【図1】 選択された抗ＧＰＲＣ５Ｄ ｍＡｂの、ヒトＧＰＲＣ５Ｄ細胞及び遺伝子導入していないＨＥＫ２９３細胞に対する濃度依存的結合プロファイル。３種類のｍＡｂ、すなわちＧＣ５Ｂ３６、ＧＣ５Ｂ１６８、及びＧＣ５Ｂ２０５は、遺伝子導入していない（ＧＰＲＣ５Ｄ ｎｕｌｌ）ＨＥＫ２９３細胞にも結合することが観察された。

【図2】 ヒトＧＰＲＣ５Ｄ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する抗ＧＰＣＲ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体の用量依存的結合。

【図3】 ＦＡＣＳを使用して、二重特異性抗体のＭＭ１Ｒ細胞及びＨ９２９細胞に対する結合プロファイルを、過剰発現させたヒトＧＰＣＲ５Ｄ ＨＥＫ２９３細胞及び遺伝子導入していないＨＥＫ２９３細胞の場合と比較した。

【図4A】 ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する抗ＧＰＣＲ５Ｄ×ＣＤ３抗体によるＴ細胞介在性細胞傷害及びＴ細胞活性化。

【図4B】 ヒトＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する抗ＧＰＣＲ５Ｄ×ＣＤ３抗体によるＴ細胞介在性細胞傷害及びＴ細胞活性化。

【図5A】 カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する抗ＧＰＣＲ５Ｄ×ＣＤ３抗体によるＴ細胞介在性細胞傷害及びＴ細胞活性化。

【図5B】 カニクイザルＧＰＲＣ５Ｄ発現細胞に対する抗ＧＰＣＲ５Ｄ×ＣＤ３抗体によるＴ細胞介在性細胞傷害及びＴ細胞活性化。

【図6A】 ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３ Ａｂは、予防的（prophylactic）ＮＳＧマウスモデルにおいて、Ｈ９２９細胞を効率的に殺傷する。ＧＣＤＢ３２（６Ａ）及びＧＣＤＢ３５（６Ｂ）では、投与量１０μｇで腫瘍の成長が完全に阻害され、ＧＣＤＢ３２については、投与量１μｇでも腫瘍の成長阻害率は１００％が可能であった。

【図6B】 ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３ Ａｂは、予防的（prophylactic）ＮＳＧマウスモデルにおいて、Ｈ９２９細胞を効率的に殺傷する。ＧＣＤＢ３２（６Ａ）及びＧＣＤＢ３５（６Ｂ）では、投与量１０μｇで腫瘍の成長が完全に阻害され、ＧＣＤＢ３２については、投与量１μｇでも腫瘍の成長阻害率は１００％が可能であった。

【図7A】 Ｆｃブロックの非存在下（７Ａ）での力価の比較。

【図7B】 Ｆｃブロックの存在下（７Ｂ）での力価の比較。

【図8A】 ＧＣＤＢ３５ ＧＣＤＢ３２、ＧＣＤＢ４０及びＧＣＤＢ４３のＦｃγ受容体に対する結合。

【図8B】 ＧＣＤＢ３５ ＧＣＤＢ３２、ＧＣＤＢ４０及びＧＣＤＢ４３のＦｃγ受容体に対する結合。

【図8C】 ＧＣＤＢ３５ ＧＣＤＢ３２、ＧＣＤＢ４０及びＧＣＤＢ４３のＦｃγ受容体に対する結合。

【図8D】 ＧＣＤＢ３５ ＧＣＤＢ３２、ＧＣＤＢ４０及びＧＣＤＢ４３のＦｃγ受容体に対する結合。

【図9A】 ハイブリドーマ由来ｍＡｂの、ＦＡＣＳによる結合評価。

【図9B】 ハイブリドーマ由来ｍＡｂの、ＦＡＣＳによる結合評価。

【図10A】 Ｈ９２９細胞に対するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞介在性細胞傷害。

【図10B】 Ｈ９２９細胞に対するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体のＴ細胞介在性細胞傷害。

【図11A】 ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞株（Ｈ９２９、ＭＭ１Ｒ、ＬＰ１、ＯＰＭ２）及び陰性細胞株（ＮＡＬＭ６）に結合するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体。

【図11B】 ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞株（Ｈ９２９、ＭＭ１Ｒ、ＬＰ１、ＯＰＭ２）及び陰性細胞株（ＮＡＬＭ６）に結合するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体。

【図11C】 ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞株（Ｈ９２９、ＭＭ１Ｒ、ＬＰ１、ＯＰＭ２）及び陰性細胞株（ＮＡＬＭ６）に結合するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体。

【図11D】 ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞株（Ｈ９２９、ＭＭ１Ｒ、ＬＰ１、ＯＰＭ２）及び陰性細胞株（ＮＡＬＭ６）に結合するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体。

【図11E】 ＧＰＲＣ５Ｄ陽性細胞株（Ｈ９２９、ＭＭ１Ｒ、ＬＰ１、ＯＰＭ２）及び陰性細胞株（ＮＡＬＭ６）に結合するＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体。

【図12A】 ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂは、生体内において強力な腫瘍阻害剤である。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂ（図１２ＡにはＧＣＤＢ３２を示す）は、投与量１０μｇ及び１μｇで多発性骨髄腫細胞（Ｈ９２９）の腫瘍成長を完全に阻害した。

【図12B】 ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂは、生体内において強力な腫瘍阻害剤である。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂ（図１２ＢにはＧＣＤＢ５３を示す）は、投与量１０μｇ及び１μｇで多発性骨髄腫細胞（Ｈ９２９）の腫瘍成長を完全に阻害した。

【図12C】 ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂは、生体内において強力な腫瘍阻害剤である。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂ（図１２ＣにはＧＣＤＢ６１を示す）は、投与量１０μｇ及び１μｇで多発性骨髄腫細胞（Ｈ９２９）の腫瘍成長を完全に阻害した。

【図12D】 ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂは、生体内において強力な腫瘍阻害剤である。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性Ａｂ（図１２ＤにはＧＣＤＢ７２を示す）は、投与量１０μｇ及び１μｇで多発性骨髄腫細胞（Ｈ９２９）の腫瘍成長を完全に阻害した。ＧＣＤＢ７２を０．１μｇで投与した場合には、腫瘍の成長阻害率は８０％であるという差異が観察された。

【図13】 様々な濃度のリード抗体（lead antibodies）でＧＰＲＣ５Ｄ+ＭＭ１．Ｒ細胞株を６０分間染色し、表面結合プロファイルを測定した（ｎ＝３）。フィコエリトリン標識したヒトＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＨＰ６０２５クローン）を、シグナルを捕捉する二次抗体として使用した。結合は、ＦＡＣＳにより求められた、正規化された幾何平均蛍光強度として表される。データのグラフ化及びフィッティングは、勾配が可変の非線形回帰（４パラメータ）及び最小二乗法を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６で実施した。

【図14A-1】 様々な濃度のＦＡＢ６３００抗体及びＧＣ５Ｍ４８１抗体でＧＰＲＣ５Ｄ+細胞株を６０分間染色し、表面結合プロファイルを測定した。フィコエリトリン標識したヒトＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＨＰ６０２５クローン）を、シグナルを捕捉する二次抗体として使用した。結合をヒストグラムとして表す。黒線はアイソタイプを示し、赤線はＧＰＲＣ５Ｄ特異的抗体を表す。影をつけた点線は、アイソタイプ対照を示し、実線はリード分子の結合を示す。

【図14A-2】 様々な濃度のＦＡＢ６３００抗体及びＧＣ５Ｍ４８１抗体でＧＰＲＣ５Ｄ+細胞株を６０分間染色し、表面結合プロファイルを測定した。フィコエリトリン標識したヒトＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＨＰ６０２５クローン）を、シグナルを捕捉する二次抗体として使用した。結合をヒストグラムとして表す。黒線はアイソタイプを示し、赤線はＧＰＲＣ５Ｄ特異的抗体を表す。影をつけた点線は、アイソタイプ対照を示し、実線はリード分子の結合を示す。

【図14B-1】 様々な濃度のＦＡＢ６３００抗体及びＧＣ５Ｍ４８１抗体でＧＰＲＣ５Ｄ+細胞株を６０分間染色し、表面結合プロファイルを測定した。フィコエリトリン標識したヒトＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＨＰ６０２５クローン）を、シグナルを捕捉する二次抗体として使用した。ＧＰＲＣ５Ｄ＋多発性骨髄腫細胞株に対するリード分子の結合パターンを示す。影をつけた点線は、アイソタイプ対照を示し、実線はリード分子の結合を示す。

【図14B-2】 様々な濃度のＦＡＢ６３００抗体及びＧＣ５Ｍ４８１抗体でＧＰＲＣ５Ｄ+細胞株を６０分間染色し、表面結合プロファイルを測定した。フィコエリトリン標識したヒトＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＨＰ６０２５クローン）を、シグナルを捕捉する二次抗体として使用した。ＧＰＲＣ５Ｄ＋多発性骨髄腫細胞株に対するリード分子の結合パターンを示す。影をつけた点線は、アイソタイプ対照を示し、実線はリード分子の結合を示す。

【図14B-3】 様々な濃度のＦＡＢ６３００抗体及びＧＣ５Ｍ４８１抗体でＧＰＲＣ５Ｄ+細胞株を６０分間染色し、表面結合プロファイルを測定した。フィコエリトリン標識したヒトＩｇＧ４Ｆｃ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＨＰ６０２５クローン）を、シグナルを捕捉する二次抗体として使用した。ＧＰＲＣ５Ｄ＋多発性骨髄腫細胞株に対するリード分子の結合パターンを示す。影をつけた点線は、アイソタイプ対照を示し、実線はリード分子の結合を示す。

【図15A】 ２名の異なるＭＭ患者由来の、凍結した骨髄由来単核細胞を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ対照と比較したＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体の結合、プラズマ細胞の細胞傷害（plasma cell cytotoxicity）及びＴ細胞活性化を評価した。細胞傷害アッセイのため、患者のＢＭ ＭＮＣサンプルに健常ドナー由来のＴ細胞を外部より添加し、４種類のリード分子と共に４８時間インキュベートした。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体は、全てのドナーサンプルについて用量依存的な様式で血漿細胞に結合した。平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体処理に応答する血漿生細胞（ＣＤ１３８+）の減少及び付随するＴ細胞でのＣＤ２５の上方制御に注目されたい。

【図15B】 ２名の異なるＭＭ患者由来の、凍結した骨髄由来単核細胞を使用して、ＩｇＧ４アイソタイプ対照と比較したＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体の結合、プラズマ細胞の細胞傷害（plasma cell cytotoxicity）及びＴ細胞活性化を評価した。細胞傷害アッセイのため、患者のＢＭ ＭＮＣサンプルに健常ドナー由来のＴ細胞を外部より添加し、４種類のリード分子と共に４８時間インキュベートした。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体は、全てのドナーサンプルについて用量依存的な様式で血漿細胞に結合した。平均蛍光強度をＹ軸に記録した。ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体処理に応答する血漿生細胞（ＣＤ１３８+）の減少及び付随するＴ細胞でのＣＤ２５の上方制御に注目されたい。

【図16】 第０日目に、ＮＳＧマウスに、ＭＭ．１Ｓヒト多発性骨髄腫細胞を皮下移植した。７日目に、ヒトＰＢＭＣを静脈内投与した。第１５、１８、２２、２４、２９、３２、及び３６日目に、ＰＢＳ、ＧＣＤＢ７２（０．１μｇ、１μｇ、１０μｇ、及び５０μｇ／個体（それぞれ０．００５、０．０５、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇ相当））、及びＮｕｌｌ対照抗体を静脈内投与した。週に２度皮下腫瘍を測定し、その結果を、それぞれの群における平均腫瘍体積としてｍｍ3±（ＳＥＭ）で表した。１μｇ（０．０５ｍｇ／ｋｇ）で投与した場合、ＧＣＤＢ７２抗体処理では、ＰＢＳと比較して皮下腫瘍の成長は有意に阻害された（ＴＧＩ＝６４％，ｐ＜０．０００１）。ＧＣＤＢ７２は、１０μｇ／個体（０．５ｍｇ／ｋｇ）及び５０μｇ／個体（２．５ｍｇ／ｋｇ）の投与量では、腫瘍の成長を完全に退縮させた（ｐ≦０．０００１）。Ｎｕｌｌ対照抗体は、ほとんど影響がなく、又は全く影響がなかった。テューキー多重比較検定（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン６）を使用）を利用した、多重比較２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡを用いて、統計的有意性を評価した。確率値（ｐ）が＜０．０５であれば、グループ間の差分は有意であるとみなした。

【図17】 第０日目に、ＮＳＧに、ＭＭ．１Ｓヒト多発性骨髄腫細胞を皮下移植した。７日目に、ヒトＰＢＭＣを静脈内投与した。第１５、１８、２２、２４、２９、３２、及び３６日目に、ＰＢＳ、ＧＣＤＢ７２（０．１μｇ、１μｇ、１０μｇ、及び５０μｇ／個体（それぞれ０．００５、０．０５、０．５及び２．５ｍｇ／ｋｇ相当））、及びＮｕｌｌ対照抗体を静脈内投与した。体重は、処置の開始時から試験終了までの体重の絶対値（absolute body weight）として表す。