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特許7464709ＣＴＧＦ遺伝子特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含む線維症関連疾患及び呼吸器関連疾患の予防及び治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-01
(45)【発行日】2024-04-09
(54)【発明の名称】ＣＴＧＦ遺伝子特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及びこれを含む線維症関連疾患及び呼吸器関連疾患の予防及び治療用組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240402BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20240402BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240402BHJP
A61P 11/06 20060101ALI20240402BHJP
A61P 11/08 20060101ALI20240402BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240402BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240402BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240402BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240402BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240402BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 120Z
C12N15/87 Z ZNA
A61P11/00
A61P11/06
A61P11/08
A61P1/16
A61K31/713
A61K48/00
A61K9/14
A61P43/00 101
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2022529798
(86)(22)【出願日】2020-10-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-01-26
(86)【国際出願番号】 KR2020014948
(87)【国際公開番号】W WO2021101113
(87)【国際公開日】2021-05-27
【審査請求日】2022-07-19
(31)【優先権主張番号】10-2019-0151673
(32)【優先日】2019-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(73)【特許権者】
【識別番号】514171197
【氏名又は名称】バイオニア コーポレーション
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＥＥＲ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８－１１， Ｍｕｎｐｙｅｏｎｇｓｅｏ－ｒｏ， Ｄａｅｄｅｏｋ－ｇｕ， Ｄａｅｊｅｏｎ ３４３０２， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100139594
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 健次郎
(72)【発明者】
【氏名】パク ハンオ
(72)【発明者】
【氏名】キム テリム
(72)【発明者】
【氏名】コ ヨンホ
(72)【発明者】
【氏名】ユン スンイル
(72)【発明者】
【氏名】パク ジュンホン
【審査官】伊達 利奈
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１６－５２５３４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１３－５３２９５２（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２０１４／００６５１６２（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２００５／００５９６２９（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１３／０１７８５１０（ＵＳ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５１８７２１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１２－５２０６８３（ＪＰ，Ａ）
【文献】Nucleic Acids Research，2018, Vol.46, pp.1614-1623
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の構造式１の構造を含むＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体：［構造式（１）］
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して単純共有結合又はリンカーが媒介した共有結合を意味し、Ｒは、配列番号１０の配列から成るセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、を含む二重鎖オリゴヌクレオチドであって、前記センス鎖はＤＮＡであり、前記アンチセンス鎖はＲＮＡである、二重鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【請求項2】
下記の構造式（２）の構造を含む、請求項１に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体：［構造式（２）］
Ａ－Ｘ－Ｓ－Ｙ－Ｂ
ＡＳ
前記構造式（２）において、Ｓ及びＡＳは、それぞれ請求項１に記載の二重鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、請求項１に記載の定義と同一である。
【請求項3】
下記の構造式（３）又は構造式（４）の構造を含む、請求項２に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体：Ａ－Ｘ－５’Ｓ ３’ －Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（３）
Ａ－Ｘ－３’Ｓ ５’ －Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（４）
前記構造式（３）及び（４）において、Ａ、Ｂ、Ｘ、Ｙ、Ｓ及びＡＳは、請求項２に記載の定義と同一であり、５’及び３’は、二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’及び３’末端を意味する。
【請求項4】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群から選ばれる、請求項１に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項5】
前記親水性物質は、下記の構造式（５）又は構造式（６）の構造を有することを特徴とする、請求項１に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体：（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ 構造式（５）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
前記構造式（５）又は構造式（６）において、Ａ’は親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）を、Ｊは、ｍ個の親水性物質単量体の間又はｍ個の親水性物質単量体と二重鎖オリゴヌクレオチドとを互いに連結するリンカーを、ｍは１～１５の整数を、ｎは１～１０の整数を意味し、
親水性物質単量体Ａ’は、下記の化合物（１）～化合物（３）から選ばれたいずれか一つの化合物であり、リンカー（Ｊ）は、－ＰＯ３ －－、－ＳＯ３－及び－ＣＯ２－からなる群から選ばれる；
【化1】
【化2】
【請求項6】
下記の構造式（７）又は構造式（８）の構造を有することを特徴とする、請求項５に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体：（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（７）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）
【請求項7】
前記親水性物質の分子量は、２００～１０，０００であることを特徴とする、請求項１に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項8】
前記疎水性物質の分子量は、２５０～１，０００であることを特徴とする、請求項１に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項9】
前記疎水性物質は、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）、脂質（ｌｉｐｉｄ）、トコフェロール（ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ）及びトコトリエノール（ｔｏｃｏｔｒｉｅｎｏｌ）からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とし、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンからなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とし、前記グリセリド誘導体は、モノグリセリド、ジグリセリド及びトリグリセリドからなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする、請求項８に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項10】
前記Ｘ及びＹで表される共有結合は、非分解性結合又は分解性結合であることを特徴とする、請求項１に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項11】
前記非分解性結合は、アミド結合又はリン酸結合であることを特徴とする、請求項１０に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項12】
前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合及び酵素分解性結合からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１０に記載のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド構造体。
【請求項13】
請求項１に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子。
【請求項14】
前記ナノ粒子は、互いに異なる配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合されて構成されることを特徴とする、請求項１３に記載のナノ粒子。
【請求項15】
請求項１３に記載のナノ粒子を有効成分として含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項16】
前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１５に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項17】
前記線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髓線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び放射線線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１５に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項18】
請求項１に記載の二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を有効成分として含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項19】
前記呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎及び喉頭炎からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１８に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項20】
前記線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髓線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び放射線線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）からなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項１８に記載の線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＣＴＧＦ発現を非常に特異的且つ高い効率で阻害できる二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びナノ粒子、及びその線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用途に関する。
【背景技術】
【0002】
１９９５年、ＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓでアンチセンスを用いた遺伝子発現を抑制するのに、アンチセンスＲＮＡと同様にセンスＲＮＡも有効であることを発見することによって、その原因を究明するための研究が進められた。１９９８年、Ｆｉｒｅ等が初めてｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）を注入し、それに対応するｍＲＮＡが特異的に分解されることによって遺伝子の発現が抑制される現象を確認し、これをＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）と命名した。ＲＮＡｉは、遺伝子発現を抑制するために使用される方法であり、手軽でありながら少ない費用で遺伝子抑制効果を明確に達成できるので、その技術の応用分野が多様になっている。
【0003】
このような遺伝子の発現を抑制する技術は、特定遺伝子の発現を調節できるので、特定遺伝子の過剰発現が原因になる癌、遺伝疾患などの標的遺伝子をｍＲＮＡ水準で除去することができ、疾病治療のための治療剤開発及び標的検証の重要な道具として活用され得る。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては、標的遺伝子に対する転移遺伝子を導入する技術が開示されているが、プロモーターを基準にして逆方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）に転移遺伝子を導入する方法と、プロモーターを基準にして正方向（ｓｅｎｓｅ）に移植遺伝子を導入する方法とがある。
【0004】
このようなＲＮＡを標的とするＲＮＡ治療法は、標的ＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドを用いて該当の遺伝子の機能を除去する方法であり、既存の抗体と化合物（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）などの従来の治療剤が主にタンパク質を標的とするのとは異なると言える。ＲＮＡを標的とする接近法には大きく二つが存在するが、一つは、二重らせん－ＲＮＡが媒介したＲＮＡｉであり、他の一つはアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）である。現在、多様な疾病でＲＮＡを標的とした臨床が試みられている。
【0005】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（以下、「ＡＳＯ」と言う）は、ワトソン－クリック塩基反応によって目的遺伝子に結合されるようにデザインされた短い長さの合成ＤＮＡであり、遺伝子の特定塩基配列の発現を特異的に抑制することができ、遺伝子の機能を研究し、癌などの疾患を分子水準で治療できる治療剤を開発するのに用いられてきた。このようなＡＳＯは、遺伝子発現を抑制する目標を多様に設定することによって容易に製作可能であるという長所を有し、発癌遺伝子の発現と癌細胞の成長を抑制するのに活用しようとする研究が進められてきた。ＡＳＯが特定遺伝子の発現を抑制する過程は、相補的なｍＲＮＡ配列との結合によってＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導することによってｍＲＮＡを除去したり、タンパク質翻訳のためのリポソーム複合体の形成及び進行を妨害して行われる。また、ＡＳＯは、ゲノムＤＮＡと結合し、トリプル－ヘリックス（Ｔｒｉｐｌｅ ｈｅｌｉｘ）構造を形成することによって遺伝子の転写を抑制するとも報告された。ＡＳＯは、上記のような潜在的可能性を有するが、これを臨床に活用するためには、ヌクレアーゼ（ｎｕｃｌｅａｓｅ）に対する安定性を向上させ、目的遺伝子の塩基配列に特異的に結合するように標的組織や細胞内に効率的に伝達されなければならない。また、遺伝子ｍＲＮＡの２次及び３次構造は、ＡＳＯの特異的結合に重要な要素であり、ｍＲＮＡの２次構造が少ない部分は、ＡＳＯが接近するのに非常に有利であるので、ＡＳＯを合成する前にｍＲＮＡの２次構造が少なく生成される領域を体系的に分析し、生体外のみならず、生体内でも遺伝子－特異的抑制を効果的に達成するために努力してきた。このようなＡＳＯは、ＲＮＡの種類であるｓｉＲＮＡより非常に安定的であり、水及び生理食塩水などによく溶解されるという長所を有しており、現在、三つのＡＳＯがＦＤＡ（Ｆｅｄｅｒａｌ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）に承認された（Ｊｅｓｓｉｃａ，Ｃ．，Ｊ Ｐｏｓｔｄｏｃ Ｒｅｓ，４：３５－５０，２０１６）。
【0006】
干渉ＲＮＡ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、以下、「ＲＮＡｉ」と言う）は、その役割が発見されて以来、多様な種類の哺乳動物細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ）で配列特異的ｍＲＮＡに作用するという事実が明らかになった（Ｂａｒｉｋ，Ｓ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２００５）８３：７６４－７７３）。長い鎖のＲＮＡ二重鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二重鎖は、ダイサーというエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）によって２１個～２３個の二重鎖（ｂａｓｅ ｐａｉｒ、ｂｐ）にプロセッシングされた短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ、以下、「ｓｉＲＮＡ」と言う）に変換され、ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）に結合し、ガイド（アンチセンス）鎖がターゲットｍＲＮＡを認識して分解する過程を通じてターゲット遺伝子の発現を配列特異的に阻害する。ｓｉＲＮＡを用いた遺伝子の発現抑制技術は、標的細胞で標的遺伝子の発現を抑制させ、これによる変化を観察することによって、標的細胞での標的遺伝子の機能を究明する研究に有用に使用される。特に、感染性ウイルス又は癌細胞などで標的遺伝子の機能を抑制することは、該当の疾病の治療方法を開発するのに有用に活用可能であり、生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での研究及び実験動物を用いた生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）研究を行った結果、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能であると報告されている。
【0007】
Ｂｅｒｔｒａｎｄ研究陣によると、同一のターゲット遺伝子に対するｓｉＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＡＳＯ）に比べて生体内／外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ）でのｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れ、該当の効果が長い間持続されるという効果を有することが明らかになった。また、ｓｉＲＮＡの作用メカニズムは、ターゲットｍＲＮＡと相補的に結合し、配列特異的にターゲット遺伝子の発現を調節するので、既存の抗体基盤の医薬品や化学物質医薬品（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｄｒｕｇ）に比べて適用可能な対象が画期的に拡大され得るという長所を有する（ＭＡ Ｂｅｈｌｋｅ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＴＨＥＲＡＰＹ．２００６ １３（４）：６６４－６７０）。
【0008】
ｓｉＲＮＡの優れた効果及び多様な使用範囲にもかかわらず、ｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、体内でのｓｉＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）改善及び細胞伝達効率改善を通じてｓｉＲＮＡがターゲット細胞に効果的に伝達されなければならない（ＦＹ Ｘｉｅ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ．２００６ Ｊａｎ；１１（１－２）：６７－７３）。体内安定性を向上させ、ｓｉＲＮＡの非特異的な細胞免疫反応（ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）問題を解決するために、ｓｉＲＮＡの一部のヌクレオチド又は骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を、核酸分解酵素抵抗性を有するように変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）したり、ウイルス性ベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）、リポソーム又はナノ粒子（ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ）などの伝達体を用いるなど、これに対する研究が活発に試みられている。
【0009】
アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス性ベクターを用いた伝達システムは、形質注入効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。その一方で、ナノ粒子を含む非ウイルス性（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ）伝達システムは、ウイルス性伝達システムに比べて細胞伝達効率が低い方であるが、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）が高く、ターゲット特異的に伝達が可能であり、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞又は組織に吸収（ｕｐｔａｋｅ）及び内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）し、細胞毒性及び免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）がほとんどないという長所を有しており、現在は、ウイルス性伝達システムに比べて有力な伝達方法であると評価されている（Ａｋｈｔａｒ Ｓ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００７ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ３；１１７（１２）：３６２３－３６３２）。
【0010】
非ウイルス性伝達システムのうちナノ伝達体（ｎａｎｏ ｃａｒｒｉｅｒ）を用いる方法は、リポソーム、陽イオン高分子複合体などの多様な高分子を使用することによってナノ粒子を形成し、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ）、すなわち、ナノ伝達体（ｎａｎｏ ｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞に伝達する方法である。ナノ伝達体を用いる方法のうち主に活用される方法としては、高分子ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポフレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などを用いた方法があるが、このうち、リポフレックスを用いた方法は、陽イオン性脂質で構成され、細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の陰イオン性脂質との相互作用によってエンドソームの脱安定化効果を誘発し、細胞内への伝達を実現することができる。
【0011】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結し、増進した薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的な特徴を付与することによって生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できることが知られている（Ｊ Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ １１；４３２（７０１４）：１７３－８，２００４）。このとき、ｓｉＲＮＡセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））又はアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合された化学物質の性質によってｓｉＲＮＡの安定性が変わる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）などの高分子化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡは、陽イオン性物質が存在する条件でｓｉＲＮＡの陰イオン性リン酸基と相互作用しながら複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡ安定性を有する伝達体になる（ＳＨ Ｋｉｍ，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１６，２００８）。特に、高分子複合体で構成された各ミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）は、薬物伝達運搬体として使用される他のシステムである、微小球体（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）又はナノ粒子（ｎａｎｏ ｐａｒｔｉｃｌｅ）などに比べてその大きさが極めて小さいながらも分布が非常に一定であり、自発的に形成される構造であるので、製剤の品質管理及び再現性確保が容易であるという長所を有する。
【0012】
ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ））を単純共有結合又はリンカー－媒介（ｌｉｎｋｅｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ）共有結合で接合させたｓｉＲＮＡ接合体を通じて、ｓｉＲＮＡの安定性確保及び効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許第８８３４７１号）。しかし、ｓｉＲＮＡの化学的変形及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）のみでは、生体内での低い安定性及び標的臓器への伝達が円滑でないという短所を依然として有する。このような短所を解決するために、オリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡなどの二重鎖オリゴＲＮＡに親水性及び疎水性物質が結合された二重鎖オリゴＲＮＡ構造体が開発されたが、前記構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によってＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ＲＮＡ）と命名された自己集合ナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国登録特許第１２２４８２８号）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は、既存の伝達技術に比べて非常にサイズが小さいながらも、均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を収得できるという長所を有する。
【0013】
ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の具体的な例としては、親水性物質としてＰＥＧ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）又はＨＥＧ（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）が使用されるが、ＰＥＧは、合成ポリマー（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ）であり、通常、医薬品、特にタンパク質の水溶性（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）増加及び薬物動態学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調節のために使用される。ＰＥＧは、多分散系（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ）物質であり、一つのバッチ（ｂａｔｃｈ）のポリマーは、他の個数の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の総合からなり、分子量がガウス曲線形態を示し、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｅ ｖａｌｕｅ、Ｍｗ／Ｍｎ）で物質の同質性程度を表現する。すなわち、ＰＥＧは、低い分子量（３ｋＤａ～５ｋＤａ）であるときに約１．０１の多分散指数を示し、高い分子量（２０ｋＤａ）であるときに約１．２という高い多分散指数を示すので、高い分子量であるほど、物質の同質性が相対的に低いという特徴を示す。よって、ＰＥＧを医薬品に結合させた場合、接合体にＰＥＧの多分散的特徴が反映され、単一物質の検証が容易でないという短所があり、ＰＥＧの合成及び精製過程の改善を通じて低い多分散指数を有する物質を生産する趨勢であるが、特に、分子量が小さい物質にＰＥＧを結合させた場合、結合が容易に行われたかどうかを確認することが容易でないという不便さがあるなど、物質の多分散性特徴による問題が存在する（Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ Ｍ．ＶＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＴＯＤＡＹ（２００５）１０（２１）：１４５１－１４５８）。
【0014】
これによって、最近は、既存の自己集合ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術の改良された形態として、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭを構成する二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質を、一定の分子量を有する均一な１個～１５個の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）及びリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）（必要時に）を含む基本単位にブロック（ｂｌｏｃｋ）化し、これを必要によって適切な個数だけ使用することによって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＴＭに比べてより小さい大きさを有しながらも、多分散性が画期的に改善された新しい形態の伝達体技術が開発された。また、体内にｓｉＲＮＡを注入した場合、血液内に存在する多様な酵素によってｓｉＲＮＡが急速に分解され、標的細胞又は組織などへの伝達効率が良くないことが既に知られているように、改良されたＳＡＭｉＲＮＡＴＭでも、標的遺伝子によって安定性及び発現阻害率の偏差が表れた。よって、本発明者等は、改良された自己集合ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡＴＭを用いて標的遺伝子の発現をより安定的且つ効果的に阻害するために、ガイドであるセンス鎖はＡＳＯであるＤＮＡ配列を、パッセンジャーであるアンチセンス鎖はＲＮＡ配列を用いてＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態の二重鎖オリゴヌクレオチドを適用することによって、標的遺伝子に対する発現阻害効果及び安定性を増進させようとした。
【0015】
喘息と共に、代表的な肺疾患の一つである慢性閉塞性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅ、以下、「ＣＯＰＤ」と言う）は、非可逆的な気道の閉塞を伴うという点で喘息と異なり、繰り返される感染、有害な粒子やガスの吸入又は喫煙によって発生する肺の非正常的な炎症反応に伴い、完全に可逆的ではなく、徐々に進行する気流制限を示す呼吸器疾患である（Ｐａｕｗｅｌｓ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，１６３：１２５６－１２７６、２００１）。ＣＯＰＤは、気道及び肺実質炎症による細気管支及び肺実質の病理学的変化によって発生する病気であり、閉塞性細気管支炎及び肺気腫（肺実質の破壊）を特徴とする。ＣＯＰＤの種類には、慢性閉塞性気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、慢性細気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）及び肺気腫（Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）がある。ＣＯＰＤの場合、好中球の数が増加し、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－８、ＭＩＰ－２などのサイトカインの分泌が増加する。また、気道に炎症が生じ、筋肉の壁が厚くなり、粘液分泌が増加し、気管支閉鎖が表れる。気管支が閉鎖されると、肺胞は拡張・損傷し、酸素と二酸化炭素との交換能力が損傷を受けるようになり、呼吸不全の発生が増加する。
【0016】
全世界的にＣＯＰＤの深刻性が浮き彫りになっているが、これは、ＣＯＰＤが１９９０年に疾患による死亡原因の６位であったが、２０２０年には３位になると予測されており、１０大疾患のうち唯一にその発病率が増加する疾患であるためである。ＣＯＰＤは、有病率が高く、呼吸障害をもたらし、ＣＯＰＤの診断及び治療に必要な直接医療費が多く発生するだけでなく、呼吸困難障害や休職によって発生する損失又は早期死亡による損失などの間接医療費も相当であるので、全世界的にも社会－経済的な問題になっている（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）診療指針．２００５．慢性気道閉塞性疾患臨床研究センター．ｐ.３０－３１）。
【0017】
現存する如何なる治療薬剤においても、ＣＯＰＤの特徴である長期的肺機能の減少を緩和させると確認されたことがない。そのため、ＣＯＰＤでの薬物療法は、主に症状或いは合併症を減少させる目的で使用する。このうち、気管支拡張剤は、代表的なＣＯＰＤ対症療法治療剤であり、抗炎症剤や副腎皮質ホルモンなどが主に処方されるが、その効果が微々たるもので、適用範囲が狭小であり、副作用が発生する憂いが大きい。その他の薬物としては、インフルエンザワクチンのみが、ＣＯＰＤ患者で深刻な病症及び死亡を約５０％まで減少できると知られている（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）診療指針．２００５．慢性気道閉塞性疾患臨床研究センター．ｐ．５２－５８）。
【0018】
一方、多くの遺伝的因子が個人のＣＯＰＤ発生危険を増加（或いは減少）させると推定される。現在まで証明された遺伝的な危険因子としては、α１－アンチトリプシンの遺伝的欠乏がある。喫煙がＣＯＰＤ発病危険を相当増加させるが、幼い年齢で速く進行する汎小葉性肺気腫（ｐａｎｌｏｂｕｌａｒ ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）の発生及び肺機能の減少は、深刻な遺伝的欠乏を示す喫煙者と非喫煙者の両方から表れる。α１－アンチトリプシン遺伝子の他に、ＣＯＰＤ病因と関係すると確認された他の遺伝子は未だにないが、ＣＯＰＤ患者達で表れる基本的な細胞的、分子的及び遺伝子的な非正常的な状態に対する研究を通じて疾病のバイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）を識別し、これを診断に活用したり、新しい治療方法の発掘に活用するための試みが進行中である（Ｐ．Ｊ．Ｂａｒｎｅｓ ａｎｄ Ｒ．Ａ．Ｓｔｏｃｋｅｌｙ．Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．（２００５）２５：１０８４－１１０６）。特に、遺伝子マイクロアレイ（ｇｅｎｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）やプロテオミクス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）などの方法を通じてＣＯＰＤの診断及び治療ターゲットを選定する研究が活発に進められているが、ＣＯＰＤ敏感性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を付与する遺伝因子の分析及び喫煙で誘発されるＣＯＰＤ症状の悪化の原因に対する分析が主に行われている（Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｃａｓｔａｌｄｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０，Ｖｏｌ．１９，Ｎｏ．３ ５２６－５３４）。
【0019】
線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の一種類である特発性肺線維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、以下、「ＩＰＦ」と言う）は、肺胞壁に慢性炎症細胞が浸透しながら肺を硬くする多くの変化が発生しながら、肺組織の深刻な構造的変化をもたらし、肺機能が徐々に低下し、結局は死亡に至る疾患であり、未だに効果的な治療方法がないので、ほとんどの場合、症状が表れてから診断すると、平均生存期間が僅か３年～５年程度である予後が非常に悪い疾病である。発生頻度は、外国の場合、人口１０万名当たり約３人～５人程度であると報告されており、ほとんどの場合、５０代以後に発病率が高く、男が女よりも２倍ほど高い発病率を有すると知られている。
【0020】
ＩＰＦの発病原因は未だに明確に究明されていないが、喫煙者で頻度が高く、抗憂鬱剤、胃－食道逆流による慢性的肺吸入、金属粉塵、木材粉塵、又は溶媒剤吸入などがＩＰＦの発生と連関する各危険因子であると報告されているが、ほとんどの患者達では、確実な因果関係を有する各因子が報告されていない。最も多く言及される因子としては、如何なる原因によっても、Ｔｈ１／Ｔｈ２反応、凝固カスケードなどが活性化されると、これらによって線維化性サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）が分泌され、活性化されたサイトカインが、線維芽細胞を刺激することによってＥＣＭ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ）を増加させ、肺線維化が起こると知られている。もちろん、この過程で肺の炎症を伴うようになり、これによって肺の線維化を起こし得るが、最近は、肺の炎症と関係なく、肺線維化を直接起こし得るという意見がさらに支配的である。最近は、上皮間葉相互作用（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の非正常的な信号伝逹体系によって傷治癒過程で病理的な肺線維化が起こるという仮説がある。上皮細胞が損傷を受けると、上皮細胞のアポトーシスが増加し、移動が制限され、分化が調節されずに増殖が抑制され、液性因子（ＴＧＦ、ＨＧＦ、ＫＧＦ、アンジオテンシンＩＩ、ＲＯＳなど）が分泌され、ＥＣＭと共に間葉系細胞のアポトーシスが抑制され、筋線維芽細胞の分化が増加し、ＥＣＭの沈着による肺線維化を誘発したり、或いは上皮細胞を再度刺激するようになる。すなわち、肺の炎症が肺線維化を直接起こすとは言えなく、ただ、肺の炎症が先行され、引き続いて、正常組織に治癒される過程でＩＰＦ患者と正常人との差によって肺線維化が起こることを意味する。また、ＩＰＦは、Ｔｈ１／Ｔｈ２サイトカインの不調和によって誘発し得るが、Ｔｈ１サイトカイン反応は、細胞媒介性免疫に関係するものとして、組織回復に関する損傷部位を正常に回復させる一方で、Ｔｈ２サイトカインは、線維芽細胞の活性化及び増殖を通じてＥＣＭの沈着及び線維化を誘発する。ブレオマイシンを用いた肺線維化モデルでＩＦＮ－γを投与すると、ＴＧＦ－β及びプロコラーゲンのｍＲＮＡを減少させ、肺線維化を防止できると報告されているが、病因に対して正確に知られていないので、後ほどで線維化を起こす初期の原因因子を究明し、ＩＰＦと関連する遺伝子及びＴＧＦ－β信号伝達体系を抑制できる物質の開発などが必要である。
【0021】
ＩＰＦは、治療していないときに継続的に悪化し、患者の約５０％以上が３年～５年内に死亡すると知られており、また、一旦病気が進行し、線維化で完全に硬くなった後は如何なる治療をしても好転しないので、早期に治療する場合に効果がある可能性が高いと予測している。現在使用されている治療剤としては、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）とアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、又はシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）の併合療法を使用する方法が知られているが、特別な効果を示すとは見なしにくく、様々な線維化抑制剤が動物実験及び小規模の患者達で試みられたが、確実な効果が立証されていない状態である。特に、末期ＩＰＦ患者では、肺移植以外の他の効果的な治療方法がない実情である。よって、より効率的なＩＰＦの治療剤開発が切実な状況である。
【0022】
線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、何らかの理由により、組織や臓器が結合組織の過剰線維化によって硬くなる病症を通称するが、線維化が起こる全ての過程は、部位を問わず、傷痕が治療される過程と同一の経路で行われる。線維症状は、現在まで完治方法がほとんどなく、治療方法が開発及び研究中である。効果的な線維化治療剤は、代表的な線維症である肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、骨髓線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）のみならず、線維症が伴われる多様な疾病に適用可能であるので、効率的な線維症の治療剤開発が切実な状況である。
【0023】
ＣＴＧＦ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＣＣＮ２）は、ＣＣＮファミリーに属したマトリセルラータンパク質の一つであり、細胞結合（ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ）、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、傷回復（ｗｏｕｎｄ ｒｅｐａｉｒ）などの多様な生物学的過程（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）に関与するものとして知られている分泌サイトカインであり、ＣＴＧＦの過剰発現は、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、線維症（ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）及び傷痕形成などの症状の主要原因であると見なされる（Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ ＤＲ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ（２０１０）４（１）：１－４）。特に、線維症と関連して、ＣＴＧＦは、ＴＧＦ－β増殖因子－βと共に、慢性線維症（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を誘発したり、線維形成を誘発する条件でＥＣＭ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕａｒ ｍａｔｒｉｘ）の生産を促進させる役割をするものとして知られており、近来は、ＣＴＧＦの発現を阻害したり、作用を抑制する試料や物質を処理することによって、非正常的なＣＴＧＦの発現による視覚障害（ｏｃｕｌａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）や筋萎縮症（Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）を治療できると知られている（米国登録特許第７６２２４５４号、米国公開特許第２０１２０１６４１５１号）。
【0024】
上記で検討したように、未だにＣＴＧＦに対するＲＮＡｉ治療剤及びその伝達技術に対する技術開発は微々たるものであり、特異的且つ高効率でＣＴＧＦ発現を阻害できる二重鎖オリゴヌクレオチド治療剤及びその伝達技術に対する市場の需要は非常に高い状況である。
【0025】
そこで、本発明者等は、ＣＯＰＤを初めとした呼吸器疾患及びＩＰＦを初めとした線維症と関連する遺伝子としてＣＴＧＦを選定し、ＣＴＧＦを標的とする二重鎖オリゴヌクレオチドを選別し、ＣＴＧＦ発現を阻害できるＲＮＡｉ治療剤及びその伝達体を確認することによって本発明を完成した。
【発明の概要】
【0026】
本発明の目的は、ＣＴＧＦの発現を非常に特異的且つ高い効率で阻害できる二重鎖オリゴヌクレオチド、好ましくはＲＮＡ／ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＤＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形態、最も好ましくはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド形態の配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を提供することにある。
【0027】
本発明の他の目的は、前記二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記ナノ粒子を有効成分として含有する呼吸器疾患及び線維症の予防又は治療用医薬組成物を提供することにある。
【0028】
本発明の更に他の目的は、前記二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記ナノ粒子を線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法を提供することにある。
【0029】
本発明の更に他の目的は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に使用するための二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供することにある。
【0030】
本発明の更に他の目的は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に使用するための前記薬学的組成物の用途を提供することにある。
【0031】
本発明の更に他の目的は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療のための薬物を製造するための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途を提供することにある。
【0032】
前記目的を達成するために、本発明は、配列番号１～１６で構成された群、好ましくは、配列番号１、２、１０及び１５で構成された群から選ばれるいずれか一つの配列、さらに好ましくは、配列番号１０で表される配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含む二重鎖オリゴヌクレオチドを提供する。
【0033】
また、本発明は、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体；及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子；を提供する。
【0034】
また、本発明は、配列番号１～１６で構成された群、好ましくは、配列番号１、２、１０及び１５で構成された群から選ばれたいずれか一つの配列、さらに好ましくは、配列番号１０で表される配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含む二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び／又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【0035】
また、本発明は、前記二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記ナノ粒子を線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0036】
また、本発明は、前記線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法を提供する。
【0037】
本発明に係る配列番号１～１６で構成された群、好ましくは、配列番号１、２、１０及び１５で構成された群から選ばれたいずれか一つの配列、さらに好ましくは、配列番号１０で表される配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖（ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ ｓｔｒａｎｄ）とを含む二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子のそれぞれは、ＣＴＧＦの発現を非常に効率的に阻害できるので、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び前記ナノ粒子は、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に有用に使用可能である。
【0038】
前記目的を達成するために、提供される好ましい二重鎖オリゴヌクレオチドに含まれる配列番号１、２、１０及び１５の配列は次の通りである。
【0039】
５’－ＡＴＧＴＡＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴ－３’（配列番号１）
【0040】
５’－ＴＧＴＡＣＡＧＴＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＡ－３’（配列番号２）
【0041】
５’－ＴＧＡＴＴＴＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＴ－３’（配列番号１０）
【0042】
５’－ＴＣＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡＧＴＴＡＴＴＴ－３’（配列番号１５）
【0043】
本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、一般的なＲＮＡｉ（ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）作用を有する全ての物質を含む概念であり、前記ＣＴＧＦタンパク質をエンコードするｍＲＮＡ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドにＣＴＧＦ特異的ｓｈＲＮＡなども含まれることは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。すなわち、前記オリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡであることを特徴とすることができる。
【0044】
また、ＣＴＧＦに対する特異性が維持される限り、前記配列番号１、２、１０及び１５で構成された群から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖又はこれに相補的なアンチセンス鎖において、一つ以上の塩基が置換、欠失、又は挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むＣＴＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドも本発明の権利範囲に含まれることは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【0045】
本発明において、前記センス又はアンチセンス鎖は、独立してＤＮＡ又はＲＮＡであることを特徴とすることができ、また、センス鎖はＤＮＡ、アンチセンス鎖はＲＮＡであったり、センス鎖はＲＮＡ、アンチセンス鎖はＤＮＡであるハイブリッド形態が使用され得る。
【0046】
本発明において、前記配列番号１、２、１０及び１５はＤＮＡ形態で記載されているが、ＲＮＡ形態が使用される場合、配列番号１、２、１０及び１５の配列としては、これに対応するＲＮＡ配列、すなわち、ＴがＵに変更された配列が使用され得る。
【0047】
また、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＣＴＧＦに対する特異性が維持される限り、配列のセンス鎖がＣＴＧＦ遺伝子の結合部位と１００％相補的な塩基配列である場合、すなわち、完全一致（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）するものだけでなく、一部の塩基配列が一致していない場合、すなわち、不完全一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）するものも含む。
【0048】
本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、一つ又は両鎖の３’末端に一つ又はそれ以上の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）ヌクレオチドを含む構造であるオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができる。
【0049】
本発明において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖は、好ましくは１９個～３１個のヌクレオチドで構成されることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
【0050】
本発明において、配列番号１、２、１０及び１５で構成された群から選ばれたいずれか一つの配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含む二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＣＴＧＦ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に特異的であることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
【0051】
本発明において、前記二重鎖オリゴヌクレオチドのセンス鎖又はアンチセンス鎖は、生体内の安定性向上のために、又は核酸分解酵素の抵抗性付与及び非特異的免疫反応の減少のために、多様な化学的変形（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とすることができ、化学的変形は、ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造の２’炭素位置で水酸化基（－ＯＨ）がメチル基（－ＣＨ３）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミン基（－ＮＨ２）、フッ素（－Ｆ）、Ｏ－２－メトキシエチル基、Ｏ－プロピル基、Ｏ－２－メチルチオエチル基、Ｏ－３－アミノプロピル基、Ｏ－３－ジメチルアミノプロピル基、Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド基及びＯ－ジメチルアミドオキシエチルで構成された群から選ばれるいずれか一つに置換される変形；ヌクレオチド内の糖構造の酸素が硫黄に置換される変形；ヌクレオチド結合がホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）結合、ボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）結合及びメチルホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合で構成された群から選ばれるいずれか一つの結合になる変形；ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）及びＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）形態への変形；及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド形態への変形；で構成された群から選ばれたいずれか一つ以上であることを特徴とすることができるが（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５５，６１－６５ ２００４；ＵＳ ５，６６０，９８５；ＵＳ ５，９５８，６９１；ＵＳ ６，５３１，５８４；ＵＳ ５，８０８，０２３；ＵＳ ６，３２６，３５８；ＵＳ ６，１７５，００１；Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４：１１３９－１１４３，２００３；ＲＮＡ，９：１０３４－１０４８，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ.３１：５８９－５９５，２００３；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８（１７）５７６１－７７３，２０１０；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９（５）：１８２３－１８３２，２０１１）、これに限定されるのではない。
【0052】
本発明において、二重鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖の５’末端に一つ以上のリン酸基（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が結合されていることを特徴とすることができ、好ましくは、１個～３個のリン酸基が結合されていることを特徴とすることができる。
【0053】
本発明は、他の観点において、下記の構造式（１）の構造を含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体に関するものであり、下記の構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して単純共有結合又はリンカーが媒介した共有結合を意味し、Ｒは、二重鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【0054】
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
【0055】
一つの好ましい具体例として、本発明に係るＣＴＧＦ特異的配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、構造式（１）のような構造を有することが好ましい。
【0056】
Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１）
【0057】
前記構造式（１）において、Ａは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは、それぞれ独立して単純共有結合又はリンカーが媒介した共有結合を意味し、Ｒは、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【0058】
本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドの形態としては、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）及びｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などが好ましいが、これに限定されるのではなく、ｍｉＲＮＡに対する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）としての役割をし得る単一鎖のｍｉＲＮＡ阻害剤も含まれる。
【0059】
以下、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを中心に説明するが、本発明の二重鎖オリゴヌクレオチドと同一の特性を有する他の二重鎖オリゴヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）にも適用可能であることは、当業界の通常の技術者にとって自明である。
【0060】
より好ましくは、本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（２）の構造を有する。
【0061】
Ａ－Ｘ－Ｓ－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（２）
ＡＳ 構造式（２）
【0062】
前記構造式（２）において、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）での定義と同一であり、Ｓは、ＣＴＧＦ特異的ヌクレオチド配列のセンス鎖を意味し、ＡＳは、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖を意味する。
【0063】
より好ましくは、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（３）又は（４）の構造を有する。
【0064】
Ａ－Ｘ－５’Ｓ ３’ －Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（３）
Ａ－Ｘ－３’Ｓ ５’ －Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（４）
ＡＳ 構造式（３）
Ａ－Ｘ－３’Ｓ ５’ －Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（４）
【0065】
前記構造式（３）及び構造式（４）において、Ａ、Ｂ、Ｓ、ＡＳ、Ｘ及びＹは、前記構造式（２）での定義と同一であり、５’及び３’は、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
【0066】
前記親水性物質は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンで構成された群から選ばれることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
【0067】
前記構造式（１）～構造式（４）における前記ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、アンチセンス鎖の５’末端にリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｇｒｏｕｐ）が１個～３個結合され得る。また、ＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡも使用可能であることは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【0068】
前記構造式（１）～構造式（４）における親水性物質は、分子量が２００～１０，０００である高分子物質であることが好ましく、さらに好ましくは、分子量が１，０００～２，０００である高分子物質である。例えば、親水性高分子物質としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるのではない。
【0069】
特に、構造式（１）～構造式（４）における親水性物質（Ａ）は、下記の構造式（５）又は構造式（６）のような形態の親水性物質ブロック形態で利用可能であるが、このような親水性物質ブロックを必要によって適切な個数（構造式（５）又は構造式（６）でのｎ）だけ使用することによって、一般の合成高分子物質などを使用する場合に発生し得る多分散性による問題を大きく改善することができる。
【0070】
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ 構造式（５）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ 構造式（６）
【0071】
前記構造式（５）において、Ａ’は親水性物質単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）を意味し、Ｊは、ｍ個の親水性物質単量体の間又はｍ個の親水性物質単量体とオリゴヌクレオチドとを互いに連結するリンカーを意味し、ｍは１～１５の整数を意味し、ｎは１～１０の整数を意味し、（Ａ’ｍ－Ｊ）又は（Ｊ－Ａ’ｍ）で表される反復単位が親水性物質ブロックの基本単位に該当する。
【0072】
前記構造式（５）又は構造式（６）のような親水性物質ブロックを有する場合、本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体は、下記の構造式（７）又は構造式（８）のような構造を有することができる。
【0073】
（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（７）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）
（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（８）
【0074】
前記構造式（７）及び構造式（８）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ及びＢは、構造式（１）での定義と同一であり、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは、構造式（５）及び構造式（６）での定義と同一である。
【0075】
前記構造式（５）及び構造式（６）において、親水性物質単量体（Ａ’）は、非イオン性親水性高分子の単量体のうち、本発明の目的に符合するものであれば制限なく使用可能であり、好ましくは、表１に記載した化合物（１）～化合物（３）から選ばれた単量体、さらに好ましくは化合物（１）の単量体が使用され得る。また、化合物（１）において、Ｇは、好ましくはＯ、Ｓ及びＮＨから選ばれ得る。
【0076】
特に、親水性物質単量体のうち化合物（１）で表される単量体は、多様な官能基を導入することができ、生体内の親和性が良く、免疫反応を少なく誘導するなど、生体適合性（ｂｉｏ－ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）に優れるだけでなく、構造式（７）又は構造式（８）による構造体内に含まれた二重鎖オリゴヌクレオチドの生体内の安定性を増加させ、伝達効率を増加できるという長所を有しており、本発明に係る構造体の製造に非常に適している。
【0077】
【表1】
【0078】
前記構造式（５）～構造式（８）での親水性物質は、総分子量が１，０００～２，０００の範囲内であることが特に好ましい。よって、例えば、構造式（７）及び構造式（８）において、化合物（１）によるヘキサエチレングリコール（Ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、すなわち、ＧがＯで、ｍが６である物質が使用される場合、ヘキサエチレングリコールスペーサーの分子量が３４４であるので、反復回数（ｎ）は３～５であることが好ましい。特に、本発明は、必要によって、前記構造式（５）及び構造式（６）において（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ又は（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎで表される親水性グループの反復単位、すなわち、親水性物質ブロックがｎで表される適切な個数で使用され得ることを特徴とする。前記各親水性物質ブロック内に含まれる親水性物質単量体であるＡとリンカーであるＪは、独立して各親水性物質ブロックの間で同一又は異なり得る。すなわち、親水性物質ブロックが３個使用される場合（ｎ＝３）、１番目のブロックには化合物（１）による親水性物質単量体が、２番目のブロックには化合物（２）による親水性物質単量体が、３番目のブロックには化合物（３）による親水性物質単量体が使用されるなど、全ての親水性物質ブロック別に異なる親水性物質単量体が使用されてもよく、全ての親水性物質ブロックに化合物（１）～化合物（３）による親水性物質単量体から選ばれたいずれか一つの親水性物質単量体が同一に使用されてもよい。同様に、親水性物質単量体の結合を媒介するリンカーとしても、各親水性物質ブロック別に全て同一のリンカーが使用されてもよく、各親水性物質ブロック別に異なるリンカーが使用されてもよい。また、親水性物質単量体の個数であるｍも、各親水性物質ブロックの間で同一又は異なり得る。すなわち、１番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が３個連結（ｍ＝３）され、２番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が５個連結（ｍ＝５）され、３番目の親水性物質ブロックでは親水性物質単量体が４個連結（ｍ＝４）されるなど、互いに異なる個数の親水性物質単量体が使用されてもよく、全ての親水性物質ブロックで同一の個数の親水性物質単量体が使用されてもよい。
【0079】
また、本発明において、前記リンカー（Ｊ）は、－ＰＯ３
－－、－ＳＯ３－及び－ＣＯ２－で構成された群から選ばれることが好ましいが、これに制限されるのではなく、使用される親水性物質の単量体などによって、本発明の目的に符合する限り、如何なるリンカーも使用可能であることは通常の技術者にとって自明である。
【0080】
前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）での疎水性物質（Ｂ）は、疎水性相互作用を通じて構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による二重鎖オリゴヌクレオチド構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割をする。前記疎水性物質は、分子量が２５０～１，０００であることが好ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）などが使用され得るが、これに制限されるのではなく、本発明の目的に符合するものであれば、如何なる疎水性物質も使用可能であることは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。
【0081】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメート及びコレステリルアミンで構成された群から選ばれ得る。また、前記グリセリド誘導体は、モノ－、ジ－及びトリ－グリセリドなどから選ばれ得るが、このとき、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ１２～Ｃ５０の不飽和又は飽和脂肪酸であることが好ましい。
【0082】
特に、前記疎水性物質のうち飽和又は不飽和炭化水素やコレステロールは、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合できるという長所を有している点で好ましく、Ｃ２４炭化水素、特にジスルフィド結合を含む形態であることが最も好ましい。
【0083】
前記疎水性物質は、親水性物質の反対側末端（ｄｉｓｔａｌ ｅｎｄ）に結合され、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のいずれの位置に結合されても構わない。
【0084】
本発明に係る構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）での親水性物質又は疎水性物質とＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドは、単純共有結合又はリンカーが媒介した共有結合（Ｘ又はＹ）によって結合される。前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質又は疎水性物質とＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドの末端で共有結合し、必要によって、特定の環境で分解可能な結合を提供する限り、特に限定されるのではない。よって、前記リンカーとしては、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造過程でＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチド及び／又は親水性物質（又は疎水性物質）を活性化するために結合させる如何なる化合物も使用され得る。前記共有結合は、非分解性結合及び分解性結合のうちいずれであっても構わない。このとき、非分解性結合としては、アミド結合又はリン酸結合があり、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、アンハイドライド結合、生分解性結合又は酵素分解性結合などがあるが、これに限定されるのではない。
【0085】
また、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）でのＲ（又はＳ及びＡＳ）で表されるＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドは、ＣＴＧＦのｍＲＮＡと特異的に結合できるという特性を有する二重鎖オリゴヌクレオチドであれば、いずれも制限なく使用可能であり、好ましくは、本発明では、配列番号１、２、１０及び１５から選ばれたいずれか一つの配列を含むセンス鎖と、それに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とで構成される。
【0086】
また、本発明は、本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体において、前記構造体内の親水性物質のオリゴヌクレオチドと結合された反対側末端部位にアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）グループがさらに導入され得る。
【0087】
これは、本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の伝達体の細胞内導入及びエンドソーム脱出を容易にするためのものであり、既に量子ドット、デンドリマー、リポソームなどの伝達体の細胞内導入及びエンドソーム脱出を容易にするために、アミングループの導入、ポリヒスチジングループの利用及びその効果が報告されている。
【0088】
具体的に、伝達体の末端或いは外側に修飾された一次アミン基は、生体内のｐＨでプロトン化されながら陰電荷を帯びる遺伝子との静電気的相互作用によって結合体を形成し、細胞内に流入した後、エンドソームの低いｐＨで緩衝効果を有する内部３次アミンによってエンドソームの脱出が容易になることによってリソソームの分解から伝達体を保護できると知られており（高分子基盤のハイブリッド物質を用いた遺伝子伝達及び発現抑制。Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３，ｐｐ２５４－２５９）、
【0089】
非必須アミノ酸の一つであるヒスチジンは、残基（－Ｒ）にイミダゾール環（ｐＫａ３ ６．０４）を有するので、エンドソームとリソソームで緩衝能力（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加させるという効果を有し、リポソームを初めとした非ウイルス性遺伝子伝達体（ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ）においてエンドソーム脱出効率を高めるためにヒスチジン修飾を利用可能であることが知られている（Ｎｏｖｅｌ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １１８，ｐｐ２６２－２７０）。
【0090】
前記アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）グループは、一つ以上のリンカーを介して親水性物質又は親水性物質ブロックと連結され得る。
【0091】
本発明の構造式（１）による二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質にアミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）グループが導入される場合は、構造式（９）のような構造を有することができる。
【0092】
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（９）
【0093】
前記構造式（９）において、Ａ、Ｂ、Ｒ、Ｘ、及びＹは構造式（１）での定義と同一であり、
Ｐは、アミン基又はポリヒスチジングループを意味し、Ｊ１とＪ２は、リンカーとして、独立して単純共有結合、ＰＯ３ －、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２－１２アルキル、アルケニル及びアルキニルから選ばれ得るが、これに限定されるのではなく、使用される親水性物質によって本発明の目的に符合するＪ１とＪ２であれば、如何なるリンカーも使用可能であることは通常の技術者にとって自明である。
Ｐは、アミン基又はポリヒスチジングループを意味し、Ｊ１とＪ２は、リンカーとして、独立して単純共有結合、ＰＯ３ －、ＳＯ３、ＣＯ２、Ｃ２－１２アルキル、アルケニル及びアルキニルから選ばれ得るが、これに限定されるのではなく、使用される親水性物質によって本発明の目的に符合するＪ１とＪ２であれば、如何なるリンカーも使用可能であることは通常の技術者にとって自明である。
【0094】
好ましくは、アミン基が導入された場合、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３
－で、Ｊ１はＣ６アルキルであることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【0095】
また、ポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）グループが導入された場合、構造式（９）において、Ｊ２は単純共有結合又はＰＯ３
－で、Ｊ１は化合物（４）であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【0096】
【化1】
【0097】
また、構造式（９）による二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の親水性物質が構造式（５）又は構造式（６）による親水性物質ブロックで、これに、アミン基又はポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）グループが導入される場合、構造式（１０）又は構造式（１１）のような構造を有することができる。
【0098】
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１０）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１１）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１１）
【0099】
前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ’、Ｊ、ｍ及びｎは、構造式（５）又は構造式（６）での定義と同一であり、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は、構造式（９）での定義と同一である。
【0100】
特に、前記構造式（１０）及び構造式（１１）において、親水性物質は、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の３’末端に結合された形態であることが好ましく、この場合、前記構造式（９）～構造式（１１）は、次の構造式（１２）～構造式（１４）の形態を有することができる。
【0101】
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－Ａ－Ｘ－３’Ｓ ５’－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（１２）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－３’Ｓ ５’－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（１３）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－３’Ｓ ５’－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（１４）
ＡＳ 構造式（１２）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ａ’ｍ－Ｊ）ｎ－Ｘ－３’Ｓ ５’－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（１３）
Ｐ－Ｊ１－Ｊ２－（Ｊ－Ａ’ｍ）ｎ－Ｘ－３’Ｓ ５’－Ｙ－Ｂ
ＡＳ 構造式（１４）
【0102】
前記構造式（１２）～構造式（１４）において、Ｘ、Ｒ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ａ’、Ｊ、ｍ、ｎ、Ｐ、Ｊ１及びＪ２は、前記構造式（９）～構造式（１１）での定義と同一であり、５’及び３’は、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドセンス鎖の５’末端及び３’末端を意味する。
【0103】
本発明で導入され得るアミン基としては、１次～３次アミン基が使用可能であり、１次アミン基が使用されることが特に好ましい。前記導入されたアミン基は、アミン塩としても存在し得るが、例えば、１次アミン基の塩はＮＨ３＋の形態で存在し得る。
【0104】
また、本発明で導入され得るポリヒスチジングループは、３個～１０個のヒスチジンを含むことが好ましく、特に好ましくは５個～８個、最も好ましくは６個のヒスチジンを含むことができる。さらに、ヒスチジン以外に、一つ以上のシステインが含まれ得る。
【0105】
一方、本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びこれから形成されたナノ粒子にターゲッティングモイエティが備えられる場合、ターゲット細胞への伝達を効率的に促進し、比較的低い濃度の投与量でもターゲット細胞に伝達され、高いターゲット遺伝子発現調節機能を示すことができ、他の臓器及び細胞への非特異的なＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドの伝達を防止することができる。
【0106】
これによって、本発明は、前記構造式（１）～構造式（４）、構造式（７）及び構造式（８）による構造体に、リガンド（Ｌ）、特に、受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＲＭＥ）を通じてターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合するという特性を有するリガンドがさらに結合された二重鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供し、例えば、構造式（１）による二重鎖オリゴＲＮＡ構造体にリガンドが結合された形態は、下記の構造式（１５）のような構造を有する。
【0107】
（Ｌｉ－Ｚ）－Ａ－Ｘ－Ｒ－Ｙ－Ｂ 構造式（１５）
【0108】
前記構造式（１５）において、Ａ、Ｂ、Ｘ及びＹは、前記構造式（１）での定義と同一であり、Ｌは、受容体媒介内包作用（ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ、ＲＭＥ）を通じてターゲット細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させる受容体と特異的に結合するという特性を有するリガンドを意味し、ｉは、１～５の整数、好ましくは１～３の整数である。
【0109】
前記構造式（１５）でのリガンドは、好ましくは、ターゲット細胞特異的に細胞内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を増進させるＲＭＥ特性を有するターゲット受容体特異的抗体、アプタマー及びペプチド；又は葉酸塩（Ｆｏｌａｔｅ）（一般に、葉酸塩（ｆｏｌａｔｅ）と葉酸（ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ）は交互に使用されており、本発明での葉酸塩は、自然状態又は人体で活性化状態である葉酸塩を意味する。）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ、ＮＡＧ）などのヘキソアミン（ｈｅｘｏａｍｉｎｅ）、ブドウ糖（ｇｌｕｃｏｓｅ）、マンノース（ｍａｎｎｏｓｅ）を初めとした糖や炭水化物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ）などの化学物質などから選ばれ得るが、これに限定されるのではない。
【0110】
また、前記構造式（１５）での親水性物質Ａは、構造式（５）及び構造式（６）による親水性物質ブロックの形態で使用され得る。
【0111】
本発明の更に他の様態として、本発明は、ＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法を提供する。
【0112】
本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する過程は、例えば、
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）を基盤にして親水性物質を結合させる段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体を基盤にしてオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド単一鎖５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体からオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖を分離・精製する段階；及び
（６）製造されたオリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニーリングを通じて二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んで構成され得る。
（１）固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）を基盤にして親水性物質を結合させる段階；
（２）前記親水性物質が結合された固形支持体を基盤にしてオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド単一鎖５’末端に疎水性物質を共有結合させる段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体からオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖を分離・精製する段階；及び
（６）製造されたオリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニーリングを通じて二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；を含んで構成され得る。
【0113】
本発明での固形支持体（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）は、ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）であることが好ましいが、これに限定されるのではなく、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）シリカゲル、セルロースペーパーなどが使用され得る。ＣＰＧの場合、直径は４０μｍ～１８０μｍであることが好ましく、５００Å～３０００Åの空隙サイズを有することが好ましい。前記段階（５）以後、製造が完了すると、精製されたＲＮＡ－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖に対しては、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計で分子量を測定し、目的とするオリゴヌクレオチド－高分子構造体及びオリゴヌクレオチド単一鎖が製造されたかどうかを確認することができる。前記製造方法において、（２）段階で合成されたオリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階（４）は、（１）段階以前又は（１）段階～（５）段階のうちいずれか一つの過程中に行われても構わない。
【0114】
また、（２）段階で合成されたオリゴヌクレオチド単一鎖と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド単一鎖は、５’末端にリン酸基が結合された形態で用いられたことを特徴とする。
【0115】
一方、本発明のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体に追加的にリガンドが結合された二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の製造方法を提供する。
【0116】
リガンドが結合されたＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する方法は、例えば、
（１）官能基が結合されている固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基－親水性物質が結合されている固形支持体を基盤にしてオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程で合成する段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体から官能基－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を用いて親水性物質の末端にリガンドを結合することによってリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体単一鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニーリングを通じてリガンド－二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；
を含んで構成され得る。
（１）官能基が結合されている固形支持体に親水性物質を結合させる段階；
（２）官能基－親水性物質が結合されている固形支持体を基盤にしてオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（３）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合させる過程で合成する段階；
（４）前記オリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階；
（５）合成が完了すると、固形支持体から官能基－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を分離する段階；
（６）前記官能基を用いて親水性物質の末端にリガンドを結合することによってリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体単一鎖を製造する段階；及び
（７）製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニーリングを通じてリガンド－二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造する段階；
を含んで構成され得る。
【0117】
前記（６）段階以後、製造が完了すると、リガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を分離・精製した後、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計で分子量を測定し、目的とするリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体及び相補的なオリゴヌクレオチドが製造されたかどうかを確認することができる。製造されたリガンド－オリゴヌクレオチド－高分子構造体と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖のアニーリングを通じてリガンド－二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を製造することができる。前記製造方法において、（３）段階で合成されたオリゴヌクレオチド単一鎖の配列と相補的な配列のオリゴヌクレオチド単一鎖を合成する段階（４）は、独立的な合成過程であり、（１）段階以前又は（１）段階～（６）段階のうちいずれか一つの過程中に行われても構わない。
【0118】
本発明は、更に他の観点において、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子に関するものである。本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド構造体の場合、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己集合ナノ粒子を形成するようになるが（大韓民国登録特許公報第１２２４８２８号）、このようなナノ粒子は、体内への伝達効率及び体内での安定性に極めて優れるだけでなく、粒子サイズの均一性に優れ、ＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易であるので、薬物としての製造工程が簡単である。
【0119】
本発明において、前記ナノ粒子は、互いに異なる配列を含む二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体が混合されて構成されることを特徴とすることができ、例えば、前記ナノ粒子は、配列番号１、２、１０及び１５から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含む一種類のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含み得るが、更に他の様態として、配列番号１、２、１０及び１５から選ばれるいずれか一つの配列を含むセンス鎖と、これに相補的な配列を含むアンチセンス鎖とを含む互いに異なる種類のＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを共に含むことができ、本発明で開示していないＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを共に含むこともできる。
【0120】
本発明は、他の観点において、本発明に係る二重鎖オリゴヌクレオチド、二重鎖オリゴヌクレオチド構造体又はナノ粒子を有効成分として含有する線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【0121】
本発明に係る線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物は、結合組織再形成（ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）、特に、肺動脈再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）及び気道再形成（ａｉｒｗａｙ ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を抑制し、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療において効果を示す。
【0122】
本発明において、呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎又は喉頭炎であることを特徴とすることができ、線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髓線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）などから選ばれることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。本発明において、前記放射線線維症は、癌、腫瘍などの治療のためによく使用される放射線療法によって頻繁に誘発される副作用であり、放射線線維症侯群（ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｓｙｎｄｒｏｍ、ＲＦＳ）と混用され得る。
【0123】
本発明の組成物は、投与のために、前記記載した有効成分以外に、薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んで製造され得る。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能でなければならなく、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち一つの成分又は二つ以上の成分を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができ、特に、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）された形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥剤形の製造のために、本発明の属する技術分野で通常的に知られている方法が使用可能であり、凍結乾燥のための安定化剤が追加されてもよい。さらに、当分野の適正な方法又はレミントン薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）に開示されている方法を用いて各疾病又は成分によって好ましく製剤化することができる。
【0124】
本発明の組成物は、通常の患者の症侯及び疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、本発明の組成物は、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの多様な形態に製剤化することができ、単位－投与量又は多－投与量容器、例えば、密封されたアンプル及び瓶などに提供されてもよい。
【0125】
本発明の組成物は、経口又は非経口投与が可能である。本発明に係る組成物の投与経路は、これらに限定されるのではないが、例えば、口腔、吸入用、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下又は局所投与が可能である。特に、呼吸器疾患の治療のために、気管支内点滴注入を通じた肺への投与も可能である。本発明に係る組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率又は疾病の重症度などによってその範囲が多様であり、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のために、公知の技術を用いて本発明の組成物を適切な剤形に製剤化することができる。
【0126】
本発明は、他の観点において、本発明に係る医薬組成物を含む凍結乾燥された形態の剤形に関するものである。
【0127】
本発明は、他の観点において、本発明に係る線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療用医薬組成物を、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法に関するものである。
【0128】
本発明において、呼吸器疾患は、慢性閉塞性疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、急・慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、扁桃炎又は喉頭炎であることを特徴とすることができ、線維症は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、骨髓線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心筋線維症（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腎線維症（ｒｅｎａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、ケロイド（ｋｅｌｏｉｄ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、心臓線維症（ｃａｒｄｉａｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、又は放射線線維症（ｒａｄｉａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）であることを特徴とすることができるが、これに限定されるのではない。
【0129】
本発明は、更に他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に使用するための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、これを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びナノ粒子の用途に関するものである。
【0130】
本発明は、更に他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に使用するための前記薬学的組成物の用途に関するものである。
【0131】
本発明は、更に他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療に使用するための二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途に関するものである。
【0132】
本発明は、更に他の観点において、前記二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及び／又は前記ナノ粒子を、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療を必要とする個体に投与する段階を含む線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療方法に関するものである。
【0133】
本発明は、更に他の観点において、線維症又は呼吸器疾患の予防又は治療のための薬物の製造のための前記二重鎖オリゴヌクレオチド、前記二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体、及び前記二重鎖オリゴヌクレオチド又は前記二重鎖オリゴヌクレオチド構造体を含むナノ粒子の用途に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【0134】
【図1】ヒトＣＴＧＦをターゲットにする１，１６２個のＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングの結果であり、実施例３のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示す図である。
【0135】
【図2】実施例４のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、本発明の配列番号１、２、１０、１５の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを異なる濃度で（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示したグラフである。
【0136】
【図3】実施例４のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、本発明の配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを濃度別に肺癌細胞株であるＡ５４９に処理したとき、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析し、ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。
【0137】
【図4】実施例４のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、本発明の配列番号１０及びＲｘｉ－１０９の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを処理したとき、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析し、ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を比較分析したグラフである。
【0138】
【図5】実施例５のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、選別されたＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較した分析結果である。本発明の配列番号１０の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを異なる濃度で（２００ｎＭ又は６００ｎＭ）肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較して示したグラフである。
【0139】
【図6】ラットＣＴＧＦをターゲットにする９４個のＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングの結果及びそのうち選別された１２個の候補配列の効果を示す図である。
【0140】
【図7】実施例６のラットＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、本発明の配列番号４６、４７、４８の配列を含む選別された１２個の候補配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを異なる濃度で（２００ｎＭ又は５００ｎＭ）ラット肝癌細胞株であるＨ４－ＩＩ－Ｅに処理し、ｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示したグラフである。
【0141】
【図8】実施例６のラットＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、本発明の配列番号４６、４７、４８の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを異なる濃度で（２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）ラット肝癌細胞株であるＨ４－ＩＩ－Ｅに処理し、ｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を分析し、ＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認したグラフである。
【0142】
【図9】実施例６のｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の定量分析結果を示した図であり、選別されたｒａｔＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドによるｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較した分析結果である。本発明の配列番号４６、４７、４８の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを異なる濃度で（２００ｎＭ又は６００ｎＭ）肝癌細胞株であるＨ４－ＩＩ－Ｅに処理し、ｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較して示したグラフである。
【0143】
【図10】実施例７の創傷誘発ケロイドモデルのネズミに、皮内投与法によってＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ（Ｄ／Ｒ）＃４６及びＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ（Ｒ／Ｒ）＃４６ １２００μｇを投与した後、皮膚組織リアルタイムＰＣＲ分析結果及びターゲット遺伝子ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0144】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものに過ぎなく、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないことは、当該技術分野で通常の知識を有する者にとって自明である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されると言える。
【0145】
本発明では、ＣＴＧＦの発現を阻害できる最終の一つの特異的な配列を同定し、これらがＣＴＧＦを暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合し、ＣＴＧＦの発現を効果的に抑制することによって、線維症及び呼吸器疾患関連疾患を効果的に治療できることを確認した。
【0146】
実施例１．ＣＴＧＦをターゲットにするＳＡＭｉＲＮＡスクリーニングのためのアルゴリズム及び候補配列選定
【0147】
ＳＡＭｉＲＮＡベースの治療剤高速大量スクリーニング（ＳＡＭｉＲＮＡ ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、ｍＲＮＡ全体に対して１－塩基（１－ｂａｓｅ）又は２－塩基（２－ｂａｓｅ）スライディングウィンドウアルゴリズム（ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用することによって可能な全ての候補配列を生成し、相同性フィルタリング（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）を進行することによって不必要な候補配列を除去し、最終的に選別された全てのＳＡＭｉＲＮＡに対して該当の遺伝子発現阻害程度を確認する方法である。
【0148】
まず、ＣＴＧＦに対するＳＡＭｉＲＮＡ候補配列に対するデザイン過程は、ヒトＣＴＧＦ ｍＲＮＡであるＮＭ＿００１９０１．２（２，３５８ｂｐ）に対して２－塩基スライディングウィンドウアルゴリズム（２－ｂａｓｅ ｓｌｉｄｉｎｇ ｗｉｎｄｏｗ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を適用することによって、１９個の塩基で構成された１，１６２個のＳＡＭｉＲＮＡ候補配列を最終的に選別し、ＣＴＧＦ阻害程度の実験を行った。
【0149】
実施例２．二重鎖オリゴＲＮＡ構造体の合成
【0150】
本発明で製造された二重鎖オリゴＲＮＡ構造体（ＳＡＭｉＲＮＡ）は、下記の構造式のような構造を有する。
【0151】
Ｃ２４－５’Ｓ ３’－（ヘキサエチレングリコール－ＰＯ４
－）３－ヘキサエチレングリコール
ＡＳ ５’－ＰＯ４
ＡＳ ５’－ＰＯ４
【0152】
ｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）二重鎖オリゴ構造体のセンス鎖は、３，４，６－トリアセチル－１－ヘキサ（エチレングリコール）－Ｎ－アセチルガラクトサミン－ＣＰＧ（１－Ｈｅｘａ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）－Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ－ＣＰＧを支持体とし、親水性物質単量体であるＤＭＴヘキサエチレングリコールホスホロアミダート（Ｄｅｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ ｈｅｘａｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）３個を前記反応を通じて連続的に結合し、ＲＮＡ又はＤＮＡ合成を進行した後、追加的に５’末端部位に疎水性物質であるジスルフィド結合が含まれているＣ２４（Ｃ６－Ｓ－Ｓ－Ｃ１８）を結合させ、３’末端にＮＡＧ－ヘキサエチレングリコール－（－ＰＯ３
－ヘキサエチレングリコール）３が結合されており、５’末端にＣ２４（Ｃ６－Ｓ－Ｓ－Ｃ１８）が結合されているｍｏｎｏＳＡＭｉＲＮＡ（ｎ＝４）のセンス鎖を製造した。
【0153】
合成が完了すると、６０℃の温湯器（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で２８％（ｖ／ｖ）アンモニア（ａｍｍｏｎｉａ）を処理し、合成されたＲＮＡ単一鎖及びオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体をＣＰＧから剥ぎ取った後、脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）反応を通じて保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ単一鎖及びオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ－メチルピロリドン（Ｎ－ｍｅｔｈｙｌｐｙｒｏｌｉｄｏｎ）、トリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）及びトリエチルアミントリヒドロフルオライド（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅｔｒｉｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｄｅ）を体積比１０：３：４の比率で処理することによって２’－ジメチルシリルを除去した。前記各反応物から高速液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）でＲＮＡ単一鎖、オリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体及びリガンドが結合されたオリゴ（ＤＮＡ又はＲＮＡ）－高分子構造体を分離し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ－ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本）で分子量を測定し、合成しようとする塩基配列及びオリゴ－高分子構造体に符合するかどうかを確認した。その後、それぞれの二重鎖オリゴ構造体を製造するためにセンス鎖とアンチセンス鎖を同量混合し、１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ酢酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭ酢酸マグネシウム（Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、ｐＨ７．０）に入れ、９０℃恒温水槽で３分反応させた後、再度３７℃で反応させ、目的とするＳＡＭｉＲＮＡを製造した。製造された二重鎖オリゴＲＮＡ構造体のアニーリングは、電気泳動を通じて確認した。
【0154】
実施例３．ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦをターゲットにしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の高速大量スクリーニング（ＨＴＳ）
【0155】
３．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の製造
【0156】
実施例２で合成されたＣＴＧＦ配列をターゲットにする１，１６２種のＳＡＭｉＲＮＡを１ＸＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）（ＷＥＬＧＥＮＥ、ＫＲ）に溶かし、凍結乾燥機（ＬＧＪ－１００Ｆ、ＣＮ）で５日間凍結乾燥した。凍結乾燥されたナノ粒子パウダーを脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ（Ｂｉｏｎｅｅｒ、ＫＲ））１，４２９ｍｌに溶かして均質化し、これを本発明のための実験に使用した。
【0157】
３．２ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
【0158】
ＣＴＧＦの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡ発掘のためにヒト由来乳癌細胞株であるＭＤＡ－ＭＢ２３１を用いており、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏＴＭＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。上記と同一の培地を用いてＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞株を９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に２Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日に前記実施例３．１において脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１ＸＤＰＢＳで希釈し、細胞に２００ｎＭ又は６００ｎＭの濃度になるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で合計４回行い、３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。
【0159】
３．３ ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効能分析を通じたＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
【0160】
実施例３－２においてＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全体のＲＮＡを抽出することによってｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてＣＴＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0161】
ＣＴＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量分析のために、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標） Ｄｕａｌ－ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）の各ウェルにＣＴＧＦ正方向プライマー３００ｎＭ、ＣＴＧＦ逆方向プライマー３００ｎＭ、ＣＴＧＦプローブ３００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ正方向プライマー２００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａ逆方向プライマー２００ｎＭ、ＲＰＬ１３Ａプローブ３００ｎＭ、ＴＢＰ正方向プライマー４００ｎＭ、ＴＢＰ逆方向プライマー４００ｎＭ、ＴＢＰプローブ３００ｎＭが追加されて乾燥・製造された（表２）。製造されたキットの性能は、Ａ５４９細胞の全体のＲＮＡを用いて検量曲線を作成し、ＰＣＲ増幅効率（表３）に基づいて判定した。ＲＴ－ｑＰＣＲは、９５℃ １０分（９５℃ ５秒、５８℃ １５秒）ｘ４５サイクルの条件で反応し、各サイクルごとに蛍光値が検出されるプロトコルを使用した。
【0162】
ＳＡＭｉＲＮＡ処理された９６－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）は、全体のＲＮＡ抽出からＲＴ－ｑＰＣＲまで自動化装備であるＥｘｉＳｔａｔｉｏｎ ＨＴＴＭ（韓国）にＨＴ ＤＮＡ／ＲＮＡ抽出キット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）と、ＣＴＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ定量分析のためのプライマー及びプローブを含んで別途に製造されたＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標） Ｄｕａｌ－ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲＴ－ｑＰＣＲキット（Ｂｉｏｎｅｅｒ、Ｋｏｒｅａ）とを使用し、自動化プログラムによって全体のＲＮＡ抽出及びワンステップＲＴ－ｑＰＣＲが行われた。
【0163】
ｑＰＣＲアレイ後に導出される二つの遺伝子のＣｔ値に基づいて、２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ［Ｌｉｖａｋ ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．２００１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄａｔａ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ａｎｄ ｔｈｅ ２（－Ｄｅｌｔａ Ｄｅｌｔａ Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｄｅｃ；２５（４）：４０２－８］を通じて相対定量分析を行うことによって、対照群に比べて実験群であるＣＴＧＦ遺伝子のｍＲＮＡの相対的な量（％）を計算した。
【0164】
【表2】
【0165】
【表3】
【0166】
実施例４．ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦをターゲットにしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子スクリーニング
【0167】
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、対照群に比べて、２００ｎＭ又は６００ｎＭの最終濃度でのＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、減少効率が＞６０％以上である１６種の配列（合計４９種のＳＡＭｉＲＮＡ－ｈＣＴＧＦに対する２次スクリーニング結果）を肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株で５００ｎＭ及び１０００ｎＭの濃度で処理して行った。該当のＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は、下記の表４の通りである。
【0168】
その後、Ｒｘｉ－１０９（Ｓｅｎｓｅ：５’－ＧＣＡＣＣＵＵＵＣＵＡ＊Ｇ＊Ａ－ｃｈｏｌ－３’（配列番号５７）１３ｍｅｒ／ＡＳ：５’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＵＣＵＡＧＡＡＡＧＧＵＧＣ＊Ａ＊Ａ＊Ａ＊Ｃ＊Ａ＊Ｕ－３’（配列番号５８）１９ｍｅｒ／ボールド体＝２’ＯＭＥ／下線＝２’Ｆ／星印＝ホスホロチオエート／ｃｈｏｌ＝ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）（ＷＯ２００９／１０２４２７参照）に比べてＩＣ５０を確認するために低濃度まで処理した後、発現量の減少効果（Ｋｎｏｃｋ－ｄｏｗｎ）確認実験を進行するために、最も強力な配列８種に対する３次スクリーニングを肺癌細胞株であるＡ５４９細胞株で５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭの濃度で処理して行った。その結果、配列番号１、２、１０、１５の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡの４種を選別した。
【0169】
【0170】
【表4】
【0171】
実施例３で選別された配列番号１、２、１０、１５の配列を、それぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、前記細胞株でＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現様相を分析した。
【0172】
４．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
【0173】
ＣＴＧＦの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡ発掘のためにヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５ＴＭ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を用いており、Ａ５４９細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏＴＭＦ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。上記と同一の培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日に前記実施例３．１において脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１ＸＤＰＢＳで希釈し、細胞に５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭの濃度になるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で合計４回行い、３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。
【0174】
４．２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効能分析を通じたＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
【0175】
実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全体のＲＮＡを抽出することによってｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてＣＴＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0176】
４－２－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
【0177】
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例４－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標） ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭＣｙｃｌｅ ＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡに製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエペンドルプチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標） ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０（Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に、一つのチューブ当たりに抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これに、遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭＧｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーを混成化し、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させることによって増幅反応を終了した。
【0178】
４－２－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対定量分析
【0179】
実施例４－２－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にし、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じて、ＳＡＭｉＲＮＡコントロールサンプルに比べてＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的発現率を下記のような方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例４－２－１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌ、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ（韓国）２５μｌ、蒸留水１９μｌ、及びＣＴＧＦ ｑＰＣＲプライマー（配列番号７及び８（表５）；それぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）３μｌを入れることによって混合液を製造した。一方、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子にした。前記混合液が入っている９６－ウェルプレートに対して、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応することによって酵素を活性化し、ｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃での３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃での３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃での３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、及びＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４個の過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
【0180】
ＰＣＲが終了した後、それぞれ収得したターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値としては、ＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）（Ｓｅｎｓｅ：５’－ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ－３’（１９ｍｅｒ）（配列番号５９）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ：５’－ＵＣＧＡＡＧＵＡＣＵＣＡＧＣＧＵＡＡＧ－３’（１９ｍｅｒ）（配列番号６０））が処理された実験群を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。前記ΔＣｔ値と計算式２（－ΔＣｔ×１００）を用いてＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した。
【0181】
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、対照群に比べて、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、５００ｎＭ、１０００ｎＭの最終濃度でＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡ#１０を最終的に選別した。
【0182】
図３に示したように、ＣＴＧＦを標的にする８種のＳＡＭｉＲＮＡから、ＣＴＧＦ遺伝子発現を最も効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡ＃１０を最終的に選別し、前記細胞株でＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現様相を分析することによってＳＡＭｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認した。該当のＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は、下記の表６の通りである。
【0183】
その結果、配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡは、いずれも５０ｎＭの低濃度でも５０％以上のＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の減少を示し、非常に高効率でＣＴＧＦ発現を阻害する効果を示すことを確認した。ＩＣ５０は、配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡの場合、図４に示したように３０．７５ｎＭであると確認され、最も効果的にＣＴＧＦ遺伝子発現を阻害する効果を示すことを確認し、Ｒｘｉ－１０９ ＩＣ５０に比べても相対的にさらに優れた効果を確認した。
【0184】
【表5】
【0185】
【表6】
【0186】
実施例５．選別された配列番号１０の配列をセンス鎖として含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡによるヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦの発現抑制比較分析
【0187】
実施例４で選別された配列番号１０の配列をセンス鎖として有するＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを用いて肺癌細胞株であるＡ５４９に処理し、前記細胞株でＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を比較・分析した。
【0188】
５．１ ＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子の細胞内処理方法
【0189】
ＣＴＧＦの発現を抑制するＳＡＭｉＲＮＡ発掘のためにヒト由来肺癌細胞株であるＡ５４９を用いており、Ａ５４９細胞株は、１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳ）が含まれたＧｉｂｃｏＴＭＦ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（Ｔｈｅｒｍｏ、ＵＳ）を用いて３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。上記と同一の培地を用いてＡ５４９細胞株を１２－ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、ＵＳ）に８Ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で分注し、翌日に前記実施例３．１において脱塩蒸留水（ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）で均質化したＳＡＭｉＲＮＡを１ＸＤＰＢＳで希釈し、細胞に２００ｎＭ又は６００ｎＭになるように処理した。ＳＡＭｉＲＮＡの処理は、１２時間ごとに１回ずつ処理する条件で合計４回行い、３７℃及び５％ＣＯ２の条件で培養した。
【0190】
５．２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現抑制効能分析を通じたＳＡＭｉＲＮＡスクリーニング
【0191】
実施例５－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全体のＲＮＡを抽出することによってｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を用いてＣＴＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を相対定量した。
【0192】
５－２－１ ＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞からＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ製造
【0193】
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、前記実施例５－１でＳＡＭｉＲＮＡ処理された細胞株から全体のＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡに製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエペンドルプチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭ（韓国）に一つのチューブ当たりに抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れ、総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）処理された蒸留水を添加した。これに、遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅＴＭＧｒａｄｉｅｎｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３７℃で３０秒間ＲＮＡとプライマーを混成化し、４８℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を１２回繰り返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させることによって増幅反応を終了した。
【0194】
５－２－２ ヒト（Ｈｕｍａｎ）ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対定量分析
【0195】
実施例５－２－１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にし、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じて、ＳＡＭｉＲＮＡコントロールサンプルに比べてＣＴＧＦ ｍＲＮＡの相対的発現率を下記のような方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに前記実施例５－２－１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈し、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ ３μｌ、ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＴＭ（韓国）２５μｌ、蒸留水１９μｌ、及びＣＴＧＦ ｑＰＣＲプライマー（配列番号４４及び４５（表５）；それぞれ１０ｐｍｏｌｅ／μｌ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）３μｌを入れることによって混合液を製造した。一方、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの発現量を正規化するために、ハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子にした。前記混合液が入った９６－ウェルプレートに対して、ＥｘｉｃｙｃｌｅｒＴＭＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った：９５℃で１５分間反応することによって酵素を活性化し、ｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃での３０秒変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃での３０秒アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃での３０秒延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、及びＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ｓｃａｎ）の４個の過程を４２回繰り返して行い、７２℃で３分間最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持し、５５℃から９５℃までのメルティングカーブ（ｍｅｌｔｉｎｇ ｃｕｒｖｅ）を分析した。
【0196】
ＰＣＲが終了した後、それぞれ収得したターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値としては、ＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて補正されたターゲット遺伝子のＣｔ値を求めた後、遺伝子発現阻害を起こさないコントロール配列であるＳＡＭｉＲＮＡ（ＳＡＭｉＣＯＮＴ）が処理された実験群を対照群にしてΔ値の差を求めた。前記Δ値と計算式２（－Δ×１００）を用いてＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡが処理された細胞のターゲット遺伝子の発現量を相対定量した。
【0197】
二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのうち高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、対照群に比べて、２００ｎＭ、６００ｎＭの最終濃度でＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号１０のＤＮＡ配列をセンス鎖として有するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるＳＡＭｉＲＮＡを最終的に選別した。
【0198】
図５に示したように、最終的に選別されたＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、ＣＴＧＦ遺伝子発現を最も効果的に抑制するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ＃１０を最終的に選別した。
【0199】
実施例６．ラット（Ｒａｔ）ＣＴＧＦをターゲットにしてＲＮＡｉを誘導するＳＡＭｉＲＮＡナノ粒子のスクリーニング
【0200】
ｓｉＲＮＡ治療剤の場合、互いに異なる種（Ｓｔｒａｉｎ）に共通的に適用可能な最適な配列の発掘が難しい。この場合、治療効果を分析する動物モデル（ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ確認）特異的なｓｉＲＮＡ配列（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉＲＮＡ）をデザインし、該当の遺伝子の発現阻害による薬剤学的効能（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ）及び該当の遺伝子発現阻害による毒性部分を検証するように米ＦＤＡガイドラインが存在する（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｒｏｂｅｒｔ Ｔ．Ｄｏｒｓａｍ Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ／Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｅｒ、ＦＤＡ／ＣＤＥＲ）。
【0201】
既存のアルゴリズム基盤のｓｉＲＮＡデザインプログラム（自社が保有したＴｕｒｂｏ－ｓｉ－ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を通じてＳＡＭｉＲＮＡ基盤の配列発掘を進行した。ラットＣＴＧＦ遺伝子（ＮＭ＿０２２２６６．２）フルスクリプト配列を対象にして合計９４個の候補ｓｉＲＮＡ配列を生成し、該当のＳＡＭｉＲＮＡを合成した後、ラット肝癌由来Ｈ４－ＩＩ－Ｅ細胞株に１０％ＦＢＳが存在する細胞培養条件で５００ｎＭの濃度で処理し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現阻害効果を表８（ｑＰＣＲ用プライマー配列情報）のプライマーを用いて１次スクリーニングした。（図６）
【0202】
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、対照群に比べて、５００ｎＭの最終濃度でｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、減少効率が＞６０％以上である１２種の配列（合計９４種のＳＡＭｉＲＮＡ－ｒａｔＣＴＧＦ）に対する２次スクリーニングをラット肝癌細胞株であるＨ４－ＩＩ－Ｅ細胞株で２００ｎＭ、５００ｎＭの濃度で処理して行った。その結果、配列番号４６、４７、４８の配列をそれぞれセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡの３種を選別した。
【0203】
図６に示したように、ｒａｔＣＴＧＦを標的にする９４種のＳＡＭｉＲＮＡから、ｒａｔＣＴＧＦ遺伝子発現を最も効果的に抑制するＳＡＭｉＲＮＡの３種を最終的に選別（図８）し、該当のＳＡＭｉＲＮＡの配列情報は下記の表９の通りである。
【0204】
高効率のＳＡＭｉＲＮＡを選別するために、対照群に比べて、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの最終濃度でｒａｔＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量の減少効率が最も良い配列、すなわち、配列番号４６の配列をセンス鎖として有するＳＡＭｉＲＮＡ－ｒａｔＣＴＧＦ ＃４６を最終的に選別した。
【0205】
図８に示したように、ＩＣ５０は、配列番号４６の配列をセンス鎖として有するｒａｔＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡの場合、１２２．９ｎＭであると確認され、最も効果的にｒａｔＣＴＧＦ遺伝子発現を阻害する効果を示すことを確認した。
【0206】
また、図９に示したように、最終的に選別されたｒａｔＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド及びＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドから、ｒａｔＣＴＧＦ遺伝子発現を最も効果的に抑制するＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドＳＡＭｉＲＮＡ ＃４６を最終的に選別した。
【0207】
【表8】
【0208】
【表9】
【0209】
実施例７．創傷誘発ケロイド性動物モデルにおける皮内投与法によるＳＡＭｉＲＮＡ－ｒａｔＣＴＧＦの効能検証
【0210】
８ｍｍのバイオプシーパンチ（Ｂｉｏｐｓｙ ｐｕｎｃｈ、ＢＰ－８０Ｆ、Ｋａｉ、日本）で誘発した創傷に対して、ＳＡＭｉ－ｒＣＴＧＦの効能分析を実施した。実験のために、７週齢のラットを入手（ＳＤ Ｒａｔ、Ｎａｒａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、江南、大韓民国）して１週間馴化させた。８ｍｍのバイオプシーパンチを用いて背中皮膚に創傷を作った。陰性対照群に生理食塩液（ＰＢＳ）を投与した群、実験群にＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ＃４６ ＤＮＡ／ＲＮＡ（Ｄ／Ｒ）を投与した群、実験群にＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ ＃４６ ＲＮＡ／ＲＮＡ（Ｒ／Ｒ）を投与した群に、創傷を誘発する２日前及び創傷当日に１２００μｇ／ｓｉｔｅを皮内に合計２回投与した。創傷を誘発してから３日後にラットを犠牲させた。
【0211】
７－１．創傷誘発ケロイド性動物モデルにおけるＳＡＭｉＲＮＡに対する遺伝子発現分析
【0212】
ＳＡＭｉＲＮＡ処理されたネズミの皮膚組織を獲得し、液体窒素及び乳鉢を用いて１次粉砕した。粉砕された組織は、ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）の溶解バッファーに入れた後、ホモジナイザーで２次粉砕した。その後、製造社のマニュアルに従って全体のＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡは、ＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＲｏｃｋｅｔＳｃｒｉｐｔＴＭＲＴ Ｐｒｅｍｉｘ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡに製造した。
【0213】
【表10】
【0214】
製造されたｃＤＮＡを鋳型にし、ＳＹＢＲグリーン方式のリアルタイムｑＰＣＲを通じて各群の全体のｍＲＮＡの相対的発現率を下記のような方法で分析した。９６－ウェルプレートの各ウェルに製造されたｃＤＮＡを蒸留水で１０倍希釈し、ＣＴＧＦ ｍＲＮＡ発現量分析のために希釈されたｃＤＮＡ １０μｌ及びＡｃｃｕＰｏｗｅｒ（登録商標）ＧｒｅｅｎＳｔａｒＴＭ（韓国）２５μｌ、蒸留水２０μｌ、及びＣＴＧＦ ｑＰＣＲプライマー（それぞれ３ｐｍｏｌｅ／μｌ、表１１参照）５μｌを入れることによって混合液を製造した。一方、ＣＴＧＦ、フィブロネクチン及びＣｏｌ３α１ ｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ、以下、ＨＫ遺伝子）であるＲＰＬ１３Ａを標準遺伝子にした。ｑＰＣＲが終了した後、それぞれ収得したターゲット遺伝子のＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値としては、ＲＰＬ１３Ａ遺伝子を通じて補正されたターゲット遺伝子のΔＣｔ値を求めた後、各群を対照群と比較することによってΔΔＣｔ値を求めた。前記ΔΔＣｔ値と計算式２（－ΔΔＣｔ×１００）を用いてＣＴＧＦ、フィブロネクチン及びＣｏｌ３α１遺伝子の発現量を相対定量した。
【0215】
【表11】
【0216】
【表12】
【0217】
その結果、ＣＴＧＦの場合、創傷モデルに生理食塩液を処理した群に比べて、ＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ（Ｄ／Ｒ）１２００μｇを処理した群で有意性のある減少効果を確認した。また、ＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ（Ｒ／Ｒ）１２００μｇを処理した群に比べて、ＳＡＭｉＲＮＡ－ｒＣＴＧＦ（Ｄ／Ｒ）１２００μｇを処理した群で統計的に有意性のある減少効果を同時に確認した。
【0218】
すなわち、図１０に示したように、最終的に選別されたｒＣＴＧＦ特異的ＳＡＭｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに比べて、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドがＣＴＧＦ遺伝子発現を最も効果的に抑制する様相を確認した。
【0219】
以上では、本発明の内容の特定の部分を詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は好ましい実施様態に過ぎなく、これによって本発明の範囲が制限されないことは明白であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義されると言える。
【産業上の利用可能性】
【0220】
本発明に係るＣＴＧＦ特異的二重鎖オリゴヌクレオチドを含む二重鎖オリゴヌクレオチド構造体及びこれを有効成分として含む医薬組成物は、副作用なしで高い効率でＣＴＧＦの発現を抑制することができ、過度な線維化による疾病及び呼吸器疾患の予防及び治療において優れた効果を達成することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】