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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-04
(45)【発行日】2024-04-12
(54)【発明の名称】キメラ抗原受容体及びその適用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240405BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240405BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240405BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240405BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240405BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240405BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240405BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C07K14/705
C07K19/00
C12N15/867 Z
C12N5/0783
C12N5/10
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2022548605
(86)(22)【出願日】2021-02-05
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2023-04-13
(86)【国際出願番号】 CN2021075544
(87)【国際公開番号】W WO2021160038
(87)【国際公開日】2021-08-19
【審査請求日】2022-10-06
(31)【優先権主張番号】202010090749.5
(32)【優先日】2020-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】507389842
【氏名又は名称】四川大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107766
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠重
(74)【代理人】
【識別番号】100107515
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100070150
【弁理士】
【氏名又は名称】伊東 忠彦
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲うぇい▼
(72)【発明者】
【氏名】魏 于全
【審査官】藤山 純
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１８－５２５０３３（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０２０／０１６８９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１９／１４０１００（ＷＯ，Ａ１）
【文献】KUMARESAN, P. R. et al.，Bioengineering T cells to target carbohydrate to treat opportunistic fungal infection，Proc Natl Acad Sci U S A.，111(29)，2014年07月22日，pp.10660-10665
【文献】ARIIZUMI, K. et al.，Identification of a novel, dendritic cell-associated molecule, dectin-1, by subtractive cDNA cloning，J Biol Chem.，275(26)，2000年06月30日，pp.20157-20167
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０
Ｃ１２Ｎ １／００－ ７／０８
Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００
Ａ６１Ｋ ３５／１７
Ａ６１Ｐ ３５／００
Ａ６１Ｐ ３５／０２
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＰｕｂＭｅｄ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通ドメイン及び前記細胞内ドメインが共刺激シグナル伝達ドメインを形成し、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、逆デクチン－１をコードするアミノ酸配列の完全長を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項2】
細胞外ドメインは、ＣＤ１９又はＨＥＲ２を標的とする一本鎖抗体を含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項3】
さらに、ＣＤ８αヒンジ領域、逆デクチン－１膜貫通ドメイン、逆デクチン－１細胞内シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインがこの順序で連結される、請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項4】
逆デクチン－１をコードするアミノ酸配列が、配列番号３で表される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項5】
逆デクチン－１膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列が、配列番号２で表される、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項6】
逆デクチン－１細胞内シグナル伝達ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号１で表される、請求項３に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項7】
ｐＣＬＫ、ｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．０Ｇからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を含むレンチウイルスベクター。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体を発現する、ＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項9】
請求項８に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される賦形剤及び／又はアジュバントとを含む、抗腫瘍剤。
【請求項10】
腫瘍は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含み、かつ、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ球性白血病、乳がん、胃がん、食道がん及び卵巣がんからなる群から選択される、請求項９に記載の抗腫瘍剤。
【請求項11】
がんの治療において使用するための、請求項８に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項12】
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、エフェクターサイトカインの分泌を刺激することができる、請求項１１に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞であって、ここで、エフェクターサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６を含む、ＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項13】
ＣＡＲ－Ｔ細胞は、刺激された後に、セントラルメモリーＴ細胞の表現型を示す、請求項１１に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項14】
腫瘍は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含み、かつ、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ球性白血病、乳がん、胃がん、食道がん及び卵巣がんからなる群から選択される、請求項１１に記載のＣＡＲ－Ｔ細胞。
【請求項15】
請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体の合成方法であって、以下の：（１） 逆デクチン－１膜貫通ドメイン－逆デクチン－１細胞内ドメインの遺伝子配列又は逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を合成する工程；かつ
（２） 標的に応じたプライマーを合成し、オーバーラップＰＣＲ法によりキメラ抗原受容体の遺伝子配列を合成する工程；
を含む、合成方法であって、ここで、前記工程（２）は、以下の：プライマーＦ１及びＲ１を用いて、細胞外ドメイン及びＣＤ８αヒンジ領域の結合遺伝子配列を増幅する工程、その後、プライマーＦ２及びＲ２を用いて、前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を増幅する工程；最後に、結合した前記細胞外ドメイン及びＣＤ８αヒンジ領域の遺伝子配列、並びに前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を鋳型として、前記Ｆ１及びＲ２をプライマーとして用いて、前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列を合成する工程であって、
ここで、前記Ｆ１は配列番号７で表され、前記Ｒ１は配列番号８で表され、前記Ｆ２は配列番号９で表され、前記Ｒ２は配列番号１０で表される、合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
優先権出願
［１］．本出願は、２０２０年２月１３日に出願された中国の発明特許出願［ＣＮ２０２０１００９０７４９５］である、「キメラ抗原受容体の共刺激シグナル伝達ドメイン及びその応用」という名称の特許出願の優先権を主張する。この優先権発明特許出願の全てが、参照により援用される。
［１］．本出願は、２０２０年２月１３日に出願された中国の発明特許出願［ＣＮ２０２０１００９０７４９５］である、「キメラ抗原受容体の共刺激シグナル伝達ドメイン及びその応用」という名称の特許出願の優先権を主張する。この優先権発明特許出願の全てが、参照により援用される。
【0002】
技術分野
［２］．本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、キメラ抗原受容体及びその適用に関する。
［２］．本発明は、生物医学の分野に属し、詳しくは、キメラ抗原受容体及びその適用に関する。
【背景技術】
【0003】
［３］．キメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法は、非常に有望な腫瘍治療戦略として、一連の進化の過程を経てきた。第１世代ＣＡＲに仲介されたＴ細胞の活性化は、ＣＤ３ζ又はＦｃｅＲＩｇ上のチロシン活性化モチーフを介して達成された。ところが、Ｔ細胞増殖の減少が最終的にＴ細胞のアポトーシスにつながるため、第１世代のＣＡＲ改変Ｔ細胞の抗腫瘍活性は生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で制限される。第２世代のＣＡＲは、４－１ＢＢやＣＤ２８などの新しい共刺激シグナルが細胞内に追加された。第１世代のＣＡＲと比較して、第２世代のＣＡＲは同じ抗原特異性を持ち、Ｔ細胞増殖とサイトカイン分泌の増加、抗アポトーシスタンパク質分泌の増加、及び細胞死の遅延を示す。しかしながら、既存のＣＡＲ－Ｔ 細胞免疫療法は、血液悪性腫瘍の治療においてかなりの進歩を遂げただけであり、固形腫瘍の治療においては限られた成功を収めている。
【0004】
［４］．ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）等の血液悪性腫瘍の治療において進歩を遂げている。今まで、ＣＤ１９特異的又はＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ－Ｔの臨床試験では、４８％～９５％の範囲の客観的奏効率（ＯＲＲ）が達成されている。２０１７年、米国食品医薬品局（ＵＳ ＦＤＡ）は、Ｂ細胞リンパ腫を標的とする２つのＣＡＲ－Ｔ細胞製品としてＡｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅＣｉｌｏｌｅｕｃｅｌ（ＫＴＥ－Ｃ１９、Ｋｉｔｅ Ｐｈａｒｍａ）及びＴｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅ（ＣＴＬ０１９、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を承認した。Ａｘｉｃａｂｔａｇｅｎｅｃｉｌｏｌｅｕｃｅｌの第１／２相臨床試験では、難治性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の１０８人の患者が２年間追跡調査されていた。その結果から、患者の８３％が客観的奏効（ＯＲ）を、５８％が完全奏効（ＣＲ）を達成し、平均追跡期間が１５．４ヶ月（ＩＱＲ １３．７－１７．３）であったことが判明した。これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法が長期の奏効を維持できることを示唆している。しかし、固形腫瘍の治療において、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は依然として多くの課題に直面している。例えば、適切な腫瘍特異的抗原の欠如、腫瘍微小環境の抑制、ＣＡＲ－Ｔ細胞の局在化と持続性の不足などがある。さらに、持続的な抗原曝露はＣＡＲ－Ｔ細胞の枯渇につながる可能性があり、その結果、ＣＡＲ－Ｔ細胞の腫瘍に対する有効性が損なわれる。したがって、固形腫瘍の治療のためには新しいＣＡＲを設計する必要がある。
【0005】
［５］．デクチン－１、すなわちＣＬＥＣ－７Ａは、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲｓ）の新しいサブグループである。デクチン－１には、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインが含まれる。デクチン－１の細胞外部分は、真菌を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞のｓｃＦｖとして使用されている。デクチン－１は、主に好中球、単球、樹状細胞、マクロファージなどの骨髄細胞に発現するだけでなく、ヒトＴ細胞やＢ細胞の特定のサブセットにも発現する。デクチン－１は、ＮＫ細胞を活性化することにより、腫瘍の増殖と転移において重要な役割を果たす。デクチン－１は、ＤＣ成熟、抗原提示、サイトカイン及びケモカイン産生などの様々な細胞応答も調節できる。さらに、理論的には、デクチン－１は先天性免疫記憶を直接誘導し、ＣＤ８、ＣＤ４、Ｔ細胞、及びＢ細胞の発生に影響を与える可能性がある。
【0006】
［６］．要するに、本発明の実験チームは、上記の課題の少なくとも１つを解決するために、デクチン－１を共刺激シグナル伝達ドメインとして第２世代のＣＡＲ構造に組み込むことにより、新しい第２世代のＣＡＲ－Ｔ細胞を設計し、また、それによって改変された新しい第２世代のＣＡＲ－Ｔ細胞の機能と抗腫瘍活性を評価した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
［７］．これに鑑みて、本発明の目的は、新しい第２世代のＣＡＲ構造を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
［８］．細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインとを含むキメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体の前記膜貫通ドメインと前記細胞内ドメインとが共刺激シグナル伝達ドメインを構成し、前記共刺激シグナル伝達ドメインには、逆デクチン－１をコードするアミノ酸配列の全長又は断片が含まれる。
［９］．また、前記細胞外ドメインには、ＣＤ１９を標的とするか、又はＨＥＲ２を標的とする単鎖抗体が含まれる。
［１０］．また、前記キメラ抗原受容体はさらに、ＣＤ８αヒンジ領域と、逆デクチン－１膜貫通ドメインと、逆デクチン－１細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを順次接続して含む。
［１１］．また、前記逆デクチン－１をコードするアミノ酸配列が配列番号３によって表される。
［１２］．また、前記逆デクチン－１膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号２によって表される。
［１３］．また、前記逆デクチン－１細胞内シグナル伝達ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号１によって表される。
［９］．また、前記細胞外ドメインには、ＣＤ１９を標的とするか、又はＨＥＲ２を標的とする単鎖抗体が含まれる。
［１０］．また、前記キメラ抗原受容体はさらに、ＣＤ８αヒンジ領域と、逆デクチン－１膜貫通ドメインと、逆デクチン－１細胞内シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインとを順次接続して含む。
［１１］．また、前記逆デクチン－１をコードするアミノ酸配列が配列番号３によって表される。
［１２］．また、前記逆デクチン－１膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号２によって表される。
［１３］．また、前記逆デクチン－１細胞内シグナル伝達ドメインをコードするアミノ酸配列が配列番号１によって表される。
【0009】
［１４］．上記いずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を包含するレンチウイルスベクター。
［１５］．また、前記レンチウイルスベクターは、ｐＣＬＫ、ｐｓＰＡＸ２又はｐＭＤ２．０Ｇを含む。
［１５］．また、前記レンチウイルスベクターは、ｐＣＬＫ、ｐｓＰＡＸ２又はｐＭＤ２．０Ｇを含む。
【0010】
［１６］．本発明の他の目的は、上記の新しい第２世代のＣＡＲに従って改変されたＣＡＲ－Ｔ細胞及びその応用を提供することにある。
［１７］．前記キメラ抗原受容体を発現させるＣＡＲ－Ｔ細胞。
［１８］．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含有する抗腫瘍薬。
［１９］．また、前記腫瘍は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む。
［２０］．また、前記腫瘍は、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ球性白血病、乳がん、胃がん、食道がん、又は卵巣がんを含む。
［２１］．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍薬の調製への応用。
［２２］．また、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、エフェクターサイトカインの分泌を刺激することができる。
［２３］．また、前記エフェクターサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６を含む。
［２４］．また、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、刺激された後にセントラルメモリーＴ細胞の表現型を示すことができる。
［２５］．また、前記腫瘍は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む。
［２６］．また、前記腫瘍は、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ球性白血病、乳がん、胃がん、食道がん、又は卵巣がんを含む。
［１７］．前記キメラ抗原受容体を発現させるＣＡＲ－Ｔ細胞。
［１８］．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞と、薬学的に許容される副原料及び／又は補助剤とを含有する抗腫瘍薬。
［１９］．また、前記腫瘍は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む。
［２０］．また、前記腫瘍は、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ球性白血病、乳がん、胃がん、食道がん、又は卵巣がんを含む。
［２１］．前記ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍薬の調製への応用。
［２２］．また、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、エフェクターサイトカインの分泌を刺激することができる。
［２３］．また、前記エフェクターサイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α及びＩＬ－６を含む。
［２４］．また、前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、刺激された後にセントラルメモリーＴ細胞の表現型を示すことができる。
［２５］．また、前記腫瘍は、血液腫瘍及び固形腫瘍を含む。
［２６］．また、前記腫瘍は、大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、リンパ球性白血病、乳がん、胃がん、食道がん、又は卵巣がんを含む。
【0011】
［２７］．本発明のさらに他の目的は、上記のキメラ抗原受容体を合成する方法を提供することにある。
［２８］．前記キメラ抗原受容体の合成方法であって、（１）前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－逆デクチン－１細胞内ドメインの遺伝子配列又は逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を合成する工程と、（２）標的に応じてプライマーを合成してからオーバーラップＰＣＲ法を使用して前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列を合成する工程と、を含むことを特徴とする合成方法。
［２９］．また、前記工程（２）では、具体的には、まず、プライマーＦ１及びＲ１を用いて、前記ＣＤ８αヒンジ領域と結合した前記細胞外ドメインの遺伝子配列を増幅し、その後、プライマーＦ２及びＲ２を用いて、前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を増幅し、最後に、前記ＣＤ８αヒンジ領域と結合した前記細胞外ドメインの遺伝子配列と前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列の合成を行った。
［３０］．また、前記プライマーＦ１が配列番号７、Ｒ１が配列番号８、Ｆ２が配列番号９、Ｒ２が配列番号１０によって表される。
［３１］．前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－逆デクチン－１細胞内ドメインの遺伝子配列を合成する方法は同じである。
［２８］．前記キメラ抗原受容体の合成方法であって、（１）前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－逆デクチン－１細胞内ドメインの遺伝子配列又は逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を合成する工程と、（２）標的に応じてプライマーを合成してからオーバーラップＰＣＲ法を使用して前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列を合成する工程と、を含むことを特徴とする合成方法。
［２９］．また、前記工程（２）では、具体的には、まず、プライマーＦ１及びＲ１を用いて、前記ＣＤ８αヒンジ領域と結合した前記細胞外ドメインの遺伝子配列を増幅し、その後、プライマーＦ２及びＲ２を用いて、前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を増幅し、最後に、前記ＣＤ８αヒンジ領域と結合した前記細胞外ドメインの遺伝子配列と前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインの遺伝子配列を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列の合成を行った。
［３０］．また、前記プライマーＦ１が配列番号７、Ｒ１が配列番号８、Ｆ２が配列番号９、Ｒ２が配列番号１０によって表される。
［３１］．前記逆デクチン－１膜貫通ドメイン－逆デクチン－１細胞内ドメインの遺伝子配列を合成する方法は同じである。
【発明の効果】
【0012】
［３２］．有益な効果
［３３］．本発明は、逆デクチン－１を共刺激シグナル伝達ドメインとした新しい第２世代のＣＡＲ構造、及びそれから調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。本発明の生体内外実験の結果から、新しいＣＡＲ設計がデクチン－１共刺激を通じてＴ細胞機能に影響を与え、複数のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６など）の分泌と溶解能力の増強、枯渇の軽減、細胞増殖の増加、及び顕著な抗腫瘍活性を達成したことが判明した。本発明により提供される新しいＣＡＲ－Ｔ細胞は、様々な固形腫瘍及び血液悪性腫瘍に対して有効であることが実験で証明されている。
［３４］．本発明の実施形態又は従来の技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下、実施形態又は従来の技術の説明で使用される添付の図面を簡単に紹介する。 明らかに、以下の説明における図面は、本発明のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、創造的な努力なしにこれらの図面から他の図面を取得することもできる。
［３３］．本発明は、逆デクチン－１を共刺激シグナル伝達ドメインとした新しい第２世代のＣＡＲ構造、及びそれから調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞を提供する。本発明の生体内外実験の結果から、新しいＣＡＲ設計がデクチン－１共刺激を通じてＴ細胞機能に影響を与え、複数のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６など）の分泌と溶解能力の増強、枯渇の軽減、細胞増殖の増加、及び顕著な抗腫瘍活性を達成したことが判明した。本発明により提供される新しいＣＡＲ－Ｔ細胞は、様々な固形腫瘍及び血液悪性腫瘍に対して有効であることが実験で証明されている。
［３４］．本発明の実施形態又は従来の技術における技術的解決策をより明確に説明するために、以下、実施形態又は従来の技術の説明で使用される添付の図面を簡単に紹介する。 明らかに、以下の説明における図面は、本発明のいくつかの実施形態であり、当業者にとって、創造的な努力なしにこれらの図面から他の図面を取得することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】［３５］．ＣＡＲ構築物と発現を示す図であり、（Ａ）は膜貫通ドメインと細胞内ドメインにおいて異なる、ＨＥＲ２又はＣＤ１９に結合した単鎖断片を包含するキメラ受容体の模式図であり、（Ｂ）はｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲとｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ及びｈ１９８－ＢＢｚ ＣＡＲとｈ１９Ｄ－Ｄｚ ＣＡＲのヒトＴ細胞の表面での発現を示す図である。
【図2】［３６］．ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体外でのサイトカインの産生と細胞毒性の産生を示す図であり、具体的には、４つの異なるＣＡＲ－Ｔ細胞又はコントロールＴ細胞（標的陽性或いは陰性腫瘍細胞と一晩共培養した細胞（Ｅ：Ｔ＝１０：１又は５：１））からの上清液中の（Ａ）ＩＦＮ－γ、（Ｂ）ＩＬ－６及び（Ｃ）ＴＮＦ－αのＥＬＩＳＡによる定量分析（ｎ＝３／群）を行い、また、一元配置分散分析を通じて統計分析を行ってからＴｕｋｅｙの事後分析を行い、Ｐ＜０．０５である場合は有意と見なされ、また、（Ｄ）ＲＴＣＡ分析はＴ細胞溶解能力を示した（ｎ＝４／グループ）。
【図3】［３７］．ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型、枯渇マーカーの発現、及びＣＡＲ発現を示す図であり、（Ａ）は、ＣＤ３又はＣＤ４又はＣＤ８又はナイーブ（ＴＮ）（ＣＤ４５ＲＡ－／ＣＤ６２Ｌ－）セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）（ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ＋）又はエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）（ＣＤ４５ＲＯ＋／ＣＤ６２Ｌ－）を含む、各ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型特性のフローサイトメトリー密度マップであり、（Ｂ）は、ＰＤ－１又はＬＡＧ３又はＣＴＬＡ－４又はＴＩＭ３を持つ細胞を含む、各ＣＡＲ－Ｔ細胞阻害分子のフローサイトメトリー密度マップであり、（Ｃ）は、フローサイトメトリーで測定されたｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞及びｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の経時的なＣＡＲ発現を示す図である。
【図4】［３８］．ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗腫瘍活性を示す図であり、（Ａ）はＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ担がんモデルの生体内リアルタイムイメージング（ｎ＝４／グループ）を示す図であり、（Ｂ）は各グループの全生存率のカプランマイヤー分析を示す図である。
【図5】［３９］．ＨＥＲ２を標的とする第２世代のキメラ抗原受容体（ＲＤ－１）の構造模式図である。
【図6】［４０］．従来の第２世代のＣＡＲの遺伝子をトランスフェクトされたヒトＴ細胞の発現検出を示す図である。
【図7】［４１］．新しい第２世代のＣＡＲ（ＲＤ－１）の遺伝子をトランスフェクトされたヒトＴ細胞の発現検出を示す図である。
【図8】［４２］．ＨＥＲ２陽性腫瘍細胞ＳＫＯＶ３及びＨＥＲ２陰性腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８を標的としてＩＦＮ－γを分泌するＣＡＲ－Ｔ細胞（ＲＤ－１）の検出を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0014】
［４３］．言及された実施例は、本発明をよりよく説明するためのものであるが、本発明の内容はこれらの実施例に限定されない。したがって、当業者は、本発明の上述の内容に従って、実施形態に対して本質的でない改良や調整を行い、これらの改良や調整も本発明の保護範囲に属する。
［４４］．注意すべきことは、ここにおいて、「含む」、「包含する」、又はそれらの任意の他の変形語という用語は、非排他的な包含をカバーすることを意図しているということである。したがって、一連の要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素だけでなく、明示的に列挙されていない他の要素、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素も含む。さらなる限定がない場合は、「一つの……を含む」という語句によって限定される要素は、その要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置における追加の同一要素の存在を排除しない。
［４５］．例えば、本明細書で使用される「約」という用語は、典型的には記載された値の＋／－５％、より典型的には該当値の＋／－４％、より典型的には該当値の＋／－３％、より典型的には該当値の＋／－２％、さらに典型的には該当値の＋／－１％、さらに典型的には該当値の＋／－０．５ ％として表示される。
［４６］．本明細書では、特定の実施形態をある範囲内の形式で開示することができる。この「ある範囲内」の説明は、ただ便宜や簡潔さを図るためのものであり、開示された範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１ から６の範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６、など、及びこの範囲内の１、２、３、４、５、及び６などの個々の番号を具体的に開示したと見なされるべきである。上記のルールは、範囲の幅に関係なく適用される。
［４４］．注意すべきことは、ここにおいて、「含む」、「包含する」、又はそれらの任意の他の変形語という用語は、非排他的な包含をカバーすることを意図しているということである。したがって、一連の要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置は、それらの要素だけでなく、明示的に列挙されていない他の要素、又はそのようなプロセス、方法、物品、又は装置に固有の要素も含む。さらなる限定がない場合は、「一つの……を含む」という語句によって限定される要素は、その要素を含むプロセス、方法、物品、又は装置における追加の同一要素の存在を排除しない。
［４５］．例えば、本明細書で使用される「約」という用語は、典型的には記載された値の＋／－５％、より典型的には該当値の＋／－４％、より典型的には該当値の＋／－３％、より典型的には該当値の＋／－２％、さらに典型的には該当値の＋／－１％、さらに典型的には該当値の＋／－０．５ ％として表示される。
［４６］．本明細書では、特定の実施形態をある範囲内の形式で開示することができる。この「ある範囲内」の説明は、ただ便宜や簡潔さを図るためのものであり、開示された範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、すべての可能な部分範囲を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１ から６の範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３から６、など、及びこの範囲内の１、２、３、４、５、及び６などの個々の番号を具体的に開示したと見なされるべきである。上記のルールは、範囲の幅に関係なく適用される。
【0015】
［４７］．「ＲＤ－１」は逆デクチン－１（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｄｅｃｔｉｎ－１）であり、そのアミノ酸配列は配列番号３に示すように「ＧＬＶＶＡＩＶＬＩＶＬＣＬＩＧＬＩＶＡＩＬＲＷＰＰＳＡＡＣＳＧＫＥＳＶＶＡＩＲＴＮＳＱＳＤＦＨＬＱＴＹＧＤＥＤＬＮＥＬＤＰＨＹＥＭ」であり、デクチン－１のアミノ酸配列は配列番号４に示すように「ＭＥＹＨＰＤＬＥＮＬＤＥＤＧＹＴＱＬＨＦＤＳＱＳＮＴＲＴＡＶＶＳＥＫＧＳＣＡＡＳＰＰＷＲＬＩＡＶＩＬＧＩＬＣＬＶＩＬＶＩＡＶＶＬＧ」である。「ＲＤ－１細胞内ドメイン」のアミノ酸配列は、配列番号１に示すように「ＲＷＰＰＳＡＡＣＳＧＫＥＳＶＶＡＩＲＴＮＳＱＳＤＦＨＬＱＴＹＧＤＥＤＬＮＥＬＤＰＨＹＥＭ」であり、「ＲＤ－１膜貫通ドメイン」のアミノ酸配列は、配列番号２に示すように「ＧＬＶＶＡＩＶＬＩＶＬＣＬＩＧＬＩＶＡＩＬ」である。本発明者は研究を行った結果、新しい第２世代のＣＡＲの調製において、逆デクチン－１を共刺激ドメインとして使用すると、デクチン－１の活性と機能を効率的に生成し維持できる（つまり、Ｔ細胞機能に影響を与え、複数のサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６など）の分泌と溶解能力の増強、枯渇の軽減、細胞増殖の増加、及び顕著な抗腫瘍活性を達成できる）ことを見い出した。したがって、ここにおいては、特に明記しない限り、ＣＡＲ構造のデクチン－１は逆デクチン－１を指す。
【実施例1】
【0016】
［４８］．実施例１
［４９］．材料と方法
［５０］．１．細胞株：すべての細胞株はＡＴＣＣに由来した。Ｋ５６２細胞（骨髄性白血病）及びＮＡＬＭ６細胞（リンパ球性白血病）を、ＲＰＭＩ－１６４０で、熱失活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｃａｔ：ＳＴ３０－３３０２）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：ＳＶ３００１０）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：ＳＶ３００１０）とともに培養した。ヒトがん細胞株ＳＫ－ＯＶ－３（卵巣嚢胞腺がん）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（乳がん）を、熱失活化された１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭで培養した。ＳＫ－ＯＶ－３は、ルシフェラーゼを発現するように設計された。
［４９］．材料と方法
［５０］．１．細胞株：すべての細胞株はＡＴＣＣに由来した。Ｋ５６２細胞（骨髄性白血病）及びＮＡＬＭ６細胞（リンパ球性白血病）を、ＲＰＭＩ－１６４０で、熱失活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｃａｔ：ＳＴ３０－３３０２）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：ＳＶ３００１０）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：ＳＶ３００１０）とともに培養した。ヒトがん細胞株ＳＫ－ＯＶ－３（卵巣嚢胞腺がん）及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８（乳がん）を、熱失活化された１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）を含有するＤＭＥＭで培養した。ＳＫ－ＯＶ－３は、ルシフェラーゼを発現するように設計された。
【0017】
［５１］．２．ＣＡＲをコードするプラスミドの構築
［５２］．抗ＣＤ１９又は抗ＨＥＲ２のＣＡＲｓには、ＣＤ１９（クローンＦＭＣ６３）又はＨＥＲ２（クローン４Ｄ５）に特異的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖの後には、ヒトＣＤ８αヒンジ領域が続き、その後にヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４－１ＢＢ又はＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＩＣＤｓ）が続く。ＣＡＲｓの配列は、オーバーラップＰＣＲを使用して形成された。各ＣＡＲ配列をコードする単一のレンチウイルスプラスミドは、ＰＣＬＫレンチウイルスベクターを用いたダブルダイジェストによって構築された。構築された４つのＣＡＲｓ配列は次のとおりである。
［５２］．抗ＣＤ１９又は抗ＨＥＲ２のＣＡＲｓには、ＣＤ１９（クローンＦＭＣ６３）又はＨＥＲ２（クローン４Ｄ５）に特異的な単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖの後には、ヒトＣＤ８αヒンジ領域が続き、その後にヒトＣＤ８α膜貫通ドメイン（ＴＭ）、４－１ＢＢ又はＣＤ３ζ細胞内ドメイン（ＩＣＤｓ）が続く。ＣＡＲｓの配列は、オーバーラップＰＣＲを使用して形成された。各ＣＡＲ配列をコードする単一のレンチウイルスプラスミドは、ＰＣＬＫレンチウイルスベクターを用いたダブルダイジェストによって構築された。構築された４つのＣＡＲｓ配列は次のとおりである。
【0018】
［５３］．１）ｈＨ８－ＢＢＺ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８α（ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５４］．２）ｈＨＤ－ＤＺ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αｈｉｎｇｅ＋Ｄｅｃｔｉｎ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５５］．３）ｈ１９８－ＢＢＺ：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８α（ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５６］．４）ｈ１９Ｄ－ＤＺ：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αｈｉｎｇｅ＋Ｄｅｃｔｉｎ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５７］．３．レンチウイルス粒子の製造
［５８］．ＡＴＣＣから購入したＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（胎児腎臓細胞）を、ＤＭＥＭで、熱失活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｃａｔ：ＳＴ３０－３３０２）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：ＳＶ３００１０）とともに培養した。
［５９］．上清液を含有するレンチウイルスを生成するために、まず、プラスミドとしてｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．０Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコードする適切なＣＡＲを用いて、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を上記のプラスミドでトランスフェクトした。１２時間のトランスフェクションの後に培地を交換した。上清液を回収し、遠心分離して細胞破片を除去した。上清液を濾過し、１９，７００ｒｐｍで２時間の超遠心分離により濃縮した。上清液を捨てた。該当レンチウイルス粒子をＰＢＳ培地に溶解し、濃縮レンチウイルスを－８０℃で保存した。濃縮レンチウイルス力価は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）によって測定された。
［５４］．２）ｈＨＤ－ＤＺ：ＨＥＲ２ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αｈｉｎｇｅ＋Ｄｅｃｔｉｎ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５５］．３）ｈ１９８－ＢＢＺ：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８α（ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５６］．４）ｈ１９Ｄ－ＤＺ：ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αｈｉｎｇｅ＋Ｄｅｃｔｉｎ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍ）－ＣＤ３ζＩＣＤｓ
［５７］．３．レンチウイルス粒子の製造
［５８］．ＡＴＣＣから購入したＨＥＫ－２９３Ｔ細胞（胎児腎臓細胞）を、ＤＭＥＭで、熱失活化された１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ＰＡＮ，Ｇｅｒｍａｎｙ．Ｃａｔ：ＳＴ３０－３３０２）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：ＳＶ３００１０）とともに培養した。
［５９］．上清液を含有するレンチウイルスを生成するために、まず、プラスミドとしてｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．０Ｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をコードする適切なＣＡＲを用いて、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を上記のプラスミドでトランスフェクトした。１２時間のトランスフェクションの後に培地を交換した。上清液を回収し、遠心分離して細胞破片を除去した。上清液を濾過し、１９，７００ｒｐｍで２時間の超遠心分離により濃縮した。上清液を捨てた。該当レンチウイルス粒子をＰＢＳ培地に溶解し、濃縮レンチウイルスを－８０℃で保存した。濃縮レンチウイルス力価は、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ－ＲＴ－ＰＣＲ）によって測定された。
【0019】
［６０］．４．ＣＡＲ－Ｔ細胞の分離、形質導入、産生及び拡大
［６１］．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は健康な献血者の血液からＦｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔ：０４－４１８Ｑ）によって分離された。すべてのサンプルは生物治療国家重点実験室倫理委員会からインフォームドコンセント且つ承認を得た後に取得された。
［６２］．５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ４５２２）及び１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ，ＵＳＡ．Ｃａｔ：２００－０２－１０）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ：１０７７１）で培養されたＰＢＭＣ。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８電磁ビーズ（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：１１１３１Ｄ）に刺激された。２４時間後、Ｔ細胞を感染多重度（ＭＯＩ）が５のレンチウイルスとともに４８時間培養し、次いで細胞を洗浄し、Ｔ細胞培地で培養した。形質導入効率は、フローサイトメトリーによって測定されたＣＡＲの発現により決定された。
［６１］．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）は健康な献血者の血液からＦｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔ：０４－４１８Ｑ）によって分離された。すべてのサンプルは生物治療国家重点実験室倫理委員会からインフォームドコンセント且つ承認を得た後に取得された。
［６２］．５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ４５２２）及び１００Ｕ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－２（ｒｈＩＬ－２）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＮＪ，ＵＳＡ．Ｃａｔ：２００－０２－１０）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ：１０７７１）で培養されたＰＢＭＣ。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ３／ＣＤ２８電磁ビーズ（Ｇｉｂｃｏ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．Ｃａｔ：１１１３１Ｄ）に刺激された。２４時間後、Ｔ細胞を感染多重度（ＭＯＩ）が５のレンチウイルスとともに４８時間培養し、次いで細胞を洗浄し、Ｔ細胞培地で培養した。形質導入効率は、フローサイトメトリーによって測定されたＣＡＲの発現により決定された。
【0020】
［６３］．５．フローサイトメトリー
［６４］．すべてのフローサイトメトリーは新生細胞フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で実施され、データ分析は新生細胞発現（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で行われた。
［６５］．ビオチン－ＳＰ結合アフィニティヤギ抗マウス ＩｇＧ（Ｃａｔ：１２０９６２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、Ｆ（ａｂ’）２断片はＰＥ－ストレプトアビジン（Ｃａｔ：４０５２０３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に特異的に結合し、その形質導入効率と関連するＣＡＲタンパク質の発現を評価した。
［６６］．次の抗体は、分化表現型及び枯渇マーカー分析に使用された。
［６７］．ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＦＩＴＣ（ｃｌｏｎｅ：ＨＩＴ３ａ，Ｃａｔ：３００３０６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＤ８－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ：ＨＩＴ８ａ，Ｃａｔ：３００９１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４－ＰＥ（ｃｌｏｎｅ：ＲＰＡ－Ｔ４，Ｃａｔ：３００５０８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ：ＵＣＨＬ１，Ｃａｔ：５５５４９３）、ａｎｔｉ－ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ：ＤＲＥＧ－５６，Ｃａｔ：５５９７７２）、ａｎｔｉ－ＰＤ－１－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ：ＥＨ１２．２Ｈ７，Ｃａｔ：３２９９０８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４－ＡＰＣ（Ｃａｔ：３６９６１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３－ＡＰＣ（Ｃａｔ：３６９２１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３－ＡＰＣ（Ｃａｔ：３４５０１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
［６４］．すべてのフローサイトメトリーは新生細胞フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で実施され、データ分析は新生細胞発現（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で行われた。
［６５］．ビオチン－ＳＰ結合アフィニティヤギ抗マウス ＩｇＧ（Ｃａｔ：１２０９６２，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、Ｆ（ａｂ’）２断片はＰＥ－ストレプトアビジン（Ｃａｔ：４０５２０３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に特異的に結合し、その形質導入効率と関連するＣＡＲタンパク質の発現を評価した。
［６６］．次の抗体は、分化表現型及び枯渇マーカー分析に使用された。
［６７］．ａｎｔｉ－ＣＤ３－ＦＩＴＣ（ｃｌｏｎｅ：ＨＩＴ３ａ，Ｃａｔ：３００３０６，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＤ８－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ：ＨＩＴ８ａ，Ｃａｔ：３００９１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４－ＰＥ（ｃｌｏｎｅ：ＲＰＡ－Ｔ４，Ｃａｔ：３００５０８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ：ＵＣＨＬ１，Ｃａｔ：５５５４９３）、ａｎｔｉ－ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｃｌｏｎｅ：ＤＲＥＧ－５６，Ｃａｔ：５５９７７２）、ａｎｔｉ－ＰＤ－１－ＡＰＣ（ｃｌｏｎｅ：ＥＨ１２．２Ｈ７，Ｃａｔ：３２９９０８，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４－ＡＰＣ（Ｃａｔ：３６９６１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎ）、ａｎｔｉ－ＬＡＧ３－ＡＰＣ（Ｃａｔ：３６９２１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ａｎｔｉ－ＴＩＭ３－ＡＰＣ（Ｃａｔ：３４５０１２，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。
【0021】
［６８］．６．生体外サイトカインアッセイ
［６９］．標的細胞（ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、ＳＫ－ＯＶ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８、１×１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２中、３７°Ｃで一晩インキュベートした。その後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を効果／標的（Ｅ：Ｔ）が５又は１０の割合で添加した。ＣＡＲ－Ｔ細胞数は、形質導入効率によって正規化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）。標的細胞との２４時間の共培養の後に上清液を回収した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのサイトカインアッセイ用ＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ－γＣａｔ：８８－７３１６－８８、ＴＮＦ－α Ｃａｔ：８８－７３４６－８８、ＩＬ－６Ｃａｔ：８８－７０６６－８８）を使用して定量的検出を行った。
［６９］．標的細胞（ＮＡＬＭ６、Ｋ５６２、ＳＫ－ＯＶ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８、１×１０５細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２中、３７°Ｃで一晩インキュベートした。その後、ＣＡＲ－Ｔ細胞を効果／標的（Ｅ：Ｔ）が５又は１０の割合で添加した。ＣＡＲ－Ｔ細胞数は、形質導入効率によって正規化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）。標的細胞との２４時間の共培養の後に上清液を回収した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのサイトカインアッセイ用ＥＬＩＳＡキット（ＩＦＮ－γＣａｔ：８８－７３１６－８８、ＴＮＦ－α Ｃａｔ：８８－７３４６－８８、ＩＬ－６Ｃａｔ：８８－７０６６－８８）を使用して定量的検出を行った。
【0022】
［７０］．７．リアルタイム細胞毒性アッセイ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ，ＲＴＣＡ）
［７１］．ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性は、リアルタイム細胞毒性アッセイによって測定された（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＳＰ）。ＳＫ－ＯＶ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、Ｅ－ｐｌａｔｅ ９６アッセイプレートで１ｘ１０４細胞／ウェルで約２４時間培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＨ８－ＢＢｚ及びｈＨＤ－Ｄｚ）又はコントロールＴ細胞（モックＴ細胞）を効果／標的が１０の割合でプレートに添加し、製造元のプロトコルに基づいてデータの収集と分析を行った（ＡＣＥＡ １６２ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．ＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ２．１）。
［７１］．ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性は、リアルタイム細胞毒性アッセイによって測定された（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ ＲＴＣＡ ＳＰ）。ＳＫ－ＯＶ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞を、Ｅ－ｐｌａｔｅ ９６アッセイプレートで１ｘ１０４細胞／ウェルで約２４時間培養した。ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＨ８－ＢＢｚ及びｈＨＤ－Ｄｚ）又はコントロールＴ細胞（モックＴ細胞）を効果／標的が１０の割合でプレートに添加し、製造元のプロトコルに基づいてデータの収集と分析を行った（ＡＣＥＡ １６２ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．ＲＴＣＡ Ｓｏｆｔｗａｒｅ２．１）。
【0023】
［７２］．８．生体内異種移植研究
［７３］．６週齢のメスのＢ－ＮＳＧマウス（ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１／Ｂｃｇｅｎ）をこの研究に使用した。各マウスに２×１０６個のＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ細胞を腹腔内注射した。
［７４］．ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ細胞は、ルシフェラーゼを発現できるように ＳＫ－ＯＶ－３ 細胞から設計され、その後の腫瘍生物発光イメージング実験で蛍光シグナルを介して腫瘍増殖を表示する。
［７５］．腫瘍増殖の３日後に再び１×１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＨ８－ＢＢｚ又はｈＨＤ－Ｄｚ又はコントロール）を腹腔内注射した。さらに３日後、再び各マウスにＣＡＲ－Ｔ細胞を腹腔内注射した。予定された３、１０、１７、２４、３１、及び５５日目に、ＩＶＩＳ（Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）によって腫瘍の生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施した。腫瘍フラックス（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）は、腫瘍周辺の関心領域（ＲＯＩ）内の光子信号を測定することによって定量化された。ＢＬＩデータは、生体イメージングソフトウェア（ｖ２．５０、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して提示された。生存分析データは、各マウスの死亡時に確立された。
［７３］．６週齢のメスのＢ－ＮＳＧマウス（ＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１／Ｂｃｇｅｎ）をこの研究に使用した。各マウスに２×１０６個のＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ細胞を腹腔内注射した。
［７４］．ＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ細胞は、ルシフェラーゼを発現できるように ＳＫ－ＯＶ－３ 細胞から設計され、その後の腫瘍生物発光イメージング実験で蛍光シグナルを介して腫瘍増殖を表示する。
［７５］．腫瘍増殖の３日後に再び１×１０７個のＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＨ８－ＢＢｚ又はｈＨＤ－Ｄｚ又はコントロール）を腹腔内注射した。さらに３日後、再び各マウスにＣＡＲ－Ｔ細胞を腹腔内注射した。予定された３、１０、１７、２４、３１、及び５５日目に、ＩＶＩＳ（Ｉｎｔｒａｖｉｔａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）によって腫瘍の生物発光イメージング（ＢＬＩ）を実施した。腫瘍フラックス（光子／秒／ｃｍ２／ステラジアン）は、腫瘍周辺の関心領域（ＲＯＩ）内の光子信号を測定することによって定量化された。ＢＬＩデータは、生体イメージングソフトウェア（ｖ２．５０、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して提示された。生存分析データは、各マウスの死亡時に確立された。
【0024】
［７６］．９．データ
［７７］．ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＳＰＳＳ ｖ１７を使用して、統計プロットと分析を行った。データは平均値±ＳＤとして表示された。一元配置分散分析は、単一条件下での３つのグループの比較に使用された。
［７８］．カプランマイヤー生存データは、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を通して分析された。標準化された分散が必要な場合は、データを変換した。記号は統計的有意性を＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１のように示した。
［７７］．ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）及びＳＰＳＳ ｖ１７を使用して、統計プロットと分析を行った。データは平均値±ＳＤとして表示された。一元配置分散分析は、単一条件下での３つのグループの比較に使用された。
［７８］．カプランマイヤー生存データは、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を通して分析された。標準化された分散が必要な場合は、データを変換した。記号は統計的有意性を＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１のように示した。
【実施例2】
【0025】
［７９］．実施例２
［８０］．１．デクチン－１共刺激シグナル伝達ドメインを持つ新しいＣＡＲ構造
［８１］．本発明では、ＣＤ１９又はＨＥＲ２エピトープを標的とするｓｃＦｖドメインをデクチン－１ ＴＭ、デクチン－１及びＣＤ３ζＩＣＤに結合することにより、新しい第２世代のＣＡＲ構築物が設計された（図１Ａ）。最もよく使用される第２世代の ＣＡＲ構築物 （４－１ＢＢ 及び ＣＤ３ζＩＣＤｓ を持つヒト ＣＤ８αＴＭ） の一部を使用して、２つの追加のＣＡＲ構築物を生成した。構築されたすべてのＣＡＲは、Ｔ細胞の表面に発現していた（図１Ｂ）。抗ＨＥＲ２のＣＡＲｓに関して、ｈＨ８－ＢＢｚ（４－１ＢＢ）のＣＡＲ発現率は４９．６１％であり、ｈＨＤ－Ｄｚ（デクチン－１）のＣＡＲ発現率は４６．１７％であった。抗ＣＤ１９ のＣＡＲｓに関して、ｈ１９８－ＢＢｚ（４－１ＢＢ） のＣＡＲ発現率は９２．９５％、ｈ１９Ｄ－Ｄｚ（デクチン－１）のＣＡＲ 発現率は９５．０７％ であった。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲの発現は抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現よりも低かったが、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを包含する抗ＨＥＲ２又は抗ＣＤ１９ ＣＡＲの間で発現レベルに有意差はなかった。
［８０］．１．デクチン－１共刺激シグナル伝達ドメインを持つ新しいＣＡＲ構造
［８１］．本発明では、ＣＤ１９又はＨＥＲ２エピトープを標的とするｓｃＦｖドメインをデクチン－１ ＴＭ、デクチン－１及びＣＤ３ζＩＣＤに結合することにより、新しい第２世代のＣＡＲ構築物が設計された（図１Ａ）。最もよく使用される第２世代の ＣＡＲ構築物 （４－１ＢＢ 及び ＣＤ３ζＩＣＤｓ を持つヒト ＣＤ８αＴＭ） の一部を使用して、２つの追加のＣＡＲ構築物を生成した。構築されたすべてのＣＡＲは、Ｔ細胞の表面に発現していた（図１Ｂ）。抗ＨＥＲ２のＣＡＲｓに関して、ｈＨ８－ＢＢｚ（４－１ＢＢ）のＣＡＲ発現率は４９．６１％であり、ｈＨＤ－Ｄｚ（デクチン－１）のＣＡＲ発現率は４６．１７％であった。抗ＣＤ１９ のＣＡＲｓに関して、ｈ１９８－ＢＢｚ（４－１ＢＢ） のＣＡＲ発現率は９２．９５％、ｈ１９Ｄ－Ｄｚ（デクチン－１）のＣＡＲ 発現率は９５．０７％ であった。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲの発現は抗ＣＤ１９ ＣＡＲの発現よりも低かったが、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを包含する抗ＨＥＲ２又は抗ＣＤ１９ ＣＡＲの間で発現レベルに有意差はなかった。
【0026】
［８２］．２．デクチン－１共刺激の新しいＣＡＲ－Ｔ細胞効果機能に対する影響
［８３］．一般的に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の後期のエフェクター機能は、サイトカインの分泌によって評価できる。したがって、ＨＥＲ２又はＣＤ１９を発現する腫瘍細胞への曝露後に、新しいＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン放出に対する、共刺激シグナル伝達分子としてのデクチン－１の影響が評価された。
［８４］．陽性細胞株（ＳＫ－ＯＶ－３及びＮＡＬＭ６）を標的とするデクチン－１シグナル伝達ドメインの取り込み後、抗ＨＥＲ２又は抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって放出されるエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６など）が大幅に増加した（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。本研究における抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＤ－ＭＢ－４６８（陰性細胞株）に対するサイトカイン産生の有意な増加を示すことがなかった（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。ＳＫ－ＯＶ－３細胞株では、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いＩＦＮ－γレベルを示した。対照的に、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はより多くのＴＮＦ－αを分泌した（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。ＮＡＬＭ６細胞株では、ｈ１９Ｄ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈ１９８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様のレベルのＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。
［８５］．抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）とＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を説明するために、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性機能をさらに研究した。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＳＫ－ＯＶ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞株と共培養した後、ｈＨＤ－Ｄｚ及びｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方がＳＫ－ＯＶ－３腫瘍細胞を効率的に溶解することが観察されてきた。ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもはるかに強い細胞毒性溶解機能を示した（図２Ｄ）。
［８３］．一般的に、ＣＡＲ－Ｔ細胞の後期のエフェクター機能は、サイトカインの分泌によって評価できる。したがって、ＨＥＲ２又はＣＤ１９を発現する腫瘍細胞への曝露後に、新しいＣＡＲ－Ｔ細胞からのサイトカイン放出に対する、共刺激シグナル伝達分子としてのデクチン－１の影響が評価された。
［８４］．陽性細胞株（ＳＫ－ＯＶ－３及びＮＡＬＭ６）を標的とするデクチン－１シグナル伝達ドメインの取り込み後、抗ＨＥＲ２又は抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞によって放出されるエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、及びＩＬ－６など）が大幅に増加した（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。本研究における抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＭＤ－ＭＢ－４６８（陰性細胞株）に対するサイトカイン産生の有意な増加を示すことがなかった（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。ＳＫ－ＯＶ－３細胞株では、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも高いＩＦＮ－γレベルを示した。対照的に、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はより多くのＴＮＦ－αを分泌した（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。ＮＡＬＭ６細胞株では、ｈ１９Ｄ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈ１９８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞と同様のレベルのＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αを産生した（図２Ａ、２Ｂ、及び２Ｃ）。
［８５］．抗原結合（ａｎｔｉｇｅｎ ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）とＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を説明するために、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞毒性機能をさらに研究した。抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞をＳＫ－ＯＶ－３又はＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞株と共培養した後、ｈＨＤ－Ｄｚ及びｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の両方がＳＫ－ＯＶ－３腫瘍細胞を効率的に溶解することが観察されてきた。ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりもはるかに強い細胞毒性溶解機能を示した（図２Ｄ）。
【0027】
［８６］．３．抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の表現型と枯渇マーカーの発現
［８７］．７日間の細胞増殖後、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞とコントロールＴ細胞の表現型と枯渇マーカーの発現を分析した（図３）。
［８８］．ｈＨＤ－Ｄｚ、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ及びコントロールＴ細胞は、同様のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示した（図３Ａ）。エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－）の同程度の割合がｈＨＤ－Ｄｚ及びｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞で観察されてきたが、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多くのセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）を示した（図３Ａ）。
［８９］本発明はまた、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３を含む、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（図３Ｂ）における抑制性受容体の発現パターンを評価した。
［９０］．その結果から、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１又はＬＡＧ３陽性細胞が、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるものより約１０％少ないことが分かった。ＴＩＭ３及びＣＴＬＡ－４陽性細胞に関して、ｈＨＤ－Ｄｚ及びｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞で同様の割合が観察されてきた（図３Ｂ）。
［９１］．本発明は、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ発現の経時変化をさらに調査した。ＣＡＲ発現は、９６時間以内に低下することがあったが、さらに４８時間が経つと９０％以上に達した（図３Ｃ）。
［９２］．要するに、上記の結果から、新しいＣＡＲ－Ｔ細胞のデクチン－１シグナル伝達ドメインが、有意な表現型と枯渇マーカーの発現、及び離散（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）Ｔ細胞の増殖能につながる可能性があることが判明した。
［８７］．７日間の細胞増殖後、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞とコントロールＴ細胞の表現型と枯渇マーカーの発現を分析した（図３）。
［８８］．ｈＨＤ－Ｄｚ、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ及びコントロールＴ細胞は、同様のＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を示した（図３Ａ）。エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ－）の同程度の割合がｈＨＤ－Ｄｚ及びｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞で観察されてきたが、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞はｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞よりも多くのセントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋）を示した（図３Ａ）。
［８９］本発明はまた、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３を含む、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（図３Ｂ）における抑制性受容体の発現パターンを評価した。
［９０］．その結果から、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるＰＤ－１又はＬＡＧ３陽性細胞が、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるものより約１０％少ないことが分かった。ＴＩＭ３及びＣＴＬＡ－４陽性細胞に関して、ｈＨＤ－Ｄｚ及びｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞で同様の割合が観察されてきた（図３Ｂ）。
［９１］．本発明は、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ発現の経時変化をさらに調査した。ＣＡＲ発現は、９６時間以内に低下することがあったが、さらに４８時間が経つと９０％以上に達した（図３Ｃ）。
［９２］．要するに、上記の結果から、新しいＣＡＲ－Ｔ細胞のデクチン－１シグナル伝達ドメインが、有意な表現型と枯渇マーカーの発現、及び離散（ｄｉｓｃｒｅｔｅ）Ｔ細胞の増殖能につながる可能性があることが判明した。
【0028】
［９３］．４．抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体内抗腫瘍活性
［９４］．異種移植されたＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ腫瘍細胞を担持するＮＳＧマウスを利用して、本発明は、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＨ８－ＢＢｚ又はｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞）の生体内抗腫瘍活性をさらに研究した。全生存率と腫瘍体積を評価した （図４）。コントロールＴ細胞治療を施したマウスと比較して、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は腫瘍の進行を遅らせ（図４Ａ）、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞群の担癌マウスの生存期間の中央値は少なくとも２倍になった（図４Ｂ）。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定では、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞群とコントロールＴ細胞群との間で統計的に有意な生存率の差が示された。さらに、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞群のマウスの１００％は５５日目にまだ生存していたが、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞群はより長い全生存期を示した（図４Ｂ）。
［９４］．異種移植されたＳＫ－ＯＶ－３－ｌｕｃ腫瘍細胞を担持するＮＳＧマウスを利用して、本発明は、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｈＨ８－ＢＢｚ又はｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞）の生体内抗腫瘍活性をさらに研究した。全生存率と腫瘍体積を評価した （図４）。コントロールＴ細胞治療を施したマウスと比較して、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は腫瘍の進行を遅らせ（図４Ａ）、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞群の担癌マウスの生存期間の中央値は少なくとも２倍になった（図４Ｂ）。ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定では、抗ＨＥＲ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞群とコントロールＴ細胞群との間で統計的に有意な生存率の差が示された。さらに、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞群のマウスの１００％は５５日目にまだ生存していたが、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞群はより長い全生存期を示した（図４Ｂ）。
【実施例3】
【0029】
［９５］．実施例３
［９６］．本実施例はさらに、キメラ抗原受容体の共刺激シグナル伝達ドメインを提供する。前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＲＤ－１の細胞内領域を包含する。
［９７］．また、前記共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζを包含する。
［９８］．また、前記ＲＤ－１細胞内領域は、配列番号１を含有するアミノ酸配列、又は配列番号１と９０％以上同一であるアミノ酸配列を包含する。
［９９］．また、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、さらに、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｃＲ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＩ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０ ＫＬＲＥ１、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ８３、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＩＩＢ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７ ＴＡＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１ ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、Ｄ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８ ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＥ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６ ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４、ＮＷＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄから選ばれた１種又は複数種を包含する。
［１００］．本実施形態はさらに、前述の共刺激シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
［１０１］．また、前記キメラ抗原受容体は、抗原認識ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、膜貫通領域、ＲＤ－１細胞内領域、及びＣＤ３ζを順次接続して含む。
［１０２］．また、前記膜貫通領域は、細胞膜上に前記キメラ抗原受容体を固定することができるアミノ酸配列を包含する。
［１０３］．また、前記膜貫通領域はＲＤ－１膜貫通領域を包含する。
［１０４］．また、前記ＲＤ－１膜貫通領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列、又は配列番号２と９０％以上同一であるアミノ酸配列を包含する。
［１０５］．好ましくは、前記抗原認識ドメインはＨＥＲ２結合ドメインである。
［１０６］．また、前記キメラ抗原受容体は、配列番号５を含有するアミノ酸配列を包含する。
［１０７］．好ましくは、前記抗原認識ドメインはＣＤ１９結合ドメインである。
［１０８］．また、前記キメラ抗原受容体は、配列番号６を含有するアミノ酸配列を包含する。
［１０９］．本実施形態はさらに、前記のキメラ抗原受容体の合成方法を提供する。前記方法は、（１）ＲＤ－１－ＣＤ３ζ遺伝子配列を合成する工程と、（２）キメラ抗原受容体遺伝子配列を合成する工程と、を含む。
［１１０］．また、前記工程（２）では、具体的には、まず、プライマーＦ１及びＲ１を用いて、ＣＤ８αヒンジ領域と結合した抗原認識ドメインの遺伝子配列を増幅し、その後、プライマーＦ２及びＲ２を用いて、前記ＲＤ－１－ＣＤ３ζ遺伝子配列を増幅し、最後に、ＣＤ８αヒンジ領域と結合した前記抗原認識ドメインの遺伝子配列と前記ＲＤ－１－ＣＤ３ζ遺伝子配列を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列の合成を行った。
［１１１］．また、前記プライマーＦ１が配列番号７、Ｒ１が配列番号８、Ｆ２が配列番号９、Ｒ２が配列番号１０によって表される。
［１１２］．合成された（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８αｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）のアミノ酸配列は配列番号５である。
［１１３］．本実施形態はさらに、前記のキメラ抗原受容体及びベクター構築を発現する組換えプラスミドベクターを提供する。
［１１４］．また、前記発現ベクターはｐＣＬＫベクターである。
［１１５］．本実施形態はさらに、ＭｌｕＩ及びＳｐｅＩを制限酵素切断部位として使用し、前記キメラ抗原受容体遺伝子と前記発現ベクターを連結し、それによって前記組換えプラスミドベクターを得ることを含む、前述の組換えプラスミドベクターの構築方法を提供する。
［１１６］．本実施形態はさらに、前記のキメラ抗原受容体で改変された免疫細胞を提供する。
［１１７］．また、前記免疫細胞はＴリンパ球である。
［１１８］．また、前記免疫細胞には、Ｂリンパ球、Ｋリンパ球、及びＮＫリンパ球の１種又は複数種も含まれる。
［１１９］．本実施形態はさらに、前述の免疫細胞を得る方法を提供する。前記方法は、ＭｌｕＩ及びＳｐｅＩを制限酵素切断部位として使用し、前記キメラ抗原受容体遺伝子と発現ベクターを連結して組換えプラスミドベクターを得る工程と、前記組換えプラスミドベクター及びパッケージングプラスミドを培養細胞に共移入し培養することにより組換えウイルス粒子を得る工程と、免疫細胞を前記組換えウイルス粒子で改変する工程と、を含む。
［１２０］．また、前記改変方法は、ウイルスベクターシステム又は非ウイルスベクターシステムを使用することを含む。
［１２１］．また、前記ウイルスベクターシステムには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びセンダイウイルスベクターの１種又は複数種が含まれる。
［１２２］．また、前記非ウイルスベクターシステムには、トランスポゾンシステム、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、ＴＡＬＥＮシステム、リポソームトランスフェクションシステム、及びエレクトロトランスフェクションシステムの１種又は複数種が含まれる。
［９６］．本実施例はさらに、キメラ抗原受容体の共刺激シグナル伝達ドメインを提供する。前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＲＤ－１の細胞内領域を包含する。
［９７］．また、前記共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζを包含する。
［９８］．また、前記ＲＤ－１細胞内領域は、配列番号１を含有するアミノ酸配列、又は配列番号１と９０％以上同一であるアミノ酸配列を包含する。
［９９］．また、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、さらに、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｃＲ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＩ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０ ＫＬＲＥ１、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ８３、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＩＩＢ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７ ＴＡＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１ ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、Ｄ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８ ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＥ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６ ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４、ＮＷＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄから選ばれた１種又は複数種を包含する。
［１００］．本実施形態はさらに、前述の共刺激シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を提供する。
［１０１］．また、前記キメラ抗原受容体は、抗原認識ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、膜貫通領域、ＲＤ－１細胞内領域、及びＣＤ３ζを順次接続して含む。
［１０２］．また、前記膜貫通領域は、細胞膜上に前記キメラ抗原受容体を固定することができるアミノ酸配列を包含する。
［１０３］．また、前記膜貫通領域はＲＤ－１膜貫通領域を包含する。
［１０４］．また、前記ＲＤ－１膜貫通領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含有するアミノ酸配列、又は配列番号２と９０％以上同一であるアミノ酸配列を包含する。
［１０５］．好ましくは、前記抗原認識ドメインはＨＥＲ２結合ドメインである。
［１０６］．また、前記キメラ抗原受容体は、配列番号５を含有するアミノ酸配列を包含する。
［１０７］．好ましくは、前記抗原認識ドメインはＣＤ１９結合ドメインである。
［１０８］．また、前記キメラ抗原受容体は、配列番号６を含有するアミノ酸配列を包含する。
［１０９］．本実施形態はさらに、前記のキメラ抗原受容体の合成方法を提供する。前記方法は、（１）ＲＤ－１－ＣＤ３ζ遺伝子配列を合成する工程と、（２）キメラ抗原受容体遺伝子配列を合成する工程と、を含む。
［１１０］．また、前記工程（２）では、具体的には、まず、プライマーＦ１及びＲ１を用いて、ＣＤ８αヒンジ領域と結合した抗原認識ドメインの遺伝子配列を増幅し、その後、プライマーＦ２及びＲ２を用いて、前記ＲＤ－１－ＣＤ３ζ遺伝子配列を増幅し、最後に、ＣＤ８αヒンジ領域と結合した前記抗原認識ドメインの遺伝子配列と前記ＲＤ－１－ＣＤ３ζ遺伝子配列を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、前記キメラ抗原受容体の遺伝子配列の合成を行った。
［１１１］．また、前記プライマーＦ１が配列番号７、Ｒ１が配列番号８、Ｆ２が配列番号９、Ｒ２が配列番号１０によって表される。
［１１２］．合成された（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８αｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）のアミノ酸配列は配列番号５である。
［１１３］．本実施形態はさらに、前記のキメラ抗原受容体及びベクター構築を発現する組換えプラスミドベクターを提供する。
［１１４］．また、前記発現ベクターはｐＣＬＫベクターである。
［１１５］．本実施形態はさらに、ＭｌｕＩ及びＳｐｅＩを制限酵素切断部位として使用し、前記キメラ抗原受容体遺伝子と前記発現ベクターを連結し、それによって前記組換えプラスミドベクターを得ることを含む、前述の組換えプラスミドベクターの構築方法を提供する。
［１１６］．本実施形態はさらに、前記のキメラ抗原受容体で改変された免疫細胞を提供する。
［１１７］．また、前記免疫細胞はＴリンパ球である。
［１１８］．また、前記免疫細胞には、Ｂリンパ球、Ｋリンパ球、及びＮＫリンパ球の１種又は複数種も含まれる。
［１１９］．本実施形態はさらに、前述の免疫細胞を得る方法を提供する。前記方法は、ＭｌｕＩ及びＳｐｅＩを制限酵素切断部位として使用し、前記キメラ抗原受容体遺伝子と発現ベクターを連結して組換えプラスミドベクターを得る工程と、前記組換えプラスミドベクター及びパッケージングプラスミドを培養細胞に共移入し培養することにより組換えウイルス粒子を得る工程と、免疫細胞を前記組換えウイルス粒子で改変する工程と、を含む。
［１２０］．また、前記改変方法は、ウイルスベクターシステム又は非ウイルスベクターシステムを使用することを含む。
［１２１］．また、前記ウイルスベクターシステムには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、及びセンダイウイルスベクターの１種又は複数種が含まれる。
［１２２］．また、前記非ウイルスベクターシステムには、トランスポゾンシステム、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集システム、ＴＡＬＥＮシステム、リポソームトランスフェクションシステム、及びエレクトロトランスフェクションシステムの１種又は複数種が含まれる。
【0030】
［１２３］本発明の目的は、前述の免疫細胞の、抗腫瘍薬組成物の調製への応用をさらに提供することにある。
［１２４］．また、前記抗腫瘍薬組成物は、化学薬品をさらに含むことを特徴とする。
［１２５］．また、前記化学薬品には、シクロホスファミド及び／又はフルダラビンが含まれる。
［１２６］．また、前記抗腫瘍薬組成物は、抗乳がん及び／又は抗卵巣がん薬である。
［１２７］．本実施形態はさらに、前述のキメラ抗原受容体を包含する組成物を提供する。前記組成物はさらに、前記共刺激シグナル伝達ドメインに結合したβ－グルカン受容体、Ｓｙｋ、ＣＲ３、及びＣＤ１１ｂの１種又は複数種を含む。
［１２８］．この例でＣＡＲ遺伝子を取得するために使用したプライマーを表１に示す。
［１２９］．表１ ＣＡＲ遺伝子を取得するために使用したプライマー
［１２４］．また、前記抗腫瘍薬組成物は、化学薬品をさらに含むことを特徴とする。
［１２５］．また、前記化学薬品には、シクロホスファミド及び／又はフルダラビンが含まれる。
［１２６］．また、前記抗腫瘍薬組成物は、抗乳がん及び／又は抗卵巣がん薬である。
［１２７］．本実施形態はさらに、前述のキメラ抗原受容体を包含する組成物を提供する。前記組成物はさらに、前記共刺激シグナル伝達ドメインに結合したβ－グルカン受容体、Ｓｙｋ、ＣＲ３、及びＣＤ１１ｂの１種又は複数種を含む。
［１２８］．この例でＣＡＲ遺伝子を取得するために使用したプライマーを表１に示す。
［１２９］．表１ ＣＡＲ遺伝子を取得するために使用したプライマー
【0031】
【表1】
【実施例4】
【0032】
［１３０］．実施例４
［１３１］．全長抗原がＨＥＲ２であるＣＡＲ遺伝子をＰＣＲで取得する：
［１３２］．（１）工程１、遺伝子の合成：ＲＤ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－ＣＤ３ζの全長断片を合成する。
［１３３］．（２）工程２、プライマーを合成し、オーバーラップＰＣＲ法を使用して、（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）融合断片を取得する
具体的には、次の２つの工程がある。
［１３４］．（２．１）プライマーＦ１、Ｒ１を使用して（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）を増幅し、Ｆ２、Ｒ２を使用して（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を増幅する。
［１３５］．（２．２）次に、（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）及び（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、ＰＣＲにより全長ＣＡＲ遺伝子を取得する。
［１３６］．合成された（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）のアミノ酸配列は配列番号５である。
［１３１］．全長抗原がＨＥＲ２であるＣＡＲ遺伝子をＰＣＲで取得する：
［１３２］．（１）工程１、遺伝子の合成：ＲＤ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－ＣＤ３ζの全長断片を合成する。
［１３３］．（２）工程２、プライマーを合成し、オーバーラップＰＣＲ法を使用して、（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）融合断片を取得する
具体的には、次の２つの工程がある。
［１３４］．（２．１）プライマーＦ１、Ｒ１を使用して（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）を増幅し、Ｆ２、Ｒ２を使用して（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を増幅する。
［１３５］．（２．２）次に、（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）及び（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、ＰＣＲにより全長ＣＡＲ遺伝子を取得する。
［１３６］．合成された（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）のアミノ酸配列は配列番号５である。
【0033】
［１３７］．抗原がＨＥＲ２であるＣＡＲの組換えプラスミドベクターの構築：
［１３８］．（１）工程１、遺伝子の合成：ＲＤ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－ＣＤ３ζの全長断片を合成する。
［１３９］．（２）工程２、プライマーを設計し、オーバーラップＰＣＲ法で（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）融合断片を取得する。具体的には、次の２つの工程がある。
［１４０］．（２．１）プライマーＦ１、Ｒ１を使用して（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）を増幅し、Ｆ２、Ｒ２を使用して（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を増幅する。
［１４１］．（２．２）（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）及び（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、ＰＣＲにより全長ＣＡＲ遺伝子を取得する。
［１４２］．（３）工程３、ＭｌｕＩとＳｐｅＩを制限酵素切断部位として、上記の工程で合成したＣＡＲ遺伝子とＰＣＬＫベクターを接続し、ＣＡＲ－ＰＣＬＫプラスミドベクターを取得する。
［１３８］．（１）工程１、遺伝子の合成：ＲＤ－１（ＴＭ＋ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－ＣＤ３ζの全長断片を合成する。
［１３９］．（２）工程２、プライマーを設計し、オーバーラップＰＣＲ法で（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）融合断片を取得する。具体的には、次の２つの工程がある。
［１４０］．（２．１）プライマーＦ１、Ｒ１を使用して（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）を増幅し、Ｆ２、Ｒ２を使用して（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を増幅する。
［１４１］．（２．２）（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）及び（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）を鋳型、Ｆ１とＲ２をプライマーとして、ＰＣＲにより全長ＣＡＲ遺伝子を取得する。
［１４２］．（３）工程３、ＭｌｕＩとＳｐｅＩを制限酵素切断部位として、上記の工程で合成したＣＡＲ遺伝子とＰＣＬＫベクターを接続し、ＣＡＲ－ＰＣＬＫプラスミドベクターを取得する。
【0034】
［１４３］．Ｔリンパ球のウイルストランスフェクションと標的遺伝子発現の検出：
［１４４］．キメラ抗原受容体遺伝子を持つ新しい第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８αｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）（図５に模式的に示すように）と従来の第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）－（ＣＤ３ζ）（図５に模式的に示すように）がレンチウイルスベクターＰＣＬＫにそれぞれロードし、２つのヘルパーベクターｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．ＧをＴ細胞にコトランスフェクトし、それぞれにパッケージングしてウイルス粒子を取得し、遠心濃縮後、高濃度のレンチウイルスベクターが得られた。
［１４５］．（２）密度勾配遠心法によりリンパ球を分離し、リンパ球をＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍｌ）とＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）で刺激を与えた。１日後、ウイルストランスフェクションのためにリンパ球を収集し、リンパ球を４８時間培養し、トランスフェクトされたリンパ球を収集した。
［１４６］．（３）収集したウイルストランスフェクトされたリンパ球を、抗体のＦａｂフラグメントを認識する特異抗体を用いてフローサイトメトリーによって検出された。
［１４７］．図６は、従来の第２世代ＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現検出を示している。一次抗体はビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂモノクローナル抗体で、二次抗体はＰＥ標識ａｎｔｉ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎフロースルー抗体であった。第１のトラックはエンプテウイルスをトランスフェクトしたＴ細胞で、第２のトラックはＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたＴ細胞である。（図２では、ｈＨ８－ＢＢｚは伝統的な第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）－（ＣＤ３ζ）である。）。
［１４８］．図７は、新しい第２世代ＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現検出を示している。一次抗体はビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂモノクローナル抗体で、二次抗体はＰＥ標識ａｎｔｉ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎフロースルー抗体であった。第１のトラックはエンプテウイルスをトランスフェクトしたＴ細胞で、第２のトラックはＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたＴ細胞である。（図３では、ｈＨＤ－Ｄｚは新しい第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）である）。
［１４９］．同じＭＯＩ（感染多重度）ウイルストランスフェクション効率の下で、フローサイトメトリーにより、新しい第２世代ＣＡＲ分子と従来の第２世代ＣＡＲ分子の両方がリンパ球の表面に高度に発現していることが確認された。
［１４４］．キメラ抗原受容体遺伝子を持つ新しい第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８αｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）（図５に模式的に示すように）と従来の第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）－（ＣＤ３ζ）（図５に模式的に示すように）がレンチウイルスベクターＰＣＬＫにそれぞれロードし、２つのヘルパーベクターｐｓＰＡＸ２及びｐＭＤ２．ＧをＴ細胞にコトランスフェクトし、それぞれにパッケージングしてウイルス粒子を取得し、遠心濃縮後、高濃度のレンチウイルスベクターが得られた。
［１４５］．（２）密度勾配遠心法によりリンパ球を分離し、リンパ球をＣＤ３抗体（１ｕｇ／ｍｌ）とＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍｌ）で刺激を与えた。１日後、ウイルストランスフェクションのためにリンパ球を収集し、リンパ球を４８時間培養し、トランスフェクトされたリンパ球を収集した。
［１４６］．（３）収集したウイルストランスフェクトされたリンパ球を、抗体のＦａｂフラグメントを認識する特異抗体を用いてフローサイトメトリーによって検出された。
［１４７］．図６は、従来の第２世代ＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現検出を示している。一次抗体はビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂモノクローナル抗体で、二次抗体はＰＥ標識ａｎｔｉ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎフロースルー抗体であった。第１のトラックはエンプテウイルスをトランスフェクトしたＴ細胞で、第２のトラックはＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたＴ細胞である。（図２では、ｈＨ８－ＢＢｚは伝統的な第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）－（ＣＤ３ζ）である。）。
［１４８］．図７は、新しい第２世代ＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたヒトＴ細胞の発現検出を示している。一次抗体はビオチン標識ヤギ抗マウスＦａｂモノクローナル抗体で、二次抗体はＰＥ標識ａｎｔｉ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎフロースルー抗体であった。第１のトラックはエンプテウイルスをトランスフェクトしたＴ細胞で、第２のトラックはＣＡＲ遺伝子をトランスフェクトしたＴ細胞である。（図３では、ｈＨＤ－Ｄｚは新しい第２世代ＣＡＲ遺伝子（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）である）。
［１４９］．同じＭＯＩ（感染多重度）ウイルストランスフェクション効率の下で、フローサイトメトリーにより、新しい第２世代ＣＡＲ分子と従来の第２世代ＣＡＲ分子の両方がリンパ球の表面に高度に発現していることが確認された。
【0035】
［１５０］．ＨＥＲ２を発現する腫瘍細胞の殺傷効果：
［１５１］．従来の第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞：（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）（－ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）－（ＣＤ３ζ）－Ｔ細胞
［１５２］．新しい第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞：（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８αｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）－Ｔ細胞
［１５３］．（１）ＲＴＣＡ（ＲｅａｌＴｉｍｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ、リアルタイム細胞分析技術）を用いて、ＨＥＲ２陽性細胞ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん細胞）腫瘍細胞に対する２種類のＴ細胞の殺傷効果を検出し、検出結果を図２Ｄに示した。（図２Ｄでは、ｈＨ８－ＢＢｚは従来の第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ｈＨＤ－Ｄｚは新しい第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞である）。
［１５４］．（２）ＥＬＩＳＡを用いて、２つのＣＡＲ Ｔ細胞によるＨＥＲ２陽性腫瘍細胞ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん細胞）及びＨＥＲ２陰性腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ヒト乳がん細胞）へのサイトカインの分泌をそれぞれ検出し、検出及び分析結果を図８に示す。図８は、新しい第２世代ＣＡＲ Ｔが従来の第２世代ＣＡＲ Ｔよりも多くのサイトカイン（ＩＦＮγ）をＨＥＲ２陽性腫瘍細胞ＳＫＯＶ３に分泌したことを明確に示している。（図８では、ｈＨ８－ＢＢｚは伝統的な第２世代のＣＡＲ遺伝子である（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）（－ＣＤ３ζ）、ｈＨＤ－Ｄｚは新しい第２世代のＣＡＲ遺伝子である（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ））。
［１５１］．従来の第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞：（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）（－ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）－（ＣＤ３ζ）－Ｔ細胞
［１５２］．新しい第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞：（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８αｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ）－Ｔ細胞
［１５３］．（１）ＲＴＣＡ（ＲｅａｌＴｉｍｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ、リアルタイム細胞分析技術）を用いて、ＨＥＲ２陽性細胞ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん細胞）腫瘍細胞に対する２種類のＴ細胞の殺傷効果を検出し、検出結果を図２Ｄに示した。（図２Ｄでは、ｈＨ８－ＢＢｚは従来の第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞であり、ｈＨＤ－Ｄｚは新しい第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞である）。
［１５４］．（２）ＥＬＩＳＡを用いて、２つのＣＡＲ Ｔ細胞によるＨＥＲ２陽性腫瘍細胞ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣がん細胞）及びＨＥＲ２陰性腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ヒト乳がん細胞）へのサイトカインの分泌をそれぞれ検出し、検出及び分析結果を図８に示す。図８は、新しい第２世代ＣＡＲ Ｔが従来の第２世代ＣＡＲ Ｔよりも多くのサイトカイン（ＩＦＮγ）をＨＥＲ２陽性腫瘍細胞ＳＫＯＶ３に分泌したことを明確に示している。（図８では、ｈＨ８－ＢＢｚは伝統的な第２世代のＣＡＲ遺伝子である（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ＋ＴＭ）－（４－１ＢＢ）（－ＣＤ３ζ）、ｈＨＤ－Ｄｚは新しい第２世代のＣＡＲ遺伝子である（ａｎｔｉ－ＨＥＲ２ ｓｃＦＶ）－（ＣＤ８α ｈｉｎｇｅ）－（ＲＤ－１ＴＭ＋Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）－（ＣＤ３ζ））。
【0036】
［１５５］．まとめ
［１５６］．一般的なＣＡＲは主に３つの重要な組成部があり、具体的には抗原を認識する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、及び膜貫通ドメイン（ＴＭ）、例えばＣＤ３、ＣＤ２８又はＣＤ８タンパク質、及びＣＤ３ζ又はＦｃＲγなどの細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）がある。ＣＡＲには、活性化シグナルを伝達するために、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＩＬ－１５Ｒα、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０、ＴＬＲ２などの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが１つ以上含まれている。
［１５６］．一般的なＣＡＲは主に３つの重要な組成部があり、具体的には抗原を認識する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、ヒンジ、及び膜貫通ドメイン（ＴＭ）、例えばＣＤ３、ＣＤ２８又はＣＤ８タンパク質、及びＣＤ３ζ又はＦｃＲγなどの細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＣＤ）がある。ＣＡＲには、活性化シグナルを伝達するために、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＩＬ－１５Ｒα、ＭｙＤ８８／ＣＤ４０、ＴＬＲ２などの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが１つ以上含まれている。
【0037】
［１５７］．従来の研究により、さまざまなＴＭやＩＣＤが、Ｔ細胞の増殖、生存、その他の機能に影響を与えることが証明した。最近、いくつかの第２世代のＣＡＲが、固形腫瘍（転移性結腸直腸がんや肉腫など）の患者でテストされました。これらの試験の結果は、血液悪性腫瘍の治療で得られた結果と比較して有望である。したがって、さまざまな共刺激ドメインを探索することは、固形腫瘍におけるＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍効果を高めるための新しいアプローチを提供する可能性がある。
【0038】
［１５８］．本発明において、我々の実験チームは、ＣＤ１９又はＨＥＲ２をターゲットとするｓｃＦｖドメインを４－１ＢＢ又はデクチン－１シグナル伝達ＩＣＤと組み合わせ、４つの異なる第２世代ＣＡＲを構築した。実験データによると、生体内外での実験で、新しいＣＡＲ設計がデクチン－１共刺激を通じてＴ細胞機能に影響を与えた。例えばサイトカインの分泌と溶解能力の増強、枯渇の可能性の軽減、細胞増殖の増加、及び顕著な抗腫瘍活性を達成した。
【0039】
［１５９］．本発明では、先行研究の結果の確認を行った。４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインによるＣＡＲ－Ｔ細胞の機能強化を示している。興味深いことに、ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の生体外Ｔ細胞機能（例えば、サイトカイン産生の増加）は、４－１ＢＢベースの細胞に匹敵し、両方ともコントロールＴ細胞よりも優れていた。ＨＥＲ２特異的ＣＡＲ－Ｔ細胞には、ｈＨＤ－ＤｚＣＡＲ－Ｔ細胞はｈＨ８－ＢＢｚよりも高いＩＦＮ－γ分泌を示し、Ｔｈ１表現型の可能性を呈している。ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、Ｔｈ１／Ｔｈ２表現型と一致して、より多くのＴＮＦ－αを放出した。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の同様のサイトカイン産生パターンは、使用された特定の共刺激シグナル伝達ドメインに関係なく、表現型が比較可能であることを呈している。ＲＴＣＡ（ＲｅａｌＴｉｍｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）において、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞を超えるｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞の細胞傷害能を説明した。上記の結果は、デクチン－１共刺激が、固形腫瘍の治療のためのＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法に新しいメカニズムを提供することを呈している。
【0040】
［１６０］．免疫抵抗性とＴ細胞の枯渇により、固形腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法における最大の課題の１つは、腫瘍の微小環境を抑制することである。しかし、従来の研究により、さまざまなＴ細胞の表現型が抗腫瘍免疫に重要な役割を果たしている可能性がある。例えば、養子免疫療法では、ＴＣＭ細胞がＴＥＭ細胞よりもはるかに重要であることが実証された。本発見で、我々はｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞におけるより多くのＴＣＭ及び顕著な枯渇マーカーが、固形腫瘍におけるデクチン－１共刺激シグナル伝達を介して、新しいＣＡＲ－Ｔ細胞が腫瘍の免疫抑制性微小環境の影響をあまり受けない可能性があることを発見した。
【0041】
［１６１］．さらに、我々は腫瘍異種移植モデルのデクチン－１又は４－１ＢＢによる共刺激の確立を通じ、第２世代ＣＡＲ－Ｔ細胞の有意な抗腫瘍効果を実証した。しかし、ここでは、異なる共刺激シグナル伝達ドメインを持つＣＡＲは、生体内で生存率に関して抗腫瘍活性において離散的な傾向を示した。ｈＨＤ－Ｄｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は早い時期にエフェクター機能の増強を示したが、ｈＨ８－ＢＢｚ ＣＡＲ－Ｔ細胞は遅い時期に抗腫瘍活性を示した。これらの観察結果から、共刺激シグナル伝達ドメインの違いによって、Ｔ細胞の表現型が異なる可能性があることが判明した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】