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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-04
(45)【発行日】2024-04-12
(54)【発明の名称】血管内皮細胞活性化物質のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240405BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240405BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240405BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240405BHJP
C07K 14/475 20060101ALI20240405BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
G01N33/15 Z
G01N33/50 Z
C12N5/077
C07K14/475
【請求項の数】
13
(21)【出願番号】P 2021539317
(86)(22)【出願日】2020-08-04
(86)【国際出願番号】 JP2020030921
(87)【国際公開番号】W WO2021029436
(87)【国際公開日】2021-02-18
【審査請求日】2023-02-15
(31)【優先権主張番号】P 2019147942
(32)【優先日】2019-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】300061835
【氏名又は名称】公益財団法人神戸医療産業都市推進機構
(74)【代理人】
【識別番号】230104019
【弁護士】
【氏名又は名称】大野 聖二
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】田口 明彦
(72)【発明者】
【氏名】田浦 映恵
(72)【発明者】
【氏名】小川 優子
【審査官】中野 あい
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１２－５０２１１４（ＪＰ，Ａ）
【文献】Stem Cells，2010年，vol. 28, no. 7，pp. 1292-1302
【文献】神経治療学，2017年，vol.34, no.1，pp.31-36
【文献】Molecular neurobiology，2016年，vol. 53, no. 9，pp. 6057-6068，Epub 2015 Nov 3
【文献】生化学，2017年，vol. 89, no. 3，pp. 368-376
【文献】Nature，2005年09月22日，vol. 437, no. 7058，pp. 497-504
【文献】Stroke，2020年02月19日，vol. 51, no. 4，pp. 1279-1289
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ１２Ｑ １／００－ ３／００
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記の工程を含む、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法：１）標識されたＶＥＧＦの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量に基づき、前記被験物質の血管内皮細胞活性化効果を評価する工程。
【請求項2】
血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量が、被験物質との培養前後における、血管内皮細胞内における標識されたＶＥＧＦ由来のシグナルの変化によって決定される、請求項１に記載の方法。【請求項3】
血管内皮細胞への標識ＶＥＧＦの取り込み量が、被験物質との培養前後における、培養上清中における標識されたＶＥＧＦ由来のシグナルの変化によって決定される、請求項１に記載の方法。【請求項4】
被験物質による血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量の変化を、標準物質による血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量の変化と比較する工程をさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。【請求項5】
工程３）において、前記血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量が増加した場合に、前記被験物質は血管内皮細胞活性化促進物質として有用と評価し、前記血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量が減少した場合に、前記被験物質は血管内皮細胞抑制物質として有用と評価する、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。【請求項6】
さらに、アンジオポエチン２、エンドグリン、ＩＧＦＢＰ（インスリン様増殖因子結合タンパク質）、ＴＮＦα、及びＴＧＦαからなる群から選ばれる１又は２以上のサイトカインの培養上清中の濃度を決定する工程を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。【請求項7】
サイトカインが、少なくともアンジオポエチン２を含む、請求項６に記載の方法。【請求項8】
血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量の増加に加えて、上記培養上清中のサイトカイン濃度が減少した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化促進物質の候補として有用と評価し、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量の減少に加えて、培養上清中のサイトカイン濃度が増加した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化抑制物質として有用と評価する、請求項６又は７に記載の方法。【請求項9】
血管内皮細胞活性化促進物質が虚血性疾患治療薬の候補であり、血管内皮細胞活性化抑制物質が血管新生阻害薬の候補である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。【請求項10】
下記の工程を含む、虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法：１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が増加した場合に、前記被験物質を虚血性疾患治療薬の候補として選択する工程。
【請求項11】
下記の工程を含む、血管新生阻害薬のスクリーニング方法：１）標識されたＶＥＧＦの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量が減少した場合に、前記被験物質を血管新生阻害薬として選択する工程。
【請求項12】
標識が蛍光標識である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。【請求項13】
血管内皮細胞がヒト血管内皮細胞である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願：
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１９－１４７９４２（２０１９年８月９日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野：
本発明は、血管内皮細胞活性化を制御する物質のスクリーニング方法に関する。より詳細には、血管内皮細胞内へのＶＥＧＦの取り込み量を指標として、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質をスクリーニングする方法に関する。
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１９－１４７９４２（２０１９年８月９日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
技術分野：
本発明は、血管内皮細胞活性化を制御する物質のスクリーニング方法に関する。より詳細には、血管内皮細胞内へのＶＥＧＦの取り込み量を指標として、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【0002】
骨髄単核球細胞（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ－Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ：ＢＭ－ＭＮＣ）の移植は、虚血組織における血管新生を活性化することが知られている。ＢＭ－ＭＮＣは造血幹細胞を比較的高い割合で含有し、自家組織から容易に調製できるため、細胞療法の供給源に適しており、四肢虚血、心筋梗塞、脳梗塞などの虚血性疾患の実験的治療に頻繁に使用されているが、どのようにＢＭ－ＭＮＣが血管新生を活性化するかはわかっていない。
【0003】
当初は、ＢＭ－ＭＮＣに含まれる造血幹細胞から内皮細胞への分化が基本的なメカニズムとして提案されていたが、その後の研究において、内皮細胞に分化するのは極めて少数の移植細胞であり、根本的なメカニズムではないことが判明した。複数の増殖因子やエクソソームの分泌も提唱されているが、はっきりしたエビデンスは示されていない。さらに、移植後の細胞の生存期間は比較的短いことが知られており、増殖因子やエクソソームの分泌は、ＢＭ－ＭＮＣ移植後に長期間観察される強力な血管新生活性化作用の根本的なメカニズムではないと考えられている。
【0004】
血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は最も重要な血管新生促進因子の１つである。ＶＥＧＦは細胞表面に存在するＶＥＧＦ受容体に結合することで、チロシンキナーゼを活性化し、細胞内にシグナルを伝達し、細胞の機能や構造に変化を与える。ＶＥＧＦ受容体であるＶＧＦＲ１とＶＧＦＲ２の発現比率を指標として血管新生能の高い内皮細胞をスクリーニングする方法（特許文献１）や、ＶＥＧＦＲ１を細胞表面に発現する培養血管内皮細胞株を利用して、ＶＥＧＦＲ１のリン酸化や当該細胞の遊走を指標として血管新生促進作用を有する物質をスクリーニングする方法が報告されている（特許文献２）。また、ＶＥＧＦとエンドスタチンの血中濃度を測定することにより、血管新生能を評価する方法が報告されている（特許文献３）。以上のように、従前は、ＶＥＧＦの濃度や、ＶＥＧＦ受容体の動態等により、血管新生促進能力の測定を行なってきたが、本発明のように、ＶＥＧＦの血管内皮細胞の取り込み量で、候補物質の血管新生促進能力を直接測定するという発想は、全く欠如していた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【文献】特開２００５－０６５６９７号公報
【文献】特開２００７－２４４２７３号公報
【文献】ＷＯ２００２／０３１４９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の課題は、ＢＭ－ＭＮＣ移植による血管新生の作用機序を応用し、その機能を代替する低分子物質をスクリーニングする方法を確立し、脳梗塞や心筋梗塞、四肢虚血を含む虚血性疾患、あるいは、癌、炎症性疾患、リウマチなどの血管新生が病態の進行に関与する疾患の新たな治療薬候補を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
従来、ＢＭ－ＭＮＣは、血管新生促進に関する各種成長因子などを分泌することにより、血管新生を促進すると考えられてきた。本発明者らは、ＢＭ－ＭＮＣが、血管新生促進に関する各種成長因子などを分泌することにより、血管内新生を促進するのではなく、ＢＭ－ＭＮＣが、血管内皮細胞に作用し、血管新生を促進する因子の血管内皮細胞における取り込みを、促進することにより、結果として、血管新生が促進されることを発見した。そして、ＶＥＧＦあるいは、他の血管新生促進因子の血管内皮細胞における取り込み量の変化を指標として、ＢＭ－ＭＮＣと同様の作用を有する低分子化合物をスクリーニングすることで、新たな虚血疾患治療薬候補の探索が可能になることを見出した。
【0008】
すなわち、本発明は、以下の（１）～（１３）に関する。
（１）下記の工程を含む、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法：
１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量に基づき、前記被験物質の血管内皮細胞活性化効果を評価する工程。
上記標識としては、蛍光標識、酵素標識、又は放射性標識が挙げられ、好ましくは蛍光標識である。
（２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が、被験物質との培養前後における、血管内皮細胞内における標識されたVEGF由来のシグナルの変化によって決定される、（１）に記載の方法。
（３）血管内皮細胞への標識VEGFの取り込み量が、被験物質との培養前後における、培養上清中における標識されたVEGF由来のシグナルの変化によって決定される、（１）に記載の方法。
（４）被験物質による血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量の変化を、標準物質による血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量の変化と比較する工程をさらに含む、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程３）において、前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が増加した場合に、前記被験物質は血管内皮細胞活性化促進物質として有用と評価し、前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が減少した場合に、前記被験物質は血管内皮細胞抑制物質として有用と評価する、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）さらに、アンジオポエチン2、エンドグリン、IGFBP（インスリン様増殖因子結合タンパク質）、TNFα、及びTGFαからなる群から選ばれる１又は２以上のサイトカインの培養上清中の濃度を決定する工程を含む、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記サイトカインが、少なくともアンジオポエチン2を含む、（６）に記載の方法。
（８）被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのVEGF取り込み量の増加に加えて、上記培養上清中のサイトカイン濃度が減少した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化促進物質の候補として有用と評価し、血管内皮細胞へのVEGF取り込み量の減少に加えて、培養上清中のサイトカイン濃度が増加した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化抑制物質として有用と評価する、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）血管内皮細胞活性化促進物質が虚血性疾患治療薬の候補であり、血管内皮細胞活性化抑制物質が血管新生阻害薬の候補である、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
換言すれば、（１）～（８）の方法は、虚血性疾患治療薬あるいは血管新生阻害薬のスクリーニング方法となりうる。前記虚血性疾患としては、例えば、四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞などの虚血性脳血管障害等が挙げられる。血管新生阻害薬は、固形腫瘍や血管腫などの癌、慢性関節リウマチ、クロ？ン病、ベーチェット病、乾癬、粥状動脈硬化、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症など、血管新生が病態の進行に関与する疾患（血管新生病）の治療に有用である。
（１０）下記の工程を含む、虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法：
１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が増加した場合に、前記被験物質を虚血性疾患治療薬の候補として選択する工程。
（１１）下記の工程を含む、血管新生阻害薬のスクリーニング方法：
１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が減少した場合に、前記被験物質を血管新生阻害薬として選択する工程。
（１２）標識が蛍光標識である、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）血管内皮細胞がヒト血管内皮細胞である、（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
（１）下記の工程を含む、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質のスクリーニング方法：
１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量に基づき、前記被験物質の血管内皮細胞活性化効果を評価する工程。
上記標識としては、蛍光標識、酵素標識、又は放射性標識が挙げられ、好ましくは蛍光標識である。
（２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が、被験物質との培養前後における、血管内皮細胞内における標識されたVEGF由来のシグナルの変化によって決定される、（１）に記載の方法。
（３）血管内皮細胞への標識VEGFの取り込み量が、被験物質との培養前後における、培養上清中における標識されたVEGF由来のシグナルの変化によって決定される、（１）に記載の方法。
（４）被験物質による血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量の変化を、標準物質による血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量の変化と比較する工程をさらに含む、（１）～（３）のいずれかに記載の方法。
（５）工程３）において、前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が増加した場合に、前記被験物質は血管内皮細胞活性化促進物質として有用と評価し、前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が減少した場合に、前記被験物質は血管内皮細胞抑制物質として有用と評価する、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）さらに、アンジオポエチン2、エンドグリン、IGFBP（インスリン様増殖因子結合タンパク質）、TNFα、及びTGFαからなる群から選ばれる１又は２以上のサイトカインの培養上清中の濃度を決定する工程を含む、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）前記サイトカインが、少なくともアンジオポエチン2を含む、（６）に記載の方法。
（８）被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのVEGF取り込み量の増加に加えて、上記培養上清中のサイトカイン濃度が減少した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化促進物質の候補として有用と評価し、血管内皮細胞へのVEGF取り込み量の減少に加えて、培養上清中のサイトカイン濃度が増加した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化抑制物質として有用と評価する、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）血管内皮細胞活性化促進物質が虚血性疾患治療薬の候補であり、血管内皮細胞活性化抑制物質が血管新生阻害薬の候補である、（１）～（８）のいずれかに記載の方法。
換言すれば、（１）～（８）の方法は、虚血性疾患治療薬あるいは血管新生阻害薬のスクリーニング方法となりうる。前記虚血性疾患としては、例えば、四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞などの虚血性脳血管障害等が挙げられる。血管新生阻害薬は、固形腫瘍や血管腫などの癌、慢性関節リウマチ、クロ？ン病、ベーチェット病、乾癬、粥状動脈硬化、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症など、血管新生が病態の進行に関与する疾患（血管新生病）の治療に有用である。
（１０）下記の工程を含む、虚血性疾患治療薬のスクリーニング方法：
１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が増加した場合に、前記被験物質を虚血性疾患治療薬の候補として選択する工程。
（１１）下記の工程を含む、血管新生阻害薬のスクリーニング方法：
１）標識されたVEGFの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する工程、
２）血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量を決定する工程、
３）前記血管内皮細胞へのVEGFの取り込み量が減少した場合に、前記被験物質を血管新生阻害薬として選択する工程。
（１２）標識が蛍光標識である、（１）～（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）血管内皮細胞がヒト血管内皮細胞である、（１）～（１２）のいずれかに記載の方法。
【0009】
これまで、ＶＥＧＦ受容体の発現やＶＥＧＦの分泌量を指標として血管新生活性化作用を評価する手法は知られているが（前掲）、ＶＥＧＦの取り込み量の促進を指標として、血管内皮細胞の活性化作用を評価する方法は知られていない。
【発明の効果】
【0010】
本発明によれば、ＢＭ－ＭＮＣと同様の機構で血管内皮細胞を活性化する作用を有する物質を公知の低分子化合物等からスクリーニングすることができ、生体内におけるＢＭ－ＭＮＣの機能を低分子化合物で置換することが可能になる。標識ＶＥＧＦの細胞内取り込み量を指標としたスクリーニング系は、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質のハイスループットスクリーニングを可能とする。同定された被験物質は、標的が血管内皮細胞であるため、薬物送達の観点からも有利である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
［図１］ 図１は、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養によるヒト臍帯静脈血管内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ）への血管内皮増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ：ＶＥＧＦ）取り込みを示す。
（Ａ）培地中のＶＥＧＦ濃度の有意な減少が、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養によって観察された。対照的に、セルカルチャーインサートによるＢＭ－ＭＮＣとの非接触共培養は、ＶＥＧＦレベルを減少させなかった。（Ｂ）ＨＵＶＥＣ及びＢＭ－ＭＮＣは、抗ＣＤ３１抗体及び抗ＣＤ４５抗体によって明確に区別することができた。（Ｃ－Ｇ）ストレプトアビジン－Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）のＨＵＶＥＣへの取り込みは観察されなかった（Ｃ）。ＨＵＶＥＣ培養のみ（Ｄ）と比較して、ＶＥＧＦのＨＵＶＥＣへの取り込みがＢＭ－ＭＮＣ共培養後に上昇していることが観察された（Ｅ）。１－オクタノール（Ｆ）又はカルベノキソロン（Ｇ）によるＢＭ－ＭＮＣギャップ結合の遮断は、共培養効果を無効にした。（Ｈ－Ｊ）ストレプトアビジン－ＡＰＣのＢＭ－ＭＮＣへの結合は観察されなかった（Ｈ）。ＢＭ－ＭＮＣを単独で培養した場合（Ｉ）又はＨＵＶＥＣと共培養した場合（Ｊ）、ＢＭ－ＭＮＣへのＶＥＧＦの取り込みはほとんど観察されなかった。＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｄｉｕｍ、＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｄｉｕｍ、各群ｎ＝３（Ａ）。
［図２］ 図２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのギャップ結合を介したＢＭ－ＭＮＣからＨＵＶＥＣへのＢＣＥＣＦ（２’，７’－Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－４ ｏｒ ５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）移行を示す。
（Ａ－Ｄ）ナイーブ（Ａ）及びＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣ（Ｂ）と共培養したＨＵＶＥＣ（Ａ－Ｃ）のＦＡＣＳ分析。ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣとの共培養後にＢＣＥＣＦ陽性のＨＵＶＥＣが観察された。セルカルチャーインサートを用いて共培養した場合（Ｃ）、又はギャップ結合脱共役剤１－オクタノールを適用した場合（Ｄ）、ＢＣＥＣＦ移行は遮断された。（Ｅ、Ｆ）ＨＵＶＥＣはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光標識抗体（以下、Ａｌｅｘａ４８８）単独（Ｅ）又は抗Ｃｘ３７（コネキシン３７）抗体及びＡｌｅｘａ４８８（Ｆ）で染色した。ＨＵＶＥＣでは、Ｃｘ３７の発現はほとんど見られなかった。（Ｇ、Ｈ）アイソタイプコントロール抗体（Ｇ）又は抗Ｃｘ４３（コネキシン４３）抗体（Ｈ）で染色したＨＵＶＥＣ。Ｃｘ４３の発現はＨＵＶＥＣで観察された。（Ｉ、Ｊ）ＢＭ－ＭＮＣはＡｌｅｘａ４８８単独（Ｉ）、又は抗Ｃｘ３７抗体及びＡｌｅｘａ４８８（Ｊ）で染色した。Ｃｘ３７の発現はＢＭ－ＭＮＣにおいて観察された。（Ｋ、Ｌ）アイソタイプコントロール抗体（Ｋ）又は抗Ｃｘ４３抗体（Ｌ）で染色したＢＭ－ＭＮＣ。Ｃｘ４３の発現はＨＵＶＥＣで観察された。
［図３］ 図３は、ｉｎ ｖｉｖｏでのギャップ結合を介したＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞へのＢＣＥＣＦの移行を示す。
（Ａ－Ｄ）脳梗塞後脳への静脈内注射の５分後に移植したＢＣＥＣＦ陽性ＢＭ－ＭＮＣ。ＢＣＥＣＦ陽性細胞（Ａ）が脳微小血管系（Ｂ）に観察された。画像を重ね合わせることで、ＢＣＥＣＦはＣＤ３１陽性内皮細胞膜を通過してＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞への移行が実証される（Ｃ、Ｄ）。（Ｅ、Ｆ）反対側の健康な大脳皮質ではコネキシン３７（Ｃｘ３７）の発現は観察されなかったが（Ｅ）、同側では脳梗塞誘発４８時間後に明らかに発現された（Ｆ）。（Ｇ、Ｈ）コネキシン４３（Ｃｘ４３）の発現は健康な皮質ではほとんど観察されなかったが（Ｇ）、脳梗塞後には発現の増加が観察された（Ｈ）。（Ｉ－Ｌ）ＢＣＥＣＦの浸潤（Ｊ）を伴うＣｘ３７の蓄積（Ｊ）が内皮細胞において観察された（Ｋ、Ｌ）。（Ｍ－Ｐ）ＢＣＥＣＦの浸潤（Ｎ）を伴うＣｘ４３の蓄積（Ｍ）が内皮細胞において観察された（Ｏ、Ｐ）。スケールバー、２０μｍ（Ａ），５μｍ（Ｄ，Ｉ），４０μｍ（Ｅ）
［図４］ 図４は、内皮細胞の微細構造の変化が、ＢＭ－ＭＮＣ移植動物におけるオートファジーの減少を示唆することを示す。
（Ａ）非脳梗塞マウスにおける内皮細胞、基底層、周皮細胞及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｆｏｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）からなる正常な毛細血管。（Ｂ、Ｃ）病変部の毛細血管の代表的な写真。相当数のオートファゴソーム様液胞が、ＰＢＳ処置マウスの内皮細胞において観察された（Ｂ）。対照的に、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｆｏｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の消失にもかかわらず、脳梗塞誘発７２時間後のＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの内皮細胞中には、付着した周皮細胞を伴う数個のオートファゴソーム様液胞が観察された（Ｃ）。（Ｄ、Ｅ）ＰＢＳ処置マウスの内皮細胞において、相当数のオートファゴソーム様液胞が観察された（Ｄ）。対照的に、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの内皮細胞では、オートファゴソーム様の液胞はほとんど観察されなかった（Ｅ）。（Ｆ、Ｇ）非損傷対側皮質における毛細血管の写真。オートファゴソーム様液胞が、ＰＢＳ処置マウスのいくつかの内皮細胞において観察された（Ｆ）。対照的に、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの内皮細胞においてオートファゴソーム様液胞は観察されなかった（Ｇ）。（Ｈ）定量分析により、ＢＭ－ＭＮＣ移植が関連領域におけるオートファゴソーム様液胞の形成を抑制することが確認された。スケールバー、２μｍ（Ａ）、ｐ＜０．０１ｖｅｒｓｕｓ ＰＢＳ、各群ｎ＝５（Ｈ）。
［図５］ 図５は、脳梗塞後の内皮細胞におけるオートファジーマーカーＬＣ３の発現を示す。
（Ａ）病変領域のほとんどのＣＤ３１陽性内皮細胞は、ＰＢＳ及びＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの両方においてＬＣ３を発現する。（Ｂ）病変周辺領域において、ＬＣ３陽性内皮細胞はＢＭ－ＭＮＣ処置マウスにおいてめったに観察されなかったが、ほとんどの内皮細胞はＰＢＳ処置マウスにおいてＬＣ３陽性であった。（Ｃ）損傷を受けていない対側皮質では、ＰＢＳを投与されたマウスではいくつかのＬＣ３陽性内皮細胞が観察されたが、ＢＭ－ＭＮＣを投与されたマウスではＬＣ３陽性内皮細胞は観察されなかった。スケールバー、２０μｍ（Ａ）
［図６］ 図６は、ＢＭ－ＭＮＣ移植後のＨｉｆ－１α発現を示す。
（Ａ－Ｃ）脳損傷誘発後３時間（Ｂ）又は４８時間（Ｃ）において、損傷を受けていない脳（Ａ）、及び脳梗塞後領域において、Ｈｉｆ－１αの発現はほとんど観察されなかった。（Ｄ）しかしながら、ＢＭ－ＭＮＣ移植の１時間後、毛細血管様構造においてＨｉｆ－１α発現の増加が観察された。（Ｅ－Ｈ）ＢＣＥＣＦシグナル（Ｅ）は、ＣＤ３１陽性内皮細胞におけるＨｉｆ－１α発現と共局在していた（Ｇ、Ｈ）。スケールバー、４０μｍ（Ａ），１０μｍ（Ｅ）
［図７］ 図７は、ＨＵＶＥＣ培養上清中の各種サイトカイン濃度の変化を示す。
ＨＵＶＥＣ単独培養（ＰＢＳ）、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養（ＢＭ－ＭＮＣ）。グラフは、上清中のサイトカイン濃度の培養６時間での変化量（ｐＭ）を示す。（Ａ）Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２、（Ｂ）Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、（Ｃ）ＴＧＦα、（Ｄ）ＩＧＦＢＰ－１、（Ｅ）ＴＮＦα。
［図８］ 図８は、低分子化合物によるＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）のＶＥＧＦ取り込み促進作用を、標準物質と比較したものである。
（Ａ）蛍光バックグラウンド、（Ｂ）標準物質／被験物質なし、（Ｃ）標準物質（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、（Ｄ）被験物質１（４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、（Ｅ）被験物質２（Ｃｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ）。
（Ａ）培地中のＶＥＧＦ濃度の有意な減少が、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養によって観察された。対照的に、セルカルチャーインサートによるＢＭ－ＭＮＣとの非接触共培養は、ＶＥＧＦレベルを減少させなかった。（Ｂ）ＨＵＶＥＣ及びＢＭ－ＭＮＣは、抗ＣＤ３１抗体及び抗ＣＤ４５抗体によって明確に区別することができた。（Ｃ－Ｇ）ストレプトアビジン－Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）のＨＵＶＥＣへの取り込みは観察されなかった（Ｃ）。ＨＵＶＥＣ培養のみ（Ｄ）と比較して、ＶＥＧＦのＨＵＶＥＣへの取り込みがＢＭ－ＭＮＣ共培養後に上昇していることが観察された（Ｅ）。１－オクタノール（Ｆ）又はカルベノキソロン（Ｇ）によるＢＭ－ＭＮＣギャップ結合の遮断は、共培養効果を無効にした。（Ｈ－Ｊ）ストレプトアビジン－ＡＰＣのＢＭ－ＭＮＣへの結合は観察されなかった（Ｈ）。ＢＭ－ＭＮＣを単独で培養した場合（Ｉ）又はＨＵＶＥＣと共培養した場合（Ｊ）、ＢＭ－ＭＮＣへのＶＥＧＦの取り込みはほとんど観察されなかった。＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｄｉｕｍ、＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ｍｅｄｉｕｍ、各群ｎ＝３（Ａ）。
［図２］ 図２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのギャップ結合を介したＢＭ－ＭＮＣからＨＵＶＥＣへのＢＣＥＣＦ（２’，７’－Ｂｉｓ（ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－４ ｏｒ ５－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）移行を示す。
（Ａ－Ｄ）ナイーブ（Ａ）及びＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣ（Ｂ）と共培養したＨＵＶＥＣ（Ａ－Ｃ）のＦＡＣＳ分析。ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣとの共培養後にＢＣＥＣＦ陽性のＨＵＶＥＣが観察された。セルカルチャーインサートを用いて共培養した場合（Ｃ）、又はギャップ結合脱共役剤１－オクタノールを適用した場合（Ｄ）、ＢＣＥＣＦ移行は遮断された。（Ｅ、Ｆ）ＨＵＶＥＣはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光標識抗体（以下、Ａｌｅｘａ４８８）単独（Ｅ）又は抗Ｃｘ３７（コネキシン３７）抗体及びＡｌｅｘａ４８８（Ｆ）で染色した。ＨＵＶＥＣでは、Ｃｘ３７の発現はほとんど見られなかった。（Ｇ、Ｈ）アイソタイプコントロール抗体（Ｇ）又は抗Ｃｘ４３（コネキシン４３）抗体（Ｈ）で染色したＨＵＶＥＣ。Ｃｘ４３の発現はＨＵＶＥＣで観察された。（Ｉ、Ｊ）ＢＭ－ＭＮＣはＡｌｅｘａ４８８単独（Ｉ）、又は抗Ｃｘ３７抗体及びＡｌｅｘａ４８８（Ｊ）で染色した。Ｃｘ３７の発現はＢＭ－ＭＮＣにおいて観察された。（Ｋ、Ｌ）アイソタイプコントロール抗体（Ｋ）又は抗Ｃｘ４３抗体（Ｌ）で染色したＢＭ－ＭＮＣ。Ｃｘ４３の発現はＨＵＶＥＣで観察された。
［図３］ 図３は、ｉｎ ｖｉｖｏでのギャップ結合を介したＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞へのＢＣＥＣＦの移行を示す。
（Ａ－Ｄ）脳梗塞後脳への静脈内注射の５分後に移植したＢＣＥＣＦ陽性ＢＭ－ＭＮＣ。ＢＣＥＣＦ陽性細胞（Ａ）が脳微小血管系（Ｂ）に観察された。画像を重ね合わせることで、ＢＣＥＣＦはＣＤ３１陽性内皮細胞膜を通過してＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞への移行が実証される（Ｃ、Ｄ）。（Ｅ、Ｆ）反対側の健康な大脳皮質ではコネキシン３７（Ｃｘ３７）の発現は観察されなかったが（Ｅ）、同側では脳梗塞誘発４８時間後に明らかに発現された（Ｆ）。（Ｇ、Ｈ）コネキシン４３（Ｃｘ４３）の発現は健康な皮質ではほとんど観察されなかったが（Ｇ）、脳梗塞後には発現の増加が観察された（Ｈ）。（Ｉ－Ｌ）ＢＣＥＣＦの浸潤（Ｊ）を伴うＣｘ３７の蓄積（Ｊ）が内皮細胞において観察された（Ｋ、Ｌ）。（Ｍ－Ｐ）ＢＣＥＣＦの浸潤（Ｎ）を伴うＣｘ４３の蓄積（Ｍ）が内皮細胞において観察された（Ｏ、Ｐ）。スケールバー、２０μｍ（Ａ），５μｍ（Ｄ，Ｉ），４０μｍ（Ｅ）
［図４］ 図４は、内皮細胞の微細構造の変化が、ＢＭ－ＭＮＣ移植動物におけるオートファジーの減少を示唆することを示す。
（Ａ）非脳梗塞マウスにおける内皮細胞、基底層、周皮細胞及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｆｏｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）からなる正常な毛細血管。（Ｂ、Ｃ）病変部の毛細血管の代表的な写真。相当数のオートファゴソーム様液胞が、ＰＢＳ処置マウスの内皮細胞において観察された（Ｂ）。対照的に、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｆｏｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の消失にもかかわらず、脳梗塞誘発７２時間後のＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの内皮細胞中には、付着した周皮細胞を伴う数個のオートファゴソーム様液胞が観察された（Ｃ）。（Ｄ、Ｅ）ＰＢＳ処置マウスの内皮細胞において、相当数のオートファゴソーム様液胞が観察された（Ｄ）。対照的に、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの内皮細胞では、オートファゴソーム様の液胞はほとんど観察されなかった（Ｅ）。（Ｆ、Ｇ）非損傷対側皮質における毛細血管の写真。オートファゴソーム様液胞が、ＰＢＳ処置マウスのいくつかの内皮細胞において観察された（Ｆ）。対照的に、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの内皮細胞においてオートファゴソーム様液胞は観察されなかった（Ｇ）。（Ｈ）定量分析により、ＢＭ－ＭＮＣ移植が関連領域におけるオートファゴソーム様液胞の形成を抑制することが確認された。スケールバー、２μｍ（Ａ）、ｐ＜０．０１ｖｅｒｓｕｓ ＰＢＳ、各群ｎ＝５（Ｈ）。
［図５］ 図５は、脳梗塞後の内皮細胞におけるオートファジーマーカーＬＣ３の発現を示す。
（Ａ）病変領域のほとんどのＣＤ３１陽性内皮細胞は、ＰＢＳ及びＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの両方においてＬＣ３を発現する。（Ｂ）病変周辺領域において、ＬＣ３陽性内皮細胞はＢＭ－ＭＮＣ処置マウスにおいてめったに観察されなかったが、ほとんどの内皮細胞はＰＢＳ処置マウスにおいてＬＣ３陽性であった。（Ｃ）損傷を受けていない対側皮質では、ＰＢＳを投与されたマウスではいくつかのＬＣ３陽性内皮細胞が観察されたが、ＢＭ－ＭＮＣを投与されたマウスではＬＣ３陽性内皮細胞は観察されなかった。スケールバー、２０μｍ（Ａ）
［図６］ 図６は、ＢＭ－ＭＮＣ移植後のＨｉｆ－１α発現を示す。
（Ａ－Ｃ）脳損傷誘発後３時間（Ｂ）又は４８時間（Ｃ）において、損傷を受けていない脳（Ａ）、及び脳梗塞後領域において、Ｈｉｆ－１αの発現はほとんど観察されなかった。（Ｄ）しかしながら、ＢＭ－ＭＮＣ移植の１時間後、毛細血管様構造においてＨｉｆ－１α発現の増加が観察された。（Ｅ－Ｈ）ＢＣＥＣＦシグナル（Ｅ）は、ＣＤ３１陽性内皮細胞におけるＨｉｆ－１α発現と共局在していた（Ｇ、Ｈ）。スケールバー、４０μｍ（Ａ），１０μｍ（Ｅ）
［図７］ 図７は、ＨＵＶＥＣ培養上清中の各種サイトカイン濃度の変化を示す。
ＨＵＶＥＣ単独培養（ＰＢＳ）、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養（ＢＭ－ＭＮＣ）。グラフは、上清中のサイトカイン濃度の培養６時間での変化量（ｐＭ）を示す。（Ａ）Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２、（Ｂ）Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、（Ｃ）ＴＧＦα、（Ｄ）ＩＧＦＢＰ－１、（Ｅ）ＴＮＦα。
［図８］ 図８は、低分子化合物によるＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞）のＶＥＧＦ取り込み促進作用を、標準物質と比較したものである。
（Ａ）蛍光バックグラウンド、（Ｂ）標準物質／被験物質なし、（Ｃ）標準物質（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）、（Ｄ）被験物質１（４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）、（Ｅ）被験物質２（Ｃｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ）。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、血管内皮細胞におけるＶＥＧＦの取り込みを指標とした血管内皮細胞活性化促進物質又は抑制物質、特にＢＭ－ＭＮＣと同様の機構で血管内皮細胞の活性化を制御する作用を有する物質のスクリーニング方法に関する。
【0013】
１．工程１）標識されたＶＥＧＦの存在下、血管内皮細胞を被験物質とともに培養する「血管内皮細胞」
本発明で使用される「血管内皮細胞」は、ＶＥＧＦに対するレセプターを発現している培養可能な血管内皮細胞であれば特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞が好ましく、特にヒト由来の細胞がより好ましい。ヒト血管内皮細胞としては、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、ヒト伏在静脈血管内皮細胞（ＨＳａＶＥＣ）、ヒト皮膚血管内皮細胞（ＨＤＢＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、ヒト子宮微小血管内皮細胞（ＨＵｔＭＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＰＭＥＣ）、ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）、ヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞（ＨＤＬＥＣ）などが挙げられ、いずれも市販の培養細胞株を利用することができる。特に好ましいのは、ＨＵＶＥＣ及びＨＢＭＥＣである。
本発明で使用される「血管内皮細胞」は、ＶＥＧＦに対するレセプターを発現している培養可能な血管内皮細胞であれば特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞が好ましく、特にヒト由来の細胞がより好ましい。ヒト血管内皮細胞としては、例えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト脳微小血管内皮細胞（ＨＢＭＥＣ）、ヒト臍帯動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡｏＥＣ）、ヒト冠状動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）、ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、ヒト伏在静脈血管内皮細胞（ＨＳａＶＥＣ）、ヒト皮膚血管内皮細胞（ＨＤＢＥＣ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ）、ヒト子宮微小血管内皮細胞（ＨＵｔＭＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＰＭＥＣ）、ヒト心臓微小血管内皮細胞（ＨＣＭＥＣ）、ヒト皮膚微小リンパ管内皮細胞（ＨＤＬＥＣ）などが挙げられ、いずれも市販の培養細胞株を利用することができる。特に好ましいのは、ＨＵＶＥＣ及びＨＢＭＥＣである。
【0014】
「血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）」
本発明で使用される血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、使用する血管内皮細胞に発現しているＶＥＧＦ受容体に結合できるものであれば特に限定されないが、哺乳動物由来のＶＥＧＦが好ましく、特にヒト由来のＶＥＧＦがより好ましい。ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＩＧＦ－１、ＰＩＧＦ－２など７つのファミリーが存在する。一般にＶＥＧＦ－ＡをＶＥＧＦと呼ぶこともあり、本明細書においても、単にＶＥＧＦと記載する場合には、ＶＥＧＦ－Ａを意味するものとする。
本発明で使用される血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、使用する血管内皮細胞に発現しているＶＥＧＦ受容体に結合できるものであれば特に限定されないが、哺乳動物由来のＶＥＧＦが好ましく、特にヒト由来のＶＥＧＦがより好ましい。ＶＥＧＦには、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ、ＰＩＧＦ－１、ＰＩＧＦ－２など７つのファミリーが存在する。一般にＶＥＧＦ－ＡをＶＥＧＦと呼ぶこともあり、本明細書においても、単にＶＥＧＦと記載する場合には、ＶＥＧＦ－Ａを意味するものとする。
【0015】
本発明では、標識されたＶＥＧＦを使用することができる。標識方法は特に限定されず、酵素標識、放射性標識、蛍光標識など、公知の方法を適宜選択して用いることができる。本発明においては、蛍光標識が好ましい。
【0016】
酵素標識に使用する酵素としては、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ＡＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）が挙げられ、ＨＲＰはＤＡＢやＴＡＢなどの発色基質を用いて、ＡＰはＢＣＩＰ／ＮＢＴやｐＰＮＰＰなどの発色基質を用いて発色させる。
放射性標識に使用する放射性同位体としては、１２５Ｉ、３Ｈなどを使用することができ、タンパク質ヨウ素標識試薬を用いて、酵素的又は化学的酸化により検出対象であるタンパク質に組み込む。
放射性標識に使用する放射性同位体としては、１２５Ｉ、３Ｈなどを使用することができ、タンパク質ヨウ素標識試薬を用いて、酵素的又は化学的酸化により検出対象であるタンパク質に組み込む。
【0017】
蛍光標識に使用する蛍光物質としては、ＰＥ（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）、ＡＰＣ（Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）、ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＲＦＰなどのなどの蛍光蛋白質、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、ＴＲＩＴＣ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）、Ｃｙ（登録商標）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔなどの低分子蛍光色素を好適に使用することができるが、これらに限定されない。蛍光標識のシグナルは、光学顕微鏡、高感度ＣＣＤカメラ、共焦点レーザー顕微鏡、フローサイトメトリーなどの検出方法と画像処理技術によって検出・定量することができる。
【0018】
検出は、感度を上げるためにビオチン－アビジン系やビオチン－ストレプトアビジン系を用いて蛍光シグナルを増幅してもよい。
【0019】
「被験物質」
本発明の方法においてスクリーニングの対象となる被験物質の種類は特に限定されない。後述する虚血性疾患治療薬としての使用を考慮した場合、合成や取扱いが容易な低分子化合物が好ましい。低分子化合物とは、分子量が約１万以下の化合物を意味する。
本発明の方法においてスクリーニングの対象となる被験物質の種類は特に限定されない。後述する虚血性疾患治療薬としての使用を考慮した場合、合成や取扱いが容易な低分子化合物が好ましい。低分子化合物とは、分子量が約１万以下の化合物を意味する。
【0020】
「血管内皮細胞の培養」
血管内皮細胞は、標識ＶＥＧＦの存在下で被験物質とともに培養する。培養には、市販の内皮細胞用の培地を用いてもよいし、基本培地に細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成してもよい。基本培地としては、ＤＭＥＭ、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ＳＦＭ、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、α ＭＥＭ、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０ 培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に使用できる培地であればいずれも用いることができる。
血管内皮細胞は、標識ＶＥＧＦの存在下で被験物質とともに培養する。培養には、市販の内皮細胞用の培地を用いてもよいし、基本培地に細胞の維持増殖に必要な各種栄養源や分化誘導に必要な各成分を添加して作成してもよい。基本培地としては、ＤＭＥＭ、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ＳＦＭ、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ、ＩＭＤＭ、Ｍｅｄｉｕｍ １９９、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ、α ＭＥＭ、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０ 培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭｃＣｏｙ’ｓ培地、ウイリアムスＥ培地、及びこれらの混合培地など、哺乳動物細胞の培養に使用できる培地であればいずれも用いることができる。
【0021】
栄養源としては、グリセロール、グルコース、果糖、ショ糖、乳糖、ハチミツ、デンプン、デキストリン等の炭素源、また、脂肪酸、油脂、レシチン、アルコール類等の炭化水素類、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、尿素、硝酸ナトリウム等の窒素源、食塩、カリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等の無機塩類、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、モリブデン酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム及び硫酸マンガン、各種ビタミン類、アミノ酸類等を含むことができる。
【0022】
培地には、その他必要に応じて、レチノイン酸、ピルビン酸、βメルカプトエタノール等のアミノ酸還元剤、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、３’チオールグリセロール、増殖因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ，ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｒａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ｂＦＧＦ，Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＩＧＦなど）、血清あるいは血清代替物等を添加してもよい。なお血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、市販のＫｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ｂｏｖｉｎｅ ｐｉｔｕｉｔａｒｙ ｅｘｔｒａｃｔ（ＢＰＥ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｂ２７ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｙ－２７６３２（和光純薬）が挙げられる。
【0023】
これらの成分を配合して得られる培地のｐＨは５．５～９．０、好ましくは６．０～８．０、より好ましくは６．５～７．５の範囲である。
【0024】
培養は、３６℃～３８℃、好ましくは３６．５℃～３７．５℃で、１％～２５％ Ｏ２、１％～１５％ ＣＯ２の条件下で行われる。
【0025】
２．工程２）血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量を決定する
「血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量の決定」
血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量は、被験物質との培養前後における、血管内皮細胞内における標識ＶＥＧＦ由来のシグナル強度の変化を測定することにより、直接的に決定することができる。あるいは被験物質との培養前後における、培養液中に残存する標識ＶＥＧＦ由来のシグナル強度の変化を測定することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量を間接的に決定してもよい。
「血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量の決定」
血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量は、被験物質との培養前後における、血管内皮細胞内における標識ＶＥＧＦ由来のシグナル強度の変化を測定することにより、直接的に決定することができる。あるいは被験物質との培養前後における、培養液中に残存する標識ＶＥＧＦ由来のシグナル強度の変化を測定することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量を間接的に決定してもよい。
【0026】
血管内皮細胞内における標識されたＶＥＧＦ由来のシグナルの変化を測定する場合、血管内皮細胞と被験物質を、標識ＶＥＧＦの存在下において、少なくとも１０分以上、２０分以上、３０分以上、より好ましくは３０分～４時間、更に好ましくは１～３時間程度、被験物質と培養した後に測定することが推奨されるが、培養条件や使用する細胞に応じて適宜変更しても良い。
【0027】
培養上清中における標識されたＶＥＧＦ由来のシグナルの変化を測定する場合、血管内皮細胞と被験物質を、標識ＶＥＧＦの存在下において、少なくとも３０分以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、より好ましくは４時間以上、特に好ましくは６時間程度、被験物質と培養した後に測定することが推奨されるが、培養条件や使用する細胞に応じて適宜変更しても良い。
【0028】
細胞内における標識ＶＥＧＦの量は、例えば、ＦＡＣＳを使用することで簡便に測定することができる。培養上清中に残存する標識ＶＥＧＦの量は、例えば、分光蛍光光度計及びマイクロプレートリーダー、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘリーダーを利用して測定することができる。
【0029】
３．工程３）被験物質の血管内皮細胞活性化効果を評価する
被験物質の血管内皮細胞活性化効果は、前記被験物質による血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量に基づいて評価する。評価は、被験物質単独で行ってもよいし、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み促進作用が既知の化合物を標準物質として使用し、当該標準物質と比較して評価してもよい。
被験物質の血管内皮細胞活性化効果は、前記被験物質による血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量に基づいて評価する。評価は、被験物質単独で行ってもよいし、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み促進作用が既知の化合物を標準物質として使用し、当該標準物質と比較して評価してもよい。
【0030】
被験物質単独で評価を行う場合、最も単純には、被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量が有意に増加した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化物質の候補として同定する。あるいは、一定の基準値が設定できれば、その基準値を上回るＶＥＧＦの取り込み量が認められた場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化物質の候補として同定する。
【0031】
被験物質単独で評価を行う場合、最も単純には、被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦの取り込み量が有意に減少した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞抑制物質の候補として同定する。あるいは、一定の基準値が設定できれば、その基準値を上回るＶＥＧＦの取り込み量が認められた場合に、当該被験物質を血管内皮細胞抑制物質の候補として同定する。
【0032】
「標準物質」
標準物質と比較して評価する場合には、同一の条件において、標準物質を添加した場合と、被験物質を添加した場合における、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量を比較することで、血管内皮細胞活性化効果を評価する。なお、標準物質は血管内皮細胞のＶＥＧＦ取り込み促進作用が確認できている物質であれば特に限定されない。後述する実施例では、本発明の方法により、発明者らが血管内皮細胞に対するＶＥＧＦ取り込み促進効果を確認しているＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄを使用することにより、他の低分子化合物の血管内皮細胞に対するＶＥＧＦ取り込みを評価したが、標準物質はこれに限定されるものではない。
標準物質と比較して評価する場合には、同一の条件において、標準物質を添加した場合と、被験物質を添加した場合における、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量を比較することで、血管内皮細胞活性化効果を評価する。なお、標準物質は血管内皮細胞のＶＥＧＦ取り込み促進作用が確認できている物質であれば特に限定されない。後述する実施例では、本発明の方法により、発明者らが血管内皮細胞に対するＶＥＧＦ取り込み促進効果を確認しているＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄを使用することにより、他の低分子化合物の血管内皮細胞に対するＶＥＧＦ取り込みを評価したが、標準物質はこれに限定されるものではない。
【0033】
「血管内皮細胞活性化促進物質」
本発明の方法でスクリーニングされる「血管内皮細胞活性化促進物質」とは、ＢＭ－ＭＮＣと同様の機構で血管内皮細胞の活性化を促進する作用を有する物質である。
本発明の方法でスクリーニングされる「血管内皮細胞活性化促進物質」とは、ＢＭ－ＭＮＣと同様の機構で血管内皮細胞の活性化を促進する作用を有する物質である。
【0034】
「血管内皮細胞活性化抑制物質」
本発明の方法でスクリーニングされる「血管内皮細胞活性化抑制物質」とは、ＢＭ－ＭＮＣと逆の作用を発揮し、血管内皮細胞の活性化を抑制する作用を有する物質である。
本発明の方法でスクリーニングされる「血管内皮細胞活性化抑制物質」とは、ＢＭ－ＭＮＣと逆の作用を発揮し、血管内皮細胞の活性化を抑制する作用を有する物質である。
【0035】
４．培養上清中のサイトカイン濃度の評価
必要に応じて、上記方法は、さらに、アンジオポエチン２、エンドグリン、ＩＧＦＢＰ（インスリン様増殖因子結合タンパク質）、ＴＮＦα、及びＴＧＦαからなる群から選ばれる１又は２以上のサイトカインの培養上清中の濃度を決定する工程を含んでいてもよい。サイトカイン濃度は、ＶＥＧＦと同様の方法で測定できるが、市販のマルチプレックスシステムを使用して複数のサイトカインを同時測定してもよい。例えば、被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量の増加に加えて、上記培養上清中のサイトカイン濃度が減少した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化促進物質の候補として同定する。逆に、被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量の減少に加えて、培養上清中のサイトカイン濃度が増加した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化抑制物質の候補として同定する。評価に使用するサイトカインとしては、特にアンジオポエチン２とＴＧＦαが好ましく、アンジオポエチン２がより好ましい。
必要に応じて、上記方法は、さらに、アンジオポエチン２、エンドグリン、ＩＧＦＢＰ（インスリン様増殖因子結合タンパク質）、ＴＮＦα、及びＴＧＦαからなる群から選ばれる１又は２以上のサイトカインの培養上清中の濃度を決定する工程を含んでいてもよい。サイトカイン濃度は、ＶＥＧＦと同様の方法で測定できるが、市販のマルチプレックスシステムを使用して複数のサイトカインを同時測定してもよい。例えば、被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量の増加に加えて、上記培養上清中のサイトカイン濃度が減少した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化促進物質の候補として同定する。逆に、被験物質とともに培養することにより、血管内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込み量の減少に加えて、培養上清中のサイトカイン濃度が増加した場合に、当該被験物質を血管内皮細胞活性化抑制物質の候補として同定する。評価に使用するサイトカインとしては、特にアンジオポエチン２とＴＧＦαが好ましく、アンジオポエチン２がより好ましい。
【0036】
５．虚血性疾患治療薬のスクリーニング
「虚血性疾患治療薬」
本発明のスクリーニング方法で同定された血管内皮細胞活性化促進物質は、ＢＭ－ＭＮＣと同様の作用機序で血管内皮細胞による血管新生を活性化させることができる。そのため、床ずれ・皮膚潰瘍、手術瘢痕、難治性消化性潰瘍を含む創傷、潰瘍性大腸炎、クローン病などの慢性炎症性腸疾患を含む炎症性疾患、重症四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞などの虚血性脳血管障害、糖尿病性ニューロパチー、重症虚血を伴うがんなどの虚血に起因する疾患（虚血性疾患）の治療薬として有用である。換言すれば、本発明のスクリーニング方法は、虚血性疾患治療薬の候補物質のスクリーニングに利用できる。
「虚血性疾患治療薬」
本発明のスクリーニング方法で同定された血管内皮細胞活性化促進物質は、ＢＭ－ＭＮＣと同様の作用機序で血管内皮細胞による血管新生を活性化させることができる。そのため、床ずれ・皮膚潰瘍、手術瘢痕、難治性消化性潰瘍を含む創傷、潰瘍性大腸炎、クローン病などの慢性炎症性腸疾患を含む炎症性疾患、重症四肢虚血、心筋梗塞・狭心症・心不全を含む虚血性心疾患、脳梗塞などの虚血性脳血管障害、糖尿病性ニューロパチー、重症虚血を伴うがんなどの虚血に起因する疾患（虚血性疾患）の治療薬として有用である。換言すれば、本発明のスクリーニング方法は、虚血性疾患治療薬の候補物質のスクリーニングに利用できる。
【0037】
６．血管新生阻害薬のスクリーニング
「血管新生阻害薬」
本発明のスクリーニング方法で同定された血管内皮細胞活性化阻害物質は、ＢＭ－ＭＮＣの作用に拮抗する機序で血管内皮細胞による血管新生活性化を抑制することができる。そのため、血管新生阻害薬として、病態の進行と血管新生が密接に関連する癌、慢性関節リウマチ、、クロ－ン病、ベーチェット病、乾癬、粥状動脈硬化、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症などの血管新生病の治療薬として有用である。換言すれば、本発明のスクリーニング方法は、上記した血管新生阻害薬の候補物質のスクリーニングに利用できる。
「血管新生阻害薬」
本発明のスクリーニング方法で同定された血管内皮細胞活性化阻害物質は、ＢＭ－ＭＮＣの作用に拮抗する機序で血管内皮細胞による血管新生活性化を抑制することができる。そのため、血管新生阻害薬として、病態の進行と血管新生が密接に関連する癌、慢性関節リウマチ、、クロ－ン病、ベーチェット病、乾癬、粥状動脈硬化、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症などの血管新生病の治療薬として有用である。換言すれば、本発明のスクリーニング方法は、上記した血管新生阻害薬の候補物質のスクリーニングに利用できる。
【0038】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例1】
【0039】
実施例１：ＢＭ－ＭＮＣによるＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ取り込みの促進
１．材料及び方法
・ＢＭ－ＭＮＣの調製
骨髄は、６週齢、オスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）から得た。大腿骨及び脛骨を解剖し、ＰＢＳを用いて骨から骨髄を抽出した。骨髄を機械的に分離し、ＢＭ－ＭＮＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。
１．材料及び方法
・ＢＭ－ＭＮＣの調製
骨髄は、６週齢、オスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｐａｎ ＳＬＣ）から得た。大腿骨及び脛骨を解剖し、ＰＢＳを用いて骨から骨髄を抽出した。骨髄を機械的に分離し、ＢＭ－ＭＮＣをＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた密度勾配遠心分離によって単離した。
【0040】
・内皮細胞の調製とＢＭ－ＭＮＣとの共培養
メーカーのプロトコルに従い、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｋｕｒａｂｏ）を培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２、Ｋｕｒａｂｏ）、血清及び増殖添加剤とともに培養した。ＨＵＶＥＣを６ウェルプレート（１０００μｌ、１．５ｘ１０５細胞／ウェル）に播種し、７２時間インキュベートした。試料から上清（２００μｌ）を集めた。次に、共培養実験のために、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２のみ、又はＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２に懸濁させたＢＭ－ＭＮＣ懸濁液（１×１０６細胞／ウェル）、をＨＵＶＥＣに添加した。６時間共培養の後、上清（２００μｌ）をウェルから集めた。
メーカーのプロトコルに従い、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ、Ｋｕｒａｂｏ）を培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２、Ｋｕｒａｂｏ）、血清及び増殖添加剤とともに培養した。ＨＵＶＥＣを６ウェルプレート（１０００μｌ、１．５ｘ１０５細胞／ウェル）に播種し、７２時間インキュベートした。試料から上清（２００μｌ）を集めた。次に、共培養実験のために、ＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２のみ、又はＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ２に懸濁させたＢＭ－ＭＮＣ懸濁液（１×１０６細胞／ウェル）、をＨＵＶＥＣに添加した。６時間共培養の後、上清（２００μｌ）をウェルから集めた。
【0041】
ＨＵＶＥＣとＢＭ－ＭＮＣとの間のギャップ結合介在性細胞間相互作用の関連性を評価するために、ＢＭ－ＭＮＣをギャップ結合阻害剤である１－オクタノール（最終濃度１ｍＭ）又はギャップ結合阻害剤であるカルベノキソロン（ＣＤＸ：終濃度１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートし、ＨＵＶＥＣと共培養する前にＨｕＭｅｄｉａ－ＥＢ ２で２回洗浄した。
【0042】
・ＶＥＧＦ測定
ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）の濃度を、メーカーのプロトコルに従いＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて測定した。予想したとおり、ＢＭ－ＭＮＣ懸濁液中のｈＶＥＧＦレベルは検出限界以下であった。ＨＵＶＥＣとＢＭ－ＭＮＣとの間の細胞間相互作用の効果を評価するため、セルカルチャーインサート（１μｍ孔径：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて直接の細胞間相互作用を防止した。
ヒト血管内皮増殖因子（ｈＶＥＧＦ）の濃度を、メーカーのプロトコルに従いＢｉｏ－Ｐｌｅｘ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて測定した。予想したとおり、ＢＭ－ＭＮＣ懸濁液中のｈＶＥＧＦレベルは検出限界以下であった。ＨＵＶＥＣとＢＭ－ＭＮＣとの間の細胞間相互作用の効果を評価するため、セルカルチャーインサート（１μｍ孔径：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて直接の細胞間相互作用を防止した。
【0043】
・ＢＭ－ＭＮＣのサイトゾルへの低分子蛍光分子の導入
ＢＭ－ＭＮＣを１μＭのＢＣＥＣＦ－ＡＭ（２’，７’－ｂｉｓ－（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－５－（ａｎｄ－６）－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに室温で３０分間インキュベートした。使用前に、ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣをＰＢＳで２回洗浄した。
ＢＭ－ＭＮＣを１μＭのＢＣＥＣＦ－ＡＭ（２’，７’－ｂｉｓ－（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－５－（ａｎｄ－６）－ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ，ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともに室温で３０分間インキュベートした。使用前に、ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣをＰＢＳで２回洗浄した。
【0044】
・ＨＵＶＥＣによるＶＥＧＦの取り込み
ビオチン結合ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をストレプトアビジン結合ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、モル比４：１）とともに室温で１０分間インキュベートした。ＨＵＶＥＣをＰＢＳ中に懸濁した。２×１０５個のＢＭ－ＭＮＣ及びＡＰＣ標識ＶＥＧＦ（最終濃度１０ｎＭ）を１×１０５個のＨＵＶＥＣに加え、３７℃で３時間インキュベートした。同時インキュベーション後、細胞混合物をＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。ＨＵＶＥＣ中のＡＰＣのレベル（ＣＤ３１陽性、ＣＤ４５陰性及び７ＡＡＤ陰性）をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ蛍光セルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で評価した。ＶＥＧＦ取り込みに対するギャップ結合の役割を評価するために、ＢＭ－ＭＮＣを１－オクタノールとともにインキュベートした。
ビオチン結合ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をストレプトアビジン結合ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、モル比４：１）とともに室温で１０分間インキュベートした。ＨＵＶＥＣをＰＢＳ中に懸濁した。２×１０５個のＢＭ－ＭＮＣ及びＡＰＣ標識ＶＥＧＦ（最終濃度１０ｎＭ）を１×１０５個のＨＵＶＥＣに加え、３７℃で３時間インキュベートした。同時インキュベーション後、細胞混合物をＰＢＳで２回洗浄し、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識抗ヒトＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識抗マウスＣＤ４５抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び７－ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。ＨＵＶＥＣ中のＡＰＣのレベル（ＣＤ３１陽性、ＣＤ４５陰性及び７ＡＡＤ陰性）をＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ蛍光セルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で評価した。ＶＥＧＦ取り込みに対するギャップ結合の役割を評価するために、ＢＭ－ＭＮＣを１－オクタノールとともにインキュベートした。
【0045】
・局所脳虚血の誘発及びＢＭ－ＭＮＣ投与
再現性に優れたマウス脳梗塞モデルを採用した（Ｔａｇｕｃｈｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ＣＢ－１７ ａｎｄ ＳＣＩＤ Ｍｉｃｅ．”Ｊ Ｅｘｐ Ｓｔｒｏｋｅ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；３（１）：２８－３３．）。すなわち、３％ハロタン吸入麻酔下で双極鉗子を用いて７週齢のオスのＣＢ－１７マウス（オリエンタル酵母）の左中大脳動脈（ＭＣＡ）遠位部分を結紮及び切断して永久局所的脳虚血を誘発した。術中、直腸温をモニターし、フィードバック調節式加温パッドで３７．０±０．２℃に制御した。ＭＣＡ領域における脳血流（ＣＢＦ）もモニターした。ＭＣＡ閉塞直後にＣＢＦが７５％以上減少したマウスを実験に使用した（成功率１００％）。術前の動物の体重は２０～２５グラムであった。脳梗塞誘発４８時間後に、５×１０５個のＢＭ－ＭＮＣ又はＰＢＳを尾静脈から注入した。
再現性に優れたマウス脳梗塞モデルを採用した（Ｔａｇｕｃｈｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ａｎｄ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ＣＢ－１７ ａｎｄ ＳＣＩＤ Ｍｉｃｅ．”Ｊ Ｅｘｐ Ｓｔｒｏｋｅ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；３（１）：２８－３３．）。すなわち、３％ハロタン吸入麻酔下で双極鉗子を用いて７週齢のオスのＣＢ－１７マウス（オリエンタル酵母）の左中大脳動脈（ＭＣＡ）遠位部分を結紮及び切断して永久局所的脳虚血を誘発した。術中、直腸温をモニターし、フィードバック調節式加温パッドで３７．０±０．２℃に制御した。ＭＣＡ領域における脳血流（ＣＢＦ）もモニターした。ＭＣＡ閉塞直後にＣＢＦが７５％以上減少したマウスを実験に使用した（成功率１００％）。術前の動物の体重は２０～２５グラムであった。脳梗塞誘発４８時間後に、５×１０５個のＢＭ－ＭＮＣ又はＰＢＳを尾静脈から注入した。
【0046】
・免疫組織化学
梗塞皮質を分析するために組織化学的に、マウスをペントバルビタールナトリウムで深く麻酔し、生理食塩水終濃度４％パラホルムアルデヒドを含む生理食塩水で灌流して固定した。脳を注意深く摘出し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を用いて冠状切片（２０μｍ）を作製した。非脳梗塞ＣＢ－１７マウスの切片も、大脳皮質でのコネキシン３７及び４３の発現を評価するために作製した。切片をＣＤ３１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、希釈率１：５０）、ＬＣ３（Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５００）、ＨＩＦ－１α（Ｈｉｆ－１α Ｒ＆Ｄ、１：５０）、コネキシン３７（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ、１：５０）、コネキシン４３（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１：２００）又はＤＡＰＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１０００）に対する一次抗体で免疫染色した。抗Ｈｉｆ－１α抗体を３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）法によって可視化し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン溶液（Ｗａｋｏ）で対比染色した。Ａｌｅｘａ ５５５結合抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を二次抗体として使用して、ＣＤ３１、コネキシン３７及びコネキシン４３を可視化した。Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ６３３（すべてＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）－結合抗体を、それぞれＨｉｆ－１α、ＬＣ３、コネキシン３７又はコネキシン４３抗体を検出するための二次抗体として使用した。
梗塞皮質を分析するために組織化学的に、マウスをペントバルビタールナトリウムで深く麻酔し、生理食塩水終濃度４％パラホルムアルデヒドを含む生理食塩水で灌流して固定した。脳を注意深く摘出し、ビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）を用いて冠状切片（２０μｍ）を作製した。非脳梗塞ＣＢ－１７マウスの切片も、大脳皮質でのコネキシン３７及び４３の発現を評価するために作製した。切片をＣＤ３１（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、希釈率１：５０）、ＬＣ３（Ｍｅｄｉｃａｌ＆Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１：５００）、ＨＩＦ－１α（Ｈｉｆ－１α Ｒ＆Ｄ、１：５０）、コネキシン３７（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ、１：５０）、コネキシン４３（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、１：２００）又はＤＡＰＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１０００）に対する一次抗体で免疫染色した。抗Ｈｉｆ－１α抗体を３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）法によって可視化し、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン溶液（Ｗａｋｏ）で対比染色した。Ａｌｅｘａ ５５５結合抗体（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を二次抗体として使用して、ＣＤ３１、コネキシン３７及びコネキシン４３を可視化した。Ａｌｅｘａ６４７、Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ６３３（すべてＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）－結合抗体を、それぞれＨｉｆ－１α、ＬＣ３、コネキシン３７又はコネキシン４３抗体を検出するための二次抗体として使用した。
【0047】
・電子顕微鏡分析
超微細構造を分析するため、動物を４％パラホルムアルデヒドと２％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を含む固定液で灌流した。脳を注意深く摘出し、４℃のパラホルムアルデヒドに２４時間浸漬した。冠状脳切片をマイクロスライサーで１００μｍの厚さに薄切した。切片を１％ＯｓＯ４で固定した。１時間、脱水し、エポキシ樹脂中でシリコン処理したスライドグラス上に平らに包埋した。虚血性病変、脳梗塞周辺領域又は対応する対側性皮質領域を含む大脳皮質の超薄切片を切り出し、Ｆｏｒｍｖａｒ被覆シングルスロット（２ｘ１ｍｍ）グリッドに載せ、２％酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。電子顕微鏡写真は、ＪＥＭ－１４００ＥＸ＋（ＪＤＥＬ）を使用し８０ｋＶで撮影した。虚血性病変、脳梗塞周辺領域及び対応する対側性皮質領域におけるオートファゴソーム様液胞の数を数えた。
超微細構造を分析するため、動物を４％パラホルムアルデヒドと２％グルタルアルデヒド含有ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を含む固定液で灌流した。脳を注意深く摘出し、４℃のパラホルムアルデヒドに２４時間浸漬した。冠状脳切片をマイクロスライサーで１００μｍの厚さに薄切した。切片を１％ＯｓＯ４で固定した。１時間、脱水し、エポキシ樹脂中でシリコン処理したスライドグラス上に平らに包埋した。虚血性病変、脳梗塞周辺領域又は対応する対側性皮質領域を含む大脳皮質の超薄切片を切り出し、Ｆｏｒｍｖａｒ被覆シングルスロット（２ｘ１ｍｍ）グリッドに載せ、２％酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。電子顕微鏡写真は、ＪＥＭ－１４００ＥＸ＋（ＪＤＥＬ）を使用し８０ｋＶで撮影した。虚血性病変、脳梗塞周辺領域及び対応する対側性皮質領域におけるオートファゴソーム様液胞の数を数えた。
【0048】
・データ解析
群間の統計的比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定を用いたｐｏｓｔ－ｈｏｃ分析を用いて決定した。指示がある場合は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を使用して個々の比較を行った。全ての実験において、平均±ＳＤとして示した。
群間の統計的比較は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、続いてＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ検定を用いたｐｏｓｔ－ｈｏｃ分析を用いて決定した。指示がある場合は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ検定を使用して個々の比較を行った。全ての実験において、平均±ＳＤとして示した。
【0049】
２．結果
（１）ＢＭ－ＭＮＣはギャップ結合介在性相互作用を通してＨＵＶＥＣへのＶＥＧＦの取り込みを促進する
ＶＥＧＦは、最も顕著な血管新生促進因子の１つである。最初にＨＵＶＥＣ培地中のＶＥＧＦレベルに対するＢＭ－ＭＮＣの効果を評価した。マウスＢＭ－ＭＮＣをＨＵＶＥＣと共培養し、共培養の前及び６時間後に培地中のｈＶＥＧＦのレベルを評価した。ｈＶＥＧＦレベルはＢＭ－ＭＮＣとの共培養後にベースラインから有意に減少したが、対照においては増加した（図１Ａ）。セルカルチャーインサートによって分離されたＢＭ－ＭＮＣとの共培養では、ｈＶＥＧＦレベルは減少しなかった。この発見は、ＢＭ－ＭＮＣが細胞間相互作用を介してＨＵＶＥＣへのｈＶＥＧＦの取り込みを促進し得るという仮説を支持する。
（１）ＢＭ－ＭＮＣはギャップ結合介在性相互作用を通してＨＵＶＥＣへのＶＥＧＦの取り込みを促進する
ＶＥＧＦは、最も顕著な血管新生促進因子の１つである。最初にＨＵＶＥＣ培地中のＶＥＧＦレベルに対するＢＭ－ＭＮＣの効果を評価した。マウスＢＭ－ＭＮＣをＨＵＶＥＣと共培養し、共培養の前及び６時間後に培地中のｈＶＥＧＦのレベルを評価した。ｈＶＥＧＦレベルはＢＭ－ＭＮＣとの共培養後にベースラインから有意に減少したが、対照においては増加した（図１Ａ）。セルカルチャーインサートによって分離されたＢＭ－ＭＮＣとの共培養では、ｈＶＥＧＦレベルは減少しなかった。この発見は、ＢＭ－ＭＮＣが細胞間相互作用を介してＨＵＶＥＣへのｈＶＥＧＦの取り込みを促進し得るという仮説を支持する。
【0050】
仮説を確認するために、ＡＰＣ標識ＶＥＧＦをＨＵＶＥＣ培地に添加し、ＨＵＶＥＣへのＡＰＣ標識ＶＥＧＦの取り込みをＦＡＣＳによって評価した。ＨＵＶＥＣ及びＢＭ－ＭＮＣは、ＣＤ３１及びＣＤ４５に対する抗体によって区別した（図１Ｂ）。ＨＵＶＥＣへのＶＥＧＦの取り込みの増加は、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養後に観察された（図１Ｃ－Ｅ）。ギャップ結合は、骨髄の造血幹細胞（ＨＳＣ）と内皮細胞間の相互作用を含む、細胞間相互作用において重要な役割を果たすことが知られている。ＶＥＧＦの取り込みに対するギャップ結合を介した細胞間相互作用の本質的な寄与を調べた。ＢＭ－ＭＮＣが共培養の前にギャップ結合阻害薬（１－オクタノール又はカルベノキソロン）で前処理されている場合、ＨＵＶＥＣへのＡＰＣ－ＶＥＧＦの取り込みは改善されなかった（図１Ｆ、Ｇ）。ＨＵＶＥＣの存在下又は非存在下で共培養した場合、ＢＭ－ＭＮＣにおいてＶＥＧＦの取り込みがほとんど観察されなかったことに留意すべきである（図１Ｈ－Ｊ）
【0051】
（２）ギャップ結合を介したＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞への低分子量物質のｉｎ ｖｉｔｒｏ輸送
ＢＭ－ＭＮＣとＨＵＶＥＣ、低分子量蛍光の間の仮定されたギャップ結合介在性相互作用を確認するため、低分子蛍光物質（ＢＣＥＣＦ）をＢＭ－ＭＮＣの細胞質に導入した。ＢＣＥＣＦの分子量は約５２０であり、ギャップ結合を通過することが知られている。ＢＭ－ＭＮＣからＨＵＶＥＣへのＢＣＥＣＦの移行をＦＡＣＳによって評価した（図２Ａ、Ｂ）。ＢＭ－ＭＮＣとＨＵＶＥＣをセルカルチャーインサートで分離して共培養しても移動は観察されず（図２Ｃ）、ギャップ結合脱共役剤１－オクタノールを塗布した場合も移動は認められなかった（図２Ｄ）。ＢＭ－ＭＮＣとＨＵＶＥＣとの間のギャップ結合介在性相互作用を確認するために、コネキシン３７及び４３の発現を調べた。コネキシン３７の発現は観察されなかったが（図２Ｅ、Ｆ）、コネキシン４３の発現はＨＵＶＥＣの細胞表面で観察された（図２Ｇ、Ｈ）。対照的に、コネキシン３７（図２Ｉ、Ｊ）及びコネキシン４３（図２Ｋ）の両方の発現がＢＭ－ＭＮＣで観察された。
ＢＭ－ＭＮＣとＨＵＶＥＣ、低分子量蛍光の間の仮定されたギャップ結合介在性相互作用を確認するため、低分子蛍光物質（ＢＣＥＣＦ）をＢＭ－ＭＮＣの細胞質に導入した。ＢＣＥＣＦの分子量は約５２０であり、ギャップ結合を通過することが知られている。ＢＭ－ＭＮＣからＨＵＶＥＣへのＢＣＥＣＦの移行をＦＡＣＳによって評価した（図２Ａ、Ｂ）。ＢＭ－ＭＮＣとＨＵＶＥＣをセルカルチャーインサートで分離して共培養しても移動は観察されず（図２Ｃ）、ギャップ結合脱共役剤１－オクタノールを塗布した場合も移動は認められなかった（図２Ｄ）。ＢＭ－ＭＮＣとＨＵＶＥＣとの間のギャップ結合介在性相互作用を確認するために、コネキシン３７及び４３の発現を調べた。コネキシン３７の発現は観察されなかったが（図２Ｅ、Ｆ）、コネキシン４３の発現はＨＵＶＥＣの細胞表面で観察された（図２Ｇ、Ｈ）。対照的に、コネキシン３７（図２Ｉ、Ｊ）及びコネキシン４３（図２Ｋ）の両方の発現がＢＭ－ＭＮＣで観察された。
【0052】
（３）ギャップ結合を介したＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞への低分子量物質のｉｎ ｖｉｖｏ移動
ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣを脳梗塞誘発４８時間後にマウスに静脈内移植した。ＢＭ－ＭＮＣ注入の５分後、マウスを安楽死させ、ＢＣＥＣＦの局在を蛍光顕微鏡により評価した。ＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞へのＢＣＥＣＦ移行の証拠とともに、ＢＣＥＣＦ陽性細胞が脳梗塞領域の微小血管系において観察された（図３Ａ－Ｄ）。ＢＭ－ＭＮＣと内皮細胞との間のギャップ結合介在性細胞間相互作用を調査するために、脳梗塞後の脳におけるコネキシン３７の発現を調査した。非脳梗塞マウスではコネキシン３７の発現はほとんど観察されず（図３Ｅ）、脳梗塞誘発の４８時間後の病変領域ではコネキシン３７の発現の増加が観察された（図３Ｆ）。同様に、非脳梗塞マウスにおいてコネキシン４３の発現は観察されなかった（図３Ｇ）。しかし、コネキシン４３発現は、脳梗塞誘発の４８時間後に病変領域において増加した（図３Ｈ）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＭ－ＭＮＣと内皮細胞との間のギャップ結合介在性の細胞間相互作用を確認するために、ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣを脳梗塞誘発４８時間後にマウスに静脈内移植した。ＢＣＥＣＦ陽性シグナルは、コネキシン３７（図３Ｉ－Ｌ）及びコネキシン４３（図３Ｍ－Ｐ）の蓄積を伴う内皮細胞において観察された。
ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣを脳梗塞誘発４８時間後にマウスに静脈内移植した。ＢＭ－ＭＮＣ注入の５分後、マウスを安楽死させ、ＢＣＥＣＦの局在を蛍光顕微鏡により評価した。ＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞へのＢＣＥＣＦ移行の証拠とともに、ＢＣＥＣＦ陽性細胞が脳梗塞領域の微小血管系において観察された（図３Ａ－Ｄ）。ＢＭ－ＭＮＣと内皮細胞との間のギャップ結合介在性細胞間相互作用を調査するために、脳梗塞後の脳におけるコネキシン３７の発現を調査した。非脳梗塞マウスではコネキシン３７の発現はほとんど観察されず（図３Ｅ）、脳梗塞誘発の４８時間後の病変領域ではコネキシン３７の発現の増加が観察された（図３Ｆ）。同様に、非脳梗塞マウスにおいてコネキシン４３の発現は観察されなかった（図３Ｇ）。しかし、コネキシン４３発現は、脳梗塞誘発の４８時間後に病変領域において増加した（図３Ｈ）。ｉｎ ｖｉｖｏでのＢＭ－ＭＮＣと内皮細胞との間のギャップ結合介在性の細胞間相互作用を確認するために、ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣを脳梗塞誘発４８時間後にマウスに静脈内移植した。ＢＣＥＣＦ陽性シグナルは、コネキシン３７（図３Ｉ－Ｌ）及びコネキシン４３（図３Ｍ－Ｐ）の蓄積を伴う内皮細胞において観察された。
【0053】
（４）ＢＭ－ＭＮＣ移植は脳梗塞後の内皮細胞におけるオートファジーを減少させる
ＢＭ－ＭＮＣ移植後の内皮細胞における超微細構造変化を調べるために、電子顕微鏡検査用の試験片を調製した。図４Ａは、内皮細胞、基底膜、周皮細胞、及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｆｏｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）で構成される病変のない脳の正常な血液脳関門（ＢＢＢ）を有する無傷の毛細血管を示す。
ＢＭ－ＭＮＣ移植後の内皮細胞における超微細構造変化を調べるために、電子顕微鏡検査用の試験片を調製した。図４Ａは、内皮細胞、基底膜、周皮細胞、及び星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔｅ ｆｏｏｔ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）で構成される病変のない脳の正常な血液脳関門（ＢＢＢ）を有する無傷の毛細血管を示す。
【0054】
予想通り、ニューロン及びグリア細胞の変性及び壊死は、脳梗塞誘発７２時間後（すなわち、それぞれＰＢＳ及びＢＭ－ＭＮＣ投与の２４時間後）の病巣中心において有意であったが、血管構造は依然としてＰＢＳ処置マウス（図４Ｂ）及びＢＭ－ＭＮＣ処置マウス（図４Ｃ）の両方で比較的良好に維持された。ＰＢＳ処置マウス（図４Ｂ）では、内皮細胞中に多数のオートファゴソーム様液胞が形成され、時には非晶質物質を含有したり、層状構造を有していた。不明瞭なクリステを伴う変性ミトコンドリアもＥＣ細胞質において観察され、核ヘテロクロマチンも減少した。対照的に、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスではほとんど変化が見られなかった（図４Ｃ）。
【0055】
脳梗塞周辺領域では、ＰＢＳを投与されたマウス内皮細胞の細胞質内に様々なサイズの液胞が形成された（図４Ｄ）。対照的に、ＢＭ－ＭＮＣを投与されたマウスは、内皮細胞においてオートファゴソーム様液胞形成をほとんど示さなかった（図４Ｅ）。内皮細胞におけるいくらかの液胞が、ＰＢＳを投与されたマウスの病変のない対側皮質で観察された（図４Ｆ）が、ＢＭ－ＭＮＣを投与されたマウスにおいてはそのような液胞は観察されなかった（図４Ｇ）。異なる領域におけるオートファゴソーム様液胞数を計測したところ、ＢＭ－ＭＮＣ移植はすべての関連領域でオートファゴソーム様液胞の形成を減少させることが確認された（図４Ｈ）。
【0056】
内皮細胞におけるオートファゴソーム様液胞を調べるために、脳梗塞誘発７２時間後（すなわち、ＰＢＳ又はＢＭ－ＭＮＣ注射の２４時間後）の脳切片をオートファジーマーカーであるＬＣ３で染色した。ＬＣ３陽性血管内皮細胞は、脳梗塞領域においては、ＰＢＳ処置マウス及びＢＭ－ＭＮＣ処置マウスの両方において観察された。脳梗塞周辺領域では、ＰＢＳ投与マウスにおいはＬＣ３陽性血管内皮細胞が観察されたが、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスにおいてほとんど観察されなかった（図５Ｂ）。脳梗塞反対側においては、ＰＢＳ投与マウスにおいはＬＣ３陽性血管内皮細胞が観察されたが、ＢＭ－ＭＮＣ処置マウスにおいては、全く観察されなかった。（図５Ｃ）。これらのデータは、ＢＭ－ＭＮＣ移植が、脳虚血後の内皮細胞におけるオートファジーを抑制することを実証する。
【0057】
（５）ＢＭ－ＭＮＣ移植後の脳梗塞後の微小血管系におけるＨｉｆ－１α発現の増加
内皮細胞におけるＶＥＧＦ取り込みの上流調節因子を最終的に調査するために、脳梗塞後の脳におけるＨｉｆ－１αの発現を調査した。以前の報告と同様に、脳梗塞誘発３時間後（図６Ｂ）又は４８時間後（図６Ｃ）において、損傷を受けていない脳ではＨｉｆ－１αの発現はほとんど観察されなかった（図６Ａ）。ＢＭ－ＭＮＣは、脳梗塞の誘発後４８時間に静脈内投与され、細胞投与後１時間で、脳梗塞後の脳の血管系様細胞におけるＨｉｆ－１αの発現が見られた。ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣの移植後のＨｉｆ－１α活性化の可能性の増加を調べた。ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣを脳梗塞誘発後４８時間で静脈内注射し、内皮細胞におけるＢＣＥＣＦ及びＨｉｆ－１αの局在を細胞注射後３０分で調べた。その結果、内皮細胞ではＢＣＥＣＦとＨｉｆ－１αの共局在が観察された（図６Ｅ－Ｈ）。これらのデータは、ＢＭ－ＭＮＣからの低分子量物質の移動が脳梗塞後の脳の内皮細胞においてＨｉｆ－１αの発現を潜在的に誘導し得ることを示した。
内皮細胞におけるＶＥＧＦ取り込みの上流調節因子を最終的に調査するために、脳梗塞後の脳におけるＨｉｆ－１αの発現を調査した。以前の報告と同様に、脳梗塞誘発３時間後（図６Ｂ）又は４８時間後（図６Ｃ）において、損傷を受けていない脳ではＨｉｆ－１αの発現はほとんど観察されなかった（図６Ａ）。ＢＭ－ＭＮＣは、脳梗塞の誘発後４８時間に静脈内投与され、細胞投与後１時間で、脳梗塞後の脳の血管系様細胞におけるＨｉｆ－１αの発現が見られた。ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣの移植後のＨｉｆ－１α活性化の可能性の増加を調べた。ＢＣＥＣＦ標識ＢＭ－ＭＮＣを脳梗塞誘発後４８時間で静脈内注射し、内皮細胞におけるＢＣＥＣＦ及びＨｉｆ－１αの局在を細胞注射後３０分で調べた。その結果、内皮細胞ではＢＣＥＣＦとＨｉｆ－１αの共局在が観察された（図６Ｅ－Ｈ）。これらのデータは、ＢＭ－ＭＮＣからの低分子量物質の移動が脳梗塞後の脳の内皮細胞においてＨｉｆ－１αの発現を潜在的に誘導し得ることを示した。
【0058】
３．考察
本結果により、ＢＭ－ＭＮＣが低分子物質のギャップ結合介在性細胞間交換によりＨｉｆ－１α発現を増加させることで、ＶＥＧＦ取り込みをアップレギュレートし、内皮細胞活性化をサポートすることが実証された。
本結果により、ＢＭ－ＭＮＣが低分子物質のギャップ結合介在性細胞間交換によりＨｉｆ－１α発現を増加させることで、ＶＥＧＦ取り込みをアップレギュレートし、内皮細胞活性化をサポートすることが実証された。
【0059】
内皮細胞は骨髄血管ニッチで骨髄細胞集団と連絡することが知られており、これはギャップ結合に仲介される。本実験では、脳内皮細胞におけるコネキシン３７と４３の発現が脳梗塞後にアップレギュレートされることを実証した。低分子水溶性物質は、移植されたＢＭ－ＭＮＣから内皮細胞に移動し、この移動によりＨｉｆ－１α含有量が増加した。Ｈｉｆ－１αの活性化は、内皮細胞へのＶＥＧＦ取り込みのアップレギュレーションを誘導することが知られている（Ｇｌｅａｄｌｅ ＪＭ ａｎｄ Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ ＰＪ．，（１９９７）Ｂｌｏｏｄ．１５；８９（２）：ｐｐ５０３－９．）。これらの知見は、内皮細胞におけるＨｉｆ－１αのＢＭ－ＭＮＣ介在性活性化、それに続くＶＥＧＦ取り込みのアップレギュレーションが、脳梗塞における細胞療法による血管形成の重要なメカニズムであることを示す。このＢＭ－ＭＮＣによるＶＥＧＦ取り込みに至る複雑な過程を低分子で代替することができれば、それは脳梗塞など血管新生が関与する疾患に対して、細胞療法に代わる治療法として有用である。
【実施例2】
【0060】
実施例２：ＢＭ－ＭＮＣによるＨＵＶＥＣの各種サイトカイン取り込みの促進
１．材料及び方法
ＢＭ－ＭＮＣは、実施例１に記載した方法で調製した。実施例１にしたがいＨＵＶＥＣをＢＭ－ＭＮＣと共培養し、培養上清中の各種サイトカイン濃度の培養６時間での変化量を調べた。各種サイトカイン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－α（いずれもヒト由来））の濃度は、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ＰｒｏヒトＣａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ２ １８－Ｐｌｅｘパネル＃１７１ＡＣ６００Ｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて同時に測定した。比較のため、ＢＭ－ＭＮＣの代わりに、同量の培地を添加して同様にＨＵＶＥＣを培養したときの各種サイトカインの濃度も測定した。
１．材料及び方法
ＢＭ－ＭＮＣは、実施例１に記載した方法で調製した。実施例１にしたがいＨＵＶＥＣをＢＭ－ＭＮＣと共培養し、培養上清中の各種サイトカイン濃度の培養６時間での変化量を調べた。各種サイトカイン（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１（Ｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－１）、ＴＮＦ－α、ＴＧＦ－α（いずれもヒト由来））の濃度は、Ｂｉｏ－Ｐｌｅｘ ＰｒｏヒトＣａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ２ １８－Ｐｌｅｘパネル＃１７１ＡＣ６００Ｍ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて同時に測定した。比較のため、ＢＭ－ＭＮＣの代わりに、同量の培地を添加して同様にＨＵＶＥＣを培養したときの各種サイトカインの濃度も測定した。
【0061】
２．結果
結果を図７に示す。Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２は、ＨＵＶＥＣのみの場合には培養上清中の濃度は７０８１ｐＭに増加したが、ＢＭ－ＭＮＣと共培養した場合には培養上清中の濃度は１６１８ｐＭ低下し、結果としてＢＭ－ＭＮＣは培養上清中のＡｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２を８６９９ｐＭ低下させる。同様に、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１、ＴＮＦα、ＴＧＦαについても、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養により、培養上清中の濃度は有意な差を持って低下した。なおこの実験系では、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養前と、共培養６時間後の、培養上清中の濃度の変化を観察しており、値がプラスであれば、培養上清中の濃度が上昇したこと、値がマイナスであれば培養上清中の濃度が低下したこと、値が０であれば、培養上清中の濃度に変化がなかったことを示す。
結果を図７に示す。Ａｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２は、ＨＵＶＥＣのみの場合には培養上清中の濃度は７０８１ｐＭに増加したが、ＢＭ－ＭＮＣと共培養した場合には培養上清中の濃度は１６１８ｐＭ低下し、結果としてＢＭ－ＭＮＣは培養上清中のＡｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２を８６９９ｐＭ低下させる。同様に、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１、ＴＮＦα、ＴＧＦαについても、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養により、培養上清中の濃度は有意な差を持って低下した。なおこの実験系では、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養前と、共培養６時間後の、培養上清中の濃度の変化を観察しており、値がプラスであれば、培養上清中の濃度が上昇したこと、値がマイナスであれば培養上清中の濃度が低下したこと、値が０であれば、培養上清中の濃度に変化がなかったことを示す。
【0062】
３．考察
培養上清中のＡｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１、ＴＮＦα、ＴＧＦαなどのサイトカイン濃度の低下は、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養により、ＶＥＧＦに加えて、これらサイトカインの細胞内への取り込みが増加することを示唆する。これらのサイトカインも、血管新生に深く関与している分子であり、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養によりＶＥＧＦと同様にＨＵＶＥＣでの取り込みが増加したと考えられる。そのため、これらのサイトカインの培養上清中濃度の減少あるいはＨＵＶＥＣへの取り込み量を測定することにより、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質のスクリーニングが、可能となる。
培養上清中のＡｎｇｉｏｐｏｅｔｉｎ－２、Ｅｎｄｏｇｌｉｎ、ＩＧＦＢＰ－１、ＴＮＦα、ＴＧＦαなどのサイトカイン濃度の低下は、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養により、ＶＥＧＦに加えて、これらサイトカインの細胞内への取り込みが増加することを示唆する。これらのサイトカインも、血管新生に深く関与している分子であり、ＢＭ－ＭＮＣとの共培養によりＶＥＧＦと同様にＨＵＶＥＣでの取り込みが増加したと考えられる。そのため、これらのサイトカインの培養上清中濃度の減少あるいはＨＵＶＥＣへの取り込み量を測定することにより、血管内皮細胞活性化促進又は抑制物質のスクリーニングが、可能となる。
【実施例3】
【0063】
実施例３：標準物質を使った血管活性化物質の定量的評価方法の標準化
発明者らは、本発明の実験系（スクリーニング系）により、１００μｇ／ｍｌのＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ、ＣＡＳ登録番号３３１－３９－５）には、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ取り込み作用があることが確認された。事実、Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄは、クロロゲン酸類に属するポリフェノールであり、クロロゲン酸類に属するポリフェノールには血管機能向上効果が知られている（Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２００７ Ｍａｙ；２０（５）：５０８－１３．Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｔｏｒｅｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｏｒｔａｓ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ．）。このことから、本実験系は血管内皮細胞活性化作用のスクリーニングに有用と判断された。
本実施例では、このＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ（１００μｇ／ｍｌ）を標準物質として、他の低分子化合物の血管内皮細胞に対するＶＥＧＦ取り込み促進作用を定量的に評価できることを示す。
発明者らは、本発明の実験系（スクリーニング系）により、１００μｇ／ｍｌのＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ（３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄ、ＣＡＳ登録番号３３１－３９－５）には、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦ取り込み作用があることが確認された。事実、Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄは、クロロゲン酸類に属するポリフェノールであり、クロロゲン酸類に属するポリフェノールには血管機能向上効果が知られている（Ａｍ Ｊ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２００７ Ｍａｙ；２０（５）：５０８－１３．Ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｔｏｒｅｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｓｏｄｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ ａｏｒｔａｓ ｏｆ ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅｒａｔｓ．）。このことから、本実験系は血管内皮細胞活性化作用のスクリーニングに有用と判断された。
本実施例では、このＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ（１００μｇ／ｍｌ）を標準物質として、他の低分子化合物の血管内皮細胞に対するＶＥＧＦ取り込み促進作用を定量的に評価できることを示す。
【0064】
１．材料及び方法
ビオチン結合ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をストレプトアビジン結合ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、モル比４：１）とともに室温で１０分間インキュベートし、ＡＰＣ結合ＶＥＧＦを作成した。上記等同様の方法でＨＵＶＥＣを回収し、ＰＢＳ中に懸濁した。
ビオチン結合ＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をストレプトアビジン結合ＡＰＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、モル比４：１）とともに室温で１０分間インキュベートし、ＡＰＣ結合ＶＥＧＦを作成した。上記等同様の方法でＨＵＶＥＣを回収し、ＰＢＳ中に懸濁した。
【0065】
実験サンプルとして、以下の１－６を用意した。
１．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加えないサンプル（蛍光バックグランド）
２．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、ＰＢＳを添加後、３時間培養したもの（標準物質／被検物質なし）
３．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、１００μｇ／ｍｌのＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄを添加後、３時間培養したもの（標準物質）
４．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、ＶＥＧＦ取り込み促進作用が未知である４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＳ登録番号９０５－９９－７）を１００μｇ／ｍｌとなるように添加後、３時間培養したもの（被検物質１）
５．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、ＶＥＧＦ取り込み促進作用が未知であるＣｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＳ登録番号６５３７－８０－０）を１００μｇ／ｍｌとなるように添加後、３時間培養したもの（被検物質２）
１．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加えないサンプル（蛍光バックグランド）
２．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、ＰＢＳを添加後、３時間培養したもの（標準物質／被検物質なし）
３．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、１００μｇ／ｍｌのＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄを添加後、３時間培養したもの（標準物質）
４．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、ＶＥＧＦ取り込み促進作用が未知である４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＳ登録番号９０５－９９－７）を１００μｇ／ｍｌとなるように添加後、３時間培養したもの（被検物質１）
５．ＨＵＶＥＣにＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加え、ＶＥＧＦ取り込み促進作用が未知であるＣｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ（ＣＡＳ登録番号６５３７－８０－０）を１００μｇ／ｍｌとなるように添加後、３時間培養したもの（被検物質２）
【0066】
２．結果
本測定系のバックグランド蛍光（ＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加えなかったサンプルの蛍光強度）は１．５４であった（図８Ａ）。標準物質／被検物質なし（ＰＢＳ添加）のサンプルは、４．９２の蛍光強度を示した（図８Ｂ）。標準物質（１００μｇ／ｍｌ Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）添加サンプルは、６．７８の蛍光強度を示した。被験物質１及び２（各１００μｇ／ｍｌの４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｃｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ）添加サンプルは、それぞれ、６．５６、３．９０の蛍光強度を示した（図８Ｄ、Ｅ）。
本測定系のバックグランド蛍光（ＡＰＣ結合ＶＥＧＦを加えなかったサンプルの蛍光強度）は１．５４であった（図８Ａ）。標準物質／被検物質なし（ＰＢＳ添加）のサンプルは、４．９２の蛍光強度を示した（図８Ｂ）。標準物質（１００μｇ／ｍｌ Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）添加サンプルは、６．７８の蛍光強度を示した。被験物質１及び２（各１００μｇ／ｍｌの４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ、Ｃｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ）添加サンプルは、それぞれ、６．５６、３．９０の蛍光強度を示した（図８Ｄ、Ｅ）。
【0067】
標準物質／被検物質なしの場合のＶＥＧＦ取り込み量は、３．３８（蛍光強度４．９２よりバックグランド蛍光１．５４を差し引いた値）、標準物質（Ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）添加サンプルのＶＥＧＦ取り込み量は、５．２４であった。これらの結果は、標準物質の添加によりＨＵＶＥＣではＶＥＧＦ取り込みが５５％増加したことを示す（（標準物質添加時のＶＥＧＦ取り込み量［５．２４］－標準物質／被検物質なしの場合のＶＥＧＦ取り込み量［３．３８］）／標準物質／被検物質なしの場合のＶＥＧＦ取り込み量［３．３８］）。
【0068】
被検物質１（４－０－Ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ）では、ＨＵＶＥＣには４９％増加のＶＥＧＦ取り込みが起こることが示されており、結果として、標準物質に比し、その取り込み促進能力は８８％であることが判明した（［４９％］／［５５％］）。
【0069】
被検物質２（Ｃｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄ）では、ＨＵＶＥＣには３０％減少のＶＥＧＦ取り込みが起こることが示されており、結果として、標準物質に比し、その取り込み促進能力は－５５％であることが判明した（［－３０％］／［５５％］）。
【0070】
３．考察
以上のように、本測定系を用いることにより、標準物質であるＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄに比べて、どの程度の血管内皮細胞活性化作用を有しているかの判定が可能である。さらに、本測定系を用いることにより、血管活性化を促進する物質だけでなく、血管活性化を抑制する物質の定量的判定も可能である。なお、標準物質は適宜変更することも可能である。
以上のように、本測定系を用いることにより、標準物質であるＣａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄに比べて、どの程度の血管内皮細胞活性化作用を有しているかの判定が可能である。さらに、本測定系を用いることにより、血管活性化を促進する物質だけでなく、血管活性化を抑制する物質の定量的判定も可能である。なお、標準物質は適宜変更することも可能である。
【0071】
なおＣａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄは血管内皮活性化作用があることが知られている（Ｉｎｔ Ｊ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉ Ｎｕｔｒ．２０１９ Ｍａｙ；７０（３）：２６７－２８４．ＴＮＦ－α－ｉｎｄｕｃｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ＥＡ．ｈｙ９２６ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｍａｔｅ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｃｏｆｆｅｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ，５－ｃａｆｆｅｏｙｌｑｕｉｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｉｔｓ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ，ｄｉｈｙｄｒｏｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ．Ｗａｎｇ Ｓ，ｅｔ ａｌ．）。また、Ｃｈｉｃｏｒｉｃ ａｃｉｄはＨｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ ａｃｉｄであるが、それらは血管新生阻害作用があることが知られており（２０１１年度ＫＡＫＥＮ費実績報告書（研究課題／領域番号：２１３９００３３）、血管新生阻害療法のためのバイオプローブ分子設計とケミカルジェネティクス、研究代表者：永澤 秀子）、本測定系の結果とも一致している。
【産業上の利用可能性】
【0072】
本発明により、ＢＭ－ＭＮＣと同様の機構で血管内皮細胞を活性化する作用を有する物質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで簡便にスクリーニングすることができる。本発明の方法で同定された物質は、生体内でのＢＭ－ＭＮＣの機能を代替し、脳梗塞や四肢虚血などの虚血性疾患、あるいは癌などの血管新生病の治療薬の候補物質として有用である。
【0073】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】