特許 7464707 ＵＤＰ－ガラクトースを調製するための酵素的方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-01

(45)【発行日】2024-04-09

(54)【発明の名称】ＵＤＰ－ガラクトースを調製するための酵素的方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/30 20060101AFI20240402BHJP

   C12N 9/12 20060101ALI20240402BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20240402BHJP

   C12N 15/54 20060101ALN20240402BHJP

【ＦＩ】

C12P19/30 ZNA

C12N9/12

C12N9/10

C12N15/54

【請求項の数】 15

(21)【出願番号】P 2022525883

(86)(22)【出願日】2020-09-30

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-01-18

(86)【国際出願番号】 EP2020077396

(87)【国際公開番号】W WO2021089251

(87)【国際公開日】2021-05-14

【審査請求日】2023-10-02

(31)【優先権主張番号】19207016.7

(32)【優先日】2019-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】501497655

【氏名又は名称】マックス プランク ゲゼルシャフト ツゥアー フェデルゥン デル ヴィッセンシャフテン エー フォー

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】マホウア レザ

(72)【発明者】

【氏名】レクサー トーマス エフ．テー．

【審査官】大西 隆史

(56)【参考文献】

【文献】米国特許出願公開第２００２／０１５０９６８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特開２００１－１６１３９０（ＪＰ，Ａ）

【文献】特開平０３－１０８４９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】MAHOUR, Reza et al.，Journal of Biotechnology，2018年07月22日，Vol. 283，pp. 120-129，DOI: 10.1016/J.JBIOTEC.2018.07.027

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １／００－４１／００

Ｃ１２Ｎ ９／００－ ９／９９

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：

【化1】

Ａ）（ｉ）以下の式で表されるウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース

【化2】

（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記酵素のセットが、ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記酵素のセットが、１ドメインポリリン酸キナーゼ２をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記酵素のセットが、２ドメインポリリン酸キナーゼ２をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記酵素のセットの少なくとも１つの酵素が、固体支持体に固定化されている、請求項１または４に記載の方法。

【請求項6】

前記酵素のセットが、固体支持体に共固定化されている、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記酵素のセットが、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから直接的に固体支持体に共固定化されている、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

ステップＡ）で準備される溶液中のウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースの濃度が、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記ポリリン酸塩が、少なくとも２５個のリン酸残基を有する長鎖ポリリン酸塩である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースが、単一反応混合物中で生産される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ステップＡ）のウリジン一リン酸が、ウリジン、アデノシン三リン酸、およびウリジンキナーゼから；またはウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼから；またはオロチン酸、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびＵＭＰトランスフェラーゼから得られる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、またはペプチドの利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、またはペプチドから、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、またはガラクトシル化ペプチドを生産するステップ
をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、またはペプチドが、抗体もしくはモノクローナル抗体であるか、またはヒト乳オリゴサッカライドである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

Ｅ）ステップＤ）で形成されるウリジン二リン酸を再利用して、ウリジン三リン酸を得るステップ
をさらに含む、請求項１２または１３に記載の方法。

【請求項15】

グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットであって、当該酵素のセットがエポキシ基で官能化された固体支持体に共固定化されている、酵素のセット。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

［発明の分野］
本発明は、低コスト基質であるウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからＵＤＰ－ガラクトースを単一反応混合物中で生産するための酵素触媒プロセスに関する。上記プロセスは、バッチモードまたは送込バッチモードまたは任意の他の操業モードで（半）連続的に操業することができる。さらに、上記プロセスは、サッカライド、特にヒト乳オリゴサッカライド（ＨＭＯ）、タンパク質、糖タンパク質、特に抗体、糖ペプチド、ならびにバイオコンジュゲート、特に炭水化物コンジュゲートワクチンおよび抗体－薬物コンジュゲートを含むガラクトシル化分子および生体分子を生産するように適合させることができる。

【0002】

［発明の背景］
ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトース（ＵＤＰ－ガラクトースまたはＵＤＰ－Ｇａｌ）は、数多くのバイオテクノロジー応用および食品技術の重要な基質である。これは、自己免疫疾患の治療に使用される療法用抗体のガラクトシル化のための基質である。さらに、ＵＤＰ－ガラクトースは、炭水化物ワクチンを生産するために、および個別化医療の成長分野に、つまり薬物送達用の糖ナノ材料の調製に必要である。乳幼児用食品（ヒト乳）では、ガラクトシル化オリゴサッカライドは、ヒト乳オリゴサッカライドの重要な成分を構成しており、したがって乳幼児向けの合成的に生産された乳製品にガラクトシル化糖を含めることには大きな需要が存在する（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４３２号（２０１６年）６２～７０頁）。

【0003】

しかしながら、ＵＤＰ－ガラクトースの需要が高いにも関わらず（年間トン規模）、研究者でさえ、ＵＤＰ－ガラクトースの入手可能性は非常に限られている。これまでのところ、ＵＤＰ－ガラクトースの価格は、１グラムあたり約２，０００米ドルである。ＵＤＰ－ガラクトースの価格が高いため、基礎研究活動および応用研究活動が滞っているのみならず、産業的応用も妨げられている。

【0004】

ＵＤＰ－ガラクトースを合成するためのバイオプロセス工学戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏプロセスおよびｉｎ ｖｉｔｒｏプロセスに分類することができ、微生物は、代謝の一部として細胞内または細胞外のいずれかでＵＤＰ－ガラクトースを産生するために代謝的に操作されている。しかしながら、収率が低いこと、不要な副産物のレベルが高いこと、細胞株設計に時間が必要であること、および大規模化が複雑であることが欠点である。特に乳幼児用食品の場合は規制側面を考慮すると、遺伝子組換え生物（ＧＭＯ）の応用は、承認プロセスを大幅に遅延させる可能性がある。

【0005】

米国特許出願第０９／７５７，８４６号およびＬｉｕら（ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ、２００２年、３巻、３４８～３５５頁）には、糖ヌクレオチド産生酵素およびグリコシルトランスフェラーゼを使用する、複合糖質をｉｎ ｖｉｔｒｏで産生するための方法が開示されている。ＵＤＰ－Ｇａｌは、高価なグルコース１－リン酸およびＵＤＰ－グルコースから開始して７個の酵素のカスケードにより調製され、全収率は３５％だった。酵素は、より大規模の合成には実用的ではないＮｉ ＮＴＡアガロースビーズに固定化されている。酵素はアガロースビーズに弱く結合しており、最適なＵＤＰ－Ｇａｌ産生に必要な高イオン強度の反応混合物では急速に洗い流されてしまう。酵素が浸出するため、特に食品応用および薬学的応用の認証プロセスが大幅に滞る可能性があり、各使用後にビーズを再負荷する必要がある。さらに、大量では毒性のあるニッケルイオンがビーズから溶液に放出されることにより、ビーズをＨＭＯＳの合成に使用することはほとんど不可能である可能性が高い。加えて、Ｎｉアガロースビーズは機械的にロバストではない。Ｎｉアガロースビーズは、柔らかく、高剪断速度がアガロースビーズを劣化させるためまたは大規模カラムパッキングでは圧縮のため、撹拌槽型反応器では使用することができない。劣化したアガロースビーズからのガラクトースの放出は、酵素の基質中毒を引き起こす可能性がある。

【0006】

Ｋｏｉｚｕｍｏら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９９８年、１６巻、８４７頁）は、出発物質としてガラクトースおよびオロチン酸に加えてグルコース１－リン酸を使用する類似のＵＤＰ－Ｇａｌ合成を報告している。ＵＴＰのガラクトースへの移転は、２つの酵素ＧａｌＴおよびＧａｌＵを用いて達成された。このプロセスは、１０％（容積／容積）キシレンの存在下で実施され、ガラクトースからの２９％の低反応収率は２１時間後に達成された。質量移動制限が著しいため大規模応用が困難である高濃度バイオマスが使用された。さらに、キシレンは、中程度の急性毒性となる。

【0007】

Ｍｕｔｈａｎａら（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１２年、４８巻、２７２８～２７３０頁）は、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）（ＢＬＵＳＰ）に由来する無差別ＵＤＰ糖ピロホスホリラーゼ（ＵＳＰ、ＥＣ２．７．７．６４）を使用する、モノサッカライドおよびＵＴＰからのＵＤＰ－糖のワンポット多酵素合成を報告している。

【0008】

低コストで容易に入手可能な基質から開始して、費用効果の高い様式でＵＤＰ－ガラクトースを生産するための方法が長らく必要とされている。

【0009】

したがって、本発明の目的は、ＵＤＰ－ガラクトースを調製するための費用効果が高い効率的な方法を提供することである。

【0010】

本発明の目的は、独立請求項の教示により解決される。本発明のさらに有利な特徴、態様、および詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図面、及び実施例から明らかである。

【発明の概要】

【0011】

［発明の説明］
生化学では、ヌクレオチド糖はモノサッカライドの活性型として周知であり、グリコシル化反応では、ヌクレオチド糖はグリコシル供与体として作用することが公知である。グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）は、活性化ヌクレオチド糖から求核性グリコシル受容体分子へのサッカライド部分の移転を触媒する酵素である。したがって、生化学的には、グリコシル化反応は、グリコシルトランスフェラーゼにより触媒される。

【0012】

グリコシル供与体として作用するためには、それぞれのモノサッカライドが、例えばヌクレオチド糖、特にウリジン二リン酸、グアノシン二リン酸、またはシトシン二リン酸などに由来するヌクレオチドジホスホ糖の形態のように、高エネルギー形態で存在することが不可欠である。周知のヌクレオチド糖の例は、ＵＤＰ－グルコース、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、ＵＤＰ－キシロース、ＵＤＰ－グルクロン酸、ＧＤＰ－マンノース、およびＧＤＰ－フコースである。単純なモノサッカライドの活性化ヌクレオチド糖への変換は、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）およびグリコシル一リン酸の酵素触媒反応により達成できること、及び、グリコシル一リン酸は、アノマー炭素にリン酸基を含有することは、周知である。

【0013】

ヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）－モノサッカライドを得るためには、使用されるモノサッカライドは、グリコシル一リン酸誘導体へと変換される必要がある。一般に、上記反応は、ホスホトランスフェラーゼおよび加えて必要に応じてホスホムターゼのような特異的な酵素を適用して、所望のモノサッカライド－１－リン酸を得ることにより達成することができる。ホスホトランスフェラーゼは、リン酸化反応を触媒するＥＣ番号２．７に分類される酵素である。ホスホトランスフェラーゼは、それらの受容体分子に応じてさらに分類される。例えば、ＥＣ２．７．１のホスホトランスフェラーゼは、受容体としてアルコール基を有するホスホトランスフェラーゼである。ホスホムターゼは、イソメラーゼ、つまりリン酸基の内部移転を触媒することができる酵素である。Ｄ－マンノースまたはＤ－グルコース、例えばそれぞれマンノース－６－リン酸およびグルコース－６－リン酸の場合のように、ホスホトランスフェラーゼを介した基質のリン酸化がモノサッカライド－６－リン酸をもたらす場合、ホスホムターゼが必要とされる。次いで、それぞれのホスホムターゼは、リン酸基の内部移転を触媒し、それによりそれぞれマンノース－６－リン酸がマンノース－１－リン酸へと、またはグルコース－６－リン酸がグルコース－１－リン酸へと変換される。

【0014】

キナーゼは、ホスホトランスフェラーゼファミリーの一部を形成する酵素である。キナーゼは、高エネルギーのリン酸供与分子から特定の基質へのリン酸基の移転を触媒する酵素である。このプロセスはリン酸化として公知であり、基質がリン酸基を獲得し、高エネルギーアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）分子がリン酸基を供与する。このエステル交換により、リン酸化基質およびＡＤＰが産生される。したがって、モノサッカライド－１－リン酸を得るために、ガラクトキナーゼのような好適なキナーゼを適用して、Ｄ－ガラクトースからガラクトース１－リン酸を得ることができる。

【0015】

ヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用すると、ヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）およびモノサッカライド－１－リン酸を、それぞれのヌクレオシド二リン酸（ＮＤＰ）－モノサッカライドに変換することができる。ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、リン含有基のトランスフェラーゼ酵素であり、ＥＣ番号２．７．７に分類される。様々な天然に存在するヌクレオチドとして、ヌクレオチド特異的ヌクレオチジルトランスフェラーゼが当技術分野で公知であり、例えば、ウリジルトランスフェラーゼはウリジリル基を移転し、アデニルトランスフェラーゼはアデニリル基を移転し、グアニリルトランスフェラーゼはグアニリル基を移転し、シチジリルトランスフェラーゼはシチジル基を移転し、チミジリルトランスフェラーゼはチミジリル基を移転する。したがって、ヌクレオチジルトランスフェラーゼは、モノサッカライド－１－リン酸とヌクレオシド三リン酸との反応を触媒し、例えば、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸（ＵＴＰ）との反応を触媒してＵＤＰ－ガラクトースを得るのに好適である。ＵＤＰ－ガラクトースの場合、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）との反応を触媒するためには、ウリジリルトランスフェラーゼが好適である。

【0016】

天然に存在するＵＤＰ－モノサッカライドに関するウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－モノサッカライドは、ＵＤＰ－ガラクトース、ＵＤＰ－ＧａｌＮＡｃ、およびＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃである。上記に記載の基本反応スキームは、特定のウリジニリルトランスフェラーゼとともにウリジン三リン酸およびガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を使用する、ＵＤＰ－ガラクトースには適用されない。というのは、ＵＴＰ：ガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．７．７．１０）へのアクスセスが非常に制限されているためである（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２０１２年、４８巻、２７２８～２７３０頁を参照）。代わりに、ＵＤＰ－ガラクトースは、通常、ガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ、ＥＣ２．７．７．１２）を使用するＵＤＰ－グルコースから調製されることにより（例えば、米国特許出願第０９／７５７，８４６号明細書；ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１９９８年、１６巻、８４７頁を参照）、さらなる基質（ＵＤＰ－グルコースまたはグルコース１－リン酸）およびさらなる酵素ＧａｌＴが必要とされる。

【0017】

文献に記載されているＵＤＰ－Ｇａｌ合成の上述の欠点にも関わらず、ＮＴＰ糖に至る基本反応スキームのさらなる不都合は、出発物質、特にそれぞれのヌクレオシド三リン酸が非常に高価であり、したがって合成経路がＮＤＰモノサッカライド、特にＵＤＰ－ガラクトースの合成にコストがかかるという事実に基づく。上記で既に説明したように、ＵＤＰ－ガラクトースの場合、当技術ではヌクレオシド二リン酸モノサッカライドを調製するための、特に、低コストで容易に入手可能な出発物質からＵＤＰ－ガラクトースを調製するための費用効果が高い効率的な方法を提供する必要性が存在する。

【0018】

ＵＤＰ－モノサッカライドに関しては、ＵＤＰ－ガラクトースは、哺乳動物では、天然に存在する活性化ＵＤＰ－糖に関する。したがって、ＵＭＰは好適なヌクレオチドとして特定され、Ｄ－ガラクトースはＵＤＰ－ガラクトースの調製に好適なモノサッカライドとして特定される。酵素触媒反応に関しては、少なくとも好適な酵素が提供されなければならないことが明らかなはずである。したがって、本発明者らは、ＵＭＰおよび容易に入手可能なＤ－ガラクトースが、酵素的ワンポットカスケード反応でＵＤＰ－ガラクトースを生産するための好適な出発物質であることを特定した。

【0019】

ＵＤＰ－ガラクトースを調製するための費用効果が高く効率的な方法を提供するためには、ＵＭＰ（ウリジン一リン酸）およびＤ－ガラクトースが、図１に図示されている通りの酵素的カスケード反応でＵＤＰ－ガラクトースを生産するための好適な出発物質であることを特定した。この酵素カスケード反応は、（ａ）Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ；触媒量）からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、（ｂ）ＵＭＰおよびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、および（ｃ）ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸（ＵＴＰ）とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ることから構成される。ＵＤＰ－ガラクトースは、ガラクトキナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、Ｄ－ガラクトースおよびウリジン一リン酸から直接的に生産することが起想された。

【0020】

驚くべきことに、本発明者らは、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ることが、ＵＴＰとα－Ｄ－グルコース１－リン酸とが反応して二リン酸およびＵＤＰ－グルコースに至ることを触媒する能力について公知であるに過ぎない酵素であるグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＵ）（ＥＣ２．７．７．９）により効率的に触媒され得ることを見出した。したがって、本発明の酵素カスケードには、グルコース１－リン酸などのさらなるモノサッカライド基質も、ガラクトース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼも必要とされない。したがって、本発明による、ＵＤＰ－Ｇａｌを生産するための方法は、酵素カスケードがより少量の酵素およびより少数の高価な出発物質を必要とすることにより、本発明の方法がより効率的になり収率が９９％を上回り、より安価になるため、上記に記載の方法よりも有益である（実施例２を参照）。

【0021】

さらに、本発明の方法は、高価なウリジン三リン酸出発物質を回避し、ウリジン一リン酸に置き換えることができ、それにより本明細書に記載の通りの、ＵＤＰ－ガラクトースを調製するための費用効果が高く効率的な方法がもたらされるため、Ｄ－ガラクトースおよびウリジン三リン酸からのＵＤＰ－ガラクトースの酵素的合成に関して当技術分野で公知である上記に記載の方法よりも有益である。

【0022】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：

【0023】

【化1】

Ａ）（ｉ）以下の式により表されるウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース

【0024】

【化2】

（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む、方法に関する。

【0025】

本発明による、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースの生産ステップＢ）は、
（ａ）ガラクトキナーゼにより触媒されている、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）ウリジン一リン酸キナーゼおよびポリリン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、アデノシン三リン酸、およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、
（ｃ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ること
を含む。

【0026】

自明のことではあるが、ステップ（ａ）および（ｂ）は、同時に実施してもよくまたは連続して実施してもよい。それらの順序は（ｂ）－＞（ａ）－＞（ｃ）と逆にすることもできる。

【0027】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）（ａ）ガラクトキナーゼにより触媒されている、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ）ウリジン一リン酸キナーゼおよびポリリン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、アデノシン三リン酸、およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、ならびに
（ｃ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ること
により、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む、方法に関する。

【0028】

より詳細には、本発明による、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースの生産ステップＢ）は、
（ａ）ガラクトキナーゼにより触媒されている、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジン一リン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン一リン酸およびアデノシン三リン酸からウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ポリリン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン二リン酸およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、ならびに
（ｃ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ること
を含む。

【0029】

自明のことではあるが、ステップ（ａ）は、ステップ（ｂ１）または（ｂ２）の前に、同時に、または後に実施してもよい。したがって、ステップの順序は、（ｂ１）－＞（ｂ２）－＞（ａ）－＞（ｃ）と逆にすることもできる。

【0030】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）（ａ）ガラクトキナーゼにより触媒されている、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジン一リン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン一リン酸およびアデノシン三リン酸からウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ポリリン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン二リン酸およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、ならびに
（ｃ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ること
により、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む、方法に関する。

【0031】

ＵＤＰ－ガラクトースを生産するための本発明の方法は、先行技術に記載されている方法に対して、以下の重要な利点を有する：
・出発物質に関してコストが大幅に低減されること、つまり高価なＵＤＰまたはＵＴＰを必要としないこと、
・本方法は、連続的様式で実施することができ、それによって年間トン規模のＵＤＰガラクトース提供が潜在的に可能になること、
・無細胞プロセスであり、それによって有害なＧＭＯ側面（規制、ラベリング）が回避されること、
・無細胞抽出物が直接的に使用され、生体触媒精製のコストがかからないこと、
・酵素は、低コストで市販のすぐに使用することができる固体支持体に固定化することができること、
・ガラクトースに関して収率がほぼ定量的であること、
・大規模化可能性が高く、本発明の方法が産業応用に有用であること。

【0032】

一実施形態では、酵素は、固体支持体に固定化されている。したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ、を含み
酵素のセットは固体支持体に固定化されている方法を対象とする。好ましくは、酵素のセットは、各酵素の酵素活性に影響を及ぼすことなく、固体支持体に共固定化されている。

【0033】

本発明のさらなる態様は、サッカライド、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチド、特にヒト乳オリゴサッカライド（ＨＭＯ）、および（モノクローナル）抗体を含む分子および生体分子のガラクトシル化であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ
を含むガラクトシル化を対象とする。

【0034】

ガラクトシル化のための本発明の方法の一実施形態では、ＵＴＰは、副産物ＵＤＰから再生される。したがって、触媒量のＵＭＰしか必要とされない。したがって、ガラクトシル化のための本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；ならびに
Ｅ）ステップＤ）で形成されたウリジン二リン酸を再利用して、ウリジン三リン酸を得るステップ
を含む。

【0035】

好ましくは、酵素のセットは、各酵素の酵素活性に影響を及ぼすことなく、固体支持体に共固定化されている。上記固体支持体は、エポキシ基で官能化されたメタクリレートなど、機械的強度の高いポリマー骨格で構成されている場合、生産性に影響を及ぼすことなく複数回再使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様は、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットであって、エポキシ基で官能化された固体支持体に共固定化されている酵素のセットに関する。好ましくは、固体支持体は、メタクリレートポリマーである。好ましくは、ガラクトシルトランスフェラーゼは、酵素のセットと共に固体支持体に共固定化されている。

【0036】

[発明を実施するための形態]
定義
本明細書で使用される場合、「ポリリン酸塩」という用語は、長鎖の形成を導く、６つ以上のリン酸（ＰＯ_４）四面体の角共有（ｃｏｒｎｅｒ ｓｈａｒｉｎｇ）により形成される幾つかのＰ－Ｏ－Ｐ結合を含有する任意の塩を指す。「ＰｏｌｙＰ_ｎ」という用語が同義的に使用され、ｎは、リン酸残基の数の平均鎖長を表し、例えば、ＰｏｌｙＰ_２５は、約２５個のリン酸残基を有するポリリン酸塩を指し、ＰｏｌｙＰ_１４は、約１４個のリン酸残基を有するポリリン酸塩を指す。

【0037】

本明細書で使用される場合、「ウリジンキナーゼ」という用語は、ウリジンキナーゼ活性を有するポリペプチドを指し、つまりウリジンキナーゼは、アデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン５’一リン酸に至るウリジンの反応を触媒する。ウリジンキナーゼは、ＥＣ分類２．７．１．４８に属する。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ポリリン酸キナーゼ」という用語は、ポリリン酸キナーゼ活性を有するポリペプチドを指し、つまり、ポリリン酸キナーゼは、以下の反応を触媒する：

【化3】

［式中、Ｎは、グアノシン、アデノシン、ウリジンなどのヌクレオチドであり、ＮＭＰはヌクレオシド一リン酸であり、ＮＤＰはヌクレオシド二リン酸であり、ＮＴＰはヌクレオシド三リン酸である］。

【0039】

ウリジンの場合、ポリリン酸キナーゼは、以下の反応を触媒する。

【化4】

ポリリン酸キナーゼは、ＥＣ分類２．７．４．１に属する。本明細書に記載の本発明の方法にて使用されるポリリン酸キナーゼ酵素の代表としては、これらに限定されないが、ポリリン酸キナーゼ１（ＰＰＫ１）、ポリリン酸キナーゼ２（ＰＰＫ２）、２ドメインポリリン酸キナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）および１ドメインポリリン酸キナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）、ならびにポリリン酸キナーゼ３（ＰＰＫ３）が挙げられる。

【0040】

本明細書で使用される場合、「グルコース１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ」という用語は、ウリジリルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、つまりＵＴＰ：α－Ｄ－グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼであり、以下の反応を触媒するポリペプチドを指す。

【化5】

グルコース１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＵ）は、ＥＣ分類２．７．７．９に属する。本発明者らが見出したように、グルコース１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、α－Ｄ－ガラクトース１－リン酸へのＵＴＰの移転も触媒する。

【化6】

【0041】

本明細書で使用される場合、「ピロホスファターゼ」という用語は、ピロホスファターゼ活性を有するポリペプチド、つまり以下の反応を触媒するポリペプチドを指す：

【化7】

［式中、ＰＰｉは、ピロリン酸を指し、Ｐｉはリン酸を指す］。
ピロホスファターゼは、ＥＣ分類３．６．１．１に属する。この状況では、「ジホスファターゼ」という用語は、二リン酸のリン酸への加水分解を触媒するピロホスファターゼポリペプチドを指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「ガラクトキナーゼ」という用語は、キナーゼ活性を有するポリペプチド、つまりα－Ｄ－ガラクトース１－リン酸に至る以下のリン酸化を触媒するキナーゼを指す。

【化8】

ガラクトキナーゼは、ＥＣ分類２．７．１．６に属する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ」という用語は、ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、つまり、以下の反応を触媒するトランスフェラーゼを指す：

【化9】

［式中、ＰＲＰＰは、リン酸化ペントース、好ましくはリン酸化リボース、最も好ましくは５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸を指す］。例示的に、トランスフェラーゼは、これらに限定されないが、ＥＣ分類２．４．２．９に属するウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、またはそのようなトランスフェラーゼ活性があることも公知である、ＥＣ分類２．４．２．５７に属するＡＭＰホスホリラーゼである。

【0044】

本明細書で使用される場合、「ＵＭＰシンターゼ」という用語は、ウリジン一リン酸シンセターゼ活性を有するポリペプチド、つまり、以下の反応を触媒するシンターゼを指す：

【化10】

［式中、ＯＭＰは、オロチジン－５’－リン酸を指す］。ＵＭＰシンターゼという用語は、オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼと同義的に使用され、この酵素はＥＣ分類４．１．１．２３に属する。

【0045】

本明細書で使用される場合、「オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ」という用語は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、つまり、以下の反応を触媒するトランスフェラーゼを指す。

【化11】

このトランスフェラーゼは、ＥＣ分類２．４．２．１０に属する。

【0046】

本明細書で使用される場合、「ガラクトシルトランスフェラーゼ」という用語は、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、つまり、ＵＤＰ－Ｇａｌから受容体（生体）分子へのガラクトースの移転を触媒するポリペプチドを指す。好ましくは、受容体は、グルコースまたはＮ－アセチルグルコサミンなどのサッカライドである。好ましくは、ガラクトシルトランスフェラーゼは、β－ガラクトシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、ガラクトースと受容体サッカライドの４位との間にβ－グリコシド連結を形成することにより、ＵＤＰ－Ｇａｌから受容体サッカライドへのガラクトースの移転を触媒するβ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼである。

【0047】

ヒトでは末端α－ガラクトシル部分は天然に生じず、したがって抗体などにあるα－ガラクトシル構造に対する抗体反応の点で免疫応答を誘発する可能性があるため、α－ガラクトシルトランスフェラーゼよりもβ－ガラクトシルトランスフェラーゼが好ましい。ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＥＣ分類２．４．１．－に属する。

【0048】

「配列同一性のパーセンテージ」および「相同性パーセンテージ」は、本明細書では、ポリペプチド間の比較を参照するために交換可能に使用され、比較ウィンドウにわたって最適にアラインされた２つの配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウ内のポリペプチド配列の部分は、２つの配列を最適にアラインメントするために参照配列と比較して付加又は欠失（つまりギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、両配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出することができる。その代わりに、パーセンテージは、両配列において同一のアミノ酸残基が存在するかまたはアミノ酸残基がギャップ付きでアラインされているかのいずれかである位置の数を決定して一致位置の数を得、一致位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除算し、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることにより算出することができる。当業者であれば、２つの配列をアラインするために利用可能な多くの確立されているアルゴリズムが存在することを理解している。

【0049】

「参照配列」は、配列比較の基準として使用される画定配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長ポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、ポリペプチドの少なくとも２０アミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、または完全長である。２つのポリペプチドは各々、（１）２つの配列間で類似する配列（つまり、完全な配列の部分）を含んでいてもよく、（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含んでいてもよいため、２つ（またはそれよりも多くの）ポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することにより実施される。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づいていてもよく、参照配列は、一次配列に１つまたは複数の変化を有する可能性のある配列である。

【0050】

本明細書で使用される場合、「サッカライド」は、これらに限定されないが、モノサッカライド、ジサッカライド、トリサッカライド、テトラサッカライド、ペンタサッカライド、ヘキササッカライド、ヘプタサッカライド、オクタサッカライド・・・、オリゴサッカライド、グリカン、およびポリサッカライドを指す。サッカライドは、好ましくは、以下のものから選択されるモノサッカライド単位を含む：Ｄ－アラビノース、Ｄ－リキソース、Ｄ－リボース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、Ｌ－リキソース、Ｌ－リボース、Ｌ－キシロース、Ｄ－リブロース、Ｄ－キシルロース、Ｌ－リブロース、Ｌ－キシルロース、Ｄ－デオキシリボース、Ｌ－デオキシリボース、Ｄ－エリスロース、Ｄ－スレオ－ス、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－グリセロ－Ｄ－マンノ－ヘプトース、Ｄ－アロース、Ｄ－アルトロース、Ｄ－グルコース、Ｄ－マンノース、Ｄ－グロース、Ｄ－イドース、Ｄ－ガラクトース、Ｄ－タロース、Ｄ－プシコース、Ｄ－フルクトース、Ｄ－ソルボース、Ｄ－タガトース、６－デオキシ－Ｌ－アルトロース、６－デオキシ－Ｄ－タロース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－ラムノース、Ｌ－ラムノース、Ｄ－キノボース、オリボース、チベロース、アスカリロース、アベクオース、パラトース、ジギトキソース、コリトース、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－マンノサミン、Ｄ－アロサミン、Ｌ－アルトロサミン、Ｄ－グロサミン、Ｌ－イドサミン、Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－マンノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－アロサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－アルトロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－グロサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－イドサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－タロサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－フコサミン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ラムノサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－キノボサミン、Ｄ－グルクロン酸、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－マンヌロン酸、Ｄ－アルロン酸、Ｌ－アルトルロン酸、Ｄ－グルロン酸、Ｌ－グルロン酸、Ｌ－イズロン酸、Ｄ－タルロン酸、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルノイラミン酸、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、アピオース、バシロサミン、テベトース、アコフリオース、シマロース、ムラミン酸、Ｎ－アセチルムラミン酸、Ｎ－グリコリルムラミン酸、３－デオキシ－ｌｙｘｏ－ヘプツロサル酸、ケトデオキシオクトン酸、およびケトデオキシノノン酸。好ましくは、モノサッカライド単位は、以下のものを含むかまたはからなる群のα－およびβ－Ｄ／Ｌ－炭水化物に属する：
α－Ｄ－リボピラノース、α－Ｄ－アラビノピラノース、α－Ｄ－キシロピラノース、α－Ｄ－リキソピラノース、α－Ｄ－アロピラノース、α－Ｄ－アルトロピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－マンピラノース、α－Ｄ－グルコピラノース、α－Ｄ－イドピラノース、α－Ｄ－ガラクトピラノース、α－Ｄ－タロピラノース、α－Ｄ－プシコピラノース、α－Ｄ－フルクトピラノース、α－Ｄ－ソルボピラノース、α－Ｄ－タガトピラノース、α－Ｄ－リボフラノース、α－Ｄ－アラビノフラノース、α－Ｄ－キシロフラノース、α－Ｄ－リキソフラノース、α－Ｄ－アロフラノース、α－Ｄ－アルトロフラノース、α－Ｄ－グルコフラノース、α－Ｄ－マンノフラノース、α－Ｄ－グロフラノース、α－Ｄ－イドフラノース、α－Ｄ－ガラクトフラノース、α－Ｄ－タロフラノース、α－Ｄ－プシコフラノース、α－Ｄ－フルクトフラノース、α－Ｄ－ソルボフラノース、α－Ｄ－タガトフラノース、α－Ｄ－キシルロフラノース、α－Ｄ－リブロフラノース、α－Ｄ－トレオフラノース、α－Ｄ－ラムノピラノース、α－Ｄ－エリトロフラノース、α－Ｄ－グルコサミン、α－Ｄ－グルコピラヌロン酸、β－Ｄ－リボピラノース、β－Ｄ－アラビノピラノース、β－Ｄ－キシロピラノース、β－Ｄ－リキソピラノース、β－Ｄ－アロピラノース、β－Ｄ－アルトロピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－マンピラノース、β－Ｄ－グルコピラノース、β－Ｄ－イドピラノース、β－Ｄ－ガラクトピラノース、β－Ｄ－タロピラノース、β－Ｄ－プシコピラノース、β－Ｄ－フルクトピラノース、β－Ｄ－ソルボピラノース、β－Ｄ－タガトピラノース、β－Ｄ－リボフラノース、β－Ｄ－アラビノフラノース、β－Ｄ－キシロフラノース、β－Ｄ－リキソフラノース、β－Ｄ－ラムノピラノース、β－Ｄ－アロフラノース、β－Ｄ－アルトロフラノース、β－Ｄ－グルコフラノース、β－Ｄ－マンノフラノース、β－Ｄ－グロフラノース、β－Ｄ－イドフラノース、β－Ｄ－ガラクトフラノース、β－Ｄ－タロフラノース、β－Ｄ－プシコフラノース、β－Ｄ－フルクトフラノース、β－Ｄ－ソルボフラノース、β－Ｄ－タガトフラノース、β－Ｄ－キシルロフラノース、β－Ｄ－リブロフラノース、β－Ｄ－トレオフラノース、β－Ｄ－エリトロフラノース、β－Ｄ－グルコサミン、β－Ｄ－グルコピラヌロン酸、α－Ｌ－リボピラノース、α－Ｌ－アラビノピラノース、α－Ｌ－キシロピラノース、α－Ｌ－リキソピラノース、α－Ｌ－アロピラノース、α－Ｌ－アルトロピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－マンピラノース、α－Ｌ－グルコピラノース、α－Ｌ－イドピラノース、α－Ｌ－ガラクトピラノース、α－Ｌ－タロピラノース、α－Ｌ－プシコピラノース、α－Ｌ－フルクトピラノース、α－Ｌ－ソルボピラノース、α－Ｌ－タガトピラノース、α－Ｌ－ラムノピラノース、α－Ｌ－リボフラノース、α－Ｌ－アラビノフラノース、α－Ｌ－キシロフラノース、α－Ｌ－リキソフラノース、α－Ｌ－アロフラノース、α－Ｌ－アルトロフラノース、α－Ｌ－グルコフラノース、α－Ｌ－マンノフラノース、α－Ｌ－グロフラノース、α－Ｌ－イドフラノース、α－Ｌ－ガラクトフラノース、α－Ｌ－タロフラノース、α－Ｌ－プシコフラノース、α－Ｌ－フルクトフラノース、α－Ｌ－ソルボフラノース、α－Ｌ－タガトフラノース、α－Ｌ－キシルロフラノース、α－Ｌ－リブロフラノース、α－Ｌ－トレオフラノース、α－Ｌ－エリトロフラノース、α－Ｌ－グルコサミン、α－Ｌ－グルコピラヌロン酸、β－Ｌ－リボピラノース、β－Ｌ－アラビノピラノース、β－Ｌ－キシロピラノース、β－Ｌ－リキソピラノース、β－Ｌ－アロピラノース、β－Ｌ－アルトロピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－マンピラノース、β－Ｌ－グルコピラノース、β－Ｌ－イドピラノース、β－Ｌ－ガラクトピラノース、β－Ｌ－タロピラノース、β－Ｌ－プシコピラノース、β－Ｌ－フルクトピラノース、β－Ｌ－ソルボピラノース、β－Ｌ－タガトピラノース、β－Ｌ－リボフラノース、β－Ｌ－アラビノフラノース、β－Ｌ－キシロフラノース、β－Ｌ－リキソフラノース、β－Ｌ－アロフラノース、β－Ｌ－アルトロフラノース、β－Ｌ－グルコフラノース、β－Ｌ－マンノフラノース、β－Ｌ－グロフラノース、β－Ｌ－イドフラノース、β－Ｌ－ガラクトフラノース、β－Ｌ－タロフラノース、β－Ｌ－プシコフラノース、β－Ｌ－フルクトフラノース、β－Ｌ－ソルボフラノース、β－Ｌ－タガトフラノース、β－Ｌ－キシルロフラノース、β－Ｌ－リブロフラノース、β－Ｌ－トレオフラノース、β－Ｌ－エリトロフラノース、β－Ｌ－グルコサミン、β－Ｌ－グルコピラヌロン酸、およびβ－Ｌ－ラムノピラノース

【0051】

サッカライドは、アミド、カーボネート、カルバメート、カルボニル、チオカルボニル、カルボキシ、チオカルボキシ、エステル、チオエステル、エーテル、エポキシ、ヒドロキシアルキル、アルキレニル、フェニレン、アルケニル、イミノ、イミド、イソ尿素、チオカルバメート、チオ尿素、および／または尿素部分を有するように、任意選択でさらに修飾されている。

【0052】

本明細書で使用される場合、「糖ペプチド」という用語は、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合で付着している炭水化物部分を含有するペプチドを指す。炭水化物部分は、側鎖を形成し、セリン残基もしくはスレオニン残基のヒドロキシ基に接続されているＯ－グリコシド、またはアスパラギン残基のアミド窒素に接続されているＮ－グリコシドのいずれかである。

【0053】

本明細書で使用される場合、「糖タンパク質」という用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合で付着している炭水化物部分を含むポリペプチドを指す。炭水化物部分は、側鎖を形成し、セリン残基もしくはスレオニン残基のヒドロキシ基に接続されているＯ－グリコシド、またはアスパラギン残基のアミド窒素に接続されているＮ－グリコシドのいずれかである。

【0054】

本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、非グリコシル化タンパク質およびグリコシル化タンパク質を含む、ポリペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合で付着している炭水化物部分を含有するかまたは欠如するポリペプチドを指す。

【0055】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、非グリコシル化ペプチドおよびグリコシル化ペプチドを含む、ペプチドを構成するアミノ酸残基の側鎖に共有結合で付着している炭水化物部分を含有するかまたは欠如するペプチドを指す。

【0056】

本明細書で使用される場合、「療法用抗体」という用語は、特に疾患の治療に所望の効果を有するようにヒトまたは動物に投与することができる抗体を指す。そのような療法用抗体は、一般にモノクローナル抗体であり、一般に遺伝子改変されているだろう。抗体が組換え抗体である場合、それはヒト化されていてもよい。その代わりに、療法用抗体はポリクローナル抗体であってもよい。

【0057】

本明細書で使用される場合、「バイオコンジュゲート」という用語は、互いに共有結合で結合している少なくとも２つの分子で構成されており、それらのうちの少なくとも１つは、１つまたは複数の典型的には生物学的プロセスに不可欠な生体分子、つまり生物に存在する分子である分子構築物を指す。例示的なバイオコンジュゲートは、キャリアタンパク質に共有結合でカップリングされている炭水化物抗原で構成されている炭水化物コンジュゲートワクチン、および抗体薬物コンジュゲートである。

【0058】

本明細書で使用される場合、「炭水化物コンジュゲートワクチン」という用語は、免疫原性キャリアに共有結合で結合している炭水化物抗原を含有するコンジュゲートを指す。炭水化物抗原は、これらに限定されないが、細菌性莢膜サッカライド、ウイルス糖タンパク質のサッカライド、胞子虫もしくは寄生虫のサッカライド抗原、病原性真菌のサッカライド抗原、またはがん細胞に特異的なサッカライド抗原であってもよい。免疫原性キャリアは、これらに限定されないが、破傷風トキソイド（ＴＴ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、交差反応物質１９７（ＣＲＭ_１９７）、分類不可能なＨ．インフルエンザ（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のタンパク質Ｄ、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）莢膜群Ｂの外膜タンパク質複合体（ＯＭＰＣ）、Ｐ．エルギノーザ（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の外毒素Ａ（ＥＰＡ）、Ｃ．ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（ＣＤＴＡ）、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）などの肺炎球菌タンパク質、肺炎球菌ヒスチジントライアドＤ（ＰｈｔＤ）、無毒化ニューモリシン（ｄＰｌｙ）、およびｓｐｒ９６／２０２１、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）α毒素、および志賀毒素１ｂであってもよい。

【0059】

「固体支持体」という用語は、本明細書で使用される場合、酵素または他の試薬を、直接的にまたは係留基を有するリンカーを介して付着または固定化することができ、過剰な試薬、可溶性反応産物、副産物、または溶媒からの酵素の（洗浄、濾過、遠心分離などによる）容易な分離を可能にする不溶性官能化材料を指す。固体支持体は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミドなどの有機ポリマー、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトで構成されていてもよい。また、固体支持体は、ガラス、シリカ、多孔性制御ガラス（ＣＰＧ、ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などの無機物であってもよい。また、固体支持体は、磁性粒子で構成されていてもよい。酵素固定化に好適な支持材料の概要については、Ｚｄａｒｔａら、Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ２０１８年、８巻、９２頁、およびＤａｔｔａら、Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０１３年 ３巻：１～９頁を参照されたい。

【0060】

固体支持体の構成は、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、または表面の形態であってもよい。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であってもよい。固体支持体は、多孔性であってもよくまたは非多孔性であってもよく、膨潤特質を有していてもよくまたは非膨潤特質を有していてもよい。固体支持体は、ウェル、窪み、または他の入れ物、容器、特徴、または場所の形に構成されていてもよい。

【0061】

驚くべきことに、本発明者らは、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至る反応が、ＵＴＰとα－Ｄ－グルコース１－リン酸が二リン酸およびＵＤＰ－グルコースに至る反応を触媒する能力について公知であるに過ぎない酵素（ＥＣ２．７．７．９）であるグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ（ＧａｌＵ）により効率的に触媒され得ることを見出した。したがって、本発明の酵素カスケードには、グルコース１－リン酸などのさらなるモノサッカライド基質も、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼも必要とされない。

【0062】

したがって、本発明による、ＵＤＰ－Ｇａｌを生産するための方法は、酵素カスケードのためのより少数の酵素、およびより少数の高価な出発物質が必要であり、それにより本発明の方法がより効率的になり収率が９９％を上回り、より安価になるため、先行技術の方法よりも有益である（実施例２を参照）。

【0063】

本発明の方法の一実施形態では、プロセスコストを低減するために、より高濃度の反応混合物が使用される。したがって、ステップＡ）で準備される溶液中のＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、好ましくは、０．０１ｍＭ～１００，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．０５ｍＭ～５０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．１ｍＭ～３０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である。

【0064】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）で準備される溶液中のウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースの濃度は、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である、方法を対象とする。

【0065】

好ましくは、酵素のセット中の酵素の濃度は、ステップＡ）で準備される溶液の総容積に基づき、０．０００１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬである。

【0066】

ＵＤＰ－ガラクトースに至るガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸との反応の副産物として、ピロリン酸（ＰＰｉ）が形成される。ピロリン酸は、水溶液中で不安定であるが、無機リン酸（Ｐｉ）へとゆっくりと加水分解するに過ぎない。ＰＰｉは、Ｍｇ^２＋などの金属イオンと結合し、溶液から析出するため、高濃度のピロリン酸は、ＵＤＰ－ガラクトース形成に関与するグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ酵素の活性を低下させる。加えて、ピロリン酸は、ウリジリルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼを阻害する能力が公知である。酵素ピロホスファターゼは、ピロリン酸のリン酸への加水分解を触媒し、それによりＵＤＰ－ガラクトース形成を効果的に不可逆化することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。したがって、本発明による、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0067】

言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）（ａ）ガラクトキナーゼにより触媒されている、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジン一リン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン一リン酸およびアデノシン三リン酸からウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ポリリン酸キナーゼにより触媒されている、ウリジン二リン酸およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、ならびに
（ｃ’）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ること、ならびに
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下で、ピロリン酸をリン酸へと変換することにより、
酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0068】

好ましくは、本明細書に記載の本発明の方法で使用されるピロホスファターゼは、無機ピロホスファターゼである。好ましくは、ピロホスファターゼは、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来の無機ピロホスファターゼ（ＰｍＰｐＡ）である。

【0069】

ポリリン酸塩は、初期に水性媒体に溶解されていた金属イオン（例えば、Ｃａ^２＋、Ｍｇ^２＋、Ｆｅ^{２＋／３＋}）と安定した水溶性錯体を形成することができる。この効果は、金属イオン封鎖と呼ばれ、結合した金属イオンが、反応、特に酵素反応に参加することを防止する。したがって、金属イオン封鎖された金属イオン、特にＭｇ^２＋およびＭｎ^２＋は、本明細書に記載の本発明の方法に関与する酵素の補因子として作用することができない。特定のポリリン酸塩が特定の金属イオンを金属イオン封鎖する能力は、ポリリン酸塩の鎖長の増加とともに減少するため、本発明では長鎖ポリリン酸塩が好ましい。少なくとも１４個のリン酸残基を有するポリリン酸塩がより好ましい。少なくとも２５個のリン酸残基を有するポリリン酸塩がより好ましい。

【0070】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ポリリン酸塩は、少なくとも２５個のリン酸残基を有する長鎖ポリリン酸塩である、方法を対象とする。

【0071】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ポリリン酸塩は、少なくとも２５個のリン酸残基を有する長鎖ポリリン酸塩である。

【0072】

好ましくは、酵素は、他の基質を有する単一反応混合物中に存在する。混合物は、均質（溶液）であってもよくまたは不均質であってもよい。酵素は、固体支持体に固定化されていてもよくまたはされなくてもよい。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースは、本発明の方法のさらなる態様に従って単一反応混合物中で生産される。

【0073】

したがって、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸、ならびに
（ｉｉｉ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセット
を含む混合物を準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0074】

また、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸、ならびに
（ｉｉｉ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセット
を含む溶液を準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
も含む。

【0075】

言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸、ならびに
（ｉｉｉ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む少なくとも４つの酵素
を含む混合物を準備するステップ；
Ｂ）少なくとも４つの酵素、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0076】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸、ならびに
（ｉｉｉ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、任意選択でピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセット
を含む溶液を準備するステップ；ならびに
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0077】

ポリリン酸塩は、本明細書に記載の本発明の方法において唯一のエネルギーキャリアとしての役目を果たし、ポリリン酸キナーゼ３（ＰＰＫ３）を使用するＡＤＰからのＡＴＰの再生におけるリン酸供給源として使用される。ＡＴＰの再生は、ＡＴＰに至るＡＤＰのリン酸化も触媒する１ドメインポリリン酸キナーゼ（１Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは１ドメインポリリン酸キナーゼ２（１Ｄ－ＰＰＫ２）を、本発明の方法の酵素カスケードに添加することにより増強することができる。さらに、ＡＤＰなどのヌクレオシドリン酸は、水性媒体中で不安定であり、急速に加水分解する傾向がある。ＡＭＰへの加水分解によるＡＤＰの喪失を回避するため、ＡＤＰに至るＡＭＰのリン酸化を触媒する２ドメインポリリン酸キナーゼ（２Ｄ－ＰＰＫ）、好ましくは２ドメインポリリン酸キナーゼ２（２Ｄ－ＰＰＫ２）を、１Ｄ－ＰＰＫと共にまたは単独で本発明の酵素カスケードに添加してもよい。

【0078】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、ならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0079】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼ、および２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0080】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、および１ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0081】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、および２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0082】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0083】

本明細書に記載の本発明の方法では、ＡＴＰは、ＡＤＰおよびポリリン酸塩から連続的に再生されるため、ＵＤＰ－ガラクトースの生産は、触媒量のＡＴＰで実施することができる。したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0084】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、ならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0085】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、および１ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0086】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、および２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0087】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼ、および２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0088】

「触媒量」という用語は、本明細書では、準化学量論的量のＡＴＰ、つまり、本発明の方法で使用されるガラクトースの量よりも少ないＡＴＰの量を指す。好ましくは、触媒量のＡＴＰは、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．０００００１～０．９９モルの範囲である。より好ましくは、触媒量のＡＴＰは、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．０００００１～０．９５モルの範囲である。より好ましくは、触媒量のＡＴＰは、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．０００００１～０．９モルの範囲である。より好ましくは、触媒量のＡＴＰは、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．０００００５～０．５モル、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００００１～０．１モル、より好ましくはＤ－ガラクトース１モルあたり０．００００１～０．０５モル、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００００１～０．０１モル、最も好ましくは、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．００００１～０．００１モルの範囲である。

【0089】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）では、アデノシン三リン酸は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．０００００１モル～０．９モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．０００００５モル～０．５モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００００１モル～０．１モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００００１モル～０．０５モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００００１モル～０．０１モルの量で、最も好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００００１モル～０．００１モルの量で添加される。

【0090】

したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、ならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）では、アデノシン三リン酸は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．００１モル～０．９モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００２モル～０．８モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．７モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．５モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．２モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．１モルの量で、最も好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００５モル～０．０５モルの量で添加される。

【0091】

好ましくは、ＡＴＰは、ステップＡ）で準備される溶液中に、０．０５ｍＭ～１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ～５０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ～２０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ～１０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ～５ｍＭ、最も好ましくは０．５ｍＭ～３ｍＭの濃度で存在する。
したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）では、溶液中のアデノシン三リン酸の濃度は、０．５ｍＭ～３ｍＭの範囲である。

【0092】

代替的な実施形態では、ＡＴＰの代わりにＡＤＰまたはＡＭＰを、本明細書に記載の本発明の方法に使用することができる。ＡＴＰは、ＡＭＰまたはＡＤＰおよびポリリン酸塩からｉｎ ｓｉｔｕで生成されるため、ＵＤＰ－ガラクトースの生産は、ＡＤＰまたはＡＭＰを出発物質として用いて実施することもできる。したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン一リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0093】

本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン二リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0094】

代替的な実施形態では、ＡＴＰは、時空収率を増加させるために、過剰量のＤ－ガラクトースで使用される。したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、ならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ＡＴＰの量は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり１～１００モルの範囲であり、より好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり１．２～５０モルの範囲であり、より好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり１．５～２０モルの範囲であり、最も好ましくは、ＡＴＰの量は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり２～１０モルの範囲である。

【0095】

好ましくは、本発明の方法では、ステップＡ）で得られる溶液は、５．０～１０．０、好ましくは５．５～９．５、より好ましくは６．０～９．０、さらにより好ましくは６．５～９．０、さらにより好ましくは７．０～９．０の範囲のｐＨ値、および最も好ましくは７．５～８．５の範囲のｐＨ値を有する。
したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン二リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）で得られる溶液は、７．５～８．５の範囲のｐＨ値を有する。

【0096】

本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン二リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）で得られる溶液は、約８．５の範囲のｐＨ値を有する。

【0097】

本発明の一実施形態では、ステップＡ）で準備される溶液は、酵素のセットの触媒活性のための補因子としてＭｇ^２＋イオンを含む。好ましくは、Ｍｇ^２＋イオンは、ステップＡ）で準備される溶液中に、１ｍＭ～２００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ～１５０ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ～１５０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ～１００ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭ～８０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ～８０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する。
したがって、本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩および触媒量のアデノシン二リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）で得られる溶液は、２０ｍＭ～８０ｍＭの、好ましくは２０ｍＭ～５０ｍＭの範囲のＭｇ^２＋濃度を有する。

【0098】

また、ＵＤＰ－ガラクトースを生産するための本発明の方法は、固定化酵素のセットを用いて実施することもできる。その場合、酵素は、それらの活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性を保持するように、固体支持体に固定化されている。好適な固体支持体は、例えば、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、表面、または他の固相材料である。

【0099】

一実施形態では、各酵素、つまりグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼは、固体支持体に固定化されている。さらなる実施形態では、各酵素、つまりグルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼは、固体支持体に固定化されている。

【0100】

一実施形態では、酵素のセットの一部の酵素のみが、固体支持体に固定化されている。さらなる実施形態では、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、またはポリリン酸キナーゼの組合せ、例えば１Ｄ－および２Ｄ－ｐｐｋ２およびｐｐｋ３の組合せ、ウリジン一リン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットから選択される１つの酵素のみが、固体支持体に固定化されている。さらなる別の実施形態では、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、および任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットから選択される少なくとも１つの酵素が、固体支持体に固定化されている。好ましくは、ポリリン酸キナーゼは、固体支持体に固定化されている。好ましくは、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、固体支持体に固定化されている。好ましくは、ガラクトキナーゼは、固体支持体に固定化されている。好ましくは、ウリジン一リン酸キナーゼは、固体支持体に固定化されている。好ましくは、ピロホスファターゼは、固体支持体に固定化されている。

【0101】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは固体支持体に結合または固定化されている、方法も対象とする。

【0102】

本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは固体支持体に結合または固定化されている、方法も対象とする。

【0103】

本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは固体支持体に結合または固定化されている、方法も対象とする。

【0104】

本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットの少なくとも１つの酵素は固体支持体に固定化されている、方法も対象とする。

【0105】

好ましくは、本明細書に記載の本発明の方法で使用される酵素は、固体支持体に共固定化されている。連続的に作用する酵素を狭い空間内に固定化すると、基質の拡散時間が劇的に低減されるため、変換の触媒効率が増加する。加えて、基質のｉｎ－ｓｉｔｕ形成は、動力学的増強に結び付く高局所濃度をもたらし、実質的なコスト削減と同じであるとみなすことができる。共固定化は、通常、固体支持体に固定化する前に酵素を混合することにより達成される。

【0106】

したがって、また、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは固体支持体に共固定化されている、方法も対象とする。

【0107】

本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは固体支持体に共固定化されている、方法も対象とする。

【0108】

本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは固体支持体に共固定化されている、方法も対象とする。

【0109】

また、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に共固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む方法も対象とする。

【0110】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に共固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
固体支持体は、ビーズ、モノリス、球体、粒子、粒子床、繊維マット、顆粒、ゲル、膜、中空繊維膜、混合マトリックス膜、または表面の形態を有する、方法を含む。好ましくは、固体支持体はビーズの形態を有する。

【0111】

そのような実施形態では、固定化された酵素は、ＵＭＰおよびＤ－ガラクトースからのウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースの生産を容易にすることができ、反応完了後、固定化された酵素は容易に保持され（例えば、酵素が固定化されているビーズを保持することにより）、次いでその後の実行に再使用または再利用される。そのような固定化された生体触媒プロセスは、さらなる効率化およびコスト低減を可能にする。加えて、本発明の方法は、ステップＡ）の供給溶液を、固体支持体に固定化された酵素のセットを含有する反応器に通すことにより、連続的な様式で実施することができる。

【0112】

したがって、一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む供給溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に共固定化された酵素のセットを準備するステップであって、固定化された酵素のセットを含む固体支持体は化学反応器に配置されている、ステップ；
Ｂ）ステップＡ）からの供給溶液を、固定化された酵素のセットを含む固体支持体が配置されている化学反応器に連続的に通すことにより、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0113】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む供給溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、およびピロホスファターゼを含む、固体支持体に共固定化された酵素のセットを準備するステップであって、固定化された酵素のセットを含む固体支持体は化学反応器に配置されている、ステップ；
Ｂ）ステップＡ）からの供給溶液を、固定化された酵素のセットを含む固体支持体が配置されている化学反応器に連続的に通すことにより、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0114】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む供給溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む、固体支持体に共固定化された酵素のセットを準備するステップであって、固定化された酵素のセットを含む固体支持体は化学反応器に配置されている、ステップ；
Ｂ）ステップＡ）からの供給溶液を、固定化された酵素のセットを含む固体支持体が配置されている化学反応器に連続的に通すことにより、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0115】

酵素固定化の方法は当技術分野で周知である。酵素は、吸着、共有結合、イオン結合、金属結合、架橋、または結晶化などの、非共有結合または共有結合で結合していてもよい。酵素を固体支持体（例えば、レジン、膜、ビーズ、ガラスなど）にコンジュゲートおよび固定化するための種々の方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Ｙｉら、Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７年、４２巻、８９５頁；Ｍａｒｔｉｎら、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００７年、７６巻、８４３頁；Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ、２０１０年、６３巻、３９頁；Ｔｒｕｐｐｏら、Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．、２０１１年、１５巻、１０３３頁；Ｍａｔｅｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、２００２年、１８巻、６２９頁に記載されている。好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための本発明の方法で使用される酵素は、固体支持体に共有結合で結合している。

【0116】

本明細書に記載の本発明の方法で使用される酵素、すなわち、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼ、２ドメインポリリン酸キナーゼ、およびピロホスファターゼは、当業者に周知であり、当業者に周知の任意の方法により得ることができる。特に、酵素は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ウイルスおよびファージの培養物、ならびに真核細胞培養物を含む微生物学的培養物中で過剰発現させることができるか、それらから単離することができるか、またはそれらから組換え法により調製することができる。本明細書に記載の本発明の方法は、実験セクションに記載の供給源に由来する酵素に限定されない。したがって、本発明の方法は、一般的なタンパク質発現または単離技法を使用して種々の供給源から得られる上記に列挙されている酵素を用いて実施することができる。さらに、本方法が使用される特定の応用に酵素調製を適合させることは、当業者にとって周知である。例えば、上記に列挙されている酵素は、大豆由来のトリプトンを含むルリア－ベルターニブロスなどの、非動物起源の細菌増殖培地を使用することにより、大腸菌で発現させることができる。

【0117】

一実施形態では、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、配列番号４に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ガラクトキナーゼは、配列番号１に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリリン酸キナーゼは、配列番号３に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ウリジン一リン酸キナーゼは、配列番号２に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、１ドメインポリリン酸キナーゼは、配列番号６に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、２ドメインポリリン酸キナーゼは、配列番号７に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ピロホスファターゼは、配列番号５に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0118】

したがって、一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼは、配列番号４に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ガラクトキナーゼは、配列番号１に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ポリリン酸キナーゼは、配列番号３に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ウリジン一リン酸キナーゼは、配列番号２に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、１ドメインポリリン酸キナーゼは、配列番号６に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、２ドメインポリリン酸キナーゼは、配列番号７に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ピロホスファターゼは、配列番号５に示されているアミノ酸配列、または上記配列に対して少なくとも８０％配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0119】

発酵プロセス、細胞ホモジナイゼーション、または細胞溶解から得られる酵素含有溶液は、通常は、遠心分離および濾過されて細胞残渣が除去されており、酵素を固体支持体に固定化するために直接的に使用することができる。したがって、さらなる精製ステップも単離ステップも必要ではなく、酵素が、活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性を保持するように酵素を固体支持体に固定化するために、発酵ブロス、（粗または精製）細胞ライセート、または細胞ホモジネートを使用することができる。

【0120】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に固定化されている、方法をさらに対象とする。

【0121】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、粗細胞ライセート、または細胞ホモジネートから直接的に固体支持体に固定化されている。

【0122】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、事前に精製することなく発酵ブロスから直接的に固体支持体に固定化されている。

【0123】

言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、事前に精製することなく発酵上清から直接的に固体支持体に固定化されている。

【0124】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に共固定化されている。

【0125】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に共固定化されている。

【0126】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に共固定化されている。

【0127】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットの少なくとも１つの酵素は、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に共固定化されている。

【0128】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットの少なくとも１つの酵素は、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に共固定化されている。

【0129】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットの少なくとも１つの酵素は、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから固体支持体に共固定化されている。

【0130】

本発明の方法で使用される酵素の固定化に有用な固体支持体としては、これらに限定されないが、以下のものを含むビーズまたはレジンが挙げられる：エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン酸官能基を有するポリスチレン、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、Ｎｉ－ＮＴＡ官能基を有する磁性シリカ粒子、またはマグネタイトのコアおよびＮｉ－ＮＴＡ官能基を有するデキストランシェルを有する磁性ナノ粒子。原理的には、当技術分野で公知の任意の好適な固体支持体を本発明の方法に使用することができるが、ＮｉアガロースビーズまたはＮｉ ＮＴＡアガロースレジンは、上記に示されている理由から好ましくない。

【0131】

本発明の方法に使用される酵素の固定化に有用な例示的な固体支持体としては、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：ｓｅｐａｂｅａｄｓ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）：ＥＣ－ＥＰ／ＳおよびＥＣ－ＥＰ／Ｍを含むＥＣ－ＥＰ、ＥＰ１１２／Ｓ、ＥＰ１１２／Ｍ、ＥＰ１１３／Ｓ、ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｍ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＥＡ／Ｍ、ＥＣ－ＥＡ／Ｓ、ＥＰ４００／ＳＳ、ならびにＥＣ－ＨＡ／ＳおよびＥＣ－ＨＡ／Ｍを含むＥＣ－ＨＡ；ｒｅｌｉｚｙｍｅ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）ＥＡ４０３／Ｓ；ｉｍｍｏｂｅａｄｓ（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ）Ｉｍｍ１５０Ｐ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ２、ＩＢ－ＡＮＩ３、ＩＢ－ＡＮＩ４、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４；Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）；Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８４０９Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ１０３０Ｆ、８８０６Ｆ、８４１５Ｆ、１０９１Ｍ、１６０４；ならびに磁性粒子（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）：Ｎａｎｏ－ｍａｇ－ＤおよびＳｉｃａｓｔａｒ－Ｍ－ＣＴ。

【0132】

好ましくは、固体支持体は、以下ものから選択されるレジンまたはビーズで構成されている：ｓｅｐａｂｅａｄｓ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）：ＥＣ－ＥＰ、ＥＣ－ＥＰ／Ｓ、ＥＣ－ＥＰ／Ｍ、ＥＰ１１２／Ｓ、ＥＰ１１２／Ｍ、ＥＰ１１３／Ｓ、ＥＰ１１３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＥＰ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｍ、ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＨＦＡ４０３／Ｓ、ＥＣ－ＥＡ／Ｍ、ＥＣ－ＥＡ／Ｓ、ＥＰ４００／ＳＳ、およびＥＣ－ＨＡ；ＥＣ－ＨＡ／Ｓ、ＥＣ－ＨＡ／Ｍ、ｒｅｌｉｚｙｍｅ（Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ）ＥＡ４０３／Ｓ；ｉｍｍｏｂｅａｄｓ（ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ）Ｉｍｍ１５０Ｐ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、ＩＢ－ＡＮＩ１、ＩＢ－ＡＮＩ２、ＩＢ－ＡＮＩ３、ＩＢ－ＡＮＩ４、ＩＢ－ＣＡＴ１、ＩＢ－ＡＤＳ１、ＩＢ－ＡＤＳ２、ＩＢ－ＡＤＳ３、およびＩＢ－ＡＤＳ４；Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）；Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２８５、ＥＣＲ８４０９Ｆ、ＥＣＲ８３１５Ｆ、ＥＣＲ８３０９Ｆ、ＥＣＲ１０３０Ｆ、８８０６Ｆ、８４１５Ｆ、１０９１Ｍ、１６０４；ならびに磁性粒子（ｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨ）：Ｎａｎｏ－ｍａｇ－ＤおよびＳｉｃａｓｔａｒ－Ｍ－ＣＴ。

【0133】

より好ましくは、固体支持体は、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）ＣＭ、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２８５、ＥＰ４０３／Ｓ、およびＥＰ４００／ＳＳから選択されるレジンまたはビーズで構成されている。

【0134】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
固体支持体は、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）ＣＭ、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２８５、ＥＰ４０３／Ｓ、およびＥＰ４００／ＳＳから選択されるレジンまたはビーズで構成されている、方法をさらに対象とする。

【0135】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
固体支持体は、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）ＣＭ、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２８５、ＥＰ４０３／Ｓ、およびＥＰ４００／ＳＳから選択されるレジンまたはビーズで構成されている。

【0136】

好ましくは、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
固体支持体は、ＥＣ－ＥＰ、ＥＰ４０３／Ｍ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、ＩＢ－ＣＯＶ３、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）ＣＭ、ＥＣＲ８２１５Ｆ、ＥＣＲ８２０４Ｆ、ＥＣＲ８２０９Ｆ、ＥＣＲ８２８５、ＥＰ４０３／Ｓ、およびＥＰ４００／ＳＳから選択されるレジンまたはビーズで構成されている。

【0137】

また、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む、固体支持体に固定化された酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
固体支持体は、エポキシド官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシド官能基を有するポリメタクリレート、エチレンジアミン官能基を有するポリメタクリレート、エポキシ官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／アミノＣ６スペーサー官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／三級アミン官能基を有するポリアクリル酸、アニオン性／四級アミン官能基を有するポリスチレン、カチオン性／スルホン酸官能基を有するポリスチレン、カルボン酸エステル官能基を有するポリアクリル酸、フェニル官能基を有するポリスチレン、オクタデシル官能基を有するポリメタクリレート、スチレン／メチル官能基を有するポリスチレン、Ｎｉ－ＮＴＡ官能基を有する磁性シリカ粒子、またはマグネタイトのコアおよびＮｉ－ＮＴＡ官能基を有するデキストランシェルを有する磁性ナノ粒子を含むビーズまたはレジンで構成されている、方法も対象とする。

【0138】

一実施形態では、酵素は、固体支持体として、エポキシ基で官能化された固体支持体に、共有結合で固定化されている。メタクリレートポリマーなどの固体支持体は、複数回の実行またはサイクルによる反応器での使用に好適な高い機械的強度を有する。エポキシ基は、酵素の活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性が保持されるように、ＵＤＰ－Ｇａｌカスケードの酵素と非常に安定した共有結合を形成し、それにより合成中の酵素の早期流出が最小限に抑えられる。したがって、上記固体支持体は、酵素活性を喪失することなく、または変換もしくは反応収率を低下させることなく、複数回の実行またはサイクルで再使用することができる（図１５を参照）。このように、本発明者らは、酵素が共有結合で固定化された固体支持体を複数回のサイクルで再使用した場合でも、Ｄ－ガラクトースおよびＵＭＰのＵＤＰ－ガラクトースへの完全な変換を達成することができることを示した。

【0139】

好ましくは、酵素のセットは、再使用可能で機械的に安定な固体支持体に共固定化され、それによりロバストな固体酵素調製物が形成されている。

【0140】

本発明の状況では、再使用可能で機械的に安定な固体支持体は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための本発明の方法ならびに本明細書に記載の他の発明方法内で、固体支持体に共固定化されたすべての酵素が、活性、基質特異性、立体選択性、および／または他の特性の大部分を保持するかまたはそれらを増加させ、酵素が固体支持体から洗い流されず、機械的応力により固体支持体を著しく分解または摩耗させずに、支持体の複数回使用を可能にする支持体である。さらに、酵素は、粗細胞ライレートまたは粗細胞ホモジネートから直接的に、再使用可能で機械的に安定な固体支持体に共固定化することができ、固体支持体は、多数回のサイクル（例えば、２０バッチサイクルおよびそれよりも多く）で使用することができるか、または本明細書に記載の本発明の方法が連続的に実行される場合は、再使用可能で機械的に安定な固体支持体を長期間にわたって使用することができる。「ロバストな固体支持体」という用語は、本明細書では、ｉ）粗細胞ライセートまたは粗細胞ホモジネートからの酵素のセットの共固定化を可能にし、ｉｉ）共固定化されたすべての酵素の活性の大部分が保持されるかまたは増加し、ｉｉｉ）多数回のサイクル（例えば、２０バッチサイクルまたはそれよりも多く）で標的産物の合成を可能にするか、または本明細書に記載の本発明の方法を連続的に実行する場合は、固体支持体を長期間にわたって使用することができる、再使用可能で機械的に安定な固体支持体と同義的に使用される。

【0141】

好ましくは、再使用可能で機械的に安定な固体支持体は、本明細書に記載の本発明の方法の少なくとも３サイクル、より好ましくは少なくとも４サイクル、より好ましくは少なくとも５サイクル、より好ましくは少なくとも６サイクル、より好ましくは少なくとも７サイクル、より好ましくは少なくとも８サイクル、より好ましくは少なくとも９サイクル、より好ましくは少なくとも１０サイクル、より好ましくは少なくとも１２サイクル、より好ましくは少なくとも１４サイクル、より好ましくは少なくとも１６サイクル、より好ましくは少なくとも１８サイクル、より好ましくは少なくとも２０サイクル、より好ましくは少なくとも２５サイクル、より好ましくは少なくとも２５サイクル、より好ましくは少なくとも３０サイクル、最も好ましくは少なくとも５０サイクルで使用することができる。

【0142】

したがって、本発明のさらなる態様は、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットであって、エポキシ基で官能化された機械的強度が高い骨格を有するポリマー性固体支持体に共固定化されている酵素のセットを対象とする。好ましくは、酵素のセットは、エポキシ基で官能化されたメタクリレートポリマーに共固定化されている。

【0143】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼも含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。

【0144】

好ましくは、機械的強度が高い骨格を有する固体支持体は、ビーズの形態を有する。好ましくは、ビーズは、１５０μｍ～３００μｍの範囲の粒子サイズを有する。好ましくは、固体支持体は、多孔性であり、孔径は６００Å～１２００Åである。一実施形態では、固体支持体は、３００Å～６００Åの孔径を有する低多孔度のものである。一実施形態では、固体支持体は、４５０Å～６５０Åの孔径を有する低多孔度のものである。一実施形態では、固体支持体は、１２００Å～１８００Åの孔径を有する高多孔度のものである。一実施形態では、固体支持体は、ブチル基でさらに官能化されている。

【0145】

好ましくは、固体支持体は、６００Å～１２００Åの孔径を有する多孔性メタクリレートポリマーである。一実施形態では、固体支持体は、３００Å～６００Åの孔径を有する低多孔度のメタクリレートポリマーである。一実施形態では、固体支持体は、４５０Å～６５０Åの孔径を有する低多孔度のメタクリレートポリマーである。一実施形態では、固体支持体は、１２００Å～１８００Åの孔径を有する高多孔度のメタクリレートポリマーである。一実施形態では、メタクリレートポリマーは、ブチル基でさらに官能化されている。

【0146】

好ましくは、エポキシ基で官能化されているメタクリレートポリマーは、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＥＣ－ＥＰ、ＲＥＬＩＺＹＭＥ ＥＰ４０３／Ｍ、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＥＣ－ＨＦＡ／Ｍ、ＲＥＬＩＺＹＭＥ ＨＦＡ４０３／Ｍ、ＲＥＬＩＺＹＭＥ ＨＦＡ４０３／Ｓ、ＳＥＰＡＢＥＡＤＳ ＥＣ－ＨＦＡ／Ｓ、ＲＥＬＩＺＹＭＥ ＥＰ４０３／Ｓ、ＲＥＬＩＳＯＲＢ ＥＰ４００／ＳＳ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ（登録商標）ＣＭ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２１５Ｆ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０４Ｆ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０９Ｆ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２８５、Ｉｍｍ１５０Ｐ、ＩＢ－ＣＯＶ１、ＩＢ－ＣＯＶ２、およびＩＢ－ＣＯＶ３からなる群から選択される。

【0147】

したがって、また、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、エポキシ基で官能化されている固体支持体に共有結合で固定化されている、方法も対象とする。好ましくは、固体支持体は、エポキシ基で官能化されているメタクリレートポリマーである。

【0148】

また、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、およびピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、エポキシ基で官能化されている固体支持体に共有結合で固定化されている、方法も対象とする。好ましくは、固体支持体は、エポキシ基で官能化されているメタクリレートポリマーである。

【0149】

また、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
酵素のセットは、エポキシ基で官能化されている固体支持体に共有結合で固定化されている、方法も対象とする。好ましくは、固体支持体は、エポキシ基で官能化されているメタクリレートポリマーである。

【0150】

好ましくは、固体支持体はビーズの形態を有する。好ましくは、ビーズは、１５０μｍ～３００μｍの範囲の粒子サイズを有する。好ましくは、固体支持体は、多孔性であり、孔径は６００Å～１２００Åである。一実施形態では、固体支持体は、３００Å～６００Åの孔径を有する低多孔度のものである。一実施形態では、固体支持体は、４５０Å～６５０Åの孔径を有する低多孔度のものである。一実施形態では、固体支持体は、１２００Å～１８００Åの孔径を有する高多孔度のものである。一実施形態では、固体支持体は、ブチル基でさらに官能化されている。

【0151】

好ましくは、固体支持体は、ビーズの形態のメタクリレートポリマーである。好ましくは、ビーズは、１５０μｍ～３００μｍの範囲の粒子サイズを有する。好ましくは、メタクリレートポリマーは、多孔性であり、孔径は６００Å～１２００Åである。一実施形態では、メタクリレートポリマーは、３００Å～６００Åの孔径を有する低多孔度のものである。一実施形態では、メタクリレートポリマーは、４５０Å～６５０Åの孔径を有する低多孔度のものである。一実施形態では、メタクリレートポリマーは、１２００Å～１８００Åの孔径を有する高多孔度のものである。一実施形態では、メタクリレートポリマーは、ブチル基でさらに官能化されている。

【0152】

本発明のさらなる実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、追加のステップＣ）：
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを単離するステップ
を含む。

【0153】

本発明のさらなる実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、追加のステップＣ）：
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースをイオン交換クロマトグラフィーにより単離するステップ
を含む。

【0154】

したがって、本発明は、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法であって、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを単離するステップ
を含む方法をさらに対象とする。

【0155】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。

【0156】

したがって、一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを単離するステップ；
を含み、
酵素のセットは固体支持体に固定化または共固定化されている。

【0157】

一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを単離するステップ；
を含み、
酵素のセットは、細胞ライセートから固体支持体に共固定化されている。

【0158】

好ましくは、ポリリン酸塩は、少なくとも２５個のリン酸残基を有する長鎖ポリリン酸塩である。

【0159】

好ましくは、ステップＡ）で準備される溶液中のＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である。

【0160】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。

【0161】

本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースは、ウリジンおよびＤ－ガラクトースから生産される。したがって、本発明の方法のステップＡ）におけるウリジン一リン酸は、ウリジン、アデノシンリン酸、およびウリジンキナーゼ酵素から得られる。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ’）ウリジンおよびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
ウリジンキナーゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジンおよびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0162】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体に固定化または共固定化されている。好ましくは、酵素のセットは、発酵ブロス、粗細胞ライセート、精製細胞ライセート、または細胞ホモジネートから直接的に固体支持体に共固定化されている。

【0163】

好ましくは、ステップＡ）で準備される溶液中のウリジンおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である。

【0164】

本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースは、ウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸（ＰＲＰＰ）、およびＤ－ガラクトースから生産される。したがって、本発明の方法のステップＡ）におけるウリジン一リン酸は、ウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素から得られる。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ’）ウラシル、ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0165】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体に固定化または共固定化されている。

【0166】

本発明の一実施形態では、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースは、オロチン酸、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸（ＰＲＰＰ）、およびＤ－ガラクトースから生産される。オロチン酸は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼの存在下でリン酸化され、形成されたオリチジン５’－リン酸（ＯＭＰ）は、ＵＭＰシンターゼによりウリジン一リン酸へと脱炭酸化される。したがって、本発明の方法のステップＡ）におけるウリジン一リン酸は、オロチン酸、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびＵＭＰシンターゼ酵素から得られる。したがって、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ’）オロチン酸、ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＵＭＰシンターゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含む。

【0167】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットは、固体支持体に固定化または共固定化されている。

【0168】

言い換えると、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ’）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ
を含み、
ステップＡ）におけるウリジン一リン酸は、ウリジン、アデノシン三リン酸、およびウリジンキナーゼから、またはウラシル、５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸、およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼから得られる。

【0169】

ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子
本発明のさらなる態様では、本明細書に記載の本発明の方法は、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、またはガラクトシル化小分子の生産に有用である。

【0170】

したがって、本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ
を含む。

【0171】

したがって、本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ
を含む。

【0172】

したがって、本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジンおよびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
ウリジンキナーゼ、グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジンおよびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ
を含む。

【0173】

本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ピロホスファターゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ
を含み、
ステップＡ）では、アデノシン三リン酸は、Ｄ－ガラクトース１モル当たり０．００１モル～０．９モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００２モル～０．８モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．７モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．５モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．２モルの量で、より好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００３モル～０．１モルの量で、最も好ましくはＤ－ガラクトース１モル当たり０．００５モル～０．０５モルの量で添加される。

【0174】

したがって、本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ
を含む。

【0175】

ガラクトシルトランスフェラーゼは、ＵＤＰ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との反応を触媒し、それによりガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子、および副産物としてウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を形成する。ステップＢ）、特にステップ（ｂ１）で形成される中間産物であるＵＤＰは、その後、再使用または再利用することができる。

【0176】

したがって、本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）（ａ）ガラクトキナーゼによる触媒作用で、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジン一リン酸キナーゼによる触媒作用で、ウリジン一リン酸およびアデノシン三リン酸からウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ポリリン酸キナーゼによる触媒作用で、ウリジン二リン酸およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、ならびに
（ｃ）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ること
により、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；ならびに
Ｅ）ｉｎ－ｓｉｔｕで形成されたウリジン二リン酸を再利用して、ウリジン三リン酸を形成するステップ
を含む。

【0177】

したがって、本発明の一実施形態では、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）（ａ）ガラクトキナーゼによる触媒作用で、Ｄ－ガラクトースおよびアデノシン三リン酸からガラクトース１－リン酸（Ｇａｌ－１－Ｐ）を形成すること、
（ｂ１）ウリジン一リン酸キナーゼによる触媒作用で、ウリジン一リン酸およびアデノシン三リン酸からウリジン二リン酸（ＵＤＰ）を形成すること、
（ｂ２）ポリリン酸キナーゼによる触媒作用で、ウリジン二リン酸およびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、ならびに
（ｃ’）グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼの存在下で、ガラクトース１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースを得ること、ならびに
（ｃ’’）ピロホスファターゼの存在下で、ピロリン酸をリン酸へと変換すること
により、酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；ならびに
Ｅ）ｉｎ－ｓｉｔｕで形成されたウリジン二リン酸を再利用してウリジン三リン酸を形成するステップ
を含む。

【0178】

本明細書に記載の本発明のガラクトシル化法では副産物ウリジン二リン酸が再利用されるため、ステップＡ）で準備される溶液中にはより少ない量のＵＭＰが必要とされる。したがって、一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は、０．０００１～０．９９９、より好ましくは０．０００５～０．９９５、より好ましくは０．００１～０．９９５、より好ましくは０．００２～０．９９、最も好ましくは０．００５～０．９８である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．０５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．１である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．２である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．５である。

【0179】

別の実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は、１～１０、より好ましくは１．２～８、より好ましくは１．５～７、より好ましくは１．６～６、最も好ましくは２～５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は１．５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は２である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は１０である。

【0180】

好ましくは、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；
Ｆ）ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を単離するステップ
を含む。

【0181】

好ましくは、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；
Ｆ）ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を単離するステップ
を含む。

【0182】

好ましくは、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、ウリジン一リン酸キナーゼ、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼ、ならびに任意選択でピロホスファターゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；
Ｃ）ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを単離するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；
Ｆ）ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を単離するステップ
を含む。

【0183】

好ましくは、ポリリン酸塩は、少なくとも２５個のリン酸残基を有する長鎖ポリリン酸塩である。

【0184】

好ましくは、ステップＡ）で準備される溶液中のＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．０２ｍＭ～５０，０００ｍＭの範囲である。より好ましくは、ＵＭＰおよびＤ－ガラクトースの濃度は、０．２ｍＭ～１５，０００ｍＭの範囲である。

【0185】

好ましくは、酵素のセットの酵素の濃度は、ステップＡ）で準備される溶液の総容積に対して、０．０００１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬである。

【0186】

好ましくは、ＡＴＰは、ステップＡ）で準備される溶液中に、０．０５ｍＭ～１００ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは０．１ｍＭ～５０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ～２０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ～１０ｍＭ、より好ましくは０．２ｍＭ～５ｍＭ、最も好ましくは０．５ｍＭ～３ｍＭの濃度で存在する。

【0187】

好ましくは、ステップＡ）で得られる溶液は、５．０～１０．０、好ましくは５．５～９．５、より好ましくは６．０～９．０、さらにより好ましくは６．５～９．０、さらにより好ましくは７．０～９．０の範囲のｐＨ値を有し、最も好ましくは７．５～８．５の範囲のｐＨ値を有する。

【0188】

好ましくは、Ｍｇ^２＋イオンは、ステップＡ）で準備される溶液中に、１ｍＭ～１００ｍＭ、より好ましくは１ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは２ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ～９０ｍＭ、より好ましくは１５ｍＭ～８０ｍＭ、より好ましくは２０ｍＭ～８０ｍＭ、最も好ましくは２０ｍＭ～５０ｍＭの濃度で存在する。

【0189】

好ましくは、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化バイオコンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するための方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと、サッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよびサッカライド、糖ペプチド、糖タンパク質、タンパク質、ペプチド、バイオコンジュゲート、または小分子から、ガラクトシル化サッカライド、ガラクトシル化糖ペプチド、ガラクトシル化糖タンパク質、ガラクトシル化タンパク質、ガラクトシル化ペプチド、ガラクトシル化コンジュゲート、またはガラクトシル化小分子を生産するステップ；
を含み、
酵素のセットの少なくとも１つの酵素またはガラクトシルトランスフェラーゼは、固体支持体に固定化されている。
好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。また、好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼを含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットの各酵素およびガラクトシルトランスフェラーゼは、固体支持体に共固定化されている。

【0190】

一実施形態では、ガラクトシル化乳サッカライドが、本明細書に記載の本発明の方法により生産される。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、以下のステップを含む：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと乳サッカライドの利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよび乳サッカライドからガラクトシル化乳サッカライドを生産するステップ
を含む。
好ましくは、ガラクトシル化乳サッカライドは、ヒト乳オリゴサッカライドである。

【0191】

好ましくは、ガラクトシル化乳サッカライドは、以下のものを含む群から選択される：ラクト－Ｎ－ビオース、ラクト－Ｎ－トリオース、３’－ガラクトシルラクトース、ラクト－Ｎ－テトラオース、ラクト－Ｎ－ネオテトラオース、ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、ラクト－Ｎ－ヘキサオース、ラクト－Ｎ－ネオオクタオース、ラクト－Ｎ－ネオオクタオース、パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、ラクト－Ｎ－ネオデカオース、２’－フコシルラクトース、２’，３－ジフコシルラクトース、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－フコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－フコネオペンタオースＩＩＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩ、Ｆ－ｐ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、Ｆ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ、Ｆ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ、ＤＦ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、α１，２－フコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ、α１，２－ジフコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、α１，２－１，３ジフコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ、α１，２－１，３ジフコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ、α１，２－１，３トリフコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩ、α１，２－１，３トリフコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオースＩＩ、α１，２－１，３－テトラフコシル化ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、３－フコシルラクトース、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＶ、ラクト－Ｎ－ネオフコペンタオースＩＩ、ラクト－Ｎ－ネオジフコヘキサオースＩＩ、ラクト－Ｎ－ジフコヘキサオースＩＩ、α１，３－フコシル化ラクト－Ｎ－トリオースＩＩ、ジフコシル化パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース、α２，３－シアリルラクトース、α２，３－シアリルラクト－Ｎ－ビオース、α２，６－シアリルラクトース、α２，６－シアリルラクト－Ｎ－テトラオース、α２，６－シアリルラクト－Ｎ－ネオテトラオース、α２，６－シアリルラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（図１４を参照）。

【0192】

一実施形態では、ガラクトシル化炭水化物コンジュゲートワクチンが、本明細書に記載の本発明の方法により生産される。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースとコンジュゲートワクチンの炭水化物抗原の利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよび炭水化物コンジュゲートワクチンからガラクトシル化炭水化物コンジュゲートワクチンを生産するステップ
を含む。
好ましくは、炭水化物コンジュゲートワクチンは、肺炎球菌サッカライド、Ｈ．インフルエンザＢ型サッカライド、およびＮ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、またはＹサッカライドから選択されるＣＲＭ_１９７コンジュゲート；肺炎球菌サッカライド、Ｈ．インフルエンザＢ型サッカライド、およびＮ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、またはＹサッカライドから選択されるＴＴコンジュゲート；肺炎球菌サッカライド、Ｈ．インフルエンザＢ型サッカライド、およびＮ．メニンギティディス血清型Ａ、Ｃ、Ｗ、またはＹサッカライド；から選択されるＤＴコンジュゲート；肺炎球菌サッカライドタンパク質Ｄコンジュゲート、またはＨ．インフルエンザＢ型サッカライドＯＭＰＣコンジュゲートであり、肺炎球菌サッカライドは、好ましくは、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、および２３Ｆから選択される。

【0193】

一実施形態では、ガラクトシル化抗体薬物コンジュゲートが、本明細書に記載の本発明の方法により生産される。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと抗体薬物コンジュゲートの利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよび抗体薬物コンジュゲートからガラクトシル化抗体薬物コンジュゲートを生産するステップ
を含む。
好ましくは、抗体薬物コンジュゲートは、モノクローナル抗体および細胞傷害剤を含む。

【0194】

好ましい実施形態では、ガラクトシル化療法用タンパク質が、本明細書に記載の本発明の方法により生産される（図１３Ａ＋１３Ｂ）。したがって、一実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと療法用タンパク質のサッカライドの利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよび療法用タンパク質からガラクトシル化療法用タンパク質を生産するステップ
を含む。

【0195】

好ましくは、療法用タンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質である。好ましくは、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質は、抗体である。好ましくは、抗体は、二重特異性モノクローナル抗体および抗体ベース薬物を含むモノクローナル抗体である。好ましくは、抗体は完全にはガラクトシル化されていない。好ましくは、療法用タンパク質は、以下ものもからなる群から選択される：
３Ｆ８、８Ｈ９、アルシツモマブ、アスクリンバクマブ（Ａｓｃｒｉｎｖａｃｕｍａｂ）、アセリズマブ、アテゾリズマブ、アチドルトキスマブ（Ａｔｉｄｏｒｔｏｘｕｍａｂ）、アチヌマ（Ａｔｉｎｕｍａ）、アトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、アベルマブ、アジンツキシズマブベドチン（Ａｚｉｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バピネオズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ＢＣＤ－１００、ベクツモマブ（Ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）、ベゲロマブ（Ｂｅｇｅｌｏｍａｂ）、ベランタマブマホドチン、ベリムマブ、ベマリツズマ（Ｂｅｍａｒｉｔｕｚｕｍａ）、ベンラリズマブ、ベルリマトキスマブ（Ｂｅｒｌｉｍａｔｏｘｕｍａｂ）、ベルメキマブ（Ｂｅｒｍｅｋｉｍａｂ）、ベルサンリマブ（Ｂｅｒｓａｎｌｉｍａｂ）、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトキスマブ（Ｂｅｚｌｏｔｏｘｕｍａｂ）、ビシロマブ（Ｂｉｃｉｒｏｍａｂ）、ビマグルマブ、ビメキズマブ（Ｂｉｍｅｋｉｚｕｍａｂ）、ビルタミマブ（Ｂｉｒｔａｍｉｍａｂ）、ビバツズマブメルタンシン、ブレセルマブ（Ｂｌｅｓｅｌｕｍａｂ）、ブリナツモマブ、ブロンツベトマブ（Ｂｌｏｎｔｕｖｅｔｍａｂ）、ブロソズマブ（Ｂｌｏｓｏｚｕｍａｂ）、ボコシズマブ、ブラジクマブ（Ｂｒａｚｉｋｕｍａｂ）、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、ブロルシズマブ（Ｂｒｏｌｕｃｉｚｕｍａｂ）、ブロンチクツズマブ、ブロスマブ、カビラリズマブ、カミダンルマブテシリン（Ｃａｍｉｄａｎｌｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、カムレリズマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブラブタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ（Ｃａｒｌｕｍａｂ）、カロツキシマブ（Ｃａｒｏｔｕｘｉｍａｂ）、カツマキソマブ、ｃＢＲ９６－ドキソルビシンイムノコンジュゲート、セデリズマブ（Ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、セミプリマブ、セルグツズマブアムナロイキン（Ｃｅｒｇｕｔｕｚｕｍａｂ ａｍｕｎａｌｅｕｋｉｎ）、セルトリズマブペゴール、セトレリマブ（Ｃｅｔｒｅｌｉｍａｂ）、セツキシマブ、シビサタマブ（Ｃｉｂｉｓａｔａｍａｂ）、シルムツズマブ（Ｃｉｒｍｔｕｚｕｍａｂ）、シタツズマブボガトックス（Ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ ｂｏｇａｔｏｘ）、シズツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン（Ｃｌｉｖａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、コドリツズマブ（Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）、コフェツズマブペリドチン（Ｃｏｆｅｔｕｚｕｍａｂ ｐｅｌｉｄｏｔｉｎ）、コルツキシマブラブタンシン（Ｃｏｌｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、コナツムマブ（Ｃｏｎａｔｕｍｕｍａｂ）、コンシズマブ（Ｃｏｎｃｉｚｕｍａｂ）、コスフロビキシマブ（Ｃｏｓｆｒｏｖｉｘｉｍａｂ）、ＣＲ６２６１、クレネズマブ、クリザンリズマブ（Ｃｒｉｚａｎｌｉｚｕｍａｂ）、クロテズマブ（Ｃｒｏｔｅｄｕｍａｂ）、クサツズマブ（Ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ）、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ（Ｄａｌｏｔｕｚｕｍａｂ）、ダピロリズマブペゴール（Ｄａｐｉｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ダラツムマブ、デクトレクマブ（Ｄｅｃｔｒｅｋｕｍａｂ）、デムシズマブ（Ｄｅｍｃｉｚｕｍａｂ）、デニンツズマブマホドチン（Ｄｅｎｉｎｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デノスマブ、デパツキシズマブマホドチン（Ｄｅｐａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、デルロツキシマブビオチン（Ｄｅｒｌｏｔｕｘｉｍａｂ ｂｉｏｔｉｎ）、デツモマブ（Ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）、デザミズマブ（Ｄｅｚａｍｉｚｕｍａｂ）、ジヌツキシマブ（Ｄｉｎｕｔｕｘｉｍａｂ）、ジリダブマブ（Ｄｉｒｉｄａｖｕｍａｂ）、ドマグロズマブ（Ｄｏｍａｇｒｏｚｕｍａｂ）、ドルリモマブアリトックス（Ｄｏｒｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、ドスタルリマ（Ｄｏｓｔａｒｌｉｍａ）、ドロジツマブ（Ｄｒｏｚｉｔｕｍａｂ）、ＤＳ－８２０１、ズリゴツズマブ（Ｄｕｌｉｇｏｔｕｚｕｍａｂ）、デュピルマブ、デュルバルマブ、ズシギツマブ（Ｄｕｓｉｇｉｔｕｍａｂ）、ズボルツキシズマブ（Ｄｕｖｏｒｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、エクロメキシマブ（Ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）、エクリズマブ、エドバコマブ（Ｅｄｏｂａｃｏｍａｂ）、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ（Ｅｆｕｎｇｕｍａｂ）、エルデルマブ（Ｅｌｄｅｌｕｍａｂ）、エレザヌマブ（Ｅｌｅｚａｎｕｍａｂ）、エルゲムツマブ（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）、エロツズマブ、エルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、エマクツズマブ（Ｅｍａｃｔｕｚｕｍａｂ）、エマパルマブ、エミベツズマブ（Ｅｍｉｂｅｔｕｚｕｍａｂ）、エミシズマブ、エナポタマブベドチン（Ｅｎａｐｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エナバツズマブ（Ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ）、エンホルツマブベドチン（Ｅｎｆｏｒｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、エンリモマブペゴール（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、エノブリツズマブ（Ｅｎｏｂｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、エノキズマブ（Ｅｎｏｋｉｚｕｍａｂ）、エノチクマブ（Ｅｎｏｔｉｃｕｍａｂ）、エンシツキシマブ（Ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）、エピツモマブシツキセタン（Ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）、エピラツズマブ、エプチネズマブ（Ｅｐｔｉｎｅｚｕｍａｂ）、エレヌマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ（Ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）、エタラシズマブ、エチギリマブ（Ｅｔｉｇｉｌｉｍａｂ）、エトロリズマブ（Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、エビナクマブ（Ｅｖｉｎａｃｕｍａｂ）、エボロクマブ、エキスビビルマブ（Ｅｘｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、ファノレソマブ（Ｆａｎｏｌｅｓｏｍａｂ）、ファラリモマブ（Ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）、ファリシマブ（Ｆａｒｉｃｉｍａｂ）、ファーレツズマブ、ファシヌマブ（Ｆａｓｉｎｕｍａｂ）、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ（Ｆｅｚａｋｉｎｕｍａｂ）、フィバツズマブ（Ｆｉｂａｔｕｚｕｍａｂ）、フィクラツズマブ（Ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）、フィギツムマブ、フィリブマブ（Ｆｉｒｉｖｕｍａｂ）、フランボツマブ（Ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）、フレチクマブ（Ｆｌｅｔｉｋｕｍａｂ）、フロテツズマブ（Ｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ、ホラルマブ（Ｆｏｒａｌｕｍａｂ）、ホラビルマブ（Ｆｏｒａｖｉｒｕｍａｂ）、フレマネズマブ、フレソリムマブ、フロボシマブ（Ｆｒｏｖｏｃｉｍａｂ）、フルネベトマブ（Ｆｒｕｎｅｖｅｔｍａｂ）、フルラヌマブ（Ｆｕｌｒａｎｕｍａｂ）、フツキシマブ（Ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）、ガルカネズマブ、ガリキシマブ、ガンコタマ（Ｇａｎｃｏｔａｍａ）、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガチポツズマブ（Ｇａｔｉｐｏｔｕｚｕｍａｂ）、ガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、ゲジブマブ（Ｇｅｄｉｖｕｍａｂ）、ゲムツズマブオゾガミシン、ゲボキズマブ、ギルベトマブ（Ｇｉｌｖｅｔｍａｂ）、ギムシルマブ（Ｇｉｍｓｉｌｕｍａｂ）、ギレンツキシマブ（Ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）、グレンバツムマブベドチン（Ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ（Ｇｏｍｉｌｉｘｉｍａｂ）、ゴスラネマブ（Ｇｏｓｕｒａｎｅｍａｂ）、グセルクマブ、イアナルマブ（Ｉａｎａｌｕｍａｂ）、イバリズマブ（Ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、ＩＢＩ３０８、イブリツモマブチウクセタン、イクルクマブ（Ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）、イダルシズマブ、イファボツズマブ（Ｉｆａｂｏｔｕｚｕｍａｂ）、イゴボマブ（Ｉｇｏｖｏｍａｂ）、イラダツズマブベドチン（Ｉｌａｄａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＩＭＡＢ３６２、イマルマブ（Ｉｍａｌｕｍａｂ）、イマプレリマブ（Ｉｍａｐｒｅｌｉｍａｂ）、イムシロマブ（Ｉｍｃｉｒｏｍａｂ）、イムガツズマブ（Ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）、インクラクマブ（Ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）、インダツキシマブラブタンシン（Ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、インズサツマブベドチン（Ｉｎｄｕｓａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、イネビリズマブ、インフリキシマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、
インテツムマブ、Ｉｏｍａｂ－Ｂ、イピリムマブ、イラツムマブ（Ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）、イサツキシマブ、イスカリマブ（Ｉｓｃａｌｉｍａｂ）、イスチラツマブ（Ｉｓｔｉｒａｔｕｍａｂ）、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、ラクノツズマブ（Ｌａｃｎｏｔｕｚｕｍａｂ）、ラジラツズマブベドチン（Ｌａｄｉｒａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ランパリズマブ（Ｌａｍｐａｌｉｚｕｍａｂ）、ラナデルマブ（Ｌａｎａｄｅｌｕｍａｂ）、ランドグロズマブ（Ｌａｎｄｏｇｒｏｚｕｍａｂ）、ラプリツキシマブエムタンシン（Ｌａｐｒｉｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ラルカビキシマブ（Ｌａｒｃａｖｉｘｉｍａｂ）、レブリキズマブ、レマレソマブ（Ｌｅｍａｌｅｓｏｍａｂ）、レンダリズマブ（Ｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、レンベルビマブ（Ｌｅｎｖｅｒｖｉｍａｂ）、レンジルマブ（Ｌｅｎｚｉｌｕｍａｂ）、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）、レロンリマブ（Ｌｅｒｏｎｌｉｍａｂ）、レソファブマブ（Ｌｅｓｏｆａｖｕｍａｂ）、レトリズマブ（Ｌｅｔｏｌｉｚｕｍａｂ）、レクサツムマブ、リビビルマブ（Ｌｉｂｉｖｉｒｕｍａｂ）、リファスツズマブベドチン（Ｌｉｆａｓｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、リゲリズマブ（Ｌｉｇｅｌｉｚｕｍａｂ）、リロトマブサテトラキセタン（Ｌｉｌｏｔｏｍａｂ ｓａｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、リンツズマブ、リリルマブ、ロデルシズマブ（Ｌｏｄｅｌｃｉｚｕｍａｂ）、ロキベトマブ、ロンカスツキシマブテシリン（Ｌｏｎｃａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロルボツズマブメルタンシン（Ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）、ロサツキシズマブベドチン（Ｌｏｓａｔｕｘｉｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ルカツムマブ、ルリズマブペゴール（Ｌｕｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、ルミリキシマブ、ルムレツズマブ（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、ルパルツマブアマドチン（Ｌｕｐａｒｔｕｍａｂ ａｍａｄｏｔｉｎ）、ルチキズマブ（Ｌｕｔｉｋｉｚｕｍａｂ）、マパツズマブ（Ｍａｐａｔｕｍｕｍａｂ）、マルゲツキシマブ（Ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）、マルスタシマ（Ｍａｒｓｔａｃｉｍａ）、マスリモマブ（Ｍａｓｌｉｍｏｍａｂ）、マツズマブ、マブリリムマブ（Ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）、メポリズマブ、メテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、ミラツズマブ、ミンレツモマブ（Ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）、ミリキズマブ（Ｍｉｒｉｋｉｚｕｍａｂ）、ミルベツキシマブソラブタンシン（Ｍｉｒｖｅｔｕｘｉｍａｂ ｓｏｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）、ミツモマブ（Ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）、モドツキシマブ（Ｍｏｄｏｔｕｘｉｍａｂ）、モガムリズマブ、モナリズマブ（Ｍｏｎａｌｉｚｕｍａｂ）、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、モスネツズマブ（Ｍｏｓｕｎｅｔｕｚｕｍａｂ）、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトックス（Ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）、ムロモナブ－ＣＤ３、ナコロマブタフェナトックス（Ｎａｃｏｌｏｍａｂ ｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナミルマブ（Ｎａｍｉｌｕｍａｂ）、ナプツモマブエスタフェナトックス（Ｎａｐｔｕｍｏｍａｂ ｅｓｔａｆｅｎａｔｏｘ）、ナラツキシマブエムタンシン（Ｎａｒａｔｕｘｉｍａｂ ｅｍｔａｎｓｉｎｅ）、ナルナツマブ（Ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）、ナタリズマブ、ナビシキシズマブ（Ｎａｖｉｃｉｘｉｚｕｍａｂ）、ナビブマブ（Ｎａｖｉｖｕｍａｂ）、ナキシタマブ（Ｎａｘｉｔａｍａｂ）、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネモリズマブ、ＮＥＯＤ００１、ネレリモマブ（Ｎｅｒｅｌｉｍｏｍａｂ）、ネスバクマブ（Ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）、ネタキマブ（Ｎｅｔａｋｉｍａｂ）、ニモツズマブ、ニルセビマブ（Ｎｉｒｓｅｖｉｍａｂ）、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン（Ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オビルトキサキシマブ（Ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、オビヌツズマブ、オカラツズマブ（Ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）、オクレリズマブ、オズリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、オファツムマブ、オララツマブ、オレクルマブ（Ｏｌｅｃｌｕｍａｂ）、オレンダリズマブ（Ｏｌｅｎｄａｌｉｚｕｍａｂ）、オロキズマブ（Ｏｌｏｋｉｚｕｍａｂ）、オマリズマブ、オンブルタマブ（Ｏｍｂｕｒｔａｍａｂ）、ＯＭＳ７２１、オナルツズマブ、オンツキシズマブ（Ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、オンバチリマブ（Ｏｎｖａｔｉｌｉｍａｂ）、オピシヌマブ（Ｏｐｉｃｉｎｕｍａｂ）、オポルツズマブモナトックス（Ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｍｏｎａｔｏｘ）、オレゴボマブ、オルチクマブ（Ｏｒｔｉｃｕｍａｂ）、オテリキシズマブ、オチリマブ（Ｏｔｉｌｉｍａｂ）、オトレルツズマブ（Ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）、オキセルマブ（Ｏｘｅｌｕｍａｂ）、オザネズマブ（Ｏｚａｎｅｚｕｍａｂ）、オゾラリズマブ（Ｏｚｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、パギバキシマブ、パリビズマブ、パムレブルマブ（Ｐａｍｒｅｖｌｕｍａｂ）、パニツムマブ、パンコマブ（Ｐａｎｋｏｍａｂ）、パノバクマブ（Ｐａｎｏｂａｃｕｍａｂ）、パルサツズマブ（Ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）、パスコリズマブ、パソツキシズマブ（Ｐａｓｏｔｕｘｉｚｕｍａｂ）、パテクリズマブ（Ｐａｔｅｃｌｉｚｕｍａｂ）、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ）、ＰＤＲ００１、ペムブロリズマブ、ペムツモマブ（Ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）、ペラキズマブ（Ｐｅｒａｋｉｚｕｍａｂ）、ペルツズマブ、パキセリズマブ、ピディリズマブ、ピナツズマブベドチン（Ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ピンツモマブ（Ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）、プラクルマブ（Ｐｌａｃｕｌｕｍａｂ）、プロザリズマブ（Ｐｌｏｚａｌｉｚｕｍａｂ）、ポガリズマブ（Ｐｏｇａｌｉｚｕｍａｂ）、ポラツズマブベドチン、ポネズマブ、ポルガビキシマブ（Ｐｏｒｇａｖｉｘｉｍａｂ）、プラシネズマブ（Ｐｒａｓｉｎｅｚｕｍａｂ）、プレザリズマブ（Ｐｒｅｚａｌｉｚｕｍａｂ）、プリリキシマブ（Ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、プリトキサキシマブ（Ｐｒｉｔｏｘａｘｉｍａｂ）、プリツムマブ（Ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）、ＰＲＯ １４０、キリズマブ（Ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）、ラコツモマブ（Ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）、ラドレツマブ（Ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）、ラフィビルマブ（Ｒａｆｉｖｉｒｕｍａｂ）、ラルパンシズマブ（Ｒａｌｐａｎｃｉｚｕｍａｂ）、ラムシルマブ、ラネベトマブ（Ｒａｎｅｖｅｔｍａｂ）、ラニビズマブ、ラバガリマブ（Ｒａｖａｇａｌｉｍａｂ）、ラブリズマブ、ラキシバクマブ、レファネズマブ（Ｒｅｆａｎｅｚｕｍａｂ）、レガビルマブ、レラトリマブ（Ｒｅｌａｔｌｉｍａｂ）、レムトルマブ（Ｒｅｍｔｏｌｕｍａｂ）、レスリズマブ、リロツムマブ、リヌクマブ（Ｒｉｎｕｃｕｍａｂ）、リサンキズマブ、リツキシマブ、リババズマブペゴール（Ｒｉｖａｂａｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）、Ｒｍａｂ、ロバツムマブ（Ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）、ロレズマブ（Ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）、ロミルキマブ（Ｒｏｍｉｌｋｉｍａｂ）、ロモソズマブ、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロスマンツズマブ（Ｒｏｓｍａｎｔｕｚｕｍａｂ）、ロバルピツズマブテシリン（Ｒｏｖａｌｐｉｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｓｉｒｉｎｅ）、ロベリズマブ（Ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ロザノリキシズマブ（Ｒｏｚａｎｏｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、ルプリズマブ（Ｒｕｐｌｉｚｕｍａｂ）、ＳＡ２３７、サシツズマブゴビテカン（Ｓａｃｉｔｕｚｕｍａｂ ｇｏｖｉｔｅｃａｎ）、サマリズマブ（Ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）、サムロタマブベドチン（Ｓａｍｒｏｔａｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、サリルマブ、サトラリズマブ、サツモマブペンデチド（Ｓａｔｕｍｏｍａｂ ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）、セクキヌマブ、セリクレルマブ（Ｓｅｌｉｃｒｅｌｕｍａｂ）、セリバンツマブ（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、セトキサキシマブ（Ｓｅｔｏｘａｘｉｍａｂ）、セトルスマブ（Ｓｅｔｒｕｓｕｍａｂ）、セビルマブ（Ｓｅｖｉｒｕｍａｂ）、ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ、ＳＨＰ６４７、シブロツズマブ（Ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）、シルツキシマブ、シムツズマブ（Ｓｉｍｔｕｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、シルトラツマブベドチン（Ｓｉｒｔｒａｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、シルクマブ、ソフィツズマブベドチン（Ｓｏｆｉｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ソラネズマブ、ソリトマブ（Ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）、ソネプシズマブ（Ｓｏｎｅｐｃｉｚｕｍａｂ）、ソンツズマブ（Ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）、スパルタリズマブ、スタムルマブ（Ｓｔａｍｕｌｕｍａｂ）、スレソマブ（Ｓｕｌｅｓｏｍａｂ）、スプタブマブ（Ｓｕｐｔａｖｕｍａｂ）、スチムリマブ（Ｓｕｔｉｍｌｉｍａｂ）、スビズマブ（Ｓｕｖｉｚｕｍａｂ）、スブラトキスマブ（Ｓｕｖｒａｔｏｘｕｍａｂ）、タバルマブ（Ｔａｂａｌｕｍａｂ）、タカツズマブテトラキセタン（Ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）、タドシズマブ（Ｔａｄｏｃｉｚｕｍａｂ）、タラコツズマブ（Ｔａｌａｃｏｔｕｚｕｍａｂ）、タリズマブ、タムツベトマブ（Ｔａｍｔｕｖｅｔｍａｂ）、タネズマブ、タプリツモマブパプトックス（Ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ ｐａｐｔｏｘ）、タレキスツマブ（Ｔａｒｅｘｔｕｍａｂ）、タボリマブ（Ｔａｖｏｌｉｍａｂ）、テフィバズマブ（Ｔｅｆｉｂａｚｕｍａｂ）、テリモマブアリトックス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）、テリソツズマブベドチン（Ｔｅｌｉｓｏｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、テナツモマブ（Ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）、テネリキシマブ（Ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、テプリズマブ、テポジタマブ（Ｔｅｐｏｄｉｔａｍａｂ）、テプロツムマブ（Ｔｅｐｒｏｔｕｍｕｍａｂ）、テシドルマブ（Ｔｅｓｉｄｏｌｕｍａｂ）、テツロマブ（Ｔｅｔｕｌｏｍａｂ）、テゼペルマブ、ＴＧＮ１４１２、チブリズマブ（Ｔｉｂｕｌｉｚｕｍａｂ）、ティガツズマブ、チルドラキズマブ、チミグツズマブ（Ｔｉｍｉｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、チモルマブ（Ｔｉｍｏｌｕｍａｂ）、チラゴツマブ（Ｔｉｒａｇｏｔｕｍａｂ）、チスレリズマブ、チソツマブベドチン（Ｔｉｓｏｔｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、ＴＮＸ－６５０、トシリズマブ、トムゾツキシマブ（Ｔｏｍｕｚｏｔｕｘｉｍａｂ）、トラリズマブ（Ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、トサトキスマブ（Ｔｏｓａｔｏｘｕｍａｂ）、トシツモマブ、トベツマブ（Ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）、トラロキヌマブ（Ｔｒａｌｏｋｉｎｕｍａｂ）、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ（Ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）、トレメリムマブ、トレボグルマブ（Ｔｒｅｖｏｇｒｕｍａｂ）、ツコツズマブセルモロイキン（Ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）、ツビルマブ（Ｔｕｖｉｒｕｍａｂ）、ウブリツキシマブ（Ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）、ウロクプルマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、バダスツキシマブタリリン（Ｖａｄａｓｔｕｘｉｍａｂ ｔａｌｉｒｉｎｅ）、バナリマブ（Ｖａｎａｌｉｍａｂ）、バンドルツズマブベドチン（Ｖａｎｄｏｒｔｕｚｕｍａｂ ｖｅｄｏｔｉｎ）、バンチクツマブ（Ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）、バヌシズマブ（Ｖａｎｕｃｉｚｕｍａｂ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、バリサクマブ（Ｖａｒｉｓａｃｕｍａｂ）、バルリルマブ（Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）、バテリズマブ（Ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）、ベセンクマブ（Ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）、ビジリズマブ、ボバリリズマブ（Ｖｏｂａｒｉｌｉｚｕｍａｂ）、ボロシキシマブ、ボンレロリズマブ（Ｖｏｎｌｅｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、ボプラテリマブ（Ｖｏｐｒａｔｅｌｉｍａｂ）、ボルセツズマブマホドチン（Ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）、ボツムマブ（Ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）、ブナキズマブ（Ｖｕｎａｋｉｚｕｍａｂ）、キセンツズマブ（Ｘｅｎｔｕｚｕｍａｂ）、ＸＭＡＢ－５５７４、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ（Ｚａｔｕｘｉｍａｂ）、ゼノクツズマブ（Ｚｅｎｏｃｕｔｕｚｕｍａｂ）、ジラリムマブ（Ｚ
ｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）、ゾルベツキシマブ（Ｚｏｌｂｅｔｕｘｉｍａｂ）（＝ＩＭＡＢ３６、Ｃｌａｕｄｉｘｉｍａｂ）、およびゾリモマブアリトキス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ ａｒｉｔｏｘ）。

【0196】

好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼをさらに含む。また、好ましくは、酵素のセットは、１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼを含む。好ましくは、酵素のセットは、ピロホスファターゼならびに１ドメインポリリン酸キナーゼおよび／または２ドメインポリリン酸キナーゼをさらに含む。好ましくは、酵素のセットの各酵素およびガラクトシルトランスフェラーゼは、固体支持体に共固定化されている。

【0197】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと抗体のサッカライドの利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよび抗体からガラクトシル化抗体を生産するステップ
を含む。

【0198】

好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下のステップ：
Ａ）（ｉ）ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトース、
（ｉｉ）ポリリン酸塩およびアデノシン三リン酸
を含む溶液を準備し、
グルコース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、ガラクトキナーゼ、ポリリン酸キナーゼ、およびウリジン一リン酸キナーゼを含む酵素のセットを準備するステップ；
Ｂ）酵素のセット、ポリリン酸塩、およびアデノシン三リン酸の存在下で、ウリジン一リン酸およびＤ－ガラクトースからウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースを生産するステップ；ならびに
Ｄ）β－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼの存在下で、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースと抗体のサッカライドの利用可能なヒドロキシル基との間にＯ－グリコシド結合を形成することにより、ウリジン５’－ジホスホ－α－Ｄ－ガラクトースおよび抗体からガラクトシル化抗体を生産するステップ；ならびに
Ｅ）ｉｎ－ｓｉｔｕで形成されたウリジン二リン酸を再利用してウリジン三リン酸を形成するステップ
を含む。

【0199】

本明細書に記載の本発明のガラクトシル化法では副産物ウリジン二リン酸が再利用されるため、ステップＡ）で準備される溶液にはより少ない量のＵＭＰが必要とされる。したがって、一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は、０．０００１～０．９９９、より好ましくは０．０００５～０．９９５、より好ましくは０．００１～０．９９５、より好ましくは０．００２～０．９９、最も好ましくは０．００５～０．９８である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．０５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．１である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．２である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は０．５である。

【0200】

別の実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は、１～１０、より好ましくは１．２～８、より好ましくは１．５～７、より好ましくは１．６～６、最も好ましくは２～５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は１．５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は２である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は５である。一実施形態では、ＵＭＰのＤ－ガラクトースに対するモル比は１０である。

【図面の簡単な説明】

【0201】

【図1】低コスト基質であるガラクトース、ポリリン酸塩、およびＵＭＰから、ＵＤＰ－ガラクトースを酵素的に合成する多酵素カスケードを示す図である。反応カスケードは、（ａ）Ｄ－ガラクトースおよびＡＴＰからガラクトース－１－リン酸（Ｇａｌ－１Ｐ）を形成すること、（ｂ）ＵＭＰおよびポリリン酸塩からウリジン三リン酸（ＵＴＰ）を形成すること、および（ｃ）ガラクトース－１－リン酸とウリジン三リン酸とを反応させてＵＤＰ－ガラクトースに至ることで構成される。任意選択で、酵素グルコース１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼを阻害するピロリン酸ＰＰ_ｉを加水分解するために、無機ジホスファターゼ（ＰｍＰｐａ）を反応カスケードに添加してもよい。このカスケードは、ＡＤＰのＡＴＰへの変換を支援する１Ｄ－ＰＰＫ２を添加することにより拡張することもできる。このカスケードは、ＡＭＰのＡＤＰへのリン酸化を活性化するために、２Ｄ－ＰＰＫ２を添加することにより拡張することもできる。さらに、このカスケードは、アデノシンリン酸の高頻度加水分解を阻害するために、１Ｄ－ＰＰＫ２および２ＤＰＰＫ２を添加することにより拡張することができる。

【図2】ウリジンまたはウラシルおよび５－ホスホ－α－Ｄ－リボース１－二リン酸から開始してＵＤＰ－ガラクトースを生産するための本発明の方法の例示的な反応スキームを示す図である。ウリジンからのＵＭＰの形成はウリジンキナーゼにより触媒され、ウラシルからのＵＭＰの形成はウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼにより触媒される。

【図3】発現モードＢで得られた精製酵素ミックスのＳＤＳ－ゲルを示す図である。

【図4A】すべての測定された化合物の反応時間経過を示す図である。

【図4B】０分反応時間後の供給溶液のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す図である。

【図4C】３７０分の反応時間後に取り出したアリコートのＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す図である。

【図5A】すべての測定された化合物の反応時間経過を示す図である。

【図5B】０分反応時間後の供給溶液のＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す図である。

【図5C】５４０分の反応時間後に取り出したアリコートのＨＰＡＥＣ－ＵＶクロマトグラムを示す図である。

【図6】ＨＰＡＥＣ－ＵＶ／ＰＡＤにより測定した、１４時間の反応時間後の基質、代謝物、および産物の濃度を示す図である。

【図7】過剰発現させた酵素を含むバイオマスを混合することから開始して、固体支持体でのＵＤＰ－ガラクトースの合成反応を実施するまでの、完全なＵＤＰ－ガラクトースカスケードのワークフロースキームを示す図である。このワークフローは、酵素固定化のための種々の固体支持体のスクリーニングにも好適である。

【図8】ＵＤＰ－ガラクトース合成の固体支持体スクリーニングの結果を示す図である。濃度はＨＰＡＥＣ－ＵＶにより測定した。

【図9】リツキシマブまたはハーセプチンなどの市販の抗体を糖鎖工学するための、ＧａｌＴにカップリングされたＵＤＰ－ガラクトースカスケードの反応スキームを示す図である。

【図10】本発明の方法により調製されたリツキシマブ（Ａ）およびガラクトシル化リツキシマブ（Ｂ）のエレクトロフェログラム（ＣＧＥ－ＬＩＦ分析）を示す図である。

【図11】本発明の方法の１段階プロセスでガラクトシル化されたリツキシマブのエレクトロフェログラム（ＣＧＥ－ＬＩＦ分析）を示す図である。

【図12】本発明の方法の２段階プロセスでガラクトシル化されたリツキシマブのエレクトロフェログラム（ＣＧＥ－ＬＩＦ分析）を示す図である。

【図13A】２つの反応器セットアップでの、糖タンパク質または抗体などの分子の本発明のガラクトシル化のプロセススキームを示す図である。

【図13B】１段階１反応器セットアップでの、糖タンパク質または抗体などの分子の本発明のガラクトシル化のプロセススキームを示す図である。Ｄ－ガラクトース、ポリリン酸塩、および触媒量のＵＭＰを、ガラクトシル化しようとする基質、本発明のＵＤＰ－Ｇａｌカスケードの酵素が負荷されたビーズ、およびガラクトシルトランスフェラーゼを含む反応器に添加する。また、ガラクトシルトランスフェラーゼが溶液中に存在していてもよく、ビーズに固定化されていなくともよい。ガラクトシル化反応で消費されたＵＤＰ－Ｇａｌは、本発明のＵＤＰ－Ｇａｌカスケードの酵素が負荷されたビーズ、ガラクトース、およびポリリン酸塩の存在下で継続的に再生されるため、触媒量のＵＭＰしか必要とされない。

【図14A】例示的なガラクトシル化ヒト乳サッカライドを示す図である。

【図14B】例示的なガラクトシル化ヒト乳サッカライドを示す図である。

【図15】エポキシ基で官能化されたメタクリレートビーズに共固定化されたＵＤＰ－Ｇａｌ酵素カスケードの再使用性を例示的に示す図である。

【図16A】実験ＨのＵＤＰ－Ｇａｌカスケードで形成された中間体および産物を示す図である。（Ａ）ＵＤＰ－Ｇａｌおよびウリジン。実験は三重重複で実施した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図16B】実験ＨのＵＤＰ－Ｇａｌカスケードで形成された中間体および産物を示す図である。（Ｂ）ＵＭＰ、ＵＤＰ、およびＵＴＰ。実験は三重重複で実施した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図16C】実験ＨのＵＤＰ－Ｇａｌカスケードで形成された中間体および産物を示す図である。（Ｃ）ＡＤＰ、ＡＭＰ、およびＡＴＰ。実験は三重重複で実施した。エラーバーは標準偏差を表す。

【図17-I】実施例ＩのＵＤＰ－Ｇａｌ大規模化実験で形成された抽出物、中間体、および産物が、小規模実行との直接比較で示されている図である。（Ａ）ウリジン；（Ｂ）ＵＤＰ－Ｇａｌ；（Ｃ）ＵＭＰ；（Ｄ）ＵＤＰ。

【図17-II】実施例ＩのＵＤＰ－Ｇａｌ大規模化実験で形成された抽出物、中間体、および産物が、小規模実行との直接比較で示されている図である。（Ｅ）ＵＴＰ；（Ｆ）ＡＤＰ；（Ｇ）ＡＴＰ；および（Ｈ）ＡＭＰ。

【図18】（Ａ）ＬＮｎＴを含む反応産物のクロマトグラムおよび（Ｂ）反応産物のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。

【図19】パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（パラ－ＬＮｎＨ）形成（実験Ｋ）の反応産物のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0202】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。当業者であれば、実施例に開示されている技法は、本発明の実施において良好に機能することが発明者により発見された技法を表し、したがって、その実施のための好ましい形態を構成するとみなすことができることを理解するはずである。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、開示されている特定の実施形態において多くの変更をなすことができ、依然として同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解するはずである。

【0203】

本発明の種々の態様のさらなる改変および代替的実施形態は、当業者にとって本明細書を考慮すれば明らかであろう。したがって、本明細書は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実施する基本的様式を当業者に教示するためのものである。本明細書に示され記載されている本発明の形態は、実施形態の例であるとみなされることになることが理解されるべきである。本明細書に図示および記載されているものの代わりに要素および物質を使用することができ、部分およびプロセスを逆にすることができ、本発明のある特定の特徴を独立して使用することができ、それらは全て、本発明の本明細書の利益を享受した後の当業者にとっては明らかなことであろう。以下の特許請求の範囲に記載の通りの本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の要素に変更をなすことができる。

【実施例】

【0204】

略語および頭字語
ＡＤＰ アデノシン５’－二リン酸
ＡＭＰ アデノシン５’－一リン酸
ＡＴＰ アデノシン５’－三リン酸
ｄＨ_２Ｏ 脱イオン水
ＩＰＴＧ イソプロピルβ－Ｄ－チオガラクトピラノシド
ＬＧＴＢ ラクト－Ｎ－ネオテトラオース生合成グリコシルトランスフェラーゼ
ＵＤＰ ウリジン５’－二リン酸
ＵＭＰ ウリジン５’－一リン酸
ＵＴＰ ウリジン５’－三リン酸
ＧＴＰ グアノシン５’－三リン酸
ＰｏｌｙＰ ポリリン酸塩
ＰＰｉ ピロリン酸
Ｐｉ リン酸
ＰＰＫ２ ポリリン酸キナーゼ２
ＰＰＫ３ ポリリン酸キナーゼ３
１Ｄ－ＰＰＫ２ １ドメインポリリン酸キナーゼ２
２Ｄ－ＰＰＫ２ ２ドメインポリリン酸キナーゼ２
ＧａｌＵ グルコース１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ
ＧａｌＴ ＵＤＰ－ガラクトシルトランスフェラーゼ
ＢｉＧａｌＫ ガラクトキナーゼ
ＧａｌＫ ガラクトキナーゼ
ＵＲＡ６ ウリジン一リン酸キナーゼ
ＵＰＰ ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ
ＰｍＰｐＡ パスツレラ・マルトシダ無機ピロホスファターゼ

【0205】

化学薬品＆試薬
別様に記載されていない限り、化学薬品および試薬はすべて、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、入手可能な最の高い純度のものだった。固体支持体は、Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ、ＣｈｉｒａｌＶｉｓｉｏｎ、Ｒｏｈｍ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ、およびｍｉｃｒｏｍｏｄ ＧｍｂＨから入手した。

【0206】

［実施例１］
酵素の調製
酵素ＢｉＧａｌＫ、ＵＲＡ６、ＰＰＫ３、ＧａｌＵ、１Ｄ－ＰＰＫ２、２Ｄ－ＰＰＫ２、およびＰｍＰｐＡをコードする遺伝子を、表１に列挙されている通り、標準的発現ベクターにクローニングした。

【0207】

【表1】

【0208】

形質転換、培養、発現
遺伝子発現にはすべて、別様に記載されていない限り、大腸菌ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）を宿主生物として使用した。

【0209】

遺伝子発現：１酵素、１培養（発現モードＡ）。
プラスミドおよびストック培養
ＧａｌＵ、ＰＰＫ３、ＵＲＡ６、ＰｍＰｐａ、１Ｄ－ＰＰＫ２の遺伝子配列を有するプラスミド（カナマイシン耐性を有するｐＥＴ２８ａ）を保持する大腸菌培養物のストック溶液は、以前の研究から入手可能だった（［１、２］を参照）。ストック溶液は、５０％グリセロールを含み、－２０℃で維持されていた。
ＢｉＧａｌＫの遺伝子配列の遺伝子合成およびアンピシリンに対する抗生物質耐性を有する発現ベクターｐＥＴ１００／Ｄ－ＴＯＰＯへのクローニングは、商業的供給業者が以前に発表された文献［３］に従って実施した。
１μｌのプラスミドストック溶液を培養大腸菌ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に移すことにより、購入したプラスミドを大腸菌に移した。次いで、溶液を氷上で１時間維持し、続いて４２℃で１分間、細胞に熱ショックを与えた。その後、５００μＬのＬＢ培地を添加し、混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、続いて溶液を６０００ｇおよび４℃で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを１００μｌの脱イオンＨ_２Ｏ（ｄＨ_２Ｏ．）に溶解し、アンピシリンを含むＬＢ寒天プレートに撒いた。寒天プレートを３７℃でインキュベートした。プラスミドを含む大腸菌細胞のストック溶液を、２ｍＬ傾斜培地で生成した。

【0210】

酵素発現
異種性遺伝子発現のために、ストック溶液からアリコートを取り出し、対応する抗生物質を含むＬＢ寒天プレートに撒いた。プレートを３７℃で一晩培養した。単一の培養物を使用して、バッフル付き振盪フラスコの前培養物（それぞれ５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む）を接種した。培養物を、典型的には約４．２のＯＤ_６００まで増殖させた。それぞれ５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む主発現培養物を、典型的には１％前培養物で接種し、約０．６～０．８のＯＤ_６００まで３７℃にて培養した。次いで温度を１６～２０℃に変更し、典型的には０．４ｍＭ ＩＰＴＧで発現を誘導した。典型的には２０時間後、培養物を、典型的には４℃で３０分間６０００×ｇで回収した。使用した培地は、自動誘導（ＡＩ）培地、ＬＢ培地、およびＴＢ培地だった。実験で使用した培地のさらなる詳細は、以下の表２に記載されている。

【0211】

【表2】

【0212】

酵素精製
プラスミドｐＥＴ２８ａおよびｐＥＴ１００／Ｄ－ＴＯＰＯは、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグを有しており、したがって酵素は、ＧＥ ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＡＫＴＡ（商標）ｓｔａｒｔ装置およびＨｉｓＴｒａｐ Ｈｉｇｈ－ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅまたはＦａｓｔ－Ｆｌｏｗカラム（１ｍＬカラム容量）を使用したイオン金属アフィニティクロマトグラフィーで精製される。酵素を精製するために、溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍｇ^２＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）中での超音波処理により細胞を溶解した。

【0213】

イミダゾール（５００ｍＭ）を、定組成溶離の溶離液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍｇ^２＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、５％グリセロール）として使用した。製造業者が推奨する標準的条件を使用した。精製後、酵素濃度をＢＣＡアッセイにより試験し、ＳＤＳゲルで評価した。

【0214】

遺伝子発現：全酵素、１培養（発現モードＢ）。
このセクションに記載の遺伝子発現には、Ｋｅｒａｆａｓｔ ＩｎｃのＬＯＢＳＴＲ大腸菌発現株（大腸菌ＢＬ２１ Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）に基づく）を使用した。２つの遺伝子配列を、各々１つの特定の発現ベクターにクローニングした。３つすべての発現プラスミドを保有する大腸菌株を作出した。

【0215】

クローニング
使用した発現ベクターの耐性マーカーおよび制限部位は表３に詳述されている。
ＵＲＡ６およびＰＰＫ３の遺伝子配列を有するｐＡＣＺＤｕｅｔベクターを、商業的供給業者から購入した。ＧａｌＵおよびＰｍＰｐＡの遺伝子配列を、単離したｐＥＴ２８ａベクターから酵素消化により切断し、ｐＣＤＦＤｕｅｔ発現ベクターにクローニングした。クローニングには、酵素消化、ＰＣＲ、およびライゲーションの標準的プロトコールを使用した。ｐＥＴ１００－Ｄ／ＴＯＰＯに由来するＧａｌＫおよびｐＥＴ２８ａに由来するＮａｈＫを、発現ベクターｐＲＳＦＤｕｅｔ１にクローニングした。空発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔおよびｐＲＳＦＤｕｅｔ１は、商業的供給業者から購入した。
遺伝子構築物は、商業的供給業者による遺伝子配列決定により確認した。

【0216】

【表3】

【0217】

形質転換
プラスミドはすべて、熱ショックによりＬＯＢＳＴＲ大腸菌細胞へと形質転換し（「遺伝子発現：１酵素、１培養」セクションに記載の通り）、次いですべての選択マーカー（クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、カナマイシン）を含むＬＢ寒天プレートに播種した。したがって、３つのベクターすべてを保持する細胞のみが寒天プレートで増殖することができた。

【0218】

酵素発現
ここで説明されている発現には、以下の濃度の抗生物質（３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシン、および３０μｇ／ｍＬカナマイシン）を含むＴＢ培地を使用した。１５ｍＬの細胞を３０℃で一晩前培養し、２００ｍＬの主培養物に１％前培養物を接種し、ＯＤ_６００＝０．８まで３０℃にて培養した。温度を１６℃に下げ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより発現を誘導した。２０時間後、４℃にて３０分間６０００×ｇで遠心分離することにより、細胞を回収した。溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ Ｍｇ^２＋、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）中での超音波処理により細胞を溶解した。

【0219】

精製
「遺伝子発現：１酵素、１培養」に記載の通りに、酵素濃度をＢＣＡアッセイで試験し、ＳＤＳ－ｇｅｌにより精製を評価した（図３を参照）。

【0220】

測定
ＵＶ（２６０ｎｍ）およびパルスアンペロメトリー検出（ＰＡＤ）による高速アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）を使用して、反応物の濃度を測定した。分析物分離および定量化のために、ステップ勾配溶出法を開発し、検証した。非多孔性ペリキュラーカラムＣａｒｂｏＰａｃ（商標）ＰＡ１（２５０×２ｍｍ）を使用して、０．５ｍＬ／分の装置流でクロマトグラフィー分離を実施した。ＨＰＡＥＣ装置（ＩＣＳ５０００）ならびにすべてのカラム、部品、およびソフトウェアは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ウォルサム、米国）から購入した。
抗体のサッカライドを、ＰＮＧａｓｅＦ処理およびＣＧＥ－ＬＩＦ分析により分析した。分析は、標準的プロトコールに従った。

【0221】

［実施例２］
ＵＤＰ－ガラクトースの均質調製－実験Ａ、Ｂ、およびＣ
こうした実験には、発現モードＢの精製酵素を使用した。合成は、１Ｄ－ＰＰＫ２を用いずに（実験Ａ、経路については図１を参照）および１Ｄ－ＰＰＫ２を用いて（実験Ｂ）で実施した。ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）緩衝水溶液中の反応容量は、実験Ａでは１２μＬ、実験Ｂでは３４μＬだった。反応温度は３０℃だった。使用した精製酵素の量は４００μｇだった。初期基質、緩衝液、補因子濃度、および使用した酵素の量は表４に示されている。

【0222】

反応時間経過測定のための反応アリコートを、以下の通りにクエンチした。実験Ａでは、２μＬの反応物をアリコートし、２９８μＬの９０℃ ｄＨ_２Ｏで希釈し、実験Ｂでは、５μＬを、３１５μＬの９０℃ ｄＨ２Ｏで希釈した。

【0223】

【表4】

【0224】

実験Ａの反応時間経過は、図４Ａ～Ｃに示されている。３７０分後、ＵＭＰおよびガラクトースに関して１００％のＵＤＰ－ガラクトース収率が達成された。この結果は、この酵素組合せが、基質のＵＤＰ－ガラクトースへの完全変換を達成し得ることを示す。明らかな酵素阻害は存在せず、副反応は起こっていない。ＡＭＰが検出され、これは、ＡＤＰが部分的に加水分解されていることを示す。

【0225】

実験Ｂの反応時間経過は、図５Ａ～Ｃに示されている。５４０分後、ＵＭＰおよびガラクトースに関して１００％のＵＤＰ－ガラクトース収率が達成された。この結果は、この酵素組合せが、基質のＵＤＰ－ガラクトースへの完全変換を達成し得ることを示す。明らかな酵素阻害は存在せず、副反応は起こっていない。しかしながら、ＡＭＰは検出されず、これは、検出可能な量のＡＤＰがＡＭＰへと加水分解される前に、ＡＤＰが１Ｄ－ＰＰＫ２の存在下で十分に急速にＡＴＰへと変換され戻されたことを示す（実験Ａを参照）。

【0226】

実験Ｃでは、種々の酵素濃度を試験し、この組合せが生産性に及ぼす効果を調査した。酵素を、「遺伝子発現：１酵素、１培養（発現モードＡ）」のセクションで詳述されている通りに発現させた。反応容量は１００μｌだった。１４時間の反応時間後、２０μｌのアリコートを取り出し、それを４８０μｌのｄＨ_２Ｏ（９０℃）で希釈することにより反応をクエンチした。

【0227】

【表5】

【0228】

実験Ｃの結果は図６に示されている。すべての反応でＵＤＰ－ガラクトースの形成に成功した。

【0229】

［実施例３］
ＵＤＰ－ガラクトースの不均質調製－実験Ｄ
実験Ｄでは、本発明のＵＤＰ－ガラクトース合成（図１を参照）で使用される酵素の共固定化について、幅広い範囲の市販の固体支持体（表７）をスクリーニングし、ＵＤＰ－ガラクトースの合成に対するそれらの効果を評価した。図７に図示されているように、実験には以下のプロトコールを使用した。様々な培養物からのバイオマスを一緒に混合し［図７、ステップ１を参照］、６０００×ｇで３０分間４℃にて遠心分離した［ステップ２］。使用した培養物の組成は表８に詳述されている。細胞ペレットを６０ｍＬの緩衝液Ａに再懸濁した［ステップ３］（表６を参照）。超音波処理により細胞を溶解した［ステップ４］。超音波処理後、スラリーを１２，０００×ｇで４５分間４℃にて遠心分離して［ステップ５］、細胞残渣を除去し、続いて１．２μｍおよび０．８μｍフィルターで濾過した。遠心分離後、上清を取り出し、氷上で維持した。所定の質量の各固定化物（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｒ）（表８を参照）を、２ｍＬの低結合チューブに添加した。緩衝液Ａと共に約２時間インキュベーションした後、上清を除去した。その後、０．５ｍＬの細胞溶解物を各チューブに添加し、４℃で一晩（約１２時間）インキュベートした［ステップ６］。ビーズを溶解緩衝液Ｂで洗浄し（３回）［ステップ７］、ブロッキング緩衝液（２Ｍグリシン）を添加し、続いて２４時間インキュベートした［ステップ８］。その後、ブロッキング緩衝液を廃棄し、ビーズを緩衝液Ｂ（表６を参照）で３回洗浄した。
種々の酵素が負荷されたビーズでの多酵素カスケードを試験するため、基質を含む１００μＬの供給溶液（表９を参照）を、ビーズを含む各チューブに移した。反応は、振盪（４００ｒｐｍ）しながら３０℃で約２０時間実施した。次いで、ＵＤＰ－ガラクトース濃度を、ＨＰＡＥＣ－ＵＶ／ＰＡＤで測定した。結果は図８に示されている。幅広く様々な市販のビーズに共固定化しても、酵素は活性化であることが示されている。

【0230】

【表6】

【0231】

【表7】

【0232】

【表8】

【0233】

【表9】

【0234】

［実施例４］
抗体のガラクトシル化－実験ＦおよびＧ
実験ＦおよびＧでは、固体支持体ＥＣＲ８２８５に固定化したＵＤＰ－ガラクトースカスケードを、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した可溶性ＵＤＰ－ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）にカップリングして、市販の抗体リツキシマブ（Ｅｖｉｄｅｎｔｉｃ ＧｍｂＨから購入）をガラクトシル化した。

【0235】

予備試験
予備試験（実験Ｅ）では、リツキシマブの糖プロファイルを、ＰＮＧａｓｅＦ消化およびＣＧＥ－ＬＩＦで分析した（「測定」セクションを参照）。結果が図１０Ａに示されている。抗体のＦｃ領域のグリカンの少数のみが完全にガラクトシル化されていることを理解することができる。抗体の糖プロファイルを操作するために、１００μｇのリツキシマブを、購入したＵＤＰ－Ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入、注文番号Ｕ４５００）、２５ミリ単位のＧａｌＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから、注文番号Ｇ５５０７）と共に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２中で一晩３０℃にてインキュベートした。結果は図１０Ｂに示されている。ＣＧＥ－ＬＩＦ分析は、反応後、すべての検出されたグリカンがガラクトシル化されたことを示した。

【0236】

カスケードとＧａｌＴとのカップリング
１段階カップリング
実験Ｆでは、供給溶液（２５０μＬ、表９を参照）を、固定化されたカスケードを有するＥＣＲ８２８５ビーズ（５２ｍｇの固体支持体、酵素をビーズに固定化する前に測定した重量）（実験Ｄから）に添加した。その直後に、１００μｇのリツキシマブ、ＧａｌＴ（２５ミリ単位）、および１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２を添加した。次いで、３０℃にて５５０ｒｐｍで振盪した２４時間のインキュベーション時間後、反応の上清をＰＮＧａｓｅＦ消化およびＣＧＥ－ＬＩＦ分析により分析した（「測定」セクションを参照）。結果は図１１に示されている。すべてのグリカンがガラクトシル化されていたことを理解することができる。ほとんどのグリカンは完全にガラクトシル化されているが、より少数のものは、２つの分岐の１つに１つのガラクトース部分しか呈していなかった。これは、完全なガラクトシル化の達成が、それぞれインキュベーション時間および反応条件、つまり反応物濃度の最適化の問題であることを示す。

【0237】

２段階カップリング－図１３を参照
実験Ｇでは、１００μｇのリツキシマブを２段階プロセスでガラクトシル化した。第１段階では、ＥＣＲ８２８５に固定化した酵素カスケードを使用して、ＵＤＰ－ガラクトースを生産した。５２ｍｇのビーズ（酵素を固定化する前に測定した重量）を、供給溶液（１００μＬ）と共に３０℃で２４時間インキュベートした。第２段階では、上清を１００μｇのリツキシマブ、２５ミリ単位のＧａｌＴ、および１０ｍＭ ＭｎＣｌ_２を含む別の反応器に移した。次いで、反応物を３０℃および５５０ｒｐｍで約２４時間インキュベートした。反応の上清を、ＰＮＧａｓｅＦ消化およびＣＧＥ－ＬＩＦ分析で分析した（「測定」セクションを参照）（図１２を参照）。実験Ｆと一致して、すべてのグリカンがガラクトシル化され、ほとんどのグリカンは両分岐にガラクトース部分を呈していた。これは、完全なガラクトシル化の達成が、それぞれインキュベーション時間および反応条件、つまり反応物濃度の最適化の問題であることを示す。

【0238】

［実施例５］
ウリジンから開始したＵＤＰ－Ｇａｌの合成－実験Ｈ、Ｉ、Ｊ、およびＫ
酵素の生産および精製
この研究で使用したプラスミドのリストは表１０に示されている。ＬＯＢＳＴＲ大腸菌コンピテント細胞（Ｋｅｒａｆａｓｔ、米国）を発現宿主として使用した。細胞を、熱ショックプロトコールに基づいて形質転換した。１．５ｍＭ ＭｇＳＯ_４および対応する抗生物質で補完されたＴＢ培地で発酵を実施した。細胞をＯＤ_６００が０．８～１．０になるまで３７℃で培養し、その後、０．４ｍＭ ＩＰＴＧで誘導を実施し、１６℃で２０～２４時間培養した。使用した化学物質はすべてＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ Ｌｔｄからのものである。
培養の終了時に、細胞を、遠心分離（７０００×ｇ、２０分）で回収し、細胞ペレットを溶解緩衝液（ｐＨ７．４の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロール）に再懸濁し、高圧ホモジナイゼーション（Ｍａｘｉｍａｔｏｒ、ドイツ）（８００～１０００ｐｓｉで３回通過）で破砕した。酵素を、１ｍＬまたは５ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン）カラムと組み合わせた固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＡＫＴＡｓｔａｒｔ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して精製した。結合緩衝液は、ｐＨ７．４の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロールを含んでいた。また、溶離緩衝液は、ｐＨ７．４の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２５０ｍＭイミダゾール、および５％グリセロールで構成されていた。
溶離緩衝液からイミダゾールを除去し、酵素溶液を濃縮するために、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－１５遠心分離フィルターユニット－３ＫＤａ ＭＷカットオフ（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ）を用いて緩衝液交換を実施した。交換緩衝液は、ｐＨ７．４の５０ｍＭ ＭＯＰＳ緩衝液、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５％グリセロールを含んでいた。その後、保持溶液（濃縮酵素）をグリセロールと１：１で混合し、最終酵素溶液を５０％グリセロールにした。酵素を－２０℃で保管した。

【0239】

【表10】

【0240】

実験Ｈ：精製酵素を使用してウリジンからの開始したＵＤＰ－Ｇａｌの合成
反応は、２５０μＬの総容積に、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、７５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、５２ｍＭウリジン、５４ｍＭ Ｇａｌ、０．６ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＰｏｌｙＰ_ｎ、０．０７μｇ／μＬ ＵＤＫ、０．１２μｇ／μＬ ＵＲＡ６／ＰＰＫ３、０．１７μｇ／μＬ ＧＡＬＫ、０．１２μｇ／μＬ ＧＡＬＵ、０．０６μｇ／μＬ ＰｍＰｐａを含んでいた。ＵＤＰ－Ｇａｌの成功した生産および中間体の濃度が図１６に示されている。収率は、２４時間後に１００％に近づいている。

【0241】

実験Ｉ：細胞ライセートを使用した、ウリジンおよびＧａｌからのＵＤＰ－Ｇａｌの大規模生産
細胞ライセートを調製するために、以下のバイオマス：ＵＤＫ、３．４６ｇ；ＵＲＡ６／ＰＰＫ３、５．２０ｇ；ＧＡＬＫ、５．５４ｇ；ＧＡＬＵ、５．７０ｇ；ＰｍＰｐＡ、１．７ｇを、１２０ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．１）、４００ｍＭ ＮａＣｌ、および５％グリセロール中に混合した。混合物を高圧ホモジナイザーに３回通した。無細胞抽出物を、１０，０００×ｇで４５分間遠心分離した。その後、ＵＤＰ－Ｇａｌ合成に好適なライセート量を見出すために、小規模（２００μＬ）の予備実験を実施した。容積／容積で１０％の細胞ライセートが、合成の実施に十分であることが見出された。こうした知見を、５０００×大規模化係数に相当する１リットル規模の合成に直接的に使用した。
１リットル実験を実施するために、プロペラ型インペラを備えたスピナーフラスコを選択して、撹拌槽型反応器の状態を模倣した。合成条件は以下の通りだった：１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、５８ｍＭウリジン、５５ｍＭ Ｇａｌ、６．２ｍＭ ＡＴＰ、２０ｍＭ ＰｏｌｙＰ_ｎ、および７５ｍＭ ＭｇＣｌ_２。反応は３７℃および６０ｒｐｍで実施した。カスケードの性能に対する大規模化の影響を理解するために、並行２００μＬ実験を実施した。カスケード中間体の時間経過が図１７に示されている。

【0242】

実験Ｊ：ラクト－Ｎ－ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）のワンポット生産
こうした実験では、組換えＬｅｌｏｉｒグリコシルトランスフェラーゼおよびヌクレオチド糖モジュール（ＵＤＰ－ＧａｌおよびＵＤＰ－ＧｌｃＮＡｃ）を使用して、ＨＭＯＳを合成する。まずヌクレオチド糖を合成し、その後、反応混合物をグリコシルトランスフェラーゼおよび基質と組み合わせて、標的ＨＭＯを生産する。

【0243】

ＵＤＰ－Ｇａｌを、表１１に記載の条件に基づいて生産した。すべての反応は、約２４時間のインキュベーション時間、３７℃での５５０ｒｐｍ振盪で実施した。その後、産物ＵＤＰ－Ｇａｌを含む７５μＬの反応モジュールを、０．２μｇ／μＬのＬＧＴＢ（大腸菌ＢＬ２１で発現させた、ナイセリア・メニンギティディス血清型Ｂ（ＭＣ５８菌株）由来のラクト－Ｎ－ネオテトラオース生合成グリコシルトランスフェラーゼ）、２０単位のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、１５０μＬのラクト－Ｎ－トリオース（ＬＮＴ ＩＩ）、および１５６ｍＭ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）を含む新しいバイアルに移した。一晩インキュベーションした後の反応産物のクロマトグラムおよびＭＳ／ＭＳの結果を図１８に示す。

【0244】

【表11】

【0245】

実験Ｋ：パラ－ラクト－Ｎ－ネオヘキサオース（パラ－ＬＮｎＨ）のワンポット生産
５０μＬのパラ－ラクト－Ｎ－ネオペンタオース含有溶液を、総容積が２１０μＬのＭＥＳ緩衝液（２４０ｍＭ－ｐＨ６．５）中の、ＵＤＰ－Ｇａｌを反応産物として含む表１１に列挙されている通りの４０μＬのＵＤＰ－Ｇａｌ反応混合物、および２０単位のＡＰ、および０．２μｇ／μＬのＬＧＴＢと混合した。反応産物のＭＳ／ＭＳスペクトルを図１９に示す。

【0246】

参考文献
1. Mahour, R., et al., Establishment of a five-enzyme cell-free cascade for the synthesis of uridine diphosphate N-acetylglucosamine.Journal of Biotechnology, 2018. 283: p. 120-129.
2. Rexer, T.F.T., et al., One pot synthesis of GDP‐mannose by a multi‐enzyme cascade for enzymatic assembly of lipid‐linked oligosaccharides.Biotechnology and Bioengineering, 2018. 115(1): p. 192-205.
3. Li, L., et al., A highly efficient galactokinase from Bifidobacterium infantis with broad substrate specificity. Carbohydrate Research, 2012. 355: p. 35-39.
4. Warnock, D., et al., In vitro galactosylation of human IgG at 1 kg scale using recombinant galactosyltransferase. Biotechnology and Bioengineering, 2005. 92(7): p. 831-842.
5. Li, Z., et al., Simple defined autoinduction medium for high-level recombinant protein production using T7-based Escherichia coli expression systems. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011. 91(4): p. 1203.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17-I】

【図17-II】

【図18】

【図19】

【配列表】

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