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特許7465576放射性同位体をキレート化し、ＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾された表面を有するポリマーナノ粒子を調製するプロセスおよびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-03
(45)【発行日】2024-04-11
(54)【発明の名称】放射性同位体をキレート化し、ＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾された表面を有するポリマーナノ粒子を調製するプロセスおよびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 51/08 20060101AFI20240404BHJP
A61K 51/06 20060101ALI20240404BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20240404BHJP
A61K 51/12 20060101ALI20240404BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240404BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240404BHJP
【ＦＩ】
A61K51/08 100
A61K51/08 200
A61K51/06 100
A61K51/06 200
A61K51/04 100
A61K51/04 200
A61K51/12 100
A61K51/12 200
A61P35/04
A61P35/00
【請求項の数】
10
(21)【出願番号】P 2022504739
(86)(22)【出願日】2019-03-19
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-08-08
(86)【国際出願番号】 IB2019052218
(87)【国際公開番号】W WO2020188318
(87)【国際公開日】2020-09-24
【審査請求日】2022-03-18
(73)【特許権者】
【識別番号】521435075
【氏名又は名称】ナノティア エス．エー．
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】コーチ，トマシュ
(72)【発明者】
【氏名】ヤンチェヴィスカ，マグダレナ
(72)【発明者】
【氏名】ピクス，グジェゴジェ
(72)【発明者】
【氏名】コピラ，コンスタンシア
【審査官】伊藤 基章
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／２２０４８８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】WASIAK, I. et al.，PLOS ONE，2016年，Vol. 11, No. 1, Article No. e0146237，pp. 1-17
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ ５１／００
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
放射性同位体をキレート化し、癌細胞表面上のＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾されたその表面を有するポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスであって、ａ）デキストラン鎖が、過ヨウ素酸によってポリアルデヒドに酸化される段階、
ｂ）リンカー分子によって修飾された、標的剤であるグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素が、前記デキストラン鎖に存在する遊離アルデヒド基に結合する段階、
ｃ）疎水性ジアミンまたはポリアミンの形態のフォールディング剤が、アルデヒド基に結合する前記フォールディング剤の１つまたは２つのアミノ基で結合する段階、
ｄ）結果として生じるイミン結合が、アミン結合に還元される段階、
ｅ）前記結合したフォールディング剤の遊離アミノ基に、キレート剤分子が、アミド結合を介して結合する段階、
ｆ）結果として生じる混合物が、精製される段階、
ｇ）ナノ粒子画分が、凍結乾燥に供される段階
を含むことを特徴とする、プロセス。
【請求項2】
段階ｆ）からの前記混合物が、透析によって精製される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
ＰＳＭＡ受容体が存在する細胞が、前立腺癌細胞および転移性前立腺癌細胞である、請求項１または請求項２に記載のプロセス。
【請求項4】
ＰＳＭＡ受容体が存在する細胞が、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、および膵臓癌細胞である、請求項１または請求項２に記載のプロセス。
【請求項5】
前記標的剤によるアルデヒド基の置換が、１～５０％である、請求項１～４のいずれかに記載のプロセス。
【請求項6】
前記標的剤によるアルデヒド基の置換が、２．５～５％である、請求項５に記載のプロセス。
【請求項7】
前記キレート剤が、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、および／またはＮＯＴＡの誘導体である、請求項１～６のいずれかに記載のプロセス。
【請求項8】
前記リンカーが、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ２，２－ジメチル－４－オキソ－３，８，１１，１４，１７，２０－ヘキサオキサ－５－アザトリコサ－２３－エート（ＰＥＧ５）である、請求項１～７のいずれかに記載のプロセス。
【請求項9】
ドデシルアミン類、ジアミノオクタン類、ジアミノデカン類（ＤＡＤ）、ポリエーテルジアミン類、ポリプロピレンジアミン類、およびブロックコポリマージアミン類などの脂溶性ジアミン類が、フォールディング剤として使用される、請求項１～８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項10】
得られた前記ナノ粒子が、好ましくは、崩壊経路がベータプラス崩壊、ベータマイナス崩壊、ガンマ放出体崩壊を伴う同位体によって、放射化学的に標識される、請求項１～９のいずれかに記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の主題は、腫瘍細胞の表面上に存在するＰＳＭＡ受容体への標的剤が結合した、放射性同位体の持続性かつ安定なキレート化が可能なポリマーナノ粒子の調製のためのプロセスである。記載された粒子は、前立腺癌細胞、転移性前立腺癌細胞、および局所療法（標的密封小線源療法）の治療法および診断法に主に使用される。
【背景技術】
【0002】
米国癌協会のデータによれば、約１４１０万例の癌および約８２０万例の癌による死亡が、２０１２年に世界全体で記録された。２０１５年には、１，６５８，３７０例の新規癌症例が米国で認められると予測され、このうち２２０，８００例が前立腺癌を表す。それらの症例のうち５８９，４３０例（３５．５％）は、死亡に至ると予測され、それらのうち２７，５４０例は前立腺癌によって引き起こされる。推定では、２０３０年には、約２１７０万例の新規癌症例が認められ、そのうち約１３００万例は死亡に至ることが示されている。上記の値は、正の出生率、およびますます強まり一般化する人口の高齢化に起因する。それらの予測は、文明およびライフスタイルに関連する決定要因（喫煙、悪い食生活、運動不足）のため、増え続けるであろう。
【0003】
前立腺癌の診断法は、明確に定められている。現在使用されている、超音波画像法およびＭＲＩのハイブリッド法は、前立腺内の著しく病変した部位の確定的な同定をますます可能とする。この結果、その後の、依然として代替法がない生検は、より正確になる。しかしながら、転移性細胞の治療法は、いまだ現代医学の課題である。現在知られている、放射性同位体を使用する解決策は、３つのサブグループ：（ｉ）キレート化された放射性同位体を有する標的分子によって導かれるコンジュゲート（ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（登録商標））、（ｉｉ）標的要素として代謝変化を使用する小分子（ａｘｕｍｉｎ（登録商標））、または（ｉｉｉ）骨組織、すなわち、転移性前立腺癌細胞の最好発部位への放射性同位体の自然蓄積を使用する、遊離同位体混合物（ｘｏｆｉｇｏ（登録商標））に分けることができる。
【0004】
コンジュゲートは、３つの構成要素：キレート剤（通常、二官能性キレート剤）、リンカー、および標的分子（アプタマー、オリゴペプチド、抗体、代謝拮抗剤）からなる化合物である。
【0005】
代謝拮抗剤および小分子（グルコース）は、腫瘍によってより大きい程度に吸収および使用される。この作用機序により、様々な種類の癌の普遍的な標的化が可能となる。この群の化合物は、ＦＤＧ（フッ素１８標識グルコース）およびＡｘｕｍｉｎ（登録商標）（フッ素１８標識フルシクロビン）、またはＣ－コリン（炭素１１コリン）などのマーカーに使用される。記載の製品に共通する特有の特徴は、炭素化合物骨格の不可欠な部分である放射性同位体である。しかしながら、これは、「ホット」合成および放射性医薬品の迅速な輸送の必要性を伴う。
【0006】
放射性同位体の骨細胞への自然な生物学的親和性、およびそれらの骨組織に蓄積する傾向のため、非結合放射性同位体の溶液の形態で患者に投与される放射性医薬品が市販されている。そのような製剤の適用は、主に、転移性前立腺癌の患者の治療において正しいと認められる。Ｂａｙｅｒ社のＸｏｆｉｇｏ（登録商標）は、そのような製剤の例であり得る。遊離同位体を投与することは、放射の活性が非特異的であることを意味する。それは、骨組織にある前立腺転移性細胞、ならびに骨格の適切な機能に不可欠な骨形成および骨吸収細胞の両方に影響を及ぼす。
【0007】
ナノ粒子に基づく治療法は、癌細胞によって高度に発現される表面受容体を認識することによって、１つの薬剤が前立腺癌のための薬物および造影剤を供給し得るため、有益な解決策である。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、前立腺癌ヒト細胞株ＬＮＣａＰで初めて検出されたＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。利用可能な知識によれば、前立腺癌細胞の膜は、健康な前立腺細胞の１０倍超のＰＳＭＡ受容体を有する［Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２００４， ５８， ２００－２１０．］
【0008】
ＰＳＭＡ発現は、通常、前立腺癌が進行および転移するにつれて増加し、特に、より侵襲性型の疾患の場合、画像化および癌の処置と共に有効な癌細胞の標的化のための完全な標的を提供する。過去２０年間で、ホスホン酸類、リン酸類、およびホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅｓ）、ならびにチオール類および尿素などの、多くの低分子ＰＳＭＡ阻害剤が試験されてきた。さらに、高いＰＳＭＡレベルが、乳房、肺、結腸、および膵臓を含む、他の固形腫瘍系に関連する癌の内皮細胞で同定された。
【0009】
癌の処置における標的療法は、前臨床試験および臨床試験の両方で活発になっている領域である。ナノ粒子を使用する癌細胞への薬物の特異的送達は、ナノ粒子から腫瘍微小環境への治療薬の細胞外放出（受動輸送）、またはエンドサイトーシスによる細胞内薬物放出（能動輸送）のいずれかによって起こり得る。
【0010】
薬物ナノ粒子に別の物質を結合させることを含む能動的標的療法を使用することは、非常に有益であると思われ、癌細胞の膜受容体へのそのような物質の親和性は極めて高く、薬物と癌細胞との結合および薬物の取り込みを著しく増加させる（Ｍｏｇｈｉｍｉら、２００１）。これによって、特定の癌の種類に特徴的な受容体に適合する正しいリガンドを発見することが重要となる。
【0011】
発明の目的
発明の目的は、放射性同位体を、前立腺癌細胞、転移性前立腺癌細胞、およびＰＳＭＡ受容体の過剰発現が確認されている任意の癌に運ぶ、特異的に標的化されたポリマーナノ粒子を提供することである。
発明の目的は、放射性同位体を、前立腺癌細胞、転移性前立腺癌細胞、およびＰＳＭＡ受容体の過剰発現が確認されている任意の癌に運ぶ、特異的に標的化されたポリマーナノ粒子を提供することである。
【0012】
発明の目的は、ＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾された表面を有するナノ粒子の調製のためのプロセスを提供することである。発明の別の目的は、治療法（局所密封小線源療法）およびＰＥＴ、ＰＥＴ／ＭＲ診断法に使用され得る、特異的に標的化されたナノ粒子を提供することである。
【発明の概要】
【0013】
発明の主題は、放射性同位体をキレート化し、癌細胞表面上のＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾されたその表面を有するポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスである。発明は、特許請求された方法に従って得られるナノ粒子およびその使用も対象とする。
【0014】
放射性同位体をキレート化し、癌細胞表面上のＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾されたその表面を有するポリマーナノ粒子を調製するためのプロセスは、
ａ）デキストラン鎖が、過ヨウ素酸によってポリアルデヒドに酸化される段階、
ｂ）リンカー分子によって修飾された標的剤が、デキストラン鎖に存在する遊離アルデヒド基に結合する段階、
ｃ）疎水性または親水性アミン、ジアミン、またはポリアミンの形態のフォールディング剤が、アルデヒド基に結合するフォールディング剤の１つまたは２つのアミノ基で結合する段階、
ｄ）結果として生じるイミン結合が、アミン結合に還元される段階、
ｅ）結合したフォールディング剤の遊離アミノ基に、キレート剤分子が、アミド結合を介して結合する段階、
ｆ）結果として生じる混合物が、精製される段階、
ｇ）ナノ粒子画分が、凍結乾燥に供される段階
のいくつかの段階を含む。
ａ）デキストラン鎖が、過ヨウ素酸によってポリアルデヒドに酸化される段階、
ｂ）リンカー分子によって修飾された標的剤が、デキストラン鎖に存在する遊離アルデヒド基に結合する段階、
ｃ）疎水性または親水性アミン、ジアミン、またはポリアミンの形態のフォールディング剤が、アルデヒド基に結合するフォールディング剤の１つまたは２つのアミノ基で結合する段階、
ｄ）結果として生じるイミン結合が、アミン結合に還元される段階、
ｅ）結合したフォールディング剤の遊離アミノ基に、キレート剤分子が、アミド結合を介して結合する段階、
ｆ）結果として生じる混合物が、精製される段階、
ｇ）ナノ粒子画分が、凍結乾燥に供される段階
のいくつかの段階を含む。
【0015】
好ましくは、段階（ｆ）からの混合物は、透析によって精製される。
【0016】
好ましくは、ＰＳＭＡ受容体が存在する細胞は、前立腺癌細胞および転移性前立腺癌細胞である。
【0017】
また好ましくは、ＰＳＭＡ受容体が存在する細胞は、乳癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、および膵臓癌細胞である。
【0018】
発明のプロセスによれば、標的剤によるアルデヒド基置換レベルは、１～５０％、好ましくは２．５～５％である。
【0019】
キレート剤として、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、および／またはＮＯＴＡの誘導体が使用される。
【0020】
標的剤として、グルタミン酸とリシンとのα，α－尿素が使用される。
【0021】
リンカーとして、好ましくは、２，５－ジオキソピロリジン－１－イル ２，２－ジメチル－４－オキソ－３，８，１１，１４，１７，２０－ヘキサオキサ－５－アザトリコサ－２３－エート（ＰＥＧ５）が使用される。
【0022】
フォールディング剤として、ドデシルアミン類、ジアミノオクタン類、ジアミノデカン類（ＤＡＤ）、ポリエーテルジアミン類、ポリプロピレンジアミン類、およびブロックコポリマージアミン類などの、疎水性または親水性アミン類、ジアミン類、またはポリアミン類が使用される。
【0023】
発明のプロセスによれば、結果として生じるナノ粒子は、放射化学的に標識される。好ましくは、ナノ粒子は、Ｃｕ－６４、Ｇａ－６８、Ｇａ－６７、Ｉｔ－９０、Ｉｎ－１１１、Ｌｕ－１７７、Ａｋ－２２７、およびＧｄ（ＭＲ用）などの、崩壊経路がベータプラス崩壊、ベータマイナス崩壊、ガンマ放出体を含む同位体で標識される。
【0024】
発明はまた、診断法および治療法に使用するための、上記プロセスによって得られるような、ＰＳＭＡ受容体を標的とする特異的分子で修飾された表面を有する、放射性同位体をキレート化するポリマーナノ粒子も含む。
【0025】
発明は、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）、ハイブリッド陽電子放射断層撮影／磁気共鳴（ＰＥＴ／ＭＲＩ）を使用した診断法における、放射性同位体をキレート化するポリマーナノ粒子の使用を含む。
【0026】
発明は、局所密封小線源療法における、放射性同位体をキレート化するポリマーナノ粒子の使用も対象とする。
【0027】
さらに、発明は、前立腺癌細胞および転移性前立腺癌細胞ならびにナノ粒子が親和性を示す残存病変細胞の治療法および診断法における、放射性同位体をキレート化するポリマーナノ粒子の使用を含む。
【0028】
発明のナノ粒子は、デキストラン、ヒアルロン酸、セルロース、およびその誘導体のようなポリマーを使用して得られ得る。ポリマーは、天然形態、およびアルデヒド基またはカルボキシル基に酸化された後の両方で使用される。ナノ粒子の合成は、イミンの形成およびそれに続くそれらの還元、ならびにカルボキシル基のエステルによって行われる。
【0029】
フォールディング剤として、疎水性または親水性アミン類、ジアミン類、ポリエチレングリコール類、ポリプロピレングリコール類、または短いブロック－ブロックポリマーが使用され、１つまたは２つのアミン基が反応を起こし得る。
【0030】
標的剤として、グルタミン酸とリシンとのα，α－尿素、すなわちＧｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＧｕＬ）が使用され、以下の式を有する。
【化1】
【0031】
２つのアミノ酸の尿素誘導体であるこの小分子化合物は、ＰＳＭＡ受容体に高い親和性を有する。それは、アミノ酸との水素結合、およびタンパク質内部の活性中心の亜鉛原子との配位結合を形成する。結果として、受容体に強く結合し、エンドサイトーシスによって細胞に侵入する複合体を形成する。ＧｕＬは、第一級アミノ基で選択的に修飾され得る化合物であり、その粒子の生体共役反応に多くの可能性を開く。
【0032】
標的分子（ＧｕＬ）が結合するリンカー分子は、受容体タンパク質の構造により選択および適用された。オリゴペプチド誘導体を含むω－アミノ酸誘導体が、リンカーとして使用され、アミノ基は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、９－フルオレニルメチルカルボニル基（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｃｂｚ）、ベンジル基（Ｂｎ）、トリフェニルメチル基（Ｔｒ）のような基で保護され、一方、カルボニル基は、遊離酸（カルボキシル基）またはエステルとして生じる。使用されたリンカーの全体の構造式は、以下の図で示され、
式中、ＲおよびＲ’は、以下の構造を有し得る：
【化2】
【表1】
【0033】
標的剤が親和性を示す受容体のタンパク質構造により、以下の種類のリンカーを使用する：
【表2】
【0034】
以下に示されるように、ｎが５（ＰＥＧ５）またはｎが４（ＰＥＧ４）のポリエチレンオキシド（ＰＥＧ）を含有するリンカーを使用することが特に好ましい。
【表3】
【0035】
発明のナノ粒子は、水性環境中で、ポリマー鎖の化学修飾、続いて自己組織化による動的ミセル構造の形成によって得られる。
【0036】
初期段階で、デキストラン鎖は、ポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）に酸化される。
【化3】
【0037】
デキストランは、過ヨウ素酸を使用して酸化されてアルデヒド基を形成する。アルデヒド基は、ポリマー鎖が破壊されることなく形成される。
【0038】
酸化プロセスで形成されたアルデヒド基の定量は、加えられる標的剤およびフォールディング剤の量の適切な計算に必要である。製剤は、プロセス再現性、およびその後の一連の調製されるナノ粒子間の類似性を確保するために、パーセント比率を保存して調製される。アルデヒド基の数は、２００～８００μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤ、好ましくは３００～６００μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤである。
【0039】
標的剤をナノ粒子に結合する前に、標的剤をリンカーと結合する。トリエステルの形態で反応に使用されるＧｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＧｕＬ）は、リンカーとの架橋による修飾を受けて、そのアミン分岐を伸ばす。プロセスのこの段階は、阻害剤、すなわちＰＳＭＡ受容体活性部位のポケットに正確にアクセスする標的分子を提供する。同時に、阻害剤は、ナノ粒子との結合後、その表面上に適切に露出する。
【0040】
次の段階は、ポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）のアルデヒド基に、先に調製された、すでにリンカーに結合している標的剤（ＧｕＬ）を結合させることを含み、イミノ化反応は、シッフ塩基の形成をもたらす。その後、脂溶性ジアミンの形態のフォールディング剤が、ＰＡＤアルデヒド基に結合し、さらなるイミン結合の形成をもたらす。
【0041】
形成されたイミン結合は、水素化ホウ素エタノール溶液を使用して還元される。それは、水素化ホウ素またはシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはカリウムであり得る。続いて、キレート剤分子を、デキストラン鎖に結合したジアミンに由来する遊離アミン基に結合する。キレート剤分子は、アミンと、キレート剤分子のＮＨＳエステル（Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）との共役を介して結合する。
【0042】
標識化の準備ができた生成物を調製する重要な段階は、透析による製剤の精製である。
【0043】
透析は、水または適切な緩衝液で、１２～７２時間、好ましくは２４～４８時間、頻繁に液交換して行われる。外液対精製される試料の体積比は、２０：１～２００：１、好ましくは１００：１である。キレート剤分子の結合後、反応後混合物を、ｐＨ５．０の酢酸緩衝液に対して精製し、葉酸（ＦＡ）分子の結合後、混合物を、ｐＨ７．４のリン酸緩衝液に対して精製する。
【0044】
次いで、精製されたナノ粒子を凍結乾燥に供し、これによってナノ粒子は乾燥フォームの形態で少なくとも３ヶ月間貯蔵することが可能となる。水と再結合させた後、ナノ粒子は、標的緩衝液中で穏やかに撹拌すると、約２０分以内に再組織化する。
【0045】
最終ナノ粒子調製段階は、放射化学的標識化を含み得る。
【0046】
発明によるナノ粒子は、崩壊経路がベータプラス崩壊、ベータマイナス崩壊、ガンマ放出体崩壊を含む同位体で標識される。それらは、Ｃｕ－６４、Ｇａ－６８、Ｇａ－６７、Ｉｔ－９０、Ｉｎ－１１１、Ｌｕ－１７７、Ａｋ－２２７、およびＧｄ（ＭＲＩ用）のような同位体である。これにより、発明は治療目的および診断目的の両方にとって有用となる。診断法は、様々な利用可能な方法：ＰＥＴ、ＳＣＥＰＴ、ＭＲＩ、およびそれらのハイブリッド、例えばＰＥＴ／ＭＲＩを使用してもよい。
【0047】
そのような調製されたナノ粒子の画像診断法での使用は、処置の進行を監視する可能性と共に早期の癌検出および同時の標的治療により、前立腺癌または転移性前立腺癌に罹患している患者を完治させる可能性を高める。
【0048】
発明を説明する記載に含まれている図面は、以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で１０％（ＢＣＳ ０２７７）、３０％（ＢＣＳ ０２９０）、および２．５％ ＢＣＳ ０３１９）置換されたナノ粒子、ならびに置換されていないナノ粒子（ナノ粒子を含まない対照）の、様々な濃度、すなわち１６μｇ、４μｇ、１．６μｇ、０．４μｇ、０．１６μｇのナノ粒子溶液を分析に使用した、ＰＳＭＡ受容体酵素活性阻害の蛍光アッセイ。
【図2】リンカーを含まないＧｕＬを有するナノ粒子（４０８）、およびリンカーを含むＧｕＬを有するナノ粒子（２７７）による、様々な量、すなわち、８０００ｎｇ、８００ｎｇ、８０ｎｇ、および８ｎｇの標的剤でのＰＳＭＡ阻害の蛍光アッセイ。
【発明を実施するための形態】
【0050】
発明の目的は、以下に記載される好ましい実施形態で説明される。
【0051】
実施例１
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で１０％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９０％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ２７７）の調製
１．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で１０％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９０％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ２７７）の調製
１．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
【0052】
ＰＡＤ中のアルデヒド基の定量：
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、室温の暗所で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。これらの定量に基づいて、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、室温の暗所で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。これらの定量に基づいて、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
【0053】
１．２．Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２とリンカーＰＥＧ５との反応
リンカー（化合物１）１０．４０ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）１０．００ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ４μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ １５０μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で撹拌を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液で、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【化4】
【0054】
１．３．標的剤Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓが結合したデキストランナノ粒子の形成
ＰＡＤ ４２７ｍｇ（２０５．１μｍｏｌのＣＨＯを含有する）を、超純水４．３ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（化合物５）の水溶液を、この混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１１．００にし、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液２．２７ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液１．６０ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液で、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【化5】
【0055】
１．４．ＧｕＬ標的剤を含有するナノ粒子へのＤＯＴＡキレート剤の結合
ナノ粒子の凍結乾燥物（化合物８）１００ｍｇを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解した。その後、キレート剤１８．５ｍｇを含有する、ＤＯＴＡ－ＮＨＳの超純水懸濁液０．５ｍｌを加えた。このように調製した反応混合物を、室温で９０分間撹拌した。生成物を、１００倍の体積のｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝溶液で、緩衝溶液を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子（化合物９）から凍結乾燥によって除去した。
【化6】
【0056】
実施例２
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で３０％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で７０％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ２９０）の調製
２．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で３０％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で７０％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ２９０）の調製
２．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
【0057】
ＰＡＤ中のアルデヒド基の定量：
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、室温の暗所で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は５０８．１μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、室温の暗所で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は５０８．１μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
【0058】
２．２．Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２とリンカーＰＥＧ５との反応
リンカー（化合物１）１５．５０ｍｇ（０．０３０７ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．７５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）１５．００ｍｇ（０．０３０７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ６μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ ２３４μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で撹拌を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．７５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【化7】
リンカー（化合物１）１５．５０ｍｇ（０．０３０７ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．７５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）１５．００ｍｇ（０．０３０７ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ６μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ ２３４μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で撹拌を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．７５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【0059】
２．３．標的剤ＧｕＬが結合したデキストランナノ粒子の形成
（１０１．６μｍｏｌのＣＨＯを含有する）ＰＡＤ ２００ｍｇを、超純水２．０ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１１．００にし、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液０．８７ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液０．８８ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【化8】
（１０１．６μｍｏｌのＣＨＯを含有する）ＰＡＤ ２００ｍｇを、超純水２．０ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１１．００にし、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液０．８７ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液０．８８ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【0060】
２．４．ＧｕＬ標的剤を含有するナノ粒子へのＤＯＴＡキレート剤の結合
ナノ粒子の凍結乾燥物（化合物８）１００ｍｇを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解した。その後、キレート剤１８．５ｍｇを含有する、ＤＯＴＡ－ＮＨＳの超純水懸濁液０．５ｍｌを加えた。このように調製した反応混合物を、室温で９０分間撹拌した。生成物を、１００倍の体積のｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液で、緩衝溶液を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子（化合物９）から凍結乾燥によって除去した。
【化9】
【0061】
実施例３
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で５％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９５％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ ３１８）を得る
３．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で５％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９５％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ ３１８）を得る
３．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
【0062】
ＰＡＤ中のアルデヒド基の定量：
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、暗所で、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、暗所で、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
【0063】
３．２．Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２とリンカーＰＥＧ５との反応
リンカー（化合物１）１０．４０ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）１０．００ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ４μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ １５０μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で混合を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【化10】
リンカー（化合物１）１０．４０ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）１０．００ｍｇ（０．０２０５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ４μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ １５０μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で混合を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【0064】
３．３．標的剤Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓが結合したデキストランナノ粒子の形成
（４１０．２μｍｏｌのＣＨＯを含む）ＰＡＤ ８５４ｍｇを、超純水８．５４ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して１１．００のｐＨを確立し、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液４．７８ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液３．１８ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液で、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【化11】
（４１０．２μｍｏｌのＣＨＯを含む）ＰＡＤ ８５４ｍｇを、超純水８．５４ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して１１．００のｐＨを確立し、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液４．７８ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液３．１８ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液で、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【0065】
３．４．ＧｕＬ標的剤を含有するナノ粒子へのＤＯＴＡキレート剤の結合
ナノ粒子の凍結乾燥物（化合物８）１００ｍｇを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解した。その後、キレート剤１８．５ｍｇを含有する、ＤＯＴＡ－ＮＨＳの超純水懸濁液０．５ｍｌを加えた。このように調製した反応混合物を、室温で９０分間撹拌した。生成物を、１００倍の体積のｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液で、緩衝溶液を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子（化合物９）から凍結乾燥によって除去した。
【化12】
【0066】
実施例４
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で２．５％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９７．５％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ ３１９）を得る
４．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で２．５％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９７．５％置換されたナノ粒子（ＢＣＳ ３１９）を得る
４．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
【0067】
ＰＡＤ中のアルデヒド基の定量：
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、暗所で、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、暗所で、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
【0068】
４．２．Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２とリンカーＰＥＧ５との反応
リンカー（化合物１）５．２０ｍｇ（０．０１０２５ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．２５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）５．００ｍｇ（０．０１０２５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ２μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ ７５μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で混合を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．２５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【化13】
【0069】
４．３．標的剤Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓが結合したデキストランナノ粒子の形成
（４１０．２μｍｏｌのＣＨＯを含有する）ＰＡＤ ８５４ｍｇを、超純水８．５４ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。そのように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して１１．００のｐＨを確立し、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液４．９０ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液３．１４ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【化14】
（４１０．２μｍｏｌのＣＨＯを含有する）ＰＡＤ ８５４ｍｇを、超純水８．５４ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。そのように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用して１１．００のｐＨを確立し、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液４．９０ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液３．１４ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【0070】
４．４．ＧｕＬ標的剤を含有するナノ粒子へのＤＯＴＡキレート剤の結合
ナノ粒子の凍結乾燥物（化合物８）１００ｍｇを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解した。その後、キレート剤１８．５ｍｇを含有する、ＤＯＴＡ－ＮＨＳの超純水懸濁液０．５ｍｌを加えた。このように調製した反応混合物を、室温で９０分間撹拌した。生成物を、１００倍の体積のｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液で、緩衝溶液を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子（化合物９）から凍結乾燥によって除去した。
【化15】
【0071】
実施例５
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で１％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９９％置換されたナノ粒子の生成
５．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
アルデヒド基がＧｕＬ標的剤で１％置換され、ＤＡＤフォールディング剤で９９％置換されたナノ粒子の生成
５．１．デキストランのポリアルデヒドデキストラン（ＰＡＤ）への酸化
デキストラン酸化反応：
デキストラン５．００ｇを、超純水１００ｍｌに溶解した。過ヨウ素酸ナトリウム０．６６ｇを加えた。酸化反応を、室温の暗所で一晩継続した。生成物を、１００倍の体積の超純水で、水を少なくとも２回交換して、７２時間の透析によって精製した。水を、４０℃での留去によって除去した。
【0072】
ＰＡＤ中のアルデヒド基の定量：
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、暗所で、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、およびＰＡＤ ２０～１００μｌを、２ｍｌチューブに加え、次いで、超純水（０～８０μｌ）を加えて総体積５００μｌとした。アッセイを、３つの異なるＰＡＤ体積（２０、６０、および１００μｌ）について行った。対照試料を調製した：０．８ｍＭ塩酸ヒドロキシルアミン溶液１００μｌ、ｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌ、および超純水１００μｌを、チューブに加えた。試料を混合し、９５℃で１５分間インキュベートし、次いで、室温で５分間インキュベートした。０．０５％ＴＮＢＳ溶液５００μｌを、試料ごとに加えた。試料を混合し、暗所で、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの完了後、試料の吸光度を５００ｎｍの波長で測定した。超純水２００μｌと混合したｐＨ５．８の０．６Ｍ酢酸緩衝液３００μｌを、ブランク試料として使用した。そのようなアッセイにより、アルデヒド基含有量は４８０．３μｍｏｌ／１ｇ ＰＡＤであると決定された。
【0073】
５．２．Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２とリンカーＰＥＧ５との反応
リンカー（化合物１）５．２０ｍｇ（０．０１０２５ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．２５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）５．００ｍｇ（０．０１０２５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ２μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ ７５μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で混合を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．２５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【化16】
リンカー（化合物１）５．２０ｍｇ（０．０１０２５ｍｍｏｌ）を、無水塩化メチレン０．２５ｍｌに溶解した。その後、ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素（化合物２）５．００ｍｇ（０．０１０２５ｍｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ ２μｌを加えた。反応を、室温で２４時間行った。その後、ＴＦＡ ７５μｌを加え、それから２４時間にわたって室温で混合を継続した。溶媒を留去し、油状残渣を超純水０．２５ｍｌに溶解し、次いで、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を使用して、万能指示薬紙によってｐＨ＞１１となるようにアルカリ化した。このように調製したリンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、精製することなく合成の次の段階に使用した。
【0074】
５．３．標的剤Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓが結合したデキストランナノ粒子の形成
（１０２５．５μｍｏｌのＣＨＯを含有する）ＰＡＤ ２１３５ｍｇを、超純水２１．３５ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１１．００にし、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液１２．４５ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液８．８４ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【化17】
（１０２５．５μｍｏｌのＣＨＯを含有する）ＰＡＤ ２１３５ｍｇを、超純水２１．３５ｍｌに溶解して１０％（ｗ／ｖ）溶液を得た。リンカー修飾ＧｕＬ（化合物５）の水溶液を、その混合物に加えた。このように調製した反応混合物に、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を使用してｐＨを１１．００にし、混合物を３０℃で６０分間撹拌し、修飾されたポリアルデヒドデキストラン（化合物６）を得た。その後、１，１０－ジアミノデカン二塩酸塩の２％（ｗ／ｖ）超純水溶液１２．４５ｍｌを加え、このように得られた反応混合物を、ｐＨを制御し、２０分ごとにｐＨを１０に調整しながら、３０℃で１０分間撹拌した。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。その後、水素化ホウ素ナトリウムの１％（ｗ／ｖ）エタノール溶液８．８４ｍｌを加えた。還元反応を、３７℃で６０分間行った。反応終了後、０．５Ｍ ＨＣｌ溶液を使用して、ｐＨを７．４にした。最終生成物８を、１００倍の体積の超純水で、水を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子から凍結乾燥によって除去した。
【0075】
５．４．ＧｕＬ標的剤を含有するナノ粒子へのＤＯＴＡキレート剤の結合
ナノ粒子の凍結乾燥物（化合物８）１００ｍｇを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解した。その後、キレート剤１８．５ｍｇを含有する、ＤＯＴＡ－ＮＨＳの超純水懸濁液０．５ｍｌを加えた。このように調製した反応混合物を、室温で９０分間撹拌した。生成物を、１００倍の体積のｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液で、緩衝溶液を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子（化合物９）から凍結乾燥によって除去した。
【化18】
ナノ粒子の凍結乾燥物（化合物８）１００ｍｇを、ｐＨ８．０の０．１Ｍリン酸緩衝液２．０ｍｌに溶解した。その後、キレート剤１８．５ｍｇを含有する、ＤＯＴＡ－ＮＨＳの超純水懸濁液０．５ｍｌを加えた。このように調製した反応混合物を、室温で９０分間撹拌した。生成物を、１００倍の体積のｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液で、緩衝溶液を６回交換して、４８時間の透析によって精製した。水を、このように精製したナノ粒子（化合物９）から凍結乾燥によって除去した。
【0076】
実施例６
ＧｕＬ標的剤が結合したナノ粒子によるＰＳＭＡ受容体の阻害
リンカーに埋め込まれたＧｕＬ標的剤が結合したナノ粒子の、ＰＳＭＡ受容体に対する特異性試験を行った。酵素インビトロアッセイを行って、ＧｕＬによるＰＳＭＡ活性部位の遮断によって起こるＰＳＭＡ活性の低下を調べた。試験を、以下のナノ粒子：
－ＢＣＳ ０２７７ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を１０％置換
－ＢＣＳ ０２９０ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を３０％置換
－ＢＣＳ ０３１９ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を２．５％置換
について、様々な濃度、すなわち１６μｇ、４μｇ、１．６μｇ、０．４μｇ、０．１６μｇのナノ粒子溶液を分析に使用して行った。
ＧｕＬ標的剤が結合したナノ粒子によるＰＳＭＡ受容体の阻害
リンカーに埋め込まれたＧｕＬ標的剤が結合したナノ粒子の、ＰＳＭＡ受容体に対する特異性試験を行った。酵素インビトロアッセイを行って、ＧｕＬによるＰＳＭＡ活性部位の遮断によって起こるＰＳＭＡ活性の低下を調べた。試験を、以下のナノ粒子：
－ＢＣＳ ０２７７ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を１０％置換
－ＢＣＳ ０２９０ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を３０％置換
－ＢＣＳ ０３１９ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を２．５％置換
について、様々な濃度、すなわち１６μｇ、４μｇ、１．６μｇ、０．４μｇ、０．１６μｇのナノ粒子溶液を分析に使用して行った。
【0077】
結果を図１に示し、酵素活性の低下を反映する蛍光の減少を示す。このように、ＧｕＬ標的剤が結合したナノ粒子によるＰＳＭＡ阻害が確立された。
【0078】
試験は、ナノ粒子の結合（ＧｕＬ含有量）が多くなるほど、ＰＳＭＡ酵素活性を表す蛍光が減少することを示した。ＧｕＬ標的剤によるアルデヒド基の３０％、１０％、および２．５％置換について、結合したＧｕＬ標的剤の量の増加を確認する傾向が観察された。同時に、様々な値のナノ粒子溶液濃度についての結果の分析は、示された方法が、ＧｕＬ剤の定量、および阻害が生じるのに必要な最小ナノ粒子濃度の決定を可能とすることを示す。
【0079】
試験は、一旦ナノ粒子構造に結合すると、リンカー上に配置されたＧｕＬ標的剤が、前立腺癌細胞の表面上に存在するＰＳＭＡ受容体に高い親和性を有することの証明において決定的である。
【0080】
実施例７
ＧｕＬ標的剤を有するナノ粒子のＰＳＭＡ受容体への親和性
リンカー上に配置されたＧｕＬ標的剤を有するナノ粒子を、ＰＳＭＡ受容体の高度の過剰発現を示すＬＮＣａＰ細胞（前立腺癌細胞株）の表面へのその結合の程度の測定によって、ＰＳＭＡ受容体に対する親和性について試験した。ナノ粒子を、放射性ルテチウムで標識し、次いで、５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＬＮＣａＰとともにマルチウェルプレート上でインキュベートした。ナノ粒子の結合能および細胞への内部移行を、ガンマ線の測定によって決定した。方法は、高感度の測定によって特徴づけられる。
以下のナノ粒子の結果を示す：
－ＢＣＳ ０２９０ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を３０％置換
－ＢＣＳ ０３１８ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を５％置換
－ＢＣＳ ０３１９ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を２．５％置換
表１に示す結果は、すべての試験されたナノ粒子が、高度のＰＳＭＡ受容体過剰発現を示すことを示唆する。試験は、２．５％～５％のアルデヒド基がＧｕＬ標的剤で置換されたナノ粒子が、ＰＳＭＡ受容体に対して有意に高レベルの親和性を有することを示す。
ＧｕＬ標的剤を有するナノ粒子のＰＳＭＡ受容体への親和性
リンカー上に配置されたＧｕＬ標的剤を有するナノ粒子を、ＰＳＭＡ受容体の高度の過剰発現を示すＬＮＣａＰ細胞（前立腺癌細胞株）の表面へのその結合の程度の測定によって、ＰＳＭＡ受容体に対する親和性について試験した。ナノ粒子を、放射性ルテチウムで標識し、次いで、５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＬＮＣａＰとともにマルチウェルプレート上でインキュベートした。ナノ粒子の結合能および細胞への内部移行を、ガンマ線の測定によって決定した。方法は、高感度の測定によって特徴づけられる。
以下のナノ粒子の結果を示す：
－ＢＣＳ ０２９０ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を３０％置換
－ＢＣＳ ０３１８ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を５％置換
－ＢＣＳ ０３１９ － ＧｕＬ標的剤でアルデヒド基を２．５％置換
表１に示す結果は、すべての試験されたナノ粒子が、高度のＰＳＭＡ受容体過剰発現を示すことを示唆する。試験は、２．５％～５％のアルデヒド基がＧｕＬ標的剤で置換されたナノ粒子が、ＰＳＭＡ受容体に対して有意に高レベルの親和性を有することを示す。
【表4】
【0081】
実施例８
ＰＳＭＡ受容体へのナノ粒子結合の特異性に対する、ＧｕＬ標的剤リンカーの重要性の試験
ＧｕＬ標的剤は、リンカー－ＰＥＧ５（ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ５－ＮＨＳ）分子を介して結合し、ＰＳＭＡ受容体への標的剤のアクセスの増加を担う。リンカーなしでナノ粒子に結合したＧｕＬ分子と比較したナノ粒子の表面上のＧｕＬリンカー分子の優位性を確認するために、試験を行った。図２に示す結果は、リンカーを含まないＧｕＬを有するナノ粒子（４０８）、およびリンカーを含むＧｕＬを有するナノ粒子（２７７）による、様々な量、すなわち、８０００ｎｇ、８００ｎｇ、８０ｎｇ、および８ｎｇの標的剤でのＰＳＭＡ阻害を示す。
ＰＳＭＡ受容体へのナノ粒子結合の特異性に対する、ＧｕＬ標的剤リンカーの重要性の試験
ＧｕＬ標的剤は、リンカー－ＰＥＧ５（ＢｏｃＮＨ－ＰＥＧ５－ＮＨＳ）分子を介して結合し、ＰＳＭＡ受容体への標的剤のアクセスの増加を担う。リンカーなしでナノ粒子に結合したＧｕＬ分子と比較したナノ粒子の表面上のＧｕＬリンカー分子の優位性を確認するために、試験を行った。図２に示す結果は、リンカーを含まないＧｕＬを有するナノ粒子（４０８）、およびリンカーを含むＧｕＬを有するナノ粒子（２７７）による、様々な量、すなわち、８０００ｎｇ、８００ｎｇ、８０ｎｇ、および８ｎｇの標的剤でのＰＳＭＡ阻害を示す。
【0082】
行われた試験に基づいて、蛍光の減少は、ＰＳＭＡ受容体タンパク質に対する、ＧｕＬ標的剤でのナノ粒子の結合の程度を反映することが見出された。得られた結果は、リンカーに結合した標的剤によるナノ粒子の結合の特異性を確認する。それらはまた、リンカーを含む標的剤が、リンカーを含まない標的剤と比較すると、結合プロセスの効率、および受容体に関連する得られたナノ粒子の効力を高めることを示す。
【0083】
略称
ＤＯＴＡ － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸
ＤＴＰＡ － ペンテト酸
ＮＯＴＡ － １，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸
ＤＯＴＡ－ＮＨＳ － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸とＮ－ヒドロキシスクシンイミドとのモノエステル
ＤＯＴＡ－ブチルアミン － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス（酢酸）－１０－（４－アミノブチル）アセトアミド
ＤＯＴＡ－マレイミド － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス－酢酸－１０－マレイミドエチルアセトアミド
ＤＯＴＡ－ＳＣＮ － ２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス－酢酸
ＰＥＴ － 陽電子放射断層撮影
ＰＥＴ／ＭＲＩ － 陽電子放射断層撮影および磁気共鳴画像法
ＮＨＳ － Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
スルホＮＨＳ － Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩
ＰＦＰ － ペンタフルオロフェノール
ＴＦＰ － ２，３，５，６－テトラフルオロフェノール
ＳＴＰ － ２，３，５，６－テトラフルオロ－４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム塩
ＳＣＮ － チオシアナート
ＰＡＤ － ポリアルデヒドデキストラン
ＤＡＤ － ジアミノデカン
ＤＩＰＥＡ － ジイソプロピルエチルアミン
ＴＦＡ － トリフルオロ酢酸
ＧｕＬまたはＧｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ － グルタミン酸とリシンとのα，α－尿素
Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２ － ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素
ＤＯＴＡ － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸
ＤＴＰＡ － ペンテト酸
ＮＯＴＡ － １，４，７－トリアザシクロノナン－１，４，７－三酢酸
ＤＯＴＡ－ＮＨＳ － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸とＮ－ヒドロキシスクシンイミドとのモノエステル
ＤＯＴＡ－ブチルアミン － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス（酢酸）－１０－（４－アミノブチル）アセトアミド
ＤＯＴＡ－マレイミド － １，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス－酢酸－１０－マレイミドエチルアセトアミド
ＤＯＴＡ－ＳＣＮ － ２－（４－イソチオシアナトベンジル）－１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス－酢酸
ＰＥＴ － 陽電子放射断層撮影
ＰＥＴ／ＭＲＩ － 陽電子放射断層撮影および磁気共鳴画像法
ＮＨＳ － Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド
スルホＮＨＳ － Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩
ＰＦＰ － ペンタフルオロフェノール
ＴＦＰ － ２，３，５，６－テトラフルオロフェノール
ＳＴＰ － ２，３，５，６－テトラフルオロ－４－ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム塩
ＳＣＮ － チオシアナート
ＰＡＤ － ポリアルデヒドデキストラン
ＤＡＤ － ジアミノデカン
ＤＩＰＥＡ － ジイソプロピルエチルアミン
ＴＦＡ － トリフルオロ酢酸
ＧｕＬまたはＧｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ － グルタミン酸とリシンとのα，α－尿素
Ｇｌｕ－ＣＯ－Ｌｙｓ（ＯＢｕｔ）３ＮＨ２ － ｔｅｒｔ－ブチルトリエステルの形態のグルタミン酸とリシンとのα，α－尿素
【図1】
【図2】