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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-05
(45)【発行日】2024-04-15
(54)【発明の名称】広域スペクトルの抗ウイルス治療のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/192 20060101AFI20240408BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240408BHJP
A61P 31/20 20060101ALI20240408BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240408BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240408BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240408BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240408BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240408BHJP
【ＦＩ】
A61K31/192
A61P31/14 ZNA
A61P31/20
A61P31/16
A61P43/00 121
A61K45/00
A61P29/00
A61P11/00
A61P43/00 111
【請求項の数】
3
(21)【出願番号】P 2020542534
(86)(22)【出願日】2018-10-16
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2021-01-07
(86)【国際出願番号】 US2018056138
(87)【国際公開番号】W WO2019079339
(87)【国際公開日】2019-04-25
【審査請求日】2021-10-15
(31)【優先権主張番号】62/573,933
(32)【優先日】2017-10-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(73)【特許権者】
【識別番号】516259217
【氏名又は名称】ヴァーシテック・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＶＥＲＳＩＴＥＣＨ ＬＩＭＩＴＥＤ
【住所又は居所原語表記】１５／Ｆ， Ｋ．Ｋ． ＬＥＵＮＧ ＢＵＩＬＤＩＮＧ， ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＨＯＮＧ ＫＯＮＧ， ＰＯＫＦＵＬＡＭ， ＨＯＮＧ ＫＯＮＧ， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】ユアン，シュオフェン
(72)【発明者】
【氏名】チャン，フック・ウー・ジャスパー
(72)【発明者】
【氏名】チュ，ヒン
(72)【発明者】
【氏名】ラウ，ジョンソン・ユ‐ナム
(72)【発明者】
【氏名】ユエン，クウォック・ユン
【審査官】井上 能宏
(56)【参考文献】
【文献】特表２０１７－５０８７３７（ＪＰ，Ａ）
【文献】国際公開第２０１５／１３８３５４（ＷＯ，Ａ１）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ａ６１Ｋ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス感染症に関連する炎症反応を低減するための医薬組成物であって、
抗ウイルス化合物として、ＡＭ５８０を含み、
ここで、前記化合物は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＺＩＫＡＶ、インフルエンザ、エンテロウイルス及びヒトアデノウイルスから選択されるウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、
前記化合物が、間質性炎症又は肺胞障害を低減する、医薬組成物。
【請求項2】
ウイルス感染症に関連する炎症反応を低減するための医薬組成物であって、
抗ウイルス化合物として、ＡＭ５８０を含み、
ここで、前記化合物は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＺＩＫＡＶ、インフルエンザ、エンテロウイルス及びヒトアデノウイルスから選択されるウイルスに対する抗ウイルス活性を有し、
前記化合物が、炎症誘発性サイトカインのウイルス誘導活性化を低減する、医薬組成物。
【請求項3】
前記炎症誘発性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８からなる群から 選択される、請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１７年１０月１８日に出願の米国仮出願第６２／５７３９３３号の利益を主張するものである。これら及び全ての参照される外因性材料は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれている参考文献内の用語の定義又は使用が本明細書において提供されるその用語の定義と矛盾しているか又は相容れない場合、本明細書において提供されるその用語の定義が優先されるとみなす。
【0002】
本発明の分野は、抗ウイルス治療、特に小分子を用いた抗ウイルス治療である。
【背景技術】
【0003】
背景の記載は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書において提供される情報の内の何れかが従来技術であること、若しくは請求される本発明に関連したものであることは承認されるものではなく、又は具体的に若しくは暗黙的に参照されるいかなる刊行物も従来技術であることは承認されるものではない。
【0004】
重症急性呼吸器症状群（ＳＡＲＳ）、パンデミックインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）、中東呼吸器症状群（ＭＥＲＳ）、西部／東部ウマ脳炎（ＷＥＥ／ＥＥＥ）、エボラ及びジカ（ＺＩＫＶ）の流行性ウイルス疾患が、それぞれ、２００３年、２００９年、２０１２年、２０１３年、２０１４年及び２０１６年に発生した。これらの感染性疾患は、致死性であり、且つ伝染性である。これらのウイルスの高い毒性と、有効な治療が存在しないこととによって、世界的な公衆衛生に対する脅威が続いています。特異的なウイルスを標的とするために特異的な薬物（ｄｒｕｂ）を開発する従来の「ｏｎｅ－ｂｕｇ－ｏｎｅ－ｄｒｕｇ」パラダイムは、ウイルス病原体の出現及び再出現の課題に対処するには不充分である［１］。本明細書における全ての刊行物は、あたかも個々の刊行物又は特許出願書が参照により組み込まれていることが具体的且つ個別に示されているかのように、同程度に参照により組み込まれている。組み込まれた参考文献内における用語の定義又は使用が本明細書において提供されるその用語の定義と矛盾しているか又は相容れない場合、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、前記参考文献内のその用語の定義は適用されない。新規基礎的病原体による流行性ウイルス疾患の効果的制御を管理するために、広域クラスの抗ウイルス剤を開発することが不可避である。そのような交差防御抗ウイルス剤は、迅速な診断が利用可能でない場合にウイルス症状群の患者における急速な使用を可能にし、ひいては潜在的なエピデミック又はパンデミックのリスクを最小限に抑える［２］。
【0005】
広域スペクトルの抗ウイルス剤の開発のための現行の戦略は、主に、ウイルス感染性を標的とすることと、宿主の防御システムを調節することとの二つの態様に焦点を合わせる。ウイルス吸着及びウイルス融合の遮断剤［３、４］並びにウイルスポリメラーゼ活性の阻害剤［５］を含む、ウイルス感染性を低下させるための成功した候補物質が利用可能である。しかし、薬剤耐性の進展のため、ウイルス成分に対する特異性によって、そのような薬物の長期適用が限定される［６］。別の場合、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）及びＩＦＮ誘導タンパク質は、防御の細胞機構を誘発してウイルス複製を抑制する。細胞タンパク質阻害剤及び関連する経路調節物質は、ウイルスライフサイクルに介入して複製適応度を抑制する［７、８］。しかし、宿主に対する薬物毒性及び耐性ウイルス子孫の生成の課題は、対処すべきものとして残る。リバビリンは、広域スペクトルの抗ウイルス治療のための現在唯一のＦＤＡ認可薬物である。しかし、多くの欠点（例えば、好ましくない薬物動態及び狭い治療域）によって、臨床背景におけるその広い適用が制限される［９］。
【0006】
ウイルスは、不可避の細胞内寄生体である。ウイルス誘導脂質代謝再プログラムは、広域スペクトルの抗ウイルス剤の開発のためのこれらのプロセスを標的とすることの潜在性を示す感染性の転帰に実質的に影響を及ぼす可能性がある［１０、１１］。脂質は、ウイルス膜及び細胞膜の構造的要素として長く知られてきた。動物ウイルスは、細胞の出入りのために宿主の境界を交差する必要がある。エンベロープウイルスにおいて、このことは、細胞膜を介して、入ってくるウイルスの融合及び発生期のウイルスの出芽によって起きる。非エンベロープウイルスにおいて、ウイルスが入ってくるためには、ウイルスゲノムを細胞質内にトランスファーするために細胞（主にエンドソーム）膜の一時的な撹乱が必要である［１２］。細胞内において、ウイルスは、ゲノム複製及びゲノム構築が起きる細胞質膜構造及び細胞質画分を誘導する。最近、脂質は、細胞内及び細胞間の両方においてメッセージを伝達する真核生物における主要な信号伝達分子であることが明らかにされている［１３］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【文献】Peiris, J.S., et al., Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome. Lancet, 2003. 361(9366): p. 1319-25.
【文献】Chan, J.F., et al., Middle East respiratory syndrome coronavirus: another zoonotic betacoronavirus causing SARS-like disease. Clin Microbiol Rev, 2015. 28(2): p. 465-522.
【文献】Yuen, K.Y., et al., Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus. Lancet, 1998. 351(9101): p. 467-71.
【文献】To, K.K., et al., The emergence of influenza A H7N9 in human beings 16 years after influenza A H5N1: a tale of two cities. Lancet Infect Dis, 2013. 13(9): p. 809-21.
【文献】De Clercq, E., Strategies in the design of antiviral drugs. Nat Rev Drug Discov, 2002. 1(1): p. 13-25.
【文献】Zumla, A., et al., Coronaviruses - drug discovery and therapeutic options. Nat Rev Drug Discov, 2016. 15(5): p. 327-47.
【文献】Simmons, G., et al., Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(33): p. 11876-81.
【文献】Kaletsky, R.L., G. Simmons, and P. Bates, Proteolysis of the Ebola virus glycoproteins enhances virus binding and infectivity. J Virol, 2007. 81(24): p. 13378-84.
【文献】Warren, T.K., et al., Protection against filovirus diseases by a novel broad-spectrum nucleoside analogue BCX4430. Nature, 2014. 508(7496): p. 402-5.
【文献】Zhu, J.D., et al., Broad-spectrum antiviral agents. Front Microbiol, 2015. 6: p. 517.
【文献】Burke, J.D., L.C. Platanias, and E.N. Fish, Beta interferon regulation of glucose metabolism is PI3K/Akt dependent and important for antiviral activity against coxsackievirus B3. J Virol, 2014. 88(6): p. 3485-95.
【文献】Thakur, C.S., et al., Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007. 104(23): p. 9585-90.
【文献】Graci, J.D. and C.E. Cameron, Mechanisms of action of ribavirin against distinct viruses. Rev Med Virol, 2006. 16(1): p. 37-48.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
したがって、広い範囲のウイルスを効果的に処置する、安全且つ有効な化合物の必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【0009】
（発明の概要）
本発明の主題は、－－－である装置、システム及び方法を提供するものである。
本発明の主題は、－－－である装置、システム及び方法を提供するものである。
【0010】
本発明の主題の各種の目的、特徴、態様及び長所は、同様の符号が同様の構成要素を表す添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳述される記載からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】ＡＭ５８０の構造。
【図2】タミバロテンの構造。
【図3】図３は、抗ウイルス剤としてのＡＭ５８０の試験の結果を示す。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ阻害剤及びインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス阻害剤のスクリーニングのためのＭＯＩ条件及び時点の最適化が示される。陽性対照としてファビピラビル（５０μｇ／ｍＬ）及びレムデシビル（５μＭ）を用いた。結果は、擬感染細胞の細胞生存率によって正規化される。
【図4】図４は、抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ候補物質及び／又は抗インフルエンザウイルス候補物質についてのライブラリースクリーニングを示すヒートマップを示す。Ｈｕｈ７細胞をＭＥＲＳ－ＣｏＶ（０．１ＭＯＩ）に感染させ、ＭＤＣＫ細胞をインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス（０．０１ＭＯＩ）に感染させた後、感染の直後に生体活性脂質化合物（１０μＭ）又はＤＭＳＯビヒクルによる処置を行った。それぞれ２４ｈｐｉ（ＭＥＲＳ－ＣｏＶについて）及び４８ｈｐｉ（インフルエンザウイルスについて）において細胞生存率を決定した。前記ＤＭＳＯ対照を０に設定し、擬感染を１に設定することによって正規化を行った。三つの独立したスクリーニングから得られた平均が示される。
【図7】図７は、多重サイクルＭＥＲＳ－ＣｏＶ増殖アッセイを用いるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を特性決定する試験の結果を示す。Ｈｕｈ７細胞を０．００１ＭＯＩのＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ウイルス感染の１時間後（「ｈｐｉ」）にＤＭＥＭ培地中における２０μＭのＡＭ５８０で接種物を置換した。細胞培養上清におけるウイルス力価を、示された通りの異なる時点でプラークアッセイによって定量した。
【図8】図８は、ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を特性決定する免疫ブロット試験の結果を示す。ウェスタンブロット法は、ＡＭ５８０処置後のＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ生成の低下を示した。１ＭＯＩのウイルスの感染後の示された時点でＨｕｈ７細胞溶解物を回収した。細胞生存率の内部対照及び内部指示薬としてβ－アクチンを検出した。
【図9】図９は、ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を特性決定するフローサイトメトリー試験の試験結果を示す。フローサイトメトリーによってＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＮＰ陽性細胞を検出した。Ｈｕｈ７細胞を０．０１ＭＯＩのＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させた。ＡＭ５８０又はＤＭＳＯによる２４時間のインキュベーション後、フローサイトメトリーのために、対照細胞を剥離し、固定し、透過処理し、抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＮＰ抗体で染色した。典型的な実験の結果を示す。
【図11】図１１は、ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を特性決定するウイルス複製試験の結果を示す。ＡＭ５８０は、２４ｈｐｉにおいてＡ５４９（０．１ＭＯＩ）細胞、Ｃａｌｕ－３（０．１ＭＯＩ）細胞及びＶｅｒｏ（０．０１ＭＯＩ）細胞の細胞培養上清中で検出されるようにＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を低下させた。
【図12】図１２は、ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を特性決定するウイルス複製試験の結果を示す。ＡＭ５８０は、２４ｈｐｉにおいて単球由来マクロファージ（ＭＤＭ、１ＭＯＩ）細胞及びＴＨＰ－１（０．１ＭＯＩ）細胞の細胞溶解物において検出されるようにＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を低下させた。
【図13】図１３は、ＡＭ５８０処置を行った又は行わないＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞の遺伝子発現分析の結果を示す。ＡＭ５８０は、Ｈｕｈ７細胞及び単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ誘導炎症誘発性サイトカインのアップレギュレーションを低下させたが、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β及びＩＬ－８についての代表的サイトカインマーカーが示される。ＭＥＲＳ－ＣｏＶとＡＭ５８０によって処置されたＭＥＲＳ－ＣｏＶとの群の間の差をスチューデントｔ検定によって統計学的に分析した。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図14】図１４は、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性試験及び細胞毒性試験の結果を示す。ＡＭ５８０アナログの構造的活性分析。上のパネルは、異なる濃度（２０μＭ、５μＭ、１．２５μＭ及び０μＭ）における個別の化合物の抗ウイルス効力を示し、下のパネルは、それぞれ、それらの化学構造及び生物学的機能の概要である。
【図16】図１６は、オルガノイドにおけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性の結果試験（ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｔｕｄｉｅｓ）を示す。ＡＭ５８０は、ヒト腸管オルガノイド（インテスチノイド（ｉｎｔｅｓｔｉｎｏｉｄ））において抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を示した。分化したインテスチノイドにＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＭＯＩ≒０．１）を三回接種し、次いでマトリゲル内に再包埋し、培養培地中で維持した。示されたｈｐｉにおいて、ウイルス収率の定量のためにインテスチノイド、無細胞マトリゲル及び培養培地を採取した。溶解した前記マトリゲル及び培養培地をプラークアッセイによるウイルス滴定に適用した。
【図17】図１７は、オルガノイドにおけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性の結果試験を示す。ＡＭ５８０は、ヒト腸管オルガノイド（インテスチノイド）において抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を示した。分化したインテスチノイドにＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＭＯＩ≒０．１）を三回接種し、次いでマトリゲル内に再包埋し、培養培地中で維持した。示されたｈｐｉにおいて、ウイルス収率の定量のためにインテスチノイド、無細胞マトリゲル及び培養培地を採取した。インテスチノイドにおける絶対ウイルス負荷をＲＴ－ｑＰＣＲによって定量し、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）ｍＲＮＡ転写物によって正規化した。
【図18】図１８は、オルガノイドにおけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性の結果試験を示す。ＡＭ５８０は、ヒト腸管オルガノイド（インテスチノイド）において抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を示した。分化したインテスチノイドにＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＭＯＩ≒０．１）を三回接種し、次いでマトリゲル内に再包埋し、培養培地中で維持した。示されたｈｐｉにおいて、ウイルス収率の定量のためにインテスチノイド、無細胞マトリゲル及び培養培地を採取した。２４ｈｐｉにおいて、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ、ＤＡＰＩ及びファロイジンの固定及び免疫蛍光染色の後のＡＭ５８０（２０μＭ）又はＤＭＳＯ（０．１％）で処置したインテスチノイドを全組織標本化し、共焦点顕微鏡で３Ｄ撮像した。
【図19】図１９は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ（緑色）についての（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）感染エクスビボ肺組織の免疫蛍光染色による肺組織におけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶの免疫細胞化学試験の結果を示す。正常肺組織を１ミリリットル当たり１×１０８ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させるか、又は３７℃で１時間、擬感染させた。感染の合計１８時間後、組織を固定し、凍結保護し、凍結切片にした。スライドを順次染色し、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ８００顕微鏡で共焦点像を取り込んだ。終末細気管支の上皮細胞内でＮＰに対する免疫反応性が検出された（ＤＭＳＯ群）。ＡＭ５８０（２０μＭ）処置は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＮＰ抗原発現を著しく低下させた。
【図20】図２０は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性の試験の結果を示す。ＤＤＰ４トランスジェニックマウス（１８匹／群）を、５０ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶによる攻撃後、２日間ＡＭ５８０又は０．１％ＤＭＳＯ（プラセボ対照）で処置した。腹腔内経路により薬物を注射した。マウスの生存及び病気のシグナルを１４日間又はマウス死亡までモニタした。Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定（＊＊ｐ＜０．０１）を用いて、処置群と対照群との間の生存率の差を比較し、分析した。
【図22】図２２は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性の試験の結果を示す。各群から四匹のマウスを感染後２日及び４日に安楽死させ、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いたウイルス負荷の検出のために肺を回収した。結果は、スチューデントのｔ検定試験を用いてＤＭＳＯ処置群と比較した平均値＋ＳＤ（＊＊ｐ＜０．０１）として示される。
【図23】図２３は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性の試験の結果を示す。感染後２日及び４日に回収されたマウス肺組織における組織病理学的変化。ヘマトキシリン－エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色による示された群から得られた肺組織の代表的組織学的切片が示される。
【図24】図２４は、ＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性をまとめたものである。ＡＭ５８０は、示されたウイルスに対して広域な抗ウイルス効果を示した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ（Ｖｅｒｏ－Ｅ６細胞）、ＺＩＫＶ（Ｖｅｒｏ細胞）、インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１ウイルス（ＭＤＣＫ細胞）並びにＥＶ７１（ＲＤ細胞）におけるＡＭ５８０の抗ウイルス活性を評価するためにプラーク低減アッセイを行った。＊ウイルス負荷低減アッセイをＡｄＶ５（Ｈｅｐ－２細胞）について行った。化合物が存在しない場合における対照に対する示された濃度のＰＦＵ又はウイルス負荷が示される（％）。
【図25】図２５は、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性試験及び細胞毒性試験の結果を示す。（ウイルス負荷低減アッセイを用いて評価された）ＡｄＶ５を除いて、異なるウイルスに対するＡＭ５８０のＩＣ５０をプラーク低減アッセイによって決定した。
【図26】図２６は、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性試験及び細胞毒性試験の結果を示す。それぞれ細胞ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性細胞オキシドレダクターゼ酵素（ＭＴＴアッセイ）又はＡＴＰ活性（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ）の何れかを評価することによって異なる細胞系におけるＡＭ５８０のＣＣ５０を決定した。
【図28】図２８は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性を特性決定する試験の結果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８匹／群）を１００ＰＦＵのインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによる攻撃後、３日間ＡＭ５８０、ザナミビル又は０．１％ＤＭＳＯで処置した。麻酔後に鼻腔内経路により薬物を送達した。生存率が示される。感染後３日及び６日にマウス組織試料を採取した。
【図29】図２９は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性を特性決定する試験の結果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８匹／群）を１００ＰＦＵのインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによる攻撃後、３日間ＡＭ５８０、ザナミビル又は０．１％ＤＭＳＯで処置した。麻酔後に鼻腔内経路により薬物を送達した。体重の変化が示される。感染後３日及び６日にマウス組織試料を採取した。
【図30】図３０は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性を特性決定する試験の結果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８匹／群）を１００ＰＦＵのインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによる攻撃後、３日間ＡＭ５８０、ザナミビル又は０．１％ＤＭＳＯで処置した。麻酔後に鼻腔内経路により薬物を送達した。肺組織ウイルス負荷が示される。感染後３日及び６日にマウス組織試料を採取した。
【図31】図３１は、動物モデルにおけるＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性を特性決定する試験の結果を示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１８匹／群）を１００ＰＦＵのインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによる攻撃後、３日間ＡＭ５８０、ザナミビル又は０．１％ＤＭＳＯで処置した。麻酔後に鼻腔内経路により薬物を送達した。Ｈ＆Ｅ組織病理学的染色分析の結果が示される。感染後３日及び６日にマウス組織試料を採取した。
【図32】図３２は、ＲＡＲ－α－シグナル伝達又は先天性抗ウイルス応答に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。Ｈｕｈ７細胞に２４時間ＲＡＲ－α－標的化ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした後、さらに２４時間ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染（０．０１ＭＯＩ）を生じさせた。細胞培養上清中におけるウイルス負荷が示される。内部対照としてβ－アクチンを用いたウェスタンブロット法によってｓｉＲＮＡノックダウン（ＫＤ）の効率性を検出した。野生型（擬）と前処置（ｓｉＲＮＡノックダウン又は外来遺伝子過剰発現）との間の差を比較した。
【図33】図３３は、ＲＡＲ－α－シグナル伝達又は先天性抗ウイルス応答に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。Ｈｕｈ７細胞に２４時間ＲＡＲ－α過剰発現プラスミドをトランスフェクトした後、さらに２４時間ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染（０．０１ＭＯＩ）を生じさせた。細胞培養上清中におけるウイルス負荷が示される。内部対照としてβ－アクチンを用いてウェスタンブロット法によってＲＡＲ－αの過剰発現（ＯＥ）を検出した。野生型（擬）と前処置（ｓｉＲＮＡノックダウン又は外来遺伝子過剰発現）との間の差を比較した。
【図34】図３４は、ＲＡＲ－α－シグナル伝達又は先天性抗ウイルス応答に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。ＲＡＲ－α拮抗剤及びＡＭ５８０の併用による試験の結果は、前記抗ウイルス活性を低下させなかった。
【図35】図３５は、ＲＡＲ－α－シグナル伝達又は先天性抗ウイルス応答に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。ルシフェラーゼ標識レポート構築物をコードする遺伝子を担持するルシフェラーゼアッセイ遺伝子修飾細胞の結果は、ＡＭ５８０がＴＫ、ＣＭＶ及びＳＶ４０などのプロモータのトランス活性化を阻害しなかったことを示した。
【図36】図３６は、ＲＡＲ－α－シグナル伝達又は先天性抗ウイルス応答に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。示される通りのレポータ遺伝子の発現を評価するために、二重ルシフェラーゼアッセイを行った。ＩＦＮ－β－Ｌｕｃ活性及びＩＳＲＥ－Ｌｕｃ活性の測定のために、ＩＦＮ－β（１００単位／ｍＬ）を陽性対照とした。ルシフェラーゼアッセイの中において、ＡＭ５８０（２０μΜ）及びＤＭＳＯ（０．５％）の濃度は安定していた。結果は、二つの独立した実験の平均値＋ＳＤとして示される。
【図37】図３７は、ＲＡＲ－α－シグナル伝達又は先天性抗ウイルス応答に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。ＡＭ５８０は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染を生じさせたＷＴ Ａ５４９細胞及びＲＩＧ－Ｉ欠損Ａ５４９細胞の両方において同様の抗ウイルス活性パターンを示した。
【図38】図３８は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶの侵入及び内部移行に対するＡＭ５８０の影響の試験の結果を示す。Ｈｕｈ７細胞をＡＭ５８０（２０μＭ）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（２ＭＯＩ）の混合物によって２時間処置した後、徹底的に洗浄を行い、培養平板から分離し、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ－ＮＰ陽性細胞のフローサイトメトリー分析を行った。
【図39】図３９は、ＳＲＥＢＰ依存性脂質生合成に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。ＡＭ５８０処置後のＭＥＲＳ感染細胞のリピドミック分析（ｌｉｐｉｄｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ）。同定された脂質リストに基づいた階層的クラスタ分析が示される。各棒は、青色（減少レベル）から赤色（増加レベル）までの正規化スケールにおけるその平均強度によって色づけられた脂質を表す。上部におけるデンドログラムは、脂質強度に基づいて構築された。
【図40】図４０は、図３９に示される通りのＬｙｓｏＰＥ（１８：０／０：０）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図41】図４１は、図３９に示される通りのＬｙｓｏＰＥ（１６：０／０：０）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図42】図４２は、図３９に示される通りのＬｙｓｏＰＥ（１６：ｌ／０：０）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図43】図４３は、図３９に示される通りのＬｙｓｏＰＥ（１８：１／０：０）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図44】図４４は、図３９に示される通りのＰＥ（Ｐ－１８：０／０：０）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図45】図４５は、図３９に示される通りのＬｙｓｏ－ＰＣ（０：０／１６：ｌ）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図46】図４６は、図３９に示される通りのＬｙｓｏ－ＰＣ（１６：１／０：０）代謝産物のピーク高さを示す。一元配置分散分析検定によって群間差を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図51】図５１は、ＳＲＥＢＰ依存性脂質生合成に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。ＡＭ５８０は、細胞脂質滴（ＬＤ）レベルを減少させた。０．１％ＤＭＳＯ若しくは２０μΜのＡＭ５８０の存在下で２４時間０．０１ＭＯＩでＭＥＲＳ－ＣｏＶにＨｕｈ７細胞を感染させたか、又は擬感染させた。細胞を固定し、ＤＡＰＩ及びＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３で染色した。
【図52】図５２は、ＳＲＥＢＰ依存性脂質生合成に対するＡＭ５８０の効果の試験の結果を示す。ＡＭ５８０は、細胞コレステロールレベルを低下させた。Ｈｕｈ７細胞を固定し、遊離コレステロールに特異的に結合するフィリピン（青色）で染色した。
【図53】図５３は、ＡＭ５８０処置を行った又は行わないＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞の遺伝子発現分析の結果を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲによって脂肪酸合成経路における同義遺伝子の発現を分析した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶとＡＭ５８０によって処置されたＭＥＲＳ－ＣｏＶとの群の間の差をスチューデントｔ検定によって統計学的に分析した。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図54】図５４は、ＡＭ５８０処置を行った又は行わないＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞の遺伝子発現分析の結果を示す。ＲＴ－ｑＰＣＲによってコレステロール合成経路における同義遺伝子の発現を分析した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶとＡＭ５８０によって処置されたＭＥＲＳ－ＣｏＶとの群の間の差をスチューデントｔ検定によって統計学的に分析した。エラーバーは標準偏差を表す。＊ｐ＜０．０５。
【図55】図５５は、ウイルス複製に対するｓｉＲＮＡノックダウンの効果の試験の結果を示す。ＳＲＥＢＰ１又はＳＲＥＢＰ２の何れかのｓｉＲＮＡノックダウンは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を低下させた。２日間連続で７５ｎＭのＳＲＥＢＰ１、ＳＲＥＢＰ２又はスクランブル対照ｓｉＲＮＡでＨｕｈ７細胞をトランスフェクトした。ノックダウン効率性をウェスタンブロットによって評価した。ｓｉＲＮＡ処置細胞を０．０１ＭＯＩでＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させた。２４ｈｐｉ後、前記細胞培養上清中におけるウイルス負荷をｑＰＣＲ分析によって評価した。対照ｓｉＲＮＡ処置群と比較した場合、＊ｐ＜０．０５であった。
【図56】図５６は、ウイルス複製におけるｎ－ＳＲＥＢＰの過剰誘導と併用したＡＭ５８０の結果を示す。内在性ｎ－ＳＲＥＢＰ１又は内在性ｎ－ＳＲＥＢＰ２の過剰誘導は、ＡＭ５８０の存在下でＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を促進した。Ｈｕｈ７細胞に対して、５％ＬＰＤＳ及び１０μＭメバスタチンを含有する培地中で１６時間インキュベートすることによってステロールを欠乏させた（すなわち、飢餓）。細胞を採取し、溶解させて、ウェスタンブロットによってそれぞれｎ－ＳＲＥＢＰ１及びｎ－ＳＲＥＢＰ２の検出の前に核分画を調製した。飢餓細胞を、示されたＭＯＩでＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ＡＭ５８０（１０μＭ）で２４時間処置した。前記細胞培養上清中におけるウイルス負荷をｑＰＣＲ分析によって定量した。飢餓処置を行った又は行わなかった群の間の差を、スチューデントのｔ検定を用いて分析した。
【図57】図５７は、ウイルス複製に対するｎ－ＳＲＥＢＰ処理阻害剤の効果の試験の結果を示す。前記ｎ－ＳＲＥＢＰ処理阻害剤ＰＦ４２９２４２及びベツリンは、抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を示した。Ｈｕｈ７細胞をＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、示された濃度の前記化合物で処置した。２４時間後、前記上清中のウイルス負荷をｑＰＣＲによって分析した。０μＭ群と比較した場合、＊ｐ＜０．０５であった。
【図58】図５８は、ＳＲＥへのｎ－ＳＲＥＢＰの結合に対するＡＭ５８０の効果を示す。ＡＭ５８０は、ｎ－ＳＲＥＢＰ１及びＳＲＥの結合を阻害した。前記ＳＲＥを含むＳＲＥＢＰ１特異的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）配列を９６ウェル平板のウェル上に固定する。陽性対照競合体ｄｓＤＮＡ、ベツリン（５０μＭ）又はＡＭ５８０（２０μＭ）と共にＨｕｈ７核抽出物を加えた。結合したＳＲＥＢＰ－１を製造業者のプロトコルに従って検出した。＊は、薬物の投入のない前記擬対照と比較した場合、ｐ＜０．０５を示す。
【図59】図５９は、ＳＲＥへのｎ－ＳＲＥＢＰの結合に対するＡＭ５８０の効果を示す。ＳＲＥＢＰ２ ＤＮＡ結合活性アッセイは、ＡＭ５８０が用量依存的な様式でＳＲＥ及びＳＲＥＢＰ２の結合を阻害したことを示した。
【図60】図６０は、ＳＲＥへのｎ－ＳＲＥＢＰの結合に対するＡＭ５８０の効果を示す。示された濃度のＡＭ５８０をＳＲＥ固定ウェルで２時間インキュベートし、徹底的に洗浄した後、前記細胞核抽出物を加えた。別の場合、ＡＭ５８０を等量の核抽出物で２時間プレインキュベートした後、前記検出ウェルに加えた。ＡＭ５８０は、ＳＲＥではなくｎ－ＳＲＥＢＰ１に結合したことが分かった。
【図61】図６１は、ＡＭ５８０の分子ドッキング試験の結果を示す。ＡＭ５８０は、ＳＲＥＢＰ１及びＳＲＥＢＰ２のＳＲＥ認識部位を占めると予測された。３Ｄ分子ドッキング分析が示される。ＳＲＥＢＰにおける潜在的相互作用表面は赤色で着色され、ＡＭ５８０は棒及びメッシュの表現で表示される。下のパネル：ヒト及びマウスのＳＲＥＢＰ１及びＳＲＥＢＰ２のＤＮＡ結合部分の部分配列配置。Ｔｙｒ３３５、すなわち箱で強調されたＡＭ５８０結合についての主要残基は完全に保存されていることが示される。
【図63】図６３は、ＡＭ５８０結合におけるｎ－ＳＲＥＢＰ１の突然変異の結果を示す。トランケートされたｎ－ＳＲＥＢＰ１（ＷＴ）及びその突然変異プラスミド構築物Ｙ３３５ＲをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に４８時間トランスフェクトした後、核抽出とＤＮＡ結合強度の測定とを行った。ＷＴとＹ３３５Ｒとの間の差をスチューデントｔ検定によって分析した。＊ｐ＜０．０５。Ｔｙｒ３３５は、ｎ－ＳＲＥＢＰ１結合活性のために重要であることが分かった。
【図64】図６４は、ＡＭ５８０アナログの抗ウイルス活性の試験の結果を示す。化学修飾化合物ＡＭ５８０（アジド－ＡＭ５８０）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させたＶｅｒｏ細胞及びＨｕｈ７細胞において同様の抗ウイルス効力を示した。
【図65】図６５は、ＡＭ５８０アナログで処置した細胞の蛍光撮像の結果を示す。Ｈｕｈ７細胞をアジド－ＡＭ５８０（２０μＭ）で６時間処置し、固定し、透過処理し、共焦点撮像のためにＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８－ホスフィン、ＤＡＰＩ及びファロイジンで免疫蛍光染色した。ホスフィン特異的アジド基が無いため、ＡＭ５８０を対照として用いた。
【図66】図６６は、特異的官能性を有する指定された基の局在化を示すＡＭ５８０由来光親和性プローブ（ＡＭ５８０ｄｐ）の構造を示す。アジド－ＡＭ５８０は、アジド－ＰＥＧ５－アミンとＡＭ５８０との間の反応により達成された。三官能基架橋剤２－｛Ｎ２－［Ｎα－ベンゾイルベンゾイカミド－Ｎ６－６－ビオチンアミドカプロイル］リシニルアミド｝エチル－２’－（Ｎスルホスクシンイミジルカルボキシ）エチルジスルフィドナトリウム塩（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）にメチル４－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル］－２－ジフェニルホスファニル－ベンゾエートを加え、次いでアジド－ＡＭ５８０を加えることによりＡＭ５８０ｄｐを合成した。
【図67】図６７は、図６６に示されるようにＡＭ５８０アナログを用いて行った親和性結合試験の結果を示す。ＡＭ５８０ｄｐをストレプトアビジンビーズ上に固定し、ＷＴ構築物又はＹ３３５Ｒ構築物の何れかによってトランスフェクトされた細胞溶解物によってインキュベートした。架橋（クリック化学）を活性化するＵＶ曝露の後、ＡＭ５８０ｄｐ結合タンパク質複合体をそのビオチンタグでプルダウンした。抗フラグ及びｎ－ＳＲＥＢＰ１特異的抗体を用いてｎ－ＳＲＥＢＰ１を検出するためにウェスタンブロット法を用いたと共に、ＲＡＲ－αは、プルダウン分子の中で陽性対照タンパク質として含まれ、アジド－ＡＭ５８０は、非特異的結合を除外するために陰性対照として用いられた。
【図68】図６８は、ＡＭ５８０処置後の転写活性化の試験の結果を示す。ＡＭ５８０によるＨＭＧＣＳ及びＦＡＳ転写活性化の阻害は、ＨＭＧＣＳ－プロモータ－Ｌｕｃレポート構築物及びＦＡＳ－プロモータ－Ｌｕｃレポート構築物を担持し且つ前記薬物に曝露された細胞におけるルシフェラーゼ活性の減失によって示される。
【図70】図７０は、脂質生成及びウイルス複製に対するＡＭ５８０処置の効果の試験の結果を示す。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（０．０１ＭＯＩ）に感染させたＨｕｈ７細胞を追加の外因的パルミチン酸（１００μＭ）の非存在下（白色の棒）又は存在下（灰色の棒）でＤＭＳＯ（０．１％）又はＣ７５（１０μＭ）又はＡＭ５８０（２０μＭ）で処置した。２４ｈｐｉにおけるウイルス収率を示した。一元配置分散分析試験によって群間差を分析した。外因的パルミチン酸は、ＡＭ５８０処置を行った細胞におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を促進することが分かった。
【図71】図７１は、脂質生成及びウイルス複製に対するＡＭ５８０処置の効果の試験の結果を示す。インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）（０．００１ＭＯＩ）に感染させたＭＤＣＫ細胞を追加の外因的パルミチン酸（１００μＭ）の非存在下（白色の棒）又は存在下（赤色の棒）でＤＭＳＯ（０．１％）又はＣ７５（１０μＭ）又はＡＭ５８０（２０μＭ）で処置した。２４ｈｐｉにおけるウイルス収率を示した。一元配置分散分析試験によって群間差を分析した。外因的パルミチン酸は、ＡＭ５８０処置を行った細胞におけるインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス複製を促進した。
【図72】図７２は、脂質生成及びウイルス複製に対するＡＭ５８０処置の効果の試験の結果を示す。ＥＶＡ－７１（０．００１ＭＯＩ）に感染させたＲＤ細胞を追加の外因的パルミチン酸（１００μＭ）の非存在下（白色の棒）又は存在下（青色の棒）でＤＭＳＯ（０．１％）又はＣ７５（１０μＭ）又はＡＭ５８０（２０μＭ）で処置した。２４ｈｐｉにおけるウイルス収率を示した。一元配置分散分析試験によって群間差を分析した。外因的パルミチン酸は、ＡＭ５８０処置を行った細胞におけるＥＶＡ－７１ウイルス複製を促進した。
【図73】図７３は、脂質生成及びウイルス複製に対するＡＭ５８０処置の効果の試験の結果を示す。ヒトＡｄＶ５（０．１ＭＯＩ）に感染させたＨＥｐ－２細胞を追加の外因的パルミチン酸（１００μＭ）の非存在下（白色の棒）又は存在下（灰色の棒）でＤＭＳＯ（０．１％）又はＣ７５（１０μＭ）又はＡＭ５８０（２０μＭ）で処置した。２４ｈｐｉにおけるウイルス収率を示した。一元配置分散分析試験によって群間差を分析した。外因的パルミチン酸は、ＡＭ５８０処置を行った細胞におけるヒトＡｄＶ５ウイルス複製を促進した。
【図74】図７４は、二層膜小胞（「ＤＭＶ」）の形成におけるＡＭ５８０処置の結果を示す。Ｖｅｒｏ細胞をＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ＡＭ５８０により又はＡＭ５８０なしで１８時間インキュベートした。細胞ペレットをグルタルアルデヒドで固定し、電子顕微観察のために処理した。処置のないウイルス感染細胞は、ＤＭＶの核周囲クラスタ（赤色箱）及びＡＭ５８０処置（２０μＭ）におけるＤＭＶ生成の欠如を示した。示された各代表的画像は、二つの別々の実験において取り込まれた三十を超える画像のプールから選択された。ＡＭ５８０は、ＤＭＶ形成を阻害した。
【発明を実施するための形態】
【0012】
以下の記載は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書において提供される情報の内の何れかが従来技術であること、若しくは請求される本発明に関連したものであることは承認されるものではなく、又は具体的に若しくは暗黙的に参照されるいかなる刊行物も従来技術であることは承認されるものではない。
【0013】
本発明の主題は、インビトロ及びインビボの両方で広域スペクトルの抗ウイルス活性を提供するために脂質生成に干渉する小分子を利用する装置、システム及び方法を提供するものである。本発明者らは、ウイルス増殖に干渉するための細胞の脂質代謝の調節が抗ウイルス治療に対して広域なスペクトルのアプローチを提供することができることを見出した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、脂質生成及び／又は脂質代謝における撹乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）がウイルス適応度を減少且つ／又は低下させる可能性があると考える。生物活性脂質ライブラリの薬理学的スクリーニングによって、潜在的抗ウイルス阻害剤が同定され得る。例えば、ＡＭ５８０（レチノイド誘導体として知られている（図１参照））は、インビトロ及びインビボにおける効力があり且つ広域スペクトルの抗ウイルス活性を提供することが分かった。構造活性分析によって、効力のあるＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製阻害剤として、さらにタミバロテン（図２）（ＡＭ５８０のアナログ）が同定された。そのような化合物は、脂質代謝及び／又は抗ウイルス化合物を調節する他の化合物と共に使用され得る。
【0014】
本発明の主題の各種の目的、特徴、態様及び長所は、以下の好ましい実施形態の詳細な記載からより明らかになるであろう。以下の考察は、本発明の主題の多くの例示的な実施形態を提供するものである。各実施形態が本発明の要素の単一の組み合わせを表すにもかかわらず、本発明の主題は、開示された前記要素の全ての可能な組み合わせを含むと考えられる。したがって、ある実施形態が要素Ａ、Ｂ及びＣを含み、且つ第二の実施形態が要素Ｂ及びＤを含む場合、本発明の主題は、明示的に開示されない場合であっても、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤの他の残りの組み合わせを含むと考えられる。
【0015】
いくつかの実施形態において、本発明のある種の実施形態を記載し、主張するために用いられる成分の量、濃度、反応条件などの特性を表現する数字は、「約」という用語によっていくつかの例において修正されると理解されるものとする。したがって、いくつかの実施形態において、明細書及び添付の請求項に記載される数値的パラメータは、特定の実施形態によって得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態において、前記数値的パラメータは、報告される有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を記載する前記数域及びパラメータが近似値であるにも関わらず、具体例に記載される数値は、実行可能であるのと同程度に正確に報告される。本発明のいくつかの実施形態において示される数値は、それらのそれぞれの試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を含んでもよい。
【0016】
本明細書における記載において、及び以下の請求項にわたって用いられる場合、「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」の意味は、文脈が明確に規定しない限り、複数形の参照を含む。また、本明細書における記載において用いられる場合、「中の（ｉｎ）」の意味は、文脈が明確に規定しない限り、「中の」及び「上の（ｏｎ）」を含む。
【0017】
本明細書における値域の説明は、単に、前記範囲内にある別々の各値を個別に指す短縮された方法の役割を果たすことを意図するものである。本明細書に示されない限り、個別の各値は、あたかも本明細書において個別に列挙されるかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書におけるある種の実施形態に関して提供されるあらゆる例又は例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、単に、本発明をより良好に明らかにすることを意図するものであって、それ以外の場合に請求される本発明の範囲に対する限定をもたらすものではない。本明細書における言葉は、本発明の実施に必須な、請求されない任意の要素を示すものとして解釈されるべきでない。
【0018】
本明細書に開示される本発明の代替的な要素又は実施形態のグループ分けは、限定するものとして解釈されないものとする。各グループのメンバーは、個別に、又は前記グループの他のメンバー若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組み合わせにおいて参照され、請求され得る。グループの一つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由のために、グループの中に包含され得るか、又は、から削除され得る。そのような包含又は削除が生じる場合、本明細書は、しかるに添付の請求項において用いられる全てのマーカッシュグループの明細書を実現して修正されるように本明細書において前記グループを含むとみなされる。
【0019】
いくつかの実施形態において、広域スペクトルの抗ウイルス化合物は、レチノイド又はレチノイド誘導体であることができる。適切なレチノイド誘導体としては、ＡＭ５８０、タミバロテン及び／又はベキサロテンが挙げられる。前記製剤は、経口的、非経口的、注射により、注入により、及び／又は粘膜を通した吸収により投与され得る。前記製剤は、溶液、懸濁液、注射剤、丸剤、錠剤、カプセル剤及び／又は坐剤として提供され得る。いくつかの実施形態において、前記薬物は、医薬的に許容し得る担体及び／又は別の医薬的に活性な化合物を含むこともできる。そのような医薬的に活性な化合物は、リババリンなどの別の抗ウイルス化合物であることができる。他の実施形態において、前記医薬的に活性な化合物は、抗炎症剤、制吐剤、鎮痛剤及び／又は抗生剤など、ウイルス感染の症状又は後遺症に対して活性を有することができる。
【0020】
本発明の概念のレチノイド誘導体を一種以上の追加的な医薬的に活性な化合物と併用して用いる場合、相乗（すなわち、相加効果よりも大きい）効果が観察され得る。例えば、ＭＥＲＳ－ＣｏＶに対して併用する場合におけるＡＭ５８０及びロピナビルの有効なＩＣ５０当量は、相乗効果の存在を示す０．５未満のＦＩＣＩを示す。
【0021】
【表1-1】
【0022】
本発明の概念の別の実施形態は、広域スペクトル（すなわち、複数のウイルス株又はウイルス種）の抗ウイルス活性を示す薬物を製剤化するために、脂質生成を減少させ、且つ／又は脂質代謝に干渉するか、若しくは、それ以外の場合、調節する化合物を投与することによって、且つ／又はそのような化合物を用いることによって、ウイルス感染症を処置する方法である。感受性ウイルスとしては、ＭＥＲＳコロナウイルス（Ｃｏｎａｒｏｖｉｒｕｓ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、ジカウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス（例えばインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ５Ｎ１）及びインフルエンザウイルスＡ（Ｈ７Ｎ９））、ヒトアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス５）及びエンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、前記化合物は、レチノイド又はレチノイド誘導体であることができる。適切なレチノイド誘導体としては、ＡＭ５８０、タミバロテン及び／又はベキサロテンが挙げられる。前記製剤は、経口的、非経口的、注射により、注入により、及び／又は粘膜を通した吸収により投与され得る。前記製剤は、溶液、懸濁液、注射剤、丸剤、錠剤、カプセル剤及び／又は坐剤として提供され得る。いくつかの実施形態において、前記薬物は、医薬的に許容し得る担体及び／又は別の医薬的に活性な化合物を含むこともできる。そのような医薬的に活性な化合物は、リババリンなどの別の抗ウイルス化合物であることができる。他の実施形態において、前記医薬的に活性な化合物は、抗炎症剤、制吐剤、鎮痛剤及び／又は抗生剤など、ウイルス感染の症状又は後遺症に対して活性を有することができる。
【0023】
そのような実施形態において、前記方法は、ウイルス感染を低下させるか又は制御するために有効な用量及び頻度で前記製剤を提供する投与スケジュールを含むことができる。そのような投与スケジュールは、用量当たり１μｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量の、脂質生成を減少させ、且つ／又は脂質代謝に干渉するか、若しくは、それ以外の場合、調節する前記化合物を提供することができる。そのような投与スケジュールは、一定の注入を提供することが可能であるか、又は周期的な投与を提供することが可能である。適切な周期的投与スケジュールは、４時間ごと～１週間以上につき１回の範囲の頻度で前記製剤を提供することが可能である。
【0024】
開示された技術が、特定のウイルス株の同定及び有効な処置の後続の遅滞の必要性を低下させ得る広域スペクトルの抗ウイルス化合物の提供を含む多くの有利な技術的効果を提供することが可能であることを認めるべきである。
【0025】
本発明の概念の一実施形態において、脂質生成を減少させ、且つ／又は脂質代謝に干渉するか、若しくは、それ以外の場合、調節する化合物は、広域スペクトル（すなわち、複数のウイルス株又はウイルス種）の抗ウイルス活性を示す製剤の少なくとも一部を形成する。感受性ウイルスとしては、ＭＥＲＳコロナウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、ジカウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス（例えばインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９、インフルエンザウイルスＡ（Ｈ５Ｎ１）及びインフルエンザウイルスＡ（Ｈ７Ｎ９））、ヒトアデノウイルス（例えば、ヒトアデノウイルス５）及びエンテロウイルス（例えば、ＥＶ７１）を挙げることができる。いくつかの実施形態において、前記化合物は、レチノイド又はレチノイド誘導体であることができる。適切なレチノイド誘導体としては、ＡＭ５８０、タミバロテン及び／又はベキサロテンが挙げられる。
【0026】
抗ウイルス化合物を同定するために、本発明者らは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及び／又はインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス感染の際に細胞変性効果（ＣＰＥ）発生を阻害し得る化合物をスクリーニングするために最適化された細胞生存率を反映する比色アッセイを開発した。薬物処置群と薬物未処置群との間の細胞生存率を最大限に区別するために、感染多重度（ＭＯＩ）及び生存率検査の時点の各種の組み合わせを評価した。ウイルス感染の高ＭＯＩは、抗ウイルス活性を損なう可能性があり、薬物スクリーニングのためのウインドウを短縮する可能性がある。一方で、低ＭＯＩは、ひいては細胞代謝によって薬物分解が生じる可能性がある薬物の有効性を区別するために複数回のウイルス複製が必要になる可能性がある。Ｈｕｈ７細胞及びＭＤＣＫ細胞が、それぞれＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びインフルエンザＡ型ウイルスの複製を強く支持することができるので使用された。ＧＳ５７３４（レムデシビル）及びＴ－７０５（ファビピラビル）が、それぞれコロナウイルス［２０］及びインフルエンザＡ型ウイルス［２１］に対するそれらの著しい抗ウイルス効力のために陽性対照阻害剤として利用された。抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶスクリーニングのために０．１ＭＯＩと感染２４時間後（ｈｐｉ）におけるエンドポイントとの組み合わせが適切であると判断されたが、一方で抗インフルエンザ阻害剤については、０．０１ＭＯＩ及び４８ｈｐｉが適切であると判断された（図３参照）。最適化された条件に基づいて、１８９の生体活性脂質を含むライブラリを一次スクリーニングのために用いた後、候補化合物を検証し、且つ優先順位を付けるために用量依存的分析を行った（図４参照）。
【0027】
とりわけ、化合物ＡＭ５８０は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスの両方による感染に対して細胞を保護した。アリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）作動薬ＦＩＣＺ及びアポトーシス調節性メッセンジャーＣ１６セラミドは、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍウイルス感染に対して特異的にＭＤＣＫ細胞を保護したが、一方で抗炎症効果を有する脂質代謝産物２５－ヒドロキシビタミンＤ３は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染に対してＨｕｈ７細胞を保護した（図５及び図６参照）。ＡＭ５８０は、両ウイルスに対して細胞保護効果を示した化合物として同定され、さらなる特性決定のために選択された。
【0028】
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染をモデルとして用いて、本発明者らは、細胞培養物におけるＡＭ５８０の抗ウイルス活性を特性決定した。ＡＭ５８０による又はよらないウイルス複製動態をプロットするために、マルチサイクルウイルス増殖アッセイを行った。感染の１８時間後、２４時間後、３６時間後、４２時間後及び４８時間後（「ｈｐｉ」）の示された時点において、ＡＭ５８０処置は、前記ＤＭＳＯ陰性対照と比較した場合、３ｌｏｇ以上、前記細胞上清中におけるウイルス力価を低下させた（図７参照）。著しく、前記ＡＭ５８０群における感染についてのプラーク形成単位（ＰＦＵ）は、前記試験の全体時間経過にわたってベースラインレベルに制限されたが、このことは、初期感染サイクルにおけるＡＭ５８０によるＭＥＲＳ－ＣｏＶの高効率的抑制を示している。さらに、ウェスタンブロット法は、特に９ｈｐｉにおいて、ＡＭ５８０の添加の際にＭＥＲＳ－ＣｏＶ核タンパク質（ＮＰ）の発現が著しく減少することを示した（図８参照）。
【0029】
ＡＭ５８０処置後においてＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染した細胞の割合を決定するためにフローサイトメトリーを利用した。Ｈｕｈ７細胞を０．０１ＭＯＩのＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、２０μＭのＡＭ５８０により又はよらず２４時間インキュベートした。図９に示されるように、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ陽性細胞は、６５％（ＤＭＳＯ群）から５．３８％（ＡＭ５８０群）に減少したが、このことは、ＡＭ５８０による子孫ウイルス生成の効率的阻害を示している。前記フローサイトメトリーデータによって裏づけられた場合、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染Ｈｕｈ７細胞におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰについての免疫蛍光染色によって、ＡＭ５８０処置の際におけるウイルス感染のほぼ完全な抑制が示唆された（図１０参照）。
【0030】
また、ＡＭ５８０が、肺（Ａ５４９及びＣａｌｕ－３）、腎臓（Ｖｅｒｏ－Ｅ６）及び免疫細胞［ＴＨＰ－１及びヒト主要単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）］を含む多細胞型のＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を低下させることも分かった（図１１及び図１２参照）。ＡＭ５８０が、Ｈｕｈ７細胞及びＭＤＭにおけるウイルス誘導炎症誘発性サイトカイン活性化を抑制することも分かった（図１３参照）。全体として、ＡＭ５８０は、細胞保護効果及びウイルス複製の阻害を伴う細胞培養における効力のある抗ＭＥＲＳ活性並びに抗炎症応答を示した。
【0031】
増強された生物学的利用能及び抗ウイルス効力を有するＡＭ５８０アナログをスクリーニングするために、ＡＭ５８０との構造的類似性を有する十三の化合物を抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性について試験した。タミバロテン及びベキサロテンは、それぞれ３２０±２６ｎＭ及び８７５±１５ｎＭのＩＣ５０を伴って、ＡＭ５８０と同等の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を有することが分かった（図１４参照）。これらの三つの化合物は、全てが架橋基の一方の側にテトラリン部分を有し、他方の側に安息香酸部分を有する高度な構造的類似性を共有することを理解すべきである（図１５参照）。これらの化合物間の顕著な差異は、テトラリン部分及び安息香酸部分を連結する中心連結架橋基である。具体的には、ＡＭ５８０及びタミバロテンは、アミド結合を利用するが、反対に配向している。ベキサロテンは、この位置にエチレンを有する）。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、これらの分子の前記テトラリン部分及び前記安息香酸部分の両方が抗ウイルス効力にとって重要且つ／又は重大であると考える。
【0032】
三次元培養されたヒトオルガノイドによって、ヒト感染症の試験は実質的に前進した［２２］。本発明者らは、インビボにおける設定の形態学的特性及び機能的特性をシミュレーションするためにヒト腸内のほとんどの型の上皮細胞を有するヒト腸管オルガノイド（インテスチノイド）におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染性及び複製動態を立証し且つ特性決定した［２３］。本発明者らは、このヒト器官様システムにおけるＡＭ５８０の抗ウイルス効力を評価した。０．１ＭＯＩのＭＥＲＳ－ＣｏＶによる接種後、インテスチノイドは、マトリゲル及び上清培地中において感染性ウイルス力価の安定した増加を示し（すなわち、それぞれ２４ｈｐｉ及び４８ｈｐｉにおいて約３ｌｏｇ１０及び４ｌｏｇ１０増加）、前記インテスチノイド内で増殖性ウイルス複製が検出された（図１６及び図１７参照）。ＡＭ５８０処置は、細胞内及び細胞外の両方でＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を有意に（ｐ＜０．０５）低下させることが分かった。４８ｈｐｉにおいて、ＡＭ５８０処置（２０μＭ）インテスチノイド培養物上清ではＰＦＵは検出可能でなかったが、このことは、ＤＭＳＯ処置対照インテスチノイドに対して約６ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬの低下を表す（図１６参照）。その上、前記ＡＭ５８０処置インテスチノイドは、形態学的に無傷のままであり、ＤＭＳＯ処置対照インテスチノイドにおいて観察される通りのＭＥＲＳ－ＣｏＶ誘導ＣＰＥを示さなかった（図１８参照）。インテスチノイドにおけるＡＭ５８０によるＭＥＲＳ－ＣｏＶの阻害は、前記ＤＭＳＯ処置対照インテスチノイドと比較した前記ＡＭ５８０処置インテスチノイドにおけるウイルスＮＰの発現の著しい減少によっても証明された（図１８参照）。追加的には、ｅｘ ｖｉｖｏヒト肺器官培養モデルは、ＡＭ５８０処置が終末細気管支の上皮細胞におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ発現の著しい減少をもたらしたことを示した（図１９参照）。ＡＭ５８０は、ヒト肺組織及びヒト肺外組織におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶのウイルス複製を強く阻害することが明らかである。
【0033】
ＡＭ５８０のインビボ抗ウイルス活性を評価するために、本発明者らは、ヒトＤＰＰ４（ｈＤＰＰ４）－トランスジェニックマウスを用いた確立されたマウスモデルにおいて、前記薬物化合物がＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びインフルエンザＡ型ウイルスの致死的攻撃に対する保護を付与したかどうかについて検討した［２３］。図２０に示されるように、５０ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶによって攻撃されたｈＤＰＰ４－トランスジェニック（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｅ）マウスの中で、十匹／十匹のマウス（１００％）がＡＭ５８０の腹腔内注射を三日間受けた後で生存したが、ＰＢＳ処置マウスは、三匹／十匹（３０％）だけが生存した（ｐ＜０．０１）。前記ＡＭ５８０処置マウスの平均体重も、前記ＤＭＳＯ処置対照マウスより概して高かった（図２１参照）。
【0034】
各群において四匹のマウスを、ウイルス学的分析及び組織学的分析のために攻撃後の２日及び４日に安楽死させた。ＡＭ５８０処置マウスは、両時点において、前記ＤＭＳＯ処置対照マウスと比較して、それらの肺組織内のウイルスＲＮＡ含有率が有意に（ｐ＜０．０１）低かった。同様に、攻撃後の４日において、前記ＡＭ５８０処置マウスの脳組織のウイルスＲＮＡ含有率は、ほとんど検出不可能であり、前記ＤＭＳＯ処置対照マウスよりも４－ｌｏｇ１０低かった（図２２参照）。組織病理学的検査は、前記ＡＭ５８０処置マウスの肺組織における肺胞損傷及び間質性炎症性浸潤が前記ＤＭＳＯ処置対照マウスと比較して有意に向上したことを示した（図２３参照）。まとめると、これらの結果は、ＡＭ５８０が、インビボにおいてＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製及びウイルス関連病状を阻害することによって致死的ＭＥＲＳ－ＣｏＶ攻撃からｈＤＰＰ４トランスジェニックマウスを効果的に保護したことを示した。
【0035】
本発明者らは、ＲＮＡ［例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ジカウイルス（ＺＩＫＶ）、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ００９ウイルス）及びエンテロウイルス（例えば、エンテロウイルス－Ａ７１（ＥＶ－Ａ７１）］ウイルス及びＤＮＡ［例えば、ヒトアデノウイルス５型（ＡｄＶ５）］ウイルスの両方を含む他のウイルス病原体に対するＡＭ５８０の抗ウイルス効果も特性決定した。驚くべきことに、ＡＭ５８０は、ナノモル濃度から低マイクロモル濃度の範囲内で、用量依存的様式において、全てのこれらの様々なウイルス種の複製を阻害した（図２４及び図２５参照）。メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）アッセイ及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイの両方を用いて、ヒト由来及び非ヒト由来の両方から誘導されたものを含む異なる細胞系にわたって、ＡＭ５８０の細胞毒性は同様であった（約１００～２００μＭ）（図２６参照）。重要なことに、ＡＭ５８０の選択指数は、試験された前記ウイルスのほとんど、とりわけＭＥＲＳ－ＣｏＶ（５０７）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ（１１４）及びインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス（１５９）について適切に充分に高かったが、臨床用の望ましい安全領域を提供することが可能である（図２７参照）。全体的に、ＡＭ５８０は、適切な医薬的特性を伴う、ＲＮＡウイルス及びＤＮＡウイルスに対する広域スペクトルの抗ウイルス活性を有することが分かった。
【0036】
野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルを用いて、高い病原性のインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルス（Ａ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９よりも毒性が強いサブタイプ）に対するＡＭ５８０の抗ウイルス活性も評価した。１００ＰＦＵのＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによって攻撃した前記マウスにおいて、前記ＡＭ５８０処置マウスは、前記ＤＭＳＯ処置対照マウス（０／１０、０％）よりも有意に（ｐ＜０．０１）高い生存率（６／１０、６０％）を有した（図２８参照）。前記ＡＭ５８０処置マウスの平均体重は、攻撃後の８日において徐々に回復しはじめた（図２９参照）。前記ＡＭ５８０処置マウスの肺組織における平均ウイルスＲＮＡ負荷は、前記ＤＭＳＯ処置対照マウスよりも有意に（ｐ＜０．０１）低かった（図３０参照）。組織病理学的検査によって、ＡＭ５８０処置がウイルス関連肺炎症性浸潤及び気管支肺炎を寛解させたことが示された（図３１参照）。ＡＭ５８０は、高毒性／致死的インフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルス攻撃に対して有意なインビボ保護効果を提供することが明らかである。
【0037】
ＡＭ５８０は、既知の選択的レチノイン酸受容体－α（ＲＡＲ－α）作動薬である。本発明者らは、驚くべきことに、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性が、ＲＡＲ－αシグナル伝達の活性化や宿主の先天性抗ウイルス応答の活性化に依存しないことを見出した。ＡＭ５８０の抗ウイルス活性がＲＡＲ－αシグナル伝達経路の活性化に依存する程度を決定するために、機能喪失型アッセイ及び機能獲得型アッセイを行った。ＲＡＲ－α遺伝子サイレンシングによる前記経路のダウンレギュレーション（図３２参照）や、前記ＲＡＲ－α受容体の過剰発現（図３３参照）は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製に有意な影響を及ぼさなかった。下流ＲＡＲ－α拮抗剤ＥＲ５０８９１及びＡＭ５８０の併用は、ＡＭ５８０の抗ウイルス効力を減少させなかった（図３４参照（ｓｅ））。これらの結果は、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性が前記ＲＡＲ－αシグナル伝達経路から独立していることを示唆する。ＲＡＲ－αは核内受容体であるが、汎転写性阻害剤（ｐａｎ－ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）として作用するＡＭ５８０の可能性は、ＣＭＶプロモータ、ＴＫプロモータ及びＳＶ４０プロモータを含んだレポータ遺伝子ルシフェラーゼアッセイによって除外された（図３５参照）。
【0038】
ＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性を説明し、宿主自然免疫応答が前記薬物によって修飾された程度を決定するために、本発明者らは、ＩＦＮ－βプロモータ（ＩＦＮβ－Ｌｕｃ）又はＩＦＮ刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ－Ｌｕｃ）によって駆動されるレポータ構築体を開発した（図３６参照）。これらの結果は、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性が宿主の自然免疫応答の活性化と関連がある可能性がなく、シグナル伝達増幅因子として機能しなかったことを示す。このことは、ＡＭ５８０がＲＩＧ－Ｉノックアウト及び野生型Ａ５４９細胞において同様の抗ウイルス活性を示したという観察によって支持される（図３７参照）。まとめると、これらのデータは、ＡＭ５８０の広域スペクトルの抗ウイルス活性がＲＡＲ－α－シグナル伝達経路の活性化又は宿主の自然免疫応答によって発揮されないことを示唆した。
【0039】
ＡＭ５８０の抗ウイルス機序を決定するために、本発明者らは、薬物化合物がＭＥＲＳ－ＣｏＶ吸着又は内部移行に干渉しなかったことを示すために時間依存性薬物添加アッセイ（ｔｉｍｅ－ｏｆ－ｄｒｕｇ－ａｄｄｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を利用した（図３８参照）。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、薬物化合物がＭＥＲＳ－ＣｏＶライフサイクルの侵入後ステップを妨害する可能性があると考える。どのようにしてＡＭ５８０が細胞内ウイルス－宿主相互作用に影響を及ぼすのかについて特性決定するために、本発明者らは、前記化合物が存在する場合又は存在しない場合におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ－感染細胞のグローバルな遺伝子発現試験を行った。多くの遺伝子は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染Ｃａｌｕ－３細胞においてアップレギュレーション（ｎ＝２０６１）又はダウンレギュレーション（ｎ＝１６２６）された。とりわけ、ＡＭ５８０処置群及び擬感染群における遺伝子発現プロファイルは同様であった。
【0040】
本発明者らは、ＡＭ５８０処置細胞及びＤＭＳＯ処置細胞の中で有意に差次的に発現した遺伝子の経路強化分析も行った。強化スコアが２．０超であることによって証明される通りの変化が最大の二つの遺伝子クラスタを示す（表１参照）。
【0041】
【表1-2】
【0042】
各遺伝子クラスタにおいて最も高いスコアリング経路は、それぞれアルツハイマー病及びリジン分解に関連した。この後にランク付けた場合、ＡＭ５８０で処置されたＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞は、脂肪酸代謝、脂肪酸分解及び非アルコール性脂肪肝（ＮＡＦＬＤ）に機能的に関連した遺伝子の発現を有意に減少させた。全体的に、理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＡＭ５８０が、ウイルス複製によって誘発された前記脂質代謝プロファイルを再プログラムする可能性があると考える。とりわけ、コレステロール経路及びホスホイノシチド経路の調節不全はアルツハイマー病のアミロイド形成において高く関連付けられたが［２４］、一方でリジンなどのケトン生成必須アミノ酸は脂質合成経路を調節する［２５］。
【0043】
脂質ホメオスタシスのＭＥＲＳ－ＣｏＶ誘導撹乱におけるＡＭ５８０の役割をさらに探索するために、本発明者らは、ＡＭ５８０が存在する又は存在しない場合におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染Ｃａｌｕ－３細胞の無標識リピドミック分析を行った（図３９参照）。２４ｈｐｉにおいて脂質を単離した。陽性様式における３０８の脂質特徴と１１の脂質クラスの陰性様式における１９９の脂質特徴との存在率を特性決定した。重複した脂質特徴を除去した後、データ処理及び統計分析を行った。擬感染及びＤＭＳＯ処置ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染対照細胞と比較した場合、ＡＭ５８０処置ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞において、前記細胞リピドームの多くの変化が認められた。１２の内在性脂質は、有意な（ｐ＜０．０５）変化を示した（図４０～図５０参照）。同定された前記脂質の全ては、グリセロリン脂質クラスに属していた。グリセロリン脂質（ＧＰ）は、哺乳類細胞膜の主要な脂質カテゴリを構成する。構造的に、ＧＰは、さらに、二つのリゾリン脂質（ＬｙｓｏＰＬ）［リゾホスファチジルコリン（ＬｙｓｏＰＣ）及びリゾホスファチジルエタノールアミン（ＬｙｓｏＰＥ）］並びに二つのリン脂質（ＰＬ）［ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）］を含む四つのサブグループに分類される。バリエーションの傾向を特性決定するために、本発明者らは、異なる脂質の存在量の程度に基づいて階層的クラスタ分析を行った。２４ｈｐｉにおいて、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染は、擬感染対照と比較した場合、ＬｙｓｏＰＬ（ＬｙｓｏＰＣ及びＬｙｓｏＰＥ）をダウンレギュレーションし、ＰＬ（ＰＣ及びＰＥ）をアップレギュレーションした（図３９参照）。ＡＭ５８０は、脂質ホメオスタシスのこのウイルス誘導撹乱に拮抗し、前記擬感染対照として同様のリピドームを示した（図４０～図５０参照）。
【0044】
二つの協調酵素、すなわち、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）及びリゾホスホリピドアシルトランスフェラーゼ（ＬＰＣＡＴ）は、ランズサイクル（Ｌａｎｄｓ’ｃｙｃｌｅ）サイクルにおけるＬｙｓｏＰＬ及びＰＬの代謝回転のバランスをとる［２６］。ＰＬＡ２は、ＰＬのｓｎ－２位置エステル結合を特異的に加水分解してＬｙｓｏＰＬを形成する。続いて、前記脂質再生酵素ＬＰＣＡＴは、アシルＣｏＡからＬｙｓｏＰＬにアシル基をトランスファーしてリン脂質を再生し、しかるに脱アシル化／再アシル化サイクルを完了する。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製は、ＬｙｓｏＰＬ形成よりもむしろＰＬに好都合だった（図４０～図５０参照）。リピドミックデータに即して、ＰＬＡ２Ｇ４Ａ、ＰＬＡ２Ｇ１０、ＰＬＡ２Ｇ１２Ａ、ＰＬＡ２Ｇ１６及びＰＬＡ２Ｒ１を含むＰＬＡ２のパネルの遺伝子発現は、ＡＭ５８０処置群又は擬感染対照群と比較した場合、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染によって有意に抑制された（ｐ＜０．０５）。まとめると、これらの結果は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染が、前記細胞ホスホリパーゼが調節的役割を果たした前記ランズサイクルの脱アシル化及び再アシル化による脂質ホメオスタシスを撹乱させることを示す。本発明者らは、これらが、ウイルスの複製及び生存に有利になるようなウイルス誘導変化であると考える。
【0045】
脂質代謝変化を特性決定するために、本発明者らは、ＡＭ５８０が存在する又は存在しない場合におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染Ｈｕｈ７細胞内の細胞の脂質滴（ＬＤ）及びコレステロールの分布パターンを視覚化するために免疫蛍光を使用し、ｍＲＮＡ発現の変化を測定するためにＲＴ－ｑＰＣＲアッセイを使用した。図５１及び図５２に示されるように、ＭＥＲＳ－ＣｏＶによる感染は、ＬＤ及びコレステロールの蓄積を著しく増強したが、ＡＭ５８０の添加は、それらの生成を有意に低下させた。また、ｄｅ ｎｏｖｏの脂肪酸合成及び取り込み経路（ＡＣＣ、ＦＡＳ、ＡＤＲＰ）、脂肪酸酸化経路（ＣＰＴ１ａ、ＨＡＤＨα、ＵＣＰ２、ＡＣＯＸ、ＢＯＸ、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ４Ａ１１、ＰＰＡＲα）、抗酸化経路（ＳＯＤ、カタラーゼ、ＧＳＳ）並びにトリグリセリド合成及び触媒経路（ＤＧＡＴ１、ＰＰＡＲγ、ＨＳＬ）を含む脂肪酸代謝に関与する１８の主要な触媒遺伝子の発現を特性決定した。ＤＭＳＯ処置感染対照と比較した場合、ＡＭ５８０処置感染細胞内の１３／１７（７６．５％）の遺伝子においてｍＲＮＡ発現の有意な低下が検出された（図５３参照）。
【0046】
同様に、ＨＭＧＣＲ、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧＣＳ）及びＳＣＤなどの前記コレステロール合成経路における１０／１２（８３．３％）の測定された遺伝子におけるｍＲＮＡ発現は、ＡＭ５８０処置によって低下した（図５４参照）。これらの知見は、脂肪酸及びコレステロール合成が（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染の間の前記主要生合成酵素、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）及びＨＭＧＣＳの大幅な増加によって証明されるように）ＭＥＲＳ－ＣｏＶライフサイクルの必須成分であることを示唆しただけでなく、ＡＭ５８０及びそのアナログが、ウイルス複製の一つ以上のステップに影響を及ぼす様式で脂質合成を阻害する可能性があることを示唆した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染によって誘発された、高められた代謝要求が、脂質生合成経路を急速にアップレギュレーションするが、ＡＭ５８０は、そのような再プログラムに拮抗し、ウイルス複製を減少させる可能性があると考える。
【0047】
ＳＲＥＢＰ－１及びＳＲＥＢＰ－２は、コレステロール、脂肪酸及びトリグリセリドの生合成を制御する一次転写因子である［２７］。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製の間におけるＳＲＥＢＰの役割を特性決定するために、本発明者らは、野生型（擬処置）細胞と前処置（ＳＲＥＢＰのノックダウン又は過剰発現）細胞との間におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶの増殖を比較する。とりわけ、ＳＲＥＢＰ－１又はＳＲＥＢＰ－２標的化ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションは前駆体ＳＲＥＢＰ（ｐｒｅ－ＳＲＥＢＰ）産生を減少させ、それによってＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製が有意に（ｐ＜０．０５）減少した（図５６参照）。このことは、ＳＲＥＢＰがＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製に必須であるということを示す。
【0048】
脂質生合成遺伝子のトランス活性化は、前記核形態（ｎ－ＳＲＥＢＰ）を解除するためにｐｒｅ－ＳＲＥＢＰの切断を必要とし、このプロセスは、ステロールによって調節される［２８］。ウイルス感染の間における脂質生合成の過剰活性化を模倣するためにＳＲＥＢＰのこの成熟形態を誘導するために、５％リポ蛋白欠乏血清（ＬＰＤＳ）及び１０μＭメバスタチンによる一晩のインキュベーションによってＨｕｈ７細胞からステロールを欠乏させた。前記細胞の飢餓は、内在性ｎ－ＳＲＥＢＰ１及びｎ－ＳＲＥＢＰ２を強化した（図５６参照）。しかし、増加したｎ－ＳＲＥＢＰは、０．１ＭＯＩ又は１ＭＯＩのＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染の際に１０μＭのＡＭ５８０の抗ウイルス効力を約１ｌｏｇ１０単位減少させた。このことは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製におけるＳＲＥＢＰについての促進的役割と、関与するｎ－ＳＲＥＢＰにおけるＡＭ５８０及び関連化合物についての阻害的役割とを示唆する。
【0049】
ＳＲＥＢＰの成熟は、ＳＲＥＢＰ切断活性化タンパク質（ＳＣＡＰ）との会合並びにサイト－１プロテアーゼ（Ｓ１Ｐ）及びサイト－２プロテアーゼ（Ｓ２Ｐ）の連続的切断によって誘導される。本発明者らは、ＳＲＥＢＰ成熟の阻害が抗ウイルス治療のために有効である可能性があると考える。このために、本発明者らは、ベツリン（ＳＣＡＰ阻害剤）及びＰＦ４２９２４２（Ｓ１Ｐ阻害剤）の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を特性決定した。両化合物は、用量依存的様式でＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を低下させたが、このことによって、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染Ｈｕｈ７細胞の処置のために５０μＭを用いる場合にウイルス力価の約１ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍＬの低減が達成された（図５７参照）。本発明者らは、これらの結果がＭＥＲＳ－ＣｏＶ誘導代謝再プログラムにおいてＳＲＥＢＰの重要で且つ／又は不可欠な役割を示すと考える。追加的に、ｎ－ＳＲＥＢＰの処理ステップは、ウイルス複製を抑制するための薬物修飾可能な分子標的を提供することができる。
【0050】
ｎ－ＳＲＥＢＰの増加がＡＭ５８０の抗ウイルス効力を減少させたという観察によって、本発明者らは、ＡＭ５８０及び関連化合物がｎ－ＳＲＥＢＰへの結合によって機能する可能性があると推測した（図５６参照）。核ＳＲＥＢＰは、ＨＭＧＣＳ、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素、ＦＡＳ、ＡＣＣ及びスクアレンシンターゼなど、遺伝子に対するプロモータ内に存在するＳＲＥへの結合によって一群のリポゲネシス酵素の遺伝子発現をアップレギュレーションする［２９］。ＡＭ５８０及び関連化合物がそのような相互作用を妨害し得るのかどうかを決定するために、ｎ－ＳＲＥＢＰのＤＮＡ結合活性を特性決定した。ＳＲＥＢＰ１結合エレメント又はＳＲＥＢＰ２結合エレメントを含む特異的二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）配列を試験ウェル上に固定し、次いで候補阻害剤が存在する又は存在しない場合において核抽出ＳＲＥＢＰ１又は核抽出ＳＲＥＢＰ２の結合の程度を特性決定した。驚くべきことに、ＡＭ５８０は、ｎ－ＳＲＥＢＰ１及びｎ－ＳＲＥＢＰ２の両方のそれらの対応するＳＲＥへの結合を阻害した（図５８及び図５９参照）。
【0051】
本発明者らは、ｎ－ＳＲＥＢＰ結合のＡＭ５８０阻害のための機序も検討した。ＡＭ５８０がｎ－ＳＲＥＢＰ又はＳＲＥを標的としたかどうかを決定するため、本発明者らは、（１）ｎ－ＳＲＥＢＰを加える前の固定化された前記ｄｓＤＮＡを有するか、又は（２）前記ｄｓＤＮＡとの結合前のｎ－ＳＲＥＢＰを有する前記薬物化合物をプレインキュベートした。ｎ－ＳＲＥＢＰ１を一例として用いて、ＡＭ５８０は、ＳＲＥではなくｎ－ＳＲＥＢＰ１に結合することが見出され、用量依存的様式でｎ－ＳＲＥＢＰ１のＤＮＡ結合活性を阻害することが見出された（図６０参照）。
【0052】
ＡＭ５８０が相互作用する可能性がある（一つ又は複数の）潜在的アミノ酸残基を予測するために、本発明者らは、ＳＲＥＢＰ１及びＳＲＥＢＰ２の公開された結晶構造を用いて分子ドッキング分析を行った［３０、３１］。ＡＭ５８０は、前記ＤＮＡ結合ドメイン内に位置し、ＳＲＥ認識を決定する残基Ｔｙｒ３３５と相互作用すると予測された（図６１及び図６２参照）［３０］。ＳＲＥＢＰ１及びＳＲＥＢＰ２の両方のＳＲＥ認識部位はヒトとマウスとの間で高度に保存されることが理解されるべきであり（図６１参照）、そのことは、本発明者らが各種の細胞系、ヒトオルガノイド、エクスビボ組織及びマウスモデルにわたって観察した安定した抗ウイルス活性を説明することができる。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＡＭ５８０が、ＳＲＥ認識部位を阻害することによってＳＲＥＢＰのＤＮＡ結合活性を阻害すると考える。
【0053】
Ｔｙｒ３３５がＡＭ５８０－ＳＲＥＢＰ相互作用部位（又は少なくとも前記相互作用部位の一部）であったかどうかを決定するために、本発明者らは、部位特異的突然変異を行ってＹ３３５Ｒ突然変異体ｎ－ＳＲＥＢＰ１を構築し、ＡＭ５８０又はＳＲＥの何れかに対してＷＴ及びＹ３３５Ｒ ｎ－ＳＲＥＢＰ１の結合親和性を評価した。ｎ－ＳＲＥＢＰｌのＤＮＡ結合活性は、Ｔｙｒ３３５がアルギニンで置換された場合に有意に（ｐ＜０．０１）減少した（図６３参照）。このことは、ｎ－ＳＲＥＢＰ１における前記Ｔｙｒ３３５がＡＭ５８０への結合にとって重要である可能性があることを示す。ＷＴ及びＹ３３５Ｒ ｎ－ＳＲＥＢＰ１に対するＡＭ５８０の結合親和性を比較するために、ＡＭ５８０由来プローブ（ＡＭ５８０ｄｐ）を合成した。ＡＭ５８０ｄｐの合成前に、本発明者らは、アジド部分を含むリンカーアームをＡＭ５８０のカルボン酸基に導入して、特異的且つ／又は追加的なプロービング機能を有する化学基の将来の付加のために設計されたアジド－ＡＭ５８０を生成した。ＡＭ５８０と同様に、アジド－ＡＭ５８０は、Ｈｕｈ７細胞及びＶｅｒｏ細胞におけるＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を阻害することが分かった（図６４参照）。アジド反応性緑色蛍光染料を用いて、アジド－ＡＭ５８０が宿主細胞の核内に大部分が局在化したことが視覚化されたが、そのことは、ＡＭ５８０が脂質生成トランス活性化事象を標的とするという前の結論に一致する（図６５参照）。ＡＭ５８０ｄｐは、光親和性基及びビオチンタグの両方を含む（図６６参照）。
【0054】
結合標的を取り込むために、ＡＭ５８０ｄｐを、そのビオチン基によってストレプトアビジン共役アガロース上に固定し、外因的に発現した前記ＷＴ及びＹ３３５Ｒ ｎ－ＳＲＥＢＰ１によってそれぞれインキュベートした。クリックケミストリーに基づいてＡＭ５８０ｄｐにおいて非特異的架橋基を活性化するための紫外線（ＵＶ）照射の後、タンパク質－ＡＭ５８０ｄｐ複合体を固定し、ビオチンタグ精製によって共にプルダウンした。ウェスタンブロット法による特性決定において、ＷＴ及び突然変異体Ｙ３３５Ｒ ｎ－ＳＲＥＢＰ１によって等量のＲＡＲ－αを沈殿させたが、このことは、ＡＭ５８０ｄｐが生物学的に機能的だったことを示した（図６７参照）。Ｙ３３５Ｒ ｎ－ＳＲＥＢＰ１よりも有意に多くのＷＴ ｎ－ＳＲＥＢＰ１をプルダウンしたが、このことは、Ａｍ５８０とＹ３３Ｒ ｎ－ＳＲＥＢＰ１との間よりもＡＭ５８０とＷＴ ｎ－ＳＲＥＢＰ１との間における非常に高い結合親和性を示唆した（図６７参照）。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＡＭ５８０が、少なくとも部分的に残基Ｔｙｒ３３５との相互作用のためにｎ－ＳＲＥＢＰ１を標的とすると考える。
【0055】
ＳＲＥＢＰは、ＨＭＧＣＳ及びＦＡＳなど、脂質生成経路における酵素の発現を制御することによって脂質ホメオスタシスを調節する。ＡＭ５８０がＳＲＥＢＰ依存性転写活性化を阻害し得るのかどうかを決定するために、二つのレポータ構築体、すなわちＨＭＧＣＳ－プロモータ－Ｌｕｃ及びＦＡＳ－プロモータ－Ｌｕｃを調製した。前者はハムスターＨＭＧＣＳプロモータ配列（－３２４／－２２５）を含み［３２］、一方で後者はＦＡＳ－プロモータを含む［３３］。ＡＭ５８０は前記レポータ遺伝子活性の濃度依存的阻害を示したが、このことは、ＨＭＧＣＳ及びＦＡＳなどのリポゲネシス酵素が転写レベルで阻害されたことを示した（図６８参照）。ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性と脂質生合成の低下との間の相関関係を確認するために、本発明者らは、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性を逆転させる前記ｄｅ ｎｏｖｏ脂肪酸生合成経路の最終生成物、すなわちパルミチン酸ナトリウムの能力を特性決定した（図６９参照）。これらの試験において、既知のＦＡＳ阻害剤（Ｃ７５）を陽性対照として用いた。とりわけ、Ｃ７５及びＡＭ５８０は、抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を示した（図７０）。パルミチン酸ナトリウムの添加は、ＤＭＳＯで処置されたＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞におけるウイルス収率に影響を及ぼさなかったが、ＡＭ５８０又はＣ７５で処置されたＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞におけるウイルス収率を増加させた（ｐ＜０．０５）（図７０参照）。このことは、ＡＭ５８０が、少なくとも部分的に脂肪酸合成を次第に弱くすることによってＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製を阻害することを示唆する。
【0056】
本発明者らは、脂肪酸合成が、ＡＭ５８０によって阻害される可能性があった他のウイルスの複製に極めて関与したかどうかも探索した。このために、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス（マイナス鎖ＲＮＡウイルス）、ＥＶ－Ａ７１（非エンベロープＲＮＡウイルス）及びＡｄＶ５（ＤＮＡウイルス）を用いた複製レスキューアッセイを行った（図７１～図７３）。レスキューの有意な（ｐ＜０．０５）程度は、１００μＭパルミチン酸ナトリウムの添加において、これらのウイルスについて達成された。それらの中で、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスは、脂肪酸合成に対する最も高い依存性を示した（ｐ＜０．０１）。全体的に、これらのデータは、ＡＭ５８０及びそのアナログの広域スペクトルの抗ウイルス活性が、前記脂質代謝フラックスを再プログラムする能力に少なくとも部分的に関連することを示す。
【0057】
プラス鎖ＲＮＡウイルスは、細胞内膜上でそれらのゲノムを複製することが知られている。ＭＥＲＳ－ＣｏＶの場合、二層膜小胞（ＤＭＶ）及び他の複製オルガネラ（ＲＯ）は、ウイルス複製／転写複合体（ＲＴＣ）のための定着足場を提供する。これらのウイルス誘導小胞がＡＭ５８０及び同様の化合物による脂肪酸合成の阻害における特異的標的の役割を果たす可能性があるのかどうかを決定するために、本発明者らは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ誘導ＤＭＶを代表的試験モデルとして用いた。核周囲ＤＭＶクラスタは、電子顕微観察によって、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染細胞において容易に検出可能だった（左パネル、図７４）。それに対して、ＤＭＶは、ＡＭ５８０による処置後に認められなかった（右パネル、図７４）。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＡＭ５８０及び関連化合物が、少なくとも部分的にＤＭＶの形成を妨げることによってウイルス複製を阻害する可能性があると考える。
【0058】
マイナス鎖ウイルス（インフルエンザＡ型ウイルスなど）は、細胞内膜から独立したゲノム複製及びゲノム転写の異なる機序を利用する。パルミチン酸は、パルミトイル化を含むいくつかの生物学的機能を有する。パルミトイル化は、タンパク質機能及びタンパク質局在化を調節する脂肪酸の翻訳後吸着である［３４］。インフルエンザＡ型ウイルスにおいて、最良の特性決定されたウイルスパルミトイル化されたタンパク質は、表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）である［３５］。脂肪酸合成の阻害がインフルエンザＨＡパルミトイル化を妨げ、その結果、前記ウイルスライフサイクルの翻訳後ステップを抑制するのかどうかを決定するために、ＡＭ５８０による処置を行う又は行わない場合におけるパルミトイル化レベルを特性決定した。ＡＭ５８０、ビヒクル／対照（ＤＭＳＯ）、又はパルミトイルアシルトランスフェラーゼパルミチン酸を阻害することによってパルミトイル化を特異的に弱める陽性対照阻害剤２－ＢＰと共に、ＨＡ過剰発現Ａ５４９細胞を培養した［３６］。樹脂アシスト取り込みによってＳ－パルミトイル化ＨＡタンパク質を精製した。総ＨＡタンパク質の量の有意な差は、異なる前記投与群の中で検出されなかったが、このことは、２－ＢＰ及びＡＭ５８０がタンパク質合成に影響を及ぼさなかったことを示唆した（図７５参照）。
【0059】
２－ＢＰ及びＡＭ５８０の添加によってパルミトイル化ＨＡのレベルの減少が認められたが、このことはウイルスタンパク質パルミトイル化の減少を示した。ウイルス侵入後の２－ＢＰの添加は、ＤＭＳＯ処置対照と比較した場合、上清中におけるインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス力価の１ｌｏｇ１０／ｍＬの低下を示した（図７６参照）。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＡＭ５８０が、ＳＲＥＢＰ依存性経路を阻害して、ウイルスパルミトイル化を弱め、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルス複製を減少させると考える。驚くべきことに、２－ＢＰは、用量依存的様式でＭＥＲＳ－ＣｏＶ複製も阻害したが（図７６参照）、このことは、ウイルスパルミトイル化が別の重要な広域スペクトルの抗ウイルス標的である可能性があったことを示した。
【0060】
ウイルスは、それらの複製のためのエネルギー及び構成要素を提供するために、それらの細胞宿主の代謝ネットワークに依存する。インビトロ及びインビボにおけるＳＲＥＢＰ関連経路の阻害によるＡＭ５８０及び関連化合物の著しい抗ウイルス性の有効性は、宿主脂質代謝の再プログラムがウイルスライフサイクルの複数の態様において重要であることを示し、且つ、重要なことに、これらのステップが影響を受けやすく、且つ抗ウイルス介入のための医薬的に対処可能な分子標的を表すことを示す。本発明者らは、ＳＲＥＢＰが、結果的にＤＭＶ生合成に影響を及ぼし（図７４参照）且つ翻訳後タンパク質パルミトイル化に影響を及ぼす（図７５参照）ウイルス誘導脂質過剰誘導の調整に必須である（図５５参照）ことを見出した。ウイルス感染のシナリオにおいて、ＡＭ５８０は、コレステロール及び脂肪酸の生合成における遺伝子をダウンレギュレーションし、細胞脂質の含有率を減少させてウイルス複製を制限する（図５２及び図５３参照）。ＳＲＥＢＰのタンパク分解処理の前に、ｐｒｅ－ＳＲＥＢＰは、最初にＥＲ膜貫通タンパク質として合成される［１９］。ステロールが低い場合、ＳＣＡＰは、ｎ－ＳＲＥＢＰを核に放出し、移送して、遺伝子発現をトランス活性化するように、ＳＲＥＢＰを、ＥＲから、ＳＲＥＢＰがプロテアーゼＳ１Ｐ及びＳ２Ｐによって順次切断されるゴルジ体までエスコートする。しかし、細胞ステロールレベルが高い場合、コレステロール又はオキシステロールは、ＳＣＡＰとインスリン誘導遺伝子１タンパク質（ＩＮＳＩＧ１）との間の会合を刺激し、それによってＳＣＡＰ－ＳＲＥＢＰ複合体のＥＲ保持を引き起こし、それによってｎ－ＳＲＥＢＰを減少させ、脂質代謝に関与する遺伝子の発現を低下させる。本発明者らは、ＡＭ５８０が、ｎ－ＳＲＥＢＰとＳＲＥとの間の結合の阻害によって複数のリポゲネシス酵素を転写的に阻害することを示した（図５９及び図６１参照）。より早期の事象を標的として、Ｔａｎｇらは、ＳＲＥＢＰのＥＲ保持を促進することによってＳＲＥＢＰを阻害するベツリンを同定した［２８］。実際、ベツリン及びＳ１Ｐ活性の阻害剤は、ウイルス複製の阻害を示した（図５７参照）。全体的に、本発明者らは、広域スペクトルの抗ウイルス剤のための可能な標的として、ＳＲＥＢＰのタンパク分解処理を同定した。
【0061】
ＳＲＥＢＰによって調節される場合、細胞脂質代謝に関与するリポゲネシス酵素は宿主－ウイルス相互作用において重要な役割を果たすことが示唆されているが［３７］、このことは、本発明者らの知見に一致する。Ｃ７５によるＦＡＳの薬理学的阻害によって、フラビウイルス［３８］及びワクシニアウイルス［３９］の複製が弱まった。陽性対照としてＣ７５を用いて、本発明者らは、分岐ウイルス、エンベロープ（ＭＥＲＳ、インフルエンザ）及び非エンベロープ（ＥＶ－Ａ７１）、ＲＮＡ又はＤＮＡ（ＡｄＶ５）ウイルス、のＡＭ５８０阻害を外因的パルミチン酸によって部分的に促進することが可能であったことを示した（図７１～図７４参照）。そのような試験の結果は、最適な且つ／又は最大のウイルス複製のための脂質生合成（特に新規脂肪酸合成）の緊要性を示す。このことは、異なる細胞系、マウスモデル、ヒトオルガノイド及びエクスビボモデルにわたるＡＭ５８０の観察された広域スペクトルの抗ウイルス効力も説明する（図７～図１２、図１５～図２２、図２４及び図２７～図３１）。本発明者らは、ＡＭ５８０による転写性不活性化の後、ＦＡＳ以外のリポゲネシス酵素のサイレンシングは、弱められたウイルス複製に寄与する可能性もあると考える（図６９参照）。上記で示されるように、パルミトイル化阻害剤（２－ＢＰ）は、インフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス及びＭＥＲＳ－ＣｏＶに対する抗ウイルス活性を示したが、このことは、ウイルスタンパク質パルミトイル化が広域スペクトルの抗ウイルス剤のための別の医薬的に対処可能な宿主分子標的であることを示唆した（図４４参照）。ラフト標的化シグナルとして機能する場合、パルミトイル化は、ウイルス構築及びウイルス出芽において必須な一般的で且つ保存された生物学的プロセスである。ヒト病原体について報告された顕著な例としては、インフルエンザＡ型ウイルスのＨＡ、インフルエンザＢ型ウイルスのＮＢ、麻疹ウイルスの融合（Ｆ）タンパク質、フィロウイルス及びレトロウイルス（ＨＩＶを含む）の糖タンパク質などの表面糖タンパク質が挙げられる［３４］。タンパク質パルミトイル化は、細胞タンパク質の機能も調節する。したがって、抗ウイルス治療としてのパルミトイル化阻害剤の開発の前に副作用に対する予期された有効性を検討することが重要である。ＤＨＨＣタンパク質ファミリーの発見は、この方法に沿った解明を助ける［４０］。ＤＨＨＣタンパク質は、異なる基質特異性を有するパルミトイル化を触媒するが、このことは、これらのタンパク質が、それらの阻害によってウイルス複製の抑制が生じたので有望な薬物標的である可能性があったことを示唆しており、一方で細胞タンパク質のアシル化は損なわれることはない［４１］。
【0062】
驚くべきことに、ＡＭ５８０の抗ウイルス活性は、ＲＡＲ－α経路に依存しない（図３２～図３４参照）。ＡＭ５８０の構造活性分析は、アジド－ＡＭ５８０及びＡＭ５８０ｄｐの適切な修飾をガイドしたが、それは、その細胞分布の視覚化（図６５参照）とＡＭ５８０の直接結合標的としてのＳＲＥＢＰのプルダウン（図６８参照）とを可能にした。ＳＲＥＢＰ１又はＳＲＥＢＰ２のノックダウンは、ＡＭ５８０と同様のレベルの抗ウイルス効力を示さなかったが（図５５参照）、それは、ＳＲＥＢＰ１及びＳＲＥＢＰ２は、一方のタンパク質が弱められた場合に互いを補償する可能性のためかもしれなかった［４２］。マウスモデルにおけるＡＭ５８０の催奇形作用が報告されているが［４３］、特に動物実験におけるＡＭ５８０による三日間の短期間の処置を考慮する場合、予期された治療上の利益は、そのような副作用のリスクを上回る。同等の効力及び向上した生物学的利用能を有するＡＭ５８０アナログを探索した際、急性前骨髄球性白血病の処置のためのタミバロテン、すなわち経口で有効なレチノイドが同定された［４４］。タミバロテンは、既知の、且つ、総合的な安全性プロファイルを有し、日本における市販品であることを理解すべきである。タミバロテンの臨床的忍容性の成功によって、本発明者らは、特に高められた脂質要求の突発がウイルス感染によって誘発される間だけＡＭ５８０が活性であるので、ＡＭ５８０及び／又は関連化合物を安全で且つ幅広い抗ウイルス治療薬として修飾することができると考える。
【実施例】
【0063】
細胞及びウイルス：
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞、ヒト肝臓癌（Ｈｕｈ７）細胞、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞、ヒト上皮２型（ＨＥｐ－２）細胞、ヒト肺腺癌（Ｃａｌｕ－３）細胞、ヒト白血病（ＴＨＰ－１）単球、マジンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞及びＶｅｒｏ－Ｅ６細胞をＡＴＣＣから得て、供給業者／製造業者によって示唆されるように培養培地中で維持した。香港大学の施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅから回収された成人健常者血液試料からヒト末梢血単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を単離した。本発明者らが以前に記載したように［４５］充分に確立されたプロトコルに従って単球の調製及び分化を行った。全ての細胞系を５％のＣＯ２中において３７℃で培養した。前記試験で用いられた全ての細胞系は、Ｐｌａｓｍｏ Ｔｅｓｔ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）によって決定されるようにマイコプラズマの混入がないことが確認された。ウイルス感染の際、化合物を有する又は有さないＦＢＳ不含培地中で前記感染細胞を維持した。インフルエンザＡ型ウイルス株Ａ／香港／４１５７４２／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９をＭＤＣＫ細胞内で培養した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＨＣｏＶ－ＥＭＣ／２０１２）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＧＺ５０）をＶｅｒｏ－Ｅ６細胞内で増殖させた。ＺＩＫＶ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ株ＰＲＶＡＢＣ５９）の臨床分離株をＶｅｒｏ細胞内で増幅した。エンテロウイルスＡ７１（ＳＺ／ＨＫ０８－５）をＲＤ細胞内で培養した。ヒトアデノウイルス５型（ＡｄＶ５）の臨床分離株をＡ５４９細胞内で増殖させた。インビボ抗ウイルス試験のために、二種のマウス適合ウイルス株、すなわちＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＨＣｏＶ－ＥＭＣ／２０１２）を用いた。本発明者らがわずかな修飾と共に以前に記載したように［４６］プラーク形成単位アッセイ（プラークアッセイ）及び／又は５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって、全ての培養ウイルスを滴定した。全てのウイルスストックを、アリコートで、－８０℃で保持した。本発明者らが以前に記載したように［４７］生物学的安全性レベル２又は３の施設を用いて生ウイルスによる全ての実験を行った。
ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞、ヒト肺癌（Ａ５４９）細胞、ヒト肝臓癌（Ｈｕｈ７）細胞、ヒト横紋筋肉腫（ＲＤ）細胞、ヒト上皮２型（ＨＥｐ－２）細胞、ヒト肺腺癌（Ｃａｌｕ－３）細胞、ヒト白血病（ＴＨＰ－１）単球、マジンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、アフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞及びＶｅｒｏ－Ｅ６細胞をＡＴＣＣから得て、供給業者／製造業者によって示唆されるように培養培地中で維持した。香港大学の施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルに従ってＨｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ Ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓｅｒｖｉｃｅから回収された成人健常者血液試料からヒト末梢血単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を単離した。本発明者らが以前に記載したように［４５］充分に確立されたプロトコルに従って単球の調製及び分化を行った。全ての細胞系を５％のＣＯ２中において３７℃で培養した。前記試験で用いられた全ての細胞系は、Ｐｌａｓｍｏ Ｔｅｓｔ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）によって決定されるようにマイコプラズマの混入がないことが確認された。ウイルス感染の際、化合物を有する又は有さないＦＢＳ不含培地中で前記感染細胞を維持した。インフルエンザＡ型ウイルス株Ａ／香港／４１５７４２／２００９（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９をＭＤＣＫ細胞内で培養した。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＨＣｏＶ－ＥＭＣ／２０１２）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ＧＺ５０）をＶｅｒｏ－Ｅ６細胞内で増殖させた。ＺＩＫＶ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ株ＰＲＶＡＢＣ５９）の臨床分離株をＶｅｒｏ細胞内で増幅した。エンテロウイルスＡ７１（ＳＺ／ＨＫ０８－５）をＲＤ細胞内で培養した。ヒトアデノウイルス５型（ＡｄＶ５）の臨床分離株をＡ５４９細胞内で増殖させた。インビボ抗ウイルス試験のために、二種のマウス適合ウイルス株、すなわちＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）及びＭＥＲＳ－ＣｏＶ（ＨＣｏＶ－ＥＭＣ／２０１２）を用いた。本発明者らがわずかな修飾と共に以前に記載したように［４６］プラーク形成単位アッセイ（プラークアッセイ）及び／又は５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）アッセイによって、全ての培養ウイルスを滴定した。全てのウイルスストックを、アリコートで、－８０℃で保持した。本発明者らが以前に記載したように［４７］生物学的安全性レベル２又は３の施設を用いて生ウイルスによる全ての実験を行った。
【0064】
化学試薬及び抗体：
特に明記しない限り、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国ミシガン州）からＡＭ５８０を購入し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州）から他の化学阻害剤を得た。本発明者らが以前に記載したように［４８］、モルモット抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ血清によってＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰを検出した。ヒトＲＡＲ－α（Ａｂｃａｍ）、ＳＲＥＢＰ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＲＥＢＰ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｎ－ＳＲＥＢＰ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ｎ－ＳＲＥＢＰ－２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｆｌａｇ－タグ（Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体を購入し、関連した実験で用いた。免疫蛍光染色のための二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ｐｇ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。核及び細胞膜の染色のために、それぞれ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）及びＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ－Ａｔｔｏ ６４７Ｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＳｉｌｅｎｃｅｒ ＳｅｌｅｃｔヒトＳＲＥＢＰ１ ｓｉＲＮＡ、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ＳｅｌｅｃｔヒトＳＲＥＢＰ２ ｓｉＲＮＡ及びＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ陰性対照を得た。脂質滴（ＬＤ）を染色するために蛍光中性脂質染料４，４－ジフルオロ－１，３，５，７，８－ペンタメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、細胞内コレステロールの視覚化のためにＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いた。アジド標識分子、すなわちＡｚｉｄｏ－ＡＭ５８０の特異的標識化及び検出のために、ホスフィン活性蛍光染料ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８－Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。
特に明記しない限り、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（米国ミシガン州）からＡＭ５８０を購入し、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州）から他の化学阻害剤を得た。本発明者らが以前に記載したように［４８］、モルモット抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰ血清によってＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＮＰを検出した。ヒトＲＡＲ－α（Ａｂｃａｍ）、ＳＲＥＢＰ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ＳＲＥＢＰ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、ｎ－ＳＲＥＢＰ１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ｎ－ＳＲＥＢＰ－２（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｆｌａｇ－タグ（Ｓｉｇｍａ）に対する一次抗体を購入し、関連した実験で用いた。免疫蛍光染色のための二次抗体としてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗ｐｇ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。核及び細胞膜の染色のために、それぞれ４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）及びＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ－Ａｔｔｏ ６４７Ｎ（Ｓｉｇｍａ）を用いた。Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＳｉｌｅｎｃｅｒ ＳｅｌｅｃｔヒトＳＲＥＢＰ１ ｓｉＲＮＡ、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ ＳｅｌｅｃｔヒトＳＲＥＢＰ２ ｓｉＲＮＡ及びＳｉｌｅｎｃｅｒ Ｓｅｌｅｃｔ ｓｉＲＮＡ陰性対照を得た。脂質滴（ＬＤ）を染色するために蛍光中性脂質染料４，４－ジフルオロ－１，３，５，７，８－ペンタメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、細胞内コレステロールの視覚化のためにＦｉｌｉｐｉｎ ＩＩＩ（Ｃａｙｍａｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いた。アジド標識分子、すなわちＡｚｉｄｏ－ＡＭ５８０の特異的標識化及び検出のために、ホスフィン活性蛍光染料ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８－Ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。
【0065】
プラスミド：
ＦＡＳプロモータルシフェラーゼは、Ｂｒｕｃｅ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ博士からの寄贈であり（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８８９０）、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素プロモータを含むｐＳｙｎＳＲＥ－Ｔ－Ｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６０４４４）、ｐｃＤＮＡ３．１－２×ＦＬＡＧ－ＳＲＥＢＰ－２（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２６８０７）、ｐｃＤＮＡ３．１－２×ＦＬＡＧ－ＳＲＥＢＰ－１ｃ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２６８０２）は、Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｏｓｂｏｒｎｅ博士からの寄贈であった。ルシフェラーゼ構築物ＩＦＮβ－Ｌｕｃ及びＩＳＲＥ－Ｌｕｃは、Ｄｏｎｇ－ｙａｎ ＪＩＮ博士（香港大学）によって提供された。
ＦＡＳプロモータルシフェラーゼは、Ｂｒｕｃｅ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ博士からの寄贈であり（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃８８９０）、ＨＭＧ－ＣｏＡ合成酵素プロモータを含むｐＳｙｎＳＲＥ－Ｔ－Ｌｕｃ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃６０４４４）、ｐｃＤＮＡ３．１－２×ＦＬＡＧ－ＳＲＥＢＰ－２（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２６８０７）、ｐｃＤＮＡ３．１－２×ＦＬＡＧ－ＳＲＥＢＰ－１ｃ（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２６８０２）は、Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｏｓｂｏｒｎｅ博士からの寄贈であった。ルシフェラーゼ構築物ＩＦＮβ－Ｌｕｃ及びＩＳＲＥ－Ｌｕｃは、Ｄｏｎｇ－ｙａｎ ＪＩＮ博士（香港大学）によって提供された。
【0066】
一次スクリーニング：
スクリーニングのために１８９の生体活性脂質を含む化合物ライブラリ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国ミシガン州）を購入した。ライブラリ回収は、プロスタグランジン、受容体作動薬及び拮抗剤並びにセラミド誘導体を含んだが、それは、Ｇタンパク質共役型受容体スクリーニング及び通常の薬理学的スクリーニングのために理想的である。本発明者らがわずかな修飾と共に以前に記載したように［４９］、ＭＴＴ系ＣＰＥ阻害アッセイを行った。抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ阻害剤を同定するために、三つの組における９６ウェル培養平板におけるコンフルエントＨｕｈ７細胞（４×ｌ０４細胞／ウェル）を、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１でＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させた。ウイルス吸収の１時間後、接種物を除去し、その後薬物含有培地（１０μＭ）を加えた。２４時間後、前記ウェルに１０μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。単層を、４時間、上記のようにインキュベートした。最後に、０．０１ＭのＨＣｌを有する１００μＬの１０％ＳＤＳを加え、さらに５％ＣＯ２により３７℃で一晩インキュベートした。６４０ｎｍにおける参照波長で５７０ｎｍにおいて活性を読み取った。抗インフルエンザウイルス阻害剤をスクリーニングするため、０．０１ＭＯＩにおいてインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスにＭＤＣＫ細胞を感染させたが、細胞生存率のスコアリングのための時点は感染の４８時間後（ｈｐｉ）であった。他の手順は上記と同じであった。次に、プラーク低減アッセイ（ＰＲＡ）を用いた用量反応分析［５０］を行い、一次ヒットのインビトロ抗ウイルス有効性を評価したが、ここで個別の化合物を連続的に希釈し（１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ及び０．６２５μＭ）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ又はインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス阻害について試験した。
スクリーニングのために１８９の生体活性脂質を含む化合物ライブラリ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国ミシガン州）を購入した。ライブラリ回収は、プロスタグランジン、受容体作動薬及び拮抗剤並びにセラミド誘導体を含んだが、それは、Ｇタンパク質共役型受容体スクリーニング及び通常の薬理学的スクリーニングのために理想的である。本発明者らがわずかな修飾と共に以前に記載したように［４９］、ＭＴＴ系ＣＰＥ阻害アッセイを行った。抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ阻害剤を同定するために、三つの組における９６ウェル培養平板におけるコンフルエントＨｕｈ７細胞（４×ｌ０４細胞／ウェル）を、感染多重度（ＭＯＩ）が０．１でＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させた。ウイルス吸収の１時間後、接種物を除去し、その後薬物含有培地（１０μＭ）を加えた。２４時間後、前記ウェルに１０μＬの５ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａ）を加えた。単層を、４時間、上記のようにインキュベートした。最後に、０．０１ＭのＨＣｌを有する１００μＬの１０％ＳＤＳを加え、さらに５％ＣＯ２により３７℃で一晩インキュベートした。６４０ｎｍにおける参照波長で５７０ｎｍにおいて活性を読み取った。抗インフルエンザウイルス阻害剤をスクリーニングするため、０．０１ＭＯＩにおいてインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９ウイルスにＭＤＣＫ細胞を感染させたが、細胞生存率のスコアリングのための時点は感染の４８時間後（ｈｐｉ）であった。他の手順は上記と同じであった。次に、プラーク低減アッセイ（ＰＲＡ）を用いた用量反応分析［５０］を行い、一次ヒットのインビトロ抗ウイルス有効性を評価したが、ここで個別の化合物を連続的に希釈し（１０μＭ、５μＭ、２．５μＭ、１．２５μＭ及び０．６２５μＭ）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ又はインフルエンザＡ型（Ｈ１Ｎ１）ウイルス阻害について試験した。
【0067】
選択指数：
各化合物の選択指数（ＳＩ）を、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に対する５０％の細胞の細胞毒性濃度（ＣＣ５０）の比として算出した。ＣＣ５０値を、製造業者のプロトコルに従ってＭＴＴアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定したが、一方でプラーク低減アッセイ又は示される通りのウイルス負荷低減アッセイ［５１］によってＩＣ５０データを得た。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いて、ＣＣ５０及びＩＣ５０の両方を算出した。
各化合物の選択指数（ＳＩ）を、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に対する５０％の細胞の細胞毒性濃度（ＣＣ５０）の比として算出した。ＣＣ５０値を、製造業者のプロトコルに従ってＭＴＴアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって決定したが、一方でプラーク低減アッセイ又は示される通りのウイルス負荷低減アッセイ［５１］によってＩＣ５０データを得た。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６を用いて、ＣＣ５０及びＩＣ５０の両方を算出した。
【0068】
フローサイトメトリー：
細胞内染色のために、細胞を、ＰＢＳ中における１０ｍＭのＥＤＴＡによって剥離し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳ中における０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。本発明者らが以前に記載したように［５２］標準的手法に従ってフローサイトメトリーのためのイムノ染色を行った。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて前記フローサイトメトリーを行い、Ｆｌｏｗ Ｊｏ ｖＸ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いてデータを分析した。
細胞内染色のために、細胞を、ＰＢＳ中における１０ｍＭのＥＤＴＡによって剥離し、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、ＰＢＳ中における０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過処理した。本発明者らが以前に記載したように［５２］標準的手法に従ってフローサイトメトリーのためのイムノ染色を行った。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて前記フローサイトメトリーを行い、Ｆｌｏｗ Ｊｏ ｖＸ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いてデータを分析した。
【0069】
動物実験：
ヒトジペプチジルペプチダーゼ４トランスジェニック（ＤＰＰ４）Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを生物学的安全性レベル３のハウジング内に保持し、随時に標準ペレット飼料及び水にアクセスさせた。全ての実験プロトコルは、香港大学におけるＡｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、生物学的安全性レベル３の動物施設の標準操作手順を遵守して行われた。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ７Ｎ９）を、本発明者らが以前に記載したように、それぞれＤＤＰ４マウスモデル［２３］及びＢＡＬＢ／ｃマウスモデル［４７］において試験した。ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を検討するために、合計３６匹のマウス（１８匹／群）を評価した。麻酔後、マウスに対して、５０ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む２０μＬのウイルス懸濁剤を鼻腔内に（ｉ．ｎ．）接種した。ウイルス攻撃の６時間後、治療的処置を腹腔内（ｉ．ｐ．）接種によって開始した。一方の群のマウスに２００μＬのＡＭ５８０をｉ．ｐ．で３日間接種した（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）。第二の群のマウスに未処置対照としてＰＢＳ中における２００μＬの０．１％ＤＭＳＯをｉ．ｐ．で投与した。動物の生存及び病気のシグナルを１４日間又は死亡までモニタした。各群における四匹のマウスを、それぞれ攻撃後の２日及び４日にランダムに安楽死させた。本発明者らが以前に記載したように［４７］、ウイルス滴定及びＨ＆Ｅ組織病理学的分析のためにマウスの肺及び脳を回収した。ＡＭ５８０の抗インフルエンザ効力をインビボで評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１８匹／群）に対して、２０μＬのウイルス懸濁剤、すなわち１００ＰＦＵのインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスを鼻腔内に（ｉ．ｎ．）接種した。ウイルス攻撃の６時間後、治療的処置をｉ．ｎ．鼻腔内投与によって開始した。一方の群のマウスに２０μＬのｉ．ｎ．によるＡＭ５８０（１ｍｇ／ｋｇ／日）を接種した。第二の群のマウスを陽性対照として２０μＬのｉ．ｎ．によるザナミビル（２ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した。第三の群に、未処置対照として、ｉ．ｎ．でＰＢＳ中における０．１％ＤＭＳＯを与えた。ＡＭ５８０、ザナミビル又はＰＢＳの一日当たり二回のｉ．ｎ．による投与を三日間行った（合計六回投与／匹）。動物の生存及び病気のシグナルを１４日間又は死亡までモニタした。ウイルス滴定及びＨ＆Ｅ組織病理学的分析のために、それぞれ攻撃後の３日及び６日に肺組織（四匹／群）を回収した。
ヒトジペプチジルペプチダーゼ４トランスジェニック（ＤＰＰ４）Ｃ５７ＢＬ／６マウス及びＢＡＬＢ／ｃ雌性マウスを生物学的安全性レベル３のハウジング内に保持し、随時に標準ペレット飼料及び水にアクセスさせた。全ての実験プロトコルは、香港大学におけるＡｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認され、生物学的安全性レベル３の動物施設の標準操作手順を遵守して行われた。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ及びインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ７Ｎ９）を、本発明者らが以前に記載したように、それぞれＤＤＰ４マウスモデル［２３］及びＢＡＬＢ／ｃマウスモデル［４７］において試験した。ＡＭ５８０の抗ＭＥＲＳ－ＣｏＶ活性を検討するために、合計３６匹のマウス（１８匹／群）を評価した。麻酔後、マウスに対して、５０ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶを含む２０μＬのウイルス懸濁剤を鼻腔内に（ｉ．ｎ．）接種した。ウイルス攻撃の６時間後、治療的処置を腹腔内（ｉ．ｐ．）接種によって開始した。一方の群のマウスに２００μＬのＡＭ５８０をｉ．ｐ．で３日間接種した（１２．５ｍｇ／ｋｇ／日）。第二の群のマウスに未処置対照としてＰＢＳ中における２００μＬの０．１％ＤＭＳＯをｉ．ｐ．で投与した。動物の生存及び病気のシグナルを１４日間又は死亡までモニタした。各群における四匹のマウスを、それぞれ攻撃後の２日及び４日にランダムに安楽死させた。本発明者らが以前に記載したように［４７］、ウイルス滴定及びＨ＆Ｅ組織病理学的分析のためにマウスの肺及び脳を回収した。ＡＭ５８０の抗インフルエンザ効力をインビボで評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１８匹／群）に対して、２０μＬのウイルス懸濁剤、すなわち１００ＰＦＵのインフルエンザＡ型（Ｈ７Ｎ９）ウイルスを鼻腔内に（ｉ．ｎ．）接種した。ウイルス攻撃の６時間後、治療的処置をｉ．ｎ．鼻腔内投与によって開始した。一方の群のマウスに２０μＬのｉ．ｎ．によるＡＭ５８０（１ｍｇ／ｋｇ／日）を接種した。第二の群のマウスを陽性対照として２０μＬのｉ．ｎ．によるザナミビル（２ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した。第三の群に、未処置対照として、ｉ．ｎ．でＰＢＳ中における０．１％ＤＭＳＯを与えた。ＡＭ５８０、ザナミビル又はＰＢＳの一日当たり二回のｉ．ｎ．による投与を三日間行った（合計六回投与／匹）。動物の生存及び病気のシグナルを１４日間又は死亡までモニタした。ウイルス滴定及びＨ＆Ｅ組織病理学的分析のために、それぞれ攻撃後の３日及び６日に肺組織（四匹／群）を回収した。
【0070】
ヒト腸管オルガノイド培養及びウイルス感染実験：
香港大学／Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｗｅｓｔ Ｃｌｕｓｔｅｒの施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で、外科的切除を受けた患者から正常小腸を得た。次いで、腸管オルガノイドを、本発明者らが他で記載したように［２３］、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染のために培養し、分化させた。１０５ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶの接種物を用いて、一滴のインテスチノイド（５０～１００のインテスチノイドを含む）に０．１の推定ＭＯＩを感染させた。前記接種物を除去した後、ウイルス接種された前記インテスチノイドをＰＢＳで濯ぎ、次いで、マトリゲル内に再包埋し、ＡＭ５８０（２０μＭ）を含有するか又は含有しない培養培地を有する４８ウェル平板内で培養した。示された時点で、細胞内ウイルス負荷の定量のために前記インテスチノイドを採取したが、一方で細胞外上清のウイルス滴定のために無細胞マトリゲル及び培養培地を併用した。
香港大学／Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｗｅｓｔ Ｃｌｕｓｔｅｒの施設内倫理委員会によって承認されたプロトコルの下で、外科的切除を受けた患者から正常小腸を得た。次いで、腸管オルガノイドを、本発明者らが他で記載したように［２３］、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染のために培養し、分化させた。１０５ＰＦＵのＭＥＲＳ－ＣｏＶの接種物を用いて、一滴のインテスチノイド（５０～１００のインテスチノイドを含む）に０．１の推定ＭＯＩを感染させた。前記接種物を除去した後、ウイルス接種された前記インテスチノイドをＰＢＳで濯ぎ、次いで、マトリゲル内に再包埋し、ＡＭ５８０（２０μＭ）を含有するか又は含有しない培養培地を有する４８ウェル平板内で培養した。示された時点で、細胞内ウイルス負荷の定量のために前記インテスチノイドを採取したが、一方で細胞外上清のウイルス滴定のために無細胞マトリゲル及び培養培地を併用した。
【0071】
エクスビボ肺組織培養及びウイルス感染実験：
エクスビボ肺組織培養及びウイルス感染実験は、香港大学／Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｗｅｓｔ Ｃｌｕｓｔｅｒの施設内倫理委員会によって承認された。肺外科的切除を受けている患者から新鮮な正常肺組織を得た。本発明者らが以前に記載したように［４５］、ウイルス感染及びその後の免疫蛍光染色のための実験条件を行った。簡潔に言えば、肺組織を２ｍｍ３の立方体に切断し、続いて、３７℃で１時間、２×１０８ＰＦＵ／ｍＬのＭＥＲＳ－ＣｏＶ接種物によって感染させるか、又は擬感染させた。接種後、組織立方体を、固定及び凍結切片化の前に、１０％ヒト血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。
エクスビボ肺組織培養及びウイルス感染実験は、香港大学／Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ Ｗｅｓｔ Ｃｌｕｓｔｅｒの施設内倫理委員会によって承認された。肺外科的切除を受けている患者から新鮮な正常肺組織を得た。本発明者らが以前に記載したように［４５］、ウイルス感染及びその後の免疫蛍光染色のための実験条件を行った。簡潔に言えば、肺組織を２ｍｍ３の立方体に切断し、続いて、３７℃で１時間、２×１０８ＰＦＵ／ｍＬのＭＥＲＳ－ＣｏＶ接種物によって感染させるか、又は擬感染させた。接種後、組織立方体を、固定及び凍結切片化の前に、１０％ヒト血清及びペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で維持した。
【0072】
トランスクリプトーム分析：
Ｃａｌｕ－３細胞を擬感染させるか、又はＭＯＩが２のＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ＡＭ５８０（２０μＭ）を含有する（又は含有しない）ＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。２４ｈｐｉにおいて、個別の群のトータルＲＮＡ（ｎ＝３）を回収した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ技術［５３］を用いて、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染及びＡＭ５８０処置の後の改変された遺伝子発現を分析した。Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＧＩ）によって配列決定ライブラリを構築し、配列決定したが、それによって、低い質の濾過後に平均して２３，９７７，７２２の清浄な読み取りを生成した。ＨＩＳＡＴ［５４］／Ｂｏｗｔｉｅ２［５５］を用いて、清浄な読み取りを参照にマップした。ＡＭ５８０処置を行った又は行っていないＭＥＲＳ感染試料における差次的に発現した遺伝子を、経路強化分析及びクラスタ分析を行うためにＤＡＶＩＤサーバに提出した。
Ｃａｌｕ－３細胞を擬感染させるか、又はＭＯＩが２のＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ＡＭ５８０（２０μＭ）を含有する（又は含有しない）ＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。２４ｈｐｉにおいて、個別の群のトータルＲＮＡ（ｎ＝３）を回収した。ＲＮＡ－Ｓｅｑ技術［５３］を用いて、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染及びＡＭ５８０処置の後の改変された遺伝子発現を分析した。Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＧＩ）によって配列決定ライブラリを構築し、配列決定したが、それによって、低い質の濾過後に平均して２３，９７７，７２２の清浄な読み取りを生成した。ＨＩＳＡＴ［５４］／Ｂｏｗｔｉｅ２［５５］を用いて、清浄な読み取りを参照にマップした。ＡＭ５８０処置を行った又は行っていないＭＥＲＳ感染試料における差次的に発現した遺伝子を、経路強化分析及びクラスタ分析を行うためにＤＡＶＩＤサーバに提出した。
【0073】
リピドーム分析：
Ｃａｌｕ－３細胞を擬感染させたか、又はＭＯＩが２のＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ＡＭ５８０（２０μＭ）を含有する（又は含有しない）ＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。８ｈｐｉ及び２４ｈｐｉにおいて、それぞれ細胞を回収し、細胞脂質抽出に供した。プラークアッセイによってウイルス感染性の不活性化を確認した。公開された論文［５６］に従って、少しの修飾と共に試料調製を行った。簡潔に言えば、１５０ｍＭ重炭酸アンモニウムの氷冷急冷緩衝液を加えて細胞を解離し、次いで前記細胞を抗クロロホルムチューブにトランスファーした。２ミリリットルのクロロホルム／メタノール（ｖ／ｖ２：１）を前記チューブに加えた後、４℃で１０分間、４５００ｒｐｍでボルテックス及び遠心分離を行った。底相をガラスバイアルに回収し、－８０℃における貯蔵のために真空濃縮器によって乾燥した。ＬＣ－ＭＳ分析の際、前記乾燥試料を３００μＬのクロロホルム／メタノール（ｖ／ｖ２：１）中において再構成し、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－ＨＤＭＳ質量分光計システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州）に結合されたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いて分析した。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｉ．Ｄ．、１．７ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、米国マサチューセッツ州）でクロマトグラフィを行った。移動相は、（Ａ）水中における０．１％酢酸及び（Ｂ）アセトニトリルから成った。以下の通りの勾配プログラムの下で０．４ｍＬ／分の流速で分離を行った：０．５％Ｂ（０～１．５分間）、０．５～８％Ｂ（１．５～２分間）、８～３５％Ｂ（２～７分間）、３５～７０％Ｂ（７～１３分間）、７０～９９．５％Ｂ（１３～２９分間）、９９．５％Ｂ（２９～３６分間）。陽性モード及び陰性モードで質量スペクトルデータを取得した。全ての実験のためのロック塊としてロイシンエンケファリンを用いた。重大な代謝産物の推定上の同定及び構造的解明を可能にするため、フラグメンテーションのために衝突エネルギーを２０～４０ｅＶの範囲で用いた。
Ｃａｌｕ－３細胞を擬感染させたか、又はＭＯＩが２のＭＥＲＳ－ＣｏＶに感染させ、ＡＭ５８０（２０μＭ）を含有する（又は含有しない）ＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。８ｈｐｉ及び２４ｈｐｉにおいて、それぞれ細胞を回収し、細胞脂質抽出に供した。プラークアッセイによってウイルス感染性の不活性化を確認した。公開された論文［５６］に従って、少しの修飾と共に試料調製を行った。簡潔に言えば、１５０ｍＭ重炭酸アンモニウムの氷冷急冷緩衝液を加えて細胞を解離し、次いで前記細胞を抗クロロホルムチューブにトランスファーした。２ミリリットルのクロロホルム／メタノール（ｖ／ｖ２：１）を前記チューブに加えた後、４℃で１０分間、４５００ｒｐｍでボルテックス及び遠心分離を行った。底相をガラスバイアルに回収し、－８０℃における貯蔵のために真空濃縮器によって乾燥した。ＬＣ－ＭＳ分析の際、前記乾燥試料を３００μＬのクロロホルム／メタノール（ｖ／ｖ２：１）中において再構成し、Ｓｙｎａｐｔ Ｇ２－ＨＤＭＳ質量分光計システム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、米国マサチューセッツ州）に結合されたＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムを用いて分析した。Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＢＥＨ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｉ．Ｄ．、１．７ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、米国マサチューセッツ州）でクロマトグラフィを行った。移動相は、（Ａ）水中における０．１％酢酸及び（Ｂ）アセトニトリルから成った。以下の通りの勾配プログラムの下で０．４ｍＬ／分の流速で分離を行った：０．５％Ｂ（０～１．５分間）、０．５～８％Ｂ（１．５～２分間）、８～３５％Ｂ（２～７分間）、３５～７０％Ｂ（７～１３分間）、７０～９９．５％Ｂ（１３～２９分間）、９９．５％Ｂ（２９～３６分間）。陽性モード及び陰性モードで質量スペクトルデータを取得した。全ての実験のためのロック塊としてロイシンエンケファリンを用いた。重大な代謝産物の推定上の同定及び構造的解明を可能にするため、フラグメンテーションのために衝突エネルギーを２０～４０ｅＶの範囲で用いた。
【0074】
電子顕微観察：
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染によって誘導された二重膜ビヒクル（ＤＭＶ）を観察するために電子顕微観察を利用した。Ｖｅｒｏ細胞を６ウェル平板で増殖させた。ＭＯＩが３のＭＥＲＳ－ＣｏＶによる１時間の感染（又は擬感染）の後、細胞培養培地を２０μΜのＡＭ５８０又は対照としての０．１％ＤＭＳＯを含む新鮮な培地に置き換えた。１２時間後、前記細胞培養培地を除去した。前記細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、さらなる処理及び対比染色のために４％ホルムアルデヒドで固定した［５７］。香港大学のＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｕｎｉｔ内で画像を取得した。
ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感染によって誘導された二重膜ビヒクル（ＤＭＶ）を観察するために電子顕微観察を利用した。Ｖｅｒｏ細胞を６ウェル平板で増殖させた。ＭＯＩが３のＭＥＲＳ－ＣｏＶによる１時間の感染（又は擬感染）の後、細胞培養培地を２０μΜのＡＭ５８０又は対照としての０．１％ＤＭＳＯを含む新鮮な培地に置き換えた。１２時間後、前記細胞培養培地を除去した。前記細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理し、さらなる処理及び対比染色のために４％ホルムアルデヒドで固定した［５７］。香港大学のＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｕｎｉｔ内で画像を取得した。
【0075】
分子ドッキング：
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋデータベースからＳＲＥＢＰ１（ＰＤＢコード：１ＡＭ９）及びＳＲＥＢＰ２（ＰＤＢコード：１ＵＫＬ）の結晶構造を検索した。ＰｙｍｏｌによってＳＲＥＢＰ１ダイマー及びＳＲＥＢＰ２ダイマーを抽出した。Ｉ－ＴＡＳＳＥＲサーバを用いて、ＳＲＥＢＰ２において失われた残基をモデル化した［５８］。ＭａｅｓｔｒｏにおけるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄモジュールでタンパク質モデルを調製した［５９］。ＡＭ５８０の３Ｄ配座異性体をＰｕｂＣｈｅｍデータベースからダウンロードした［６０］。Ｌｅａｄｆｉｎｄｅｒ ｖ１．８１を用いて、超精密方法によりドッキングシミュレーションを行った［６１］。
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋデータベースからＳＲＥＢＰ１（ＰＤＢコード：１ＡＭ９）及びＳＲＥＢＰ２（ＰＤＢコード：１ＵＫＬ）の結晶構造を検索した。ＰｙｍｏｌによってＳＲＥＢＰ１ダイマー及びＳＲＥＢＰ２ダイマーを抽出した。Ｉ－ＴＡＳＳＥＲサーバを用いて、ＳＲＥＢＰ２において失われた残基をモデル化した［５８］。ＭａｅｓｔｒｏにおけるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｗｉｚａｒｄモジュールでタンパク質モデルを調製した［５９］。ＡＭ５８０の３Ｄ配座異性体をＰｕｂＣｈｅｍデータベースからダウンロードした［６０］。Ｌｅａｄｆｉｎｄｅｒ ｖ１．８１を用いて、超精密方法によりドッキングシミュレーションを行った［６１］。
【0076】
化学合成：
ＡＭ５８０の細胞内視覚化のためにアジド－ＡＭ５８０を用いたが、一方でＡＭ５８０結合標的のプルダウン試験のためにＡＭ５８０ｄｐを設計し、合成した。
ＡＭ５８０の細胞内視覚化のためにアジド－ＡＭ５８０を用いたが、一方でＡＭ５８０結合標的のプルダウン試験のためにＡＭ５８０ｄｐを設計し、合成した。
【0077】
アジド－ＡＭ５８０を合成するために、２０ｍｇのＡＭ５８０を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した３．１４ｍＬのアジド－ＰＥＧ５－アミン（Ｃｏｎｊｕ－Ｐｒｏｂｅ，ＬＬＣ）（１０ｍｇ／ｍＬ）と混合した。次に、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェイト（ＨＡＴＵ）、５０μＬのＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）及び２．４６ｍＬのジクロロメタン（ＤＣＭ）を最終体積５．７ｍＬとなるように加えた。振盪により室温で反応を行った。一晩のインキュベーションの後、反応混合物を凍結乾燥して溶媒を除去した。ＨＰＬＣによってアジド－ＡＭ５８０を精製し、質量スペクトロメトリー（ＭＳ）によってｍ／ｚ６４０を検出した。核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって最終収率を定量した。
【0078】
ＡＭ５８０ｄｐを合成するために、精製されたアジド－ＡＭ５８０に、化合物Ａと称されるビオチン－ＵＶ活性化－ＮＨＳエステル化合物であったアミン反応性三官能性架橋剤（２－｛Ｎ２－［Ｎα－ベンゾイルベンゾイカミド－Ｎ６－６－ビオチンアミドカプロイル］リシニルアミド｝エチル－２’－（Ｎ－スルホスクシンイミジルカルボキシ）エチルジスルフィドナトリウム塩（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を連結した。この三官能性架橋剤は、別の架橋剤ホスフィン化合物（化合物Ｂ）（メチル４－［２－［２－（２－アミノエトキシ）エトキシ］エチルカルバモイル］－２－ジフェニルホスファニル－ベンゾエート（Ｓｈｉｎｓｅｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．）のアミン尾部への連結のためのＮＨＳエステル頭部基、他端上におけるストレプトアビジン樹脂結合のためのビオチン頭部基、及びＡＭ５８０の標的結合タンパク質との架橋のためのＵＶ活性化ベンゾフェノン基を含む。具体的に、ＤＭＦによって１ｍＬの最終体積になるように１ｍｇの化合物Ａに（ＤＭＳＯ－ｄ６に溶解された）３０μＬの７４．８ｍＭの化合物Ｂを混合した。化合物Ｂに対する化合物Ａのモル比は、１：２であった。１４００ｒｐｍにおける振盪によって４０℃で反応を行った。前記混合物に過剰なアジド－ＡＭ５８０を加えて、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション反応によるホスフィン基との架橋を可能にした。次いで、前記反応生成物をストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）でインキュベートして、ＡＭ５８０ｄｐ生成物を得た。
【0079】
すでに記載されているものの他の多くのさらなる修飾が本明細書における本発明の概念を逸脱することなく可能であることは、当業者にとって明らかであろう。ゆえに、本発明の主題は、添付の請求項の精神を除いて制限されるものではない。その上、本明細書及び請求項の両方を解釈する場合、全ての用語は、文脈に一致する最も幅広い可能な様式で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、参照された要素、成分又はステップが、明示的に参照されない他の要素、成分又はステップと存在してもよいか、利用されてもよいか、又は組み合わされてもよいことを示す非排他的様式で要素、成分又はステップを参照することと解釈されるべきである。本明細書が、Ａ、Ｂ、Ｃ．．．．及びＮから成る群から選択される何れかの内の少なくとも一つに対する参照を請求する場合、本文は、Ａ＋ＮやＢ＋Ｎなどではなく、前記群からの一つの要素だけを必要とするものと解釈されるべきである。
【0080】
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
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【図24】
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【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39A】
【図39B】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【図54】
【図55】
【図56】
【図57】
【図58】
【図59】
【図60】
【図61】
【図62】
【図63】
【図64】
【図65】
【図66】
【図67】
【図68】
【図69】
【図70】
【図71】
【図72】
【図73】
【図74】
【図75】
【図76】
【配列表】