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特許7464812ミトコンドリアＤループ塩基配列を標識母系とする栽培漁業事業化法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-02
(45)【発行日】2024-04-10
(54)【発明の名称】ミトコンドリアＤループ塩基配列を標識母系とする栽培漁業事業化法
(51)【国際特許分類】
A01K 61/10 20170101AFI20240403BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20240403BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20240403BHJP
【ＦＩ】
A01K61/10
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
【請求項の数】
1
(21)【出願番号】P 2021189662
(22)【出願日】2021-11-22
(65)【公開番号】P2023076313
(43)【公開日】2023-06-01
【審査請求日】2021-11-25
(73)【特許権者】
【識別番号】508350889
【氏名又は名称】有限会社ジェノテックス
(72)【発明者】
【氏名】添田 栄一
【審査官】竹中 靖典
(56)【参考文献】
【文献】特開２０１０－１４８５０５（ＪＰ，Ａ）
【文献】中国特許出願公開第１１０１３５７２０（ＣＮ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ０１Ｋ ６１／００ － ６３／１０
Ｃ１２Ｑ １／６８６
Ｃ１２Ｑ １／６８６９
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
継代養殖した人工孵化種苗のミトコンドリア（ｍｔ）ＤループからＤＮＡ塩基配列を採集し、分子系統樹のホモロジー解析（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって母系特異的塩基配列別に分割し、標識放流後、該漁獲成魚個体及びその加工品のｍｔＤループ塩基配列が上記種苗の母系特異的塩基配列と一致し、分布密度と比例関係にある場合を種苗の母系多型遺伝子と同定し、その成魚として再生・確保する孵化放流による事業化法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
エビ、カニの甲殻類を含む水産魚介類のミトコンドリア（ｍｔ）Ｄループを母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成と分布による母系集団遺伝学を創設し、継代養殖で増幅した人工孵化種苗放流による栽培漁業の事業化のための調査技術分野。
【背景技術】
【0002】
激減する漁獲資源の再生・確保のために、１９７４年、栽培漁業法が制定された。全国の種苗養殖場では、海洋で漁獲した繁殖用親魚数百尾から数百万尾の人工孵化種苗を育成し放流しているが、人工孵化種苗の標識と漁獲成魚との識別ができず、事業化は停滞している。
【0003】
当初、養殖魚との形態的相違や物理的標識、あるいは耳石温度法によって識別していたが、分析精度、調査規模に限界があった。２１世紀初めから遺伝子解析技術が導入され、ゲノムＤＮＡやミトコンドリアによる制限酵素地図法（ＲＦＬＰ）やマイクロサテライト（ＭＳ）等のＤＮＡマーカーを用いた「ハプロタイプ」あるいは「親子識別」（非特許文献１－３）で、標識、識別を試みたが、ゲノム構造の複雑性、および遺伝子の多様性が障害となった。
【0004】
本発明者らは、近畿大学水産研究所で完全養殖した３代目太平洋クロマグロ、および８代目マダイの親子間、受精卵のｍｔＤループ塩基配列が一致し、継代遺伝することを発見し、「ミトコンドリアＤＮＡ可変領域塩基配列による水産魚介類の標識、および識別のための方法」として特許文献１を、マグロ属のｍｔＤループ多型と識別できる実例をもって漁獲量への貢献度を判定する方法として特許文献２を公開した。これらは、個体間の標識・識別法であり、数千万尾を対象とする漁獲資源の増減を推定する内容ではなかった。
【0005】
有明海沿岸のクルマエビ、ガザミの資源激減は深刻であり、このために沿岸４県は、２００９年から毎年、クルマエビ８５０万尾、及びガザミ３００万尾を放流し絶滅を食い止めたと推定しているが、事業化による回復の目度は立っていない（表１）。
【0006】
【表1】
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【文献】ジェノテックス（２００９）特許第４９５８０１号 「ミトコンドリアＤＮＡ可変領域塩基配列による水産魚介類の標識および識別のための方法」
【文献】ジェノテックス（２００９）特許第５７６７１４３号 「ミトコンドリアＤＮＡ可変領域塩基配列による水産魚介類の標識および識別のための方法」
【非特許文献】
【0008】
【文献】菅谷琢磨ら（２００１） 「クルマエビｍｔＤＮＡ調節領域のＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析によるハプロタイプの検出」、水産育種、３１巻、１１～１５頁
【文献】藤井徹生（２００６） 「開放性海域におけるヒラメ放流魚の移動および産卵群への加入過程の定量的評価」、水産総合研究センター報告、別冊５,１４３～１４６
【文献】水産総合研究センター報告（２００７）「ヒラメの見えない放流効果に迫る」、養殖、１２巻８１～８３頁
【文献】ジェノテックス(２００９)「ＤＮＡ識別商品」(商標登録第52277171号）
【文献】添田栄一(２０１７)「クロマグロ資源の再生・確保へ」養殖ビジネス８巻 ３９～４０頁
【文献】Davis,P., K. Byrne,J.David,S.Hetzel, N, Preston (1999)：The development and application of genetic markersfor the Kuruma prawn Penaeus japonicas Aquaculture 173巻 19-32頁.
【文献】Tamura, K. Dudley, J. Nei, M. ＆ Kumar(2007): Molecular Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) Software Version 4.0. Mol.Biol. Evol. 24巻, 1596-1599頁
【文献】Ling F., R. Niu, H. Hatakeyama, Y.Goto, T. Shibata ＆ M.Yoshida, ”ROS stimulate mitochondrial allele segregationtowards homoplasmy in human cells”, Molecular Biology of the Cell, doi:10.1091/mbc.E15-10-0690
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
激減する漁獲資源の再生・確保のために、孵化放流による栽培漁業の事業化課題を解決する。すなわち、養殖場で育成した人工孵化種苗のｍｔＤループを、標識母系とし放流後、漁獲採集した成魚のｍｔＤループを分子系統樹による母系集団遺伝学によって該種苗の成魚と選択・同定し、地域特産の天然魚として「ＤＮＡ識別商品」として再生・確保する。
【課題を解決するための手段】
【0010】
東日本大震災で自然発生した３６尾の抱卵ガザミ（図２）を採取し、ｍｔＤループの分子系統樹を構築した結果、同母系親子間のｍｔＤループは完全に一致していたが、異母系間の配列は３３の母系統に分離し、母系からゾエア幼生まで継代遺伝することを発見し、ｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、母系集団遺伝学を創設し、該種苗の「母系別加入量変動調査法」を発明とした。
【0011】
本調査法の実施試験のために、抱卵ガザミ４０尾のゾエア幼生と養殖クルマエビの孵化種苗のｍｔＤループを採取し、標識母系として放流し、漁獲成魚から収集したｍｔＤループを分子系統樹により母系多型遺伝子に分離・識別し、遺伝子構成の分布による「母系別加入量変動調査法」によって再生・確保する。なお、漁獲した母系多型遺伝子の大部分は、海洋での生存・再生率の低い野生地魚由来であり、とりわけ、消費圧力の強い魚種では世代を重ねる毎に分散し１尾以下の未漁獲魚となる事を発見した。
【発明の効果】
【0012】
母系多型遺伝子を継代養殖により選択育種し、再生・確保を事業化する。すなわち、消費予測量の継代種苗を大量調製し標識放流する。漁獲した成魚のｍｔＤループ配列を分子系統樹で野生地魚と識別し、継代種苗の成魚を地域特産天然魚として「ＤＮＡ識別商品」とし、栽培漁業の生産・流通基盤を確保し、受益者負担の事業化を樹立する。
で漁獲資源を維持する。
で漁獲資源を維持する。
【0013】
本発明に係る栽培漁業の事業化法は、抱卵ガザミ、クルマエビに人工孵化種苗に限定するものでない。海洋水産魚類のｍｔＤループ配列が、分子系統樹で数百～数千で分離し、数千の受精卵が均一の塩基配列で標識していることは、特許文献１、２等で明らかにしている。従って、他の魚種のｍｔＤループも、あらためて確認することなく栽培漁業の事業化調査法として本法を適用できる。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】天然クロマグロのｍｔＤループ多型配列の分布を示すグラフである。
【図2】那珂湊で入手した天然抱卵ガザミを示す写真である。
【図3】ガザミｍｔＤループ一塩基多型配列の分布を示すグラフである。
【図4】ミトコンドリアＤＮＡの複製と体細胞分配機構を示す説明図である。
【図5】抱卵ガザミ標識種苗の漁獲分布を示すグラフである。
【図6】クルマエビの親子を示す写真である。
【図7】漁獲クルマエビの母系別分布を示すグラフである。
【図8】継代養殖クルマエビの母系別分布を示すグラフである。
【図9】
抱卵ガザミ孵化種苗による再生・確保の事業化の流れを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0015】
≪１≫抱卵ガザミのｍｔＤループ配列と母系多型遺伝子
＜１－１：抱卵ガザミの人工孵化種苗＞
抱卵ガザミは１回に８０万～４５０万粒を産卵・孵化し、そのうち数十万尾を抱卵し海洋で脱皮するが（図２）、ほとんどがプランクトンとして捕食され死滅する。種苗養殖場では、１回に約４０尾の抱卵ガザミから脱皮した数百万尾の人工孵化種苗を作製し放流しているが、４０以下のｍｔＤループ配列で標識されていることを発見し、ｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学を導入し、孵化放流による栽培漁業に「母系別加入量変動調査法」を発明し、事業化課題を解決した。
＜１－１：抱卵ガザミの人工孵化種苗＞
抱卵ガザミは１回に８０万～４５０万粒を産卵・孵化し、そのうち数十万尾を抱卵し海洋で脱皮するが（図２）、ほとんどがプランクトンとして捕食され死滅する。種苗養殖場では、１回に約４０尾の抱卵ガザミから脱皮した数百万尾の人工孵化種苗を作製し放流しているが、４０以下のｍｔＤループ配列で標識されていることを発見し、ｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学を導入し、孵化放流による栽培漁業に「母系別加入量変動調査法」を発明し、事業化課題を解決した。
【0016】
＜１－２：遺伝子材料と解析方法＞
甲殻類を含む水産魚介類の筋肉を、プロテアーゼＫで５５℃、一晩溶解してＤＮＡを抽出し、フェノール処理をした後、ＮＬＳ／酢酸カリウムによってミトコンドリアＤＮＡを抽出する。PＣＲによるサイクル・シーケンスによってｍｔＤループ塩基配列（約１ｋｂ）を決め、分子系統樹（非特許文献７）により母系多型遺伝子を分離する。
甲殻類を含む水産魚介類の筋肉を、プロテアーゼＫで５５℃、一晩溶解してＤＮＡを抽出し、フェノール処理をした後、ＮＬＳ／酢酸カリウムによってミトコンドリアＤＮＡを抽出する。PＣＲによるサイクル・シーケンスによってｍｔＤループ塩基配列（約１ｋｂ）を決め、分子系統樹（非特許文献７）により母系多型遺伝子を分離する。
【0017】
＜１－３：ガザミのｍｔＤループ塩基配列決定法＞
１）エタノール保存された筋肉片からｍｔＤＮＡを抽出する。
２）プライマーＣｒａｂ１２ｓ-４及びＤ-ｄｒを用いてＰＣＲ増幅を行う。
３）プライマーＣｒａｂ１２ｓ-５を用いサイクル・シーケンスでｍｔＤループを読み取る。
４）分子系統樹からｍｔＤループ塩基配列を抽出し、標識母系とする。
PCRプライマーの塩基配列は、
Crab12s-4 5'-GACAAGACTAAACCACCG-3'
D-dr 5'-GCTACCCTTTTAAATCAGGCAC-3'
Crab12s-5 5'-CCGCGACTGCTGGCACAATATT-3'
１）エタノール保存された筋肉片からｍｔＤＮＡを抽出する。
２）プライマーＣｒａｂ１２ｓ-４及びＤ-ｄｒを用いてＰＣＲ増幅を行う。
３）プライマーＣｒａｂ１２ｓ-５を用いサイクル・シーケンスでｍｔＤループを読み取る。
４）分子系統樹からｍｔＤループ塩基配列を抽出し、標識母系とする。
PCRプライマーの塩基配列は、
Crab12s-4 5'-GACAAGACTAAACCACCG-3'
D-dr 5'-GCTACCCTTTTAAATCAGGCAC-3'
Crab12s-5 5'-CCGCGACTGCTGGCACAATATT-3'
【0018】
＜１―４：抱卵ガザミのｍｔＤループ配列＞
東日本大震災で自然発生し那珂湊で捕獲した抱卵ガザミ３６尾のｍｔＤループ塩基配列（約１ｋｂ）を決定し、分子系統樹を構築した結果、同母系親子間の配列は完全に一致したが、異母系間のｍｔＤループ配列は異なり、３３の母系統に分れたが、同母系からガザミ幼生までで継代遺伝していることを発見した。
東日本大震災で自然発生し那珂湊で捕獲した抱卵ガザミ３６尾のｍｔＤループ塩基配列（約１ｋｂ）を決定し、分子系統樹を構築した結果、同母系親子間の配列は完全に一致したが、異母系間のｍｔＤループ配列は異なり、３３の母系統に分れたが、同母系からガザミ幼生までで継代遺伝していることを発見した。
【0019】
＜１－５：ｍｔＤループの遺伝子構造と機能（図３）＞
中国上海ガザミ４３尾を加えた計７９尾のｍｔＤループ塩基配列を整列化し、相同解析をした結果、約千塩基配列に長さの異なるＡＴ反復配列（～３０ｂｐ）と２１１部位に一塩基多型配列（ＳＮＰ）クラスターが２箇所あり、分子系統樹で７５系統に分離した。ただし、ＳＮＰクラスター間に連続した制限酵素EcoT22-I切断部位、１１塩基の共通配列が見られ（図３）、体細胞遺伝の開始とローリングサークルによるｍｔＤＮＡのθ型複製と長鎖ＤＮＡの切断と分配のための異母系間での共通遺伝子機能と想定した。
中国上海ガザミ４３尾を加えた計７９尾のｍｔＤループ塩基配列を整列化し、相同解析をした結果、約千塩基配列に長さの異なるＡＴ反復配列（～３０ｂｐ）と２１１部位に一塩基多型配列（ＳＮＰ）クラスターが２箇所あり、分子系統樹で７５系統に分離した。ただし、ＳＮＰクラスター間に連続した制限酵素EcoT22-I切断部位、１１塩基の共通配列が見られ（図３）、体細胞遺伝の開始とローリングサークルによるｍｔＤＮＡのθ型複製と長鎖ＤＮＡの切断と分配のための異母系間での共通遺伝子機能と想定した。
【0020】
＜１－６：ｍｔＤループによる個体識別から母系識別へ＞
特許文献１および２では、完全養殖した人工孵化種苗のｍｔＤループが母系特異的配列で標識され、放流後、漁獲した成魚、あるいはその加工品のｍｔＤループ配列と一致した場合を、該種苗の後代とし個体識別を行なったが、数百万～数千万尾の栽培漁業の事業化は困難である。このために個体識別から母系識別へ転換し、継代養殖によって母系多型遺伝子を選択育種し、増殖による栽培漁業の事業化法を発明した。
特許文献１および２では、完全養殖した人工孵化種苗のｍｔＤループが母系特異的配列で標識され、放流後、漁獲した成魚、あるいはその加工品のｍｔＤループ配列と一致した場合を、該種苗の後代とし個体識別を行なったが、数百万～数千万尾の栽培漁業の事業化は困難である。このために個体識別から母系識別へ転換し、継代養殖によって母系多型遺伝子を選択育種し、増殖による栽培漁業の事業化法を発明した。
【0021】
≪２≫ｍｔＤループ塩基配列と母系多型遺伝
海洋で捕獲された４０尾の抱卵ガザミから１６０万尾の人工孵化種苗を作製し、モニタリングで採取した３６尾のｍｔＤループから分子系統樹で２６の塩基配列を分離し標識母系とした。放流半年後、漁獲収集した３１４尾のガザミのｍｔＤループを分子系統樹で分離し、標識母系２０に１６１尾を非標識母系７６に１５３尾を検出した（表２）。ただし、非標識には標識漏れがあり標識母系から補正すると、人工孵化種苗の母系３９で２４０尾を、非標識母系６５で７４尾の野生地魚を漁獲し、標識種苗の７６．４％の漁獲成魚により母系多型遺伝子の証明とした。なお、表２の母系別漁獲数は、（同母系漁獲数）×（標識母系）＝（標識母系漁獲数）、及び（同母系漁獲数）×（非標識母系）＝（非標識母系漁獲数）で算出した。
海洋で捕獲された４０尾の抱卵ガザミから１６０万尾の人工孵化種苗を作製し、モニタリングで採取した３６尾のｍｔＤループから分子系統樹で２６の塩基配列を分離し標識母系とした。放流半年後、漁獲収集した３１４尾のガザミのｍｔＤループを分子系統樹で分離し、標識母系２０に１６１尾を非標識母系７６に１５３尾を検出した（表２）。ただし、非標識には標識漏れがあり標識母系から補正すると、人工孵化種苗の母系３９で２４０尾を、非標識母系６５で７４尾の野生地魚を漁獲し、標識種苗の７６．４％の漁獲成魚により母系多型遺伝子の証明とした。なお、表２の母系別漁獲数は、（同母系漁獲数）×（標識母系）＝（標識母系漁獲数）、及び（同母系漁獲数）×（非標識母系）＝（非標識母系漁獲数）で算出した。
【0022】
【表2】
【0023】
＜２－１：抱卵ガザミ種苗の漁獲分布＞
漁獲採集した抱卵ガザミ種苗のｍｔＤループを分子系統樹で標識、および非標識母系に分け、母系多型遺伝子別に分配すれば、野生ガザミとの生存率の差によって母系別加入量変動調査ができる。表２の同母系漁獲１～４０尾を横軸に、同母系漁獲数の積算を縦軸に棒グラフにすると（図５）、非標識母系７６の同母系漁獲数（□棒）は急降下するが、標識種苗の母系２０の同母系漁獲数（■棒）は、種苗養殖場での母系多型遺伝子の増幅再生率によって右肩上がりとなる。なお、同母系漁獲４０尾は４尾で標識し、継代養殖による増幅が認められる。
漁獲採集した抱卵ガザミ種苗のｍｔＤループを分子系統樹で標識、および非標識母系に分け、母系多型遺伝子別に分配すれば、野生ガザミとの生存率の差によって母系別加入量変動調査ができる。表２の同母系漁獲１～４０尾を横軸に、同母系漁獲数の積算を縦軸に棒グラフにすると（図５）、非標識母系７６の同母系漁獲数（□棒）は急降下するが、標識種苗の母系２０の同母系漁獲数（■棒）は、種苗養殖場での母系多型遺伝子の増幅再生率によって右肩上がりとなる。なお、同母系漁獲４０尾は４尾で標識し、継代養殖による増幅が認められる。
【0024】
＜２－２：抱卵ガザミ事業化調査＞
標識母系漁獲率：２０/２６＝７７％
種苗漁獲（補正）率：（１６１＋７９）/３１４＝７６.４％
１６０万×０.７７×０.７６４×４９８＝４.７億円（１尾当り粗利益；５００－２≒４９８円）
標識母系漁獲率：２０/２６＝７７％
種苗漁獲（補正）率：（１６１＋７９）/３１４＝７６.４％
１６０万×０.７７×０.７６４×４９８＝４.７億円（１尾当り粗利益；５００－２≒４９８円）
【0025】
≪３≫クルマエビ母系別加入量変動調査法
＜３－１：栽培漁業の実施試験＞
クルマエビは１回の産卵で70～100万尾が孵化するが、海洋ではほとんどがプランクトンとして死滅する。 種苗養殖場では、海洋で捕獲した繁殖用親エビ数百尾が産卵し、育成した人工孵化種苗として数百万尾を放流し、資源の再生・確保を試みているが、種苗の標識と漁獲成魚の識別法がなく、栽培漁業の評価は定まっていない（表１）。
＜３－１：栽培漁業の実施試験＞
クルマエビは１回の産卵で70～100万尾が孵化するが、海洋ではほとんどがプランクトンとして死滅する。 種苗養殖場では、海洋で捕獲した繁殖用親エビ数百尾が産卵し、育成した人工孵化種苗として数百万尾を放流し、資源の再生・確保を試みているが、種苗の標識と漁獲成魚の識別法がなく、栽培漁業の評価は定まっていない（表１）。
【0026】
＜３－２：試験材料・方法＞
１）エタノール保存された筋肉片（体細胞）からＤＮＡを抽出。
２）下記プライマーＦ２及びＰＪＣＲｒ-Ｔを用いたＰＣＲでｍｔＤＮＡを増幅する。
３）サイクル・シーケンス反応には、プライマーＦ３を用いてｍｔＤループ塩基配列を読み取る。
４）クルマエビ人工孵化種苗１，７００万尾からｍｔＤループ配列を採集し、標識母系とし放流後、漁獲収集した標識母系を分子系統樹で分離し、母系別加入量変動調査法で事業化調査をする。
プライマーの塩基配列
F2：5'-AAAATGAAAGAATAAGCCAGGATAA-3'
PJCRr-T：5‘-AGTTTTGATCTTTGGGGTAATGGTG-3'
F3：5'-GAAAGAATAAGCCAGGATAA-3’
１）エタノール保存された筋肉片（体細胞）からＤＮＡを抽出。
２）下記プライマーＦ２及びＰＪＣＲｒ-Ｔを用いたＰＣＲでｍｔＤＮＡを増幅する。
３）サイクル・シーケンス反応には、プライマーＦ３を用いてｍｔＤループ塩基配列を読み取る。
４）クルマエビ人工孵化種苗１，７００万尾からｍｔＤループ配列を採集し、標識母系とし放流後、漁獲収集した標識母系を分子系統樹で分離し、母系別加入量変動調査法で事業化調査をする。
プライマーの塩基配列
F2：5'-AAAATGAAAGAATAAGCCAGGATAA-3'
PJCRr-T：5‘-AGTTTTGATCTTTGGGGTAATGGTG-3'
F3：5'-GAAAGAATAAGCCAGGATAA-3’
【0027】
＜３－３：母系別加入量変動調査＞
繁殖用親エビ数百尾から育成した人工孵化種苗１，７００万尾から１，１５９尾を採取し、分子系統樹でｍｔＤループを４７３の標識母系に分離し（標識母系当り平均２．４５尾）有明海に放流した。半年後、漁獲採集した９，６２３尾のｍｔＤループを分子系統樹で解析し、その内１，２５２尾を標識母系２１５（漁獲母系当たり平均５．８２尾）に、残り８，３７１尾に非標識母系５，９５５（漁獲母系当り１．４２尾）に分離し、同母系多型遺伝子別に漁獲尾数を積算し、母系遺伝子の分布を調べた（表３、表４）。
繁殖用親エビ数百尾から育成した人工孵化種苗１，７００万尾から１，１５９尾を採取し、分子系統樹でｍｔＤループを４７３の標識母系に分離し（標識母系当り平均２．４５尾）有明海に放流した。半年後、漁獲採集した９，６２３尾のｍｔＤループを分子系統樹で解析し、その内１，２５２尾を標識母系２１５（漁獲母系当たり平均５．８２尾）に、残り８，３７１尾に非標識母系５，９５５（漁獲母系当り１．４２尾）に分離し、同母系多型遺伝子別に漁獲尾数を積算し、母系遺伝子の分布を調べた（表３、表４）。
【表3】
【0028】
【表4】
【0029】
＜３－４：漁獲成魚の母系多型遺伝子分布＞
表３の上段の同母系漁獲１～４尾は、人工孵化種苗２３９尾の標識母系１８２を放流し３２８尾を漁獲したが、母系分布は平均１．８０尾で生産性は低い。残り漁獲エビ７，４４０尾には非標識母系５，７７８があり、母系遺伝子当り平均１．２９尾であるが、大部分は野生地エビであるが、再生率の低さによって次世代では１尾以下となる。
同表中段の同母系漁獲５～１９尾は、人工孵化種苗７９尾による標識種苗２４で１６８尾を漁獲した。非標識母系１３７に９３１尾があり、母系当り平均７尾対６．８尾であり、人工種苗の標識漏れとし補正した。
同表下段の同母系漁獲２９～１２９尾は、種苗５６３尾を９母系多型遺伝子で標識し（標識６２．６尾／母系）、放流後７５６尾（漁獲８４尾／母系）を漁獲回収した。非標識ないことから継代養殖によって母系多型遺伝子４７３が９母系に選択育種されたことを示す。
表３の上段の同母系漁獲１～４尾は、人工孵化種苗２３９尾の標識母系１８２を放流し３２８尾を漁獲したが、母系分布は平均１．８０尾で生産性は低い。残り漁獲エビ７，４４０尾には非標識母系５，７７８があり、母系遺伝子当り平均１．２９尾であるが、大部分は野生地エビであるが、再生率の低さによって次世代では１尾以下となる。
同表中段の同母系漁獲５～１９尾は、人工孵化種苗７９尾による標識種苗２４で１６８尾を漁獲した。非標識母系１３７に９３１尾があり、母系当り平均７尾対６．８尾であり、人工種苗の標識漏れとし補正した。
同表下段の同母系漁獲２９～１２９尾は、種苗５６３尾を９母系多型遺伝子で標識し（標識６２．６尾／母系）、放流後７５６尾（漁獲８４尾／母系）を漁獲回収した。非標識ないことから継代養殖によって母系多型遺伝子４７３が９母系に選択育種されたことを示す。
【0030】
＜３－５：栽培漁業事業化調査＞
非標識母系の補正の結果、漁獲成魚の生産履歴は、野生地魚は７，７４０尾（１．２９尾/母系）、一般養殖は１，４２７尾（４．１６尾/母系）、継代養殖は７５６尾（８４尾／母系）に分離でき（表４）、海洋での生存漁獲率は（１，４７２＋７５６）／９，６０４＝２２．７％となる。クルマエビ種苗１尾を２円、漁獲成魚１尾を700円とすると、粗収入は７００－２＝６９８円となる。
１）標識母系漁獲率：（４７３－２５８）／４７３＝４５％（７６５万尾）
２）母系漁獲（補正）率：（１，２５２＋９３１）／９，６０４＝２２．７％(１７３万尾)
３）事業粗収入：１７３万尾×６９８円＝１２億円
非標識母系の補正の結果、漁獲成魚の生産履歴は、野生地魚は７，７４０尾（１．２９尾/母系）、一般養殖は１，４２７尾（４．１６尾/母系）、継代養殖は７５６尾（８４尾／母系）に分離でき（表４）、海洋での生存漁獲率は（１，４７２＋７５６）／９，６０４＝２２．７％となる。クルマエビ種苗１尾を２円、漁獲成魚１尾を700円とすると、粗収入は７００－２＝６９８円となる。
１）標識母系漁獲率：（４７３－２５８）／４７３＝４５％（７６５万尾）
２）母系漁獲（補正）率：（１，２５２＋９３１）／９，６０４＝２２．７％(１７３万尾)
３）事業粗収入：１７３万尾×６９８円＝１２億円
【0031】
＜３－６：「一世代回収型」の栽培漁業の事業化＞
表３の同母系遺伝子漁獲数１～１２９尾までを横軸に、同母系漁獲数の積算を縦軸の棒グラフにした（図７－１）。非標識同母系（■棒）は、海洋での孵化再生率、生存率が低いために急激に減少し、L字型の分布となる。同母系標識数（□棒）特に５尾以上は、養殖場での増殖率と海洋での生存率が高く、栽培漁業に適応した母系多型遺伝子では右肩上がりにＶ字型となり、野生地エビと識別できる（図７－２）。このことは、漁獲制限や放流種苗を海洋で再生する「資源増殖型」は、消費圧力が強い現状では絶滅の運命にある。ただし、継代養殖による選択育種による「一世代回収型」の栽培漁業の事業化によって、資源の再生・確保の可能性はある。
表３の同母系遺伝子漁獲数１～１２９尾までを横軸に、同母系漁獲数の積算を縦軸の棒グラフにした（図７－１）。非標識同母系（■棒）は、海洋での孵化再生率、生存率が低いために急激に減少し、L字型の分布となる。同母系標識数（□棒）特に５尾以上は、養殖場での増殖率と海洋での生存率が高く、栽培漁業に適応した母系多型遺伝子では右肩上がりにＶ字型となり、野生地エビと識別できる（図７－２）。このことは、漁獲制限や放流種苗を海洋で再生する「資源増殖型」は、消費圧力が強い現状では絶滅の運命にある。ただし、継代養殖による選択育種による「一世代回収型」の栽培漁業の事業化によって、資源の再生・確保の可能性はある。
【0032】
≪４≫継代養殖によるクルマエビの選択育種
＜４－１:母系多型遺伝子の減縮と増幅＞
継代養殖によるクルマエビ人工孵化種苗８５０万尾から採取した１，２０９尾のｍｔＤループを２９９の塩基配列に分離し（標識４．０４尾/母系）、標識母系として有明海に放流した。半年後、漁獲採集した５，６６０尾のｍｔＤループ配列を決め、その内１，４５２尾を標識母系１６０に（漁獲９．０８尾／母系）に、残り４，２０８尾を非標識母系３，１２３（漁獲１．３５尾／母系）を分子系統樹で分離し、さらに母系多型遺伝子別に分配した（表５）。遺伝子構成の分布から漁獲エビの生産起源を、海洋再生、１世代養殖、継代養殖型に分離した（表６）。
＜４－１:母系多型遺伝子の減縮と増幅＞
継代養殖によるクルマエビ人工孵化種苗８５０万尾から採取した１，２０９尾のｍｔＤループを２９９の塩基配列に分離し（標識４．０４尾/母系）、標識母系として有明海に放流した。半年後、漁獲採集した５，６６０尾のｍｔＤループ配列を決め、その内１，４５２尾を標識母系１６０に（漁獲９．０８尾／母系）に、残り４，２０８尾を非標識母系３，１２３（漁獲１．３５尾／母系）を分子系統樹で分離し、さらに母系多型遺伝子別に分配した（表５）。遺伝子構成の分布から漁獲エビの生産起源を、海洋再生、１世代養殖、継代養殖型に分離した（表６）。
【0033】
【表5】
【0034】
【表6】
【0035】
＜４－２：継代種苗の母系別加入量変動調査＞
表５および表６は、同母系多型遺伝子別に漁獲尾数を積算し、母系の分布を調べた。表５の下段の同母系漁獲９０～３７８尾は、継代種苗７９８尾で６母系多型遺伝子を標識し（標識１３３尾／母系）、放流後、１,０６６尾を漁獲し母系多型遺伝子別に分配した（漁獲１７８尾/母系）。非標識漁獲エビが１尾もない分布から継代種苗の成魚と同定しＤＮＡ識別商品とした。
表中段の同母系漁獲５～４５尾には、標識母系１７よる１３８尾の識別は（８．１１尾/母系）は、非標識母系４２を３１２尾と（７．６１尾/母系）と類似することから標識モレを含む一般養殖種苗とした。
表５上段の同母系漁獲１～４尾では、標識母系１３７で２４８尾を（１．８１尾／母系）、非標識母系３，０８２で３，８９６尾を漁獲したが（１．２６尾／母系）、ほとんどが再生産率の低い養殖、あるいは野生エビの母系多系遺伝子である。
表５および表６は、同母系多型遺伝子別に漁獲尾数を積算し、母系の分布を調べた。表５の下段の同母系漁獲９０～３７８尾は、継代種苗７９８尾で６母系多型遺伝子を標識し（標識１３３尾／母系）、放流後、１,０６６尾を漁獲し母系多型遺伝子別に分配した（漁獲１７８尾/母系）。非標識漁獲エビが１尾もない分布から継代種苗の成魚と同定しＤＮＡ識別商品とした。
表中段の同母系漁獲５～４５尾には、標識母系１７よる１３８尾の識別は（８．１１尾/母系）は、非標識母系４２を３１２尾と（７．６１尾/母系）と類似することから標識モレを含む一般養殖種苗とした。
表５上段の同母系漁獲１～４尾では、標識母系１３７で２４８尾を（１．８１尾／母系）、非標識母系３，０８２で３，８９６尾を漁獲したが（１．２６尾／母系）、ほとんどが再生産率の低い養殖、あるいは野生エビの母系多系遺伝子である。
【0036】
＜４－３：継代種苗の母系別調査＞
以上の標識モレを補正した結果、漁獲成魚５，６６０尾の生産履歴と漁獲尾数を、野生エビ３，８９６尾、養殖エビ４５０尾、継代養殖エビ１，０６６尾に分離し、継代養殖による栽培漁業の事業化効果を示した。
１）標識漁獲率：（２９９－１３９）／２９９＝５３．５％（検索数１，２０９尾）
２）種苗漁獲（補正）率：（１，０６６＋４５０）／５，６６０＝３１．２％（生存数：２６５万尾）
３）漁獲粗収入：８５０万×０．５３５×０．３１２×（７００－２）＝９，８億円：稚魚１尾を２円、漁獲活エビ１尾を７００円で販売。
以上の標識モレを補正した結果、漁獲成魚５，６６０尾の生産履歴と漁獲尾数を、野生エビ３，８９６尾、養殖エビ４５０尾、継代養殖エビ１，０６６尾に分離し、継代養殖による栽培漁業の事業化効果を示した。
１）標識漁獲率：（２９９－１３９）／２９９＝５３．５％（検索数１，２０９尾）
２）種苗漁獲（補正）率：（１，０６６＋４５０）／５，６６０＝３１．２％（生存数：２６５万尾）
３）漁獲粗収入：８５０万×０．５３５×０．３１２×（７００－２）＝９，８億円：稚魚１尾を２円、漁獲活エビ１尾を７００円で販売。
【0037】
＜４－４：一世代回収型の栽培漁業の事業化＞
表５の同母系漁獲１～３７８尾までを横軸に、同母系漁獲の積算数を縦軸に棒グラフにした（図８）。継代養殖により標識母系（■棒）の同母系漁獲数は多いが母系は少なく、逆に、非標識母系（□棒）では母系と漁獲数が多いためにＵ字型を示す。中央の凹みは両者を繋ぐ標識モレである。いずれの場合も、海洋での再生産率は低いために「資源増殖型」では激減し、漁獲エビは一尾以下に収斂するために、遺伝子多様性や生態系への影響は少ない。一方、継代養殖によって選択育種した母系多型遺伝子は、養殖場で必要量だけ生産でき、放流後「餌要らず、世話いらず」の自然力で成長し、生存率が高いために、「一世代回収型」の栽培漁業の事業化で地域特産天然の「ＤＮＡ標識商品」として確保できる。近海沿岸漁業を活性化し、排他的経済水域（ＥＥＺ）の実効支配ができる。
表５の同母系漁獲１～３７８尾までを横軸に、同母系漁獲の積算数を縦軸に棒グラフにした（図８）。継代養殖により標識母系（■棒）の同母系漁獲数は多いが母系は少なく、逆に、非標識母系（□棒）では母系と漁獲数が多いためにＵ字型を示す。中央の凹みは両者を繋ぐ標識モレである。いずれの場合も、海洋での再生産率は低いために「資源増殖型」では激減し、漁獲エビは一尾以下に収斂するために、遺伝子多様性や生態系への影響は少ない。一方、継代養殖によって選択育種した母系多型遺伝子は、養殖場で必要量だけ生産でき、放流後「餌要らず、世話いらず」の自然力で成長し、生存率が高いために、「一世代回収型」の栽培漁業の事業化で地域特産天然の「ＤＮＡ標識商品」として確保できる。近海沿岸漁業を活性化し、排他的経済水域（ＥＥＺ）の実効支配ができる。
【0038】
＜４－５：継代養殖による選択育種＞
表３の人工孵化種苗から接種し継代した表５の継代種苗の標識母系は４７３から２９９に減縮され、放流後、同母系漁獲数は平均５．８２尾から９．０８尾に上がった。特に、継代種苗８５０万尾から７９８尾で６母系多型遺伝子を標識し、放流後、１,０６６尾を漁獲確保したことは、継代養殖で選択育種と増幅で、放流後、効率よく漁獲確保した結果であり、地域特産の天然魚としてＤＮＡ識別商品に登録できる。他の水産魚介類のｍｔＤループ配列も数多く分離し、数十万尾を産卵・孵化することから、母系集団遺伝学が漁獲資源再生・確保のための原理となる。
表３の人工孵化種苗から接種し継代した表５の継代種苗の標識母系は４７３から２９９に減縮され、放流後、同母系漁獲数は平均５．８２尾から９．０８尾に上がった。特に、継代種苗８５０万尾から７９８尾で６母系多型遺伝子を標識し、放流後、１,０６６尾を漁獲確保したことは、継代養殖で選択育種と増幅で、放流後、効率よく漁獲確保した結果であり、地域特産の天然魚としてＤＮＡ識別商品に登録できる。他の水産魚介類のｍｔＤループ配列も数多く分離し、数十万尾を産卵・孵化することから、母系集団遺伝学が漁獲資源再生・確保のための原理となる。
【0039】
≪５≫発見・発明の要約と事業化課題の解決手段
＜５－１：発見・発明の要約＞
自然発生した抱卵ガザミ３６尾のｍｔＤループ塩基配列を分子系統樹で母系統３３に分離し、継代遺伝することを発見した。そこでｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、母系集団遺伝学を創設し、遺伝子構成の分布による「母系別加入量変動調査法」を発明し、栽培漁業の事業化調査法とした。その実施試験として継代養殖したクルマエビ種苗８５０万尾を有明海に放流し、漁獲採集した５，６６０尾の母系多型遺伝子３，２７７から、純化・増幅した６母系多型遺伝子で１，０６６尾を検出・識別し、母系集団遺伝学を栽培漁業の事業化調査法に組み入れた。
＜５－１：発見・発明の要約＞
自然発生した抱卵ガザミ３６尾のｍｔＤループ塩基配列を分子系統樹で母系統３３に分離し、継代遺伝することを発見した。そこでｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、母系集団遺伝学を創設し、遺伝子構成の分布による「母系別加入量変動調査法」を発明し、栽培漁業の事業化調査法とした。その実施試験として継代養殖したクルマエビ種苗８５０万尾を有明海に放流し、漁獲採集した５，６６０尾の母系多型遺伝子３，２７７から、純化・増幅した６母系多型遺伝子で１，０６６尾を検出・識別し、母系集団遺伝学を栽培漁業の事業化調査法に組み入れた。
【0040】
＜５－２：生産・流通基盤＞
継代養殖によって純化・増幅した母系多型遺伝子の遺伝子別の分布により種苗成魚を同定し、地域特産の天然魚とする「ＤＮＡ識別商品」を栽培漁業の生産・流通基盤とし、事業化課題を解決する。他の遺伝子同様
継代養殖によって純化・増幅した母系多型遺伝子の遺伝子別の分布により種苗成魚を同定し、地域特産の天然魚とする「ＤＮＡ識別商品」を栽培漁業の生産・流通基盤とし、事業化課題を解決する。他の遺伝子同様
【0041】
＜５－３：一世代回収型栽培漁業＞
継代養殖した人工孵化種苗の海洋での生存・成長率は高いが、再生率は低いために、生態環境への影響は少ない事を発見し、継代養殖で消費需要量だけの標識種苗を生産し、放流後、「一世代回収型」で成魚を漁獲確保することで生態系環境を維持する。
継代養殖した人工孵化種苗の海洋での生存・成長率は高いが、再生率は低いために、生態環境への影響は少ない事を発見し、継代養殖で消費需要量だけの標識種苗を生産し、放流後、「一世代回収型」で成魚を漁獲確保することで生態系環境を維持する。
【0042】
＜５－４：漁業権の課題解決＞
漁業権は漁「場」でなく漁「業」を排他的に営む権利であり、受益者負担を原則に漁獲資源、及び、生態系環境を維持する義務がある。継代養殖で選択育種した標識母系を漁獲成魚として回収し「ＤＮＡ識別商品」として地域特産の天然魚とすれば、密漁や密売を監視し、漁業権者あるいは地元漁業関係者の協力が得られ、日本の排他的経済水域（ＥＥＺ）を保全する。
漁業権は漁「場」でなく漁「業」を排他的に営む権利であり、受益者負担を原則に漁獲資源、及び、生態系環境を維持する義務がある。継代養殖で選択育種した標識母系を漁獲成魚として回収し「ＤＮＡ識別商品」として地域特産の天然魚とすれば、密漁や密売を監視し、漁業権者あるいは地元漁業関係者の協力が得られ、日本の排他的経済水域（ＥＥＺ）を保全する。
【0043】
≪６≫補足；特許文献１、２と本発明との比較
＜６－１：ミトコンドリア遺伝子の変異速度＞
細胞質ミトコンドリア遺伝子は核ゲノム遺伝子と比較して塩基置換速度が５～１０倍早いといわれる。ただし、細胞遺伝では核ゲノム１コピーが複製する間にミトコンドリアは数百コピーが複製するために、核、ミトコンドリアに共通するリボソーム遺伝子等で塩基置換速度の差を測定できた。一方、海洋水産類細胞間のｍｔＤループ配列は、数十以上の塩基配列が異なるために、分子遺伝学ではジャンク（ガラクタ）として処理されていた。今回、抱卵ガザミのｍｔＤループは異母系間で分離するが同母系親子間の塩基配列は一致し継代遺伝すること、ローリングサークルによる細胞質遺伝のための共通遺伝子構造や、クルマエビの継代養殖でｍｔＤループが母系多型遺伝子であり、母系集団遺伝学に従うことを実証し、突然変異を否定した。
＜６－１：ミトコンドリア遺伝子の変異速度＞
細胞質ミトコンドリア遺伝子は核ゲノム遺伝子と比較して塩基置換速度が５～１０倍早いといわれる。ただし、細胞遺伝では核ゲノム１コピーが複製する間にミトコンドリアは数百コピーが複製するために、核、ミトコンドリアに共通するリボソーム遺伝子等で塩基置換速度の差を測定できた。一方、海洋水産類細胞間のｍｔＤループ配列は、数十以上の塩基配列が異なるために、分子遺伝学ではジャンク（ガラクタ）として処理されていた。今回、抱卵ガザミのｍｔＤループは異母系間で分離するが同母系親子間の塩基配列は一致し継代遺伝すること、ローリングサークルによる細胞質遺伝のための共通遺伝子構造や、クルマエビの継代養殖でｍｔＤループが母系多型遺伝子であり、母系集団遺伝学に従うことを実証し、突然変異を否定した。
【0044】
＜６－２：特許文献１、２と本発明とに共通する技術＞
特許文献１、２の個体識別は他の遺伝子同様の塩基配列の相同性比較であり、本発明の母系識別と共通技術でない。
特許文献１、２の個体識別は他の遺伝子同様の塩基配列の相同性比較であり、本発明の母系識別と共通技術でない。
【0045】
＜６－３：特許文献１、２には無い本発明に特有の技術＞
特許文献１、２は完全養殖によるｍｔＤループ塩基配列による個体識別であり、本発明は継代養殖による母系識別であり、技術的に異なる。ｍｔＤループ配列を母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学の創設は、他の海洋漁獲資源にも適用できる生命遺伝学の共通原理の発見・発明である
特許文献１、２は完全養殖によるｍｔＤループ塩基配列による個体識別であり、本発明は継代養殖による母系識別であり、技術的に異なる。ｍｔＤループ配列を母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学の創設は、他の海洋漁獲資源にも適用できる生命遺伝学の共通原理の発見・発明である
【0046】
＜６－４：特許文献１、２の課題解決＞
特許文献１、２では、完全養殖による同母系ｍｔＤループ配列が均一、かつ継代遺伝すること証明し、個体識別による追跡調査、生態調査では役立った。しかし、元々海洋地魚を養殖し人工孵化種苗を海洋で育成し、個体識別によって漁獲成魚を識別することは、ゲノムＤＮＡによる「ハプロタイプ解析」「親子識別」を加えても解決できなかった。
特許文献１、２では、完全養殖による同母系ｍｔＤループ配列が均一、かつ継代遺伝すること証明し、個体識別による追跡調査、生態調査では役立った。しかし、元々海洋地魚を養殖し人工孵化種苗を海洋で育成し、個体識別によって漁獲成魚を識別することは、ゲノムＤＮＡによる「ハプロタイプ解析」「親子識別」を加えても解決できなかった。
【0047】
＜６－５：本発明による事業化課題の解決法＞
抱卵ガザミのｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学を創設した。ついで栽培漁業の事業化試験のために、継代養殖したクルマエビ人工孵化種苗８５０万尾のｍｔＤループ配列２９９を標識母系として有明海に放流した。その結果、漁獲採集した５，６６０尾のうち１，０６６尾に６母系多型遺伝子を検出し、選択育種したＤＮＡ識別商品と同定した。地域特産天然魚として栽培漁業の生産・流通基盤とすれば「一世代回収型」栽培漁業の事業化調査法として地元漁業従事者や漁業権者の合意が得られ課題は解決する。
抱卵ガザミのｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学を創設した。ついで栽培漁業の事業化試験のために、継代養殖したクルマエビ人工孵化種苗８５０万尾のｍｔＤループ配列２９９を標識母系として有明海に放流した。その結果、漁獲採集した５，６６０尾のうち１，０６６尾に６母系多型遺伝子を検出し、選択育種したＤＮＡ識別商品と同定した。地域特産天然魚として栽培漁業の生産・流通基盤とすれば「一世代回収型」栽培漁業の事業化調査法として地元漁業従事者や漁業権者の合意が得られ課題は解決する。
【0048】
＜６－６：漁獲資源の再生・確保＞
有明海でのガザミ、及びクルマエビ事業の実施形態を参照し、母系別加入量変動調査法の開発を行なったが、上記２魚種に限定するものでない。特許文献１、２、及び非特許文献５では、完全養殖したマダイ、本マグロのｍｔＤループを母系特異的塩基配列で標識し、放流後、漁獲した成魚との個体識別で生態調査等を行った。今回、漁獲資源の再生・確保のためにクルマエビ継代養殖による選択育種と母系識別により漁獲調査を行い、養殖場での再生産率と海洋での生存率の高い母系６種を選択したが、他の水産資源にも適用できる母系集団遺伝学による事業調査法である。
有明海でのガザミ、及びクルマエビ事業の実施形態を参照し、母系別加入量変動調査法の開発を行なったが、上記２魚種に限定するものでない。特許文献１、２、及び非特許文献５では、完全養殖したマダイ、本マグロのｍｔＤループを母系特異的塩基配列で標識し、放流後、漁獲した成魚との個体識別で生態調査等を行った。今回、漁獲資源の再生・確保のためにクルマエビ継代養殖による選択育種と母系識別により漁獲調査を行い、養殖場での再生産率と海洋での生存率の高い母系６種を選択したが、他の水産資源にも適用できる母系集団遺伝学による事業調査法である。
【0049】
≪７≫添付図の詳しい説明
＜図１＞クロマグロのミトコンドリア（ｍｔ）Ｄループの母系分布
図１の横軸に、太平洋クロマグロ(□棒)、および大西洋クロマグロ（■棒）の同母系漁獲数を、縦軸にその積算数を示す。完全養殖した太平洋クロマグロマは、１回の産卵で数百万尾の稚魚が孵化し、ｍｔＤループは同一塩基配列で標識されているが、同母系当たりの漁獲数は数尾である。２００９年冬、津軽海峡で漁獲した太平洋クロマグロ４０５尾、及び築地市場で入手した大西洋クロマグロ３５２尾のｍｔＤループ塩基配列を決め、分子系統樹でそれぞれ３９５、及び２９５の母系多型配列に分離した。母系当たりの平均漁獲数は、１.０３尾と１.１９尾である。なお、タイ、サバ、ブリ等漁獲資源のｍｔＤループからも多くの母系多型配列を分離した。
＜図１＞クロマグロのミトコンドリア（ｍｔ）Ｄループの母系分布
図１の横軸に、太平洋クロマグロ(□棒)、および大西洋クロマグロ（■棒）の同母系漁獲数を、縦軸にその積算数を示す。完全養殖した太平洋クロマグロマは、１回の産卵で数百万尾の稚魚が孵化し、ｍｔＤループは同一塩基配列で標識されているが、同母系当たりの漁獲数は数尾である。２００９年冬、津軽海峡で漁獲した太平洋クロマグロ４０５尾、及び築地市場で入手した大西洋クロマグロ３５２尾のｍｔＤループ塩基配列を決め、分子系統樹でそれぞれ３９５、及び２９５の母系多型配列に分離した。母系当たりの平均漁獲数は、１.０３尾と１.１９尾である。なお、タイ、サバ、ブリ等漁獲資源のｍｔＤループからも多くの母系多型配列を分離した。
【0050】
＜図２＞自然発生した抱卵ガザミと母系標識
ガザミは１回に８０万～４５０万粒を産卵し（黒デコ；図２）、このうち数十万尾がゾエア幼生として海洋で脱皮するが、ほとんどプランクトンとして捕食される。東北大震災で自然発生した抱卵ガザミ３６尾を那珂湊で入手し、同母系親子間のｍｔＤループは同一の塩基配列で標識していたが、異母系間の配列は分子系統樹で３３の系統に分離したが、継代遺伝することを発見し、母系多型遺伝子と定義した。
ガザミは１回に８０万～４５０万粒を産卵し（黒デコ；図２）、このうち数十万尾がゾエア幼生として海洋で脱皮するが、ほとんどプランクトンとして捕食される。東北大震災で自然発生した抱卵ガザミ３６尾を那珂湊で入手し、同母系親子間のｍｔＤループは同一の塩基配列で標識していたが、異母系間の配列は分子系統樹で３３の系統に分離したが、継代遺伝することを発見し、母系多型遺伝子と定義した。
【0051】
＜図３＞ガザミｍｔＤループ一塩基多型配列（ＳＮＰ）の分布図
那珂湊で入手した天然抱卵ガザミ３６尾に、中国上海産ガザミ４３尾を加え、７５の母系統に分離した。図３では、ｍｔＤループ塩基番号１,１３４を横軸に、７９尾から積算したＳＮＰ数を縦軸に示す。２１１部位にＳＮＰクラスターが２箇所、その間に長さの異なるＡＴ反復配列（～３０ｂｐ）が分散している。
ＳＮＰは通常、核のゲノムＤＮＡに１％以上、５００塩基に１回の頻度で現れる一塩基多型配列である。水産魚介類のｍｔＤループでは５塩基に１回以上のＳＮＰが現れ、意味不明（ジャンク）のＤＮＡとされていた。しかし、異母系間で配列が異なり安定的に維持されかつ継代遺伝することを発見し、ｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義した。
那珂湊で入手した天然抱卵ガザミ３６尾に、中国上海産ガザミ４３尾を加え、７５の母系統に分離した。図３では、ｍｔＤループ塩基番号１,１３４を横軸に、７９尾から積算したＳＮＰ数を縦軸に示す。２１１部位にＳＮＰクラスターが２箇所、その間に長さの異なるＡＴ反復配列（～３０ｂｐ）が分散している。
ＳＮＰは通常、核のゲノムＤＮＡに１％以上、５００塩基に１回の頻度で現れる一塩基多型配列である。水産魚介類のｍｔＤループでは５塩基に１回以上のＳＮＰが現れ、意味不明（ジャンク）のＤＮＡとされていた。しかし、異母系間で配列が異なり安定的に維持されかつ継代遺伝することを発見し、ｍｔＤループを母系多型遺伝子と定義した。
【0052】
＜図４＞ガザミのミトコンドリアＤＮＡ複製と体細胞分配機構
抱卵ガザミの同母系親子のｍｔＤループは、生殖細胞遺伝により同一塩基配列で標識されるが、ミトコンドリアＤＮＡ配列の両末端に分断されている。体細胞遺伝では環状化し、ローリング・サークルによるＤＮＡ複製が始まり、生成した長鎖ＤＮＡの切断によって、各体細胞に数百コピーが分配されるが、母親から子に継代遺伝する。図４は、ミトコンドリアＤＮＡの複製工程を示す図である。ｍｔＤループ配列のＳＮＰクラスター間に制限酵素EcoT22-1切断部位２ヶ所を含む１１の共通配列があり、ローリング・サークルの切り替え点となる。３重螺旋を形成した後、途中で合流し、２重螺旋２本のθ型を形成する。
抱卵ガザミの同母系親子のｍｔＤループは、生殖細胞遺伝により同一塩基配列で標識されるが、ミトコンドリアＤＮＡ配列の両末端に分断されている。体細胞遺伝では環状化し、ローリング・サークルによるＤＮＡ複製が始まり、生成した長鎖ＤＮＡの切断によって、各体細胞に数百コピーが分配されるが、母親から子に継代遺伝する。図４は、ミトコンドリアＤＮＡの複製工程を示す図である。ｍｔＤループ配列のＳＮＰクラスター間に制限酵素EcoT22-1切断部位２ヶ所を含む１１の共通配列があり、ローリング・サークルの切り替え点となる。３重螺旋を形成した後、途中で合流し、２重螺旋２本のθ型を形成する。
【0053】
＜図５＞抱卵ガザミ人工種苗漁獲成魚の母系遺伝子分布図
抱卵ガザミ４０尾から育成した１６０万尾の人工孵化種苗から３６尾を採取し、２６のｍｔＤループ多型を分離し、標識母系として有明海に放流した。半年後、漁獲採集した３１４尾からで１６１尾に２０の標識母系を、１５３尾に７０の非標識母系を分子系統樹で分離した。図５は同母系漁獲数を横軸に、漁獲数の積算を縦軸に作成した棒グラフである。標識魚（■棒）では同母系漁獲尾数は多いが母系は少ないために母系当たりの漁獲数は平均６.２尾となった。逆に、非標識魚では（□棒）同母系漁獲尾数は少ないが母系が多いために、母系当たりの漁獲数は平均１.６尾でＶ字型を示した。非標識母系には標識漏れも含まれ、標識母系の分布から補正すると、１６０万尾の人工孵化種苗の漁獲成魚は、３７の母系多型遺伝子で標識、識別される。
抱卵ガザミ４０尾から育成した１６０万尾の人工孵化種苗から３６尾を採取し、２６のｍｔＤループ多型を分離し、標識母系として有明海に放流した。半年後、漁獲採集した３１４尾からで１６１尾に２０の標識母系を、１５３尾に７０の非標識母系を分子系統樹で分離した。図５は同母系漁獲数を横軸に、漁獲数の積算を縦軸に作成した棒グラフである。標識魚（■棒）では同母系漁獲尾数は多いが母系は少ないために母系当たりの漁獲数は平均６.２尾となった。逆に、非標識魚では（□棒）同母系漁獲尾数は少ないが母系が多いために、母系当たりの漁獲数は平均１.６尾でＶ字型を示した。非標識母系には標識漏れも含まれ、標識母系の分布から補正すると、１６０万尾の人工孵化種苗の漁獲成魚は、３７の母系多型遺伝子で標識、識別される。
【0054】
＜図６＞クルマエビの親子を示す写真
クルマエビは一回の産卵で７０～１００万尾が孵化する。海洋ではプランクトンとしてほとんどが捕食される。有明海沿岸４県では、海洋で捕獲した数百尾の繁殖用親エビから毎年８５０万尾の稚エビ（３ｃｍ）を育成、人工孵化種苗として海洋に放流する。半年後に１６～２０cmのエビを漁獲し出荷している。
クルマエビは一回の産卵で７０～１００万尾が孵化する。海洋ではプランクトンとしてほとんどが捕食される。有明海沿岸４県では、海洋で捕獲した数百尾の繁殖用親エビから毎年８５０万尾の稚エビ（３ｃｍ）を育成、人工孵化種苗として海洋に放流する。半年後に１６～２０cmのエビを漁獲し出荷している。
【0055】
＜図７＞漁獲クルマエビの同母系遺伝子の分布
クルマエビ人工孵化種苗１,７００万尾を放流し、半年後、漁獲採取した９,６２３尾のうち１,２５２尾に２１５の標識母系を検出したが、残り８,３７２尾は５，９５５の非標識母系に分離した（表３、図７－１）。母系別に漁獲数の分布を示すと、非標識（□棒）の同母系漁獲４尾以下は急降下しＬ字型となる。その理由としては、海洋地エビの母系種は多いが海洋での生存率が低いので、母系当たりの漁獲分布が平均１．４尾と少ないと推測できる。ただし、拡大図７－２の同母系漁獲数５～１９尾における標識/非標識の比は平均７尾対６.８尾であり、標識漏れによる養殖種苗由来と推定した。なお、同母系漁獲数３２～１２９尾での標識/非標識の比は平均８４尾対０尾であり（表５）、継代養殖による種苗増幅と母系減縮の結果である（図７－２）。該漁獲量に対する種苗成魚の割合は２３％であった。
クルマエビ人工孵化種苗１,７００万尾を放流し、半年後、漁獲採取した９,６２３尾のうち１,２５２尾に２１５の標識母系を検出したが、残り８,３７２尾は５，９５５の非標識母系に分離した（表３、図７－１）。母系別に漁獲数の分布を示すと、非標識（□棒）の同母系漁獲４尾以下は急降下しＬ字型となる。その理由としては、海洋地エビの母系種は多いが海洋での生存率が低いので、母系当たりの漁獲分布が平均１．４尾と少ないと推測できる。ただし、拡大図７－２の同母系漁獲数５～１９尾における標識/非標識の比は平均７尾対６.８尾であり、標識漏れによる養殖種苗由来と推定した。なお、同母系漁獲数３２～１２９尾での標識/非標識の比は平均８４尾対０尾であり（表５）、継代養殖による種苗増幅と母系減縮の結果である（図７－２）。該漁獲量に対する種苗成魚の割合は２３％であった。
【0056】
＜図８＞継代養殖人工孵化種苗による栽培漁業
栽培漁業事業化では、人工孵化種苗の放流量と標識母系による漁獲成魚の確保が鍵となる。表５の継代養殖クルマエビ漁獲成魚の分布を標識（■棒）、および非標識（□棒）に分けた。非標識同母系漁獲数４尾以下は急降下するが、母系当たりの漁獲数１.２６尾は海洋地魚再生の分布であり、次世代では１尾以下の母系多型遺伝子に吸収される。ただし、同母系漁獲数５～４５尾は、１７の標識母系で１３８尾を、４２の非標識母系で３１２尾を検出した。その母系漁獲比は平均８.１１尾対７．６１尾であり、標識漏れと養殖再生エビの分布である。一方、同母系漁獲数６０～３７８尾の標識と非標識母系漁獲比は、１７８尾対０尾であり、海洋で漁獲できない人工孵化種苗の天然エビとしてＤＮＡ識別商品に同定した。その結果、生産履歴と漁獲尾数により人工種苗８５０万尾の内、海洋再生３,８９６尾、養殖再生３８６尾、継代養殖１,０６６尾を分離した。図７と比べ、４７３の母系が２９９に減縮し、漁獲量は２３％から３１.２％に増えた。
栽培漁業事業化では、人工孵化種苗の放流量と標識母系による漁獲成魚の確保が鍵となる。表５の継代養殖クルマエビ漁獲成魚の分布を標識（■棒）、および非標識（□棒）に分けた。非標識同母系漁獲数４尾以下は急降下するが、母系当たりの漁獲数１.２６尾は海洋地魚再生の分布であり、次世代では１尾以下の母系多型遺伝子に吸収される。ただし、同母系漁獲数５～４５尾は、１７の標識母系で１３８尾を、４２の非標識母系で３１２尾を検出した。その母系漁獲比は平均８.１１尾対７．６１尾であり、標識漏れと養殖再生エビの分布である。一方、同母系漁獲数６０～３７８尾の標識と非標識母系漁獲比は、１７８尾対０尾であり、海洋で漁獲できない人工孵化種苗の天然エビとしてＤＮＡ識別商品に同定した。その結果、生産履歴と漁獲尾数により人工種苗８５０万尾の内、海洋再生３,８９６尾、養殖再生３８６尾、継代養殖１,０６６尾を分離した。図７と比べ、４７３の母系が２９９に減縮し、漁獲量は２３％から３１.２％に増えた。
【0057】
≪８≫付記
以上、上記実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細については、当業者が理解し得るさまざまな変更を加えることができる。例えば、次のように表現してもよい。
以上、上記実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細については、当業者が理解し得るさまざまな変更を加えることができる。例えば、次のように表現してもよい。
【0058】
＜付記１＞水産魚介類のミトコンドリアＤＮＡのＤループ塩基配列を母系多型遺伝子と定義し、遺伝子構成の分布による母系集団遺伝学を人工孵化種苗による栽培漁業に導入する方法であって、
該水産魚介類の同母系親子間のＤループを同一塩基配列で標識し、異母系親子間の塩基配列とは一塩基多型のクラスター配列とＡＴ反復配列による分子系統樹解析で識別する方法。
該水産魚介類の同母系親子間のＤループを同一塩基配列で標識し、異母系親子間の塩基配列とは一塩基多型のクラスター配列とＡＴ反復配列による分子系統樹解析で識別する方法。
【0059】
＜付記２＞種苗養殖場で継代養殖した人工孵化種苗を標識母系として登録し、前記人工孵化種苗を放流後、成長した捕獲魚のＤループ塩基配列から分子系統樹解析で母系多型遺伝子を分離し、遺伝子構成の分布による母系別加入量変動調査法で、捕獲魚の生産履歴や漁獲高への貢献度を明らかにする付記１記載の方法。
【0060】
＜付記３＞水産魚介類を放流する事業の漁獲高への貢献度を判定する方法であって、
前記水産魚介類の雌親又は前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚、成魚若しくは種苗から採取されるミトコンドリアＤＮＡＤループの母系特異的塩基配列（第１の塩基配列）を決定し、
次いで、前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚又は成魚を放流し、
次いで、漁獲された前記水産魚介類から採取されるミトコンドリアＤＮＡＤループの母系特異的塩基配列（第２の塩基配列）を決定し、
次いで、漁獲された前記水産魚介類の総数に占める、前記第１の塩基配列と同じ前記第２の塩基配列を持つ前記水産魚介類の割合を求めることにより、前記漁獲高への貢献度を判定する、
ことを含む方法。
前記水産魚介類の雌親又は前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚、成魚若しくは種苗から採取されるミトコンドリアＤＮＡＤループの母系特異的塩基配列（第１の塩基配列）を決定し、
次いで、前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚又は成魚を放流し、
次いで、漁獲された前記水産魚介類から採取されるミトコンドリアＤＮＡＤループの母系特異的塩基配列（第２の塩基配列）を決定し、
次いで、漁獲された前記水産魚介類の総数に占める、前記第１の塩基配列と同じ前記第２の塩基配列を持つ前記水産魚介類の割合を求めることにより、前記漁獲高への貢献度を判定する、
ことを含む方法。
【0061】
＜付記４＞前記漁獲された前記水産魚介類の総数に占める、前記第１の塩基配列と同じ前記第２の塩基配列を持つ前記水産魚介類の割合を求める際に、
前記第１の塩基配列を母系特異的遺伝子、前記第２の塩基配列を母系多型遺伝子とし、分子系統樹解析に基づく母系集団遺伝学の母系別加入量変動調査によって、生産履歴を同定することを利用する、
付記３記載の方法。
前記第１の塩基配列を母系特異的遺伝子、前記第２の塩基配列を母系多型遺伝子とし、分子系統樹解析に基づく母系集団遺伝学の母系別加入量変動調査によって、生産履歴を同定することを利用する、
付記３記載の方法。
【0062】
＜付記５＞前記第１の塩基配列と前記第２の塩基配列とが同母系であることはホモプラスミーの母系特異的塩基配列で判定し、前記第１の塩基配列と前記第２の塩基配列とが異母系であることは一塩基多型クラスターと反復配列とに着目して分子系統樹解析で判定する、
付記４記載の方法。
付記４記載の方法。
【0063】
＜付記６＞前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚又は成魚を放流する際に、
前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚又は成魚をＤＮＡ識別商品として放流する、
付記４又は５記載の方法。
前記雌親に由来する受精卵、仔魚、稚魚又は成魚をＤＮＡ識別商品として放流する、
付記４又は５記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
