知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-03
(45)【発行日】2024-04-11
(54)【発明の名称】ＰＥＧ－リン脂質分子を用いたエクスビボ臓器処置
(51)【国際特許分類】
A61K 31/685 20060101AFI20240404BHJP
A61K 31/77 20060101ALI20240404BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240404BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240404BHJP
A01N 1/02 20060101ALI20240404BHJP
【ＦＩ】
A61K31/685
A61K31/77
A61K47/60
A61P9/00
A01N1/02
【請求項の数】
16
(21)【出願番号】P 2021529705
(86)(22)【出願日】2019-11-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-01
(86)【国際出願番号】 SE2019051215
(87)【国際公開番号】W WO2020112018
(87)【国際公開日】2020-06-04
【審査請求日】2022-10-25
(31)【優先権主張番号】1851492-7
(32)【優先日】2018-11-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(73)【特許権者】
【識別番号】521225269
【氏名又は名称】アイコート メディカル アクチエボラグ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ニルソン，ボー
(72)【発明者】
【氏名】ニルソン エクダール，クリスティーナ
(72)【発明者】
【氏名】ジェンセン ワエルン，マリアンヌ
(72)【発明者】
【氏名】寺村 裕治
(72)【発明者】
【氏名】ビグラルニア，アリレザ
【審査官】鶴見 秀紀
(56)【参考文献】
【文献】特表２００６－５２４２６０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２００６／０９３３１４（ＷＯ，Ａ１）
【文献】Molecular Immunology，2015年，Vol.67，pp.121
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ３１／００－３１／８０
Ａ６１Ｋ ４７／００－４７／６９
Ａ６１Ｐ ９／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
レシピエント対象における臓器移植片の再灌流後に進行する再灌流と関連する低血圧症の阻害または予防のための薬剤の製造のための、ポリ（エチレングリコール）－リン脂質（ＰＥＧ－リン脂質）の使用。
【請求項2】
前記ＰＥＧ－リン脂質が、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液として配合されかつ前記ＰＥＧ－リン脂質分子での血管系の内膜のコーティングを可能にするための前記臓器移植片の血管系中へのエクスビボ注入を目的とする、請求項１に記載の使用。
【請求項3】
臓器または前記臓器の一部を処置するエクスビボ方法であって、前記臓器または前記臓器の一部の血管系中にポリ（エチレングリコール）－リン脂質（ＰＥＧ－リン脂質）分子を含む溶液をエクスビボ注入すること；および
ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に前記臓器または前記臓器の一部を浸漬しておきながら前記ＰＥＧ－リン脂質分子での前記血管系の前記内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にするために前記血管系中でＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液をエクスビボインキュベートすること
を含む、方法。
【請求項4】
前記血管系から非結合ＰＥＧ－リン脂質分子を流し出すために前記血管系中に臓器保存溶液をエクスビボ注入することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記血管系中にＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液をエクスビボ注入する前に前記血管系中に臓器保存溶液をエクスビボ注入することをさらに含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
溶液をエクスビボ注入することが、前記血管系の動脈および静脈の一方をエクスビボクランピングすること；
前記動脈および前記静脈の他方の中にＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液をエクスビボ注入すること；ならびに
前記動脈および前記静脈の他方をエクスビボクランピングすること
を含む、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記溶液をエクスビボ注入することが、前記血管系中に０．２５ｍｇ／ｍＬから最大で２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液をエクスビボ注入することを含む、請求項３から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記溶液をエクスビボ注入することが、前記血管系中に５ｍＬから最大で２５０ｍＬのＰＥＧ－リン脂質分子を含む前記溶液をエクスビボ注入することを含む、請求項３から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
エクスビボインキュベートすることが、０℃を超えるが８℃未満の温度でＰＥＧ－リン脂質分子を含む前記臓器保存溶液中に前記臓器または前記臓器の一部を浸漬しておきながら前記血管系中でＰＥＧ－リン脂質分子を含む前記溶液をエクスビボインキュベートすることを含む、請求項３から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記臓器保存溶液が、ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、クエン酸溶液、ウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液、コリンズ溶液、セルシオ溶液、京都大学溶液およびＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｌｏｐｅｚ－１（ＩＧＬ－１）溶液からなる群より選択される、請求項３から９のいずれかに一項に記載の方法。
【請求項11】
エクスビボインキュベートすることが、１０分から最大で４８時間の期間前記血管系中でＰＥＧ－リン脂質分子を含む前記溶液をエクスビボインキュベートすることを含む、請求項３から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＰＥＧ－リン脂質分子が、ＰＥＧ－リン脂質からなる非官能化ＰＥＧ－リン脂質分子、前記ＰＥＧ－リン脂質分子のＰＥＧに結合された各官能化分子を含む官能化ＰＥＧ－リン脂質分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される；ならびに前記官能化分子が、補体阻害剤、凝固阻害剤、血小板阻害剤、補体阻害剤を結合できる分子、凝固阻害剤を結合できる分子、血小板阻害剤を結合できる分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、
請求項３から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ＰＥＧ－リン脂質分子が、式（Ｉ）または式（ＩＩ）：【化1】
【化2】
ｎ、ｍは、１０から最大で１６の範囲内で独立して選択される整数であり、
ｐは、ＰＥＧ鎖が１０００Ｄａから最大で４００００Ｄａの範囲内の平均分子量を有するように選択される；および
Ｒは、Ｈ、ＣＨ ３ 、ＮＨ２、マレイミド基、ビオチン基、ストレプトアビジン基、アビジン基または補体阻害剤、凝固阻害剤、血小板阻害剤、補体阻害剤を結合できる分子、凝固阻害剤を結合できる分子、血小板阻害剤を結合できる分子、およびそれらの混合物からなる基から選択される官能化分子である）
を有する、請求項３から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記官能化分子が、ヘパリン結合ペプチド、補体受容体１（ＣＲ１）のＮ－末端４～６ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）、ＣＤ４６補体調節タンパク質（ＣＤ４６）、補体崩壊促進因子（ＤＡＦ）、因子Ｈ結合分子、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）分解酵素、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項15】
前記臓器が、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、肺、子宮、膀胱、胸腺および腸からなる群より選択される、請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記臓器が、腎臓である；およびエクスビボインキュベートすることが、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に前記腎臓を浸漬しておきながらＰＥＧ－リン脂質分子での腎臓血管系の腎臓内皮のコーティングおよび腎実質の尿細管のコーティングを可能にするために前記血管系中でＰＥＧ－リン脂質分子を含む前記溶液をエクスビボインキュベートすることを含む、
請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、一般にエクスビボ臓器処置に、特に、臓器再灌流により誘導された血栓炎症および低血圧症を阻害すること、または、予防することができるそのようなエクスビボ臓器処置に関する。
【背景技術】
【0002】
虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害（ＩＲＩ）は、すべて血栓炎症を誘導する、移植、血栓性疾患、敗血症および心肺バイアスを含む、いくらかの病状の病理に対する主要な誘因である。
【0003】
現在まで、腎臓移植は、末期腎臓病を有する患者の最も効果的な処置である。１９６０年代に導入されたものと比較して、治療成績における素晴らしい改善にも関わらず、依然として５年後に２５％、１０年後にほぼ５０％の移植片機能損失がある。ＩＲＩは、急性腎不全、臓器移植後臓器機能障害およびリモート臓器不全を引き起こすので、腎臓移植結果を改善するための主な標的は、ＩＲＩである。免疫抑制は、体液性自然免疫系にそれほど大きな程度に影響せず、そのためＩＲＩを軽減しない。移植分野はまた、臓器不足により妨害される。ドナープールを増加させるための１つの選択肢は、死亡した心停止後（ＤＣＤ）ドナーからのものなどのマージナル臓器の使用の増加である。しかし、これらの臓器はまた、ＩＲＩにより深刻に影響される。
【0004】
虚血の間、代謝は、最終的に炎症状態をもたらす嫌気性条件へと切り替わり、これは、活性化Ｂ細胞の核因子カッパ－軽鎖エンハンサー（ＮＦ－κＢ）を誘導する多数の遺伝子およびそれによるサイトカイン、ケモカインおよび組織因子（ＴＦ）だけでなく、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ－１）、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）１および２ならびにニトロチロシンなどの虚血に対して保護する遺伝子のアップレギュレーションおよびダウンレギュレーションにより誘発される。正常酸素圧条件下で、内皮細胞表面は、グリコカリックス（ＧＣＸ）と呼ばれる負電荷の「ヘアリー」メッシュにより覆われ、それは、微小血管恒常性を確実にし、かつ血栓炎症を予防するために抗炎症性および抗凝固性タンパク質を組み込むプロテオグリカン類、グリコサミノグリカン類および糖タンパク質類の複合ネットワークを含む。さらに、厚いＧＣＸは、細胞表面ならびに細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）、血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ－１）およびＥ－セレクチンなどの接着分子をシールドし、それにより白血球および血小板が内皮表面に集まるのを予防する。ＧＣＸは、酸化ストレスおよび虚血誘導性構造的損傷に対して非常に感受性であり、結果として、頻繁にＧＣＸコートの急速な損失をもたらす。これは、内皮細胞株におけるヘパリナーゼおよびメタロプロテイナーゼの発現により引き起こされ、結果として、自然免疫の攻撃から内皮細胞を保護するＧＣＸの開裂および破壊をもたらす。ＧＣＸは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの、多数の増殖因子を内包し、それらは従ってＧＣＸの分解中に放出される。これは結果として、補体、凝固および接触系の調節因子が細胞表面から放出されることももたらす。そのような調節因子は、例えば、アンチトロンビン（ＡＴ）、タンパク質Ｃ、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）、Ｃ４ｂ－結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）、因子ＨおよびＣ１－阻害剤（Ｃ１－ＩＮＨ）であり、その結果内皮細胞表面が補体、凝固および接触系による攻撃に対して保護されない。最終的に、虚血が長引く場合、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の貯蔵は、枯渇し、アポトーシスおよびネクローシスに至る。
【0005】
虚血臓器の再灌流は、修復プロセスを誘導するが、当初それは、虚血によりすでに誘導された病理学的変化に起因して臓器に壊滅的な損傷を起こす。急速な酸素投与は、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を伴う損傷を引き起こし、保護されていない内皮表面は、補体および接触系の破壊的な活性化を誘発する。移植時に、移植腎におけるコレクチン－１１／１２（ＣＬ－１１／１２）発現は、虚血細胞を認識し、レクチン経路（ＬＰ）を介して補体活性化に寄与する。また、ＬＰのマンノース－結合レクチン（ＭＢＬ）およびフィコリン－２などの他の認識分子は、補体の活性化と関連している。補体活性化の証拠は、近脈管柔組織における膜侵襲複合体（ＭＡＣ）沈着と組み合わせた内皮細胞へのＣ４ｄの沈着であり、これらの領域での細胞障害を示唆する。アップレギュレートされたＴＦ発現および接触系活性化により誘発され、繊維素沈着は、凝固系が関与することを明らかにする。補体活性化、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）のアップレギュレーションおよび曝露の組み合わせ、それに続く内皮表面への血小板および多形核好中球（ＰＭＮ）の結合および活性化により、血栓炎症が誘発される。この血栓炎症の多くは、腎臓移植のマウスモデルにおいて明らかに示される局所的に生産された補体因子により引き起こされ、ここでＣ３のノックアウトは、移植された臓器を拒絶から保護する。
【0006】
移植された臓器の再灌流はまた、再灌流後の血行動態の不安定性とも関連する。以前は再灌流後症候群（ＰＲＳ）として説明されたこの現象は、移植肝の再灌流後に重度の血行動態の不安定性を経験した肝臓移植レシピエントにおいて最初に説明された。しかし、この現象はまた、再灌流後に瞬間的な血行動態の不安定性に頻繁に悩まされている腎臓および膵臓移植レシピエントにおいても観察される。したがって、全身動脈圧の急速な低下は結果として、移植片の灌流不全および移植片の温虚血の延長をもたらす。これらの患者は、臓器移植後臓器機能障害、拒絶および早期移植片機能損失の増加した危険性に悩まされる可能性がある。
【0007】
両親媒性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）－リン脂質（ＰＥＧ－共役リン脂質または単にＰＥＧ－リン脂質）は、疎水的相互作用により細胞膜の脂質二重膜に自然に組み込まれる［１，２］。さらに、ＰＥＧ－リン脂質による人工細胞表面層の作成は、糖尿病マウスにおいて門脈内注入後に即座の血液介在性炎症反応（ＩＢＭＩＲ）を軽減し、かつ膵島の生存期間および機能の両方を延長できた［３，６］。
【0008】
アピラーゼおよび因子Ｈなどの、自然免疫調節因子と共役したＰＥＧ－リン脂質が、細胞および物質の表面をインビトロでの自然免疫攻撃に対して保護することが、以前に示されている［４，５］。
【0009】
しかし、臓器移植に関連して改善の必要性がある。
【0010】
一般的な目的は、臓器移植に関連して改善を提供することである。
【0011】
この目的および他の目的は、本明細書に開示されたような実施形態により満たされる。
【0012】
本発明は、独立請求項において定義される。本発明のさらなる実施形態は、従属請求項において定義される。
【0013】
臓器または臓器の一部を処置するエクスビボ方法は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を、臓器または臓器の一部の血管系にエクスビボ注入することを含む。方法はまた、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を血管系でエクスビボインキュベートして、臓器または臓器の一部をＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に浸漬しておきながらＰＥＧ－リン脂質分子で血管系の内膜の少なくとも一部のコーティングを可能にすることを含む。
【0014】
本発明はまた、レシピエント対象における臓器移植片の再灌流後に進行する再灌流と関連する低血圧症の阻害または予防における使用のためのＰＥＧ－リン脂質にも関する。
【0015】
ＰＥＧ－リン脂質分子でエクスビボ処置された臓器移植片は、ＴＡＴなどの凝固マーカー、ならびにＣ３ａおよびｓＣ５ｂ－９などの相補的マーカーの血漿中濃度により反映されるように、未処置の対照臓器移植片と比較して血栓炎症が有意に低かった。また、サイトカインの発現、特にＩＬ－６およびＩＬ－１βは、ＰＥＧ－リン脂質処置臓器移植片においてさらに抑制された。臓器機能は、ＰＥＧ－リン脂質処置臓器移植片において改善された。ＰＥＧ－リン脂質処置臓器移植片はまた、Ｃ３ｂおよびＭＡＣなどの相補的マーカーの低減された沈着、ならびにＣ５ａＲの発現も示した。非常に驚いたことであるが、医療的に重要なことは、ＰＥＧ－リン脂質分子を用いて臓器移植片をエクスビボ処置する効果は、そのようなＰＥＧ－リン脂質処置が、頻繁に臓器移植片の再灌流と関連する、レシピエントにおける破壊的な血圧低下を低減できたことであった。さらに、４日後にＰＥＧ－リン脂質処置は、適応免疫応答の活性化と関連する、Ｔ細胞依存性サイトカインＩＬ－４およびＩＬ－１２における増加を低減できた。
【0016】
実施形態は、さらなる目的およびその利点と共に、以下の説明を添付図面と共に参照することにより、最もよく理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図2A】図２Ａ～図２Ｃは、コートされたＭＳＣがインビトロチャンドラーループモデルにおいて分析されたときの、凝固（図２Ａ）および補体（図２Ｂおよび図２Ｃ）に対するＰＥＧ－リン脂質の種々の官能基の効果を、対照（未コート細胞）と比較して示す。
【図2B】図２Ａ～図２Ｃは、コートされたＭＳＣがインビトロチャンドラーループモデルにおいて分析されたときの、凝固（図２Ａ）および補体（図２Ｂおよび図２Ｃ）に対するＰＥＧ－リン脂質の種々の官能基の効果を、対照（未コート細胞）と比較して示す。
【図2C】図２Ａ～図２Ｃは、コートされたＭＳＣがインビトロチャンドラーループモデルにおいて分析されたときの、凝固（図２Ａ）および補体（図２Ｂおよび図２Ｃ）に対するＰＥＧ－リン脂質の種々の官能基の効果を、対照（未コート細胞）と比較して示す。
【図3】図３は、２ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質２５ｍＬでの灌流中の、６０分間の液相濃度を示す。円は、接続した腎臓がないものを示し、四角は、接続した腎臓を有するものを示す。ＰＥＧ－リン脂質の算出された取り込みは、７６％であった。
【図4】図４Ａ-図４Ｆ。図４Ａ～図４Ｆは、再灌流後５分（図４Ａ：対照、図４Ｂ：処置）、６０分（図４Ｃ：対照、図４Ｄ：処置）および３６０分（図４Ｅ：対照、図４Ｆ：処置）の時点での対照および処置腎臓から回収した生検を示す。腎臓を、ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質溶液で灌流し、ＰＥＧ－リン脂質を用いた腎臓内皮のコーティングの検証を、ストレプトアビジン－４８８を用いる対比染色により実行した。切片を、共焦点顕微鏡により分析した。
【図5A】図５Ａ～図５Ｅは、短期同種間ブタ腎臓移植モデルにおける補体活性化を示す。腎臓からの生検における、図５Ａは、血漿Ｃ３ａ、図５Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図５Ｃは、Ｃ４ｄ、図５Ｄは、Ｃ３ｂ、図５Ｅは、ＭＡＣ沈着である。矢印がある四角および棒は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、矢印がない円および棒は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図5B】図５Ａ～図５Ｅは、短期同種間ブタ腎臓移植モデルにおける補体活性化を示す。腎臓からの生検における、図５Ａは、血漿Ｃ３ａ、図５Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図５Ｃは、Ｃ４ｄ、図５Ｄは、Ｃ３ｂ、図５Ｅは、ＭＡＣ沈着である。矢印がある四角および棒は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、矢印がない円および棒は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図5C】図５Ａ～図５Ｅは、短期同種間ブタ腎臓移植モデルにおける補体活性化を示す。腎臓からの生検における、図５Ａは、血漿Ｃ３ａ、図５Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図５Ｃは、Ｃ４ｄ、図５Ｄは、Ｃ３ｂ、図５Ｅは、ＭＡＣ沈着である。矢印がある四角および棒は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、矢印がない円および棒は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図5D】図５Ａ～図５Ｅは、短期同種間ブタ腎臓移植モデルにおける補体活性化を示す。腎臓からの生検における、図５Ａは、血漿Ｃ３ａ、図５Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図５Ｃは、Ｃ４ｄ、図５Ｄは、Ｃ３ｂ、図５Ｅは、ＭＡＣ沈着である。矢印がある四角および棒は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、矢印がない円および棒は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図5E】図５Ａ～図５Ｅは、短期同種間ブタ腎臓移植モデルにおける補体活性化を示す。腎臓からの生検における、図５Ａは、血漿Ｃ３ａ、図５Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図５Ｃは、Ｃ４ｄ、図５Ｄは、Ｃ３ｂ、図５Ｅは、ＭＡＣ沈着である。矢印がある四角および棒は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、矢印がない円および棒は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、ｐ＜０．０００１である。
【図6A】図６Ａ～図６Ｄは、短期同種間腎臓移植モデルにおける凝固活性化を示す。図６Ａは、血漿ＴＡＴ、図６Ｂは、ＴＦ、図６Ｃは、ＦＸＩＩ／ＡＴ、図６Ｄは、ＦＸＩＩ／Ｃ１ＩＮＨである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。
【図6B】図６Ａ～図６Ｄは、短期同種間腎臓移植モデルにおける凝固活性化を示す。図６Ａは、血漿ＴＡＴ、図６Ｂは、ＴＦ、図６Ｃは、ＦＸＩＩ／ＡＴ、図６Ｄは、ＦＸＩＩ／Ｃ１ＩＮＨである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。
【図6C】図６Ａ～図６Ｄは、短期同種間腎臓移植モデルにおける凝固活性化を示す。図６Ａは、血漿ＴＡＴ、図６Ｂは、ＴＦ、図６Ｃは、ＦＸＩＩ／ＡＴ、図６Ｄは、ＦＸＩＩ／Ｃ１ＩＮＨである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。
【図6D】図６Ａ～図６Ｄは、短期同種間腎臓移植モデルにおける凝固活性化を示す。図６Ａは、血漿ＴＡＴ、図６Ｂは、ＴＦ、図６Ｃは、ＦＸＩＩ／ＡＴ、図６Ｄは、ＦＸＩＩ／Ｃ１ＩＮＨである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１、＊＊＊は、ｐ＜０．００１である。
【図7A】図７Ａ～図７Ｃは、短期同種間腎臓移植モデルにおける炎症促進性サイトカインの濃度を示す。図７Ａは、血漿ＩＬ－１β、図７Ｂは、ＩＬ－６、図７Ｃは、ＴＮＦである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図7B】図７Ａ～図７Ｃは、短期同種間腎臓移植モデルにおける炎症促進性サイトカインの濃度を示す。図７Ａは、血漿ＩＬ－１β、図７Ｂは、ＩＬ－６、図７Ｃは、ＴＮＦである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図7C】図７Ａ～図７Ｃは、短期同種間腎臓移植モデルにおける炎症促進性サイトカインの濃度を示す。図７Ａは、血漿ＩＬ－１β、図７Ｂは、ＩＬ－６、図７Ｃは、ＴＮＦである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図8A】図８Ａ～図８Ｃは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化を示す。図８Ａは、血漿Ｃ３ａ、図８Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図８Ｃは、ＴＡＴである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図8B】図８Ａ～図８Ｃは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化を示す。図８Ａは、血漿Ｃ３ａ、図８Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図８Ｃは、ＴＡＴである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図8C】図８Ａ～図８Ｃは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化を示す。図８Ａは、血漿Ｃ３ａ、図８Ｂは、ｓＣ５ｂ－９、図８Ｃは、ＴＡＴである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１である。
【図9-1】図９Ａ～図９Ｌは、長期同種間腎臓移植モデルにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。図９Ａは、血漿ＩＮＦγ、図９Ｂは、ＩＬ－１β、図９Ｃは、ＩＬ－１α、図９Ｄは、ＩＬ－１Ｒ、図９Ｅは、ＩＬ－２、図９Ｆは、ＩＬ－４、図９Ｇは、ＩＬ－６、図９Ｈは、ＩＬ－１０、図９Ｉは、ＩＬ－８、図９Ｊは、ＩＬ－１２、図９Ｋは、ＩＬ－１８、図９Ｌは、ＴＮＦである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。
【図9-2】図９Ａ～図９Ｌは、長期同種間腎臓移植モデルにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。図９Ａは、血漿ＩＮＦγ、図９Ｂは、ＩＬ－１β、図９Ｃは、ＩＬ－１α、図９Ｄは、ＩＬ－１Ｒ、図９Ｅは、ＩＬ－２、図９Ｆは、ＩＬ－４、図９Ｇは、ＩＬ－６、図９Ｈは、ＩＬ－１０、図９Ｉは、ＩＬ－８、図９Ｊは、ＩＬ－１２、図９Ｋは、ＩＬ－１８、図９Ｌは、ＴＮＦである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。
【図9-3】図９Ａ～図９Ｌは、長期同種間腎臓移植モデルにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度を示す。図９Ａは、血漿ＩＮＦγ、図９Ｂは、ＩＬ－１β、図９Ｃは、ＩＬ－１α、図９Ｄは、ＩＬ－１Ｒ、図９Ｅは、ＩＬ－２、図９Ｆは、ＩＬ－４、図９Ｇは、ＩＬ－６、図９Ｈは、ＩＬ－１０、図９Ｉは、ＩＬ－８、図９Ｊは、ＩＬ－１２、図９Ｋは、ＩＬ－１８、図９Ｌは、ＴＮＦである。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。
【図10A】図１０Ａおよび図１０Ｂは、短期（図１０Ａ）および長期（図１０Ｂ）同種間腎臓移植モデルにおけるＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓の機能評価を示す。図１０Ａにおいて、利尿を評価し、図１０Ｂにおいて、クレアチン濃度を測定した。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図10B】図１０Ａおよび図１０Ｂは、短期（図１０Ａ）および長期（図１０Ｂ）同種間腎臓移植モデルにおけるＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓の機能評価を示す。図１０Ａにおいて、利尿を評価し、図１０Ｂにおいて、クレアチン濃度を測定した。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図11】図１１は、長期同種間腎臓移植モデルにおける、対照腎臓を移植された動物と比較した、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を移植されたブタにおける再灌流直後の脈拍数の補整的増加に関する機能評価を示す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図17A】図１７Ａ～図１７Ｄは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化、ならびにクレアチニン濃度、血漿ＴＡＴ（図１７Ａ）、Ｃ３ａ（図１７Ｂ）、ｓＣ５ｂ－９（図１７Ｃ）およびクレアチニン（図１７Ｄ）を示す。四角のある線は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円のある線は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図17B】図１７Ａ～図１７Ｄは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化、ならびにクレアチニン濃度、血漿ＴＡＴ（図１７Ａ）、Ｃ３ａ（図１７Ｂ）、ｓＣ５ｂ－９（図１７Ｃ）およびクレアチニン（図１７Ｄ）を示す。四角のある線は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円のある線は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図17C】図１７Ａ～図１７Ｄは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化、ならびにクレアチニン濃度、血漿ＴＡＴ（図１７Ａ）、Ｃ３ａ（図１７Ｂ）、ｓＣ５ｂ－９（図１７Ｃ）およびクレアチニン（図１７Ｄ）を示す。四角のある線は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円のある線は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図17D】図１７Ａ～図１７Ｄは、長期同種間腎臓移植モデルにおける補体および凝固活性化、ならびにクレアチニン濃度、血漿ＴＡＴ（図１７Ａ）、Ｃ３ａ（図１７Ｂ）、ｓＣ５ｂ－９（図１７Ｃ）およびクレアチニン（図１７Ｄ）を示す。四角のある線は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円のある線は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図18-1】図１８Ａ～図１８Ｇは、長期同種間腎臓移植モデルにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度、血漿ＩＬ－１β（図１８Ａ）、ＩＬ－２（図１８Ｂ）、ＩＬ－４（図１８Ｃ）、ＩＬ－６（図１８Ｄ）、ＩＬ－８（図１８Ｅ）、ＩＬ－１０（図１８Ｆ）およびＴＮＦ（図１８Ｇ）を表す。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図18-2】図１８Ａ～図１８Ｇは、長期同種間腎臓移植モデルにおけるサイトカイン／ケモカインの濃度、血漿ＩＬ－１β（図１８Ａ）、ＩＬ－２（図１８Ｂ）、ＩＬ－４（図１８Ｃ）、ＩＬ－６（図１８Ｄ）、ＩＬ－８（図１８Ｅ）、ＩＬ－１０（図１８Ｆ）およびＴＮＦ（図１８Ｇ）を表す。四角は、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を表し、円は、未処置対照を表す。＊は、ｐ＜０．０５である。
【図19-1】図１９は、５ｋＤのＰＥＧ－脂質のために１つの腎臓を使用しおよび４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質のために他の腎臓を使用した、４頭の異なるブタからの腎臓へのＰＥＧ－脂質分子の注入後の５ｋＤａのＰＥＧ－脂質および４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質の取り込みを示す。腎臓を、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質溶液で灌流し、ＰＥＧ－リン脂質による腎臓内皮および柔組織のコーティングの検証を、可視化した。切片を、共焦点顕微鏡により分析した。
【発明の概要】
【0018】
本発明は一般に、エクスビボ臓器処置、特に臓器再灌流により誘導される適応免疫系の活性化、および低血圧症に先行する、血栓炎症を処置、阻害または予防できる、そのようなエクスビボ臓器処置に関する。
【0019】
本発明のエクスビボ方法は、内膜または血管系の内皮およびそのような臓器またはそのような臓器の一部の柔組織の保護的シールドまたはコーティングを提供することにより、臓器移植および臓器処置において有意な改善をもたらす。この保護的コーティングは、血栓炎症および虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害（ＩＲＩ）の有害作用に対する効果的保護を構成する。
【0020】
グリコカリックスは、微小血管うっ血および血栓炎症の予防を確実にするために必須である。しかし、このグリコカリックスは、酸化ストレスおよび虚血誘導性損傷に対して非常に感受性である。したがって、保護的グリコカリックスコーティングは、インビトロでの臓器調達および臓器保存に関連して生じる虚血中に急速に失われる。臓器移植片が移植され再灌流されると、修復プロセスが誘導され、これは、グリコカリックスがないことやそれへの損傷のため臓器移植片への壊滅的な損傷を開始する。したがって、補体および接触系が、活性化される。血小板は、消費され、白血球は、活性化され、かつ臓器移植片に浸透するようになる。これらの系の活性化の結果として、サイトカインが最終的に生成され、細胞死および移植片機能損失または臓器移植後臓器機能障害をもたらす。臓器移植片へのこの壊滅的な損傷は、血栓炎症であり、これは主に、血液のカスケード系、すなわち、補体、接触／凝固および線維素溶解系、からなる体液性自然免疫系により誘発される。これらの系の活性化はその後、内皮細胞、白血球および血小板の活性化を誘導し、最終的に、血栓性および炎症反応をもたらす。
【0021】
本明細書に示すように、臓器または臓器の一部をポリ（エチレングリコール）－リン脂質（ＰＥＧ－リン脂質）分子でエクスビボ処置することにより、臓器または臓器の一部を、血栓炎症に対して保護できる。したがって、ＰＥＧ－リン脂質分子は、臓器または臓器の一部の血管系の内膜の細胞膜に結合でき、それによりグリコカリックスの損失を埋め合わせる。したがって、ＰＥＧ－リン脂質分子は、凝固および補体活性化のレベルの低下、サイトカイン発現の抑制および移植片機能の一般的な改善を含む、血栓炎症の有害効果を阻害するか、または少なくとも有意に低減する、内皮の保護コーティングを形成する。
【0022】
特に、臓器のＰＥＧ－リン脂質分子を用いたエクスビボ処置は、インターロイキン４（ＩＬ－４）およびＩＬ－１２を含むＴ細胞特異的サイトカインなどのサイトカインにおける顕著な低減をもたらした。非処置対照臓器において、移植後の数日間、高レベルのそのようなサイトカインがあり、これは免疫付与の継続およびさらなる免疫抑制に対して負の効果を有する。したがって、ＰＥＧ－リン脂質分子による内皮のコーティングは、サイトカインに誘導された効果および移植後の臓器または臓器の一部への損傷を阻害し、また、移植後の免疫抑制の結果も改善する。
【0023】
ＰＥＧ－リン脂質分子を用いて臓器または臓器の一部をエクスビボ処置することにより達成された別の非常に驚くべき効果は、臓器移植片の再灌流後に進行する再灌流と関連する心拍数増加および低血圧症を伴う血行動態の不安定性の処置、阻害または予防であった。移植に関連するそのような低血圧症は、結果として、灌流の低下、臓器不全をもたらし、さらには、患者の死をもたらし得る。低血圧症は、臓器移植片が患者の血管系と接続され、それにより再灌流されるときに誘導される。低血圧症を処置できない場合、移植中の患者の死の大きな危険性があるので、そのような低血圧症の処置は今日では、臓器移植中の重要な課題である。しかしながら、ＰＥＧ－リン脂質分子で移植前に臓器移植片をエクスビボ処置することにより、低血圧症は、予防されるか、少なくとも有意に阻害または低減され得た。したがって、臓器移植に関連する低血圧症が誘導する損傷の危険性は、本発明のＰＥＧ－リン脂質分子を使用することにより低減される。本発明のＰＥＧ－リン脂質分子はそのため、再灌流後症候群（ＰＲＳ）の処置、予防および／または阻害において有用である。
【0024】
本発明の一態様はしたがって、臓器または臓器の一部を処置するエクスビボ方法に関する。方法は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を、臓器または臓器の一部の血管系および任意で柔組織に、エクスビボ注入することを含む。方法はまた、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液に臓器または臓器の一部を浸漬しておきながら、ＰＥＧ－リン脂質分子での血管系の内膜の少なくとも一部、好ましくは柔組織のコーティングを可能にするように、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を血管系中で、任意で柔組織中でエクスビボインキュベートすることを含む。
【0025】
したがって、エクスビボ方法は、ＰＥＧ－リン脂質分子を臓器または臓器の一部の血管系に導入することを含み、そこで、ＰＥＧ－リン脂質分子が内皮または柔組織の細胞膜と相互作用しかつそれに結合することを可能にする。図１は、内皮の脂質二重膜と疎水的に相互作用し、それによりリン脂質基を介して細胞膜中でＰＥＧ－リン脂質分子を固定または結合する、ＰＥＧ－リン脂質分子を用いるこの原理を概略的に示す。
【0026】
ＰＥＧ－リン脂質分子の、内皮、任意で、腎臓の場合には腎実質などの、柔組織の脂質二重膜との間の相互作用は、エクスビボで生じ、一方で臓器または臓器の一部は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に置かれるか、浸漬される。本明細書において提示されるような実験データは、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に臓器を浸漬しておくことが、臓器または臓器の一部の血管系および任意で柔組織がＰＥＧ－リン脂質分子でコートされる場合であっても、ＰＥＧ－リン脂質分子がない臓器保存溶液中に臓器または臓器の一部を単に浸漬しておく場合と比較して、結果として有意に低いカスケード系の活性化およびサイトカイン発現をもたらすことを示唆する。
【0027】
したがって、臓器または臓器の一部の効果的なエクスビボ処置を達成するため、臓器または臓器の一部の血管系、および任意で柔組織は、ＰＥＧ－リン脂質分子に曝露される必要があり、臓器または臓器の一部は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に浸漬される必要がある。そのようなエクスビボ処置の抗血栓炎症効果は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を臓器または臓器の一部の血管系、および任意でその柔組織に単にエクスビボ注入することと比較して有意に改善される。実際に、本発明のエクスビボ処置の抗血栓炎症効果は、臓器または臓器の一部が、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に浸漬しておいた場合、すなわち、臓器または臓器の一部の再灌流前であっても、冷虚血期間中に既に誘導されていた。
【0028】
特定の実施形態において、臓器または臓器の一部は最初に、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を用いて臓器または臓器の一部の血管系、および任意でその柔組織にエクスビボ注入される。このエクスビボ注入は有利には、ドナーの体内から臓器または臓器の一部を外植および除去した後に、可能な限り早く起こる。灌流された臓器または臓器の一部はその後、ＰＥＧリン脂質を含む臓器保存溶液中に浸漬され、その中で、好ましくは約４℃などの低温で維持され、これは本明細書においてさらに議論される。
【0029】
別の特定の実施形態において、臓器または臓器の一部は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に最初に浸漬され、その後ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を、臓器または臓器の一部の血管系、および任意でその柔組織にエクスビボ注入する。このエクスビボ注入は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に臓器または臓器の一部を浸漬しておきながら、実行できる。代わりに、臓器または臓器の一部は、臓器保存溶液から一時的に取り出され、エクスビボ注入を実行し、その後、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液に戻される。
【0030】
一実施形態において、方法はまた、臓器保存溶液を血管系にエクスビボ注入して非結合ＰＥＧ－リン脂質分子を血管系から洗い流すことも含む。したがって、非結合ＰＥＧ－リン脂質分子は好ましくは、１回または複数回の、すなわち、少なくとも２回の、臓器保存溶液を使用する洗浄工程において洗い流される。
【0031】
そのような臓器保存溶液はまた、１回または複数回の洗浄工程においてＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を注入する前に臓器または臓器の一部の血管系を洗浄するためにも使用できる。そのような実施形態において、方法はまた、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を血管系にエクスビボ注入する前に血管系に臓器保存溶液をエクスビボ注入することも含む。ＰＥＧ－リン脂質分子を添加する前の臓器保存溶液の初期注入は、臓器または臓器の一部の血管系を洗浄し、それによりＰＥＧ－リン脂質分子での内皮の効果的なコーティングを促進する。
【0032】
一実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液のエクスビボ注入は、血管系の動脈および静脈の１つをエクスビボクランピングすることを含む。この実施形態はまた、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を動脈および静脈の他方にエクスビボ注入し、動脈および静脈のその他方をエクスビボクランピングすることも含む。
【0033】
したがって、一実施形態において、臓器または臓器の一部の血管系の静脈（または動脈）は、最初にクランプされて、添加される溶液が血管系から流出することを防止する。ＰＥＧ－リン脂質分子を有する溶液は、血管系の動脈（または静脈）に添加され、この動脈（または静脈）はその後、クランプされて、添加される溶液が血管系から流出することを防止する。したがって、臓器または臓器の一部の血管系の血管の入口および出口は、クランピングにより閉じられて、それによりＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を血管系内に維持し、それにより血管系の内皮にＰＥＧ－リン脂質分子を結合させることを可能にする。
【0034】
別の実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質分子を有する溶液は、溶液が臓器または臓器の一部の静脈（または動脈）で出現するまで、臓器または臓器の一部の血管系の動脈（または静脈）に注入される。これは、ＰＥＧ－リン脂質分子を有する溶液が、血管系を充填したことを確認する。その時点で、動脈および静脈をクランプする。
【0035】
ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液は、静脈を通って、または動脈を通って添加できる。特定の実施形態において、溶液は、動脈に注入される。そのような特定の実施形態において、任意の初期クランピングがその後、血管系の静脈でなされることが好ましい。
【0036】
上述したクランピングの実施形態は特に、血管系にエクスビボ注入される溶液が、臓器または臓器の一部が浸漬される臓器保存溶液とは異なる、および／または溶液中に含まれるＰＥＧ－リン脂質分子が、臓器保存溶液に含まれるＰＥＧ－リン脂質分子とは異なる場合に有用である。他の場合、臓器または臓器の一部が浸漬されるのと同じＰＥＧ－リン脂質含有臓器保存溶液がエクスビボ注入されるので、クランピングの必要はない。
【0037】
ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液は好ましくは、１０分から最大で４８時間の期間、血管系中でエクスビボインキュベートされて、ＰＥＧ－リン脂質分子が内皮の細胞膜と疎水的に相互作用することを可能にし、それにより臓器または臓器の一部の血管系の少なくとも一部をコートする。エクスビボインキュベーションは好ましくは、２０分間から最大で３６時間、より好ましくは３０分間から最大で２４時間、例えば３０分間から最大で１２時間、最大で８時間、最大で４時間、または最大で１時間実行される。
【0038】
血管系に注入されるＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液の量は、臓器の種類および臓器のサイズ（成人対小児）に依存する。一般に、溶液の体積は、臓器の血管系を満たすのに充分である必要がある。最も実用的な用途において、５ｍＬから最大で２５０ｍＬのＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液が、血管系にエクスビボ注入される。好ましい実施形態において、５ｍＬから最大で１００ｍＬ、好ましくは、５ｍＬから最大で５０ｍＬのＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液が、血管系にインビボ注入される。
【0039】
一実施形態において、溶液は、０．２５ｍｇ／ｍＬから最大で２５ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質分子を含む。好ましい実施形態において、溶液は、０．２５ｍｇ／ｍＬから最大で１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．２５ｍｇ／ｍＬから最大で５ｍｇ／ｍＬ、例えば、２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質分子を含む。
【0040】
ＰＥＧ－リン脂質分子の上述した濃度はまた、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液のために使用できる。
【0041】
本発明によれば、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液は、臓器または臓器の一部をＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に置かれたまたは浸漬されたままにしながら、血管系中でエクスビボインキュベートされる。加えて、臓器または臓器の一部は好ましくはまた、０℃より高いが８℃よりも低い温度、好ましくは０℃より高いが６℃以下である温度、より好ましくは０℃より高いが４℃以下である温度で維持される。
【0042】
この実施形態において、臓器または臓器の一部は、ＰＥＧ－リン脂質分子が血管系の内皮の細胞膜と相互作用しかつそれに結合させられるインキュベーション時間の間、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に浸漬される。臓器または臓器の一部はまた好ましくは、冷たくして、すなわち、０℃付近であるが０℃より高い温度で維持される。
【0043】
本発明によれば、臓器または臓器の一部は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液中に浸漬されたままである。
【0044】
臓器保存のための理論的に完全な温度は、４℃～８℃であることが示されている。より高い温度は、代謝が効率的に低下しないので臓器の低酸素性損傷をもたらし、４℃より低い温度は、タンパク質変性を伴う低温損傷のリスクを高める。
【0045】
現在、臨床臓器移植におけるドナー臓器保存のための絶対的基準は、３つのプラスチック袋およびアイスボックスを使用する。第１のプラスチック袋は、臓器保存溶液に浸漬された臓器自体を含む。この第１のプラスチック袋を、生理食塩水で満たされた第２のプラスチック袋に入れ、その後これらの２つのプラスチック袋を、生理食塩水で満たされた第３のプラスチック袋に入れ、その後それをアイスボックスに入れる。温度制御された環境で臓器を維持するためのさらに進んだ臓器保存デバイスが利用可能であり、Ｐａｒａｇｏｎｉｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からのＳｈｅｒｐａ Ｐａｋ（商標）輸送システム、Ｗａｔｅｒｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｙｓｔｅｍｓからのＷａｖｅｓ、Ｏｒｇａｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓからのＬｉｆｅＰｏｒｔトランスポーターなどを、使用できる。
【0046】
ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液は、生理食塩水、水性緩衝溶液または臓器保存溶液であり得る。
【0047】
使用できる水性緩衝溶液の具体的ではあるが、限定されない例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）およびクエン酸溶液を含む。
【0048】
ＰＥＧ－リン脂質分子をエクスビボ注入する前またはその後にＰＥＧ－リン脂質分子を注入する、および／または臓器もしくは臓器の一部の血管系を洗浄するのに使用できる、および／または、臓器もしくは臓器の一部をその中に浸漬できる臓器保存溶液は、既知の臓器保存溶液から選択できる。そのような臓器保存溶液の具体的ではあるが、限定されない例は、ヒスチジン－トリプトファン－ケトグルタル酸（ＨＴＫ）溶液、クエン酸溶液、ウィスコンシン大学（ＵＷ）溶液、コリンズ溶液、セルシオ溶液、京都大学溶液およびＩｎｓｔｉｔｕｔ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｌｏｐｅｚ－１（ＩＧＬ－１）溶液を含む。
【0049】
本明細書において提示されるような実験データは、ＰＥＧ－リン脂質分子が、沈殿なしで臓器保存溶液中に容易に混合可能であることを示す（図２０）。
【0050】
一実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質分子は、ＰＥＧ－リン脂質からなる非官能化ＰＥＧ－リン脂質分子である。したがって、本実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質分子は、あらゆる官能基を含まない。これは、図１において、ＣＨ２またはＨと等しいＲを有するものに相当する。
【0051】
別の実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質分子は、ＰＥＧ－リン脂質分子のＰＥＧに結合された各官能化分子を含む官能化ＰＥＧ－リン脂質分子である。
【0052】
さらなる実施形態において、溶液は、ＰＥＧ－リン脂質からなる非官能化ＰＥＧ－リン脂質分子およびＰＥＧ－リン脂質分子のＰＥＧに結合された各官能化分子を含む官能化ＰＥＧ－リン脂質分子の混合物を含む。
【0053】
官能化ＰＥＧ－リン脂質分子のみまたは官能化および非官能化ＰＥＧ－リン脂質分子の混合物を含む実施形態において、官能化分子は好ましくは、補体阻害剤、凝固阻害剤、血小板阻害剤、補体阻害剤を結合できる分子、凝固阻害剤を結合できる分子、血小板阻害剤を結合できる分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【0054】
補体阻害剤の具体的ではあるが、限定されない例は、因子Ｈ；Ｃ４ｂ－結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）；Ｃ３ｂ／Ｃ４ｂ受容体または分化抗原群３５（ＣＤ３５）としても既知の補体受容体１（ＣＲ１）のＮ－末端４～６ショートコンセンサスリピート（ＳＣＲ）；膜補因子蛋白質（ＭＣＰ）としても既知のＣＤ４６補体調節タンパク質（ＣＤ４６）；およびＣＤ５５としても既知の補体崩壊促進因子（ＤＡＦ）を含む。
【0055】
凝固阻害剤の具体的ではあるが、限定されない例は、ヘパリンを含む。
【0056】
血小板阻害剤の具体的ではあるが、限定されない例は、アピラーゼなどのアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）分解酵素およびＣＤ３９としても既知のエクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ－１（ＮＴＰＤａｓｅ１）である。
【0057】
補体阻害剤を結合できる分子の具体的ではあるが、限定されない例は、［４］に開示される５Ｃ６などの因子Ｈ結合ペプチド；および［５］に開示されるストレプトコッカスＭタンパク質由来ペプチドＭ２－Ｎ、Ｍ４－ＮまたはＭ２２－ＮなどのＣ４ＢＰ結合ペプチドである。
【0058】
凝固阻害剤を結合できる分子の具体的ではあるが、限定されない例は、［７］に開示されるようなヘパリン結合ペプチドである。
【0059】
したがって、一実施形態において、官能化分子は、ヘパリン結合ペプチド、ＣＲ１のＮ－末端４～６ＳＣＲ、ＣＤ４６、ＤＡＦ、因子Ｈ結合分子、ＡＤＰ分解酵素、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【0060】
特定の実施形態において、官能化分子は、ペプチド５Ｃ６、アピラーゼ、ＣＤ３９、Ｃ４ＢＰ、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【0061】
一実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質分子は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）：
を有する。
【化1】
【化2】
【0062】
一実施形態において、ｎ、ｍは、１０から最大で１６の範囲内で独立して選択される整数である。パラメータｎ、ｍは好ましくは、独立して１０、１２、１４または１６であり、より好ましくは、ｎ＝ｍ＝１４である。
【0063】
一実施形態において、ｐは、ＰＥＧ鎖が、１０００Ｄａから最大で４００００Ｄａの範囲内で選択される平均分子量を有するように選択される。パラメータｐは好ましくは、ＰＥＧ鎖が３０００から最大で１００００Ｄａ、より好ましくは、５０００Ｄａの平均分子量を有するように選択される。
【0064】
本明細書において定義されるような平均分子量は、個々のＰＥＧ－リン脂質分子が、この平均分子量とは異なる分子量を有してよいこと、しかし平均分子量が、ＰＥＧ－リン脂質分子の中間分子量を表すことを示唆する。これはさらに、ＰＥＧ－リン脂質試料についてこの平均分子量付近の分子量の自然分布があることを含む。
【0065】
末端基Ｒは、一実施形態において、Ｈ、ＣＨ２、ＮＨ２、マレイミド（ｍａｌｅｍｉｄｅ）基、ビオチン基、ストレプトアビジン基、アビジン基または官能化分子である。官能化分子の場合、これは好ましくは、補体阻害剤、凝固阻害剤、血小板阻害剤、補体阻害剤を結合できる分子、凝固阻害剤を結合できる分子、血小板阻害剤を結合できる分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される。
【0066】
ＰＥＧ－リン脂質分子の脂肪酸鎖は、飽和されてよい。少なくとも１つまたは両方の脂肪酸鎖はあるいは、不飽和であり得る、すなわち、少なくとも１つの－ＣＨ＝ＣＨ－基、少なくとも１つの－Ｃ≡Ｃ－基またはそれらの組み合わせを含む。各脂肪酸鎖は、直鎖または分岐であり得る。
【0067】
臓器または臓器の一部の血管系、および任意で柔組織にエクスビボ注入されるＰＥＧ－リン脂質分子は、臓器または臓器の一部を浸漬しておく臓器保存溶液に含まれるＰＥＧ－リン脂質分子と同じ種類であり得る。別の実施形態において、臓器または臓器の一部を浸漬しておく臓器保存溶液と比較して異なる種類のＰＥＧ－リン脂質分子が、臓器または臓器の一部の血管系、および任意でその柔組織にエクスビボ注入される溶液に使用できる。例えば、ＰＥＧ鎖のサイズは、ＰＥＧ－リン脂質分子について異なってよく、臓器または臓器の一部の血管系、および任意でその柔組織において標的サイズに到達するように選択されたＰＥＧ－リン脂質分子のＰＥＧ鎖のサイズを有する。図１９に示すように、ＰＥＧ鎖のサイズは、その中にＰＥＧ－リン脂質分子が到達できる、血管系および柔組織の部分を制限する。特に、５ｋＤａのＰＥＧ－リン脂質分子は、より大きな４０ｋＤａのＰＥＧ－リン脂質分子と比較して血管系および柔組織のより大きい部分に到達できる。
【0068】
したがって、一実施形態において、臓器または臓器の一部の血管系および任意で柔組織にエクスビボ注入される溶液に含まれるＰＥＧ－リン脂質分子は、臓器または臓器の一部が浸漬される臓器保存溶液に含まれるＰＥＧ－リン脂質分子と比較して、異なる平均サイズのＰＥＧ鎖を有してよい。
【0069】
加えて、または代わりに、エクスビボ注入溶液中のＰＥＧ－リン脂質分子および臓器保存溶液中のＰＥＧ－リン脂質分子は、異なる官能基、すなわち、式（Ｉ）および（ＩＩ）中の末端基Ｒを有してよい。
【0070】
本発明のエクスビボ方法は、血管系を有し、臓器移植片として使用できる、すなわち、レシピエントに移植されるあらゆる臓器または臓器の一部に適用できる。そのような臓器の具体的ではあるが、限定されない例は、腎臓、肝臓、膵臓、心臓、肺、子宮、膀胱、胸腺および腸を含む。
【0071】
特定の実施形態において、臓器は、腎臓である。この特定の実施形態において、血管系中でのＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液のエクスビボインキュベーションは、ＰＥＧ－リン脂質分子による腎臓血管系の腎臓内皮のコーティングだけでなく好ましくは、腎実質の細管のコーティングも可能にする。したがって、本明細書において提示されるような実験データは、ＰＥＧ－リン脂質分子が、大動脈基部を通じてＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液をエクスビボ注入する場合、尿細管周囲血管、糸球体および腎臓の細管に均一に分布されたことを示す。
【0072】
本明細書において提示されるような実験データは、ＰＥＧ－リン脂質処置臓器移植片が、ＴＡＴなどの凝固マーカー、およびＣ３ａおよびｓＣ５ｂ－９などの補体マーカーの血漿中濃度により反映されるように未処置対照臓器移植片と比較して有意に少ない血栓炎症を有したことを示す。また、サイトカイン発現、特にＩＬ－６およびＩＬ－１βも、ＰＥＧ－リン脂質処置臓器移植片において非常に抑制された。臓器機能は、ＰＥＧ－リン脂質処置臓器移植片において改善された。ＰＥＧ－リン脂質処置臓器はまた、Ｃ３ｂなどの補体マーカーおよび膜侵襲複合体の低減された沈着、およびＣ５ａＲの発現も示した。
【0073】
したがって、ＰＥＧ－リン脂質分子を用いた臓器移植片のエクスビボコーティングは、Ｉ／Ｒ誘導性血栓炎症に対して保護し、これは、臨床移植におけるＩ／Ｒ損傷に対する可能性があることを示唆する。
【0074】
本発明のさらなる態様は、臓器移植片の再灌流後に進行する再灌流に関連する低血圧症の処置、阻害または予防における使用のためのＰＥＧ－リン脂質に関する。
【0075】
本発明のさらに別の態様は、ＰＲＳの処置、阻害または予防において使用するためのＰＥＧ－リン脂質に関する。
【0076】
臓器移植の間およびその直後、典型的には２４時間までの合併症は、レシピエントにおける臓器移植片の再灌流後の血圧における顕著な低下である。レシピエントにおけるこの血行動態的変化は重度の場合、レシピエントの臓器においておよび移植された移植片において虚血をもたらす可能性があり、処置が成功しない場合これらの実体のいずれかへの損傷および患者の死さえも引き起こす。
【0077】
ＰＥＧ－リン脂質による血管の不安定性に対する観察された保護は、接触／カリクレイン系の阻害によるものであり得る。接触／カリクレイン系が再灌流後に活性化されたことが、予期せず確認された。接触／カリクレイン系は、血管拡張および透過性の増加を誘導し低血圧症をもたらす、高度に血管作動性のペプチドであるブラジキニンを生成し、それは代償性頻脈を引き起こす。手術中に、血圧の低下は、医薬品および液体で処置され、依然として生命を脅かすような状況が発生する可能性がある。したがって、低血圧症を予防する可能性は、大いに臨床的な価値がある。
【0078】
したがって、臓器移植片の再灌流と関連するそのような低血圧症および血圧における低下を予防する、処置する、または少なくとも低減することは、臓器移植に関連する重要な改善である。本明細書において提示されるような実験データは、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を用いて移植前の臓器移植片をエクスビボ処置することが、臓器移植片が再灌流される場合にそのような低血圧症または血圧低下に対しレシピエントを保護したことを示す。
【0079】
一実施形態において、ＰＥＧ－リン脂質は、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液として配合され、ＰＥＧ－リン脂質分子による血管系の内膜および柔組織のコーティングを可能にする臓器移植片の血管系へのエクスビボ注入を目的とする。
【0080】
本発明の関連する態様は、臓器移植片の再灌流後に進行する再灌流と関連する低血圧症の処置、阻害または予防のための薬剤の製造のためのＰＥＧ－リン脂質の使用を定義する。一態様はまた、臓器移植片の再灌流後に進行する再灌流に関連する低血圧症を処置する、阻害する、または予防するための方法に関する。この方法は、任意ではあるが好ましくは、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む臓器保存溶液に臓器移植片を浸漬しておきながら、ＰＥＧ－リン脂質分子による血管系の内皮の少なくとも一部のコーティングを可能にするための、ＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液を臓器移植片の血管系にエクスビボ注入するおよび血管系中でＰＥＧ－リン脂質分子を含む溶液をエクスビボインキュベートする、以前説明した方法ステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【0081】
実験１
材料、方法および動物実験
ＰＥＧ－リン脂質誘導体の合成
材料、方法および動物実験
ＰＥＧ－リン脂質誘導体の合成
【0082】
ａ．ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質
ＰＥＧ－リン脂質の合成を、以前説明した方法［１］により実行した。簡潔に言うと、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社、東京、日本、ＤＰＰＥ、２１ｍｇ）をジクロロメタン（シグマ－アルドリッチケミカル社（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ））３ｍＬに溶解した。α－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルポリ（エチレングリコール）（ＮＯＦからのＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｂｏｃ、Ｍｗ：５０００、１８５ｍｇ）およびトリエチルアミン（３μＬ、ナカライテスク（京都、日本））を反応溶液に加え、その後、室温（ＲＴ、約２０℃）で４日間撹拌した。ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＢｏｃのＮＨＳ基は、リン脂質のアミノ基とすぐに反応した。保護基、Ｂｏｃ、アミノ基を、９９％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業（大阪、日本））２ｍＬの添加後に除去し、４℃で３０分間、追加でインキュベートした。粗生成物をジエチルエーテル（ナカライテスク）中での再沈殿により精製した。クロロホルム（ナカライテスク）を用いた抽出および蒸発濃縮の後、ＰＥＧ－リン脂質を白色固体として得た。収率は、８５％であった。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（同仁科学研究所（熊本、日本））を用いる蛍光標識のために、ＰＥＧ－リン脂質（２００ｍｇ）をＦＩＴＣ（３１ｍｇ）と１２時間、アセトン中で反応させた。ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質を、ゲル浸透クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５、ＧＥヘルスケア（バッキンガムシャー、ＵＫ））により精製した。
ＰＥＧ－リン脂質の合成を、以前説明した方法［１］により実行した。簡潔に言うと、１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（日油株式会社、東京、日本、ＤＰＰＥ、２１ｍｇ）をジクロロメタン（シグマ－アルドリッチケミカル社（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ））３ｍＬに溶解した。α－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルポリ（エチレングリコール）（ＮＯＦからのＮＨＳ－ＰＥＧ－Ｂｏｃ、Ｍｗ：５０００、１８５ｍｇ）およびトリエチルアミン（３μＬ、ナカライテスク（京都、日本））を反応溶液に加え、その後、室温（ＲＴ、約２０℃）で４日間撹拌した。ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＢｏｃのＮＨＳ基は、リン脂質のアミノ基とすぐに反応した。保護基、Ｂｏｃ、アミノ基を、９９％トリフルオロ酢酸（和光純薬工業（大阪、日本））２ｍＬの添加後に除去し、４℃で３０分間、追加でインキュベートした。粗生成物をジエチルエーテル（ナカライテスク）中での再沈殿により精製した。クロロホルム（ナカライテスク）を用いた抽出および蒸発濃縮の後、ＰＥＧ－リン脂質を白色固体として得た。収率は、８５％であった。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（同仁科学研究所（熊本、日本））を用いる蛍光標識のために、ＰＥＧ－リン脂質（２００ｍｇ）をＦＩＴＣ（３１ｍｇ）と１２時間、アセトン中で反応させた。ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質を、ゲル浸透クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－２５、ＧＥヘルスケア（バッキンガムシャー、ＵＫ））により精製した。
【0083】
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（４０ｋＤａ）の合成は、以下に従った。α－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ω－マレイミジルポリ（エチレングリコール）（ＮＨＳ－ＰＥＧ（４０ｋ）－Ｍａｌ、Ｍｗ：４０，０００）およびＤＰＰＥ（９．６ｍｇ）をジクロロメタン３ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（３μＬ、ナカライテスク）を反応溶液に加え、その後、室温（ＲＴ、約２０℃）で４日間撹拌した。粗生成物を、ジエチルエーテル中での再沈殿により精製した。クロロホルムを用いた抽出および蒸発濃縮の後、Ｍａｌ－ＰＥＧ－リン脂質（４０ｋＤａ）を白色固体として得た。収率は、８０％であった。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を用いる蛍光標識のために、Ｍａｌ－ＰＥＧ－リン脂質（４０ｋＤａ）（１２００ｍｇ）をＤＭＳＯ（ナカライテスク、２０ｍＬ）に溶解し、その後、ＦＩＴＣ－グリシン－システイン（ＦＩＴＣ－ＧＣ、株式会社ベックス、東京、日本、１２ｍｇ）を加え３７℃で２４時間インキュベートした。粗生成物を、ジエチルエーテル中での再沈殿により精製した。クロロホルムを用いた抽出および蒸発濃縮の後、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（４０ｋＤａ）を黄色固体として得た。
【0084】
ｂ．ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質
ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質を、ポリ（エチレングリコール）（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド５－ペンタノエート）エーテル２－（ビオチニルアミノ）エタン（ＮＯＦからのビオチン－ＰＥＧ－ＮＨＳ、Ｍｗ：５０００、１８０ｍｇ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）（２０ｍｇ）をトリエチルアミン（５０μＬ）およびジクロロメタン（４ｍＬ）と組み合わせること、およびＲＴで４８時間撹拌することにより合成した。ジエチルエーテルを用いた沈殿により、ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質を白色粉末（１６５ｍｇ、８０％収率）として得た。ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質を、さらなる精製なしで視覚化に使用した。
ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質を、ポリ（エチレングリコール）（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド５－ペンタノエート）エーテル２－（ビオチニルアミノ）エタン（ＮＯＦからのビオチン－ＰＥＧ－ＮＨＳ、Ｍｗ：５０００、１８０ｍｇ）および１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）（２０ｍｇ）をトリエチルアミン（５０μＬ）およびジクロロメタン（４ｍＬ）と組み合わせること、およびＲＴで４８時間撹拌することにより合成した。ジエチルエーテルを用いた沈殿により、ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質を白色粉末（１６５ｍｇ、８０％収率）として得た。ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質を、さらなる精製なしで視覚化に使用した。
【0085】
ｃ．ＰＥＧ－リン脂質
ＰＥＧ－リン脂質を、α－スクシンイミジルオキシスクシニル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン（ＮＯＦからのＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、Ｍｗ：５０００、１７１ｍｇ）およびＤＰＰＥ（２２ｍｇ）をトリエチルアミン（２５μＬ）およびジクロロメタン（５ｍＬ）と組み合わせること、およびＲＴで７２時間撹拌することにより合成した。ジエチルエーテルを用いた沈殿により、ＰＥＧ－リン脂質を白色粉末（１６０ｍｇ、８０％収率）として得た。ＰＥＧ－リン脂質を、さらなる精製なしで腎臓処置に使用した。
ＰＥＧ－リン脂質を、α－スクシンイミジルオキシスクシニル－ω－メトキシ，ポリオキシエチレン（ＮＯＦからのＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨＳ、Ｍｗ：５０００、１７１ｍｇ）およびＤＰＰＥ（２２ｍｇ）をトリエチルアミン（２５μＬ）およびジクロロメタン（５ｍＬ）と組み合わせること、およびＲＴで７２時間撹拌することにより合成した。ジエチルエーテルを用いた沈殿により、ＰＥＧ－リン脂質を白色粉末（１６０ｍｇ、８０％収率）として得た。ＰＥＧ－リン脂質を、さらなる精製なしで腎臓処置に使用した。
【0086】
種々の種類のＰＥＧ－リン脂質の官能性評価
官能基部分がその保護特性に対する影響を有するかどうかを評価するため、一連の実験を、初代ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）で行った。ｈＭＳＣを、ＰＥＧ－リン脂質、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質およびビオチン－ＰＥＧ－リン脂質でコートした。表面修飾後に、コートされた細胞の生存率を、メーカーの説明書にしたがいＡｌｌｍａｒ ｂｌｕｅアッセイ（ライフテクノロジーズ、ストックホルム、スウェーデン）により分析した。簡潔に言うと、コートされた細胞を、９６ウェル細胞培養マイクロプレートで、ＭＳＣ培養培地中で培養した。６時間培養後に、Ａｌｌｍａｒ ｂｌｕｅ試薬１０μＬを培養培地１００μＬに加え、その後３７℃で４時間インキュベートした。続いて、蛍光発光を５８０～６１０ｎｍで測定した。
官能基部分がその保護特性に対する影響を有するかどうかを評価するため、一連の実験を、初代ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）で行った。ｈＭＳＣを、ＰＥＧ－リン脂質、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質およびビオチン－ＰＥＧ－リン脂質でコートした。表面修飾後に、コートされた細胞の生存率を、メーカーの説明書にしたがいＡｌｌｍａｒ ｂｌｕｅアッセイ（ライフテクノロジーズ、ストックホルム、スウェーデン）により分析した。簡潔に言うと、コートされた細胞を、９６ウェル細胞培養マイクロプレートで、ＭＳＣ培養培地中で培養した。６時間培養後に、Ａｌｌｍａｒ ｂｌｕｅ試薬１０μＬを培養培地１００μＬに加え、その後３７℃で４時間インキュベートした。続いて、蛍光発光を５８０～６１０ｎｍで測定した。
【0087】
ｈＭＳＣの血液適合性を測定するため、表面修飾ＭＳＣを、以前説明した［７］ようにループモデルにおいて全血に曝露した。要約すると、全血を健常人からヘパリンコートチューブ（Ｃｏｒｌｉｎｅ ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）に採取した。ヘパリン添加ＰＶＣチューブ（３０ｃｍ）を使用した。各チューブを血液３ｍＬで満たし、それに１０，０００ＭＳＣ／ｍＬを加えた。チューブを３７℃で６０分間３０ｒｐｍの速度で回転させた。インキュベーション後に、血液１．２ｍＬを、最終濃度１０ｍＭでＥＤＴＡを含む２ｍＬチューブ（エッペンドルフ、ドイツ）に収集した。続いて、血液を４２００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離して血漿を得た。血漿をアリコートに分割し、さらなる分析まで－８０℃で貯蔵した。
【0088】
異なる長さのＰＥＧサブユニットを有するＰＥＧ－リン脂質の保持
細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、浮遊細胞株、ｎ＝３）を、ＲＴで３０分間ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートし、続いて培養培地で洗浄した。ここで、異なる分子量、１ｋＤａ、５ｋＤａおよび４０ｋＤａのＰＥＧ鎖を有するＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質を使用した。処置細胞を３７℃で培養培地中にて培養し、０時間、１時間、３時間、６時間、２４時間および４８時間でフローサイトメトリー分析のために収集した。
細胞（ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、浮遊細胞株、ｎ＝３）を、ＲＴで３０分間ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）とインキュベートし、続いて培養培地で洗浄した。ここで、異なる分子量、１ｋＤａ、５ｋＤａおよび４０ｋＤａのＰＥＧ鎖を有するＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質を使用した。処置細胞を３７℃で培養培地中にて培養し、０時間、１時間、３時間、６時間、２４時間および４８時間でフローサイトメトリー分析のために収集した。
【0089】
ブタ同種間移植モデル
人間のものと非常に似ているその解剖学的構造および生理のため、ブタを大型動物モデルとして選択した。特に、腎臓の構造および機能は、霊長類の臓器と非常に類似している。ブタでのすべての研究において、健康水準が高い従来品種を使用した。長期間の生存実験において、動物を２週間の期間順化させ、訓練および社会化プログラムを受けさせた。尿路の超音波、血液学、および臨床病理を含む臨床検査を、頻繁に実行し、ドナーおよびレシピエントをミスマッチさせるため、ＳＬＡ－タイピングを移植前に実行した。レシピエントブタは、術後急速に回復したが、免疫抑制剤で処置しなかった。そのような薬剤の投与は、免疫応答を妨害し、実験から除外した。ブタをそのため、移植の急性拒絶反応を回避するために、９６時間後に安楽死させた。完全剖検を、安楽死後に実行した。すべての研究は、ウプサラ、スウェーデンの動物実験倫理委員会により承認された。
人間のものと非常に似ているその解剖学的構造および生理のため、ブタを大型動物モデルとして選択した。特に、腎臓の構造および機能は、霊長類の臓器と非常に類似している。ブタでのすべての研究において、健康水準が高い従来品種を使用した。長期間の生存実験において、動物を２週間の期間順化させ、訓練および社会化プログラムを受けさせた。尿路の超音波、血液学、および臨床病理を含む臨床検査を、頻繁に実行し、ドナーおよびレシピエントをミスマッチさせるため、ＳＬＡ－タイピングを移植前に実行した。レシピエントブタは、術後急速に回復したが、免疫抑制剤で処置しなかった。そのような薬剤の投与は、免疫応答を妨害し、実験から除外した。ブタをそのため、移植の急性拒絶反応を回避するために、９６時間後に安楽死させた。完全剖検を、安楽死後に実行した。すべての研究は、ウプサラ、スウェーデンの動物実験倫理委員会により承認された。
【0090】
Ａ．短期モデル（４０分間のＰＥＧ－リン脂質単独での腎臓の灌流）
虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ障害）は、移植、血栓性疾患、敗血症および心肺バイパスを含むいくつかの病状の病理への主要な誘因である。本実験は、ＰＥＧ－リン脂質でのブタ腎臓移植片の虚血性細胞表面のエクスビボコーティングが、一括同種間腎臓移植モデルにおいて、Ｉ／Ｒ損傷に対して保護するかどうかを試験した。
虚血再灌流障害（Ｉ／Ｒ障害）は、移植、血栓性疾患、敗血症および心肺バイパスを含むいくつかの病状の病理への主要な誘因である。本実験は、ＰＥＧ－リン脂質でのブタ腎臓移植片の虚血性細胞表面のエクスビボコーティングが、一括同種間腎臓移植モデルにおいて、Ｉ／Ｒ損傷に対して保護するかどうかを試験した。
【0091】
動物。研究を、ヘデンスティエナ実験施設、ウプサラ大学病院、スウェーデンで実行した。両方の性のブタ６頭のドナーおよび６頭のレシピエントブタを含めた。ブタの体重および年齢は、それぞれ３０～３５ｋｇおよび１０～１２週で異なった。ノンサバイバル手順を適用し、動物を、８時間の移植後観察期間の後、犠牲にした。
【0092】
麻酔。研究室に到着したとき、ゾラゼパム６ｍｇ／ｋｇ（Ｚｏｌｅｔｉｌ；ビルバック、カロ、フランス）と組み合わせた２．２ｍｇ／ｋｇのキシラジン（ロンプン；バイエル、レバークーゼン、ドイツ）の筋肉内注射を鎮静のために与えた。続いて、動物を腹臥位で固定した。末梢静脈カテーテルを、麻酔の導入および維持のため、ならびに流体投与のため、両耳に導入した。上気管最小皮切開を、気管の曝露および人工呼吸Ｓｅｒｖｏ－Ｉ人工呼吸器、ＭＡＱＵＥＴ、メディカルシステムズ、ＵＳ用の経気管挿管のために行った。動物に、５．０～５．５ｋＰａのＣＯ２を得るため、空気中の３０％酸素を通した。＞６０ｍｍＨｇの平均動脈圧（ＭＡＰ）は、充分な臓器灌流を確保することを目的とした。
【0093】
移植モデル。我々は、ドナーからレシピエント動物への両腎臓の二重一括回収および移植を可能にするブタ移植モデルを開発した。一括パッケージ内で無作為に選択された１つのみの腎臓の、孤立性のエクスビボＰＥＧ－リン脂質インキュベーションにより、この技術は、我々が、１頭のレシピエントブタにおいて、処置された臓器をその完全にマッチした対照組織とともに共移植することを可能にし、これは実験動物の数を低減しただけでなく、実験的交絡変数を最小化した。
【0094】
２つの腎臓、尿管および完全腎血管系からなる一括パッケージが作成されるように腎動脈上部および腎動脈下部大動脈の主要部ならびに下大静脈を固定した。一括パッケージを直ちに取り出し、ＨＴＫ（カストジオール；ケーラーケミーＧｍｂＨ、ドイツ）溶液を低温で流した。その後、一括パッケージをＨＴＫ溶液中、４℃で２４時間低温貯蔵した。
【0095】
保存後、各一括パッケージ内の１つの腎臓を、ＰＥＧ－リン脂質インキュベーションのために無作為に選択した。対側腎（対照）の静脈および動脈ならびに選択された腎臓の静脈をクランプした。２ｍｇ／ｍＬの濃度のＰＥＧ－リン脂質溶液全１０～１５ｍＬを、選択された腎臓に徐々に注入した。その後、処置された腎臓の動脈をクランプし、一括パッケージを４℃でさらに４０分間、ＨＴＫ中で低温貯蔵した。インキュベーション後かつ移植前に、余分なＰＥＧ－リン脂質を、対照からのクランプを除去することなく、ＨＴＫを有する処置された腎臓から流した。
【0096】
レシピエントブタを、以前説明したように扱い麻酔をかけた。一括パッケージを水平に、腹部内に配置した。移植の大静脈および大動脈の遠位端を、それぞれレシピエントの大静脈および大動脈に端から端まで吻合した。脱クランプの際、処置された腎臓および対照腎臓を、対照腎臓の脱クランプを数秒ずつ遅らせることにより順次再灌流し、一方で処置された腎臓からの流出物を流出させた。これは、大動脈導管内に残っているＰＥＧ－リン脂質溶液が対照腎臓に混入することを防止するために行われた。両方の移植尿管に、尿量の記録のために別個にカテーテルを挿入した。
【0097】
Ｂ．長期モデル（４０分間のＰＥＧ－リン脂質単独での腎臓の灌流）
動物。ＳＬＡタイピングからの結果に基づいて、ドナー（ｎ＝１２）およびレシピエント（ｎ＝２１）の雑種のブタを、ミスマッチ移植のために選択した。動物を、互いに目が届き声が聞こえる、３ｍ２程度の各檻に収容した。藁および木の削りくずを、寝床として使用した。１４：１０時間の明／暗スケジュール（０６：００時に点灯）を適用し、赤外線ランプ（２４時間）を各檻に与えた。温度は、１６～１８℃であった。動物に、成長促進剤（ＳＯＬＯ３３０、ラントマネン、スウェーデン）を含まない市販の仕上げ飼料を、１日２回、ＢＷに応じた量で、スウェーデン農業科学大学のブタ育成計画にしたがって与えた。水を、自由に与えた。ドナーブタを、０．１ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）ｖｅｔ、１ｍｇ／ｍＬ；オリオンファーマアニマルヘルス、ソーレントゥーナ、スウェーデン）、０．２ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でブトルファノール（Ｂｕｔｏｍｉｄｏｒ ｖｅｔ、１０ｍｇ／ｍＬ；サルファームスカンディナヴィア、ヘルシンボリ、スウェーデン）および５ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ（登録商標）ｖｅｔ、１００ｍｇ／ｍＬ；インターベットインターナショナルＢＶ、ボクスメール、オランダ）の組み合わせを筋肉内（ｉ．ｍ．）で用いて麻酔し、腎臓を、線形（１０ＭＨｚ）および曲線形（４ＭＨｚ）のプローブを使用して超音波（Ｌｏｇｉｑ ｅ Ｒ６、ＧＥヘルスケア、ウォーワトサ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で調べて、腎嚢胞を有するブタを除外した。腎臓の長さ、エコー輝度および皮髄定義を評価し、腎盂領域を、腎盂拡張の証拠について評価し、カラードプラを使用して腎臓における血流の存在を評価した。２週間の順応期間中、ブタを、移植後に拘束なしで異なる試験を実行するために毎日扱い訓練した。
動物。ＳＬＡタイピングからの結果に基づいて、ドナー（ｎ＝１２）およびレシピエント（ｎ＝２１）の雑種のブタを、ミスマッチ移植のために選択した。動物を、互いに目が届き声が聞こえる、３ｍ２程度の各檻に収容した。藁および木の削りくずを、寝床として使用した。１４：１０時間の明／暗スケジュール（０６：００時に点灯）を適用し、赤外線ランプ（２４時間）を各檻に与えた。温度は、１６～１８℃であった。動物に、成長促進剤（ＳＯＬＯ３３０、ラントマネン、スウェーデン）を含まない市販の仕上げ飼料を、１日２回、ＢＷに応じた量で、スウェーデン農業科学大学のブタ育成計画にしたがって与えた。水を、自由に与えた。ドナーブタを、０．１ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）ｖｅｔ、１ｍｇ／ｍＬ；オリオンファーマアニマルヘルス、ソーレントゥーナ、スウェーデン）、０．２ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でブトルファノール（Ｂｕｔｏｍｉｄｏｒ ｖｅｔ、１０ｍｇ／ｍＬ；サルファームスカンディナヴィア、ヘルシンボリ、スウェーデン）および５ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｏｌ（登録商標）ｖｅｔ、１００ｍｇ／ｍＬ；インターベットインターナショナルＢＶ、ボクスメール、オランダ）の組み合わせを筋肉内（ｉ．ｍ．）で用いて麻酔し、腎臓を、線形（１０ＭＨｚ）および曲線形（４ＭＨｚ）のプローブを使用して超音波（Ｌｏｇｉｑ ｅ Ｒ６、ＧＥヘルスケア、ウォーワトサ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）で調べて、腎嚢胞を有するブタを除外した。腎臓の長さ、エコー輝度および皮髄定義を評価し、腎盂領域を、腎盂拡張の証拠について評価し、カラードプラを使用して腎臓における血流の存在を評価した。２週間の順応期間中、ブタを、移植後に拘束なしで異なる試験を実行するために毎日扱い訓練した。
【0098】
移植モデル。麻酔を、０．０５ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でメデトミジン（Ｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）ｖｅｔ、１ｍｇ／ｍＬ；オリオンファーマアニマルヘルス、ソーレントゥーナ、スウェーデン）、ならびに５ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でチレタミンおよびゾラゼパム（Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）、５０ｍｇ＋５０ｍｇ／ｍＬ；ビルバック、リーディング、カロ、フランス）の組み合わせを用いてｉ．ｍ．で導入した。０．０１ｍｇ／ｋｇＢＷの用量でブプレノルフィン（Ｖｅｔｅｒｇｅｓｉｃ（登録商標）ｖｅｔ、０．３ｍｇ／ｍＬ；オリオンファーマアニマルヘルス、ソーレントゥーナ、スウェーデン）を筋肉内に、０．１ｍｇ／ｋｇの用量で硬膜外モルヒネ（Ｍｏｒｆｉｎ Ｅｐｉｄｕｒａｌ Ｍｅｄａ、２ｍｇ／ｍＬ；メーダ、ソルナ、スウェーデン）を術前に追加の鎮痛剤として与えた。プロカインベンジルペニシリン（Ｐｅｎｏｖｅｔ（登録商標）ｖｅｔ、３００ｍｇ／ｍＬ；ベーリンガーインゲルハイムベトメディカ、インゲルハイム・アム・ライン、ドイツ）を２０ｍｇ／ｋｇＢＷの用量で術前にｉ．ｍ．で与えた。麻酔導入後に、長期使用のための静脈カテーテル（Ｃａｒｅｆｌｏｗ（商標）、３Ｆｒ、２００ｍｍ、ＢＤ、フランクリンレイクス、ＮＪ、ＵＳＡ）をセルディンガーテクニックにより耳介静脈に挿入した。術後、カテーテルは、ストレスフリーの採血を促進した。１日１回、カテーテルにヘパリン添加生理食塩水１００ＩＥ／ｍＬ（ヘパリンＬＥＯ、５０００ＩＥ／ｍＬ；レオファーマ、バレルプ、デンマーク）を流した。麻酔を、酸素中に気化したイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標）ｖｅｔ；オリオンファーマアニマルヘルス、ソーレントゥーナ、スウェーデン）で維持した。ブタは、継続的に晶質液（Ｒｉｎｇｅｒ－ａｃｅｔａｔ；フレゼニウスカービ、バート・ホムブルク、ドイツ）を用いる輸液療法を受けた。コロイド（Ｇｅｌｏｆｕｓｉｎｅ（登録商標）４０ｍｇ／ｍＬ；ブラウン、メルズンゲン、ドイツ）およびドブタミン（ドブタミンカリノ、２５０ｍｇ／ｍＬ；カリノファルム、エルゼ、ドイツ）を、血圧を基準値内に維持するために必要な場合与えた。麻酔の間、呼吸および循環器系パラメータを監視した。
【0099】
ドナー手順。最初の一連の実験（３＋３のドナーおよび６＋５のレシピエント）において、両方の腎臓を調達し、ＨＴＫ灌流で同様に処置し（ｎ＝１１）、氷上で一晩維持し、その後、腎臓の一方を、挿入前にＰＥＧ－リン脂質で６０分間、無作為に処置し、一方で他方の腎臓を未処置のままにした。ＰＥＧ－リン脂質の交互投与を、ＰＥＧ－リン脂質を含むＨＴＫ灌流または標準のＨＴＫ灌流溶液のいずれかで処置した別の１０の腎臓（５のドナーおよび１０のレシピエント）に適用した。その手順後に、ドナーブタを、全身麻酔下でペントバルビタールナトリウム（Ａｌｌｆａｔａｌ ｖｅｔ、１００ｍｇ／ｍＬ；Ｏｍｎｉｄｅａ ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン）のｉ．ｖ注射により安楽死させた。
【0100】
移植手術。レシピエントブタは、同種間単一腎臓移植を受けた。すべての手順を１５～２０ｃｍの正中切開を通じて腹部内で実行し、右腸骨窩内の腸骨血管を確認し、穏やかに動かした。大静脈および腸骨動脈の末節（大動脈からのその出現から）を、周囲のリンパ節組織を封止して集めた。腎移植片をその後、腸骨血管の近傍で右腸骨窩に配置した。腎静脈および動脈を切り取り、続いて、ポリプロピレン製７／０連続縫合糸（ＰＲＯＬＥＮＥ（登録商標）、エチコン、Ｕ．Ｓ．）を使用してレシピエントの右腸骨窩および遠位大静脈に端側吻合の様式で吻合した。尿管を管膀胱外尿管膀胱吻合術によって６－０ポリジオキサノン縫合糸（ＰＤＳ（登録商標）、エチコン、ＵＳ）により膀胱の頂部に移植した。その後、元の腎臓の両側腎出除術を実行した。正中切開を、連続２／０ポリグラクチン（ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）エチコン、ＵＳ）帯状縫合糸および皮膚クリップにより閉じた。外科手術の平均期間は、３時間（２．５～５．５時間）であった。
【0101】
外科手術の終わりに向かって、イソフルラン投与を中断し、吸気酸素濃度を増加させ（ＦｉＯ２ １．０）、人工呼吸器を止めてブタに自発呼吸を回復させた。ブタを、職員により容易に連続的に監視できる、集約的ケアケージに入れた。酸素供給を行い、心拍数、呼吸数、酸素飽和度および体温を、ブタの意識が戻るまで観察した。１日目の間、ブタに果実を手で与え、必要であれば、水を飲むのを支援した。ブタが立って歩くことも支援し、ブタは中殿筋、大腿二頭筋および大殿筋に数回マッサージを受けた。術後痛覚脱失のため、ブプレノルフィンを２日間ｉ．ｖ．で投与した。
【0102】
安楽死および剖検。レシピエントを、９６時間後に過剰量のペントバルビタールナトリウム（Ａｌｌｆａｔａｌ ｖｅｔ、１００ｍｇ／ｍＬ；Ｏｍｎｉｄｅａ ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン）を用いて安楽死させた。組織学的検査のための腎生検を、死後検査直後に回収し、すべてのブタは、生体医科学獣医公衆衛生学科、病理部、ＳＬＵで死後検査を受けた。
【0103】
ＨＴＫ溶液の前処置。別の実験のセットにおいて、４頭のブタにＰＥＧ－リン脂質処置腎臓を移植し、５頭のブタに、対照腎臓を移植した。この実験のセットにおいて、調達後に、腎臓を、２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質を有する（処置された腎臓）か、ＰＥＧ－リン脂質を有しない（対照腎臓）ＨＴＫ（カストジオール；ケーラーケミーＧｍｂＨ、ドイツ）溶液で灌流した。腎臓をまた、４℃で２４時間２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質を有するＨＴＫ溶液（処置された腎臓）またはＰＥＧ－リン脂質を有しないＨＴＫ溶液（対照腎臓）に浸漬して貯蔵した。
【0104】
Ｃ．腎臓内皮からのＰＥＧ－リン脂質の分離の評価のための長期モデル
腎臓をドナーブタから調達し、上述したような２週間の順化および訓練の後レシピエントブタに移植した。腎臓を、挿入前６０分でＰＥＧ－リン脂質を受けた移植片と同じ手順を使用して処置した。内皮からの分離を測定するため、ＰＥＧ－リン脂質を蛍光標識した。同じ麻酔および外科手術プロトコルを使用したが、元の腎臓を、レシピエント中に残した（ｎ＝４）。ブタを、それぞれ１２時間、２４時間、４８時間および７２時間後に安楽死させた。すべてのブタで剖検を行い、生検を組織学および蛍光のモニタリングのために収集した。
腎臓をドナーブタから調達し、上述したような２週間の順化および訓練の後レシピエントブタに移植した。腎臓を、挿入前６０分でＰＥＧ－リン脂質を受けた移植片と同じ手順を使用して処置した。内皮からの分離を測定するため、ＰＥＧ－リン脂質を蛍光標識した。同じ麻酔および外科手術プロトコルを使用したが、元の腎臓を、レシピエント中に残した（ｎ＝４）。ブタを、それぞれ１２時間、２４時間、４８時間および７２時間後に安楽死させた。すべてのブタで剖検を行い、生検を組織学および蛍光のモニタリングのために収集した。
【0105】
採血
短期モデルにおいて、血液試料を、再灌流の開始後５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分および３６０分に左右の腎臓移植片静脈から得た。長期モデルにおいて、血液を、１時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間後に得た。試料をＥＤＴＡバキュテイナチューブ（ベクトン・ディッキンソンＡＢ、スウェーデン）に採取し、その直後、ＲＴで１５分間遠心分離した。収集した血漿を、さらなる分析のために－８０℃で貯蔵した。
短期モデルにおいて、血液試料を、再灌流の開始後５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、２４０分および３６０分に左右の腎臓移植片静脈から得た。長期モデルにおいて、血液を、１時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間後に得た。試料をＥＤＴＡバキュテイナチューブ（ベクトン・ディッキンソンＡＢ、スウェーデン）に採取し、その直後、ＲＴで１５分間遠心分離した。収集した血漿を、さらなる分析のために－８０℃で貯蔵した。
【0106】
ＴＡＴ、Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９のＥＩＡ
血漿中のＴＡＴ、Ｃ３ａ、およびｓＣ５ｂ－９を、以前説明した［７］ようにサンドイッチＥＩＡにより測定した。簡潔に言うと、ＴＡＴの評価のため、血漿試料を標準クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）血漿で１／１００に希釈した。抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体を捕捉のために使用し、ＨＲＰ結合抗ヒトアンチトロンビン抗体（ＡＴ）を検出のために使用した（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サウスベンド、ＩＮ、ＵＳＡ）。標準品を、プールしたヒト血清を標準ＣＰＤ血漿で希釈することにより調製した。値を、μｇ／Ｌで表した。Ｃ３ａの評価のため、血漿を作業緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で１／１０００に希釈した。抗ヒトＣ３ａ ｍＡｂ ４ＳＤ１７．１を、Ｃ３ａを捕捉するために使用し、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗Ｃ３ａ抗体、その後ＨＲＰ共役ストレプトアビジンを、血漿Ｃ３ａの検出のために使用した。精製Ｃ３ａに対して校正されたザイモサン活性化血清は、標準品として機能した。値を、ｎｇ／ｍＬで表した。ｓＣ５ｂ－９、血漿を作業緩衝液（上述）で１／５０に希釈した。ｓＣ５ｂ－９を、抗ヒトＣ５ｂ－９ ｍＡｂ（ａ９ｅ）により捕捉し、抗ヒトＣ５ポリクローナルウサギ抗体（Ｄａｋｏ）およびＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）により検出した。６×１０４ＡＵ／ｍＬを含むザイモサン活性化血清を、標準品として使用した。値を、ＡＵ／ｍＬで表した。
血漿中のＴＡＴ、Ｃ３ａ、およびｓＣ５ｂ－９を、以前説明した［７］ようにサンドイッチＥＩＡにより測定した。簡潔に言うと、ＴＡＴの評価のため、血漿試料を標準クエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）血漿で１／１００に希釈した。抗ヒトトロンビンモノクローナル抗体を捕捉のために使用し、ＨＲＰ結合抗ヒトアンチトロンビン抗体（ＡＴ）を検出のために使用した（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、サウスベンド、ＩＮ、ＵＳＡ）。標準品を、プールしたヒト血清を標準ＣＰＤ血漿で希釈することにより調製した。値を、μｇ／Ｌで表した。Ｃ３ａの評価のため、血漿を作業緩衝液（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で１／１０００に希釈した。抗ヒトＣ３ａ ｍＡｂ ４ＳＤ１７．１を、Ｃ３ａを捕捉するために使用し、ビオチン化ポリクローナルウサギ抗Ｃ３ａ抗体、その後ＨＲＰ共役ストレプトアビジンを、血漿Ｃ３ａの検出のために使用した。精製Ｃ３ａに対して校正されたザイモサン活性化血清は、標準品として機能した。値を、ｎｇ／ｍＬで表した。ｓＣ５ｂ－９、血漿を作業緩衝液（上述）で１／５０に希釈した。ｓＣ５ｂ－９を、抗ヒトＣ５ｂ－９ ｍＡｂ（ａ９ｅ）により捕捉し、抗ヒトＣ５ポリクローナルウサギ抗体（Ｄａｋｏ）およびＨＲＰ共役抗ウサギＩｇＧ（Ｄａｋｏ）により検出した。６×１０４ＡＵ／ｍＬを含むザイモサン活性化血清を、標準品として使用した。値を、ＡＵ／ｍＬで表した。
【0107】
組織学的解析
腎臓組織生検を、対照およびビオチン－ＰＥＧ－リン脂質処置腎臓から再灌流後５分、６０分および３６０分で採取した。ＰＥＧ－リン脂質の検出のため、生検を液体窒素中ですぐに凍結し、さらなる分析まで－８０℃で貯蔵した。ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質で処置した腎臓の凍結した断片（４μｍ厚）を、ＲＴで１０分間Ａｌｅｘａ４８８－ストレプトアビジン（ＧＥヘルスケア、１：５００）中にてインキュベートした。その断片を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ５１０、ＭＥＴＡ、カール・ツァイス、ドイツ）により分析した。ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質およびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（５ｋＤａ、４０ｋＤａ）の両方を評価した。
腎臓組織生検を、対照およびビオチン－ＰＥＧ－リン脂質処置腎臓から再灌流後５分、６０分および３６０分で採取した。ＰＥＧ－リン脂質の検出のため、生検を液体窒素中ですぐに凍結し、さらなる分析まで－８０℃で貯蔵した。ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質で処置した腎臓の凍結した断片（４μｍ厚）を、ＲＴで１０分間Ａｌｅｘａ４８８－ストレプトアビジン（ＧＥヘルスケア、１：５００）中にてインキュベートした。その断片を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ５１０、ＭＥＴＡ、カール・ツァイス、ドイツ）により分析した。ビオチン－ＰＥＧ－リン脂質およびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（５ｋＤａ、４０ｋＤａ）の両方を評価した。
【0108】
組織試料をまた、４％パラホルムアルデヒド溶液中で一晩固定し、パラフィンに埋め込まれるまで７０％エタノール中で貯蔵した。パラフィン断片（５μｍ厚）をキシレン中で脱脂し、エタノールで再水和した。熱誘導抗原賦活を、クエン酸ナトリウム緩衝液中で２回、断片を沸騰させることにより実行した。一次抗体のインキュベーション前にヤギ血清でブロックした。スライスされた断片を、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ染色）、ならびにＣ５ａＲ（Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ヘルフォルト、ドイツ）、Ｃ３ｂ（Ｂｉｏｓｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ウォーバン、ＭＡ、ＵＳＡ）、Ｃ４ｄ（アブカム、ケンブリッジ、ＵＫ）およびＣ５ｂ－９（ＭＡＣ；アブカム）などの補体マーカーのための抗体で染色した。対照実験として、ＩｇＧウサギ（Ｄａｋｏ、グロストルプ、デンマーク）およびＩｇＧマウス（アブカム）を使用した。一次抗体検出を、Ｄａｋｏ ｒｅａｌ検出システムアルカリホスファターゼレッド（Ｄａｋｏ）で実行し、続いてヘマトキシリンで対比染色した。スライドを、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｉｍａｇｅｒ Ａ１顕微鏡を使用して可視化した。レンズは対物が１０×であり、評価した視野は、８００，０００μｍ２であった。正方形領域を、Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏ（ｒｅｌ．４．８）ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、イェーナ、ドイツ）を使用して免疫反応領域の強度および面積について定量した。結果を、平均濃度測定合計赤として表す。組織学的解析を、尿細管拡張および壊死、糸球体障害および空胞変性の検出のため、試料に対する病理学者の二重盲検により実行した。
【0109】
統計解析
結果を、平均±ＳＥＭとして表す。データプロットおよび統計解析を、マッキントッシュソフトウェアのためのＰｒｉｓｍバージョン６（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実行した。２群の平均間の差をウィルコクソンの対応あり検定を使用して統計的に評価し、一方で２つより多い群間の統計的有意性を、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡに続く事後解析ボンフェローニ評価により分析した。群間の比較を、ｐ＜０．０５の場合、有意であるとみなすが、それを超える値は、有意でない（ｎｓ）とみなした。
結果を、平均±ＳＥＭとして表す。データプロットおよび統計解析を、マッキントッシュソフトウェアのためのＰｒｉｓｍバージョン６（Ｇｒａｐｈｐａｄ、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して実行した。２群の平均間の差をウィルコクソンの対応あり検定を使用して統計的に評価し、一方で２つより多い群間の統計的有意性を、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡに続く事後解析ボンフェローニ評価により分析した。群間の比較を、ｐ＜０．０５の場合、有意であるとみなすが、それを超える値は、有意でない（ｎｓ）とみなした。
【0110】
結果
種々のＰＥＧ－リン脂質製剤の機能特性の比較
ｈＭＳＣを各種のＰＥＧ－リン脂質製剤で処置した。ｈＭＳＣの生存率は、ＰＥＧ－リン脂質単独（９７．３％）、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質（９８．３％）およびビオチン標識ＰＥＧ－リン脂質（９７％）での表面修飾後でも変わらず、ＰＥＧ－リン脂質が生存率に影響しないことを示唆した。
種々のＰＥＧ－リン脂質製剤の機能特性の比較
ｈＭＳＣを各種のＰＥＧ－リン脂質製剤で処置した。ｈＭＳＣの生存率は、ＰＥＧ－リン脂質単独（９７．３％）、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質（９８．３％）およびビオチン標識ＰＥＧ－リン脂質（９７％）での表面修飾後でも変わらず、ＰＥＧ－リン脂質が生存率に影響しないことを示唆した。
【0111】
異なる長さのＰＥＧサブユニットを有するＰＥＧ－リン脂質の保持を、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ浮遊細胞を使用して試験した。細胞を、ＦＩＴＣと共役した１ｋＤａ、５ｋＤａおよび４０ｋＤａのＰＥＧサブユニットを有するＰＥＧ－リン脂質でコートした。細胞を３７℃でインキュベートし、結合をフローサイトメトリーで監視した。全製剤の結合が、２４時間後に９０％失われたが、５ｋＤａ製剤が最も長い時間保持されたものであったことが示された（図１３）。
【0112】
ＴＡＴレベルは、未コート細胞と比較してＰＥＧ－リン脂質コートされた細胞が全血に曝露される場合に有意に低下した。ＴＡＴ生成におけるこの減少は、ＰＥＧ－リン脂質コーティングがない対照（１１０±７．６）と比較した場合、ＰＥＧ－リン脂質単独（６１．５±２．９対１１０±７．６）、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質（６０．１±２．７）またはビオチン標識ＰＥＧ－リン脂質（６１．４±５．１）のいずれかでコートされた細胞と類似であった（図２Ａ）。
【0113】
類似の傾向が、コートされた細胞および未コート細胞を全血に曝露した場合、補体活性化マーカーについて観察された。血液曝露後６０分で、Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９の血漿中濃度は、細胞がＰＥＧ－リン脂質（５０．８±３．２、３７．７±１．５）、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質（５１．３±３．８、３５．０±２．１）、およびビオチン標識ＰＥＧ－リン脂質（４９．８±４．１、３８．３±２．０）でコートされた場合、未コートグ細胞（１０４±７．７、１０４±６．２）と比較して有意に低下した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【0114】
ＰＥＧ－リン脂質で処置したブタ腎臓におけるＦＩＴＣ標識リン脂質の分布
同種腎臓を、材料および方法において説明したように一括でレシピエント（ｎ＝６）に移植した。レシピエントにおける再灌流後の腎臓組織におけるＰＥＧ－リン脂質の分布を、５分、６０分および３６０分で採取した生検で分析した。図４に示すように、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質からの再灌流前の蛍光は、腎臓全体の尿細管周囲血管、糸球体および尿細管に均一に分布し、腎臓組織が、大動脈基部を通るＰＥＧ－リン脂質溶液の注射を介してＰＥＧ－リン脂質で均等に修飾されたことを反映した。対照的に、対照腎臓組織には蛍光がなく、試験腎臓と対照腎臓の間で顕著な漏出がなかったことを示唆した。
同種腎臓を、材料および方法において説明したように一括でレシピエント（ｎ＝６）に移植した。レシピエントにおける再灌流後の腎臓組織におけるＰＥＧ－リン脂質の分布を、５分、６０分および３６０分で採取した生検で分析した。図４に示すように、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質からの再灌流前の蛍光は、腎臓全体の尿細管周囲血管、糸球体および尿細管に均一に分布し、腎臓組織が、大動脈基部を通るＰＥＧ－リン脂質溶液の注射を介してＰＥＧ－リン脂質で均等に修飾されたことを反映した。対照的に、対照腎臓組織には蛍光がなく、試験腎臓と対照腎臓の間で顕著な漏出がなかったことを示唆した。
【0115】
５分、６０分および３６０分での腎臓組織を比較した場合、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓組織における特に糸球体、また尿細管周囲血管および尿細管の蛍光は、時間の経過とともに徐々に低下し、３６０分で管に結合したＰＥＧ－リン脂質が依然としていくらかあるにも関わらず、ＰＥＧ－リン脂質が細胞から分離したことを示唆した。
【0116】
分離の評価の長期研究（Ｃ．腎臓内皮からのＰＥＧ－リン脂質の分離の評価のための長期モデル）において、２４時間後には僅かな蛍光しか見られず、４８時間後には蛍光が観察されず、全ＰＥＧ－リン脂質が分離されたことを示す。エクスビボＦＩＴＣ標識ＰＥＧ－リン脂質はまた、心臓血管の内皮に結合した。
【0117】
Ａ．短期同種間移植モデル
移植された腎臓の免疫組織学的解析
移植された腎臓を、アルブミン漏出、補体沈着および受容体発現（Ｃ３ａ、ｓＣ５ｂ－９、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｂ；図５Ａ～図５Ｄ）について免疫組織学により分析した。組織学的評価は、対照腎臓と比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓においてＣ３ｂ／ｉＣ３ｂおよびＣ５ｂ－９などの補体活性化マーカーの沈着の量ならびに補体受容体Ｃ５ａＲの発現が少ないことを明らかにした。灌流後のＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓において５分でＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ沈着における有意な低減があった。アルブミンまたは酸化ストレスマーカーＨＯ－１、ｉＮＯＳおよびニトロチロシンについて、それらのマーカーが対照腎臓と比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓においてより低いという傾向（ｎｓ）があった。したがって、組織学的ランク付けからの結果は、ＰＥＧ－リン脂質による腎臓移植片の表面処置が補体活性化に対して保護すること、および酸化ストレスを抑制する傾向があることを支持する。
移植された腎臓の免疫組織学的解析
移植された腎臓を、アルブミン漏出、補体沈着および受容体発現（Ｃ３ａ、ｓＣ５ｂ－９、Ｃ４ｄ、Ｃ３ｂ；図５Ａ～図５Ｄ）について免疫組織学により分析した。組織学的評価は、対照腎臓と比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓においてＣ３ｂ／ｉＣ３ｂおよびＣ５ｂ－９などの補体活性化マーカーの沈着の量ならびに補体受容体Ｃ５ａＲの発現が少ないことを明らかにした。灌流後のＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓において５分でＣ３ｂ／ｉＣ３ｂ沈着における有意な低減があった。アルブミンまたは酸化ストレスマーカーＨＯ－１、ｉＮＯＳおよびニトロチロシンについて、それらのマーカーが対照腎臓と比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓においてより低いという傾向（ｎｓ）があった。したがって、組織学的ランク付けからの結果は、ＰＥＧ－リン脂質による腎臓移植片の表面処置が補体活性化に対して保護すること、および酸化ストレスを抑制する傾向があることを支持する。
【0118】
凝固および補体活性化
短期ブタ一括同種間移植モデルにおける腎臓の再灌流後の血管自然免疫系に対するＰＥＧ－リン脂質処置の影響を評価するため、血液中の凝固活性化（ＴＡＴ、図６Ａ）および補体活性化マーカー（Ｃ３ａ、ｓＣ５ｂ－９、図５Ａおよび図５Ｂ）を分析した。ＴＡＴ量は、対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントの血液中でより低かった。ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓対未コート対照でのＴＡＴ量における有意な低減は、５分（４６．１±５．２対７３±１２．３、ｐ：０．０１）、１５分（４８±８．４対７３±９、ｐ：０．０２）、３０分（４１±９．１対５７±４．９、ｎｓ）、６０分（３２±４．８対５８±３．７、ｐ：０．０２）、および１２０分（２８．６±５．１対５３±４、ｐ：０．０２）で観察されたが、再灌流後の２４０分後（３２±４対４９±６．１、ｎｓ）および３６０分後（２９±９対４１±１４、ｎｓ）では観察されなかった。これらの結果は、凝固活性化が、腎臓移植後、表面修飾により有意に抑制されたことを示唆した。
短期ブタ一括同種間移植モデルにおける腎臓の再灌流後の血管自然免疫系に対するＰＥＧ－リン脂質処置の影響を評価するため、血液中の凝固活性化（ＴＡＴ、図６Ａ）および補体活性化マーカー（Ｃ３ａ、ｓＣ５ｂ－９、図５Ａおよび図５Ｂ）を分析した。ＴＡＴ量は、対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントの血液中でより低かった。ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓対未コート対照でのＴＡＴ量における有意な低減は、５分（４６．１±５．２対７３±１２．３、ｐ：０．０１）、１５分（４８±８．４対７３±９、ｐ：０．０２）、３０分（４１±９．１対５７±４．９、ｎｓ）、６０分（３２±４．８対５８±３．７、ｐ：０．０２）、および１２０分（２８．６±５．１対５３±４、ｐ：０．０２）で観察されたが、再灌流後の２４０分後（３２±４対４９±６．１、ｎｓ）および３６０分後（２９±９対４１±１４、ｎｓ）では観察されなかった。これらの結果は、凝固活性化が、腎臓移植後、表面修飾により有意に抑制されたことを示唆した。
【0119】
類似の結果が補体マーカー（Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９）について観察された。対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を移植したレシピエントの血液中でのＣ３ａ量における有意な低減が、５分後（４０±２．８対６３．６±５．４、ｐ：０．０３）、１５分後（３９±４対６１±７．２、ｐ：０．０４）、６０分後（４１±５．２対６８±５．１、ｐ：０．０１）、１２０分後（４４±６．１対６７±３．１、ｐ：０．０３）、２４０分後（４５±１２対９３±３、ｐ＜０．０００１）および３６０分後（４５±１２対８０±１６、ｐ＜０．００１）にあったが、再灌流後の３０分（３９±５．８対５４±５．９、ｎｓ）ではなかった。加えて、ｓＣ５ｂ－９量における有意な低減も対照レシピエントと比較して観察された。処置された腎臓からの試料中のｓＣ５ｂ－９の生成は、対照と比較して５分後を除いてすべての時点で低減された。処置されたおよび対照の腎臓の再灌流後５分でのｓＣ５ｂ－９の血漿中濃度は、（１６±６対３１±５、ｐ：０．２）、１５分後（１５±３対４５±１１、ｐ：０．０１）、３０分後（１６±４対４５±３、ｐ：０．０１）、６０分後（２５±７対５４±４、ｐ：０．０１）、１２０分後（３６±１２対６４±９、ｐ：０．０１）、２４０分後（４５±１１対７５±１１、ｐ：０．０１）、および３６０分後（４４±１４対７９±１１、ｐ＝０．００８）であった。したがって、これらの結果は、ＰＥＧ－リン脂質を用いて内皮をコートすることにより、補体活性化が有意に抑制されたことを示した。
【0120】
腎機能
腎機能を、ＰＥＧ－リン脂質処置ありおよびなしの腎臓移植後の利尿を評価することにより分析した（図１０Ａ）。再灌流後３６０分で対照レシピエントと比較して、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントからの全尿生産において有意な増加があった（４８．３±２２．２ｍＬ対３３．５±１８．２ｍＬ、ｐ＜０．０５）。しかし、レシピエントの腎臓が除去されなかったので、利尿時間または血清クレアチニンの濃度に関して群間に有意差はなかった。
腎機能を、ＰＥＧ－リン脂質処置ありおよびなしの腎臓移植後の利尿を評価することにより分析した（図１０Ａ）。再灌流後３６０分で対照レシピエントと比較して、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントからの全尿生産において有意な増加があった（４８．３±２２．２ｍＬ対３３．５±１８．２ｍＬ、ｐ＜０．０５）。しかし、レシピエントの腎臓が除去されなかったので、利尿時間または血清クレアチニンの濃度に関して群間に有意差はなかった。
【0121】
Ｂ．長期同種間移植モデル
凝固および補体活性化
長期ブタ同種間移植モデルにおいて腎臓の再灌流後の血管自然免疫系に対するＰＥＧ－リン脂質処置の影響を評価するため、血液中の補体活性化マーカー（Ｃ３ａ、ｓＣ５ｂ－９、図８Ａおよび図８Ｂ）および凝固活性化（ＴＡＴ、図８Ｃ）を分析した。ＴＡＴ量は、対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントの血液中でより低かった。ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓対コートされない対照におけるＴＡＴ量の有意な低減は、２４時間（３７２±１２３対１３７±２１、ｐ＜０．０５）、４８時間（３６５±８２対１５２±１７、ｐ＜０．０５）、７２時間（４６７±９６対１３５±１８、ｐ＜０．００１）、および９６（４２８．６±１１１対１６８±２３、ｐ＜０．０１）で観察されたが、再灌流後の１時間後（３７８±８２対１７６±２４、ｎｓ）では観察されなかった。これらの結果は、凝固活性化が腎臓移植後の表面修飾により有意に抑制されたことを示唆した。
凝固および補体活性化
長期ブタ同種間移植モデルにおいて腎臓の再灌流後の血管自然免疫系に対するＰＥＧ－リン脂質処置の影響を評価するため、血液中の補体活性化マーカー（Ｃ３ａ、ｓＣ５ｂ－９、図８Ａおよび図８Ｂ）および凝固活性化（ＴＡＴ、図８Ｃ）を分析した。ＴＡＴ量は、対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントの血液中でより低かった。ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓対コートされない対照におけるＴＡＴ量の有意な低減は、２４時間（３７２±１２３対１３７±２１、ｐ＜０．０５）、４８時間（３６５±８２対１５２±１７、ｐ＜０．０５）、７２時間（４６７±９６対１３５±１８、ｐ＜０．００１）、および９６（４２８．６±１１１対１６８±２３、ｐ＜０．０１）で観察されたが、再灌流後の１時間後（３７８±８２対１７６±２４、ｎｓ）では観察されなかった。これらの結果は、凝固活性化が腎臓移植後の表面修飾により有意に抑制されたことを示唆した。
【0122】
類似の結果が補体マーカー（Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９）について観察された。対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を移植されたレシピエントの血液中でのＣ３ａ量における有意な低減が、４８時間後（１１９±４０対６７±９、ｐ＜０．００１）、７２時間後（９５±１３対６３±１０、ｐ＜０．０１）にはあったが、再灌流後の１時間後（６８±１１対５４±４、ｎｓ）、２４時間分後（１２８±５４対６３±１８、ｎｓ）または９６時間後（１０３±２１対７４±８、ｎｓ）にはなかった。加えて、ｓＣ５ｂ－９量における有意な低減もまた、対照レシピエントと比較して観察された。処置された腎臓からの試料中のｓＣ５ｂ－９の生成は、対照と比較して、５分後を除いてすべての時点で低減された。処置された腎臓および対照腎臓の再灌流後５分でのｓＣ５ｂ－９の血漿中濃度は、２４時間分（７３±２９対３３±１６、ｐ＜０．０５）、４８時間（９４±３３対３３±１１、ｐ＜０．００１）、７２時間（１２６±４６対４１±１８、ｐ＜０．０００１）、および９６（１０８±２３対５１±１１、ｐ＜０．０１）であったが、１時間後（６３±１１対３３±１６、ｎｓ）ではなかった。したがって、これらの結果は、補体活性化がＰＥＧ－リン脂質で内皮をコートすることにより有意に抑制されたことを示した。
【0123】
炎症性サイトカイン
長期同種間腎臓移植におけるサイトカイン／ケモカインの濃度を評価した。マルチプレックスアッセイを使用して、ＩＮＦγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、およびＴＮＦの血漿中の濃度を評価した。図９Ａ～図９Ｌを参照のこと。ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８およびＴＮＦの量は、４日後に、ＰＥＧ－脂質処置された腎臓を移植された動物において有意に低かった。
長期同種間腎臓移植におけるサイトカイン／ケモカインの濃度を評価した。マルチプレックスアッセイを使用して、ＩＮＦγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－１α、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、およびＴＮＦの血漿中の濃度を評価した。図９Ａ～図９Ｌを参照のこと。ＩＬ－１β、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８およびＴＮＦの量は、４日後に、ＰＥＧ－脂質処置された腎臓を移植された動物において有意に低かった。
【0124】
腎機能
すべての動物は、移植後順調に回復し、２４時間以内に食事を開始した。尿生産を、超音波検査で確認し、尿がすべてのブタにおいて７２時間以内に膀胱で検出された。腎機能を、ＰＥＧ－リン脂質処置ありおよびなしで腎臓移植後のクレアチン量を評価することにより分析した（図１０Ｂ）。全４日の期間にわたり対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントにおいて有意に低い量があった。
すべての動物は、移植後順調に回復し、２４時間以内に食事を開始した。尿生産を、超音波検査で確認し、尿がすべてのブタにおいて７２時間以内に膀胱で検出された。腎機能を、ＰＥＧ－リン脂質処置ありおよびなしで腎臓移植後のクレアチン量を評価することにより分析した（図１０Ｂ）。全４日の期間にわたり対照レシピエントと比較してＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を有するレシピエントにおいて有意に低い量があった。
【0125】
剖検
腎臓移植に関連する変化以外の疾患の兆候は観察されなかった。死後検査を、病理部門、ＳＬＵ、ウプサラで実行した。
腎臓移植に関連する変化以外の疾患の兆候は観察されなかった。死後検査を、病理部門、ＳＬＵ、ウプサラで実行した。
【0126】
灌流後症候群
我々の長期生存ブタ研究において、ＰＥＧ－リン脂質処置腎臓を移植された動物は、再灌流後の心拍数および動脈血圧の変化が最小であったか、変化がなかったことが示された。したがって、ＰＥＧ－リン脂質生成物はまた、接触系の活性化および最終的にＰＲＳを予防した。図１１を参照のこと。
我々の長期生存ブタ研究において、ＰＥＧ－リン脂質処置腎臓を移植された動物は、再灌流後の心拍数および動脈血圧の変化が最小であったか、変化がなかったことが示された。したがって、ＰＥＧ－リン脂質生成物はまた、接触系の活性化および最終的にＰＲＳを予防した。図１１を参照のこと。
【0127】
ＨＴＫ溶液の前処置
図１６Ａおよび図１６Ｂは、４℃でＰＥＧ－リン脂質追加ＨＴＫ溶液中２４時間のブタ腎臓のインキュベーションの評価の結果を示す。ＴＡＴ値を図１６Ａに示し、血漿クレアチニン値を図１６Ｂに示す。ＨＴＫ溶液のみおよびＰＥＧ－リン脂質処置なしの対照と比較して、ＰＥＧ－リン脂質が追加されたＨＴＫ溶液中にブタ腎臓を維持すると、有意な改善があった。処置ブタ腎臓において見られる低血漿クレアチニン濃度は、追加の免疫抑制がなくても得られた。
図１６Ａおよび図１６Ｂは、４℃でＰＥＧ－リン脂質追加ＨＴＫ溶液中２４時間のブタ腎臓のインキュベーションの評価の結果を示す。ＴＡＴ値を図１６Ａに示し、血漿クレアチニン値を図１６Ｂに示す。ＨＴＫ溶液のみおよびＰＥＧ－リン脂質処置なしの対照と比較して、ＰＥＧ－リン脂質が追加されたＨＴＫ溶液中にブタ腎臓を維持すると、有意な改善があった。処置ブタ腎臓において見られる低血漿クレアチニン濃度は、追加の免疫抑制がなくても得られた。
【0128】
臓器貯蔵
＋４℃での移植片の長期にわたる貯蔵と組み合わせてＰＥＧ－脂質を灌流液に溶解した場合、再灌流時、ＰＥＧ－脂質処置された腎臓においてカスケード系活性化（図１７Ａ～図１７Ｄ）およびサイトカインの発現量（図１８Ａ～図１８Ｇ）が有意に低かった。
＋４℃での移植片の長期にわたる貯蔵と組み合わせてＰＥＧ－脂質を灌流液に溶解した場合、再灌流時、ＰＥＧ－脂質処置された腎臓においてカスケード系活性化（図１７Ａ～図１７Ｄ）およびサイトカインの発現量（図１８Ａ～図１８Ｇ）が有意に低かった。
【0129】
ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質の組織学的分析
図１９は、対照と一緒に、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（５ｋＤａ）およびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（４０ｋＤａ）で処置された腎臓からの生検の共焦点顕微鏡画像を示す。これらの画像はしたがって、４つの異なるブタからの腎臓へのＰＥＧ－脂質のエクスビボ注入後の５ｋＤａのＰＥＧ－脂質および４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質の取り込みを示し、ここで１つの腎臓を、５ｋＤａのＰＥＧ－脂質に使用し、残りを、４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質に使用した。図１９に示すように、５ｋＤａのＰＥＧ－脂質は、４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質と比較して、より効果的に腎臓の柔組織に浸透した。したがって、４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質分子は、５ｋＤａのＰＥＧ－脂質分子ほど効果的にネフロンの糸球体を通して濾過されなかった。
図１９は、対照と一緒に、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（５ｋＤａ）およびＦＩＴＣ－ＰＥＧ－リン脂質（４０ｋＤａ）で処置された腎臓からの生検の共焦点顕微鏡画像を示す。これらの画像はしたがって、４つの異なるブタからの腎臓へのＰＥＧ－脂質のエクスビボ注入後の５ｋＤａのＰＥＧ－脂質および４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質の取り込みを示し、ここで１つの腎臓を、５ｋＤａのＰＥＧ－脂質に使用し、残りを、４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質に使用した。図１９に示すように、５ｋＤａのＰＥＧ－脂質は、４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質と比較して、より効果的に腎臓の柔組織に浸透した。したがって、４０ｋＤａのＰＥＧ－脂質分子は、５ｋＤａのＰＥＧ－脂質分子ほど効果的にネフロンの糸球体を通して濾過されなかった。
【0130】
考察
多くの疾患および病的状態において、虚血は、病理変化を誘導する。原則として、４種のメカニズムが、組織に虚血を誘導する、つまり、血栓症、移植、動脈のクランピングが、臓器および敗血症をもたらす。ＩＲＩは、臓器移植中の回避不可能なイベントであるが、それはまた脳死、敗血症、心臓手術などの幅広い他の臨床的に関連のある状況でならびに脅迫的な心筋梗塞または脳卒中における虚血領域の再灌流後にも生じる。本実験において、我々は、短期および長期の両方のブタ同種間移植モデルにおける移植の前の、ＰＥＧ－リン脂質構築物での内膜および尿細管システムのコーティングが、インビボでＧＸＣを機能的に置き換えかつ初期Ｉ／Ｒ損傷応答を強く軽減することを示す。
多くの疾患および病的状態において、虚血は、病理変化を誘導する。原則として、４種のメカニズムが、組織に虚血を誘導する、つまり、血栓症、移植、動脈のクランピングが、臓器および敗血症をもたらす。ＩＲＩは、臓器移植中の回避不可能なイベントであるが、それはまた脳死、敗血症、心臓手術などの幅広い他の臨床的に関連のある状況でならびに脅迫的な心筋梗塞または脳卒中における虚血領域の再灌流後にも生じる。本実験において、我々は、短期および長期の両方のブタ同種間移植モデルにおける移植の前の、ＰＥＧ－リン脂質構築物での内膜および尿細管システムのコーティングが、インビボでＧＸＣを機能的に置き換えかつ初期Ｉ／Ｒ損傷応答を強く軽減することを示す。
【0131】
移植される腎臓は、ドナー中での期間～実際の移植イベントの種々の段階で虚血損傷に曝露される。死後ドナーは臓器提供の主な提供者としての役割を果たすので、死後ドナーにおける循環の血行動態の不安定性は、虚血の主な原因の１つである。温虚血は、死後ドナーからの臓器調達中に経験され、冷虚血損傷は、より低い温度で臓器保存中に生じる。レシピエントにおける臓器の再灌流は、Ｉ／Ｒ損傷を完了させる。
【0132】
これらの問題を克服するため、我々は、腎臓移植における自然免疫攻撃からの局所保護の新規方法を提示する。腎臓内皮および腎尿細管を、細胞脂質二重膜との疎水的相互作用によりＰＥＧ－リン脂質でコートし、それによりＧＸＣ層を置き換えた。ＰＥＧ鎖は、不活性であり、高い生体適合性を提供する。したがって、ＰＥＧ－リン脂質は単独で、内皮および尿細管細胞膜を遮蔽することにより、およびタンパク質が腎臓の内皮細胞表面に到達し活性化するのを妨害することにより、Ｉ／Ｒ損傷に対して保護する。
【0133】
レシピエントにおいてＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓は、ＴＡＴ、ＦＸＩＩａ、ＴＦ、Ｃ３ａおよびｓＣ５ｂ－９の低下した血漿中濃度、ならびに腎臓移植片の内皮表面上へのＣ３ｂの沈着に反映されるように、低い免疫活性化を示した。このことは、脂質二重膜から突き出るＰＥＧ鎖が、補体活性化を阻害でき、かつレシピエントからの新鮮な血液の再灌流後に補体成分の沈着から細胞膜を保護できることを示した。それはまた、凝固活性化の抑制をもたらした。補体および凝固活性化は、Ｉ／Ｒの特性であり、補体マーカーの低下した量は、拒絶をもたらすＩ／Ｒ損傷に対する遮蔽効果の概念を確証する。
【0134】
短期研究において、移植を、腎機能および局所的な血液適合性の評価のために、最大６時間追跡した。ＰＥＧ－リン脂質懸濁液が、２つの腎臓移植片の一般的な大動脈部分を介して注射された場合、糸球体を含む試験腎臓全体の組織は、ＰＥＧ－リン脂質で等しくコートされた（図４Ｂ、図４Ｄ、図４Ｆ）。腎臓移植片の肉眼形態は、変化せず、腎臓移植片のＰＥＧ－リン脂質での処置が、細胞生存率に対して有害作用がないことを示唆した。また、全尿生産を対照腎臓およびＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓の間で比較した場合、利尿の有意な改善が試験腎臓で観察された。これらの結果は、腎臓内皮が自然免疫攻撃から保護されただけでなく、糸球体がＰＥＧ－リン脂質でコートされたにも関わらず、腎機能が充分に保存されたことを示唆する。生存および非生存の腎臓の間をエクスビボで識別するためのツールとしての虚血損傷後の形態学的変化および腎機能の間の確立された関連を考慮すると、我々の短期観察研究は、腎機能に対するあらゆる有害作用なしにＩ／Ｒ攻撃を軽減するためのＰＥＧ－リン脂質コーティングの有効性を示す。
【0135】
結合が疎水的相互作用により介在されるので、ＰＥＧ－リン脂質の効果は、細胞表面に限定される。腎臓に結合したＰＥＧ－リン脂質の蛍光の監視から、短期および長期モデルの両方において、観察期間中に強度における低下があったことが示され、ＰＥＧ－リン脂質が内皮から分離したことを示唆した。蛍光は、糸球体から尿細管系に移動し、最終的に移植後６時間で尿細管細胞の基部に到達するように見えた。蛍光は、観察期間中、尿中に認められ、これはＰＥＧ－リン脂質分子が腎臓により代謝されたことを支持する。長期研究において、かなりの蛍光が、再灌流後１２～２４時間まで検出され、４８時間後に完全に失われた。初期にはＰＥＧ－リン脂質の過剰飽和があり、これは容易に洗い流され、および内皮細胞の実際の保護が、僅かな蛍光のみを与える分子により実行される可能性がある。これは、血液中のＴＡＴ、Ｃ３ａ、およびｓＣ５ｂ－９の量ならびに腎臓移植片中のＣ３ｂ沈着における有意な差により示唆されるように、自然免疫攻撃に対する保護効果と組み合わせて、移植後の６時間後の短期研究における比較的低いＰＥＧ－リン脂質蛍光により確証される。これはまた、内皮表面に挿入されたＰＥＧ－リン脂質のより低い密度が観察されたにも関わらず７２時間までの長期研究において有効性が維持されたことによっても支持される。そのため、ＰＥＧ－リン脂質の長期安定性は、充分である。
【0136】
この短期研究は、血栓炎症を直接抑制することによりＩ／Ｒ損傷イベントを軽減するソリティアＰＥＧ－リン脂質コーティングの有効性の概念実証を提供する。ＰＥＧ－リン脂質は、細胞に結合した自然免疫の調節因子のためのリンクおよびスペーサとして機能するように開発された。官能化ＰＥＧ－リン脂質分子は、補体活性化、接触系活性化および血小板の活性化などの種々の自然免疫および血栓反応を軽減するのに非常に効果的である。例えば、因子Ｈに親和性を有するペプチドは、補体活性化を阻害し、アピラーゼは、血小板活性化に関連する血栓反応を低減できる。これらの２つの調節因子の組み合わせは、ブタ大動脈内皮細胞が全血インビボシステムにおいてヒト血液と接触するようになる場合、異種システムにおいて誘発される血栓炎症を全体的に阻害できる。ＰＥＧ－リン脂質単独による大きな影響を考慮すると、ＰＥＧ－リン脂質への調節因子の添加は、同種間腎臓移植においてＩ／Ｒ損傷を阻害することに関して構築物をさらに改善する。
【0137】
自然免疫の一部である接触系の活性化は、再灌流後の心血管障害および血行動態の不安定性などの深刻な術中合併症を引き起こす可能性がある。再灌流後症候群（ＰＲＳ）として以前に説明されているこの現象は、肝臓移植片の再灌流後に重度の血行動態の不安定性を経験した肝臓移植レシピエントにおいて最初に観察された。しかし、この現象はまた、再灌流後の瞬間的な血行動態の不安定性に頻繁に悩まされている腎臓および膵臓移植レシピエントにおいても観察される。ＰＲＳの間に、血漿タンパク質因子ＸＩＩ、プレカリクレインおよび高分子量キニノーゲンが活性化され、凝固カスケードの開始および血行動態の不安定性を引き起こす非常に強力な血管拡張剤であるブラジキニンの生産をもたらす。したがって、全身動脈圧の急速な低下は、移植片灌流障害および移植片の温虚血の延長をもたらす。これらの患者は、臓器移植後臓器機能障害、拒絶の増加した危険性および早期の移植片機能損失に悩まされる可能性がある。健康な個体において、増加した心拍数は、血圧における低下を部分的に補うことができる。
【0138】
我々の長期生存ブタ研究において、ＰＥＧ－リン脂質処置された腎臓を移植された動物は、再灌流後に心拍数および動脈血圧の変化が最小であったか、変化がなかったことが示された。したがって、ＰＥＧ－リン脂質生成物はまた、接触系の活性化および最終的にＰＲＳを予防した。
【0139】
異なる長期実験間の差は、前者の実験における移植片が、灌流液に浸漬されることなく＋４℃で２４時間、冷蔵庫で貯蔵されたこと、ならびにＰＥＧ－リン脂質が腎臓の移植前４０分に血管系に灌流により投与されたことであった。後者の実験において、移植片は、調達後すぐにＰＥＧ－リン脂質で灌流され、その後移植および再灌流まで＋４℃で２４時間、灌流液に溶解したＰＥＧ－リン脂質中に浸漬された。すでに最初の研究において、ＰＥＧ－リン脂質処置された動物において有意に低いカスケード系活性化（図８Ａ～図８Ｃ）およびサイトカイン発現（図９Ａ～図９Ｌ）があった。しかし、第２の研究において、カスケード系活性化（図１７Ａ～図１７Ｄ）およびサイトカイン発現（図１８Ａ～図１８Ｇ）は、最初の研究と比較してさらに低く、加えて、ＰＥＧ－リン脂質処置は、カスケード系活性化（図１７Ａ～図１７Ｄ）およびサイトカイン発現（図１８Ａ～１８Ｇ）の有意な低減をもたらした。したがって、本実験は、灌流液およびＰＥＧ－リン脂質の組み合わせが、優れた組み合わせであったことを明らかに示した。この実験において、サイトカイン発現がＰＥＧ－リン脂質処置移植片（図１８Ａ～図１８Ｇ）の移植片の再灌流直後に明らかに低かったことも示され、抗炎症効果が、おそらく上述した虚血中のＣＬ－１１に対する阻害効果のために、再灌流前の冷虚血期間中にすでに誘導されたことを示唆する。
【0140】
実験２
実験の目的は、ラットにおけるリン脂質（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスファチジルエタノールアミン、ＤＰＰＥ）と共役したＰＥＧの安全性評価である。化合物の単一用量を、静脈内に投与し、１４日の回収期間が続いた。臨床現場において、ＰＥＧ（ＭＷ：５．０ｋＤａ）／リン脂質化合物２ｇを、レシピエントでの挿入の前に、臓器移植片にエクスビボで常に投与される灌流溶液１０００ｍＬで希釈する。低用量群のラットに、同じ濃度を、高用量群のラットに、その濃度の１０倍をそれぞれ与えた。
実験の目的は、ラットにおけるリン脂質（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロール－３－ホスファチジルエタノールアミン、ＤＰＰＥ）と共役したＰＥＧの安全性評価である。化合物の単一用量を、静脈内に投与し、１４日の回収期間が続いた。臨床現場において、ＰＥＧ（ＭＷ：５．０ｋＤａ）／リン脂質化合物２ｇを、レシピエントでの挿入の前に、臓器移植片にエクスビボで常に投与される灌流溶液１０００ｍＬで希釈する。低用量群のラットに、同じ濃度を、高用量群のラットに、その濃度の１０倍をそれぞれ与えた。
【0141】
研究デザイン
両方の性別のスプラーグドーリーラット３０匹を、チャールズ・リバーから購入し、ウプサラに輸送した。実験を、全体で４週間実行し、２週間の順化期間で開始し、その後、動物に無作為順序でＮａＣｌ、低用量または高用量のＰＥＧ－リン脂質のいずれかを注射した（１日目）。注射を側尾静脈で行った。ラットをその後、急性毒性の兆候についての神経機能および運動機能の延長臨床試験を含むアーウィン観察試験を使用して、６時間それらのケージ中で繰り返し観察した。観察者は、処置について知らされなかった。週５日の臨床試験をその後、２週間継続した。研究の最後に、血液を、終末麻酔下での心臓穿刺により採取した。安楽死後に、すべての動物をすぐに剖検に供した（１５日目）。
両方の性別のスプラーグドーリーラット３０匹を、チャールズ・リバーから購入し、ウプサラに輸送した。実験を、全体で４週間実行し、２週間の順化期間で開始し、その後、動物に無作為順序でＮａＣｌ、低用量または高用量のＰＥＧ－リン脂質のいずれかを注射した（１日目）。注射を側尾静脈で行った。ラットをその後、急性毒性の兆候についての神経機能および運動機能の延長臨床試験を含むアーウィン観察試験を使用して、６時間それらのケージ中で繰り返し観察した。観察者は、処置について知らされなかった。週５日の臨床試験をその後、２週間継続した。研究の最後に、血液を、終末麻酔下での心臓穿刺により採取した。安楽死後に、すべての動物をすぐに剖検に供した（１５日目）。
【0142】
第１群：ＮａＣｌ１ｍＬを受けた１０匹の対照動物（５匹のメス、５匹のオス）
第２群：２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質１ｍＬを受けた１０匹のラット（５匹のメス、５匹のオス）
第３群：２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質１ｍＬを受けた１０匹のラット（５匹のメス、５匹のオス）
第２群：２ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質１ｍＬを受けた１０匹のラット（５匹のメス、５匹のオス）
第３群：２０ｍｇ／ｍＬのＰＥＧ－リン脂質１ｍＬを受けた１０匹のラット（５匹のメス、５匹のオス）
【0143】
臨床観察
研究全体にわたり、すべての動物を週５日で検査し取り扱った。ラットをケージから取り出し、一度に１匹または２匹で１枚の合成フリースに載せた。週３回、すべてのラットを、クライミング、水浴びおよび調査のために、一度にラット５匹で大きい遊び場に入れた。陽性強化を、取り扱い直後にコーンフレークの形状で使用した。ラットは、動物施設への到着時におよび物質の注入前に徹底的な臨床試験を受けた。注射直後に、ラットを、設定時間間隔で６時間、毒性の兆候について観察した。ラットをその後、経験豊富な獣医により、定期的に検査した。疾患または毒性の臨床徴候は、順化および実験期間中、すべての動物において観察されなかった。
研究全体にわたり、すべての動物を週５日で検査し取り扱った。ラットをケージから取り出し、一度に１匹または２匹で１枚の合成フリースに載せた。週３回、すべてのラットを、クライミング、水浴びおよび調査のために、一度にラット５匹で大きい遊び場に入れた。陽性強化を、取り扱い直後にコーンフレークの形状で使用した。ラットは、動物施設への到着時におよび物質の注入前に徹底的な臨床試験を受けた。注射直後に、ラットを、設定時間間隔で６時間、毒性の兆候について観察した。ラットをその後、経験豊富な獣医により、定期的に検査した。疾患または毒性の臨床徴候は、順化および実験期間中、すべての動物において観察されなかった。
【0144】
体重
すべての動物の体重を、静脈注射の前およびその後、研究の残りの期間、週２回で記録した。動物の体重増加は、３つの群で同じ規模であった。
すべての動物の体重を、静脈注射の前およびその後、研究の残りの期間、週２回で記録した。動物の体重増加は、３つの群で同じ規模であった。
【0145】
眼科的検査
すべての動物は、ＰＥＧ－リン脂質の注射前１週間、および注射後１週間に生体顕微鏡（ＫＯＷＡ－ＳＬ１７）および検眼鏡検査（Ｈｅｉｎｅ Ｏｍｅｇａ ５００）による眼科的検査を受けた。ラットは、検査前にＭｙｄｒｉａｃｙｌ（登録商標）（トロピカミド）点眼薬、０．５％、５ｍｇ／ｍＬを受けた。ラットを、手順の間ずっと、穏やかな手動の拘束で保持した。
すべての動物は、ＰＥＧ－リン脂質の注射前１週間、および注射後１週間に生体顕微鏡（ＫＯＷＡ－ＳＬ１７）および検眼鏡検査（Ｈｅｉｎｅ Ｏｍｅｇａ ５００）による眼科的検査を受けた。ラットは、検査前にＭｙｄｒｉａｃｙｌ（登録商標）（トロピカミド）点眼薬、０．５％、５ｍｇ／ｍＬを受けた。ラットを、手順の間ずっと、穏やかな手動の拘束で保持した。
【0146】
毒性の兆候は、眼科的検査により観察されなかった。物質の投与前に、１匹のメスラットは、右眼に角膜混濁があり、２匹のメスラットは、レンズに核性の混濁があり、１匹は両眼に、他方は右眼のみにあった。眼科学的変化は、１匹のメスにおける軽い上皮の刺激を除いて、物質の投与後に見られなかった。２匹のオスラットは、物質の注射前に角膜変性症があり、１匹は両側に、他の１匹は、右の角膜のみにあった。１匹のオスは、レンズの核欠陥があり、別の１匹は白内障であった。左眼における硝子体出血が、１匹のオスラットで確認できた。物質の投与後、変化をオスのラットで確認できず、出血は再吸収された。
【0147】
臨床病理
研究の終わりに、血液をすべての動物から心臓穿刺により採取し、血液１ｍＬをＥＤＴＡ－およびＬｉ－ヘパリンチューブに分割した。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、血漿を収集し、臨床生化学の分析まで－２０℃で貯蔵した。ＥＤＴＡ血液をすぐに、アドヴィア２１２０シーメンスヘルスケアインスツルメントを用いて血液学について、およびＡｒｃｈｉｔｅｃｔ ｃ４０００、アボット・ラボラトリーズを用いて血漿について、ユーザマニュアルおよびＳＯＰにしたがい臨床病理学科、ＳＬＵ、ウプサラで分析した。分析を、げっ歯類について検証する。以下の血液学的検査：Ｂ－血小板（Ｂ－ＴＰＫ）、Ｂ－赤血球（Ｂ－ＥＰＫ）、Ｂ－ヘモグロビン（Ｂ－Ｈｂ）、Ｂ－平均血球体積（Ｂ－ＭＣＶ）、Ｂ－平均赤血球ヘモグロビン濃度（Ｂ－ＭＣＨＣ）、ｅｒｙ－網赤血球、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均血小板体積（ＭＰＶ）、ｅｒｙ－形態、Ｂ－白血球（Ｂ－ＬＰＫ）、Ｂ－好中球、Ｂ－好酸球、Ｂ－好塩基球、Ｂ－リンパ球、Ｂ－単球、がなされ、臨床生化学のために以下の測定：ナトリウム、カリウム、グルコース、総コレステロール、尿、クレアチニン、総タンパク質およびアルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）および胆汁酸、を実行した。可能な場合、以下の尿の分析：ｐＨ、タンパク質、グルコースおよび血液、を実行した。
研究の終わりに、血液をすべての動物から心臓穿刺により採取し、血液１ｍＬをＥＤＴＡ－およびＬｉ－ヘパリンチューブに分割した。３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離後、血漿を収集し、臨床生化学の分析まで－２０℃で貯蔵した。ＥＤＴＡ血液をすぐに、アドヴィア２１２０シーメンスヘルスケアインスツルメントを用いて血液学について、およびＡｒｃｈｉｔｅｃｔ ｃ４０００、アボット・ラボラトリーズを用いて血漿について、ユーザマニュアルおよびＳＯＰにしたがい臨床病理学科、ＳＬＵ、ウプサラで分析した。分析を、げっ歯類について検証する。以下の血液学的検査：Ｂ－血小板（Ｂ－ＴＰＫ）、Ｂ－赤血球（Ｂ－ＥＰＫ）、Ｂ－ヘモグロビン（Ｂ－Ｈｂ）、Ｂ－平均血球体積（Ｂ－ＭＣＶ）、Ｂ－平均赤血球ヘモグロビン濃度（Ｂ－ＭＣＨＣ）、ｅｒｙ－網赤血球、赤血球分布幅（ＲＤＷ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均血小板体積（ＭＰＶ）、ｅｒｙ－形態、Ｂ－白血球（Ｂ－ＬＰＫ）、Ｂ－好中球、Ｂ－好酸球、Ｂ－好塩基球、Ｂ－リンパ球、Ｂ－単球、がなされ、臨床生化学のために以下の測定：ナトリウム、カリウム、グルコース、総コレステロール、尿、クレアチニン、総タンパク質およびアルブミン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）および胆汁酸、を実行した。可能な場合、以下の尿の分析：ｐＨ、タンパク質、グルコースおよび血液、を実行した。
【0148】
すべての血液および血漿分析からの結果は、８～１６週齢のスプラーグドーリーラットの基準範囲内であった。５つの尿試料において、血液が検出された。
【0149】
病理
すべての動物を、イソフルランおよび酸素麻酔下での瀉血により１５日目に、予定された剖検のために安楽死させた。体重を、安楽死後に記録し、肉眼的病理を実行した。すべての動物において巨視的異常は認められなかった。
すべての動物を、イソフルランおよび酸素麻酔下での瀉血により１５日目に、予定された剖検のために安楽死させた。体重を、安楽死後に記録し、肉眼的病理を実行した。すべての動物において巨視的異常は認められなかった。
【0150】
結論
眼科的研究を含む臨床検査は、低用量、高用量および対照群の動物のいずれにおいても毒性のあらゆる兆候を明らかにしなかった。血液学的分析および生化学的分析は、すべて基準範囲内であり、巨視的異常は、すべての動物において剖検時に認められなかった。静脈内に投与されたＰＥＧ－リン脂質が、最大で２０ｍｇ／ｍＬの濃度でラットにおいて充分耐性があると結論づけることができる。
眼科的研究を含む臨床検査は、低用量、高用量および対照群の動物のいずれにおいても毒性のあらゆる兆候を明らかにしなかった。血液学的分析および生化学的分析は、すべて基準範囲内であり、巨視的異常は、すべての動物において剖検時に認められなかった。静脈内に投与されたＰＥＧ－リン脂質が、最大で２０ｍｇ／ｍＬの濃度でラットにおいて充分耐性があると結論づけることができる。
【0151】
実験３
ガリウム－６８（６８Ｇａ）は、半減期が６８分の陽電子放出体であり、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）において診断用放射性核種として一般に使用される。放射標識ＰＥＧ－リン脂質分子、６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－リン脂質を、二段階合成で生産した。
ガリウム－６８（６８Ｇａ）は、半減期が６８分の陽電子放出体であり、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）／コンピュータ断層撮影（ＣＴ）において診断用放射性核種として一般に使用される。放射標識ＰＥＧ－リン脂質分子、６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－リン脂質を、二段階合成で生産した。
【0152】
緩衝液および原液の調製
６８Ｇａ－溶出のための塩酸（ＨＣｌ）０．１Ｍ。濃ＨＣｌ（９．００ｍＬ、ｄ＝１．１７ｇ×ｍＬ－１、１１．２３Ｍ、微量金属分析用の３２～３５％Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＮＯＲＭＡＴＯＭ）を水（１０００ｍＬ、サーモフィッシャー、超微量分析用）に添加し、混合し、直接水フラスコ中で暗所にて４℃で貯蔵した。アリコートを、発生剤溶出前にプラスチックフラスコ（ナルゲン高密度ポリエチレン低金属樹脂、サーモフィッシャー）中、ＲＴで維持した。
６８Ｇａ－溶出のための塩酸（ＨＣｌ）０．１Ｍ。濃ＨＣｌ（９．００ｍＬ、ｄ＝１．１７ｇ×ｍＬ－１、１１．２３Ｍ、微量金属分析用の３２～３５％Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ ＮＯＲＭＡＴＯＭ）を水（１０００ｍＬ、サーモフィッシャー、超微量分析用）に添加し、混合し、直接水フラスコ中で暗所にて４℃で貯蔵した。アリコートを、発生剤溶出前にプラスチックフラスコ（ナルゲン高密度ポリエチレン低金属樹脂、サーモフィッシャー）中、ＲＴで維持した。
【0153】
無金属水。脱イオン水を、浄水器（ＭｉｌｌｉｅＱ）からガラスフラスコ中に得た。アリコートをプラスチック容器に移し、金属イオンを除去するためにＣｈｅｌｅｘ－１００上で貯蔵した。
【0154】
ＤＭＳＯおよび水中のＮＯ２Ａ－アジド１．０Ｍ溶液。１，４，７－トリアザシクロノナン－１，４－ビス（酢酸）－７－（３－アジドプロピルアセトアミド）三塩酸塩（ＮＯ２Ａ－アジド、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ、式量４９４．８ｇ／ｍｏｌ）（１．０ｍｇ、２．０μｍｏｌ）をエッペンドルフチューブ（２ｍＬ）に添加した。固体を最初にジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５０μＬ）に溶解し、均質な１．０Ｍ溶液が得られるまで、無金属水（１９５０μＬ）を非常にゆっくりと滴下で希釈した。
【0155】
酢酸ナトリウム１．０Ｍ緩衝液ｐＨ３．５。無金属水を緩衝液の調製におけるすべての工程で使用した。酢酸ナトリウム（８．２０３ｇ、０．１００ｍｏｌ、９９．９９５％微量金属ベース、ＴｒａｃｅＳＥＬＥＣＴ）を、プラスチックボトル（ナルゲン、ＨＤＰＥ低金属樹脂）中で水（１００ｍＬ）に溶解し、ｐＨを、プラスチックピペットを使用して濃酢酸（≧９９％、微量分析用ＴｒａｃｅＳＥＬＥＣＴ）の添加により４．５、４．０または３．５に調節した。最終体積は、塩および酸の添加のため１００ｍＬ超であり、したがって、最終溶液のモル濃度は、１．０Ｍ未満であった。約５ｍＬの緩衝液のアリコートを順次取り出し、ｐＨを、校正したｐＨメーター（メトラー・トレド）で測定した。アリコートを、ｐＨプローブからのあらゆる金属汚染を回避するために、ｐＨ測定後に廃棄した。最終緩衝液をＣｈｅｌｅｘ １００上で貯蔵し、さらなる使用の前に０．５μｍシリンジフィルタに通して濾過した。
【0156】
水酸化ナトリウム１．０Ｍ溶液。水酸化ナトリウム溶液（１００μＬ、１０Ｍ、生物学エキストラグレード、シグマアルドリッチ）を、エッペンドルフチューブ中にて無金属水（９００μＬ）で希釈した。
【0157】
６８Ｇａ－発生剤の溶出
６８Ｇａを、１０ｍＬプラスチックシリンジおよび電動シリンジドライバ（Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ ８６４、Ｍａｌｔａ）を使用して、０．１Ｍ ＨＣｌ（５．０ｍＬ、約０．８ｍＬ／分）で６８Ｇａ／６８Ｇｅ－発生剤（５０ｍＣｉ発生剤、オブニンスク、ロシア）から溶出した。得られる溶液をエッペンドルフチューブに分画して小容量および高放射能濃度を得た。
６８Ｇａを、１０ｍＬプラスチックシリンジおよび電動シリンジドライバ（Ｕｎｉｖｅｎｔｏｒ ８６４、Ｍａｌｔａ）を使用して、０．１Ｍ ＨＣｌ（５．０ｍＬ、約０．８ｍＬ／分）で６８Ｇａ／６８Ｇｅ－発生剤（５０ｍＣｉ発生剤、オブニンスク、ロシア）から溶出した。得られる溶液をエッペンドルフチューブに分画して小容量および高放射能濃度を得た。
【0158】
画分１：時間０～４５秒、６００μｌ、０ＭＢｑ－廃棄
画分２：時間４５～１分１５秒、４００μｌ、２１２ＭＢｑ－標識用に維持
画分３：時間１分１５秒～６分１５秒、４０００μｌ、２８１ＭＢｑ－廃棄
画分２：時間４５～１分１５秒、４００μｌ、２１２ＭＢｑ－標識用に維持
画分３：時間１分１５秒～６分１５秒、４０００μｌ、２８１ＭＢｑ－廃棄
【0159】
ＨＰＬＣ法
手動インジェクタ（Ｒｅｈｏｄｙｎｅ ７２２５ｉ、２０μＬループサイズ）、光ケーブルと接続した接続した外部分析用ＵＶフローセル（２μＬ）を有する（ＵＶ検出器（４Ｄ ＬＷＬ、Ｋｎａｕｅｒ）を備えたＬａＰｒｅｐシグマＨＰＬＣシステム（日立）、およびＵＶ検出器の後に順に取り付けられた拡張範囲モジュールＦＣ６１０６（エッカート・アンド・チーグラー）およびＰＭＴ／ＮａＩウェル検出器ＦＣ－３３００（エッカート・アンド・チーグラー）を備えた放射能検出器（Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ、Ｂｉｏｓｃａｎ）。分析される放射性物質の粘着性のため、無線検出器内のプラスチックループよりもステンレス鋼ループが好ましかった。ＨＰＬＣ装置を、ＯｐｅｎＬＡＢ（アジレント）を使用してソフトウエア制御し、結果を、同じソフトウエアを使用して分析した。
手動インジェクタ（Ｒｅｈｏｄｙｎｅ ７２２５ｉ、２０μＬループサイズ）、光ケーブルと接続した接続した外部分析用ＵＶフローセル（２μＬ）を有する（ＵＶ検出器（４Ｄ ＬＷＬ、Ｋｎａｕｅｒ）を備えたＬａＰｒｅｐシグマＨＰＬＣシステム（日立）、およびＵＶ検出器の後に順に取り付けられた拡張範囲モジュールＦＣ６１０６（エッカート・アンド・チーグラー）およびＰＭＴ／ＮａＩウェル検出器ＦＣ－３３００（エッカート・アンド・チーグラー）を備えた放射能検出器（Ｆｌｏｗ Ｃｏｕｎｔ、Ｂｉｏｓｃａｎ）。分析される放射性物質の粘着性のため、無線検出器内のプラスチックループよりもステンレス鋼ループが好ましかった。ＨＰＬＣ装置を、ＯｐｅｎＬＡＢ（アジレント）を使用してソフトウエア制御し、結果を、同じソフトウエアを使用して分析した。
【0160】
イオンチャンバ（ＶＤＣ ２０２、Ｖｅｅｎｓｔｒａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、使用した６８Ｇａ用の校正係数は７５１であった）。
【0161】
方法Ａ：逆相Ｃ１８カラムＹＭＣ－Ｐａｃｋ ＯＤＳ－ＡＬ、ＡＬ１２Ｓ０５－１０４６ＷＴ、ＡＬ－３０１、（ＹＭＣ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ）１００×４．６ｍｍ（Ｉ．Ｄ）、５μｍ、１２０Ａ。溶媒Ａ：水および０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリルおよび０．１％ＴＦＡ。溶媒グラジェントは、５分かけて５～７０％のＢ、その後３分間７０％のＢ。流速１．０ｍｌ・ｍｉｎ－１。
【0162】
方法Ｂ：サイズ排除クロマトグラフィ、カラム：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ１０／３００ＧＬ、ＧＥヘルスケア。イソクラティック溶離３０％Ｂ。流速０．８０ｍＬ・ｍｉｎ－１。
【0163】
［６８Ｇａ］ＮＯ２Ａ－アジドの合成
水酸化ナトリウム１．０Ｍ（４０μＬ、４０μｍｏｌ）および酢酸ナトリウム緩衝液０．１０Ｍ（２５μＬ、ｐＨ３．５）をエッペンドルフチューブ（２ｍＬ）で混合し、０．１Ｍ ＨＣｌ（４００μＬ）中の６８Ｇａ（１７９ＭＢｑ）に添加した。その後、ＮＯ２Ａ－アジド溶液（１０μＬ、体積によるＤＭＳＯ／純水混合物（１／３９）中で１．０Ｍ）を添加し（総反応体積２５０μＬ）、バイアルをボルテックスし、遠心分離し、ヒートブロック中で１５分間、８０℃に加熱して６８Ｇａ標識ＮＯ２Ａ－アジドを形成した。図１４を参照のこと。粗反応混合物を、ラジオ－ＨＰＬＣ法Ａ、波長λ＝２１５ｎｍ、ｔＲ：信号なし（ＵＶ）、３．７分（ラジオ）を使用して分析し、さらなる精製なしで後続の反応に使用した。ラジオ－ＨＰＬＣ、方法Ｂを使用して、クリック反応での未反応１の参照を有した、ｔＲ：信号なし（ＵＶ）ｔＲ：２５．７分（ラジオ）。
水酸化ナトリウム１．０Ｍ（４０μＬ、４０μｍｏｌ）および酢酸ナトリウム緩衝液０．１０Ｍ（２５μＬ、ｐＨ３．５）をエッペンドルフチューブ（２ｍＬ）で混合し、０．１Ｍ ＨＣｌ（４００μＬ）中の６８Ｇａ（１７９ＭＢｑ）に添加した。その後、ＮＯ２Ａ－アジド溶液（１０μＬ、体積によるＤＭＳＯ／純水混合物（１／３９）中で１．０Ｍ）を添加し（総反応体積２５０μＬ）、バイアルをボルテックスし、遠心分離し、ヒートブロック中で１５分間、８０℃に加熱して６８Ｇａ標識ＮＯ２Ａ－アジドを形成した。図１４を参照のこと。粗反応混合物を、ラジオ－ＨＰＬＣ法Ａ、波長λ＝２１５ｎｍ、ｔＲ：信号なし（ＵＶ）、３．７分（ラジオ）を使用して分析し、さらなる精製なしで後続の反応に使用した。ラジオ－ＨＰＬＣ、方法Ｂを使用して、クリック反応での未反応１の参照を有した、ｔＲ：信号なし（ＵＶ）ｔＲ：２５．７分（ラジオ）。
【0164】
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－脂質の合成
Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質（２０ｍｇ）を、ＲＴで１時間ＰＢＳ（１ｍＬ）中でシステイン（２ｍｇ）と反応させ、スピンカラム（タンパク質脱塩スピンカラム、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により精製して、凍結乾燥後にＣｙｓ－ＰＥＧ－脂質を得た。その後、Ｃｙｓ－ＰＥＧ－脂質（ＰＢＳ中１０ｍｇ）を、ＲＴで１時間ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中でＤＢＣＯ－Ｃ６－ＮＨＳエステル（６ｍｇ、クリクケミストリーツールズＬＬＣ）と反応させた。純水１０ｍＬの添加後に、沈殿を濾過（孔径：０．２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＧＶ、メルクミリポア社）により除去し、続いて真空で乾燥させて、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－脂質（５ｍｇ）を得た。標識効率ＤＢＣＯは、ＤＢＣＯのＵＶ吸収から算出して８０％であった。
Ｍａｌ－ＰＥＧ－脂質（２０ｍｇ）を、ＲＴで１時間ＰＢＳ（１ｍＬ）中でシステイン（２ｍｇ）と反応させ、スピンカラム（タンパク質脱塩スピンカラム、サーモフィッシャーサイエンティフィック）により精製して、凍結乾燥後にＣｙｓ－ＰＥＧ－脂質を得た。その後、Ｃｙｓ－ＰＥＧ－脂質（ＰＢＳ中１０ｍｇ）を、ＲＴで１時間ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中でＤＢＣＯ－Ｃ６－ＮＨＳエステル（６ｍｇ、クリクケミストリーツールズＬＬＣ）と反応させた。純水１０ｍＬの添加後に、沈殿を濾過（孔径：０．２μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ（登録商標）－ＧＶ、メルクミリポア社）により除去し、続いて真空で乾燥させて、ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－脂質（５ｍｇ）を得た。標識効率ＤＢＣＯは、ＤＢＣＯのＵＶ吸収から算出して８０％であった。
【0165】
６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質の合成
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－脂質（２．０ｍｇ、３３３ｎｍｏｌ脂質、７５％ＤＢＣＯ官能化、２５０ｎｍｏｌ ＤＢＣＯ）およびＰＢＳ（５０μＬ）をエッペンドルフチューブ（２ｍＬ）に加えた。遠心分離を使用して、すべての物質をバイアルの底に移動させた。続いて、予め調製した［６８Ｇａ］ＮＯ２Ａ－アジド溶液（１１６ＭＢｑ、９．０ｎｍｏｌ）からの４５０μＬを添加した。反応混合物中の最終ＤＢＣＯ／アジド比は、モル比で１／２８であった。反応をＲＴで１０分間放置し、その後、ヒートブロック中で１０分間、６０℃に加熱した。
ＤＢＣＯ－ＰＥＧ－脂質（２．０ｍｇ、３３３ｎｍｏｌ脂質、７５％ＤＢＣＯ官能化、２５０ｎｍｏｌ ＤＢＣＯ）およびＰＢＳ（５０μＬ）をエッペンドルフチューブ（２ｍＬ）に加えた。遠心分離を使用して、すべての物質をバイアルの底に移動させた。続いて、予め調製した［６８Ｇａ］ＮＯ２Ａ－アジド溶液（１１６ＭＢｑ、９．０ｎｍｏｌ）からの４５０μＬを添加した。反応混合物中の最終ＤＢＣＯ／アジド比は、モル比で１／２８であった。反応をＲＴで１０分間放置し、その後、ヒートブロック中で１０分間、６０℃に加熱した。
【0166】
反応混合物の４５０μＬをＮＡＰ－５カラム（ＰＢＳ５ｍＬで予め平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ－２５ＤＮＡグレードカラム、カットオフ５ｋＤａ、ＧＥヘルスケア）に移し、これをＰＢＳで２００μＬ画分に溶出した。図１５を参照して、所望の生成物６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質を、画分２～４（３５．０ＭＢｑ、添加された［６８Ｇａ］ＮＯ２Ａ－アジドの量に基づくクリック反応での３２％の減衰補正放射化学的収率、溶出６８Ｇａの全量に基づく７％の非減衰補正放射化学的収率）に溶出し、サイズ排除クロマトグラフィカラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）ペプチド１０／３００ＧＬ、ＧＥ）を備えたラジオ－ＨＰＬＣで分析した、波長λ＝２５４ｎｍ、ｔＲ：２１．５分、＞９２％の放射化学的純度。主な不純物は、未反応の［６８Ｇａ］ＮＯ２Ａ－アジド（５％）、ｔＲ：２５．７分であった。
【0167】
実験４
ブタ腎臓におけるＰＥＧ－リン脂質構築物の分布を追跡するために、および腎臓に分布されるＰＥＧ－リン脂質の量を推定するために、インビボ研究からの結果に基づいてＰＥＴ／磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検査を実行した。
ブタ腎臓におけるＰＥＧ－リン脂質構築物の分布を追跡するために、および腎臓に分布されるＰＥＧ－リン脂質の量を推定するために、インビボ研究からの結果に基づいてＰＥＴ／磁気共鳴画像（ＭＲＩ）検査を実行した。
【0168】
６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質（ＰＢＳ中）を、使用直前に非標識ＭｅＯ－ＰＥＧ－脂質（ＨＴＫ溶液中）と混合した（６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質／ＭｅＯ－ＰＥＧ－脂質＝１／４のモル比、［ＰＥＧ－脂質］＝２．０ｍｇ／ｍＬ）。
【0169】
血液を冷ＰＢＳでブタ腎臓から洗い流し、その後、腎臓に４℃でＨＴＫ溶液を流し、ＨＴＫ溶液で満たされたプラスチック袋に一晩入れた。６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質の溶液（２ｍｇ／ｍＬ、ＨＴＫ中、２０ｍＬ、少なくとも１０ＭＢｑ）を、注射器によりブタ腎臓の動脈を通じて慎重に注射し、氷上で３０分間インキュベートした。腎臓を冷ＨＴＫ溶液（５０ｍＬ）で洗浄した後、処置腎臓をＰＥＴ／ＭＲＩ装置（ｎａｎｏＳｃａｎ（登録商標）、メディゾ・メディカル・イメージング・システムズ、ブダペスト、ハンガリー）のステージに載せた。ステージは、小動物ＰＥＴ／３Ｔ ＭＲＩ前臨床スキャナのラージラット用であった。ＭＲスカウトスキャン（ＧＲＥ Ｍｕｌｔｉ－ＦＯＶ）を使用して、ＰＥＴでの全腎臓スキャン用のベッド位置を設定した。静的ＰＥＴ試験、複数ベッドスキャンを４０分間実行した。ＭＲＩ測定を、ブタ腎臓送受信コイルの全体を使用して３Ｔで実行した。グラジェントエコー（ＧＲＥ ＭｕｌｔｉＦＯＶ）シーケンスを、以下のパラメータ：励起回数（ＮＥＸ）：２；繰り返し時間（ＴＲ）：３９６ｍｓ；エコー時間（ＴＥ）：４．１５ｍｓ；フリップ：４５；スライス：１８０；スライス厚：１ｍｍ；視野（ＦＯＶ）：６４×６４ｍｍ２；空間分解能：０．５×０．５ｍｍ２；収集時間：１４分で収集した。リストモードＰＥＴデータを、Ｔｅｒａ ｔｏｍｏ ３Ｄアルゴリズム（４反復、ボクセルサイズ：０．４０ｍｍ、マトリクス：２１２×２１２×５８２）を使用して再構築した。
【0170】
ＰＥＴおよびＭＲＩ画像を、ＰＭＯＤ（バージョン３．５１０；ＰＭＯＤテクノロジーズ社）を使用して分析した。関心対象物の体積を、腎臓全体および周囲の髄質領域を含むように、融合ＰＥＴ－ＭＲ画像上に手動で描いた。腎臓の残りのトレーサ分布を、腎臓全体および周囲の髄質領域からの値を減じることにより推定した。
【0171】
各組織における取り込みを、ＭＢｑ、注射時に補正された減衰で表した。注射された放射能の量およびすべての洗浄工程からの静脈からの流出物を、ドーズキャリブレータ（ＶＤＣ－４０５、Ｖｅｅｎｓｔｒａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｅｎ、オランダ）中で測定し、減衰を注射時に補正した。すべての測定を、ＲＴで実行した。ＰＥＴ／ＭＲＩおよびガンマカウンターによる最初の測定の後で、腎臓を再度冷ＨＴＫ溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、その後、腎臓を第２の測定のためにＰＥＧ／ＭＲＩ装置のステージに載せた。
【0172】
結果
ブタ腎臓を、ブタレシピエントへの腎臓移植と同様の方法で６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質で処置し、その後ＰＥＴ／ＭＲＩ撮像に供した。注射および動脈を通る洗い流しによる６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質での腎臓の処置後に、撮像を、６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質の分布を評価するために実行した。６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質のシグナルは、腎臓全体にわたって分布しており、またより高いシグナルが、皮質領域（１９％）と比較して髄質の領域（８１％）で特に検出された。同じ腎臓を、ＨＴＫ溶液でのさらなる洗浄後の９０分で再撮像した場合、撮像結果は、ほとんど同じであった。６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質のシグナルは、依然として腎臓全体にわたって分布しており、より高いシグナルが、皮質領域（７％）と比較して髄質領域（９３％）で検出された。これらの結果は、腎臓内のすべての組織および血管が、注射により６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質でコートされ、かつ髄質中の組織および血管が、６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質で充分に修飾されたことを示した。
ブタ腎臓を、ブタレシピエントへの腎臓移植と同様の方法で６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質で処置し、その後ＰＥＴ／ＭＲＩ撮像に供した。注射および動脈を通る洗い流しによる６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質での腎臓の処置後に、撮像を、６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質の分布を評価するために実行した。６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質のシグナルは、腎臓全体にわたって分布しており、またより高いシグナルが、皮質領域（１９％）と比較して髄質の領域（８１％）で特に検出された。同じ腎臓を、ＨＴＫ溶液でのさらなる洗浄後の９０分で再撮像した場合、撮像結果は、ほとんど同じであった。６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質のシグナルは、依然として腎臓全体にわたって分布しており、より高いシグナルが、皮質領域（７％）と比較して髄質領域（９３％）で検出された。これらの結果は、腎臓内のすべての組織および血管が、注射により６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質でコートされ、かつ髄質中の組織および血管が、６８Ｇａ－ＮＯ２Ａ－ＰＥＧ－脂質で充分に修飾されたことを示した。
【0173】
上述した実施形態は、本発明の数個の例示的な例として理解されるべきである。本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に対して種々の修正、組み合わせおよび変更がなされ得ることは、当業者により理解される。特に、異なる実施形態における異なる部分解決策は、技術的に可能である他の構成において組み合わせることができる。しかし、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により定義される。
【0174】
参考文献
［１］Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔｓ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａ－ｔｈｉｎ ｐｏｌｙｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ａｎｃｈｏｒｅｄ ｔｏ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００６， ２７：５８２８－５８３５．
［２］Ｔｅｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００８， ２９：１３４５－１３５５．
［３］Ｔｅｒａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｗａｔａ， Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ２０１１， ９１（３）：２７１－２７８．
［４］Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏａｔｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１３， ３４（４）：９８５－９９４．
［５］Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｙ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２００９， ３０（１３）：２６５３－２６５９．
［６］Ｔｅｒａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｗａｔａ， Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｌｅｔｓ Ｗｉｔｈ ＰＥＧ－Ｌｉｐｉｄ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ２００９， ８８（５）：６２４－６３０．
［７］Ａｓｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｒｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｒｏｍｏｂｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＳＣｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌａ． ２０１６， ３５：１９４－２０５．
［１］Ｍｉｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔｓ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａ－ｔｈｉｎ ｐｏｌｙｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ａｎｃｈｏｒｅｄ ｔｏ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００６， ２７：５８２８－５８３５．
［２］Ｔｅｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， ２００８， ２９：１３４５－１３５５．
［３］Ｔｅｒａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｗａｔａ， Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｇｒａｆｔ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）－ｌｉｐｉｄ ａｎｄ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ ｉｓｌｅｔ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ２０１１， ９１（３）：２７１－２７８．
［４］Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｕｔｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｂｙ ａ ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃｏａｔｉｎｇ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２０１３， ３４（４）：９８５－９９４．
［５］Ｅｎｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｂｙ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ Ｍ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ． ２００９， ３０（１３）：２６５３－２６５９．
［６］Ｔｅｒａｍｕｒａ ａｎｄ Ｉｗａｔａ， Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｓｌｅｔｓ Ｗｉｔｈ ＰＥＧ－Ｌｉｐｉｄ ｆｏｒ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ Ｉｎｔｒａｐｏｒｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ２００９， ８８（５）：６２４－６３０．
［７］Ａｓｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｒｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｗｉｔｈ ｓｈｏｒｔ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＰＥＧ－ｌｉｐｉｄ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｈｒｏｍｏｂｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＭＳＣｓ ａｎｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌａ． ２０１６， ３５：１９４－２０５．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図18-1】
【図18-2】
【図19-1】
【図19-2】
【図20】
