特許 7471688 オリゴペプチド、検出キット及び医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-12

(45)【発行日】2024-04-22

(54)【発明の名称】オリゴペプチド、検出キット及び医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/08 20060101AFI20240415BHJP

   A61K 51/08 20060101ALI20240415BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20240415BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240415BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240415BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240415BHJP

   C12N 5/0775 20100101ALN20240415BHJP

【ＦＩ】

C07K7/08

A61K51/08 200

A61K38/10

A61K47/64

A61K35/28

A61P19/02 ZNA

C12N5/0775

【請求項の数】 7

(21)【出願番号】P 2022533146

(86)(22)【出願日】2020-12-03

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2023-03-09

(86)【国際出願番号】 US2020063007

(87)【国際公開番号】W WO2021113440

(87)【国際公開日】2021-06-10

【審査請求日】2022-09-02

(31)【優先権主張番号】62/942,847

(32)【優先日】2019-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(73)【特許権者】

【識別番号】509075457

【氏名又は名称】中國醫藥大學

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＮＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ． ９１， Ｈｓｕｅｈ－Ｓｈｉｈ Ｒｏａｄ， Ｎｏｒｔｈ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｔａｉｃｈｕｎｇ， Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110003214

【氏名又は名称】弁理士法人服部国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フン シー‐チー

(72)【発明者】

【氏名】ウー ハン‐チャン

(72)【発明者】

【氏名】リン チン‐イー

(72)【発明者】

【氏名】チー イー‐シュアン

【審査官】西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】特表２００５－５１６８８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２００６／０６２７７６（ＷＯ，Ａ２）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ０７Ｋ ７／００－１９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

結合モチーフを含むアミノ酸配列を有するオリゴペプチドであって、前記結合モチーフは、式（ｉ）に示す配列を有し、
ＷＸ_１ＰＸ_２Ｗ （ｉ）、
式中、Ｗはトリプトファンであり、Ｐはプロリンであり、Ｘ_１及びＸ_２はそれぞれアミノ酸であり、且つＸ_１及びＸ_２は互いに同一又は異なり、或いは、
前記結合モチーフは、式（ｉｉ）に示す配列を有し、
ＤＴＨ （ｉｉ）、
式中、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｔはスレオニンであり、Ｈはヒスチジンであり、
アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２又は配列番号４の全長アミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも９０％の同一性を有する、オリゴペプチド。

【請求項2】

前記アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２又は配列番号４の全長アミノ酸配列の少なくとも一つと同一であることを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。

【請求項3】

前記オリゴペプチドの結合標的は、ＸＩＩ型コラーゲンであり、かつ前記オリゴペプチドは、骨関節炎に罹患している軟骨組織に対して結合特異性を有することを特徴とする、請求項１に記載のオリゴペプチド。

【請求項4】

請求項１～請求項３の何れか１項に記載のオリゴペプチドを含む検出キット。

【請求項5】

前記オリゴペプチドは、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）又は画像現像剤と結合することを特徴とする、請求項４に記載の検出キット。

【請求項6】

請求項１～請求項３の何れか１項に記載のオリゴペプチドと、
前記オリゴペプチドと結合する治療分子又は幹細胞と、
を含む医薬組成物。

【請求項7】

前記治療分子は、骨関節炎治療剤、椎間症治療剤、眼疾患治療剤、ヒアルロン酸、軟骨成長因子又はそれらの組み合わせであることを特徴とし、かつ前記幹細胞は、間葉性幹細胞（ＭＳＣ）である、請求項６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権主張
本出願は、２０１９年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／９４２,８４７号の優先権を主張し、前記出願は引用により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
ＥＦＳによって提出した配列表は、引用により本明細書に組み込まれる。ＥＦＳによって提出された配列表ファイルは、２０２０年１１月３０日に作成されたファイル「ＣＰ－４６４８－ＰＣＴ_ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ」を含み、そのサイズが１,０６９バイトである。

【0003】

発明の分野
本開示の内容は、オリゴペプチド、医薬検出キット及び医薬組成物に関する。より具体的には、本開示の内容は、ＸＩＩ型コラーゲンに特異的なオリゴペプチド、検出キット及び医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0004】

関節軟骨が自己修復能力に欠けるため、特に６０歳以上の人々にとって、骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ；ＯＡ）の罹患率は、持続的に増加している。抗炎症剤による治療、関節腔への潤滑用の補充剤の注射及びマイクロフラクチャー手術、骨軟骨柱移植術などの外科手術法は、従来の骨関節炎の治療方法であるが、症状を和らげるだけであり、現在、骨関節炎に使用される疾患緩和薬はない。自己軟骨細胞移植を使用する細胞に基づく治療法は、局所的な関節軟骨欠損の治療にのみ効果的である。特に、大きな病巣の場合、幹細胞又は前駆細胞の移植は、骨関節炎及び骨軟骨欠損の治療での軟骨細胞の代替となっている。

【0005】

自己再生及び多能的分化能を有する間葉性幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣｓ）は、間葉組織の修復だけではなく、軟骨及び骨の組織工学にも適用可能である。間葉性幹細胞の関節内注射の長期安全性は、既に、変形性膝関節症患者４１人で実証されている。なお、骨関節炎を治療するための間葉性幹細胞の移植の臨床的有効性と安全性は、１１の適合試験と変形性膝関節症患者５８２人のメタアナリシスにより証明されている。

【0006】

変形性膝関節症を治療するために関節に間葉性幹細胞を注射することの治療効果に関する２年の追跡研究によると、低用量及び中用量治療に対する臨床と構造的結果の耐用性に潜在的な懸念があることが判明し、これは更なる研究の必要性を示している。前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｃｒｕｃｉａｔｅ ｌｉｇａｍｅｎｔ；ＡＣＬ）の切断による骨関節炎を治療するために、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＨＡ）を担体とする間葉性幹細胞を関節腔内注射に用いることは、単独でヒアルロン酸を注射することよりも優れた効果を示している。前記研究及び他の研究によると、間葉性幹細胞と滑膜、半月板及び靭帯組織との非特異的結合が判明し、損傷した関節軟骨へ細胞を局所的に送達することを強化する方法の開発の重要性が強調される。しかしながら、前記の問題に着目した研究はほとんどない。磁気的に標識された間葉性幹細胞は、関節軟骨の修復に適用されている。磁性粒子で標識された間葉性幹細胞は、軟骨形成分化中に悪化の状況を示さないが、組織の鉄分に対する吸収については依然として懸念がある。

【0007】

現在の研究において、ヒトの骨関節炎のサンプルによってファージディスプレイペプチドライブラリーに対してバイオパニンを行って、骨関節を標的とするペプチドを同定する。骨関節炎を標的とするペプチドが診断剤、潤滑補助品及び間葉性幹細胞を関節表面に送達する適用については、更に、酵素により誘導されたラットの骨関節炎モデル及び前十字靭帯を切断したブタ骨関節炎モデルによって研究を行う。

【発明の概要】

【0008】

本開示の内容による一つの態様は、結合モチーフを含むアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。

【0009】

前記結合モチーフは、式（ｉ）に示す配列を有する。
ＷＸ ₁ ＰＸ ₂ Ｗ （ｉ）
式中、Ｗはトリプトファンであり、Ｐはプロリンであり、Ｘ ₁ 及びＸ ₂ はそれぞれアミノ酸であり、且つＸ ₁ 及びＸ ₂ は互いに同一又は異なる。

【0010】

前記結合モチーフは、式（ｉｉ）に示す配列を有する。
ＤＴＨ （ｉｉ）
式中、Ｄはアスパラギン酸であり、Ｔはスレオニンであり、Ｈはヒスチジンである。
アミノ酸配列は、配列番号１、配列番号２又は配列番号４の全長アミノ酸配列の少なくとも一つと少なくとも９０％の同一性を有する。

【0011】

本開示の内容による別の態様は、前記態様のオリゴペプチドを含む検出キットである。
本開示の内容によるまた一つの態様は、前記態様のオリゴペプチド、及びオリゴペプチドと結合する治療分子又は幹細胞を含む医薬組成物である。

【0012】

本開示の内容は、添付の図面を参照しながら下記の実施例の詳細な説明を読めば、明確に理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】生体内でイメージングしてＣ５－２４ペプチドと骨関節炎の軟骨との結合能力を証明する結果を示す。

【図1B】生体内でイメージングしてＣ５－２４ペプチドと骨関節炎の軟骨との結合能力を証明する結果を示す。

【図1C】生体内でイメージングしてＣ５－２４ペプチドと骨関節炎の軟骨との結合能力を証明する結果を示す。

【図2A】Ｃ５－２４ペプチドの初期骨関節炎の診断での適用結果を示す。

【図2B】Ｃ５－２４ペプチドの初期骨関節炎の診断での適用結果を示す。

【図2C】Ｃ５－２４ペプチドの初期骨関節炎の診断での適用結果を示す。

【図2D】Ｃ５－２４ペプチドの初期骨関節炎の診断での適用結果を示す。

【図3A】Ｃ５－２４ペプチドの関節潤滑での適用結果を示す。

【図3B】Ｃ５－２４ペプチドの関節潤滑での適用結果を示す。

【図3C】Ｃ５－２４ペプチドの関節潤滑での適用結果を示す。

【図4A】Ｃ５－２４ペプチドの骨関節炎の再生医療での適用結果を示す。

【図4B】Ｃ５－２４ペプチドの骨関節炎の再生医療での適用結果を示す。

【図4C】Ｃ５－２４ペプチドの骨関節炎の再生医療での適用結果を示す。

【図4D】Ｃ５－２４ペプチドの骨関節炎の再生医療での適用結果を示す。

【図5A】間葉性幹細胞を追跡するためのＭＲＩ分析及びプルシアンブルー染色の結果を示す。

【図5B】間葉性幹細胞を追跡するためのＭＲＩ分析及びプルシアンブルー染色の結果を示す。

【図6A】Ｃ５－２４ペプチドの結合タンパク質の同定結果を示す。

【図6B】Ｃ５－２４ペプチドの結合タンパク質の同定結果を示す。

【図6C】Ｃ５－２４ペプチドの結合タンパク質の同定結果を示す。

【図6D】Ｃ５－２４ペプチドの結合タンパク質の同定結果を示す。

【図6E】Ｃ５－２４ペプチドの結合タンパク質の同定結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、当業者が過度の解釈や過度の実験をせずに本発明を完全に利用及び実践できるように、下記の特定の実施形態によって本発明をより詳しく検討する。しかしながら、これらの実際の詳細は、本発明の材料や方法を如何に達成させるかを記述するためのものであり、必須のものではない。

【0015】

一、結果

【0016】

＜骨関節炎を標的とするペプチドの同定＞

【0017】

ファージディスプレイペプチドライブラリーを使用し、人工膝関節全置換術を受けた患者の膝関節から切除された軟骨下骨から、骨関節炎の関節軟骨を検知した。骨関節炎の軟骨標本を、組織溶解物を取得するように均質化し、又は、大きさ５ｍｍ×５ｍｍの正方形の組織ブロックに切った。組織溶解物及び組織断片と結合するファージディスプレイペプチド（バイオパニン）による５回のスクリーニングの後で、ファージの結合力価がそれぞれ３８８倍と８６４倍へと著しく向上した。５回目のバイオパニンから集められたファージクローンに対して、更にＥＬＩＳＡスクリーニングを行い、組織溶解物又は組織断片に対する高親和性を有するクローンが選択、配列決定及びアライメントされることになった。最後、独特な保存的モチーフを有する５群の標的ファージを確定した。ファージクローンの結合能力は、ヒト軟骨細胞株ｈＰｉ－ＧＬ１０に対して免疫細胞蛍光染色を行うことで検証された。Ｍ１３－ＰＥ（蛍光染料にコンジュゲートしている抗体）で標識された同定済みファージクローンが全てｈＰｉ－ＧＬに用量依存的に結合した。注意すべきなのは、Ｃ５－２４及びＣ５－９１ペプチドがｈＰｉ－ＧＬにおいて特異的且つ有意的な結合を示すことである。骨関節炎の軟骨に特異的に結合するが、滑膜及び半月板などの他の軟組織に特異的に結合していないファージクローンを探すために、ヒトの骨関節炎の組織切片に対して、更に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）で標識されたファージクローンによって免疫染色を行った後、沈殿した３,３－ジアミノベンジジン（３,３-ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）の強度（－～＋＋＋）を半定量した。具体的に、Ｃ５－２４ペプチド（例えば、配列番号１のアミノ酸配列で示される）及びＣ５－９１ペプチド（例えば、配列番号２のアミノ酸配列で示される）は、軟骨に対して優れた結合活性を示すが、半月板及び滑膜に対する結合活性はなかった。なお、Ｃ５－２４ペプチドは、骨関節炎の軟骨の細胞質領域を標的とする最適な特異性を示し、更に後の研究に使用するために選択された。

【0018】

＜骨関節炎を標的とする生体イメージング＞

【0019】

Ｃ５－２４ペプチドの骨関節炎に対する標的活性を証明するために、ローダミン標識されたＣ５－２４ペプチド及びスクランブルペプチドをそれぞれラットの骨関節炎モデルの関節に注入して、２光子顕微鏡によって蛍光及び第２高調波発生（ｓｅｃｏｎｄ ｈａｒｍｏｎｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ＳＨＧ）信号を観察した。スクランブルペプチドは、元のペプチドと同一の全てのアミノ酸を含むが、新しいシーケンスでランダムに配列された。表面レンダリングされた３Ｄ再構成画像及び軟骨の側方再結合画像によると、散在的な赤色ドットは、Ｃ５－２４ペプチドが注射された対照軟骨、スクランブルペプチドが注射された対照軟骨、及びスクランブルペプチドが注射された骨関節炎の軟骨にランダムに現れた。それに対して、Ｃ５－２４ペプチドが注射された骨関節炎の軟骨には多くの赤色ドットが観察された。ＳＨＧによって第ＩＩ型コラーゲンを探索すると、赤色ドットは、骨関節炎の軟骨の細胞質領域に対応する、信号ＳＨＧのない領域（図１Ａ）に位置していた。ｚ軸平面から、Ｃ５－２４ペプチド骨関節炎の軟骨への深さは少なくとも５０μｍである（図１Ａ）ことが確認できた。また、全ての切片における合計蛍光ペプチド結合面積（図１Ｂ）及び結合強度（図１Ｃ）は、更に算出され、Ｃ５－２４ペプチドが標的とする骨関節炎及び対照軟骨の有意差を示した。前記した一連のデータにより、Ｃ５－２４ペプチドが骨関節炎の軟骨の細胞質領域を標的とすることは、優れた認識能力と特異性を有することが証明された。

【0020】

＜初期骨関節炎の診断への適用＞

【0021】

骨関節炎を標的とするペプチドが骨関節炎の初期診断中に診断用薬を送達する適合性を証明するために、Ｃ５－２４及びスクランブルペプチドを超常磁性酸化鉄（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ ｉｒｏｎ ｏｘｉｄｅ；ＳＰＩＯ）とコンジュゲートさせた（図２Ａ）。フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）によると、Ｎ－Ｈ帯域／Ｃ－Ｏ延伸比が増加すると示され、ＳＰＩＯのＣ５－２４及びスクランブルペプチドに担持できたと判明し（図２Ｂ）、前記ペプチドは酵素切断の形態で樹立されたラットの骨関節炎モデルの関節に関節内注射されたものであった。ペプチドとコンジュゲートしていないＳＰＩＯを注射した骨関節炎性膝関節の磁気共鳴イメージング（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ；ＭＲＩ）と擬似対照群の膝関節とは差を示さず、これは、軟骨がひどく剥離されていない場合、ＭＲＩの骨関節炎の初期診断に対する挑戦を開示した。同様に、骨関節炎の軟骨と結合していないスクランブルペプチドコンジュゲートＳＰＩＯ及びＭＲＩ信号の低下により、初期骨関節炎と擬似対照群加を区分することもできなかった。それに対して、Ｃ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯが骨関節炎の軟骨に結合されると、骨関節炎の軟骨のＭＲＩ信号が低下するが、この状況は健康な軟骨には見られなかった（図２Ｃ）。臨床状態により近づくために、Ｃ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯの初期骨関節炎の診断に用いられる実現可能性は、更に、前十字靭帯を切断した蘭嶼ミニブタから樹立された大型動物の骨関節炎モデルによって実証された。前十字靭帯を切断した２ヶ月後、擬似対照群がＣ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯを受け又はＣ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯ処理を受けず、又は骨関節炎性膝関節がＣ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯ処理を受けないにもかかわらず、Ｔ１－及びＴ２－強調ＭＲ画像にも差異がなく（図２Ｄ）、ＭＲＩによる初期骨関節炎の診断の難しさが判明した。しかしながら、Ｃ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯを受けた骨関節炎性膝関節はそのＴ１－及びＴ２－強調ＭＲ画像に強化信号の減少が示され、Ｃ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯの初期骨関節炎の診断に対する感度が証明された。以上をまとめると、前記した一連のデータによると、Ｃ５－２４ペプチドとコンジュゲートすると、ＳＰＩＯなどの画像現像剤は、ＭＲイメージングシステムに合わせて初期骨関節炎の診断に用いることができることが判明した。

【0022】

＜関節潤滑への適用＞

【0023】

Ｃ５－２４ペプチドがヒアルロン酸を骨関節炎の軟骨の中に運んで潤滑に用いられる潜在力を研究するために、Ｃ５－２４ペプチド又はスクランブルペプチドは、ヒアルロン酸とコンジュゲートして、それぞれＣ５－２４－ＨＡ及びスクランブル－ＨＡと略称された（図３Ａ）。¹Ｈプロトン－ＮＭＲ（核磁気共鳴）によって、ＨＡ－ＭＡのメタクリル酸エステルは、含有量が約２８．１％と測定され、後でＣ５－２４ペプチド（図３Ｂ）及びスクランブルペプチドと結合する中間体として用いられた。流動潤滑性能は、静摩擦係数（μ_s）及び動摩擦係数（μ_k）を含み、改良された先行技術におけるロータロッド試験方法によって評価し、非修飾のＨＡ、スクランブル－ＨＡ又はＣ５－２４－ＨＡ処理の対になるヒト骨関節炎の軟骨円盤（１３の個体から集める）の間で比較した。非修飾のＨＡ、スクランブル－ＨＡ及びＣ５－２４－ＨＡは、１．２秒間弛緩させる場合、総合摩擦係数として、それぞれ、μ_sが０．０６５、０．０７３及び０．０４４であり、μ_kが０．０４５、０．０５２及び０．０３４であり、且つ非修飾のＨＡに比べると、Ｃ５－２４－ＨＡがそれぞれ３２．３％及び２４．４％低下した。１２秒間弛緩させる場合、μ_sがそれぞれ０．０７２、０．０７５及び０．０４３であり、μ_kがそれぞれ０．０４５、０．０５２及び０．０３３であり、且つ非修飾のＨＡに比べると、Ｃ５－２４－ＨＡがそれぞれ４０．３％及び２６．７％低下した。１２０秒間弛緩させる場合、μ_sがそれぞれ０．０７７、０．０７９及び０．０４４であり、μ_kがそれぞれ０．０４８、０．０５５及び０．０３４であり、且つ非修飾のＨＡに比べると、Ｃ５－２４－ＨＡが４２．９％及び２９．２％低下した。１２００秒間弛緩させる場合、μ_sがそれぞれ０．０９４、０．１０２及び０．０６６であり、μ_kがそれぞれ０．０６０、０．０６７及び０．０４２であり、且つ非修飾のＨＡに比べると、Ｃ５－２４－ＨＡがそれぞれ２９．８％及び３０％低下した（図３Ｃ）。つまり、全ての弛緩段階において、Ｃ５－２４－ＨＡは、非修飾のＨＡ及びスクランブル－ＨＡと比較して、統計的に有意的に優れた静的及び動的摩擦特性を有し、その潤滑効果が卓越していることが示された。そして、流動的前処理段階及びトルク計測において、Ｃ５－２４－ＨＡの潤滑性が非修飾のＨＡ及びスクランブル－ＨＡよりも優れていた。代表的で個人的な患者データは補足データに置かれ、前処理段階で３６００秒間の弛緩時間内に軟骨円板の高さが次第に失われるのと同じ様子を示すが、次の４つの弛緩期中に一致した軟骨円板の高さまで回復したことにより、摩擦計測に影響を与える因子が減少した。前記した一連のデータをまとめると、Ｃ５－２４ペプチドは新規且つ効果的な骨関節炎の関節の潤滑剤を開発するための適合性が判明した。

【0024】

＜骨関節炎の再生医療への適用＞

【0025】

Ｃ５－２４－ＨＡは、ＣＤ４４（ＨＡの受容体）と結合することで間葉性幹細胞の再生医療に適用することができ、ＣＤ４４は間葉性幹細胞の表面で広く発現され、間葉性幹細胞を骨関節炎の軟骨表面に送達した。なお、以前の研究により、ＨＡの軟骨形成活性により間葉性幹細胞が軟骨を形成するように誘導する可能性が高いことが実証された。これを証明するために、ラット間葉性幹細胞に、後で追跡できるようにＳＰＩＯを加えて、蛍光コンジュゲート化Ｃ５－２４－ＨＡ又はスクランブル－ＨＡと一緒にインキュベートした（図４Ａ）。蛍光顕微鏡で観察すると、間葉性幹細胞が緑蛍光によって密接に取り囲まれることが判明した（図４Ｂ、モノクロ模様で示す）。なお、Ｃ５－２４－ＨＡ又はスクランブル－ＨＡと一緒にインキュベートした後で、間葉性幹細胞を直ちにラットの骨関節炎モデルの関節に注射して、移植の８週間後に関節に対して組織学的検査を行った。骨関節炎群と擬似対照群とを比較し、組織形態計測分析結果によると、骨関節炎が誘導されたことが示された（図４Ｃ、図４Ｄ）。なお、Ｃ５－２４－ＨＡにより送達された間葉性幹細胞を受けた膝関節は明確な軟骨再生と明確なサフラニンＯ染色を有するが（図４Ｃ）、スクランブル－ＨＡにより送達された間葉性幹細胞を受けた膝関節は相変わらず重篤な骨関節炎を発現し、且つ軟骨表面に多くの亀裂が現れ、そのサフラニンＯ染色も消えた。修正マンキンスコアによって骨関節炎の程度を定量化した結果によっても、前者の骨関節炎の改善は後者よりも優れる（図４Ｄ）ことが判明した。骨関節炎の関節に移植されたＳＰＩＯの加えられた間葉性幹細胞を追跡するために、移植３日後にラットに対してＭＲＩ走査（図５Ａ）及びプルシアンブルー染色（図５Ｂ）を行い、その結果はＣ５－２４－ＨＡ補助の群に示される。間葉性幹細胞は骨関節炎の軟骨において特異性ホーミング特性を有するが、ぼかされているＨＡ補助群に現れなかった。前記した一連のデータによると、Ｃ５－２４－ＨＡの、間葉性幹細胞の再生医療強化への適合性が判明した。

【0026】

＜結合タンパク質の同定＞

【0027】

ヒト骨関節炎の軟骨組織におけるＣ５－２４ペプチドと結合する、推定される標的タンパク質を同定するために、化学架橋剤である３,３’－ジチオビススルホスクシンイミジルプロピオネート（３,３’－Ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；ＤＴＳＳＰ）と結合するビオチン変性されたＣ５－２４ペプチドを使用し、次に、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）及び液体クロマトグラフィ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって結合標的（図６Ａ）を認識した。銀染色によれば、幾つかの明瞭なバンドが現れ、例えば、免疫共沈降タンパク質ＣＯＩＰ－１、ＣＯＩＰ－３及びＣＯＩＰ－５（図６Ｂ）であり、それらをそれぞれ集めて、トリプシンで消化してＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。前記断片は、アルゴリズムによって、ＭＡＳＣＯＴ及びＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔサーチエンジンでスイスプロテインデータベース（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）より検索して同定された。確率スコアを有するコラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）及びコラーゲンａｌｐｈａ－３（ＶＩ）断片を含む幾つかの候補タンパク質が発見され、前記ペプチドがあるタンパク質に属する可能性はそれぞれ８５０及び３７２にも達し、ほとんどの他の同定されたペプチドよりも高いことが判明した。これらのタンパク質断片がＣ５－２４ペプチドの標的タンパク質であることを更に確認するために、ＥＬＩＳＡによって標的タンパク質とビオチン変性されたＣ５－２４ペプチドとの間の相互の結合活性を検出した。まず、ペプチド結合の最も高いコラーゲン濃度（図６Ｃ）を同定するように、特定濃度のコラーゲンによってＥＬＩＳＡプレートに対してプリコート処理を行って、次に、３．３μｇ／ｍＬのコラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）によってペプチドの結合を検査した（図６Ｄ）。ビオチン変性されたＣ５－２４ペプチドはコラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）及びコラーゲンａｌｐｈａ－３（ＶＩ）断片と結合するが、ビオチン変性されたスクランブルペプチドは結合しないことが発見された。しかしながら、相互的な用量依存的結合は、コラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）とビオチン変性されたＣ５－２４ペプチドとの間にしか観察されなかった（図６Ｃ、図６Ｄ）。また、ビオチン変性されたＣ５－２４ペプチド及びビオチン変性されたスクランブルペプチドとウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）との結合には、差異がなかった。以上をまとめると、前記した一連のデータによると、コラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）はＣ５－２４ペプチドの標的タンパク質であることが判明した。

【0028】

タンパク質－ペプチド複合体の構造を予測するために、配列２の類似性を検索し、ヒトＸＩＩ型コラーゲンをホモロジーモデリング及び標的とする幾つかの信頼できる構造モデルは、タンパク質－ペプチドのドッキングを補助した。これらの構造モデルは、後で最も潜在的で本研究で選用されて更なる実験に用いられるＣ５－２４及びＣ５－９１ペプチド鎖の潜在的な分子ドッキング構造の算出に適用された。タンパク質－ペプチドドッキングモデルは、主に、標的タンパク質のペプチド鎖と結合した後で、最も低いギブス自由エネルギー及び化学熱力学に該当するアルゴリズムに基づいたものであった。本発明者のデータによると、Ｃ５－２４及びＣ５－９１ペプチド鎖はそれぞれ構造１２５及び構造６８によってＸＩＩ型コラーゲンにおける領域Ｌ１３８５－Ｓ２２８５の袋点を標的とし、それぞれ構造３４及び４２によってＣ端のＳ２５０６－Ｐ２７２４を標的にし、最も高い構造頻度を有するＣ５－２４とＣ５－９１は同一のドッキング部位を有する（図６Ｅ）ことが判明した。なお、これらの予測される構造は、重要な保存的結合モチーフであるＷＸＰＸＷを共有し、ＷＸＰＸＷがペプチド鎖とＸＩＩ型コラーゲンとの間の主なドッキングの親和性を支配する必要があった。また、ヒト、ブタ、ウサギ、ラット及びマウスのＸＩＩ型コラーゲンの配列相同性として９０．３％の類似性及び８３．７％の同一性に達し、且つ親族関係の分析結果によると、ＸＩＩ型コラーゲンが前記５つの物種の間に高い遺伝的関連性を有することが判明した。Ｃ５－２４ペプチドの齧歯類、ウサギ及びブタ骨関節炎モデルでの検査は非常に信頼できるものであった。なお、表１における保存的ドメインによると、同一群のペプチド配列は重要且つ同一のモチーフを共有し、例えば、第１群及び第３群ではそれぞれＦＶＥＷ及びＤＴＨを共有していた。

【0029】

【表1】

【0030】

最後に、ＸＩＩ型コラーゲンの骨関節炎の関節軟骨での独占的な発現を証明した。ＸＩＩ型コラーゲンの発現は、ラット骨関節炎の軟骨のみに観察され、正常関節軟骨には観察されなかった。ほかに、ＸＩＩ型コラーゲンの発現は、ヒト骨関節炎の軟骨のみに観察され、ヒトの骨関節炎に罹患していない軟骨には観察されなかった。ＸＩＩ型コラーゲンは、主にクラスター化した軟骨細胞の細胞質領域で発現され、それはＣ５－２４ペプチド結合の領域と一致していた（図１Ａ）。これらのデータは、更に、１６１人の骨関節炎患者及び２９人の非骨関節炎患者のコホート研究の結果にサポートされた。初期分析によると、非骨関節炎の軟骨に比べると、骨関節炎股関節と骨関節炎性膝関節との軟骨複合におけるＣＯＬ１２Ａ１ ｍＲＮＡレベルは著しく増加した。

【0031】

＜疾患修飾性の骨関節炎用薬剤（ＤＭＯＡＤｓ）への適用＞

【0032】

現在、疾患修飾性の骨関節炎用薬剤として認可される薬剤はなかった。そのため、骨関節炎は、治療上の医学的ニーズに応えてその基本の病態生理学を変えずに、長期間で、臨床に関連する進展に転換する重篤な疾病である可能性がある。現在、第ＩＩ相、第ＩＩＩ相又は前臨床段階にある幾つかの薬剤があり、軟骨再生を標的とする繊維芽細胞増殖因子－１８（Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎ）、及びコア結合因子ｂｅｔａ（ＣＢＦβ）の解離及び核内在化を促進してカスケード軟骨の形成を刺激するＫａｒｔｏｇｅｎｉｎを含む。発進中の全ての疾患修飾性の骨関節炎用薬剤も、本研究で開発された骨関節炎を標的とするペプチドの協力で、骨関節炎組織への送達が促進される。また、全身性薬剤による治療とは逆に、多数の薬剤は、関節内での投薬経路に着目して、薬剤の局所生体利用率を向上させて従来の障害物を避け、オフターゲット効果を低下させることで全身毒性を最小化して安全性を向上させることができる。しかしながら、関節局所投与による明確なプラセボ効果を了解し、治療効果の評価をより困難にすることが重要である。本研究の発見したペプチドのような、治療剤を骨関節炎部位に送達する技術の精度向上により、骨関節炎に対する効果的な治療法を首尾よく開発することができる。将来、疾患修飾性の骨関節炎用薬剤の発進を増進するように、骨関節炎を標的とするペプチドを備える複雑な担体によって疾患修飾性薬を提供することに専念すべきである。

【0033】

ファージにコードされた幾つかのペプチドモチーフ（ＷＸＰＸＷ及びＤＴＨ）が既に特定され、これらのモチーフは骨関節炎の関節を選択的に標的とするが、滑膜組織、半月板及び靭帯を含む他の関節軟組織に対して、効果的に標的とすることはなかった。なお、Ｃ５－２４及びＣ５－９１ペプチドと骨関節炎の関節における軟骨細胞の細胞質領域との特異的結合を同定した。Ｃ５－２４は、ＳＰＩＯ及びＨＡと結合しており、それぞれ骨関節炎の診断及び潤滑に用いられた。Ｃ５－９１ペプチドは診断剤又は潤滑剤を骨関節炎の関節の関節表面に送達できると確認されていないが、Ｃ５－９１ペプチドはＣ５－２４ペプチドと同一の大きさを有し及び同一のモチーフを共有するため、同一の機能を有すると考えられた。

【0034】

コラーゲンＩＩは透明軟骨の基礎であり、且つ関節軟骨における全てのタンパク質の８５～９０％を占めるにも関わらず、老化又は骨関節炎によりコラーゲンが損傷し、且つ前記損傷が関節表面の軟骨細胞（細胞質領域）から始まって、進展中の退化に従って軟骨全体に広がる。コラーゲンＩＩが骨関節炎で特異的に発現していないことに鑑みて、コラーゲンＩＩを標的とするペプチドは、骨関節炎の診断、治療、潤滑及び再生医療への適用に適合しない可能性がある。逆に、本研究で開示されるように、実験とコンピュータシミュレーションによると、結合モチーフであるＷＸＰＸＷを共有する骨関節炎を標的とするペプチドは、細胞質領域に選択的にホーミングして、骨関節炎の軟骨のみで発現するＸＩＩ型コラーゲンと結合することが証明される。抗体で行われた免疫蛍光研究によると、ＸＩＩ型コラーゲンは、胚組織におけるコラーゲンＩを含有する、筋腱、靭帯、軟骨膜及び骨膜などの密集した結合組織構造に位置する（ＸＩＩ型コラーゲンが角膜、椎間板及び気管の組織にも発現する）ことが説明され、それが関節の退化及び再生で現れることが判明する。ＸＩＩ型コラーゲンの骨関節炎の再生での作用を述べるには、更なる研究が必要である。上記をまとめると、骨関節炎の潤滑、診断、治療及び再生医療を改良するための、ＸＩＩ型コラーゲンに対する新規の送達プラットフォームが開発される。

【0035】

ＸＩＩ型コラーゲンと結合するペプチドは、骨関節炎の診断、潤滑剤及び再生医療に用いられるように開発されたが、例えば、重篤なドライアイで発生する可能性のある角膜潰瘍及び穿孔、又は椎間板及び気管軟骨などの透明軟骨を含む他の組織に関連する傷害又は変性疾患などの他の疾病に適合されてもよい。例えば、角膜のボーマン層で発現するＸＩＩ型コラーゲンが角膜潰瘍及び瘢痕形成の過程で過度発現するため、機能化されたＸＩＩ型コラーゲン標的ペプチドは、潤滑剤、抗炎症剤及び幹細胞の輸送に寄与し、角膜潰瘍を治療することができる。上記をまとめると、骨関節炎の潤滑、診断、治療及び再生医療を改良するための、ＸＩＩ型コラーゲンに対する新規の送達プラットフォームを開発した。前記プラットフォームは、更に、眼潰瘍及び透明軟骨を含む他の組織の疾病などの他の疾病の治療に用いられてもよい。

【0036】

＜材料と方法＞

【0037】

本出願の上記実施例は、以下の方法及び材料によって実行され、その細部については下記のように記述される。

【0038】

＜バイオパニン及びＥＬＩＳＡスクリーニング用の軟骨標本の調製＞

【0039】

患者間の個体差の干渉を避けるために、同一のファージディスプレイ実験において、ファージディスプレイ実験でバイオパニンを５回行うように、同一の骨関節炎患者からの手術した関節軟骨の標本を使用した。５回のバイオパニンに用いられる軟骨の粒度組成が確実に一致するように、下記処理を行った。重量３．２ｇのヒトの手術した骨関節炎標本を、２倍のリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）に加えて均質化した。軟骨均質化液を８００×ｇ及び４℃の条件で１０分間遠心分離させ、「大粒子軟骨サンプル（Ｃ１）」として沈殿物を集めた。上澄みを新しい遠心チューブに添加して、次に１,５００×ｇ及び４℃の条件で１０分間遠心分離させ、「中間粒子（Ｃ２）付きの軟骨サンプル」として沈殿物を集めた。次に、上澄みを２,０００×ｇ及び４℃の条件で再び１０分間遠心分離させた後で、「小粒子軟骨サンプル（Ｃ３）」として沈殿物を集めた。この場合の上澄みをそれぞれ集めて「軟骨組織溶解物」として別に５回のバイオパニンを行い、これは「軟骨組織断片」で行われたバイオパニンと同一ではなかった。「軟骨組織溶解物」のバイオパニンでは、それぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３を秤量して５等分した。５回のバイオパニンは、それぞれＣ１、Ｃ２及びＣ３等分の混合物によって行われた。

【0040】

「軟骨組織断片」のバイオパニンにおいて、軟骨細胞の結合スクリーニングを行うように、軟骨サンプルを同様に正方形の断片（サイズ５×５ｍｍ）に切って、ウェルあたり１個の断片の数でネイルエナメルによって９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに接着した。

【0041】

＜骨関節炎の軟骨組織溶解物と断片に対するファージクローンバイオパニン＞

【0042】

「軟骨組織溶解物」のバイオパニンでは、組織溶解物の上澄みを塗工液［０．１ Ｍ ＮａＨＣＯ₃、ｐＨ８．６］によって１０倍に希釈し、次に直ちにバイオパニン用の１０ｃｍディッシュ（及びスクリーニング用の９６ウェルＥＬＩＳＡプレート）にコートし、使用前に４℃で２４時間静置した。組織溶解物被覆のプレートを１％のＢＳＡを含むＰＢＳによって４℃の条件下で一晩ブロックして、１０ｐｆｕのＰｈ．Ｄ．－１２ＴＭファージ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）ディスプレイペプチドライブラリーを加えて４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合されたファージを１ｍｌのＥＲ２７３８の対数培養物を用いて、３７℃、１００ｒｐｍで２０分間振盪して溶出させた。溶出されたファージライブラリーをＥＲ２７３８で一晩培養して増幅と滴定を行った。回收されたファージを次回のパニングに投入して、５回目のバイオパニンから合計１３０個のファージクローンをランダムに選択して培養を行って、ＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。

【0043】

「軟骨組織断片」の各バイオパニンにおいて、軟骨サンプルを１％のウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）を含むＰＢＳによって４℃の条件下で１時間ブロックした。最初に１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）を含むＰｈ．Ｄ．－１２ＴＭ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）ファージディスプレイペプチドライブラリーを加え、４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、結合されたファージを、１ｍｌの大腸菌ＥＲ２７３８の対数培養物（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）によって３７℃、１００ｒｐｍで３０分間振盪して溶出させた。溶出されたファージライブラリーをＥＲ２７３８で一晩培養して増幅と滴定を行った。回収されたファージを次回のパニングに投入して、５回目のバイオパニンから合計９５個のファージクローンをランダムに選択して培養を行って、ＥＬＩＳＡスクリーニングを行った。

【0044】

＜骨関節炎軟骨を標的とするアミノ酸配列モチーフの同定＞

【0045】

選択されたファージクローンと軟骨組織溶解物の結合活性、及び軟骨組織断片との結合活性を、ＥＬＩＳＡによって検出した。最も高い結合親和性を有するファージクローン（軟骨組織溶解物のＡ４９０値＞０．１５で、且つ軟骨組織断片のＡ４９０値＞２．０である）は、選用されて配列決定された。アミノ酸配列のアライメントによって、５つの異なる保存的モチーフを有する群（表１に示される）を同定した。

【0046】

＜ｈＰｉ－ＧＬ軟骨細胞株で免疫蛍光標識によって骨関節炎軟骨を標的とするペプチドを検証する＞

【0047】

前記した一連のファージクローンを検出するために、室温で４％のパラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液によって、ガラススライドで培養されたｈＰｉ－ＧＬ細胞を１５分間固定し、次にＰＢＳで洗浄し、室温で０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００によって３０分間透過処理して、１％のＢＳＡ／ＰＢＳＴとの非特異的結合をブロックした。ガラススライドで培養されたｈＰｉ－ＧＬ細胞をそれぞれ４×１０⁸ｐｆｕ、８×１０⁸ｐｆｕ及び１０⁹ｐｆｕの選択されたファージクローンと共に、４℃で１時間インキュベートした。結合されていないファージを洗い流した後で、細胞と一次抗体である抗Ｍ１３マウスモノクローン抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、ＵＳＡ）及び二次抗体であるＲ－フィコエリトリン－ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）をそれぞれ室温で１時間インキュベートした。次に、ＰＢＳＴで洗浄し、室温でＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８（１μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によって１０分間対比染色した。細胞とファージとの結合及び位置決めについては、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００）によって蛍光分析を行った。

【0048】

＜滑膜及び半月板ではなく骨関節炎軟骨を標的とするペプチドの選択＞

【0049】

ヒト骨関節炎の軟骨標本は、関節組織と結合する標的ファージの位置決めをチェックすることに用いられる。パラフィン包埋切片のヒト骨関節炎組織、滑膜及び半月板は、中国医薬大学及び付属医院研究倫理委員により承認された臨床試験プログラム（ＩＲＢ番号ＣＭＵＨ１０８－ＲＥＣ１－０４６とＴ－ＣＭＵ－２３７２８）のヒト骨関節炎手術の治療標本に由来する。前記試験は、既に書面によるインフォームドコンセントを取得し、全てのヒト組織サンプルに対して匿名でコードした。全ての切片の何れに対しても、標準法によって乾燥、脱パラフィン化及び再水和を行って、次にＣ５－８７、Ｃ５－６６、Ｃ５－８３、Ｃ５－９１、Ｃ５－２４、Ｅ５－８及びＣ５－４６ファージクローン又は対照ファージ（５×１０⁸ｐｆｕ／μｌ）と一緒にインキュベートした。洗浄後、切片を室温で抗Ｍ１３マウスモノクローン抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって１時間処理した。複数回の洗浄工程の後で、ビオチンを含まない超高感度重合体－ＨＲＰ検出システム（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）によってその免疫反応性を検出した。前記ガラススライドをヘマトキシリンによって軽く対比染色して、Ａｑｕａｔｅｘ（Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって取り付け、後で光学顕微鏡でチェックした。ファージクローンにおいて滑膜又は半月板ではなく軟骨細胞と著しく結合されるようになったペプチド配列を選択して、後の研究のために合成を行った。

【0050】

＜ラットの骨関節炎モデルの樹立＞

【0051】

ラットの骨関節炎モデルを、前記と僅かに異なるように樹立した。つまり、本研究では、体重がちょうど３００ｇである雄のＳＤラットを使用した。全ての動物実験も中国医薬大学実験動物照護及び使用委員会により認可された。ラットを標準的な実験室の条件下（温度２４℃、明暗サイクル１２時間）で飼育し、標準食及び飲用水道水を摂取させた。ラットを、各注射の前に流速７０ｍｌ／ｍｉｎの２．５％イソフルラン（Ａｂｏｔｔ、ＵＳＡ）によって麻酔した。ラットの関節に骨関節炎を発生させるように、各群のラットの右膝に賦活剤である０．２ｍｌの４％パパイン溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）と０．１ｍｌの０．０３Ｍシステイン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を注射した。各群のラットの左膝に同じ用量の食塩水を注射した。前記の注射をそれぞれ４日目及び７日目に繰り返して行い、最後のパパイン注射の２週間後に、ラットの膝を取って組織学分析を行って骨関節炎の形成を確認した。以下の実験では、更に、樹立されたラットの骨関節炎モデルによって関節内注射を行った。

【0052】

＜ローダミン標識されたＣ５－２４ペプチドの調製及び２光子顕微鏡観察＞

【0053】

Ｃ５－２４ペプチドの骨関節炎に特異的な標的活性を証明するために、骨関節炎の軟骨に結合できないＤＹＬＷＱＹＰＤＩＴＷＨペプチドは、スクランブルペプチドとして用いられた。ローダミン標識されたＣ５－２４ペプチド及びスクランブルペプチドをそれぞれ非骨関節炎（対照群）又は酵素により誘導された骨関節炎ラットの関節に注射した。Ｃ５－２４ペプチド及びスクランブルペプチドを化学的に適宜に合成（ＡＢＩ、ＵＳＡ）して、クリック反応によってＨＥＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ８．０）においてビオチン－ＰＥＧ２－ヨードアセチル基ブリッジ架橋分子によって修飾され、更にストレプトアビジンで標識されたローダミン（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ、ＵＳＡ）と連結して、ｄｄＨ₂Ｏにおいて分画分子量４Ｋによって透析して、標識されていないローダミンを除去した後で、－２０℃の条件下で凍結乾燥させた。４０μｌのＰＢＳにおける１μｇローダミン標識ペプチドのアリコートを３０Ｇ針によって関節内注射した。

【0054】

ラットの膝を注射後の１日目に取り除き、その大腿骨及び脛骨組織を完全に洗浄し、後で、ＰＢＳに浸して、２光子顕微鏡による観察のために３．５ｃｍのディッシュに正確に取り付けた。顕微鏡システムとしてセンター波長８１０ｎｍ、パルス反復周波数７６ＭＨｚの近赤外フェムト秒レーザー（Ｍｉｒａ ９００、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ、ＵＳＡ）によって動作させ、且つパルス幅２００ｆｓでイメージングした。レーザーパワーは、ＳＨＧ及びＴＰＥＦを確かに発生させるように２０ｍＷに制御され、連続照明過程中の光損傷を防止できる。そのため、コラーゲン繊維に由来するＳＨＧの波長は４０５ｎｍであり、コラーゲン、エラスチン、ＦＡＤ及びＮＡＤＨに由来するＴＰＥＦの波長は約４５０～６５０ｎｍであった。全ての画像は、レーザースキャナ（Ｆｌｕｏｖｉｅｗ ３００、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）、レーザーを収束し及び光子を集めるための２つの対物レンズ（ＵＰｌａｎＳＡｐｏ ２０×／０．７５、Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）及びＳＨＧ及びＴＰＥＦをそれぞれ検知するための２つの光電子増倍管（Ｒ３８９６、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）によって得られた。ＳＨＧ及びＴＰＥＦは、バンドパスフィルタ（ＦＦ０１－４０５／１０、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＵＳＡ）と着色ガラス（ＢＧ３９、Ｓｃｈｏｔｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）との組み合わせによって、強励起されたレーザーバックグラウンドから濾過された。次に、ダイクロイックミラー（ＦＦ４３５－Ｄｉ０１、Ｓｅｍｒｏｃｋ、ＵＳＡ）で分離し、遡及的に検出した。ここで、立方体偏光ビームスプリッタ（ＧＴ１０－Ｂ、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＵＳＡ）を半波長のテストボード（ＡＨＷＰ０５Ｍ－９８０、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＵＳＡ）と１／４波長テストボード（ＡＱＷＰ０５Ｍ－９８０、Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ＵＳＡ）に合わせて、それぞれＬＰ及びＣＰイメージングを例示した。集束対物レンズの直線偏光消光比が５０：１よりも大きく且つ円偏光の楕円率（Ｉｍａｘ／Ｉｍｉｎ）が１．１よりも小さくなる場合にのみ、後の双光子イメージングに用いられることができる。取得した画像を、主にＩｍａｇｅＪ／ＦｉＪｉソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡ）によって処理及び分析した。第２高調波の生成した画像で再構成されたコラーゲンＩＩの構造（図１Ａ）は、軟骨細胞（黒い領域）の周りに嵌合した多孔質コラーゲン繊維の相互接続された構造（緑）となっていた。

【0055】

＜Ｃ５－２４ペプチドコンジュゲート超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）の調製及び赤外線スペクトル＞

【0056】

Ｃ５－２４ペプチド及びスクランブルペプチドを化学的に合成し、同時に、直径５０ｎｍのアミノシラン改質ＳＰＩＯ粒子（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍＢＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をスクシンイミジル－［（Ｎ－マレイミドプロピオンアミド）－テトラエチレングリコール］エステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）と架橋して、ｐＨ８．５の炭酸水素ナトリウム緩衝溶液でアミド結合を形成する。次に、ｐＨ７．２の条件下でペプチドにおけるシステイン上のメルカプト基と相互作用によって安定したチオエーテル結合を形成し、分画分子量１０ＫのｄｄＨ₂Ｏで透析を行って遊離型のペプチド、架橋分子、塩類及び脱離基を除去し、減圧状態で更に濃縮し、ＰＢＳで再懸濁させ、２週間を超えない期間、実験のために４℃の環境に保存した。ペプチドのＳＰＩＯへの導入を分析するために、調製されたＳＰＩＯの一部を凍結乾燥して、１：１００ｗｔ．／ｗｔ．の臭化カリウム（ＫＢｒ）によって完全に研磨し、次に赤外分光分析（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ＵＳＡ）に用いるために、２００ｐｏｕｎｄ／ｉｎｃｈ²の圧力によって圧縮してシートに形成した。赤外線スペクトルは、４００～４０００ １／ｃｍの周波数で走査し、それぞれ透過モードでの赤外線スペクトルの特徴群及び指紋領域分子群を記録した。

【0057】

＜ラット骨関節炎の磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）の分析＞

【0058】

結果に示すように、ラットに対して、指定の時点で吸引麻酔を実行してＭＲＩ走査を行った。ＭＲＩ走査は、台湾中央研究院生物医学研究所の４．７Ｔ ＭＲ走査システム（Ｂｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。Ｔ１強調及びＴ２強調の矢状断面は、下記のように設定された。ファストスピンエコー系列で、繰り返し時間は２０００ｍｓであり、回波時間は７２ｍｓであり、切片の厚さは１ｍｍであり、層間ギャップは１ｍｍであり、２５６マトリックスであり、ＴＥは６０であり、ＴＲは２０００であり、視野は６０ｍｍであり、平均数は２であった。体積６０ｍｍの共振器及び直径２ｃｍの表面受信コイルによって画像分解能及び質量を最大化した。ＭＲＩ断層スキャナのＤＩＣＯＭｓとして、Ｏｓｉｒｉｘ ＭＤ（Ｏｓｉｒｉｘ Ｌｔｄ．、ＵＳＡ）によって分析した。

【0059】

＜ミニブタ骨関節炎モデル、Ｃ５－２４ペプチドコンジュゲートＳＰＩＯの関節内注射及び３Ｔ－ＭＲＩ分析＞

【0060】

前十字靭帯（ＡＣＬ）切断術による骨関節炎の樹立に関しては、台湾蘭嶼ミニブタ（９ヶ月、体重約５０～６０ｋｇ）に対してＳｔｒｅｓｎｉｌ（２０ｍｇ／ｋｇ）及び硫酸アトロピン（０．０２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内（ｉ．ｍ．）注射して麻酔し、次に１５分後にＺｏｌｅｔｉｌ（登録商標）５０（４ｍｇ／ｋｇ、Ｖｉｒｂａｃ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ、Ｆｒａｎｃｅ）を筋肉内注射した。膝関節がより均質である群を取得するために、本研究は、雌ブタしか含まなかった。手術過程中に、続けて酸素（流速１．５Ｌ／ｍｉｎ）、亜酸化窒素（流速１Ｌ／ｍｉｎ）及び１％のイソフルランを含むガスによって動物を麻酔した。動物の右後肢を洗浄して滅菌状態で被覆した。セファゾリン（２ｇ）を静脈内注射した後で、膝蓋骨から脛骨粗面まで約７ｃｍの皮膚切り口を切った。その後、膝関節を内側から膝蓋骨靭帯へと開けて膝蓋骨を部分的に脱臼させた。次に、前十字靭帯をクリップで固定し、外科用刃によって遠位端で切断した。前記切断された前十字靭帯の自然治癒を避けるために、別に、電気関節固定機構によって近位に切除した。無菌の０．９％食塩水溶液でよく洗い流した後で、１－０ ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、ＵＳＡ）によって皮膚切り口を層状に縫合した。この後、ミニブタは正常に歩行及び活動できるようになった。ＭＲＩ走査は、台湾ＮＡＲＬａｂｓ機械技術研究センターの３Ｔ ＭＲ走査システム（Ａｃｈｉｅｖａ ｘ ３．０、Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって指定の時点で行われた。Ｔ１強調及びＴ２強調の矢状断面は、下記のように設定された。ファストスピンエコー系列で、繰り返し時間は２０００ｍｓであり、回波時間は７２ｍｓであり、切片厚さは３ｍｍであり、５１２マトリックスであり、ＴＥは２００であり、ＴＲは３５００であり、視野は６０ｍｍであり、平均数は２であった。ＭＲＩ断層スキャナのＤＩＣＯＭｓとして、Ｏｓｉｒｉｘ ＭＤ（Ｏｓｉｒｉｘ Ｌｔｄ．、ＵＳＡ）によって分析した。

【0061】

＜Ｃ５－２４ペプチド及びスクランブルペプチドとコンジュゲートするヒアルロン酸（ＨＡ）の調製＞

【0062】

ペプチドとコンジュゲートするＨＡは前記のように合成したが、僅かに修正した。つまり、まずＭｅＨＡを、無水メタクリル酸（９４％、Ｍ．Ｗ．１５４．１７；Ｓｉｇｍａ）と１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＨＡ（ヒアルロン酸ナトリウム粉末、分子量約１１０～１５０ｋＤａ、キッコーマン株式会社）からｐＨ８の脱イオン水で反応させて合成して、透析（分画分子量６～８ｋＤａ）によって精製して凍結乾燥させた。中間体ＭｅＨＡのマクロモノマーのメタクリル化の効率を¹Ｈ ＮＭＲによって推定した。Ｃ５－２４ペプチド及びスクランブルペプチドの何れも、Ｃ端にシステイン残基があるので、メルカプト基のＭｉｃｈａｅｌ－Ａｄｄｉｔｉｏｎ反応とＭｅＨＡ反応を可能にした。ＭｅＨＡマクロモノマー及びペプチドをトリエタノールアミン緩衝食塩水（ＴＥＯＡ ｂｕｆｆｅｒ、０．２ Ｍ ＴＥＯＡ、０．３Ｍ ｔｏｔａｌ ｏｓｍｏｌａｒｉｔｙ、ｐＨ８．０）に溶解させて、ペプチドコンジュゲートを行うように３７℃で一晩維持した。ペプチドにコンジュゲートしたＨＡをカットオフ分子量１２ＫのｄｄＨ₂Ｏにおいて透析して、遊離型のペプチド、ＴＥＯＡ、塩類及びＭＡを除去した後で、更に凍結乾燥させて室温で保存した。ＨＡにコンジュゲートしたペプチドを０．１Ｍの酸において溶解させて、¹Ｈ ＮＭＲを行ってペプチドのコンジュゲート効率を推定した。

【0063】

＜潤滑剤性能の分析＞

【0064】

大腿骨から集めたヒト関節軟骨サンプルを調製して潤滑に用いる試験として、以前の刊行物の内容を僅かに修正した。中国医薬大学及び付属医院研究倫理委員会の厳格な監督の下で、人工膝関節全置換術を受けた患者からヒト骨関節炎の軟骨サンプル（ＩＲＢ番号ＣＭＵＨ１０８－ＲＥＣ１－０４６とＴ－ＣＭＵ－２３７２８）を切り取って、解剖の過程中に関節の表面を損傷させないように気を付けた。単一の患者の骨関節炎の軟骨表層を無傷にして、打ち抜いて切断して、それぞれ直径８．０ｍｍ及び６．０ｍｍの円盤を取得し、且つレオメーターにおいて摩擦計測を行う場合に軟骨の深層しか切断せずに、１つを取得して特別に設計された試験モジュールの金属反面に接着した。軟骨としては、新鮮なものを使用し、且つその表面潤滑性能を変えないように、凍結もせず、プロテアーゼ阻害剤も添加されなかった。サンプルをＰＢＳにおいて激しく一晩洗浄して、軟骨表面に残されたすべての潤滑液を完全に枯渇させて、少なくとも３群に分けた。結果に示すように、軟骨円盤を１ｍｌの最初のＨＡ又はペプチド変性のＨＡ（ＰＢＳにおける１％ＨＡ）で２時間プレインキュベートして、非変性のＨＡ又はペプチド変性のＨＡと軟骨円盤とを結合させ、次にそれを試験モジュールにおける１０ｍｌのＰＢＳに浸して、摩擦試験に用いられるようにレオメーター（ＨＲ－１、ＴＡ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．、ＵＳＡ）に取り付けた。

【0065】

製造元の指示によると、レオメーターは、標準法によって初期値を「０」にセットし、次に、サンプルをレオメーターに担持した後で、電子キャリパーによって軟骨サンプルの初期高さを算出した。サンプルを平行平板構成によってシアノアクリレート接着剤を介して頂上部及び底部のレオメーター固定装置に接着した。軟骨及び金属固定装置の表面に、１層の接着剤が薄く接着された。６．０ｍｍのサンプル表面が８．０ｍｍの表面の頂上部に位置決めされていた。サンプル表面間の不十分な接触、荷重値の変動を避け、高さ計測の誤差を最小限にするために、０．０１Ｎの荷重値になるまで、頂上部のサンプルを低下させて底部のサンプルに押し付けた。レオメーターの自動的に感知した対応記録高さを歪み量の算出に用いた。器具は、総軟骨厚さを記録して約１４％圧縮時の高さを算出するように設定された。ヒト骨関節炎の軟骨サンプルは、全厚さが約２．５～３．５ｍｍの範囲にあり、乾燥しないように、保護カバーの被覆されたＨＡ／ＰＢＳ溶液（１０ｍＬ）による水浴において試験された。各サンプルの適切な整列及び表面不正をすべて検査し、平坦表面を有するサンプルによって実験した。サンプルを試験潤滑剤に浸して元の全高さの８６％まで圧縮させ、且つ各方向において０．３ｍｍ／ｓの効果的な摺動速度で２回転して前処理をし、前記速度は角速度に環状の有効半径Ｒ_eff＝２／３［（Ｒｏ³－Ｒｉ³）／（Ｒｏ²－Ｒｉ²）］を乗算すると定義された。前記の前処理を２回以上繰り返して、後で３６００秒間の応力緩和期間にして、圧縮された軟骨における液体加圧を完全に解消させた。各実験群の平衡垂直応力データに対して記録と計測を行った。潤滑試験を１４の段階に分けて行われた。最初の２つの段階は、整理又は事前カット段階として、無視されてもよい。異なる緩和時間の影響を分析するために、段階３、６、９及び１２を行った。サンプルが試験の間に１２００、１２０、１２及び１．２秒間緩和することを許可した。段階４～５、７～８、１０～１１及び１３～１４の期間中に潤滑データを記録した。各段階でも、異なるロータロッド方向及び一定の剪断速度で行った。毎回の試験の過程中にも、トルク（τ）及び軸力（Ｎ）を計測して、μ_k＝τ／（Ｒ_eff×Ｎ）の公式に基づいて動摩擦係数μ_kの瞬間的測定値を求めた。アライメント用の平均μ_kは、瞬間的μ_k値に対して、各方向での２回目の回転で平均値を取って生成された。静摩擦係数は、試験の起動期間に最大トルク値で瞬間的μ_s＝τｍａｘ／（Ｒ_eff×Ｎ）として算出された。実験後、軟骨表面の約１４％の圧縮による中央の窪みを検証した。

【0066】

＜ラット間葉性幹細胞の単離、及びＳＰＩＯで標識されＣ５－２４ペプチドにコンジュゲートしたＨＡの伝達＞

【0067】

ラット間葉性幹細胞は、前記のように単離され、増幅される。つまり、２匹の８～１０週齢のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雌性ラット（ＢｉｏＬＡＳＣＯ Ｔａｉｗａｎ Ｃｏ Ｌｔｄ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）から集めた大腿骨の軟組織を無菌的に単離した。骨髓における単核細胞を密度勾配遠心法によって単離して完全培地（ＣＣＭ：１６．６％のウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び２ｍＭのＬ－グルタミンのα－ＭＥＭを含む）に懸濁させ、次に１×１０⁵／ｃｍ²の密度によってディッシュに播種した。２４時間後、培地を洗浄及び交換することにより、非接着性細胞を除去した。細胞がサブコンフルエントとなる場合は、細胞（継代０）を集めて更に継代培養した。次に、細胞を１００細胞／ｃｍ²の密度でＣＣＭに植えて成長させて、培地を毎週２回交換した。この研究に使用された間葉性幹細胞は、３～４継代であった。

【0068】

超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）で標識された間葉性幹細胞の点で、５０μｇ／ｍＬのＳＰＩＯ（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ ＧｍｂＨ、Ｇｅｍａｎｙ）と０．７５μｇ／ｍＬのポリ－Ｌ－リジン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を培地で予混合させ、室温で１時間放置した。ＳＰＩＯナノ粒子を内在化するために、間葉性幹細胞をウェルあたり４×１０⁴個の細胞の密度で６ウェルプレートに播種し、２４時間成長させた後で、ＰＢＳで完全に洗浄した。次に、間葉性幹細胞をマイクロチューブに集めて、１×１０⁶個の細胞／２００μｌの濃度で３７℃の条件下で無血清培地における２％のＣ５－２４ペプチドコンジュゲートＨＡと一緒に３０分間インキュベートした。関節腔内注射の点で、ＨＡ封入の間葉性幹細胞の体積を、２５μｌに１×１０⁶個の細胞を含むまで減少させて、骨関節炎ラットの膝関節の滑液包に精密に注射した。

【0069】

＜組織学、免疫細胞蛍光と免疫組織化学分析及び共焦点顕微鏡観察＞

【0070】

ＨＡ封入の間葉性幹細胞移植の組織学分析の点で、結果に示すように、ラットを移植後の時点で犠牲死させて膝関節全体を切除し、膝関節を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含むＰＢＳによって固定し、次に０．５ＭのＥＤＴＡで２週間脱灰してパラフィンに包埋して、矢状方向に沿って５μｍの厚さに連続切片した。標準法によって調製された大腿骨の中央の連続切片に対して、Ｈ&Ｅ染色、プルシアンブルー染色及びサフラニンＯ染色を行って、位相差顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）によって観察した。Ｈ&Ｅ染色の点で、脱パラフィンのスライドに対して連続して再水和処理を行って、Ｌｉｌｌｉｅ Ｍａｙｅｒヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で１０分間染色し、またエオシンＹ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で３０秒間染色し、最後に一連の脱水、洗浄及び固定を行った。プルシアンブルー染色されたガラススライドの調製は、Ｈ&Ｅ染色に類似し、再水和されたガラススライドを５％のフェロシアン化カリウムを含む１０％のＨＣｌ溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）で２０分間染色し、またファストレッド（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ）で対比染色し、最後に脱水して定型し、洗浄して樹脂によってゲル及びスライドを固定した。サフラニンＯ染色の点で、再水和されたスライドをまず０．０５％のファストグリーン（Ｆａｓｔ Ｇｒｅｅｎ）溶液で３分間染色し、その後、０．１％のサフラニンＯ染色溶液で５分間染色し、最後に、洗浄して樹脂ゲルによって固定した。

【0071】

ＨＡ封入の間葉性幹細胞の共焦点顕微鏡観察に関しては、ＨＡをメタクリル化させてＰＢＳで調製された２％のＡｌｅｘａ－４８８蛍光染料とコンジュゲートさせた。間葉性幹細胞をマイクロチューブに集めて製造元の説明に基づいてＤｉｌ３蛍光染料で標識（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）し、３７℃のＨＡ溶液において３０分間インキュベートした。その後、それをガラススライドに滴下して、直ちに共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）によって観察し、その後、ＩｍａｇｅＪ Ｆｉｊｉ（ＮＩＨ）によって３Ｄ画像を再構成した。

【0072】

＜親和性吸着、液体クロマトグラフィータンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）及びＥＬＩＳＡによるＣ５－２４ペプチドの標的タンパク質の同定＞

【0073】

Ｃ５－２４ペプチド鎖の結合先を同定するために、ヒト骨関節炎の軟骨サンプルを、親和性吸着のために均質化した。まず、ＰＢＳにおける１ｍｇ／ｍｌのビオチン変性されたＣ５－２４ペプチドを軟骨均質化液に添加して、４℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペプチド－と標的タンパク質とを架橋させるように、ＤＴＳＳＰ溶液を最終濃度が２ｍＭになるまで加えた。前記反応混合物を室温で３０分間回転しながらインキュベーションした。前記反応系を１ＭのＴｒｉｓ塩基によって停止させた。第１の溶解緩衝溶液（１００ｍＭの酢酸トリスにおける１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）によって４℃で軟骨細胞を２４時間溶解した後で溶解物を遠心分離し、次に第２の溶解緩衝溶液（５０ｍＭ酢酸ナトリウムにおける４Ｍの塩酸グアニジン、６５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．８）によって４℃で２４時間再反応した。遠心分離後、残した塩酸グアニジンを確実に除去するように、グアニジニウム抽出物と１００％のアルコール（体積比５：１）を－２０℃で１６時間混合させた。次に１６,０００×ｇ及び４℃の条件下で４５分間遠心分離して、標的タンパク質を分層して沈殿させてから、９０％のアルコールによって沈殿物を洗浄して乾燥させ、１００μｇ／ｍＬのペプシンを含む１００ｍＭの酢酸によって再構成した。ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）をタンパク質溶解物に加えて、１時間よく混合した。免疫磁気分離法によってペプチド－タンパク質複合体を抽出可能であった。最後、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で精製されたタンパク質を単離して、ＳｉｌｖｅｒＱｕｅｓｔ銀染色キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって銀染色を行った。

【0074】

染色されたタンパク質バンドを小片に切って、５０％のＡＣＮを含む１０ｍＭの炭酸水素アンモニウム（ＡＢＣ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）によって５分間洗浄することを３回繰り返した。ゲル断片を１００％のＣＡＮによって脱水して、また１ｎｇ／μｌのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を含む２５ｍＭのＡＢＣ溶液（ｐＨ８．２）によって再水和してから、３７℃で一晩インキュベートした。分解後、トリプシンペプチドを、１％のＦＡを含む５０％ＡＣＮ溶液によってゲルから抽出して、遠心濃縮機によって乾燥させた。ペプチド断片をＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって同定した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、イオントラップ質量分析計（ＨＣＴｕｌｔｒａ ＰＴＭ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）をＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ｎａｎｏＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）にオンライン接続させることで運行された。サンプルを吸着カラム（Ｃ１８、５μｍ、１ｍｍ×５ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）に注入して、流速３００ｎｌ／ｍｉｎで逆相カラム（Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８、３μｍ、７５μｍ×１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を通過させてオンライン分離した。ペプチドは、６分間内にＨ₂Ｏ／ＡＣＮの勾配２％～４０％で溶剤Ｂ（１００％のＡＣＮ、０．１％のＦＡ）から溶出され、２４分間内に４０％～７０％で溶剤Ｂから溶出された。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳの走査範囲は、それぞれ４００～１６００ｍ／ｚ及び１００～２５００ｍ／ｚであった。ＥＬＩＳＡ検証された後で、ＭＡＳＣＯＴ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）及びＴｕｒｂｏＳｅｑｕｅｓｔサーチエンジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によってスイスプロテインデータベースを検索することでタンパク質候補物を同定した。

【0075】

まず、ＥＬＩＳＡプレートを室温で塗工液（０．５ＭのＮａＨＣＯ₃）でのコラーゲンａｌｐｈａ－３（ＶＩ）及びコラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）にて２時間コートし、４℃の条件下で５％の牛乳／ＴＢＳＴによって一晩ブロックした。ビオチン変性されたペプチドをＥＬＩＳＡプレートに加えて、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰのコンジュゲートされたマウス抗Ｍ１３抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってビオチン変性されたペプチドを検知した。ビオチン変性されたペプチドと公知のコラーゲンａｌｐｈａ－３（ＶＩ）又はコラーゲンａｌｐｈａ－１（ＸＩＩ）との結合を、ＨＲＰコンジュゲートのストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。前記ウェルプレートをＰＢＳで洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質Ｏ‐フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ；Ｓｉｇｍａ）と共にインキュベートした。前記反応を３ＮのＨＣｌによって停止させて、酵素免疫測定器によって４９０ｎｍでの吸光度を計測した。

【0076】

＜Ｃ５－２４ペプチドドッキング標的のホモロジーモデリング＞

【0077】

開発者の指示に応じてＤａｓｓａｕｌｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＢＩＯＶＩＡ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｓｔｕｄｉｏ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、Ｒｅｌｅａｓｅ ２０１９、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＵＳＡ）によって分子モデル化して、選択されたファージクローンの軟骨組織での結合標的を更に確認した。つまり、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースから検索されたヒト、マウス及びブタのＣｏｌＸＩＩ基準配列コードは、それぞれＱ９９７１５、Ｑ６０８４７及びＦ１ＲＱＩ０であった。ＢＬＡＳＴ結果からのテンプレート（ＰＤＢ ｃｏｄｅ：１ＦＮＦ、２Ｂ２Ｘ、２ＵＵＲ）に基づいて、ＭＯＤＥＬＥＲによって３つのヒトＣｏｌＸＩＩホモロジーモデルの異なる部分を樹立した。第１のヒトＣｏｌＸＩＩモデルの長さはＬ１３８５～Ｓ２２８５であり、テンプレート１ＦＮＦと３０％の同一性を有し、これはフィブロネクチンの構造を示しており、且つ高度に保存された構造トポロジーのためモデル化は可能であった。第２及び第３のヒトＣｏｌＸＩＩモデルはそれぞれＫ２３２１～Ｌ２５１３及びＳ２５０６～Ｐ２７２４であり、それぞれテンプレート２Ｂ２Ｘ及び２ＵＵＲと３１％及び３６％の配列同一性を有していた。全てのホモロジーモデルに対してまずＰＤＦ全エネルギー、ＤＯＰＥ（タンパク質エネルギーの離散最適化）、スコア検証及びＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ画像検査をして、合理的な主鎖及び側鎖構造を取得するように構造を最適化した。ＩＨＣで最も有望な結果のため、最も代表的なタンパク質テンプレートは、Ｃ５－２４及びＣ５－９１ペプチド鎖の結合部位及び構造の予測に用いられた。その後、可能な結合領域を検索するように、ＺＤＯＣＫによってタンパク質－ペプチドドッキングを行った。Ｚ_Ｄｏｃｋスコア及びＥ_Ｒ_Ｄｏｃｋスコアは、ペプチドと標的タンパク質テンプレートとのドッキング能力及び正確性を検証するために用いられた。

【0078】

＜統計分析＞

【0079】

前記した一連のデータを平均値±ＳＤと表し、スチューデントのｔ検定又は単一因子独立変異データ分析（ＡＮＯＶＡ）によって統計アライメントを行い、ｐ値＜０．０５を有意とみなした。全ての計算も、中国医薬大学により承認された統計分析システム（ＳＡＳ）によって行われた。示された全てのインビボのデータは、何れも独立した実験を少なくとも３回実施したことを表す。

【0080】

本発明を実施形態によって以上の通りに開示したが、他の実施形態も可能である。そのため、特許請求の範囲の精神や範囲は、含まれる実施例の記述に限定されない。

【0081】

当業者であれば、本発明の精神や範囲から逸脱せずに、各種の変更や修正を加えてもよいので、本発明の保護範囲は特許請求の範囲の定めたものを基準とする。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【配列表】

0007471688000001.app