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特許7466553生物学的製剤における可視粒子及び／またはサブビジブル粒子のキャラクタリゼーション方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-04
(45)【発行日】2024-04-12
(54)【発明の名称】生物学的製剤における可視粒子及び／またはサブビジブル粒子のキャラクタリゼーション方法
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240405BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240405BHJP
G01N 15/10 20240101ALI20240405BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240405BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N27/62 V
G01N27/62 X
G01N15/10 Z
C12Q1/02
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2021544299
(86)(22)【出願日】2020-01-29
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-03-22
(86)【国際出願番号】 US2020015699
(87)【国際公開番号】W WO2020160161
(87)【国際公開日】2020-08-06
【審査請求日】2023-01-13
(31)【優先権主張番号】62/798,750
(32)【優先日】2019-01-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】507302748
【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】シュ シャオビン
【審査官】北条 弥作子
(56)【参考文献】
【文献】特表昭６３－５０２９５８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１２８４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５２４７１１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５２５３９０（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１８／００７４５６（ＷＯ，Ａ１）
【文献】国際公開第２０１７／１４３３３２（ＷＯ，Ａ１）
【文献】特表２０１５－５０３７６６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１６－５１９１４５（ＪＰ，Ａ）
【文献】米国特許出願公開第２００９／０１３６９３７（ＵＳ，Ａ１）
【文献】米国特許出願公開第２０１７／０１３７５００（ＵＳ，Ａ１）
【文献】John den Engelsman，Strategies for the Assessment of Protein Aggregates in Pharmaceutical Biotech Product Development，Pharm Res，2011年，28，pp.920-933，DOI 10.1007/s11095-010-0297-1
【文献】Krista Rule Wigginton，Gold-coated polycarbonate membrane filter for pathogen concentration and SERS-based detection，Analyst，2010年，135，pp.1320-1326
【文献】M. Rocchia，Microplastic identification and characterization by Raman imaging spectroscopy，Thermo Fisher Scientific，2017年11月10日，pp.1-5
【文献】Jared S. Bee，Trace Levels of the CHO Host Cell Protease Cathepsin D Caused Particle Formation in a Monoclonal Antibody Product，Biotechnol. Prog.，2015年，Vol. 31, No. 5，pp.1360-1369，DOI 10.1002/btpr.2150
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｇ０１Ｎ ３３／４８～３３／９８
Ｇ０１Ｎ ２７／６２
Ｇ０１Ｎ １５／１０
Ｇ０１Ｎ １／００～ １／４４
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質のキャラクタリゼーション方法であって、
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を分析して、タンパク質の存在を同定すること；及び
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を質量分析法分析に供して前記タンパク質をキャラクタリゼーションすること
を含む、方法。
【請求項2】
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、ラマン分光法を使用して分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、少なくとも約１００μｍのサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、固有の不純物である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
金でコーティングされたポリカーボネート膜上に、前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記金でコーティングされたポリカーボネート膜の細孔サイズが、約５μｍである、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を分析した後に前記サンプルを尿素に溶解することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
尿素の濃度が約８Ｍである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を分析した後に変性条件下で前記サンプルを消化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記サンプルが、目的のタンパク質をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記目的のタンパク質が抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記目的のタンパク質が治療用抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
質量分析法分析の前に、前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を液体クロマトグラフィー分離に供することをさらに含み、質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに連結されている、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記液体クロマトグラフィーシステムが、ナノ液体クロマトグラフィーシステムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記タンパク質が、宿主細胞由来タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の少なくとも１種のタンパク質の定量方法であって、
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を分析して、前記少なくとも１種のタンパク質の存在を同定すること；及び
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を質量分析法分析に供して前記少なくとも１種のタンパク質を定量すること
を含む、方法。
【請求項18】
前記少なくとも１種のタンパク質が、宿主細胞由来タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、タンパク質の凝集体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質のキャラクタリゼーション方法であって、
前記少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を分析して、タンパク質の存在を同定すること；及び
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を質量分析法分析に供して、前記タンパク質が宿主細胞由来タンパク質であるかどうかを決定するために前記タンパク質をキャラクタリゼーションすること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
分野
本発明は、概して、サンプル中に形成された可視粒子及び／またはサブビジブル粒子中の１種以上のタンパク質をキャラクタリゼーションまたは定量する方法に関する。
本発明は、概して、サンプル中に形成された可視粒子及び／またはサブビジブル粒子中の１種以上のタンパク質をキャラクタリゼーションまたは定量する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
背景
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のための重要な薬品として台頭してきており、それらは製薬業界で最も急速に成長している製品セグメントのうちの１つである。ロバストかつ安定したバイオ医薬品は、バイオ医薬品業界で成功を収めるための重要な要素である。重要な基準は、可視粒子及び／またはサブビジブル粒子を本質的に含まない製剤の開発である。特にそのようなタンパク質ベースのバイオ医薬品における可視粒子及び／またはサブビジブル粒子は、数年間バイオ医薬品業界内での議論及び調査の焦点となってきた。合成材料または生物学的材料から構成された、様々な供給源由来の粒子は、患者において免疫原性作用の可能性を高めることがあり、また医薬品に対する様々な影響を有する可能性がある。したがって、これらの粒子を医薬品から低減または排除する助けとするために、これらの粒子の起源、組成、及び結果を調査することが重要になる場合がある。
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のための重要な薬品として台頭してきており、それらは製薬業界で最も急速に成長している製品セグメントのうちの１つである。ロバストかつ安定したバイオ医薬品は、バイオ医薬品業界で成功を収めるための重要な要素である。重要な基準は、可視粒子及び／またはサブビジブル粒子を本質的に含まない製剤の開発である。特にそのようなタンパク質ベースのバイオ医薬品における可視粒子及び／またはサブビジブル粒子は、数年間バイオ医薬品業界内での議論及び調査の焦点となってきた。合成材料または生物学的材料から構成された、様々な供給源由来の粒子は、患者において免疫原性作用の可能性を高めることがあり、また医薬品に対する様々な影響を有する可能性がある。したがって、これらの粒子を医薬品から低減または排除する助けとするために、これらの粒子の起源、組成、及び結果を調査することが重要になる場合がある。
【0003】
可視粒子及び／またはサブビジブル粒子がバイオ医薬品中で生じる場合、それらの組成の同定は、それらの形成の理解及び軽減において重要なステップである。しかしながら、これらの粒子は小さく、壊れやすく、単離が難しく、少量の材料のみから構成されていることから、これはワークフロー及び分析試験を決定するには困難な課題である。前述したことから、サンプル中で形成され得るそのような可視粒子及び／またはサブビジブル粒子をキャラクタリゼーションするための改善された方法に対する要求が存在することが理解されるであろう。
【発明の概要】
【0004】
概要
バイオ医薬品を開発する際の重要な基準は、可視粒子及びサブビジブル粒子を含まない製剤を開発することである。そのような粒子が生じる場合には、それらの同定及び定量がバイオプロセスの重要なステップになる可能性がある。
バイオ医薬品を開発する際の重要な基準は、可視粒子及びサブビジブル粒子を含まない製剤を開発することである。そのような粒子が生じる場合には、それらの同定及び定量がバイオプロセスの重要なステップになる可能性がある。
【0005】
本明細書に開示の例示的な実施形態は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーション、同定、及び／または定量する方法を提供することによって前述した要求を満たす。
【0006】
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法を提供する。
【0007】
例示的な一実施形態では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること、及び質量分析計を使用してタンパク質をキャラクタリゼーションすることを含む。
【0008】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、ラマン分光法を使用して少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定することを含み得る。
【0009】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、少なくとも約５μｍのサイズを有する少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を含み得る。
【0010】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、固有の不純物を含む少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を含み得る。
【0011】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、金でコーティングされたポリカーボネート膜上に、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含み得る。
【0012】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、金でコーティングされた約５μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜上に、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含み得る。
【0013】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルを尿素に溶解することをさらに含み得る。
【0014】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルをグアニジン塩酸塩に溶解することをさらに含み得る。
【0015】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルを８Ｍの尿素溶液に溶解することをさらに含み得る。
【0016】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルを変性条件下で消化することをさらに含み得る。
【0017】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、目的のタンパク質をさらに含むサンプルを含み得る。
【0018】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、抗体をさらに含むサンプルを含み得る。
【0019】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、治療用抗体をさらに含むサンプルを含み得る。
【0020】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーシステムを含み得る。
【0021】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、質量分析計に連結されたナノ液体クロマトグラフィーシステムを含み得る。
【0022】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、タンパク質をキャラクタリゼーションするためにタンデム質量分析計を使用することを含み得る。
【0023】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、宿主細胞由来タンパク質であるタンパク質を含み得る。
【0024】
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【0025】
例示的な一実施形態では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること、及び質量分析計を使用してタンパク質をキャラクタリゼーションすることを含む。
【0026】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、ラマン分光法を使用して少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定することを含み得る。
【0027】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、少なくとも約５μｍのサイズを有する少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を含み得る。
【0028】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、固有の不純物であってもよい。
【0029】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、金でコーティングされたポリカーボネート膜上に、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含み得る。
【0030】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、金でコーティングされた約５μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜上に、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含み得る。
【0031】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルを尿素に溶解することをさらに含み得る。
【0032】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルを８Ｍの尿素溶液に溶解することをさらに含み得る。
【0033】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定した後にサンプルを変性条件下で消化することをさらに含み得る。
【0034】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質をさらに含むサンプルを含み得る。
【0035】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、抗体をさらに含むサンプルを含み得る。
【0036】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、治療用抗体をさらに含むサンプルを含み得る。
【0037】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーシステムを含み得る。
【0038】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、質量分析計に連結されたナノ液体クロマトグラフィーシステムを含み得る。
【0039】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、タンパク質をキャラクタリゼーションするためにタンデム質量分析計を使用することを含み得る。
【0040】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法は、宿主細胞由来タンパク質であるタンパク質を含み得る。
【0041】
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法を提供する。
【0042】
例示的な一実施形態では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること、及び質量分析計を使用して、タンパク質が宿主細胞由来タンパク質であるかどうかを決定するためにタンパク質をキャラクタリゼーションすることを含む。
【0043】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、ラマン分光法を使用して少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在を同定することを含み得る。
【0044】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、少なくとも約５μｍのサイズを有する少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を含み得る。
【0045】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、固有の不純物であってもよい宿主細胞由来タンパク質を含み得る。
【0046】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、金でコーティングされたポリカーボネート膜上に、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含み得る。
【0047】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、金でコーティングされた約５μｍの細孔サイズを有するポリカーボネート膜上に、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含み得る。
【0048】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在を同定した後にサンプルを尿素に溶解することをさらに含み得る。
【0049】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在を同定した後にサンプルを８Ｍの尿素溶液に溶解することをさらに含み得る。
【0050】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在を同定した後にサンプルを変性条件下で消化することをさらに含み得る。
【0051】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質をさらに含むサンプルを含み得る。
【0052】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法は、抗体をさらに含むサンプルを含み得る。
【0053】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、治療用抗体をさらに含むサンプルを含み得る。
【0054】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーシステムを含み得る。
【0055】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、質量分析計に連結されたナノ液体クロマトグラフィーシステムを含み得る。
【0056】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、タンパク質をキャラクタリゼーションするためにタンデム質量分析計を使用することを含み得る。
【0057】
この実施形態の一態様では、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法は、宿主細胞由来タンパク質であるタンパク質を含み得る。
[本発明1001]
サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること；及び
質量分析計を使用して前記タンパク質をキャラクタリゼーションすること
を含む、サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質のキャラクタリゼーション方法。
[本発明1002]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、ラマン分光法を使用して同定される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、少なくとも約100μｍのサイズを有する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、固有の不純物である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
金でコーティングされたポリカーボネート膜上に、前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記金でコーティングされたポリカーボネート膜の細孔サイズが、約5μｍである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
ラマン分光分析を行った後に前記サンプルを尿素に溶解することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記尿素の濃度が約8Ｍである、本発明1006の方法。
[本発明1009]
ラマン分光分析を行った後に変性条件下で前記サンプルを消化することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記サンプルが、目的のタンパク質をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記目的のタンパク質が抗体である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記目的のタンパク質が治療用抗体である、本発明1009の方法。
[本発明1013]
前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記液体クロマトグラフィーシステムが、ナノ液体クロマトグラフィーシステムである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記質量分析計がタンデム質量分析計である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記タンパク質が、宿主細胞由来タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、少なくとも1種のタンパク質の存在を同定すること；及び
質量分析計を使用して前記少なくとも1種のタンパク質を同定すること
を含む、サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の少なくとも1種のタンパク質の定量方法。
[本発明1018]
前記少なくとも1種のタンパク質が、宿主細胞由来タンパク質である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、タンパク質の凝集体である、本発明1017の方法。
[本発明1020]
サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること；及び
質量分析計を使用して、前記タンパク質が宿主細胞由来タンパク質であるかどうかを決定するために前記タンパク質をキャラクタリゼーションすること
を含む、サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質のキャラクタリゼーション方法。
[本発明1001]
サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること；及び
質量分析計を使用して前記タンパク質をキャラクタリゼーションすること
を含む、サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質のキャラクタリゼーション方法。
[本発明1002]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、ラマン分光法を使用して同定される、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、少なくとも約100μｍのサイズを有する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、固有の不純物である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
金でコーティングされたポリカーボネート膜上に、前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記金でコーティングされたポリカーボネート膜の細孔サイズが、約5μｍである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
ラマン分光分析を行った後に前記サンプルを尿素に溶解することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記尿素の濃度が約8Ｍである、本発明1006の方法。
[本発明1009]
ラマン分光分析を行った後に変性条件下で前記サンプルを消化することをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記サンプルが、目的のタンパク質をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記目的のタンパク質が抗体である、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記目的のタンパク質が治療用抗体である、本発明1009の方法。
[本発明1013]
前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記液体クロマトグラフィーシステムが、ナノ液体クロマトグラフィーシステムである、本発明1012の方法。
[本発明1015]
前記質量分析計がタンデム質量分析計である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記タンパク質が、宿主細胞由来タンパク質である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、少なくとも1種のタンパク質の存在を同定すること；及び
質量分析計を使用して前記少なくとも1種のタンパク質を同定すること
を含む、サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の少なくとも1種のタンパク質の定量方法。
[本発明1018]
前記少なくとも1種のタンパク質が、宿主細胞由来タンパク質である、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子が、タンパク質の凝集体である、本発明1017の方法。
[本発明1020]
サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること；
前記少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること；及び
質量分析計を使用して、前記タンパク質が宿主細胞由来タンパク質であるかどうかを決定するために前記タンパク質をキャラクタリゼーションすること
を含む、サンプル中の少なくとも1種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質のキャラクタリゼーション方法。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】医薬品中で見られる粒子の粒子サイズの範囲を示す（ミクロン単位）。
【図2】医薬品中の粒子状物質の種類を示す。
【図3】タンパク質凝集体の一般的なメカニズムの概略的なスキームを示す。
【図4】医薬品における粒子形成の潜在的原因を示す。
【図5】２００５年から２０１７年までの粒子状物質によるＦＤＡの薬物リコールのグラフを示す。
【図6】２００８年から２０１２年までのＦＤＡの滅菌注射薬のリコールの理由を示すチャートを示す。
【図7】例示的な実施形態による、タンパク質または宿主細胞由来タンパク質のキャラクタリゼーションのための２つのワークフローを示す。
【図8】いくつかの例示的な実施形態による、タンパク質または宿主細胞由来タンパク質のキャラクタリゼーションのためのワークフローを示す。
【図9】例示的な一実施形態による可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉する方法を示す。
【図10】例示的な一実施形態による、可視粒子またはサブビジブル粒子を評価するために行われた濾紙の切除を示す。
【図11】例示的な実施形態による、可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉するために使用される濾紙の切断領域におけるｍＡｂ１のペプチド断片の存在量の比較を示す。図は、配列番号：１～６をそれぞれ出現順に開示している。
【図12】例示的な実施形態による、金でコーティングされたポリカーボネート膜上で可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉する方法を示す。
【図13】例示的な実施形態による、金でコーティングされたポリカーボネート膜上で単離及び捕捉された、ラマン分光法を使用して分析された粒子の暗視野照明を示す。
【図14】例示的な実施形態に従って分析された異なるロット（ロット５～１２）からの薬液中のメタロプロテイナーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ１）の相対存在量を示す。
【図15】例示的な実施形態に従って分析された異なるロット（ロット５～１２）からの薬液中のＣ－Ｃモチーフケモカイン１３（ＣＣＬ１３）の相対存在量を示す。
【図16】例示的な実施形態による、標的化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して高分子量サンプル中で同定された宿主細胞由来タンパク質の相対的定量を示す。
【図17】例示的な実施形態による、金フィルター上で可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉する方法を示す。
【図18】例示的な実施形態による、金フィルター上で可視粒子またはサブビジブル粒子を単離する方法を示す。
【図19】例示的な実施形態による、ラマン分光法を使用した可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在の確認を示す。
【図20】例示的な実施形態に従ってキャラクタリゼーションされた粒子中のｍＡｂ１の存在量を示す。
【図21】例示的な実施形態に従って撮影されたサブビジブル粒子を含むサンプルの暗視野画像を示す。
【図22】例示的な実施形態に従って撮影されたサブビジブル粒子を含むサンプルの暗視野画像及びラマン画像を示す。
【図23】例示的な実施形態による、粒子をキャラクタリゼーションするために使用される２つのフィルターについての、経時的なＶｍａｘ容量及び濁度の減少のグラフを示す。
【図24】例示的な実施形態に従って実施された濾紙の切除を示す。
【図25】例示的な実施形態に従って実施された、ｍＡｂ２を含む粒子についての７２時間にわたる粒子中のｍＡｂ２の重鎖及び軽鎖の正規化された存在量のグラフを示す。
【図26】例示的な実施形態に従って実施された、ｍＡｂ２を含む粒子の時間に対する宿主細胞由来タンパク質の相対存在量の平行プロットを示す。
【図27】例示的な実施形態に従って実施された、時間Ｔ＝０時間における粒子中のｍＡｂ２の相対量に対する、時間Ｔ＝０時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質対時間Ｔ＝０時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在量の比のバブルプロットを示す。
【図28】例示的な実施形態に従って実施された、時間Ｔ＝２４時間における粒子中のｍＡｂ２の相対量に対する、時間Ｔ＝２４時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質対時間Ｔ＝０時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在量の比のバブルプロットを示す。
【図29】例示的な実施形態に従って実施された、時間Ｔ＝４８時間における粒子中のｍＡｂ２の相対量に対する、時間Ｔ＝４８時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質対時間Ｔ＝０時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在量の比のバブルプロットを示す。
【図30】例示的な実施形態に従って実施された、時間Ｔ＝７２時間における粒子中のｍＡｂ２の相対量に対する、時間Ｔ＝７２時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質対時間Ｔ＝０時間における粒子中の宿主細胞由来タンパク質の存在量の比のバブルプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【0059】
詳細な説明
可視粒子及びサブビジブル粒子の存在は、タンパク質を含む薬物の処方中の主要な問題である。これらの粒子はタンパク質系または非タンパク質系のいずれかの場合があり、製剤の安定性を監視するために分析する必要がある。医薬品中のそのような粒子の免疫原性についての懸念の高まりのため、その内容をキャラクタリゼーションするためのロバストな方法及び／またはワークフローが必要とされている。
可視粒子及びサブビジブル粒子の存在は、タンパク質を含む薬物の処方中の主要な問題である。これらの粒子はタンパク質系または非タンパク質系のいずれかの場合があり、製剤の安定性を監視するために分析する必要がある。医薬品中のそのような粒子の免疫原性についての懸念の高まりのため、その内容をキャラクタリゼーションするためのロバストな方法及び／またはワークフローが必要とされている。
【0060】
タンパク質を含む医薬品の処方開発中の主要な課題は、それらの限定的な安定性を克服することである。凝集は、最も深刻な劣化メカニズムのうちの１つである。凝集体は、サイズ、可逆性、及び構造など多くの状況で変化する場合がある。例えば、それらのサイズは、ナノメートル範囲の二量体から、人間の目に見える数百ミクロンの大きな凝集体までの範囲の可能性がある（図１を参照）。凝集体は、タンパク質系粒子のみならず、例えば製品の品質に影響を与える包装材料または添加剤に由来する非タンパク質系粒子を含む場合があり、そのため分析が必要とされる。
【0061】
米国薬局方に開示されている“Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ ｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ＜７９０＞”及び“ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ＜１７８７＞”について指定されている章は、医薬品の粒子状物質含有量についての一般的な指針を得るのに役立つ。医薬品中に存在し得る粒子状物質のタイプは図２に概説されている。
【0062】
図２に示されるような薬品に固有の粒子状物質は、凝集したタンパク質を含み得る。凝集体は、異なるタイプの異なるメカニズム及び経路に起因して形成される場合がある（図３を参照のこと）。これらのメカニズムは相互に排他的ではなく、同じ製品内で並行して発生する可能性がある（Ｊｏｈｎ Ｐｈｉｌｏ＆Ｔｓｕｔｏｍｕ Ａｒａｋａｗａ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ，１０ ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ３４８－３５１（２００９））。主なメカニズムは、タンパク質自体だけでなく、製剤、不純物または汚染物質の存在、並びに上述した化学的または物理的ストレスへの曝露などの他の様々な要因にも依存する。異なる凝集メカニズム及びそれによって生じる凝集体の構造的差異がそれらの潜在的な免疫原性にどのように影響を及ぼすかはこれまでのところ完全には理解されていない。
【0063】
図４に列挙されている医薬品における粒子形成の潜在的な原因のいくつかは、言い換えると熱応力、保存期間中の分解、医薬品中の添加剤の化学的分解、機械的応力、及び界面応力に起因する。医薬品中のそのような粒子の潜在的な結果は、製品を危険に安全でないものにする（毛細血管閉塞、免疫原性、または細胞毒性の原因）か、有効性を変更する（低い効力もしくは高い効力の原因、または体内の薬物の生体内分布及びクリアランスの変更）か、薬物の薬物動態を変更するか、製品の一貫性をなくすか、バイオプロセスの一貫性をなくす可能性がある。
【0064】
注射薬のＦＤＡリコールは、粒子状物質が薬物リコールの主な理由の１つであることを示唆している（図５を参照）。２００８年から２０１２年にかけて、可視粒子の存在は、滅菌注射薬のリコールの２２％を占めた（図６を参照）。
【0065】
規制機関は、粒子状物質についての医薬品分析に、製品の特性評価及び管理の一部として可視粒子及びサブビジブル粒子分析を含めることを要求しており、安全性及び有効性に対するそれらの潜在的影響を評価するためにリスク評価を含める必要がある。分析には、粒子状物質を形成する傾向の評価及び安定性の評価のための複数のストレス条件も含まれる。このような分析の後に、粒子状物質の形成を最小限に抑えるための戦略を実施する必要がある。可視粒子については、粒子状物質の試験に関する米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）の指針に、（ｉ）充填プロセスにおける１００％目視検査の要件（ＵＳＰ＜１＞Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）、（ｉｉ）１００％目視検査の指針（ＵＳＰ＜７９０＞Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｓ ｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）、及び（ｉｉｉ）検査者の訓練、サンプリング方法、及び検査の説明が記載されており、予防／検査ライフサイクルに重点が置かれている（ＵＳＰ＜１７９０＞Ｖｉｓｕａｌ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）。米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）には、（ｉ）サブビジブル粒子の制限（≧１０μｍ粒子≦２５個／ｍｌ；≧２５μｍ粒子≦３個／ｍｌ）、並びに粒子計数のための２つの方法である光遮蔽法及び顕微鏡法の推奨（ＵＳＰ＜７８８＞Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）、（ｉｉ）生物製剤の具体的要件、及びタンパク質系粒子を数えるための顕微鏡検査の使用の中止（ＵＳＰ＜７８７＞Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）、並びに（ｉｉｉ）粒子の種類を識別する方法などの、サブビジブル粒子についての粒子状物質の試験についての指針も記載されており、タンパク質系粒子のキャラクタリゼーションに重点が置かれている（ＵＳＰ＜１７８７＞Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｕｂｖｉｓｉｂｌｅ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）。最後に、点眼液中の粒子状物質については、粒子状物質の試験に関する米国薬局方（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）の指針は、ＵＳＰ＜７８９＞Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ及びＵＳＰ＜１７８８＞Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔｔｅｒ ｉｎ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓの章において指針が示されている。
【0066】
タンパク質製剤の開発及び評価中の主要な課題の１つは、潜在的な分解生成物、特に凝集体及び粒子のキャラクタリゼーション及び定量である（Ｌｉｎｄａ Ｎａｒｈｉ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓｃｈｍｉｔ＆Ｄｅｅｐａｋ Ｓｈａｒｍａ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，１０１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ４９３－４９８（２０１２））。
【0067】
装置のメーカーは、サブビジブルサイズ範囲の分析の空白部分を克服するための新規な分析技術の提供に取り組んできたが、それらの重要な科学的評価を支援するためのワークフローを確立することに対する大きな需要が存在する。
【0068】
既存の方法の限界を踏まえ、医薬品中の可視粒子またはサブビジブル粒子の同定及びキャラクタリゼーションのための効果的かつ効率的な方法が開発された。
【0069】
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法及び材料を実施または試験において使用できるものの、以降では特定の方法及び材料について説明する。言及される全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0070】
「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。「約」及び「おおよそ」という用語は、当業者によって理解される標準的な変化形が可能なように理解されるべきである。範囲が示されている場合には終点が含まれる。
【0071】
いくつかの例示的な実施形態において、本開示は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法を提供する。
【0072】
本明細書において、「タンパク質」という用語には、共有結合しているアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーが含まれる。タンパク質は、当該技術分野で「ポリペプチド」として一般的に知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの合成による天然に存在しない類似体、関連する天然に存在する構造バリアント、及びそれらの合成による天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば自動化されたポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成方法が当業者に公知である。タンパク質は、単一の機能する生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質には、バイオ治療用タンパク質、研究または治療で使用される組み換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれも含まれ得る。別の例示的な態様では、タンパク質には、抗体断片、ナノボディ、組み換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが含まれ得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えばピチア属の種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．））、哺乳動物系（例えばＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ派生物）などの組み換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。バイオ治療用タンパク質及びその製造に関して説明されているレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＧＥＮＥＴ．ＥＮＧ．ＲＥＶ．１４７－１７５（２０１２））を参照のこと。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾物、付加物、及び他の共有結合された部位を含む。これらの修飾物、付加物、及び部位には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の染料などが含まれる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類できることから、タンパク質には、球状タンパク質や繊維状タンパク質などの単純なタンパク質；核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などの複合タンパク質；並びに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質が含まれ得る。
【0073】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、宿主細胞由来タンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【0074】
本明細書で使用される「抗体」という用語には、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ．ｓｕｂ．Ｌ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。様々な例示的な実施形態において、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、あるいは天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される「抗体」という用語には、完全な抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【0075】
本明細書で使用される抗体の「抗原結合部分」や抗体の「抗原結合断片」などの用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解または組み換え遺伝子工学技術（抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む）などの任意の適切な標準的手法を使用して、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知である、及び／または例えば販売元のＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、あるいは合成することができる。ＤＮＡは、例えば１つ以上の可変及び／または定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を形成するため、アミノ酸を修飾、追加、もしくは削除するなどのために化学的に、または分子生物学手法を使用することによって、配列決定及び操作をすることができる。
【0076】
本明細書で使用される「抗体断片」には、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などのインタクト抗体の一部が含まれる。抗体断片の例としては、限定するものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組み換え一本鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって製造することができる。例えば、抗体断片は、インタクト抗体の断片化によって酵素的もしくは化学的に製造することができる、及び／またはこれは部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み換えにより製造することができる。あるいは、またはこれに加えて、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成により製造することができる。抗体断片は、任意選択的には一本鎖抗体断片を含んでいてもよい。あるいは、またはこれに加えて、抗体断片は、例えばスルフィド結合によって一体に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的には多分子複合体を含んでいてもよい。
【0077】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能なまたは公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導することができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して作製することができる。
【0078】
本明細書で使用される「宿主細胞由来タンパク質」という用語は、宿主細胞によって発現されるタンパク質を含み、対象の目的タンパク質とは無関係な場合がある。宿主細胞由来タンパク質は、製造プロセスに由来する可能性がある製造に関連する不純物である場合があり、細胞基質由来、細胞培養由来、及び下流由来の３つの主要なカテゴリーが含まれ得る。細胞基質由来の不純物としては、限定するものではないが、宿主生物及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、または全ＤＮＡ）に由来するタンパク質が挙げられる。細胞培養由来の不純物としては、限定するものではないが、誘導物質、抗生物質、血清、及びその他の培地成分が挙げられる。下流由来の不純物としては、限定するものではないが、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば臭化シアン、グアニジン、酸化剤、及び還元剤）、無機塩（例えば重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えばモノクローナル抗体）、及びその他の浸出物が挙げられる。
【0079】
いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子は、プロセスに関連する不純物を含み得る。
【0080】
いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子は、製品に関連する不純物を含み得る。
【0081】
本明細書で使用される「製品に関連する不純物」（例えば前駆体、特定の分解生成物）は、活性、有効性、及び安全性に関して望まれる製品の特性に匹敵する特性を有さない製造及び／または保管中に生じる分子バリアントである場合がある。そのようなバリアントは、修飾のタイプを特定するために単離及びキャラクタリゼーションにおいて多大な労力が必要とされる場合がある。製品に関連する不純物には、切断された形態、修飾された形態、及び凝集体が含まれ得る。切断された形態は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾された形態には、限定するものではないが、脱アミド化、異性化、ミスマッチのＳ－Ｓ結合、酸化、または改変された複合体形態（例えばグリコシル化、リン酸化）が含まれる。修飾された形態には、翻訳後修飾された任意の形態も含まれ得る。凝集体には、目的生成物の二量体及びより高次の多量体が含まれる。（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
【0082】
いくつかの例示的な実施形態では、可視粒子またはサブビジブル粒子はタンパク質凝集体を含み得る。本明細書で使用される「タンパク質凝集体」という用語は、サイズ、可逆性、及び構造が様々な場合があるタンパク質モノマーの集合体を指す。タンパク質凝集体形成のメカニズムのいくつかが図４に概説されている。
【0083】
本明細書で使用される「製剤」という用語は、１種以上の薬学的に許容されるビヒクルと一緒に配合される有効な薬剤を指す。
【0084】
本明細書で使用される「有効な薬剤」という用語には、医薬品の生物学的に有効な成分が含まれ得る。有効な薬剤とは、薬理学的活性を提供すること、またはその他疾患の診断、治癒、緩和、治療、もしくは予防に直接的な効果をもたらすこと、または動物の生理学的機能を回復、修正、もしくは変更する直接的な効果を有することが意図された、医薬品において使用される任意の物質または物質の組み合わせを意味し得る。有効な薬剤を調製するための非限定的な方法としては、発酵プロセス、組み換えＤＮＡ、天然供給源からの単離及び回収、化学合成、またはそれらの組み合わせの使用を挙げることができる。
【0085】
いくつかの例示的な実施形態では、製剤はタンパク質製剤であってもよい。
【0086】
本明細書で使用される「タンパク質製剤」という用語は、１種以上の薬学的に許容されるビヒクルと一緒に製剤化される治療用タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、治療計画における投与に適した単位用量で存在する。
【0087】
いくつかの別の実施形態では、製剤は、限定するものではないが、緩衝剤、増量剤、調性調整剤、界面活性剤、可溶化剤、及び防腐剤などの添加剤をさらに含み得る。その他の追加的な添加剤については機能に基づいて選択することもでき、製剤との適合性については、例えばＬＯＹＤ Ｖ．ＡＬＬＥＮ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（１９ ｅｄ．１９９５），ＪＯＨＮ Ｅ ＨＯＯＶＥＲ，ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ （１９７５）、及びＬＹＯＤ ＡＬＬＥＮ，ＡＮＳＥＬ’ＳＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＤＯＳＡＧＥ ＦＯＲＭＳ ＡＮＤ ＤＲＵＧ ＤＥＬＩＶＥＲＹ ＳＹＳＴＥＭＳ（１０ｅｄ．）の中で見ることができ、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0088】
いくつかの例示的な実施形態では、製剤は安定であってもよい。
【0089】
製剤の安定性は、有効な薬剤の化学的安定性、物理的安定性、または機能的安定性を評価することを含み得る。本発明の製剤は、典型的には、有効薬剤の高レベルの安定性を示す。
【0090】
タンパク質製剤に関し、本明細書において使用される「安定」という用語は、本明細書に記載の例示的な条件下での保存後に許容可能な程度の化学構造または生物学的機能を保持できる製剤内のタンパク質を指す。製剤は、その中に含まれるタンパク質が、規定の期間保存した後にその化学構造または生物学的機能の１００％を維持していなくても安定である可能性がある。特定の状況下では、規定の期間保存した後のタンパク質の構造または機能の約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の維持が、「安定」とみなされる場合がある。
【0091】
いくつかの例示的な実施形態では、脂肪酸粒子は少なくとも５μｍのサイズであってもよい。さらに、これらの脂肪酸粒子は、サイズに応じて、可視（＞１００μｍ）、サブビジブル（＜１００μｍ、これはミクロン（１～１００μｍ）及びサブミクロン（１００ｎｍ～１０００ｎｍ）にさらに分けることができる）、及びナノメートル粒子（＜１００ｎｍ）に分類することができる（Ｌｉｎｄａ Ｎａｒｈｉ，Ｊｅｒｅｍｙ Ｓｃｈｍｉｔ＆Ｄｅｅｐａｋ Ｓｈａｒｍａ，Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，１０１ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ４９３－４９８（２０１２））。
【0092】
いくつかの例示的な実施形態では、粒子は、ラマン分光法によってタンパク質として検出することができる。本明細書で使用される「ラマン分光法」という用語は、ラマン散乱法に基づく分光法を指す。ラマン分光法は、指紋領域（２０００～４００ｃｍ－１）のバンドの存在及び位置を特定可能なラマンスペクトルを提供することができ、これは、ラマンスペクトルのデータベースとの比較による分析された物質の化学的同定を可能する（Ｃ．Ｖ．Ｒａｍａｎ ａｎｄ Ｋ．Ｓ．Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ａ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ，１２１ ＮＡＴＵＲＥ ５０１－５０２（１９２８）；Ｚａｉ－Ｑｉｎｇ Ｗｅｎ，Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，９６ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ２８６１－２８７（２００７））。
【0093】
本明細書で使用される「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって運ばれる化学混合物を、液体固定相または固体固定相の周囲または上を流れる際の化学物質の異なる分布の結果として複数の成分に分離することができるプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。それぞれ疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン相互作用が主要な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードのクロマトグラフィーでは、これらの相互作用モードを２つ以上組み合わせて使用することができる。
【0094】
本明細書で使用される「質量分析計」という用語には、特定の分子種を識別し、それらの正確な質量を測定することができる装置が含まれる。この用語は、検出及び／またはキャラクタリゼーションのためにポリペプチドまたはペプチドを中で溶離させることができる任意の分子検出器を含むことを意図している。質量分析計は、イオン源、質量分析器、及び検出器の３つの主要部分を含み得る。イオン源の役割は、気相イオンを形成することである。分析対象の原子、分子、またはクラスターは、気相に移され、同時にイオン化することができる。（エレクトロスプレーイオン化と同様）。イオン源の選択は用途に大きく依存する。
【0095】
明細書で使用される「質量分析器」という用語には、種、すなわち原子、分子、またはクラスターをそれらの質量に応じて分離できる装置が含まれる。高速タンパク質配列解析に使用可能な質量分析器の非限定的な例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気／電気セクター型、四重極質量フィルター型（Ｑ）、四重極イオントラップ型（ＱＩＴ）、オービトラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴＩＣＲ）、及び加速器質量分析法（ＡＭＳ）である。
【0096】
本明細書で使用される「タンデム質量分析」という用語には、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによってサンプル分子に関する構造情報が得られる技術が含まれる。前提条件は、サンプル分子を気相に移して完全なままイオン化できること、及び最初の質量選択段階の後に予測可能かつ制御可能な形で壊れるように誘導できることである。マルチステージＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、有意義な情報を取得できるか、フラグメントイオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択及び単離してフラグメント化し、一次フラグメントイオン（ＭＳ３）を単離してこれをフラグメント化し、二次フラグメントイオン（ＭＳ４）を単離するなどして行うことができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせを用いて首尾よく行われてきた。特定の用途のために組み合わせられる分析器が何であるかは、感度、選択性、及び速度などの多くの様々な要因だけでなく、サイズ、コスト、及び有効性によっても決定され得る。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、空間的タンデムと時間的タンデムであるが、時間的タンデム分析器が空間的にまたは空間的タンデム分析器と連結されているハイブリッドも存在する。空間的タンデム質量分析計は、イオン源と、プリカーサーイオン活性化デバイスと、少なくとも２つの非トラッピング質量分析器とを含む。装置の１つの区域でイオンが選択され、中間領域で解離され、その後生成物イオンがｍ／ｚ分離及びデータ取得のために別の分析器に送られるように、特定のｍ／ｚ分離機能を設計することができる。時間的タンデム質量分析計では、イオン源で生成されたイオンを、同じ物理的デバイス内で捕捉、単離、フラグメント化、及びｍ／ｚ分離することができる。
【0097】
質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトタンパク質及びそれらの翻訳後修飾のサロゲートの典型として使用することができる。これらは、実験的及び理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることによってタンパク質のキャラクタリゼーションのために使用することができ、後者はタンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。キャラクタリゼーションには、限定するものではないが、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質配列決定、タンパク質デノボ配列決定、翻訳後修飾の位置特定、または翻訳後修飾の同定、または適合分析、またはこれらの組み合わせが含まれる。
【0098】
本明細書で使用される「データベース」という用語は、データベース内の全ての可能な配列に対して未解釈のＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティクスツールを指す。このようなツールの非限定的な例は以下のものである：Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）。
【0099】
例示的な実施形態
本明細書に開示の複数の実施形態は、サンプル中のタンパク質の迅速なキャラクタリゼーションのための組成物、方法、及びシステムを提供する。
本明細書に開示の複数の実施形態は、サンプル中のタンパク質の迅速なキャラクタリゼーションのための組成物、方法、及びシステムを提供する。
【0100】
いくつかの実施形態では、本開示は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること、及び質量分析計を使用してタンパク質をキャラクタリゼーションすること、を含む、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質をキャラクタリゼーションする方法を提供する。
【0101】
いくつかの実施形態では、本開示は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること、及び質量分析計を使用してタンパク質をキャラクタリゼーションすること、を含む、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質を同定する方法を提供する。
【0102】
いくつかの実施形態では、本開示は、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を検出すること、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を単離及び捕捉して、タンパク質の存在を同定すること、及び質量分析計を使用して、タンパク質が宿主細胞由来タンパク質であるかどうかを決定するためにタンパク質をキャラクタリゼーションすること、を含む、サンプル中の少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中の宿主細胞由来タンパク質を同定する方法を提供する。
【0103】
いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質の存在を同定するためにラマン分光法を使用することができる。
【0104】
いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子は、少なくとも約２μｍのサイズを有し得る。一態様では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子は、少なくとも約２μｍ、少なくとも約３μｍ、少なくとも約４μｍ、少なくとも約５μｍ、少なくとも約６μｍ、少なくとも約７μｍ、少なくとも約８μｍ、少なくとも約９μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約１１μｍ、少なくとも約１２μｍ、少なくとも約１３μｍ、少なくとも約１４μｍ、少なくとも約１５μｍ、少なくとも約２０μｍ、少なくとも約２５μｍ、少なくとも約３０μｍ、少なくとも約３５μｍ、少なくとも約４０μｍ、少なくとも約４５μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約５５μｍ、少なくとも約６０μｍ、少なくとも約６５μｍ、少なくとも約７０μｍ、少なくとも約７μｍ、少なくとも約８０μｍ、少なくとも約８５μｍ、少なくとも約９０μｍ、少なくとも約９５μｍ、または少なくとも約１００μｍのサイズを有し得る。
【0105】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は固有の不純物であってもよい。
【0106】
いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子は、金でコーティングされたポリカーボネート膜上に捕捉することができる。いくつかの例示的な実施形態では、金でコーティングされたポリカーボネート膜は約５μｍの細孔サイズを有し得る。
【0107】
いくつかの例示的な実施形態では、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子は濾紙上に捕捉することができる。いくつかの例示的な実施形態では、濾紙は約５μｍの細孔サイズを有し得る。
【0108】
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子を捕捉するために使用される金でコーティングされたポリカーボネート膜または濾紙の一部を切除することをさらに含み得る。
【0109】
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質または宿主細胞由来タンパク質の存在を同定した後に、サンプルを尿素に溶解することをさらに含み得る。一態様では、サンプルは、８Ｍの尿素溶液に溶解することができる。
【0110】
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質または宿主細胞由来タンパク質の存在を同定した後、変性条件下でサンプルを変性させることをさらに含み得る。一態様では、サンプルは、適切な温度でジチオトレイトールを使用して変性させることができる。
【0111】
いくつかの例示的な実施形態では、方法は、少なくとも１種の可視粒子またはサブビジブル粒子中のタンパク質または宿主細胞由来タンパク質の存在を同定した後に、変性条件下でサンプルを消化することをさらに含み得る。一態様では、サンプルは、加水分解剤を使用して消化することができる。酵素的消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼが挙げられる。非酵素的消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例はエタノール及びアセトニトリルである）、固定化酵素的消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、及びオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質消化に利用可能な技術に関して説明されている最近のレビューについては、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，１２，１０６７－１０７７）を参照のこと。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、配列特異的な形でタンパク質またはポリペプチドのペプチド結合を切断し、予測可能なより短いペプチドのコレクションを生成することができる。
【0112】
いくつかの例示的な実施形態では、サンプルは目的のタンパク質をさらに含み得る。一態様では、目的のタンパク質は、治療用抗体、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【0113】
例示的な一実施形態では、タンパク質または宿主細胞由来タンパク質は、目的のタンパク質の翻訳後修飾であってもよい。様々な翻訳後修飾としては、限定するものではないが、切断、Ｎ－末端伸長、タンパク質分解、Ｎ－末端のアシル化、ビオチン化（リシン残基のビオチンによるアシル化）、Ｃ－末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常はタンパク質のＮ－末端におけるアセチル基の付加）、アルキル化（通常はリシンまたはアルギニン残基におけるアルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間の共有結合による架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリシンヒドロキシル化及びカルボキシ末端アミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ここでのビタミンＫは、γ－カルボキシグルタミン酸（グル残基）を形成するグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子である）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、またはトレオニンのいずれかへグリコシル基を付加させて糖タンパク質を得る）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポエート官能基の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド、及びロイシン生合成の場合のような補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部位の付加）、リン酸化（リン酸基の付加、通常はセリン、チロシン、トレオニン、またはヒスチジンへの付加）、及び硫酸化（硫酸基の付加、通常はチロシン残基への付加）が挙げられる。アミノ酸の化学的性質を変える翻訳後修飾としては、限定するものではないが、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸またはアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が挙げられる。構造変化を伴う翻訳後修飾としては、限定するものではないが、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質分解切断（ペプチド結合におけるタンパク質の切断）が挙げられる。特定の翻訳後修飾には、ＩＳＧｙｌａｔｉｏｎ（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン活性化遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ（ＳＵＭＯタンパク質（低分子ユビキチン様修飾因子）への共有結合）、及びユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）などの他のタンパク質またはペプチドの付加が含まれる。ＵｎｉＰｒｏｔによって収集されたＰＴＭのより詳細な統制されている用語については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔを参照のこと。
【0114】
別の例示的な実施形態では、サンプルは、培養細胞培養液（ＣＣＦ）、採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）、プロセス適格性評価（ＰＰＱ）などのバイオプロセスの任意のステップから、最終製剤製品を構成する薬液（ＤＳ）もしくは医薬品（ＤＰ）の下流処理における任意のステップから得ることができる。いくつかの別の特定の例示的な実施形態では、サンプルは、清澄化、クロマトグラフィー精製、ウイルス不活化、または濾過の下流プロセスの任意のステップから選択することができる。一態様では、医薬品は、診療所、出荷、保管、または取り扱いにおける製造された医薬品から選択することができる。
【0115】
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は液体クロマトグラフィーに連結することができる。一態様では、質量分析計はナノ液体クロマトグラフィーに連結することができる。いくつかの例示的な実施形態では、液体クロマトグラフィーにおいてタンパク質を溶離するために使用される移動相は、質量分析計と適合性を有することができる移動相とすることができる。一態様では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせとすることができる。
【0116】
別の例示的な実施形態では、質量分析計は、ナノスプレーを含み得る。
【0117】
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンパク質をキャラクタリゼーションするためのタンデム質量分析計であってもよい。
【0118】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質または宿主細胞由来タンパク質は、治療用抗体、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、またはこれらの組み合わせであってもよい。一態様では、抗体断片には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、トライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれ得る。
【0119】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質または宿主細胞由来タンパク質は抗体の消化産物であってもよい。消化産物は、加水分解剤によって形成することができる。消化産物は、製品に関連する不純物であってもよい。
【0120】
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質または宿主細胞由来タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有することができる。一態様では、タンパク質は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有し得る。
【0121】
例示的な一実施形態では、サンプル中の可視粒子またはサブビジブル粒子の数は、少なくとも２個であってもよい。
【0122】
例示的な一実施形態では、可視粒子またはサブビジブル粒子の中のタンパク質または宿主細胞由来タンパク質の種類は少なくとも２種であってもよい。
【0123】
方法は、前述したタンパク質、不純物、及びカラムのいずれかに限定されず、同定または定量する方法は任意の適切な手段によって行い得ることが理解される。
【0124】
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、粒子検査１００、粒子単離１１０、粒子捕捉１２０、及びクロマトグラフィーカラム１３０に連結された質量分析計１４０を含むワークフローを提供する（図７を参照）。
【0125】
いくつかの例示的な実施形態では、ワークフローは、タンパク質の存在を同定することが可能なラマン分光法１５０をさらに含み得る。
【0126】
いくつかの例示的な実施形態では、粒子検査１００は、目視検査、光遮蔽、またはマイクロフローイメージングによって行うことができる。例示的な一実施形態では、粒子検査は、目視検査、ＦＴＩＲ分光法、ラマン分光法、またはマイクロフローイメージング（ＭＦＩ）によって行うことができる。
【0127】
いくつかの例示的な実施形態では、粒子単離１１０及び粒子捕捉１２０は濾過装置を使用して行うことができる。
【0128】
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１３０は移動相を用いて洗浄することができることができる。例示的な一実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【0129】
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１４０はナノスプレーを含み得る。
【0130】
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１４０はタンデム質量分析計であってもよい。例示的な一実施形態では、質量分析計１４０は空間的タンデム質量分析計であってもよい。例示的な一実施形態では、質量分析計１４０は時間的タンデム質量分析計であってもよい。
【0131】
ワークフローの例示的な一実施形態を図８に示す。
【0132】
システムは、前述したタンパク質、宿主細胞由来タンパク質、分光法、またはクロマトグラフィーカラムのいずれかに限定されないことが理解される。
【0133】
本明細書で示される方法の工程の数字及び／または文字による連続したラベル付けは、方法またはその任意の実施形態を特定の示された順序に限定することを意図するものではない。
【0134】
特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物が、明細書全体にわたって引用されている。これらの引用された参考文献のそれぞれは、その全体が、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0135】
本開示は、本開示をより詳細に説明するために示されている以降の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。これらは説明を目的としており、開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【0136】
実施例１
１．１ 粒子の検出
ｍＡｂ１製剤を含むプロセス適格性評価（ＰＰＱ）ロット（ロット番号１）のバイアルの評価において、ＰＰＱロットの約２６４個のバイアル（約４．５％）は、可視粒子を有していた。ＰＰＱロットの許容限度は０．７％であるため、ロットは不合格とされた。
１．１ 粒子の検出
ｍＡｂ１製剤を含むプロセス適格性評価（ＰＰＱ）ロット（ロット番号１）のバイアルの評価において、ＰＰＱロットの約２６４個のバイアル（約４．５％）は、可視粒子を有していた。ＰＰＱロットの許容限度は０．７％であるため、ロットは不合格とされた。
【0137】
ＰＰＱロットを、正常であると判明したポリソルベートレベルの存在について評価した。
【0138】
ＰＰＱロットからの粒子（粒子１）を灰色のフィルター上で捕捉した（図９を参照）。
【0139】
１．２ 粒子の単離
濾紙上で切除を行った：（ａ）切断領域１－粒子１が負荷されている４ｍｍ×４ｍｍの領域、（ｂ）切断領域２－タンパク質溶液が負荷されている４ｍｍ×４ｍｍの領域、及び（ｃ）切断領域３－タンパク質が負荷されていない４ｍｍ×４ｍｍの領域（図１０を参照）。切断領域／サンプルを８Ｍの尿素に溶解させた。
濾紙上で切除を行った：（ａ）切断領域１－粒子１が負荷されている４ｍｍ×４ｍｍの領域、（ｂ）切断領域２－タンパク質溶液が負荷されている４ｍｍ×４ｍｍの領域、及び（ｃ）切断領域３－タンパク質が負荷されていない４ｍｍ×４ｍｍの領域（図１０を参照）。切断領域／サンプルを８Ｍの尿素に溶解させた。
【0140】
サンプルを、８Ｍの尿素及び５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）と共に５０℃で３０分間インキュベートし、続いて１０ｍＭのインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）と共に室温で３０分間インキュベートした。インキュベートしたサンプルを変性条件下で１μｇのｒＬｙｓＣを用いて１時間消化した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで希釈した。この混合物に１μｇのトリプシンを添加し、消化を３時間継続した。その後、消化混合物を２０％のギ酸（ＦＡ）で酸性にした後、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。
【0141】
１．３ ペプチド分析
粒子１の組成を明らかにするために、粒子１のペプチド分析を、Ｔｈｅｒｍｏ ＱＥｘｔｉｖｉｃ ＨＦ質量分析計と連結されたナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｔｈｅｒｍｏ ＥＡＳＹ－ｎＬＣを使用して行った。存在するタンパク質の同定、Ｓｅｑｕｅｓｔモードを使用するＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒｖ．１．４ソフトウェアは、ＣＨＯタンパク質配列データベースに対して質量スペクトルデータを検索することによって使用した。ペプチド品質スコアは、検索アルゴリズムがサンプル中のペプチドを誤って含める確率を計算するＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ内のＰｅｐｔｉｄｅＶａｌｉｄａｔｏｒノードを使用してデコイデータベースに対して処理することによって導き出した。偽発見率（ＦＤＲ）、または偽陽性率は、ペプチド同定検索によって見出される全ての同定の中での偽陽性同定の数を推定する統計値である。５％未満のＦＤＲ（中及び高信頼性ペプチド）で評価されたペプチドは保持され、１％未満のＦＤＲ（高信頼性）しきい値で評価されたものは高信頼性として記録した。各ＨＣＰを確実に同定するためには、タンパク質あたり最低２つの中または高信頼性（合格）ペプチドが必要であった。１つの高信頼性ペプチドのみによって同定されたタンパク質のペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを、３つ以上の連続したｂイオンとｙイオン並びに少数の豊富な外来イオンのカバー率について手動で調べ、それらの許容性を判断した。
粒子１の組成を明らかにするために、粒子１のペプチド分析を、Ｔｈｅｒｍｏ ＱＥｘｔｉｖｉｃ ＨＦ質量分析計と連結されたナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ Ｔｈｅｒｍｏ ＥＡＳＹ－ｎＬＣを使用して行った。存在するタンパク質の同定、Ｓｅｑｕｅｓｔモードを使用するＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒｖ．１．４ソフトウェアは、ＣＨＯタンパク質配列データベースに対して質量スペクトルデータを検索することによって使用した。ペプチド品質スコアは、検索アルゴリズムがサンプル中のペプチドを誤って含める確率を計算するＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ内のＰｅｐｔｉｄｅＶａｌｉｄａｔｏｒノードを使用してデコイデータベースに対して処理することによって導き出した。偽発見率（ＦＤＲ）、または偽陽性率は、ペプチド同定検索によって見出される全ての同定の中での偽陽性同定の数を推定する統計値である。５％未満のＦＤＲ（中及び高信頼性ペプチド）で評価されたペプチドは保持され、１％未満のＦＤＲ（高信頼性）しきい値で評価されたものは高信頼性として記録した。各ＨＣＰを確実に同定するためには、タンパク質あたり最低２つの中または高信頼性（合格）ペプチドが必要であった。１つの高信頼性ペプチドのみによって同定されたタンパク質のペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを、３つ以上の連続したｂイオンとｙイオン並びに少数の豊富な外来イオンのカバー率について手動で調べ、それらの許容性を判断した。
【0142】
全てのサンプルを、ｍＡｂ１の存在量について分析した。切断領域１（粒子１を含む）は豊富に存在するｍＡｂ１タンパク質を示し、続いて切断領域２（粒子１を含まないタンパク質溶液）にはｍＡｂ１が若干存在し、切断領域３にはｍＡｂ１タンパク質が少ない／存在しないことが示された（図１１を参照）。
【0143】
ｍＡｂ１－ＴＩＭＰ１以外の宿主細胞由来タンパク質が粒子１に存在することが判明した（表１）。ただし、ＴＩＭＰ１は、粒子１なしのタンパク質溶液中に存在しなかった。これは、ＴＩＭＰ１が粒子の中に多く含まれていることを示している。
【0144】
【表1】
【0145】
実施例２
ｍＡｂ１からの製剤を含むＰＰＱロット（ロット番号１）において、４つの追加の粒子（粒子２～５）を確認した。これらの粒子を捕捉し、分析した。
ｍＡｂ１からの製剤を含むＰＰＱロット（ロット番号１）において、４つの追加の粒子（粒子２～５）を確認した。これらの粒子を捕捉し、分析した。
【0146】
２．１ 粒子の単離
検出された各粒子を、図１２に示されるように、５μＭの細孔サイズと４０／２０ｎｍコーティングとを有する個々のＲａｐ ＩＤ金被覆ポリカーボネート膜上に載せた。
検出された各粒子を、図１２に示されるように、５μＭの細孔サイズと４０／２０ｎｍコーティングとを有する個々のＲａｐ ＩＤ金被覆ポリカーボネート膜上に載せた。
【0147】
実施例１で示したように、タンパク質溶液から粒子を単離するために膜上で切除を行った。
【0148】
２．２ ラマン分析
粒子の成分を同定するためにラマン分光法を使用した。この方法は、非弾性光散乱を使用して各分子に固有のエネルギースペクトルを生成し、その後様々な化学構造のフィンガープリントを含む参照ライブラリーと比較する。ラマン分析により、４つの粒子全て（粒子２、３、４、及び５）がタンパク質を含むことが確認された。暗視野照明からは、領域の周囲の粒子がタンパク質シグナルを有さないか非常にわずかであることが示された。これにより、フィルターから粒子を切り取っても、ＭＳ分析に汚染が生じなかったことが確認された（図１３を参照）。
粒子の成分を同定するためにラマン分光法を使用した。この方法は、非弾性光散乱を使用して各分子に固有のエネルギースペクトルを生成し、その後様々な化学構造のフィンガープリントを含む参照ライブラリーと比較する。ラマン分析により、４つの粒子全て（粒子２、３、４、及び５）がタンパク質を含むことが確認された。暗視野照明からは、領域の周囲の粒子がタンパク質シグナルを有さないか非常にわずかであることが示された。これにより、フィルターから粒子を切り取っても、ＭＳ分析に汚染が生じなかったことが確認された（図１３を参照）。
【0149】
２．３ ペプチド分析
粒子の組成を明らかにするために、実施例１で示した通りにナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して粒子のペプチド分析を行った。表２には、薬液ロット（ＤＳ）と共に粒子１～５において同定された宿主細胞由来タンパク質が列挙されており、これらの全てにｍＡｂ１が含まれている。宿主細胞由来タンパク質を、通常のナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してスクリーニングし、標的化ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して確認した。粒子３及び４はサイズが小さく、粒子１及び粒子５の約１０～５０分の１のタンパク質の量であった。これは、同定された宿主細胞由来タンパク質が少ないという結果を説明していると考えられる。
粒子の組成を明らかにするために、実施例１で示した通りにナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して粒子のペプチド分析を行った。表２には、薬液ロット（ＤＳ）と共に粒子１～５において同定された宿主細胞由来タンパク質が列挙されており、これらの全てにｍＡｂ１が含まれている。宿主細胞由来タンパク質を、通常のナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してスクリーニングし、標的化ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して確認した。粒子３及び４はサイズが小さく、粒子１及び粒子５の約１０～５０分の１のタンパク質の量であった。これは、同定された宿主細胞由来タンパク質が少ないという結果を説明していると考えられる。
【0150】
【表2】
【0151】
調査から、単離された不合格のｍＡｂ１ロット番号１の粒子における宿主細胞由来タンパク質の存在が確認された。
【0152】
実施例３
ｍＡｂ１製剤を含む他のロットにおいて可視粒子が宿主細胞由来タンパク質を多く含んでいるかどうかを調査するために、ｍＡｂ１製剤を含む臨床ロット（ロット番号２）及びｍＡｂ１製剤を含む他の２つのＰＰＱロット（ロット番号３及び４）における粒子を評価した。
ｍＡｂ１製剤を含む他のロットにおいて可視粒子が宿主細胞由来タンパク質を多く含んでいるかどうかを調査するために、ｍＡｂ１製剤を含む臨床ロット（ロット番号２）及びｍＡｂ１製剤を含む他の２つのＰＰＱロット（ロット番号３及び４）における粒子を評価した。
【0153】
粒子の単離、ラマン分析、及びペプチド分析は、実施例２で示した通りに行った。
【0154】
表３に、ロット番号１（ＰＰＱロット）、ロット番号２（臨床ロット）、ロット番号３（ＰＰＱロット）、及びロット番号４（ＰＰＱロット）からの粒子において同定された宿主細胞由来タンパク質が列挙されている。宿主細胞由来タンパク質は、通常のナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してスクリーニングし、標的化ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して確認した。一部の宿主細胞由来タンパク質は最初のスクリーニングでは同定されなかったものの、確認分析を使用して同定された。ロット番号２（臨床ロット）の粒子はサイズが小さく、ロット番号４（ＰＰＱロット）の粒子の約１５～３０分の１のタンパク質の量を有していた。これは、同定された宿主細胞由来タンパク質が少ないという結果を説明していると考えられる。これらのロット２～４からの粒子中に存在することが確認された宿主細胞由来タンパク質を比較すると、ロット番号１から単離された可視粒子で特定されたタンパク質に相当することが示唆される。
【0155】
【表3】
【0156】
実施例４
ＰＰＱロットを構成し得るｍＡｂ１の薬液が宿主細胞由来タンパク質を多く含むかどうかを調べるために、薬液ロット（ロット番号５～１２）を評価した。
ＰＰＱロットを構成し得るｍＡｂ１の薬液が宿主細胞由来タンパク質を多く含むかどうかを調べるために、薬液ロット（ロット番号５～１２）を評価した。
【0157】
４．１ ＰＬＢＤ２レベル
薬液を、ハムスター推定ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＤ２）ＥＬＩＳＡキット、ＣＵＳＡＢＩＯからのカタログＣＳＢ－ＥＬ０１４１２５Ｈａを使用するＬＣ－ＭＳ ＭＲＭ法を使用して、ＰＬＢＤ２について試験した。このキットは、ハムスターの推定ホスホリパーゼＢ様（ＰＬＢＤ２）濃度の定量測定を提供するとされている。キットに含まれるハムスターＰＬＢＬ２標準が０．１２～８ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる検出を示す検量線を作成した。ロット番号５～１２の薬液は、ＰＬＢＤ２レベルが定量の下限（１ｐｐｍ、つまり１ｍｇのｍＡｂ１中に１ｎｇのＰＬＢＤ）を下回っていることを示した。
薬液を、ハムスター推定ホスホリパーゼＢ様２（ＰＬＢＤ２）ＥＬＩＳＡキット、ＣＵＳＡＢＩＯからのカタログＣＳＢ－ＥＬ０１４１２５Ｈａを使用するＬＣ－ＭＳ ＭＲＭ法を使用して、ＰＬＢＤ２について試験した。このキットは、ハムスターの推定ホスホリパーゼＢ様（ＰＬＢＤ２）濃度の定量測定を提供するとされている。キットに含まれるハムスターＰＬＢＬ２標準が０．１２～８ｎｇ／ｍｌの範囲にわたる検出を示す検量線を作成した。ロット番号５～１２の薬液は、ＰＬＢＤ２レベルが定量の下限（１ｐｐｍ、つまり１ｍｇのｍＡｂ１中に１ｎｇのＰＬＢＤ）を下回っていることを示した。
【0158】
したがって、上の全てのロットの薬液は、異常なＰＬＢＤ２レベルではないことが示された。
【0159】
４．２ 直接ペプチドマッピングを使用するＨＣＰプロファイリング
薬液の組成を明らかにするために、実施例１に示した通りにナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してペプチド分析を行った。通常のナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して宿主細胞由来タンパク質をスクリーニングし、標的化ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して確認した。試験したいずれのロット（ロット番号５～１２）においても宿主細胞由来タンパク質は同定されなかった（表４）。ＴＩＭＰ１及びＣＣＬ１３は、全てのロットの最初のスクリーニングでは同定されなかったものの、より感度の高い確認試験を使用したところ、全てのロットに存在することが判明した。ロット５～１２からの薬液中の宿主細胞由来タンパク質ＴＩＭＰ１及びＣＣＬ１３の相対存在量を、ロット番号５の相対存在量に対して正規化してプロットした（図１４及び１５を参照）。
薬液の組成を明らかにするために、実施例１に示した通りにナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用してペプチド分析を行った。通常のナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して宿主細胞由来タンパク質をスクリーニングし、標的化ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用して確認した。試験したいずれのロット（ロット番号５～１２）においても宿主細胞由来タンパク質は同定されなかった（表４）。ＴＩＭＰ１及びＣＣＬ１３は、全てのロットの最初のスクリーニングでは同定されなかったものの、より感度の高い確認試験を使用したところ、全てのロットに存在することが判明した。ロット５～１２からの薬液中の宿主細胞由来タンパク質ＴＩＭＰ１及びＣＣＬ１３の相対存在量を、ロット番号５の相対存在量に対して正規化してプロットした（図１４及び１５を参照）。
【0160】
８つのロットのうち、ロット番号９及びロット番号１１は、ＰＰＱロット１及び３をそれぞれ調製するために使用した薬液から構成された。ロット番号９及びロット番号１１の薬液中の宿主細胞由来タンパク質をこれらが使用されたＰＰＱロットと比較したところ、これらは他の原薬ロットと比較して、粒子が生成したロットで観察された宿主細胞由来タンパク質のレベルが評価されなかったことを示唆している。
【0161】
【表4】
【0162】
４．３ 抗ＨＣＰ免疫精製（ＩＰ）濃縮及びそれに続くペプチドマッピングを使用するＨＣＰプロファイリング
薬液ロットに存在する宿主細胞由来タンパク質をさらに評価するために、より感度の高い抗ＨＣＰ免疫精製を行った。ビオチン化抗ＨＣＰ抗体のプールを使用して、治療用タンパク質及びその他の成分を除去することにより、ＨＣＰをプルダウン及び濃縮した。濃縮の後、ＨＣＰを酵素で消化し、ＨＣＰの同定及び定量のためにナノＬＣ－ＭＳに注入した。濃縮により、ＨＣＰをより高感度に同定及び定量することができる。
薬液ロットに存在する宿主細胞由来タンパク質をさらに評価するために、より感度の高い抗ＨＣＰ免疫精製を行った。ビオチン化抗ＨＣＰ抗体のプールを使用して、治療用タンパク質及びその他の成分を除去することにより、ＨＣＰをプルダウン及び濃縮した。濃縮の後、ＨＣＰを酵素で消化し、ＨＣＰの同定及び定量のためにナノＬＣ－ＭＳに注入した。濃縮により、ＨＣＰをより高感度に同定及び定量することができる。
【0163】
表５に、抗ＨＣＰ免疫精製濃縮を使用してＨＣＰプロファイリングを行うことにより同定された宿主細胞由来タンパク質が列挙されている。
【0164】
【表5】
【0165】
ロット番号１（ＰＰＱロット、表５）からロット番号９（ロット番号１を調製するために使用された薬液ロット１、表３）において同定された宿主細胞由来タンパク質を比較すると、ロット番号１と関連付けられる固有の宿主細胞由来タンパク質はないと結論付けることができる。これは、ＰＰＱロットにおける宿主細胞由来タンパク質のプロファイルが薬液ロットの宿主細胞由来タンパク質のプロファイルと類似していたことを示唆している。
【0166】
実施例５
宿主細胞由来タンパク質は、凝集体形成の結果として濃縮される可能性がある。これは、薬液ロット（ロット番号６）の宿主細胞由来タンパク質を、以下の表６に示す高分子量種のｍＡｂ１が濃縮されたロットと比較することによって調査した。
宿主細胞由来タンパク質は、凝集体形成の結果として濃縮される可能性がある。これは、薬液ロット（ロット番号６）の宿主細胞由来タンパク質を、以下の表６に示す高分子量種のｍＡｂ１が濃縮されたロットと比較することによって調査した。
【0167】
【表6】
【0168】
実施例２で示した通りにロット１３～１５について粒子の単離及びラマン分析を行った。
【0169】
５．１ 直接ペプチドマッピングを使用して同定した宿主細胞由来タンパク質
サンプルをＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥し、次いで８Ｍの尿素及び１０ｍＭのＴＣＥＰ－ＨＣｌで溶解し、５０℃で３０分間変性させ、続いて室温で３０分間１０ｍＭのインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）と共にインキュベートした。インキュベートしたサンプルを１μｇのｒＬｙｓＣを用いて変性条件下で１時間消化した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで希釈した。この混合物に１μｇのトリプシンを添加し、消化を３時間継続した。その後、消化混合物を２０％のギ酸（ＦＡ）で酸性にした後、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＨＭＷのｍＡｂ１種が濃縮されたロットで６つの宿主細胞由来タンパク質が同定されたものの、薬液ロットでは同定されなかった（表７）。
サンプルをＳｐｅｅｄＶａｃを使用して乾燥し、次いで８Ｍの尿素及び１０ｍＭのＴＣＥＰ－ＨＣｌで溶解し、５０℃で３０分間変性させ、続いて室温で３０分間１０ｍＭのインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）と共にインキュベートした。インキュベートしたサンプルを１μｇのｒＬｙｓＣを用いて変性条件下で１時間消化した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで希釈した。この混合物に１μｇのトリプシンを添加し、消化を３時間継続した。その後、消化混合物を２０％のギ酸（ＦＡ）で酸性にした後、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＨＭＷのｍＡｂ１種が濃縮されたロットで６つの宿主細胞由来タンパク質が同定されたものの、薬液ロットでは同定されなかった（表７）。
【0170】
【表7】
【0171】
５．２ 標的化ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを使用する宿主細胞由来タンパク質の相対定量
上のステップ５．１から同定されたペプチド／タンパク質を使用して、断片化するこれらの特定のペプチドを質量分析計が探してＨＣＰをさらに確認及び定量するために、同定されたペプチドの質量リストを形成した。そのようにすることで、標的化スクリーニングにより、検出感度が向上した。ＨＭＷ ｍＡｂ１種が濃縮されたロット（ロット番号１３～１５）で７つの宿主細胞由来タンパク質が同定された。ＨＭＷ ｍＡｂ１種が濃縮されたロットで同定された宿主細胞由来タンパク質の量は、薬液ロット（ロット番号６）の宿主細胞由来タンパク質の量よりも約２～６０倍多かった。図１６は、濃縮されたＨＭＷ ｍＡｂ１種を含むロットにおける宿主細胞由来タンパク質の相対定量のチャートを示している。
上のステップ５．１から同定されたペプチド／タンパク質を使用して、断片化するこれらの特定のペプチドを質量分析計が探してＨＣＰをさらに確認及び定量するために、同定されたペプチドの質量リストを形成した。そのようにすることで、標的化スクリーニングにより、検出感度が向上した。ＨＭＷ ｍＡｂ１種が濃縮されたロット（ロット番号１３～１５）で７つの宿主細胞由来タンパク質が同定された。ＨＭＷ ｍＡｂ１種が濃縮されたロットで同定された宿主細胞由来タンパク質の量は、薬液ロット（ロット番号６）の宿主細胞由来タンパク質の量よりも約２～６０倍多かった。図１６は、濃縮されたＨＭＷ ｍＡｂ１種を含むロットにおける宿主細胞由来タンパク質の相対定量のチャートを示している。
【0172】
５．３ 抗ＨＣＰ ＩＰ濃縮及びそれに続くペプチドマッピングを使用して同定された宿主細胞由来タンパク質
ビオチン化抗ＨＣＰ抗体のプールを使用して、治療用タンパク質及び他の成分を除去することにより、ＨＣＰをプルダウン及び濃縮した。濃縮の後、ＨＣＰを酵素で消化し、ＨＣＰの同定及び定量のためにナノＬＣ－ＭＳに注入した。ＨＭＷ ｍＡｂ１種が濃縮されたロット（ロット番号１３～１５）において３１個の宿主細胞由来タンパク質が同定された。３１個の宿主細胞由来タンパク質のうち、薬液ロットは２個の宿主細胞由来タンパク質の存在のみを示した（表８）。
ビオチン化抗ＨＣＰ抗体のプールを使用して、治療用タンパク質及び他の成分を除去することにより、ＨＣＰをプルダウン及び濃縮した。濃縮の後、ＨＣＰを酵素で消化し、ＨＣＰの同定及び定量のためにナノＬＣ－ＭＳに注入した。ＨＭＷ ｍＡｂ１種が濃縮されたロット（ロット番号１３～１５）において３１個の宿主細胞由来タンパク質が同定された。３１個の宿主細胞由来タンパク質のうち、薬液ロットは２個の宿主細胞由来タンパク質の存在のみを示した（表８）。
【0173】
【表8】
【0174】
上の結果は、ｍＡｂ１薬液ロットよりもＨＭＷ ｍＡｂ１種を含むロットにおける宿主細胞由来タンパク質のより多い量及び濃縮を示している。これは、宿主細胞由来タンパク質が濃縮されたＨＭＷｍＡｂ１種であることを示唆している。
【0175】
実施例６
ｍＡｂ１を含む医薬品を、ｍＡｂ１の薬液、ｍＡｂ１のＨＭＷ種を含むロット、及びｍＡｂ１のＰＰＱロットの試験に加えて、可視粒子及び宿主細胞由来タンパク質の存在についても試験した。
ｍＡｂ１を含む医薬品を、ｍＡｂ１の薬液、ｍＡｂ１のＨＭＷ種を含むロット、及びｍＡｂ１のＰＰＱロットの試験に加えて、可視粒子及び宿主細胞由来タンパク質の存在についても試験した。
【0176】
６．１ 粒子の検出
ｍＡｂ１を含む医薬品が入っている２つのバイアル（バイアル＃１及びバイアル＃２）を手作業で検査して、粒子の存在を検出した。
ｍＡｂ１を含む医薬品が入っている２つのバイアル（バイアル＃１及びバイアル＃２）を手作業で検査して、粒子の存在を検出した。
【0177】
６．２ 粒子の単離
各バイアルについて、検出された粒子を、図１７に示されるような、５μＭの細孔サイズ及び４０／２０ｎｍコーティングを有する別個の（Ｒａｐ ＩＤ）金被覆ポリカーボネート膜上に置いた。
各バイアルについて、検出された粒子を、図１７に示されるような、５μＭの細孔サイズ及び４０／２０ｎｍコーティングを有する別個の（Ｒａｐ ＩＤ）金被覆ポリカーボネート膜上に置いた。
【0178】
膜上で切除を行った：（ａ）粒子サンプル－粒子を含む直径３ｍｍの円形領域を切除し、（ｂ）陰性対照－粒子を含まない直径３ｍｍの円形領域を切除した（図１８）。粒子サンプルと陰性対照を８Ｍの尿素に溶解した。表９に示すように、２つのバイアルの膜から３つの粒子サンプルと２つの陰性対照を単離した。
【0179】
【表9】
【0180】
６．３ ラマン分析
実施例２で示した通りに粒子についてラマン分光を行った。表９に列挙されている粒子１の１つのラマンスペクトルから、粒子がタンパク質系であることが確認された（図１９を参照）。図１９で見られる緑色のトレースはタンパク質の参照スペクトルであり、図１９に見られる赤いトレースは粒子サンプルのスペクトルである。
実施例２で示した通りに粒子についてラマン分光を行った。表９に列挙されている粒子１の１つのラマンスペクトルから、粒子がタンパク質系であることが確認された（図１９を参照）。図１９で見られる緑色のトレースはタンパク質の参照スペクトルであり、図１９に見られる赤いトレースは粒子サンプルのスペクトルである。
【0181】
６．４ ペプチド分析
実施例２で示した通りに粒子についてペプチド分析を行った。
実施例２で示した通りに粒子についてペプチド分析を行った。
【0182】
全ての粒子サンプル及び陰性サンプルを、ｍＡｂ１の存在量について分析した。粒子サンプルは、ｍＡｂ１タンパク質が非常に多く存在することを示し、陰性サンプルは、ｍＡｂ１タンパク質が存在しないことを示した（図２０を参照）。存在量のピークは、ｍＡｂ１で最も多い存在量の上位２つのペプチドの平均ピーク面積に基づいて見積もった。
【0183】
ペプチド分析から得られたｍＡｂ１以外のタンパク質を表１０に示す。粒子サンプル及び陰性サンプル中のｍＡｂ１存在量を１Ｅ６に対して正規化し、表１０でｐｐｍ単位で他のタンパク質を相対定量した。表１０のＮＤという用語はタンパク質が検出されなかったことを表す。
【0184】
【表10】
【0185】
粒子サンプル及び陰性サンプル中のタンパク質の存在量は表１１に示す。
【0186】
【表11】
【0187】
ペプチド分析から、ｍＡｂ１を含む医薬品から単離された粒子中に宿主細胞由来タンパク質が存在することが明らかになった。
【0188】
実施例７
サブビジブル粒子の検出を、ｍＡｂ１を含有する製剤原薬（ＦＤＳ）を使用しても行った。
サブビジブル粒子の検出を、ｍＡｂ１を含有する製剤原薬（ＦＤＳ）を使用しても行った。
【0189】
サブビジブル粒子を単離するために、１．５ｍｌのＦＤＳ溶液を、５μＭの細孔サイズと４０／２０ｎｍのコーティングとを有する金でコーティングされたポリカーボネート膜上にピペットで載せた。次いでこれをｍｉｌｌｉ－Ｑ水で洗浄した。最初に１．５ｍｌのＦＤＳ溶液を０．２μＭのフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にピペットで載せ、通過した画分を回収することにより、比較のために粒子を含まない陰性対照を形成した。その後、通過した画分を、５Ｍの細孔サイズと４０／２０ｎｍのコーティングとを有する金でコーティングされたポリカーボネート膜にピペットで移し、ｍｉｌｌｉ－Ｑ水で洗浄した。
【0190】
ラマン分析及びペプチド分析を、実施例２に記載の通りに行った。タンパク質を含む粒子は、ラマン分光法を使用して確認した。記載の方法によって同定されたタンパク質を含む粒子の暗視野画像が図２１に示されている。サブビジブル粒子のペプチド分析から、ｍＡｂ１と共に宿主細胞由来タンパク質－メタロプロテイナーゼ阻害剤１の存在が示された一方で、粒子を含まない陰性対照はｍＡｂ１の存在のみを示した。粒子を含まない陰性対照に宿主タンパク質メタロプロテイナーゼ阻害剤１が存在しないことは、宿主細胞由来タンパク質がサブビジブル粒子のみの中に多く含まれていることを示唆している（表１２）。
【0191】
【0192】
実施例８
バイオプロセスにおける宿主細胞由来タンパク質の存在を評価するために、ｍＡｂ２の前臨床製造及びプロセス開発（ＰＭＰＤ）から採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を試験した。ｍＡｂ２のＨＣＣＦは、滅菌濾過後及び凍結融解サイクルにおける粒子の存在を示した。生産工程及び製品供給（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｕｐｐｌｙ（ＩＯＰＳ））におけるＨＣＣＦ滅菌濾過工程中に、高い背圧が生じた。これは、一部の不溶性物質がフィルターを詰まらせていることを示している。
バイオプロセスにおける宿主細胞由来タンパク質の存在を評価するために、ｍＡｂ２の前臨床製造及びプロセス開発（ＰＭＰＤ）から採取された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を試験した。ｍＡｂ２のＨＣＣＦは、滅菌濾過後及び凍結融解サイクルにおける粒子の存在を示した。生産工程及び製品供給（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｓｕｐｐｌｙ（ＩＯＰＳ））におけるＨＣＣＦ滅菌濾過工程中に、高い背圧が生じた。これは、一部の不溶性物質がフィルターを詰まらせていることを示している。
【0193】
粒子の単離、ラマン分析、及びペプチド分析は、実施例２で示した通りに行った。図２２は、粒子の暗視野画像及びラマン画像を示している。ｍＡｂ２以外に、粒子の１つの中で７４３個の宿主細胞由来タンパク質が同定された。上位１０個のＨＣＰ（シーケンスカバレッジに基づく）は、Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｑ０６ＢＵ８）、アクチン、細胞質（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３ＧＶＤ０）、トランスケトラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３ＧＵＵ５）、Ｒａｂ ＧＤＰ解離阻害剤ベータ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３ＧＲ７３）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｐ１７２４４）、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３Ｈ０６６）、トランスゲリン（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３Ｈ７Ｚ２）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼＭｕ５（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３ＩＬＦ１）、クロライド細胞内チャネルタンパク質４（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３ＨＭＵ４）、及びロイコトリエンＡ－４ヒドロラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション：Ｇ３ＨＢＩ９）であった。
【0194】
実施例９
バイオプロセスの異なる段階における宿主細胞由来タンパク質からなる粒子は、濾過容量の低下をもたらす可能性がある。バイオプロセスにおける宿主細胞由来タンパク質の存在を評価するために、ｍＡｂ３／ｍＡｂ２バイオプロセスの細胞培養液（ＣＣＦ）を試験した。
バイオプロセスの異なる段階における宿主細胞由来タンパク質からなる粒子は、濾過容量の低下をもたらす可能性がある。バイオプロセスにおける宿主細胞由来タンパク質の存在を評価するために、ｍＡｂ３／ｍＡｂ２バイオプロセスの細胞培養液（ＣＣＦ）を試験した。
【0195】
９．１ 濾過容量の評価
ＰＭＰＤ及びＩＯＰＳプロセスは、様々なプログラムからのいくつかのロットにおいて異常に低いＣＣＦ濾過スループットを示した。ｍＡｂ３／ｍＡｂ２ロットのうちの１つについて、室温で０、２４、４８、及び７２時間インキュベートした後、採取プールの濾過容量を評価した。濾過容量の評価は、上述した時点でＣＣＦフィルタープールでＶｍａｘ法を使用して行った（Ｖｍａｘ（商標）定圧試験プロトコル、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。Ｖｍａｘ（商標）試験では、時間とその時間までに回収された体積を一定間隔で記録した。その後、データを時間／体積対時間としてプロットした。
ＰＭＰＤ及びＩＯＰＳプロセスは、様々なプログラムからのいくつかのロットにおいて異常に低いＣＣＦ濾過スループットを示した。ｍＡｂ３／ｍＡｂ２ロットのうちの１つについて、室温で０、２４、４８、及び７２時間インキュベートした後、採取プールの濾過容量を評価した。濾過容量の評価は、上述した時点でＣＣＦフィルタープールでＶｍａｘ法を使用して行った（Ｖｍａｘ（商標）定圧試験プロトコル、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。Ｖｍａｘ（商標）試験では、時間とその時間までに回収された体積を一定間隔で記録した。その後、データを時間／体積対時間としてプロットした。
【0196】
評価には、Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ（登録商標）２（それぞれ０．４５μｍ及び０．２μｍの２層のフィルター）及びＬｉｆｅＡＳＳＵＲＥ（商標）（それぞれ０．６５μｍ及び０．２μｍの２層のフィルター）の２種類のフィルターを使用した。時間単位での時間に対するＶｍａｘ容量（Ｌ／ｍ２）のプロット（図２３を参照）は、経時的なＶｍａｘ（商標）の減少を示し、これは時間の経過に伴う凝集または粒子の形成を示唆している。時間の増加は濁度の増加も示した。この濁度の増加と濾過容量の減少は、フィルターを詰まらせる経時的な宿主細胞由来タンパク質または薬液の析出に起因する可能性がある。
【0197】
９．２ タンパク質存在量の定量
濁度の増加及び濾過容量の減少の原因を明らかにするために、ｍＡｂ２（ｐＩ：約６．３）のＣＣＦを、ｐＨ５．６０～６．１０で０、２４、４８及び７２時間、前濾過でインキュベートした。各時点のインキュベートしたＣＣＦ液を、ＬｉｆｅＡＳＳＵＲＥ（商標）フィルター（それぞれ０．６５μｍ及び０．２μｍの２層のフィルター）を使用して濾過した。
濁度の増加及び濾過容量の減少の原因を明らかにするために、ｍＡｂ２（ｐＩ：約６．３）のＣＣＦを、ｐＨ５．６０～６．１０で０、２４、４８及び７２時間、前濾過でインキュベートした。各時点のインキュベートしたＣＣＦ液を、ＬｉｆｅＡＳＳＵＲＥ（商標）フィルター（それぞれ０．６５μｍ及び０．２μｍの２層のフィルター）を使用して濾過した。
【0198】
経時的に析出したタンパク質が何であるかを評価するために、フィルターを切り開き、４ｍｍのディスクを分析した（図２４を参照）。切断したフィルターを８Ｍの尿素及び１０ｍＭのＴＣＥＰ－ＨＣｌに浸し、５０℃で３０分間インキュベートして、切断したフィルター上のタンパク質を溶解、変性、及び還元した。次いで、サンプルを１０ｍＭのインドール－３－酢酸（ＩＡＡ）と共にＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベートしたサンプルを変性条件下で１μｇのｒＬｙｓＣを用いて１時間消化した後、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで希釈した。この混合物に１μｇのトリプシンを添加し、消化を３時間継続した。その後、消化混合物を２０％ギ酸（ＦＡ）を用いて酸性にした後、ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行った。タンパク質の存在量は、特定のタンパク質に割り当てられた上位３つのペプチドイオンの質量分析シグナルの存在量の平均に基づいた。
【0199】
合計２３６６個の定量可能なタンパク質が、ｍＡｂ２のＣＣＦにおいて同定された。同定されたタンパク質から、１８８０個のタンパク質が追加の分析に組み込まれた（４８６個のタンパク質は、タンパク質あたり２個未満の固有のペプチドを示したため除外した）。最も多く含まれるタンパク質はｍＡｂ２であった。フィルター上のｍＡｂ２の存在量は経時的に変化しなかった（図２５及び表１３を参照）。
【0200】
【表13】
【0201】
ｍＡｂ２ ＬＣの平均存在量を１Ｅ６に設定し、他のタンパク質の存在量をＨＣＰペプチド質量分析計のピーク面積を使用して計算し、ｍＡｂ２ ＬＣの平均存在量に対して正規化した。最も多く含まれる上位５０種のタンパク質（表１４に記載）はフィルターを詰まらせる可能性が高いためこれらを詳細に調べた。
【0202】
【表14】
【0203】
時間に対するｍＡｂ２の相対存在量の並行プロットから、高存在量のＨＣＰのいくつかが経時的に増加することが明らかになった（図２６を参照）。
【0204】
インキュベートされたＣＣＦフィルターに異なる時点で析出したＨＣＰの量を理解するために、時間ＴにおけるＨＣＰの存在量／Ｔ０におけるＨＣＰの存在量対時間ＴにおけるｍＡｂ２ＬＣの相対量（ｐｐｍ）の比のバブルプロットが図２７（Ｔ＝０時間）、図２８（Ｔ＝２４時間）、図２９（Ｔ＝４８時間）、及び図３０（Ｔ＝７２時間）に示されている。図２８で見られるように、いくつかのＨＣＰ（例えば補体Ｃ１ｑ腫瘍壊死、伸長因子１－ベータ、７８ｋＤａグルコース調節タンパク質、及び伸長因子１－デルタ様アイソフォーム１）は２倍よりも多く増加し、これは濾過容量の緩やかな減少と相関していた。４８時間後には、多くのＨＣＰが２倍よりも多く増加し、濾過容量の同様の有意な減少と相関していた（図２９を参照）。７２時間では、上位５０種のＨＣＰのほぼ全ての７２時間における存在量が、０時間における存在量と比較して２倍よりも多く増加した（図３０を参照）。９個のタンパク質形態では、上位５０種のＨＣＰは、０時間における存在量と比較して５倍よりも多く増加した（表１４）。
【0205】
上位５０種のＨＣＰの中でも、フィブロネクチンは、７２時間で４．６倍の増加を示し、最も高い分子量を有しており、最も可能性の高い濾過容量減少の原因であった。
【0206】
サブビジブル粒子または可視粒子は、濾過容量の低下を引き起こす可能性があり、サブビジブル粒子もしくは可視粒子の形成の根本的原因または濾過容量の低下の根本的原因を見つけることは、医薬品またはバイオプロセスにとって必要不可欠な場合がある。原因が特定された後、それを回避するための措置を講じることができる。本明細書に記載の方法は、可視粒子及びサブビジブル粒子の形成の根本的原因の特定を容易にすることができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【配列表】