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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-04
(45)【発行日】2024-04-12
(54)【発明の名称】癌の診断および治療のための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240405BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240405BHJP
C07K 14/78 20060101ALI20240405BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240405BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240405BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240405BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240405BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240405BHJP
C40B 40/10 20060101ALI20240405BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240405BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240405BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240405BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240405BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240405BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240405BHJP
G01N 33/574 20060101ALI20240405BHJP
G01N 33/531 20060101ALI20240405BHJP
A61K 38/56 20060101ALN20240405BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12N15/62 Z ZNA
C07K14/78
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C40B40/10
A61P35/00
A61K38/16
A61K48/00
A61K35/12
A61K49/00
A61K47/64
G01N33/574 B
G01N33/531 A
A61K38/56
【請求項の数】
15
(21)【出願番号】P 2020568252
(86)(22)【出願日】2019-06-06
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-10-11
(86)【国際出願番号】 EP2019064872
(87)【国際公開番号】W WO2019234190
(87)【国際公開日】2019-12-12
【審査請求日】2022-06-06
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2018/065205
(32)【優先日】2018-06-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
【早期審査対象出願】
【前置審査】
(73)【特許権者】
【識別番号】509146023
【氏名又は名称】バイオエヌテック エスエー
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＮＴＥＣＨ ＳＥ
【住所又は居所原語表記】Ａｎ ｄｅｒ Ｇｏｌｄｇｒｕｂｅ １２ ５５１３１ Ｍａｉｎｚ Ｇｅｒｍａｎｙ
(74)【代理人】
【識別番号】100110928
【弁理士】
【氏名又は名称】速水 進治
(72)【発明者】
【氏名】サヒン， ウグル
(72)【発明者】
【氏名】ルイ， ボニー ギャビー
(72)【発明者】
【氏名】サロモン， ナジャ
(72)【発明者】
【氏名】ヴューステヒューブ－ローシュ， ジョイスリン
(72)【発明者】
【氏名】ダネシュダール， マティン
(72)【発明者】
【氏名】シュモルト， ハンス－ウルリッヒ
(72)【発明者】
【氏名】フィードラー， マルクス
【審査官】松井 一泰
(56)【参考文献】
【文献】国際公開第２０１７／０４９００９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１６／０２２５９７（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１２－５０５９２９（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１０－５００８７５（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１６／１４６６３９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】GEBAUER, Michaela et al.，Combinatorial Design of an Anticalin Directed against the Extra-Domain B for the Specific Targeting of Oncofetal Fibronectin，J. Mol. Biol.，2013年，425，pp. 780-802
【文献】PARK, Jinho et al.，Fibronectin extra domain B-specific aptide conjugated nanoparticles for targeted cancer imaging，Journal of Controlled Release，2012年09月03日，163，pp. 111-118
【文献】MAAB, Franziska et al.，Cystine-knot peptides targeting cancer-relevant human cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 (CTLA-4)，Journal of Peptide Science，2015年05月10日，21，pp. 651-660
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｎ １５／００－ １５／９０
Ｃ０７Ｋ １／００－ １９／００
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
Ｇ０１Ｎ ３３／４８－ ３３／９８
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合ペプチドであって、当該ＥＤＢ結合ペプチドは、
（ｉ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＬｙｓＡｓｎＶａｌＳｅｒＩｌｅＭｅｔＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号８）、
（ｉｉ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＡｌａＨｉｓＴｙｒＡｓｎＴｈｒＩｌｅＡｒｇＶａｌＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号９）、
（ｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１１）、
（ｉｖ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＬｙｓＧｌｎＡｌａＡｓｎＰｈｅＶａｌＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１２）、
（ｖ）ＡｌａＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１３）、
（ｖｉ）ＰｒｏＡｌａＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１４）、
（ｖｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＡｌａＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１５）、
（ｖｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１６）、
（ｉｘ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｌａＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１７）、
（ｘ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１８）、
（ｘｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号１９）、
（ｘｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｌａＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号２４）、および
（ｘｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｌａＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ（配列番号２５）
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＥＤＢ結合ペプチド。
【請求項2】
足場を形成するかまたは足場の一部である、および／または共有結合修飾によって安定化されている、請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチド。
【請求項3】
共有結合修飾によって安定化されており、前記共有結合修飾が、１つ以上のジスルフィド架橋を介する環化である、請求項２に記載のＥＤＢ結合ペプチド。
【請求項4】
シスチンノット構造を形成する、および／またはその一部である、請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチド。
【請求項5】
請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドを含むフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合剤。
【請求項6】
前記ＥＤＢ結合ペプチドが共有結合および／または非共有結合で、担体タンパク質、標識、レポータ、およびタグから選択される少なくとも１つのさらなる部分と会合している、請求項５に記載のＥＤＢ結合剤。
【請求項7】
共有結合および／または非共有結合で会合している少なくとも２つのサブユニットを含み、前記サブユニットのそれぞれが、同じでも異なっていてもよい、請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドを含む、ＥＤＢ結合剤。
【請求項8】
共有結合および／または非共有結合で、少なくとも１つの検出可能な標識もしくはレポータおよび／または少なくとも１つの治療エフェクタ部分と会合した、請求項５に記載のＥＤＢ結合剤。
【請求項9】
請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドをコードする組換え核酸。
【請求項10】
請求項９に記載の組換え核酸を含む宿主細胞。
【請求項11】
請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドを含む試験キットまたはアッセイ装置。
【請求項12】
試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）の存在および／または量を検定するための方法であって、請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドを使用することを含み、ＥＤＢの存在および／または量を検定することが、
（ｉ）試料を前記ＥＤＢ結合ペプチドまたは前記ＥＤＢ結合ペプチドを含むＥＤＢ結合剤と接触させること、ならびに
（ｉｉ）前記ＥＤＢ結合ペプチドまたは前記ＥＤＢ結合剤とＥＤＢとの間の複合体の形成を検出することおよび／または複合体の量を決定すること
を含む、方法。
【請求項13】
患者における癌の検出またはモニタリングのためのインビトロ方法であって、当該方法は、前記患者におけるフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）の存在および／または量を検定することを含み、
ＥＤＢの存在および／または量を検定することが、請求項１２に記載の方法にしたがって、前記患者から単離された生物学的試料を検定することを含む、方法。
【請求項14】
請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドを含む医薬組成物。
【請求項15】
患者を処置するための医薬の調製のための、請求項１に記載のＥＤＢ結合ペプチドの使用であって、前記患者が癌を有するかまたは癌を発症するリスクがある、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、組織リモデリングおよび／または血管新生を特徴とする疾患、特に頭頸部癌、脳の癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌および乳癌などの癌性疾患のようなフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）を発現する疾患の診断および治療に関する。より具体的には、本発明は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを標的とするペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
癌は、心疾患を上回って、世界中で主要な死亡原因の１つである。世界人口のうち８２０万人が２０１２年に癌で亡くなっている（ＷＨＯ）。古典的な抗癌療法、例えば放射線療法、化学療法および従来の外科的処置は、しばしば選択性が低く、したがって、健康な組織に対する重篤な毒性副作用を抱える。新しい治療形態は、腫瘍関連抗原に特異的な結合分子による腫瘍環境への生物活性分子（薬物、サイトカイン、放射性核種など）の標的化送達にある。これにより、標的陽性の腫瘍組織への薬物の選択的な方向付けが可能になり、健康な細胞に害を与えることなく悪性細胞を有効に死滅させる。これは、個々の癌療法に合理的に適合させた戦略をあらかじめ保証するために、患者内の標的陽性腫瘍の決定を可能にする、いわゆるコンパニオン診断の開発と共に行われる。ここでは、標的特異的な画像化技術の適用が、過去数十年間の目覚ましい進歩を明らかにする重要な診断段階となっている。画像化技術は、腫瘍関連タンパク質の存在と量、局在化、早期検出、分布、患者の層別化、および治療モニタリングについての重要な情報を提供することができる。腫瘍イメージングは、癌の診断および癌治療における治療成功のモニタリングのための基本的な工程である。コンピュータ断層撮影スキャンまたは磁気共鳴画像法などの長い間確立された技術は、何十年にもわたって日常的に使用されてきた。しかしながら、標的分子イメージングは、癌関連タンパク質に対する分子薬を使用して腫瘍を正確に可視化するので、より一層の注目を集めている。腫瘍血管新生の間に出現するバイオマーカは、通常、血管中に高レベルで発現され、したがって血流から容易にアクセス可能であるため、非常に有用である。
【0003】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型ドメインからなる、細胞外マトリックスの二量体ジスルフィド結合糖タンパク質である。このタンパク質は、細胞接着、移動、分化および止血を含む多くの生理学的過程に寄与する。ＦＮは、一次転写産物に由来する複数の選択的スプライシング変異体として発現される。アイソフォームエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）は、ＦＮドメイン７と８の間に特異的に挿入される、９１アミノ酸のさらなるＩＩＩ型ドメインを含む。この高度に保存されたフィブロネクチンエクストラドメインＢ配列は、マウス、ラット、ウサギおよびヒトにおいて全く同じように生じる。フィブロネクチンエクストラドメインＢは、通常、正常な成体組織には存在しないが、組織リモデリングおよび血管新生に関与する。さらに、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、頭頸部腫瘍、脳腫瘍および乳房腫瘍などのいくつかの侵攻性固形ヒト腫瘍の新生血管系において豊富な発現パターンを有する多くの異なる癌型で見出されている。
【0004】
血管新生が不十分な腫瘍を標的とする場合、大きなサイズの抗体、さらにはその断片でも、組織浸透の速度を遅くする可能性があり、これにより効率的な送達が妨げられる。さらに、抗体の長期の血液循環のために、特に画像化の概念の文脈では、診断用途に最適ではないと考えられる。前記に加えて、複雑なグリコシル化パターンとジスルフィド架橋を有する抗体の分子構造は、複雑なコストのかかる製造を必要とし、例えばイメージングトレーサによるさらなる機能化を複雑にする。これらの制限を克服するために、抗体に代わるものとして、いわゆるタンパク質足場が過去数十年の間に出現した：足場は、所与の標的の厳密で特異的な認識に合わせた相互作用分子を正確に操作するための堅固な構造フレームワークを提供する。それらのほとんどは、非還元条件下で適切に折りたたまれ、変性や再折り畳みを必要とせずに細菌中で発現され得る。化学合成でさえも、いくつかの形態を作製するための１つの選択肢である。最後に、それらは、多機能結合分子を生成するためのさらなる機能化（標識化、オリゴマー化、他のペプチドとの融合など）に非常に適する。様々な足場ベースのアプローチの中で、シスチンノットミニタンパク質（「ノッティン」）は、標的診断薬および治療薬の開発のために大きな可能性を示している。ミニタンパク質は、その名の通りの結び目構造を形成する３つのジスルフィド結合を含む小さな３０～５０アミノ酸のポリペプチドである。シュードノットシスチントポロジーは、インビボでの生物医学適用のために望ましい、並外れた熱安定性、タンパク質分解安定性、化学的安定性の原因である。例えば、構造的および機能的完全性を失うことなく、ミニタンパク質はアルカリ性または酸性環境で煮沸することができる。ジスルフィド拘束されたループ領域は、幅広い配列の多様性を許容し、様々な生物医学的標的を認識するタンパク質を操作するための堅固な分子フレームワークを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【文献】Ａｌｂｒｅｃｈｔ，Ｖａｌｅｒｉｅ；Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ａｎｔｏｎｉａ；Ｐｆｅｉｆｆｅｒ，Ｓａｒａｈ；Ｇｅｂａｕｅｒ，Ｍｉｃｈａｅｌａ；Ｌｉｎｄｎｅｒ，Ｓｉｍｏｎ；Ｇｉｅｓｅｒ，Ｅｕｇｅｎｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０１６）：Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｅｘｔｒａ ｄｏｍａｉｎ Ｂ ａｓ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｒａｃｅｒｓ ｆｏｒ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ．Ｉｎ：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ １３８（５），Ｓ．１２６９－１２８０．ＤＯＩ：１０．１００２／ｉｊｃ．２９８７４．
【文献】Ｂａｒｂａｓ，Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．；Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．；Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．；Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００４）：Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ．
【文献】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ，Ｂ．；Ｂａｌｚａ，Ｅ．；Ｓｉｒｉ，Ａ．；Ｚａｒｄｉ，Ｌ．；Ｎｉｃｏｔｒａ，Ｍ．Ｒ．；Ｂｉｇｏｔｔｉ，Ａ．；Ｎａｔａｌｉ，Ｐ．Ｇ．（１９８９）：Ａ ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ．Ｉｎ：Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ １０８（３），Ｓ．１１３９－１１４８．
【文献】Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ，Ｂａｒｂａｒａ；Ｌｅｐｒｉｎｉ，Ａｌｅｓｓａｎｄｒａ；Ａｌｌｅｍａｎｎｉ，Ｇｉｏｒｇｉｏ；Ｓａｇｉｎａｔｉ，Ｍａｒｃ；Ｚａｒｄｉ，Ｌｕｃｉａｎｏ（１９９２）：Ｔｈｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｒｅｐｅａｔ ＥＤ－Ｂ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｕｎｍａｓｋ ａ ｃｒｙｐｔｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７（３４），Ｓ．２４６８９－２４６９２．
【文献】Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ，Ｐａｔｒｉｚｉａ；Ｖｉａｌｅ，Ｇｉｕｓｅｐｐｅ；Ｄｏｒｃａｒａｔｔｏ，Ａｌｅｓｓａｎｄｒａ；Ｎｉｃｏｌｏ，Ｇｕｉｄｏ；Ｋａｃｚｍａｒｅｋ，Ｊａｎｕｓｚ；Ｑｕｅｒｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｏ；Ｚａｒｄｉ，Ｌｕｃｉａｎｏ（１９９４）：Ｔｈｅ ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ ｉｓｏｆｏｒｍ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｅｄ－ｂ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ｄｏｍａｉｎ．Ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎ：Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５９（５），Ｓ．６１２－６１８．ＤＯＩ：１０．１００２／ｉｊｃ．２９１０５９０５０７．
【文献】Ｈａｃｋｅｌ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｊ．；Ｋｉｍｕｒａ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈ．；Ｍｉａｏ，Ｚｈｅｎｇ；Ｌｉｕ，Ｈｏｎｇｇｕａｎｇ；Ｓａｔｈｉｒａｃｈｉｎｄａ，Ａｔａｙａ；Ｃｈｅｎｇ，Ｚｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３）：１８Ｆ－ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｏａｔｅ－ｌａｂｅｌｅｄ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ＰＥＴ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αｖβ６．Ｉｎ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ５４（７），Ｓ．１１０１－１１０５．ＤＯＩ：１０．２９６７／ｊｎｕｍｅｄ．１１２．１１０７５９．
【文献】Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｊ．Ｆ．；Ｇａｇｎｏｎ，Ｊ．；Ｃｈｉｃｈｅ，Ｌ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｍ．；Ａｎｄｒｉｅｕ，Ｊ．Ｐ．；Ｈｅｉｔｚ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２０００）：Ｓｑｕａｓｈ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｅｘｈｉｂｉｔ ａｎ ａｔｙｐｉｃａｌ ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９（１９），Ｓ．５７２２－５７３０．
【文献】Ｋｉｍｕｒａ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｈ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｚｈｅｎ；Ｇａｍｂｈｉｒ，Ｓａｎｊｉｖ Ｓａｍ；Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ Ｒ．（２００９）：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｋｎｏｔｔｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｓｕｂｊｅｃｔｓ．Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６９（６），Ｓ．２４３５－２４４２．ＤＯＩ：１０．１１５８／０００８－５４７２．ＣＡＮ－０８－２４９５．
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【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
当技術分野では、診断および治療アプローチに有用なフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合分子が必要とされている。
【0007】
ヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢに対して高い特異性および選択性を示す、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドなどのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤が本明細書に記載されている。本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、診断用途、特に腫瘍イメージング、および腫瘍環境の効率的な標的化による治療用途のための優れたツールである。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明によれば、モモルディカ・コキネンシス（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（ナンバンキカラスウリ）（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）由来のノッティン型トリプシン阻害剤ＩＩの開鎖変異体を、フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）特異的結合タンパク質を操作するための分子足場として使用した。この目的のために、モモルディカ・コキネンシス由来のトリプシン阻害剤ＩＩ（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）に基づくファージライブラリを使用して、組換えフィブロネクチンエクストラドメインＢに対するシスチンノットミニタンパク質を選択した。操作されたシスチンノットミニタンパク質、ＭＣ－ＦＮ－０１０および誘導体ＭＣ－ＦＮ－０１６は、高いフィブロネクチンエクストラドメインＢ特異性と妥当な親和性を特徴とする。リガンドの化学的オリゴマー化および部位特異的蛍光色素結合は、その高い特異性を維持しながら結合強度を大幅に増加させ、Ｕ－８７ ＭＧベースの異種移植片神経膠芽腫マウスモデルでのインビボイメージングを可能にした。両方のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合分子が、腎臓を除いて、腫瘍中の強い蓄積と低いバックグラウンドシグナルを示した。本発明人の結果は、腫瘍イメージング技術のための分子足場としてのシスチンノットミニタンパク質の高い可能性を明らかにする。
【0009】
本発明は、一般に、癌疾患などのフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する疾患の治療および／または診断に有用な化合物を提供する。これらの化合物は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞の選択的検出、ならびに／またはフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞および／もしくはフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞に関連する細胞などのフィブロネクチンエクストラドメインＢが発現される環境に関連する細胞の根絶を提供する。本発明は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現しない、および／またはフィブロネクチンエクストラドメインＢが発現される環境に関連しない正常細胞への有害作用を最小限に抑えることを可能にする。
【0010】
本発明は、アミノ酸配列モチーフＡｒｇ－Ｉｌｅ／Ｖａｌ－Ａｒｇを含むフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合ペプチドを提供する。
【0011】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、アミノ酸配列モチーフＡｒｇ－Ｉｌｅ／Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｌｅｕを含む。
【0012】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは以下のアミノ酸配列を含む：
（Ｘａａ）ｎ１ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ２ Ａｒｇ Ｉｌｅ／Ｖａｌ Ａｒｇ（Ｘａａ）ｎ３ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ４ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ５ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ６ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ７ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ８
ここで、
Ｃｙｓ残基はシスチンノット構造を形成し、
Ｘａａは、互いに独立して任意のアミノ酸であり、ならびに
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、およびｎ８は、それぞれのアミノ酸の数であり、
ここで、アミノ酸Ｘａａの性質および／またはアミノ酸ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７およびｎ８の数は、Ｃｙｓ残基間にシスチンノット構造が形成され得るものである。
（Ｘａａ）ｎ１ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ２ Ａｒｇ Ｉｌｅ／Ｖａｌ Ａｒｇ（Ｘａａ）ｎ３ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ４ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ５ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ６ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ７ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ８
ここで、
Ｃｙｓ残基はシスチンノット構造を形成し、
Ｘａａは、互いに独立して任意のアミノ酸であり、ならびに
ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７、およびｎ８は、それぞれのアミノ酸の数であり、
ここで、アミノ酸Ｘａａの性質および／またはアミノ酸ｎ１、ｎ２、ｎ３、ｎ４、ｎ５、ｎ６、ｎ７およびｎ８の数は、Ｃｙｓ残基間にシスチンノット構造が形成され得るものである。
【0013】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では：
ｎ１は０～４、好ましくは１または２であり、
ｎ２は３～１０、好ましくは４、５、６または７であり、
ｎ３は０～４、好ましくは０または１であり、
ｎ４は３～７、好ましくは４、５または６であり、
ｎ５は２～６、好ましくは２、３または４であり、
ｎ６は１～３、好ましくは１または２であり、
ｎ７は３～７、好ましくは４、５または６であり、および
ｎ８は０～４、好ましくは１または２である。
ｎ１は０～４、好ましくは１または２であり、
ｎ２は３～１０、好ましくは４、５、６または７であり、
ｎ３は０～４、好ましくは０または１であり、
ｎ４は３～７、好ましくは４、５または６であり、
ｎ５は２～６、好ましくは２、３または４であり、
ｎ６は１～３、好ましくは１または２であり、
ｎ７は３～７、好ましくは４、５または６であり、および
ｎ８は０～４、好ましくは１または２である。
【0014】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では、（Ｘａａ）ｎ３はＬｅｕであるかまたは欠落しており、好ましくは（Ｘａａ）ｎ３はＬｅｕである。フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では、（Ｘａａ）ｎ２は（Ｘａａ）ｎ２'Ａｓｎであり、好ましくはｎ２'は２～９、好ましくは３、４、５または６である。フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では、（Ｘａａ）ｎ７はＡｒｇ（Ｘａａ）ｎ７'であり、好ましくはｎ７'は２～６、好ましくは３、４または５である。
【0015】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では：
ｎ２は５もしくは６であるか、またはｎ２'は４もしくは５であり、
ｎ３は０または１であり、
ｎ４は５であり、
ｎ５は３であり、
ｎ６は１であり、および
ｎ７は５であるか、またはｎ７'は４である。
ｎ２は５もしくは６であるか、またはｎ２'は４もしくは５であり、
ｎ３は０または１であり、
ｎ４は５であり、
ｎ５は３であり、
ｎ６は１であり、および
ｎ７は５であるか、またはｎ７'は４である。
【0016】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、アミノ酸配列：
（Ｘａａ）ｎ１ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ２ Ａｒｇ Ｉｌｅ／Ｖａｌ Ａｒｇ（Ｘａａ）ｎ３ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ５ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ８
を含む。
（Ｘａａ）ｎ１ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ２ Ａｒｇ Ｉｌｅ／Ｖａｌ Ａｒｇ（Ｘａａ）ｎ３ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ５ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ８
を含む。
【0017】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、アミノ酸配列：
（Ｘａａ）ｎ１ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ２ Ａｒｇ Ｉｌｅ／Ｖａｌ Ａｒｇ（Ｘａａ）ｎ３ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ５ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
を含む。
（Ｘａａ）ｎ１ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ２ Ａｒｇ Ｉｌｅ／Ｖａｌ Ａｒｇ（Ｘａａ）ｎ３ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ（Ｘａａ）ｎ５ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｙ
を含む。
【0018】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では、Ｉｌｅ／ＶａｌはＩｌｅである。フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドの一実施形態では、Ｉｌｅ／ＶａｌはＶａｌである。
【0019】
一実施形態では、本発明は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドを提供し、これは、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
（ｉ）ＴｒｐＬｙｓＣｙｓＧｌｎＰｒｏＴｈｒＡｓｎＧｌｙＴｙｒＡｒｇＩｌｅＡｒｇＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｓｐＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｉ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＬｙｓＡｓｎＶａｌＳｅｒＩｌｅＭｅｔＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｉｉ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＡｌａＨｉｓＴｙｒＡｓｎＴｈｒＩｌｅＡｒｇＶａｌＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｖ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＬｙｓＧｌｎＡｌａＡｓｎＰｈｅＶａｌＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖｉ）ＡｌａＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖｉｉ）ＰｒｏＡｌａＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＡｌａＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｘ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｌａＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｌａＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、および
（ｘｉｖ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｌａＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ。
（ｉ）ＴｒｐＬｙｓＣｙｓＧｌｎＰｒｏＴｈｒＡｓｎＧｌｙＴｙｒＡｒｇＩｌｅＡｒｇＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｓｐＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｉ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＬｙｓＡｓｎＶａｌＳｅｒＩｌｅＭｅｔＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｉｉ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＡｌａＨｉｓＴｙｒＡｓｎＴｈｒＩｌｅＡｒｇＶａｌＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｖ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖ）ＳｅｒＶａｌＣｙｓＬｙｓＧｌｎＡｌａＡｓｎＰｈｅＶａｌＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＰｒｏＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖｉ）ＡｌａＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖｉｉ）ＰｒｏＡｌａＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｖｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＡｌａＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｉｘ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｌａＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＡｌａＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、
（ｘｉｉｉ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｌａＡｒｇＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ、および
（ｘｉｖ）ＰｒｏＭｅｔＣｙｓＴｈｒＧｌｎＡｒｇＬｙｓＡｓｎＡｒｇＩｌｅＡｒｇＬｅｕＣｙｓＡｒｇＡｌａＡｓｐＳｅｒＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｙＡｌａＣｙｓＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＡｓｎＧｌｙＴｙｒＣｙｓＧｌｙ。
【0020】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、足場を形成するかまたは足場の一部である。一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、共有結合修飾によって安定化されている。一実施形態では、共有結合修飾は環化である。一実施形態では、環化は１つ以上のジスルフィド架橋を介する。
【0021】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造を形成し、および／またはその一部である。一実施形態では、アミノ酸配列モチーフは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造のループ１内、好ましくはシスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造のループ１のＣ末端に位置する。一実施形態では、シスチンノット構造は、モモルディカ・コキネンシス（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）由来の開鎖トリプシン阻害剤ＩＩに基づく。
【0022】
一実施形態では、少なくとも１つの融合パートナーをさらに含むフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチド。一実施形態では、融合パートナーは、異種アミノ酸配列を含む。
【0023】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドを含むフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合剤を提供する。本発明はまた、同じでも異なっていてもよい、本明細書に記載の１つ以上の、例えば２、３、４、５、６またはそれ以上のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドを含むフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合剤を提供する。
【0024】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤の一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、共有結合および／または非共有結合で、好ましくは共有結合で、少なくとも１つのさらなる部分と会合している。
【0025】
フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤の一実施形態では、融合パートナーまたはさらなる部分は、担体タンパク質、標識、レポータ、またはタグを含む。一実施形態では、レポータは、好ましくはアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、または蛍光分子からなる群より選択される、免疫学的アッセイのためのレポータである。一実施形態では、融合パートナーまたはさらなる部分は、Ｈｉｓ６カセット、チオレドキシン、Ｓタグ、ビオチンまたはそれらの組合せからなる群より選択される。
【0026】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、共有結合および／または非共有結合で会合している少なくとも２つのサブユニットを含み、前記サブユニットのそれぞれは、同じでも異なっていてもよい、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドを含む。
【0027】
本発明によれば、一実施形態では、非共有結合は、ストレプトアビジンを含む化合物を介する。本発明によれば、一実施形態では、共有結合は、ペプチド性および／または非ペプチド性リンカーを介する。
【0028】
したがって、一実施形態では、本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、オリゴマーまたは多量体の形態で存在する。この実施形態では、同じでも異なっていてもよい本発明の２つ以上のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、ビオチン／ストレプトアビジンなどを介した共有結合または非共有結合によって連結または結合され得る。したがって、本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、二量体、三量体、四量体などを形成し得る。
【0029】
一実施形態では、本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、少なくとも４つのサブユニットを含む。一実施形態では、本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、少なくとも３つのサブユニットを含む。
【0030】
本発明はまた、共有結合および／または非共有結合で、好ましくは共有結合で、少なくとも１つの検出可能な標識もしくはレポータおよび／または少なくとも１つの治療エフェクタ部分と会合した、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を含むフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を提供する。
【0031】
一実施形態では、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、フィブロネクチンエクストラドメインＢの天然エピトープに結合する。
【0032】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、内皮細胞および／または腫瘍細胞によって発現される。
【0033】
本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤の一実施形態では、結合は特異的結合である。
【0034】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドをコードする組換え核酸を提供する。一実施形態では、組換え核酸は、ベクターの形態またはＲＮＡの形態である。
【0035】
本発明はまた、本明細書に記載の組換え核酸を含む宿主細胞を提供する。
【0036】
本発明の別の目的は、癌疾患などのフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する疾患の診断、検出またはモニタリング、すなわち後退、進行、経過および／または発症を決定するための手段および方法を提供することである。
【0037】
本発明は、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を含む試験キットを提供する。一実施形態では、試験キットは、イムノアッセイを実施するための少なくとも１つのさらなる試薬および／またはイムノアッセイを実施するためのキットの使用説明書をさらに含む。一実施形態では、試験キットは診断試験キットである。
【0038】
本発明の診断試験キットは、本発明の癌の診断、検出またはモニタリングのための方法において有用であり得る。キットは、情報を提供するパンフレット、例えば本明細書に開示される方法を実施するための試薬の使用方法を知らせるパンフレットを含み得る。
【0039】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を含むアッセイ装置を提供する。一実施形態では、アッセイ装置は、酵素結合免疫吸着アッセイ装置である。アッセイ装置の一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、固体支持体上に解除可能にまたは解除不能に固定化されている。
【0040】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を使用することを含む、試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）の存在および／または量を検定する方法を提供する。
【0041】
本発明はまた、患者における癌の診断、検出またはモニタリングのための方法であって、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を使用して、前記患者におけるフィブロネクチンエクストラドメインＢの存在および／または量を検定することを含む方法を提供する。
【0042】
特定の態様では、本発明は、癌疾患の検出、すなわち癌疾患の位置または部位、例えば特定の組織または器官を決定するための方法に関する。一実施形態では、前記方法は、検出可能な標識に結合された本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合化合物、例えば結合ペプチドまたは結合剤を患者に投与することを含む。
【0043】
前記患者の組織または器官の標識化は、前記組織または器官における癌疾患の存在またはリスクを示し得る。
【0044】
一実施形態では、組織または器官は、組織または器官が癌を有さない場合、フィブロネクチンエクストラドメインＢを実質的に発現しない組織または器官である。
【0045】
本発明の方法の一実施形態では、前記検定は、前記患者から単離された生物学的試料に対して実施される。
【0046】
一実施形態では、生物学的試料は、癌疾患を有する患者、癌疾患を有するもしくは癌疾患に罹患していることが疑われる患者、または癌疾患の可能性を有する患者から単離される。一実施形態では、生物学的試料は、組織または器官が癌を有さない場合、フィブロネクチンエクストラドメインＢを実質的に発現しない組織または器官からのものである。
【0047】
典型的には、生物学的試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢのレベルは参照レベルと比較され、前記参照レベルからの逸脱は、対象における癌疾患の存在および／または病期を指示する。参照レベルは、対照試料（例えば健常組織もしくは対象由来）で決定されたレベル、または健常対象からの中央値レベルであり得る。前記参照レベルからの「逸脱」は、少なくとも１０％、２０％、または３０％、好ましくは少なくとも４０％または５０％、またはそれ以上の増加または減少などの有意な変化を表す。フィブロネクチンエクストラドメインＢの存在および／または参照レベルと比較して、例えば癌疾患のない患者と比較して増加しているフィブロネクチンエクストラドメインＢの量は、前記患者における癌疾患の存在またはリスク（すなわち発症の可能性）を示し得る。
【0048】
一実施形態では、生物学的試料および／または対照／参照試料は、癌疾患による影響に関して診断、検出または観測されるべき組織または器官に対応する組織または器官からのものであり、例えば診断、検出または観測されるべき癌疾患は脳腫瘍であり、生物学的試料および／または対照／参照試料は脳組織である。
【0049】
一実施形態では、生物学的試料および／または対照／参照試料は、組織または器官が癌を有さない場合、フィブロネクチンエクストラドメインＢを実質的に発現しない組織または器官からのものである。本発明の方法による患者における癌疾患の存在またはリスクの指示は、癌疾患が前記組織もしくは器官に存在すること、または前記組織もしくは器官に前記癌疾患のリスクがあることを示し得る。
【0050】
診断、検出またはモニタリングのための方法は、定量的および／または定性的評価、例えば標的分子、例えばフィブロネクチンエクストラドメインＢの発現レベルの絶対的および／または相対的測定を可能にする。
【0051】
フィブロネクチンエクストラドメインＢの存在および／または量についての前記検定を達成するための手段は本明細書に記載されており、当業者には明らかであろう。典型的には、本発明の方法における検定は、フィブロネクチンエクストラドメインＢに特異的に結合する標識リガンド、例えば検出を提供する標識に直接または間接的に結合された、フィブロネクチンエクストラドメインＢに特異的に結合する本発明の化合物、例えば指標酵素、放射性標識、フルオロフォア、または常磁性粒子の使用を含む。
【0052】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢの存在、または癌のない参照と比較してより高いフィブロネクチンエクストラドメインＢの量は、患者が癌を有することを示す。
【0053】
本発明によるモニタリングの方法は、好ましくは、第１の時点での第１の試料および第２の時点でのさらなる試料におけるフィブロネクチンエクストラドメインＢの存在および／または量について検定することを含み、癌疾患の後退、進行、経過および／または発症は、２つの試料を比較することによって決定され得る。
【0054】
患者から以前に採取された生物学的試料と比較して生物学的試料中で減少しているフィブロネクチンエクストラドメインＢの量は、前記患者における癌疾患の後退、好ましい経過、例えば治療の成功、または発症のリスクの低下を示し得る。
【0055】
患者から以前に採取された生物学的試料と比較して増加しているフィブロネクチンエクストラドメインＢの量は、前記患者における癌疾患の進行、好ましくない経過、例えば治療の失敗、再発または転移挙動、癌疾患の発症または発症のリスクを示し得る。
【0056】
本発明の方法の一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢの存在および／または量について検定することは、
（ｉ）試料をフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤と接触させること、ならびに
（ｉｉ）フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤とフィブロネクチンエクストラドメインＢとの間の複合体の形成を検出することおよび／または複合体の量を決定すること
を含む。
（ｉ）試料をフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤と接触させること、ならびに
（ｉｉ）フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤とフィブロネクチンエクストラドメインＢとの間の複合体の形成を検出することおよび／または複合体の量を決定すること
を含む。
【0057】
本発明の方法の一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、少なくとも１つの検出可能な標識またはレポータを含むか、またはそれに結合されている。
【0058】
一実施形態では、本発明の方法は、イムノアッセイの状況で実施される。
【0059】
本発明の方法の一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、固体支持体上に解除可能にまたは解除不能に固定化されている。
【0060】
本発明によるフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合化合物のフィブロネクチンエクストラドメインＢへの結合は、フィブロネクチンエクストラドメインＢの機能を妨げる可能性がある。さらに、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合化合物は、治療エフェクタ部分、例えば放射性標識、細胞毒素、細胞毒性酵素などに結合することができ、フィブロネクチンエクストラドメインＢへの化合物の結合は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞またはフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞に関連する細胞、特に癌細胞を選択的に標的化し、死滅させることができる。一実施形態では、前記化合物は、腫瘍細胞の成長を低減し、および／または腫瘍細胞死を誘導し、したがって、腫瘍阻害作用または腫瘍破壊作用を有する。したがって、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合化合物は、治療法において、特に癌疾患の予防的および／または治療的治療のために使用され得る。
【0061】
本発明の方法を使用する上記のような癌疾患の確定診断は、本明細書に記載の治療方法に適する癌疾患を示し得る。
【0062】
したがって、本発明の別の目的は、癌疾患の治療的および／または予防的治療のための手段および方法を提供することである。
【0063】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチド、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤、本明細書に記載の組換え核酸、または本明細書に記載の宿主細胞を含む医薬組成物を提供する。
【0064】
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含み得、および任意で、本明細書に記載されるさらなる物質を含み得る。
【0065】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチド、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤、本明細書に記載の組換え核酸、本明細書に記載の宿主細胞、または治療法で使用するため、特に患者における癌の治療または予防に使用するための本明細書に記載の医薬組成物を提供する。
【0066】
本発明はまた、患者における癌を標的化するのに使用するための、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を提供する。
【0067】
本発明はまた、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチド、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤、本明細書に記載の組換え核酸、本明細書に記載の宿主細胞、または本明細書に記載の医薬組成物を患者に投与することを含み、好ましくは患者が癌を有するかまたは癌を発症するリスクがある、患者を治療する方法を提供する。
【0068】
上記態様の一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、少なくとも１つの治療エフェクタ部分を含むか、またはそれに結合されている。
【0069】
上記態様の一実施形態では、癌は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ陽性であり、および／またはフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞を含む。
【0070】
本発明のすべての態様によれば、癌は、好ましくは乳癌、脳の癌、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、結腸癌、食道癌、頭頸部癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、膀胱癌、または前立腺癌からなる群より選択される。
【0071】
本発明のすべての態様によれば、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、好ましくは配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【0072】
一態様では、本発明は、本明細書に記載の治療方法で使用するための本明細書に記載の薬剤を提供する。一実施形態では、本発明は、本明細書に記載の治療方法で使用するための、本明細書に記載される医薬組成物を提供する。
【0073】
本明細書に記載の治療は、外科的切除および／または放射線および／または従来の化学療法と組み合わせることができる。
【0074】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】（図１Ａ）ＩＭＡＣおよびＳＥＣ精製後のＦＮタンパク質の分析ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。合計１０μｇのタンパク質を、還元（＋β－メルカプトエタノール）および非還元（－β－メルカプトエタノール）条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに適用した。タンパク質バッチの純度を、未処理のＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像からＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用したデンシトメトリ分析によってさらに決定した。この画像では、視覚化を向上させるためにコントラストと明るさが変更されている。 （図１Ｂ）抗Ｈｉｓ抗体およびＢＣ－１抗体を用いたＦＮ－６７８９、ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－Ｂの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）に基づく結合分析。エラーバーは、それぞれウェル当たり１μｇのタンパク質が被覆された、２回の重複測定から得られた標準偏差を表す。
【図2】ＭＣｏｐｔ １．０およびＭＣｏｐｔ ２．０ライブラリの３回のファージスクリーニングラウンド後の濃縮されたシスチンノットミニタンパク質配列。クローン名、シスチンノットミニタンパク質配列、および全スクリーニングクローンの割合を各候補物について示している。可変アミノ酸を太字で示す。同定された共通のＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフを灰色で強調表示している。
【図3】ＭＣｏｐｔ １．０ライブラリのファージディスプレイスクリーニングから得られた、ヒット同定工程後のＥＤＢ結合シスチンノットミニタンパク質。ランキング値は、ＥＬＩＳＡによって決定されたシグナル（ＦＮ－Ｂ）対ノイズ（ＢＳＡ）比に基づいて計算し、Ｔｒｘ－シスチンノットミニタンパク質の発現率に対してさらに正規化した。可変アミノ酸を太字で示す。
【図4】Ｔｒｘ－シスチンノットミニタンパク質クローンＭＣｏｐｔ １．０－１／－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２／－３の特異性分析。２００ｎＭの各変異体を、固定化されたＦＮ－ＢおよびＦＮ－６７Ｂ８９標的タンパク質、ならびに対照タンパク質ＦＮ－６７８９、粉乳およびウシ血清アルブミン（１μｇ／ウェルで被覆）に適用した。ＨＲＰ結合抗ｓタグ抗体を使用して結合を分析した。陰性対照としての役割を果たすＴｒｘ－ＭＣ－Ｍｙｃ－０１０を用いてＥＬＩＳＡを２回重複して実施した。
【図5】Ｔｒｘ－シスチンノットミニタンパク質クローンＭＣｏｐｔ １．０－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２／３の拡張特異性分析。合計２００ｎＭの各変異体を、ＦＮ－Ｂ、Ｔ７－ＴＥＶ－Ｂ、ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－Ｂ（８－１４）標的タンパク質、ならびに陰性対照のＦＮ－６７８９、粉乳、ウシ血清アルブミン、リゾチーム、オボアルブミンおよびアルドラーゼ（１μｇ／ウェルで被覆）に適用した。ＥＬＩＳＡを２回重複して実施し、エラーバーは標準偏差を表し、Ｔｒｘ－ＭＣ－Ｍｙｃ－０１０は陰性シスチンノットミニタンパク質対照としての役割を果たした。
【図6A】ＭＣｏｐｔ １．０－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２／－３のＥＤＢ結合の飽和結合曲線。Ｔｒｘ－シスチンノットミニタンパク質結合を、１０の異なる濃度のＦＮ－Ｂ、ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－Ｂ（８－１４）標的タンパク質、ならびにＦＮ－６７８９対照タンパク質（１μｇ／ウェルで被覆）に対して検定した。ＨＲＰ結合抗ｓタグ抗体を用いてＴｒｘ－シスチンノットミニタンパク質の結合を検出した。ＥＬＩＳＡを２回重複して実施した（ＦＮ－Ｂ（８－１４）については１回の値）。
【図6B】ＭＣｏｐｔ １．０－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２／－３のＥＤＢ結合の飽和結合曲線。Ｔｒｘ－シスチンノットミニタンパク質結合を、１０の異なる濃度のＦＮ－Ｂ、ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－Ｂ（８－１４）標的タンパク質、ならびにＦＮ－６７８９対照タンパク質（１μｇ／ウェルで被覆）に対して検定した。ＨＲＰ結合抗ｓタグ抗体を用いてＴｒｘ－シスチンノットミニタンパク質の結合を検出した。ＥＬＩＳＡを２回重複して実施した（ＦＮ－Ｂ（８－１４）については１回の値）。
【図7A】親ＭＣ－ＦＮ－０１０配列の１番目、２番目または５番目のループのそれぞれのアミノ酸をアラニンと交換した。アラニン置換を灰色で強調表示している。
【図7B】親ＭＣ－ＦＮ－０１０およびＴｒｘ融合タンパク質としてのアラニンスキャン変異体（５０ｎＭ～１．５６３ｎＭ）を、予備被覆したヒトＦＮ－Ｂと共にインキュベートした。１０ｎｇのＨＲＰ結合抗ｓタグ抗体を用いて結合を検出した。ＥＬＩＳＡを、２回重複して、３つの独立したアッセイにおいて実施した。各変異体の相対的結合を、見かけの結合定数を決定し、親ＭＣ－ＦＮ－０１０と比較することによって計算した。エラーバーは、３回の重複測定の標準偏差を表す。
【図7C】親ＭＣ－ＦＮ－０１０の配列。太字および角括弧は、アミノ酸システインおよびジスルフィド結合の接続性を示す。明灰色で強調表示されている残基は標的結合に関連しており、灰色で表示されている残基は結合相互作用に寄与しないかまたわずかな程度にしか寄与しない。
【図8】神経膠芽腫異種移植腫瘍切片へのＭＣ－ＦＮ－０１０の特異的結合。ＥＤＢリガンドＭＣ－ＦＮ－０１０および陰性対照ＭＣ－ＦＮ－０１１５によるＵ－８７ ＭＧ腫瘍組織の免疫蛍光染色の代表的な結果。組織切片（５μｍ）を、四量体化したシスチンノットミニタンパク質－ビオチンストレプトアビジン－Ｃｙ３複合体（赤色）および血管系を可視化するための抗ＣＤ３１抗体（緑色）で染色した。スケールバーは１００μｍを示す。
【図9】（図９Ａ）ＥＬＩＳＡを使用したヒトＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－６７８９に対するＴｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１０の特異性分析。 （図９Ｂ）ＥＬＩＳＡを使用したヒトＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－６７８９へのＴｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１６の特異性分析。Ｔｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１０およびＴｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１６のＦＮ－６７Ｂ８９への結合を、ＦＮ－６７８９と比較して１．５６～５０ｎＭの範囲の濃度で、５０ｎｇのＨＲＰ結合抗Ｓタグ抗体を用いて検出した。ＥＬＩＳＡを、ウェル当たり１μｇの被覆したＦＮ－６７Ｂ８９またはＦＮ－６７８９を使用して、２回重複して実施した。
【図10】（図１０Ａ）表面プラズモン共鳴分析から得られたＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１６の速度論的パラメータ。ビオチン化ヒトＦＮ－６７Ｂ８９をストレプトアビジンセンサに固定化して、４０００ｎＭから開始する２倍段階希釈を使用してＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１６の親和性測定を実施した。速度論的パラメータを、生成されたセンサグラムに適用した１：１ラングミュアフィッティングモデルを使用して計算した。 （図１０Ｂ）単一サイクルの速度論的分析による表面プラズモン共鳴から得られたＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３およびＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３の速度論的パラメータ。ビオチン化ヒトＦＮ－６７Ｂ８９をストレプトアビジンチップに固定化して、１０ｎＭから開始する２倍段階希釈を使用してＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３およびＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３の結合測定を実施した。速度論的パラメータを、生成されたセンサグラムに適用した１：１ラングミュアフィッティングモデルを使用して計算した。
【図11A】Ｕ－８７ ＭＧ保有マウスのインビボおよびエクスビボイメージング。皮下注射したヒトＵ－８７ＭＧ細胞から生じた腫瘍を有するマウスを、３．３６ｎｍｏｌのＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３、ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３（ＥＤＢ結合剤）および対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３の静脈内投与後に画像化した。それぞれが異なる腫瘍サイズを担持する群当たり３匹のマウスで、群を層別化した。注射の１時間後、２時間後および６時間後にイメージングを実施した。インビボイメージング後、器官および腫瘍を切除し、秤量し、エクスビボ蛍光シグナル分析に使用した。
【図11B】腫瘍、腎臓、肝臓および肺における経時的な蛍光シグナルの発生。器官の蛍光シグナルを、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ２．５画像解析ソフトウェアを使用して定量化し、それぞれの器官／腫瘍重量に正規化した。三重の反復から得られたデータセットの平均±ＳＥを示す。二元配置分散分析で統計的有意性を計算した（＊Ｐ＜０．０３４２；＊＊Ｐ＜０．００５５；＊＊＊Ｐ＝０．０００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎ．ｓ．＝有意でない）。
【図12】ＥＤＢリガンドＭＣ－ＦＮ－０１０および陰性対照ＭＣ－ＦＮ－０１１５による正常なマウス脳の代表的な免疫蛍光染色。組織切片（６μｍ）を、四量体化したシスチンノットミニタンパク質－ビオチン／ストレプトアビジン－Ｃｙ３複合体および血管系を可視化するための抗ＣＤ３１抗体で染色した。スケールバー、１００μｍ。
【図13A】マウス異種移植腫瘍として増殖させたヒトＵ－８７ ＭＧ神経膠芽腫細胞株に由来する組織切片へのＭＣ－ＦＮ－０１０の特異的結合。三量体ＭＣ－ＦＮ－０１０および陰性対照ＭＣ－ＦＮ－０１１５によるＵ－８７ ＭＧ腫瘍組織（Ａ）および正常マウス脳（Ｂ）の代表的な免疫蛍光染色。組織切片（６μｍ）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０結合三量体シスチンノットミニタンパク質で染色し、抗ＣＤ３１抗体を二次抗体で検出して血管系を可視化した。スケールバー、２０μｍ。
【図13B】マウス異種移植腫瘍として増殖させたヒトＵ－８７ ＭＧ神経膠芽腫細胞株に由来する組織切片へのＭＣ－ＦＮ－０１０の特異的結合。三量体ＭＣ－ＦＮ－０１０および陰性対照ＭＣ－ＦＮ－０１１５によるＵ－８７ ＭＧ腫瘍組織（Ａ）および正常マウス脳（Ｂ）の代表的な免疫蛍光染色。組織切片（６μｍ）をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０結合三量体シスチンノットミニタンパク質で染色し、抗ＣＤ３１抗体を二次抗体で検出して血管系を可視化した。スケールバー、２０μｍ。
【図14A】Ｕ－８７ ＭＧ保有マウスのインビボイメージング。Ｆｏｘ ｎ１／ｎｕマウスの側腹部に皮下注射したヒトＵ－８７ ＭＧ細胞に由来する腫瘍を、３．３４ｎｍｏｌのＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３を単独で、または同時に注射（同時注射）もしくはその３０分前に注射（事前注射）した３倍および５倍モル過剰のＤＯＴＡ－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３と組み合わせて静脈内投与した後、イメージングに供した。トリプルアラニン変異ペプチドＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３は陰性対照としての役割を果たした。
【図14B】プローブの静脈内注射の６時間後の器官のイメージング。
【図14C】腫瘍の蛍光シグナルを定量化し、それぞれの腫瘍重量に対して正規化した。
【図15】ＥＤＢへのシスチンノットミニタンパク質変異体のＳＰＲ結合分析。表面プラズモン共鳴分析によって測定し、１：１ラングミュアフィッティングモデルを使用して計算した、ＥＤＢ特異的シスチンノットミニタンパク質変異体の速度論的パラメータ。ビオチン化ヒトＦＮ－６７Ｂ８９をストレプトアビジンセンサに固定化して、２倍段階希釈を使用してＤＯＴＡ－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３の親和性を測定した。
【発明を実施するための形態】
【0076】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0077】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、さらなる実施形態を創出するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されていると見なされるべきである。
【0078】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，ＣＨ－４０１０ Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【0079】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
【0080】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除も意味しないと理解され、しかしいくつかの実施形態では、そのような他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群が排除され得る、すなわち主題は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含に存する。本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの」および「その」という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図しており、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【0081】
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【0082】
本発明は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは１つ以上のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドを含む薬剤などのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合化合物または薬剤に関する。
【0083】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、Ｃ末端で２つのジスルフィド結合によって連結された約２５０ｋＤａの２つのサブユニットからなる二量体で構成される、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）および体液中に存在する高分子量の接着性糖タンパク質である。各単量体は、３種類の反復単位：１２のＩ型（それぞれ約４０アミノ酸）、２つのＩＩ型（約６０アミノ酸）および１５～１７のＩＩＩ型（約９０アミノ酸）ＦＮリピートからなる。フィブロネクチンは多種多様な細胞相互作用を媒介し、細胞接着、正常な細胞形態の確立と維持、細胞の移動、成長および分化などの多くの過程に関与する。フィブロネクチンは、コラーゲン、ヘパリン、フィブリン、および細胞膜受容体を含む他のいくつかのＥＣＭおよび細胞表面タンパク質と相互作用する。最後に、ＦＮは、リピートＩＩＩ－１０のＲＧＤ配列上の古典的ＦＮ受容体α５－β１を含む、多数のインテグリンのリガンドであり得る。フィブロネクチンは第２染色体上に局在する単一遺伝子の産物であるが、一部のＥＣＭタンパク質では、３つの部位：ＩＩＩ型接続配列（ＩＩＩＣＳ）、完全なＩＩＩ型リピートエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）、および完全なＩＩＩ型リピートエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）でサイトカインおよび細胞外／細胞内ｐＨによって調節される過程である、プレｍＲＮＡの選択的スプライシングから、異なるアイソフォームが生じる。これらの最後は、９１アミノ酸の完全なＩＩＩ型相同性リピートであり、エクソンの使用頻度またはスキッピングがこれらのＩＩＩ型リピートの包含または除外をもたらす。したがって、アイソフォームエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）は、ＦＮドメイン７と８の間に特異的に挿入される９１アミノ酸のさらなるＩＩＩ型ドメインを含む。ＦＮ ＩＩＩ型リピート７と８の間にＥＤＢが挿入されると、潜在配列を脱マスク化し、他の配列を妨げる立体配座変化が誘導される。フィブロネクチンエクストラドメインＢは、通常、正常な成体組織には存在しないが、組織リモデリングおよび血管新生に関与する。さらに、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、いくつかの侵攻性固形ヒト腫瘍の新生血管系において豊富な発現パターンを有する多くの異なる癌型で見出されている。
【0084】
本発明によれば、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ」という用語は、好ましくはヒトフィブロネクチンエクストラドメインＢに関する。
【0085】
好ましくは、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ」という用語または「ＥＤＢ」という略語は、エクストラドメインＢリピートを含む特定のフィブロネクチンアイソフォームに関する。一実施形態では、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ」という用語または「ＥＤＢ」という略語は、配列表の配列番号１の核酸配列または前記核酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなる核酸、およびこの核酸によってコードされるタンパク質、好ましくは配列表の配列番号２のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む、好ましくはそれからなるタンパク質に関する。特定の実施形態では、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ」という用語または「ＥＤＢ」という略語はまた、本明細書ではＥＤＢフィブロネクチンのエクストラドメインＢリピート部分を明確に表すために使用される。一実施形態では、ＥＤＢフィブロネクチンのそのようなエクストラドメインＢリピート部分は、配列表の配列番号２８に示されるアミノ酸配列または前記アミノ酸配列の変異体を含む。
【0086】
フィブロネクチンエクストラドメインＢは、頭頸部癌、脳の癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌および乳癌などの様々な起源の癌で発現される。フィブロネクチンエクストラドメインＢは、原発性腫瘍および転移の診断、予防および／または治療のための貴重な標的である。
【0087】
本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、フィブロネクチンエクストラドメインＢに結合する能力、すなわちフィブロネクチンエクストラドメインＢに存在するエピトープに結合する能力を有する。一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、腫瘍形成などにおける血管新生血管系の周囲に発現されるフィブロネクチンエクストラドメインＢに結合する。一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、腫瘍組織の細胞外マトリックス内などの腫瘍組織内および／もしくは腫瘍組織周囲で、ならびに／または腫瘍新生血管などの腫瘍血管内および／もしくは腫瘍血管において発現されるフィブロネクチンエクストラドメインＢに結合する。特に好ましい実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、フィブロネクチンエクストラドメインＢの天然エピトープに結合する。
【0088】
「エピトープ」という用語は、結合剤によって認識される分子の一部または部分を指す。例えば、エピトープは、結合剤によって認識される、分子上の個別の三次元部位である。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われ、後者への結合は失われないという点で区別される。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５～１００、好ましくは５～５０、より好ましくは８～３０、最も好ましくは１０～２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。
【0089】
本発明によれば、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤」または「フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合化合物」という用語は、フィブロネクチンエクストラドメインＢへの結合能力を有する任意の化合物（分子の複合体を含む）を含む。好ましくは、そのような結合剤は、本発明の少なくとも１つのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドであるか、またはそれを含む。フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤が本発明の少なくとも２つのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチド（同じでも異なっていてもよい）を含む場合、これらのペプチドは共有結合または非共有結合で会合（すなわち結合）し得る。フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、標識または治療エフェクタ部分などの任意の他の化合物または部分に共有結合または非共有結合で会合した１つ以上のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドを含み得る。
【0090】
本発明によれば、薬剤が標準的なアッセイにおいてフィブロネクチンエクストラドメインＢなどの所定の標的に有意な親和性を有し、前記所定の標的に結合する場合、薬剤は前記所定の標的に結合することができる。「親和性」または「結合親和性」は、しばしば平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。好ましくは、「有意な親和性」という用語は、１０－５Ｍ以下、１０－６Ｍ以下、１０－７Ｍ以下、１０－８Ｍ以下、１０－９Ｍ以下、１０－１０Ｍ以下、１０－１１Ｍ以下、または１０－１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合することを指す。
【0091】
薬剤が標準的なアッセイにおいて標的に有意な親和性を有さず、前記標的に有意に結合しない、特に検出可能に結合しない場合、薬剤は前記標的に（実質的に）結合することができない。好ましくは、薬剤は、２μｇ／ｍｌまで、好ましくは１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは２０μｇ／ｍｌ、特に５０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する場合、前記標的に検出可能に結合しない。好ましくは、薬剤が結合することができる所定の標的への結合のＫＤよりも少なくとも１０倍、１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍高いＫＤである標的に結合する場合、薬剤は前記標的に有意な親和性を有さない。例えば、薬剤が結合することができる標的へのその薬剤の結合のＫＤが１０－７Ｍである場合、薬剤が有意な親和性を有さない標的への結合のＫＤは、少なくとも１０－６Ｍ、１０－５Ｍ、１０－４Ｍ、１０－３Ｍ、１０－２Ｍ、または１０－１Ｍである。
【0092】
本発明によれば、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。
【0093】
「特異的結合」とは、薬剤が、別の標的への結合と比較して、それが特異的である標的により強く結合することを意味する。薬剤は、第２の標的の解離定数（ＫＤ）よりも低い解離定数で第１の標的に結合する場合、第２の標的と比較して第１の標的により強く結合する。好ましくは、薬剤が特異的に結合する標的の解離定数（ＫＤ）は、薬剤が特異的に結合しない標的の解離定数（ＫＤ）よりも１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、または１０１０倍以上低い。
【0094】
好ましくは、薬剤が、フィブロネクチンエクストラドメインＢなどの所定の標的には結合することができるが、他の標的には（実質的に）結合することができない、すなわち標準的なアッセイにおいて他の標的に有意な親和性を有さず、他の標的に有意に結合しない場合、薬剤は前記所定の標的に特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性および結合が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または他の特定のポリペプチドなどのフィブロネクチンエクストラドメインＢに無関係なタンパク質に対する親和性または結合を有意に上回らない場合、薬剤はフィブロネクチンエクストラドメインＢに特異的である。好ましくは、薬剤は、それが特異的でない標的への結合のＫＤよりも少なくとも１０２倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、１０６倍、１０７倍、１０８倍、１０９倍、または１０１０倍低いＫＤで所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に特異的である。
【0095】
標的への薬剤の結合は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる；例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ａｎｔｉｇｅｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ"Ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載の方法参照。親和性は、従来の技術を使用して、例えば平衡透析によって；製造者によって概説される一般的手順を用いて、表面プラズモン共鳴分析（例えばＢｉａｃｏｒｅ）を使用することによって；放射性標識された標的抗原を使用する放射免疫測定法によって；または当業者に公知の別の方法によって、容易に決定し得る。親和性データは、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，５１：６６０（１９４９）の方法によって分析し得る。特定の相互作用の測定される親和性は、異なる条件下で、例えば異なる塩濃度、ｐＨの下で測定された場合、異なり得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えばＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは結合剤および標的の標準溶液、ならびに標準緩衝液を用いて行われる。
【0096】
本発明の一実施形態では、癌は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ陽性癌である。本発明によれば、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ陽性癌」という用語または同様の用語は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを含むまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢに関連する癌、特にフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する腫瘍細胞および／または内皮細胞などの細胞を含む癌を意味する。一実施形態では、「フィブロネクチンエクストラドメインＢ陽性癌」という用語または同様の用語は、フィブロネクチンエクストラドメインＢが、腫瘍組織の細胞外マトリックス内などの腫瘍組織内および／もしくは腫瘍組織周囲で、ならびに／または腫瘍新生血管などの腫瘍血管内および／もしくは腫瘍血管において発現される癌を意味する。
【0097】
一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢが癌に空間的に関連する場合、特にフィブロネクチンエクストラドメインＢが腫瘍組織の細胞外マトリックス内などの癌内ならびに／または腫瘍血管内および／もしくは腫瘍血管に存在する場合、前記癌はフィブロネクチンエクストラドメインＢを含むか、またはフィブロネクチンエクストラドメインＢに関連する。好ましくは、フィブロネクチンエクストラドメインＢを含むまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢに関連する癌は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞を含む。前記細胞は、癌細胞または内皮細胞などの癌に関連する細胞、特に腫瘍新生血管などの腫瘍血管の内皮細胞などの癌関連内皮細胞であり得る。
【0098】
「一部」または「断片」という用語は、本明細書では互換的に使用され、連続するエレメントを指す。タンパク質配列の一部または断片は、好ましくはタンパク質配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
【0099】
「部分」という用語は、連続する要素および／または不連続な要素を指す。タンパク質配列の一部分は、好ましくはタンパク質配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するおよび／また不連続なアミノ酸を含む。
【0100】
本発明によれば、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、発現レベルが検出限界未満である場合、および／または発現レベルがフィブロネクチンエクストラドメインＢ特異的結合剤による結合を可能にするには低すぎる場合、（実質的に）発現されない。
【0101】
本発明によれば、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、発現レベルが検出限界を超える場合、および／または発現レベルがフィブロネクチンエクストラドメインＢ特異的結合剤による結合を可能にするのに十分に高い場合、発現される。好ましくは、細胞によって発現されるフィブロネクチンエクストラドメインＢは、細胞から細胞外マトリックスなどに分泌される。
【0102】
「足場」という用語は、剛性を与える構造、例えばフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドまたは本明細書に記載のアミノ酸配列モチーフに剛性を与える構造に関する。
【0103】
シスチンノットは、少なくとも３つのジスルフィド架橋（システイン分子の対から形成される）を含むタンパク質構造モチーフである。これは、第３のジスルフィド結合が通り抜ける、２つのジスルフィド結合とそれらの接続骨格セグメントによって形成される埋め込まれた環を含む。この構造は、好ましくは、βシート構造と関連する。シスチンノットを含むペプチドは、好ましくは２５～６０、好ましくは２５～５０または２５～４０アミノ酸残基の長さである。
【0104】
シスチンノットは、多くの種にわたって多くのペプチドまたはタンパク質中に生じ、かなりの構造安定性を提供する。ジスルフィド結合のトポロジーが異なる３種類のシスチンノットがある：成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）、阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）および環状シスチンノット、またはシクロチド。
【0105】
阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）またはノッティンは、３つのジスルフィド架橋を含むタンパク質構造モチーフである。それらの間のポリペプチドの区画と共に、２つのジスルフィド（それぞれ１番目と４番目のシステインおよび２番目と５番目のシステインを連結する）がループを形成し、第３のジスルフィド結合（配列中の３番目と６番目のシステインを連結する）がこのループを通過することで、ノットを形成する。このモチーフは、クモ類および軟体動物由来のものなどの無脊椎動物の毒素に一般的である。このモチーフは、植物に見られるいくつかの阻害タンパク質にも見出される。
【0106】
したがって、本発明によれば、ＩＣＫモチーフは、２つのシステイン内骨格セグメントおよびそれらの接続ジスルフィド結合、ＣｙｓＩ－ＣｙｓＩＶおよびＣｙｓＩＩ－ＣｙｓＶを含み、これらが、第３のジスルフィド結合、ＣｙｓＩＩＩ－ＣｙｓＶＩが貫通する環を形成する。
【0107】
ＩＣＫモチーフは、環状シスチンノットまたはシクロチドに類似するが、後者のファミリーに存在するポリペプチド骨格の環化を欠く。成長因子シスチンノット（ＧＦＣＫ）はモチーフを共有するが、そのトポロジーは、ループ（それぞれ２番目と５番目のシステインおよび３番目と６番目のシステインの間で形成される）を通り抜ける１番目と４番目のシステインの間の結合であるようなトポロジーである。
【0108】
シクロチドは２つの主要な構造サブファミリーに分類される。２つのうちあまり一般的ではないメビウスシクロチドは、局所的な１８０°の骨格のねじれを誘導するシス－プロリンをループ５に含むが、ブレスレットシクロチドは含まない。トリプシン阻害剤シクロチドは、配列多様性および天然の活性に基づいて、それらの独自のファミリーに分類される。トリプシン阻害剤シクロチドは、他のシクロチドよりも、ノッティンまたは阻害剤シスチンノットとして公知のカボチャ植物由来の非環状トリプシン阻害剤のファミリーとの相同性がより高い。
【0109】
ＭＣｏＴＩ－ＩおよびＭＣｏＴＩ－ＩＩは、トゲヒョウタン（ｓｐｉｎａｌ ｇｏｕｒｄ）、モモルディカ・コキネンシスの種子に由来する天然のポリペプチドである。これらのポリペプチドは、トリプシン様プロテアーゼの阻害剤であり、アミノ末端とカルボキシ末端を接続する追加のループと、３つの保存されたジスルフィド結合の結び目のある配置を含む。シスチンノットは、３つの分子内ジスルフィド結合によって規定され、線状ペプチド配列のＣｙｓＩＣｙｓＩＶおよびＣｙｓＩＩ－ＣｙｓＶが、第３のジスルフィド結合であるＣｙｓＩＩＩ－ＣｙｓＶＩが貫通する環を形成する。この配置は、並外れた熱安定性およびタンパク質分解安定性を示す、明確に定義された極めて安定な足場を提供する。構造的類似性と共通の生物学的活性、すなわちトリプシンファミリーのプロテアーゼの阻害により、ＭＣｏＴＩ－ＩおよびＭＣｏＴＩ－ＩＩは、低分子プロテアーゼ阻害剤のカボチャ阻害剤シスチンノット（ＩＣＫ）ファミリーに分類されている。このファミリーの成員は、シスチンノットフレームワークを生じさせる３つの分子内ジスルフィド結合によって結び付けられた、小さな三本鎖βシートと短い３１０ヘリックスを形成する開鎖分子である。ＭＣｏＴＩ－ＩおよびＭＣｏＴＩ－ＩＩは、環状であるカボチャ阻害剤の大きなファミリーの唯一の公知の成員である。環化ループを欠くＭＣｏＴＩ－ＩＩの開鎖変異体が合成されている。
【0110】
特定の実施形態では、本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合ペプチドは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造を形成する、および／またはその一部である。特定の実施形態では、本明細書に記載のアミノ配列モチーフは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造の一部である。一実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列モチーフは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造のループ１内に位置する。一実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列モチーフは、シスチンノット構造、好ましくは阻害剤シスチンノット構造のループ１のＣ末端に位置する。一実施形態では、システインノット構造の第１のループ（ループ１）は、シスチンノット構造の１番目のシステインと２番目のシステインとの間に位置する。
【0111】
本発明によれば、本明細書に記載のペプチドは、単離されたペプチドとして、または別のペプチドもしくはポリペプチドの一部として、当技術分野で周知の化学合成法によって合成的に生成することができる。あるいは、ペプチドは、ペプチドを産生する微生物において生成することができ、次にこれを単離し、所望する場合はさらに精製する。したがって、ペプチドは、細菌、酵母もしくは真菌などの微生物において；哺乳動物細胞もしくは昆虫細胞などの真核細胞において；またはアデノウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、セムリキ森林ウイルス、バキュロウイルス、バクテリオファージ、シンドビスウイルスもしくはセンダイウイルスなどの組換えウイルスベクターにおいて生成することができる。ペプチドを生成するための適切な細菌には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、またはペプチドを発現することができる他の任意の細菌が含まれる。ペプチドを発現するための適切な酵母の種類には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、またはペプチドを発現することができる他の任意の酵母が含まれるが、これらに限定されない。前述の細菌、組換えウイルスベクター、真核細胞を使用してペプチドを生成する方法は、当技術分野で周知である。
【0112】
ペプチドを生成するために、ペプチドをコードする核酸は、好ましくはプラスミド内にあり、核酸は、微生物におけるペプチドの発現に影響を及ぼすプロモータに作動可能に連結されている。適切なプロモータには、Ｔ７ファージプロモータ、Ｔ３ファージプロモータ、β－ガラクトシダーゼプロモータ、およびＳｐ６ファージプロモータが含まれるが、これらに限定されない。ペプチドを単離および精製するための方法は当技術分野で周知であり、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、または遠心分離などの方法が含まれる。
【0113】
本発明のペプチドは、それ自体でまたは融合ペプチドの一部として、異種ペプチドまたはタンパク質に結合させることができる。そのような異種タンパク質には、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質、およびホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼを含むがこれらに限定されないレポータ酵素が含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明のペプチドまたは本発明のペプチドを含む融合ペプチドは、フルオレセインまたはＲ－フィコエリトリンを含むがこれらに限定されない蛍光レポータ分子に化学的に結合させることができる。担体タンパク質、酵素、および蛍光レポータ分子をペプチドおよび融合ペプチドに結合させるための方法は、当技術分野で周知である。
【0114】
ペプチドの単離を容易にするために、ペプチドが、融合ポリペプチドの簡単な回収、例えばアフィニティクロマトグラフィまたは金属アフィニティクロマトグラフィ、好ましくはニッケルアフィニティクロマトグラフィによる単離を可能にする異種タグ、例えば異種ポリペプチドまたはポリヒスチジン、好ましくは６つのヒスチジン残基に翻訳的に融合（共有結合連結）されている融合ポリペプチドを作製することができる。場合によっては、精製後にタグを除去することが望ましい場合がある。そのために、融合ポリペプチドは、ペプチドと異種タグとの間の接合部に切断部位を含むことも企図される。切断部位は、その部位のアミノ酸配列に特異的な酵素で切断されるアミノ酸配列からなる。
【0115】
本明細書に記載のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、フィブロネクチンエクストラドメインＢまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ抗体の存在または量を検定するためのアッセイにおいて使用され得る。そのようなアッセイは、免疫検出を含むがこれに限定されない多くの方法で実施することができ、ＥＬＩＳＡ、特にペプチドＥＬＩＳＡ、競合結合アッセイ、ＲＩＡ等を含む。本発明の方法は、フィブロネクチンエクストラドメインＢまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢ抗体の定量的および／または定性的評価、例えば絶対的および／または相対的評価を可能にする。
【0116】
一般に、アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の実施形態を使用して実施される。
【0117】
本明細書で使用される「酵素結合免疫吸着アッセイまたはＥＬＩＳＡ」という用語は、マルチウェルプレート形式（通常は１プレート当たり９６ウェル）で試料、例えば血漿、血清または細胞／組織抽出物からのタンパク質濃度を定量的または半定量的に決定するための方法に関する。おおまかに言えば、溶液中のタンパク質がＥＬＩＳＡプレートに吸着される。目的のタンパク質に特異的な抗体を使用してプレートをプローブし得る。ブロッキングおよび洗浄方法を最適化することによってバックグラウンドが最小限に抑えられ（ＩＨＣの場合）、陽性および陰性対照の存在によって特異性が確保される。検出方法は通常、比色分析または化学発光に基づく。
【0118】
第１のウェルまたは一連のウェルが、ウェルの表面に固定化されたフィブロネクチンエクストラドメインＢに対するモノクローナル抗体を含む、複数のウェルを含むマイクロタイタプレートが提供され得る。結合したモノクローナル抗体を含むウェルに試料を添加し得る。試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢはモノクローナル抗体に結合する。ＥＬＩＳＡを、抗体複合体が形成されるのに十分な時間インキュベートする。本発明のペプチドをさらに添加してもよい。ペプチドは、融合ポリペプチドの一部であり得る。その後、ウェルを洗浄して未結合物質をすべて除去する。次に、ウェルを、標識抗体または融合ポリペプチドに結合して検出可能な複合体を形成するレポータ分子に結合した抗体と共にインキュベートし得る。標識またはレポータからの検出可能なシグナルは、試料がフィブロネクチンエクストラドメインＢを含むことを示し、一方シグナルの非存在は、試料がフィブロネクチンエクストラドメインＢを含まないことを示し得る。融合ポリペプチドが、標識またはレポータ分子、例えばアルカリホスファターゼなどのレポータ酵素を含む場合、抗体複合体は、標識抗体を必要とせずに直接検出することができる。
【0119】
あるいは、第１のウェルまたは一連のウェルが、ウェルの表面に固定化された担体タンパク質または融合ポリペプチドに結合し得る本発明のペプチドを含む、複数のウェルを含むマイクロタイタプレートが提供され得る。結合したペプチドを含むウェルに試料を添加し得る。試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢおよびウェル表面に結合したペプチドを、複合体が形成されるのに十分な時間インキュベートする。その後、ウェルを洗浄して未結合物質をすべて除去する。ウェル中の固定化されたペプチドに結合するフィブロネクチンエクストラドメインＢの量は、ウェルを、標識抗体またはフィブロネクチンエクストラドメインＢに結合するレポータ分子に結合して検出可能な複合体を形成する抗体と共にインキュベートすることによって決定される。レポータからの検出可能なシグナルは、試料がフィブロネクチンエクストラドメインＢを含むことを示し、一方シグナルの非存在は、試料がフィブロネクチンエクストラドメインＢを含まないことを示す。シグナルの強度は、試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢの濃度の推定値を提供し得る。
【0120】
本発明のペプチドはまた、フィブロネクチンエクストラドメインＢに対する抗体の存在を検出するための方法において使用され得る。これらの方法を実施するための適切なイムノアッセイの設計は、大きく変動する可能性があり、これらの様々なイムノアッセイが当技術分野で公知である。適切なイムノアッセイプロトコルは、例えば競合、直接反応、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。使用されるイムノアッセイプロトコルはまた、例えば固体支持体を使用してもよく、または免疫沈降によるものでもよい。アッセイは、標識されたペプチドの使用を含み得、標識は、例えば蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、または色素分子であり得る。特に好ましいアッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイなどの酵素標識および酵素媒介イムノアッセイである。
【0121】
したがって、ペプチドはまた、試料中のフィブロネクチンエクストラドメインＢに対する抗体を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイなどのアッセイにおいて使用され得る。この目的のために、ＥＬＩＳＡプレートのウェルをペプチドで被覆し得る。フィブロネクチンエクストラドメインＢおよびウェル表面に結合したペプチドを、複合体が形成されるのに十分な時間インキュベートし得る。その後、血漿などの試料を添加し、フィブロネクチンエクストラドメインＢ特異的抗体（一次抗体）の検出を、一次抗体に対する標識された二次抗体を用いて実施し得る。
【0122】
本明細書に記載されるようにアッセイ試薬として使用される場合、本発明のペプチドは標識に結合され得る。
【0123】
本発明によれば、標識は、その存在を容易に検出することができる任意の実体である。好ましくは、標識は直接標識である。直接標識は、それらの天然の状態で、肉眼で容易に見えるか、または光学フィルタおよび／もしくは刺激の適用、例えば蛍光を促進するためのＵＶ光を用いて容易に見える実体である。例には、放射性化合物、化学発光化合物、電気活性化合物（レドックス標識など）、および蛍光化合物が含まれる。直接微粒子標識、例えば染料ゾル、金属ゾル（例えば金）および着色ラテックス粒子も非常に適しており、蛍光化合物と共に好ましい。これらの選択肢のうちで、着色ラテックス粒子および蛍光化合物が最も好ましい。小さな領域または体積への標識の濃縮は、容易に検出可能なシグナル、例えば強く着色された領域を生じさせるはずである。酵素、例えばアルカリホスファターゼおよびホースラディッシュペルオキシダーゼなどの間接標識も使用できるが、これらは通常、可視シグナルが検出できる前に基質などの１つ以上の展開試薬の添加を必要とする。
【0124】
本発明によれば、標識は、（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１の標識もしくは第２の標識によって提供される検出可能なシグナル、例えばＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を変化させる；（ｉｉｉ）電荷、疎水性、形状もしくは他の物理的パラメータによって移動度、例えば電気泳動移動度に影響を及ぼす；または（ｉｖ）捕捉部分、例えば親和性、抗体／抗原もしくはイオン錯体形成を提供するように機能し得る。標識として適切なのは、蛍光標識、発光標識、発色団標識、放射性同位体標識、同位体標識、好ましくは安定同位体標識、同重体標識、酵素標識、粒子標識、特に金属粒子標識、磁性粒子標識、ポリマー粒子標識、ビオチンなどの有機低分子、細胞接着タンパク質またはレクチンなどの受容体のリガンドまたは結合分子、結合剤の使用によって検出できる核酸および／またはアミノ酸残基を含む標識配列などの構造体である。標識には、非限定的に、硫酸バリウム、イオセタム酸、イオパノ酸、カルシウムイポデート、ジアトリゾ酸ナトリウム、ジアトリゾ酸メグルミン、メトリザミド、チロパノ酸ナトリウム、ならびにフッ素－１８および炭素－１１などの陽電子放射体、ヨウ素－１２３、テクネチウム－９９ｍ、ヨウ素－１３１およびインジウム－１１１などのγ放射体、フッ素およびガドリニウムなどの核磁気共鳴用の核種を含む放射性診断物質が含まれる。好ましい実施形態では、標識は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤に結合したＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７，１０－四酢酸）などのリガンドと錯体形成し得るルテチウム１７７またはガリウム６８などの放射性核種を含む。
【0125】
本発明のペプチドへの標識の結合は、共有結合もしくは非共有結合（疎水性結合を含む）、または吸着によるものであり得る。そのような結合のための技術は当技術分野で一般的であり、使用される特定の試薬に容易に適合させ得る。
【0126】
本明細書で使用される「試料」という用語は、患者から単離され、分析目的に使用され得る任意の生物学的試料を含む。前記試料は、体液試料、組織試料、または細胞試料であり得る。例えば、本発明に包含される試料は、組織（例えば切片もしくは外植片）試料、単一細胞試料、細胞コロニー試料、細胞培養試料、血液（例えば全血もしくは血球画分、血清もしくは血漿などの血液画分）試料、尿試料、または他の末梢源からの試料である。前記試料は混合またはプールされてもよく、例えば、試料は血液試料と尿試料の混合物であってもよい。前記試料は、体液、細胞（１つもしくは複数）、細胞コロニー、外植片、または切片を患者から取り出すことによって提供され得るが、以前に単離された試料を使用することによっても提供され得る。例えば、組織試料は、従来の生検技術によって患者から取り出され得るか、または血液試料は、従来の採血技術によって患者から採取され得る。試料、例えば組織試料または血液試料は、治療的処置の開始前、治療的処置中、および／または治療的処置後に患者から得られ得る。
【0127】
一実施形態では、試料は体液試料である。本明細書で使用される「体液試料」という用語は、患者の身体に由来する任意の液体試料を指す。前記体液試料は、成分または画分を含む、血液試料、尿試料、痰試料、母乳試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、耳垢（みみあか）試料、内リンパ試料、外リンパ試料、胃液試料、粘液試料、腹水試料、胸膜液試料、唾液試料、皮脂（皮膚の油分）試料、精液試料、汗試料、涙試料、膣分泌物試料、または嘔吐物試料であり得る。前記体液試料は、混合またはプールされてもよい。したがって、体液試料は、血液試料と尿試料の混合物、または血液試料と脳脊髄液試料の混合物であってもよい。前記体液試料は、患者から体液を取り出すことによって提供され得るが、以前に単離された体液試料物質を使用することによっても提供され得る。
【0128】
１つの好ましい実施形態では、試料は、全血試料、または血球画分、血清もしくは血漿試料などの血液画分試料である。
【0129】
一実施形態では、生物学的試料は、癌などの疾患に罹患していることが疑われる組織から得られた試料である。一実施形態では、生物学的試料は、腫瘍試料、例えば腫瘍から得られ、腫瘍細胞および／または細胞外マトリックスもしくは細胞外マトリックス成分などの腫瘍間質を含む試料である。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の画分または単離物などの処理された生物学的試料、例えば核酸およびペプチド／タンパク質単離物も含む。
【0130】
本発明によれば、参照試料または参照生物などの「参照」は、試験試料または試験生物、すなわち患者から本発明の方法で得られた結果を関連付け、比較するために使用され得る。典型的には、参照生物は健常生物、特に腫瘍疾患に罹患していない生物である。
【0131】
「参照値」または「参照レベル」は、十分に多数の参照を測定することによって参照から経験的に決定することができる。好ましくは、参照値は、少なくとも２、好ましくは少なくとも３、好ましくは少なくとも５、好ましくは少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、好ましくは少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、好ましくは少なくとも５０、または好ましくは少なくとも１００の参照を測定することによって決定される。
【0132】
本明細書で使用される「低減する」、「減少させる」または「阻害する」は、レベル、例えば細胞の発現レベルまたは増殖レベルの、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上の全体的な減少または全体的な減少を生じさせる能力を意味する。物質の量はまた、参照試料では検出可能であるが、試験試料では存在しないかまたは検出できない場合、参照試料と比較して生物学的試料などの試験試料では低減されている。
【0133】
「増加する」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％またはそれ以上の増加または増強に関する。物質の量はまた、試験試料では検出可能であるが、参照試料では存在しないかまたは検出できない場合、参照試料と比較して生物学的試料などの試験試料では増加している。
【0134】
本発明のペプチドなどのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、固体支持体、例えばイムノアッセイウェルもしくはディップスティックの表面に結合され得、および／または適切な試薬、対照、説明書などと共に適切な容器内のキットに包装され得る。
【0135】
したがって、本発明はまた、本発明の少なくとも１つのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を含むキットを提供する。好ましい実施形態では、キットは、イムノアッセイを実施するための１つ以上の適切な試薬などの少なくとも１つのさらなる薬剤、対照、またはキットの使用説明書をさらに含む。
【0136】
本発明によれば、本発明の少なくとも１つのフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤を含むアッセイ装置がさらに提供される。一実施形態では、アッセイ装置は、酵素結合免疫吸着アッセイ装置からなる群より選択される。
【0137】
そのような装置は様々な形態をとることができ、実施されるアッセイの正確な性質に応じて変更することができる。例えば、本発明のペプチドは、固体支持体、典型的にはニトロセルロースまたは他の疎水性多孔質材料上に被覆され得る。あるいは、ペプチドは、合成プラスチック材料、マイクロタイタアッセイプレート、マイクロアレイチップ、ラテックスビーズ、セルロースまたは合成ポリマー材料を含むフィルタ、ガラスまたはプラスチックスライド、ディップスティック、キャピラリー充填装置などに被覆され得る。これらの表面へのペプチドの被覆は、当技術分野で公知の方法によって達成することができる。タンパク質担体は、典型的には複合体形成のために使用され、ＢＳＡまたは接着性ペプチドが最も好ましい。一実施形態では、本発明のペプチドは、固体支持体上に解除可能に固定化されている。さらなる好ましい実施形態では、本発明のペプチドは、固体支持体上に解除不能に固定化されている。
【0138】
本明細書に記載のペプチドは、ペプチドをコードするＲＮＡなどの核酸を投与することによって、および／またはペプチドをコードするＲＮＡなどの核酸を含む宿主細胞を投与することによって、患者に送達され得ることが理解されるべきである。したがって、患者に投与されるとき、ペプチドをコードする核酸は、裸の形態で、またはリポソームもしくはウイルス粒子の形態などの適切な送達ビヒクル中に、または宿主細胞内に存在し得る。提供された核酸は、持続的な方法で長期間にわたってペプチドを産生することができる。患者に送達される核酸は、組換え手段によって生成することができる。核酸が宿主細胞内に存在せずに患者に投与される場合、核酸は、好ましくは、核酸によってコードされるペプチドの発現のために患者の細胞によって取り込まれる。核酸が宿主細胞内に存在しつつ患者に投与される場合、核酸は、好ましくは、核酸によってコードされるペプチドを産生するように患者内の宿主細胞によって発現される。
【0139】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子を含むことが意図されている。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。ＲＮＡは、インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。
【0140】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、β－Ｄ－リボフラノース部分の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然のＲＮＡとは異なる改変されたＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端（一方もしくは両方）または内部などへの、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドには、天然には存在しないヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含まれ得る。これらの改変ＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
【0141】
本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味する「ｍＲＮＡ」を含み、好ましくはこれに関し、ＤＮＡを鋳型として使用して生成され得る、ペプチドまたはタンパク質をコードする「転写産物」に関する。ｍＲＮＡは、典型的には５'非翻訳領域（５'－ＵＴＲ）、タンパク質またはペプチドコード領域、および３'非翻訳領域（３'－ＵＴＲ）を含む。本発明の一実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって得られる。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写によって生成される。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【0142】
本発明に従って使用されるＲＮＡの発現および／または安定性を増加させるために、ＲＮＡは、好ましくは発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変更することなく、修飾され得る。
【0143】
本発明に従って使用されるＲＮＡに関連して「修飾」という用語は、前記ＲＮＡ中に天然には存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。
【0144】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップされていない５'－三リン酸を有さない。そのようなキャップされていない５'－三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成できる。
【0145】
本発明によるＲＮＡは、その安定性を高めるおよび／または細胞毒性を低下させるために、修飾された天然または合成のリボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、シチジンを５－メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。あるいはまたはさらに、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、ウリジンをプソイドウリジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。
【0146】
一実施形態では、「修飾」という用語は、ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することに関する。「５'キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に見出されるキャップ構造を指し、一般に独特の５'－５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「従来の５'キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡ ５'キャップ、好ましくは７－メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明の文脈において、「５'キャップ」という用語は、ＲＮＡキャップ構造に類似し、好ましくはインビボおよび／または細胞中で、ＲＮＡに結合した場合にＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾されている５'キャップ類似体を含む。
【0147】
ＲＮＡに５'キャップまたは５'キャップ類似体を提供することは、前記５'キャップまたは５'キャップ類似体の存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５'キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に共転写的に組み込まれるか、またはＲＮＡは、例えばインビトロ転写によって生成され得、５'キャップは、キャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して転写後にＲＮＡに結合させ得る。
【0148】
ＲＮＡはさらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用されるＲＮＡのさらなる修飾は、天然のポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは切断、または前記ＲＮＡのコード領域に関連しない非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入などの５'－ＵＴＲまたは３'－ＵＴＲの改変、例えばα２グロビン、α１グロビン、βグロビン、好ましくはβグロビン、より好ましくはヒトβグロビンなどのグロビン遺伝子に由来する１コピー以上、好ましくは２コピーの３'－ＵＴＲの挿入であり得る。
【0149】
本発明の文脈において、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターが転写産物の生成に適用される。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと呼ばれ、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。
【0150】
本発明による「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはタンパク質を作製するようにアミノ酸の配列の構築を指示する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【0151】
「発現」という用語は、本発明に従ってその最も一般的な意味で使用され、例えば転写および／または翻訳による、ＲＮＡおよび／またはペプチドもしくはタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはタンパク質の産生に関する。この用語はまた、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定的であり得る。本発明によれば、発現という用語は、「異所性発現」または「異常発現」も含む。
【0152】
「異所性発現」または「異常発現」とは、本発明によれば、参照、例えば特定のタンパク質、例えばフィブロネクチンエクストラドメインＢの異所性発現または異常発現に関連する疾患を有していない対象における状態と比較して、発現が変化している、好ましくは増加していることを意味する。発現の増加とは、少なくとも１０％、特に少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも１００００％、またはさらにそれ以上の増加を指す。一実施形態では、発現は罹患組織でのみ見出され、健常組織での発現は抑制されている。
【0153】
「特異的に発現される」という用語は、タンパク質が本質的に特定の組織または器官でのみ発現されることを意味する。例えば、胃粘膜で特異的に発現されるタンパク質は、前記タンパク質が主に胃粘膜で発現され、他の組織では発現されないかまたは他の組織もしくは器官型では有意な程度に発現されないことを意味する。したがって、胃粘膜の細胞で排他的に発現され、精巣などの他の組織では有意に低い程度に発現されるタンパク質は、胃粘膜の細胞で特異的に発現される。
【0154】
本発明によれば、「～をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、それがコードするタンパク質またはペプチドを産生するように発現され得ることを意味する。
【0155】
本発明に従って記載される核酸は、好ましくは単離されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換えＤＮＡ技術による操作に利用可能な核酸である。
【0156】
本発明による、例えば核酸およびアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に突然変異体、スプライス変異体、立体配座変異体、アイソフォーム変異体、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。対立遺伝子変異体は、遺伝子の正常な配列の改変に関連しており、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定は、しばしば所与の遺伝子について多数の対立遺伝子変異体を同定する。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。
【0157】
核酸分子に関して、「変異体」という用語は縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列が参照核酸とは異なる核酸である。
【0158】
さらに、本発明による特定の核酸配列の「変異体」には、単一または複数、例えば少なくとも２、少なくとも４、または少なくとも６、好ましくは最大３、最大４、最大５、最大６、最大１０、最大１５、または最大２０のヌクレオチド置換、欠失および／または付加を含む核酸配列が含まれる。
【0159】
好ましくは、所与の核酸配列と、前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。同一性の程度は、好ましくは、参照核酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％である領域について与えられる。例えば、参照核酸配列が２００個のヌクレオチドからなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のヌクレオチド、好ましくは連続するヌクレオチドについて与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照核酸配列の全長について与えられる。
【0160】
２つの核酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示す。
【0161】
「同一性パーセント」という用語は、最適なアラインメント後に得られる、比較する２つの配列間で同一であるヌクレオチドの割合を示すことが意図されており、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違は、ランダムにおよびそれらの全長にわたって分布する。２つのヌクレオチド配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業に加えて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【0162】
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
【0163】
好ましくは、所与の核酸配列および前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列は、ハイブリダイズすることができる。
【0164】
２つの配列が互いに相補的である場合、核酸は別の核酸に「ハイブリダイズすることができる」または「ハイブリダイズする」。２つの配列が互いに安定な二重鎖を形成できる場合、核酸は別の核酸に「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中、６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温で２×ＳＳＣ中で洗浄し、次に６８℃までの温度で０．１～０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
【0165】
相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン－クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続する残基の割合を示す（例えば１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」または「全面的に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。
【0166】
「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸の任意の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語はまた、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸を含む。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。
【0167】
核酸は、本発明によれば、単独で、または他の核酸、特に異種核酸と組み合わせて存在し得る。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸は、前記ペプチドまたはタンパク質を発現する。好ましい実施形態では、核酸は、前記核酸に対して同種でも異種でもよい発現制御配列または調節配列に機能的に連結されている。コード配列および調節配列は、それらが、前記コード配列の発現または転写が前記調節配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合連結されている場合、互いに「機能的に」連結されている。コード配列が機能的タンパク質に翻訳される場合、調節配列が前記コード配列に機能的に連結されていると、前記調節配列の誘導は、コード配列にフレームシフトを引き起こすことなく、または前記コード配列が所望のタンパク質もしくはペプチドに翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。
【0168】
「発現制御配列」または「調節配列」という用語は、本発明によれば、遺伝子の発現を調節するプロモータ、エンハンサおよび他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列を調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列および５'非翻訳配列を含む。より具体的には、５'非転写調節配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を含むプロモータ領域を含む。調節配列はまた、エンハンサ配列または上流活性化配列を含み得る。
【0169】
本発明によれば、核酸はさらに、前記核酸によってコードされるタンパク質またはペプチドの宿主細胞からの分泌を制御するペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在し得る。本発明によれば、核酸はまた、コードされるタンパク質またはペプチドを宿主細胞の細胞膜に固定させるかまたは前記細胞の特定の細胞小器官に区画化させるペプチドをコードする別の核酸と組み合わせて存在し得る。同様に、レポータ遺伝子または任意の「タグ」である核酸との組合せが可能である。
【0170】
好ましい実施形態では、組換え核酸分子は、本発明によれば、核酸の発現を制御する、適切な場合はプロモータを有する、ベクターである。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば核酸が原核生物および／または真核生物宿主細胞に導入され、適切な場合はゲノムに組み込まれることを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。この種のベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。中間ビヒクルは、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リポソーム投与、アグロバクテリウム（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）を用いた移入、またはＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスを介した挿入における使用に適合させ得る。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスゲノムを含む。
【0171】
本発明による核酸は、宿主細胞のトランスフェクションに使用し得る。ここでの核酸とは、組換えＤＮＡと組換えＲＮＡの両方を意味する。組換えＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって調製し得る。さらに、これは、適用前に配列の安定化、キャッピングおよびポリアデニル化によって修飾し得る。
【0172】
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え核酸などの「組換え物」は、天然には存在しない。
【0173】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人間によって意図的に修飾されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
【0174】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのその正常な細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞に関する。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその通常の代謝機能を実施することができる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸でトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。好ましくは、外因性核酸でトランスフェクトされたときの細胞は、核酸を発現することができる。
【0175】
「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、霊長動物からの細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来してもよく、初代細胞および細胞株を含み得る。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄の幹細胞および胚性幹細胞が含まれる。核酸は、単一のコピーまたは２つ以上のコピーの形態で宿主細胞に存在することができ、一実施形態では、宿主細胞で発現される。
【0176】
「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合によって共有結合で連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、および好ましくは８個、１０個、２０個、３０個、４０個または５０個まで、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に、「ペプチド」と「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【0177】
本発明によれば、ペプチドは、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含み得る。一実施形態では、ペプチドは単に天然アミノ酸を含む。
【0178】
本発明によれば、「非天然アミノ酸」という用語は、２０の天然アミノ酸種のものとは異なる構造を有するアミノ酸を指す。非天然アミノ酸は天然アミノ酸のものと類似の構造を有するため、非天然アミノ酸は所与の天然アミノ酸の誘導体または類似体として分類されることがある。
【0179】
本発明によれば、「環状ペプチド」という用語は、環を形成するペプチドまたはポリペプチド鎖に関する。ペプチドは、４つの異なる方法で環化され得る：頭－尾結合（Ｃ末端－Ｎ末端結合）、頭－側鎖結合、側鎖－尾結合、または側鎖－側鎖結合。本発明によれば、環状ペプチドを与える分子内ジスルフィド架橋を形成することができるシステインなどのチオール基を含む２つ以上の残基を含むペプチドが特に好ましい。
【0180】
本発明によれば、ペプチドは、１つ以上の他の化合物に共有結合または非共有結合し得る。そのような化合物には、ペプチドおよびタンパク質などのペプチド性化合物、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非ペプチド性化合物が含まれる。
【0181】
一実施形態では、本明細書に記載のペプチドはペグ化されている。ペグ化は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖をペプチドまたはタンパク質などの別の分子に共有結合させる工程である。ＰＥＧの共有結合は、宿主の免疫系から薬剤を「マスク」し（免疫原性および抗原性を低下させる）、薬剤の流体力学的サイズ（溶液中のサイズ）を増加させることができ、これは、腎クリアランスを低下させることによって薬剤の循環時間を延長する。ペグ化は、疎水性薬物およびタンパク質に水溶性を提供することもできる。
【0182】
好ましくは、本発明に従って記載されるタンパク質およびペプチドは単離されている。「単離されたタンパク質」または「単離されたペプチド」という用語は、タンパク質またはペプチドがその天然環境から分離されていることを意味する。単離されたタンパク質またはペプチドは、本質的に精製された状態であり得る。「本質的に精製された」という用語は、タンパク質またはペプチドが、それが自然界でまたはインビボで結合している他の物質を本質的に含まないことを意味する。そのようなタンパク質およびペプチドは、例えば免疫学的アッセイもしくは診断アッセイにおいて、または治療薬として使用され得る。本発明に従って記載されるタンパク質およびペプチドは、組織または細胞ホモジネートなどの生物学的試料から単離することができ、また、多数の原核生物または真核生物発現系において組換え発現させ得る。
【0183】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、およびそのような糖タンパク質の抗原結合部分を含む任意の分子を含む。「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、限定されることなく、一本鎖抗体、例えばｓｃＦｖならびにＦａｂおよびＦａｂ'断片などの抗原結合抗体断片を含む抗体の結合断片または誘導体を含む分子を含み、また、抗体のすべての組換え形態、例えば原核生物で発現される抗体、非グリコシル化抗体、ならびに本明細書に記載の任意の抗原結合抗体断片および誘導体を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクタ細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【0184】
特定のアミノ酸配列、例えば配列表に示されるものに関して本明細書で与えられる教示は、前記特定の配列と機能的に等価である配列、例えば前記特定のアミノ酸配列の特性と同一または類似の特性を示すアミノ酸配列をもたらす前記特定の配列の変異体にも関連するように解釈されるべきである。１つの重要な特性は、フィブロネクチンエクストラドメインＢなどの標的への結合を保持することである。
【0185】
本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。
【0186】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列中に１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
【0187】
アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合を含む。
【0188】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０個、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失は、ペプチドまたはタンパク質の任意の位置にあってよい。
【0189】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。修飾が、相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列内の位置にあること、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は、一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。
【0190】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域について与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸について与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最適な配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ開始１０．０、ギャップ伸長０．５を使用して行うことができる。
【0191】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
【0192】
「同一性パーセント」という用語は、最適なアラインメント後に得られる、比較する２つの配列間で同一であるアミノ酸残基の割合を示すことが意図されており、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違は、ランダムにおよびそれらの全長にわたって分布する。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、従来、これらの配列を最適に整列させた後に比較することによって行われ、前記比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとにまたは「比較ウィンドウ」ごとに行われる。比較のための配列の最適なアラインメントは、手作業に加えて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４の類似性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムを使用するコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【0193】
同一性パーセントは、比較する２つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除し、得られた結果に１００を乗じて、これら２つの配列間の同一性パーセントを得ることによって計算される。
【0194】
本明細書に記載のペプチドおよびアミノ酸変異体は、公知のペプチド合成技術を用いて、例えば固相合成（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６４）および同様の方法によって、または組換えＤＮＡ操作によって、容易に調製され得る。置換、挿入または欠失を有するタンパク質およびペプチドを調製するためのＤＮＡ配列の操作は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に詳細に記載されている。
【0195】
本発明によれば、「ペプチド」または「タンパク質」という用語は、ペプチドおよびタンパク質の「誘導体」を含む。そのような誘導体は、ペプチドおよびタンパク質の修飾形態である。そのような修飾には任意の化学修飾が含まれ、ならびに炭水化物、脂質、タンパク質および／またはペプチドなどのタンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。「誘導体」という用語はまた、前記ペプチドおよびタンパク質のすべての機能的な化学的等価物に及ぶ。好ましくは、修飾ペプチドは、増加した安定性および／または増加した免疫原性を有する。
【0196】
本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、治療アプローチにおいて使用され得る。この目的のために、本発明のフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤は、１つ以上の治療エフェクタ部分に共有結合および／もしくは非共有結合され得、ならびに／または様々な成分と組み合わされて薬学的に許容される組成物を生成し得る。本明細書に記載されるペプチドなどの薬剤は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
【0197】
「標的細胞」とは、癌細胞などの望ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態では、標的細胞は、フィブロネクチンエクストラドメインＢに関連するかまたは空間的に連結され、例えば近接し、例えば標的細胞は、腫瘍細胞および／またはフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する内皮細胞などの細胞を含む癌または腫瘍内に存在する。一実施形態では、フィブロネクチンエクストラドメインＢは、腫瘍組織の細胞外マトリックス内などの腫瘍組織内および／もしくは腫瘍組織周囲で、ならびに／または腫瘍新生血管などの腫瘍血管内および／もしくは腫瘍血管において発現される。
【0198】
本発明によれば、「治療エフェクタ部分」という用語は、治療効果を発揮し得る任意の分子を意味する。本発明によれば、治療エフェクタ部分は、好ましくは、フィブロネクチンエクストラドメインＢまたはフィブロネクチンエクストラドメインＢに関連するかまたは空間的に連結される細胞に選択的に誘導される。癌細胞に対して治療効果を発揮する任意の薬剤を、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤に結合させるための薬物として使用することができる。好ましくは、薬物の結合は、本明細書で論じるように、フィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤の結合特性、特に特異性を改変しないまたは有意に改変しない。
【0199】
本発明によれば、治療エフェクタ部分は、抗癌剤、放射性ヨウ素標識化合物などの放射性同位体、毒素、細胞増殖抑制薬または細胞溶解薬等を含む。抗癌剤は、例えばアミノグルテチミド、アザチオプリン、ブレオマイシン硫酸塩、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シクロスポリン、シタラビジン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、タキソール、エトポシド、フルオロウラシル、インターフェロンα、ロムスチン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトタン、塩酸プロカルバジン、チオグアニン、ビンブラスチン硫酸塩およびビンクリスチン硫酸塩を含む。他の抗癌剤は、例えばＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，"Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ"，８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、特にＣｈａｐｔｅｒ ５２（Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ（Ｐａｕｌ Ｃａｌａｂｒｅｓｉ ａｎｄ Ｂｒｕｃｅ Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ）に記載されている。毒素は、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、コレラ毒素、百日咳毒素、リシン、ゲロニン、アブリン、ジフテリア外毒素またはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素などのタンパク質であり得る。毒素残基は、コバルト６０などの高エネルギー放出放射性核種であり得る。
【0200】
治療エフェクタ部分には、特に細胞毒素または細胞毒性薬が含まれる。細胞毒素または細胞毒性薬には、細胞に有害であり、特に細胞を死滅させる任意の薬剤が含まれる。
【0201】
細胞毒性薬の有用なクラスには、例えば抗チューブリン剤、ＤＮＡ副溝結合剤（例えばエンジインおよびレキシトロプシン）、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えばシスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金錯体などの白金錯体ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、ニトロソ尿素、プラチノール、予備形成化合物、プリン代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン（例えばパクリタキセルおよびドセタキセル）、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。
【0202】
個々の細胞毒性薬には、例えばアンドロゲン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、アスパラギナーゼ、５－アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ブスルファン、ブチオニンスルホキシミン、カンプトテシン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ＣＣ－１０６５、クロラムブシル、シスプラチン、コルヒチン、シクロホスファミド、シタラビン、シチジンアラビノシド、サイトカラシンＢ、ダカルバジン、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ダウノルビシン、デカルバジン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エストロゲン、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウラシル、グラミシジンＤ、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、６－メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ニトロイミダゾール、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、ストレプトゾトシン、テニポシド、６－チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ＶＰ－１６およびＶＭ－２６が含まれる。
【0203】
抗チューブリン剤の例には、ドラスタチン（例えばオーリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶＢ）、メイタンシノイド、タキサン（例えばパクリタキセル、ドセタキセル）、Ｔ６７（Ｔｕｌａｒｉｋ）、ビンカアルキロイド（例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、およびビノレルビン）、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例えばエポチロンＡおよびＢ）、ノコダゾール、コルヒチンおよびコルセミド（ｃｏｌｃｉｍｉｄ）、エストラムスチン、クリプトフィジン、セマドチン、コンブレタスタチン、ディスコデルモライド、およびエリュテロビンが含まれるが、これらに限定されない。
【0204】
細胞毒性放射性医薬品を生成するための放射性同位体には、例えばヨウ素－１３１、イットリウム－９０またはインジウム－１１１が含まれる。
【0205】
そのような治療エフェクタ部分（薬物）をペプチドに結合させるための技術は周知である。ペプチド－薬物複合体の生成は、当業者に公知の任意の技術によって達成することができる。ペプチドと薬物は、それら自身のリンカー基を介して互いに直接結合し得るか、またはリンカーもしくは他の物質を介して間接的に結合し得る。
【0206】
ペプチドへの薬物の共有結合には、多くの異なる反応が利用可能である。これは、しばしば、リジンのアミン基、グルタミン酸およびアスパラギン酸の遊離カルボン酸基、システインのスルフヒドリル基、ならびに芳香族アミノ酸の様々な部分を含む、ペプチド分子のアミノ酸残基の反応によって達成される。共有結合の最も一般的に使用される非特異的方法の１つは、化合物のカルボキシ（またはアミノ）基をペプチドのアミノ（またはカルボキシ）基に連結するカルボジイミド反応である。さらに、ジアルデヒドまたはイミドエステルなどの二官能性薬剤が、化合物のアミノ基をペプチド分子のアミノ基に連結するために使用されてきた。シッフ塩基反応も、ペプチドへの薬物の結合にも利用可能である。この方法は、グリコール基またはヒドロキシ基を含む薬物の過ヨウ素酸酸化を含み、したがってアルデヒドを形成し、それが次にペプチド分子と反応する。結合は、ペプチド分子のアミノ基とのシッフ塩基の形成によって起こる。イソチオシアネートも、薬物をペプチドに共有結合させるためのカップリング剤として使用することができる。他の技術は当業者に公知であり、本発明の範囲内である。
【0207】
ペプチド－薬物複合体を作製するための当技術分野で公知の多くの連結基が存在する。リンカーは、好ましくは、ペプチドおよび薬物のいずれかまたは両方と反応する１つ以上の官能基を含む。官能基の例には、アミノ、カルボキシル、メルカプト、マレイミド、およびピリジニル基が含まれる。
【0208】
本発明の一実施形態では、ペプチドは、二官能性架橋試薬によって薬物と連結される。本明細書で使用される場合、「二官能性架橋試薬」は、２つの反応性基を有し、その一方がペプチドと反応することができ、他方が薬物と反応してペプチドを薬物と連結することができ、それにより複合体を形成する試薬を指す。リンカー試薬が薬物の保持、例えば細胞毒性、およびペプチドの標的化特性を提供する限り、任意の適切な二官能性架橋試薬を本発明に関連して使用することができる。好ましくは、リンカー分子は、薬物とペプチドが互いに化学的に結合する（例えば共有結合する）ように、化学結合を介して薬物をペプチドに結合する。
【0209】
一実施形態では、二官能性架橋試薬は、切断不可能なリンカーを含む。切断不可能なリンカーは、安定した共有結合様式で薬物をペプチドに連結することができる任意の化学的部分である。好ましくは、切断不可能なリンカーは、生理学的条件下で、特に体内および／または細胞内で切断可能ではない。したがって、切断不可能なリンカーは、薬物またはペプチドが活性を維持する条件下で、酸誘導切断、光誘導切断、ペプチダーゼ誘導切断、エステラーゼ誘導切断、およびジスルフィド結合切断に対して実質的に耐性である。薬物とペプチドとの間に切断不可能なリンカーを形成する適切な架橋試薬は、当技術分野で周知である。一実施形態では、薬物は、チオエーテル結合を介してペプチドに連結される。
【0210】
１つの特に好ましい実施形態では、連結試薬は、切断可能なリンカーである。好ましくは、切断可能なリンカーは、生理学的条件下で、特に体内および／または細胞内で切断可能である。適切な切断可能なリンカーの例には、ジスルフィドリンカー、酸不安定性リンカー、光解離性リンカー、ペプチダーゼ不安定性リンカー、およびエステラーゼ不安定性リンカーが含まれる。
【0211】
リンカーの例には、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート（ＳＰＤＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スルホスクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（スルホ－ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシ－（６－アミドカプロエート）（ＬＣ－ＳＭＣＣ）、４－マレイミド酪酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、３－マレイミドカプロン酸Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ－（α－マレイミドアセトキシ）－スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル－６－（β－マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（ｐ－マレイミドフェニル）－ブチレート（ＳＭＰＢ）、Ｎ－（ｐ－マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、６－マレイミドカプロイル（ＭＣ）、マレイミドプロパノイル（ＭＰ）、ｐ－アミノベンジルオキシカルボニル（ＰＡＢ）、Ｎ－スクシンイミジル－４－（２－ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）、およびＮ－スクシンイミジル（４－ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）が含まれるが、これらに限定されない。バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ）またはアラニン－フェニルアラニン（ａｌａ－ｐｈｅ）などのペプチドリンカーも使用することができ、前述のリンカーのいずれかを適切な組合せで使用し得る。
【0212】
ジスルフィド含有リンカーは、生理学的条件下で起こり得るジスルフィド交換によって切断可能なリンカーである。さらに他の実施形態では、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えばジスルフィドリンカー）。例えばＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－５－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－α－メチル－α－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）を使用して形成され得るものを含む、様々なジスルフィドリンカーが当技術分野で公知である。
【0213】
酸不安定性リンカーは、酸性のｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、エンドソームおよびリソソームなどの特定の細胞内区画は酸性ｐＨ（ｐＨ４～５）を有し、酸不安定性リンカーを切断するのに適した条件を提供する。酸不安定性リンカーは、血液中のｐＨなどの中性ｐＨ条件下では比較的安定しているが、ｐＨ５．５または５．０未満では不安定である。例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ－アコニット酸アミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなどを使用することができる。
【0214】
光解離性リンカーは、体表面および光にアクセスできる多くの体腔において有用である。さらに、赤外光は組織を透過することができる。
【0215】
ペプチダーゼ不安定性リンカーは、細胞内または細胞外の特定のペプチドを切断するために使用できる。一実施形態では、切断可能なリンカーは、穏やかな条件下で、すなわち細胞毒性剤の活性が影響を受けない細胞内の条件下で切断される。
【0216】
リンカーは、例えば、リソソームまたはエンドソームプロテアーゼを含むがこれらに限定されない細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断される、ペプチジルリンカーであり得るか、またはそれを含み得る。典型的には、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長または少なくとも３アミノ酸長である。切断剤には、カテプシンＢおよびＤならびにプラスミンが含まれ得、これらはすべて、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが公知である。例えば、癌性組織で高度に発現されるチオール依存性プロテアーゼカテプシンＢによって切断可能なペプチジルリンカーを使用することができる（例えばＰｈｅ－ＬｅｕまたはＧｌｙ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカー）。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、バリン－シトルリン（Ｖａｌ－Ｃｉｔ；ｖｃ）リンカーまたはフェニルアラニン－リジン（Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）リンカーである。治療薬の細胞内タンパク質分解性放出を使用することの１つの利点は、薬剤が複合体化されると、典型的には弱毒化されること、および典型的には複合体の血清安定性が高いことである。
【0217】
「個体」および「対象」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患している可能性があるかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していても有していなくてもよいヒト、非ヒト霊長動物または他の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「対象」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本発明の好ましい実施形態では、「個体」または「対象」は「患者」である。「患者」という用語は、本発明によれば、治療のための対象、特に罹患した対象を意味する。
【0218】
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部に由来する因子によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、苦痛、社会問題、もしくは死を引き起こすか、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型のバリエーションを含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと見なされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは、人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的だけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。本発明によれば、「疾患」という用語は、癌、特に本明細書に記載の癌の形態を含む。本明細書における癌または癌の特定の形態への言及には、その癌転移も含まれる。好ましい実施形態では、本出願に従って治療される疾患は、フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞を含む。
【0219】
「フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞が関与する疾患」または同様の表現は、本発明によれば、フィブロネクチンエクストラドメインＢが罹患組織または器官の細胞によって発現されることを意味する。一実施形態では、罹患組織または器官の細胞によるフィブロネクチンエクストラドメインＢの発現は、健常組織または器官の状態と比較して増加している。一実施形態では、発現は罹患組織でのみ見出され、健常組織での発現は抑制されている。本発明によれば、フィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する細胞が関与する疾患には、癌疾患が含まれる。さらに、本発明によれば、癌疾患は、好ましくは、細胞がフィブロネクチンエクストラドメインＢを発現する疾患である。
【0220】
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞増殖を特徴とする個体の生理学的状態を指すまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれるが、これらに限定されない。本発明による「癌」という用語は、癌転移も含む。好ましくは、「癌疾患」は、フィブロネクチンエクストラドメインＢの発現または存在を特徴とする。
【0221】
「転移」とは、癌細胞がその元の部位から身体の別の部分に広がることを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、内皮基底膜の貫通による体腔および血管への進入、次いで血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新しい腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発現し得るため、しばしば原発性腫瘍の除去後にも起こる。一実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。一実施形態では、本発明による「転移」という用語は、リンパ節転移に関する。
【0222】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、好ましくは腫脹または病変を形成する細胞（新生細胞、腫瘍形成性細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な成長を指す。「腫瘍細胞」とは、急速な制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る明確な組織塊を形成する。本発明によれば、「癌疾患」は、好ましくは「腫瘍疾患」である。しかしながら、一般に、「癌」および「腫瘍」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【0223】
好ましくは、本発明による腫瘍疾患は、癌疾患、すなわち悪性疾患であり、腫瘍細胞は癌細胞である。好ましくは、腫瘍疾患または癌疾患は、フィブロネクチンエクストラドメインＢの存在を特徴とする。一実施形態では、癌は、フィブロネクチンエクストラドメインＢ陽性癌である。
【0224】
再発または回帰は、人が過去に罹患した状態に再び侵される場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患したことがあり、前記疾患の治療を受けて成功し、前記疾患を再び発症した場合、前記の新たに発症した疾患は再発または回帰と見なされ得る。しかしながら、本発明によれば、腫瘍疾患の再発または回帰は、元の腫瘍疾患の部位でも起こり得るが、必ずしもそうとは限らない。腫瘍の再発または回帰には、腫瘍が元の腫瘍の部位とは異なる部位で発生する状況および元の腫瘍の部位で発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が治療を受けた元の腫瘍は原発性腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位の腫瘍は二次性腫瘍または転移性腫瘍である。
【0225】
「治療」または「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長させる（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体における疾患を排除し、個体における疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体における疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体における症状の頻度もしくは重症度を低下させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体における再発を減少させ得る。
【0226】
「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。例えば、癌のリスクがある対象は、癌を予防するための治療法の候補となる。
【0227】
「リスクがある」とは、一般集団と比較して、疾患、特に癌を発症する可能性が通常よりも高いと特定された対象を意味する。さらに、疾患、特に癌を有していたか、または現在有している対象は、引き続き疾患を発症する可能性があるため、疾患を発症するリスクが高い対象である。現在癌に罹患しているか、または罹患したことがある対象は、癌転移のリスクも高い。
【0228】
癌の（治療的）治療は、手術、化学療法、放射線療法および標的療法からなる群より選択され得る。
【0229】
本明細書で使用される「手術」という用語は、手術中の腫瘍の除去を含む。これは癌の一般的な治療である。外科医は、局所切除を使用して腫瘍を除去し得る。
【0230】
本明細書で使用される「化学療法」という用語は、好ましくは、細胞を死滅させるかまたは細胞の分裂を停止させることによって癌細胞の増殖を停止させるための、化学療法剤または化学療法剤の組合せの使用を指す。化学療法が経口摂取されるか、静脈または筋肉内に注射された場合、薬物は血流に入り、全身の癌細胞に到達することができる（全身化学療法）。化学療法が脳脊髄液、臓器、または腹部などの体腔に直接注入される場合、薬物は主にそれらの領域中の癌細胞に影響を及ぼす（局所化学療法）。
【0231】
本発明による化学療法剤には、細胞増殖抑制性化合物および細胞毒性化合物が含まれる。従来の化学療法剤は、ほとんどの癌細胞の主要な特性の１つである、急速に分裂する細胞を死滅させることによって作用する。これは、化学療法が、骨髄、消化管、および毛包における細胞などの通常の状況下で急速に分裂する細胞にも害を及ぼすことを意味する。これは、化学療法の最も一般的な副作用をもたらす。癌で異常発現されるタンパク質（フィブロネクチンエクストラドメインＢなど）を標的とし、治療部分または当該薬剤に結合した薬剤を介して作用する薬剤は、化学療法の一形態と見なされ得る。しかしながら、最も厳密な意味では、本発明による「化学療法」という用語は標的療法を含まない。
【0232】
本発明によれば、「標的療法」という用語は、罹患していない器官、組織または細胞は標的化しないかまたはより少ない程度に標的化する一方で、癌組織または細胞などの罹患した器官、組織または細胞を選択的に標的化するために使用できる、任意の治療法に関する。罹患した器官、組織または細胞の標的化は、好ましくは、罹患細胞の死滅および／または増殖もしくは生存能力の低下をもたらす。そのような治療法には、ｉ）特定の標的、例えばフィブロネクチンエクストラドメインＢを標的とする治療部分を送達するために治療部分に結合された薬剤（例えば治療部分に結合されたフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤）、またはｉｉ）特定の標的、例えばフィブロネクチンエクストラドメインＢを標的とし、罹患細胞の増殖、広がり、移動および／もしくは生存能力を損なう薬剤（例えば治療部分に結合したもしくは治療部分に結合していないフィブロネクチンエクストラドメインＢ結合剤）が含まれる。
【0233】
本発明に従って記載される医薬組成物および治療方法は、本明細書に記載される疾患を治療的に処置するまたは予防するために使用され得る。癌に対する作用を試験するために動物モデルを使用することが可能である。例えば、ヒトの癌細胞をマウスに導入して腫瘍を生成し得る。癌細胞への作用（例えば腫瘍サイズの縮小）を、動物に投与された薬剤の有効性の尺度として測定し得る。
【0234】
ペプチドは、それ自体公知の方法で投与され得る。一般に、１ｎｇ～１ｍｇ、好ましくは１０ｎｇ～１００μｇのペプチドの用量が製剤化され、投与される。
【0235】
核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の投与が望ましい場合、１ｎｇ～０．１ｍｇの用量を製剤化し、投与し得る。
【0236】
一実施形態では、核酸は、エクスビボ法によって、すなわち患者から細胞を取り出し、核酸を組み込むために前記細胞を遺伝子修飾し、改変された細胞を患者に再導入することによって投与される。これは一般に、遺伝子の機能的コピーをインビトロで患者の細胞に導入すること、および遺伝子改変された細胞を患者に再導入することを含む。遺伝子の機能的コピーは、遺伝子が遺伝的に改変された細胞において発現されることを可能にする調節エレメントの機能的制御下にある。トランスフェクションおよび形質導入の方法は当業者に公知である。
【0237】
本発明はまた、例えばウイルスおよび標的制御リポソームなどのベクターを使用することによってインビボで核酸を投与することを提供する。
【0238】
好ましい実施形態では、核酸を投与するためのウイルスまたはウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよび弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスならびにＴｙウイルス様粒子からなる群より選択される。アデノウイルスおよびレトロウイルスが特に好ましい。レトロウイルスは、典型的には複製欠損である（すなわち感染性粒子を生成することができない）。
【0239】
インビトロまたはインビボで核酸を細胞に導入する方法には、核酸のリン酸カルシウム沈殿物のトランスフェクション、ＤＥＡＥと結合した核酸のトランスフェクション、目的の核酸を担持する上記ウイルスによるトランスフェクションまたは感染、リポソーム媒介トランスフェクションなどが含まれる。特定の実施形態では、核酸を特定の細胞に向かわせることが好ましい。そのような実施形態では、核酸を細胞に投与するために使用される担体（例えばレトロウイルスまたはリポソーム）は、結合した標的制御分子を有し得る。例えば、標的細胞上の表面膜タンパク質に特異的な抗体または標的細胞上の受容体のリガンドなどの分子を、核酸担体に組み込み得るかまた結合し得る。好ましい抗体は、腫瘍抗原に選択的に結合する抗体を含む。リポソームによる核酸の投与が望ましい場合、標的の制御および／または取込みを可能にするために、エンドサイトーシスに関連する表面膜タンパク質に結合するタンパク質をリポソーム製剤に組み込み得る。そのようなタンパク質は、特定の細胞型に特異的なキャプシドタンパク質またはその断片、内在化されるタンパク質に対する抗体、細胞内部位を指向するタンパク質などを含む。
【0240】
本発明の治療的に活性な化合物は、注射または注入を含む任意の従来の経路によって投与し得る。投与は、例えば経口的、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下または経皮的に実施し得る。投与は、局所的または全身的、好ましくは全身的であり得る。
【0241】
「全身投与」という用語は、薬剤が個体の体内に有意な量で広く分布するようになり、所望の効果を発現するような薬剤の投与を指す。例えば、薬剤は、血液中でその所望の効果を発現することができ、および／または血管系を介してその所望の作用部位に達する。典型的な全身投与経路には、薬剤を血管系に直接導入することによる投与、または経口、肺もしくは筋肉内投与が含まれ、この場合、薬剤は吸着され、血管系に入り、血液を介して１つ以上の所望の作用部位に運ばれる。
【0242】
本発明によれば、全身投与は非経口投与によることが好ましい。「非経口投与」という用語は、薬剤が腸管を通過しないような薬剤の投与を指す。「非経口投与」という用語には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または動脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【0243】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応または所望の効果を生じさせるために、本明細書に記載の薬剤および任意で本明細書で論じるさらなる薬剤の有効量を含む。
【0244】
医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。医薬組成物は、例えば、溶液または懸濁液の形態であり得る。
【0245】
医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよく、それらのすべてが、好ましくは薬学的に許容される。「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【0246】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用されてもよく、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩を含む。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
【0247】
医薬組成物での使用に適する緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸が含まれる。
【0248】
医薬組成物での使用に適する防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
【0249】
「担体」という用語は、適用を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「担体」という用語はまた、患者への投与に適する１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質を含む。
【0250】
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に、生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。
【0251】
注射製剤は、乳酸リンゲル液などの薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
【0252】
本明細書で使用される場合「賦形剤」という用語は、医薬組成物中に存在し得る、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤などの活性成分ではないすべての物質を示すことが意図されている。
【0253】
本明細書に記載の薬剤および組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻害に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、および特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。
【0254】
本明細書に記載の薬剤または組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の薬剤の投与量は、そのような様々なパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される効果的により高い用量）を使用し得る。
【0255】
本明細書に記載の薬剤および組成物は、本明細書に記載されるような様々な障害を治療または予防するために、例えばインビボで患者に投与することができる。好ましい患者には、本明細書に記載の薬剤および組成物を投与することによって矯正または改善することができる障害を有するヒト患者が含まれる。これには、フィブロネクチンエクストラドメインＢの変化した発現パターンを特徴とする障害が含まれる。
【0256】
例えば、一実施形態では、本明細書に記載の薬剤は、癌疾患、例えばフィブロネクチンエクストラドメインＢの存在を特徴とする本明細書に記載されるような癌疾患を有する患者を治療するために使用できる。
【0257】
本発明を以下の図面および実施例によって詳細に説明するが、これらは例示目的のみに使用されるものであり、限定することを意図しない。説明および実施例によって、同様に本発明に含まれるさらなる実施形態が当業者にアクセス可能である。
【実施例】
【0258】
本明細書で使用される技術および方法は、本明細書に記載されているか、またはそれ自体公知の方法で、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されているように実施される。キットおよび試薬の使用を含むすべての方法は、特に指示されない限り、製造者の情報に従って実施される。
【0259】
実施例１：材料および方法
標的の発現、精製およびビオチン化
単一ドメイン（ＦＮ－Ｂ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ０２７５１、アイソフォーム７、アミノ酸Ｅ１２６５－Ｔ１３５５）としての、またはその周囲のＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ－６７Ｂ８９、アミノ酸Ｇ１０８０－Ｅ１４５５）に隣接する、組換えヒトフィブロネクチンＥＤＢは、本試験における標的タンパク質としての役割を果たし、ＥＤＢを含まないドメイン６～９（ＦＮ－６７８９）を対照として使用した。すべての変異体を、ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグを付けて大腸菌で発現させ、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって精製した。このために、コドン最適化したＤＮＡ配列がＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって合成され、これをｐＥＴ－２１ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）に導入した。タンパク質を、ＯＤ６００が約０．７に達するまで、３０℃、１２０ｒｐｍで、７５０ｍＬスケールで発現させた。タンパク質産生を誘導するために、７５０μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを主培養物に添加し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細胞を回収し、１０ｍＬの平衡化緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、ソニフィケーション（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０）によって溶解した。上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）ｐｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２０分で１０～５００ｍＭイミダゾールの線形勾配を使用して、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＩＭＡＣによって精製した。続いて、タンパク質をＰＢＳ（１４ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５）に対して４℃で一晩透析し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－６７８９の場合）または７５ｐｇ（ＦＮ－Ｂの場合）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製した。最終的に精製されたタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析ＳＥＣ、およびＥＤＢ特異的ＢＣ－１抗体（ａｂ１５４２１０、Ａｂｃａｍ）を使用したＥＬＩＳＡによって分析した。タンパク質を、－２０℃で５％マンニトールおよび５％トレハロースを添加したＰＢＳ中でアリコートとして保存した。
標的の発現、精製およびビオチン化
単一ドメイン（ＦＮ－Ｂ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｐ０２７５１、アイソフォーム７、アミノ酸Ｅ１２６５－Ｔ１３５５）としての、またはその周囲のＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ－６７Ｂ８９、アミノ酸Ｇ１０８０－Ｅ１４５５）に隣接する、組換えヒトフィブロネクチンＥＤＢは、本試験における標的タンパク質としての役割を果たし、ＥＤＢを含まないドメイン６～９（ＦＮ－６７８９）を対照として使用した。すべての変異体を、ｃ末端ヘキサヒスチジン（Ｈ６）タグを付けて大腸菌で発現させ、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって精製した。このために、コドン最適化したＤＮＡ配列がＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃによって合成され、これをｐＥＴ－２１ａ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）に導入した。タンパク質を、ＯＤ６００が約０．７に達するまで、３０℃、１２０ｒｐｍで、７５０ｍＬスケールで発現させた。タンパク質産生を誘導するために、７５０μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを主培養物に添加し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。細胞を回収し、１０ｍＬの平衡化緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０％グリセロール、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール）に再懸濁し、ソニフィケーション（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０）によって溶解した。上清を、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）ｐｌｕｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および２０分で１０～５００ｍＭイミダゾールの線形勾配を使用して、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのＩＭＡＣによって精製した。続いて、タンパク質をＰＢＳ（１４ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．５）に対して４℃で一晩透析し、ＨｉＬｏａｄ ２６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇ（ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－６７８９の場合）または７５ｐｇ（ＦＮ－Ｂの場合）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用したサイズ排除クロマトグラフィによってさらに精製した。最終的に精製されたタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、分析ＳＥＣ、およびＥＤＢ特異的ＢＣ－１抗体（ａｂ１５４２１０、Ａｂｃａｍ）を使用したＥＬＩＳＡによって分析した。タンパク質を、－２０℃で５％マンニトールおよび５％トレハロースを添加したＰＢＳ中でアリコートとして保存した。
【0260】
ＦＮ－Ｂ、ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－６７８９タンパク質を、製造者の紹介に従って、ＥＺ－Ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して第一級ＮＨ２基によってビオチン化した。
【0261】
ＦＮ－６７Ｂ８９標的タンパク質の品質管理
発現され、精製されたＦＮ－６７Ｂ８９タンパク質の品質を決定するために、９６ウェル形式でタンパク質間相互作用を分析する手法としてＥＬＩＳＡを使用した。最初の段階では、５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ ９．４の被覆緩衝液を使用して、アルカリ性条件下での受動吸収によって、１０μｇ／ｍＬの標的タンパク質を１００μＬの容量でＭａｘｉｓｏｒｂ（商標）９６ウェルプレートに被覆した。ＥＬＩＳＡプレートの被覆を４℃で一晩実施した。被覆緩衝液を除去した後、プレートを３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、３００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加した。ブロッキングを室温で２時間実施した。一次インキュベーションのために、プレートを３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ－Ｔで１：１０００に希釈した１００μＬのＢＣ－１抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨＲＰ結合抗マウス抗体（５５４００２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＨＲＰを介したＴＭＢ基質の変換によって抗原－抗体複合体を検出した。１００μＬのＴＭＢ基質をウェルに添加し、試料中に存在する分析物の量に比例して青色を発現させた。５０μＬの０．２Ｍ ＨＣｌを添加することによって発色を停止させ、４５０ｎｍで比吸光度を測定した。
発現され、精製されたＦＮ－６７Ｂ８９タンパク質の品質を決定するために、９６ウェル形式でタンパク質間相互作用を分析する手法としてＥＬＩＳＡを使用した。最初の段階では、５０ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ ９．４の被覆緩衝液を使用して、アルカリ性条件下での受動吸収によって、１０μｇ／ｍＬの標的タンパク質を１００μＬの容量でＭａｘｉｓｏｒｂ（商標）９６ウェルプレートに被覆した。ＥＬＩＳＡプレートの被覆を４℃で一晩実施した。被覆緩衝液を除去した後、プレートを３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、３００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中３％ＢＳＡ）を添加した。ブロッキングを室温で２時間実施した。一次インキュベーションのために、プレートを３００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳ－Ｔで１：１０００に希釈した１００μＬのＢＣ－１抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨＲＰ結合抗マウス抗体（５５４００２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を、１００μＬ／ウェルのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後に添加し、４℃で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回、ＰＢＳで３回洗浄した後、ＨＲＰを介したＴＭＢ基質の変換によって抗原－抗体複合体を検出した。１００μＬのＴＭＢ基質をウェルに添加し、試料中に存在する分析物の量に比例して青色を発現させた。５０μＬの０．２Ｍ ＨＣｌを添加することによって発色を停止させ、４５０ｎｍで比吸光度を測定した。
【0262】
ファージディスプレイによるＥＤＢ特異的リガンドの選択
ＥＤＢ特異的シスチンノットミニタンパク質を、モモルディカ・コキネンシス（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）からのトリプシン阻害剤ＩＩの開鎖変異体に基づく２つの異なるコンビナトリアルライブラリを使用したファージディスプレイによって選択した。どちらのライブラリもＭ１３ファージミド系に基づくが、適用されるランダム化スキームが異なる。ＭＣｏｐｔ１．０ライブラリでは、ループ１（６、９および１２アミノ酸の長さの相違を含む）および３、ならびにＮ末端の２つのアミノ酸がランダム化されているが、ＭＣｏｐｔ２．０ライブラリは、１０アミノ酸のみを有するループ１のランダム化によって構築された。さらに、ＭＣｏｐｔ１．０はメジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩによって提示され、ＭＣｏｐｔ２．０はｐＩＩＩによって提示されるため、ディスプレイの種類においても異なる。
ＥＤＢ特異的シスチンノットミニタンパク質を、モモルディカ・コキネンシス（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）からのトリプシン阻害剤ＩＩの開鎖変異体に基づく２つの異なるコンビナトリアルライブラリを使用したファージディスプレイによって選択した。どちらのライブラリもＭ１３ファージミド系に基づくが、適用されるランダム化スキームが異なる。ＭＣｏｐｔ１．０ライブラリでは、ループ１（６、９および１２アミノ酸の長さの相違を含む）および３、ならびにＮ末端の２つのアミノ酸がランダム化されているが、ＭＣｏｐｔ２．０ライブラリは、１０アミノ酸のみを有するループ１のランダム化によって構築された。さらに、ＭＣｏｐｔ１．０はメジャーコートタンパク質ｐＶＩＩＩによって提示され、ＭＣｏｐｔ２．０はｐＩＩＩによって提示されるため、ディスプレイの種類においても異なる。
【0263】
ストレプトアビジンで被覆した（ＳＡ）磁気ビーズに基づく合計３回のスクリーニングラウンドを各ライブラリで実施した。スクリーニングラウンドのために、２ｘ５０μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ２ｍＬチューブに移し、１ｍＬ ＴＢＳ－Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．４）で洗浄した。２００μＬのＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中の１００μｇのビオチン化ＦＮ－Ｂを最初のチューブに添加し、２００μＬのＴＢＳを標的なしで２番目のチューブに添加し（ファージの陰性選択）、ビーズを３０ｒｐｍで２０分間、ローリングミキサー上でインキュベートした。チューブを磁石に戻し、残りの溶液を廃棄し、ビーズをＴＢＳ－Ｔで２回洗浄した。ビーズを、４℃、３０ｒｐｍで１時間、ＴＢＳ中の２％粉乳（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）でブロックした。ビオチン化ＦＮ－Ｂ被覆ＳＡビーズをさらに３０分間ブロックし、一方７×１０１３（１回目のラウンド）または７×１０１２（２回目および３回目のラウンド）ファージを１ｍＬのＴＢＳ中２％粉乳中の被覆されていないＳＡビーズに添加し、室温、３０ｒｐｍで３０分間インキュベートした（陰性選択）。標的被覆ビーズのブロッキング溶液を廃棄し、ビーズをＴＢＳ－Ｔで２回洗浄し、陰性選択からのファージ上清を添加した。標的被覆ビーズをファージ懸濁液と共に室温および３０ｒｐｍで１時間インキュベートした。続いて、結合していないファージを洗い流し、ビーズをＴＢＳ－Ｔで６回、ＴＢＳで２回洗浄した。結合したファージを溶出するために、洗浄したビーズに５０μＬの１００ｍＭトリメチルアミン（ＴＥＡ）を添加して、ｐＨシフト溶出を行った。ＴＥＡビーズ懸濁液を３０００ｒｐｍで６分間インキュベートし、磁石に戻し、上清を、中和のために１００μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７を含む新しいチューブに移した。２番目の溶出段階は、５０μＬの１００ｍＭグリシン（ｐＨ２）を標的被覆ビーズに添加し、混合物をサーモミキサーにおいて最大ｒｐｍで１０分間インキュベートすることによって実施した。チューブを磁石に戻し、上清を最初の溶出からのＴｒｉｓ／ＴＥＡ混合物に移した。ファージ溶出液を使用して、ファージプール増幅のために指数関数的に増殖している大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を感染させた。０．５のＯＤ６００で１８００μＬの大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を溶出液に添加し、撹拌せずに３７℃で３０分間および１５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートした。次に、感染したＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンおよび０．４％グルコースを含む２つの大きな寒天プレートに分注し、３７℃で一晩インキュベートした後、翌日にファージレスキューを実施した。
【0264】
ファージレスキューのために、プレートごとに４ｍＬのＬＢ培地を分配し、細胞スクレーパで細胞をこすり取った。５０ｍＬの培養物を、最終ＯＤ６００が０．２になるように接種した。ＯＤ６００が０．５になるまで細胞を増殖させ、ファージミドベクターからファージを産生するために０．５×１０１２ ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に感染させた。大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ細胞を、撹拌せずに３７℃で３０分間インキュベートし、続いて１５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で３０分間インキュベートした。細菌懸濁液を４５００×ｇで１０分間、室温で遠心分離し、上清を廃棄した。タンパク質産生の誘導のために細菌ペレットを５０ｍＬ ＬＢ培地（１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、２５μｇ／ｍＬカナマイシン、１ｍＭ ＩＰＴＧを添加した）に取り、大腸菌ファージ産生培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで一晩増殖させた。４５００×ｇで１５分間、４℃で遠心分離して大腸菌細胞を回収した。１０ｍＬのＰＥＧ／ＮａＣｌ溶液（２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール、１５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）を４０ｍＬのファージ含有上清に添加し、逆さにし、氷上に３０分間置いた。１５．０００×ｇ、４℃で２０分間の遠心分離によってファージ粒子を沈殿させた。上清を廃棄し、ファージペレットを１６００μＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に取り、その後１５．０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。ファージ含有上清を再び４００μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌに添加し、氷上で２０分間インキュベートした。２回目のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿後、チューブを１５．０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。ファージペレットを８００μＬのＴｒｉｓ／ＨＣｌに再懸濁し、最終精製段階で１５分間６５℃に加熱した。ファージ懸濁液を１５．０００×ｇで１０分間、室温で遠心分離し、上清を採取し、２波長モードＯＤ２６９－ＯＤ３２０を使用してファージ粒子濃度を測光法で決定した。ファージ濃度を、Ｍ１３ファージのヌクレオチド含有量およびモル吸光係数に従って計算した（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．２００４）。
【0265】
選択されたシスチンノットミニタンパク質のヒット同定
同定工程では、ＰＣＲによってシスチンノットミニタンパク質配列を増幅するために、３回目のスクリーニングラウンドに由来する濃縮スクリーニングプールファージミドを調製した。チオレドキシンＡ融合変異体としてのシスチンノットミニタンパク質の発現を可能にするために、ＰＣＲインサートをｐＥＴ－３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の誘導体である発現ベクターｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘにクローニングした。このベクターは、細胞質での効率的なジスルフィド結合形成を可能にする大腸菌チオレドキシンＡ、迅速な精製のためのＨ６タグ、抗体による検出のためのｓタグ、および融合タグを除去するためのトロンビン切断部位をコードするＤＮＡ配列を連続的な順序で担持する。シスチンノットミニタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を、トロンビン切断部位の下流で、固有のＢａｍ ＨＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位を介してｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘベクターに導入した。ベクターを熱ショックによってＥ．ｃｏｌｉ ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に導入し、細胞を選択寒天プレートに播種した。単一コロニーを採取し、配列決定し、１ｍＬの自動誘導培地（ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での小規模発現のために９６ウェルプレートに移した。タンパク質生産を３０℃、２２０ｒｐｍで一晩行った。細胞を３０００ｘｇで１５分間の遠心分離によって回収し、凍結融解サイクルと組み合わせて０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中でインキュベートして溶解し、８０℃で１０分間加熱した。細胞破片を除去するための最後の遠心分離（３０００ｘｇ、１５分、４℃）の後、Ｅ－ＰＡＧＥ（商標）および結合分析のために上清を収集した。
同定工程では、ＰＣＲによってシスチンノットミニタンパク質配列を増幅するために、３回目のスクリーニングラウンドに由来する濃縮スクリーニングプールファージミドを調製した。チオレドキシンＡ融合変異体としてのシスチンノットミニタンパク質の発現を可能にするために、ＰＣＲインサートをｐＥＴ－３２ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）の誘導体である発現ベクターｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘにクローニングした。このベクターは、細胞質での効率的なジスルフィド結合形成を可能にする大腸菌チオレドキシンＡ、迅速な精製のためのＨ６タグ、抗体による検出のためのｓタグ、および融合タグを除去するためのトロンビン切断部位をコードするＤＮＡ配列を連続的な順序で担持する。シスチンノットミニタンパク質配列をコードするＤＮＡ断片を、トロンビン切断部位の下流で、固有のＢａｍ ＨＩおよびＫｐｎ Ｉ制限部位を介してｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘベクターに導入した。ベクターを熱ショックによってＥ．ｃｏｌｉ ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に導入し、細胞を選択寒天プレートに播種した。単一コロニーを採取し、配列決定し、１ｍＬの自動誘導培地（ＭａｇｉｃＭｅｄｉａ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での小規模発現のために９６ウェルプレートに移した。タンパク質生産を３０℃、２２０ｒｐｍで一晩行った。細胞を３０００ｘｇで１５分間の遠心分離によって回収し、凍結融解サイクルと組み合わせて０．１ｍｇ／ｍＬリゾチーム（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）および５Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含む緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中でインキュベートして溶解し、８０℃で１０分間加熱した。細胞破片を除去するための最後の遠心分離（３０００ｘｇ、１５分、４℃）の後、Ｅ－ＰＡＧＥ（商標）および結合分析のために上清を収集した。
【0266】
Ｅ－ＰＡＧＥ（商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、生成され、熱精製されたタンパク質を定量化するために、９６プローブを並行して同時に分析するためのハイスループットゲルシステムとして使用した。Ｅ－ＰＡＧＥ（商標）分析は、製造者の指示に従って実施した。
【0267】
タンパク質間相互作用を分析するための手法としてＥＬＩＳＡを使用した。９６ウェルマイクロタイタプレート（Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の穴を、１μｇ ＦＮ－Ｂ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｅｕｒｏｂｉｏ）、乳粉、ストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｔ７－Ｈｉｓ－ＴＥＶ－Ｂ（ＬＤ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、ＦＮ－Ｂ（８－１４）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、リゾチーム、オボアルブミン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、アルドラーゼ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、または０．６μｇの抗ｃ－ｍｙｃ抗体（Ｍ４４３９、Ｓｉｇｍａ）で、４℃にて一晩被覆した。ウェルをＰＢＳ－Ｔ（０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１ｘＰＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳで希釈した１ｘカゼイン緩衝液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温にて２時間ブロックし、記載したように再度洗浄した。それぞれの熱精製融合タンパク質を含む２０μＬの上清を８０μＬのＰＢＳ－ＴまたはＰＢＳ－Ｔで希釈した２００ｎＭのＭＣ－Ｍｙｃ－０１０融合タンパク質（抗ｃ－ｍｙｃ抗体を含むウェル）に添加し、穴に適用し、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗Ｓタグ抗体（ａｂ１８５８９またはａｂ１９３２４、Ａｂｃａｍ）でそれぞれの変異体の結合を検出した。酵素反応を、ＴＭＢを発色基質として用いて測定し、約５分後に０．２Ｍ ＨＣｌで停止させた。４５０ｎｍでの吸光度の測定は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＰＲＯマイクロプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ）を使用して実施した。
【0268】
異なるプレート間で結合シグナルを比較するために、ＥＬＩＳＡシグナルを内部プレート対照（ｃ－ｍｙｃ結合）に対して正規化した。次に、正規化したＦＮ－Ｂシグナルを正規化したＢＳＡシグナルに参照して、選択されたシスチンノットミニタンパク質の結合能力を評価した。さらに、標的結合シグナルはタンパク質発現率と相関しており、ヒットを同定するためのランキング値が得られた。
【0269】
組換えシスチンノットミニタンパク質の生産
組換えタンパク質の生産を、それぞれのシスチンノットミニタンパク質配列をコードするｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘベクターを担持するＥ．ｃｏｌｉ ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞を使用して、３０℃、１２０ｒｐｍにて７５０ｍＬスケールで実施した。培養物が約０．７のＯＤ６００に達した後、７５０μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを添加し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートすることによって産生の誘導を達成した。大腸菌細胞を回収し、１０ｍＬの平衡化緩衝液に再懸濁し、ソニフィケーションによって溶解し、１０分間８０℃に加熱した。細胞破片を遠心分離（１５．０００×ｇ、４℃で３０分間）した後、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）ｐｌｕｓシステムおよび２０分で１０～５００ｍＭイミダゾールの線形勾配を使用して、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラムでのＩＭＡＣによって上清を精製した。シスチンノットミニタンパク質融合タンパク質含有画分を収集し、トロンビン切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２および５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．４５）に対して４℃で一晩透析した。
組換えタンパク質の生産を、それぞれのシスチンノットミニタンパク質配列をコードするｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘベクターを担持するＥ．ｃｏｌｉ ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞を使用して、３０℃、１２０ｒｐｍにて７５０ｍＬスケールで実施した。培養物が約０．７のＯＤ６００に達した後、７５０μＬの１Ｍ ＩＰＴＧを添加し、２５℃、１２０ｒｐｍで一晩インキュベートすることによって産生の誘導を達成した。大腸菌細胞を回収し、１０ｍＬの平衡化緩衝液に再懸濁し、ソニフィケーションによって溶解し、１０分間８０℃に加熱した。細胞破片を遠心分離（１５．０００×ｇ、４℃で３０分間）した後、ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（商標）ｐｌｕｓシステムおよび２０分で１０～５００ｍＭイミダゾールの線形勾配を使用して、１ｍＬ ＨｉｓＴｒａｐカラムでのＩＭＡＣによって上清を精製した。シスチンノットミニタンパク質融合タンパク質含有画分を収集し、トロンビン切断緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＣａＣｌ２および５％（ｗ／ｖ）グリセロール、ｐＨ８．４５）に対して４℃で一晩透析した。
【0270】
融合タンパク質は、ＥＬＩＳＡベースのアッセイに直接使用するか、または例えばＳＰＲ分析のために、タグなしのミニタンパク質が必要な場合はさらに処理した。このために、融合タンパク質を１ｍｇタンパク質あたり０．５Ｕのトロンビン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で切断し、３７℃で一晩インキュベートした。
【0271】
タンパク質断片の分離を、０．０５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加したＨ２Ｏ中の２～８０％アセトニトリルの線形勾配を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）および３ｍＬ ＲＥＳＯＵＲＣＥ（商標）ＲＰＣカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた逆相クロマトグラフィによって実施した。シスチンノットミニタンパク質を含むそれぞれの画分を、最終段階としてＲＶＣ ２－１８－ＣＤ Ｐｌｕｓ ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｃｈｒｉｓｔ）で凍結乾燥した。シスチンノットミニタンパク質の量を秤量によって決定し、ペプチドを－２０℃で凍結乾燥形態で保存した。標準的なエレクトロスプレーイオン化プロトコルを使用したＬＣＭＳ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄ Ｇ６１３０Ｂ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）での質量分析によって同一性を検証した。
【0272】
選択されたＭＣ－ＦＮ－０１０のアラニンスキャニング変異誘発
ＥＤＢ結合に寄与するＭＣ－ＦＮ－０１０内の残基を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施した。この方法は、定義された配列位置のアラニンに対するアミノ酸の体系的な置換と、生成された変異体のその後の結合分析を含む。アラニンスキャニングを生成するために、ＭＣ－ＦＮ－０１０誘導体の変異をＰＣＲによって導入するか、またはＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）断片（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の直接合成によってコード配列全体を構築した。それぞれのＤＮＡ断片を、固有のＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限部位を使用してｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘ発現ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に導入した。すべての変異をＤＮＡ塩基配列決定によって検証した。アラニンスキャニング変異誘発変異体を、５ｍＬの選択的自己誘導培地を使用して２４ウェル形式で発現させた。生産および融合タンパク質の精製は、９６ウェル形式について上述したように実施したが、ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ－ＮＴＡスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した上清のさらなる精製段階を含んだ。シスチンノット融合タンパク質の標的タンパク質およびオフターゲットタンパク質への結合能力および特異性は、上記のように抗体ベースのＥＬＩＳＡアッセイを用いて実施した。
ＥＤＢ結合に寄与するＭＣ－ＦＮ－０１０内の残基を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を実施した。この方法は、定義された配列位置のアラニンに対するアミノ酸の体系的な置換と、生成された変異体のその後の結合分析を含む。アラニンスキャニングを生成するために、ＭＣ－ＦＮ－０１０誘導体の変異をＰＣＲによって導入するか、またはＧｅｎｅＡｒｔ（商標）Ｓｔｒｉｎｇｓ（商標）断片（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の直接合成によってコード配列全体を構築した。それぞれのＤＮＡ断片を、固有のＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ制限部位を使用してｐＥＴ－３２－ＬｉｂＥｘ発現ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＳＨｕｆｆｌｅ（登録商標）Ｔ７ Ｅｘｐｒｅｓｓコンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）に導入した。すべての変異をＤＮＡ塩基配列決定によって検証した。アラニンスキャニング変異誘発変異体を、５ｍＬの選択的自己誘導培地を使用して２４ウェル形式で発現させた。生産および融合タンパク質の精製は、９６ウェル形式について上述したように実施したが、ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ－ＮＴＡスピンカラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した上清のさらなる精製段階を含んだ。シスチンノット融合タンパク質の標的タンパク質およびオフターゲットタンパク質への結合能力および特異性は、上記のように抗体ベースのＥＬＩＳＡアッセイを用いて実施した。
【0273】
表面プラズモン共鳴分光法
単量体および三量体のシスチンノットミニタンパク質リガンドの標的タンパク質への結合速度論を、ＰＢＳ－Ｔをランニング緩衝液として用いるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して決定した。このために、ビオチン化ＦＮ－６７Ｂ８９タンパク質（２００～３００μｇ／ｍＬ）を、ＳＡセンサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のフローセルに結合することによって捕捉した。単量体リガンドを分析するために、最大７５０応答単位（ＲＵ）の固定化標的密度を適用し、三量体変異体については、最大４００のＲＵを目指した。５０～４０００ｎＭの範囲の濃度でマルチサイクル速度論的方法を使用して、単量体リガンドの結合分析を実施した。サイクルを９０秒の結合期間で開始し、続いて４２０秒の解離期間と最後の再生段階を実施した。２０μＬ／分の流量を適用して速度論的測定を実施した。三量体変異体は、同じ結合および解離条件下で分析したが、３０μＬ／ｍＬの一定流量で単一サイクルの速度論的測定モードを使用した。この場合、分析物の濃度は１．２５ｎＭ～１０ｎＭであった。結合速度論および定常状態分析は、グローバル速度論適合モデル（１：１ラングミュア、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して計算した。
単量体および三量体のシスチンノットミニタンパク質リガンドの標的タンパク質への結合速度論を、ＰＢＳ－Ｔをランニング緩衝液として用いるＢｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して決定した。このために、ビオチン化ＦＮ－６７Ｂ８９タンパク質（２００～３００μｇ／ｍＬ）を、ＳＡセンサチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）のフローセルに結合することによって捕捉した。単量体リガンドを分析するために、最大７５０応答単位（ＲＵ）の固定化標的密度を適用し、三量体変異体については、最大４００のＲＵを目指した。５０～４０００ｎＭの範囲の濃度でマルチサイクル速度論的方法を使用して、単量体リガンドの結合分析を実施した。サイクルを９０秒の結合期間で開始し、続いて４２０秒の解離期間と最後の再生段階を実施した。２０μＬ／分の流量を適用して速度論的測定を実施した。三量体変異体は、同じ結合および解離条件下で分析したが、３０μＬ／ｍＬの一定流量で単一サイクルの速度論的測定モードを使用した。この場合、分析物の濃度は１．２５ｎＭ～１０ｎＭであった。結合速度論および定常状態分析は、グローバル速度論適合モデル（１：１ラングミュア、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ－１００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して計算した。
【0274】
免疫蛍光染色
免疫蛍光染色のために、凍結保存された腫瘍または脳の小片を５ミクロンの厚さの切片に切断し、氷冷アセトンで５分間固定し、風乾した。次に、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で室温にて５分間、スライドをブロックした。ＥＤＢを染色するために、１μｇのそれぞれのビオチン化シスチンノットミニタンパク質を、２．９μｇのストレプトアビジン－Ｃｙ３複合体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次に、あらかじめ形成した複合体を腫瘍切片に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでスライドを３回洗浄した。ＣＤ３１染色を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈したラット抗マウスＣＤ３１ ＩｇＧ抗体（クローン３９０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して３７℃で３０分間実施した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞核を、ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨｏｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温で３０分間染色した。スライドを上記のように再度洗浄し、封入剤（Ｄａｋｏ）の薄層中で、カバーガラスで覆った。Ｚｅｉｓｓ Ａｐｏｔｏｍｅ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で画像を捕捉し、ＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
免疫蛍光染色のために、凍結保存された腫瘍または脳の小片を５ミクロンの厚さの切片に切断し、氷冷アセトンで５分間固定し、風乾した。次に、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で室温にて５分間、スライドをブロックした。ＥＤＢを染色するために、１μｇのそれぞれのビオチン化シスチンノットミニタンパク質を、２．９μｇのストレプトアビジン－Ｃｙ３複合体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次に、あらかじめ形成した複合体を腫瘍切片に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでスライドを３回洗浄した。ＣＤ３１染色を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈したラット抗マウスＣＤ３１ ＩｇＧ抗体（クローン３９０、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して３７℃で３０分間実施した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞核を、ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨｏｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温で３０分間染色した。スライドを上記のように再度洗浄し、封入剤（Ｄａｋｏ）の薄層中で、カバーガラスで覆った。Ｚｅｉｓｓ Ａｐｏｔｏｍｅ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で画像を捕捉し、ＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。
【0275】
ペプチド合成
三量体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（ＡＦ６８０）結合リガンドおよびＮ末端ビオチン化ミニタンパク質をＰｅｐｓｃａｎから購入した。得られたすべてのペプチド構築物は、１００μｇのアリコートとして－２０℃で保存した。実験のために、すべてのペプチドを１００μＬのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に溶解し、１μｇ／μＬの濃度にした。すべての構築物について、ＥＳＩ質量分析によって同一性を検証し、分析逆相クロマトグラフィ（Ｐｅｐｓｃａｎ）によって純度を分析した。さらに、標的結合特性（ＦＮ－６７Ｂ８９への結合）および特異性（ＦＮ－６７８９への結合）を特徴付けるために、三量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＰＲによって分析した。
三量体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０（ＡＦ６８０）結合リガンドおよびＮ末端ビオチン化ミニタンパク質をＰｅｐｓｃａｎから購入した。得られたすべてのペプチド構築物は、１００μｇのアリコートとして－２０℃で保存した。実験のために、すべてのペプチドを１００μＬのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に溶解し、１μｇ／μＬの濃度にした。すべての構築物について、ＥＳＩ質量分析によって同一性を検証し、分析逆相クロマトグラフィ（Ｐｅｐｓｃａｎ）によって純度を分析した。さらに、標的結合特性（ＦＮ－６７Ｂ８９への結合）および特異性（ＦＮ－６７８９への結合）を特徴付けるために、三量体をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＳＰＲによって分析した。
【0276】
Ｕ－８７ ＭＧ異種移植マウスモデル
ヒト神経膠芽腫Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ）細胞株を、無菌条件下に３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で、１０％ＦＣＳを添加したＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。
ヒト神経膠芽腫Ｕ－８７ ＭＧ（ＡＴＣＣ）細胞株を、無菌条件下に３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で、１０％ＦＣＳを添加したＥＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ）で培養した。
【0277】
マウスは、ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＡＧの動物施設に収容し、すべての動物プロトコルはＴｉｅｒｓｃｈｕｔｚｋｏｍｍｉｓｉｏｎ ｄｅｓ Ｌａｎｄｅｓｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｓａｍｔｓ Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ－Ｐｆａｌｚによって承認された。体重が約２５～２８ｇの範囲の４週齢のＦｏｘ ｎ１／ｎｕマウスをＪａｎｖｉｅｒから入手した。異種移植マウスの試験のために、７ｘ１０６個のヒトＵ－８７ ＭＧ細胞をＦｏｘ ｎ１／ｎｕマウスの右側腹部に皮下注射し、腫瘍を約５週間増殖させた。楕円体式
を用いて皮下腫瘍の大きさを決定した。腫瘍体積が１００～１２００ｍｍ３のすべての動物を試験に含め、マウスを実験コホートに無作為に割り当てた。
【数1】
【0278】
インビボおよびエクスビボイメージング
三量体構築物の生体内分布および腫瘍標的化の分析のために、所望の腫瘍サイズを担持するマウスを含めた。すべての三量体構築物を、最終容量１００μｌのＰＢＳ緩衝液（３．３４ｎｍｏｌ／マウス）中で眼球後静脈叢を介して静脈内注射した。マウス（各構築物についてｎ＝３）を、６１５～６６５ｎｍの励起範囲を使用し、６９５～７７０ｎｍで発光シグナルをモニタリングして、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。画像化工程を注射の１時間後、２時間後または６時間後に実施し、安楽死させた後、腫瘍と特定の器官を切除し、画像化し、秤量し、さらなる分析のために凍結保存した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、目的の領域の蛍光強度を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで二元配置分散分析を使用した三重に反復したデータセットに基づいて統計的有意性を計算した。
三量体構築物の生体内分布および腫瘍標的化の分析のために、所望の腫瘍サイズを担持するマウスを含めた。すべての三量体構築物を、最終容量１００μｌのＰＢＳ緩衝液（３．３４ｎｍｏｌ／マウス）中で眼球後静脈叢を介して静脈内注射した。マウス（各構築物についてｎ＝３）を、６１５～６６５ｎｍの励起範囲を使用し、６９５～７７０ｎｍで発光シグナルをモニタリングして、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。画像化工程を注射の１時間後、２時間後または６時間後に実施し、安楽死させた後、腫瘍と特定の器官を切除し、画像化し、秤量し、さらなる分析のために凍結保存した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して、目的の領域の蛍光強度を定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで二元配置分散分析を使用した三重に反復したデータセットに基づいて統計的有意性を計算した。
【0279】
実施例２：ＥＤＢ特異的リガンドのスクリーニングおよび選択
シスチンノットミニタンパク質は腫瘍イメージングの薬剤として理想的に適することが示されているため（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｖｅｉｓｅｈ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１４）、標的結合リガンドを選択するためのコンビナトリアルファージライブラリ構築の基礎として、モモルディカ・コキネンシストリプシン阻害剤－ＩＩ（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）の開鎖配列を使用した（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０００）。第１のライブラリ（ＭＣｏｐｔ １．０）は、最初のループにランダム化されたアミノ酸、３番目のループに散在する位置、および最初のシステインの前に２つの可変残基を有する配列を含む。シスチンノットミニタンパク質配列を、Ｍ１３ファージのメジャーコートタンパク質（ｐＶＩＩＩ）に遺伝的に融合した。さらに、第２のライブラリ（ＭＣｏｐｔ ２．０）は、配列の最初のループでのランダム化、およびＭ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）によるタンパク質の提示を用いて開発した。したがって、ライブラリは、ランダム化されたループ位置と配列の長さ、およびタンパク質提示価で区別され、これはリガンド選択の結果の変動性につながり得る。卵巣または滑膜細胞の間質を除くほとんどの正常組織には存在しないが、様々な腫瘍実体で高度に発現されることが公知である（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９４）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に対するシスチンノットミニタンパク質を同定するために、両方のライブラリを並行して適用した。
シスチンノットミニタンパク質は腫瘍イメージングの薬剤として理想的に適することが示されているため（Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．２００９；Ｓｏｒｏｃｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．１９９８；Ｖｅｉｓｅｈ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０；Ｈａｃｋｅｌ ｅｔ ａｌ．２０１３；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．２０１４）、標的結合リガンドを選択するためのコンビナトリアルファージライブラリ構築の基礎として、モモルディカ・コキネンシストリプシン阻害剤－ＩＩ（ｏＭＣｏＴＩ－ＩＩ）の開鎖配列を使用した（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．２０００）。第１のライブラリ（ＭＣｏｐｔ １．０）は、最初のループにランダム化されたアミノ酸、３番目のループに散在する位置、および最初のシステインの前に２つの可変残基を有する配列を含む。シスチンノットミニタンパク質配列を、Ｍ１３ファージのメジャーコートタンパク質（ｐＶＩＩＩ）に遺伝的に融合した。さらに、第２のライブラリ（ＭＣｏｐｔ ２．０）は、配列の最初のループでのランダム化、およびＭ１３ファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）によるタンパク質の提示を用いて開発した。したがって、ライブラリは、ランダム化されたループ位置と配列の長さ、およびタンパク質提示価で区別され、これはリガンド選択の結果の変動性につながり得る。卵巣または滑膜細胞の間質を除くほとんどの正常組織には存在しないが、様々な腫瘍実体で高度に発現されることが公知である（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．１９８９；Ｃａｓｔｅｌｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９４）フィブロネクチンエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）に対するシスチンノットミニタンパク質を同定するために、両方のライブラリを並行して適用した。
【0280】
その後のスクリーニングおよびヒット同定工程に適した標的および対照タンパク質を生成するために、単一のＥＤＢドメイン（ＦＮ－Ｂ）、周囲のＩＩＩ型ドメインに隣接するＥＤＢ（ＦＮ－６７Ｂ８９）、およびＥＤＢなしのＩＩＩ型ドメイン６～９（ＦＮ－６７８９）を組換え生産した。図１Ａに示すように、すべてのＦＮ変異体の正しいタンパク質サイズを確認することができ、得られた純度は９３％を上回った。ＥＤＢを含むフィブロネクチンとＥＤＢを含まないフィブロネクチンを区別するモノクローナル抗体（ＢＣ－１）を使用することによって（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．１９９２）、ＦＮ－６７Ｂ８９タンパク質の天然の折り畳みを評価した。さらに、Ｃ末端のＨ６タグをすべてのＦＮ融合タンパク質で検出した（図１Ｂ）。両方のファージライブラリをビオチン化ＦＮ－Ｂに対して３回の連続するラウンドでスクリーニングし、完了後、４６個の単一クローンを配列決定した。ＭＣｏｐｔ １．０スクリーニングでは、１つのシスチンノットミニタンパク質が強く濃縮され、プールの４０％を占めた。さらに、他の２つのシスチンノットミニタンパク質クローンは４％と２％で濃縮された（図２）。ＭＣｏｐｔ ２．０スクリーニングの場合は、３つの異なるシスチンノットミニタンパク質クローンが、全配列の１３％、１０％および２％の割合で濃縮された。興味深いことに、６つの増幅された配列のうち５つは、ループ１のｃ末端に共通のＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフを含む（図２）。
【0281】
これらの所見に促されて、ＭＣｏｐｔ １．０ライブラリのスクリーニングから得られた濃縮配列のＦＮ－Ｂ結合能力を評価した。この目的のために、シスチンノットミニタンパク質を発現させ、９６ウェルミニスケール形式でチオレドキシン、ｈｉｓタグおよびｓタグにＣ末端融合させた（Ｔｒｘ－シスチンノットミニタンパク質）。タンパク質のＦＮ－ＢおよびＢＳＡへの結合をＥＬＩＳＡで検定し、さらに各クローンの発現率をＥ－ＰＡＧＥ（登録商標）分析によって決定した。得られたシグナル対ノイズ比と発現値に基づいて、ＦＮ－Ｂ相互作用の尺度として各候補物のランキングスコアを計算した。３つの異なるＴｒｘ－シスチンノットミニタンパク質変異体は、ＢＳＡ対照と比較してＦＮ－Ｂへの相互作用の増加を示し（図３）、配列は、予想されたようにスクリーニングプールからの濃縮クローンに対応する。これら３つの候補物およびＭＣｏｐｔ２．０スクリーニングからのＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフ含有クローンを、その後のより綿密な結合分析のために含めた。
【0282】
実施例３：濃縮されたシスチンノットミニタンパク質候補物の特異性分析
次に、社内で生産したＥＤＢ標的タンパク質（ＦＮ－ＢおよびＦＮ－６７Ｂ８９）、ならびにオフターゲットタンパク質（ＦＮ－６７８９）および様々な対照タンパク質（粉乳、ストレプトアビジンおよびウシ血清アルブミン）を使用して、残りの６つのシスチンノットミニタンパク質の標的結合特異性に焦点を合わせた。エクストラドメインＢを欠くフィブロネクチンは多くの異なる細胞型によって発現されるため、ＦＮ－６７８９は完全に対応するオフターゲットタンパク質である（Ｍａｏ ｕｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ ２００５）。すべての候補物は、組換えＦＮ－ＢおよびＦＮ－６７Ｂ８９標的タンパク質に対して同等に高い妥当なＥＤＢ標的結合を示す（図４）。共通のＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフに基づいて選択した変異体（ＭＣｏｐｔ １．０－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２／－３）は、中程度から低いオフターゲットおよび対照タンパク質シグナルを示した。ＭＣｏｐｔ １．０－２およびＭＣｏｐｔ １．０－３はＭＣｏｐｔ １．０ヒット同定で既に同定されたが、ＭＣｏｐｔ ２．０－１、－２および－３は、それらの共通のモチーフに基づいてＭＣｏｐｔ ２．０プールからのみ同定され、したがって以前のＦＮ－Ｂ標的結合では検定されなかった。しかしながら、Ｒ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフを含まないＭＣｏｐｔ １．０－１は、オフターゲットＦＮ－６７８９および粉乳を除くすべての対照タンパク質への高い相互作用が観察されたため、特異性評価ができなかった。これらのデータは、観察されたアミノ酸モチーフがＥＤＢ結合に関連することを強く示す。
次に、社内で生産したＥＤＢ標的タンパク質（ＦＮ－ＢおよびＦＮ－６７Ｂ８９）、ならびにオフターゲットタンパク質（ＦＮ－６７８９）および様々な対照タンパク質（粉乳、ストレプトアビジンおよびウシ血清アルブミン）を使用して、残りの６つのシスチンノットミニタンパク質の標的結合特異性に焦点を合わせた。エクストラドメインＢを欠くフィブロネクチンは多くの異なる細胞型によって発現されるため、ＦＮ－６７８９は完全に対応するオフターゲットタンパク質である（Ｍａｏ ｕｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ ２００５）。すべての候補物は、組換えＦＮ－ＢおよびＦＮ－６７Ｂ８９標的タンパク質に対して同等に高い妥当なＥＤＢ標的結合を示す（図４）。共通のＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフに基づいて選択した変異体（ＭＣｏｐｔ １．０－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２／－３）は、中程度から低いオフターゲットおよび対照タンパク質シグナルを示した。ＭＣｏｐｔ １．０－２およびＭＣｏｐｔ １．０－３はＭＣｏｐｔ １．０ヒット同定で既に同定されたが、ＭＣｏｐｔ ２．０－１、－２および－３は、それらの共通のモチーフに基づいてＭＣｏｐｔ ２．０プールからのみ同定され、したがって以前のＦＮ－Ｂ標的結合では検定されなかった。しかしながら、Ｒ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフを含まないＭＣｏｐｔ １．０－１は、オフターゲットＦＮ－６７８９および粉乳を除くすべての対照タンパク質への高い相互作用が観察されたため、特異性評価ができなかった。これらのデータは、観察されたアミノ酸モチーフがＥＤＢ結合に関連することを強く示す。
【0283】
次に、市販のＴ７－ＴＥＶ－Ｂ（ＬＤ ＢｉｏＰｈａｒｍａ）、Ｔ７－ＴＥＶ Ｎ末端隣接ＥＤＢドメイン、およびＦＮ－Ｂ（８－１４）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃ末端ドメイン８～１３およびドメイン１４の１／２を有するＥＤＢも含めることにより、５つの有望な候補物のＥＤＢ特異性をさらに評価した。この場合もやはり、結合シグナルは、試験したすべてのＥＤＢ含有標的タンパク質について同等に高く、オフターゲットシグナルは比較的低かった（図５）。使用したすべての標的タンパク質がＥＤＢを異なる形式で、すなわちＥＤＢ単独で（ＦＮ－Ｂ）、人工Ｎ末端構築物に隣接して（Ｔ７－Ｈｉｓ－ＴＥＶ）、天然のＣ末端およびＮ末端ＩＩＩ型ドメインに隣接して（ＦＮ－６７Ｂ８９）、ならびにその近接する天然のＣ末端ＩＩＩ型ドメインに隣接して（ＦＮ－Ｂ（８－１４））提示するため、観察された結合活性は実際にＥＤＢセンターピースに特異的であると結論付けることができる。
【0284】
最後に、図６に示すように、異なる受容体飽和濃度を有する、ＦＮ－Ｂ、ＦＮ－６７Ｂ８９およびＦＮ－Ｂ（８－１４）に対する４つのＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフ含有候補物（ＭＣｏｐｔ １．０－２／－３およびＭＣｏｐｔ ２．０－１／－２）の用量依存的結合データを生成した。ＦＮ－６７８９オフターゲットに対して観察されるバックグラウンドシグナルは、一般に、すべてのＥＤＢ含有標的タンパク質よりもはるかに低く、ＦＮ－６７８９とＥＤＢのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインが明確に区別されていることを示す。以前に特異性ＥＬＩＳＡで既に見られたように、クローンＭＣｏｐｔ ２．０－３は、ＦＮ－６７８９オフターゲットに対する高度な非特異的結合を示す。クローンＭＣｏｐｔ ２．０－３は、ＥＤＢ標的結合において重要な機能を有すると考えられる共通のＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）モチーフを共有するが、ランダム化されたシスチンノットミニタンパク質ループ１の他の残基は、例えば疎水性相互作用に起因して、非特異的結合を促進する可能性がある。
【0285】
次に、造影剤としてのシスチンノットミニタンパク質の意図される用途のために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によってタグなしのタンパク質の結合能力を検討した。驚くべきことに、ＭＣｏｐｔ １．０－３のみが、試験した５０～１０００ｎＭの濃度範囲で５つの候補物すべてにわたってＦＮ－６７Ｂ８９標的タンパク質に対する強い結合を明らかにした（データは示していない）。したがって、以下ではＭＣ－ＦＮ－０１０と呼ばれる、ＭＣｏｐｔ １．０－３を、さらなる分析と光学イメージングプローブの開発のために選択した。
【0286】
実施例４：ＭＣ－ＦＮ－０１０結合部位のマッピング
異なる選択されたシスチンノットミニタンパク質におけるアミノ酸モチーフＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）についての以前の所見は、既にＥＤＢ結合への高い配列寄与を示唆したが、その後、その関連性を実験的により詳細に評価した。ＭＣ－ＦＮ－０１０標的配列における単一アラニン置換を取り上げ、合計で１４の誘導体構築物を得た（図７Ａに示すように、ＭＣ－ＦＮ－０１１からＭＣ－ＦＮ－０１１４まで連続的に番号を付している）。すべての構築物を単一ドメインＦＮ－Ｂに対して試験した。予想されたように、配列の先頭にアラニン交換を有する７つの構築物は、依然として強い標的相互作用を示し、これらの位置がＥＤＢ結合にとって重要ではないことを示唆した。対照的に、共通のモチーフ位置に交換を有する４つの構築物は、結合の喪失を明らかにした。５番目のループでのさらなるアラニン置換は、標的相互作用の減少をもたらし、その関連性も示した（図７Ｂ）。これらの結果は、図７Ｃに要約されているように、最初のループ（ＲＩＲＬ）の４つのアミノ酸残基および５番目のループのアルギニン残基が、ＦＮ－６７Ｂ８９への結合相互作用に直接影響するか、またはミニタンパク質の立体配座に間接的な影響を及ぼすことを確認する。
異なる選択されたシスチンノットミニタンパク質におけるアミノ酸モチーフＲ－Ｉ／Ｖ－Ｒ－（Ｌ）についての以前の所見は、既にＥＤＢ結合への高い配列寄与を示唆したが、その後、その関連性を実験的により詳細に評価した。ＭＣ－ＦＮ－０１０標的配列における単一アラニン置換を取り上げ、合計で１４の誘導体構築物を得た（図７Ａに示すように、ＭＣ－ＦＮ－０１１からＭＣ－ＦＮ－０１１４まで連続的に番号を付している）。すべての構築物を単一ドメインＦＮ－Ｂに対して試験した。予想されたように、配列の先頭にアラニン交換を有する７つの構築物は、依然として強い標的相互作用を示し、これらの位置がＥＤＢ結合にとって重要ではないことを示唆した。対照的に、共通のモチーフ位置に交換を有する４つの構築物は、結合の喪失を明らかにした。５番目のループでのさらなるアラニン置換は、標的相互作用の減少をもたらし、その関連性も示した（図７Ｂ）。これらの結果は、図７Ｃに要約されているように、最初のループ（ＲＩＲＬ）の４つのアミノ酸残基および５番目のループのアルギニン残基が、ＦＮ－６７Ｂ８９への結合相互作用に直接影響するか、またはミニタンパク質の立体配座に間接的な影響を及ぼすことを確認する。
【0287】
実施例５：腫瘍組織に対する親ＭＣ－ＦＮ－０１０ミニタンパク質の特異性分析
さらに、微小環境に天然のＥＤＢタンパク質を含むＵ－８７ ＭＧ腫瘍異種移植片切片を使用して、細胞状況内での親ＭＣ－ＦＮ－０１０の特異性を検討した。ヒト神経膠芽腫腫瘍は、血管構造にフィブロネクチンＥＤＢアイソフォームを保有することが公知である（Ｍａｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。アラニンスキャニング変異誘発に基づいて、３つの位置（ＰＭＣＴＱＲＡＮＲＩＡＡＣＲＲＤＳＤＣＴＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ）にアラニン置換を有する陰性対照構築物（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）を生成した。免疫蛍光イメージング実験のために、ビオチン化形式としてのＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１１５をＣｙ３標識ストレプトアビジンで四量体化した。四量体化されたＭＣ－ＦＮ－０１０－ｂｉｏは、血管マーカと見なされる、内皮細胞の遍在的に発現される表面タンパク質、ＣＤ３１に対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合抗体で確認されたように、血管周囲の領域をほぼ単独で装飾した（図８）。Ｃｙ３とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の重ね合わせ画像は、血管に関連する両方の蛍光シグナルの共局在を示す。さらに、周りの血管周囲領域における四量体化ＭＣ－ＦＮ－０１０の局在を検出することができた。対照的に、陰性対照構築物ＭＣ－ＦＮ－０１１５で染色されたＵ－８７ ＭＧ腫瘍切片は、蛍光シグナルを全く示さなかった（図８）。四量体化されたＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１１５の蛍光シグナルは、正常なマウスの脳切片では観察されなかった（図１２）。
さらに、微小環境に天然のＥＤＢタンパク質を含むＵ－８７ ＭＧ腫瘍異種移植片切片を使用して、細胞状況内での親ＭＣ－ＦＮ－０１０の特異性を検討した。ヒト神経膠芽腫腫瘍は、血管構造にフィブロネクチンＥＤＢアイソフォームを保有することが公知である（Ｍａｒｉａｎｉ ｅｔ ａｌ．１９９７）。アラニンスキャニング変異誘発に基づいて、３つの位置（ＰＭＣＴＱＲＡＮＲＩＡＡＣＲＲＤＳＤＣＴＧＡＣＩＣＲＧＮＧＹＣＧ）にアラニン置換を有する陰性対照構築物（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）を生成した。免疫蛍光イメージング実験のために、ビオチン化形式としてのＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１１５をＣｙ３標識ストレプトアビジンで四量体化した。四量体化されたＭＣ－ＦＮ－０１０－ｂｉｏは、血管マーカと見なされる、内皮細胞の遍在的に発現される表面タンパク質、ＣＤ３１に対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７結合抗体で確認されたように、血管周囲の領域をほぼ単独で装飾した（図８）。Ｃｙ３とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７の重ね合わせ画像は、血管に関連する両方の蛍光シグナルの共局在を示す。さらに、周りの血管周囲領域における四量体化ＭＣ－ＦＮ－０１０の局在を検出することができた。対照的に、陰性対照構築物ＭＣ－ＦＮ－０１１５で染色されたＵ－８７ ＭＧ腫瘍切片は、蛍光シグナルを全く示さなかった（図８）。四量体化されたＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１１５の蛍光シグナルは、正常なマウスの脳切片では観察されなかった（図１２）。
【0288】
実施例６：ＦＮ－６７Ｂ８９へのシスチンノットミニタンパク質の結合および親和性
標的タンパク質を診断ツールとして使用する前に、それらを造影剤と特異的に結合させる必要がある（Ｓｐｉｃｅｒ ｕｎｄ Ｄａｖｉｓ ２０１４）。リード候補物ＭＣ－ＦＮ－０１０は、ループ１にリジンを含むが、これは第一級アミンへの選択的薬剤結合のためには好ましくない。以前の分析に基づいて、このアミノ酸はＥＤＢ結合に積極的に寄与しないため、誘導体構築物ＭＣ－ＦＮ－０１６を２番目の候補物として選択する。Ｔｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１６のＦＮ－６７Ｂ８９への結合が、親Ｔｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１０と同等のシグナルで用量依存的に観察された（図９）。対照的に、ＦＮ－６７８９への全体的なバックグラウンドシグナルは、継続的に比較的低かった。両方のシスチンノットミニタンパク質候補物は、ＦＮ－６７８９との相互作用を伴わずにＦＮ－６７Ｂ８９を排他的に標的とし、フィブロネクチンは複数の細胞型で広く発現されるため、これは重要である（Ｐａｎｋｏｖ ｕｎｄ Ｙａｍａｄａ ２００２）。ビオチン化ＦＮ－６７Ｂ８９に対するタグなしのＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１６の親和性をＳＰＲ分析によって検定した。両方のシスチンノットミニタンパク質の結合速度論は、速いオフ速度で１桁のマイクロモル範囲の低い結合親和性を明らかにした（図１０Ａ）。
標的タンパク質を診断ツールとして使用する前に、それらを造影剤と特異的に結合させる必要がある（Ｓｐｉｃｅｒ ｕｎｄ Ｄａｖｉｓ ２０１４）。リード候補物ＭＣ－ＦＮ－０１０は、ループ１にリジンを含むが、これは第一級アミンへの選択的薬剤結合のためには好ましくない。以前の分析に基づいて、このアミノ酸はＥＤＢ結合に積極的に寄与しないため、誘導体構築物ＭＣ－ＦＮ－０１６を２番目の候補物として選択する。Ｔｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１６のＦＮ－６７Ｂ８９への結合が、親Ｔｒｘ－ＭＣ－ＦＮ－０１０と同等のシグナルで用量依存的に観察された（図９）。対照的に、ＦＮ－６７８９への全体的なバックグラウンドシグナルは、継続的に比較的低かった。両方のシスチンノットミニタンパク質候補物は、ＦＮ－６７８９との相互作用を伴わずにＦＮ－６７Ｂ８９を排他的に標的とし、フィブロネクチンは複数の細胞型で広く発現されるため、これは重要である（Ｐａｎｋｏｖ ｕｎｄ Ｙａｍａｄａ ２００２）。ビオチン化ＦＮ－６７Ｂ８９に対するタグなしのＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１６の親和性をＳＰＲ分析によって検定した。両方のシスチンノットミニタンパク質の結合速度論は、速いオフ速度で１桁のマイクロモル範囲の低い結合親和性を明らかにした（図１０Ａ）。
【0289】
実施例７：ＥＤＢ特異的光学イメージングプローブの生成および評価
より強い結合強度を達成するために、リガンドを、潜在的なアビディティ効果を利用するオキシムライゲーションによって化学的に三量体化した。さらに、マウスへの投与後の分布と局在の観察を可能にするために、分子を近赤外蛍光色素であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０でタグ付けした。３つの三量体構築物すべてを化学合成した後、正しいサイズと純度を管理するために様々なアッセイを実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相クロマトグラフィ分析は、すべての構築物で重要な著明点を示さなかった（データは示していない）。特に、オリゴマー化戦略は、両方のＥＤＢ結合シスチンノットミニタンパク質（ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３およびＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３）の親和性を大幅に改善し、３桁のピコモル親和定数および単量体変異体と比較して著しく緩やかなオフ速度をもたらした（図１０Ｂ）。
より強い結合強度を達成するために、リガンドを、潜在的なアビディティ効果を利用するオキシムライゲーションによって化学的に三量体化した。さらに、マウスへの投与後の分布と局在の観察を可能にするために、分子を近赤外蛍光色素であるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０でタグ付けした。３つの三量体構築物すべてを化学合成した後、正しいサイズと純度を管理するために様々なアッセイを実施した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび逆相クロマトグラフィ分析は、すべての構築物で重要な著明点を示さなかった（データは示していない）。特に、オリゴマー化戦略は、両方のＥＤＢ結合シスチンノットミニタンパク質（ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３およびＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３）の親和性を大幅に改善し、３桁のピコモル親和定数および単量体変異体と比較して著しく緩やかなオフ速度をもたらした（図１０Ｂ）。
【0290】
以前に、他のＥＤＢ標的分子が神経膠芽腫を画像化するための診断試薬として適用されることが示された（Ａｌｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｍｏｈａｍｍａｄｇｈｏｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７）。この目的のために、本発明人のＥＤＢ結合シスチンノットミニタンパク質がヒト神経膠芽腫を保有するＦｏｘ ｎ１／ｎｕマウスを標的とする可能性に焦点を合わせた。３．３４ｎｍｏｌ ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３、ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３および陰性対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３の静脈内（ｒ．ｏ．）注射後に、全身および器官のエクスビボイメージングを実施した。図１１Ａは、陰性対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３と比較したＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３およびＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３に起因する強い腫瘍シグナルを伴う蛍光画像を提示する。すべての三量体構築物は、初期の時間枠で肝臓、胆嚢および腎臓でも検出することができた。６時間後、胆嚢を除く様々な器官のシグナルが減少したが、重要な点として、ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３およびＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３から生じた腫瘍シグナルは残存した。さらに、器官の蛍光シグナルは、図１１Ｂに示すようにそれぞれの重量と相関していた。親ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３は、すべての時点で陰性対照と比較して有意に強い腫瘍シグナルを有していた。ただし、ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３はＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３よりも低いシグナルを示したが、それでも陰性対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３よりは高いシグナルを示した。
【0291】
実施例８：マウス異種移植腫瘍として増殖させたヒトＵ－８７ ＭＧ神経膠芽腫細胞株に由来する組織切片へのＭＣ－ＦＮ－０１０の特異的結合。
凍結保存された腫瘍または脳の小片を６ミクロンの厚さの切片に切断し、氷冷アセトンで５分間固定し、風乾した。次に、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で室温にて５分間、スライドをブロックした。次いで、ＥＤＢの染色のために、０．１μｇのＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３および１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈した抗マウスＣＤ３１抗体（ＲＢ－１０３３３－Ｐ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を腫瘍切片に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでスライドを３回洗浄した。一次抗マウスＣＤ３１抗体のＣＤ３１染色を、３７℃で３０分間、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：４００に希釈した二次抗ウサギＩｇＧ－Ｃｙ３抗体（１１１－１６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞核を、ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨｏｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温で３０分間染色した。スライドを上記のように再度洗浄し、封入剤（Ｄａｋｏ）の薄層中で、カバーガラスで覆った。Ｚｅｉｓｓ Ａｐｏｔｏｍｅ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で画像を捕捉し、ＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。図１３は、ヒト神経膠芽腫異種移植腫瘍および正常な脳組織試料での三量体構築物（ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３および対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３）によるさらなる免疫蛍光染色を示す。ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３は、血管マーカＣＤ３１で局在化されたＵ－８７ ＭＧ切片の腫瘍血管周辺の領域を染色したが、対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３は全く染色を示さなかった。正常なマウス脳切片ではＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３による染色は観察されず、腫瘍血管系の特異性を示した。
凍結保存された腫瘍または脳の小片を６ミクロンの厚さの切片に切断し、氷冷アセトンで５分間固定し、風乾した。次に、３％ＢＳＡを含むＰＢＳ中で室温にて５分間、スライドをブロックした。次いで、ＥＤＢの染色のために、０．１μｇのＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３および１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：１００に希釈した抗マウスＣＤ３１抗体（ＲＢ－１０３３３－Ｐ１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を腫瘍切片に添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳでスライドを３回洗浄した。一次抗マウスＣＤ３１抗体のＣＤ３１染色を、３７℃で３０分間、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１：４００に希釈した二次抗ウサギＩｇＧ－Ｃｙ３抗体（１１１－１６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞核を、ＰＢＳで１：５０００に希釈したＨｏｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて室温で３０分間染色した。スライドを上記のように再度洗浄し、封入剤（Ｄａｋｏ）の薄層中で、カバーガラスで覆った。Ｚｅｉｓｓ Ａｐｏｔｏｍｅ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で画像を捕捉し、ＺＥＮソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で分析した。図１３は、ヒト神経膠芽腫異種移植腫瘍および正常な脳組織試料での三量体構築物（ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３および対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３）によるさらなる免疫蛍光染色を示す。ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３は、血管マーカＣＤ３１で局在化されたＵ－８７ ＭＧ切片の腫瘍血管周辺の領域を染色したが、対照ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３は全く染色を示さなかった。正常なマウス脳切片ではＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１０）３による染色は観察されず、腫瘍血管系の特異性を示した。
【0292】
実施例９：選択されたシスチンノットミニタンパク質による特異的腫瘍標的化。
実施例１（Ｕ－８７ ＭＧ異種移植マウスモデル）に記載されているように、Ｕ－８７ ＭＧ異種移植マウスモデルを生成した。
実施例１（Ｕ－８７ ＭＧ異種移植マウスモデル）に記載されているように、Ｕ－８７ ＭＧ異種移植マウスモデルを生成した。
【0293】
インビボ競合実験のために、所望の腫瘍サイズ（約２００ｍｍ３）を有するマウスに、競合物質として３倍または５倍モル過剰の非標識三量体プローブ（ＤＯＴＡ－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３）をＡＦ６８０標識三量体（３．３４ｎｍｏｌ）と共に眼球後静脈叢を介して静脈内注射した。マウスを、６１５～６６５ｎｍの励起範囲を使用し、６９５～７７０ｎｍで発光シグナルをモニタリングして、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で画像化した。マウス全体の画像化工程を注射の１時間後、２時間後または６時間後に実施した。６時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍と特定の器官を切除し、画像化し、秤量し、さらなる分析のために凍結保存した。目的の領域の蛍光強度を、Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ（登録商標）ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して定量化した。これらのマウスの腫瘍蛍光強度の動態を、インビボおよびエクスビボイメージングによって、競合物質なしで標識ＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３で処置したマウスのものと比較した。測定されたＦＮ－６７Ｂ８９への見かけの結合定数はＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３と同等であったため、ＤＯＴＡ－（ＭＣ－ＦＮ－０１６）３は競合実験に良好に適していた（図１５）。競合物質で処置したマウスにおいてインビボで測定された腫瘍シグナルは、各時点で実質的に減少した（図１４Ａ）。先の実験（図１１）と同様に、陰性対照ペプチドＡＦ６８０－（ＭＣ－ＦＮ－０１１５）３は腫瘍の濃縮を示さなかった。６時間後、マウスを安楽死させ、腫瘍と器官を切除し、エクスビボ蛍光イメージング分析（図１４Ｂ）を実施した。測定された蛍光強度を腫瘍重量に対して正規化した。非標識三量体による競合が確認され、シグナル減少の競合物質用量への依存性が観察された（図１４Ｃ）。標識三量体の３０分前に競合物質を注射すると、同時注射と比較してより有効であることが認められた。
【0294】
本発明人の試験は、組換えＥＤＢに対するファージライブラリからのシスチンノットミニタンパク質（ＭＣ－ＦＮ－０１０）の選択を説明している。ＭＣ－ＦＮ－０１０およびその誘導体ＭＣ－ＦＮ－０１６を、腫瘍イメージングアプローチのための分子足場として操作した。両方のＥＤＢ結合分子は、腎臓を除いて、Ｕ８７－ＭＧ異種移植腫瘍における強い蓄積および低いバックグラウンドシグナルを示した。これらの結果は、腫瘍診断技術のための薬剤としてのＭＣ－ＦＮ－０１０およびＭＣ－ＦＮ－０１６の高い可能性を実証する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【配列表】