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特許7465252レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭの改良された産生方法

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-02

(45)【発行日】2024-04-10

(54)【発明の名称】レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭの改良された産生方法

(51)【国際特許分類】

C12N 1/15 20060101AFI20240403BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240403BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240403BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240403BHJP

C12N 15/54 20060101ALI20240403BHJP

C12P 19/18 20060101ALI20240403BHJP

C12N 9/10 20060101ALI20240403BHJP

A23L 27/00 20160101ALN20240403BHJP

【ＦＩ】

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/54 ZNA

C12P19/18

C12N9/10

A23L27/00 101A

【請求項の数】 32

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2021208879

(22)【出願日】2021-12-23

(62)【分割の表示】P 2020020276の分割

【原出願日】2014-02-06

(65)【公開番号】P2022047541

(43)【公開日】2022-03-24

【審査請求日】2022-01-21

(31)【優先権主張番号】61/761,490

(32)【優先日】2013-02-06

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】61/886,442

(32)【優先日】2013-10-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514034102

【氏名又は名称】エヴォルヴァエスアー．

【氏名又は名称原語表記】ＥＶＯＬＶＡＳＡ．

【住所又は居所原語表記】Ｄｕｇｇｉｎｇｅｒｓｔｒａｓｓｅ２３，ＣＨ－４１５３Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ

(74)【代理人】

【識別番号】100102842

【弁理士】

【氏名又は名称】葛和清司

(72)【発明者】

【氏名】ミケルセン，マイケルダルガード

(72)【発明者】

【氏名】ハンセン，ヨルゲン

(72)【発明者】

【氏名】サイモン，エルネスト

(72)【発明者】

【氏名】ブリアンザ，フェデリコ

(72)【発明者】

【氏名】セムラー，アンジェリカ

(72)【発明者】

【氏名】オルソン，キム

(72)【発明者】

【氏名】カールセン，サイモン

(72)【発明者】

【氏名】デューリング，ルイス

(72)【発明者】

【氏名】ウスペンスキー，アレクセイ

(72)【発明者】

【氏名】ヒックス，ポーラ

【審査官】堂畑厚志

(56)【参考文献】

【文献】国際公開第２０１１／１５３３７８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】特表２０１２－５０４５５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１１／０４６４２３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】J. Appl. Glycosci.，2010年08月17日，Vol. 57, No. 3，pp. 199-209

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｐ１９／

Ｃ１２Ｎ

Ａ２３Ｌ２７／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ／ＵｎｉＰｒｏｔ／ＰＤＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なウリジン５’－ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む、組換え宿主細胞であって、
ここで、ポリペプチドは、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２５３Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｗ、Ｓ２８３Ｇ、Ｓ２８３Ｎ、Ｔ２８４Ｒ、Ｓ２８５Ｇ、Ｓ２８５Ｒ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含むポリペプチドバリアントの１または２以上を含み、
ここで、組換え宿主細胞は、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３－ヒドロキシカウラ－１６－エン－１８－酸、［２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル］エステル）、またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３－ヒドロキシカウラ－１６－エン－１８－酸；［２－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－３－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノシル－β－Ｄ－グルコピラノシル］エステル）を産生する、
前記宿主細胞。

【請求項2】

組換え宿主細胞が、さらに
（ａ）ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子であって、
ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）およびイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）からゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を合成することが可能なポリペプチドが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記遺伝子；
（ｂ）ＧＧＰＰからｅｎｔ－コパリル二リン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子であって、
ＧＧＰＰからｅｎｔ－コパリル二リン酸を合成することが可能なポリペプチドが、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記遺伝子；
（ｃ）ｅｎｔ－コパリルピロリン酸からｅｎｔ－カウレンを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子であって、
ｅｎｔ－コパリルピロリン酸からｅｎｔ－カウレンを合成することが可能なポリペプチドが、配列番号２１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記遺伝子；
（ｄ）ｅｎｔ－カウレンからｅｎｔ－カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子であって、
ｅｎｔ－カウレンからｅｎｔ－カウレン酸を合成することが可能なポリペプチドが、配列番号２５に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記遺伝子；
（ｅ）ｅｎｔ－カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子であって、
ｅｎｔ－カウレン酸からステビオールを合成することが可能なポリペプチドが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記遺伝子；および／または
（ｆ）シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドをコードする遺伝子であって、
シトクロムＰ４５０複合体を還元することが可能なポリペプチドが、配列番号４または９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、前記遺伝子
を含み、
ここで、（ａ）～（ｆ）における遺伝子の少なくとも１つは組換え遺伝子である、
請求項１に記載の組換え宿主細胞。

【請求項3】

組換え宿主細胞の細胞培養物中で、植物由来のまたは合成のステビオールグリコシドの全細胞生物変換においてレバウディオサイドＭ（ＲｅｂＭ）を産生することが可能な組換え宿主細胞であって、宿主細胞は、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能なウリジン５’－ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする遺伝子であって、ここで、ポリペプチドは、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｅ、Ｙ１２８Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２５３Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｗ、Ｓ２８３Ｎ、Ｓ２８３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｓ２８５Ｇ、Ｓ２８５Ｒ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含むポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記遺伝子
；ならびに
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第１の組換え遺伝子であって、
ここで、第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記第１の組換え遺伝子；および／または
ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第２の組換え遺伝子であって、
ここで、第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５または８６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記第２の組換え遺伝子；
を含み、
ここで、ポリペプチドの少なくとも１つは、宿主細胞において発現される組換えポリペプチドであり；
ここで、ステビオールグリコシドは、ルブソシド、ステビオシド、レバウディオサイドＡ（ＲｅｂＡ）、レバウディオサイドＥ（ＲｅｂＥ）、またはそれらの組み合わせであり；ならびに
ここで、組換え宿主細胞は、細胞培養物中で増殖させたとき、少なくとも６００ｍｇ／ＬのＲｅｂＭを産生することが可能である、
前記組換え宿主細胞。

【請求項4】

ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする遺伝子、および、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする第１の遺伝子が、２以上のコピー数を有する、請求項３に記載の組換え宿主細胞。

【請求項5】

組換え宿主細胞が、ステビオールグリコシド類の合計の少なくとも３重量％より多いＲｅｂＭを有する、ＲｅｂＭが濃縮したステビオールグリコシド組成物を産生することが可能である、請求項３または４に記載の組換え宿主細胞。

【請求項6】

組換え宿主細胞が、さらにレバウディオサイドＤ（ＲｅｂＤ）を産生することが可能である、請求項３～５のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項7】

組換え宿主細胞が、細胞培養物中で増殖させたとき、少なくとも１０００ｍｇ／ＬのＲｅｂＭを産生することが可能である、請求項３～６のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項8】

組換え宿主細胞が、細胞培養物中で増殖させたとき、少なくとも１０００ｍｇ／ＬのＲｅｂＤを産生することが可能である、請求項６または７に記載の組換え宿主細胞。

【請求項9】

組換え宿主細胞が、細胞培養物中で０．６：１～１．１：１の間の比で組換え宿主細胞により産生されるＲｅｂＭおよびＲｅｂＤを、産生することが可能である、請求項６～８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項10】

組換え宿主細胞が、細胞培養物中で１：１～１．７：１の間の比で組換え宿主細胞により産生されるＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを、産生することが可能である、請求項６～８のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項11】

細胞培養物が、
（ａ）宿主細胞の細胞培養物中で全細胞生物変換において産生されるＲｅｂＭ、
（ｂ）グルコース、および／またはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－グルコース；ならびに
（ｃ）微量金属、ビタミン、塩、酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含む、請求項３～１０のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項12】

組換え宿主細胞が、溶媒、洗剤、もしくは界面活性剤である透過剤を用いて、機械的衝撃、エレクトロポレーション、または浸透圧ショックにより、透過処理される、請求項３～１１のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項13】

宿主細胞が、
（ａ）浮遊しているまたは固定化されている；
（ｂ）アルギン酸カルシウムまたはナトリウムビーズ中にトラップされている；
（ｃ）中空繊維管リアクターシステムに結合されている；
（ｄ）濃縮され、および膜リアクターシステム内にトラップされている；あるいは
（ｅ）発酵ブロス中または反応緩衝液中にある；
請求項３～１２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項14】

組換え宿主細胞が、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項15】

真菌細胞が、酵母細胞を含む、請求項１４に記載の組換え宿主細胞。

【請求項16】

酵母細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である、請求項１５に記載の組換え宿主細胞。

【請求項17】

組換え宿主細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ細胞である；あるいは、組換え宿主細胞が、ヤロウィア・リポリティカ細胞である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。

【請求項18】

細胞培養物中で１つ以上のステビオールグリコシドを産生する方法であって、遺伝子が発現される条件下において、細胞培養物中で請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を培養することを含み、ここで、１つ以上のステビオールグリコシドは、組換え宿主細胞により産生される、前記方法。

【請求項19】

遺伝子が構成的に発現される、または、遺伝子の発現が誘導される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

１つ以上のステビオールグリコシドを産生する方法であって、
配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｅ、Ｙ１２８Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２５３Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｗ、Ｓ２８３Ｎ、Ｓ２８３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｓ２８５Ｇ、Ｓ２８５Ｒ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含むポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；
ならびに、植物由来のまたは合成のステビオール前駆体、ステビオール、ステビオールグリコシド前駆体、および／またはステビオールグリコシド
を反応混合物に用いる、組換え宿主細胞の細胞培養物中における植物由来のまたは合成のステビオールおよび／またはステビオールグリコシドの全細胞生物変換を含み、
ここで、ＲｅｂＭは、反応混合物において少なくとも６００ｍｇ／Ｌの濃度で産生され；および産生されるＲｅｂＭを反応混合物から単離することをさらに含む、
前記方法。

【請求項21】

請求項２０に記載の方法であって、
（ａ）ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；および
ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５または８６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチド、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するポリペプチド、またはその組み合わせを含む、
前記第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；
のうちの１つ以上と、
（ｂ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ－１３ヒドロキシル基においてグリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；および
（ｃ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ－１９カルボキシル基においてグリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；
のうちの１つ以上とを、
さらに用い、
ここで、ポリペプチドの少なくとも１つは、組換えポリペプチドであり；および組換えポリペプチドによりステビオールグリコシド組成物を産生する、
前記方法。

【請求項22】

組換え宿主細胞が、真菌細胞、藻類細胞、または細菌細胞である、請求項２０または２１に記載の方法。

【請求項23】

真菌細胞が、酵母細胞を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

【請求項25】

組換え宿主細胞が、サッカロマイセス・セレビシエ細胞である；あるいは、組換え宿主細胞が、ヤロウィア・リポリティカ細胞である、請求項２０または２１に記載の方法。

【請求項26】

１つ以上のステビオールグリコシドを産生するin vitroの方法であって、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｅ、Ｙ１２８Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２５３Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｗ、Ｓ２８３Ｇ、Ｓ２８３Ｎ、Ｔ２８４Ｒ、Ｓ２８５Ｇ、Ｓ２８５Ｒ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含むポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；および
（ｂ）ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記第１の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；および／または
ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ２’のベータ１，２グリコシル化が可能な第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１５または８６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記第２の５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；と、
（ｃ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ－１３ヒドロキシル基においてグリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド；および
（ｄ）ステビオールまたはステビオールグリコシドをそのＣ－１９カルボキシル基においてグリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するポリペプチドを含む、
前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド
のうちの１つ以上と、
ならびに、植物由来のまたは合成のステビオール前駆体、ステビオール、ステビオールグリコシド前駆体、および／またはステビオールグリコシドとを、
反応混合物に加えることを含み、
ここで、ポリペプチドの少なくとも１つは、組換えポリペプチドであり；および組換えポリペプチドによりステビオールグリコシド組成物を産生し；
ここで、ＲｅｂＭは、反応混合物において少なくとも６００ｍｇ／Ｌの濃度で産生され；および産生されるＲｅｂＭを反応混合物から単離することをさらに含む、
前記方法。

【請求項27】

請求項２０～２６のいずれか一項に記載の方法であって、産生される１つ以上のステビオールグリコシドを細胞培養物または反応混合物から単離することをさらに含み；
ここで、単離する工程は、細胞培養物または反応混合物の液体相を、細胞培養物または反応混合物の固体相から分離して、産生される１つ以上のステビオールグリコシドを含む上澄みを得ること、および：
（ａ）産生される１つ以上のステビオールグリコシドの少なくとも一部を得るために、上澄みを１つ以上の吸着性樹脂と接触させること；あるいは
（ｂ）産生される１つ以上のステビオールグリコシドの少なくとも一部を得るために、上澄みを１つ以上のイオン交換または逆相クロマトグラフィーカラムと接触させること；あるいは、
（ｃ）産生される１つ以上のステビオールグリコシドを結晶化または抽出すること；
それにより、産生される１つ以上のステビオールグリコシドを単離すること
を含む、前記方法。

【請求項28】

請求項２０～２７のいずれか一項に記載の方法であって、１つ以上のステビオールグリコシドを細胞培養物または反応混合物から回収することをさらに含み；
ここで、回収される１つ以上のステビオールグリコシドは、ステビア植物のステビオールグリコシド組成物に対して、１つ以上のステビオールグリコシドが濃縮されており、および、植物由来のステビア抽出物から得られるステビオールグリコシド組成物に対して、減少したレベルのステビア植物由来成分を有する、
前記方法。

【請求項29】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞を含む、細胞培養物であって、細胞培養物は、
（ａ）組換え宿主細胞の細胞培養物中で、組換え宿主細胞によりまたは全細胞生物変換において産生される、ＲｅｂＭであって、
ＲｅｂＭは、細胞培養物において少なくとも６００ｍｇ／Ｌの濃度で産生される、前記ＲｅｂＭ；
（ｂ）ルブソシド、ステビオシド、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＥ、またはそれらの組み合わせ；
（ｃ）グルコース、スクロース、および／またはウリジン二リン酸（ＵＤＰ）－グルコース；ならびに
（ｄ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢおよび／またはアミノ酸を含む補助栄養
をさらに含み；
ここで、細胞培養物は、ステビア植物からのステビオールグリコシド組成物に対して、ＲｅｂＭが濃縮されており、および、植物由来のステビア抽出物に対して、減少したレベルのステビア植物由来成分を有する、
前記細胞培養物。

【請求項30】

請求項１～１７のいずれか一項に記載の宿主細胞からの細胞培養物可溶化液であって、
（ａ）組換え宿主細胞の細胞培養物中で、組換え宿主細胞によりまたは全細胞生物変換において産生される、ＲｅｂＭであって、
レバウディオサイドＭは、細胞培養物において少なくとも６００ｍｇ／Ｌの濃度で産生される、前記ＲｅｂＭ；
（ｂ）ルブソシド、ステビオシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＥ、またはそれらの組み合わせ；
（ｃ）グルコース、スクロース、および／またはＵＤＰ－グルコース；ならびに
（ｄ）微量金属、ビタミン、塩、ＹＮＢおよび／またはアミノ酸を含む補助栄養
を含み；
ここで、細胞培養物は、ステビア植物からのステビオールグリコシド組成物に対して、ＲｅｂＭが濃縮されており、および、植物由来のステビア抽出物に対して、減少したレベルのステビア植物由来成分を有する、
前記細胞培養物可溶化液。

【請求項31】

配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする、単離された核酸であって、
ここで、ポリペプチドは、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ５５Ｅ、Ｔ５５Ｋ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｅ、Ｙ１２８Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２５３Ｇ、Ｓ２５３Ｗ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｅ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｗ、Ｓ２８３Ｎ、Ｓ２８３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｓ２８５Ｇ、Ｓ２８５Ｒ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含むポリペプチドバリアントの１または２以上を含み、
ここで、核酸は、ｃＤＮＡである、
前記核酸。

【請求項32】

配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、ステビオールグリコシドの１３－Ｏ－グルコース、１９－Ｏ－グルコース、または１３－Ｏ－グルコースおよび１９－Ｏ－グルコースの両方のＣ３’のベータ１，３グリコシル化が可能な５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドであって、
ここで、ポリペプチドは、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｔ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２８５Ｒ、Ｓ２５３Ｗ、Ｓ２５３Ｇ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｅ、Ｓ２８３Ｎ、Ｓ２８３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｓ２８５Ｇ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰまたはＬ３７９Ｖを含むポリペプチドバリアントの１または２以上を含み、
ここで、ポリペプチドは、精製されたポリペプチドである、
前記５’－ＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書に開示された発明は、一般にステビオールグリコシド類の組換え産生の分野に関する。特に、本発明は、ステビオールグリコシドの組換え産生方法およびステビオールグリコシド類を含有する組成物を提供する。

【背景技術】

【0002】

甘味料は、食品、飲料、または製菓産業で最も一般に使用される成分としてよく知られている。甘味料は、製造中に最終的な食品に組み込まれるか、または適切に希釈してまたは卓上甘味料として単独での使用が可能である。甘味料としては、スクロース、高フルクトースコーンシロップ、モラセス、メープルシロップおよびハチミツなどの天然甘味料ならびにアスパルテーム、サッカリンおよびスクラロースなどの人工甘味料などが挙げられる。ステビア抽出物は、多年生低木であるステビア・レバウディアナから単離および抽出可能な天然甘味料である。ステビアは一般に、ステビア抽出物の商業的製造のために南アメリカおよびアジアで栽培されている。様々な程度に精製されたステビア抽出物は、食品中の高甘味度甘味料として商業的に使用され、卓上甘味料として、混合物または単独で使用されている。

【0003】

ステビア属植物の抽出物は、甘味に寄与するレバウディオサイド類および他のステビオールグリコシド類を含有するが、各グリコシドの量は異なる生産バッチ間でしばしば変動している。既存の商業的製品は、その大部分がレバウディオサイドＡであり、レバウディオサイドＣ、Ｄ、およびＦなどの他のグリコシド類がそれよりも少量を占める。ステビア抽出物は、異臭に寄与するか、または他の望ましくない効果を有する植物由来の化合物などの混入物も含有する可能性がある。これらの混入物は、食品システムまたは用途によっては、多かれ少なかれ問題となりうる。可能性のある混入物としては、色素、脂質、タンパク質、フェノール類、糖類、スパツレノールおよび他のセスキテルペン類、ラブダンジテルペン類、モノテルペン類、デカン酸、８，１１，１４‐エイコサトリエン酸、２‐メチルオクタデカン、ペンタコサン、オクタコサン、テトラコサン、オクタデカノール、スチグマステロール、β‐シトステロール、α‐およびβ‐アミリン、ルペオール、酢酸β‐アミリン、ペンタサイクリックトリテルペン類、センタウレジン、ケルセチン、エピ‐α‐カジノール、カリオフィレン類および誘導体、β‐ピネン、β‐シトステロール、およびジベレリンなどが挙げられる。

【0004】

ステビア属植物からのステビオールグリコシド類の回収および精製は、労働集約的で非効率であることが判明したため、限定するものではないがステビオシドなどの植物ベースの混入物が抑制されたレバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭなどの所望のステビオールグリコシド類を高収量で産生可能な組換え産生システムが依然必要とされている。ステビオールグリコシド産生サッカロマイセス・セレビシエ株ならびにin vitroの生物変換および生合成が、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７号に記載されており、それらの全開示を参照により本明細書に組み込むものである。

【0005】

自然界では、ウリジン二リン酸ステビア依存性グリコシルトランスフェラーゼ７６Ｇ１（ＵＧＴ７６Ｇ１）は、ステビオール骨格の数種類のグリコシル化反応を触媒し、ステビオールグリコシド類の産生をもたらす。最近、ＵＧＴ７６Ｇ１が１，２‐ステビオシドをレバウディオサイドＡに、１，２‐ビオシドをレバウディオサイドＢに変換できることが示された（Richman et al., 2005, The Plant Journal 41:56-67参照）。従って、当該分野において、ＵＧＴ７６Ｇ１または他のＵＧＴ酵素によりグリコシル化レバウディオサイド類を産生することに向けられた反応を同定することが必要とされている。特に、ＵＧＴ７６Ｇ１により触媒される他の反応を探索または同定する必要があり、さらにレバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭなどのステビオールグリコシド類をより高い収量で産生するためにＵＧＴ７６Ｇ１の触媒性能を向上する必要がある。

【発明の概要】

【0006】

上記のような背景に鑑みて、本発明は従来技術に対して所定の利点および進歩を提供するものである。

【0007】

特に、本発明は、レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭの生合成ならびに遺伝的に改変された細胞からのレバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭの調製に関する。

【0008】

具体的な実施態様では、本発明は、生合成速度および収量を著しく改善した遺伝的に改変された細胞からのレバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭの調製を目的とする。

【0009】

本開示は、ステビオールグリコシド類の産生に関する。特に、本開示は、限定するものではないが、組換え微生物などの組換え宿主において、生物変換を通じて、およびin vitroで、レバウディオサイドＭ：（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）‐５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イル（１Ｒ，５Ｒ，９Ｓ，１３Ｒ）‐１３‐｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）‐５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イル］オキシ｝‐５，９‐ジメチル‐１４‐メチリデンテトラシクロ［１１．２．１．０^１，１０．０^４，９］ヘキサデカン‐５‐カルボン酸
およびレバウディオサイドＤ：
４，５‐ジヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３‐｛［３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝オキサン‐２‐イル１３‐｛［５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イル］オキシ｝‐５，９‐ジメチル‐１４‐メチリデンテトラシクロ［１１．２．１．０^１，１０．０^４，９］ヘキサデカン‐５‐カルボン酸などのステビオールグリコシド類の産生に関する。

【0010】

従って、ある側面では、本開示は、その発現がレバウディオサイドＭおよびレバウディオサイドＤなどのステビオールグリコシド類の産生をもたらす１または２以上の生合成遺伝子を含む、組換え宿主、例えば微生物、を提供する。

【0011】

特に、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、およびＵＧＴ９１Ｄ２などの本明細書に記載の１または２以上のウリジン５’‐ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼ類の発現が、組換え宿主または所定のin vitroのシステムにおけるレバウディオサイドＭまたはレバウディオサイドＤの産生および蓄積を促進する。

【0012】

本明細書に開示される本発明は特定の利点または機能に限定されるものではないが、本発明は、ステビア抽出物に対して、少なくとも１つが植物由来の化合物であるステビア由来混入物のレベルが減少した、約１％～約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＭを含む組成物を提供する。ある例では、植物由来の混入化合物は、特に異臭に寄与することができる。

【0013】

いくつかの側面では、約１％～約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＭを含む組成物は、ステビア抽出物に対して、少なくとも１つが植物由来の化合物であるステビア由来混入物を０．１％未満有する。ある例では、植物由来の混入化合物が特に異臭に寄与する。

【0014】

本発明は、更に、上記の組成物を含む食品を提供する。

【0015】

いくつかの側面では、食品は、飲料または飲料濃縮物である。

【0016】

【0017】

（ｇ）ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｈ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｉ）ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｊ）ＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；および
（ｋ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
を発現する組換え宿主細胞であって、
少なくとも１つの前記遺伝子が組換え遺伝子であり、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、および／またはレバウディオサイドＩを産生する、前記細胞を提供する。

【0018】

本発明は、更に、
（ａ）ＧＧＰＰＳをコードする組換え遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ‐コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｃ）カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｄ）カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｅ）ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｆ）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｇ）ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｈ）ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｉ）ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｊ）ＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；および
（ｋ）ＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
を含む外来性核酸を含む組換え宿主細胞であって、
レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、および／またはレバウディオサイドＩを産生する、前記細胞を提供する。

【0019】

本発明は、更に少なくとも１つのポリペプチドが細胞に導入された外来性または異種遺伝子によりコードされている、ＧＧＰＰＳ、ｅｎｔ‐コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド、カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、ＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド、およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞であって、
ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する、前記細胞を提供する。

【0020】

いくつかの側面では、個々のレバウディオサイド類を標的とする産生は、ＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ活性の相対レベルを制御することで達成可能である（図１参照）。

【0021】

いくつかの側面では、個々のレバウディオサイド類を標的とする産生は、組換え細胞におけるＵＧＴをコードする遺伝子（図１参照）のコピー数の差異、プロモーター強度の差異および／または目的とする産生物への特異性／活性が向上した変異体の利用により達成可能である。例えば、もしＥＵＧＴ１１が、レバウディオサイドＡの生成に有利な他のＵＧＴと比較して低いレベルで発現されると、レバウディオサイドＤ、Ｅ、およびＭは低いレベルで生成されるであろう。ＥＵＧＴ１１の発現レベルが高いと、レバウディオサイドＭを生成するためにＵＧＴ７６Ｇ１の基質として働く１９‐Ｏ１，２ジグルコシドがより多く産生される。ある有利な実施態様では、本発明の組換え細胞におけるＵＧＴ７６Ｇ１の追加のコピーまたは変異体バージョンは、レバウディオサイドＤからのレバウディオサイドＭの生成速度を向上可能である。

【0022】

いくつかの実施態様では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、１９‐Ｏ位でステビオールおよびステビオールグリコシド類のグリコシル化を触媒する。従って、いくつかの実施態様では、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）、またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）の１または２以上が、生物変換すなわちin vitroでのＵＧＴ７６Ｇ１による触媒作用により、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現する組換え宿主中で産生される。いくつかの実施態様では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、１３‐Ｏ位でステビオールおよびステビオールグリコシド類のグリコシル化を触媒し、好ましくは、１３‐Ｏ位で１，２‐ジグリコシル化または１３‐Ｏ位でモノグリコシル化されるステビオールグリコシド基質をグリコシル化する。いくつかの実施態様では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、１９‐Ｏ位のグリコシル化の状態の優先を示さない。

【0023】

いくつかの側面では、ＧＧＰＰＳは、配列番号２４に記載のシネココッカス属ＧＧＰＰＳを含む。

【0024】

いくつかの側面では、ＣＤＰポリペプチドは、葉緑体トランジットペプチドを欠いている、配列番号１３に記載のＺ．メイズＣＤＰＳポリペプチドを含む。

【0025】

いくつかの側面では、ＫＯポリペプチドは、配列番号２５に記載のＳ．レバウディアナＫＯポリペプチドのアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するＫＯポリペプチドを含む。

【0026】

いくつかの側面では、ＫＳポリペプチドは、配列番号２１に記載のＡ．タリアナＫＳポリペプチドのアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するＫＳポリペプチドを含む。

【0027】

いくつかの側面では、ＫＡＨポリペプチドは、配列番号１１に記載のＳ．レバウディアナＫＡＨアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するＫＡＨポリペプチドを含む。

【0028】

いくつかの側面では、ＣＰＲポリペプチドは、配列番号４に記載のＳ．レバウディアナＣＰＲアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＣＰＲポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列のＡ．タリアナＣＰＲポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含む。

【0029】

いくつかの側面では、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含む。

【0030】

いくつかの側面では、ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含む。

【0031】

いくつかの側面では、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含む。

【0032】

いくつかの側面では、ＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含む。

【0033】

いくつかの側面では、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含む。

【0034】

いくつかの側面では、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号２のＴ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２８５Ｒ、Ｓ２８５Ｔ、Ｓ２５３Ｗ、Ｓ２５３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８５Ｇ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰおよびＬ３７９Ｖを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む。

【0035】

いくつかの側面では、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｒ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｅ、Ｓ２８３ＧおよびＳ２８３Ｎを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む。

【0036】

いくつかの側面では、組換え宿主細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。

【0037】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ヤロウィア・リポリティカ、カンジダ・グラブラタ、アシュビア・ゴシピー、サイバリンドネラ・ジャディニ、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、カンジダ・ボイジニイ、アークスラ・アデニニボランス、キサントフィロミセス・デンドロロウス、またはカンジダ・アルビカンス種由来の細胞である。

【0038】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0039】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0040】

本発明は、更に、レバウディオサイドＤを産生する本明細書に開示の細胞を提供する。

【0041】

本発明は、更に、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、またはレバウディオサイドＩを産生する本明細書に開示の細胞を提供する。

【0042】

本発明は、更に、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する本明細書に開示の細胞を提供する。

【0043】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤは、本明細書で開示される細胞中で約１，０００ｍｇ／Ｌ～約２，９００ｍｇ／Ｌの間の濃度で産生される。

【0044】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭは、本明細書で開示される細胞中で約１：１～約１．７：１の間の比で産生される。

【0045】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭは、本明細書で開示される細胞中で約６００ｍｇ／Ｌ～約２，８００ｍｇ／Ｌの間の濃度で産生される。

【0046】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭおよびレバウディオサイドＤは、本明細書で開示される細胞中で約０．６：１～約１．１：１の間の比で産生される。

【0047】

本発明は、更に、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する方法であって、
（ａ）ＧＧＰＰＳ；ｅｎｔ‐コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチド；カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチド；カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチド；ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチド；シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチド；ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド；およびＥＵＧＴ１１ポリペプチドをコードする遺伝子が発現され、前記遺伝子の発現を誘導することまたは前記遺伝子を構成的に発現することを含む条件下、培地において組換え細胞を培養すること；および
（ｂ）細胞中でレバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を合成すること；および任意に
（ｃ）レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を単離すること
を含む、前記方法を提供する。

【0048】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤは、本明細書で開示される細胞により産生される。

【0049】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱまたはレバウディオサイドＩは、本明細書で開示される細胞により産生される。

【0050】

いくつかの側面では、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）は、本明細書で開示される細胞により産生される。

【0051】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤは、約１，０００ｍｇ／Ｌ～約２，９００ｍｇ／Ｌの間の濃度で産生される。

【0052】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭは、約１：１～約１．７：１の間の比で産生される。

【0053】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭは、約６００ｍｇ／Ｌ～約２，８００ｍｇ／Ｌの間の濃度で産生される。

【0054】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭおよびレバウディオサイドＤは、約０．６：１～約１．１：１の間の比で産生される。

【0055】

いくつかの側面では、本明細書で開示される方法を実施する細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。

【0056】

【0057】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0058】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0059】

本発明は、更に、ＵＧＴポリペプチドの１または２以上を使用した植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類のin vitroの生物変換により、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する方法を提供する。

【0060】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを産生する前記方法は、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；
配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；
配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチドまたはそれらの組み合わせ、を含むＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド；または
配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドを使用することを含む。

【0061】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤの産生に使用するステビオールグリコシドは、ステビオシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＥ、またはその混合物を含む。

【0062】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭの産生に使用するステビオールグリコシドは、ステビオシド、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＤ、またはその混合物を含む。

【0063】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＱを産生する方法は、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；または配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドを使用することを含む。

【0064】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＱを産生するために使用するステビオールグリコシドは、ルブソシド、ＲｅｂＧ、またはその混合物を含む。

【0065】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＩを産生する方法は、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチド；またはそれらの組み合わせを含むＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドを使用することを含む。

【0066】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＩを産生するために使用するステビオールグリコシドは、１，２‐ステビオシド、ＲｅｂＡ、またはその混合物を含む。

【0067】

いくつかの側面では、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する方法が
配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；または配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドを使用することを含む。

【0068】

いくつかの側面では、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）の産生に使用するステビオールグリコシドが、ステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシドを含む。

【0069】

いくつかの側面では、トリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する方法は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドを使用することを含む。

【0070】

いくつかの側面では、トリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）の産生に使用するステビオールグリコシドは、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）、ステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシド、またはその混合物を含む。

【0071】

いくつかの側面では、本明細書に記載の生物変換方法は、酵素生物変換または全細胞生物変換を含む。

【0072】

いくつかの側面では、本明細書に開示の方法を実施する細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。

【0073】

【0074】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0075】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0076】

本発明は、更に、外来性核酸を含む組換え宿主細胞であって、
（ａ）ＧＧＰＰＳをコードする組換え遺伝子；
（ｂ）ｅｎｔ‐コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｃ）カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｄ）カウレンシンターゼ（ＫＳ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｅ）ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；
（ｆ）シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子；および／または
（ｇ）１または２以上のＵＧＴポリペプチドをコードする１または２以上の組換え遺伝子；
を含み、
レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、またはレバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する、前記細胞を提供する。

【0077】

前記組換え宿主細胞いくつかの側面では、ＧＧＰＰＳは、配列番号２４に記載のシネココッカス属ＧＧＰＰＳを含み；ＣＤＰポリペプチドは、葉緑体トランジットペプチドを欠いている、配列番号１３に記載のＺ．メイズＣＤＰＳポリペプチドを含み；ＫＯポリペプチドが、配列番号２５に記載のＳ．レバウディアナＫＯポリペプチドのアミノ酸配列と７０％以上の同一性を有するＫＯポリペプチドを含み；ＫＳポリペプチドが、配列番号２１に記載のＡ．タリアナＫＳポリペプチドのアミノ酸配列と４０％以上の同一性を有するＫＳポリペプチドを含み；ＫＡＨポリペプチドが、配列番号１１に記載のＳ．レバウディアナＫＡＨアミノ酸配列と６０％以上の同一性を有するＫＡＨポリペプチドを含み；ＣＰＲポリペプチドが、配列番号４に記載のＳ．レバウディアナＣＰＲアミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＣＰＲポリペプチド、配列番号９に記載のアミノ酸配列のＡ．タリアナＣＰＲポリペプチド；またはそれらの組み合わせを含む。

【0078】

いくつかの側面では、細胞は、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを産生し、ＵＧＴポリペプチドが、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；
配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；
配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチド；またはそれらの組み合わせを含むＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド；または
配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドである。

【0079】

いくつかの側面では、細胞は、レバウディオサイドＱを産生し、ここでＵＧＴポリペプチドは、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；または配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドである。

【0080】

いくつかの側面では、細胞は、レバウディオサイドＩを産生し、ここでＵＧＴポリペプチドは、
配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；または配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチド；またはそれらの組み合わせを含むＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドである。

【0081】

いくつかの側面では、細胞は、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生し、ここでＵＧＴポリペプチドは
配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；または配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドである。

【0082】

いくつかの側面では、細胞は、トリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生し、ＵＧＴポリペプチドは、
配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；または配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチドである、少なくとも１つのＵＧＴポリペプチドである。

【0083】

【0084】

【0085】

いくつかの側面では、組換え宿主細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。

【0086】

【0087】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0088】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0089】

本発明は、更に、本明細書で開示される組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドＤを産生する方法を提供する。

【0090】

本発明は、更に、本明細書で開示される組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドＭを産生する方法を提供する。

【0091】

本発明は、更に、本明細書で開示される組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドＱを産生する方法を提供する。

【0092】

本発明は、更に、本明細書で開示される組換え細胞を使用する発酵によりレバウディオサイドＩを産生する方法を提供する。

【0093】

本発明は、更に、本明細書で開示される組換え細胞を使用する発酵によりジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する方法を提供する。

【0094】

本発明は、更に、本明細書で開示される組換え細胞を使用する発酵により、トリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する方法を提供する。

【0095】

【0096】

【0097】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0098】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0099】

本発明は、更に、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを産生するin vitroの方法であって、
（ａ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチドまたはそれらの組み合わせを含むＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド；配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の１または２以上を反応混合物に添加すること；および
（ｂ）反応混合物中でレバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを合成すること；および任意に
（ｃ）反応混合物中でレバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを単離すること
を含む、前記方法を提供する。

【0100】

本発明は、更に、レバウディオサイドＱを産生するin vitroの方法であって、
（ａ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の１または２以上を反応混合物に添加すること；および
（ｂ）反応混合物中でレバウディオサイドＱを合成すること；および任意に
（ｃ）反応混合物中でレバウディオサイドＱを単離すること
を含む、前記方法を提供する。

【0101】

本発明は、更に、レバウディオサイドＩを産生するin vitroの方法であって
（ａ）配列番号２６に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドを含むＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；配列番号２６に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドまたはその機能的ホモログ、配列番号１５の残基２１１および２８６において置換を有するＵＧＴ９１ｄ２ｅポリペプチド；またはそれらの組み合わせを含むＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の１または２以上を反応混合物に添加すること；および
（ｂ）反応混合物中でレバウディオサイドＩを合成すること；および任意に
（ｃ）反応混合物中でレバウディオサイドＩを単離すること
を含む、前記方法を提供する。

【0102】

本発明は、更に、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生するin vitroの方法であって
（ａ）配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の１または２以上を反応混合物に添加すること；および
（ｂ）反応混合物中でジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を合成すること；および任意に
（ｃ）反応混合物中でジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を単離すること
を含む、前記方法を提供する。

【0103】

本発明は、更に、トリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生するin vitroの方法であって、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列と５０％以上の同一性を有するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；配列番号１９に記載のアミノ酸配列と５５％以上の同一性を有するＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドを含むＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；配列番号１６に記載のＯｓ０３ｇ０７０２０００アミノ酸配列と６５％以上の同一性を有するＥＵＧＴ１１ポリペプチドを含むＥＵＧＴ１１ポリペプチド、および植物由来または合成ステビオールまたはステビオールグリコシド類の１または２以上を反応混合物に添加すること；および
（ｂ）反応混合物中でトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を合成すること；および任意に
（ｃ）反応混合物中でトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を単離すること
を含む、前記方法を提供する。

【0104】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＤを産生するためのＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｒ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｅ、Ｓ２８３ＧおよびＳ２８３Ｎからなる群から選択されるＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む。

【0105】

いくつかの側面では、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド、およびトリグリコシル化ステビオールグリコシドを産生するためのＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、配列番号２のＴ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２８５Ｒ、Ｓ２８５Ｔ、Ｓ２５３Ｗ、Ｓ２５３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８５Ｇ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰおよびＬ３７９Ｖからなる群から選択されるＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む。

【0106】

いくつかの側面では、開示されたin vitroの方法は、酵素のin vitroの方法または全細胞のin vitroの方法である。

【0107】

いくつかの側面では、本明細書で開示される方法を実行する細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞または細菌細胞である。

【0108】

【0109】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0110】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0111】

本発明は、更に、本明細書で開示される方法により産生されたレバウディオサイドＱを提供する。

【0112】

本発明は、更に、本明細書で開示される方法により産生されたレバウディオサイドＩを提供する。

【0113】

本発明は、更に、本明細書で開示される方法により産生されたジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を提供する。

【0114】

本発明は、更に、本明細書で開示される方法により産生されたトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を提供する。

【0115】

本発明は、更に、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生するために使用するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドであって、配列番号２に記載のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドまたは配列番号２のＴ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２８５Ｒ、Ｓ２８５Ｔ、Ｓ２５３Ｗ、Ｓ２５３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８５Ｇ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰおよびＬ３７９Ｖを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記ポリペプチドを提供する。

【0116】

本発明は、更に、レバウディオサイドＤを産生するために使用するＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドであって、配列番号２のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドまたは配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｒ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｅ、Ｓ２８３ＧおよびＳ２８３Ｎを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記ポリペプチドを提供する。

【0117】

本発明は、更に、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドが、配列番号２のＴ５５Ｋ、Ｔ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｙ１２８Ｓ、Ｙ１２８Ｅ、Ｈ１５５Ｌ、Ｈ１５５Ｒ、Ｑ１９８Ｒ、Ｓ２８５Ｒ、Ｓ２８５Ｔ、Ｓ２５３Ｗ、Ｓ２５３Ｇ、Ｔ２８４Ｒ、Ｔ２８４Ｇ、Ｓ２８５Ｇ、Ｋ３３７Ｅ、Ｋ３３７ＰおよびＬ３７９Ｖを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記細胞を提供する。

【0118】

いくつかの側面では、本明細書で開示される組換え宿主細胞は、レバウディオサイドＤを産生する。

【0119】

本発明は、更に、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む組換え宿主細胞であって、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドが、配列番号２のＱ２３Ｇ、Ｑ２３Ｈ、Ｉ２６Ｆ、Ｉ２６Ｗ、Ｔ１４６Ａ、Ｔ１４６Ｇ、Ｔ１４６Ｐ、Ｈ１５５Ｒ、Ｌ２５７Ｐ、Ｌ２５７Ｗ、Ｌ２５７Ｔ、Ｌ２５７Ｇ、Ｌ２５７Ａ、Ｌ２５７Ｒ、Ｌ２５７Ｅ、Ｓ２８３ＧおよびＳ２８３Ｎを含むＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドバリアントの１または２以上を含む、前記細胞を提供する。

【0120】

いくつかの側面では、本明細書で開示される組換え宿主細胞は、レバウディオサイドＭ、レバウディオサイドＱ、レバウディオサイドＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）、またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）を産生する。

【0121】

いくつかの側面では、組換え宿主細胞は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、または細菌細胞である。

【0122】

【0123】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロミケス属である。

【0124】

いくつかの側面では、酵母細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞である。

【0125】

本発明は、更に、約１％～約９９％ｗ／ｗのレバウディオサイドＤを含む組成物であって、ステビア抽出物に対してステビア由来混入物のレベルが減少した、前記組成物を提供する。ある例では、少なくとも１つの混入物が、ステビオールグリコシド産生物中で特に異臭に寄与する植物由来の化合物である。

【0126】

いくつかの側面では、組成物は、ステビア抽出物に対して０．１％未満のステビア由来混入物を有する。ある例では、少なくとも１つの混入物が、ステビオールグリコシド産生物中で特に異臭に寄与する植物由来の化合物である。

【0127】

本発明は、更に、本明細書で開示される組成物を含む食品を提供する。

【0128】

いくつかの側面では、食品は、飲料または飲料濃縮物である。

【0129】

本明細書に記載される宿主は、微生物（例えば、サッカロマイセス・セレビシエなどのサッカロミケス属、または大腸菌）、または植物または植物細胞（例えば、ステビア・レバウディアナなどのステビア属またはフィスコミトレラ属）であってもよい。

【0130】

本発明の上記および他の特徴ならびに利点は、下記の本発明の詳細な説明と添付の請求の範囲からさらに詳しく理解されるであろう。請求の範囲は、その記述により定義されるものであり、本明細書に記載の具体的な特徴や利点の説明により定義されるものではないことに留意されたい。

【図面の簡単な説明】

【0131】

下記の本発明の実施の態様の詳細な記載は、以下の図面と組み合わせて読むと最もよく理解することができるであろう。図面では同様の構造は同様の符号により示される。

【0132】

【図1】図１は、ステビオールグリコシドグリコシル化反応およびそれを触媒する酵素を示す。

【0133】

【図2】図２は、レバウディオサイドＭ（ＲｅｂＭ）の化学構造を示す。

【0134】

【図3】図３は、レバウディオサイドＤ（ＲｅｂＤ）の化学構造を示す。

【0135】

【図4】図４は、ステビオールの産生のための生化学経路を示す。

【0136】

【図5】図５は、保持時間１．３１分でのヘキサグリコシル化ステビオールグリコシドの生成を示す液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ‐ＭＳ）の代表的なクロマトグラムである。上から下へのトレースは、表１２に示すｍ／ｚに対応する。

【0137】

【図6】図６は、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド類を単離する方法の模式図である。

【0138】

【図7】図７は、フラッシュクロマトグラフィー後の半精製したヘキサグリコシル化ステビオールグリコシドの液体クロマトグラフィー・四重極飛行時間型（ＬＣ‐ＱＴＯＦ）分析法により得た代表的なクロマトグラムおよびマススペクトルである。

【0139】

【図8】図８Ａは、ＥＦＳＣ３０４４酵母株の発酵により産生された化合物を示すクロマトグラムである。図８Ｂは、ステビオール‐１，２‐ビオシドの類似体である、図示したジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）のＮＭＲ構造である。ジグリコシル化ステビオールグリコシドのＩＵＰＡＣ名は、（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ）‐１３‐ヒドロキシ‐５，９‐ジメチル‐１４‐メチリデンテトラシクロ［１１．２．１．０^１，１０．０^４，９］ヘキサデカン‐５‐カルボン酸（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐４，５‐ジヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３‐｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝オキサン‐２‐イルである。図８Ｃは、ＲｅｂＢの異性体である、図示したトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステルのＮＭＲ構造の構造である。トリグリコシル化ステビオールグリコシドのＩＵＰＡＣ名は、（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，９Ｓ，１０Ｒ，１３Ｓ）‐１３‐ヒドロキシ‐５，９‐ジメチル‐１４‐メチリデンテトラシクロ［１１．２．１．０^１，１０．０^４，９］ヘキサデカン‐５‐カルボン酸（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）‐５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イルである。

【0140】

【図9】図９は、ＥＦＳＣ３２６１酵母株によるＲｅｂＤ産生を示す。最少培地（ＭＭ）におけるＥＦＳＣ３２６１酵母株の４つの発酵を示す。

【0141】

【図10】図１０は、ＥＦＳＣ３２９７酵母株によるＲｅｂＤおよびＲｅｂＭ産生を示す。

【0142】

【図11】図１１は、ＥＦＳＣ３８４１酵母株によるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＡ産生を示す。

【0143】

【図12】図１２は、ＵＧＴ７６Ｇ１の１または２以上のコピーで産生されたＲｅｂＤ／ＲｅｂＭを比較するものである。

【0144】

【図13】図１３Ａは、ＵＧＴ７６Ｇ１によるＲｅｂＤの消費およびＲｅｂＭの産生の相対速度を示す。図１３Ｂは、ＵＧＴ７６Ｇ１によるＲｅｂＥの消費およびＲｅｂＭおよびＲｅｂＤの産生の相対速度を示す。

【0145】

【図14】図１４は、ＵＧＴ７６Ｇ１の３つの相同性モデルにおける分散を示す。

【0146】

【図15】図１５Ａは、９６および４ｘ２４ディープウェルプレートにおけるＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの産生の散布図である；図１５Ｂは、９６および４ｘ２４ディープウェルプレートにおけるＲｅｂＤおよびＲｅｂＭ産生の箱ひげ図であり、図１５Ｃは、９６および４ｘ２４ディープウェルプレートにおけるＲｅｂＤ／ＲｅｂＭ産生の箱ひげ図である。

【0147】

【図16】図１６は、初期のＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異スクリーニングのすべてのデータ点を、黒い三角形で示す野生型産生とともに示す。

【0148】

【図17】図１７は、更なる試験のために選択した上位のＲｅｂＤおよびＲｅｂＭを産生するコロニーを示す。

【0149】

【図18】図１８は、３つずつ行ったＵＧＴ７６Ｇ１のＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの上位産生者（図１７に示す）の再スクリーニングであり、最初のスクリーニングと同じ傾向を示している。

【0150】

【図19】図１９Ａは、ＵＧＴ７６Ｇ１によるルブソシドの消費および１，３‐ステビオシド（ＲｅｂＧ）およびレバウディオサイドＱ（「ＲｅｂＱ」）の産生の相対速度を示す。図１９Ｂは、ＵＧＴ７６Ｇ１による１，２‐ステビオシドの消費およびＲｅｂＡの産生の相対速度を示す。図１９Ｃは、ＵＧＴ７６Ｇ１による１，２‐ビオシドの消費およびＲｅｂＢの産生の相対速度を示す。

【0151】

【図20】図２０は、ＵＧＴ７６Ｇ１を使用した場合また使用しなかった場合の１，２‐ステビオシドおよびＲｅｂＡのクロマトグラムを示し、ピークはＲｅｂＩの産生を示している。

【0152】

図面の要素は簡略化および明瞭化されて示されており、必ずしも一定の比率で描かれていないことは、当業者には明らかであろう。本発明の実施態様の理解を助けるために、例えば、図面のいくつかの要素の寸法は、他の要素に対して強調されている場合もある。

【0153】

発明の詳細な説明
本明細書で挙げたすべての文献、特許、申請特許は、あらゆる目的のために参照により本明細書に明白に組み込むものである。

【0154】

本発明による遺伝的発現構築物および組換え細胞を構築するために、当業者に公知の方法が使用可能である。これらの方法としては、in vitroの組換えＤＮＡ技術、合成技術、in vivo組換え技術、およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術などが挙げられる。例えば、Maniatis et al., 1989, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, New York, and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., 1990, Academic Press, San Diego, CA)に記載の技術を参照できる。

【0155】

本発明を詳細に説明する前に、多数の用語を定義する。本明細書で使用する場合、単数で記載されたものは、文脈上はっきりと言及しない限り、複数を含むものである。例えば、「核酸」とは、１または２以上の核酸を意味する。

【0156】

「好ましい」、「通常」、および「一般に」などの用語は、請求する発明の範囲を限定するために、またはある特徴が、請求する発明の構造または機能に重大で、必須で、重要であることを示唆するために使用されているものではないことに留意されたい。むしろ、これらの用語は、本発明の具体的な実施態様で使用可能または不可能な他のまたは追加の特徴を単に強調することを意図する。

【0157】

本発明を記述および定義する目的で、「実質的に」という用語は、本明細書では、任意の定量的比較、値、測定、または他の表示に起因するであろう固有の不確かさの程度を表すために使用されることに留意されたい。「実質的に」という用語は、問題となっている主題の基本的な機能における変化をもたらすことなしに、定量的表示が記述された参照から変動可能な程度を示すためにも使用される。

【0158】

本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「オレゴヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、その誘導体、またはその組み合わせを含む核酸を意味するために互換的に使用可能である。

【0159】

本明細書で使用される「および／または」という用語は、複数の成分を組み合わせてまたは相互に排他的に記載するために使用される。例えば、「ｘ、ｙ、および／またはｚ」は、「ｘ」単独、「ｙ」単独、「ｚ」単独、「ｘ、ｙ、およびｚ、」「（ｘおよびｙ）またはｚ、」または「ｘまたはｙまたはｚ」を意味することが可能である。いくつかの実施態様では、「および／または」は、ある群から選択された１または２以上の外来性核酸を含む組換え細胞が含む外来性核酸を意味するために使用する。いくつかの実施態様では、「および／または」は、ある群から選択された１または２以上のステビオールグリコシド類が産生される、ステビオールグリコシド類の産生を意味するために使用する。いくつかの実施態様では、「および／または」は、１または２以上のステビオールグリコシド類が、以下の工程の１または２以上を介して産生されるステビオールグリコシド類の産生を意味するために使用する：組換え細胞を培養すること、細胞において１または２以上のステビオールグリコシド類を合成すること、および１または２以上のステビオールグリコシド類を単離すること。

【0160】

高度にグリコシル化されたステビオールグリコシド類が、ステビア属植物に微量に、しかし、食品および飲料システムでのそのようなグリコシド類を使用するためには植物からの抽出が非実用的である程度に低いレベルで存在している可能性がある。Hellfritsch et al., J. Agric. Food Chem. 60: 6782-6793 (2012); DuBois GE, Stephenson RA., J Med Chem. Jan; 28:93-98 (1985); and US Patent Publication 2011-0160311参照。

【0161】

一般に、ステビオシドおよびレバウディオサイドＡは、商業的に産生されるステビア抽出物中における主要な化合物である。ステビオシドは、レバウディオサイドＡよりも、苦みが多く、甘みの少ない味であると報告されている。ステビア抽出物の組成は、植物が育つ土壌や気候に依存して、ロット毎に変動する可能性がある。原料の植物、気候条件、および抽出プロセスに依存して、商業的調製物中のレバウディオサイドＡの量は、ステビオールグリコシド全含有量の２０～９７％の範囲で変動すると報告されている。

【0162】

他のステビオールグリコシド類は、ステビア抽出物中に様々な量で存在する。例えば、レバウディオサイドＢは一般に１～２％未満存在し、一方レバウディオサイドＣは７～１５％の高いレベルで存在する可能性がある。レバウディオサイドＤは一般に２％以下のレベルで存在し、レバウディオサイドＦは一般に全ステビオールグリコシド類の３．５％以下で組成物に存在する。限定するものではないがレバウディオサイドＭなどの微量なステビオールグリコシド類の量は、ステビア抽出物のフレーバープロフィールに影響を与える可能性がある。

【0163】

更に、レバウディオサイドＤおよび他の高グリコシル化ステビオールグリコシド類は、レバウディオサイドＡよりも質の高い甘味料であると考えられている。従って、本明細書に記載される組換え宿主および方法は、例えば、多くの強力な甘味料より機能性および感覚性特徴が優れた無カロリー甘味料としての使用のためにレバウディオサイドＤの量が増加したステビオールグリコシド組成物を産生するために特に有用である。

【0164】

ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシドであるレバウディオサイドＭは、ステビア属植物に存在すると報告されており、ＩＵＰＡＣ名は（１Ｒ，５Ｒ，９Ｓ，１３Ｒ）‐１３‐｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）‐５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イル］オキシ｝‐５，９‐ジメチル‐１４‐メチリデンテトラシクロ［１１．２．１．０^１，１０．０^４，９］ヘキサデカン‐５‐カルボン酸（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）‐５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）‐３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イルである。Ohta et al., MassBank record: FU000341, FU000342, FU000343 (2010) and Ohta et al (J. Applied Glycosides, 57(3):199-209, 2010)参照。レバウディオサイドＭのＣＡＳ番号は、１２２０６１６‐４４‐３である。レバウディオサイドＭの構造は図２参照。

【0165】

ペンタグリコシル化ステビオールグリコシドであるレバウディオサイドＤも、ステビア属植物に存在すると報告されており、ＩＵＰＡＣ名は、４，５‐ジヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３‐｛［３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝オキサン‐２‐イル１３‐｛［５‐ヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）‐３，４‐ビス（｛［３，４，５‐トリヒドロキシ‐６‐（ヒドロキシメチル）オキサン‐２‐イル］オキシ｝）オキサン‐２‐イル］オキシ｝‐５，９‐ジメチル‐１４‐メチリデンテトラシクロ［１１．２．１．０^１，１０．０^４，９］ヘキサデカン‐５‐カルボン酸である。レバウディオサイドＤのＣＡＳ番号は、６４８４９‐３９‐４である。レバウディオサイドＤの構造は図３を参照。

【0166】

本明細書では、レバウディオサイドＭまたはレバウディオサイドＤの新規生合成に有用なポリペプチドを発現する微生物などの組換え宿主が提供される。本明細書に記載される宿主は、ステビオールグリコシド類を産生するのに好適な１または２以上のウリジン５’‐ジホスホ（ＵＤＰ）グリコシルトランスフェラーゼを発現する。様々な微生物システムにおけるこれらの生合成ポリペプチドの発現は、糖類、グリセロール、ＣＯ_２、Ｈ_２、および日光などのエネルギーおよび炭素源から一貫した再現できる方法でステビオールグリコシド類を産生することを可能とする。組換え宿主により産生された各ステビオールグリコシドの割合は、一貫した味プロフィールを持つ甘味料組成物を産生するように、宿主の中へ予め選択した生合成酵素を組み入れ、それらを適切なレベルで発現させることにより調整できる。さらに、組換え宿主により産生されたステビオールグリコシド類の濃度は、ステビア属植物中に産生されるステビオールグリコシド類のレベルより高いことが期待され、それにより下流の精製の効率が向上する。そのような甘味料組成物は、ステビア抽出物中に存在する混入物の量に対して、植物ベースの混入物をほとんどあるいは全く含有しないという利点がある。

【0167】

ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチド；ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチド；ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチド；またはＵＧＴ９１ｄ２ポリペプチドをコードする遺伝子の少なくとも１つが組換え遺伝子であり、その具体的な組換え遺伝子は使用する種または株に依存する、開示された方法を実施することおよび組換え宿主細胞が提供される。ステビオールグリコシド収量を増加し、エネルギーおよび炭素源をステビオールおよびそのグリコシド類に変換する効率を改善し、および／または細胞培養物からの生産性を高めるために、追加の遺伝子または生合成モジュールを含むことができる。本明細書で使用される「生合成モジュール」とは、一般的な生合成経路の一部分であり、従って組換え生物体中でしばしば共発現される遺伝子のコレクションを意味する。本明細書で使用されるそのような追加の生合成モジュールには、テルペノイド前駆体であるイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸の合成に関与する遺伝子が含まれる。追加の生合成モジュールとしては、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼおよびコパリル二リン酸シンターゼをコードする遺伝子などのテルペンシンターゼおよびテルペンシクラーゼ遺伝子が挙げられ、これらの遺伝子は、内在性の遺伝子または組換え遺伝子であることができる。

【0168】

Ｉ．ステビオールおよびステビオールグリコシド生合成ポリペプチド
Ａ．ステビオール生合成ポリペプチド
ステビオールを産生する生化学経路では、前駆体であるゲラニルゲラニル二リン酸（ＧＧＤＰＳにより触媒される）の生成、（‐）コパリル二リン酸（ＣＤＰＳにより触媒される）への環化、その後（‐）‐カウレン（ＫＳにより触媒される）の生成、その後（ＫＯにより触媒される）酸化、および（ＫＡＨにより触媒される）ヒドロキシル化により、ステビオールを生成する。図４参照。従って、組換え微生物におけるゲラニルゲラニル二リン酸のステビオールへの変換は、カウレンシンターゼ（ＫＳ）をコードする遺伝子、カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）をコードする遺伝子、およびステビオールシンセターゼ（ＫＡＨ）をコードする遺伝子の発現を含む。ステビオールシンセターゼは、カウレン酸１３‐ヒドロキシラーゼとしても知られている。

【0169】

好適なＫＳポリペプチドは公知である。例えば、好適なＫＳ酵素としては、ステビア・レバウディアナ、ゼア・メイズ、ポプルス・トリコカルパ、およびアラビドプシス・タリアナにより作られるものなどが挙げられる。表２および全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７号参照。Ａ．タリアナＫＳポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６に記載され、Ａ．タリアナＫＳポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２１に記載される。

【0170】

【表1】

【0171】

好適なＫＯポリペプチドは公知である。例えば、好適なＫＯ酵素としては、ステビア・レバウディアナ、アラビドプシス・タリアナ、ジベレラ・フジコロイおよびトラメテス・ベルシコロルから作られたものなどが挙げられる。例えば、表３および全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７号参照。

【0172】

【表2】

【0173】

好適なＫＡＨポリペプチドは公知である。例えば、好適なＫＡＨ酵素としては、ステビア・レバウディアナ、アラビドプシス・タリアナ、ヴィティス・ヴィニフェラおよびメディカゴ・トランキュラタにより作られたものなどが挙げられる。例えば、表４および全開示を参照により本明細書に組み込む、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７、米国特許公報第２００８／０２７１２０５号および第２００８／００６４０６３号、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ｇｉ１８９０９８３１２（配列番号３７）およびＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＢＤ６０２２５；ＧＩ：８９２４２７１０（配列番号３８）参照。Ａ．タリアナから得たステビオールシンセターゼは、ＣＹＰ７１４Ａ２と分類される。

【0174】

【表3】

【0175】

更に、全開示を参照により本明細書に組み込む、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号に記載されるように同定されたステビア・レバウディアナ由来のＫＡＨポリペプチドは、組換え宿主において特に有用である。Ｓ．レバウディアナＫＡＨ（ＳｒＫＡＨｅ１）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９１に記載される。酵母における発現のためにコドン最適化したＳ．レバウディアナＫＡＨをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載され、Ｓ．レバウディアナＫＡＨポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１１に記載される。Ｓ．セレビシエ中に発現されるとき、Ｓ．レバウディアナＫＡＨ（配列番号１１）は、Yamaguchi et al.（米国特許公報第２００８／０２７１２０５Ａ１号）に記載のＡ．タリアナｅｎｔ‐カウレン酸ヒドロキシラーゼ、米国特許公報第２００８／００６４０６３号およびＡＣＤ９３７２２としてＧｅｎＢａｎｋに委託されたタンパク質配列に記載の他のＳ．レバウディアナＫＡＨ酵素と比べて、有意に高いステビオールシンターゼ活性を示す。Ｓ．レバウディアナＫＡＨポリペプチド（配列番号１１）は、米国特許公報第２００８／０２７１２０５号のＫＡＨと２０％未満の同一性および米国特許公報第２００８／００６４０６３号のＫＡＨと３５％未満の同一性を有する。

【0176】

例えば、ＳｒＫＡＨｅ１によりコードされているステビオールシンターゼは、ＮＣＰ１遺伝子（ＹＨＲ０４２Ｗ）によりコードされているＳ．セレビシエＣＰＲにより活性化される。ＡＴＲ２遺伝子（配列番号１０）によりコードされているＡ．タリアナＣＰＲおよびＣＰＲ８遺伝子（配列番号５）によりコードされているＳ．レバウディアナＣＰＲが共発現されるときに、ＳｒＫＡＨｅ１によりコードされているステビオールシンターゼのより活性化レベルの増加が観察される。Ａ．タリアナＡＴＲ２のアミノ酸配列は配列番号９に記載されており、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号４に記載されている。

【0177】

いくつかの実施態様では、組換え微生物は、ＫＯ、ＫＳ，およびＫＡＨポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有する。ＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドの組み合わせが外来性ＣＰＲポリペプチドの発現を要するので、そのような微生物は、一般にシトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）ポリペプチドをコードする組換え遺伝子も含有する。特に、植物起源のＫＯおよび／またはＫＡＨポリペプチドの活性は、外来性ＣＰＲポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含有させることで有意に増加させることができる。好適なＣＰＲポリペプチドは公知である。例えば、好適なＣＰＲ酵素としては、Ｓ．レバウディアナおよびＡ．タリアナにより作られるものなどが挙げられる。例えば、表５および全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７参照。

【0178】

【表4】

【0179】

酵母遺伝子ＤＰＰ１および／または酵母遺伝子ＬＰＰ１は、これらの酵素でＧＧＰＰおよびＦＰＰ前駆体を変換することにより、ステビオールの収量を低減することが可能である。これらの遺伝子は、ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）のファルネソールへの分解が低減され、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）のゲラニルゲラニオール（ＧＧＯＨ）への分解が低減されるように、破壊または欠失することが可能である。あるいは、ホスファターゼをコードする内在性の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー領域を、それらによりコードされているタンパク質の発現を変化するように変化させることが可能である。相同組換えを、内在性遺伝子を破壊するために使用することが可能である。例えば、「遺伝子置換」ベクターを、選択マーカー遺伝子を含むように構築することが可能である。選択マーカー遺伝子は、５’末端および３’末端の両方で、当業者に公知の方法を使用して相同組換えを仲介するのに十分な長さの遺伝子の部分に機能的に連結することが可能である。

【0180】

選択マーカーは、宿主細胞栄養要求性を補完するか、抗生物質耐性を付与するか、または色の変化をもたらす任意の数の遺伝子の１つであることができる。そして、遺伝子置換ベクターの直線化されたＤＮＡ断片は、従来公知の方法を使用して細胞の中へ導入される（下記参照）。ゲノムへの直鎖断片の組込みおよび遺伝子の破壊は、選択マーカーに基づいて決定可能であり、例えばサザンブロット解析法によって検証可能である。選択において使用した後、選択マーカーは、例えばＣｒｅ‐ｌｏｘＰシステムにより宿主細胞のゲノムから除去可能である（例えば、Gossen et al., 2002, Ann. Rev. Genetics 36:153-173および米国特許公開第２００６００１４２６４号参照）。あるいは、遺伝子置換ベクターを、任意の内在性の遺伝子プロモーター配列が欠けており何もコードしていないか、または遺伝子のコード配列の不活性な断片である、破壊されるべき遺伝子の部分を含むように構築することが可能である。

【0181】

「不活性な断片」とは、遺伝子の全長コード配列から産生されるタンパク質の活性の例えば約１０％未満（例えば、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、または０％）を有するタンパク質をコードする遺伝子の断片である。そのような遺伝子部分は、公知のプロモーター配列が遺伝子配列に機能的に連結していないように、しかし終止コドンおよび転写終結配列が遺伝子配列の部分に機能的に連結しているようにベクターに挿入される。このベクターは、その後、この遺伝子配列の部分において直線化され、細胞の中へ形質転換される。１回の相同組換えにより、その後、この直線化されたベクターは、遺伝子の内在性のカウンターパートに組み込まれ、それを不活性化する。

【0182】

これらの遺伝子の組換え微生物の発現により、ゲラニルゲラニル二リン酸をステビオールへ変換することができる。

【0183】

Ｂ．ステビオールグリコシド生合成ポリペプチド
ステビオールをステビオールグリコシドに変換することが可能な組換え宿主細胞が、本明細書に記載される。そのような宿主（例えば、微生物）は、ＵＧＴとしても知られるＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼの１または２以上をコードする遺伝子を含有する。ＵＧＴは、活性化糖ヌクレオチドのモノサッカライドユニットを、受容部分、この場合には、ステビオールまたはステビオール誘導体の-ＯＨまたは-ＣＯＯＨ部分またはステビオール骨格に既に付加したグルコースの-ＯＨ部分へ転移する。ＵＧＴは、配列相同性に基づいて、ファミリーおよびサブファミリーに分類されている。Li et al., 2001, J. Biol. Chem. 276:4338-4343参照。
ルブソシド生合成ポリペプチド

【0184】

ルブソシドの生合成には、ステビオールの１３‐ＯＨおよび１９‐ＣＯＯＨのグリコシル化が含まれる。図１参照。微生物などの組換え宿主におけるステビオールのルブソシドへの変換は、グルコースユニットをステビオールの１３‐ＯＨまたは１９‐ＣＯＯＨへそれぞれ転移するＵＧＴ８５Ｃ２および７４Ｇ１をコードする遺伝子の発現により達成可能である。

【0185】

好適なＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール１３‐ＯＨトランスフェラーゼ、およびウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシド１３‐ＯＨトランスフェラーゼとして機能する。ＵＧＴ８５Ｃ２の反応の例としては、ステビオールおよびＵＤＰグルコースのステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドへの変換またはステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシドおよびＵＤＰグルコースのルブソシドへの変換などが挙げられる。図１参照。機能性ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、ステビオールおよびステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシド以外のステビオールグリコシド基質を使用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒することも可能である。

【0186】

好適なＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール１９‐ＣＯＯＨトランスフェラーゼおよびウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシド１９‐ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能する。７４Ｇ１の反応例としては、ステビオールのステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシドへの変換およびステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドのルブソシドへの変換などが挙げられる。ＵＧＴ７４Ｇ１反応の上記および他の非制限的な例は図１９を参照。機能性ＵＧＴ７４Ｇ１ポリペプチドは、ステビオールおよびステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシド以外のステビオールグリコシド基質を使用するか、またはウリジン二リン酸グルコース以外のドナーからの糖部分を転移するグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒することも可能である。

【0187】

機能性ＵＧＴ７４Ｇ１および機能性ＵＧＴ８５Ｃ２を発現する組換え微生物は、ステビオールを培地で供給原料として使用するときは、ルブソシドおよび両ステビオールモノシド類（すなわち、ステビオール１３‐Ｏ‐モノグルコシドおよびステビオール１９‐Ｏ‐モノグルコシド）を作ることができる。しかしながら、一般に、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２をコードする遺伝子は、それらを天然には持たない宿主（例えば、微生物）に形質転換される組換え遺伝子である。

【0188】

本明細書で使用される、「組換え宿主」という用語は、ゲノムが少なくとも１つ組み込まれたＤＮＡ配列により増強した宿主細胞を意味する（限定するものではない）ことを意図している；染色体外の例としては、細菌中のプラスミドおよび酵母中の２‐ミクロンサークルを含むエピソームなどが挙げられている。そのようなＤＮＡ配列としては、限定することなく、天然に存在しない遺伝子、通常ＲＮＡに転写されないまたはタンパク質に翻訳され（「発現され」）ないＤＮＡ配列、および非組換え宿主に導入されることが望まれる他の遺伝子またはＤＮＡ配列などが挙げられる。一般に本明細書に記載される組換え宿主のゲノムは、１または２以上の組換え遺伝子の安定な導入により増強されることを理解されたい。一般に、導入されたＤＮＡは、そのＤＮＡのレシピエントである宿主に元来常在するものではないが、所与の宿主からＤＮＡセグメントを単離し、その後そのＤＮＡの１または２以上の追加のコピーを同じ宿主に導入して、例えば、遺伝子産物の産生を高めるかまたは遺伝子発現パターンを変更することは本発明の範囲内である。ある例では、導入されたＤＮＡは、例えば相同組換えまたは部位特異的突然変異誘導により内在性の遺伝子またはＤＮＡ配列を改変または置換さえするであろう。好適な組換え宿主としては、微生物、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、および植物などが挙げられる。

【0189】

「組換え遺伝子」という用語は、宿主に既に同一または同様の遺伝子またはＤＮＡ配列が存在するかどうかにかかわらず、レシピエント宿主に導入された遺伝子またはＤＮＡ配列を意味する。本文脈における「導入される」または「増強される」とは、人工的に導入または増強されることを意味することは従来公知である。従って、組換え遺伝子は、他の種由来のＤＮＡ配列、または同一種由来のまたは同一種に存在するＤＮＡ配列であることができるが、組換え宿主を作るための組換え方法により宿主に組み込まれたものである。宿主に導入された組換え遺伝子は、形質転換される宿主に通常存在して、そのＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変（限定されるものではないが制御または誘導）発現を可能とするためにＤＮＡの１または２以上の追加のコピーを提供するために導入されるＤＮＡ配列と同一であることが可能であることを理解されたい。

【0190】

好適なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドとしては、Ｓ．レバウディアナにより作られるものなどが挙げられる。ステビア属由来の機能性ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドをコードする遺伝子は、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67に報告されている。Ｓ．レバウディアナＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１９）およびＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２６）ポリペプチドのアミノ酸配列は、酵母における発現に最適化したＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２およびＤＮＡ２．０コドン最適化した配列ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ７６Ｇ１をコードするヌクレオチド配列と同様に、国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号の配列番号：１および３にそれぞれ記載されている。Ｓ．レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２をコードする、ＧｅｎｅＡｒｔのコドン最適化ヌクレオチド配列は、配列番号３に記載されている。下記「機能的ホモログ」セクションに記載のＵＧＴ８５Ｃ２およびＵＧＴ７４Ｇ１バリアントも参照。例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドは、６５、７１、２７０、２８９、および３８９位（例えば、Ａ６５Ｓ，Ｅ７１Ｑ、Ｔ２７０Ｍ、Ｑ２８９Ｈ、およびＡ３８９Ｖ）のいずれか１つまたはそれらの組み合わせの位置に置換を含有することが可能である。

【0191】

いくつかの実施態様では、組換え宿主は微生物である。組換え微生物は、ルブソシドを産生するためにステビオールを含有する培地で増殖することができる。しかしながら、他の実施態様では、組換え微生物は、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子、およびＫＡＨ遺伝子などの、ステビオール生合成に関与する遺伝子を発現する。好適なＣＤＰＳポリペプチドは公知である。例えば、好適なＣＤＰＳ酵素としては、Ｓ．レバウディアナ、ストレプトミセス・クラブリゲルス、ブラディリゾビウム・ジャポニクム、ゼア・メイズ、およびアラビドプシス属により作られるものなどが挙げられる。例えば、表６および全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７号参照。

【0192】

いくつかの実施態様では、無修飾ポリペプチドのアミノ末端における葉緑体トランジットペプチドを欠損するＣＤＰＳポリペプチドを使用することが可能である。例えば、ゼア・メイズＣＤＰＳコード配列（配列番号１２）の５’末端の最初の１５０個のヌクレオチドを除去した、切断型ヌクレオチド配列を配列番号１３３に示す。そうすることにより、葉緑体トランジットペプチドをコードする配列番号１３に示すアミノ酸配列のアミノ末端の５０残基が除去される；切断型アミノ酸配列を配列番号１３４に示す。切断型ＣＤＰＳ遺伝子は、新規のＡＴＧ翻訳開始部位が結合され、プロモーター、一般に恒常的または高度発現性のプロモーターに機能的に連結することが可能である。切断型コード配列の複数のコピー、限定されるものではないが、１個のコピー、２個のコピーまたは３個のコピーが微生物に導入されると、プロモーターからのＣＤＰＳポリペプチドの発現は、ｅｎｔ‐カウレン生合成の方へ炭素フラックスを増加させる。

【0193】

【表5】

【0194】

ＣＤＰＳ‐ＫＳ二機能性タンパク質を使用することも可能である。表７に示すＣＤＰＳ‐ＫＳ二機能性酵素をコードするヌクレオチド配列は、酵母における発現のために改変されている（全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号参照）。ジベレラ・フジクロイ由来の二機能性酵素も使用可能である。

【0195】

【表6】

【0196】

従って、ＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２遺伝子とともに、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子を含有する微生物が、供給原料としてステビオールを使用する必要なしに両方のステビオールモノシド類およびルブソシドを産生することができる。

【0197】

いくつかの実施態様では、組換え微生物は、更にゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）をコードする組換え遺伝子を発現する。好適なＧＧＰＰＳポリペプチドは公知である。例えば、好適なＧＧＰＰＳ酵素としては、Ｓ．レバウディアナ、ジベレラ・フジクロイ、ムス・ムスクルス、タラシオシラ・シュードナナ、ストレプトミセス・クラブリゲルス、スルホロブス・アシドカルダリウス、シネココッカス属およびＡ．タリアナにより作られたものなどが挙げられる。表８および全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７号参照。

【0198】

【表7】

【0199】

いくつかの側面では、本発明の組換え細胞を構成する、配列番号１１に記載のＫＡＨポリペプチドをコードするＫＡＨ遺伝子は、過剰発現される。いくつかの側面では、ＫＡＨ遺伝子は、（限定されるものではないが）１個、２個または３個のコピーで存在することができる。いくつかの側面では、本発明の組換え細胞を構成する、配列番号２１に記載のＫＳポリペプチドをコードするＫＳ遺伝子は、過剰発現される。いくつかの側面では、ＫＳ遺伝子は、（限定されるものではないが）１個、２個または３個のコピーで存在することができる。

【0200】

いくつかの実施態様では、組換え微生物は、更に、例えば後述のメチルエリスリトール４‐リン酸（ＭＥＰ）経路における遺伝子またはメバロン酸（ＭＥＶ）経路における遺伝子などの、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子を発現すること、ホスファターゼ活性が低減していること、および／または本明細書に記載のスクロースシンターゼ（ＳＵＳ）を発現することが可能である。

【0201】

レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ、およびレバウディオサイドＥ生合成ポリペプチド
レバウディオサイドＡの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が含まれる。具体的には、レバウディオサイドＡは、１３‐Ｏ‐ステビオールモノシドを生成するステビオールの１３‐ＯＨのグルコシル化、ステビオール‐１，２‐ビオシドを生成するステビオールモノシドの１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’のグルコシル化、ステビオシドを生成するステビオール‐１，２‐ビオシドのＣ‐１９カルボキシルのグルコシル化、およびＲｅｂＡを産生するステビオシドのＣ‐１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐３’のグルコシル化により生成可能である。各グルコシル化反応が起こる順番は、様々であり得る。図１参照。

【0202】

レバウディオサイドＥおよび／またはレバウディオサイドＤの生合成には、アグリコンステビオールのグルコシル化が含まれる。具体的には、レバウディオサイドＥは、ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドを生成するステビオールの１３‐ＯＨのグルコシル化、ステビオール‐１，２‐ビオシドを生成するステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドの１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’のグルコシル化、１，２‐ステビオシドを生成する１，２‐ビオシドのＣ‐１９カルボキシルのグルコシル化、およびレバウディオサイドＥを生成する１，２‐ステビオシドの１９‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’のグルコシル化により生成可能である。レバウディオサイドＤは、レバウディオサイドＥのＣ‐１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐３’のグルコシル化により生成可能である。各グルコシル化反応が起こる順番は、様々であり得る。例えば、１９‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’のグルコシル化は、レバウディオサイドＡが中間体である経路の最後の工程であってもよい。図１参照。

【0203】

レバウディオサイドＭポリペプチド
本明細書で提供されるように、組換え宿主におけるステビオールのレバウディオサイドＭへの変換は、以下の機能性ＵＧＴ：９１Ｄ２、ＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、８５Ｃ２、および７６Ｇ１の組み合わせを発現することにより達成可能である。図１参照。多数のプラスミドのコピーを使用して、または強力なプロモーター、または複数の組み込まれた遺伝子のコピー、または多数の遺伝子コピーであるように選択したエピソームを使用して、ＥＵＧＴ１１を高いレベルで発現することが特に有用である。従って、これらのＵＧＴの組み合わせを発現する組換え微生物が、レバウディオサイドＡ（８５Ｃ２；７６Ｇ１；７４Ｇ１；９１Ｄ２ｅ）、レバウディオサイドＤ（８５Ｃ２；７６Ｇ１；７４Ｇ１；９１Ｄ２ｅ；ＥＵＧＴ１１）、レバウディオサイドＥ（８５Ｃ２；７４Ｇ１；９１Ｄ２ｅ；ＥＵＧＴ１１）、またはレバウディオサイドＭ（８５Ｃ２；７６Ｇ１；７４Ｇ１；９１Ｄ２ｅ；ＥＵＧＴ１１）を作ることが可能である。図１参照。一般に、１または２以上のこれらの遺伝子は、天然にそれらを有さない微生物に形質転換される組換え遺伝子である。また、本明細書でＳＭ１２ＵＧＴと命名されたＵＧＴは、ＵＧＴ９１Ｄ２の代わりに使用可能であることが発見された。

【0204】

個々のレバウディオサイド類を標的とする産生は、組換え細胞におけるＵＧＴをコードする遺伝子（図１参照）のコピー数の差異、プロモーター強度の差異および／または目的とする産生物への特異性／活性が向上した変異体の利用により達成可能である。例えば、もしＥＵＧＴ１１が、レバウディオサイドＡの生成に有利な他のＵＧＴと比較して低いレベルで発現されると、レバウディオサイドＤ、Ｅ、およびＭは低いレベルで生成されるであろう。ＥＵＧＴ１１の発現レベルが高いと、レバウディオサイドＭを生成するためにＵＧＴ７６Ｇ１の基質として働く１９‐Ｏ１，２ジグルコシドがより多く産生される。ある有利な実施態様では、本発明の組換え細胞におけるＵＧＴ７６Ｇ１の追加のコピーまたは変異体バージョンは、レバウディオサイドＤからのレバウディオサイドＭの生成速度を向上可能である。

【0205】

いくつかの実施態様では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールおよびステビオールグリコシド類の１９‐Ｏ位でのグリコシル化を触媒する。従って、いくつかの実施態様では、生物変換すなわちin vitroでのＵＧＴ７６Ｇ１による触媒作用により、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現する組換え宿主において、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＩ、ジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）、またはトリグリコシル化ステビオールグリコシド（（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）の１または２以上が産生される。いくつかの実施態様では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールおよびステビオールグリコシド類の１３‐Ｏ位でのグリコシル化を触媒し、１３‐Ｏ位で１，２‐ジグリコシル化または１３‐Ｏ位でモノグリコシル化されるステビオールグリコシド基質を優先的にグリコシル化する。いくつかの実施態様では、ＵＧＴ７６Ｇ１は、１９‐Ｏ位のグリコシル化の状態への優先を示さない。

【0206】

いくつかの側面では、本発明の組換え宿主細胞が、配列番号２に記載のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子を含む。いくつかの側面では、本発明の組換え細胞を構成する、配列番号２に記載のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子が過剰発現される。いくつかの側面では、遺伝子は、（限定されるものではないが）２個または３個のコピーで存在することができる。

【0207】

いくつかの実施態様では、配列番号２に記載のＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子は、１個のコピーで存在する。図１２（例９）に示すように、ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数が少ない（１個のコピー）と、ＵＧＴ７６Ｇ１の発現が少なくなり、レバウディオサイドＤ／レバウディオサイドＭ比が増加する。

【0208】

いくつかの実施態様では、５個未満（例えば、１個、２個、３個または４個）のＵＧＴが宿主で発現される。例えば、機能性ＥＵＧＴ１１を発現する組換え微生物は、レバウディオサイドＡを供給原料として使用すると、レバウディオサイドＤを作ることが可能である。機能性ＵＧＴ７６Ｇ１を発現する組換え微生物は、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥを供給原料として使用すると、レバウディオサイドＭを作ることが可能である。レバウディオサイドＭは、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥのいずれかから、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥの１９‐Ｏ‐グルコースのＣ‐３’のグルコシル化により作ることが可能である；レバウディオサイドＥの場合は、レバウディオサイドＭを産生する１３‐Ｏ‐グルコースの２度目のグルコシル化が必要である。

【0209】

ルブソシドまたは１，２‐ステビオシドを供給原料として使用する場合、ＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１または７６Ｇ１、および９１Ｄ２を発現する組換え微生物はレバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを作ることが可能である。さらに他の方法として、モノシドであるステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドを培地に添加するときは、ＥＵＧＴ１１、７４Ｇ１、７６Ｇ１、および９１Ｄ２を発現する組換え微生物は、レバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＭを作ることが可能である。同様に、組換え微生物におけるステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシドのレバウディオサイドＤへの変換は、ステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシドを供給するときは、細胞中でＵＧＴＥＵＧＴ１１、８５Ｃ２、７６Ｇ１、および９１Ｄ２ｅをコードする遺伝子を発現することにより達成することが可能である。

【0210】

好適なＵＧＴ７４Ｇ１およびＵＧＴ８５Ｃ２ポリペプチドとしては、上記のものなどが挙げられる。好適なＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分を、受容分子であるステビオール１，２グリコシドのＣ‐１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐３’へ付加する。ＵＧＴ７６Ｇ１は、例えばウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール１３‐Ｏ‐１，２グルコシドＣ‐３’グルコシルトランスフェラーゼおよびウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコース、１３‐Ｏ‐１，２ビオシドＣ‐３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する。機能性ＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドは、例えば、ステビオールラムノシド類およびステビオールキシロシド類などのグルコース以外の糖類を含有するステビオールグリコシド基質を使用するグルコシルトランスフェラーゼ反応を触媒することも可能である。図１参照。好適なＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドとしては、Ｓ．レバウディアナにより作られ、Richman et al., 2005, The Plant Journal 41:56-67に報告されているものなどが挙げられる。酵母における発現に最適化したＳ．レバウディアナＵＧＴ７６Ｇ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、配列番号１４に記載する。「機能的ホモログ」のセクションに記載したＵＧＴ７６Ｇ１バリアントも参照のこと。

【0211】

好適なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、グルコース部分を受容分子であるステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドの１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’へ転移するウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドトランスフェラーゼ（ステビオール‐１３‐モノグルコシド１，２‐グルコシラーゼとも呼ばれる）として機能する。

【0212】

また、好適なＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ステビオシドを産生するために、グルコース部分を受容分子であるルブソシドの１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’へ転移する、ウリジン５’‐ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能する。ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、１９‐Ｏ‐１，２‐ジグリコシル化ルブソシドを産生するために、グルコース部分を受容分子であるルブソシドの１９‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’へ転移することも可能である（図１参照）。

【0213】

また、機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドおよびルブソシド以外のステビオールグリコシド基質を用いた反応を触媒することも可能である。例えば、機能性ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、ステビオシドを基質として用いてレバウディオサイドＥを産生するためにグルコース部分を１９‐Ｏ‐グルコース残基のＣ‐２’へ転移することが可能である（図１参照）。また、機能性ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、レバウディオサイドＡを基質として用いてレバウディオサイドＤを産生するために、グルコース部分をレバウディオサイドＡの１９‐Ｏ‐グルコース残基のＣ‐２’へ転移することも可能である。ＥＵＧＴ１１は、反応を同様の条件、すなわち同様の時間、温度、純度および基質濃度で行ったとき対応する野生型ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１５）の速度よりも少なくとも２０倍速い（例えば、少なくとも２５倍または少なくとも３０倍速い）速度でレバウディオサイドＡをレバウディオサイドＤに変換することが可能である。そのように、ＥＵＧＴ１１は、細胞中またはin vitroの同様の条件、温度感受性のＥＵＧＴ１１が安定である条件で、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅよりも多量のＲｅｂＤを産生する。

【0214】

更に、機能性ＥＵＧＴ１１は、ルブソシドまたはステビオシドを基質として有意なＣ‐２’１９‐Ｏ‐ジグリコシル化活性を示すが、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅは、同じ条件でこれらの基質のジグリコシル化活性は検出されない。従って、機能性ＥＵＧＴ１１は、ステビオールグリコシド基質特異性の差異によりＵＧＴ９１Ｄ２ｅから識別可能である。

【0215】

機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、グルコース部分をＣ‐１３位に１，３‐結合グルコースを有するステビオール化合物に転移しない、すなわち、グルコース部分のステビオール‐１，３‐ビオシドおよび１，３‐ステビオシド（ＲｅｂＧ）への転移は起こらない。

【0216】

機能性ＥＵＧＴ１１およびＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、糖部分をウリジン二リン酸グルコース以外のドナーから転移することが可能である。例えば、機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ウリジン５’‐ジホスホＤ‐キシロシル：ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドトランスフェラーゼとして作用し、キシロース部分を受容分子であるステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドの１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’へ転移することが可能である。他の例としては、機能性ＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドは、ウリジン５’‐ジホスホＬ‐ラムノシル：ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドトランスフェラーゼとして作用し、ラムノース部分を受容分子であるステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドの１３‐Ｏ‐グルコースのＣ‐２’へ転移することが可能である。

【0217】

好適なＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、本明細書に記載され、オリザ・サティバ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第ＡＣ１３３３３４；配列番号１６）由来のＥＵＧＴ１１ポリペプチドなどが挙げられる。例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性（例えば、少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性）を持つアミノ酸配列を有することが可能である。また、ＥＵＧＴ１１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は配列番号１７に、酵母における発現のためにコドンを最適化したヌクレオチド配列も同様に記載した（配列番号１８）。

【0218】

好適な機能性ＵＧＴ９１Ｄ２ポリペプチドとしては、例えばＵＧＴ９１Ｄ２ｅおよびＵＧＴ９１Ｄ２ｍと命名されるポリペプチドおよび本明細書に記載される機能的ホモログなどが挙げられる。Ｓ．レバウディアナ由来ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドの１つの例のアミノ酸配列を配列番号１５に、酵母における発現のためにコドン最適化したＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も同様に記載した（配列番号８９）。Ｓ．レバウディアナ由来ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ（配列番号８６）ポリペプチドの例のアミノ酸配列は、全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号の配列番号１０に記載される。さらに、アミノ酸残基２０６、２０７、および３４３に置換を含有するＵＧＴ９１Ｄ２バリアントが使用可能である。例えば、野生型ＵＧＴ９１Ｄ２ｅに対してＧ２０６Ｒ，Ｙ２０７Ｃ、およびＷ３４３Ｒ変異を有するアミノ酸配列を使用可能である。更に、アミノ酸残基２１１および２８６に置換を含有するＵＧＴ９１Ｄ２バリアントが使用可能である。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２バリアントは、部位２１１のロイシンがメチオニンで、部位２８６のバリンがアラニンで置換されている（ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ‐ｂと呼ばれる）。これらのバリアントＬ２１１ＭおよびＶ２８６Ａは、本明細書で配列番号６６として開示される国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号の配列番号５のバリアントである。他のバリアントとしては、表１２および全開示を参照により本明細書に組み込む第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号の例１１に記載のバリアント（Ｔ１４４Ｓ，Ｍ１５２Ｌ、Ｌ２１３Ｆ、Ｓ３６４Ｐ、およびＧ３８４Ｃバリアントを除く）などが挙げられる。

【0219】

上述したように、本明細書でＳＭ１２ＵＧＴとして命名されたＵＧＴは、ＵＧＴ９１Ｄ２の代わりに使用することができる。好適な機能性ＳＭ１２ＵＧＴポリペプチドとしては、イポメア・プルプレア（アサガオ）により作られるものおよびMorita et al., 2005, Plant J. 42, 353-363に記載のものなどが挙げられる。Ｉ．プルプレアＩＰ３ＧＧＴ（配列番号６７）（全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号に記載）をコードするアミノ酸配列は、酵母における発現のためにコドン最適化した、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（配列番号６８）を有する。他の好適なＳＭ１２ＵＧＴポリペプチドは、Ｒ２５Ｓ変異（Ｂｐ９４Ｂ１ポリペプチド）を有するＵＧＴ９４Ｂ１ポリペプチドである。Osmani et al., 2008, Plant Phys. 148: 1295-1308 and Sawada et al., 2005, J. Biol. Chem. 280:899-906参照。ベリス・ペレンニス（レッドデイジー）ＵＧＴ９４Ｂ１のアミノ酸配列（配列番号６９）および酵母における発現のためにコドン最適化したヌクレオチド配列（配列番号７０）は、全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号に記載される。

【0220】

いくつかの実施態様では、レバウディオサイドＭを産生するために、組換え微生物を、ステビオール‐１３‐Ｏ‐グルコシドまたはステビオール‐１９‐Ｏ‐グルコシドを含有する培地で増殖する。そのような実施態様では、微生物は、機能性ＥＵＧＴ１１、機能性ＵＧＴ７４Ｇ１、機能性ＵＧＴ８５Ｃ２、機能性ＵＧＴ７６Ｇ１、および機能性ＵＧＴ９１Ｄ２コードする遺伝子を含有・発現し、ステビオール、１つまたは両ステビオールモノシド類、またはルブソシドを供給原料として使用するとき、ＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ活性の相対レベルに依存して、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＭまたはそれらの組み合わせを蓄積する能力がある。

【0221】

他の実施態様では、レバウディオサイドＡ、Ｄ、またはＭを産生するために、組換え微生物を、ルブソシドを含有する培地で増殖する。そのような実施態様では、微生物は、機能性ＥＵＧＴ１１、機能性ＵＧＴ７６Ｇ１、および機能性ＵＧＴ９１Ｄ２をコードする遺伝子を含有・発現し、ルブソシドを供給原料として使用すると、ＵＤＰ‐グリコシルトランスフェラーゼ活性の相対レベルに依存してレバウディオサイドＡ、Ｄ、Ｍまたはそれらの組み合わせを産生する能力がある。

【0222】

他の実施態様では、組換え微生物は、例えば、ＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子および／またはＫＡＨ遺伝子などの、ステビオール生合成に関与する遺伝子を発現する。従って、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７６Ｇ１、および機能性ＵＧＴ９１Ｄ２（例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ）に加えて、例えばＣＤＰＳ遺伝子、ＫＳ遺伝子、ＫＯ遺伝子およびＫＡＨ遺伝子を含有する微生物は、培地中にステビオールを含む必要なしにレバウディオサイドＡ、Ｄ、Ｅ、および／またはＭを産生する能力がある。

【0223】

いくつかの実施態様では、ステビオール生合成経路全体のフラックスを増加させるためのジテルペン前駆体ゲラニルゲラニル二リン酸のレベルを向上させるために、組換え宿主は、更に組換えＧＧＰＰＳ遺伝子を含有および発現する。

【0224】

いくつかの実施態様では、組換え宿主は、ゲラニルゲラニル二リン酸、ｅｎｔ‐カウレン酸またはファルネシルピロリン酸を消費する非ステビオール経路の発現を抑制する構築物を更に含有し、それによってステビオールおよびステビオールグリコシド類生合成経路のフラックスを増加する。後述するように、エルゴステロールなどのステロール産生経路へのフラックスは、ＥＲＧ９遺伝子の発現低下により減少可能である。ジベレリン類を産生する細胞においては、ｅｎｔ‐カウレン酸のステビオールへのフラックスを増加するために、ジベレリン合成を下方制御することが可能である。カロテノイドを産生する生物体では、ステビオールへのフラックスは、１または２以上のカロテノイド生合成遺伝子の下方制御により増加可能である。いくつかの実施態様では、組換え微生物は、更に、ジテルペン生合成またはテルペノイド前駆体の産生に関与する組換え遺伝子、例えば、後述のＭＥＰまたはＭＥＶ経路における遺伝子を発現し、ホスファターゼ活性を減少させ、および／または本明細書に記載するＳＵＳを発現することが可能である。

【0225】

異なるＵＧＴ遺伝子の相対的発現レベルを調節することにより、組換え宿主が所望の割合でステビオールグリコシド産生物を特異的に産生するように設計可能であることは当業者には理解されるであろう。ステビオール生合成遺伝子およびステビオールグリコシド生合成遺伝子の転写制御は、当業者に公知の技術を使用して転写活性化および抑制の組み合わせにより達成可能である。in vitroの反応においては、併用する異なるＵＧＴの相対的活性に影響を与える組み合わせまたは条件下でＵＧＴ酵素を異なるレベルで添加することにより、各ステビオールグリコシドを所望の割合で得るように合成を誘導するであろうことは当業者には理解されるであろう。レバウディオサイドＤまたはＭをより高い割合またはレバウディオサイドＤまたはＭへのより効率的な変換が、１３‐Ｏ‐グルコシド反応（レバウディオサイドＡおよびステビオシド基質）に比較して１９‐Ｏ‐グルコシド反応に活性が高いジグリコシル化酵素により達成することが可能なことは当業者には理解されるであろう。

【0226】

いくつかの実施態様では、微生物などの組換え宿主が、ステビオールグリコシド類の合計の少なくとも３重量％以上のレバウディオサイドＭを有するレバウディオサイドＭが濃縮したステビオールグリコシド組成物を産生する；例えば、少なくとも４％のレバウディオサイドＭ、少なくとも５％のレバウディオサイドＭ、少なくとも１０～２０％のレバウディオサイドＭ、少なくとも２０～３０％のレバウディオサイドＭ、少なくとも３０～４０％のレバウディオサイドＭ、少なくとも４０～５０％のレバウディオサイドＭ、少なくとも５０～６０％のレバウディオサイドＭ、少なくとも６０～７０％のレバウディオサイドＭ、または少なくとも７０～８０％のレバウディオサイドＭである組成物を産生する。共存する他のステビオールグリコシド類としては、ステビオールモノシド類、ステビオールグルコビオシド類、レバウディオサイドＡ、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、およびステビオシドなどの図１に示したものが挙げられる。いくつかの実施態様では、宿主（例えば、微生物）により産生されたレバウディオサイドＭが濃縮した組成物は更に精製することが可能であり、そのように精製されたレバウディオサイドＭは、他のステビオールグリコシド類、香味料、または甘味料と混合して所望の味システムまたは甘味組成物を得ることができる。例えば、組換え宿主により産生されたレバウディオサイドＭが濃縮した組成物は、異なる組換え宿主により産生されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、Ｄ、またはＥが濃縮した組成物、ステビア抽出物から精製されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、Ｄ、またはＥ、またはin vitroで産生されたレバウディオサイドＡ、Ｃ、Ｄ、またはＥと合わせることができる。

【0227】

いくつかの実施態様では、レバウディオサイドＭを、適切なＵＤＰ糖類を供給するin vitroの方法および／またはＵＤＰ糖類の再生のための無細胞システムを使用して産生することが可能である。いくつかの実施態様では、グリコシル化反応の間に産生したＵＤＰからＵＤＰグルコースを再生するために、スクロースおよびスクロースシンターゼを反応容器に供給することができる。スクロースシンターゼは、任意の好適な生物体から得ることができる。例えば、Ａ．タリアナ、Ｓ．レバウディアナ、またはコフィア・アラビカ由来のスクロースシンターゼコード配列を、好適なプロモーターの制御下に発現プラスミドにクローン化し、微生物または植物などの宿主中で発現することが可能である。

【0228】

複数の反応を要する変換は、同時にまたは段階的に行うことが可能である。例えば、レバウディオサイドＭは、濃縮抽出物として市販されているかまたは化学等量または過剰量のＵＤＰグルコースおよびＵＧＴ７６Ｇ１を添加して生合成により産生されるレバウディオサイドＤまたはレバウディオサイドＥから産生することが可能である。他の方法としては、レバウディオサイドＤおよびレバウディオサイドＭは、ステビオシドおよびレバウディオサイドＡが濃縮されたステビオールグリコシド抽出物から、ＥＵＧＴ１１および好適なＵＧＴ７６Ｇ１酵素を使用して産生することが可能である。いくつかの実施態様では、二次産生物を除去し、反応収量を向上するためにホスファターゼを使用する。in vitro反応用のＵＧＴおよび他の酵素は、可溶な形態または固定化された形態で提供することが可能である。

【0229】

いくつかの実施態様では、レバウディオサイドＭは、植物抽出物由来のステビオールグリコシド類の混合物を含むステビオールおよび／またはステビオールグリコシド類などの前駆体分子を含有する供給原料である全細胞を使用して産生することが可能である。原料は、細胞増殖中または細胞増殖後に供給可能である。全細胞は、浮遊させるかまたは固定化することが可能である。全細胞は、例えばアルギン酸カルシウムまたはナトリウムビーズなどのビーズ中にトラップすることが可能である。全細胞は、中空繊維管リアクターシステムに結合することが可能である。全細胞は、濃縮し、膜リアクターシステム内にトラップすることが可能である。全細胞は、発酵ブロス中または反応緩衝液中にあってもよい。同様の手法を組換え細胞の発酵に応用することが可能である。

【0230】

いくつかの実施態様では、透過剤を、基質を細胞中へ効率的に転移するために使用する。いくつかの実施態様では、細胞を、トルエンなどの溶媒またはＴｒｉｔｏｎ－ＸまたはＴｗｅｅｎなどの洗剤により透過処理する。いくつかの実施態様では、細胞は、界面活性剤、例えば臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤で透過処理される。いくつかの実施態様では、細胞を、エレクトロポレーションまたは軽度の浸透圧ショックなどの周期的な機械的衝撃により透過処理する。細胞は、１つの組換えＵＧＴまたは複数の組換えＵＧＴを含有する。例えば、細胞は、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシド類の混合物をレバウディオサイドＭに効率的に変換するようにＵＧＴ７６Ｇ１、９１Ｄ２ｅ、８５Ｃ２、７４Ｇ１およびＥＵＧＴ１１を含有することが可能である。いくつかの実施態様では、全細胞は、下記の宿主細胞である。いくつかの実施態様では、全細胞は、大腸菌などのグラム陰性細菌である。いくつかの実施態様では、全細胞はバチルス属などのグラム陽性細菌である。いくつかの実施態様では、全細胞は、アスペルギルス属などの真菌またはサッカロミケス属などの酵母である。いくつかの実施態様では、「全細胞生体触媒作用」という用語は、全細胞を上記のように増殖し（例えば、培地でそして任意に透過処理される）、レバウディオサイドＤ、レバウディオサイドＥ、またはステビオシドなどの基質を提供し、細胞由来の酵素を使用して最終産物に変換するプロセスを意味するために使用される。細胞は、生存可能であるか不可能であり、生物変換反応中に増殖可能であるかまたは不可能である。対照的に、発酵においては、細胞を増殖培地で培養し、グルコースなどの炭素およびエネルギー源を供給し、最終産物を生細胞により産生する。

【0231】

Ｃ．他のポリペプチド
発現によりステビオールまたはステビオールグリコシドのより効率的またはより大規模な産生を促進する追加のポリペプチドのための遺伝子も、組換え宿主に導入することが可能である。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ，またＧＧＤＰＳとも呼ぶ）をコードする遺伝子を１または２以上含有することが可能である。他の例として、組換え宿主は、ラムノースシンセターゼをコードする１または２以上の遺伝子またはＵＤＰグルコースデヒドロゲナーゼおよび／またはＵＤＰグルクロン酸デカルボキシラーゼをコードする１または２以上の遺伝子を含有することが可能である。他の例として、組換え宿主は、シトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）をコードする１または２以上の遺伝子も含有することが可能である。組換えＣＰＲの発現は、ＮＡＤＰ＋のサイクルを促進し、テルペノイド生合成の補助因子として利用されるＮＡＤＰＨを再生する。他の方法を使用して、ＮＡＤＨＰレベルを再生することも可能である。ＮＡＤＰＨが律速となる状況では、例えば、株を外来性トランスヒドロゲナーゼ遺伝子を含むように更に改変することが可能である。例えば、Sauer et al., 2004, J. Biol. Chem. 279: 6613-6619参照。所望の補助因子レベルが増加するように、ＮＡＤＨ／ＮＡＤＰＨの比を減少あるいは改変するための他の方法は当業者には公知である。

【0232】

他の例として、組換え宿主は、スクロースシンターゼをコードする１または２以上の遺伝子を含有することが可能であり、所望ならスクロース取り込み遺伝子を更に含有することが可能である。スクロースシンターゼ反応を使用して、発酵宿主または全細胞生物変換プロセスにおけるＵＤＰグルコースプールを増加することが可能である。これにより、グリコシル化の間に産生したＵＤＰおよびスクロースからＵＤＰグルコースを再生し、効率的なグリコシル化を可能とする。いくつかの生物体では、内在性のインベルターゼを破壊することは、スクロースの分解を防止するのに有利である。例えば、Ｓ．セレビシエＳＵＣ２インベルターゼを破壊することができる。スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は、任意の好適な生物体由来であることが可能である。例えば、限定することなく、Ａ．タリアナ、Ｓ．レバウディアナ、またはＣ．アラビカ由来のスクロースシンターゼコード配列を、好適なプロモーターの制御下に発現プラスミドへクローン化し、宿主（例えば、微生物または植物）中で発現することが可能である。スクロースシンターゼは、スクローストランスポーター（例えば、Ａ．タリアナＳＵＣ１トランスポーターまたはその機能的ホモログ）および１または２以上のＵＧＴ（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＥＵＧＴ１１またはそれらの機能的ホモログ）との組み合わせで上記のような株中で発現可能である。スクロースを含有する培地中で宿主を培養することにより、ＵＤＰグルコースならびに１または２以上のグルコシド（例えば、ステビオールグリコシド類）の産生が促進可能である。

【0233】

スクアレンシンターゼ（ＳＱＳ）をコードするＥＲＧ９遺伝子の発現も、組換え宿主にスクアレンシンターゼへの前駆体が蓄積するように組換え宿主中で抑制可能である。ＳＱＳは、ＥＣ２．５．１．２１に分類され、ステロールの産生へ導く生合成経路の最初に働く酵素である。それは、ファルネシルピロリン酸の２つのユニットがスクアレンに変換され、プレスクアレンピロリン酸中間体を経由するファルネシルピロリン酸からのスクアレンの合成を触媒する。この酵素は、テルペノイド類／イソプレノイド類の生合成における分岐点にある酵素であり、ステロール経路のイソプレン中間体のフラックスを調節すると考えられている。この酵素は、ファルネシル二リン酸ファルネシルトランスフェラーゼ（ＦＤＦＴ１）とも呼ばれる。更に、組換え宿主は、上述したように、ホスファターゼ活性が低減していてもよい。

【0234】

ＭＥＰ生合成ポリペプチド
他の例として、組換え宿主は、ＭＥＰ経路またはメバロン酸経路における１または２以上の酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含有することが可能である。そのような遺伝子は、炭素のジテルペン生合成経路へのフラックスを増加することが可能であるので有用であり、上記経路で産生されたイソペンテニル二リン酸およびジメチルアリル二リン酸からゲラニルゲラニル二リン酸を産生する。そのように産生されたゲラニルゲラニル二リン酸を、ステビオール生合成ポリペプチドおよびステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの発現によるステビオールおよびステビオールグリコシド生合成へ誘導することが可能である。例えば、Brandle et al., 2007, Phytochemistry 68:1855-1863参照。

【0235】

いくつかの実施態様では、組換え宿主は、イソプレノイド生合成のためのメチルエリスリトール４‐リン酸（ＭＥＰ）経路に関与する酵素をコードする１または２以上の遺伝子を含有する。ＭＥＰ経路における酵素としては、デオキシキシルロース５‐リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、Ｄ‐１‐デオキシキシルロース５‐リン酸レダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、４‐ジホスホシチジル‐２‐Ｃ‐メチル‐Ｄ‐エリスリトールシンターゼ（ＣＭＳ）、４‐ジホスホシチジル‐２‐Ｃ‐メチル‐Ｄ‐エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、４‐ジホスホシチジル‐２‐Ｃ‐メチル‐Ｄ‐エリスリトール２，４‐シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、１‐ヒドロキシ‐２‐メチル‐２（Ｅ）‐ブテニル４‐二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）および１‐ヒドロキシ‐２‐メチル‐２（Ｅ）‐ブテニル４‐二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）などが挙げられる。ＤＸＳ遺伝子、ＤＸＲ遺伝子、ＣＭＳ遺伝子、ＣＭＫ遺伝子、ＭＣＳ遺伝子、ＨＤＳ遺伝子および／またはＨＤＲ遺伝子の１または２以上を、組換え微生物に組み込むことが可能である。Rodriguez-Concepcion and Boronat, Plant Phys. 130: 1079-1089 (2002)参照。

【0236】

ＤＸＳ、ＤＸＲ、ＣＭＳ、ＣＭＫ、ＭＣＳ、ＨＤＳおよび／またはＨＤＲポリペプチドをコードする遺伝子の好適な例としては、大腸菌、Ａ．タリアナおよびシネココッカス・レオポリエンシスにより作られるものが挙げられる。ＤＸＲポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（例えば、配列番号７１）は、例えば、米国特許第７，３３５，８１５号に記載される。

【0237】

メバロン酸生合成ポリペプチド
Ｓ．セレビシエは、イソプレノイド合成のための機能性メバロン酸経路の酵素をコードする内在性遺伝子を含有する。いくつかの実施態様では、組換え宿主も、メバロン酸経路に関与する酵素をコードする１または２以上の異種遺伝子を含有する。宿主の形質転換に好適な遺伝子は、切断型３‐ヒドロキシ‐３‐メチル‐グルタリル（ＨＭＧ）‐ＣｏＡレダクターゼ（ｔＨＭＧ）などのメバロン酸経路における酵素をコードし、および／またはメバロン酸キナーゼ（ＭＫ）をコードする遺伝子、および／またはホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）をコードする遺伝子、および／またはメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ（ＭＰＰＤ）をコードする遺伝子などである。従って、ＨＭＧ‐ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、ＭＫ遺伝子、ＰＭＫ遺伝子、および／またはＭＰＰＤ遺伝子の１または２以上を、微生物などの組換え宿主に組み込むことが可能である。

【0238】

メバロン酸経路ポリペプチドをコードする好適な遺伝子は公知である。例えば、好適なポリペプチドとしては、大腸菌、パラコッカス・デニトリフィカンス、Ｓ．セレビシエ、Ａ．タリアナ、キタサトスポラ・グリセオラ、ホモ・サピエンス、ドロソフィラ・メラノガスター、ガルス・ガルス、ストレプトミセス属ＫＯ‐３９８８、ニコチアナ・アテヌアタ、キタサトスポラ・グリセオラ、ヘベア・ブラジリエンシス、エンテロコッカス・フェシウムおよびヘマトコッカス・プルビアリスにより作られたものなどが挙げられる。例えば、表９および全開示を参照により本明細書に組み込む米国特許第７，１８３，０８９号、第５，４６０，９４９号、および第５，３０６，８６２号、および国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３８９６７を参照。

【0239】

【表8】

【0240】

スクロースシンターゼポリペプチド
スクロースシンターゼ（ＳＵＳ）は、ＵＤＰ糖類、特にＵＤＰグルコースを産生するためのツールとして使用可能である。ＳＵＳ（ＥＣ２．４．１．１３）は、スクロースおよびＵＤＰからＵＤＰグルコースおよびフルクトースの生成を触媒する。

【0241】

このように、ＵＧＴの反応により産生されたＵＤＰは、スクロースの存在下でＳＵＳによりＵＤＰグルコースに変換することが可能である。例えば、Chen et al., 2001, J. Am. Chem. Soc. 123:8866-8867; Shao et al., 2003, Appl. Env. Microbiol. 69:5238-5242; Masada et al., 2007, FEBS Lett. 581:2562-2566; and Son et al., 2009, J. Microbiol. Biotechnol. 19:709-712参照。

【0242】

スクロースシンターゼを使用して、ＵＤＰグルコースを産生し、ＵＤＰを除去することで、様々なシステムにおける化合物の効率的なグリコシル化を容易にすることが可能である。例えば、スクロースを利用する能力が欠損した酵母に、スクローストランスポーターおよびＳＵＳを導入することによりスクロースで増殖させることが可能である。例えば、Ｓ．セレビシエは、効率的なスクロース取り込みシステムを持たず、スクロースの利用は細胞外ＳＵＣ２に依存している。内在性のＳ．セレビシエＳＵＣ２インベルターゼを破壊し、組換えＳＵＳを発現する組み合わせでは、細胞内スクロースは代謝できるが細胞外スクロースは代謝できない酵母株が得られた（Riesmeier et al., 1992, EMBO J. 11:4705-4713）。この株を使用して、ｃＤＮＡ発現ライブラリーでの形質転換およびスクロースを取り込む能力を獲得した形質転換細胞の選択により、スクローストランスポーターを単離した。

【0243】

in vivoにおける組換えスクロースシンターゼおよびスクローストランスポーターの併用発現により、ＵＤＰグルコース利用可能率の増加および不要なＵＤＰの除去が可能となる。例えば、天然スクロース分解システム（Ｓ．セレビシエの場合はＳＵＣ２）のノックアウトと組み合わせた、組換えスクロースシンターゼ、スクローストランスポーター、およびグリコシルトランスフェラーゼの機能的発現を使用して、ステビオールグリコシド類などのグリコシル化合物の産生量を増加することができる細胞を産生することが可能である。グリコシル化の能力が増加したのは、少なくとも（ａ）エネルギー効率のより高い方法でＵＤＰグルコースを産生する能力がより高いことおよび（ｂ）ＵＤＰはグリコシル化反応を阻止するので増殖培地からＵＤＰを除去したことによるものである。

【0244】

スクロースシンターゼは、任意の好適な生物体由来であることが可能である。例えば、限定することなく、Ａ．タリアナ（例えば配列番号７９または８０）またはＣ．アラビカ（例えば、配列番号８１）（例えば、全開示を参照により本明細書に組み込む第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号の配列番号：１７８、１７９、および１８０参照）由来のスクロースシンターゼコード配列としては、Ａ．タリアナ由来のスクローストランスポーターＳＵＣ１のアミノ酸配列（配列番号８０）、およびコーヒー由来のスクロースシンターゼのアミノ酸配列（配列番号８１）などが挙げられる。

【0245】

スクロースシンターゼは、任意の好適な生物体由来であることが可能である。例えば、限定することなく、Ａ．タリアナ、Ｓ．レバウディアナ、またはＣ．アラビカ（例えば、配列番号：７９‐８１参照）由来のスクロースシンターゼコード配列を、好適なプロモーターの制御下に発現プラスミドへクローン化し、宿主（例えば、微生物または植物）で発現することが可能である。ＳＵＳコード配列は、酵母による細胞外スクロースの分解を回避するために、ＳＵＣ２（スクロース加水分解酵素）欠損Ｓ．セレビシエ株中で発現可能である。

【0246】

スクロースシンターゼを、スクローストランスポーター（例えば、Ａ．タリアナＳＵＣ１トランスポーターまたはその機能的ホモログ）および１または２以上のＵＧＴ（例えば、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＥＵＧＴ１１、およびＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、またはそれらの機能的ホモログ）と組み合わせて上記のような株で発現することとが可能である。スクロースを含有する培地において宿主を培養することにより、ＵＤＰグルコースならびに１または２以上のグルコシド（例えば、ステビオールグルコシド）の産生を促進することが可能である。いくつかのケースでは、スクロースシンターゼおよびスクローストランスポーターは、特定の化合物（例えば、ステビオール）の産生のための組換え型である宿主細胞中でＵＧＴと共に発現可能であることに留意されたい。

【0247】

ＥＲＧ９遺伝子の発現を調節すること
内在性のＥＲＧ９遺伝子の発現を、核酸構築物を使用して本明細書に記載される組換え宿主中で変化させることが可能である。構築物は、それぞれＥＲＧ９プロモーターまたはＥＲＧ９読み取り枠（ＯＲＦ）の５’末端内のゲノム配列の一部と相同である２つの領域を含むことができる。構築物としては、更に、野生型ＳｃＫｅｘ２または野生型ＳｃＣｙｃ１のどちらかのプロモーターを含むことができ、プロモーターは、３’末端にヘアピンなどの異種挿入断片を含むことができる。ＯＲＦによりコードされているポリペプチドは、スクアレンシンターゼ（ＥＣ２．５．１．２１）または、このスクアレンシンターゼと少なくとも１００個のアミノ酸が重複する範囲で少なくとも７０％の配列同一性を有する生物学的に活性な断片と、少なくとも７０％の同一性を有しており有利である。例えば、第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号（すべての目的で、その全開示を本明細書に組み込む）参照。

【0248】

異種挿入断片は、ヘアピンループを持つヘアピンの二次構造領域を有することが可能である。異種挿入断片配列は、一般式（Ｉ）：
‐Ｘ１‐Ｘ２‐Ｘ３‐Ｘ４‐Ｘ５
を有し、ここで、

【0249】

Ｘ２は、Ｘ４の少なくとも４個の連続したヌクレオチドと相補的であり、それらとヘアピン二次構造領域を形成する少なくとも４個の連続したヌクレオチドを含み、

【0250】

Ｘ３は任意であり、もし存在するなら、Ｘ２およびＸ４間のヘアピンループの形成に関与するヌクレオチドを含み、

【0251】

Ｘ１およびＸ５は、個々におよび任意に１または２以上のヌクレオチドを含み、

【0252】

Ｘ２およびＸ４は、Ｘ２の少なくとも４個のヌクレオチドの連続した配列が、Ｘ４の少なくとも４個のヌクレオチド連続した配列と相補的であるかぎり、個々に任意の好適な数のヌクレオチドからなることが可能である。いくつかの実施態様では、Ｘ２およびＸ４は同数のヌクレオチドからなる。

【0253】

異種挿入断片は、ヘアピンが完全に形成できるのに十分長く、けれどもフレーム内で異種挿入断片の３’のすぐにあるＯＲＦの限定された翻訳が可能であるように十分短い。一般に、異種挿入断片は長さが１０～５０個のヌクレオチド、例えば１０～３０個のヌクレオチド、１５～２５個のヌクレオチド、１７～２２個のヌクレオチド、１８～２１個のヌクレオチド、１８～２０個のヌクレオチド、または長さが１９個のヌクレオチドである。本明細書で提供されるように：

【0254】

Ｘ２は、例えば４～２０、４～１５、６～１２、８～１２、または９～１１個の範囲のヌクレオチドなどの４～２５個の範囲のヌクレオチドからなることができる。

【0255】

Ｘ４は、例えば４～２０、４～１５、６～１２、８～１２、または９～１１個の範囲のヌクレオチドなどの４～２５個の範囲のヌクレオチドからなることができる。

【0256】

いくつかの実施態様では、Ｘ２は、Ｘ４のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列からなり、Ｘ２すべてのヌクレオチドがＸ４のヌクレオチド配列と相補的である。

【0257】

Ｘ３は存在しなくてもよく、すなわち、Ｘ３は、ゼロ個のヌクレオチドからなっていてもよい。Ｘ３は、１～３個の範囲のヌクレオチドなどの１～５個の範囲のヌクレオチドからなることもできる。

【0258】

Ｘ１は存在しなくてもよく、すなわち、Ｘ１は、ゼロ個のヌクレオチドからなっていてもよい。Ｘ１は、１～２０、１～１５、１～１０、１～５、または１～３個の範囲のヌクレオチドなど１～２５個の範囲のヌクレオチドのからなることもできる。

【0259】

Ｘ５は存在しなくてもよく、すなわち、Ｘ５は、ゼロ個のヌクレオチドからなっていてもよい。Ｘ５は、１～３個の範囲のヌクレオチドなどの１～５個の範囲のヌクレオチドからなることもできる。

【0260】

異種挿入断片は、本明細書で定義する要件を満たす任意の好適な配列であることが可能である。例えば、異種挿入断片は、ｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａｔｔｃ（配列番号８２）、ｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａｃｔｃ（配列番号８３）、ｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａｇｔｃ（配列番号８４）、またはｔｇａａｔｔｃｇｔｔａａｃｇａａａｔｔ（配列番号８５）からなることができる。

【0261】

特定の機序に束縛されること無く、リボソームが少なくとも部分的に立体障害的にＲＮＡに結合して、スクアレンシンターゼの翻訳を低減することよってＥＲＧ９発現を低減することが可能である。従って、例えば機能性スクアレンシンターゼ（ＥＣ２．５．１．２１）の翻訳速度は、減少可能である。そのような構築物を使用することにより、ファルネシルピロリン酸のスクアレンへの代謝回転を減少し、および／またはファルネシルピロリン酸、イソペンテニルピロリン酸、ジメチルアリルピロリン酸、ゲラニルピロリン酸およびゲラニルゲラニルピロリン酸からなる群から選択される化合物の蓄積を向上することも可能である。

【0262】

いくつかの例では、本明細書に記載される組換え宿主を培養するときにスクアレンシンターゼ阻害剤を含むことが有利である。例えばラパキスタットによるスクアレンシンターゼの化学的阻害は、当該分野では公知である。他のスクアレンシンターゼ阻害剤としては、ザラゴジン酸およびＲＰＲ１０７３９３などが挙げられる。従って、ある実施態様では、本明細書で定義する方法の培養工程は、スクアレンシンターゼ阻害剤の存在下に行われる。

【0263】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される組換え宿主は、ＥＲＧ９読み取り枠中に変異を含む。

【0264】

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される組換え宿主は、ＥＲＧ９［Ｄｅｌｔａ］：：ＨＩＳ３欠失／挿入対立遺伝子を含む。

【0265】

Ｄ．機能的ホモログ
上述のポリペプチドの機能的ホモログも、組換え宿主においてステビオールまたはステビオールグリコシド類を産生するための使用に好適である。機能的ホモログは、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、参照ポリペプチドの生化学的または生理学的機能の１または２以上を実行するポリペプチドである。機能的ホモログおよび参照ポリペプチドは、天然にあるポリペプチドであってもよく、配列類似性は、収束または分岐進化現象であってもよい。従って、機能的ホモログは、文献ではホモログ、またはオルソログ、またはパラログとも命名されることもある。野生型コード配列の変異体によりコードされているポリペプチドなどの天然に存在する機能的ホモログのバリアントそれ自体が機能的ホモログであることができる。機能的ホモログは、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘導により、または異なる天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせることにより（「ドメインスワッピング」）生成することも可能である。本明細書に記載される機能性ＵＧＴポリペプチドをコードする遺伝子を改変する技術は公知であり、特に定向進化技術、部位特異的突然変異誘導技術およびランダム突然変異誘導技術などが挙げられ、ポリペプチドの特定の活性を増加させること、基質特異性を変化させること、発現レベルを変化させること、細胞内位置を変化させること、または所望されるようにポリペプチド：ポリペプチド相互作用を改変することに有用であろう。そのような改変されポリペプチドは、機能的ホモログとみなされる。「機能的ホモログ」という用語は、機能的に類似のポリペプチドをコードする核酸に使用されることもある。

【0266】

機能的ホモログは、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列アラインメントの分析により同定することが可能である。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベースを検索することにより、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのホモログの同定が可能となる。配列解析には、参照配列としてＧＧＰＰＳ，ＣＤＰＳ，ＫＳ，ＫＯまたはＫＡＨアミノ酸配列を使用して、非重複データベースのＢＬＡＳＴ、ＲｅｃｉｐｒｏｃａｌＢＬＡＳＴ、またはＰＳＩ‐ＢＬＡＳＴ解析を行ってもよい。いくつかの例では、アミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から推定される。データベース中で４０％を超える配列同一性を有するポリペプチドが、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドとしての適合性を更に評価する候補となる。アミノ酸配列類似性とは、疎水性残基同士の置換または極性残基同士の置換などの保存的アミノ酸置換が含まれる。所望なら、更に評価する候補の数を少なくするために、そのような候補の手作業による検査を行うことが可能である。手作業による検査は、例えば保存された機能性ドメインなどのステビオール生合成ポリペプチドに存在するドメインを有すると思われる候補を選択することにより行うことが可能である。

【0267】

反復配列であり、何らかの二次構造（例えば、ヘリックスやβシート）を形成し、正または負に帯電したドメインを確立し、またはタンパク質モチーフまたはドメインを表す、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドの主要なアミノ酸配列内の領域の位置を決定することにより、保存領域を同定することが可能である。例えば、多様なタンパク質モチーフおよびドメインの共通配列を記載するＰｆａｍウェブサイトであるワールドワイドウェブsanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/.参照。Ｐｆａｍデータベースに含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998); Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997); and Bateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)に記載されている。保存領域は、密接に関連した種からの同一または関連ポリペプチドの配列をアラインメントすることにより決定することも可能である。密接に関連した種は、好ましくは同一の科由来のものである。いくつかの実施態様では、異なる２つの種由来の配列のアラインメントが適当である。

【0268】

一般に、少なくとも約４０％アミノ酸配列同一性を示すポリペプチドが、保存領域を同定するために有用である。関連ポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％アミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％アミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの実施態様では、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。

【0269】

例えば、組換え宿主においてステビオールグリコシド類を産生するのに好適なポリペプチドとしては、ＥＵＧＴ１１（配列番号１６）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ（配列番号１５）、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ（配列番号８６）、ＵＧＴ８５Ｃ（配列番号２６）、およびＵＧＴ７６Ｇ（配列番号２）の機能的ホモログなどが挙げられる。そのようなホモログは、本明細書または全開示を参照により本明細書に組み込む国際特許第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０５００２１号で開示されるＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、ＵＧＴ９１Ｄ２ｍ、ＵＧＴ８５ＣまたはＵＧＴ７６Ｇのアミノ酸配列と９０％を超える（例えば、少なくとも９５％または９９％）配列同一性を有する。ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５Ｃ、およびＵＧＴ７６Ｇポリペプチドのバリアントは、一般に主要なアミノ酸配列内に１０個以下のアミノ酸置換、例えば、７個以下のアミノ酸置換、５個または保存的アミノ酸置換、または１個から５個の間の置換を有する。しかしながら、いくつかの実施態様では、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ８５Ｃ、およびＵＧＴ７６Ｇポリペプチドのバリアントは、１０個以上のアミノ酸置換（例えば、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、１０～２０個、１０～３５個、２０～３０個、または２５～３５個のアミノ酸置換）を有することが可能である。置換は保存的であってもよく、あるいはいくつかの実施態様では非保存的であってもよい。限定するものではないが、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅポリペプチド中の非保存的変化の例としては、グリシンのアルギニンへの変化およびトリプトファンのアルギニンへの変化などが挙げられる。限定するものではないが、ＵＧＴ７６Ｇポリペプチド中の非保存的置換の例としては、バリンのグルタミン酸への変化、グリシンのグルタミン酸への変化、グルタミンのアラニンへの変化、およびセリンのプロリンへの変化などが挙げられる。限定するものではないが、ＵＧＴ８５Ｃポリペプチドへの変化の例として、ヒスチジンのアスパラギン酸への変化、プロリンのセリンへの変化、リジンのスレオニンへの変化、およびスレオニンのアルギニンへの変化などが挙げられる。

【0270】

いくつかの実施態様では、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、予測されるループ外側のポリペプチドの領域にアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を有することが可能であり、例えば、９１Ｄ２ｅ（配列番号１５参照）の残基２０～２６、３９～４３、８８～９５、１２１～１２４、１４２～１５８、１８５～１９８、および２０３～２１４はＮ末端ドメイン中の予測されるループであり、残基３８１～３８６はＣ末端ドメイン中の予測されるループである。例えば、有用なＵＧＴ９１Ｄ２ホモログとしては、残基１～１９、２７～３８、４４～８７、９６～１２０、１２５～１４１、１５９～１８４、１９９～２０２、２１５～３８０、または３８７～４７３での少なくとも１つのアミノ酸置換などが挙げられる。いくつかの実施態様では、ＵＧＴ９１Ｄ２ホモログは、残基３０、９３、９９、１２２、１４０、１４２、１４８、１５３、１５６、１９５、１９６、１９９、２０６、２０７、２１１、２２１、２８６、３４３、４２７、および４３８からなる群から選択される残基の１または２以上にアミノ酸置換を有することが可能である。例えば、ＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログは、残基２０６のアルギニン、残基２０７のシステイン、および残基３４３のアルギニンなどの残基２０６、２０７、および３４３の１または２以上にアミノ酸置換を有することが可能である。ＵＧＴ９１Ｄ２の他の機能的ホモログは、下記の１または２以上を有することが可能である：残基３０のチロシンまたはフェニルアラニン、残基９３のプロリンまたはグルタミン、残基９９のセリンまたはバリン、残基１２２のチロシンまたはフェニルアラニン、残基１４０のヒスチジンまたはチロシン、残基１４２のセリンまたはシステイン、残基１４８のアラニンまたはスレオニン、残基１５２のメチオニン、残基１５３のアラニン、残基１５６のアラニンまたはセリン、残基１６２のグリシン、残基１９５のロイシンまたはメチオニン、残基１９６のグルタミン酸、残基１９９のリジンまたはグルタミン酸、残基２１１のロイシンまたはメチオニン、残基２１３のロイシン、残基２２１のセリンまたはフェニルアラニン、残基２５３のバリンまたはイソロイシン、残基２８６のバリンまたはアラニン、残基４２７のリジンまたはアスパラギン、残基４３８のアラニン、および残基４６２のアラニンまたはスレオニンのどちらか。他の実施態様では、ＵＧＴ９１Ｄ２機能的ホモログは、残基２１１にメチオニンおよび残基２８６にアラニンを含有する。

【0271】

いくつかの実施態様では、有用なＵＧＴ８５Ｃホモログは、残基９、１０、１３、１５、２１、２７、６０、６５、７１、８７、９１、２２０、２４３、２７０、２８９、２９８、３３４、３３６、３５０、３６８、３８９、３９４、３９７、４１８、４２０、４４０、４４１、４４４、および４７１に１または２以上のアミノ酸置換を有することが可能である。限定するものではないが、有用なＵＧＴ８５Ｃホモログの例としては、残基６５（例えば、残基６５のセリン）に置換（配列番号２６に関して）を有するポリペプチド、残基１５（残基１５のロイシン）、２７０（例えば、残基２７０のメチオニン、アルギニン、またはアラニン）、４１８（例えば、残基４１８のバリン）、４４０（例えば、残基４４０のアスパラギン酸）、または４４１（例えば、残基４４１のアスパラギン）との組み合わせで残基６５；残基１３（例えば、残基１３のフェニルアラニン）、１５、６０（例えば、残基６０のアスパラギン酸）、２７０、２８９（例えば、残基２８９のヒスチジン）、および４１８；残基１３、６０、および２７０における置換；残基６０および８７（例えば、残基８７のフェニルアラニン）における置換；残基６５、７１（例えば、残基７１のグルタミン）、２２０（例えば、残基２２０のスレオニン）、２４３（例えば、残基２４３のトリプトファン）、および２７０における置換；残基６５、７１、２２０、２４３、２７０、および４４１における置換；残基６５、７１、２２０、３８９（例えば、残基３８９のバリン）、および３９４（例えば、残基３９４のバリン）における置換；残基６５、７１、２７０、および２８９における置換；残基２２０、２４３、２７０、および３３４（例えば、残基３３４のセリン）における置換；または残基２７０および２８９における置換を有するポリペプチドが挙げられる。以下のアミノ酸変異は、８５Ｃ２ポリペプチドの活性の損失をもたらさなかった：Ｖ１３Ｆ、Ｆ１５Ｌ、Ｈ６０Ｄ、Ａ６５Ｓ，Ｅ７１Ｑ、Ｉ８７Ｆ、Ｋ２２０Ｔ、Ｒ２４３Ｗ、Ｔ２７０Ｍ、Ｔ２７０Ｒ，Ｑ２８９Ｈ、Ｌ３３４Ｓ，Ａ３８９Ｖ、Ｉ３９４Ｖ、Ｐ３９７Ｓ，Ｅ４１８Ｖ、Ｇ４４０Ｄ、およびＨ４４１Ｎ。不活性なクローンにみられる追加の変異としては、Ｋ９Ｅ、Ｋ１０Ｒ，Ｑ２１Ｈ、Ｍ２７Ｖ、Ｌ９１Ｐ、Ｙ２９８Ｃ、Ｋ３５０Ｔ、Ｈ３６８Ｒ，Ｇ４２０Ｒ，Ｌ４３１Ｐ、Ｒ４４４Ｇ、およびＭ４７１Ｔなどが挙げられる。いくつかの実施態様では、ＵＧＴ８５Ｃ２は、部位６５（例えば、セリン）、７１（グルタミン）、２７０（メチオニン）、２８９（ヒスチジン）、および３８９（バリン）における置換を含有する。

【0272】

いくつかの実施態様では、有用なＵＧＴ７６Ｇ１ホモログ（配列番号２）は、残基２９、７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１、および３４６に、１または２以上のアミノ酸置換を有することが可能である（表１０参照）。限定するものではないが、有用なＵＧＴ７６Ｇ１ホモログの例としては、残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、および２９１；残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、および２９１；または残基７４、８７、９１、１１６、１２３、１２５、１２６、１３０、１４５、１９２、１９３、１９４、１９６、１９８、１９９、２００、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２６６、２７３、２７４、２８４、２８５、２９１、３３０、３３１、および３４６に置換を有するポリペプチドなどが挙げられる。表１０参照。

【0273】

【表9】

【0274】

例えばＥＵＧＴ１１またはＵＧＴ９１Ｄ２ｅの基質特異性を改変する方法は、当業者に公知であり、限定することなく、部位特異的／合理的突然変異誘導アプローチ、ランダム定向進化アプローチ、ランダム突然変異誘導／飽和変異技術を酵素の活性サイトの近くで行う組み合わせなどが挙げられる。例えばSarah A. Osmani, et al., Phytochemistry 70 (2009) 325-347参照。

【0275】

一般に、候補配列は、参照配列の長さの８０パーセント～２００パーセントの長さを有し、例えば、参照配列の長さの８２、８５、８７、８９、９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００パーセントである。一般に、機能的ホモログポリペプチドは、参照配列の長さの９５パーセント～１０５パーセントの長さを有し、例えば、参照配列の長さの９０、９３、９５、９７、９９、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０パーセントまたはそれらの間の任意の範囲である。参照核酸またはポリペプチドに対する任意の候補核酸またはポリペプチドの同一性率は、以下のように決定することが可能である。参照配列（例えば、本明細書に記載される核酸配列またはアミノ酸配列）を、核酸またはポリペプチド配列のアラインメントを全長にわたって行うこと（グローバルアライメント）が可能なＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータープログラム（バージョン１．８３、デフォルトパラメーター）を使用して、１または２以上の候補配列に対してアラインメントする。Chenna et al., Nucleic Acids Res., 31(13):3497-500 (2003)。

【0276】

ＣｌｕｓｔａｌＷは、参照および１または２以上の候補配列の間の最適な一致を計算し、同一性、類似性および差異を決定可能なようにそれらをアラインメントする。１または２以上の残基のギャップを参照配列、候補配列、または両方に挿入して、配列アラインメントを最適化することが可能である。核酸配列の対での迅速なアラインメントでは、以下のデフォルトパラメーターを使用する：ワードサイズ：２；ウィンドウサイズ：４；スコア方法：パーセント；トップダイアゴナルの数：４；およびギャップペナルティ：５。核酸配列の複数アラインメントでは、以下のパラメーターを使用する：ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ継続ペナルティ：５．０；および重量移行：あり。タンパク質配列の対での迅速なアラインメントでは、以下のパラメーターを使用する：ワードサイズ：１；ウィンドウサイズ：５；スコア方法：パーセント；トップダイアゴナルの数：５；ギャップペナルティ：３。タンパク質配列の複数アラインメントでは、以下のパラメーターを使用する：重量行列：ｂｌｏｓｕｍ；ギャップ開始ペナルティ：１０．０；ギャップ継続ペナルティ：０．０５；親水性ギャップ：オン；親水性残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；残基特異的ギャップペナルティ：オン。ＣｌｕｓｔａｌＷの出力は、配列間の関係を反映する配列アラインメントである。ＣｌｕｓｔａｌＷは、例えば、ワールドワイドウェブのベイラー医科大学のサーチランチャーサイト（searchlauncher.bcm.tmc.edu/multi-align/multi-align.html）およびワールドワイドウェブの欧州バイオインフォマティクス研究所のサイト（ebi.ac.uk/clustalw）で実行可能である。

【0277】

候補である核酸またはアミノ酸配列の参照配列との同一性率を決定するために、ＣｌｕｓｔａｌＷを使用して配列をアラインメントし、アラインメントにおける同一の一致の数を、参照配列の長さで割り、得られた結果に１００を掛ける。同一性率の数を最も近い小数一桁の位に四捨五入することが可能であることに留意されたい。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３および７８．１４は、７８．１に切り下げ、７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は７８．２に切り上げる。

【0278】

機能性ＵＧＴは、酵素により行われるグルコシル化または他の酵素活性に関与しない追加のアミノ酸を含むことが可能であり、従って、そのようなポリペプチドは、そうでない場合よりも長くなることが理解されるであろう。例えば、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、精製タグ（例えば、ＨＩＳタグまたはＧＳＴタグ）、葉緑体トランジットペプチド、ミトコンドリアトランジットペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、またはアミノまたはカルボキシ末端に付加した分泌タグを含むことが可能である。いくつかの実施態様では、ＥＵＧＴ１１ポリペプチドは、例えば、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などのレポーターとして機能するアミノ酸配列を含む。

【0279】

ＩＩ．ステビオールおよびステビオールグリコシド生合成核酸
本明細書に記載されるポリペプチドコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに好適な１または２以上の調節領域とセンス方向に機能的に連結したそのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロン性ｍＲＮＡから複数の遺伝子産物を発現することが可能であるため、所望ならばこれらの微生物の単一の調節領域の制御下で複数のポリペプチドを発現することが可能である。調節領域がコード配列の転写または翻訳を調節するのに効果的であるように調節領域およびコード配列が配置されているとき、コード配列および調節領域は機能的に連結しているとみなされる。一般に、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始サイトは、モノシストロン性遺伝子の調節領域から１個～約５０個のヌクレオチドの下流に配置される。

【0280】

多くの場合に、本明細書に記載されるポリペプチドのコード配列は、組換え宿主以外の種で同定されている、すなわち、異種性核酸である。従って、組換え宿主が微生物であるなら、コード配列は、他の原核または真核微生物由来、植物由来または動物由来であることができる。しかしながら、いくつかの場合では、コード配列は、宿主にネイティブでありその生物体へ再導入された配列である。天然配列は、外来性核酸に連結した非天然配列、例えば、組換え核酸構築物中で天然配列に隣接する非天然調節配列の存在により、しばしば天然に存在する配列から区別することが可能である。更に、一般に、安定に形質転換された外来性核酸は、天然配列がみられる部位以外の部位に組み込まれる。

【0281】

「調節領域」とは、転写または翻訳開始および速度、および転写または翻訳産生物の安定性および／または移動性に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を意味する。調節領域としては、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答領域、タンパク質認識部位、誘導性領域、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一般に、調節領域は、少なくともコア（基本）プロモーターを含む。調節領域は、エンハンサー配列、上流領域または上流活性化領域（ＵＡＲ）などの少なくとも１つの制御領域も含むことが可能である。調節領域は、調節領域がコード配列の転写または翻訳の調節に効果的であるように調節領域およびコード配列を配置することにより、コード配列に機能的に連結している。例えば、コード配列およびプロモーター配列を機能的に連結するために、コード配列の翻訳読み枠の翻訳開始サイトは、一般にプロモーターから１個～約５０個のヌクレオチドの下流に配置される。しかしながら、調節領域を、翻訳開始サイトから約５，０００個と多数のヌクレオチドの上流または転写開始部位から約２，０００個のヌクレオチドの上流に配置することが可能である。

【0282】

含むべき調節領域の選択は、限定されるものではないが、特定の培養段階の間の効率、選択能、誘導能、所望の発現レベル、および優先発現などいくつかの因子に依存している。調節領域を適切に選択しコード配列に対して配置することによりコード配列の発現を調節することは、当業者には公知である。例えば、イントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーターおよび誘導性領域など１または２以上の調節領域が存在できることは理解されるであろう。

【0283】

１個以上の遺伝子を、組換え核酸構築物中で、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシド産生の別々な側面のために有用な「モジュール」で組み合わせることが可能である。モジュール、特にポリシストロニック性モジュールで複数の遺伝子を組み合わせることは、様々な種におけるモジュールの使用を容易とする。例えば、ステビオール生合成遺伝子群、すなわちＵＧＴ遺伝子群は、好適な調節領域の挿入後にモジュールを多様な種の中へ導入可能であるように、ポリシストロニック性モジュールで組み合わせることが可能である。他の例として、各ＵＧＴコード配列が別々の調節領域に機能的に連結してＵＧＴモジュールを形成するように、ＵＧＴ遺伝子群を組み合わせることが可能である。そのようなモジュールは、モノシストロニック性発現が必要であるか望ましい種に使用可能である。ステビオールまたはステビオールグリコシド産生に有用な遺伝子に加えて、一般に、組換え構築物は、複製開始点および適切な種における構築物の維持のための選択マーカーを１または２以上含有する。

【0284】

遺伝コードの縮重のため、多くの核酸が特定のポリペプチドをコードすること、すなわち、多くのアミノ酸に、アミノ酸のコドンとなる２つ以上のヌクレオチド三つ組があることを理解されたい。従って、所与のポリペプチドのコード配列におけるコドンは、特定の宿主（例えば、微生物）用の適切なコドンバイアス表を使用して、その宿主における最適な発現が得られるように改変可能である。単離された核酸として、これらの改変された配列は精製分子として存在可能であり、組換え核酸構築物のモジュールを構築するのに使用されるベクターまたはウイルスに組み込み可能である。

【0285】

いくつかのケースでは、代謝中間体をステビオールまたはステビオールグリコシド生合成に転用するために、内在性のポリペプチドの機能の１または２以上を阻止することが望ましい。例えば、ステビオールまたはステビオールグリコシド産生を更に増加させるために、例えばスクアレンエポキシダーゼを下方制御することにより、酵母株におけるステロール類の合成を下方制御することが望ましい。他の例としては、例えば二次代謝物からグルコース部分を除去するグリコヒドラーゼまたは本明細書に述べるホスファターゼなどの特定の内在性の遺伝子産物の分解性機能を抑制することが望ましい。他の例としては、グリコシル化ステビオシドの分泌が抑制されるように、ステビオールグリコシド類の輸送に関する膜トランスポーターの発現を抑制することが可能である。そのような調節は、ステビオールグリコシド類の分泌が、微生物の培養の間の所望の期間抑制可能あり、回収時のグリコシド産生物の収量が増加するという点で有益である。そのようなケースでは、ポリペプチドまたは遺伝子産生物の発現を阻止する核酸を、株に形質転換される組換え構築物に含むことが可能である。あるいは、突然変異誘導を、機能を阻止することが望まれる遺伝子における変異体を作成するために使用可能である。

【0286】

ＩＩＩ．宿主
微生物
組換え宿主を、ステビオールグリコシド類の産生のためのポリペプチドを発現するために使用することが可能であり、例えば哺乳類、昆虫および植物細胞などが挙げられる。多くの原核生物および真核生物も、本明細書に記載される組換え微生物の構築における使用に好適であり、例えばグラム陰性細菌、酵母および真菌類などが挙げられる。ステビオールまたはステビオールグリコシド産生株としての使用のために選択された種および株は、まず、どの産生遺伝子が株に内在性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定するために分析する。株に内在性のカウンターパートが存在しない遺伝子を１または２以上の組換え構築物中に構築し、その後、欠落した機能を提供するために株に形質転換する。

【0287】

原核および真核種の例は、以下に詳細に説明する。しかしながら、他の種も好適であることが理解されるであろう。例えば、好適な種は、アガリクス属、アスペルギルス属、バチルス属、カンジダ属、コリネバクテリウム属、エレモテシウム属、エシェリキア属、フザリウム属／ジベレラ属、クリベロミセス属、ラエチポルス属、レンチヌス属、ファフィア属、ファネロカエテ属、ピキア属、フィスコミトレラ属、ロドトルラ属、サッカロミケス属、シゾサッカロミケス属、スファセロマ属、キサントフィロマイセス属およびヤロウイア属からなる群から選択される属であることが可能である。そのような属由来の種の例としては、レンチヌス・チグリヌス、ラエチポルス・スルフレウス、ファネロカエテ・クリソスポリウム、ピキア・パストリス、シベルリンドネラ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ）・ジャジニイ、フィスコミトレラ・パテンス、ロドトルラ・グルチニス３２、ロドトルラ・ムチラギノーザ、ファフィア・ロドジマＵＢＶ‐ＡＸ、キサントフィロマイセス・デンドロアス、フザリウム・フジコロイ／ジベレラ・フジクロイ、カンジダ・ウチリス、カンジダ・グラブラタ、カンジダ・アルビカンス、およびヤロウイア・リポリティカなどが挙げられる。いくつかの実施態様では、微生物は、ジベレラ・フジクロイ、クルイベロミセス・ラクチス、シゾサッカロミセス・ポンベ、アスペルギルス・ニガー、ヤロウイア・リポリティカ、アシュビア・ゴッシピイ、またはサッカロマイセス・セレビシエなどの子嚢菌であることができる。いくつかの実施態様では、微生物は、大腸菌、ロドバクター・スフェロイデス、またはロドバクター・カプスラータなどの原核生物であることができる。特定の微生物を、高い処理量を有する方法で、関心のある遺伝子のスクリーニングおよびテストに使用することが可能であり、一方、所望の生産性または増殖特性を有する他の微生物をステビオールグリコシド類の大規模産生に使用することが可能であることが理解されるであろう。

【0288】

サッカロマイセス・セレビシエ
サッカロマイセス・セレビシエは、合成生物学において広く使用されているシャーシ生物体であり、組換え微生物プラットフォームとして使用可能である。Ｓ．セレビシエに関する変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報があり、産生物収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能としている。組換え微生物を作る方法は公知である。

【0289】

ステビオール生合成遺伝子群は、任意の多数の公知のプロモーターを使用して酵母中にて発現可能である。テルペンを過剰産生する株は公知であり、テビオールおよびステビオールグリコシド産生に利用可能なゲラニルゲラニル二リン酸の量を増加するために使用可能である。

【0290】

アスペルギルス属
Ａ．オリゼ、Ａ．ニガーおよびＡ．ソーヤなどのアスペルギルス属種は、食物産生において広く使用される微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用可能である。Ａ．ニジュランス、Ａ．フミガタス、Ａ．オリゼ、Ａ．クラバタス、Ａ．フラバス、Ａ．ニガー、およびＡ．テレウスのゲノムのヌクレオチド配列は入手可能であり、フラックスを高め、産生物収量を増やすための内在性経路の合理的設計および改変を可能としている。アスペルギルス属の代謝モデルは開発されており、トランスクリプトームの研究およびプロテオミクスの研究も行われている。Ａ．ニガーは、クエン酸およびグルコン酸などの多くの食品成分の工業的生産のために培養されており、従ってＡ．ニガーなどの種はステビオールおよびステビオールグリコシド類などの食品成分の産生に一般的に好適である。

【0291】

大腸菌
合成生物学において広く使用されている他のプラットフォーム生物体である大腸菌も、組換え微生物プラットフォームとして使用することが可能である。サッカロミケス属と同様に、大腸菌に関する変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピューターモデルおよび他の情報があり、産生物収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能としている。組換え大腸菌微生物を作るために、サッカロミケス属に関して述べたと同様の方法を使用することが可能である。

【0292】

アガリクス属、ジベレラ属およびファネロカエテ属
アガリクス属、ジベレラ属およびファネロカエテ属は、培養物中で大量のジベレリンを産生することが公知であるので、有用であり得る。従って、大量のステビオールおよびステビオールグリコシド類を産生するテルペン前駆体は、内在性の遺伝子により既に産生されている。従って、ステビオールまたはステビオールグリコシド生合成ポリペプチドのための組換え遺伝子を含有するモジュールを、メバロン酸またはＭＥＰ経路遺伝子を導入することを要さずにそれらの属の種に導入することが可能である。

【0293】

アークスラ・アデニニボランス（ブラストボツリス・アデニニボランス）
アークスラ・アデニニボランスは、独特な生化学的特性を有する二形成の酵母である（温度４２℃まではパン酵母のように出芽酵母として増殖し、この閾値以上では糸状に増殖する）。広範囲の基質で増殖可能であり、硝酸を同化することが可能である。天然プラスチックを産生する株の生成や、環境サンプル中のエストロゲンのバイオセンサー開発への応用に成功している。

【0294】

ヤロウイア・リポリティカ
ヤロウイア・リポリティカは、広範囲の基質で増殖可能な二形成の酵母である（アークスラ・アデニニボランス参照）。産業的応用への可能性は高いが、商業的に利用可能な組換え産生物は今のところない。

【0295】

ロドバクター属
ロドバクター属は、組換え微生物プラットフォームとして使用可能である。大腸菌と同様にして、プラスミドベクターとして利用可能で好適な変異体のライブラリーがあり、産生物収量を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能としている。カロテノイドおよびＣｏＱ１０の産生増加のために、ロドバクターの膜状細菌種において、イソプレノイド経路が設計されている。米国特許公報第２００５０００３４７４号および第２００４００７８８４６号参照。大腸菌に関して述べた方法と同様の方法を使用して組換えロドバクター微生物を作成可能である。

【0296】

カンジダ・ボイジニイ
カンジダ・ボイジニイは、メチロトローフ酵母である（メタノールで増殖可能である）。ハンセヌラ・ポリモルファおよびピキア・パストリスなどの他のメチロトローフ種のように、異種タンパク質の産生に優れたプラットフォームを提供する。数グラムの範囲の収量の外来タンパク質が分泌されたことが報告されている。コンピューター法の一つであるＩＰＲＯは、最近、カンジダ・ボイジニイキシロースレダクターゼの補助因子特異性をＮＡＤＰＨからＮＡＤＨへ実験的に変換する変異を予測した。

【0297】

ハンセヌラ・ポリモルファ（ピキア・アングスタ）
ハンセヌラ・ポリモルファは、もう１つのメチロトローフ酵母である（カンジダ・ボイジニイ参照）。更に、広範囲の他の基質でも増殖可能であり、熱耐性があり、硝酸を同化することが可能である（クルイベロミセス・ラクチス参照）。Ｂ型肝炎ワクチン、インスリンおよびＣ型肝炎の処置用インターフェロンα‐２ａ、更に多様な産業用酵素の生産に応用されている。

【0298】

クルイベロミセス・ラクチス
クルイベロミセス・ラクチスは、一般に、ケフィアの生産に応用されている酵母である。数種類の糖類で、最も大切なことには牛乳やホエーに存在するラクトースで増殖可能である。特に、チーズの生産のためのキモシン（子牛の胃に通常存在する酵素）の生産への応用に成功している。生産は、４０，０００Ｌの規模の発酵槽で行われる。

【0299】

ピキア・パストリス
ピキア・パストリスはメチロトローフ酵母である（カンジダ・ボイジニイおよびハンセヌラ・ポリモルファ参照）。外来タンパク質の産生のための効率的なプラットフォームを提供する。プラットフォーム領域はキットで入手可能であり、学術的研究におけるタンパク質の産生に世界中で使用されている。株は、複雑なヒトＮ‐グリカンを産生できるように操作されている（酵母グリカンは、ヒトで見られるものと類似しているが、同一ではない）。

【0300】

フィスコミトレラ属
フィスコミトレラ・モスセスは、培養懸濁液で増殖すると、酵母または他の真菌培養物と類似の特性を有する。この属は、他のタイプの細胞では産生が困難である植物二次代謝物の産生用細胞タイプとして重要になりつつある。

【0301】

ＩＶ．ステビオールグリコシド類を産生する方法
本明細書に記載される組換え宿主を、レバウディオサイドＭなどのステビオールグリコシド類を産生する方法に使用することが可能である。例えば、組換え宿主が微生物である場合、方法には、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシド生合成遺伝子が発現される条件下で培地において組換え微生物を増殖することが含まれる。組換え微生物は、供給バッチまたは連続プロセスにおいて増殖可能である。一般に、組換え微生物は、所望の期間、所定の温度で発酵槽中で増殖される。ある実施態様では、微生物としては、限定することなくＳ．セレビシエ、Ａ．ニガー、Ａ．オリゼ、大腸菌、Ｌ．ラクチスおよびＢ．スブチリスなどが挙げられる。本発明で提供される、構築・遺伝子改変微生物は、従来の発酵プロセスを使用して培養可能であり、特に、ケモスタット、バッチ式、流加培養、連続灌流発酵、および連続灌流細胞培養などが挙げられる。

【0302】

この方法で使用される特定の微生物によっては、イソペンテニル生合成遺伝子およびテルペンシンターゼおよびシクラーゼ遺伝子などの他の組換え遺伝子が存在して、発現されることが可能である。例えば、イソペンテニル二リン酸、ジメチルアリル二リン酸、ゲラニルゲラニル二リン酸、カウレンおよびカウレン酸などの基質や中間体のレベルは、公表された方法に従って分析のために培地からサンプルを抽出して決定することが可能である。

【0303】

組換え微生物を所望の期間培養物で増殖した後、ステビオールおよび／または１または２以上のステビオールグリコシド類を、従来公知の様々な技術を使用して培養物から回収することが可能である。いくつかの実施態様では、供給原料が宿主に入ることおよび産生物を取り出すことを助けるために、透過剤を添加することが可能である。組換え宿主が植物または植物細胞である場合、ステビオールまたはステビオールグリコシド類は、従来公知の様々な技術を使用して植物組織から抽出可能である。例えば、培養した微生物または植物組織の粗製可溶化液を遠心分離して、上澄みを得ることが可能である。得られた上澄みは、例えば、Phenomenex社製Ａｑｕａ（登録商標）Ｃ１８カラムまたはＳｙｎｅｒｇｉ（商標）ＨｙｄｒｏＲＰ８０オングストロームカラムなどのＣ１８カラムなどのクロマトグラフカラムに付し、水洗して親水性化合物を除去し、アセトニトリルまたはメタノールなどの溶媒で目的の化合物を溶出することが可能である。その後、化合物を分取ＨＰＬＣにより更に精製することが可能である。国際特許第ＷＯ２００９／１４０３９４号参照。

【0304】

ステビオールグリコシド（例えば、レバウディオサイドＭ）の産生量は、約１ｍｇ／Ｌ～約２８００ｍｇ／Ｌ、例えば約１～約１０ｍｇ／Ｌ、約３～約１０ｍｇ／Ｌ、約５～約２０ｍｇ／Ｌ、約１０～約５０ｍｇ／Ｌ、約１０～約１００ｍｇ／Ｌ、約２５～約５００ｍｇ／Ｌ、約１００～約１，５００ｍｇ／Ｌ、または約２００～約１，０００ｍｇ／Ｌであることができる。一般に、培養時間が長いほど、産生物の量も多くなるであろう。従って、組換え微生物は、１日～７日、１日～５日、３日～５日、約３日、約４日、または約５日間培養することが可能である。

【0305】

本明細書に記載した様々な遺伝子およびモジュールは、単一の微生物ではなくむしろ２個以上の組換え微生物中に存在することが可能なことが理解されるであろう。複数の組換え微生物を使用する場合、それらを混合培養物中で増殖して、ステビオールおよび／またはステビオールグリコシド類を産生することが可能である。例えば、第１の微生物がステビオールを産生する１または２以上の生合成遺伝子を含み、第２の微生物が、ステビオールグリコシド生合成遺伝子を含むことが可能である。あるいは、２個以上の微生物はそれぞれ別々の培地で増殖可能であり、第１の培地の産生物、例えば、ステビオールを、第２の培地に導入して、続く中間体またはレバウディオサイドＡなどの最終産物に変換することが可能である。第２のまたは最後の微生物により産生された産生物は、その後回収する。いくつかの実施態様では、培地以外の栄養源を使用し、発酵槽以外のシステムを利用して、組換え微生物を増殖することが理解されるであろう。

【0306】

ステビオールグリコシド類は、異なる食品システムにおいて必ずしも均等な性能を有する必要はない。従って、所望のステビオールグリコシド組成物を合成させる能力を有することが望ましい。本明細書に記載される組換え宿主は、特定のステビオールグリコシド類（例えば、レバウディオサイドＭ）の濃度が選択的に高く、一貫した味プロフィールを有する組成物を産生することが可能である。従って、本明細書に記載される組換え微生物、植物および植物細胞は、所与の食品に望ましい甘味プロフィールに合致するようにデザインされた、各ステビオールグリコシド類の割合がバッチ間で一定である組成物の産生を容易とすることが可能である。本明細書に記載される微生物は、ステビア抽出物に存在する望ましくない植物副産物を産生しない。従って、本明細書に記載される組換え微生物により産生されたステビオールグリコシド組成物は、ステビア属植物由来の組成物と区別可能である。

【0307】

Ｖ．食品産生物
本明細書で開示される方法により得られたステビオールグリコシド類は、食品および飲料製品、健康補助食品および甘味料組成物を作るために使用可能である。例えば、レバウディオサイドＭなどの実質的に純粋なステビオールグリコシドを、アイスクリーム、炭酸飲料、フルーツジュース、ヨーグルト、ベイカリー製品、チューイングガム、ハードおよびソフトキャンディー、およびソース類などの食品に含有させることが可能である。実質的に純粋なステビオールグリコシドは、医薬品、医療用品、健康補助食品および栄養補助食品などの非食品に含有させることも可能である。実質的に純粋なステビオールグリコシド類は、農業用およびペット動物用両方の動物用飼料製品に含有させることも可能である。あるいは、ステビオールグリコシド類の混合物は、特定のステビオールまたはステビオールグリコシドを産生する、組換え微生物を別々に培養すること、または異なる植物／植物細胞を増殖すること、各微生物または植物／植物細胞から実質的に純粋な形態でステビオールまたはステビオールグリコシドを回収すること、その後各化合物を所望の割合で含有する混合物を得るために化合物（例えば、レバウディオサイドＭと１または２以上の他のステビオールグリコシド類）を混合することにより作ることが可能である。本明細書に記載される組換え微生物、植物および植物細胞は、現行のステビア属産生物と比較して、より正確で均一な混合物を得ることを可能とする。他の方法では、実質的に純粋なステビオールグリコシドは、例えばサッカリン、デキストロース、スクロース、フルクトース、エリスリトール、アスパルテーム、スクラロース、モナチン、またはアセスルファムカリウムなどの他の甘味料と一緒に、食品に組み込むことが可能である。他の甘味料に対するステビオールグリコシドの重量比は、最終食品の良好な味を達成するために所望ならば変化させることが可能である。例えば、米国特許公報第２００７／０１２８３１１号参照。いくつかの実施態様では、ステビオールグリコシドには、風味調節剤として風味（例えば、柑橘系）を付与することが可能である。

【0308】

本明細書に記載される組換え微生物、植物、または植物細胞により産生された組成物は、食品に組み込むことが可能である。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、ステビオールグリコシドおよび食品のタイプによって、乾燥重量基準で約２０ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇ～約１８００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇの範囲で、食品に組み込むことが可能である。例えば、組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、乾燥重量基準で食品が最大で５００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇであるように、デザート、冷菓子（例えば、アイスクリーム）、乳製品（例えば、ヨーグルト）、または飲料（例えば、炭酸飲料）に組み込むことが可能である。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、乾燥重量基準で食品が最大で３００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇであるように、ベイカリー製品（例えば、ビスケット）に組み込むことが可能である。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、乾燥重量基準で食品が最大で１０００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇであるように、ソース（例えば、チョコレートシロップ）または野菜産生物（例えば、ピクルス）に組み込むことが可能である。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、乾燥重量基準で食品が最大で１６０ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇであるように、パンに組み込むことが可能である。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、乾燥重量基準で食品が最大で１６００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇであるように、ハードまたはソフトキャンディーに組み込むことが可能である。組換え微生物、植物、または植物細胞により産生されたステビオールグリコシド組成物は、乾燥重量基準で食品が最大で１０００ｍｇのステビオールグリコシド／食品ｋｇであるように、フルーツ加工製品（例えば、フルーツジュース、フルーツフィリング、ジャム、およびゼリー）に組み込むことが可能である。

【0309】

いくつかの実施態様では、実質的に純粋なステビオールまたはステビオールグリコシドを、卓上甘味料または「カップ・フォー・カップ（cup-for-cup）」製品に組み込む。一般に、そのような産生物は、当業者に公知の例えばマルトデキストリン類などの１または２以上の増量剤で適切な甘味レベルまで希釈される。レバウディオサイドＭの濃度が高いステビオールグリコシド組成物を、卓上での使用に、乾燥重量に基づいて例えば１０，０００～３０，０００ｍｇのステビオールグリコシド／製品ｋｇで小袋に充填することが可能である。

【0310】

本発明は、以下の例において更に説明するが、それらは請求項に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

【0311】

例
以下の例は、本発明の具体的な実施態様およびその様々な使用の例示である。それらは、単に説明の目的であり、本発明を限定することを意図するものではない。

【0312】

例１：ＥＦＳＣ３０４４の株エンジニアリングおよび発酵
ＥＦＳＣ３０４４酵母株は、３つの栄養要求性改変、すなわちＵＲＡ３、ＬＥＵ２およびＨＩＳ３を欠失する野生型サッカロマイセス・セレビシエ株から誘導した。株は、標準的な遺伝子方法を用いて操作可能であり、通常の二倍体または一倍体酵母株として使用可能である。株を、５個のＤＮＡ構築物のゲノム組込みによりステビオールグリコシド類産生酵母に変換した。各構築物は複数の遺伝子を含有し、相同組換えにより酵母ゲノム中へ導入した。更に、第１、第２、および第５構築物を、酵母における相同組換えにより組み立てた。

【0313】

第１構築物は８個の遺伝子を含有し、ＤＰＰ１座に挿入され、ＤＰＰ１（ホスファターゼ）を破壊、部分的に欠失させた。挿入されたＤＮＡは、以下を含有した：ｎａｔＭＸ遺伝子（選択マーカー）を発現するアシュビア・ゴシッピイＴＥＦ１プロモーターとその後のＡ．ゴシッピイ由来ＴＥＦ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＧＰＤ１プロモーターにより発現されるＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化ステビア・レバウディアナＵＧＴ８５Ｃ２（ＧｅｎＢａｎｋＡＡＲ０６９１６．１；配列番号３）とその後のネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＰＩ１プロモーターにより発現されるＳ．レバウディアナＣＰＲ‐８（配列番号５）とその後のネイティブ酵母ＴＤＨ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＰＤＣ１プロモーターにより発現されるアラビドプシス・タリアナカウレンシンターゼ（配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋＡＥＥ３６２４６．１と類似）とその後のネイティブ酵母ＦＢＡ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＥＦ２プロモーターにより発現される合成シネココッカス属ＧＧＰＰＳ（配列番号２２、ＧｅｎＢａｎｋＡＢＣ９８５９６．１）とその後のネイティブ酵母ＰＧＩ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＥＦ１プロモーターにより発現されるＤＮＡ２．０コドン最適化したＳ．レバウディアナＫＡＨｅ１（配列番号８）とその後のネイティブ酵母ＥＮＯ２ターミネーター；ネイティブ酵母ＦＢＡ１プロモーターにより発現される合成Ｓ．レバウディアナＫＯ‐１（配列番号２３、ＧｅｎＢａｎｋＡＢＡ４２９２１．１）とその後のネイティブ酵母ＴＤＨ２ターミネーター；およびネイティブ酵母ＰＧＫ１プロモーターにより発現されるゼア・メイズ切断型ＣＤＰＳ（配列番号１３３）とその後のネイティブ酵母ＡＤＨ２ターミネーター。

【0314】

第２構築物は、ＹＰＲＣΔ１５座に挿入され、以下を含有した：ｋａｎＭＸ遺伝子（選択マーカー）の前にＡ．ゴシッピイ由来ＴＥＦ１プロモーターとその後のＡ．ゴシッピイ由来ＴＥＦ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＰＧＫ１プロモーターにより発現されるＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化Ａ．タリアナＡＴＲ２（配列番号１０）とその後のネイティブ酵母ＡＤＨ２ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＰＩ１プロモーターにより発現されるＳ．レバウディアナＵＧＴ７４Ｇ１（配列番号１３５、ＧｅｎＢａｎｋＡＡＲ０６９２０．１）とその後のネイティブ酵母ＴＤＨ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＥＦ１プロモーターにより発現されるＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化したＳ．レバウディアナＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１４、ＧｅｎＢａｎｋＡＡＲ０６９１２をコード）とその後のネイティブ酵母ＥＮＯ２ターミネーター；およびネイティブ酵母ＧＰＤ１プロモーターにより発現されるアミノ酸改変Ｌ２１１ＭおよびＶ２８６Ａを有するＳ．レバウディアナＵＧＴ９１Ｄ２ｅ‐ｂをコードするＧｅｎｅＡｒｔコドン最適化した配列（配列番号１５は野生型配列のＵＧＴ９１Ｄ２ｅアミノ酸配列；コドン最適化ヌクレオチド配列は配列番号９に記載）とその後のネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーター。ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ‐ｂは、残基２１１のメチオニン残基および残基２８６のアラニン残基に変異を有する配列番号６６として本明細書で開示される。

【0315】

第１および第２構築物は、接合および切開により同一胞子クローン中で組み合わせた。この酵母株は、その後２つの連続的な工程で構築物３および４と形質転換した。

【0316】

構築物３は、遺伝子ＰＲＰ５およびＹＢＲ２３８Ｃ間に組み込まれ、クルイベロミセス．ラクチスｌｅｕ２遺伝子を発現するＫ・ラクチスｌｅｕ２プロモーターとその後のＫ．ラクチス由来ｌｅｕ２ターミネーター、ＤＮＡ２．０最適化したＳ．レバウディアナＫＡＨｅ１（配列番号８）を発現するネイティブ酵母ＧＰＤ１プロモーターとその後のネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーター、およびゼア・メイズ切断型ＣＤＰＳ（配列番号１３３）を発現するネイティブ酵母ＴＰＩ１プロモーターとその後のネイティブ酵母ＴＰＩ１ターミネーターを含有する。

【0317】

構築物４は、遺伝子ＥＣＭ３およびＹＯＲ０９３Ｃの間のゲノムの中へ組み込まれ、Ｋ．ニューモニエｈｐｈＭＸ遺伝子を発現するＡ．ゴシッピイ由来ＴＥＦ１プロモーターとその後のＡ．ゴシッピイ由来ＴＥＦ１ターミネーター、ネイティブ酵母ＧＰＤ１プロモーターにより発現されるシネココッカス属ＧＧＰＰＳ（配列番号２２）とその後のネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーター、およびＡ．タリアナＫＳ（配列番号６）を発現するネイティブ酵母ＴＰＩ１プロモーターとその後のネイティブ酵母ＴＰＩ１ターミネーターを含有する発現カセットを有する。

【0318】

その後、４個の導入された選択マーカーｎａｔＭＸ、ｋａｎＭＸ、Ｋ．ラクチスＬＥＵ２およびＫ．ニューモニエｈｐｈＭＸおよび選択マーカー遺伝子の前のプロモーターおよびその後のターミネーターを、組換えにより除去した。

【0319】

この酵母株中に、酵母形質転換およびホモログ組換えにより、第５構築物を挿入し、組み立てた。第５構築物は７個の遺伝子を含有し、ＹＯＲＷΔ２２座に挿入した。挿入されたＤＮＡは以下を含有した：シゾサッカロミセス・ポンベＨＩＳ５遺伝子（選択マーカー）を発現するＡ．ゴシッピイＴＥＦ１プロモーターとその後のＡ．ゴシッピイ由来ＴＥＦ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＧＰＤ１プロモーターにより発現されるＳ．レバウディアナＫＯ‐１（配列番号２３、ＧｅｎＢａｎｋＡＢＡ４２９２１．１）とその後のネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＰＩ１プロモーターにより発現されるＳ．レバウディアナＣＰＲ‐８（配列番号５）とその後のネイティブ酵母ＴＤＨ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＰＤＣ１プロモーターにより発現されるアラビドプシス・タリアナカウレンシンターゼ（配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋＡＥＥ３６２４６．１と類似）とその後のネイティブ酵母ＦＢＡ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＥＦ２プロモーターにより発現されるコドン最適化バージョンのライス遺伝子Ｏｓ０３ｇ０７０２０００（配列番号１８、ＥＵＧＴ１１をコードする）とその後のネイティブ酵母ＰＧＩ１ターミネーター；ネイティブ酵母ＴＥＦ１プロモーターにより発現されるＤＮＡ２．０コドン最適化Ｓ．レバウディアナＫＡＨｅ１（配列番号８）とその後のネイティブ酵母ＥＮＯ２ターミネーター；およびネイティブ酵母ＰＧＫ１プロモーターにより発現されるゼア・メイズ切断型ＣＤＰＳ（配列番号１３３）とその後のネイティブ酵母ＡＤＨ２ターミネーター。

【0320】

上記酵母株は、２個のプラスミドＥＰＳＣ２１８２およびＥＰＳＣ２３０８の導入により原栄養性とされた。ＥＰＳＣ２１８２は、ＬＥＵ２マーカーを持つｐ４１５ＴＥＦＣＥＮ／ＡＲＳシャトルプラスミド由来であり、ネイティブ酵母ＴＥＦ１プロモーターにより発現されるおよびＳ．レバウディアナＫＡＨｅ１とその後に続くネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーターのコピーも含有した。ＥＰＳＣ２３０８は、ＥＵＧＴ１１遺伝子をクローン化し、ネイティブ酵母ＴＥＦ１プロモーターにより発現され、その後にネイティブ酵母ＣＹＣ１ターミネーターが続く、ＵＲＡ３マーカーを有するｐ４１６ＴＥＦに基づくＣＥＮ／ＡＲＳシャトルプラスミドであった。この酵母株は、その後、ＥＦＳＣ３０４４と命名された。

【0321】

【表10】

【0322】

流加発酵を、ベース培地（完全合成培地）中での約１６時間の増殖相と、その後の微量の金属、ビタミン、塩、および酵母窒素ベース（ＹＮＢ）および／またはアミノ酸補充を併用し、炭素およびエネルギー源としてグルコースを約１００時間供給することにより、２Ｌ（作業容量）の発酵槽中で好気的に行った。ｐＨは略ｐＨ５に保ち、設定温度は３０℃であった。酸素枯渇を防止しエタノール生成を最小とするために、供給速度を制御した（グルコース制限条件）。培養サンプルの全体（細胞除去をせずに）を取り、グリコシド類の合計レベルを測定するために等容量のＤＭＳＯ中で煮沸した。

【0323】

特に記載しない限り、以下の手法を使用して、ステビオールグリコシド類およびステビオール経路中間体を分析した。加熱型エレクトロスプレーイオン（ＨＥＳＩ）源付きのＴＳＱＱｕａｎｔｕｍＡｃｃｅｓｓ（ThermoFisher Scientific）三連四重極質量分析計に接続したＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨＣ１８カラム（１００ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ粒子；Waters, Milford, MA）を装着したＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００ＵＰＬＣシステム（Dionex, Sunnyvale, CA）を使用して、ＬＣ‐ＭＳ分析を行った。溶出は、溶離剤Ｂ（０．１％ギ酸含有ＭｅＣＮ）および溶離剤Ａ（０．１％ギ酸含有水）の移動相を使用し、０．０分から４．０分まで勾配を２９％から４８％Ｂに増やし、４．０分から４．２分まで４８％から１００％Ｂ、４．２分から６．２分まで１００％Ｂで保持し、２９％溶離剤Ｂで再び平衡化した。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は５５℃に保持した。ステビオールグリコシド類を、ＳＩＭ（シングル・イオン・モニタリング）を使用してポジティブモードで検出し、下記の表１２のトレースｍ／ｚを得た。

【0324】

【表11】

【0325】

ステビオールグリコシド類のレベルは、LGC Standards製の標準品を使用して得た較正曲線と比較することで定量化した。一般に、例えば、０．５～１００μＭのレバウディオサイドＡ（ＲｅｂＡ）の標準液を使用して較正曲線を作成した。図５に、ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシド（保持時間１．３１、ヘキサグルコースステビオールグリコシドおよびステビオシドに対応する質量トレース）を生成した発酵の代表的な質量スペクトルを示す。

【0326】

改変型ＬＣ‐ＭＳ法（BEH RPshield C18 HPLCカラム使用、５０ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ粒子；Waters, Milford, MA）を使用して、例５に記載の化合物を分析し、およびin vitroの実験でＵＧＴ７６Ｇ１の相対速度を求めた。溶出は、溶離剤Ｂ（０．１％ギ酸含有ＭｅＣＮ）および溶離剤Ａ（０．１％ギ酸含有水）の移動相を使用し、０．０分から４．０分まで勾配を２５％から４７％Ｂに増やし、４．０分から５．０分まで４７％から１００％Ｂ、５．０分から６．５分まで１００％Ｂで保持し、最後に２５％Ｂで再び平衡化した。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度は３５℃に保持した。改変型ＬＣ‐ＭＳ法では、表１２に示す化合物の保持時間を短縮した。改変型ＬＣ‐ＭＳ法（ｔ_Ｒ分）の典型的な保持時間は：１９‐ＳＭＧが３．３４；１３‐ＳＭＧが３．５４；ルブソシドが２．５５；ステビオール‐１，２‐ビオシドが２．９５；ステビオール‐１，３‐ビオシドが３．３１；１，２‐ステビオシドが２．０４；１，３‐ステビオシドが２．４２；レバウディオサイドＢが２．９１；レバウディオサイドＡが２．０３；レバウディオサイドＤが１．１；およびレバウディオサイドＭが１．３２であった。

【0327】

例２：ヘキサグリコシル化ステビオールグリコシドを産生する反応のin vitroキャラクタリゼーション
例１で述べたように、ＥＵＧＴ１１がステビオールグリコシドを産生する酵母株において高いレベルで発現されたとき、ヘキサグルコシルステビオールグリコシドが観察された。この分子を産生している反応をキャラクタライズするために、個々のＵＧＴを使用してin vitroの研究をさらに行った。

【0328】

ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号１）を、ｐＥＴ３０ａプラスミド（EMD Millipore）へクローン化した。得られたベクターを、適切なＤＥ３大腸菌株に形質転換し、産生会社のプロトコールに従って形質転換細胞を増殖・誘導した。対応する融合タンパク質（６ＸＨＩＳタグ）を、定法を使用して固定化金属アフィニティクロマトグラフィーで精製した。

【0329】

反応液μＬ当たり約０．０８μｇの精製ＵＧＴ７６Ｇ１を、１００μＭのＲｅｂＤ、３００μＭのＵＤＰグルコース、および１０Ｕ／ｍＬアルカリホスファターゼ（Fermentas/Thermo Fisher, Waltham, MA）とともにインキュベートした。反応は、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ‐ＮａＯＨ中３０℃、ｐＨ７．６で２４時間行った。ＬＣ‐ＭＳ分析の前に、１００％ＤＭＳＯの１容量を各反応液に添加し、ボルテックスで撹拌し、サンプルを１６，０００Ｘｇで１分間遠心分離した。

【0330】

反応中、新たなピークが、ステビオール＋６グルコース部分に対応する質量に現れ、１．３１分に溶出し、in vivoでのＥＵＧＴ１１の過剰発現でみられたヘキサグルコシルステビオールグリコシド類の１つの微量に対応した。この結果は、ＵＧＴ７６Ｇ１がＲｅｂＤを更にグリコシル化して、ヘキサグリコシドを与えることを示唆している。ステビオール骨格のＣ１３に元々あるグルコースと１，３‐グルコース結合をする以外にも、ＵＧＴ７６Ｇ１は１，３‐結合型グルコースをＣ１９に元々あるグルコースに添加する二次活性を有すると仮定された。ＵＧＴ７６Ｇ１が使用できるＲｅｂＤ中で使用可能な唯一のグリコシル化のサイトは、Ｃ１９にあるグルコースのようであり、ＲｅｂＭと命名されたヘキサグリコシドが産生されるであろう。例３および４に示すように、検出されたヘキサグリコシドを単離し、レバウディオサイドＭであると決定した。

【0331】

例３：ヘキサグリコシル化分子の単離
ヘキサグルコシルステビオールグリコシド産生物が、例１に記載と類似の発酵から単離され、図６に概要を示すスキームに従った構造解析を行った。

【0332】

発酵の後、培養ブロスを、７０００ｒｐｍ、４℃で３０分間遠心分離し、上澄みを以下のように精製した：ガラスカラムを１５０ｍＬのＨＰ２０ダイヤイオン（登録商標）樹脂（Supelco）で充填し、一定分量の上澄み３００ｍＬをカラムに注入し、２Ｘ２５０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水を流した。グリコシド産生物は、ＭｉｌｌｉＱ水中のメタノール濃度を段階的に増加させることで（それぞれ２５０ｍＬ分量で‐０％→１０％→４０％→６０％→８０％→１００％ＭｅＯＨ）溶出した。各画分中のステビオールグリコシド類のレベルを、ＬＣ‐ＭＳにより分析した。最も有望な画分（６０～８０％ＭｅＯＨ）を合わせ、真空エバポレーターを使用して合計１０ｍＬに濃縮した。６００ｍＬの球状Ｃ１８結合フラッシュシリカゲル（４５～７０ｕｍ、７０オングストローム／Supelco）を充填したガラスカラムを、５％アセトニトリル水（アセトニトリル：ＨＰＬＣグレード、水：ＭｉｌｌｉＱ）で平衡化した。ＨＰ２０精製からの濃縮した残渣をカラムに注入し、アセトニトリル負荷を段階的に増加して溶出した。開始時の溶離剤は、５％アセトニトリル水溶液であった。アセトニトリルのレベルは、段階毎に５％増加させた（各４００ｍＬ）。５０％アセトニトリルに達した後は、段階毎１０％とした。すべての画分をＬＣ‐ＭＳで分析し、それらのステビオールグリコシド組成に従ってプールし、真空下で乾燥した。表１３に、各画分にみられたグリコシド類の概要を示した。図７に、フラッシュクロマトグラフィー後に半精製したヘキサグリコシル化合物のＬＣ‐ＱＴＯＦ分析で得たクロマトグラムおよび質量スペクトルを示した。

【0333】

【表12】

【0334】

例４：ＮＭＲによる構造の確認
ＮＭＲ用の純粋なサンプルを産生するために、例３で得た約５０ｍｇのヘキサグリコシル化の濃度が高い残渣を、セミ分取ＨＰＬＣシステムで更に精製した。システムには、Ａｑｕａ（登録商標）Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ：寸法２５０ｘ２１．２ｍｍ、５ミクロン）を設けた。溶出は、移動相として溶離剤Ｂ（０．１％トリフルオロ酢酸含有ＭｅＣＮ）および溶離剤Ａ（０．１％トリフルオロ酢酸含有水）を使用し、勾配を０．０分から２１分で１％から５０％Ｂへ、２１．０分から２７．０分で５０％から１００％分へ、そして最終的に１００％Ｂを流し、再平衡化することで行った。流速は、室温で１４ｍＬ／ｍｉｎであった。画分を時間毎に収集し、ＬＣ‐ＱＴＯＦ‐ＭＳでステビオールグリコシド類が存在するかどうか分析した。システムは、ＭｉｃｒＯＴＯＦＩＩ質量分析計（Bruker）を連結したＵＰＬＣ（Waters）を使用した。カラムは、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨＣ１８、１００ｘ２．１ｍｍ、１．７μｍ（Waters）を使用した。移動相は、Ａ：０．１％ギ酸水溶液およびＢ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液であった。適用した勾配は、１２分で１％Ｂから５０％Ｂ、その後３分で１００％Ｂに増加した。流速は、０．４ｍＬ／ｍｉｎであった。

【0335】

ＮＭＲ分析には、画分９３を使用した。ＮＭＲの実験のすべては、１．７ｍｍの極低温ＴＣＩプローブを設けたBruker社製ＡｖａｎｃｅＩＩＩ６００ＭＨｚＮＭＲ分光計を使用して２５℃のＤＭＳＯ‐ｄ６中で行った。

【0336】

標準的な同種核および異種核マルチパルスＮＭＲ実験、すなわち^１Ｈ、^１Ｈ‐ＣＯＳＹ、^１Ｈ、^１３Ｃ‐ＨＳＱＣおよび^１Ｈ、^１３Ｃ‐ＨＭＢＣ実験により構造を解析した。得られたＮＭＲデータを以下に示す：

【0337】

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) d ppm 0.78 (br. s., 1 H) 0.83 (s, 3 H) 0.92 (d, J=7.39 Hz, 2 H) 0.97 - 1.04 (m, 1 H) 1.17 (s, 3 H) 1.30 - 1.54 (m, 6 H) 1.67 (d, J=10.40 Hz, 1 H) 1.72 - 1.86 (m, 4 H) 1.92 (d, J=6.49 Hz, 1 H) 1.96 - 2.05 (m, 2 H) 2.08 (d, J=10.82 Hz, 1 H) 2.32 (d, J=12.71 Hz, 1 H) 2.91 (t, J=8.82 Hz, 1 H) 2.95 - 3.01 (m, 1 H) 3.02 - 3.27 (m, 14 H) 3.31 - 3.55 (m, 10 H) 3.57 - 3.86 (m, 10 H) 4.47 (d, J=7.86 Hz, 1 H) 4.51 (d, J=8.00 Hz, 1 H) 4.53 (d, J=7.62 Hz, 1 H) 4.66 (d, J=7.81 Hz, 1 H) 4.73 (br. s., 1 H) 4.80 (d, J=7.86 Hz, 1 H) 5.11 (br. s., 1 H) 5.53 (d, J=8.19 Hz, 1 H)

【0338】

¹³C NMR (150.91 MHz, DMSO-d₆) d ppm 16.4, 19.4, 19.9, 21.8, 28.3, 36.7, 37.2, 39.3, 40.3, 41.5, 41.6, 43.2, 43.7, 47.0, 47.2, 53.2, 57.0, 60.7, 61.2, 61.4, 61.8, 62.0, 62.1, 68.5, 68.9, 70.4 (3C), 71.2, 71.6, 74.1 - 74.3 (4C), 74.8, 75.8, 76.9 - 77.1 (6C), 77.6, 79.6, 85.8, 86.8, 87.1, 92.1, 96.2, 102.1, 102.8, 103.2, 103.3, 104.5, 153.1, 175.1

【0339】

確認したＲｅｂＭ（系統名：１３‐［β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１‐＞３）‐［β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１‐＞２）］‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐１‐オキシ］カウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、１８‐［β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１‐＞３）‐［β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐（１‐＞２））］‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐１‐エステル］）の構造を、図２に示す。

【0340】

例５：ＥＦＳＣ３０４４の他の発酵産生物の単離および決定
ＲｅｂＭ以外に、ＥＦＳＣ３０４４の発酵により、保持時間２．３１でジグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸、［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）（図８Ｂ）および保持時間２．１５でトリグリコシル化ステビオールグリコシド（１３‐ヒドロキシカウラ‐１６‐エン‐１８‐酸；［２‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐３‐Ｏ‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル‐β‐Ｄ‐グルコピラノシル］エステル）（図８Ｃ）が生成した。

【0341】

これらの化合物を、以下の方法に従って単離した。発酵の後、培養ブロスを５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離し、上澄みを以下のように精製した：ガラスカラムを３００ｍＬのＨＰ２０ダイヤイオン（登録商標）樹脂（Supelco）で充填し、一定分量の上澄み１７００ｍＬをカラムに注入し、３．５リットルのｄｄＨ２Ｏを流した。化合物を、２ＬのＭｅＯＨを使用して溶出し、各５００ｍＬの画分を収集した。ＬＣ‐ＭＳ分析の後、目的化合物の大部分を含有する画分をプールし、ロータリー蒸発システム（Rotavap, Buchi, Switzerland）で蒸発させ、１．８５グラムの濃灰色物を得た。粗製抽出物を３．５ｍＬのＤＭＳＯに再溶解し、更に精製するために０．７ｍＬの一定分量をセミ分取ＬＣ‐ＭＳに注入した。使用したカラムは、ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８、１９ｘ２５０ｍｍ、５ｕｍ（Waters Corporation）であった。移動相、Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液およびＢ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液。溶出は、４４分間で１％Ｂから６０％Ｂまでの直線勾配により行った。２．１ｍＬの画分を、溶出中連続して収集した。目的分析物の存在および純度を評価するために、収集した画分をＬＣ‐ＭＳにより分析した。‘ピーク８’および‘ピーク９’として特定される化合物を含有する画分を、０．８ｍＬのＮＨ３（ａｑ．）を添加して中和し、プールし、Genevac社製遠心分離蒸発システムで乾燥した。

【0342】

これらの化合物の構造は、例４の方法でＮＭＲにより決定した。

【0343】

ジグリコシル化ステビオールグリコシドに関して得たＮＭＲデータは以下の通りである：

【0344】

¹H NMR (600MHz, DMSO-d₆) d ppm 0.72 - 0.79 (m, 1 H) 0.81 (s, 3 H) 0.93 (d, J=8.07Hz, 1 H) 0.98 - 1.05 (m, 1 H) 1.17 (s, 3 H) 1.20 (d, J=11.37 Hz, 1 H) 1.36 (d, J=4.03 Hz, 2 H) 1.40 - 1.52 (m, 1 H) 1.55 - 1.70 (m, 1 H) 1.77 (d, J=9.54 Hz, 3 H) 1.84 - 1.90 (m, 1 H) 2.03 (d, J=8.07 Hz, 1 H) 2.31 - 2.41 (m, 1 H) 2.79 - 2.87 (m, 1 H) 2.89 - 2.96 (m, 1 H) 3.08 (s, 2 H) 3.12 - 3.18 (m, 3 H) 3.19 - 3.24 (m, 1 H) 3.34 (d, J=4.77 Hz, 2 H) 3.41 - 3.45 (m, 2 H) 3.46 -3.55 (m, 1 H) 3.65 (d, J=11.37 Hz, 1 H) 3.73 (dd, J=15.41, 8.44 Hz, 4 H) 4.26 - 4.40 (m, 1 H) 4.48 (d, J=7.70 Hz, 1 H) 4.52-4.62 (m, 1 H) 4.69 (br.s., 1H) 4.81 (d, J=7.70Hz, 1 H) 4.88 (br.s., 1 H) 4.91 - 5.03 (m, 1 H) 5.05 - 5.26 (m, 2 H) 5.51 (d, J=7.70 Hz, 1 H) 5.55 (br.s., 1 H; 化学式C32H50O13; 式量642.7316)

【0345】

トリグリコシル化ステビオールグリコシドに関して得たＮＭＲデータは以下の通りである：

【0346】

¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 0.73 - 0.79 (m, 1 H) 0.81 (s, 3 H) 0.89 -0.97 (m, 2 H) 0.99 - 1.05 (m, 1 H) 1.17 (s, 3 H) 1.19 (d, J=11.37 Hz, 1 H) 1.24 (s, 2 H) 1.31 - 1.40 (m, 4 H) 1.40 - 1.51 (m, 3 H) 1.55 - 1.63 (m, 1 H) 1.67 (dd, J=14.12, 5.32 Hz, 1 H) 1.71 - 1.82 (m, 5 H) 1.88 (d, J=11.00 Hz, 1 H) 1.98 - 2.08 (m, 2 H) 2.23 - 2.30 (m, 1 H) 2.94 (t, J=8.44 Hz, 1 H) 3.01- 3.11 (m, 3 H) 3.12 - 3.17 (m, 1 H) 3.19 - 3.28 (m, 3 H) 3.44 - 3.52 (m, 5 H) 3.54 - 3.60 (m, 1 H) 3.61 - 3.71 (m, 3 H) 4.36 (br. s., 1 H) 4.49 (br. s., 1 H) 4.55 (d, J=7.70 Hz, 1 H) 4.69 (s, 1 H) 4.73 (br. s., 1 H) 4.88 (br. s., 1 H) 4.91 - 5.05 (m, 2 H) 5.17 (br.s., 1 H) 5.31 (br.s., 1 H) 5.44 (d, J=8.07 Hz, 1 H) 5.55 (br. s., 1 H; 化学式C38H60O18; 式量804.8722).

【0347】

ジグリコシル化ステビオールグリコシドエステルは、ステビオール‐１，２‐ビオシドの類似体であり（図８Ｂ）、トリグリコシル化ステビオールグリコシドは、ＲｅｂＢの異性体であり、両者ともそれぞれの異性体の１３‐Ｏ位の代わりに１９‐Ｏ位でグリコシル化されている（図８Ｃ）ことがわかった。このデータは、ＥＵＧＴ１１、ＵＧＴ７６Ｇ１、またはＵＧＴ７４Ｇ１の活性と比べてＵＧＴ８５Ｃの活性が低いときにこれらの化合物が形成することを示唆している。

【0348】

例６：ＥＦＳＣ３２６１の操作および発酵
例１で使用した野生型サッカロミケス属株を、ステビオールグリコシド産生に関与する表１４の異種遺伝子を含有するように操作した。遺伝子はすべて、例１に記載したのと同様の方法を使用して宿主株の染色体に組み込んだ。

【0349】

【表13】

【0350】

流加発酵を、ベース培地（グルコース、硫酸アンモニウム、微量の金属、ビタミン、塩、および緩衝液を含有する最少培地）中の約１６時間の増殖相と、その後グルコースを含有する規定の供給培地を約１００時間供給により、２Ｌ（作業容量）の発酵槽中で好気的に行った。グルコースを炭素およびエネルギー源として利用し、微量の金属、ビタミンおよび塩を併用した。ｐＨは略ｐＨ５に保ち、設定温度は３０℃であった。酸素枯渇を防止しエタノール生成を最小とするために（グルコース制限条件）、供給速度を制御した。培養サンプルの全体（細胞除去をせずに）を取り、グリコシド類の合計レベルを測定するために等容量のＤＭＳＯ中で煮沸させた。

【0351】

図９は、４つの別々の試験でのＥＦＳＣ３２６１によるＲｅｂＤの産生を示す。合計産生量（細胞内および細胞外を合わせる）平均力価は、８００～１２００ｍｇ／Ｌの間であった。発酵実施５８回で、１２３時間での最終合計力価は１１０９ｍｇ／ＬのＲｅｂＤ、６９５ｍｇ／ＬのＲｅｂＭであり；質量に基づくＤ：Ｍ比は１．６であった。３９４ｍｇ／ＬのＲｅｂＡも産生された。

【0352】

例７：ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの産生を増加するためのＥＦＳＣ３２９７の株エンジニアリングおよび発酵
例１で使用したものと同じ野生型サッカロミケス属株を、ステビオールグリコシド産生に関与する表１５の異種遺伝子を含有するように操作した。例１に記載のものと同様の方法で、すべての遺伝子は宿主株の染色体に組み込んだ。遺伝子は例１のものと同一であったが、ステビオール経路におけるボトルネックである酵素のコピー数が増加したことによりＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの産生が増加した。株３２９７の発酵は、上記の３２６１株と同様な方法で行った。

【0353】

【表14】

【0354】

ＥＦＳＣ３２９７によるＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの産生を、図１０に示す。質量に基づいたＤ：Ｍ比は１．１であった。発酵の終りに１５１７ｍｇ／ＬのＲｅｂＤが産生され（細胞内と細胞外の合計）、１３７５ｍｇ／ＬのＲｅｂＭが産生された。

【0355】

例８：ＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子の２つのコピーによるＥＦＳＣ３８４１の株エンジニアリングおよび発酵
例１で使用したものと同じ野生型サッカロミケス属株を、ステビオールグリコシド産生に関与する表１６の異種遺伝子を含有するように操作した。例１に記載のものと同様の方法を使用して、すべての遺伝子は宿主株の染色体に組み込んだ。３８４１の発酵条件は、上記の３２６１株と同様であった。

【0356】

【表15】

【0357】

ＥＦＳＣ３８４１によるＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＡの産生を図１１に示す。ここで、ＲｅｂＤの全産生量は２７８６ｍｇ／Ｌ、ＲｅｂＭの全産生量は２６７３ｍｇ／Ｌ、その比は１．０４Ｄ：Ｍ（ｇ／ｇ）であった。７０３．７ｍｇ／ＬのＲｅｂＡも産生された。

【0358】

例９：ＥＦＳＣ３８４１の１つのＵＧＴ７６Ｇ１遺伝子のノックダウンおよびＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの産生減少
ＥＦＳＣ３６４３と命名された、上述のＥＦＳＣ３８４１株の栄養要求性（ｌｅｕ２、ｕｒａ３）バージョンを、野生型７６Ｇ１ＵＧＴ遺伝子の１つを欠損するように更に改変した。１つのＵＧＴ７６Ｇ１のコピーを含有する３つのコロニーの性能を、２つのＵＧＴ７６Ｇ１のコピーを含有する非改変株の４つのコロニーに対して検討した。ＰＣＲを使用して、新たな株が１つの７６Ｇ１のコピーだけを持つことを確かめた。簡単に述べると、１つのＵＧＴ７６Ｇ１のコピーの破壊が、破壊用組込みカセット部分の挿入部位の上流領域と組込みカセット部分の挿入部位の下流領域を増幅する２つのＰＣＲ反応により検証された。野生型７６Ｇ１用に設計されたＰＣＲプライマーにより、野生型７６Ｇ１が依然変化しておらず株に存在することが確認された。コロニーを、９６ディープウェルプレート中３０℃、４００ＲＰＭで９６時間増殖した。ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの総量を、ＬＣ／ＭＳ分析により求めた。

【0359】

図１２から、７６Ｇ１のコピー数が、ＲｅｂＤ／ＲｅｂＭ比を有意に変化させることがわかる。１つの７６Ｇ１コピーだけを含有する３つのコロニー（グラフの左側のバー）のＲｅｂＤとＲｅｂＭの比を、２つの７６Ｇ１ＵＧＴのコピーを含有する親株の４つのコロニー（グラフの右側のバー）に対してプロットした。

【0360】

例１０：ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭ産生の相対速度の決定
ＷＴ‐７６Ｇ１を含有するｐ４１６ＧＰＤを、ＳＣ‐ｕｒａ培地中プロテアーゼ欠損酵母株ＤＳＹ６で４８時間発現した。１００μＬの細胞を、３ｍＬのＳＣ‐ｕｒａ培地に１６時間再播種した。細胞を、２００μＬのＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｙで使用説明書に従って溶解した。６μＬの可溶化液を、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３μＭのＵＤＰＧ、および０．１μＭのＲｅｂＤまたはＲｅｂＥからなる反応混合物２４μＬに添加した。反応を３０℃でインキュベートし、０、１、２、および１８時間後に３０μＬの反応混合物のうち２５μＬを２５μＬのＤＭＳＯ中へ移すことで反応を停止した。ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥおよびＲｅｂＭの量をＬＣ‐ＭＳで分析し、「曲線下面積」としてデータ処理の間のピーク積分により評価した。

【0361】

図１３は、大部分のＲｅｂＤが対応する量のＲｅｂＭを産生することなく消費されることを示している。ＲｅｂＥが２時間以内に消費され、ＲｅｂＤに変換されることも示されている。この知見は、１８時間経過の時点で最初に観察される、ステビオールからＲｅｂＡではなくＲｅｂＥを介してＲｅｂＭとなる他のグリコシル化経路が可能であることを確認するものである。

【0362】

例１１：ＵＧＴ７６Ｇ１中のＲｅｂＭおよびＲｅｂＤ結合に関与するアミノ酸の予測
ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤに対する活性および位置選択性を増加したＵＧＴ７６Ｇ１バリアントを同定する手段として、相同性モデリングおよびドッキング試験を行った。３つの相同性モデルを、テンプレートとして以下のＰＤＢファイル２ＰＱ６（％ＩＤ＝３１）、２Ｃ１Ｘ（％ＩＤ＝２８）、３ＨＢＦ（％ＩＤ＝２８）、２ＶＣＥ（％ＩＤ＝３５）を組み合わせてＳｙｂｙｌＸプログラムにおいて標準的な設定を使用して作成した。ＰＤＢ２ＶＣＥに存在するリガンドを、主鎖および側鎖の作成の間使用し、エネルギー極小化の前に除去した。最も質の高い構造を得るために、標準設定または０．１ｋＪの閾値、カットオフ半径１０オングストロームおよび最大反復数５０００回の勾配終結のどちらかでのＡＭＢＥＲＦＦ９９フォースフィールドを使用してモデルをエネルギー極小化した。モデルの統計を表１７に示し、モデル間の変動を図１４に示した。

【0363】

【表16】

【0364】

モデル生成の後、結合ポケットを形成するアミノ酸を予測するために、ＳｙｂｙｌＸでＳｕｒｆｌｅｘＤｏｃｋスイートを使用して基質を酵素の活性部位にドッキングした。７６Ｇ１モデルをＰＤＢ２ＶＣＥとアラインメントし、テンプレートから直接リガンドＵＤＰＦ２Ｇを移入して、ＵＧＴ７６Ｇ１結合溝のＵＤＰＧ部分の位置を特定した。受容体基質をドッキングするために、結合サイトの残りの部分をカバーする標準的な値を使用してプロトコールを作成した。ドッキングは、タンパク質フレキシビリティあり（モデル１）またはフレキシビリティなし（モデル２）で可能としたステビオールグリコシド類を含有するリガンドライブラリー上でＧｅｏｍＸ設定を使用して行った。ドッキング結果は、ベースモードでの上位３つのドッキング結果およびタンパク質フレキシビリティでの上位１つのドッキング結果を使用してＳｙｂｙｌＸでスコア機能の組み合わせを使用して解析した。

【0365】

ＵＧＴ７６Ｇ１アミノ酸のすべてを、以下の表１８に示す。飽和変異ライブラリーの部位は、２個以上のモデルでのドッキング分析でＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの５オングストローム以内にあるすべての残基を選択することで決定した（太字の「ｘ」で示す）。更に、ＲｅｂＤ→ＲｅｂＭ反応の結合サイトに位置するＲｅｂＭおよびＲｅｂＤ１９‐Ｏ‐グルコース部分の５オングストローム以内にあるすべての残基を選択した。太字および「！」で示す類似の酵素間で完全に保存されている残基は、スクリーニングから除去した。

【0366】

【表17-1】

【表17-2】

【表17-3】

【表17-4】

【表17-5】

【0367】

例１２：ＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリーのプレスクリーニング
本明細書に記載されるＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリースクリーニングを行う前に、ＲｅｂＭおよびＲｅｂＤの培養増殖および産生を９６および４ｘ２４ディープウェルプレート中でモニターした。標準的な酢酸リチウムプロトコールを使用して、ＥＦＳＣ３３８５株を、ＷＴ‐７６Ｇ１を含有するｐ４１６ＧＰＤで形質転換し、形質転換細胞を、ＳＣ‐ＵＲＡプレートに播種した。ＥＦＳＣ３３８５は、ＵＧＴ７６Ｇ１を欠損した株であり、従って活性なＵＧＴ７６Ｇ１を含有するプラスミドで形質転換されるまでＲｅｂＥを作成するであろう。株は、ｓｐＨＩＳ５マーカーで置換されたＵＧＴ７６Ｇ１コード領域の破壊を含有し、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ‐２Ｘ変異体、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＡＴＲ２、ＵＧＴ８５Ｃ２、Ｓ．レバウディアナＣＰＲ８（２コピー）、Ａ．タリアナＫＳ５（２コピー）、シネココッカスＧＧＰＰＳ７、コドン最適化Ｓ．レバウディアナＫＡＨｅ１（２コピー）、Ｓ．レバウディアナＫＯ（２コピー）、切断型ゼア・メイズＣＤＰＳ５（２コピー）、およびＥＵＧＴ１１のコピーも組み込まれている。

【0368】

９６ディープウェルプレート条件としては、９６個のコロニーを１ｍＬのＳＣ‐ＵＲＡを含有するプレートを転移し、プレートを３０℃および４００ＲＰＭで９６時間インキュベートした。４ｘ２４ディープウェルプレート条件としては、９６個のコロニーを、３ｍＬのＳＣ‐ＵＲＡを含有するプレートに転移した。プレートを３０℃および３２０ＲＰＭで９６時間インキュベートした後、各ウェルから２００μＬを９６ディープウェルプレートへ転移した。

【0369】

各プレートから５０μＬの培養物を９６ウェルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プレートに転移し、１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で１：１に希釈した。プレートは加熱密封し、８０℃で１０分間インキュベートしたあと、２５℃に冷却した。プレートを、４０００ＲＰＭで１０分間回転し、５０μＬの培養混合物をＬＣ‐ＭＳ分析用の新しいプレートに転移した。

【0370】

ＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリープレスクリーニングの結果を図１５に示す。ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭ産生の変動は、９６時間のインキュベーション時間の間の、特にプレートの縁に位置するウェルにおける蒸発により説明可能である。９６ディープウェルプレート中で増殖されたコロニーにより産生されたＲｅｂＭおよびＲｅｂＤの濃度が高いことは、４ｘ２４ディープウェルプレートと比較して、これらのプレートがＬＣ‐ＭＳ分析により適切であることを示唆しており、従ってＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリースクリーニングでの使用に選択された。

【0371】

例１３：ＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリースクリーニング
Baseclear社により、ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してＵＧＴ７６Ｇ１を、ＥＰＳＣ２０６０（ｐ４２３ＧＰＤ）からＥＰＳＢ４９２（ｐ４１６ＧＰＤ）へサブクローン化し、縮重ＮＮＳプライマーを使用して部位飽和変異ライブラリーを作成した。標準的な酢酸リチウムプロトコールを使用して、ＥＦＳＣ３３８５株をライブラリーまたはＷＴ‐７６Ｇ１を含有する対照プラスミドで形質転換し、形質転換細胞をＳＣ‐ＵＲＡプレートに播種した。

【0372】

１ｍＬのＳＣ‐ＵＲＡ培地を９６ディープウェルプレートに添加し、例９で特定した３８個の部位飽和変異ライブラリー残基のそれぞれからのコロニーをピッキングし、９６ディープウェルプレートで３０℃および４００ＲＰＭで９６時間インキュベートした。その後、５０μＬの各培養サンプルを、５０μＬの１００％ＤＭＳＯを含有する９６ウェルＰＣＲプレートに転移した。その後、プレートを加熱密封し、８０℃で１０分間インキュベートした後、１２℃に冷却し４０００ＲＰＭで１０分間スピンした。７０μＬの各上澄みをＬＣ‐ＭＳ分析用の新しいプレートに転移した。

【0373】

図１６は、ＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリースクリーニングのすべてのデータ点を示し、野生型産生は黒い三角形で表す。バリアント番号システムを表１９に示す。

【0374】

【表18-1】

【表18-2】

【0375】

表２０および図１７は、ＲｅｂＭまたはＲｅｂＤのどちらかの産生に最も高い選択性を持つＵＧＴ７６Ｇ１バリアントコロニーを示し、それらを更なる試験のために選択した。図１７中、「ＷＴ」の符号が付いているすべてのデータ点は、野生型酵素のＲｅｂＭおよびＲｅｂＤの産生を示す。選択した酵素バリアントが、野生型コントロールに比較してＲｅｂＤからＲｅｂＭへの活性の阻害またはＲｅｂＭの産生の増加を示したことがわかった。

【0376】

【表19-1】

【表19-2】

【表19-3】

【表19-4】

【表19-5】

【0377】

例１４：ＵＧＴ７６Ｇ１部位飽和変異ライブラリー再スクリーニングおよびバリアント配列決定
ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭＡのどちらかを最大量産生するＵＧＴ７６Ｇ１バリアントコロニーの４７個の再スクリーニングを三つずつで行ったところ、最初のスクリーニングと同じ傾向を示した（図１９）。配列を決定するコロニーを、スクリーニングおよび再スクリーニングの結果を集計して選択した。スクリーニングおよび再スクリーニングの産生レベルを直接比較できなかったので、コロニーを、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭのそれぞれの最高産生コロニーから最低産生コロニーへとランク付けし、スクリーニングおよび再スクリーニングのランクの平均を求めた。平均から、上位１６個のＲｅｂＤ、上位１６個のＲｅｂＭ、および上位１６個のＲｅｂＤ／Ｍ産生コロニー（合計４８個のコロニー）を特定した。上位ＲｅｂＤおよび上位ＲｅｂＤ／Ｍ産生コロニーのいくつかは同一のコロニーであったので、重複するコロニーは一度だけ数え、配列決定するコロニーの合計を４８個のとするために追加のコロニーを選んだ。これらのコロニーは、以下に示すＧＰＤ配列＿ｆｗｄおよびＣＹＣ１配列＿ｒｅｖプライマーで２つずつ配列決定した。

【0378】

ＧＰＤ配列＿ｆｗｄプライマー配列：ＣＧＧＴＡＧＧＴＡＴＴＧＡＴＴＧＴＡＡＴＴ（配列番号８８）

【0379】

ＣＹＣ１配列＿ｒｅｖプライマー配列：ＣＴＴＴＴＣＧＧＴＴＡＧＡＧＣＧＧＡＴＧＴ（配列番号８９）

【0380】

表示したバリアントにより産生されたＲｅｂＤ、ＲｅｂＭ、およびＲｅｂＤ／ＲｅｂＭの量とランクを表２１‐２３に示し、ＲｅｂＤまたはＲｅｂＭのどちらかの産生を選択的に増加する変異を表２４にまとめた。野生型およびＵＧＴ７６Ｇ１バリアントコロニーにより産生されたＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＡ、ルブソシド、およびＲｅｂＢの量を表２５に示す。

【0381】

【表20】

【0382】

【表21-1】

【表21-2】

【0383】

【表22】

【0384】

【表23】

【0385】

【表24-1】

【表24-2】

【表24-3】

【0386】

例１５：ＵＧＴ７６Ｇ１グリコシル化反応の相対速度の決定
ＵＧＴ７６Ｇ１は、１，２‐ステビオシドの１，３‐グリコシル化を触媒して、ＲｅｂＡに変換し、１，２‐ビオシドをＲｅｂＢに変換することだけが文献より公知である。本発明者等は、表２６に示す反応がＵＧＴ７６Ｇ１により触媒されることを新たに発見した。

【0387】

【表25】

【0388】

例９と同様にして、ＷＴ‐７６Ｇ１を含有するｐ４１６ＧＰＤを、ＳＣ‐ｕｒａ培地においてプロテアーゼ欠損酵母株ＤＳＹ６中で４８時間発現した。その後、１００μＬの細胞を、３ｍＬのＳＣ‐ｕｒａ培地に１６時間再接種した。細胞を、使用説明書に従って２００μＬのＣｅｌＬｙｔｉｃ（商標）Ｙで溶解した。６μＬの可溶化液を、２０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、０．３μＭのＵＤＰＧ、および０．１μＭのルブソシド、０．２μＭの１，２‐ビオシド、０．２μＭの１，２‐ステビオシド、０．２μＭのＲｅｂＡまたは０．１μＭのＲｅｂＥどれかからなる２４μＬの反応混合物に添加した。反応を３０℃でインキュベートし、０、１、２、および１８時間経過後３０μＬの反応混合物の２５μＬを２５μＬのＤＭＳＯへ転移することで反応を停止した。ステビオールグリコシド類の量をＬＣ‐ＭＳで分析し、データ処理の間のピーク積分により「曲線下面積」として評価した。

【0389】

図１９中、ルブソシドの「曲線下面積」の約５０％の低下は、１８時間の間に相当量の１，３‐ステビオシド（ＲｅｂＧ）が産生されたことを示した。本発明者等により新たに発見されたＲｅｂＱは、１８時間目に最初に検出された。更に、図１９は、１，２‐ビオシドがＲｅｂＢの産生用であるので、１，２‐ステビオシドはＲｅｂＡを産生している１８時間の期間に完全には消費されなかったことを示す。

【0390】

更に、１，２‐ステビオシドまたはＲｅｂＡのどちらかを基質として使用すると、ステビオール＋５グルコースクロマトグラムの１．９６分に溶出ピークが現れた（図２０）。ＲｅｂＤは１．１１分に溶出し、ＵＧＴ７６Ｇ１は１，３‐グリコシル化反応だけを触媒するので、１．９６分の溶出ピークは、ＲｅｂＩであるように思われる。しかしながら、ＲｅｂＩピークは、基質アーチファクトピーク中に位置しているので（図２０）、積分することは不可能であった。

【0391】

これらの結果を合わせると、ＵＧＴ７６Ｇ１が優先的に１３‐Ｏ‐位で１，２‐ジグリコシル化されるステビオールグリコシド基質のグリコシル化を触媒し、次に１３‐Ｏ‐位でモノグリコシル化されるステビオールグリコシド基質を触媒することを示している。１９‐Ｏ‐位のグリコシル化状態からの優先はほとんど起きないように思われる。図１に、ステビオールグリコシドグリコシル化反応およびそれを触媒すると知られている酵素をまとめる。

【0392】

例１６：ＵＧＴ７６Ｇ１バリアントによるステビオールグリコシド類の産生
各ステビオールグリコシドの定量用標準品は、市販されていないため、いくつかの濃度測定は不可能であった。従って、野生型酵素と比較した酵素バリアントによる追加のステビオールグリコシド類の産生は、データ処理の間のピーク積分により評価した。各バリアントの曲線下面積のデータを野生型ＵＧＴ７６Ｇ１に対して標準化し、表２７に示した。これらのデータは、先の例と一致したが、バリアントのいくつかは、野生型対照が産生した１，３‐ステビオシド（ＲｅｂＧ）、ルブソシド、「ＲｅｂＱ」、および／または１．４３分に溶出するステビオール‐テトラグリコシドを産生しなかったことも示した。ＲｅｂＭおよびＲｅｂＤ産生の増加は、この観察により説明可能である。

【0393】

【表26-1】

【表26-2】

【表26-3】

【表26-4】

【0394】

野生型コントロールの標準化した産生と比較した、ＲｅｂＤ最適化およびＲｅｂＭ最適化変異によるステビオールグリコシド産生の傾向を表２８にまとめる。ＲｅｂＤ産生を増加したバリアントは、主としてＲｅｂＤ→ＲｅｂＭ反応を抑制した結果であると思われた。追加のＲｅｂＤ産生は、ＲｅｂＢおよび１．４３分に溶出するテトラグルコシドの減少と、Ｒｕｂｕ→ＲｅｂＧ→ＲｅｂＱステビオールグリコシル化の分岐の抑制に由来することが可能である。１，２‐ステビオシドの４倍の増加およびＲｅｂＥの７倍の増加は予期しないものであったが、ＲｅｂＥの増加は、野生型コントロールでみられる極少量の副生成物の７倍の増加であり得る。にもかかわらず、この知見は、ステビオシド→ＲｅｂＡ反応も、ＲｅｂＤ最適化変異により部分的に抑制されたことを示したが、それは、ＲｅｂＡ中間体の減少として観察された。

【0395】

【表27】

【0396】

最大のＲｅｂＤレベルをもたらす変異であるＬ２５７Ｇは、野生型のＲｅｂＤの約４倍を産生し、配列比較した６個のコロニーに見られた。他のＬ２５７変異も、同程度の生産性を示した。変異体Ｉ２６ＷおよびＳ２８３Ｇは、最も高いＲｅｂＤ／ステビオシド比を示し、これらの変異は、Ｓｔｅｖ→ＲｅｂＡ反応を軽減することなくＲｅｂＤ→Ｍ反応を最大に抑制することを示した。これら２つの変異も、Ｒｕｂｕ→ＲｅｂＧ→ＲｅｂＱ経路を完全に無効にし、１．４３分に溶出するテトラグルコシドの量を低減したが、ＲｅｂＢ産生への影響は最小限であった。最もよいＲｅｂＤ／ＲｅｂＭ比は、Ｔ１４６ＧおよびＳ２８３Ｎ変異体でみられ、野生型に比べ４０～５０倍の増加を示した。Ｌ２５７Ｒを伴うＳ３８９Ｆ変異は、Ｌ２５７Ｒ単独よりも高いＲｅｂＤ産生を示した。

【0397】

一般に、ＲｅｂＭの増加は、ＲｅｂＤの増加ももたらす一方、Ｒｕｂｕ→ＲｅｂＧ→ＲｅｂＱグリコシル化経路および１．４３分に溶出するテトラグルコシドの減少または完全な阻止をもたらす。にもかかわらず、検討した残りのステビオールグリコシド類は影響されなかったようであった。上位のＲｅｂＭ産生株であるＴ５５ＫおよびＫ３３７Ｐは、野生型と比べてそれぞれＲｅｂＭを１．３倍増加し、ルブソシドを０．６倍減少した。ルブソシドは野生型で０．７μＭしか存在しなかったので、観察された減少は、ＲｅｂＭの増加を説明するのに不十分である。これらの変異体により１，３‐ステビオシド（ＲｅｂＧ）は産生されなかったので、Ｒｕｂｕ→ＲｅｂＧ→ＲｅｂＱ経路はほとんど取り除かれた。同様に、Ｋ３３７Ｐ変異を有するバリアントは、野生型のＲｅｂＱのレベルの０．６倍を産生した。変異Ｈ１５５ＬおよびＬ３７９Ｖはそれぞれ、ＲｅｂＤに対してより多くのＲｅｂＭを産生したが、野生型ＵＧＴ７６Ｇ１はＲｅｂＤに対して約４．５８倍のＲｅｂＭを産生し、Ｈ１５５ＬおよびＬ３７９はそれぞれＲｅｂＤに対して約６．６６倍および５．８８倍のＲｅｂＭを産生した。この実験で明らかとなったデータにより、ＵＧＴ７６Ｇ１酵素のスクリーニングは、ＲｅｂＤおよびＲｅｂＭの側へ改善した反応速度式を有し、副生成物を最小とし、それによってフラックスを所望のステビオールグリコシド類へ増加する種の同定を可能とする。

【0398】

本発明をその具体的な実施態様により詳細に説明したが、添付の請求項で規定した本発明の範囲から逸脱することなく改変および変更することが可能であることは明らかであろう。より具体的に、本発明のいくつかの側面は特に有利なものとして本明細書に特定されるが、本発明がその具体的な側面に必ずしも限定されるものではないことが意図されるものである。
参考文献
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【図1】