特許 7466128 ＴＧＦβ阻害剤およびプロドラッグ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-04

(45)【発行日】2024-04-12

(54)【発明の名称】ＴＧＦβ阻害剤およびプロドラッグ

(51)【国際特許分類】

   C07D 487/04 20060101AFI20240405BHJP

   A61K 31/4709 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 9/12 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240405BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240405BHJP

【ＦＩ】

C07D487/04 138

C07D487/04 CSP

A61K31/4709

A61P1/16

A61P3/04

A61P3/10

A61P7/06

A61P9/00

A61P9/10

A61P9/12

A61P11/00

A61P13/12

A61P17/00

A61P17/02

A61P17/06

A61P19/08

A61P21/00

A61P25/00

A61P25/28

A61P27/02

A61P35/00

A61P35/02

A61P35/04

A61P43/00 111

A61P43/00 123

【請求項の数】 28

(21)【出願番号】P 2021525161

(86)(22)【出願日】2019-11-22

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2022-03-09

(86)【国際出願番号】 EP2019082215

(87)【国際公開番号】W WO2020104648

(87)【国際公開日】2020-05-28

【審査請求日】2022-10-28

(31)【優先権主張番号】18382843.3

(32)【優先日】2018-11-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】521196741

【氏名又は名称】フンダシオ インスティテュート デ レセルカ ビオメディカ（アイアールビー バルセロナ）

(73)【特許権者】

【識別番号】521196752

【氏名又は名称】インステテューシオ カタラーナ デ レセルカ イ エストディス アヴァンサッツ

(73)【特許権者】

【識別番号】521196763

【氏名又は名称】ウニヴェルシダー・デ・バルセロナ

(74)【復代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100082072

【弁理士】

【氏名又は名称】清原 義博

(72)【発明者】

【氏名】タウリエロ，ダニエレ

(72)【発明者】

【氏名】バイロム，ダニエル

(72)【発明者】

【氏名】マタリン モラレス，ジョアン アントニー

(72)【発明者】

【氏名】バジェ ゴメス，エドゥアルド

(72)【発明者】

【氏名】リエラ エスカレ，アントニー

【審査官】神谷 昌克

(56)【参考文献】

【文献】特表２００４－５３５４０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１４／０７２５１７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】Journal of Medicinal Chemistry，2008年，Vol.51, No.7，pp.2302-2306

【文献】Molecular Cancer Therapeutics，2003年，Vo.2, No.11，pp.1171-1181

【文献】Green Chemistry，2013年，Vol.15, No.5，pp.1373-1381

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｄ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【化1】

【請求項2】

薬剤として使用するための、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【化2】

【請求項3】

ＴＧＦβ経路の阻害剤に反応する疾患の予防および／または処置に使用するための、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【化3】

【請求項4】

前記式（Ｉ）の化合物が、化学療法または癌標的療法と併用して投与される、請求項２または３のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【請求項5】

前記式（Ｉ）の化合物が免疫療法と併用して投与される、請求項２または３のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【請求項6】

前記式（Ｉ）の化合物が免疫チェックポイント阻害剤と併用して投与される、請求項２または３のいずれかに記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【請求項7】

前記ＴＧＦβ経路の阻害剤に反応する疾患は、癌、硬皮症、乾癬、貧血、サルコペニア、アルツハイマー病、マルファン症候群、動脈瘤、肺高血圧症、骨形成不全症、特発性肺線維症、肝臓線維症、肝硬変、脂肪肝、肥大型心筋症、骨髄線維症、Ｉ型神経線維腫症、腎線維症、巣状分節性糸球体硬化症、放射線誘導型線維症、全身性硬化症における皮膚線維症、びまん性全身性硬化症、瘢痕化、角膜原発性翼状片、線維症、子宮平滑筋腫、肥満症、糖尿病、糖尿病網膜症における微小血管病、およびネフロパシーからなる群から選択される、請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【請求項8】

前記ＴＧＦβ経路の阻害剤に反応する疾患は癌であり、癌は、血液癌、Ｂ細胞またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞またはＴ細胞型非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、Ｂ細胞またはＴ細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫、脳癌、中枢神経系のグリア系統の癌（神経膠腫）、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、有害な胸膜の中皮腫、乳癌、抗ＨＥＲ２治療に耐性がある乳癌、乳房癌腫、乳腺腺癌、胃および食道の癌、胃癌腫、胃腺癌、大腸癌、結腸癌腫、結腸腺癌、直腸癌、大腸癌腫、転移性結腸癌、膵臓癌、膵臓癌腫、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、肝臓癌、転移性肝臓癌、転移性疾患、肺癌、肺癌腫、肺腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣癌腫、卵巣腺癌、卵巣癌腫、子宮内膜癌、子宮内膜間質部肉腫、子宮頚部の癌腫、甲状腺癌、転移性乳頭状甲状腺癌、濾胞状甲状腺癌、膀胱癌、尿膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺癌、前立腺癌腫、神経内分泌癌、有棘細胞癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、胚性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽腫、肝芽腫、黒色腫、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項３に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【請求項9】

前記癌が転移性癌である、請求項８に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【請求項10】

癌転移の予防に使用するための、式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物。

【化4】

【請求項11】

有効量の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。

【化5】

【請求項12】

少なくとも別の有効成分をさらに含み、該少なくとも別の有効成分は免疫療法薬である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項13】

少なくとも別の有効成分をさらに含み、該少なくとも別の有効成分は化学療法薬である、請求項１１に記載の医薬組成物。

【請求項14】

式（Ｉ）の化合物のプロドラッグであって、

【化6】

前記プロドラッグは、式（ＩＩ）、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を有しており、

【化7】

式中、
Ｒ_１は、Ｈであり、ならびに
Ｒ_２とＲ_３はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、およびハロアルキルからなる群から選択される、プロドラッグ。

【請求項15】

前記プロドラッグは式（ＩＩＩ）、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を有する、請求項１４に記載のプロドラッグ。

【化8】

【請求項16】

式（Ｉ）の化合物のプロドラッグであって、

【化9】

前記プロドラッグは、式（ＩＶ）、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を有している、プロドラッグ。

【化10】

【請求項17】

薬剤として使用するための、請求項１４から１６のいずれかに記載のプロドラッグ。

【請求項18】

ＴＧＦβ経路の阻害剤に反応する疾患の予防および／または処置に使用するための、請求項１４から１６のいずれかに記載のプロドラッグ。

【請求項19】

前記式（Ｉ）の化合物のプロドラッグが、化学療法または癌標的療法と併用して投与される、請求項１７または１８のいずれかに記載のプロドラッグ。

【請求項20】

前記式（Ｉ）の化合物のプロドラッグが、免疫療法と併用して投与される、請求項１７または１８のいずれかに記載のプロドラッグ。

【請求項21】

前記式（Ｉ）の化合物のプロドラッグが、免疫チェックポイント阻害剤と併用して投与される、請求項１７から２０のいずれかに記載のプロドラッグ。

【請求項22】

前記疾患は、癌、硬皮症、乾癬、貧血、サルコペニア、アルツハイマー病、マルファン症候群、動脈瘤、肺高血圧症、骨形成不全症、特発性肺線維症、肝臓線維症、肝硬変、脂肪肝、肥大型心筋症、骨髄線維症、Ｉ型神経線維腫症、腎線維症、巣状分節性糸球体硬化症、放射線誘導型線維症、子宮平滑筋腫、肥満症、糖尿病、糖尿病網膜症における微小血管病、およびネフロパシーからなる群から選択される、請求項１８に記載のプロドラッグ。

【請求項23】

前記疾患は癌であり、癌は、血液癌、Ｂ細胞またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞またはＴ細胞型非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、Ｂ細胞またはＴ細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫、脳癌、中枢神経系のグリア系統の癌（神経膠腫）、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、有害な胸膜の中皮腫、乳癌、抗ＨＥＲ２治療に耐性がある乳癌、乳房癌腫、乳腺腺癌、胃および食道の癌、胃癌腫、胃腺癌、大腸癌、結腸癌腫、結腸腺癌、直腸癌、大腸癌腫、転移性結腸癌、膵臓癌、膵臓癌腫、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、肝臓癌、転移性肝臓癌、転移性疾患、肺癌、肺癌腫、肺腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌、卵巣癌腫、卵巣腺癌、卵巣癌腫、子宮内膜癌、子宮内膜間質部肉腫、子宮頚部の癌腫、甲状腺癌、転移性乳頭状甲状腺癌、濾胞状甲状腺癌、膀胱癌、尿膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺癌、前立腺癌腫、神経内分泌癌、有棘細胞癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、胚性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽腫、肝芽腫、黒色腫、および皮膚癌からなる群から選択される、請求項２２に記載のプロドラッグ。

【請求項24】

前記癌が転移性癌である、請求項２３に記載のプロドラッグ。

【請求項25】

癌転移の予防に使用するための、請求項１４から１６のいずれかに記載のプロドラッグ。

【請求項26】

請求項１４から１６のいずれかに記載の有効量の式（Ｉ）の化合物のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体とを含む、医薬組成物。

【請求項27】

少なくとも別の有効成分をさらに含み、該少なくとも別の有効成分は免疫療法薬である、請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

少なくとも別の有効成分をさらに含み、該少なくとも別の有効成分は化学療法薬である、請求項２６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、阻害活性、治療能、および毒性プロファイルが改善された新規なＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤、ならびにそのプロドラッグに関するものであり、前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤は、アセトバニロン由来の断片またはカルバメート断片を含み、該アセトバニロン由来の断片またはカルバメート断片はＴＧＦβシグナル伝達阻害活性を閉じ込める（ｃａｇｅ）が、前記プロドラッグが加水分解されると、より活性なＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤をインビボで送達することができる。ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤とそのプロドラッグを含む組成物も開示される。さらに本発明は、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害に反応する疾患を処置する方法に使用するための、前記ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤とそのプロドラッグを開示する。

【背景技術】

【0002】

トランスフォーミング成長因子βアイソフォームであるＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３は、分泌された小さなホモ二量体シグナル伝達タンパク質である。これらアイソフォームは脊椎動物にのみ存在するとともに、適切な発達のほか、様々な器官や組織の恒常性に必要とされている。すべてではないが大半の活性は、細胞内運命やＴＧＦβシグナル伝達経路の機能において特異的な受容体複合体により媒介され、この複合体はリガンド結合に際してアセンブルされるとともに、ＴＧＦβのＩＩ型受容体とＩ型受容体を含む。

【0003】

ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）として、Ｉ型ＴＧＦβ受容体とＩＩ型ＴＧＦβ受容体が挙げられる。Ｉ型ＴＧＦβ受容体は、７つのアクチビン受容体様キナーゼとしてＡＬＫ１（ＡＣＶＲＬ１）、ＡＬＫ２（ＡＣＶＲ１）、ＡＬＫ３（ＢＭＰＲ１Ａ）、ＡＬＫ４（ＡＣＶＲ１Ｂ）、ＡＬＫ５（ＴＧＦＢＲ１）、ＡＬＫ６（ＢＭＰＲ１Ｂ）、およびＡＬＫ７（ＡＣＶＲ１Ｃ）を含み、ＩＩ型ＴＧＦβ受容体はＴＧＦＢＲ２、ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、およびＡＣＶＲ２Ｂを含む。ＴＧＦβリガンドは、ＡＬＫ５／ＴＧＦＢＲ１とＴＧＦＢＲ２を使用して細胞膜を介し信号を伝達することから、ＴＧＦβ経路の特異的阻害に対する標的である。特に、小分子を含む標的としてＡＬＫ５が使用されているが、受容体ＡＬＫ４とＡＬＫ５は密に関連しているため、（そのいずれかに対する）阻害剤特異性が既知の課題である。ＡＬＫ４／ＡＣＶＲ１Ｂは、アクチビンＡ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１１、およびＮｏｄａｌを含む、ＴＧＦβスーパーファミリーにおける付加的な分子からのシグナル伝達を媒介する。しかし、ＡＬＫ５シグナル伝達と同様、ＡＬＫ４活性は組織線維症に関与している（「Ｊｉｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１４，５７：４２１３－４２３８」、「Ｓｕｇｉｙａｍａ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｎｏｌｏｇｙ １９９８，１１４（３）：５５０－５５８」、「Ｍａｔｓｕｓｅ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５，１３（１）：１７－２４」、「Ｐａｗｌｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９７，１００（３）：６３９－６４８」、「Ｈｕｂｎｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９９６，１７３（２）：４９０－４９８」、「Ｍｕｎｚ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．１９９９，１８（１９）：５２０５－５２１５」、「Ｗａｎｋｅｌｌ，Ｍ．ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯ Ｊ．２００１，２０（１９）：５３６１－５３７２」）。それゆえ、ＡＬＫ４／ＡＬＫ５の二重阻害は、線維性疾患に対するＴＧＦβ経路阻害剤の治療効果を増強する場合がある。

【0004】

ＴＧＦβシグナル伝達は多様な病態に関与しており、創傷治癒、または例えば熱傷の瘢痕化において重要な役割を果たす。前記病態として、遺伝病（カムラティ・エンゲルマン病、マルファン症候群、筋ジストロフィー、およびファンコーニ貧血を含む）、肥満症、糖尿病、血液病、循環器疾患、乾癬などの皮膚病、および線維性疾患が挙げられる。

【0005】

ＴＧＦβシグナル伝達は、癌の進行でも重要な役割を果たす。ＴＧＦβシグナル伝達は、複雑で異なる方法で腫瘍中の異なる細胞型すべてに影響を及ぼす可能性がある一方、全体的な効果は、特にその疾患の後期に腫瘍の成長、侵入、および転移を強く促すと考えられる。それゆえ、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害は臨床施設に強く関連するものであり、この経路を標的とする有効な薬剤の開発と試験が盛んに求められている。様々な癌種に対する臨床試験が進行中であり、この癌種として、多発性骨髄腫や骨髄異形成症候群などの血液癌、膠芽腫などの脳癌、ユーイング肉腫や悪性胸膜中皮腫などの軟性癌、ならびに、乳癌、胃および食道の癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、有棘細胞癌、または黒色腫を含む固形腫瘍のほか、前述の癌種に関連する転移が挙げられる。

【0006】

Ｌｉらの文献（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１（７）：２３０２－２３０６）、ＷＯ０２０９４８３３Ａ１、およびＷＯ２０１４０７２５１７Ａ１には、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤として使用するための多様なジヒドロピロロピラゾール誘導体が記載されている。

【0007】

近年では、ＴＧＦβシグナル伝達阻害により抗腫瘍免疫応答が活性化して他の種類の免疫療法が強化されたことで、近い将来ＴＧＦβシグナル伝達阻害がおそらく、様々な種類の癌の処置における併用免疫療法の有望な要素となることが示されている（Ｂａｔｌｌｅ ａｎｄ Ｍａｓｓａｇｕｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１９，５０（４）：９２４－９４０）。間質性ＴＧＦβシグナル伝達の阻害が腫瘍細胞に対して免疫系を放ち、この治療効果により、癌患者が死亡する主な原因である転移性疾患も治癒されることが示されている（「Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１８，５５４（７６９３）：５３８－５４３．」、「Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１８，５５４（７６９３）：５４４－５４８」）。

【0008】

これは治療標的の候補として広く認識されているが、ＴＧＦβ経路の臨床的開拓は重要な毒性問題により妨げられている。経路成分を対象とする様々な小分子阻害剤と抗体の開発は、前臨床モデルと患者における広範な毒性が原因で放棄されている（Ｇａｒｂｅｒ，Ｋ．（２００９）．ＪＮＣＩ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１０１（２４），１６６４－１６６７．）。小分子ＬＹ２１５７２９９（ガルニセルチブ（ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ））は、癌患者を対象に広範囲に試験されているＴＧＦβ経路阻害剤である。ガルニセルチブは、初めに脳癌を対象とした臨床試験段階にあるＴＧＦβ受容体Ｉの比較的弱い阻害剤（ＡＬＫ５）であり（Ｈｅｒｂｅｒｔｚ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，９：４４７９－４４９９）、過去１０年間にわたり、他の複数の癌種を対象に試験されている（Ｈｅｒｂｅｒｔｚ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，９：４４７９－４４９９）。経口毒性、心血管毒性、胃腸毒性、免疫毒性、骨／軟骨毒性、生殖毒性、および腎毒性を含む、前臨床モデルにおける関連毒性を考慮すると（Ｓｔａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｒａｃｔ ２０１４，４（３）：１－１０）、ガルニセルチブ投与の量と頻度はともに、１４日間投与と１４日間休薬を行うレジメンにおいてヒトを対象に最大３００ｍｇ／日に制限されている（Ｈｅｒｂｅｒｔｚ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，９：４４７９－４４９９）。しかし、臨床試験において広範な試験が行われているにもかかわらず、これまでこの投与レジメンを用いて報告されている癌患者に対するガルニセルチブの治療効果は、中程度であるか、または存在しなかった（「Ｈｅｒｂｅｒｔｚ Ｓ ｅｔ ａｌ；２０１５」、「Ｍｅｌｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１８，１１９（１０）：１２０８－１２１４」、「Ｋｅｌｌｅｙ ＲＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１９ Ｊｕｌ；１０（７）：ｅ０００５６．」、「Ｂｒａｎｄｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１８（８）：１１４６－１１５６．」）。そのため、治療用量で毒性プロファイルの低下と活性の増強を呈するＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤は、重要で臨床的に必要なものであることを表す。

【0009】

さらに一般的には、多くの有効薬物は多数の副作用をもたらすか、または健康な組織や細胞に対し有毒であることが知られている。他の薬物は、薬物の系統的効果を避けるべく局所送達される場合がある。プロドラッグは活性な薬剤または薬物（親化合物）に由来する化合物であり、溶解性、吸収、分布、代謝、排泄、および毒性などの特性を調節するよう修飾されている。それゆえ、プロドラッグは、溶解性、吸収、分布、代謝、排泄および毒性などの１つ以上の特性を同時に調節する間に、活性を低減するか遮断する断片に付けられる親化合物を含む、化合物である。この意味では、Ｙｏｏｎら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００３，２（１１）：１１７１－１１８１）により、活性代謝産物７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシンのプロドラッグとしてエステル結合４－ピペリジノピペリジン基の使用が報告されている。加えて、Ｒｅｉｔｅｒら（Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍ．，２０１３，１５（５）：１３７３－１３８１）により、ＬｉｇＦ（β－エテラ－ゼ）酵素とのリグニンβ－４アリールエーテル結合の酵素切断が報告されている。

【0010】

したがって、本発明の１つの目的は、毒性プロファイルが改善されるとともに治療効果が増強された、より有効なＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤を開発することである。

【0011】

加えて、本発明の別の目的は、標的組織または器官に薬物をより効率的に送達して、有害作用または望ましくない系統的作用を回避し、高度に効率的な局所投与を行いつつ、毒性の本体の残りを取っておくのに使用可能なプロドラッグを開発することである。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物に関する。

【0013】

【化1】

【0014】

本発明はまた、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物、および／または少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体、ならびに随意に少なくとも他の有効成分を含む、医薬組成物に関する。

【0015】

加えて本発明は、特にＴＧＦβ経路の阻害剤に反応する疾患の処置に使用するための、式Ｉの化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩もしくは薬学的に許容可能な溶媒和物、または、前記式Ｉの化合物、あるいはその薬学的に許容可能な塩もしくは薬学的に許容可能な溶媒和物を含む医薬組成物に関する。

【0016】

本発明はまた、式Ｉの化合物のプロドラッグに関し、前記プロドラッグは式（ＩＩ）のプロドラッグ、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物であり、

【0017】

【化2】

式中、
Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、ならびに
Ｒ_２とＲ_３はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、およびハロアルキルからなる群から選択される。

【0018】

本発明はまた、式Ｉの化合物のプロドラッグに関し、前記プロドラッグは式（ＩＩＩ）、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を有している。

【0019】

【化3】

【0020】

さらに本発明は、式Ｉの化合物のプロドラッグに関し、前記プロドラッグは式（ＩＶ）、またはその医薬塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を有している。

【0021】

【化4】

【0022】

さらに本発明は、式ＩＩのプロドラッグ、式ＩＩＩのプロドラッグ、あるいは式ＩＶのプロドラッグから選択される、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤または担体とを含む医薬組成物に関する。

【0023】

本発明はまた、特にＴＧＦβ経路の阻害剤に反応する疾患の処置に使用するための、式ＩＩのプロドラッグ、式ＩＩＩのプロドラッグ、あるいは式ＩＶのプロドラッグから選択される式Ｉの化合物のプロドラッグ、あるいはその薬学的に許容可能な塩もしくは薬学的に許容可能な溶媒和物、または、前記プロドラッグ、あるいはその薬学的に許容可能な塩もしくは薬学的に許容可能な溶媒和物を含む医薬組成物に関する。特に、癌、硬皮症、乾癬、貧血、サルコペニア、アルツハイマー病、マルファン症候群、動脈瘤、肺高血圧症、骨形成不全症、特発性肺線維症、肝臓線維症、肝硬変、脂肪肝、肥大型心筋症、骨髄線維症、Ｉ型神経線維腫症、腎線維症、巣状分節性糸球体硬化症、放射線誘導型線維症、全身性硬化症における皮膚線維症、びまん性全身性硬化症、瘢痕化、角膜原発性翼状片、線維症、子宮平滑筋腫、肥満症、糖尿病、糖尿病網膜症における微小血管病、およびネフロパシーからなる群から選択される、前記ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患、より具体的には癌の処置に使用される。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】ＣＡＧＡルシフェラーゼレポーターを用いた細胞アッセイで得たＩＣ_５０値を示す。ガルニセルチブ

【0025】

【数1】

、式Ｉの化合物

【0026】

【数2】

、式ＩＩＩの化合物

【0027】

【数3】

、および式ＩＶの化合物

【0028】

【数4】

の様々な投与量における生物発光（ｙ軸）が示されている。算出したＩＣ_５０値を図表に示す。

【図2】リン酸化ＳＭＡＤ２に対する免疫組織化学的検査により染色した肝転移部分の写真である。矢印は染色された細胞母核を指しており、対照（ビヒクル）における活性ＴＧＦβシグナル伝達を示すが、式Ｉ、ＩＶ、またはガルニセルチブの各化合物で処置したマウスのものは示していない。等モル投与量（５ｘ）のガルニセルチブ、式Ｉの化合物、および式ＩＶの化合物を３日間投与した。

【図3】マウス腫瘍オルガノイド（ＭＴＯ）を埋め込んだ免疫適格マウスを用いた、ＴＧＦβ阻害および関連する抗癌作用に関する読み出しとしてのマウス肝転移初期アッセイを示す。標準マウス投与量８０ｍｇ／ｋｇ１日２回の０．３倍、１倍、３倍、および９倍のモル当量（平均重量２５ｇと仮定して、２ｍｇ／マウスへと翻訳される）にある式Ｉの化合物またはガルニセルチブによる処置後に、肝転移（ＬｉＭ）の数を測定し（ｙ軸）、空ビヒクルで処置した対照と比較した。０．３倍のガルニセルチブ（０．６ｍｇ／マウス、１日２回）の投与量は試験しなかった（ｎ．ｔ．）。

【図4】ＴＧＦβ阻害および関連する抗癌作用に関する読み出しとしてのマウス肝転移初期アッセイを示す。免疫適格マウスに埋め込んだルシフェラーゼ発現ＭＴＯを用いて実行された生体内イメージングにより定量した正規化生物発光シグナルによって、３～１４日目にわたり様々な投与量（マウスに対する標準ガルニセルチブ投与量８０ｍｇ／ｋｇ１日２回の０．３倍、１倍、および３倍のモル当量）にある式Ｉの化合物およびガルニセルチブによる処置後に腫瘍成長と拒絶を認める。

【図5】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対する式Ｉの化合物のインビトロ細胞毒性アッセイとガルニセルチブのインビトロ細胞毒性アッセイとを示す。ＤＭＳＯを対照として使用した。

【図6】４－メチルウンベリフェロンアセトバニロン、すなわち式ＩＩのプロドラッグ、具体的には式ＩＩＩのプロドラッグのモデル化合物のβ－ケトエーテル部分の酵素切断に対し精製ＬｉｇＦを用いたインビトロ蛍光アッセイを示す。図は蛍光対時間を示す。

【図7】４－メチルウンベリフェロンアセトバニロン（ＭＵＡＶ）、すなわち式ＩＩのプロドラッグ、具体的には式ＩＩＩのプロドラッグのモデル化合物のβ－ケトエーテル部分の酵素切断に対し、ＬｉｇＦを安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたインビトロ蛍光アッセイを示す。図は様々な濃度のＭＵＡＶの蛍光を示しており、ＬｉｇＦ対時間に晒されている。ＭＵＡＶ基質の３つの濃度として、１０μＭ（黒丸）、３０μＭ（三角形）、１００μＭ（黒塗り円形）を示す。ＭＵＡＶ１００μＭを使用するがＬｉｇＦを使用しない対照を白丸で示す。

【図8A】精製ＬｉｇＦによる式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合の切断、その後の４－ＯＨＴの提供に対するＨＰＬＣ－ＭＳ実験を示す。図８Ａは陰性対照を示す。

【図8B】精製ＬｉｇＦによる式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合の切断、その後の４－ＯＨＴの提供に対するＨＰＬＣ－ＭＳ実験を示す。図８Ｂは時間＝０を示す。

【図8C】精製ＬｉｇＦによる式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合の切断、その後の４－ＯＨＴの提供に対するＨＰＬＣ－ＭＳ実験を示す。図８Ｃは時間＝１時間を示す。

【図8D】精製ＬｉｇＦによる式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合の切断、その後の４－ＯＨＴの提供に対するＨＰＬＣ－ＭＳ実験を示す。図８Ｄは時間＝３時間を示す。

【図8E】精製ＬｉｇＦによる式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合の切断、その後の４－ＯＨＴの提供に対するＨＰＬＣ－ＭＳ実験を示す。図８Ｅは時間＝４４時間を示す。

【図9】質量分光法により測定されるような、式ＶＩＩのプロドラッグ（異性体ＥとＺとして示す）から４－ＯＨＴ（異性体ＺとＥ両方を示す）への変換の定量化を示す。様々な時点（ｘ軸）での合計パーセンテージ（ｙ軸）として分子の相対存在量を示す。

【図10】４－ＯＨＴ（遍在性Ｃｒｅ－Ｅ^ＲＴ２タンパク質を運ぶ、あるいは運ばない）に対して感受性を持つ、または持たないＭＥＦを有するβエテラ－ゼを発現するとともに、式ＶＩＩの化合物または４－ＯＨＴにより処置された、マウス腸腫瘍オルガノイドの共培養アッセイを示す。ＦＡＣＳ解析で測定されるように、再結合細胞の画分が示される。

【図11】４－ＯＨＴ、プロドラッグＶＩＩを１μＭおよび１０μＭで投与した細胞中のＴＣＦ４－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質、またはＤＭＳＯを投与した対照の、正規化遺伝子発現を示す。

【図12】Ｕｂ－Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２とｍＴｍＧレポーターカセットの両方を発現し、陰性対照（油、図１２Ａ）、または式ＶＩＩの化合物１μｍｏｌ（図１２Ｂ）あるいは５μｍｏｌ（図１２Ｃ）で処置された、マウス肝臓切片のＥＧＦＰに対する免疫組織化学的検査染色を示す。

【図13】ＴＧＦβシグナル伝達阻害および関連する抗癌作用に関する読み出しとしてのマウス肝転移形成アッセイを示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＴＯを埋め込み、示された化合物による処置を腫瘍細胞の接種２日後に開始した。示された化合物の治療効果を、肝転移形成阻害能を測定することで評価した。次のモル当量：９倍、３倍、１倍、０．３倍での式Ｉの化合物、式ＩＶの化合物、化合物３３８、またはガルニセルチブにより、マウスを処置した。対照マウスは空ビヒクルで処置した。肝転移（ＬｉＭ）の数を処置後に測定した（ｙ軸）。腫瘍細胞接種後２日目～１４日目にすべてのマウスを処置し、ＭＴＯ接種後４週間にわたり転移を集計する。３つの独立実験から結果を集め、これをデータポイントの形状（正方形、三角形、または円形）により表す。集めた対照に対するＰ値を次のように示す：^＊：＜０．０５、^＊＊：＜０．００１、^＊＊＊：＜０．０００１。これらの値は次のとおりである：Ｇａｌ １ｘ：０．７２、Ｇａｌ ３ｘ：０．０１０７、Ｇａｌ ９ｘ：０．００７８、（ＩＶ）１ｘ：０．０７５、（Ｉ）０．３ｘ：０．０２６、（Ｉ）１ｘ：０．０００２、（Ｉ）３ｘ：０．０００４、（Ｉ）９ｘ：０．０３５、３３８ １ｘ：０．７２、両側マン－ホイットニー。

【図14】明らかに転移性疾患のマウスに対する化合物の治療効果を示す。免疫適格マウスにＭＴＯを埋め込み、転移性疾患が明らかになったとき接種後１６日目にマウスを処置した。ＡＬＫ５阻害剤を単独、またはチェックポイント分子ＰＤ－１に対する抗体と組み合わせて用いて、マウスを処置した。確立された肝転移の数を減らす能力を測定することで、示された化合物の治療効果を評価した。示された化合物を１倍相当のモル投与量で投与した。抗体を投与するために、３日毎で２００μｇの腹腔内注射によりマウスを処置した。胃管栄養ビヒクルとＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体２００μｇにより対照マウスを処置した。マウスを１６日目から２４日目まで処置した。肝転移（ＬｉＭ、Ｙ軸）の数をエンドポイントで測定した。２つの独立実験から結果を集め、これをデータポイントの形状（正方形、、または円形）により表す。集めた対照に対するＰ値を次のように示す：^＊：＜０．０５、^＊＊：＜０．００１、^＊＊＊：＜０．０００１。これらの値は次のとおりである：Ｇａｌ １ｘ：０．５８、（Ｉ）１ｘ：０．０４８、ａＰＤ－１：０．００６８、Ｇａｌ＋ａＰＤ－１：０．１８、（Ｉ）＋ａＰＤ１：０．０００１、両側マン－ホイットニー。

【図15】明らかに転移性疾患のマウスに対する化合物の治療効果を示す。免疫適格マウスにＭＴＯを埋め込み、肝転移性疾患が明らかになったとき接種後１６日目にマウスを処置した。示された化合物での処置後にマウスの生存率を測定することで、治療効果を評価した。この化合物は１倍相当のモル投与量で投与した。対照マウスは胃管栄養ビヒクルで処置した。すべてのマウスを１６日目から２４日目まで処置した。図１４に示すのと同じ実験からデータを得る。集めた対照に対するＰ値は次のとおりであった：（Ｉ）：０．００１８、Ｇａｌ：０．６７、ログ・ランク検定。

【図16】免疫適格マウスにＭＴＯを埋め込み、転移性疾患が明らかになったとき接種後１６日目にマウスを処置した。抗ＰＤ－１抗体（２００μｇ、３日毎）による処置後、または抗ＰＤ－１抗体と１倍相当の等モル投与量の式Ｉの化合物あるいはガルニセルチブとを用いた併用免疫療法による処置後の生存率を測定することで、示された化合物の治療効果を評価した。胃管栄養ビヒクルとＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体２００μｇにより対照マウスを処置した。マウスを１６日目から２４日目まで処置した。図１４に示すのと同じ実験からデータを得る。集めた対照に対するＰ値は次のとおりであった：（Ｉ）＋ａＰＤ－１：＜０．０００１、ａＰＤ－１：０．００４８、Ｇａｌ＋ａＰＤ１：０．４３、ログ・ランク検定。

【図17】Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＭＴＯを埋め込み、示された化合物による処置を腫瘍細胞の接種２日後に開始した。示された化合物の治療効果を、肝転移形成阻害能を測定することで評価した。１倍での式Ｉの化合物、化合物３３８、または化合物３３７でマウスを処置した。対照マウスは空ビヒクルで処置した。肝転移（ＬｉＭ）の数を処置後に測定した（ｙ軸）。すべてのマウスを腫瘍細胞の接種後２～１８日目まで処置した。ＭＴＯ接種後２１日目に肝転移の数を計数した。Ｎｓは有意でなく、^＊はマン・ホイットニー両側検定により＜０．０５を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒和物、多形体、あるいは共結晶に関する。

【0030】

【化5】

【0031】

具体的に本発明は、式（Ｉ）の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物に関する。

【0032】

本発明はまた、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒和物、多形体、あるいは共結晶と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。

【0033】

本発明は、薬剤として使用するための、具体的にはＴＧＦβ経路の阻害あるいはＴＧＦβシグナル伝達の阻害に反応する疾患の処置に使用するための、式Ｉの化合物、または該化合物を含む医薬組成物に関する。本発明の目的では、用語「ＴＧＦβ経路の阻害剤」は、用語「ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤」および用語「ＴＧＦβ阻害剤」と同等であり、これら３つの用語は本記述全体にわたり目立つことなく使用される。このため、本発明の目的では、したがって用語「ＴＧＦβ経路の阻害に反応する疾患」は、用語「ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患」と同等である。

【0034】

式Ｉの化合物はＴＧＦβ経路の阻害剤である。ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＴＧＦＢＲ２、ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、およびＡＣＶＲ２Ｂからなる群から選択される１つ以上のＴＧＦβシグナル伝達経路受容体を阻害する場合がある。したがって、本発明はまた、１つ以上のＴＧＦβシグナル伝達経路受容体の阻害に反応する疾患の処置に使用するための式Ｉの化合物を指し、前記ＴＧＦβシグナル伝達経路受容体はＩ型ＴＧＦβシグナル伝達経路受容体またはＩＩ型ＴＧＦβシグナル伝達経路受容体であり、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＴＧＦＢＲ２、ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、およびＡＣＶＲ２Ｂからなる群から選択される。それゆえ、本発明は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５、ＡＬＫ６、ＡＬＫ７、ＴＧＦＢＲ２、ＢＭＰＲ２、ＡＣＶＲ２Ａ、およびＡＣＶＲ２Ｂからなる群から選択される１つ以上のＴＧＦβシグナル伝達経路受容体の阻害剤として使用するための、式Ｉの化合物に関する。

【0035】

実施例２の表１に挙げられる結果より、式Ｉの化合物はガルニセルチブよりもＡＬＫ５に対する結合親和性が驚くほど高かった（８．６倍）ことが認められる。この比較は、同じ技術（ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標））を用いて公開データ（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８，９（６）：６６５９－６６７７）を考慮して行われている。また、実施例２の表２と図１に見られるように、ＡＬＫ５キナーゼ酵素力阻害のほか、式Ｉの化合物の培養細胞のＴＧＦβシグナル伝達阻害能は、ガルニセルチブの約２．５倍である。さらに、実施例２（表１）に記載されるように、選択性アッセイ（ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）技術）により、式Ｉの化合物の特徴として、ＡＬＫ５に対する選択性は、ＡＬＫ１、ＡＬＫ２、およびＡＬＫ３に対して３００倍、ＴＧＦＢＲ２に対して１００倍、ならびにＡＣＶＲ２ＢおよびＡＬＫ６に対してそれぞれ５倍と８倍大きいことが認められる。さらに、式Ｉの化合物は、試験した全タンパク質に対する選択性がガルニセルチブより高かった。

【0036】

したがって、式Ｉの化合物と先行技術の化合物との構造上の差異により、ＴＧＦβシグナル伝達阻害能は驚くほど強く改善され、このことはより良好なＡＬＫ５阻害に関連付けられる。式Ｉの化合物はまた、結合親和性をＡＬＫ５と比較した場合、先行技術の化合物よりも選択的である。他方、式Ｉの化合物は明確化した毒性スクリーンを有しており、遺伝毒性に対するスクリーン、薬物有害反応に強く関連するタンパク質の摂動（実施例２に記載されるように、ＳａｆｅｔｙＳｃｒｅｅｎ４４（商標））、および、式Ｉの化合物がガルニセルチブに比べて毒性プロファイルを改善し、場合により断続的処置の必要性を回避することを示すインビボ（マウス）毒性（実施例４）が挙げられる。

【0037】

式Ｉの化合物は、フェノールがパラ位にて隠れているか保護されているｐ－アニリンから合成されてもよい。この意味では、式Ｉの化合物の合成は、スキーム１の逆合成解析に見られるような様々な経路を使用してもよい。

【0038】

【化6】

【0039】

実施例１は、好ましい合成経路（ａ）と（ｄ）に従う式Ｉの化合物の調製に相当する合成詳細すべてを含むが、合成経路（ｂ）と（ｃ）も、本発明に従い式Ｉの化合物を得るのに適切な経路である。

【0040】

【化7】

【0041】

経路（ａ）は式Ｉの化合物の合成を含むが、保護されたパラ－ヒドロキシアニリンから逸脱しており、ここで前記保護されたフェノールは端部でのみ脱保護される。第１の工程では、ルイス酸触媒存在下でのデーブナー・ミラー反応を介して６－メトキシ－４－メチルキノリンが得られる。デーブナー・ミラー反応は当該技術分野で周知である（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｆ．Ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９４４，３５，１５３）。

【0042】

第２の工程では、強塩基（共役酸のｐＫａが１７超）と適切な条件の存在下でメチル６－メチルピコリネートを添加することで、６－メトキシ－４－メチルキノリンのアシル化が行われる。

【0043】

最後に、まずディーン・シュタルク条件下で１－アミノピロリジン－２－オンとルチジンなどの塩基とを使用し、続いてディーン・シュタルク条件下での脱水に際してメチル脱保護された式Ｉの化合物をもたらす環化に適切な条件を使用して、ケトン中間体をメチル脱保護された式Ｉの化合物へと形質転換させる。

【0044】

メチル基はＡｃＯＨのＨＢｒにおいて還流することで取り除くことができるが、ＢＢｒ_３、ＢＣｌ_３、ＴＭＳＣｌ／ＮａＩ、またはＢＦ_３／ＲＳＨなどの他の通常の脱保護条件を使用することができる。

【0045】

【化8】

【0046】

経路（ｂ）は経路（ａ）と同等の第１の工程を含み、パラ－ニトロアニリンの改変デーブナー・ミラー反応が実施される。第２の工程はまた、塩基の存在下でメチル６－メチルピコリネートを添加する６－ニトロ－４－メチルキノリンのアシル化を含む。続いて、ヒドラゾン形成と環化を行う工程を、経路（ａ）と同様に実施した。既知の方法（Ｈ_２／Ｐｄ／Ｃ；Ｓｎ／ＨＣｌなど）、およびジアゾニウム塩の加水分解によるアミノ基からフェノールへの変換のいずれかにより、ニトロ誘導体の還元を行う。

【0047】

【化9】

【0048】

経路（ｃ）は経路（ａ）と同等の第１の工程を含み、改変デーブナー・ミラー反応がパラ－フルオロアニリンとクロラニルなどの酸化剤を用いて実行される。第２の工程はまた、強塩基の存在下でメチル６－メチルピコリネートを添加して実施された６－フルオロ－４－メチルキノリンのアシル化を含む。続いて、ヒドラゾン形成と環化を行う工程を、経路（ａ）と同様に実施する。遷移金属触媒作用、またはＦｉｅｒ ａｎｄ Ｍａｌｏｎｅｙ（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１６，１８，２２４４）に記載されるようなアセトキシヒドロキサム酸の使用を含む様々な方法で、フルオロ誘導体からフェノールへの変換を行うことができる。

【0049】

【化10】

【0050】

経路（ｄ）は経路（ａ）と同等の第１の工程を含み、酸化剤として空気を用いてパラ－ブロモアニリンの改変デーブナー・ミラー反応が実施される。第２の工程はまた、強塩基の存在下でメチル６－メチルピコリネートを添加して実施された６－ブロモ－４－メチルキノリンのアシル化を含む。続いて、ヒドラゾン形成と環化を行う工程を、経路（ａ）と同様に実施する。続いて、宮浦ホウ素化（Ｔ．Ｉｓｈｉｙａｍａ，Ｍ．Ｍｕｒａｔａ，Ｎ．Ｍｉｙａｕｒａ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０：７５０８－７５１０）を用いて式Ｉの化合物を得ることができ、ここで臭化アリールは、ビス（ピナコラート）ジボロン（Ｂ_２Ｐｉｎ_２）などのジボロニルエステル類とのＰｄ触媒クロスカップリング反応を介して、対応するボロン酸エステルへと変換される。このカップリングはＰｄ（０）／Ｐｄ（ＩＩ）機構を介して進められるため、Ｐｄ（０）のあらゆる供給源が反応を行うことができる。好ましい実施形態では、［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（Ｐｄ（ＤＰＰＦ）Ｃｌ_２）が適切な試薬である。さらに精製することなく、ボロン酸エステルを過酸化水素で酸化することができ、その後の塩基性媒体での加水分解後、式Ｉの化合物が得られる。

【0051】

本発明はさらにプロドラッグに関する。プロドラッグは活性な薬剤または薬物（親化合物）に由来する化合物であり、溶解性、吸収、分布、代謝、排泄、および毒性などの特性を調節するよう修飾されている。それゆえ、プロドラッグは、溶解性、吸収、分布、代謝、排泄、および毒性などの１つ以上の特性を同時に調節する間に、活性を低減するか遮断する断片に付けられる親化合物を含む、化合物である。

【0052】

具体的に本発明は、式Ｉの化合物のプロドラッグに関する。

【0053】

本発明の実施形態は式Ｉの化合物のプロドラッグに関し、前記プロドラッグは、式ＩＩ、またはその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒和物、多形体、あるいは共結晶を有しており、

【0054】

【化11】

式中、
Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、ならびに
Ｒ_２とＲ_３はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、およびハロアルキルからなる群から選択される。

【0055】

一実施形態は式Ｉの化合物のプロドラッグに関し、前記プロドラッグは式ＩＩ、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を有し、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、Ｒ_３はＨである。別の実施形態では、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、およびヒドロキシアルキルからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、Ｒ_３はＨである。

【0056】

本発明の好ましい実施形態では、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はメチルであり、Ｒ_３はＨであり、式Ｉの化合物のプロドラッグは、式（ＩＩＩ）のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒和物、多形体、あるいは共結晶である。

【0057】

【化12】

【0058】

好ましくは、式Ｉの化合物のプロドラッグは、式（ＩＩＩ）のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物である。実施例１に示すように、式Ｉの化合物のフェノール基と、アセトバニロンフェノール基が保護されたアセトバニロンのハロゲン化誘導体とのアルキル化反応、続いてアセトバニロン部分の脱保護により、式ＩＩＩのプロドラッグが得られる。

【0059】

別の好ましい実施形態では、式Ｉの化合物のプロドラッグは、式（ＩＶ）のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒和物、多形体、あるいは共結晶である。

【0060】

【化13】

【0061】

好ましくは、式Ｉの化合物のプロドラッグは、式（ＩＶ）のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物である。実施例１に示すように、式Ｉの化合物と４－ピペリジノピペリジン－１－カルボニルクロリドとの反応により、式ＩＶのプロドラッグが得られる。

【0062】

用語「含む」は、特徴（Ａ、Ｂ、Ｃ）の群を含むと理解されるが、他の特徴も含まれる実施形態を除外するものではなく、このとき他の特徴は前記実施形態を実行不能にしない。加えて、本発明の目的では、前記用語「含む」は、前記特徴（Ａ、Ｂ、Ｃ）のみが含まれる実施形態も含み、この場合には用語「～からなる」と置き換えられる場合がある。

【0063】

用語「薬学的に許容可能な塩」は任意の薬学的に許容可能な塩を指し、患者への投与に際し、本明細書に記載されるような化合物を（直接的または間接的に）提供することができる。

【0064】

このような塩は酸付加塩または塩基付加塩であるのが好ましい。酸付加塩の例として、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などの鉱物酸付加塩、ならびに、例えば酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、琥珀酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩などの有機酸付加塩が挙げられる。塩基付加塩類の例として、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、およびアンモニウム塩などの無機塩、ならびに、例えばエチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ－ジアルキレンエタノールアミン、トリエタノールアミン、および塩基性アミノ酸塩などの有機塩基性塩が挙げられる。しかし、薬学的に許容可能でない塩も薬学的に許容可能な塩の調製に有用な場合があるため、本発明の範囲内にあることが認識される。塩の形成手順は当該技術分野で周知である。

【0065】

本発明の一実施形態では、式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩は、塩基付加塩または酸付加塩である。好ましい実施形態では、前記式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、エタノールアミン塩、Ｎ，Ｎ－ジアルキレンエタノールアミン塩、およびアミノ酸塩からなる群から選択される。

【0066】

他の好ましい実施形態では、前記式Ｉの化合物の薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、酒石酸、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩からなる群から選択される。

【0067】

本発明の一実施形態では、式ＩＩのプロドラッグ、具体的には式ＩＩＩのプロドラッグの薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩である。好ましい実施形態では、前記式ＩＩのプロドラッグ、具体的には式ＩＩＩのプロドラッグの薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、リン酸水素塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、グルコン酸塩、酒石酸、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩からなる群から選択される。

【0068】

本発明の一実施形態では、式ＩＶの化合物の薬学的に許容可能な塩は、塩基付加塩または酸付加塩である。好ましい実施形態では、前記式ＩＶの化合物の薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、およびｐ－トルエンスルホン酸塩からなる群から選択される。最も好ましくは、前記式ＩＶの化合物の薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である。

【0069】

別の好ましい実施形態では、前記式ＩＶの化合物の薬学的に許容可能な塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、エタノールアミン塩、Ｎ，Ｎ－ジアルキレンエタノールアミン塩、およびアミノ酸塩からなる群から選択される。

【0070】

本発明に係る用語「溶媒和物」は本発明に係る活性化合物のあらゆる形態を意味するものとして理解されたい。前記化合物は、特に水和物とアルコラートを含む別の分子（通常は極性溶媒）へと非共有結合により結合される。本発明の一実施形態では、前記薬学的に許容可能な溶媒和物はアルコラートである。本発明の一実施形態では、前記薬学的に許容可能な溶媒和物は水和物である。本発明の一実施形態では、前記式Ｉの化合物、前記式ＩＩのプロドラッグ、前記式ＩＩＩのプロドラッグ、または前記式ＩＶのプロドラッグは、一水和物である。

【0071】

本明細書では、用語「多形体」は、同じ化学組成を持つが、結晶を形成する分子、原子、および／またはイオンの空間的配置が異なっている結晶形態を指す。したがって、式Ｉの同じ化合物、またはその医薬塩あるいは医薬溶媒和物は、前記結晶形態を形成する原子またはイオンの空間的配置に応じて、様々な結晶多形体を含む場合がある。

【0072】

式Ｉの化合物は、実施例２～４、および実施例８～１０に示すように、阻害能が改善されかつ低毒性を特徴とする、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害剤である。

【0073】

したがって、一実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害に反応する疾患の処置に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、薬学的に許容可能な溶媒和物、多形体、あるいは共結晶に関する。好ましくは、ＴＧＦβ経路阻害に反応する疾患の処置に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物に関する。

【0074】

プロドラッグは、前記薬剤または薬物に結合される断片の切断後に親化合物へと形質転換される。これは様々な酵素により行われる場合がある。

【0075】

式Ｉの化合物のプロドラッグは代謝されると、式Ｉの化合物を放出し、それにより腫瘍へと局所投与され、このようにして、ＴＧＦβシグナル伝達経路の連続阻害が行われると有害作用をもたらす系統的経路阻害を防ぐ。したがって、式Ｉの化合物のプロドラッグは、ＴＧＦβ経路の阻害に反応する疾患の予防および／または処置にも有用である。

【0076】

図１と表２に見られるように、式Ｉの化合物のプロドラッグ、式ＩＩのプロドラッグ、式ＩＩＩのプロドラッグ、および式ＩＶのプロドラッグは、インビトロでのＴＧＦβシグナル伝達阻害能が低下しているが、インビボで式Ｉの化合物を送達する。すなわち、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶの各プロドラッグは、インビボで代謝されて式Ｉの活性化合物を放出するプロドラッグである。

【0077】

実際に、式ＩＶのプロドラッグの４－ピペリジノピペリジン基は水溶性をもたらし、例えば肝臓細胞や腸細胞で発現されるインビボでのカルボキシルエステラーゼによる加水分解を介して切断される。

【0078】

したがって、式ＩＶのプロドラッグが投与されると、式Ｉの化合物は、肝臓細胞や腸細胞でのカルボキシルエステラーゼによる加水分解に際して放出される。この主な利点としては、全身毒性を少なくして高局用量の投与とＴＧＦβシグナル伝達阻害が可能になるということである。

【0079】

他方、式ＩＩのプロドラッグ、具体的には式ＩＩＩのプロドラッグのアセトバニロン由来の断片は、シトクロムＰ４５０酵素ファミリー（主に肝臓に存在）などの酵素により酸化かつ切断することができ、この酵素は式Ｉの化合物を送達するエーテル結合を加水分解する。一方で、スフィンゴビウム属細菌株ＳＹＫ－６酵素ＬｉｇＥとＬｉｇＦ、真菌Ｄｉｃｈｏｍｉｔｕｓ ｓｑｕａｌｅｎｓ Ｄ－ＧＳＴ１など、非哺乳動物由来の特異的なβ－エーテラーゼを用いて、式Ｉの化合物もその式ＩＩのプロドラッグから得ることができる。これらは式ＩＩのプロドラッグ、好ましくは式ＩＩＩのプロドラッグと合わせて投与することができる。

【0080】

したがって、一実施形態は、ＴＧＦβ経路の阻害に反応する疾患の処置に使用するための式ＩＩのプロドラッグを指し、ここでβ－エーテラーゼ酵素は、式ＩＩの化合物と一緒に、その後、または前に投与される。好ましい実施形態は、ＴＧＦβ経路の阻害に反応する疾患の処置に使用するための式ＩＩＩのプロドラッグを指し、ここでβ－エーテラーゼ酵素は、式ＩＩＩの化合物と一緒に、またはその後に投与される。実施例６は、どのようにしてＬｉｇＦすなわちβ－エーテラーゼ酵素が、４－メチルウンベリフェロンのアセトバニロンエーテルおよび４－ヒドロキシタモキシフェンのアセトバニロンエーテルを用いて実行されたモデル実験において、アセトバニロン断片を切断するエーテル結合を加水分解できるのかを示している。

【0081】

特定の実施形態では、β－エーテラーゼ酵素は、細胞療法、例えば養子Ｔ細胞移入や樹状細胞ワクチン療法として、前記β－エーテラーゼ酵素を発現する細胞中で投与される。代替的に、別の特定の実施形態では、β－エーテラーゼ酵素は、腫瘍または間質に特異的な抗体へと、随意にグルタチオンとともに結合されて投与される。肺内膜などのある組織は細胞外レベルが高いグルタチオンを含み、したがってグルタチオンの投与は必要とされない。

【0082】

式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物は、ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害剤として活性が大きく低減されており、そのため、βエーテル結合が切断されない限り、ＴＧＦβ経路に対する効果をほとんどまたは全く生じさせることなく投与することができる。

【0083】

式ＩＩまたは式ＩＩＩのプロドラッグ、もしくはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物が投与されると、式Ｉの化合物は、β－エーテラーゼの局所投与に際し、標的腫瘍間質の中で放出される。この主な利点としては、全身毒性を少なくして高局所用量の投与とＴＧＦβシグナル伝達経路阻害が可能になるということである。

【0084】

他方、式ＩＶを有する式Ｉの化合物のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩はさらに、インビトロでのＴＧＦβシグナル伝達阻害活性を低減し、インビボで投与されると加水分解されて、肝臓細胞や腸細胞などの様々な体組織細胞に発現されるカルボキシルエステラーゼの酵素作用によりインビボで式Ｉの化合物を生じさせる。

【0085】

その後、式Ｉの化合物は、有効なガルニセルチブ用量よりも少ない用量で（実際は１０倍少ない）、インビボ実験において有効であることが分かった。さらに、有効用量では、式Ｉの化合物には毒性がなかった（インビボで全体、組織切片上では病理学的）が、マウス関連投与量でのガルニセルチブには毒性があった（実施例２～４を参照）。図１と表２に見られるように、式ＩＩＩのプロドラッグや式ＩＶのプロドラッグなど、式Ｉの化合物のプロドラッグにおけるインビトロでのＴＧＦβシグナル伝達阻害能は、最大１０倍少なく、これにより、式Ｉの化合物のＴＧＦβシグナル伝達阻害能は上手く閉じ込められる（ｃａｇｅｄ）か遮断されることが認められる。

【0086】

図２は、式Ｉの化合物の高いＴＧＦβシグナル伝達阻害活性を示しているが、式ＩＶのプロドラッグは、インビトロでは有意なＴＧＦβシグナル伝達阻害活性を示さなかったが、式Ｉの活性化合物を送達する前記プロドラッグのインビボでの加水分解により、インビボでは高いＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害活性をもたらす。

【0087】

したがって、本発明の一実施形態は、式Ｉの化合物のプロドラッグを指し、ここで、前記プロドラッグは、製剤として使用するための、特にＴＧＦβシグナル伝達に反応する疾患の処置に使用するための、式ＩＩのプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶である。好ましくは、前記プロドラッグは、式ＩＩＩのプロドラッグである。好ましい実施形態は、製剤として使用するための、特にＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の処置に使用するための、式ＩＩＩの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物を指す。

【0088】

別の実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の処置のための製剤の製造における、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、あるいは前記式Ｉの化合物を含む組成物の使用を指す。

【0089】

追加の実施形態は、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、随意に１つの追加の有効成分または治療剤とを含む医薬組成物を指す。

【0090】

本発明の目的上、「有効成分」または「治療剤」との用語は、本発明の化合物またはそのプロドラッグの治療効果を改善または増強する別の化合物または治療を指す。

【0091】

本発明の別の実施形態は式Ｉの化合物のプロドラッグを指し、ここで、前記プロドラッグは、薬剤として使用するための、特にＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の処置に使用するための、式ＩＶのプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶である。好ましくは、薬剤として使用するための、特にＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の処置に使用するための、式ＩＶの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩あるいは薬学的に許容可能な溶媒和物である。

【0092】

本発明の別の実施形態は、前記式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物の、単独での、または少なくとも前記式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグを、相加的または相乗的な生物学的活性を有する少なくとも１つの他の活性化合物または治療剤と組み合わせて含む組成物、特に医薬組成物中で製剤化された、薬剤としての使用に関する。

【0093】

この意味で、本発明の一実施形態は、他の癌標的療法または化学療法と組み合わせて、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の予防および／または処置に使用するための、式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物、もしくは前記化合物の少なくとも１つを含む医薬組成物に関する。

【0094】

本発明の目的上、「化学療法」との用語は、細胞を殺すことによって、または細胞の分裂を止めることによって、癌細胞の成長を止める作用をするあらゆる処置を指す。

【0095】

したがって、本発明の１つの実施形態は、化学療法または化学療法剤と組み合わせて使用するための、式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物、もしくは前記化合物の少なくとも１つを含む医薬組成物を指す。特に、白金系抗悪性腫瘍剤、有糸分裂阻害化学療法剤（ａｎｔｉ－ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）、ポリアデノシン二リン酸リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤、エポチロン、細胞骨格破壊剤（ｃｙｃｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）、アルキル化剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、キナーゼ阻害剤、葉酸代謝拮抗剤、キナーゼ阻害剤、ペプチド抗生物質、レチノイド、ビンカアルカロイド、およびチミジル酸シンターゼ阻害剤からなる群から選択される１つの化学療法剤と組み合わされる。好ましくは、化学療法剤は、シクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、テモゾロミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、タキソテール、エポチロン、ボリノスタット、ロミデプシン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、エキサテカン、ルルトテカン、エトポシド、テニポシド、タフルポシド、ボルテゾミブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、アザシタジン、アザチオプリン、カペシタビン、シタラビン、クラドリビン、フルダラビン、ドキシフルリジン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカプトプリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、チオグアニン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トレチノイン、アリトレチノイン、ベキサロテン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンからなる群から選択される。

【0096】

本発明の目的上、「癌標的療法」という用語は、癌の特定の遺伝子、タンパク質、または癌の成長と生存に寄与する組織環境を標的とするあらゆるタイプの治療を指す。したがって、本発明の一実施形態は、癌標的療法と組み合わせて、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の予防および／または処置に使用するための、式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物、もしくは前記化合物の少なくとも１つを含む組成物を指し、好ましくは、前記癌標的療法は、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤、遺伝子発現モジュレーター、アポトーシス誘導剤、血管新生阻害剤、免疫療法剤、毒性分子を送達するモノクローナル抗体、癌治療、および遺伝子治療からなる群から選択される。

【0097】

したがって、本発明の一実施形態は、免疫療法と組み合わせてＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の予防および／または処置に使用するための、式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物、もしくは前記化合物の少なくとも１つを含む組成物を指す。

【0098】

本発明の目的上、「免疫療法」という用語は、癌細胞を殺すために免疫系を活性化する免疫療法剤、化合物、または成分を指す。より好ましくは、免疫療法または免疫治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤であり、さらに好ましくは、抗ＰＤ－１またはＰＤＬ１阻害剤である。

【0099】

この意味で、本発明の別の実施形態は、免疫療法剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤、より好ましくは抗ＰＤ１またはＰＤＬ１阻害剤、さらに好ましくは抗ＰＤ１抗体と組み合わせて、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の予防および／または処置に使用するための、式Ｉの化合物またはそのプロドラッグ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、および式ＩＶのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容可能な塩あるいは溶媒和物、もしくは前記化合物の少なくとも１つを含む医薬組成物を指す。

【0100】

プログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、Ｔ細胞で発現される膜貫通タンパク質であり、Ｔ細胞の活性化を負に制御する免疫チェックポイントとして機能し、免疫系のダウンレギュレーションを引き起こす。投与により、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、ＰＤ－１およびその下流のシグナル伝達経路に結合して阻害し、Ｔ細胞の活性化および腫瘍細胞に対する細胞媒介性の免疫応答により、免疫機能を回復させる。

【0101】

好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの他の活性化合物または治療剤は、ＰＤ１を阻害する腫瘍溶解性ウイルス、および抗ＰＤ－１またはＰＤＬ１の抗体、ＰＤ－１またはＰＤＬ１を阻害する二重特異性モノクローナル抗体、ＰＤ－１またはＰＤＬ－１を阻害する低分子、ＰＤ－１に拮抗するタンパク質、およびＰＤ－１を標的とするワクチンからなる群から選択される。

【0102】

好ましい実施形態では、前記少なくとも１つの他の活性化合物または治療剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、カムレリズマブ、シンティリマブ、トリパリマブ、チスレリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、ＫＮ－０３５、ＣＫ－３０１、ＡＵＮＰ１２、ＣＡ－１７０、ＢＭＳ－９８６１８９、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ０６８０、ＬＹ３３０００５４、ＬＹ－３４３４１７２、ＡＰＬ－５０２、ビントラスプ・アルファ、ＣＳ－１００１、ＳＨＲ－１３１６、ＢＧＢＡ－３３３、ＣＸ－０７２、ＧＥＮ－１０４６、ＧＳ－４２２４、ＩＯ－１０３、ＫＤ－００５、ＫＬＡ－１６７、ＫＮ－０４６、ラゼルチニブ、ＳＴＩＡ－１０１４、ＷＰ－１０６６、ＡＤＧ－１０４、ＢＣＤ－１３５ ＢＣＤ－１３５、ＦＡＺ－０５３、ＦＰＴ－１５５、ＦＳ－１１８、ＨＬＸ－２０、ＩＢＩ－３１８、ＩＮＢＲＸ－１０５、ＩＮＣＢ－８６５５０、ＪＳ－００３、ロダポリマブ、ＬＰ－００２、ＭＣＬＡ－１４５、ＭＳＢ－２３１１、ＲＧ－６０８４、ＳＨＲ－１７０１、ＳＬ－２７９２５２、ＳＴＩＡ－１０１５、ＬＹＮ－００１０２、ＡＣＥ－０５、ＡＰ－２０１、ＡＰ－５０５、ＡＶＡ－００４、ＡＶＡ－０２１、ＢＢＩ－８０１、ＢＨ－２９９６ｈ、ＢＨ－２９ＸＸ、ＣＡ－３２７、ＣＤＸ－５２７、ＣＴＸ－８３７１、ＤＰＤＬ－１Ｅ、ＤＳＰ－１０５、ＤＳＰ－１０６、Ｇｅｎｓｃｉ－０４７、ＨＳ－６３６、ＩＢＩ－３２２、ＩＢＩ－３２３、ＩＫＴ－２０１、ＩＭＭ－２５０５、ＪＢＩ－４２６、ＫＤ－０３３、ＫＹ－１０４３、ＮＤ－０２１、ＰＨ－７９０、ＰＭＣ－１２２、ＰＲＳ－３４４、ＳＮＡ－０２、ＳＴＴ－０１、ＴＪＬ－１４Ｂ、ＴＪＬ－１Ｃ４、ＴＪＬ－１Ｄ５、ＴＪＬ－１Ｈ３、ＴＪＬ－１Ｉ７、Ｔｏｃａ－５２１、ＶＸＭ－１０、Ｙ－１１１、ＡＢＭ－１０１、ＡＢＰ－１６０、ＡＶＡ－０２７、ＡＶＡ－０４０、ＤＢ－００２、ＤＢ－００３、ＩＭＣ－２１０１、ＩＭＣ－２１０２、ＩＭＭ－２５１０、ＴＥ－７２１２、ＴＸＢ－４ＢＣ３、ＹＢＬ－００７、ＹＢＬ－００８、ＡＬＮ－ＰＤＬ、ＢＨ－２９４１、ＢＭＳ－９３６５５９ ＣＢＡ－０７１０、ＧＸＰ－２、ＨＴＩ－１３１６、ＩＧＥＭ－Ｐ、ＩＭＭ－２５、ＩＭＭ－２５０２、ＩＭＭ－２５０３、ＩＭＭ－２５０４、ＩＯ－１０４、ＫＤ－０３６、ＫＹ－１００３、ＫＹ－１０５５、ＭＳＢ－００２、ＰＭＣ－３０５、ＳＴＩＡ－１００Ｘ、ＳＴＩＡ－１０１０、ＳＴＩＡ－１０１１、ＳＴＩＡ－１０１２、ＳＴＩＢ－０１０Ｘ、ＬＹ－３４１５２４４、ＡＫ－１０３、ＡＫ－１０４、ＡＫ－１０５、ＡＫ－１０６、ドスタルリマブ、ＨＬＸ－１０、プロルゴリマブ（ｐｒｏｌｇｏｌｉｍａｂ）、スパルタリズマブ、ＡＰＬ－５０１、バルスチリマブ、ＢＡＴ－１３０６、ＢＩ－７５４０９１、セトレリマブ、ＧＬＳ－０１０、ＭＧＡ－０１２、ピディリズマブ、ＳＣＴＩ－１０Ａ、ＡＭＧ－４０４、ＢＣＤ－２１７、ブジガリマブ、ＣＣ－９０００６、ＣＳ－１００３、Ｆ－５２０、ＨＡＢ－２１、ＨＸ－００９、ＩＢＩ－３１８、ＪＴＸ－４０１４、ＬＹ－３４３４１７２、ＬＺＭ－００９、ＭＥＤＩ－５７５２、ＭＧＤ－０１３、ＭＧＤ－０１９、ＯＮＯ－４６８５、ＲＯ－７１２１６６１、ササンリマブ、スリツズマブ（ｓｕｌｉｔｕｚｕｍａｂ）、Ｓｙｍ－０２１、ＸｍＡｂ－２０７１７、ＸｍＡｂ－２３１０４、ＡＫ－１１２、ＰＳＢ－２０５、ＡＫ－１２３、ＡＬＰＮ－２０２、ＡＭ－０００１、ＡＮＢ－０３０、ＢＨ－２９２２、ＢＨ－２９５０、ＢＨ－２９５４、ＢＨ－２９９６ｈ、ＣＢ－２０１、ＣＢ－２１３、ＣＢＴ－１０３、ＣＢＴ－１０７、ＣＴＸ－８３７１、ＧＮＲ－０５１、ＨＥＩＳＣＯＩＩＩ－００３、ＩＢＩ－３１９、ＫＥＹ－Ｖａｘｘ、ＬＤ－０１、ＬＤ－１０、ＭＤ－４０２、ｍＤＸ－４００、ＯＴ－２、ＰＣ－１０１、ＰＥＧＭＰ－７、ＰＨ－７６２、ＰＲＳ－３３２、ＰＴ－００１、ＲＯ－７２４７６６９、ＳＧ－００１、ＴＳＲ－０７５、ＡＴ－１６２０１、ＤＢ－００４、ＩＫＴ－２０２、ＩＭＴ－２００、ＫＦ－０８２、ＬＢＬ－００６、ＳＳＩ－３６１、ＹＢＬ－００６、ＪＹ－０３４、ＴＲＳ－００７、ＡＭＰ－２２４、ＡＵＲ－０１２、ＢＧＢ－１０８、ＢＨ－２９４１、ＢＬＳＭ－１０１、ＣＸ－１８８、ＥＮＵＭ－２４４Ｃ８、ＥＮＵＭ－３８８Ｄ４、ＩＭＭ－１８０２、ＭＥＤＩ－０６８０、ＳＮＡ－０１、ＳＴＩＡ－１１１０、およびＳｙｍ－０１６からなる群から選択される。

【0103】

代替的に、前記組成物は、共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化薬、防腐剤、安定化剤、および抗酸化剤などの担体または賦形剤として少なくとも１つの不活性な成分とともに製剤化可能である。任意の薬理学的に許容可能な緩衝液、例えば、ＴＲＩＳまたはリン酸塩緩衝液が使用されてもよい。

【0104】

さらなる実施形態は、式Ｉの化合物のプロドラッグであって、式ＩＩまたは式ＩＩＩを有するプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、および、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、および、随意に１つの追加の有効成分を含む医薬組成物を指す。別のさらなる実施形態は、式Ｉの化合物のプロドラッグであって、式ＩＶを有するプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、および、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤、および、随意に１つの追加の有効成分を含む医薬組成物を指す。

【0105】

別の実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患の処置のための製剤の製造における、式Ｉの化合物のプロドラッグまたはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、あるいは前記式Ｉの化合物のプロドラッグを含む組成物の使用を指す。好ましい実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害に反応する疾患の処置のための製剤の製造における、式ＩＩのプロドラッグ、より好ましくは式ＩＩＩのプロドラッグ、または式ＩＶのプロドラッグの使用を指す。

【0106】

本発明の追加の実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害に反応する疾患を処置するための方法を指し、上記方法は、有効な量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、あるいは前記式Ｉの化合物を含む組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。

【0107】

本発明の別の実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害に反応する疾患を処置するための方法を指し、上記方法は、有効な量の式Ｉの化合物のプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、あるいは前記式Ｉの化合物のプロドラッグを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。好ましくは、式Ｉの化合物のプロドラッグは、式ＩＩ、または式ＩＩＩ、または式ＩＶのプロドラッグである。好ましい実施形態は、ＴＧＦβシグナル伝達阻害に反応する疾患を処置するための方法を指し、上記方法は、有効な量の式ＩＩ、または式ＩＩＩ、または式ＩＶのプロドラッグ、またはその薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶、あるいは前記プロドラッグを含む組成物を、それを必要とする被験体に投与する工程を含む。

【0108】

本発明の実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患は、癌、強皮症、乾癬、貧血、サルコペニア、アルツハイマー病、マルファン症候群、動脈瘤、肺高血圧症、骨形成不全症、特発性肺線維症、肝線維症、肝硬変、脂肪肝、肥大型心筋症、骨髄線維症、神経線維腫症Ｉ型、線維性腎臓病、巣状分節性糸球体硬化症、放射線誘発性線維症、全身性硬化症における皮膚の線維化、びまん性全身性硬化症、瘢痕形成、角膜原発性翼状片、線維症、子宮平滑筋腫、肥満、糖尿病、糖尿病性網膜症における微小血管症、および腎症からなる群から選択される。特定の実施形態では、瘢痕形成は、病的な皮膚の瘢痕、皮膚の瘢痕、または角膜の瘢痕である。

【0109】

特定の実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患は、動脈再狭窄も含む。

【0110】

癌の進行において、ＴＧＦβシグナル伝達は、細胞増殖、血管新生、上皮間葉転換、免疫の浸潤と調節、転移の拡散、および薬剤耐性に関与している。前述したように、ＴＧＦβシグナル伝達経路の全体的な効果は、腫瘍の成長、浸潤、および転移を強く促進すると思われる。

【0111】

好ましい実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患は、癌である。好ましい実施形態では、癌は固形腫瘍である。別の好ましい実施形態では、癌は固形癌ではない。さらなる好ましい実施形態では、癌は小児癌である。

【0112】

図３に見られるように、式Ｉの化合物は、参照化合物であるガルニセルチブ（ｇａｌｕｎｉｓｅｒｔｉｂ）と比較して、ガルニセルチブの等モル投与量の１／３であっても、肝転移形成をブロックする能力が向上した。

【0113】

図１３は、式Ｉの化合物が治療活性の大きな改善を示し、ガルニセルチブよりも、かつ、予期せぬことに先行技術によって開示された参照化合物４－［２－（メチル－ピリジン－２－イル）５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル］－キノリン－７－オール（参照化合物３３８）よりもはるかに大きな範囲で肝転移形成をブロックする様子を示している：

【0114】

【化14】

【0115】

見て分かるように、参照化合物３３８は、キノリン部分の７位にフェノール性ヒドロキシルを有する式Ｉの化合物の構成異性体であるのに対し、式Ｉの化合物はキノリン部分の６位に前記フェノール性ヒドロキシルを有することを特徴とするので、図１３に示す結果は非常に予想外である。

【0116】

この意味では、ＡＬＫ５に対する式Ｉの化合物のＩＣ_５０として測定される酵素活性阻害も、先行技術の化合物３３７、３３８、およびガルニセルチブと比較して、本発明の化合物の予想外の高い効力を裏付けるものである。

【0117】

４－（２－ピドリジン－２－イル－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）－キノリン－７－オール（参照化合物３３７）の構造は、参照化合物３３７が、ピリジン部分の２位にメチル基を含まず、キノリン部分の７位にフェノール性ヒドロキシルを有し、式Ｉの化合物のようにはキノリン部分の６位にフェノール性ヒドロキシルを有していないことを特徴とする点で、式Ｉの化合物とは異なる。

【0118】

【化15】

【0119】

実施例２で特徴づけられた表２に見られるように、結果は、構造的には、フェノール性ヒドロキシルの位置とピリジン部分のメチル基の有無が異なるだけであるが、式（Ｉ）の化合物は、予想に反して、参照化合物３３８よりも２．１倍、参照化合物３３７よりも１．８倍の効力を持つことを示している。

【0120】

追加のインビボアッセイは、式Ｉの化合物の治療効果を化合物３３７および３３８と比較している。図１７は、式Ｉの化合物が、化合物３３８よりも、治療活性の大きな向上を示し、かつ、肝転移形成をはるかに大きく阻害することを示しており、これは図１３に示した結果を裏付けている。この実験は、式（Ｉ）の化合物が、これらのインビボ転移アッセイにおいて、化合物３３７と比較して高い治療活性を示すことも実証している。したがって、本発明は、コア構造における置換の種類およびその位置が、驚くべきことに、式（Ｉ）の化合物によって示された予想外の改善された効力を提供することを示している。さらに、Ｌｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１（７）：２３０２－２３０６）は電子不足の比較的小さな基が６位で許容されたことを開示しており、これは、７位のヒドロキシルを特徴とする先行技術の構造異性体３３８と比較して驚くほど強い効力が得られる式（Ｉ）の化合物によって６位で特徴付けられるヒドロキシルなどの電子供与基の導入とはかけ離れたものを教示している。

【0121】

一方、図１３は、式ＩＶのプロドラッグが、インビトロでのＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害能力が最大１０倍低いが、インビボの転移アッセイでは式Ｉの化合物と同様の治療活性をもたらすことも示している。したがって、式ＩＩＩのプロドラッグと式ＩＶのプロドラッグは、インビトロのアッセイでは式Ｉの化合物よりも最大１０倍低いＴＧＦβシグナル伝達阻害能力を有するが、インビボでは同様の治療活性を示す。この結果は、式ＩＩＩと式ＩＶのプロドラッグのＴＧＦβシグナル阻害能力が、インビトロでは閉じ込められ、またはブロックされるが、インビボでは解放されることを裏付けている。

【0122】

さらに好ましい実施形態では、癌は転移性癌である。好ましくは、転移性癌は明らかな転移または明らかな転移性疾患である。

【0123】

この意味で、図１４は、式Ｉの化合物が、等モル投与量で投与されたときに、先行技術の化合物であるガルニセルチブと比較して、明らかな転移性疾患の動物モデルにおいて、非常に大幅に改善された活性を発揮する様子を示している。さらに、図１５は、明らかな転移性疾患の前記動物モデルへの式Ｉの化合物の投与により、生存率も高くなることを確認している。

【0124】

一方で、式Ｉの化合物は、他の治療法と組み合わせて投与されてもよい。前述のように、一実施形態では、式Ｉの化合物、または式ＩＩ、または式ＩＩＩ、式ＩＶを有するそのプロドラッグ、あるいはその薬学的に許容可能な塩、または薬学的に許容可能な溶媒和物、または多形体、または共結晶は、免疫療法、例えば、免疫チェックポイントに対して向けられた免疫療法と一緒に使用されてもよい。

【0125】

したがって、好ましい実施形態は、式Ｉの化合物、または式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶを有するそのプロドラッグ、またはそれらの薬学的に許容される塩、または薬学的に許容される溶媒和物、または多形体、または共結晶と、免疫チェックポイント阻害剤、より好ましくは抗ＰＤ１抗体またはＰＤＬ１抗体とを含む医薬組成物を指す。この目的のために、図１４および図１６は、式Ｉの化合物と抗ＰＤ－１抗体との併用療法が、明らかな転移性疾患の動物モデルにおいて、生存率の大きな上昇をもたらし、肝転移の数を減少させたことを示している。

【0126】

好ましい実施形態において、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患は、血液の癌、Ｂ細胞白血病またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫Ｂ細胞型またはＴ細胞型、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、リンパ腫Ｂ細胞型またはＴ細胞型、多発性骨髄腫、脳癌、中枢神経系（神経膠腫）のグリア血統の癌、神経膠芽腫、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性胸膜中皮腫、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、抗ＨＥＲ２の治療に耐性を示す乳癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳腺癌、転移性乳癌、胃と食道の癌、胃癌、胃腺癌、大腸癌、結腸癌、結腸腺癌、直腸癌、結腸直腸細胞腫、転移性結腸癌、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、肝臓癌、肝臓転移性癌、転移性疾患、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣腺癌、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、子宮頸部癌、甲状腺癌、転移性甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、膀胱癌、尿膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経内分泌癌、扁平上皮癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、胚性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽細胞腫、肝芽腫、黒色腫、および皮膚癌からなる群から選択された癌である。

【0127】

好ましい実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患は、転移性疾患である。

【0128】

好ましくは、血液の癌は白血病、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群である。好ましくは、脳癌は膠芽腫である。

【0129】

好ましい実施形態において、固形腫瘍は、乳癌、胃と食道の癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肝臓転移性癌、転移性疾患、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌からなる群から選択される。好ましくは、皮膚癌は黒色腫である。

【0130】

好ましい実施形態では、ＴＧＦβシグナル伝達経路の阻害に反応する疾患は、白血病、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、膠芽腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性胸膜中皮腫、乳癌、胃と食道の癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肝臓転移性癌、転移性疾患、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌、および黒色腫からなる群から選択された癌である。

【0131】

加えて、アセトバニヨン由来のフラグメントを含む式ＩＩのプロドラッグに対して、本発明は他のアセトバニヨン由来のプロドラッグも開示している。

【0132】

したがって、式ＩＩのプロドラッグのアセトバニロン由来のフラグメント、（ＡｃＶ）

【0133】

【化16】

は、式Ｉの化合物とは異なる他の薬物のプロドラッグを得るためにも使用することができ、それによって、前記薬物は１つのヒドロキシル基を含んでいなければならない。この意味で、構造Ｒ－ＯＨの１つのヒドロキシル基を含む前記薬物は、アセトバニロンフラグメントＡｃＶ－Ｘを含む化合物と反応し、スキームＶＩに見られるように、式ＶのプロドラッグＡｃＶ－ＯＲのエーテル結合を形成することができる。

【0134】

【化17】

【0135】

β－ケトエーテル結合がβ－エーテラーゼ酵素の存在下で、またはチトクロームＰ４５０などの肝酵素によって加水分解されると、１つのヒドロキシルＲ－ＯＨを含む薬物が放出される。式Ｒ－ＯＨの１つのヒドロキシルを含む薬剤の例は、限定されないが、４－ヒドロキシタモキシフェンまたは７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシン（ＳＮ－３８、ＣＡＳ Ｎｏ：８６６３９－５２－３、イリノテカンの活性代謝物）である。

【0136】

実施例６は、４－メチルウンベリフェロンのアセトバニロンエーテルおよび４－ヒドロキシタモキシフェンのアセトバニロンエーテルを用いて実施されたモデル実験において、β－エーテラーゼ酵素であるＬｉｇＦが、アセトバニロンフラグメントを切断するエーテル結合を加水分解することができる様子を示している。

【0137】

この意味で、本発明は一般に、式Ｒ－ＯＨの１つのヒドロキシルを含む薬物の式Ｖのプロドラッグも指し、ここで、前記プロドラッグはアセトバニロン由来のフラグメントを含み、

【0138】

【化18】

ここで、
Ｒ－ＯＨは１つのヒドロキシルを含む薬物であり、
Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、ならびに、
Ｒ_２とＲ_３はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、およびハロアルキルからなる群から選択される。

【0139】

１つの実施形態において、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、および、Ｒ_３はＨである。別の実施形態では、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、およびヒドロキシアルキルからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、および、Ｒ_３はＨである。

【0140】

１つの実施形態は、有効な量の式Ｖのプロドラッグ、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を指す。

【0141】

本発明の１つの実施形態は、式ＶＩの４－ヒドロキシタモキシフェンのプロドラッグを指し：

【0142】

【化19】

ここで、
Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、ならびに、
Ｒ_２とＲ_３はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、およびハロアルキルからなる群から選択される。

【0143】

１つの実施形態は、式ＶＩの４－ヒドロキシタモキシフェンのプロドラッグを指し、ここで、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、および、Ｒ_３はＨである。別の実施形態では、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、およびヒドロキシアルキルからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、および、Ｒ_３はＨである。

【0144】

１つの異性体が描かれているが、異性体ＺおよびＥの両方、およびそれらの混合物は、式ＶＩのプロドラッグに含まれる。一実施形態では、式ＶＩのプロドラッグは、Ｚ－異性体である。別の実施形態では、式ＶＩのプロドラッグは、Ｅ－異性体である。さらなる実施形態では、式ＶＩのプロドラッグは、Ｚ－異性体とＥ－異性体の混合物である。特に、混合物は、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９９：１の比率、または他の任意の比率の両方の異性体の混合物を含む。

【0145】

好ましい実施形態において、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はメチルであり、およびＲ_３はＨであり、ならびに、式ＶＩの４－ヒドロキシタモキシフェンのプロドラッグは、式ＶＩＩのプロドラッグである。

【0146】

【化20】

【0147】

１つの異性体が描かれているが、異性体ＺおよびＥの両方、およびそれらの混合物は、式ＶＩＩのプロドラッグに含まれる。一実施形態では、式ＶＩＩのプロドラッグは、Ｚ－異性体である。別の実施形態では、式ＶＩＩのプロドラッグは、Ｅ－異性体である。さらなる実施形態では、式ＶＩＩのプロドラッグは、Ｚ－異性体とＥ－異性体の混合物である。特に、混合物は、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９９：１の比率、または他の任意の比率の両方の異性体の混合物を含む。

【0148】

１つの実施形態は、式ＶＩまたは式ＶＩＩの有効な量のプロドラッグ、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を指す。

【0149】

式ＶＩまたは式ＶＩＩのプロドラッグは、４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）と比較して、はるかに低い活性を有している。

【0150】

４－ヒドロキシタモキシフェンは、癌の処置、好ましくは、限定されないが、乳癌の予防および／または処置で使用されるエストロゲン受容体（ＥＲ）アンタゴニストである。さらに、それはＥＲの変異型（特にＥＲ^Ｔ２変異体）の強力なアゴニストであり、これは特許ＥＰ１６９２９３６Ｂ１に記載されているように、細胞核内で主たる活性を持つＣｒｅ－ＥＲ^ＴおよびＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２（Ｔ＝タモキシフェンによる誘導可能な場合）などの融合タンパク質の活性化を誘発するために使用することができる。

【0151】

特にＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ融合タンパク質は、リガンド結合活性を有する核エストロゲン受容体の少なくとも一部を含む。核内受容体またはそのフラグメントのリガンド結合活性は、（１）ヒト核エストロゲン受容体配列またはこの配列の天然変異体の５２１位でのグリシンからアルギニンへの変異（Ｇ５２１Ｒ）、（２）ヒト核エストロゲン受容体配列またはこの配列の天然変異体の４００位でのグリシンからバリンへの変異（Ｇ４００Ｖ）、および、（３）ヒト核エストロゲン受容体配列またはこの配列の天然変異体の５４３－５４４位に位置する（メチオニン－ロイシン）から（アラニン－アラニン）への変異（Ｍ５４３Ａ／Ｌ５４４Ａ変異）から選択された少なくとも１つの変異を有する。

【0152】

特許ＥＰ１６９２９３６Ｂ１に記載されているように、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２は、Ｇ４００Ｖ／Ｍ５４３Ａ／Ｌ５４４Ａの三重変異体タンパク質であり、かつ、Ｇ５２１ Ｒ変異を有するＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ融合タンパク質である。

【0153】

４－ＯＨＴの不在下では、融合タンパク質は細胞質で隔離されているため、不活性である。しかし、４－ＯＨＴがＥＲ^Ｔ２に結合すると、これは融合タンパク質を核へと移動させる。ＥＲ^Ｔ２がＣｒｅ（Ｃａｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎｅ）タンパク質に融合されると、および、Ｃｒｅ認識部位（ｌｏｘＰ部位）に隣接する特定の遺伝子領域を用いると、これにより、４－ＯＨＴを用いて細胞内の特定の場所で遺伝子を活性化または欠失させることが可能になる。この意味で、実施例６に見られるように、特定の酵素をコードした細胞の周辺でのみ４－ヒドロキシタモキシフェン（４－ＯＨＴ）を遊離させるプロドラッグを局所的に切断することが可能である。

【0154】

式ＶＩＩのプロドラッグは、既知の化合物４，４’－（１－フェニルブト－１－エン－１，２－ジイル）ジフェノール（化合物５－４３）とアセトバニロンから出発して、実施例５に記載されるように合成された。この意味で、スキームＶＩＩは使用された合成経路について記載している：

【0155】

【化21】

【0156】

この意味で、その合成は、４，４’－ジヒドロキシベンゾフェノンとプロピオフェノンからの、タモキシフェンのジヒドロキシ前駆体である化合物５－４３（ＣＡＳ Ｎｏ：９１２２１－４６－４）から出発する。４－ヒドロキシタモキシフェンのＮ．Ｎ．ジメチルアミノエチルエーテル基を特徴とする位置に対応するヒドロキシル基はまず、グリシドールを用いてエーテルに変換される。このジオールはその後、２，２－ジメトキシプロパンで保護され、第２のヒドロキシルのアルキル化によってアセトバニヨン由来のフラグメントをカップリングする。さらなる工程は、ジオール基の脱保護を含み、これはその後、アルデヒドに酸化され、続いて還元的アミノ化によってアミンに変換される。

【0157】

式ＶＩＩのプロドラッグは不活性であるが、β－エーテラーゼ酵素の存在下では４－ＯＨＴを放出することができる。これは、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２酵素を使用する場合、実施例６に示すように、特定の場所で細胞内の遺伝子を活性化または欠失させることができ、または、抗癌剤として作用して野生型エストロゲン受容体に拮抗する。

【0158】

このようにして、４－ヒドロキシタモキシフェンは、実施例６に記載されるように腫瘍細胞のＤＮＡでコードされたＬｉｇＦなどのβ－エーテラーゼ酵素をコードした細胞でのみ遊離される。ＬｉｇＦの酵素活性は、式ＶＩのプロドラッグまたは式ＶＩＩのプロドラッグから４－ヒドロキシタモキシフェンを遊離させることになる。

【0159】

代替的に、式ＶＩのプロドラッグまたは式ＶＩＩのプロドラッグは、場合によってはＬｉｇＦよりも低い効率で、シトクロムＰ４５０酵素ファミリー（主に肝臓に存在する）などの酵素によって切断され得る。実施例７は、マウスの処置について記載しており、ここで、肝臓は用量依存的にプロドラッグを積極的に切断し、遺伝子組換えを受けることができたことから、このプロドラッグ戦略は、アセトバニロンβエーテルを含む式Ｖの任意の化合物、特に式ＶＩのプロドラッグを用いて肝臓を特異的に標的とするために使用可能であることが示された。末梢組織における遺伝子組換えは、肝臓と比較して低く、肝臓を標的とする可能性を示していた。

【0160】

この意味で、式ＶＩのプロドラッグまたは式ＶＩＩのプロドラッグは、生物医学的分野、遺伝学的分野、発生生物学的分野、細胞生物学的分野、幹細胞生物学的分野、または関連分野の研究ツールとして使用することができる。

【0161】

したがって、本明細書では、マウス中で対象となる１つ以上の遺伝子または１つ以上の配列の組換えを行うための方法が記載されており、ここで、前記１つ以上の遺伝子または配列は、４－ヒドロキシタモキシフェンの存在下で、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質を発現する前記マウスの細胞群において、前記マウスの天然ゲノムに属し、前記方法は、
ａ）Ｃｒｅリコンビナーゼタンパク質の１つ以上の認識部位であって、マウスゲノムの染色体の１つ以上に位置する対象となる前記ＤＮＡ配列に挿入される、前記認識部位と、４－ヒドロキシタモキシフェンの不在下または天然エストロゲンの存在下で実質的にリコンビナーゼ活性を有していないＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質であって、リコンビナーゼ活性が少量の４－ヒドロキシタモキシフェンによって誘導される、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質と、を含むマウスを提供する工程と、
ｂ）前記マウスを式ＶＩのプロドラッグに接触させる工程と、
ｃ）組換えが望ましい場合、前記マウスの細胞の少なくとも一部を、式ＶＩの化合物と反応させるためのβ－エーテラーゼ酵素と接触させる工程、４－ヒドロキシタモキシフェンを遊離させ、前記Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質の組換え活性を誘導する工程、および、遊離した４－ヒドロキシタモキシフェンの供給源であるβ－エーテラーゼ酵素の存在に局所的な特定の領域において、対象となる前記１つ以上の遺伝子または配列の組換えを得る工程、を含み、
前記組換えは、４－ヒドロキシタモキシフェンの不在下または天然エストロゲンの存在下で、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質を発現する前記細胞において、実質的に起こらない。

【0162】

一実施形態では、β－エーテラーゼ酵素はＬｉｇＦであり、式ＶＩのプロドラッグは式ＶＩＩを有する。本発明の目的上、４－ヒドロキシタモキシフェンの不在下または天然エストロゲンの存在下で実質的に組換え活性を有さないＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質は、前記融合タンパク質が１０％未満の組換え活性、または５％未満、あるいはさらに１％未満の組換え活性を有することを示す。同様に、４－ヒドロキシタモキシフェンの不在下または天然エストロゲンの存在下でＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質を発現する細胞において、組換えは実質的に起こらず、このことは、４－ヒドロキシタモキシフェンの不在下または天然エストロゲンの存在下で、１０％未満、５％未満、または１％未満のケースで組換えが起こることも示している。

【0163】

本発明の別の実施形態は、薬剤として使用するための、式ＶＩまたは式ＶＩＩのプロドラッグ、またはそれらの医薬組成物を指す。さらなる実施形態は、癌の処置に使用するための、式ＶＩのプロドラッグ、好ましくは式ＶＩＩのプロドラッグを指す。好ましくは、癌は、血液の癌、Ｂ細胞白血病またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫Ｂ細胞型またはＴ細胞型、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、リンパ腫Ｂ細胞型またはＴ細胞型、多発性骨髄腫、脳癌、中枢神経系（神経膠腫）のグリア血統の癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性胸膜中皮腫、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、抗ＨＥＲ２の治療に耐性を示す乳癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳腺癌、胃と食道の癌、胃癌、胃腺癌、大腸癌、結腸癌、結腸腺癌、直腸癌、結腸直腸癌、転移性結腸癌、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、肝臓癌、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣腺癌、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、子宮頸部癌、甲状腺癌、転移性甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、膀胱癌、尿膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経内分泌癌、扁平上皮癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、胚性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽細胞腫、肝芽腫、黒色腫、および皮膚癌からなる群から選択される。

【0164】

好ましくは、血液の癌は白血病、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群である。好ましくは、脳癌は膠芽腫である。

【0165】

好ましい実施形態において、固形腫瘍は、乳癌、胃と食道の癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌からなる群から選択される。好ましくは、皮膚癌は黒色腫である。

【0166】

本発明のさらなる実施形態は、式ＶＩＩＩの７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシンのプロドラッグを指し：

【0167】

【化22】

ここで、
Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、ならびに、
Ｒ_２とＲ_３はそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、およびハロアルキルからなる群から選択される。

【0168】

１つの実施形態は、式ＶＩＩＩの７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシンのプロドラッグを指し、ここで、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アミノアルキル、アルカノイルアミノ、アルコキシ、アリール、アルキルアリール、アリールアルキル、アミノ、Ｎ－アルキルアミノ、およびＮ，Ｎ－ジアルキルアミノからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、および、Ｒ_３はＨである。別の実施形態では、Ｒ_１は、Ｈ、アルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、およびヒドロキシアルキルからなる群から選択され、Ｒ_２はメチルであり、および、Ｒ_３はＨである。

【0169】

式ＶＩＩ、Ｉのプロドラッグの好ましい実施形態では、Ｒ_１はＨであり、Ｒ_２はメチルであり、およびＲ_３はＨであり、７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシンのプロドラッグは、式ＩＸのプロドラッグである。

【0170】

【化23】

【0171】

１つの実施形態は、有効な量の式ＶＩＩＩまたは式ＩＸのプロドラッグ、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を指す。

【0172】

記載されている実施形態は、薬剤として使用するための、特に癌の処置に使用するための、式ＶＩＩＩまたは式ＩＸの７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシンのプロドラッグ、またはそれらの医薬組成物を指す。好ましくは、癌は、血液の癌、Ｂ細胞白血病またはＴ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫Ｂ細胞型またはＴ細胞型、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、リンパ腫Ｂ細胞型またはＴ細胞型、多発性骨髄腫、脳癌、中枢神経系（神経膠腫）のグリア血統の癌、肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング肉腫、骨肉腫、悪性胸膜中皮腫、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ）、抗ＨＥＲ２の治療に耐性を示す乳癌、乳癌（ｂｒｅａｓｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、乳腺癌、胃と食道の癌、胃癌、胃腺癌、大腸癌、結腸癌、結腸腺癌、直腸癌、結腸直腸癌、転移性結腸癌、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵臓癌（ｐａｎｃｒｅａｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、膵臓腺癌、腎細胞癌、明細胞腎細胞癌、肝臓癌、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肺腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、卵巣腺癌、卵巣癌（ｏｖａｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、子宮頸部癌、甲状腺癌、転移性甲状腺乳頭癌、濾胞性甲状腺癌、膀胱癌、尿膀胱癌、膀胱の移行上皮癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、神経内分泌癌、扁平上皮癌、骨肉腫、横紋筋肉腫、胚性癌、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、腎芽細胞腫、肝芽腫、黒色腫、および皮膚癌からなる群から選択される。

【0173】

好ましくは、血液の癌は白血病、多発性骨髄腫、または骨髄異形成症候群である。好ましくは、脳癌は膠芽腫である。

【0174】

好ましい実施形態において、固形腫瘍は、乳癌、胃と食道の癌、大腸癌、膵臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、神経内分泌癌からなる群から選択される。好ましくは、皮膚癌は黒色腫である。

【0175】

式Ｖのプロドラッグ、特に式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸのプロドラッグのアセトバニロン由来のフラグメントは、シトクロムＰ４５０酵素などの肝酵素によって酸化および切断され得、この酵素がエーテル結合を加水分解し、それにより式ＶＩおよびＶＩＩのプロドラッグの場合には４－ヒドロキシタモキシフェン、式ＶＩＩＩおよびＩＸのプロドラッグの場合には７－エチル－１０－ヒドロキシ－カンプトテシンである、１つのヒドロキシルＲ－ＯＨを含む薬物が提供される。一方、エーテル結合は、スフィンゴビウム属細菌（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ ｓｐ．）株ＳＹＫ－６酵素ＬｉｇＥおよびＬｉｇＦ、または真菌マツノオオウズラタケ（Ｄｉｃｈｏｍｉｔｕｓ ｓｑｕａｌｅｎｓ）Ｄｓ－ＧＳＴ１などの非哺乳動物由来の特定のβ－エーテラーゼによっても加水分解可能であり、これらは、式Ｖのプロドラッグ、特に式ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、またはＩＸのプロドラッグと併用して投与することができる。

【0176】

特定の実施形態では、β－エーテラーゼ酵素は、前記β－エーテラーゼ酵素を発現する細胞において、細胞療法として、例えば、養子Ｔ細胞移植または樹状細胞ワクチン接種として投与される。代替的に、別の実施形態では、β－エーテラーゼ酵素は、腫瘍または間質に特異的な抗体と結合して、随意にグルタチオンとともに投与される。肺粘膜などの特定の組織は、細胞外の高いレベルのグルタチオンを含むため、グルタチオンを投与する必要はない。

【0177】

本明細書の目的上、「活性化合物」との用語は、ヒトや動物に投与する際に治療的効果を発揮する化学物質または活性原理を意味する。

【0178】

典型的な組成物は、一例として、担体または希釈剤であり得る少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤に伴って、本発明の前記化合物を含む。そのような組成物は、カプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、紙、または他の容器の形態であり得る。組成物を作る際に、医薬組成物を調製するための従来の技術が使用されてもよい。例えば、対象となる化合物は通常、担体と混合されるか、または担体によって希釈されるか、またはアンプル、カプセル、小袋、紙、または他の容器の形態であり得る担体内に封入される。担体は、希釈剤として働くとき、活性化合物のためのビヒクル、賦形剤、または培地として作用する固体、半固体、または液体の材料であり得る。対象となる化合物は、例えば、小袋中で粒状固体容器上に吸着され得る。適切な担体のいくつかの例は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、ピーナッツ油、オリーブ油、ラクトース、白土、スクロース、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸、またはセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンである。同様に、担体または希釈剤は、単独で、または、ワックスと混合して、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの当該技術分野で既知の任意の徐放材料を含み得る。製剤は、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、保存剤、甘味剤、または香味料も含み得る。本発明の製剤は、当該技術分野で周知の手順を採用することによって、患者への投与後に、有効成分の急速放出、徐放、または遅延放出をもたらすように製剤化され得る。

【0179】

医薬組成物は滅菌され、必要に応じて、活性化合物に有害に反応しない、助剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、および／または発色物質などと混合され得る。

【0180】

本発明の１つの好ましい実施形態は、経口、頬側、経鼻、局所、経肺、経皮、または非経口、例えば、直腸、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻腔内、点眼液、または軟膏などの適切なまたは所望の作用部位に、対象となる化合物を有効に輸送する任意の経路であり得る投与経路ルートを指す。

【0181】

経鼻投与のために、調製物は、エアロゾル用途のために、液体担体、特に水性担体中に溶解または懸濁された対象となる化合物を含有することもある。担体は、可溶化剤などの添加剤、例えば、プロピレングリコール、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）またはシクロデキストリンなどの吸収促進剤、あるいはパラベンなどの防腐剤を含有し得る。

【0182】

局所製剤を調製するために、対象となる化合物は、当該技術分野で知られるように、皮膚用ビヒクル（ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｖｅｈｉｃｌｅ）中に置かれる。投与される対象となる化合物の量および局所製剤中の化合物の濃度は、ビヒクル、選択された送達システムまたは装置、患者の臨床症状、副作用、および製剤中の化合物の安定性に依存する。したがって、医師は、当該患者または同様の患者の臨床経験に応じて、適切な濃度の対象となる化合物を含有している適切な調製物を採用し、投与される製剤の量を選択する。

【0183】

眼への適用のために、対象となる化合物は、眼での使用に適切な溶液、懸濁液、および軟膏へと製剤化される。濃度は通常、局所調製物について上に議論された通りである。

【0184】

経口投与のために、固体または液体の単位剤形のいずれかが調製可能である。錠剤などの固形組成物の調製のために、対象となる化合物は、薬学的な希釈剤または担体として、タルク、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、硫酸カルシウム、デンプン、ラクトース、アカシア、メチルセルロース、および機能的に類似する材料などの、従来の成分と混合されて製剤化される。

【0185】

カプセルは、対象となる化合物を不活性な薬学的な希釈剤と混合し、その混合物を適切なサイズのハードゼラチンカプセルに充填することによって調製される。ソフトゼラチンカプセルは、対象となる化合物のスラリーを、許容可能な植物油、軽質の液体ワセリン、または他の不活性な油と一緒に機械でカプセル化（ｍａｃｈｉｎｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）することで調製される。シロップ、エリキシル剤、および懸濁液などの経口投与のための流体単位剤形が調製可能である。水溶性の形態は、糖、芳香性の香味料、および防腐剤と一緒に水性ビヒクル中に溶解し、シロップを形成することができる。エリキシル剤は、芳香性の香味料と一緒に、糖およびサッカリンなどの適切な甘味料を用いて水アルコール性（例えば、エタノール）ビヒクルを使用することによって調製される。懸濁液は、アカシア、トラガカント、メチルセルロースなどの懸濁化剤を用いて、水性ビヒクルで調製され得る。

【0186】

非経口用途のための適切な製剤は、適切な注射液または懸濁液の使用などの当該技術の実務家にとって明白である。無菌である製剤は、皮膚内、筋肉内、血管内、および皮下を含む、様々な局所的なまたは非経口的な経路に適している。

【0187】

対象となる化合物に加えて、組成物は、製剤および所望の送達様式に依存して、動物またはヒトへ投与される医薬組成物を形成するために一般に使用されるビヒクルを含む、薬学的に許容可能な無毒の担体または希釈剤を含み得る。希釈剤は、組み合わせの生物活性に過度に影響を及ぼさないように選択される。

【0188】

注射可能な製剤に特に有用であるそのような希釈剤の例は、水、様々な生理食塩水、有機塩溶液または無機塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、およびハンクス液である。加えて、医薬組成物または製剤は、他の担体；アジュバント；または、無毒で非治療的な非免疫原性の安定化剤などの添加剤を含み得る。

【0189】

さらに、賦形剤は製剤中に含まれ得る。例としては、共溶媒、界面活性剤、油、湿潤剤、皮膚軟化剤、防腐剤、安定化剤、および抗酸化剤が挙げられる。任意の薬理学的に許容可能な緩衝液、例えば、トリス緩衝液またはリン酸緩衝液が使用されてもよい。希釈剤、添加剤、および賦形剤の有効な量とは、溶解度または生物活性の点から、薬学的に許容可能な製剤を得るのに有効な量である。

【0190】

対象となる化合物は、ミクロスフェアに組み込まれてもよい。対象となる化合物は、アルブミンミクロスフェアに充填され得、そこから、経鼻投与のための乾燥粉末中にそのようなミクロスフェアを回収することが可能である。ミクロスフェアの調製に適した他の材料は、寒天、アルギン酸塩、キトサン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アルブミン、アガロース、デキストラン、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、およびカゼインを含む。ミクロスフェアは、噴霧乾燥プロセスまたは乳化プロセスなどの当業者に既知の様々なプロセスによって生成され得る。

【0191】

例えば、アルブミンミクロスフェアは、油中水型エマルションを生成するために、リン酸緩衝液中のウサギ血清アルブミンをオリーブ油に撹拌しながら添加することによって調製可能である。その後、グルタルアルデヒド溶液は、エマルジョンに添加され、エマルジョンは撹拌されることでアルブミンを架橋結合する。その後、ミクロスフェアは、遠心分離によって単離され得、油は除去され、その球（ｓｐｈｅｒｅｓ）は例えば、石油エーテルで、その後、エタノールで洗浄される。最終的に、ミクロスフェアは篩いにかけられ、濾過によって収集および乾燥され得る。

【0192】

デンプンのミクロスフェアは、エマルジョンを形成するために、例えば、ジャガイモデンプンの暖かい水性デンプン溶液を、撹拌しながら水中のポリエチレングリコールの加熱溶液に添加することによって調製可能である。二相系が（内相としてデンプン溶液とともに）形成されると、混合物は、その後、引き続き撹拌しながら室温に冷却され、そこで内相はゲル粒子に変換される。その後、これらの粒子は室温で濾過され、エタノールなどの溶媒中でスラリー化され、その後、粒子は再び濾過され、静置されて空気乾燥される。ミクロスフェアは、熱処理などの周知の橋架手順によって、または化学的架橋剤の使用によって硬化され得る。適切な薬剤は、グリオキサール、マロンジアルデヒド、コハクアルデヒド、アジプアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびフタルアルデヒドを含むジアルデヒド、ブタジオンなどのジケトン、エピクロロヒドリン、ポリリン酸塩、およびホウ酸塩を含む。ジアルデヒドは、アミノ基との相互作用によってアルブミンなどのタンパク質を架橋結合するために使用され、ジケトンはアミノ基を有するシッフ塩基を形成する。エピクロロヒドリンは、エポキシド誘導体に対するアミノまたはヒドロキシルなどの求核試薬で化合物を活性化する。

【0193】

本発明の別の好ましい実施形態は、投薬スキームである。「単位剤形」との用語は、被験体、例えば、哺乳動物の被験体、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、およびげっ歯類のための単位投薬量として適切な物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的な希釈剤、担体、またはビヒクルによって望ましい薬学的効果を与えるように計算された活性材料のあらかじめ決められた量を含有している。本発明の単位剤形の仕様は、（ａ）活性材料の固有の特性と達成されるべき特定の効果、および（ｂ）ヒトと動物で使用するためにそのような活性材料を調合する技術に固有の制限により、かつ、それらに依存して、決定される。単位剤形の例は、錠剤、カプセル、丸剤、粉末パケット、ウェーハ、坐剤、果粒剤、カシェ剤、茶さじ１杯、テーブルスプーン１杯、スポイト１杯、アンプル、バイアル、定量排出のエアロゾル（ａｅｒｏｓｏｌｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔｅｒｅｄ ｄｉｓｃｈａｒｇｅｓ）、分離された複数の前述のもの、および本明細書に記載されるような他の形態である。組成物はキットに含まれることができ、キットは、組成物の１以上の単位剤形および本明細書に記載される障害の１以上の処置に使用するための説明書を含むことができる。

【0194】

多くのバイオポリマー（生物ベースの系）、リポソーム、コロイド、樹脂を利用する系、および他のポリマー送達系または仕切られたリザーバーのいずれかを含む、遅延放出または持続放出の送達系は、本明細書に記載される組成物とともに利用されて、治療化合物の継続的または長期的なソースを提供することができる。そのような遅延放出系は、局所、眼内、経口、および非経口の経路を経由する送達向けに製剤に適用可能である。

【0195】

有効な量の対象となる化合物が処置に利用される。本発明に従って使用される化合物の投与量は、化合物および処置されている状態、例えば、レシピエント患者の年齢、体重、および臨床症状に応じて様々である。他の因子は、投与経路、患者、患者の病歴、疾患プロセスの重症度、および特定の化合物の効力を含む。投与量は、患者に対して許容しがたい毒性をもたらすことなく、処置される疾患の症状または徴候を改善するのに十分でなければならない。一般に、有効な量の化合物は、主観的な症状の緩和、または、臨床医あるいは他の資格のある観察者により認められるような客観的に特定可能な改善のいずれかを提供する量である。

【実施例】

【0196】

以下に記載される本発明の実施例は、その保護範囲を制限することなく、開示された実施形態の一部を例示することを目的とする。加えて、本明細書で開示されているが、特許請求の範囲に含まれない実施形態を参照している参照例が含まれている。マウスモデルを用いたすべての実験は、バルセロナサイエンスパークの動物実験委員会（Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐａｒｋ）（ＣＥＥＡ－ＰＣＢ）とカタルーニャ州政府の承認を得ている。マウスは、特定病原体除去（ＳＰＦ：Ｓｐｅｃｉｆｉｃ－Ｐａｔｈｏｇｅｎ－Ｆｒｅｅ）施設内で１２時間の明暗サイクルで飼育され、標準的な食事と水を自由に与えられる。すべてのマウスは、動物福祉のために注意深くモニタリングされた。

【0197】

マウス実験での化合物投与に関する一般的な情報：ガルニセルチブ（ＬＹ２１５７２９９一水和物）、式Ｉと式ＩＶの化合物、および化合物３３８と３３７の分子量は、それぞれ３８７．４、３４２．４、５３６．７、３４２．４、３２８．４であった。したがって、対応する分子量比は、１：０．８８：１．３９：０．８８：０．８５である。以下の図と実施例に記載されているすべてのマウスの処置は、基準としてガルニセルチブの１倍用量を用いて計算されており、これは、１６０ｍｇ／ｋｇ／日を２回の経口投与（午前と午後の遅い時間）で分割した、すなわち、１日２回８０ｍｇ／ｋｇに相当する。したがって、式Ｉの化合物の１倍モル当量は１日２回７０．８ｍｇ／ｋｇであり、式ＩＶの化合物の１倍モル当量は１日２回１１１．２ｍｇ／ｋｇであり、化合物３３８の１倍モル当量は１日２回７０．８ｍｇ／ｋｇであり、および、化合物３３７の１倍モル当量は１日２回６８．０ｍｇ／ｋｇである。

【0198】

従来の化合物３３７（ＣＡＳ Ｎｏ．４７６４７４－１１－０）および３３８（ＣＡＳ Ｎｏ．４７６４７７－６７－５）は、特許ＷＯ２００５０９４８３３（３３８と３３７の両方）、および、Ｊ．Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ．２００８，５１，２３０２（３３７のみを記載）に従って調製された。

【0199】

実施例１：式Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶの化合物の合成：
すべての反応は、別段の定めのない限り、不活性雰囲気（Ｎ_２）下で行った。無水ＴＨＦ、ＤＣＭ、およびジエチルエーテルは、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． Ｐｕｒｅｓｏｌｖ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＰＳ）から入手した。その他の無水溶媒を購入し、それ以上精製または乾燥を行うことなく使用した。

【0200】

すべての実験は、シリカゲルＴＬＣ－アルミニウムシート（Ｍｅｒｃｋ ６０ Ｆ２５４）を用いて分析薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニタリングされた。結果をＵＶランプ（２５４ｎｍまたは３６５ｎｍ）で可視化し、必要に応じてＫＭｎＯ４染色を用いて明らかにした。

【0201】

フラッシュカラムクロマトグラフィーは、別段の定めのない限り、ＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ｉｓｃｏ）またはＰｕｒｉｆｌａｓｈ ４３０（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）のいずれかで行われた。移動相は、ヘキサン／酢酸エチルの勾配、またはジクロロメタン／メタノールの勾配のいずれかであった。精製される分子に塩基性窒素が存在する場合、カラムをヘキサン中の２．５％トリエチルアミン溶液であらかじめ調整した。

【0202】

ＮＭＲ用のサンプルを、ＣＤＣｌ_３、ＣＤ_３ＯＤ、ＤＭＳＯ、またはＤ_２Ｏのいずれかに溶解させた。

【0203】

^１Ｈおよび^１３Ｃスペクトルは、残留溶媒のピークおよび／またはテトラメチルシランを基準にした。カップリング定数はヘルツ（Ｈｚ）で測定された。すべてのＩＲスペクトルは、ＮａＣｌディスク上でフィルム法を用いて行われ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｎｉｃｏｌｅｔ Ｎｅｘｕｓ Ｆｔ－ＩＲフーリエ変換分光計に記録された。

【0204】

１．１．ｐ－ブロモアニリンからの式Ｉの化合物の合成－経路（ｄ）：
ｐ－ブロモアニリンから式Ｉの化合物を合成した。これはブロモがフェノールに変換された最後のステップを含んでいた：

【0205】

【化24】

【0206】

６－ブロモ－４－メチルキノリン

【0207】

【化25】

【0208】

室温のエタノール（２００ｍＬ、１０体積）中の４－ブロモアニリン（２０ｇ、１１７ｍｍｏｌ）とクロラニル（３４．７ｇ、１４１ｍｍｏｌ、１．２当量）の攪拌溶液に、３７％塩酸（２９．３ｍＬ、３５１ｍｍｏｌ、３当量）を５分かけて添加した。室温で５分間撹拌した後、反応混合物を７５℃に加熱し、エタノール（１５ｍＬ、１体積）中に希釈したメチルビニルケトン（１５．４５ｍＬ、１９０．５ｍｍｏｌ、１．５当量）を３０分かけて反応混合物に添加した。４時間後、いかなる出発物質もＴＬＣでは観察されなかった。反応物を６０℃に冷却し、それをＴＨＦ（１６５ｍＬ、１１体積）で希釈し、６０℃で１時間撹拌した後、一晩室温になるまで冷却した。懸濁液を焼結したブフナー漏斗でろ過した。残渣をＴＨＦ（２×４５ｍＬ、合計で６体積）で洗浄した後、真空オーブンで５０℃で一晩乾燥させることで、茶色の固形物として表題化合物（２１．１ｇ、８１％）を得た。

【0209】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．７８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１６－８．１４（ｍ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２５（ｄｄ，Ｊ＝４．４，０．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６８（ｄ，Ｊ＝０．９Ｈｚ，３Ｈ）．

【0210】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１４５．７６，１３８．２０，１３５．９６，１３３．０４，１２９．２１，１２７．７９，１２５．１２，１２３．２５，１２２．１８，１９．２４．

【0211】

６－ブロモ－４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン

【0212】

【化26】

【0213】

ＴＨＦ（６０ｍＬ）中の６－ブロモ－４－メチルキノリン（３．７０ｇ，１４．３１ｍｍｏｌ）の－７８℃の撹拌溶液に、１ＭのＮａＨＭＤＳ（５７ｍＬ，５７ｍｍｏｌ，４当量）を添加した。反応混合物を３時間撹拌し、その後、ＴＨＦ（７．４ｍＬ、２体積）中に希釈した６－メチルピコリン酸メチル（２．６０ｇ、１７．１７ｍｍｏｌ、１．２当量）を３０分かけて滴下した。この反応物を一晩室温に温めた後、０℃に冷却し、その後、３ＭのＨＣｌでｐＨ１にした。１時間かけて室温まで温めた後、固体のＮａＨＣＯ_３でｐＨ８にした。この混合物を水（５０ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（１×１００ｍＬ）、その後、ＣＨＣｌ_３（１×１００ｍＬ）で抽出した。結合した有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣をＭｅＯＨ（３０ｍＬ、８体積）から再結晶させることで、オフホワイト固形物として２－（６－ブロモキノリン－４－イル）－１－（６－メチルピリジン－２－イル）エタン－１－オン（２．５７ｇ、５３％）を得た。

【0214】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．８４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３６（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ），７．９７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，０Ｈ），７．７５（ｄｄ，Ｊ＝９．０，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７３（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９６（ｓ，１Ｈ），２．７０（ｓ，２Ｈ）．

【0215】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１９７．８７，１５８．４３，１５２．０１，１５０．４７，１４７．２４，１４１．３０，１３７．３９，１３２．７７，１３１．９５，１２９．３６，１２７．５８，１２７．０９，１２４．０９，１２０．８９，１１９．７６，４０．５３，２４．６０．

【0216】

６－ブロモ－４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン

【0217】

【化27】

【0218】

室温のＤＭＦ（１５．５ｍＬ、６体積）、トルエン（２６ｍＬ、１０体積）、および２，６－ルチジン（２．６ｍＬ、１体積）中の２－（６－ブロモキノリン－４－イル）－１－（６－メチルピリジン－２－イル）エタン－１－オン（２．５７ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１－アミノピロリジン－２－オン トシレート塩（ｔｏｓｙｌａｔｅ ｓａｌｔ）（２．０５ｇ、７．５３ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、室温で５分間撹拌した。出発物質のほとんどがＴＬＣによって消費されるまで、反応物をディーン・スターク条件下で加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、そこでＣｓ_２ＣＯ_３（４．１７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ、１．７当量）を充填し、再度、加熱還流した。反応をモニタリングして中間体の消失を確認し、すべてが消費されたら、反応混合物が１４５℃に反応するまでトルエンを蒸留し、その後室温に冷却し、水（３０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）に分け、相を分離した。水相をＥｔＯＡｃで抽出し（２×２０ｍＬ）、結合した有機抽出物を５％ＬｉＣｌ水溶液で洗浄し（２×２０ｍＬ）、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーにかけることで（ＤＣＭ中の０－１０％のＭｅＯＨ）、茶色の固形物として標題化合物（２．０５ｇ、６７％）を得た。

【0219】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．８５（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．７１（ｄｄ，Ｊ＝８．９，２．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３５（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１１（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９０－２．８４（ｍ，２Ｈ），２．７５－２．６６（ｍ，２Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ）．

【0220】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１５８．２２，１５３．６０，１５３．２４，１５１．２５，１５０．２２，１４７．１１，１４６．６６，１４０．８８，１３６．２９，１３２．５０，１３１．３４，１２８．７２，１２８．６６，１２３．０３，１２１．７７，１２０．２０，１１８．８６，４８．３３，２５．９８，２４．１９，２３．１５．
ＵＰＬＣ－ＭＳ：４０７ ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］

【0221】

式Ｉの化合物：４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン－６－オール

【0222】

【化28】

【0223】

加熱乾燥させたフラスコに、Ｎ_２下で、６－ブロモ－４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン（２００ｍｇ、０．４９３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２（３６ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、０．１当量）、ＫＯＡｃ（１４５ｍｇ、１．４８ｍｍｏｌ、３当量）、およびビス（ピナコラート）ジボロン（１３７ｍｇ、０．５４２ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。その後、反応フラスコに脱気したジオキサン（５ｍＬ）を添加し、２時間１００℃に加熱し、その時点で、反応物を室温に冷却し、１ＭのＮａＯＨ（４．９３ｍＬ、４．９３ｍｍｏｌ、１０当量）で希釈し、３０％のＨ_２Ｏ_２（４６．６μＬ、０．５４２ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴下した。室温でさらに２時間後、反応を１．６Ｍの亜硫酸ナトリウム（１ｍＭ、６２５μＬ）を用いてクエンチした。３０分間撹拌した後、過酸化物の存在について反応混合物を確認し、セライト（登録商標）のパッドに通して濾過し、３７％のＨＣｌを用いてｐＨ８にした。混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×５ｍＬ）およびクロロホルム（１×５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン中の０～１００％のＥｔＯＡｃ）にかけることで、表題化合物Ｉを得た（１３０ｍｇ、７７％）。

【0224】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ９．６６（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．１６（ｍ，２Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６９－２．５５（ｍ，２Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ）．

【0225】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１５６．４９，１５５．０８，１５２．０１，１５１．７０，１４６．５５，１４６．２４，１４３．１８，１３９．３７，１３６．４８，１３０．６０，１２８．７１，１２２．４７，１２１．１６，１１７．７３，１０９．８９，１０６．９８，４７．８６，２５．５３，２３．４１，２２．５０．

【0226】

ＩＲ（フィルム）：３４１２，２９４９，２８３３，１６５０，１６１８，１５０８，１２３６，１０１０ｃｍ^－１

【0227】

１．２． ｐ－メトキシアニリンからの式Ｉの化合物の合成－経路（ａ）：
６－メトキシ－４－メチルキノリン

【0228】

【化29】

【0229】

室温のエタノール（２０ｍＬ）中のｐ－アニシジン（５ｇ、４０．６ｍｍｏｌ）およびＺｎＣｌ_２（７１９ｍｇ、５．３ｍｍｏｌ、０．１３当量）の撹拌溶液に、ＦｅＣｌ_３（１７．４５ｇ、１０７．６ｍｍｏｌ、２．６５当量）を、３０分かけて少しずつ添加した。反応混合物を３０分間撹拌し、このとき、メチルビニルケトン（３．３８ｍＬ、４０．６ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、２時間７５℃に加熱した。その後、それを室温に冷却し、０℃でＮａＯＨ（１Ｍ、２２０ｍＬ）に注いだ。混合物を、ＥｔＯＡｃ（３×４０ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン中の０～１００％のＥｔＯＡｃ）にかけることで、茶色の油として表題化合物（２．８８ｇ、４１％）を得た。

【0230】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ；ＣＤＣｌ_３）δ８．６５（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３７（ｄｄ，Ｊ＝９．２，２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），３．９６（ｓ，３Ｈ），２．６７（ｓ，３Ｈ）．

【0231】

２－（６－メトキシキノリン－４－イル）－１－（６－メチルピリジン－２－イル）エタン－１－オン

【0232】

【化30】

【0233】

－７８℃のＴＨＦ（８０ｍＬ）中の６－メトキシ－４－メチルキノリン（２．５ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＬＤＡ（３３．１９ｍｍｏｌ、２．３当量）を添加した。反応混合物を３０分間撹拌し、このとき、メチル６－メチルピコリネート（３．２７ｇ、２１．６ｍｍｏｌ、１．５当量）を、反応混合物に３０分かけて滴下した。反応物を－７８℃で放置し、一晩かけて室温に温めた。その後、それを飽和ＮＨ_４Ｃｌ（２０ｍｌ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、相を分離した。水相をクロロホルム（２×５０ｍＬ）で抽出し、組み合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣をクロマトグラフィー（ヘキサン中の０～１００％のＥｔＯＡｃ）にかけることで、茶色の油として表題化合物（１．９１ｇ、５１％）を得た。

【0234】

６－メトキシ－４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン

【0235】

【化31】

室温のＤＭＦ（９．６ｍＬ、６体積）、トルエン（１６ｍＬ、１０体積）、および２，６－ルチジン（１．６ｍＬ、１体積）中の２－（６－メトキシキノリン－４－イル）－１－（６－メチルピリジン－２－イル）エタン－１－オン（１．６０ｇ、５．４７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１－アミノピロリジン－２－オン トシレート塩（ｔｏｓｙｌａｔｅ ｓａｌｔ）（１．４９ｇ、５．４７ｍｍｏｌ、１当量）を添加し、室温で５分間撹拌した。出発物質のほとんどがＴＬＣによって消費されるまで、反応物をディーン・スターク条件下で加熱還流した。反応混合物を室温に冷却し、そこでＣｓ_２ＣＯ_３（３．０２９ｇ、９．２９９ｍｍｏｌ、１．７当量）を充填し、５分間放置してから、再度、加熱還流した。反応物を中間体の消失についてモニタリングし、すべてが消費されると、反応物を室温に冷却し、水（５０ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）とに分けた。水相を抽出し（２×２５ｍＬ）、組み合わせた有機抽出物を５％のＬｉＣｌ水溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、有機層を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーにかけた（ＤＣＭ中の０～１０％のＭｅＯＨ）。生成物を含む画分を、少量のＣＨＣｌ_３に溶解し、混合物がわずかに濁るまでヘキサンでゆっくりと希釈した。フラスコを冷蔵庫に４８時間放置することで、結晶が形成された。（１．２８ｇ、６７％）白色固形物として；

【0236】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．７４（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３５－７．２０（ｍ，４Ｈ），６．９６－６．８５（ｍ，３Ｈ），４．３７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．５４（ｓ，３Ｈ），２．９１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），２．７５－２．６５（ｍ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ）．

【0237】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１５８．６２，１５７．６７，１５３．６５，１５１．８３，１４７．６６，１４６．６９，１４４．８９，１３９．９０，１３６．４３，１３１．１７，１２８．２５，１２２．４１，１２２．２２，１２１．９３，１１９．５０，１１０．５０，１０４．００，５５．５２，４８．４６，２６．１９，２４．５８，２３．３２．

【0238】

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_２２Ｈ_２０Ｎ_４Ｏ：３５６．１６３７；ｆｏｕｎｄ：３５６．１６３９．

【0239】

式Ｉの化合物：４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン－６－オール

【0240】

【化32】

【0241】

室温の酢酸（５ｍＬ）中の６－メトキシ－４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン（４３２ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＢｒ（５ｍＬ、４４．４５ｍｍｏｌ、３６．７当量）を添加した。反応混合物を、１２０℃で４８時間撹拌してから室温に冷却し、真空中で溶媒を除去した。残渣を、水（５ｍＬ）とＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）とに分離して、４０％のＮａＯＨを用いてｐＨ８にし、相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（３×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、蒸発させ、残渣を、還流するトルエンに１時間懸濁してから、１時間にわたって室温に冷却した。固形物を濾過し、真空中で乾燥させることで、オフホワイト色の固形物として化合物（３２８ｍｇ、７９％）を得た。

【0242】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ９．６６（ｓ，１Ｈ），８．５８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｔ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．１６（ｍ，２Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．６９－２．５５（ｍ，２Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ）．

【0243】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１５６．４９，１５５．０８，１５２．０１，１５１．７０，１４６．５５，１４６．２４，１４３．１８，１３９．３７，１３６．４８，１３０．６０，１２８．７１，１２２．４７，１２１．１６，１１７．７３，１０９．８９，１０６．９８，４７．８６，２５．５３，２３．４１，２２．５０．

【0244】

ＩＲ（フィルム）：３４１２，２９４９，２８３３，１６５０，１６１８，１５０８，１２３６，１０１０ｃｍ^－１

【0245】

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_２１Ｈ_１８Ｎ_４Ｏ：３４２．１４８１；ｆｏｕｎｄ：３４２．１４８０．

【0246】

１．３． 式ＩＩＩのプロドラッグの合成：
１－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－２－（（４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン－６－イル）オキシ）エタン－１－オン
式Ｉの化合物４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン－６－オール（４２ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）およびＣｓ_２ＣＯ_３（１３４ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を、１．５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解し、Ｎ_２ａｔｍ下で、６０℃で、１．５時間加熱した。その後、０．５ｍＬの無水ＤＭＦ中の４－（２－ブロモアセチル）－２－メトキシフェニルピバレートの溶液を、明るい緑色の懸濁液にカニューレを介して添加した。結果として生じる混合物を６０℃で２時間撹拌した。その後、反応物を室温に冷却し、水（１５ｍＬ）で希釈し、０．５ｍＬの１ＭのＨＣｌ溶液でクエンチした。結果として生じる水層をＥｔＯＡｃ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出し、有機層を無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗製物をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中のＭｅＯＨの０～２０％）を介して精製することで、茶色の油を得て、これを、１．５ｍＬのＭｅＯＨにおいてＬｉＯＨ．Ｈ_２Ｏ（１３ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を用いて１時間処理した。反応を１ＭのＨＣｌ（０．３ｍＬ）でクエンチし、水で希釈し、ＥｔＯＡｃ（３ｘ２０ｍＬ）で抽出した。有機層を、無水ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、溶媒を真空中で除去し、粗製物をクロマトグラフィーにかけることで（ＥｔＯＡｃ中のＭｅＯＨの０～２０％）、５１．９ｍｇ（８２％）の表題化合物を得た。

【0247】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ８．７３（ｄ，Ｊ＝４．６Ｈｚ，１Ｈ），８．１１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄ，Ｊ＝１．９Ｈｚ，１Ｈ），７．４７－７．４３（ｍ，２Ｈ），７．３２－７．２６（ｍ，２Ｈ），７．０６－６．９５（ｍ，３Ｈ），６．８９（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．９４（ｂｓ，２Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），３．９３（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｂｓ，２Ｈ），２．６１（ｂｓ，２Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．

【0248】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１９２．３，１５８．５，１５６．３，１５３．４，１５２．０，１５１．６，１４７．５，１４７．２，１４６．９，１４４．２，１４１．１，１３６．５，１３０．７，１２８．３，１２７．１，１２３．５，１２２．７，１２２．６，１２２．０，１１９．２，１１４．５，１１０．２，１１０．１，１０５．７，７０．４，５６．２，４８．４，２６．０，２４．３，２３．２ｐｐｍ．

【0249】

ＩＲ（フィルム）：３０７４，２９５８，２９２５，１６８６，１６２０，１５８９，１５０９，１４２８，１２７４，１２２５，１１９８，１０８８ｃｍ^－１．

【0250】

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｎ４Ｏ４：５０７．２０２７；ｆｏｕｎｄ：５０７．２０１６．

【0251】

Ｍｐ：１６２－１６３℃．

【0252】

１．４． 式ＩＶのプロドラッグの合成：
４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン－６－イル［１，４’－ビピリジン］－１’－カルボキシレート
３ｍＬのＣＨＣｌ_３において、１．１で合成された式Ｉの化合物の溶液（４７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を調製し、Ｎ_２下で、３Ａ活性化モレキュラーシーブを含むシュレンクフラスコに移した。溶液を室温で１時間撹拌した。その後、１ｍＬのＣＨＣｌ_３中の［１，４’－ビピリジン］－１’－カルボニルクロリド（３２ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１当量）、Ｅｔ_３Ｎ（２３μＬ、０．１７ｍｍｏｌ、１．２当量）、および４－ジメチルアミノピリジンクロリドの結晶の溶液を滴下した。結果として生じる混合物を一晩中撹拌した。いくらかの出発物質がＴＬＣにより検出されたため、翌日、０．５ｍＬのＣＨＣｌ_３中の［１，４’－ビピリジン］－１’－カルボニルクロリド（１６ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ、０．５当量）、Ｅｔ_３Ｎ（１２μＬ、０．０８ｍｍｏｌ、０．６当量）、および４－ジメチルアミノピリジンの結晶の他の溶液を反応混合物に添加し、それを一晩撹拌した。２０ｍＬのＨ_２Ｏを添加することにより、反応をクエンチした。結果として生じる水層をＥｔＯＡｃ（３×２０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、濃縮することで粗生成物を得て、これをカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の１０～２０％のＭｅＯＨの勾配での溶離）によって精製することで、オレンジ色の油として６４ｍｇ（８７％）の所望の生成物を得た。

【0253】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ８．８０（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），８．０１（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ），７．５６（ｄｄ，Ｊ＝２４．０，７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．４７（ｄｄ，Ｊ＝９．１，２．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．９５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．２７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｄｄ，Ｊ＝３７．１，１４．３Ｈｚ，２Ｈ），３．６５－３．１４（ｍ，１Ｈ），２．８１（ｄ，Ｊ＝１６．６Ｈｚ，４Ｈ），２．６１（ｍ，３Ｈ），１．８２（ｓ，３Ｈ），１．７４（ｄ，Ｊ＝１０．６Ｈｚ，３Ｈ），１．４４（ｍ，１０Ｈ）．

【0254】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１５６．５９，１５２．５５，１５１．９２，１５１．５７，１４９．１８，１４８．６０，１４７．０８，１４５．６２，１４１．１０，１３６．５７，１３０．２０，１２７．５４，１２４．７０，１２２．６３，１２１．２５，１１７．６７，１１６．９２，１０９．２７，６１．３１，４９．５９，４７．９５，２５．５３，２３．２９，２２．４１．

【0255】

ＵＰＬＣ－ＭＳ：５３７．８（Ｍ＋Ｈ）

【0256】

１．５． 式ＩＶのプロドラッグの塩酸塩の合成：
１－（１－（（（４－（２－（６－メチルピリジン－２－イル）－５，６－ジヒドロ－４Ｈ－ピロロ［１，２－ｂ］ピラゾール－３－イル）キノリン－６－イル）オキシ）カルボニル）ピペリジン－４－イル）ピペリジン－１－イウムクロリド
式ＩＶ（６５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の化合物をＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶解し、ジオキサン中の０．３ｍＬ（１．２１ｍｍｏｌ）の２ＭのＨＣｌ溶液を用いて２時間処理した。その後、溶媒を除去して、薄いオレンジ色の固形物（７０ｍｇ、１００％）を得た。

【0257】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ９．１８（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．３５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１２（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｔ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），８．０２－７．９３（ｍ，２Ｈ），７．７４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），７．２８（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ），４．５６－４．３９（ｍ，３Ｈ），４．３１－４．２８（ｍ，１Ｈ），３．５９－３．５６（ｍ，２Ｈ），３．５２－３．４５（ｍ，２Ｈ），３．１９－２．９５（ｍ，６Ｈ），２．８８（ｓ，３Ｈ），２．８５－２．８１（ｍ，１Ｈ），２．２５－２．２０（ｍ，２Ｈ），２．０１－１．８５（ｍ，７Ｈ），１．６０－１．５０（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．

【0258】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，Ｍｅｔｈａｎｏｌ－ｄ４）δ１５７．０，１５３．３，１５３．２，１５２．２，１５１．０，１４７．２，１４６．１，１４５．５，１４４．９，１３７．６２，１３１．４，１２９．３，１２８．０，１２４．６，１２４．５，１２４．１，１１９．５，１１１．０，６６．９，６４．６，５１．４，５０．４，４４．３，４４．０，２７．５，２７．２，２７．１，２４．５，２４．２，２２．９，２０．１，１５．５ｐｐｍ．

【0259】

ＩＲ（フィルム）：３４１１，３０４８，２９３３，２８５７，１７１６，１５８９，１４２０，１１９５，１０２０，８０４ｃｍ^－１．

【0260】

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_３２Ｈ_３７Ｎ_６Ｏ_２：５３７．２９７３；ｆｏｕｎｄ：５３７．２９６８．

【0261】

Ｍｐ：２１４－２１５℃．

【0262】

実施例２：インビトロのＴＧＦβ阻害剤の活性
２．１ 分子親和性および選択性のアッセイ
ＡＬＫファミリーの式Ｉの化合物の、Ｋｄ（解離定数）として測定された親和性を、ＥｕｒｏｆｉｎｓのＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ（商標）技術を用いることによって決定した。ＡＬＫ１（ＡＣＶＲＬ１）、ＡＬＫ２（ＡＣＶＲ１）、ＡＬＫ３（ＢＭＰＲ１Ａ）、ＡＬＫ４（ＡＣＶＲ１Ｂ）、ＡＬＫ６（ＢＭＰＲ１Ｂ）、ＡＣＶＲ２Ｂ、およびＴＧＦβＲ２の前での（ｉｎ ｆｒｏｎｔ ｏｆ）選択性を決定した。

【0263】

ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎスクリーニングプラットフォームは、活性部位指向性（ａｃｔｉｖｅ－ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ）競争結合アッセイを利用して、試験化合物とキナーゼの間の相互作用を定量的に測定する。ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎアッセイはＡＴＰを必要とせず、これにより、真の熱力学的相互作用親和性を報告する。

【0264】

以下の３つの構成要素を組み合わせることによってアッセイを実行する：ＤＮＡ標識キナーゼ；固定化リガンド；および試験化合物。固定化リガンドと競争する試験化合物の能力を、ＤＮＡタグの定量ＰＣＲを介して測定する。

【0265】

１倍の結合緩衝液（２０％のＳｅａＢｌｏｃｋ、０．１７ｘＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、６ｍＭのＤＴＴ）中で、キナーゼ、リガンド化親和性ビーズ、および試験化合物を組み合わせることによって、結合反応を組み立てた。１００％のＤＭＳＯ中の１１１倍のストックとして試験化合物を調製した。３つのＤＭＳＯ制御点（ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｏｉｎｔｓ）を最高濃度３０μＭとして、１１点の３倍の化合物希釈系列を用いてＫｄを決定した。Ｋｄ測定のための全ての化合物を、１００％のＤＭＳＯにおいて音響伝達（非接触分注）により分配する。その後、ＤＭＳＯの最終濃度が０．９％となるように、化合物をアッセイに直接希釈した。全ての反応を、ポリプロピレン３８４ウェルプレートにおいて実行した。それぞれ０．０２ｍｌの最終体積であった。アッセイプレートを、１時間、振盪しながら室温でインキュベートし、親和性ビーズを洗浄緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）で洗浄した。その後、ビーズを、溶出緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０、０．５μＭのビオチン化されていない親和性リガンド）に再懸濁し、３０分間、振盪しながら室温でインキュベートした。溶離液中のキナーゼ濃度をｑＰＣＲによって測定した。

【0266】

キナーゼ活性部位に結合し、固定化リガンドへのキナーゼ結合を直接的に（立体的に）または間接的に（アロステリックに）妨げる化合物は、固体支持体上で捕捉されるキナーゼの量を減少させるだろう。反対に、キナーゼに結合しない試験分子は、固体支持体上で捕捉されるキナーゼの量に対して効果がない。試験化合物濃度の関数として固体支持体上で捕捉されるキナーゼの量を測定することによって、試験化合物とキナーゼの相互作用の解離定数（Ｋｄ）を計算する。

【0267】

下記の表１で見られるように、式Ｉの化合物は、ＡＬＫ５親和性がガルニセルチブよりも８．６倍強力である。比較は、同じ技術を用いたガルニセルチブの公開データを考慮に入れて行った（Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１８，９（６）：６６５９－６６７７）。

【0268】

【表1】

【0269】

ＡＬＫ５に対する、本発明の式Ｉの化合物、式ＩＩおよびＩＶのプロドラッグ、ならびに先行技術の化合物３３７、３３８、およびガルニセルチブの、ＩＣ_５０として測定される酵素活性阻害を、ＥｕｒｏｆｉｎｓのＫｉｎａｓｅ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ ｓｅｒｖｉｃｅを使用することによって決定した。

【0270】

簡潔に言うと、ヒトＡＬＫ５を、８ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＭｎＣｌ２、２ｍｇ／ｍＬのカゼイン、１０ｍＭのＭｇＡｃｅｔａｔｅ、および［γ－３３Ｐ－ＡＴＰ］（およそ５００ｃｐｍ／ｐｍｏｌの比活性、必要に応じて濃縮）とインキュベートした。ＭｇＡＴＰ混合物の添加により反応を開始した。室温での４０分間のインキュベーション後、３％のリン酸溶液を添加することにより反応を止めた。その後、１０μＬの反応物をＰ３０フィルターマット（ｆｉｌｔｅｒｍａｔ）上にスポットし（ｓｐｏｔｔｅｄ）、７５ｍＭのリン酸で５分間３回洗浄し、メタノールで１回洗浄してから乾燥させ、シンチレーション計数を行った。

【0271】

ハーフログ連続希釈を用いた９点の曲線を使用して、化合物を試験した。試験した最高濃度は１０μＭであった。試験化合物を１００％のＤＭＳＯにおいて調製した。

【0272】

表２に示される結果は、式Ｉの化合物がガルニセルチブよりも２．５倍強力であることを示す。本発明の式ＩＩＩおよびＩＶのプロドラッグ、ならびに先行技術の化合物３３７および３３８に関する結果を、以下の同じ表に示す：

【0273】

【表2】

【0274】

表２で見られるように、意外にも、式（Ｉ）の化合物は、構造的に、フェノール性ヒドロキシルの位置のみが異なる場合、参照化合物３３８よりも２．１倍強力であることが上記結果により示される。加えて、同様の結果が参照化合物３３７と比較して示され、式（Ｉ）の化合物は、参照化合物３３７よりも１．８倍強力であり、これらの化合物は、構造的には、フェノール性ヒドロキシルの位置と、ピリジン部分におけるメチル基の有無が異なるだけである。

【0275】

見られるように、先行技術では、ＴＧＦβ経路の阻害剤として活性をもたらす化合物のファミリーが同定されたが、驚いたことに、本発明では、置換の種類およびそのコア構造の位置が、式（Ｉ）の化合物によって示される効力の予期しない改善をもたらす鍵となることが示される。

【0276】

さらに、Ｌｉら（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００８，５１（７）：２３０２－２３０６）は、電子不足で比較的小さな基が６位で許容されることを開示し、これは、式（Ｉ）の化合物によって６位において特徴付けられるヒドロキシルなどの電子供与基の導入から遠ざかる教示である。

【0277】

プロドラッグに関して、式Ｉの化合物は、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を有する式（Ｉ）の化合物のプロドラッグと比べて、それぞれ４．７倍および１２．９倍強力であり、このことにより、ＴＧＦβ阻害活性はインビトロで遮断されることが強調される。

【0278】

ｓｃａｎＥＤＧＥ（ＫＩＮＯＭＥｓｃａｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）アッセイを用いて、９７のタンパク質のパネルに対する式Ｉの化合物の選択性も測定した。式の化合物の選択性プロファイルは良好であった。

【0279】

加えて、ＥｕｒｏｆｉｎｓのＳａｆｅｔｙＳｃｒｅｅｎ４４（商標）サービスを使用することによって、安全評価を実行した。その標的はすべて、出版物Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｓａｆｅｔｙ－ｒｅｌａｔｅｄ ｄｒｕｇ ａｔｔｒｉｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（Ｂｏｗｅｓ Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１２，１１（１２）：９０９－９２２）において言及されるように、インビボの薬物有害反応に強く関連している。パネルは、予備的安全評価における合理的な最初の工程となる。なぜなら、上記評価は、安全域の最適化のために可能性のあるオフターゲット相互作用の早期発見を提供するものであるからである。この安全パネルは、酵素アッセイおよび結合アッセイの両方を含む。１０μＭの式Ｉの化合物の阻害のパーセントは、試験された全てのタンパク質で５０％未満であった。ＡＬＫ５（２０ｎＭ）に対する化合物の結合親和性を考慮に入れると、ＳａｆｅｔｙＳｃｒｅｅｎ４４パネルにおけるタンパク質の選択比は５００倍を超える。

【0280】

２．２． インビトロのルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＡＴＣＣから購入し、３７℃および５％のＣＯ_２で、Ｌ－グルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって補足されたＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、２４ウェルプレートに播種し、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、１２ｘＣＡＧＡ－Ｆｉｒｅｆｌｙ＿ＬｕｃおよびＴｋ－Ｒｅｎｉｌｌａ＿Ｌｕｃ（１つのウェル当たりそれぞれ７５ｎｇおよび１０ｎｇ）をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。７時間後、培地を飢餓培地（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ＋０．０５％のＦＢＳ）に交換した。次の日、細胞を、ガルニセルチブ、（示されるように）１０^３倍～１０^８倍の間に希釈されたＤＭＳＯ中の１０ｍＭのストック溶液からの式Ｉの化合物、式ＩＩＩのプロドラッグ化合物、および式ＩＶの化合物、ならびに５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＴＧＦＢ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で処理した。１６時間後、ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定し：培地を吸引し、細胞を２００μｌの受動溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（キット）に２０分間溶解した。生物発光を、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ Ｌｕｍａｔ ＬＢ６５０７－ルミノメーターで測定した（１８μｌの試薬、１０秒測定）。

【0281】

ＴＧβが受容体に結合すると、ＴＧＦＢＲ１のリン酸化が起こり、それによりＳＭＡＤ２／３がリン酸化され、その後、ＳＭＡＤ４と複合体を形成して、核に進入する。その後、ＳＭＡＤ２／３－ＳＭＡＤ４複合体はプロモーター（または、ＴＧＦ－β応答エレメント）に結合し、様々な補助因子を用いて、下流遺伝子、またはルシフェラーゼレポーターの転写を可能にする。

【0282】

細胞溶解物にルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）を添加すると、光の放出により、ｐＳＭＡＤ２／３－ＳＭＡＤ４の産生による活性なＴＧＦ－β経路が示唆されるが、光がまったくまたはほとんど観察されない場合は、阻害剤による上記経路の阻害が示唆される。最後に、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）を添加することによって結果を正規化することができ、Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ（登録商標）は、ホタルルシフェラーゼ酵素／基質を消光し、かつウミシイタケトランスフェクション制御を活性化して光を生成するものであり、この光を、ルミノメーターで再び測定してデータを正規化するために使用した。

【0283】

図１は、式Ｉの化合物のＴＧＦβシグナル伝達阻害能力が、ガルニセルチブの２倍を超えて大きいことを示し、すなわち、検出されたガルニセルチブのＩＣ_５０値は３５９ｎＭであり、式Ｉの化合物では１６５ｎＭであり、一方、式Ｉの化合物と比較して、式Ｉの化合物、式ＩＩＩの化合物、および式ＩＶの化合物のプロドラッグは、最大８倍低いＴＧＦβシグナル伝達阻害能力を有していた。このことは、ＴＧＦβシグナル伝達阻害能力が、その特異的な構造的特徴のために、式Ｉの化合物において強く、さらには、プロドラッグ、式ＩＩＩの化合物および式ＩＶの化合物を得るために行った修飾により、ＴＧＦβシグナル伝達阻活性が成功裡に閉じ込められおよび遮断されることを意味する。

【0284】

実施例３：インビボ試験におけるＴＧＦβ阻害剤
マウス腫瘍オルガノイド（ＭＴＯ）は、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ株の複合トランスジェニックマウス（ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ）（Ａｐｃ、Ｋｒａｓ、Ｔｒｐ５３、およびＴｇｆｂｒ２の条件突然変異、ならびにＬｇｒ５－ＥＧＦＰ／ＣｒｅＥＲ^Ｔ２を有する）に由来し、Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔｕｒｅ ５５４（７６９３）：５３８－５４３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２５４９２に記載されるように培養した。オルガノイドは、典型的には、内腔を有するスフェロイドとしての器官型構造を採用する、３次元マトリックスにおいて成長させた腫瘍上皮細胞である。このように、細胞は比較的正常な極性（このことは、外側の表面、内側／管腔側の表面、および細胞間の接触が別々に特定化されることを意味する）を保持し、これは、従来の２次元の細胞培養よりも生理学的である。さらに、これらのオルガノイドは、豊富で腫瘍形成促進性（すなわち、ＴＧＦβリッチ）の間質の動員を含む、ヒトの癌を再現する複雑な腫瘍構造を再構築することができる（つまり、上に記載されていない、ヒトのような腫瘍を移植し、肝転移を研究するシステムである）。

【0285】

インビボの抗癌効果およびＴＧＦβ阻害剤試験のために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｎｖｉｅｒから購入し、７～８週齢で注射した。ＭＴＯをトリプシン処理し（マトリックスを消化し、オルガノイドを単細胞へと分解し）、計数し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｌｏｎｚａ）で３００，０００の細胞を脾臓に注射し、したがって、肝臓と腸とをつなぐ門脈に細胞を直接送達した。本発明に記載されるすべての実験において、ＭＴＯ１２９を使用した（Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１８）。

【0286】

ミリＱ水中の１％のカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．４％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．０８５％のポリビニルピロリドン、０．０５％の消泡剤－Ａ（Ｓｉｇｍａ）中の４～１２０ｍｇ／ｍｌの懸濁液を用いた胃管栄養法（経管栄養法）によって、化合物（式Ｉの化合物およびガルニセルチブ）による処置を行った。マウスを、１５０μｌで１日２回、１４日間処置するか、またはエンドポイントまで処置した。

【0287】

ＭＴＯ移植から２週間後に処置を開始し、３日間継続してから屠殺したマウスにおいて、バイオマーカー上の治療効果を評価した。４μｍの組織切片を、当該技術分野で周知の手順を利用して、リン酸化されたＳＭＡＤ２（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、３１０８）に特異的な抗体を用いた免疫組織化学によって染色した。図２は、矢印で示される、対照で処置されたマウス（ビヒクル）におけるホスホ－ＳＭＡＤ２陽性の細胞核を示すが、ガルニセルチブ、または式Ｉの化合物あるいはそのプロドラッグ、式ＩＶの化合物で処理されたマウスでは示されない。

【0288】

図３は、異なる投与量（マウスに対する一般的なガルニセルチブ投与量８０ｍｇ／ｋｇ１日２回の０．３倍、１倍、３倍、および９倍のモル当量であり、これは、平均重量が２５ｇであると仮定すると、１匹のマウス当たり２ｍｇに換算される）での、式Ｉの化合物およびガルニセルチブの肝腫瘍数（ＬｉＭ）を示す。マウス、特に、転移性大腸癌マウスにおいて、ガルニセルチブは、標準的な１６０ｍｇ／ｋｇ／日の１倍の投与量では有効ではなく；上述のＭＴＯ論文（Ｔａｕｒｉｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１８）では、転移性癌を効果的に処置するために、最大１６００ｍｇ／ｋｇ／日（１０倍）の投与量を使用する必要があった。しかし、上記投与量は結果として毒性（心臓毒性、筋組織および軟骨の欠損、骨の発達、および皮膚ならびに腸における炎症反応の変化）をもたらす可能性がある。患者では、処置投与量を、１４日間投与し１４日間投与しないレジメンで、８０～１５０ｍｇ、１日２回に減らした。図３に示されるように、式Ｉの化合物は、ガルニセルチブと比較して、有意に少ない量の肝腫瘍を結果としてもたらした。

【0289】

ルシフェラーゼレポーターを発現するＭＴＯを、５０μｌの１５ｍｇ／ｍｌのＤ－ルシフェリンカリウム塩（Ｒｅｓｅｍ ＢＶ）の後眼窩注射を用いて、生物発光イメージングによって測定した。胸部／腹部にまたがる領域からの１秒あたりの光子を、注射当日に定量化し、測定値に対して正規化した。図４は、１２日間の処置の間（３日目から１４日目まで）の様々な投与量（８０ｍｇ／ｋｇで１日２回のマウス投与量、すなわち、１６０ｍｇ／ｋｇ／日の０．３倍、１倍、３倍、および９倍）での、式Ｉの化合物およびガルニセルチブの転移性腫瘍の発育阻害能力を示す。図４で見られるように、１倍の投与量（１６０ｍｇ／ｋｇ／日のマウス投与量）は、ガルニセルチブでは有効でなく、ほとんどの場合で有効にするためには３倍の投与量（４８０ｍｇ／ｋｇ／日に相当する）に増やす必要があった（図３で見られるように、９倍の投与量である１４４０ｍｇ／ｋｇ／日が非常に効果的であった）が、式Ｉの化合物は、０．３倍の投与量（４２．５ｍｇ／ｋｇ／日に相当する；これは、式Ｉの化合物の分子量が３４２．４であり、および、ガルニセルチブの分子量が３８７．４であるため、０．８８：１の式Ｉとガルニセルチブ一水和物の分子量比について補正した後のものである）のモル当量で効果的であり、驚くほど強力に改善されたインビボの抗腫瘍活性を示した。

【0290】

実施例４：毒性評価
毒性に関連することが多いタンパク質に関する安全評価については、実施例２．１のＳａｆｅｔｙＳｃｒｅｅｎ４４アッセイを参照する。

【0291】

式Ｉの化合物の毒性をインビトロで評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに播種し、示される化合物で２４時間処置した。ＤＭＳＯを対照として使用した。式Ｉの化合物またはガルニセルチブを、１～１００μＭの範囲の様々な濃度で添加した。測定の４時間前にインキュベートし、製造者の指示に従って、ＸＴＴアッセイ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）によって細胞の生存率を評価した。細胞の生存率は、１００μＭで６４％および３０μＭで９３％であり（図５）、特に、式Ｉの化合物のＡＬＫ５の阻害のＩＣ_５０値がｎＭ範囲内であることを考慮すると、生理学的レベルで非常に低い毒性を示した。

【0292】

インビボの毒性評価のために、マウスにＭＴＯ１２９を接種し、図３で記載されているように、２週間にわたってガルニセルチブおよび式Ｉの化合物の様々なモル当量の投与量で処置した。治癒したマウス、すなわち実験的なエンドポイントで転移がないマウスの数をスコア化した。これらのマウスの腸、皮膚試料、心臓、胸郭骨、および四肢を、１０％の緩衝化ホルマリンリン酸塩（Ｓｉｇｍａ）において固定した。軟組織を、パラフィンブロックに埋め込み、区分し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。骨格を、最初に２週間脱灰してから、埋め込み、区分し、染色した。経験豊富な病理医が、組織病理学異常について組織を分析した。肉眼で明らかな漏斗胸表現型（ｐｅｃｔｕｓ ｅｘｃａｖａｔｕｍ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）（胸骨中に陥没した）が、胸肋軟骨領域（胸骨と肋骨との間に存在する軟骨）における欠損に関連することがわかった。さらに、長骨の末端にある軟骨の骨化部位を、肥大部位（ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｚｏｎｅ）の欠損について分析した。病理学的異常は、ガルニセルチブまたは式Ｉの化合物のいずれかの１倍の投与量を用いた皮膚および腸管の分析では観察されなかった。

【0293】

【表3】

【0294】

ガルニセルチブは、３倍の用量当量（４８０ｍｇ／ｋｇ／日）から有効であり（＞５０％の有効性）、９倍の用量当量（１４４０ｍｇ／ｋｇ／日）で有毒であった（毒性＞５０％）。式Ｉの化合物は、０．３倍の用量当量（４２．５ｍｇ／ｋｇ／日）で有効であり、９倍の用量当量（１２７２ｍｇ／ｋｇ／日）で有毒であった（毒性＞５０％）。

【0295】

これに基づいて、ガルニセルチブと比較した、式Ｉの化合物の治療指数（中毒量／有効量の比）を算出することができる。

【0296】

ガルニセルチブの治療指数＝９／３＝３。式Ｉの化合物の治療指数＝９／０．３＝３０。この結果により、式Ｉの化合物が、ガルニセルチブと比較して少なくとも１０倍の改善をもたらすことが示される。

【0297】

実施例５：式ＶＩＩのプロドラッグの合成：
４－ヒドロキシタモキシフェンにアセトバニロン（ａｃｅｔｏｖａｎｉｌｌｏｎｅ）－フラグメントをカップリングするために、最初に、市販のアセトバニロンから出発して、ハロゲン化アセトバニロンフラグメントを合成した。

【0298】

１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）エタン－１－オン

【0299】

【化33】

【0300】

室温のＤＭＦ（１２０ｍＬ）のアセトバニロン（６ｇ、３６．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（７．４８ｇ、５４．１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を、その後、臭化ベンジル（４．６６ｍＬ、３８．９９ｍｍｏｌ、１．０８当量）を滴下した。反応混合物を４０℃で１４時間撹拌してから室温に冷却し、１Ｌの水／氷の混合物に注ぎ、１０分間撹拌した。その後、懸濁液を、真空下でブフナー漏斗を使用して濾過し、固形物を０℃の水（３×７０ｍＬ）ですすいでから、ブフナー漏斗内で、真空下で１時間放置した。その後、固形物を丸底フラスコに移し、高真空ライン上で恒量になるまで乾燥させることで、８．９９ｇ（９７％の収率）の表題化合物を得た。（Ｃ．Ｍｉｅｓｃｈ，Ｔ．Ｅｍｒｉｃｋ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉ．２０１４，４２５，１５２－８）．

【0301】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ７．５５（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，２．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３８（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．２９（ｍ，１Ｈ），６．９１－６．８７（ｍ，１Ｈ），５．２３（ｓ，２Ｈ），３．９４（ｓ，３Ｈ），２．５５（ｓ，３Ｈ）．

【0302】

１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－ブロモエタン－１－オン（５－８ａ）

【0303】

【化34】

【0304】

上で得られた、６０℃のＥｔＯＨ（１５０ｍＬ）中の１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）エタン－１－オン（７．８６ｇ、３０．６９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、臭素（４．９０ｇ、３０．６９ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。反応混合物を６時間撹拌してから、一晩かけてゆっくりと室温に冷却した。午前に、反応混合物を０℃に冷却し、１時間撹拌した。その後、それをガラス製ブフナー漏斗を介して濾過し、冷ＥｔＯＨ（２×３０ｍＬ）で洗浄し、その後、高真空ライン上で乾燥させた。これにより、表題化合物（７．２５ｇ、７１％）を^１Ｈ ＮＭＲにより純粋な白色固形物として得た。

【0305】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．５８－７．４９（ｍ，２Ｈ），７．４６－７．２９（ｍ，５Ｈ），６．９２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），５．２５（ｓ，２Ｈ），４．３９（ｓ，２Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ）．

【0306】

４，４’－（２－フェニルブト－１－エン－１，１－ジイル）ジフェノール（ＣＡＳ Ｎｏ．４１２０－４５－０）から出発した、式ＶＩＩのプロドラッグの合成が、スキームＶＩＩＩにおいて以下のように例示される：

【0307】

【化35】

【0308】

３－（４－（１－（４－ヒドロキシフェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノキシ）プロパン－１，２－ジオール（５－４６）

【0309】

【化36】

【0310】

密封フラスコ内で、ジオール５－４３（１．６ｇ、５．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥｔＯＨ（２４ｍＬ）中のＮＥｔ_３（０．７０６ｍＬ、５．０６ｍｍｏｌ、１当量）およびグリシドール（０．３０１ｍＬ、４．５５ｍｍｏｌ、０．９当量）を添加し、一晩かけて最大８０℃に加熱した。午前に、反応混合物を室温に冷却し、真空中で溶媒を除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）と飽和塩化アンモニウム（４０ｍＬ）とに分けてから、有機層をＭｇＳＯ_４上で乾燥させ、真空中で乾燥するまで濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、濃い無色の油（７３５ｍｇ、３７．２％の収率）として表題化合物を得た。

【0311】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ｃｄ３ｏｄ）δ７．１９－７．０６（ｍ，１Ｈ），７．０４（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．９６（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ），６．８２－６．７４（ｍ，１Ｈ），６．６７（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），６．６２－６．５５（ｍ，１Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ），４．１３－３．８０（ｍ，１Ｈ），３．７９－３．５３（ｍ，１Ｈ），２．４９（ｐ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ）．

【0312】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ｃｄ３ｏｄ）δ１５９．１４，１５８．２９，１５７．２５，１５６．３６，１４４．１１，１４４．１０，１４１．９９，１４１．８０，１３９．７４，１３９．７１，１３７．８７，１３７．５０，１３６．３４，１３５．９８，１３３．０２，１３３．００，１３１．５７，１３０．８９，１３０．８７，１２８．８４，１２６．９４，１１５．８４，１１５．１８，１１５．０９，１１４．３５，７１．８４，７１．７６，７０．３４，７０．０８，６４．２１，６４．１４，２９．８９，２９．８５，１３．９４．^＊＊二重結合はシス異性体およびトランス異性体の１：１混合物であるという事実、および、使用されたグリシドールはラセミ体であるという事実により、予想よりも多くの炭素がある。これはジアステレオマーによるものである。^＊＊

【0313】

４－（１－（４－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メトキシ）フェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノール（５－４９）

【0314】

【化37】

【0315】

５－４６（１０６ｍｇ、０．２７１ｍｍｏｌ）の溶液をＮ_２下でフラスコに添加し、室温でアセトン（３ｍＬ）に溶解し、ｐ－ＴＳＡ（７．７ｍｇ、０．０４０ｍｍｏｌ、０．１５当量）および２，２－ジメトキシプロパン（６６μＬ、５４２ｍｍｏｌ、２当量）を５０℃で添加し、５時間反応させた。ＴＬＣによりすべての出発物質が消失すると、反応混合物を室温に冷却し、それを１０％のＮａＨＣＯ_３（２ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（６ｍＬ）で希釈し、相を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×６ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせ、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させてから、真空中で濃縮した。その後、残渣をシリカを介して精製し、無色の油として表題化合物（１０２ｍｇ、８７％の収率）を得た。

【0316】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．１９－７．０４（ｍ，７Ｈ），６．９２－６．８３（ｍ，１Ｈ），６．８２－６．６９（ｍ，３Ｈ），６．５６－６．５２（ｍ，１Ｈ），６．４８－６．４４（ｍ，１Ｈ），４．９６（ｓ，０．５Ｈ），４．７０（ｓ，０．５Ｈ），４．５４－３．７７（ｍ，５Ｈ），２．５２－２．４２（ｍ，２Ｈ），１．４９－１．３４（ｍ，６Ｈ），０．９２（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，３Ｈ）．

【0317】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１５７．２０，１５６．３７，１５４．２２，１５３．４１，１４２．５３，１４１．２０，１４１．１６，１３７．６３，１３７．６１，１３６．６９，１３６．３３，１３６．２３，１３５．８９，１３２．０９，１３１．９２，１３０．７６，１３０．５９，１２９．６７，１２７．８３，１２７．８１，１２５．９２，１１４．９３，１１４．２３，１１４．０４，１１３．２９，１０９．７９，１０９．６９，７４．０３，７３．９８，６８．７１，６８．４２，６６．８９，６６．８０，２９．０１，２９．００，２６．７９，２６．７３，２５．３７，２５．３４，１３．５９．

【0318】

^＊＊二重結合はシス異性体およびトランス異性体の１：１混合物であるとういう事実、および、使用されたグリシドールがラセミ体であるという事実により、予想より多くの炭素がある。これはジアステレオマーによるものである。

【0319】

ＩＲ（フィルム）：３４００、２９２０、２８５１、１７２２、１６７３、１５９８、１４９６、１２７３ｃｍ^－１

【0320】

ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ） ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ_２８Ｈ_３０Ｏ_４：４３０．２１４４；ｆｏｕｎｄ：４３０．２１４３．

【0321】

１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－（４－（１－（４－（（２，２－ジメチル－１，３－ジオキソラン－４－イル）メトキシ）フェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノキシ）エタン－１－オン（５－５０）

【0322】

【化38】

【0323】

アセトン（１５ｍＬ）中の５－４９（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、１当量）の撹拌溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（３２１ｍｇ、２．３２ｍｍｏｌ、２当量）を添加し、その後、アルファブロモケトン５－８ａ（５８２ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、それを室温で一晩撹拌した。翌朝、溶媒を真空中で除去し、その後、それをＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で希釈した。相を分離し、水層をＥｔＯＡｃ（２×２０ｍＬ）で抽出し、有機層を組み合わせ、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させてから、真空中で濃縮した。その後、残渣をシリカを介して精製し、無色の油として表題化合物（７３７ｍｇ、９２．７％の収率）を得た。

【0324】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６１－７．２７（ｍ，７Ｈ），７．１９－６．８４（ｍ，１０Ｈ），６．７８－６．７１（ｍ，２Ｈ），６．５９－６．５０（ｍ，２Ｈ），５．３０－５．０５（ｍ，４Ｈ），４．５３－４．３４（ｍ，１Ｈ），４．２２－４．０２（ｍ，１Ｈ），３．９９－３．８６（ｍ，５ｊＨ），３．８５－３．７４（ｍ，１Ｈ），２．４６（ｑ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．４９－１．３４（ｍ，６Ｈ），０．９１（ｔｄ，Ｊ＝７．３，１．０Ｈｚ，３Ｈ）．

【0325】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ１９３．２５，１９３．２０，１５７．３９，１５６．９８，１５６．５５，１５６．１５，１５３．１８，１５３．０５，１４９．９１，１４９．８２，１４２．６２，１４２．５８，１４１．５３，１４１．４８，１３７．６６，１３７．２３，１３６．７６，１３６．７３，１３６．２６，１３６．２３，１３２．１０，１３２．０７，１３０．７８，１３０．７５，１２９．８０，１２８．８６，１２８．８４，１２８．３２，１２８．３０，１２８．１３，１２８．１２，１２７．９８，１２７．３１，１２７．３０，１２６．０９，１２２．７５，１２２．６８，１１４．５３，１１４．２０，１１３．７９，１１３．４５，１１２．３８，１１２．３２，１１０．９４，１１０．９１，１０９．８８，１０９．７８，７４．１７，７４．１２，７０．９８，７０．９５，７０．９１，７０．７８，６８．８９，６８．６０，６７．０６，６６．９７，５６．２７，５６．２３，２９．１９，２９．１４，２６．９８，２６．８９，２５．５２，２５．５０，１３．７４，１３．７３．

【0326】

^＊＊二重結合はシス異性体およびトランス異性体の１：１混合物であるという事実、および、使用したグリシドールがラセミ体であるという事実により、予想より多くの炭素がある。これはジアステレオマーによるものである。^＊＊

【0327】

ＵＰＬＣ－ＭＳ：６８５．９（Ｍ＋Ｈ）

【0328】

１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－（４－（１－（４－（２，３－ジヒドロキシプロポキシ）フェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノキシ）エタン－１－オン（５－５１）

【0329】

【化39】

【0330】

上記の５－５０（６３４ｍｇ、１．０９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、６：１のＴＨＦ：水（２０ｍＬ）に溶解し、２ＭのＨＣｌ（２ｍＬ）を室温で添加した。反応をＴＬＣによって追跡し、すべてのＳＭが消費されたときに、１０％のＮａＨＣＯ_３（１０ｍＬ）でクエンチした。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、相を分離し、水相をＥｔＯＡｃ（５ｍＬ）およびクロロホルム（５ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ_４上で乾燥させてから、真空中で濃縮した。その後、残渣を、シリカ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）を介して精製し、無色の油として表題化合物（５２７ｍｇ、８９％の収率）を得た。

【0331】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６１－７．３０（ｍ，７Ｈ），７．１９－７．０５（ｍ，７Ｈ），６．９５－６．８５（ｍ，３Ｈ），６．７９－６．７２（ｍ，２Ｈ），６．５９－６．５１（ｍ，２Ｈ），５．２６－５．０２（ｍ，４Ｈ），４．２３－３．５３（ｍ，８Ｈ），２．５０－２．４０（ｍ，２Ｈ），０．９１（ｔｄ，Ｊ＝７．３，１．１Ｈｚ，３Ｈ）．

【0332】

２－（４－（１－（４－（２－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－オキソエトキシ）フェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノキシ）アセトアルデヒド（５－５２）

【0333】

【化40】

【0334】

ＤＣＭ（７ｍＬ）中の上記５－５１（２５０ｍｇ、０．３８８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水（２ｍＬ）中のＮａＩＯ_４（２４９ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ、３当量）を室温で添加した。反応物を勢いよく３時間撹拌し、ほとんどの出発物質が消費された。ブライン（４ｍＬ）で希釈してから、相を分離した。有機相を乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、溶媒を真空中で除去してから、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製することで、無色の油（１５５ｍｇ、６３％の収率）として表題化合物を得た。

【0335】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ９．８８（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），９．７７（ｂｒ ｓ，０．５Ｈ），７．６２－７．２８（ｍ，７Ｈ），７．２０－７．０５（ｍ，７Ｈ），６．９４－６．８４（ｍ，３Ｈ），６．８１－６．７０（ｍ，２Ｈ），６．６０－６．４９（ｍ，２Ｈ），５．３３－４．９８（ｍ，４Ｈ），３．９３（ｄ，Ｊ＝１４．５Ｈｚ，４Ｈ），２．５１－２．３８（ｍ，２Ｈ），０．９２（ｄｔ，Ｊ＝８．５，４．２Ｈｚ，３Ｈ）．

【0336】

１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－（４－（１－（４－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノキシ）エタン－１－オン（５－５４）

【0337】

【化41】

【0338】

ＴＨＦ（１５ｍＬ）中の５－５２（１４３ｍｇ、０．２３３ｍｍｏｌ、１当量）の撹拌溶液に、Ｎ_２下で、ＴＨＦ（０．１７５ｍＬ、０．３５０ｍｍｏｌ、１．５当量）中のジメチルアミンの２Ｍの溶液を室温で添加し、その後、Ｎａ（ＡｃＯ）_３ＢＨ（７５ｍｇ、０．７００ｍｍｏｌ、３当量）を少しずつ添加した。反応を５時間反応させ、その時点で、ＴＬＣによって目に見えるＳＭはなかった。その後、反応混合物をブライン（３ｍＬ）およびＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）で希釈し、相を１５分間撹拌してから分離した。水相をＥｔＯＡｃ（２×１０ｍＬ）およびクロロホルム（１×１０ｍＬ）で抽出し、有機抽出物を組み合わせて乾燥し（ＭｇＳＯ_４）、溶媒を真空中で除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ－０～１５％）によって精製して、濃い油（９３ｍｇ、６２％の収率）として表題化合物を得た。

【0339】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６２－７．５５（ｍ，１Ｈ），７．５５－７．４８（ｍ，１Ｈ），７．４６－７．２８（ｍ，５Ｈ），７．２１－７．０６（ｍ，７Ｈ），６．９４－６．８１（ｍ，３Ｈ），６．７８－６．７１（ｍ，２Ｈ），６．５９－６．４５（ｍ，２Ｈ），５．２４（ｓ，１Ｈ），５．２２（ｓ，２Ｈ），５．０６（ｓ，１Ｈ），４．２６（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．１１－４．０７（ｍ，１Ｈ），３．９５（ｓ，１．５Ｈ），３．９１（ｓ，１．５Ｈ），３．１１（ｄｔ，Ｊ＝３６．９，４．３Ｈｚ，２Ｈ），２．６３（ｓ，３Ｈ），２．５７（ｓ，３Ｈ），２．４６（ｑ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），０．９１（ｔｄ，Ｊ＝７．４，１．８Ｈｚ，３Ｈ）．

【0340】

２－（４－（１－（４－（２－（ジメチルアミノ）エトキシ）フェニル）－２－フェニルブト－１－エン－１－イル）フェノキシ）－１－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）エタン－１－オン（式ＶＩＩのプロドラッグ）

【0341】

【化42】

【0342】

脱気した１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１２ｍＬ）中の５－５４（９４ｍｇ、０．１４６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｐｄ／Ｃ（９ｍｇ）を室温で添加した。Ｎ_２雰囲気を、Ｈ_２のバルーンと真空を用いて、３回のサイクルでＨ_２雰囲気に置き換えた。反応をＴＬＣによって追跡し、ＳＭが消費されると、雰囲気をＮ_２と置き換え、５分間パージした。反応混合物をセライトに通して濾過し、溶媒を除去した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ－勾配）によって精製することで、濃い油（７４ｍｇ、９２％の収率）として表題化合物を得た。

【0343】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．６５－７．５８（ｍ，１Ｈ），７．５５－７．５０（ｍ，１Ｈ），７．１７－７．０５（ｍ，７Ｈ），７．００－６．８６（ｍ，３Ｈ），６．７９－６．７１（ｍ，２Ｈ），６．５９－６．５１（ｍ，２Ｈ），５．２３（ｓ，１Ｈ），５．０７（ｓ，１Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），４．０１－３．９３（ｍ，４Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５０－２．４０（ｍ，５Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），０．９１（ｔｄ，Ｊ＝７．４，２．０Ｈｚ，３Ｈ）．

【0344】

実施例６：ＬｉｇＦ酵素アッセイ
６．１ ４－メチルウンベリフェロンアセトバニロンの合成
４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）誘導体は既知の化合物である。ＭＵＡＶの合成は、以下のように例示することができる：

【0345】

【化43】

【0346】

７－（２－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－オキソエトキシ）－４－メチル－２Ｈ－クロメン－２－オン（５－４ｂ）

【0347】

【化44】

【0348】

２５℃のアセトン（３０ｍＬ）中の４－メチルウンベリフェロン Ｉ（４００ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、１－（４－（ベンジルオキシ）－３－メトキシフェニル）－２－ブロモエタン－１－オン（実施例５で合成された５－８ａ）（９６７ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加した。反応混合物を１６時間撹拌してから濾過し、固形の残渣をアセトン（２×３０ｍＬ）で洗浄した。その後、溶媒を減圧下で除去してから、トルエンに懸濁し、溶液が形成されるまで加熱した。その後、フラスコを９０分間かけて室温に冷却し、それを濾過し、冷トルエン（１０ｍＬ）で洗浄し、高真空ライン上で乾燥させた。これにより、白色固形物（８０１ｍｇ、８２％）として表題化合物を得た。

【0349】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．５７－７．３０（ｍ，８Ｈ），６．９４（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，２Ｈ），６．７８（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３１（ｓ，２Ｈ），５．２６（ｓ，２Ｈ），３．９５（ｓ，３Ｈ）．

【0350】

７－（２－（４－ヒドロキシ－３－メトキシフェニル）－２－オキソエトキシ）－４－メチル－２Ｈ－クロメン－２－オン（５－４ａ）

【0351】

【化45】

【0352】

圧力反応器に、脱気した１０％のＭｅＯＨ／ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）中の５－４ｂ（５００ｍｇ、１．１６ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（２５ｍｇ、ｓｍの質量に対して５％）を室温で添加した。上記反応器に１バール（ｇ）の水素を入れ、圧力に耐えることができる適切なニードルを用いて試料を採取することによって、反応をＴＬＣによって追跡した。４時間後、出発物質が消費された。水素を反応器から放出し、３回の真空－窒素サイクルにより窒素と置き換えた。反応混合物をＣＨＣｌ_３（２０ｍＬ）で希釈し、セライトに通して濾過した。濾液を減圧下で濃縮した。粗製物をクロマトグラフィーにかけ（０～１０％のＭｅＯＨ：ＤＣＭ）、白色固形物として表題化合物５－４ａ（３０７ｍｇ、７８％）を得た。

【0353】

^１Ｈ ＮＭＲ（４００ ＭＨｚ，Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ）δ７．５９－７．５５（ｍ，２Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），７．００（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），６．９４（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．７９（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），６．１８（ｂｒ ｓ，１Ｈ），６．１４（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｓ，２Ｈ），３．９７（ｓ，３Ｈ），２．３９（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ）．

【0354】

６．２ インビトロの酵素蛍光アッセイ（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙｓ）
一般的に、式ＩＩＩの化合物、式Ｉの化合物のプロドラッグ、式ＶＩＩの化合物、４－ヒドロキシタモキシフェンのプロドラッグ、および式ＩＸの化合物、ＳＮ－３８のプロドラッグを含む、式ＩＩおよび式Ｖのプロドラッグのエーテル結合の切断の動態（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を研究するために、および、認識フラグメントの酵素の選択性を理解するために、蛍光化合物である蛍光４－メチルウンベリフェロンをモデル化合物として使用した。

【0355】

【化46】

【0356】

ＬｉｇＦの酵素活性を試験するために、ＩＲＢ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ内のＰｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにより、Ｈｉｓタグ付きＬｉｇＦ ＤＮＡをｐＯＰＩＮＦベクトルに挿入することによって、純粋なＬｉｇＦタンパク質を発現させ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ ｌｙｓＳ細胞中で発現させた。発現および溶解後、ニッケルカラムを用いることによってタンパク質を精製し、ゲル濾過を行った。注目すべきことには、Ｈｉｓタグは、精製後にタンパク質から取り除かれなかった。

【0357】

インビトロの蛍光アッセイのために、精製したＬｉｇＦを、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で１５μｇ／ｍｌに希釈し、１ｍＭのグルタチオンおよび３０μＭの４－メチルウンベリフェロンアセトバニロン（ＭＵＡＶ）モデル化合物を添加した。

【0358】

９６ウェル固形ポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において反応を実行し、トップウェルプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ ＦＬ６００蛍光光度計）を用いて、励起３６０、放射４８５、および感度１００で測定した。

【0359】

化合物ＭＵＡＶのβエーテル結合の切断に起因する４－メチルウンベリフェロン（４－ＭＵ）の急速な産生ゆえに、マサイ（Ｅ．Ｍａｓａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００３，１８５，１７６８－７５）によって記載されるプロトコルを、ＬｉｇＦ酵素濃度を下げることによって変更した。この最適化されたプロトコルを用いて、化合物ＭＵＡＶを、緩衝剤、グルタチオン（ＧＳＨ）、およびＬｉｇＦの存在下で、室温でインキュベートし、蛍光により４－ＭＵの産生を観察することによって、切断を観察した。ＧＳＨ、ＬｉｇＦ、およびＭＵＡＶを含有しないウェルを含む適切な対照により、エーテル結合がアッセイ条件下で分解しておらず、かつ酵素活性が必要であったことが示された。酵素ＬｉｇＦは、およそ３０～４０分で生成物ＭＵＡＶを切断した（図６）。

【0360】

細胞培養におけるアッセイでは、細胞を安定して形質導入して、ｐＬｅｎｔｉ ＰＧＫ ｐｕｒｏベクター、ならびにパッケージングプラスミドｐＣＡＧ－ＲＴＲ２、ｐＣＡＧ－ＶＳＶＧ、およびｐＣＡＧ－ＫＧＰ１Ｒによるレンチウイルス感染によってＬｉｇＦを発現させた。１μｇ／ｍｌのプロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）による選択後、感染細胞を２４ウェルプレートに播種し、４－メチルウンベリフェロン アセトバニロン（ＭＵＡＶ）を添加した。ＭＵＡＶの様々な濃度（すなわち、１０、３０、および１００μＭ）の添加後の時点で、培地を採取して４－ＭＵ蛍光の測定を行った。

【0361】

図７は、細胞により発現されたＬｉｇＦによって、ＭＵＡＶのエーテル結合が実際に切断されたことを示し、これは、蛍光における用量依存性の増大によって示される。対照実験（１００μＭで処理された空ベクター（および、ＬｉｇＦではない）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞）において切断は観察されなかった。これらの実験により、ＬｉｇＦが哺乳動物細胞の内部で活性を有していること、および、少なくとも試験した細胞において、βエーテル結合を切断することができる酵素が他にないことが示された。

【0362】

６．３． 式ＶＩＩのプロドラッグのインビトロでのＬｉｇＦアッセイ
ＬｉｇＦおよびアセトバニロン由来のプロドラッグを用いたインビトロの酵素アッセイのさらなる試験のために、式ＶＩＩの化合物である４－ヒドロキシタモキシフェンのプロドラッグを使用した。

【0363】

５．２でのインビトロのアッセイと同様に、式ＶＩＩの化合物を、ＤＭＳＯ中の３０ｍＭのストック溶液から２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の５０μＭへと希釈し、１ｍＭのグルタチオンおよび１５μｇ／ｍｌのＬｉｇＦを添加した。しかし、反応混合物を３７℃でインキュベートしたところ、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用した読み取り値は異なっていた。反応試料と、標準としての酵素およびＺ－４－ＯＨＴ（４－ヒドロキシタモキシフェン）のない対照試料とを、ＭｅＯＨ中で２：３に希釈し、２μｌをＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８カラム（５μｍ、２．１ｘ１５０ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ；Ｔｈｅｒｍｏ ＥＣ Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｍｏｄ Ｍｉｃｒｏ ＡＳ ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｓおよびＴｈｅｒｍｏ ＥＣ Ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ ｐｕｍｐ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ Ｍｏｄ． Ｓｕｒｖｅｙｏｒ ＭＳ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈを使用）上に、水－ＭｅＯＨ勾配（３０分で６０～９０％のＭｅＯＨ；５分で９０～１００％；１００μｌ／分の流量）で注入した。チップ技術によるナノエレクトロスプレーを実行するｎａｎｏＥＳＩ ｓｏｕｒｃｅとしてＡｄｖｉｏｎ Ｔｒｉｖｅｒｓａ Ｎａｎｏｍａｔｅ（Ａｄｖｉｏｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｔｈａｃａ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して、ＬＣ－ＭＳカップリングを実施した。Ｎａｎｏｍａｔｅを、ＬＴＱ－ＦＴ Ｕｌｔｒａ質量分析計に取り付け、正のモード（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｍｏｄｅ）で、１．７ｋＶのスプレー電圧および０．５ｐｓｉの吐出圧力で動作した。

【0364】

ＬＴＱ－ＦＴ Ｕｌｔｒａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ）質量分析計において、４０Ｖのキャピラリー電圧および１２０Ｖのチューブレンズ電圧を用いて解析を実行した。ＭＳ／ＭＳを、データ依存性取得（ＤＤＡ）モードおよび選択反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで動作した。サーベイＭＳスキャン画像を、１００，０００に設定された分解能（４００ｍ／ｚで定義）を有するＦＴにおいて得た。１つのスキャン当たり最も強度の高いイオンのうち最大６つを断片化し、線形イオントラップにおいて検出した。イオンカウント標的値は、サーベイスキャンでは１，０００，０００であり、ＭＳ／ＭＳスキャンでは５０，０００であった。ＭＳ／ＭＳのために既に選択された標的イオンを、３０秒間動的に排除した。ＳＲＭのために、最大注入を４００ｍｓに設定し、平均して２つのマイクロスキャン（ｍｉｃｒｏｓｃａｎｓ）を行った。

【0365】

ＱｕａｎＢｒｏｗｓｅｒ（Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウェア２．０ＳＲ２）を用いて、データを、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）遷移のＸＩＣ（抽出されたイオンクロマトグラム）ピーク面積として表す。

【0366】

ＬｉｇＦは、認識フラグメント（アセトバニロン）および４－ＯＨＴコアを結合する、式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合を切断し、４－ＯＨＴをもたらすことができた。対照実験において、ＬｉｇＦ以外のすべての他の構成成分が存在した場合、分子が無傷のままであり、体温で安定性を延長することが示されたことに注目する。意外にも、式ＶＩＩのプロドラッグのＥ－異性体は、Ｚ－異性体よりも早い速度で切断し、異性体（Ｚ）－４－ＯＨＴの特異的遊離を結果としてもたらす。（式ＶＩＩのプロドラッグのＥ－異性体が切断して（Ｚ）－４－ＯＨＴをもたらすという事実は、カーン・インゴルド・プレローグ順位則によるものである。）

【0367】

図８は、ＬｉｇＦにより、式ＶＩＩのプロドラッグのβエーテル結合が切断されて４－ＯＨＴがもたらされる、ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳの実験を示す。（Ａ）陰性対照。（Ｂ）時間＝０。（Ｃ）時間＝１時間。（Ｄ）時間＝３時間。（Ｅ）時間＝４４時間。

【0368】

式ＶＩＩのプロドラッグの切断は、およそ３０時間後に５０％のプラトーに達し、３時間後にプラトーの途中に達し、これは、図９で見られるように、有用なインビボのツールとなるのに十分な速度であると想定された。

【0369】

６．４ 細胞共培養アッセイ：
これらのアッセイを実施して、式ＶＩＩの化合物に対するこの特異的なＬｉｇＦ酵素反応が、細胞状況において起こる可能性があるかどうかを評価し、これには、プロドラッグが細胞膜を通過することができること、および、ＬｉｇＦによる切断後、４－ＯＨＴが隣接細胞に拡散し、変異ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質を活性化し、それにより、融合タンパク質の核活性を達成することができることが含まれる。この例では、それらの融合タンパク質は、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２および転写因子（ＮＴＣＦ４－ＥＲ^Ｔ２）－の活性部分である。

【0370】

ＬｉｇＦを発現する細胞に隣接する細胞における遺伝子組換えが実証される第１の実験では、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を使用した。マウスモデルは、組換えレポーターｍＴｍＧ（Ｊａｘ Ｓｔｏｃｋ：００７６７６）を保有する。このシステムは、膜が、赤色蛍光タンパク質であるｔｄＴｏｍａｔｏ（タンデムダイマーｔｏｍａｔｏ（ｔａｎｄｅｍ ｄｉｍｅｒ ｔｏｍａｔｏ）；ｍＴは膜Ｔｏｍａｔｏを表す）に結合したことを表す。活性化Ｃｒｅ酵素を用いた組換えの際に、ｍＴおよびｌｏｘＰ部位間にある終止コドンのコード配列を切除する。これは、代わりに、膜結合強化された（ｍｅｍｂｒａｎｅ－ｂｏｕｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ；ｍＧ）の発現を結果としてもたらす。効果的に、このことは、Ｃｒｅ酵素の存在下、または４－ＯＨＴ活性化Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質の存在下において、細胞がｔｄＴｏｍａｔｏの産生を止めてＥＧＦＰを発現し始めることを意味する；この遺伝的スイッチ（ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｗｉｔｃｈ）は、フローサイトメトリー分析により効率的に定量化することができる。その後、ｍＴｍＧを発現するマウス株を、すべての細胞中にＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２融合タンパク質（ＵｂＣ－Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２；Ｊａｘ Ｓｔｏｃｋ：００８０８５）を保有するマウスと交配させた。Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２を含まないレポーター株だけでなく、二重トランスジェニックマウスからも、ＭＥＦを１４日目の胎芽から採取した。簡単に言うと、妊娠しているメスを、プラグ形成（ｐｌｕｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）後１４日目に屠殺し、子宮を摘出し、胎芽を解剖し、頭部および胎仔肝臓を処分した。残りの部分を刻み、トリプシンで消化し、前述の補足されたＤＭＥＭを含む１０ｃｍのプレート中で成長させた。

【0371】

ＭＥＦ組換え：ｐＬｅｎｔｉ ＰＧＫ－ＬｉｇＦ（ｐｕｒｏ）または同等の空ベクターで形質導入されたＭＴＯ１２９を、トリプシン処理し、単細胞をＵｂＣ－Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２上に添加し；ｍＴｍＧ（または、対照ｍＴｍＧのみ）ＭＥＦを１２－ウェルプレート中で成長させた。翌日、Ｚ－４－ＯＨＴまたは式ＶＩＩのプロドラッグのいずれかを、１０００～１ｎＭの範囲の濃度で添加した。２日後に、細胞をトリプシン処理し、フローサイトメトリーによって、ＴｄＴｏｍａｔｏ／ＥＧＦＰ蛍光（Ｇａｌｌｉｏｓ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）について分析した。蛍光を２次元で生存細胞上で分析し、４象限のパーセントとしてスコア化した。ＥＧＦＰの正の象限（ＴｄＴｏｍａｔｏを有するまたはＴｄＴｏｍａｔｏを有しないＱ２およびＱ４）は組換えられたと考えられ、合計の割合を計算した。データは、２つの独立実験からの平均（＋ＳＤ）である。

【0372】

図１０はアッセイの結果を示し、ＵＶＣｒｅ－ｍＴｍＧの下にある棒は、組換えレポーターカセット（ｍＴｍＧ）と共に、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２を発現するＭＥＦで得られた結果を示し、一方、Ｃｏｎ－ｍＴｍＧの下にあるカラムは、対照として使用されるＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２発現を欠くＭＥＦでの結果を示す。

【0373】

図１０で見られるように、Ｃｒｅ－ＥＲ^Ｔ２発現にかかわらず、４－ＯＨＴの添加による用量依存性の遺伝子組換えがあった。式ＶＩＩのプロドラッグを添加すると、これは、ＬｉｇＦ エーテラーゼを発現するＭＥＦにおいて、４－ＯＨＴに非常に類似する、ＭＥＦの遺伝子組換えのパターンを達成した。ＵｂＣ－ＥＲ^Ｔ２を欠くＭＥＦにおいて、最高用量である程度の組換えのみがあり、これは、わずかな不純物、または本質的に減少した活性によって説明することができる。このことは、式ＶＩＩのプロドラッグがほとんど不活性であるが、ＭＥＦと共培養された、Ｌｉｇ－Ｆを発現するＭＴＯ１２９において切断され、および、この反応が、遊離した４－ＯＨＴがＭＥＦを拡散し、遺伝子組換えを引き起こすことを可能にするのに十分であったことを示す。

【0374】

第２の実験に関しては、ＥＲ^Ｔ２融合生成物は、転写因子であるＬＳ１７４Ｔ－ＮＴＣＦ４－ＥＲ^Ｔ２（ＬＳ－ＮＥ）細胞（Ｗｈｉｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，６９５－７０７に記載される、オリジナルＬＳ１７４Ｔ細胞をＡＴＣＣから購入した）を、Ｌｉｇ－Ｆを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞との共培養に使用した。これらのＬＳ－ＮＥ細胞を、３７℃および５％のＣＯ_２で、Ｌ－グルタミンおよび１０％のウシ胎仔血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で補足されたＤＭＥＭにおいて培養した。

【0375】

ＮＴＣＦ４は、転写因子ＴＣＦ４のＮ－終点を表す。この構築物は、ドミナントネガティブ機能（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を有しており、これによりＷｎｔ経路中のシグナル伝達のスイッチをオフに切り替え（ＷｎｔＯＦＦ）、このことは、発達および（腸）幹細胞調節に重要である。加えて、大半の大腸癌（ＣＲＣ）細胞はＷｎｔシグナル伝達に依存しており、それゆえ、それを阻害することにより、腫瘍形成促進活性幹細胞遺伝子（下降、抑制）および細胞分化遺伝子（上昇、活性化）の両方の遺伝子発現において強い反応を結果としてもたらす。ＥＲ^Ｔ２への融合は、核外に構築物を維持し、したがって、不活性である。ＣＲＣでは、ＮＴＣＦ４－ＥＲ^Ｔ２で修飾された細胞株ＬＳ１７４Ｔは、４－ＯＨＴを加えると、内因性遺伝子発現において、記載された変化をもたらす。

【0376】

ｐＬｅｎｔｉ ＰＧＫ－ＬｉｇＦ（ｐｕｒｏ）または同等の空ベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートにおいて１／１０の比率で、ＬＳ１７４Ｔ－ＮＴＣＦ４－ＥＲ^Ｔ２（ＬＳ－ＮＥ）細胞と共播種した（ｃｏ－ｐｌａｔｅｄ）。共培養物を、１または１０μＭで、ＤＭＳＯ、１μＭのＺ－４－ＯＨＴ、または式ＶＩＩのプロドラッグで処理した。１６時間後、細胞をトリゾールに溶解し、ＲＮＡ抽出（ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＲＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｃＤＮＡ調製（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ＲＴ ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ）を行った。幹細胞遺伝子ＡＳＣＬ２（４－ＯＨＴ－媒介性ＷｎｔＯＦＦによって抑制された；Ｈｓ＿００２７０８８８＿Ｓ１）、分化遺伝子ＫＲＴ２０（４－ＯＨＴ－媒介性ＷｎｔＯＦＦによって活性化された；Ｈｓ＿００３００６４３＿ｍ１）、およびハウスキーピング遺伝子ＰＰＩＡ（Ｈｓ＿９９９９９９０４＿ｍ１）を、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、Ｔａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用するＲＴ－ｑＰＣＲによって分析した。図１１のデータを、ハウスキーピング遺伝子、およびＤＭＳＯ対照に正規化した。データは、単一の実験からの技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）（＋ＳＤ）の平均である。ＬｉｇＦ陰性のＨＥＫ２９３Ｔの存在下では、４－ＯＨＴのみが転写スイッチ（活性化遺伝子ＫＲＴ２０（上昇）、および、抑制遺伝子ＡＳＣＬ２（下降））誘導することができたが、ＨＥＫ２９３Ｔ－ＬｉｇＦの存在下では、式ＶＩＩのプロドラッグは１０μＭで同じ反応に到達した。

【0377】

実施例７：式のＶＩＩの４－ＯＨＴプロドラッグインビボの試験
実施例６で記載されるＵｂＣｒｅ－ＥＲ^Ｔ２；ｍＴｍＧマウスを使用して、１または５μｍｏｌ（それぞれおよそ０．６または３ｍｇ）の式ＶＩＩのプロドラッグ、またはビヒクル対照（油）でこれらのマウスを処置した。処置５日後に、マウスを屠殺し、肝臓を１０％のリン酸緩衝ホルマリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｆｏｒｍａｌｉｎ）（ｓｉｇｍａ）中で一晩固定し、実施例３で説明されるものと同様のパラフィンに包埋した（図１）。切片を切断し、免疫組織化学的検査を使用してＥＧＦＰを染色したところ、図１２に示される結果により、マウス肝臓中に存在する酵素（しかし、我々の培養細胞中ではない、実施例６を参照）は、式ＶＩＩのプロドラッグを切断することができ、遺伝子組換えおよびＥＧＦＰ発現の用量依存性活性化を結果としてもたらすことが示される。

【0378】

実施例８：癌モデルを使用した、インビボのＴＧＦβシグナル伝達阻害に関する追加試験
追加のインビボの試験を実施して、先行技術である参照化合物ガルニセルチブおよび参照化合物３３８と対比させて、本発明の式Ｉの化合物、および式ＩＶのそれらのプロドラッグの効果をさらに評価する。実施例３で示されるように、マウス腫瘍オルガノイド（ＭＴＯ１２９）を発達させた。インビボの抗癌効果およびＴＧＦβシグナル伝達阻害試験のために、６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｎｖｉｅｒから購入し、７～８週齢で注射した。肝臓にＭＴＯ１２９を移植するために、細胞をトリプシン処理し（マトリックスを消化し、オルガノイドを単一細胞へと分解し）、計数し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｌｏｎｚａ）で３００，０００の細胞を脾臓に注射し、しがたって、肝臓と腸とをつなぐ門脈に細胞を直接送達した。

【0379】

化合物（式Ｉの化合物、式ＩＶの化合物、ガルニセルチブ、または化合物３３８）を、ミリＱ水中の１％のカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．４％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．０８５％のポリビニルピロリドン、０．０５％の消泡剤－Ａ（Ｓｉｇｍａ）で構成されたビヒクル溶液中の懸濁液として調製した。１５０μｌの化合物懸濁液を用いて１日２回、胃管栄養法（経管栄養法）によって、化合物による処置を行った。対照マウスを１５０μｌのビヒクルで処置した。

【0380】

図１３で示される実験において、転移形成を阻害する示された化合物の能力を評価した。ＭＴＯ１２９移植の２日後から、示された化合物でマウスを処置し、２週間継続した。マウスを移植後４週間目に屠殺し、固定した肝臓上の肝転移（ＬｉＭ）を目視で計数した。図３は、図の説明で記載される様々なモル当量の投与量（９倍、３倍、１倍、０．３倍）での、式Ｉの化合物およびガルニセルチブの肝腫瘍数（ＬｉＭ）を示す。１倍の投与量（７０．８ｍｇ／ｋｇ、１日２回）の式Ｉの化合物は、同じモル投与量（７０．８ｍｇ／ｋｇ、１日２回）の、式Ｉの化合物に構造的に最も近い化合物である参照化合物３３８と比較して、転移形成の防止において有意に改善された活性を提供した。

【0381】

さらに、図１３は、式Ｉの化合物が、０．３倍（２１．２５ｍｇ／ｋｇ、１日２回）の投与量で、肝転移を予防するのに依然として有効であることを示し、この治療効果は３倍のガルニセルチブ投与量に匹敵する。加えて、式Ｉの化合物の活性は、参照化合物３３８の活性よりも著しく優れており、このことは、参照化合物３３８が式Ｉの化合物の構造異性体であるために、非常に予期しないことであった。

【0382】

式Ｉ（すなわち、式ＩＶ）の化合物のプロドラッグは、このアッセイにおいて、ガルニセルチブより頑強に（ｒｏｂｕｓｔｌｙ）肝転移の数を減少させる。

【0383】

加えて、図１４および図１５で示される実験は、１倍の等モル投与量（７０．８ｍｇ／ｋｇで１日２回の式Ｉの化合物および８０ｍｇ／ｋｇで１日２回のガルニセルチブ）で、先行技術の化合物であるガルニセルチブと比較して、式Ｉの化合物の明らかな転移性疾患（ｏｖｅｒｔ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）に対する治療の効果を評価する。この目的のために、図１３で説明したＭＴＯ１２９をマウスに接種するプロトコルを使用したが、ここでは、化合物による処置を、接種後１６日目に開始した。この時点で、マウスには大きな転移が生じていた。処置を２４日目に終了した。結果（図１４）は、式Ｉの化合物が、等モル投与量でのガルニセルチブと比較すると、この実験的設定において肝転移の数を減少させる効果を改善したことを示す。一方、図１５は、化合物による処置を終えた後、明らかな転移性疾患を有するマウスの生存を示す。これらの実験において、対照マウスの大部分（＞９０％）が肝転移性疾患で死亡した。式Ｉの化合物で処置したマウスは、ガルニセルチブで処置したマウスよりも高い生存率を有していた。図１３、図１４、および図１５で示される実験により、化学的に関連する化合物であるガルニセルチブおよび参照化合物３３８（実際には、式（Ｉ）の化合物の配座異性体である）と比較した、式Ｉの化合物の予期しない強化された治療の効果が例示された。

【0384】

実施例９：ＰＤ１／ＰＤＬ１チェックポイント免疫療法を伴うインビボの併用療法アッセイ
インビボの試験を実施し、先行技術の参照化合物であるガルニセルチブと対比して、式Ｉの化合物の明らかな転移性疾患を有するマウスに対する活性を、単独で、および、抗ＰＤ－１抗体処置などのＰＤ１／ＰＤＬ１の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて評価した。

【0385】

実施例３で示されるように、マウス腫瘍オルガノイド（ＭＴＯ１２９）を発達させた。６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｎｖｉｅｒから購入し、７～８週齢で注射した。肝臓にＭＴＯ１２９を移植するために、細胞をトリプシン処理し（マトリックスを消化し、オルガノイドを単細胞に分解し）、計数し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｌｏｎｚａ）中で、３００，０００の細胞を脾臓に注射し、したがって、肝臓と腸とをつなぐ門脈に細胞を直接送達した。化合物（式Ｉの化合物またはガルニセルチブ）を、ミリＱ水中の１％のカルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．４％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、０．０８５％のポリビニルピロリドン、０．０５％の消泡剤－Ａ（Ｓｉｇｍａ）で構成されたビヒクル溶液中の懸濁液として調製した。化合物での処置を胃管栄養法（経管栄養法）によって行い、マウスをビヒクル中の１５０μｌの化合物懸濁液により１日２回処置した。８０ｍｇ／ｋで１日２回のガルニセルチブまたは７０．８ｍｇ／ｋｇで１日２回の式Ｉの化合物に相当する、１倍の等モル投与量の各化合物でマウスを処置した。２００μｇの抗ＰＤ１（クローンＲＭＰＩ－１４；Ｌｅｉｎｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、腹腔内注射により３日ごとに投与した。対照マウスに、ビヒクルおよびＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体を胃管栄養法で与えた。

【0386】

図１４および図１６で示される実験において、化合物および示された抗体での処置を、ＭＴＯ１２９の接種後１６日目に開始した。この時点で、マウスには大きな肝転移が生じていた。処置を２４日目に終了した。図１４は、１倍の等モル投与量（８０ｍｇ／ｋで１日２回のガルニセルチブまたは７０．８ｍｇ／ｋｇで１日２回の式Ｉの化合物）で、先行技術の化合物であるガルニセルチブ単独と比較した、式Ｉの化合物での処置後の肝腫瘍数（ＬｉＭ）、ならびに、抗ＰＤ－１抗体による処置後、あるいは、抗ＰＤ－１抗体と式Ｉの化合物またはガルニセルチブとの併用処置後の肝腫瘍数（ＬｉＭ）を示す。さらに、この結果により、式Ｉの化合物が、単独療法として等モル投与量で改善された活性をもたらすことが示される。加えて、抗ＰＤ－１抗体と式Ｉの化合物との併用療法は、抗ＰＤ－１抗体とガルニセルチブとの組み合わせよりも改善された活性をもたらした。注目すべきことに、ＰＤ－１抗体療法と組み合わせて式Ｉの化合物で処置したマウスの大部分は、実験時点で、転移がないままであった。図１６は、処置を終えた後に明らかな転移性疾患を有するマウスの生存を示す。これらの実験において、対照マウスの大部分（＞９０％）が肝転移性疾患で死亡した。これに対して、抗ＰＤ１抗体と組み合わせて式１の化合物で処置したマウスの８０％は、処置後に生き延びた。抗ＰＤ１抗体と組み合わせて式Ｉの化合物で処置したマウスは、ガルニセルチブと抗ＰＤ１抗体で処置したマウスと比較して、はるかに高い生存率を有していた（８０％対２０％）。

【0387】

実施例１０：式Ｉの化合物ならびに参照化合物３３８および３３７のインビボの治療効果
他の実験（図１７）において、式Ｉの化合物のインビボの治療活性を、関連する化合物３３８および化合物３３７と比較した。実施例３で示されるように、マウス腫瘍オルガノイド（ＭＴＯ１２９）を発達させた。６週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪマウスをＪａｎｖｉｅｒから購入し、７～８週齢で注射した。肝臓にＭＴＯ１２９を移植するために、細胞をトリプシン処理し（マトリックスを消化し、オルガノイドを単細胞へと分解し）、計数し、ＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類溶液、Ｌｏｎｚａ）で、２００，０００の細胞を脾臓に注射し、したがって、肝臓と腸とをつなぐ門脈に直接細胞を送達した。マウスを、１倍の等モル投与量の各化合物（７０．８ｍｇ／ｋｇの１日２回の式Ｉの化合物、７０．８ｍｇ／ｋｇで１日２回の化合物３３８、または６８．０ｍｇ／ｋｇで１日２回の化合物３３７）で処置した。すべてのマウスを、腫瘍細胞の接種後２日目から１８日目まで処置した。ＭＴＯ接種後２１日目に肝転移の数を計数した。実験（図１７）により、式Ｉの化合物が、化合物３３８および化合物３３７と比較して、転移形成を遮断する増強された効力を保持することが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図8D】

【図8E】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】