれの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態又はＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又は人工的に合成されたＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖又は二本鎖であってもよい。ＤＮＡは、コード鎖又は非コード鎖であってもよい。
【0125】
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは：成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列及び様々な追加のコード配列、成熟ポリペプチドのコード配列（及び任意に追加のコード配列）及び非コード配列を含む。
【0126】
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよく、追加のコード及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドであってもよい。
【0127】
本発明はまた、上記の配列とハイブリダイズし、二つの配列の間に少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、厳密な条件下で本発明に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることがでいるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳密な条件」とは、以下の通りである。（１）比較的に低いイオン強度と比較的に高い温度でのハイブリダイゼーションと溶出で、例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃であり、又は（２）ハイブリダイゼーション時に変性剤を添加し、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子牛血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃などであり、又は（３）ハイブリダイゼーションは、二つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上である場合にのみ発生する。また、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能と活性を有する。
【0128】
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列又はそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法又は人工合成法で得ることができる。実行可能な方法の一つは、特にフラグメントの長さが短い場合に、人工合成法によって関連配列を合成する。通常、いくつかの小さなフラグメントを合成し、それらを連結することで長い配列のフラグメントを得ることができる。さらに、重鎖のコード配列と発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合させて融合タンパク質を形成することもできる。
【0129】
関連する配列が取得されると、組換え法を用いて関連する配列を大量に取得することができる。これは通常、ベクターにクローニングし、細胞に導入した後、通常の方法で増殖後の宿主細胞から分離して関連配列を得る。本発明に係る生体分子（核酸、タンパク質等）は、単離された形態で存在する生体分子を含む。
【0130】
現在、本発明のタンパク質（又はそのフラグメント、又はその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、完全に化学合成により得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（又はベクターなど）及び細胞に導入することができる。また、化学合成により本発明のタンパク質配列に突然変異を導入することもできる。
【0131】
本発明はまた、上記の適切なＤＮＡ配列及び適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現することができるように、適切な宿主細胞を形質転換するために使用することができる。
【0132】
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、又は酵母細胞などの下等真核細胞、又は哺乳類細胞などの高等真核細胞であってもよい。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトミセス属、ネズミチフス菌の細菌細胞、酵母などの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞の動物細胞等が挙げられる。
【0133】
組換えＤＮＡで宿主細胞を形質転換する時は、当業者に周知の通常の常法を用いて行うことができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、ＤＮＡを吸収できる感受性細胞は、指数成長期後に収穫し、ＣａＣｌ２法で処理することができ、使用されるステップは当技術分野で周知である。もう一つの方法は、ＭｇＣｌ２を使用する方法である。必要に応じて、電気穿孔法により形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈殿法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム包装などの従来の機械的方法であるＤＮＡトランスフェクション方法を選択することができる。
【0134】
得られた形質転換体は、従来の方法で培養して、本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドを発現することができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択することができる。培養は、宿主細胞の増殖に適した条件下で行われる。宿主細胞が適切な細胞密度に増殖した後、選択されたプロモーターを適切な方法（温度変換又は化学的誘導など）で誘導し、細胞をさらに所定の期間培養する。
【0135】
上記方法における組換えポリペプチドは、細胞内、又は細胞膜上に発現され、又は細胞外に分泌されることができる。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的、その他の特性を利用し、様々な分離方法によって分離及び精製することができる。これらの方法は当業者によく知られている。これらの方法の例には、従来の復元処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透破壊、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び他の様々な液相クロマトグラフィー技術、及びこれらの方法の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0136】
本発明の抗体は、単独で使用されてもよく、検出可能なマーカー（診断目的）、治療薬、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分、又は上記のいずれかの物質の組み合わせに結合又はカップリングしてもよい。
【0137】
診断目的で検出可能なマーカーには、蛍光又は発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）又はＣＴ（コンピュータＸ線断層撮影技術）造影剤、又は生成物を検出可能な酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【0138】
本発明の抗体と結合又はカップリングすることができる治療剤は、１．放射性核種２．生物毒素、３．ＩＬ－２などのサイトカイン、４．金ナノ粒子／ナノロッド、５．ウイルス粒子、６．リポソーム、７．ナノ磁性粒子、８．プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ－ジアホラーゼ（ＤＴＤ）又はビフェニルヒドロラーゼ－様タンパク質（ＢＰＨＬ））、９．化学療法剤（例えば、シスプラチン）又は任意形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
【0139】
当業者に知られているように、免疫複合体及び融合発現産物には、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素及び他の診断分子又は治療分子が本発明の抗体又はそのフラグメントに結合して形成される複合体が含まれる。
【0140】
本発明の二重特異性抗体
本発明は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体を提供し、それは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体部分及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分を含む。
本発明は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質を標的とする二重特異性抗体を提供し、それは抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体部分及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分を含む。
【0141】
（１）抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体部分
本発明の二重特異性抗体における抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体部分は、マウス由来の抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体をヒト化修飾することによって得られたものである。ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１９０１９１、ＱＰ１９２１９３、ＱＰ１９９２００、ＱＰ２０１２０２、ＱＰ２０７２０８と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、マウス由来抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で可変領域配列を形成する。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。
本発明の二重特異性抗体における抗ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体部分は、マウス由来の抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体をヒト化修飾することによって得られたものである。ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１９０１９１、ＱＰ１９２１９３、ＱＰ１９９２００、ＱＰ２０１２０２、ＱＰ２０７２０８と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、マウス由来抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で可変領域配列を形成する。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。
【0142】
前記マウス由来の抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）は、それぞれ以下のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは配列中の下線部で示される。
【0143】
＞ＱＤ２０８配列番号４６
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＩＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＣＣＡＲＬＧＦＴＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞ＱＰ１９１配列番号３８
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＩＩＳＧＧＲＴＹＹＬＤＳＥＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＲＩＹＹＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
＞ＱＤ１９３配列番号４０
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＧＫＦＫＧＱＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＶＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＦＶＫＧＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞ＱＤ２００配列番号４２
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＮＳＩＹＹＶＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＮＡＹＹＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
＞ＱＤ２０２配列番号４４
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＦＶＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＤＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＬＳＬＲＦＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
前記マウス由来の抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域は、それぞれ以下のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは配列中の下線部で示される。
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＩＭＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＣＣＡＲＬＧＦＴＴＲＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞ＱＰ１９１配列番号３８
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＩＩＳＧＧＲＴＹＹＬＤＳＥＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＮＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＴＲＩＹＹＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
＞ＱＤ１９３配列番号４０
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＡＦＳＳＹＷＭＮＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＱＩＹＰＧＮＧＤＴＴＹＮＧＫＦＫＧＱＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＶＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＡＲＦＶＫＧＮＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ
＞ＱＤ２００配列番号４２
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＲＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＥＫＧＬＥＷＶＡＹＩＳＳＧＳＮＳＩＹＹＶＤＴＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＰＫＮＴＬＦＬＱＭＴＳＬＫＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＮＡＹＹＧＮＳＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
＞ＱＤ２０２配列番号４４
ＥＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＦＶＨＷＶＫＱＫＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＤＴＫＹＮＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＫＳＳＳＴＡＹＭＤＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＬＳＬＲＦＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ
前記マウス由来の抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の軽鎖可変領域は、それぞれ以下のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲは配列中の下線部で示される。
【0144】
＞ＱＤ２０７ 配列番号４５
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＨＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
＞ＱＤ１９０ 配列番号３７
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＱＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＭＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
＞ＱＤ１９２ 配列番号３９
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＮＰＧＱＰＰＫＭＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＩＤＦＳＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＬＹＹＣＱＮＡＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
＞ＱＤ１９９ 配列番号４１
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＶＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＮＮＹＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
＞ＱＤ２０１ 配列番号４３
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＩＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＨＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＮＤＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＮＬＥＬＫ
上記抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲ（下線部）領域は表Ｂに示される通りである。
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＶＳＡＧＥＫＶＴＭＮＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＧＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＨＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
＞ＱＤ１９０ 配列番号３７
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＱＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＮＭＱＡＥＤＬＡＶＹＹＣＱＮＤＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
＞ＱＤ１９２ 配列番号３９
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＮＰＧＱＰＰＫＭＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＩＤＦＳＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＬＹＹＣＱＮＡＹＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
＞ＱＤ１９９ 配列番号４１
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＶＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＮＮＹＹＹＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
＞ＱＤ２０１ 配列番号４３
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＴＶＴＡＧＥＫＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＬＬＮＳＧＮＱＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＩＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＨＶＱＡＥＤＬＡＶＹＦＣＱＮＤＹＳＹＰＬＴＦＧＡＧＴＮＬＥＬＫ
上記抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のＣＤＲ（下線部）領域は表Ｂに示される通りである。
【0145】
【表2】
【0146】
【0147】
【0148】
（２）抗ＰＤ－Ｌ１抗体部分
本発明の二重特異性抗体における抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体部分は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（抗ＰＤ－Ｌ１ナノ抗体）をヒト化することによって得られたものである。ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１１６２、ＱＰ１１６６と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、単一ドメイン抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレート（例えば、ＩＧＨＶ３－２３ ｇｅｒｍｌｉｎｅ及びＪ－ｒｅｇｉｏｎ ＩＧＨＪ４＊０１）に移植して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で可変領域配列を形成する。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。
本発明の二重特異性抗体における抗ヒトＰＤ－Ｌ１抗体部分は、抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体（抗ＰＤ－Ｌ１ナノ抗体）をヒト化することによって得られたものである。ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１１６２、ＱＰ１１６６と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、単一ドメイン抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレート（例えば、ＩＧＨＶ３－２３ ｇｅｒｍｌｉｎｅ及びＪ－ｒｅｇｉｏｎ ＩＧＨＪ４＊０１）に移植して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順で可変領域配列を形成する。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。
【0149】
前記抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のアミノ酸配列を以下に示し、ＣＤＲは配列の下線部で示される。
【0150】
＞ＱＤ１１６２ 配列番号５５
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＳＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＹＧＴＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＣＩＤＩＹＧＲＡＳＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＲＤＦＧＹＣＴＡＳＷＶＨＥＧＦＳＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞ＱＤ１１６６ 配列番号５６
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＤＳＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＹＧＴＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＣＩＤＩＹＧＲＴＳＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＲＤＦＧＹＣＴＡＳＷＶＨＥＧＦＳＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
上記単一ドメイン抗体のＣＤＲ（下線部）領域をまとめると、以下の表に示される通りである。
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＳＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＹＧＴＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＣＩＤＩＹＧＲＡＳＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＲＤＦＧＹＣＴＡＳＷＶＨＥＧＦＳＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
＞ＱＤ１１６６ 配列番号５６
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＤＳＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＹＧＴＹＡＭＳＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＣＩＤＩＹＧＲＴＳＹＴＤＰＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＲＤＦＧＹＣＴＡＳＷＶＨＥＧＦＳＲＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
上記単一ドメイン抗体のＣＤＲ（下線部）領域をまとめると、以下の表に示される通りである。
【0151】
【表3】
【0152】
本明細書で使用されるように、用語「抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体」及び「抗ＰＤ－Ｌ１ナノ抗体」は交換して使用でき、いずれも軽鎖が自然に欠失し、一つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と二つの通常のＣＨ２とＣＨ３領域のみを含む、ＰＤ－Ｌ１分子を標的とする抗体を指す。
【0153】
本明細書で使用されるように、用語「親和性」は、完全な抗体と抗原との間の平衡結合によって理論的に定義される。本発明の二重特異性抗体の親和性は、ＫＤ値（解離定数）（又は他のアッセイ方法）によって評価又は決定されることができ、例えばバイオレイヤー干渉技術（Ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）はＦｏｒｔｅｂｉｏＲｅｄ９６機器を使用して測定される。
【0154】
医薬組成物
本発明はまた、医薬組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は医薬組成物であり、上記抗体又はその活性フラグメント又はその融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含有する。通常、これらの物質は、無毒、不活性及び薬学的に許容される水性担体媒体の中で調製することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８であり、好ましくは約６～８であるが、ｐＨは、調製される物質の性質及び治療される状態によって変化することができる。調製された医薬組成物は腫瘍内、腹膜内、静脈内、又は局所投与を含む（ただし、これらに限定されない）通常の経路によって投与することができ、。
本発明はまた、医薬組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は医薬組成物であり、上記抗体又はその活性フラグメント又はその融合タンパク質、及び薬学的に許容される担体を含有する。通常、これらの物質は、無毒、不活性及び薬学的に許容される水性担体媒体の中で調製することができ、ここで、ｐＨは、通常、約５～８であり、好ましくは約６～８であるが、ｐＨは、調製される物質の性質及び治療される状態によって変化することができる。調製された医薬組成物は腫瘍内、腹膜内、静脈内、又は局所投与を含む（ただし、これらに限定されない）通常の経路によって投与することができ、。
【0155】
本発明の医薬組成物は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２及び／又はＰＤ－Ｌ１タンパク質分子を結合するために直接使用することができるため、腫瘍の治療に使用することができる。また、他の治療剤と併用することもできる。
【0156】
本発明の医薬組成物は、安全有効量（例えば、０．００１～９９ｗｔ％、好ましくは０．０１～９０ｗｔ％、さらに好ましくは０．１～８０ｗｔ％）の本発明の二重特異性抗体（又はその複合体）及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む。このような担体は、塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセリン、エタノール、及びこれらの組合せをふくむ（ただし、これらに限定されない）。薬物製剤は、投与方法と適する必要がある。本発明の医薬組成物は、針剤形態にすることができ、例えば、生理食塩水、又はグルコース及び他の補助剤を含む水溶液を用いて通常の方法により製造される。針剤、溶液などの医薬組成物は無菌条件下で製造される。活性成分の投与量は、治療有効量であり、例えば、１日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重～約５０ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドは、他の治療剤と併用することもできる。
【0157】
医薬組成物を使用する場合、免疫複合体は安全有効量で哺乳動物に投与され、ここで、安全有効量は通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重を超えなく、好ましくは、当該量は約１０μｇ／ｋｇ体重～約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。当然のとこながら、具体的な投与量は投与経路、患者の健康状態などのエレメントも考慮すべきで、これらはすべて熟練した医師の技能の範囲内のものである。
【0158】
使用
本発明は本発明の抗体の使用をさらに提供し、がん（又は腫瘍）、感染症又は免疫調節疾患を治療するための薬物の製造における使用に関する。好ましい使用は、がん（又は腫瘍）の治療に使用される。
本発明は本発明の抗体の使用をさらに提供し、がん（又は腫瘍）、感染症又は免疫調節疾患を治療するための薬物の製造における使用に関する。好ましい使用は、がん（又は腫瘍）の治療に使用される。
【0159】
本発明の主な利点は以下を含む。
【0160】
（１）本発明は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１の両方を標的とする二重特異性抗体を提供し、当該二重特異性抗体分子はヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びヒトＰＤ－Ｌ１を高い効率で標的とすることができる。
【0161】
（２）本発明の二重特異性抗体は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２を発現している腫瘍に対する治療効果を向上させることができる。当該二重特異性抗体は、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２タンパク質に結合すると同時に、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１の結合を阻害することができ、自然免疫でＮＫ細胞を活性化して腫瘍細胞を殺傷し、獲得免疫における腫瘍に対するキラーＴリンパ球の殺傷効果を促進することができるため、当該二重特異性抗体は抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体を単独で使用するよりも優れた抗腫瘍効果を有する。
【0162】
（３）本発明の二重特異性抗体は相乗効果を有する。
【0163】
以下では、本発明の技術的解決策を具体的な実施形態と合わせて詳細に説明する。
【0164】
以下の実施形態において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の条件、又は原材料又は商品の製造メーカーが提案する条件に従って選ばれる。又は、分子クローニング、実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー実験室、現代分子生物学方法、細胞生物学などのバイオテクノロジー教科書に記載されている実験方法に従って行われる。具体的な出所が明記されていない試薬は、市販で入手した通常の試薬である。
【0165】
実施例１：ハイブリドーマモノクローナル抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１９０１９１、ＱＰ１９２１９３、ＱＰ１９９２００、ＱＰ２０１２０２、ＱＰ２０７２０８と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、マウス由来抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順の可変領域配列を形成した。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。ここで、アミノ酸残基はＫａｂａｔ番号システムにより同定され、注釈付けされた。
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１９０１９１、ＱＰ１９２１９３、ＱＰ１９９２００、ＱＰ２０１２０２、ＱＰ２０７２０８と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、マウス由来抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順の可変領域配列を形成した。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択する。ここで、アミノ酸残基はＫａｂａｔ番号システムにより同定され、注釈付けされた。
【0166】
１．ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の構築
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築し、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する発現ベクターｐＱＤと相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＱＤ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＱＤを構築した。
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを構築し、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する発現ベクターｐＱＤと相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＱＤ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＱＤを構築した。
【0167】
オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．２）（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を用いて、複数のプライマーを設計してＶＨ／ＶＫ組換えに必要な遺伝子フラグメント：５’－３０ｂｐシグナルペプチド＋ＶＨ／ＶＫ＋３０ｂｐ ＣＨ１／ＣＬ－３’を合成した。ＴａＫａＲａ社のＰｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ操作説明書に従い、上記で設計した複数のプライマーを用いて、二段階に分けてＰＣＲ増幅により組換えに必要なＶＨ／ＶＫ遺伝子を含むフラグメントを得た。発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメントを有する）の構築及び酵素消化は、制限エンドヌクレアーゼＢｓｍＢＩと、認識配列が酵素消化部位と異なる特徴を利用して発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）フラグメント）を設計し、構築した。ＢｓｍＢＩ酵素切断ベクターは、ゲルを切断して、後で使用するために回収した。発現ベクターＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＱＤ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＱＤを構築した。ＶＨ／ＶＫ組み換えに必要な遺伝子フラグメントとＢｓｍＢＩ酵素切断回収発現ベクターｐＱＤを３：１の割合でそれぞれＤＨ５Ｈ感受性細胞に添加し、０℃で３０分間氷浴し、４２℃で９０秒間熱撃し、５倍体積のＬＢ媒体を添加し、３７℃で４５分間培養し、ＬＢ－Ａｍｐプレートを塗布し、３７℃で一晩培養し、モノクローナルを選択し、配列決定して各目的のクローンを得た。
【0168】
各クローンのヒト由来化設計の軽鎖及び重鎖可変領域の配列及びタンパク質発現番号は以下に示される通りであり、表中のすべての抗体軽鎖はｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬ（配列番号６７）を使用し、抗体重鎖はヒトＩｇＧ１定常領域（配列番号６８）を使用した。
【0169】
【表4】
【0170】
【0171】
【0172】
同時に、ヒト化前キメラ抗体及び対照抗体を発現するクローンを設計し、以下の表に示されるように、表の中のすべての抗体軽鎖はｋａｐｐａ軽鎖定常領域ＣＬを使用し、抗体重鎖はヒトＩｇＧ１定常領域を使用した。
【0173】
【表5】
【0174】
２．ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の発現
２９３Ｅ細胞の培養密度を０．２～３×１０６／ｍｌに維持し、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地）を使用して培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心分離し、培地を交換し、細胞密度を０．５～０．８×１０６／ｍｌに調節した。トランスフェクション当日、２９３Ｅ細胞密度は１～１．５×１０６／ｍｌであった。プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを調製し、トランスフェクションするプラスミドの量は１００ｕｇ／１００ｍｌ細胞であり、使用したＰＥＩとプラスミドの質量比は２：１であった。プラスミドとＰＥＩをよく混合し、１５分間静置し、２０分を超えてはいけなお。プラスミドとＰＥＩ混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーで培養し、トランスフェクションの５日目、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞上清を収集した。
２９３Ｅ細胞の培養密度を０．２～３×１０６／ｍｌに維持し、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地）を使用して培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心分離し、培地を交換し、細胞密度を０．５～０．８×１０６／ｍｌに調節した。トランスフェクション当日、２９３Ｅ細胞密度は１～１．５×１０６／ｍｌであった。プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを調製し、トランスフェクションするプラスミドの量は１００ｕｇ／１００ｍｌ細胞であり、使用したＰＥＩとプラスミドの質量比は２：１であった。プラスミドとＰＥＩをよく混合し、１５分間静置し、２０分を超えてはいけなお。プラスミドとＰＥＩ混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーで培養し、トランスフェクションの５日目、水平遠心分離機で４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞上清を収集した。
【0175】
３．ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製
機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように、カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり；遠心分離後の培養液上澄をカラムに通し、サンプルは４０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように、カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで上昇した時点で溶離ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで下降した時点で収集を停止し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルの収集が終了した後、ＰＡＣ－ＥＰをｐＨ調節液で中性に調節した。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製
機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように、カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり；遠心分離後の培養液上澄をカラムに通し、サンプルは４０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致するように、カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで上昇した時点で溶離ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで下降した時点で収集を停止し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルの収集が終了した後、ＰＡＣ－ＥＰをｐＨ調節液で中性に調節した。
【0176】
４．ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の結合活性（ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２ ｃｅｌｌ－ＥＬＩＳＡ）
検査試薬：脱脂粉乳（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（生工、Ｂ５４８１１７－０５００）、ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）、ＴＭＢ（Luoyang Baiaotong Experimental Materials Center、Ｃ０６０２０１）、Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：ＮａＣｌ ８．００ｇ、ＫＣｌ ０．２０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０ ２．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ～８００ｍＬを秤量してｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、十分に溶解させた後、１Ｌまで定容し、ｐＨを７．４まで調節し、使用のために高温滅菌しておいた。又は市販の１０×、２０×のＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用した。ブロッキング液：５ｇの粉ミルクをＰＢＳに秤量し、ブロッキング液は使用直前に調製する必要がある。終止液（１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下した。１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢで３７℃で１０分間発色させ、シェーカー（１２０ｒｐｍ）に置いた。
検査試薬：脱脂粉乳（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（生工、Ｂ５４８１１７－０５００）、ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）、ＴＭＢ（Luoyang Baiaotong Experimental Materials Center、Ｃ０６０２０１）、Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：ＮａＣｌ ８．００ｇ、ＫＣｌ ０．２０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０ ２．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ～８００ｍＬを秤量してｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、十分に溶解させた後、１Ｌまで定容し、ｐＨを７．４まで調節し、使用のために高温滅菌しておいた。又は市販の１０×、２０×のＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用した。ブロッキング液：５ｇの粉ミルクをＰＢＳに秤量し、ブロッキング液は使用直前に調製する必要がある。終止液（１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下した。１００ｕｌ／ウェルのＴＭＢで３７℃で１０分間発色させ、シェーカー（１２０ｒｐｍ）に置いた。
【0177】
実験ステップ：２Ｅ５／ウェルの細胞ＣＨＯＳ－ＣＬＤ１８．２－１６－２をＵ型プレートに播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した。ＶＣＤ：１．２１ Ｅ６であり、実際に１６５ｕｌ／ウェルであり；洗浄終了後、２００μＬ／ウェルのブロッキング液を加え、氷上で１時間培養した。ブロッキング終了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振って除去し、ＣＬＤ１８．２対照抗体１４－１とサンプルを培養し、１００ｕｇ／ｍＬ １：２の希釈比例により、計１２個の勾配を希釈し、最後に一つのブランク対照を設置し、１００ｕｇ／ｍＬ、３３．３３３３３３３３ｕｇ／ｍＬ、１１．１１１１１１１１ｕｇ／ｍＬ、３．７０３７０３７０４ｕｇ／ｍＬ、１．２３４５６７９０１ｕｇ／ｍＬ、０．４１１５２２６３４ｕｇ／ｍＬ、０．１３７１７４２１１ｕｇ／ｍＬ、０．０４５７２４７３７ｕｇ／ｍＬ、０．０１５２４１５７９ｕｇ／ｍＬ、０．００５０８０５２６ｕｇ／ｍＬ、０．００１６９４ｕｇ／ｍＬ、０ｕｇ／ｍＬで１００ｕｌ／ウェルを入れて十分に混合した後、氷上で２時間培養し、氷ＰＢＳで３回洗浄し；酵素標識抗体の添加：ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を培養し、１：１００００の比で希釈し、１００ｕｌ／ウェルであり、十分に混合した後、氷上に１時間置き、氷ＰＢＳを３回洗浄した。基質発色液の添加：１００μＬ／ウェルの使用量で基質発色液ＴＭＢを添加し、シェーカーに置き、２００ｒｐｍで、３５℃で１０分間暗所で発色させた。終了：発色終了後、１００μＬ／ウェルの使用量で反応停止液を速やかに添加して反応を終了させた。測定：３５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、１２０ｕｌの上清を取ってＥｌｉｓａプレートに移し、マイクロプレートリーダーでＡ４５０ｎｍのＯＤ値を測定し、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて分析し、結果は、図２、図３、図４、図５及び図６に示される通りである。
【0178】
【0179】
５．ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の結合活性（ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２ ＦＡＣＳ）
それぞれ細胞ＣＨＯＳ、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２を収集し、２Ｅ５／ウェルであり、１０００ｒで５分間遠心分離し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ ２００ｕｌ／ウェルで６０分間、４℃でブロッキングした。抗体２０ｕｇ／ｍｌの初期濃度を、１：４で希釈し、４℃で６０分間培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＦＣ（１：２００）５０ｕｌ／ウェルを培養し、４℃で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで重懸濁させ、ＦＡＣＳの結果は：表３、表４、表５、表６、表７及び図７、図８、図９、図１０と図１１に示される通りである。
それぞれ細胞ＣＨＯＳ、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２を収集し、２Ｅ５／ウェルであり、１０００ｒで５分間遠心分離し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ ２００ｕｌ／ウェルで６０分間、４℃でブロッキングした。抗体２０ｕｇ／ｍｌの初期濃度を、１：４で希釈し、４℃で６０分間培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＦＣ（１：２００）５０ｕｌ／ウェルを培養し、４℃で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで重懸濁させ、ＦＡＣＳの結果は：表３、表４、表５、表６、表７及び図７、図８、図９、図１０と図１１に示される通りである。
【0180】
ここで、表３及び図７のＥＣ５０及びＭａｘ値は、マウスキメラ抗体ＱＰ１９０１９１のヒト化抗体ＱＰ１４３６１４３５、ＱＰ１４３７１４３３、ＱＰ１４３７１４３５の、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合は、マウスキメラ抗体ＱＰ１９０１９１の結合よりも良好又は同等であることを証明し；表７及び図１１のＥＣ５０及びＭａｘ値は、マウスキメラ抗体ＱＰ２０１２０２のヒト化抗体ＱＰ１４５６１４５４、ＱＰ１４５８１４５３、ＱＰ１４５８１４５４の、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合は、マウスキメラ抗体ＱＰ２０１２０２の結合と同等であるを証明し；表６及び図１０のＥＣ５０及びＭａｘ値は、マウスキメラ抗体ＱＰ１９２１９３のヒト化抗体ＱＰ１４４５１４４０、ＱＰ１４４４１４４１、ＱＰ１４４５１４４２の、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合は、マウスキメラ抗体ＱＰ１９２１９３の結合と同等であるを証明し；表５及び図９のＥＣ５０及びＭａｘ値は、マウスキメラ抗体ＱＰ１９９２００のヒト化抗体ＱＰ１４４９１４４８、ＱＰ１４５０１４４６、ＱＰ１４５０１４４８の、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合は、マウスキメラ抗体ＱＰ１９９２００の結合と同等であるを証明し；表４及び図８のＥＣ５０及びＭａｘ値は、マウスキメラ抗体ＱＰ２０７２０８のヒト化抗体ＱＰ１４６３１４６１、ＱＰ１４６４１４６０、ＱＰ１４６４１４６１、ＱＰ１４６４１４６２、ＱＰ１４６５１４６０の、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２細胞への結合は、マウスキメラ抗体ＱＰ２０７２０８の結合よりも良好又は同等であることを証明する。
【0181】
【表6】
【0182】
【表7】
【0183】
【表8】
【0184】
【表9】
【0185】
【表10】
【0186】
６．ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の特異性同定
蛍光活性化セルソーティングＦＡＣＳを使用して、本発明のヒト化抗体のｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合するがｃｌａｕｄｉｎ１８．１には結合しない特異性を同定
それぞれ細胞ＣＨＯＳ、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．１を収集し、２Ｅ５／ウェルであり、１０００ｒで５分間遠心分離し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳｂｕｆｆｅｒ ２００ｕｌ／ウェルで６０分間、４℃でブロッキングさせた。抗体２０ｕｇ／ｍｌの初期濃度を、１：４に希釈させ、４℃で６０分間培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＦＣ（１：２００）に５０ｕｌ／ウェルで培養し、４℃で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁させ、ＦＡＣＳ読み取り値の平均蛍光値は表８に示される通りであり、ＦＡＣＳ結果は、本発明のヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体がすべてＣＨＯＳ－ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞に結合し、ＣＨＯＳ－ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びＣＨＯＳ細胞に結合しないことを示し、ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体が特異的にｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合するがｃｌａｕｄｉｎ１８．１に結合しないことを証明した。
蛍光活性化セルソーティングＦＡＣＳを使用して、本発明のヒト化抗体のｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合するがｃｌａｕｄｉｎ１８．１には結合しない特異性を同定
それぞれ細胞ＣＨＯＳ、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２、ＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．１を収集し、２Ｅ５／ウェルであり、１０００ｒで５分間遠心分離し、３％ＢＳＡ／ＰＢＳｂｕｆｆｅｒ ２００ｕｌ／ウェルで６０分間、４℃でブロッキングさせた。抗体２０ｕｇ／ｍｌの初期濃度を、１：４に希釈させ、４℃で６０分間培養した。ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＦＣ（１：２００）に５０ｕｌ／ウェルで培養し、４℃で３０分間培養し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁させ、ＦＡＣＳ読み取り値の平均蛍光値は表８に示される通りであり、ＦＡＣＳ結果は、本発明のヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体がすべてＣＨＯＳ－ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞に結合し、ＣＨＯＳ－ｃｌａｕｄｉｎ１８．１及びＣＨＯＳ細胞に結合しないことを示し、ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体が特異的にｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合するがｃｌａｕｄｉｎ１８．１に結合しないことを証明した。
【0187】
【表11】
【0188】
７．ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体のＡＤＣＣ（抗体依存性細胞で媒介される細胞毒性作用）
ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ（ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２）の製造：ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２をトリプシンで１０００ｒｐｍで５分間消化した。新鮮な培地に交換し、９６ウェルプレートに２０，０００ｃｅｌｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。抗体の製造：抗体（８０ｕｇ／ｍｌ～０．０００５１２ｕｇ／ｍｌ、０ｕｇ／ｍｌ）を培地で１：５の勾配で１０個の濃度に希釈した。９６ウェルプレートの培地を吸引し、上記の各濃度に希釈させた抗体を７０ｕｌ／ウェルで加え、濃度ごとに2つの複製ウェルを設定した。ＰＢＭＣの製造：１日目に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地で再懸濁させ、カウントした。ＰＢＭＣ：標的細胞＝５０：１で上記ウェルプレートに７０ｕｌ／ウェルを加え、３７℃で４時間培養した。１５ｕｌ ｌｙｓｉｓ緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）をＭａｘ ｌｙｓｉｓ ｗｅｌｌに加え、３７℃で１０分間培養した。
ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ（ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２）の製造：ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２をトリプシンで１０００ｒｐｍで５分間消化した。新鮮な培地に交換し、９６ウェルプレートに２０，０００ｃｅｌｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。抗体の製造：抗体（８０ｕｇ／ｍｌ～０．０００５１２ｕｇ／ｍｌ、０ｕｇ／ｍｌ）を培地で１：５の勾配で１０個の濃度に希釈した。９６ウェルプレートの培地を吸引し、上記の各濃度に希釈させた抗体を７０ｕｌ／ウェルで加え、濃度ごとに2つの複製ウェルを設定した。ＰＢＭＣの製造：１日目に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地で再懸濁させ、カウントした。ＰＢＭＣ：標的細胞＝５０：１で上記ウェルプレートに７０ｕｌ／ウェルを加え、３７℃で４時間培養した。１５ｕｌ ｌｙｓｉｓ緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）をＭａｘ ｌｙｓｉｓ ｗｅｌｌに加え、３７℃で１０分間培養した。
【0189】
ＬＤＨ試薬の製造：９６ウェルプレートを２００ｇで５分間遠心分離し、１００ｕｌ／ウェルの上清を新しい透明な９６ウェルプレートに移した。ＬＤＨ細胞毒性検出キット（ｃａｙｍａｎ、１０００８８８２－４８０ｗｅｌｌ）を取り出し、反応液を調製し、１００ｕｌ／ｗｅｌｌで加え、３７℃で３０分間軽く振とうした。４９０ｎｍでの吸光度を取得し、式Ｃｏｎ（ｕｇ／ｍｌ）％Ｍａｘｉｍａｌ ｓｉｇｎａｌ＝（Ｔｅｓｔ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）／（Ｍａｘ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｃｏｎ（０ｕｇ／ｍｌ）％Ｍａｘｉｍａｌ ｓｉｇｎａｌに従ってデータを分析した。
【0190】
実験結果は、図１２、表９及び表１０に示される通りであり、本発明のヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＱＰ１４３３１４３７、ＱＰ１４４０１４４５、ＱＰ１４６１１４６３、全ヒト抗体ＱＰ１１１５１１１６及び対照抗体ＩＭＡＢ３６２（ＱＰ０２４０２５）はいずれも濃度依存的にＰＢＭＣ媒介によりｃｌａｕｄｉｎ１８．２を高発現するＨＥＫ２９３－ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞を殺すことができることを示している。
【0191】
【表12】
【0192】
【表13】
【0193】
８．ヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体のＣＤＣ（補体依存性細胞毒性）
試薬：細胞：ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２－Ｈ１１、補体：ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ｑｕｉｄｅｌ、Ａ１１３）、抗体：ＱＰ０２４０２５（ＩＭＡＢ３６２）、ＱＰ１４６３１４６１は、本実施例から合成された。
試薬：細胞：ＨＥＫ２９３－ｈＣＬＤＮ１８．２－Ｈ１１、補体：ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ｑｕｉｄｅｌ、Ａ１１３）、抗体：ＱＰ０２４０２５（ＩＭＡＢ３６２）、ＱＰ１４６３１４６１は、本実施例から合成された。
【0194】
実験ステップ：
細胞／培地のプレーティング：背景対照群ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを設定し、即ち、培地４０ｕｌ／ウェルのみを添加し、最大放出群ｍａｘｉｍｕｍ ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅを設定し、即ち、４０ｕｌ標的細胞を添加した後、検出前４５分に１２ｕｌのｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した。体積補正群ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを設定し、即ち、培地４０ｕｌ／ウェルを添加し；ＬＤＬ陽性対照群を設定し、即ち、１ｕｌ陽性対照をボルテックスした後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡの希釈液で５０００倍（５ｍＬ）に希釈させた。１０倍の勾配で希釈することができる。実験群ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌを設定し、即ち、４０ｕｌ／ウェル ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌを加えた。補体＋抗体ｍｉｘの添加：対照群と実験群の両方に２０％の補体（細胞培地で希釈）を４０μｌ／ウェルで加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養し、１時間１５分後に１２ｕｌ／ウェルのｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを最大放出群と体積補正群に加えた。３７℃で４５分間培養を続けた後、ＬＤＨ検出キットで検出し、４９０ｎｍでの吸光度値を読み取り、読み取りは停止液ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えてから１時間以内に完了させる必要がある。計算：実験群は背景対照群を除去し、最大放出群は体積矯正群を除去し、式は以下の通りである：Ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝１００＊ＯＤ４９０（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ）／ＯＤ４９０（ｍａｘｉｍｕｍ ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ）。
細胞／培地のプレーティング：背景対照群ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉａ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄを設定し、即ち、培地４０ｕｌ／ウェルのみを添加し、最大放出群ｍａｘｉｍｕｍ ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅを設定し、即ち、４０ｕｌ標的細胞を添加した後、検出前４５分に１２ｕｌのｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加した。体積補正群ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを設定し、即ち、培地４０ｕｌ／ウェルを添加し；ＬＤＬ陽性対照群を設定し、即ち、１ｕｌ陽性対照をボルテックスした後、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡの希釈液で５０００倍（５ｍＬ）に希釈させた。１０倍の勾配で希釈することができる。実験群ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌを設定し、即ち、４０ｕｌ／ウェル ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌを加えた。補体＋抗体ｍｉｘの添加：対照群と実験群の両方に２０％の補体（細胞培地で希釈）を４０μｌ／ウェルで加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養し、１時間１５分後に１２ｕｌ／ウェルのｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎを最大放出群と体積補正群に加えた。３７℃で４５分間培養を続けた後、ＬＤＨ検出キットで検出し、４９０ｎｍでの吸光度値を読み取り、読み取りは停止液ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えてから１時間以内に完了させる必要がある。計算：実験群は背景対照群を除去し、最大放出群は体積矯正群を除去し、式は以下の通りである：Ｐｅｒｃｅｎｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ＝１００＊ＯＤ４９０（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ）／ＯＤ４９０（ｍａｘｉｍｕｍ ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ）。
【0195】
ＣＤＣ結果は、図１３に示される通りであり、本発明のヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＱＰ１４６１１４６３及び対照抗体ＩＭＡＢ３６２（ＱＰ０２４０２５）はいずれも濃度依存的な補体媒介によりｃｌａｕｄｉｎ１８．２を高発現するＨＥＫ２９３－ｃｌａｕｄｉｎ１８．２細胞を殺すことができることを示している。
【0196】
９．免疫不全マウスＣＢ．１７－ＳＣＩＤモデルＨＥＫ２９３－ｈｃｌａｕｄｉｎ１８．２におけるヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の生体内薬力学
実験方法：対数増殖期のヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２）を安定的に発現する安定トランス細胞株ＨＥＫ２９３－ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２細胞を収集し、ＰＢＳ緩衝液で細胞濃度を５×１０７／ｍＬに調節し、ＣＢ－１７ＳＣＩＤマウスの右側腹部に０．１ｍＬ（１：１Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の細胞懸濁液を皮下接種した。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニターし、接種当日にマウスの体重に応じて群を分け、投与した後観察した。
実験方法：対数増殖期のヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２（ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２）を安定的に発現する安定トランス細胞株ＨＥＫ２９３－ｈＣｌａｕｄｉｎ１８．２細胞を収集し、ＰＢＳ緩衝液で細胞濃度を５×１０７／ｍＬに調節し、ＣＢ－１７ＳＣＩＤマウスの右側腹部に０．１ｍＬ（１：１Ｍａｔｒｉｇｅｌ）の細胞懸濁液を皮下接種した。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニターし、接種当日にマウスの体重に応じて群を分け、投与した後観察した。
【0197】
実験結果：図１４及び表１１に示される通りである。
【0198】
【表14】
【0199】
検出分子は、ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＱＰ１４３３１４３７及びＱＰ１４６１１４６３であり、陽性対照抗体はＩＭＡＢ３６２（ＱＰ０２４０２５）であった。投与方法は１０ｍｐｋ×１０、ｑ２ｄ、ｉ．ｖであった。投与後３７日目のＰＢＳ群（陰性対照群）の平均腫瘍体積は１０９１．３４ｍｍ３に達し、ＱＰ１４３３１４３７群の平均腫瘍体積は２６０．６５ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝７６．１２％であり、ＱＰ１４６１１４６３群の平均腫瘍体積は２２５．０１ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝７９．３８％であり、ＩＭＡＢ３６２群の平均腫瘍体積は３２４．１９ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝７０．２９％であり；３群とＰＢＳ群の腫瘍体積はいずれも統計的な意義及び有意差があった（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。
【0200】
本実験は、ＨＥＫ２９３－ＣＬＤＮ１８．２モデルにおけるヒト化抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体が対照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも優れた抗腫瘍能力傾向を示していることを説明した。
【0201】
実施例２：抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のヒト化
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１１６２、ＱＰ１１６６と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、単一ドメイン抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートＩＧＨＶ３－２３ ｇｅｒｍｌｉｎｅ及びＪ－ｒｅｇｉｏｎ ＩＧＨＪ４＊０１に移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順の可変領域配列を形成した。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択した。ここで、アミノ酸残基はＫａｂａｔ番号システムにより同定され、注釈付けされた。
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとＭＯＥソフトウェアを比較することより、それぞれＱＰ１１６２、ＱＰ１１６６と相同性の高い重鎖及び軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をテンプレートとして選び、単一ドメイン抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートＩＧＨＶ３－２３ ｇｅｒｍｌｉｎｅ及びＪ－ｒｅｇｉｏｎ ＩＧＨＪ４＊０１に移植し、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順の可変領域配列を形成した。さらにいくつかの重要なアミノ酸残基を復帰突然変異の組み合わせのために選択した。ここで、アミノ酸残基はＫａｂａｔ番号システムにより同定され、注釈付けされた。
【0202】
１．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の分子クローニング
プライマーＰＣＲを設計して、各ヒト化抗体ＶＨ遺伝子フラグメントを構築し、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＦＣ）フラグメントを有する発現ベクターｐＱＤと相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＦＣ－ｐＱＤを構築した。
プライマーＰＣＲを設計して、各ヒト化抗体ＶＨ遺伝子フラグメントを構築し、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＦＣ）フラグメントを有する発現ベクターｐＱＤと相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターＶＨ－ＦＣ－ｐＱＤを構築した。
【0203】
オンラインソフトウェアＤＮＡＷｏｒｋｓ（ｖ３．２．２）（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を用いて、複数のプライマーを設計してＶＨ／ＶＫ組換えに必要な遺伝子フラグメント：５’－３０ｂｐシグナルペプチド＋ＶＨ＋３０ｂｐ ＦＣ－３’を合成した。ＴａＫａＲａ社のＰｒｉｍｅｒ ＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡポリメラーゼ操作説明書に従い、上記で設計した複数のプライマーを用いて、二段階に分けてＰＣＲ増幅によりＶＨ／ＶＫ組換えに必要な遺伝子を含むフラグメントを得た。シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＦＣ）フラグメントを有する発現ベクターｐＱＤの構築及び酵素消化は、制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｍＢＩを用いて、酵素消化部位の認識配列と異なる特徴を識別して、シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＦＣ）フラグメントを有する発現ベクターｐＱＤを設計し、構築した。ＢｓｍＢＩ酵素切断ベクタは、ゲルを切断して、後で使用するために回収した。発現ベクターＶＨ－ＦＣ－ｐＱＤを組換えて構築した。組み換えに必要なＶＨ遺伝子を含むフラグメントとＢｓｍＢＩ酵素切断回収発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＦＣ）フラグメントを有する）を３：１の割合でそれぞれＤＨ５Ｈ感受性細胞に添加し、０℃で３０分間氷浴し、４２℃で９０秒間熱撃し、５倍体積のＬＢ媒体を添加し、３７℃で４５分間培養し、ＬＢ－Ａｍｐプレートを塗布し、３７℃で一晩培養し、モノクローナルを選択し、配列決定して各目的のクローンを得た。
【0204】
各クローンのヒト由来化設計の軽鎖及び重鎖可変領域の配列及びタンパク質発現番号は以下に示される通りであり、表において、抗体はそのＣ末端にヒトＩｇＧ１－ＦＣ定常領域を融合させた。
【0205】
【表15】
【0206】
＊ヒト化ＶＨＨは、元のラクダの単一ドメイン抗体の長さと一致し、いずれも１２６ａａであった。
【0207】
同時に、ヒト化前のキメラ抗体及び対照抗体のクローン発現を設計し、以下の表に示される通りである。
【0208】
【表16】
【0209】
２．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体タンパク質の発現
２９３Ｅ細胞の培養密度を０．２～３×１０６／ｍｌに維持し、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心墳りし、細胞密度を０．５～０．８×１０６／ｍｌに調節した。トランスフェクション当日、２９３Ｅ細胞密度は１～１．５×１０６／ｍｌであった。プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを用意し、ＰＥＩとプラスミドの質量比が２：１になるように１００ｕｇ／１００ｍｌの細胞の量でプラスミドをトランスフェクションした。プラスミドとＰＥＩをよく混合し、１５分間静置し、２０分を超えてはいけない。プラスミドとＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーで培養し、トランスフェクション５日目、水平遠心分離機４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞上清を収集した。
２９３Ｅ細胞の培養密度を０．２～３×１０６／ｍｌに維持し、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心墳りし、細胞密度を０．５～０．８×１０６／ｍｌに調節した。トランスフェクション当日、２９３Ｅ細胞密度は１～１．５×１０６／ｍｌであった。プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを用意し、ＰＥＩとプラスミドの質量比が２：１になるように１００ｕｇ／１００ｍｌの細胞の量でプラスミドをトランスフェクションした。プラスミドとＰＥＩをよく混合し、１５分間静置し、２０分を超えてはいけない。プラスミドとＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーで培養し、トランスフェクション５日目、水平遠心分離機４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞上清を収集した。
【0210】
３．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体タンパク質の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製
カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり；遠心分離後の培養液の上澄をカラムに通し、サンプルは４０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで上昇した時点で溶離ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで下降した時点で収集を停止し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルの収集が終了した後、ＰＡＣ－ＥＰをｐＨ調節液で中性に調節した。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製
カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり；遠心分離後の培養液の上澄をカラムに通し、サンプルは４０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで上昇した時点で溶離ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで下降した時点で収集を停止し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルの収集が終了した後、ＰＡＣ－ＥＰをｐＨ調節液で中性に調節した。
【0211】
４．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の結合活性（Ｂｉｎｄｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ）
抗体ＱＰ１１６２／ＱＰ３２０／ＱＰ３２１／ＱＰ３２２／ＱＰ１１６６／ＱＰ３２３／ＱＰ３２４／ＱＰ３２５ ０．７５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ １．５ｕｇ／ｍｌを５０ｕｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェル、ＲＴ １ｈ。２ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ ＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）をそれぞれ異なる濃度で１：４に希釈し、ＲＴで１時間培養した。ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェル、ＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌで１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
抗体ＱＰ１１６２／ＱＰ３２０／ＱＰ３２１／ＱＰ３２２／ＱＰ１１６６／ＱＰ３２３／ＱＰ３２４／ＱＰ３２５ ０．７５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ １．５ｕｇ／ｍｌを５０ｕｌ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェル、ＲＴ １ｈ。２ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ ＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）をそれぞれ異なる濃度で１：４に希釈し、ＲＴで１時間培養した。ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェル、ＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌで１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
【0212】
結果は図１５及び表１４で示されるように、本発明のナノ抗体ＱＰ１１６２のヒト化抗体ＱＰ３２２、ヒト化抗体ＱＰ１１６６のヒト化抗体ＱＰ３２５は、いずれもＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することができ、ヒト化前のナノ抗体に相当する。
【0213】
【表17】
【0214】
５．ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の活性同定（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ－ＥＬＩＳＡ）
５０ｕｌ／ウェルのタンパク質ＱＰ１１３８（ＰＤ１－ＦＣ）２ｕｇ／ｍｌをコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェル、ＲＴ １ｈ。それぞれ２ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ ＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）と異なる濃度のＱＰ１１２０ １５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ ３０ ｕｇ／ｍｌを調製し、１：３に希釈し、等体積で混合し、ＲＴで１時間放置した。ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェルでＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌで１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
５０ｕｌ／ウェルのタンパク質ＱＰ１１３８（ＰＤ１－ＦＣ）２ｕｇ／ｍｌをコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェル、ＲＴ １ｈ。それぞれ２ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ ＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）と異なる濃度のＱＰ１１２０ １５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ ３０ ｕｇ／ｍｌを調製し、１：３に希釈し、等体積で混合し、ＲＴで１時間放置した。ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェルでＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌで１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
【0215】
実験結果は図１６及び表１５で示されるように、本発明のナノ抗体ＱＰ１１６２のヒト化抗体ＱＰ３２２、ナノ抗体ＱＰ１１６６のヒト化抗体ＱＰ３２５は、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１タンパク質の結合を阻害することができ、ヒト化前のナノ抗体に相当する。
【0216】
【表18】
【0217】
７．ＳＰＲによるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の親和性の同定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性の検出
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により、被検分子とタンパク質ヒトＰＤ－Ｌ１及びｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１との親和性を測定した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による親和性の検出
Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（ＧＥ）により、被検分子とタンパク質ヒトＰＤ－Ｌ１及びｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１との親和性を測定した。
【0218】
抗原情報は以下の通りである。
【0219】
【表19】
【0220】
【表20】
【0221】
【0222】
実験結果は、ＳＰＲ親和性の結果、ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＱＰ３２２、ＱＰ３２５ノいずれもヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質及びサルＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することを示している。ここで、ヒト化ナノ抗体ＱＰ３２２とラクダナノ抗体ＱＰ１１６２は、ヒト及びサルのＰＤ－Ｌ１タンパク質に対して同様の結合親和性を持ち、ヒト化に成功した。
【0223】
実施例３：抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体
本実施例では、ヒト化後のナノ抗体ＱＰ３２２をそれぞれ抗ＣＬＤＮ１８．２の重鎖と、結合ペプチド（Ｇ４Ｓ）４を介して融合タンパク質を形成して、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の構築に用いられた。
本実施例では、ヒト化後のナノ抗体ＱＰ３２２をそれぞれ抗ＣＬＤＮ１８．２の重鎖と、結合ペプチド（Ｇ４Ｓ）４を介して融合タンパク質を形成して、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の構築に用いられた。
【0224】
設計された抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体分子は、形態がを図１に示される通りであった。
【0225】
１．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のクローニング
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ遺伝子フラグメントを構築し、発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子フラグメントを有する）と相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターｐＱＤを構築した。
プライマーＰＣＲを設計して各ヒト化抗体ＶＨ遺伝子フラグメントを構築し、発現ベクターｐＱＤ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子フラグメントを有する）と相同組換えを行い、抗体全長発現ベクターｐＱＤを構築した。
【0226】
抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体配列及びタンパク質発現番号は、以下の通りである。
【0227】
【表21】
【0228】
２．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現
２９３Ｅ細胞の培養密度を０．２～３×１０６／ｍｌに維持し、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心墳りし、細胞密度を０．５～０．８×１０６／ｍｌに調節した。トランスフェクション当日、２９３Ｅ細胞密度は１～１．５×１０６／ｍｌであった。プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを用意し、トランスフェクションするプラスミドの量は１００ｕｇ／１００ｍｌの細胞であり、使用されるＰＥＩとプラスミドの質量比は２：１であった。プラスミドとＰＥＩをよく混合し、１５分間静置し、２０分を超えてはいけない。プラスミドとＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーで培養し、トランスフェクション５日目、水平遠心分離機４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞上清を収集した。
２９３Ｅ細胞の培養密度を０．２～３×１０６／ｍｌに維持し、維持段階培地（ＧＩＢＣＯ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）を用いて培養し、トランスフェクション前日にトランスフェクション細胞を遠心墳りし、細胞密度を０．５～０．８×１０６／ｍｌに調節した。トランスフェクション当日、２９３Ｅ細胞密度は１～１．５×１０６／ｍｌであった。プラスミドとトランスフェクション試薬ＰＥＩを用意し、トランスフェクションするプラスミドの量は１００ｕｇ／１００ｍｌの細胞であり、使用されるＰＥＩとプラスミドの質量比は２：１であった。プラスミドとＰＥＩをよく混合し、１５分間静置し、２０分を超えてはいけない。プラスミドとＰＥＩの混合物を２９３Ｅの細胞にゆっくりと加え、８％ＣＯ２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーで培養し、トランスフェクション５日目、水平遠心分離機４７００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞上清を収集した。
【0229】
３．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体発現の精製
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製
カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり；遠心分離後の培養液上澄をカラムに通し、サンプルは４０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで上昇した時点で溶離ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで下降した時点で収集を停止し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルの収集が終了した後、ＰＡＣ－ＥＰを調整液で中性に調節した。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製
カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであり；遠心分離後の培養液上澄をカラムに通し、サンプルは４０ｍｌであり、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；カラムに平衡液を通し、少なくとも３ＣＶであり、実際の体積は２０ｍｌであり、機器から流出する最終溶液のｐＨと導電率が平衡液と一致することを確保し、流速は０．３３ｍｌ／ｍｉｎであり；溶離液をカラムに通し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで上昇した時点で溶離ピーク（ＰＡＣ－ＥＰ）の収集を開始し、ＵＶ２８０が１５ｍＡＵまで下降した時点で収集を停止し、流速は１ｍｌ／ｍｉｎであった。サンプルの収集が終了した後、ＰＡＣ－ＥＰを調整液で中性に調節した。
【0230】
４つの抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体をＰｒｏｔｅｉｎ Ａで精製し、ＳＥＣで精製し、濃縮し、ＳＥＣを実行して純度を評価し、要約表は下記の表に示される通りである。
【0231】
【表22】
【0232】
ＳＥＣ純度同定はＨＰＬＣにより行い、表中の４つの分子スペクトルは：図１７、図１８、図１９及び図２０で示される通りである。ＱＰ３６９１４３３は図１７に示され、ＱＰ３７０１４４０の精製は図１８に示され、ＱＰ３７１１４６１の精製は図１９に示され、ＱＰ３７２１１１６の精製は図２０に示される通りである。結果は、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の一過性発現収率が良好であり、ＳＥＣ純度が良好であることを示した。タンパク質は濃縮された後、物理的及び化学的性質は安定している。
４．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性（ＰＤ－Ｌ１ｂｉｎｄｉｎｇ）
ＰＤ－Ｌ１ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡ：
抗体ＱＰ３２２ ０．７５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ １．５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ３６９１４３３、ＱＰ３７０１４４０、ＱＰ３７１１４６１、ＱＰ３７２１１１６ ５０ｕｌ／ウェルをコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェル、ＲＴで１時間放置した。１ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）をそれぞれ異なる濃度で１：５に希釈し、ＲＴで１時間培養した。ＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェルであり、ＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌで、１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
４．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性（ＰＤ－Ｌ１ｂｉｎｄｉｎｇ）
ＰＤ－Ｌ１ Ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＬＩＳＡ：
抗体ＱＰ３２２ ０．７５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ １．５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ３６９１４３３、ＱＰ３７０１４４０、ＱＰ３７１１４６１、ＱＰ３７２１１１６ ５０ｕｌ／ウェルをコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェル、ＲＴで１時間放置した。１ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）をそれぞれ異なる濃度で１：５に希釈し、ＲＴで１時間培養した。ＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェルであり、ＰＢＳＴを６回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌで、１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
【0233】
結果は図２１及び表２０に示される通りである。ＥＬＩＳＡの結果は、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３６９１４３３、ＱＰ３７０１４４０、ＱＰ３７１１４６１、ＱＰ３７２１１１６におけるＰＤ－Ｌ１ナノ抗体がＦＣフラグメントのＣ末端に融合し、及びアイソタイプ対照（ＱＰ３２２）におけるＰＤ－Ｌ１ナノ抗体がＦＣフラグメントのＮ末端に融合し、いずれもヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合し、ＥＣ５０に相当であることを示した。
【0234】
【表23】
【0235】
５．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のブロッキング活性（ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
コーティング：抗体ＱＰ１１３８ ２ｕｇ／ｍｌを５０ｕｌ／ウェルで、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェルであり、ＲＴで１時間放置した。それぞれ２ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ ＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）と異なる濃度のＱＰ３２２ １５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ ３０ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ３６９１４３３、ＱＰ３７０１４４０、ＱＰ３７１１４６１、ＱＰ３７２１１１６ ３６ｕｇ／ｍｌを調製し、１：３で希釈し、等体積で混合し、ＲＴで１時間放置した。ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェルであり、ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌであり、１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
コーティング：抗体ＱＰ１１３８ ２ｕｇ／ｍｌを５０ｕｌ／ウェルで、４℃で一晩放置した。ＰＢＳを３回実行した。ブロッキング：３％ＢＳＡ ２５０ｕｌ／ウェルであり、ＲＴで１時間放置した。それぞれ２ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ ＱＰ００４．３（ｂｉｏｔｉｎ－ＰＤＬ１－ＦＣ）と異なる濃度のＱＰ３２２ １５ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ１１８０１１８１ ３０ｕｇ／ｍｌ、ＱＰ３６９１４３３、ＱＰ３７０１４４０、ＱＰ３７１１４６１、ＱＰ３７２１１１６ ３６ｕｇ／ｍｌを調製し、１：３で希釈し、等体積で混合し、ＲＴで１時間放置した。ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。二次抗体の培養：ＨＲＰ－ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）５０ｕｌ／ウェルであり、ＰＢＳＴを３回実行し、ＰＢＳを３回実行した。発色：ＴＭＢ １００ｕｌ／ｗｅｌｌであり、１０分間発色させた。２ＭのＨ２ＳＯ４ ５０ｕｌ／ｗｅｌｌを加えて終了させた。
【0236】
結果は図２２及び表２１に示される通りである。ＥＬＩＳＡの結果は、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３６９１４３３、ＱＰ３７０１４４０、ＱＰ３７１１４６１、ＱＰ３７２１１１６におけるＰＤ－Ｌ１ナノ抗体がＦＣのＣ末端に融合し、及びアイソタイプ対照（ＱＰ３２２）におけるＰＤ－Ｌ１ナノ抗体がＦＣのＮ末端に融合し、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質とＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合をブロックすることができ、ＩＣ５０の阻害に相当することを示した。
【0237】
【表24】
【0238】
６．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のブロッキング活性（ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０ ｂｌｏｃｋｉｎｇ）
ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
ＣＤ８０－ＦＣ ４ｕｇ／ｍｌをコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、５％脱脂粉乳でブロッキングし、ＲＴで１時間放置した。最終濃度０．５ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ－ＱＰ００４＋ＣＨＯ１４（１０ｕｇ／ｍｌ、１：５で希釈）で培養し、ＲＴで１時間放置した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）、ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢで発色させた。注：ＣＨＯ１４タンパク質は、ＱＰ３７１１４６１であり、ＣＨＯ細胞で発現することによって得られたタンパク質である。
ＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＥＬＩＳＡ
ＣＤ８０－ＦＣ ４ｕｇ／ｍｌをコーティングし、４℃で一晩放置した。ＰＢＳで３回洗浄し、５％脱脂粉乳でブロッキングし、ＲＴで１時間放置した。最終濃度０．５ｕｇ／ｍｌのＢｉｏｔｉｎ－ＱＰ００４＋ＣＨＯ１４（１０ｕｇ／ｍｌ、１：５で希釈）で培養し、ＲＴで１時間放置した。ＰＢＳＴで５回洗浄した。ＨＲＰ－Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ（１：５０００）、ＰＢＳＴで６回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＴＭＢで発色させた。注：ＣＨＯ１４タンパク質は、ＱＰ３７１１４６１であり、ＣＨＯ細胞で発現することによって得られたタンパク質である。
【0239】
結果は図２３及び表２２で示される通りである。ＥＬＩＳＡの結果は、本発明の抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＣＨＯ１４（ＱＰ３７１１４６１）がＰＤ－Ｌ１とＣＤ８０の結合をブロックできることを示している。
【0240】
【表25】
【0241】
７．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性（ＥＬＩＳＡによるＣＬＤＮ１８．２活性の検出）
検査試薬：脱脂粉乳（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（生工、Ｂ５４８１１７－０５００）、ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）、ＴＭＢ（Luoyang Baiaotong Experimental Materials Center、Ｃ０６０２０１）、Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：ＮａＣｌ ８．００ｇ、ＫＣｌ ０．２０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０ ２．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ～８００ｍＬを秤量してｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、十分に溶解させた後、１Ｌまで定容し、ｐＨを７．４まで調節し、高温滅菌しておいた。又は市販の１０×、２０×のＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用した。ブロッキング液：５ｇの脱脂粉乳をＰＢＳに秤量し、ブロッキング液は使用直前に調製する必要がある。停止液（１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下した。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、シェーカー（１２０ｒｐｍ）に置き、１００ｕｌ／ウェルであった。
検査試薬：脱脂粉乳（ＢＤ、２３２１００）、ＰＢＳ（生工、Ｂ５４８１１７－０５００）、ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－０３５－０８８）、ＴＭＢ（Luoyang Baiaotong Experimental Materials Center、Ｃ０６０２０１）、Ｅｌｉｓａプレート（ｃｏｓｔａ、９０１８）１×ＰＢＳ緩衝液：ＮａＣｌ ８．００ｇ、ＫＣｌ ０．２０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０ ２．９ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇ～８００ｍＬを秤量してｄｄＨ２Ｏ中に溶解させ、十分に溶解させた後、１Ｌまで定容し、ｐＨを７．４まで調節し、高温滅菌しておいた。又は市販の１０×、２０×のＰＢＳ溶液を購入して１×ＰＢＳ緩衝液に希釈して使用した。ブロッキング液：５ｇの脱脂粉乳をＰＢＳに秤量し、ブロッキング液は使用直前に調製する必要がある。停止液（１ｍｏｌ／ＬのＨ２ＳＯ４）：１０９ｍＬの９８％濃Ｈ２ＳＯ４を２０００ｍＬのｄｄＨ２Ｏにゆっくりと滴下した。ＴＭＢを３７℃で１０分間発色させ、シェーカー（１２０ｒｐｍ）に置き、１００ｕｌ／ウェルであった。
【0242】
実験ステップ：２Ｅ５／ウェルの細胞ＣＨＯＳ－ＣＬＤ１８．２－１６－２をＵ型プレートで播種し、氷ＰＢＳで１回洗浄し、１２００ｒｐｍで、３分間遠心分離した。ＶＣＤ：１．２１ Ｅ６、実際に１６５ｕｌ／ウェルをプレーティングし、洗浄終了後、２００μＬ／ウェルでブロッキング液を加え、氷上で１時間培養した。ブロッキング終了後、１２００ｒｐｍで３分間遠心分離した後、上清を振って除去し、ＣＨＯ１４サンプルを培養し、１００ｕｇ／ｍＬ１：２の希釈比により、合計１２個の勾配を希釈し、最後に一つのブランク対照を設置し、１００ｕｇ／ｍＬ、３３．３３３３３３３３ｕｇ／ｍＬ、１１．１１１１１１１１ｕｇ／ｍＬ、３．７０３７０３７０４ｕｇ／ｍＬ、１．２３４５６７９０１ｕｇ／ｍＬ、０．４１１５２２６３４ｕｇ／ｍＬ、０．１３７１７４２１１ｕｇ／ｍＬ、０．０４５７２４７３７ｕｇ／ｍＬ、０．０１５２４１５７９ｕｇ／ｍＬ、０．００５０８０５２６ｕｇ／ｍＬ、０．００１６９４ｕｇ／ｍＬ、０ｕｇ／ｍＬで１００ｕｌ／ウェルを入れて十分に混合した後、氷上で２時間培養し、氷ＰＢＳで３回洗浄した。酵素標識抗体の添加：ＨＲＰ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を培養し、１：１００００の希釈比で、１００ｕｌ／ウェルで、十分に混合した後、氷上１時間置き、氷ＰＢＳで３回洗浄した。基質発色液の添加：１００μＬ／ウェルの使用量で基質発色液ＴＭＢを添加し、シェーカーに置き、２００ｒｐｍ、３５℃で１０分間暗所で発色させた。終了：発色終了後、１００μＬ／ウェルの使用量で停止液を速やかに添加して反応を終了させた。測定：３５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、１２０ｕｌの上清を取ってＥｌｉｓａプレートに移し、マイクロプレートリーダーでＡ４５０ｎｍのＯＤ値を測定し、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて結果を分析した。
【0243】
ＣＨＯ１４とＣＨＯＳ－ＣＬＤＮ１８．２高発現細胞株の結合ＥＣ５０は０．２６５３ｎＭであった。候補分子ＣＨＯ１４は、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合することが実証され、結果は図２４に示される通りである。
【0244】
８．抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＰＤ－Ｌ１機能活性の同定（混合リンパ球反応ＭＬＲ）
ＤＣ（ｄｏｎｏｒ１）細胞の製造：ＰＢＭＣを蘇生し、ＥａｓｙＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ １９３５９）でｍｏｎｏｃｙｔｅｓを分離し、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とｒｈＩＬ４（５００Ｕ／ｍｌ）を加え、細胞を３７℃で６日間培養してｉＤＣに誘導し；２～３日ごとに液体の半分を交換し、同時にｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とｒｈＩＬ４（５００Ｕ／ｍｌ）を補充し；細胞を回収して３００ｘｇで５分間遠心分離し、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とｒｈＩＬ４（５００Ｕ／ｍｌ）を加えた培地で再懸濁させ、同時にＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加え、続いて３７℃で１日間培養して成熟ＤＣに誘導し；細胞を収集し、カウントして予備した。Ｔ（ｄｏｎｏｒ２）細胞の製造：ＰＢＭＣを蘇生し、ＥａｓｙＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ １７９５２）でＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌを分離した。抗体の製造：抗体（初期濃度１０ｕｇ／ｍｌ）を培地で１：５の勾配で６個の濃度に希釈した。ＤＣ細胞：Ｔ細胞を１：１０の比で混合し、異なる濃度の抗体を添加して混合培養し、２日目に培養上清中のＩＬ２の発現を検出し、５日目に培養上清中のＩＦＮｇの発現を検出した。
ＤＣ（ｄｏｎｏｒ１）細胞の製造：ＰＢＭＣを蘇生し、ＥａｓｙＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ １９３５９）でｍｏｎｏｃｙｔｅｓを分離し、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とｒｈＩＬ４（５００Ｕ／ｍｌ）を加え、細胞を３７℃で６日間培養してｉＤＣに誘導し；２～３日ごとに液体の半分を交換し、同時にｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とｒｈＩＬ４（５００Ｕ／ｍｌ）を補充し；細胞を回収して３００ｘｇで５分間遠心分離し、ｒｈＧＭ－ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍｌ）とｒｈＩＬ４（５００Ｕ／ｍｌ）を加えた培地で再懸濁させ、同時にＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を加え、続いて３７℃で１日間培養して成熟ＤＣに誘導し；細胞を収集し、カウントして予備した。Ｔ（ｄｏｎｏｒ２）細胞の製造：ＰＢＭＣを蘇生し、ＥａｓｙＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ １７９５２）でＣＤ４＋Ｔｃｅｌｌを分離した。抗体の製造：抗体（初期濃度１０ｕｇ／ｍｌ）を培地で１：５の勾配で６個の濃度に希釈した。ＤＣ細胞：Ｔ細胞を１：１０の比で混合し、異なる濃度の抗体を添加して混合培養し、２日目に培養上清中のＩＬ２の発現を検出し、５日目に培養上清中のＩＦＮｇの発現を検出した。
【0245】
混合リンパ球反応実験では、候補分子ＣＨＯ１４はＴ細胞活性化後に産生されるサイトカインＩＦＮγ及びＩＬ－２の濃度に対して明らかな抗体濃度依存性を示した。候補分子ＣＨＯ１４におけるＰＤ－Ｌ１抗体の生物学的機能が証明され、ＣＨＯ１４はＴ細胞の増殖を有意に促進することができる。図２５及び図２６で示される通りである。
【0246】
９．ＰＢＭＣが介した抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の細胞殺傷
ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ（ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２）の製造：ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２をトリプシンで１０００ｒｐｍで５分間消化した。新鮮な培地に交換し、９６ウェルプレートに２０，０００ｃｅｌｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。抗体の製造：抗体を培地で１：５の勾配で（２００ｎＭ～０．０００５１２ｎＭ、０）１０濃度に希釈した。９６ウェルプレートｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌの培地を吸引し、上記で希釈した各濃度の抗体を７０ｕｌ／ウェルずつ加え、濃度ごとに複製ウェルを設定した。ＰＢＭＣの製造：１日目に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地で再懸濁させ、カウントした。ＰＢＭＣ：Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ＝５０：１で上記ウェルプレートに７０ｕｌ／ウェルを加え、３７℃で４時間培養した。１５ｕｌのｌｙｓｉｓ緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）をＭａｘ ｌｙｓｉｓ ｗｅｌｌに加え、３７℃で１０分間培養した。
ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ（ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２）の製造：ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２をトリプシンで１０００ｒｐｍで５分間消化した。新鮮な培地に交換し、９６ウェルプレートに２０，０００ｃｅｌｌ／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。抗体の製造：抗体を培地で１：５の勾配で（２００ｎＭ～０．０００５１２ｎＭ、０）１０濃度に希釈した。９６ウェルプレートｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌの培地を吸引し、上記で希釈した各濃度の抗体を７０ｕｌ／ウェルずつ加え、濃度ごとに複製ウェルを設定した。ＰＢＭＣの製造：１日目に蘇生したＰＢＭＣを遠心分離し、培地で再懸濁させ、カウントした。ＰＢＭＣ：Ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ＝５０：１で上記ウェルプレートに７０ｕｌ／ウェルを加え、３７℃で４時間培養した。１５ｕｌのｌｙｓｉｓ緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００）をＭａｘ ｌｙｓｉｓ ｗｅｌｌに加え、３７℃で１０分間培養した。
【0247】
ＬＤＨ試薬の製造：９６ウェルプレートを２００ｇで５分間遠心分離し、上清を１００ｕｌ／ウェルで新しい透明な９６ウェルプレートに移した。ＬＤＨ細胞毒性検出キット（ｃａｙｍａｎ、１０００８８８２－４８０ｗｅｌｌ）を取り出し、反応液を調製し、１００ｕｌ／ｗｅｌｌを加え、３７℃で３０分間軽く振とうした。４９０ｎｍでの吸収度を取得し、式Ｃｏｎ（ｕｇ／ｍｌ）％Ｍａｘｉｍａｌ ｓｉｇｎａｌ＝（Ｔｅｓｔ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）／（Ｍａｘ－Ｃｏｎｔｒｏｌ）－Ｃｏｎ（０ｕｇ／ｍｌ）％Ｍａｘｉｍａｌ ｓｉｇｎａｌに従ってデータを分析した。
【0248】
結果は図２７、表２３及び表２４に示される通りである。ＡＤＣＣ実験では、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体ＱＰ１４６１１４６３及び抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３７１１４６１は、いずれも濃度依存的にＰＢＭＣ媒介のｃｌａｕｄｉｎ１８．２を組換えて発現するｃｌａｕｄｉｎ１８．２及びＰＤ－Ｌ１を自然に発現するヒト肺がん細胞ＨＣＣ８２７－ＣＬＤＮ１８．２を殺傷できる。二重特異性抗体ＱＰ３７１１４６１の殺傷ＥＣ５０は、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体ＱＰ１４６１１４６３より優れる。
【0249】
【表26】
【0250】
【表27】
【0251】
１０．免疫標的ヒト化トランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６－ｈＰＤＬ１モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍＣｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内効能研究
実験方法：対数増殖期マウス大腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１（Ｔｇ）－ｍＣｌａｕｄｉｎ１８．２（Ｔｇ）細胞（ヒトＰＤＬ１及びマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現し、同時にマウスＰＤＬ１をノックアウトする）を採取し、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤＬ１マウスの右側腹部に皮下に接種し、接種量は５×１０５／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後８日目に平均腫瘍体積が８２．８５ｍｍ３に達した時点で、腫瘍体積に応じて無作為に４群に分け、群当たり９匹であった。群分け当日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
実験方法：対数増殖期マウス大腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１（Ｔｇ）－ｍＣｌａｕｄｉｎ１８．２（Ｔｇ）細胞（ヒトＰＤＬ１及びマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現し、同時にマウスＰＤＬ１をノックアウトする）を採取し、培地を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６－ｈＰＤＬ１マウスの右側腹部に皮下に接種し、接種量は５×１０５／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後８日目に平均腫瘍体積が８２．８５ｍｍ３に達した時点で、腫瘍体積に応じて無作為に４群に分け、群当たり９匹であった。群分け当日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
【0252】
実験結果：図２８及び表２５に示される通りである。
【0253】
【表28】
【0254】
試験対象とする分子は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３７１１４６１であり、投与量はそれぞれ１．５ｍｐｋ、４ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、ＢＩＷ×３であり、ｉ．ｖ．投与した。投与後２８日目のＰＢＳ群（陰性対照群）の平均腫瘍体積は１０３３．９７ｍｍ３に達し、ＱＰ３７１１４６１（１．５ｍｐｋ）群の平均腫瘍体積は９３２．５２ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝１２．１９％であり、ＱＰ３７１１４６１（４ｍｐｋ）群の平均腫瘍体積は３６０．９２ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝６１．８１％であり、ＱＰ３７１１４６１（１０ｍｐｋ）群の平均腫瘍体積は２９４．５０ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝６９．５３％であり；４ｍｐｋ群、１０ｍｐｋ群及びＰＢＳ群の腫瘍体積は統計的な意義及び有意差があった（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。
【0255】
本実験は、免疫標的ヒト化トランスジェニックマウスのＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍClaudin１８．２モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が優れた抗腫瘍能力を示すことを証明する。
【0256】
１１．免疫系ヒト化マウスＰＢＭＣ ｅｎｇｒａｆｔｅｄ－ＮＣＧモデルＨＣＣ８２７－ｈClaudin１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内効能研究
実験方法：対数増殖期のヒト肺腺がんを安定的にトランスフェクションする細胞株ＨＣＣ８２７－ｈClaudin１８．２細胞（当該細胞はヒトＰＤＬ１を自然に高発現し、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過発現する）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＮＣＧマウス右側腹部に皮下に接種し、接種量は５×１０６／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後７日目に平均腫瘍体積が１５０ｍｍ３に達した時点で、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６／１００μＬ／匹）を接種した。腫瘍体積に応じて無作為に４群に分け、群当たり９匹であった。群分けした日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
実験方法：対数増殖期のヒト肺腺がんを安定的にトランスフェクションする細胞株ＨＣＣ８２７－ｈClaudin１８．２細胞（当該細胞はヒトＰＤＬ１を自然に高発現し、ヒトｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過発現する）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＮＣＧマウス右側腹部に皮下に接種し、接種量は５×１０６／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後７日目に平均腫瘍体積が１５０ｍｍ３に達した時点で、ヒトＰＢＭＣ（５×１０６／１００μＬ／匹）を接種した。腫瘍体積に応じて無作為に４群に分け、群当たり９匹であった。群分けした日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
【0257】
実験結果：図２９及び表２６で示される通りである。
【0258】
【表29】
【0259】
試験対象とする分子は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３７１１４６１であり、投与量はそれぞれ４ｍｐｋ、１０ｍｐｋ，ＢＩＷ×３であり、ｉ．ｖ．で投与し；対照抗体分子はＴｅｃｅｎｔｒｉｑであり、投与量は５ｍｐｋであり、ＢＩＷ×３、ｉ．ｖ．で投与した。投与後２４日目のＰＢＳ群（陰性対照群）の平均腫瘍体積は１３０６．８ｍｍ３に達し、ＱＰ１４６１３７１（４ｍｐｋ）群の平均腫瘍体積は２５８．５１ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝８０．２２％であり、ＱＰ１４６１３７１（１０ｍｐｋ）群の平均腫瘍体積は１０４．８１ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝９１．９８％であり、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（５ｍｐｋ）群の平均腫瘍体積は９０．９０ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝９３．０４％であり；ＱＰ３７１１４６１（４ｍｐｋ）群、ＱＰ３７１１４６１（１０ｍｐｋ）群、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（５ｍｐｋ）群及びＰＢＳ群の腫瘍体積は統計的な意義及び有意差があった（ｔ検定、ｐ＜０．０１）。
【0260】
本実験は、免疫系ヒト化マウスのＨＣＣ８２７－ｈClaudin１８．２モデルにおける抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体も優れた抗腫瘍能力を示すことを説明する。
【0261】
１２．Ｃ５７ＢＬ／６モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍClaudin１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内相乗効能研究
実験方法：対数増殖期マウス大腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１（Ｔｇ）－ｍClaudin１８．２（Ｔｇ）細胞（当該細胞はヒトＰＤＬ１及びマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現し、マウスＰＤＬ１をノックアウトする）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下に接種し、接種量は５×１０５／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後７日目に平均腫瘍体積が約９０ｍｍ３に達した時点で、腫瘍体積に応じて無作為に４群に分け、群当たり１０匹であった。群分けした日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
実験方法：対数増殖期マウス大腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１（Ｔｇ）－ｍClaudin１８．２（Ｔｇ）細胞（当該細胞はヒトＰＤＬ１及びマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現し、マウスＰＤＬ１をノックアウトする）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に皮下に接種し、接種量は５×１０５／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後７日目に平均腫瘍体積が約９０ｍｍ３に達した時点で、腫瘍体積に応じて無作為に４群に分け、群当たり１０匹であった。群分けした日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
【0262】
実験結果：図３０及び表２７で示される通りである。
【0263】
【表30】
【0264】
試験分子は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３７１１４６１、突然変異ＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有する分子ＱＰ３０７７１４６１（ＱＰ３７１１４６１－ΔＰＤＬ１ ｎｕｌｌ）及び突然変異ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する能力を有する分子ＱＰ３０８９１９０２（ＱＰ３７１１４６１－Δｃｌａｕｄｉｎ１８．２ｎｕｌｌ）であり、投与量は５ｍｇ／ｋｇ、Ｑ２Ｄ×６であり、ｉｐ．投与であった。投与後１３日目のＰＢＳ群（陰性対照群）の平均腫瘍体積は１２６２．２７ｍｍ３に達し、ＱＰ３７１１４６１群の平均腫瘍体積は５３２．８７ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝６２．２４％であり、ＱＰ３０７７１４６１群の平均腫瘍体積は１１７３．６２ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝７．５９％であり、ＱＰ３０８９１９０２群の平均腫瘍体積は７９４．７５ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝３９．６３％であり；ＱＰ３０７７１４６１群及びＰＢＳ群の腫瘍体積は統計的な意義及び有意差があり（ｔ検定、ｐ＜０．０１）、突然変異分子ＱＰ３０８９１９０２群及びＰＢＳ群の腫瘍体積は統計的な意義及び有意差があった（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0265】
本実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍClaudin１８．２モデルで抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体は相乗効果を有し、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも優れた抗腫瘍活性を示すことを説明する。
【0266】
１３．Ｃ５７ＢＬ／６モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍClaudin１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内相乗効能研究
実験方法：対数増殖期のマウス大腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１（Ｔｇ）－ｍClaudin１８．２（Ｔｇ）細胞（当該細胞はヒトＰＤＬ１及びマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現し、マウスＰＤＬ１をノックアウトする）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側脇腹に皮下接種し、接種量は５×１０５／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後６日目に腫瘍体積に応じて無作為に３群に分け、群当たり１５匹であった。群分けした日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
実験方法：対数増殖期のマウス大腸がん細胞ＭＣ３８－ｈＰＤＬ１（Ｔｇ）－ｍClaudin１８．２（Ｔｇ）細胞（当該細胞はヒトＰＤＬ１及びマウスｃｌａｕｄｉｎ１８．２を過剰発現し、マウスＰＤＬ１をノックアウトする）を採取し、培養液を除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側脇腹に皮下接種し、接種量は５×１０５／１００μＬ／匹であった。接種後のマウスを観察し、腫瘍の増殖をモニタリングし、接種後６日目に腫瘍体積に応じて無作為に３群に分け、群当たり１５匹であった。群分けした日をＤ０日と定義し、Ｄ０日から投与を開始した。
【0267】
実験結果：図３１及び表２８で示される通りである。
【0268】
【表31】
【0269】
試験分子は、抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＱＰ３７１１４６１、突然変異ＰＤ－Ｌ１に結合する能力を有する分子ＱＰ３０７７１４６１（ＱＰ３７１１４６１－ΔＰＤＬ１ｎｕｌｌ）及び突然変異ｃｌａｕｄｉｎ１８．２に結合する能力を有する分子ＱＰ３０８９１９０２（ＱＰ３７１１４６１－Δｃｌａｕｄｉｎ１８．２ｎｕｌｌ）であり、投与量はそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ（ＱＰ３７１１４６１群）、５ｍｇ／ｋｇ＋５ｍｇ／ｋｇ（ＱＰ３０７７１４６１＋ＱＰ３０８９１９０２併用投与群）であり、Ｑ３Ｄ×６であり、ｉｖ．投与した。投与後１９日目のＰＢＳ群（陰性対照群）の平均腫瘍体積は８３８．７６ｍｍ３に達し、ＱＰ３７１１４６１群の平均腫瘍体積は３１３．６３ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝６７．１５％であり、ＱＰ３０７７１４６１＋ＱＰ３０８９１９０２併用投与群の平均腫瘍体積は４７８．６１ｍｍ３に達し、ＴＧＩ＝４５．９８％であり；ＱＰ３７１１４６１群及びＰＢＳ群の腫瘍体積は統計的な意義及び有意差があり（ｔ検定、ｐ＜０．０１）、突然変異分子ＱＰ３０７７１４６１＋ＱＰ３０８９１９０２併用投与群及びＰＢＳ群の腫瘍体積は統計的な意義及び有意差があった（ｔ検定、ｐ＜０．０５）。
【0270】
本実験は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍＣｌａｕｄｉｎ１８．２モデルにおいて抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が相乗効果を有し、ｃｌａｕｄｉｎ１８．２モノクローナル抗体及びＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体よりも優れた抗腫瘍活性を示すことを説明する（ｐ＝０．０５２）。
【0271】
本明細書で言及されるすべての文献は、各文献が単独で参照として引用されているように、引用により本出願に組み込まれる。さらに、本発明に関する上記の講義を読んだ当業者は、本発明に対して様々な変更又は修正を加えることができ、それらは同等の形で、本願に添付された請求項の範囲にも入ることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【0272】
【図1】抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体分子の構造模式図を示す。
【図2】ＥＬＩＳＡによる第１群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図3】ＥＬＩＳＡによる第２群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図4】ＥＬＩＳＡによる第３群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図5】ＥＬＩＳＡによる第４群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図6】ＥＬＩＳＡによる第５群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図7】ＦＡＣＳによる第１群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図8】ＦＡＣＳによる第２群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図9】ＦＡＣＳによる第３群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図10】ＦＡＣＳによる第４群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図11】ＦＡＣＳによる第５群のヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体活性の同定結果を示す。
【図12】ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＡＤＣＣの結果を示す。
【図13】ヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体ＣＤＣの結果を示す。
【図14】免疫不全マウスＣＢ．１７－ＳＣＩＤモデルにおけるヒト化ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体の生体内薬力学的結果を示す。
【図15】ＥＬＩＳＡによるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体の結合活性の同定結果を示す。
【図16】ＥＬＩＳＡによるヒト化抗ＰＤ－Ｌ１単一ドメイン抗体のブロッキング活性の同定結果を示す。
【図17】第１の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【図18】第２の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【図19】第３の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【図20】第４の抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現・精製の結果を示す。
【図21】ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の結合活性の同定結果を示す。
【図22】ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の活性をブロックする結果を示す。
【図23】ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＰＤ－Ｌ１／ＣＤ８０の活性をブロックする結果を示す。
【図24】ＥＬＩＳＡによる抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体がＣＬＤＮ１８．２に結合する活性の検出結果を示す。
【図25】抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＰＤ－Ｌ１の機能活性同定（混合リンパ球反応ＭＬＲにおける候補分子ＣＨＯ１４によるＴ細胞活性化後に産生されるサイトカインＩＦＮγの濃度依存結果）を示す。
【図26】抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＰＤ－Ｌ１の機能活性同定（混合リンパ球反応ＭＬＲにおける候補分子ＣＨＯ１４によるＴ細胞活性化後に産生されるサイトカインＩＬ－２の濃度依存結果）を示す。
【図27】抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＰＢＭＣが媒介した細胞殺傷実験の結果を示す。
【図28】免疫標的ヒト化トランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６－ｈＰＤＬ１モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内薬力学評価の結果を示す。
【図29】免疫系ヒト化マウスＰＢＭＣ移植－ＮＣＧモデルＨＣＣ８２７－ｈｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内薬力学評価の結果を示す。
【図30】Ｃ５７ＢＬ／６モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内相乗薬効の評価を示す。
【図31】Ｃ５７ＢＬ／６モデルＭＣ３８－ｈＰＤＬ１－ｍｃｌａｕｄｉｎ１８．２における抗ＣＬＤＮ１８．２／抗ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の生体内相乗薬効の評価を示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【配列表】