特許 7464921 ヘパロサンの製造方法及びヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-02

(45)【発行日】2024-04-10

(54)【発明の名称】ヘパロサンの製造方法及びヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/04 20060101AFI20240403BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 15/67 20060101ALI20240403BHJP

   C12N 15/69 20060101ALI20240403BHJP

【ＦＩ】

C12P19/04 C

C12N15/31 ZNA

C12N1/21

C12N15/67 Z

C12N15/69 Z

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2022560347

(86)(22)【出願日】2021-04-02

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-05-11

(86)【国際出願番号】 JP2021014335

(87)【国際公開番号】W WO2021201281

(87)【国際公開日】2021-10-07

【審査請求日】2022-09-30

(31)【優先権主張番号】PCT/JP2020/015384

(32)【優先日】2020-04-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】599161672

【氏名又は名称】レンセレイアー ポリテクニック インスティテュート

(73)【特許権者】

【識別番号】000149435

【氏名又は名称】株式会社大塚製薬工場

(73)【特許権者】

【識別番号】522388154

【氏名又は名称】キリンバイオマテリアル株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所

(72)【発明者】

【氏名】小峰 理乃

(72)【発明者】

【氏名】林 幹朗

【審査官】松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】Metabolic Engineering，2012年，Vol.14，p.521-527

【文献】PNAS，2013年，Vol.110， p.20753-20758

【文献】Carbohydrate research，2013年，Vol.378 ，p.35-44

【文献】Molecular Microbiology，2007年，Vol.65， p.1518-1533

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ １９／０４

Ｃ１２Ｎ １５／３１

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／６７

Ｃ１２Ｎ １５／６９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の（１）の遺伝子改変を有し、以下の（４）の遺伝子改変を有しておらず、かつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、ヘパロサンを培地中に生成させることを含む、ヘパロサンの製造方法。
（１）ｋｐｓＳ遺伝子の発現を非改変株と比較して上昇させる遺伝子改変
（４）ｋｐｓＣ遺伝子の発現を非改変株と比較して上昇させる遺伝子改変

【請求項2】

前記エシェリヒア属細菌が、さらに以下の（２）及び（３）の少なくとも一方の遺伝子改変を有する請求項１に記載のヘパロサンの製造方法。
（２）ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（３）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変

【請求項3】

前記（１）の前記遺伝子改変が、前記ｋｐｓＳ遺伝子の発現調節領域の改変及びコピー数を高めることの少なくとも一方である請求項１または２に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項4】

前記（２）の前記遺伝子改変が、前記ｋｆｉＡ、前記ｋｆｉＢ、前記ｋｆｉＣ及び前記ｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現調節領域の改変及び前記遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方である、請求項２または３に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項5】

前記（３）の前記遺伝子改変が、前記ｙｈｂＪ遺伝子の欠損である、請求項２～４のいずれか１項に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項6】

前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、請求項１～５のいずれか１項に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項7】

前記ｋｐｓＳ遺伝子が、配列番号３３に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３３に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項8】

前記ｋｆｉＡ遺伝子が、配列番号３４に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり、
前記ｋｆｉＢ遺伝子が、配列番号３５に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり、
前記ｋｆｉＣ遺伝子が、配列番号３６に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３６に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり、
前記ｋｆｉＤ遺伝子が、配列番号３７に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３７に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、請求項２～７のいずれか１項に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項9】

前記ｙｈｂＪ遺伝子が、配列番号３８に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３８位に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を低下させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、請求項２～８のいずれか１項に記載のヘパロサンの製造方法。

【請求項10】

ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、以下の（１）の遺伝子改変を有し、かつ以下の（４）の遺伝子改変を有していない、エシェリヒア属細菌。
（１）ｋｐｓＳ遺伝子の発現を非改変株と比較して上昇させる遺伝子改変
（４）ｋｐｓＣ遺伝子の発現を非改変株と比較して上昇させる遺伝子改変

【請求項11】

さらに以下の（２）及び（３）の少なくとも一方の遺伝子改変を有する、請求項１０に記載のエシェリヒア属細菌。
（２）ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（３）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はエシェリヒア属細菌を用い、該細菌の莢膜多糖であるＮ－アセチルヘパロサン（以下ヘパロサンと記載する）を発酵生産により製造する方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

硫酸化された多糖であるヘパリンは抗凝固薬であり、血栓閉塞症、播種性血管内凝固症候群の治療や人工透析、体外循環での凝固防止などに用いられる。工業的には、用いられるほとんどのヘパリンは豚の腸粘膜から抽出、精製される。

【0003】

２００８年に豚由来ヘパリンへの不純物混入を原因とする死亡事故が発生したことから、製造および品質が管理された非動物由来のヘパリン生産の研究開発が求められている。具体例としてグラム陰性の微生物の莢膜多糖であるヘパロサンを発酵生産して精製したものを化学的手法によりＮ－脱アセチル化、Ｎ－硫酸化し、その後および酵素的手法によりエピマー化及び硫酸化することで豚由来品と同等の構造、抗凝固活性を有するヘパリンを生産する（非特許文献１、２）。

【0004】

上記の方法において、基本構造となるヘパロサンはグルクロン酸（ＧｌｃＡ）とＮ－アセチルＤ－グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の二糖の繰り返し構造で構成される糖鎖である。ヘパロサンの生産には元々ヘパロサンの生産能を有するエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ５株を用いる方法（特許文献１、非特許文献１）、同じくヘパロサン生産能を有するエシェリヒア・コリ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株を用いる方法（非特許文献２）、および元々はヘパロサン生産能を持たないエシェリヒア・コリを用いる方法（特許文献４、非特許文献３、４）が報告されている。

【0005】

ヘパロサンはＧｒｏｕｐ ２莢膜多糖に分類され、エシェリヒア・コリ Ｋ５株でのヘパロサンの合成、輸送にはゲノム上でクラスターを形成しているＲｅｇｉｏｎ Ｉ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩＩの遺伝子群が関わっていることが知られている（非特許文献４）。

【0006】

これらの遺伝子群にコードされる蛋白質のうち、ＫｐｓＳ、ＫｐｓＣにより内膜のホスファチジルグリセロールに複数の３－ｄｅｏｘｙ－Ｄ－ｍａｎｎｏ－ｏｃｔｕｌｏｓｏｎｉｃ ａｃｉｄ（Ｋｄｏ）残基が転移され、さらに糖転移酵素ＫｆｉＡ、ＫｆｉＣにより前駆体糖ヌクレオチドが付加されることでヘパロサンの合成は進行するとされている（非特許文献５、６）。

【0007】

また、ＫｆｉＤは前駆体のＵＤＰ－ＧｌｃＡの合成、ＫｐｓＦ、ＫｐｓＵはＫｄｏリンカー合成の基質となるＣＭＰ－Ｋｄｏの合成に、ＫｐｓＭ、ＫｐｓＴ、ＫｐｓＥ、ＫｐｓＤは内膜上で合成されたヘパロサンの菌体外への輸送に関わっている（非特許文献６）。

【0008】

ヘパロサン生産能を持たないエシェリヒア・コリ ＢＬ２１株、Ｋ－１２株を宿主としてヘパロサン発酵を行う方法としては、当該宿主に、エシェリヒア・コリ Ｋ５株由来Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩのＫｆｉＡＢＣＤの遺伝子クラスターを導入する方法が知られている。また、ｒｆａＨ、ｎｕｓＧ、ｒｐｏＥなどヘパロサン生産を向上させる遺伝子が報告されている（特許文献４、非特許文献３、４）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0009】

【文献】日本国特許第５８３０４６４号公報

【文献】米国特許第８，７７１，９９５号明細書

【文献】国際公開第２０１８／０４８９７３号

【文献】米国特許第９，９７５，９２８号明細書

【非特許文献】

【0010】

【文献】Biotechnology and Bioengineering 107 (2010) 964-973

【文献】Applied Microbiology and Biotechnology 103 (2019) 6771-6782

【文献】Metabolic Engineering14(2012)521-527

【文献】Carbohydrate Research 360 (2012) 19-24

【文献】Proceedings of the National Academy of Sciences of USA 110(2013) 20753-20758

【文献】Carbohydrate Research 378 (2013) 35-44

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0011】

上記したように、製造および品質が管理された非動物由来のヘパリン生産の研究開発がなされているが、従来の製造方法は効率性が不十分である。一方、前記Ｒｅｇｉｏｎ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにコードされる各遺伝子がヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌のヘパロサン生産にどのような影響を与えるかはこれまで知られていない。

【0012】

したがって、本発明は、へパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌の遺伝子改変を行うことによりヘパロサンの生産能を向上させて、効率的なヘパロサンの製造方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本発明者らは、特定の遺伝子改変を有し、かつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌を用いることにより、ヘパロサンの生産効率が向上することを見出し、本発明を完成させた。

【0014】

すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の（１）の遺伝子改変を有し、かつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌を培地で培養し、ヘパロサンを培地中に生成させることを含む、ヘパロサンの製造方法。
（１）ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
２．前記エシェリヒア属細菌が、さらに以下の（２）及び（３）の少なくとも一方の遺伝子改変を有する前記１に記載のヘパロサンの製造方法。
（２）ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（３）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変
３．前記（１）の前記遺伝子改変が、前記ｋｐｓＳ遺伝子の発現調節領域の改変及びコピー数を高めることの少なくとも一方である前記１または２に記載のヘパロサンの製造方法。
４．前記（２）の前記遺伝子改変が、前記ｋｆｉＡ、前記ｋｆｉＢ、前記ｋｆｉＣ及び前記ｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現調節領域の改変及び前記遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方である、前記２または３に記載のヘパロサンの製造方法。
５．前記（３）の前記遺伝子改変が、前記ｙｈｂＪ遺伝子の欠損である、前記２～４のいずれか１に記載のヘパロサンの製造方法。
６．前記エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである、前記１～５のいずれか１に記載のヘパロサンの製造方法。
７．前記ｋｐｓＳ遺伝子が、配列番号３３に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３３に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、前記１～６のいずれか１に記載のヘパロサンの製造方法。
８．前記ｋｆｉＡ遺伝子が、配列番号３４に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり、
前記ｋｆｉＢ遺伝子が、配列番号３５に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり、
前記ｋｆｉＣ遺伝子が、配列番号３６に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３６に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡであり、
前記ｋｆｉＤ遺伝子が、配列番号３７に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３７に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、前記２～７のいずれか１に記載のヘパロサンの製造方法。
９．前記ｙｈｂＪ遺伝子が、配列番号３８に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３８に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を低下させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡである、前記２～８のいずれか１に記載のヘパロサンの製造方法。
１０．エシェリヒア属細菌が以下の（４）の遺伝子改変を有していない、前記１～９のいずれか１に記載のヘパロサンの製造方法。
（４）ｋｐｓＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
１１．ヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌であって、以下の（１）の遺伝子改変を有する、エシェリヒア属細菌。
（１）ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
１２．さらに以下の（２）及び（３）の少なくとも一方の遺伝子改変を有する、前記１１に記載のエシェリヒア属細菌。
（２）ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（３）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変
１３．エシェリヒア属細菌が以下の（４）の遺伝子改変を有していない、前記１１または１２に記載のエシェリヒア属細菌。
（４）ｋｐｓＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変

【発明の効果】

【0015】

本発明のヘパロサンの製造方法によれば、特定の遺伝子改変を有し、かつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌を用いることにより、優れた生産効率で非動物由来のヘパロサンを製造することができる。

【図面の簡単な説明】

【0016】

【図1】図１は、エシェリヒア・コリ Ｋ５株の染色体上のヘパロサン合成遺伝子クラスターの模式図を示す。

【図2】図２は、ヘパロサン生産に関わる酵素の模式図を示す。

【図3】図３は、ヘパロサンの生合成経路の模式図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0017】

以下、本明細書において使用される用語は特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。

【0018】

＜本発明の細菌＞
本発明のヘパロサンの製造方法は、以下の（１）の遺伝子改変を有し、かつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌（以下、本発明の細菌とも略す。）を用いる。
（１）ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変

【0019】

本発明の細菌は、さらに以下の（２）及び（３）の少なくとも一方の遺伝子改変を有することが好ましい。
（２）ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変
（３）ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変
したがって、前記エシェリヒア属細菌における遺伝子改変としては、前記（１）及び（２）、前記（１）及び（３）、前記（１）～（３）が挙げられる。

【0020】

本発明のエシェリヒア属細菌は、以下の（４）の遺伝子改変を有していないことが好ましい。
（４）ｋｐｓＣ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変

【0021】

エシェリヒア属細菌の一例として、エシェリヒア・コリ Ｋ５株の染色体上のヘパロサン合成遺伝子クラスターの模式図を図１に示す［J. Nzakizwanayo et al., PLOS ONE, (2015)］。また、ヘパロサン生産に関わる酵素の模式図を図２に示す。

【0022】

図１に示すように、ｋｐｓＳ遺伝子及びｋｐｓＣ遺伝子は、Ｒｅｇｉｏｎ Ｉ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩＩの遺伝子群のうち、Ｒｅｇｉｏｎ Ｉにコードされる遺伝子である。図２に示すように、ｋｐｓＳ及びｋｐｓＣは、ヘパロサン合成の開始に関与しており、ヘパロサン生産において、ｋｐｓＳはｋｐｓＣとともに、内膜のホスファチジルグリセロールに複数のＫｄｏリンカーを付加する役割を果たす。

【0023】

ｋｐｓＳ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｐｓＳ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｐｓＳ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｐｓＳ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｐｓＳ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５２６５９．１として登録されている。

【0024】

ｋｐｓＳ遺伝子としては、配列番号３３に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３３に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。

【0025】

図１に示すように、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤは、Ｒｅｇｉｏｎ Ｉ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩ、Ｒｅｇｉｏｎ ＩＩＩの遺伝子群のうち、ＲｅｇｉｏｎＩＩにコードされる遺伝子である。図２に示すように、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤは、ヘパロサンの合成に関与しており、糖を付加してヘパロサンを合成する役割を果たす。

【0026】

ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ５株のｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ又はｋｆｉＤ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。ｋｆｉＡはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５４７１１．１；ｋｆｉＢはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＥ５５８２４．１；ｋｆｉＣはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５４７０９．１；ｋｆｉＤはＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＣＡＡ５４７０８．１として登録されている。

【0027】

ｋｆｉＡ遺伝子としては、配列番号３４に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３４に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。

【0028】

ｋｆｉＢ遺伝子としては、配列番号３５に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３５に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。

【0029】

ｋｆｉＣ遺伝子としては、配列番号３６に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３６に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。

【0030】

ｋｆｉＤ遺伝子としては、配列番号３７に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３７に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を増大させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。

【0031】

図３にヘパロサンの生合成経路の模式図を示す。図３に示すように、ＧｌｍＳは、ヘパロサンの前駆体であるＵＤＰ－Ｎ－アセチルグルコサミン供給経路の第１酵素でありフルクトース－６－リン酸からグルコサミン－６－リン酸への反応を触媒する酵素である。ＹｈｂＪは、ＧｌｍＳをネガティブに制御する酵素である。

【0032】

ｙｈｂＪ遺伝子としては、エシェリヒア属由来のｙｈｂＪ遺伝子が好ましい。具体的には例えば、エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子が挙げられる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子の塩基配列及び該遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、公用のデータベースから取得できる。エシェリヒア・コリ Ｋ－１２株のｙｈｂＪ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＢＡＥ７７２４９．１として登録されている。

【0033】

ｙｈｂＪ遺伝子としては、配列番号３８に示す塩基配列を含むＤＮＡまたは、配列番号３８に示す塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含みかつヘパロサン生産能を有するエシェリヒア属細菌において発現量を低下させた際に同細菌のヘパロサン生産能を増大させる性質を有するＤＮＡが挙げられる。

【0034】

上記（１）～（３）における各遺伝子は、例えば、上記した各遺伝子の塩基配列を用いたＢＬＡＳＴ検索やＦＡＳＴＡ検索によって公開データベースから容易に取得することができる。また、各遺伝子のホモログは、例えば、細菌等の微生物の染色体を鋳型にして、これら公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより取得することができる。

【0035】

上記（１）～（３）における各遺伝子は、該遺伝子によりコードされるタンパク質の元の機能（例えば、活性や性質）が維持されている限り、該遺伝子のバリアントであってもよい。該遺伝子のバリアントによりコードされるタンパク質が元の機能を維持しているか否かは、具体的には例えば元の機能がヘパロサンの生産能を向上する機能である場合、該遺伝子のバリアントをヘパロサンの生産能を有するエシェリヒア属細菌に導入して、元の機能を有するか否かを確認できる。

【0036】

上記（１）～（３）における各遺伝子のバリアントは、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することによって取得することができる。また、上記（１）～（３）における各遺伝子のバリアントは、例えば、変異処理によっても取得され得る。

【0037】

上記（１）～（３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするものであってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１～５０個、１～４０個、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。

【0038】

上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ間で、極性アミノ酸である場合には、Ｇｌｎ、Ａｓｎ間で、塩基性アミノ酸である場合には、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ間で、酸性アミノ酸である場合には、Ａｓｐ、Ｇｌｕ間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、ＡｌａからＳｅｒ又はＴｈｒへの置換、ＡｒｇからＧｌｎ、Ｈｉｓ又はＬｙｓへの置換、ＡｓｎからＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｓｐへの置換、ＡｓｐからＡｓｎ、Ｇｌｕ又はＧｌｎへの置換、ＣｙｓからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＧｌｎからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ又はＡｒｇへの置換、ＧｌｕからＧｌｙ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ又はＡｓｐへの置換、ＧｌｙからＰｒｏへの置換、ＨｉｓからＡｓｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ又はＴｙｒへの置換、ＩｌｅからＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｅｕからＩｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＬｙｓからＡｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ又はＡｒｇへの置換、ＭｅｔからＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ又はＰｈｅへの置換、ＰｈｅからＴｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換、ＳｅｒからＴｈｒ又はＡｌａへの置換、ＴｈｒからＳｅｒ又はＡｌａへの置換、ＴｒｐからＰｈｅ又はＴｙｒへの置換、ＴｙｒからＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐへの置換、及び、ＶａｌからＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（ｍｕｔａｎｔ又はｖａｒｉａｎｔ）によって生じるものも含まれる。

【0039】

また、上記（１）～（３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。

【0040】

また、上記（１）～（３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、同一性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より好ましくは６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２～３回洗浄する条件を挙げることができる。

【0041】

上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、各遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上記（１）～（３）における各遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型とするＰＣＲによって作製することができる。例えば、プローブとしては、３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いることができる。プローブとして３００ｂｐ程度の長さのＤＮＡ断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳが挙げられる。

【0042】

また、宿主によってコドンの縮重性が異なるので、上記（１）～（３）における各遺伝子は、元の機能が維持されている限り、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、表１～３の遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。

【0043】

変異処理としては、上記（１）～（３）における各遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ分子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、上記（１）～（３）における各遺伝子を保持する微生物を、Ｘ線、紫外線、またはＮ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、メチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤によって処理する方法等の方法が挙げられる。

【0044】

＜＜遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変＞＞
「遺伝子の発現の増大」とは、非改変株と比較して該遺伝子の発現が上昇することをいう。遺伝子の発現の増大の一態様としては、例えば、非改変株と比較して、該遺伝子の発現が好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇していることが挙げられる。

【0045】

また、「遺伝子の発現が増大する」とは、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることを含む。すなわち、「遺伝子の発現が増大する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを含む。なお、「遺伝子の発現が増大する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」、「遺伝子の発現が上昇する」ともいう。

【0046】

遺伝子の発現の増大は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる（Miller I, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory）。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。

【0047】

例えば、染色体上に多数のコピーが存在する配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。染色体上に多数のコピーが存在する配列としては、反復ＤＮＡ配列（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ＤＮＡ）、トランスポゾンの両端に存在するインバーテッド・リピートが挙げられる。

【0048】

また、目的物質の生産に不要な遺伝子等の染色体上の適当な配列を標的として相同組み換えを行ってもよい。相同組み換えは、例えば、直鎖状ＤＮＡを用いる方法、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法、接合伝達可能なプラスミドを用いる方法、宿主内で機能する複製起点を持たないスイサイドベクターを用いる方法、またはファージを用いたｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ法により行うことができる。また、遺伝子は、トランスポゾンやＭｉｎｉ－Ｍｕを用いて染色体上にランダムに導入することもできる（日本国特開平２－１０９９８５号公報）。

【0049】

染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたＰＣＲ等によって確認できる。

【0050】

また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。形質転換の方法は特に限定されず、従来公知の方法を使用できる。

【0051】

ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、マルチコピーベクターであることが好ましい。また、形質転換体を選択するために、ベクターは抗生物質耐性遺伝子又は文献[Karl Friehs, Plasmid Copy Number and Plasmid Stability, Adv Biochem Engin/Biotechnol 86: 47-82 (2004)]に記載の他の遺伝子などのマーカーを有することが好ましい。また、ベクターは、挿入された遺伝子を発現するためのプロモーターやターミネーターを備えていてもよい。ベクターとしては、例えば、細菌プラスミド由来のベクター、酵母プラスミド由来のベクター、バクテリオファージ由来のベクター、コスミド、またはファージミド等が挙げられる。

【0052】

エシェリヒア・コリ等の腸内細菌科の細菌において自律複製可能なベクターとしては、具体的には例えば、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＢＲ３２２、ｐＳＴＶ２９（いずれもタカラバイオ社）、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ１１９（いずれもニッポンジーン社）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ファルマシア社）、ｐＰＲＯＫ系ベクター（クロンテック社）、ｐＫＫ２３３－２（クロンテック社）、ｐＥＴ系ベクター（ノバジェン社）、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、広宿主域ベクターＲＳＦ１０１０が挙げられる。

【0053】

遺伝子を導入する場合、遺伝子は、本発明における遺伝子改変を有するエシェリヒア属細菌に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、本発明の細菌で機能するプロモーター配列による制御を受けて発現するように導入されていればよい。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。

【0054】

遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、本発明の細菌において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとしては、具体的には例えば、Ｔ７ターミネーター、Ｔ４ターミネーター、ｆｄファージターミネーター、ｔｅｔターミネーター、およびｔｒｐＡターミネーターが挙げられる。

【0055】

各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８ 遺伝子工学、共立出版、１９８７年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。

【0056】

また、２以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に本発明の細菌に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。「２以上の遺伝子を導入する場合」としては、例えば、２またはそれ以上の酵素をそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、単一の酵素を構成する２またはそれ以上のサブユニットをそれぞれコードする遺伝子を導入する場合、およびそれらの組み合わせが挙げられる。

【0057】

導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムＤＮＡや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、ＰＣＲにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい［Gene, 60(1), 115-127 (1987)］。

【0058】

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。

【0059】

「より強力なプロモーター」としては、例えば、公知の高発現プロモーターであるｕｓｐＡプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｈｒプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｒａＢＡＤプロモーター、ｒｐｏＨプロモーター、ＰＲプロモーター、およびＰＬプロモーターが挙げられる。

【0060】

また、より強力なプロモーターとしては、各種レポーター遺伝子を用いることにより、在来のプロモーターの高活性型のものを取得してもよい。例えば、プロモーター領域内の－３５、－１０領域をコンセンサス配列に近づけることにより、プロモーターの活性を高めることができる（国際公開第２０００／１８９３５号）。

【0061】

高活性型プロモーターとしては、各種ｔａｃ様プロモーター（Katashkina JI et al. Russian Federation Patent application 2006134574）やｐｎｌｐ８プロモーター（国際公開第２０１０／０２７０４５号）が挙げられる。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、公知の文献［Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1, 105-128 (1995)等］に記載されている。

【0062】

また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のシャインダルガノ（ＳＤ）配列［リボソーム結合部位（ＲＢＳ）ともいう］をより強力なＳＤ配列に置換することにより達成できる。

【0063】

「より強力なＳＤ配列」とは、ｍＲＮＡの翻訳が、もともと存在している野生型のＳＤ配列よりも向上するＳＤ配列を意味する。より強力なＳＤ配列としては、例えば、ファージＴ７由来の遺伝子１０のＲＢＳが挙げられる(Olins P. O. et al, Gene, 1988, 73, 227-235)。さらに、ＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域、特に開始コドンのすぐ上流の配列（５’－ＵＴＲ）における数個のヌクレオチドの置換、あるいは挿入、あるいは欠失がｍＲＮＡの安定性および翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することによっても遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

【0064】

本発明においては、プロモーター、ＳＤ配列、およびＲＢＳと開始コドンとの間のスペーサー領域等の遺伝子の発現に影響する部位を総称して「発現調節領域」ともいう。発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。これら発現調節領域の改変は、例えば、温度感受性ベクターを用いた方法や、Ｒｅｄドリブンインテグレーション法（国際公開第２００５／０１０１７５号）により行うことができる。

【0065】

遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。具体的には例えば、遺伝子の異種発現を行う場合等には、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。

【0066】

コドンの置換は、例えば、ＤＮＡの目的の部位に目的の変異を導入する部位特異的変異法により行うことができる。部位特異的変異法としては、ＰＣＲを用いる方法［Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)］や、ファージを用いる方法［Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)］が挙げられる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」［http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)］に開示されている。

【0067】

また、遺伝子の発現の増大は、遺伝子の発現を増大させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。上記のような遺伝子の発現を増大させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。

【0068】

遺伝子の発現が増大したことは、例えば、該遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、該遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。また、遺伝子の発現が増大したことは、例えば、該遺伝子から発現するタンパク質の活性が増大したことを確認することにより確認できる。

【0069】

遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。ｍＲＮＡの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ－ＰＣＲ等が挙げられる［Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition, Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001］。ｍＲＮＡの量の上昇としては、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。

【0070】

タンパク質の量が上昇したことは、例えば、抗体を用いてウエスタンブロットによって確認できる。タンパク質の量の上昇としては、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。

【0071】

タンパク質の活性が増大したことは、例えば、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。タンパク質の活性の増大としては、タンパク質の活性が、非改変株と比較して、例えば、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは３倍以上に上昇することが挙げられる。

【0072】

上記した遺伝子の発現を増大させる手法は、上記した（１）及び（２）の各遺伝子の発現増強に利用できる。

【0073】

ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、ｋｐｓＳ遺伝子の発現調節領域の改変及びコピー数を高める遺伝子改変の少なくとも一方であることが好ましい。ヘパロサン生産遺伝子群としては、ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ遺伝子が存在するが、本発明者らは、実施例において後述するように、これらの中でも特にｋｐｓＳ遺伝子のみの発現を増大することにより、顕著なヘパロサンの生産向上効果が得られることを見出したものである。したがって、ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大する遺伝子改変としては、特に、ｋｐｓＳ遺伝子のコピー数を高める遺伝子改変がより好ましい。

【0074】

本発明の細菌は、ｋｐｓＳ遺伝子の発現を増大する遺伝子改変を有するが、本発明の細菌は好ましくはｋｐｓＣ遺伝子の発現を増大する遺伝子改変を有さず、より好ましくはｋｐｓＣ遺伝子並びにｋｐｓＦ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＤ及びｋｐｓＵ遺伝子から選択される１つ以上の遺伝子の発現を増大する遺伝子改変を有さず、最も好ましくは、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＦ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＤ及びｋｐｓＵ遺伝子の発現を増大する遺伝子改変を有しない。

【0075】

ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現を増大させる遺伝子改変としては、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子から選択される少なくとも１の遺伝子の発現調節領域の改変及び該遺伝子のコピー数を高めることの少なくとも一方であることが好ましい。ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子は図１に示すようにオペロンを構成しており、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子により構成されるオペロン全体を強化する遺伝子改変が好ましく、ｋｆｉＡ、ｋｆｉＢ、ｋｆｉＣ及びｋｆｉＤ遺伝子の発現調節領域の改変がより好ましい。

【0076】

＜＜遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変＞＞
上記した（３）のｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させる遺伝子改変としては、宿主であるエシェリヒア属細菌のゲノムＤＮＡのうちｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡに改変を加えることにより、ｙｈｂＪ遺伝子の機能を欠損させるｙｈｂＪに相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させることが挙げられる。

【0077】

本発明の方法において、ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡに加える改変の形態は、前記ｙｈｂＪに相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態であれば特に限定されず、公知の方法を適宜用いることができる。

【0078】

ｙｈｂＪに相当する部分がコードするタンパク質の機能を低減若しくは完全に停止させるような形態としては、例えば、次の（ａ）から（ｃ）のいずれか１の改変が例示できる。
（ａ）ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡの全部または一部を除去する。
（ｂ）ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡに、１または数個の置換、欠失もしくは付加する。
（ｃ）ｙｈｂＪに相当する部分をコードするＤＮＡを、改変前のＤＮＡ配列との同一性が８０％未満であるＤＮＡ配列と置き換える。

【0079】

ｙｈｂＪ遺伝子の機能の欠損としては、例えば、非改変株と比較して、ｙｈｂＪの活性が好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であることが挙げられる。ｙｈｂJの活性は、ｇｌｍＳの発現量をノーザンブロット法、ウエスタンブロット法などで調べることにより確認できる[Kalamorz F. et al, (2007) “Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli.” Mol Microbiol. 65(6):1518-33]。

【0080】

＜＜エシェリヒア属細菌＞＞
エシェリヒア属細菌としては、特に制限されないが、微生物学の専門家に知られている分類によりエシェリヒア属に分類されている細菌が挙げられる。エシェリヒア属細菌としては、例えば、文献［Backmann, B. J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p. 2460-2488. Table 1. In F. D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.］に記載されたものが挙げられる。

【0081】

エシェリヒア属細菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が挙げられる。エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）やＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ ４７０７６）等のエシェリヒア・コリＫ－１２株；エシェリヒア・コリＫ５株（ＡＴＣＣ ２３５０６）；ＢＬ２１（ＤＥ３）株等のエシェリヒア・コリＢ株；エシェリヒア・コリＮｉｓｓｌｅ １９１７株（ＤＳＭ ６６０１）；およびそれらの派生株が挙げられる。

【0082】

これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）株は、例えば、ライフテクノロジーズ社より入手可能である（製品番号 Ｃ６０００－０３）。

【0083】

本発明の細菌は、本来的にヘパロサン生産能を有するものであってもよく、ヘパロサン生産能を有するように改変されたものであってもよい。ヘパロサン生産能を有する細菌は、例えば、上記のような細菌にヘパロサン生産能を付与することにより取得できる。

【0084】

ヘパロサン生産能は、Metabolic Engineering14(2012)521-527やCarbohydrate Research 360 (2012) 19-24、米国特許第９，９７５，９２８号明細書等を参考にして、ヘパロサン生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入することにより、付与できる。ヘパロサン生産に関与するタンパク質としては、グリコシルトランスフェラーゼやヘパロサン排出担体タンパク質が挙げられる。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種以上の遺伝子を導入してもよい。遺伝子の導入は、上述した遺伝子のコピー数を増加させる手法と同様に行うことができる。

【0085】

＜ヘパロサンの製造方法＞
本発明のヘパロサンの製造法は、本発明の細菌を培地で培養してヘパロサンを該培地中に生成蓄積することを含む。本発明のヘパロサンの製造法は、必要であれば、該培地よりヘパロサンを採取することを含んでもよい。

【0086】

使用する培地は、本発明の細菌が増殖でき、ヘパロサンが生成蓄積される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、細菌の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地として、例えば、ＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ培地）が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、例えば、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有する培地を用いることができる。培地成分の種類や濃度は、当業者が適宜設定してよい。

【0087】

炭素源は、本発明の細菌が資化してヘパロサンを生成し得るものであれば、特に限定されない。炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸、フマル酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸等の有機酸類、グリセロール、粗グリセロール、エタノール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種以上の炭素源を組み合わせてもよい。

【0088】

窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせてもよい。

【0089】

リン酸源としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせてもよい。

【0090】

硫黄源として、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせてもよい。

【0091】

その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンＢ１２等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。

【0092】

また、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求性変異株を使用する場合には、培地に要求される栄養素を補添することが好ましい。また、抗生物質耐性遺伝子を搭載するベクターを用いて遺伝子を導入した際は、培地に対応する抗生物質を添加するのが好ましい。

【0093】

培養条件は、本発明の細菌が増殖でき、ヘパロサンが生成蓄積される限り、特に制限されない。培養は、例えば、細菌の培養に用いられる通常の条件で実施できる。培養条件は、当業者が適宜設定してよい。

【0094】

培養は、例えば、液体培地を用いて、通気培養または振盪培養により、好気的に実施できる。培養温度は、例えば、３０～３７°Ｃであってよい。培養期間は、例えば、１６～７２時間であってよい。培養は、回分培養（ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、流加培養（Ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ）、連続培養（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ）、またはそれらの組み合わせにより実施できる。また、培養は、前培養と本培養とに分けてもよい。前培養は、例えば、平板培地や液体培地を用いて行ってよい。

【0095】

上記のようにして本発明の細菌を培養することにより、培地中にヘパロサンが蓄積する。

【0096】

培養液からヘパロサンを回収する方法は、ヘパロサンが回収されうる限り、特に制限されない。培養液からヘパロサンを回収する方法としては、例えば、実施例に記載する方法が挙げられる。具体的には、例えば、培養液から培養上清を分離し、次いで、エタノール沈殿によって上清中のヘパロサンを沈降できる。添加するエタノールの量は、例えば、上清液量の２．５～３．５倍量であってよい。ヘパロサンの沈降には、エタノールに限られず、水と任意に混和する有機溶媒を使用できる。

【0097】

前記有機溶媒としては、エタノールに加えて、メタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｔ－ブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、プロピレングリコール、アセトニトリル、アセトン、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、Ｎ－メチルピロリドン、ピリジン、１，２－ジメトキシエタン、１，４－ジオキサン、ＴＨＦが挙げられる。

【0098】

培養液からヘパロサンを回収する方法として他には、例えばヘパロサンの末端に存在するＫｄｏを標的として精製することを含む方法も挙げられる。

【0099】

沈殿したヘパロサンは、例えば、元の上清液量の２倍量の水に溶解できる。回収されるヘパロサンは、ヘパロサン以外に、細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物等の成分を含んでいてもよい。ヘパロサンは、所望の程度に精製されていてよい。ヘパロサンの純度は、例えば、３０％（ｗ／ｗ）以上、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、または９５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。

【0100】

ヘパロサンの検出および定量は、公知の方法により実施できる。具体的には例えば、実施例で後述するように、ヘパロサンは、カルバゾール法にて検出および定量できる。カルバゾール法は、ウロン酸の定量方法として広く用いられる手法であり、ヘパロサンを硫酸の存在下でカルバゾールと熱反応させ、生成した呈色物質による５３０ｎｍの吸収を測定することにより、ヘパロサンを検出及び定量できる［Bitter T. and Muir H.M., (1962) "A modified uronic acid carbazole reaction."Analytical Biochemistry, 4(4): 330-334］。また、例えば、ヘパロサンをヘパロサン分解酵素であるヘパリナーゼIIIで処理し、二糖組成分析を行うことによって、ヘパロサンを検出及び定量できる。

【実施例】

【0101】

以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

【0102】

［実施例１］遺伝子欠損株の造成
（ａ）遺伝子欠損用マーカー遺伝子断片の構築
相同組換えを用いたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子欠損のためのマーカー遺伝子として用いるクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）およびレバンシュークラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）を含むＤＮＡ断片を以下のようにして調製した。

【0103】

配列番号１および２で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、プラスミドｐＨＳＧ３９６（タカラバイオ社）を鋳型としてＰＣＲを行い、ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いて、説明書に記載の通りに行った。また配列番号３および４で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、ｐＭＯＢ３（ＡＴＣＣ ７７２８２由来）を鋳型としてＰＣＲを行い、ｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。

【0104】

ｃａｔ遺伝子を含むＤＮＡ断片、ｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片をそれぞれ精製した後、ＳａｌＩで切断した。フェノール／クロロホルム処理、およびエタノール沈殿を行い、両者を等モルの比率で混合してＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２（タカラバイオ社製）を用いて連結した。該連結反応液をフェノール／クロロホルム処理、およびエタノール沈殿にて精製したものを鋳型とし、配列番号５および６で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲを行い、得られた増幅ＤＮＡをＱｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製し、ｃａｔ遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｃａｔ－ｓａｃＢ断片）を取得した。

【0105】

（ｂ）ｙｈｂＪ遺伝子欠損株の造成
配列番号７および８で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、並びに配列番号９および１０で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ １９１７株［ＤＳＭ ６６０１、Ｍｕｔａｆｌｏｒ（Ｐｈａｒｍａ－Ｚｅｎｔｒａｌｅ ＧｍｂＨ）、以下Ｎｉｓｓｌｅ株と略す］のゲノムＤＮＡを鋳型として一回目のＰＣＲを行い、それぞれｙｈｂＪ遺伝子の開始コドン付近からその上流１０００ｂｐ、およびｙｈｂＪ遺伝子の終始コドン付近からその下流約１０００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲはｐｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、説明書に記載の通りに行った。

【0106】

ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物と、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として二回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲはｐｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用いて、説明書に記載の通りに行った。プライマーセットには配列番号７および１０で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供して約４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｙｈｂＪ周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。

【0107】

また配列番号７および１１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、並びに配列番号１２および１０で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株のゲノムＤＮＡを鋳型として一回目のＰＣＲを行い、それぞれｙｈｂＪ遺伝子の開始コドン付近からその上流１０００ｂｐ、およびｙｈｂＪ遺伝子の終始コドン付近からその下流約１０００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。

【0108】

精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として二回目のＰＣＲを行った。プライマーセットには７および１０で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供して約２．０ ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ｙｈｂＪ遺伝子が欠損したｙｈｂＪ周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。

【0109】

次に、ｐＫＤ４６を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｎｉｓｓｌｅ／ｐＫＤ４６株）を１５ｇ／ＬのＬ－アラビノースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンの存在下でＬＢ培地［１０ｇ／ｌ バクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ イーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ 塩化ナトリウム］にて培養した。プラスミドｐＫＤ４６は、λＲｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ遺伝子を有し、該遺伝子の発現はＬ－アラビノースにより誘導することができる。よって、Ｌ－アラビノース存在下で生育させたｐＫＤ４６を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを、直鎖状ＤＮＡを用いて形質転換すると、高頻度で相同組換えが起こる。またｐＫＤ４６は温度感受性の複製起点を有するために、４２℃で生育させることにより、プラスミドを容易に脱落させることができる。Ｎｉｓｓｌｅ／ｐＫＤ４６株のコンピテントセルを調製し、上記で取得したｃａｔ－ｓａｃＢ断片の挿入されたｙｈｂＪ周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法により導入した。

【0110】

得られた形質転換体を１５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ＋クロラムフェニコール＋アンピシリン）に塗布して培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。相同組換えが生じた株はクロラムフェニコール耐性かつシュクロース感受性を示すので、選択したコロニーを１０％シュクロースおよび１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（ＬＢ＋シュクロース＋アンピシリン）およびＬＢ＋クロラムフェニコール＋アンピシリンにレプリカし、クロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。

【0111】

選択した株について配列番号１３および１０で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーＰＣＲを行い、ｙｈｂＪ遺伝子の位置にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されていることを確認した。ｙｈｂＪ遺伝子の位置にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された株を上記と同様に培養してコンピテントセルを調製し、上記で得られたｙｈｂＪ遺伝子が欠失したｙｈｂＪ周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法により導入した。

【0112】

得られた形質転換体をＬＢ＋シュクロース寒天培地で培養し、シュクロース耐性コロニーを選択した。相同組換えを起こした株はｃａｔ－ｓａｃＢ断片を含まず、よってクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示すため、選択したコロニーをＬＢ＋クロラムフェニコール寒天培地およびＬＢ＋シュクロース寒天培地にレプリカし、クロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。

【0113】

選択した株について配列番号１３および１０で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーＰＣＲを行い、ｙｈｂＪ遺伝子が欠損していることを確認した。ｙｈｂＪ遺伝子が欠損していることが確認できた株をＬＢ寒天培地に塗布して４２℃で培養した後、アンピシリン感受性を示す株、すなわちｐＫＤ４６が脱落した株を選択した。

【0114】

上記のようにしてｙｈｂＪ遺伝子が欠損した株を取得し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ株と命名した。

【0115】

［実施例２］遺伝子強化株の造成
以下に示す方法でｋｆｉＡ遺伝子のプロモーター領域置換株を造成した。配列番号１４および１５で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、並びに配列番号１６および１７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株のゲノムＤＮＡを鋳型として一回目のＰＣＲを行い、それぞれｋｆｉＡ遺伝子の開始コドンより上流１００ｂｐ付近からその上流１０００ｂｐ、およびｋｆｉＡ遺伝子の開始コドン付近からその下流約１０００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。

【0116】

ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて精製した増幅産物と、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片を等モルの比率で混合したものを鋳型として二回目のＰＣＲを行った。プライマーセットには配列番号１４および１７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供して約４．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されたｋｆｉＡ遺伝子のプロモーター周辺領域を含むＤＮＡ断片を得た。

【0117】

配列番号１４および１８で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、並びに配列番号１９および１７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用い、常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株のゲノムＤＮＡを鋳型として一回目のＰＣＲを行い、それぞれｋｆｉＡ遺伝子の開始コドンより上流１００ｂｐ付近からさらにその上流１０００ｂｐ、およびｋｆｉＡ遺伝子の開始コドン付近からその下流約１０００ｂｐを含むＤＮＡ断片を取得した。
また、配列番号２０および２１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用い、常法により調製したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ株（ＡＴＣＣ ９６３７）のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約３００ｂｐのｕｓｐＡプロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。

【0118】

精製した増幅産物を等モルの比率で混合したものを鋳型として二回目のＰＣＲを行った。プライマーセットには１４および１７で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡを用いた。増幅産物をアガロースゲル電気泳動に供して約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を分離し、ｋｆｉＡプロモーター周辺領域からｋｆｉＡプロモーター領域が欠損し、代わりにｕｓｐＡプロモーターを含むＤＮＡ断片を得た。

【0119】

次に、γＲｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＤ４６を保持するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株（Ｎｉｓｓｌｅ／ｐＫＤ４６株）と、実施例１で造成したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＹ株（ＮＹ／ｐＫＤ４６株）を１５ｇ／ＬのＬ－アラビノースと１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンの存在下で培養した。両株のコンピテントセルを調製し、上記で取得したｃａｔ－ｓａｃＢ断片の挿入されたｋｆｉＡプロモーター周辺領域を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法により導入した。

【0120】

得られた形質転換体をＬＢ＋クロラムフェニコール＋アンピシリン寒天培地で培養し、クロラムフェニコール耐性コロニーを選択した。選択したコロニーの中からさらにクロラムフェニコール耐性、かつシュクロース感受性を示した株を選択した。

【0121】

選択した株について配列番号２２および１７で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーＰＣＲを行い、ｋｆｉＡプロモーター領域にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入されていることを確認した。

【0122】

ｋｆｉＡプロモーター領域にｃａｔ－ｓａｃＢ断片が挿入された株を上記と同様に培養してコンピテントセルを調製し、上記で得られたｋｆｉＡプロモーター周辺領域からｋｆｉＡプロモーター領域が欠損し、代わりにｕｓｐＡプロモーターを含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法により導入した。

【0123】

得られた形質転換体をＬＢ＋シュクロース寒天培地で培養し、シュクロース耐性コロニーを選択した。選択したコロニーの中からさらにクロラムフェニコール感受性かつシュクロース耐性を示した株を選択した。

【0124】

選択した株について配列番号２２および１７で表わされる塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットに用いてコロニーＰＣＲを行い、ｋｆｉＡプロモーター領域にｕｓｐＡプロモーターが挿入されていることを確認した。ｋｆｉＡプロモーター領域にｕｓｐＡプロモーターが挿入されていることが確認できた株をＬＢ寒天培地に塗布して４２℃で培養した後、アンピシリン感受性を示す株、すなわちｐＫＤ４６が脱落した株を選択した。

【0125】

上記のようにしてｋｆｉＡプロモーター領域にｕｓｐＡプロモーターが挿入された株を取得し、それぞれＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＡ株、ＮＹＡ株と命名した。

【0126】

［実施例３］ＮＹ株、ＮＡ株、およびＮＹＡ株によるヘパロサン生産試験
（ａ）ヘパロサン生産株の培養
実施例１で得られたｙｈｂＪ欠損変異株ＮＹ株、および実施例２で得られたｋｆｉＡプロモーター置換株ＮＡ株、ｋｆｉＡプロモーター置換ｙｈｂＪ欠損株ＮＹＡ株、および親株であるＮｉｓｓｌｅ株をＬＢ寒天培地で３０℃、２４時間培養した後、それぞれを前培養培地［１０ ｇ／Ｌ大豆ペプチド（ハイニュートＡＭ；不二製油社製）、５ ｇ／Ｌ 塩化ナトリウム、５ ｇ／Ｌ 酵母エキスパウダー（ＡＹ－８０；アサヒフードアンドヘルスケア社製）をｐＨ７．２となるよう水酸化ナトリウムで調整］ ３３０ｍＬの入った２Ｌバッフルに植菌し、３０℃で１８時間培養した。

【0127】

得られた前培養液４０ｍＬを、本培養培地［２０ｇ／Ｌ グルコース、１３．５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、４ｇ／Ｌ リン酸二アンモニウム、１．７ｇ／Ｌクエン酸、１．７ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、１０ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩、１０ｍＬ／Ｌ 微量ミネラル溶液、ｐＨ６．７となるよう５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコースと硫酸マグネシウム七水和物は別個にオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分間）後添加した］ ７６０ｍＬの入ったジャーファーメンターに植菌し、撹拌回転数毎分８００回転、通気毎分１．５Ｌ、３７℃で７２時間培養した。

【0128】

微量ミネラル溶液は１０ｇ／Ｌ 硫酸鉄七水和物、２ｇ／Ｌ 塩化カルシウム、２．２ｇ／Ｌ 硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌ 硫酸マンガン四水和物、１ｇ／Ｌ 硫酸銅五水和物、０．１ｇ／Ｌ 七モリブデン酸六アンモニウム四水和物、０．０２ｇ／Ｌ 四ホウ酸ナトリウム十水和物を５ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解させたものを指す。

【0129】

培養液中のグルコース濃度が０ｇ／Ｌとなった時点から培養７２時間目までの間、７．０ｍＬ／ｈｏｕｒでフィード液［５００ｇ／Ｌ グルコース、３３．６ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、１４．３ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム、０．４ｇ／Ｌ チアミン塩酸塩、１４．３ｍＬ／Ｌ 微量ミネラル溶液］を添加した。培養終了までに添加したフィード液の量は約４５０ｍＬであった。

【0130】

（ｂ）ヘパロサン生産株培養液からのヘパロサン粗精製
蒸留水で１０倍に希釈した培養液を１００℃で３０分間インキュベートした後、遠心分離により培養液から菌体を除去し、得られた上清２００μＬを１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。０．５ｍｏｌ／Ｌ 硫酸ナトリウム水溶液４０μＬを加えて混合した後、１０ｇ／Ｌ 塩化ヘキサデシルピリジニウム水溶液４００μＬを加えて転倒混合し、３７℃で１時間静置した。

【0131】

該溶液を遠心分離することにより沈殿を生じさせ、上清を除去した。蒸留水で沈殿を洗浄した後、溶解液［０．５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム、４％（ｖ／ｖ） エタノールを含む水溶液］ １００μＬを加えて沈殿を溶解させた。さらに４℃で一晩静置した後、０．２５ｍｏｌ／Ｌ 塩化ナトリウム水溶液９００μＬを加えて混合して得た溶液を粗ヘパロサン溶液とした。なお、ブランク用に本培養培地２００μＬを同様に処理したものも用意した。

【0132】

（ｃ）カルバゾール－硫酸法によるヘパロサン蓄積量測定
粗ヘパロサン溶液 ２０μＬを氷冷しながら、硫酸液 ［９．５ｇ／Ｌ四ホウ酸ナトリウム十水和物を濃硫酸に溶解させた液］ １００μＬを加えて混合した後、１００℃で１０分間インキュベートした。該溶液を再度氷冷しながら、カルバゾール液 ［１．２５ｇ／Ｌ カルバゾールを１００％エタノールに溶解させた液］ ４μＬを加えて混合し、１００℃で１５分間インキュベートした。

【0133】

再度氷冷した後、常温に戻し、マイクロプレートリーダーを用いて５３０ｎｍの吸光度を測定した。なお、検量線用には０、０．１、０．２ｇ／Ｌのグルクロン酸ナトリウム一水和物を用い、横軸をグルクロン酸濃度（ｇ／Ｌ）、縦軸を５３０ｎｍの吸光度として検量線を作成した。

【0134】

下に記載の計算式に従い、ヘパロサン濃度を算出した。ただし、求めるヘパロサン濃度をＨ（ｇ／Ｌ）、得られた検量線をｙ＝ａｘ＋ｂ、粗ヘパロサンサンプルのＡ５３０測定値をｈ、ブランクのＡ５３０測定値をｋ、最終的な希釈倍率をｎと表す。なお、０．５３８７はヘパロサン中のグルクロン酸含量、２１６／２３４はグルクロン酸ナトリウム一水和物中のグルクロン酸ナトリウム含量を示す。

【0135】

【数1】

【0136】

（ｄ）ヘパロサン蓄積量の測定結果
上記の方法で測定した場合のヘパロサンの蓄積量を表１に示す。

【0137】

【表1】

【0138】

表１に示すように、ｙｈｂＪを欠損させたＮＹ株では、ヘパロサンの蓄積量が親株であるＮｉｓｓｌｅ株に比べて２倍以上に向上していた。また、ｋｆｉＡのプロモーターをｕｓｐＡプロモーターに置換したＮＡ株でも、ヘパロサンの蓄積量が親株であるＮｉｓｓｌｅ株に比べて向上していた。これら二つの変異を組み合わせたＮＹＡ株では、さらに高いヘパロサン生産性を示した。

【0139】

［実施例４］ヘパロサン生産に関わる遺伝子を発現するプラスミドの造成
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２３および２４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＳ遺伝子領域を含む約３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｋｐｓＣＳ遺伝子増幅断片という）を得た。

【0140】

ｐＭＷ１１８ベクターを鋳型とし、配列番号２５および２６で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、約４ｋｂｐのｐＭＷ１１８線状ＤＮＡ断片を得た。また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｗ株（ＡＴＣＣ ９６３７）の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２０および２１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、ｕｓｐＡプロモーター領域を含む約３００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。

【0141】

上記で得られたｐＭＷ１１８線状ＤＮＡ断片とｕｓｐＡプロモーター領域を含むＤＮＡ断片とｋｐｓＣＳ遺伝子増幅断片を混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結した。

【0142】

得られた連結ＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、配列番号２７および２４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行うことで遺伝子発現プラスミドが取得されていることを確認し、ｐＭＷ１１８－ｋｐｓＣＳと命名した。

【0143】

また、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅ株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号２８および２４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、並びに配列番号２９および２４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、それぞれ、ｋｐｓＳ遺伝子領域を含む約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｋｐｓＳ遺伝子増幅断片という）、およびｋｐｓＦ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＵ、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＳ遺伝子領域を含む約７．９ｋｂｐのＤＮＡ断片（以下ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ遺伝子増幅断片という）を得た。

【0144】

また、上記で取得したプラスミドｐＭＷ１１８－ｋｐｓＣＳを鋳型とし、配列番号２５および２１で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行い、約４．３ｋｂｐのｕｓｐＡプロモーター配列を含むｐＭＷ１１８線状ＤＮＡ断片を得た。

【0145】

上記で得られたｕｓｐＡプロモーター配列を含むｐＭＷ１１８線状ＤＮＡ断片とｋｐｓＳ遺伝子増幅断片を混合し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いて連結した。同様に、ｕｓｐＡプロモーター配列を含むｐＭＷ１１８線状ＤＮＡ断片とｋｐｓＦＥＤＵＣＳ遺伝子増幅断片を混合して連結した。

【0146】

得られた各連結ＤＮＡを用いてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ５α株を形質転換し、アンピシリン耐性を指標に形質転換体を選択した。該形質転換体から公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、ｋｐｓＳ遺伝子増幅断片を連結したプラスミドについては配列番号２０および２４で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡ、ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ遺伝子増幅断片を連結したプラスミドについては配列番号２７および３０、並びに配列番号３１および３２で表される塩基配列からなる合成ＤＮＡをそれぞれプライマーセットとして用いてＰＣＲ反応を行うことでそれぞれの遺伝子発現プラスミドが取得されていることを確認し、それぞれ、ｐＭＷ１１８－ｋｐｓＳ、ｐＭＷ１１８－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳと命名した。

【0147】

［実施例５］遺伝子発現プラスミド保持株によるヘパロサン生産試験－１
実施例１で得られたＮＹ株に、ｐＭＷ１１８プラスミドおよび、実施例４で得られたｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ、ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＣＳ、ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳをそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれＮＹ／ｐＭＷ１１８株、ＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ株、ＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＣＳ株、ＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ株と命名した。

【0148】

上記で得られた形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、３７℃で１５時間培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＲ培地 ［２０ｇ／Ｌ グルコース、１３．５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、４ｇ／Ｌ リン酸二アンモニウム、１．７ｇ／Ｌクエン酸、１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、１０ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩、１０ｍＬ／Ｌ 微量ミネラル溶液、ｐＨ６．８となるよう５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコースと硫酸マグネシウム七水和物は別個にオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分間）後添加した］ が５ｍＬ入った試験管に１％接種し、３７℃で２４時間培養した。また、ＮＹ株についても同様の操作をアンピシリンを含まない条件で行った。

【0149】

得られた培養液を実施例３に記載の方法で処理し、培養液中のヘパロサン蓄積量を測定した結果を表２に示す。

【0150】

【表2】

【0151】

表２に示すように、ｋｐｓＳを発現させたＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ株では、ヘパロサン蓄積量が親株であるＮＹ株やｐＭＷ１１８ベクターのみを保持させたＮＹ／ｐＭＷ１１８株に比べて明らかに向上していた。

【0152】

一方で、ｋｐｓＣとｋｐｓＳを発現させたＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＣＳ株および、ｋｐｓＦ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＵ、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＳを発現させたＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ株は、ＮＹ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ株とほぼ同等のヘパロサン生産性を示したことから、ヘパロサン生産遺伝子群であるｋｐｓＦＥＤＵＣＳの中で、ｋｐｓＳのみの発現強化によって十分にヘパロサン生産能向上効果が得られることがわかった。

【0153】

［実施例６］遺伝子発現プラスミド保持株によるヘパロサン生産試験－２
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｎｉｓｓｌｅの野生株に、ｐＭＷ１１８プラスミドおよび、実施例４で得られたｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ、ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＣＳ、ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳをそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体をそれぞれＮ／ｐＭＷ１１８株、Ｎ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ株、Ｎ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＣＳ株、Ｎ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ株と命名した。

【0154】

上記で得られた形質転換体を、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地が入った太型試験管に接種し、３７℃で１５時間培養した。該培養液を１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＲ培地［２０ｇ／Ｌ グルコース、１３．５ｇ／Ｌ リン酸二水素カリウム、４ｇ／Ｌ リン酸二アンモニウム、１．７ｇ／Ｌクエン酸、１ｇ／Ｌ 硫酸マグネシウム七水和物、１０ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩、１０ｍＬ／Ｌ 微量ミネラル溶液、ｐＨ６．８となるよう５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウムで調整、グルコースと硫酸マグネシウム七水和物は別個にオートクレーブ滅菌（１２０℃、２０分間）後添加した］ が５ｍＬ入った試験管に１％接種し、３７℃で２４時間培養した。また、Ｎｉｓｓｌｅ野生株についても同様の操作をアンピシリンを含まない条件で行った。

【0155】

得られた培養液を実施例3に記載の方法で処理し、培養液中のヘパロサン蓄積量を測定した結果を表３に示す。

【0156】

【表3】

【0157】

表３に示すように、ｋｐｓＳを発現させたＮ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＳ株では、ヘパロサン蓄積量が親株であるＮｉｓｓｌｅ野生株やｐＭＷ１１８ベクターのみを保持させたＮ／ｐＭＷ１１８株に比べて３倍以上に向上した。

【0158】

一方で、ｋｐｓＣとｋｐｓＳを発現させたＮ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＣＳ株、並びにｋｐｓＦ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＵ、ｋｐｓＣ及びｋｐｓＳを発現させたＮ／ｐＭＷ１１８－ＰｕｓｐＡ－ｋｐｓＦＥＤＵＣＳ株の力価向上は親株の１．８倍程度にとどまった。このことから、ヘパロサン生産遺伝子群ｋｐｓＦＥＤＵＣＳの中でも、ｋｐｓＳのみの発現強化によって十分にヘパロサン生産能向上効果が得られるうえ、むしろｋｐｓＣやｋｐｓＦＥＤＵの発現を強化させない方が、強化させるよりも、ヘパロサン生産能力が高くなることが分かった。

【0159】

本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。本出願は、２０２０年４月３日付けで出願された国際特許出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０２０／０１５３８４）に基づいており、その全体が引用により援用される。

【図1】

【図2】

【図3】

【配列表】

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