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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】
(24)【登録日】2024-04-12
(45)【発行日】2024-04-22
(54)【発明の名称】Ｓｙｋ阻害剤の塩及びその結晶形
(51)【国際特許分類】
C07D 405/14 20060101AFI20240415BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20240415BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240415BHJP
A61P 11/02 20060101ALI20240415BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240415BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240415BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240415BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240415BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240415BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240415BHJP
【ＦＩ】
C07D405/14 CSP
A61K31/4709
A61P11/00
A61P11/02
A61P19/02
A61P25/00
A61P29/00
A61P35/02
A61P37/06
A61P37/08
【請求項の数】
20
(21)【出願番号】P 2021533742
(86)(22)【出願日】2019-12-13
(65)【公表番号】
(43)【公表日】2022-02-09
(86)【国際出願番号】 CN2019125157
(87)【国際公開番号】W WO2020119785
(87)【国際公開日】2020-06-18
【審査請求日】2022-11-29
(31)【優先権主張番号】201811533849.X
(32)【優先日】2018-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(73)【特許権者】
【識別番号】516089784
【氏名又は名称】チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉａ Ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３６９ Ｙｕｚｈｏｕ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２２０６２ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ウェンユアン
(72)【発明者】
【氏名】ワン，ホンジアン
(72)【発明者】
【氏名】ツァン，ミン
(72)【発明者】
【氏名】リウ，フェイ
(72)【発明者】
【氏名】シャン，レイ
(72)【発明者】
【氏名】フー，ツォンユアン
(72)【発明者】
【氏名】グオ，ユフイ
(72)【発明者】
【氏名】リウ，ヤンロン
(72)【発明者】
【氏名】ツァン，フイフイ
【審査官】長谷川 莉慧霞
(56)【参考文献】
【文献】特表２０２０－５２３３２８（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２００６－５１９８４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１８－５２２８７１（ＪＰ，Ａ）
【文献】特表２０１７－５３７９６９（ＪＰ，Ａ）
(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)
Ｃ０７Ｄ
Ａ６１Ｋ
Ａ６１Ｐ
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＡＲＰＡＴ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ化合物の塩酸塩。【化1】
【請求項2】
式Ｉ化合物の１：１塩酸塩である、請求項１に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項4】
Ａ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、４．９°±０．２°、１０．１°±０．２°、１２．２°±０．２°、１５．５°±０．２°、１９．６°±０．２°及び２３．８°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項３に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項5】
Ａ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、４．９°±０．２°、１０．１°±０．２°、１２．２°±０．２°、１５．５°±０．２°、１７．８°±０．２°、１９．２°±０．２°、１９．６°±０．２°、２２．９°±０．２°、２３．８°±０．２°及び２５．６°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項４に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項6】
Ａ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、４．９°±０．２°、９．６°±０．２°、１０．１°±０．２°、１２．２°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．３°±０．２°、１７．８°±０．２°、１９．２°±０．２°、１９．６°±０．２°、２０．４°±０．２°、２２．９°±０．２°、２３．３°±０．２°、２３．８°±０．２°、２５．６°±０．２°、２６．８°±０．２°、２７．４°±０．２°、２９．０°±０．２°及び３６．８°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項５に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項7】
Ａ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、４．９°±０．２°、９．６°±０．２°、１０．１°±０．２°、１２．２°±０．２°、１４．４°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．３°±０．２°、１７．３°±０．２°、１７．８°±０．２°、１９．２°±０．２°、１９．６°±０．２°、２０．４°±０．２°、２２．９°±０．２°、２３．３°±０．２°、２３．８°±０．２°、２５．６°±０．２°、２６．８°±０．２°、２７．４°±０．２°、２８．３°±０．２°、２９．０°±０．２°、３１．２°±０．２°、３１．６°±０．２°、３１．９°±０．２°、３２．３°±０．２°、３３．０°±０．２°、３４．３°±０．２°及び３６．８°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項６に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項8】
Ａ型結晶であり、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）チャートにおいて２７２℃±５℃に吸収ピークを有することを特徴とする、請求項４～７のいずれか１項に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項9】
Ｂ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、５．２°±０．２°、１０．４°±０．２°、１４．７°±０．２°、１５．５°±０．２°及び２５．３°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項３に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項10】
Ｂ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、５．２°±０．２°、１０．４°±０．２°、１４．７°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．５°±０．２°、２０．７°±０．２°、２１．５°±０．２°、２２．８°±０．２°、２５．３°±０．２°及び２７．９°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項９に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項11】
Ｂ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、５．２°±０．２°、１０．４°±０．２°、１４．７°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．５°±０．２°、１７．１°±０．２°、１７．５°±０．２°、２０．３°±０．２°、２０．７°±０．２°、２１．５°±０．２°、２２．８°±０．２°、２３．８°±０．２°、２４．７°±０．２°、２５．３°±０．２°、２７．５°±０．２°、２７．９°±０．２°及び３１．２°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項１０に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項12】
Ｂ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、５．２°±０．２°、１０．４°±０．２°、１３．１°±０．２°、１４．７°±０．２°、１５．５°±０．２°、１６．５°±０．２°、１７．１°±０．２°、１７．５°±０．２°、２０．０°±０．２°、２０．３°±０．２°、２０．７°±０．２°、２１．５°±０．２°、２２．８°±０．２°、２３．２°±０．２°、２３．８°±０．２°、２４．７°±０．２°、２５．３°±０．２°、２５．９°±０．２°、２６．２°±０．２°、２７．５°±０．２°、２７．９°±０．２°、２８．２°±０．２°、２９．７°±０．２°、３０．０°±０．２°、３０．３°±０．２°、３１．２°±０．２°、３１．７°±０．２°、３２．３°±０．２°、３４．５°±０．２°、３４．９°±０．２°及び３６．６°±０．２°に回折ピークを有することを特徴とする、請求項１１に記載の式I化合物の塩酸塩の結晶。
【請求項13】
請求項１又は２に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の混合物であって、請求項４～８のいずれか１項に記載の前記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶が前記混合物の重量の５０％以上、又は７５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上を占める、前記混合物。
【請求項14】
請求項１又は２に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の混合物であって、請求項９～１２のいずれか１項に記載の前記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶が前記混合物の重量の５０％以上、又は７５％以上、又は９０％以上、又は９５％以上を占める、前記混合物。
【請求項15】
請求項１若しくは２に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩、又は請求項３～１２のいずれか１項に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶、又は請求項１３若しくは１４に記載の混合物を含む、医薬組成物。
【請求項16】
請求項１若しくは２に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩、又は請求項３～１２のいずれか１項に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶、又は請求項１３若しくは１４に記載の混合物、又は請求項１５に記載の医薬組成物の、Ｓｙｋ受容体関連疾患を治療する医薬品の製造における使用。
【請求項17】
前記Ｓｙｋ受容体関連疾患は癌又は炎症性疾患から選ばれる、請求項１６に記載の使用。
【請求項18】
前記Ｓｙｋ受容体関連疾患は、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤｓ）、アレルギー誘発性炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、急性炎症反応、アレルギー性疾患又は多発性嚢胞腎から選ばれる、請求項１６又は１７に記載の使用。
【請求項19】
式Ｉ化合物を予熱された溶媒に加えて、次に、溶液が澄明となるまで別の溶媒を滴下し、保温しながら撹拌するステップ（１）と、ステップ（１）の溶液に希塩酸を滴下し、保温しながら一晩撹拌するステップ（２）と、
ステップ（２）の溶液に溶媒を緩やかに滴下し、撹拌して固体を析出させ、ろ過して乾燥させ、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶を得るステップ（３）とを含む、請求項４～８のいずれか１項に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶の製造方法。
【請求項20】
溶媒に式Ｉ化合物を加えて、撹拌して溶解させるステップ（１）と、ステップ（１）の溶液に希塩酸を加え、一晩撹拌するステップ（２）と、
ステップ（２）の溶液を遠心分離し、固体を乾燥させ、式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶を得るステップ（３）とを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の式Ｉ化合物の塩酸塩の結晶の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
「関連出願の相互参照」
本願は、２０１８年１２月１４日に中華人民共和国国家知識産権局に提出された中国特許出願第２０１８１１５３３８４９．Ｘ号の優先権及び利益を主張し、前記出願で開示された内容は引用により全体としてここに組み込まれている。
本願は、２０１８年１２月１４日に中華人民共和国国家知識産権局に提出された中国特許出願第２０１８１１５３３８４９．Ｘ号の優先権及び利益を主張し、前記出願で開示された内容は引用により全体としてここに組み込まれている。
【0002】
本願は、医薬品化学分野に属し、Ｓｙｋ阻害剤の塩及びその結晶形に関し、より具体的には、５－フルオロ－１－メチル－３－（（５－（４－（オキセタン－３－イル）ピペラジン－１－イル）ピリジン－２－イル）アミノ）－６－（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）キノリン－２（１Ｈ）－オン塩酸塩及びその結晶形、その製造方法、医薬組成物、及び使用に関する。
【背景技術】
【0003】
脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ：ｓｐｌｅｅｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ）は細胞内チロシンプロテインキナーゼの一種であり、ＺＡＰ７０プロテインキナーゼファミリーのメンバーである。ＳｙｋはＢ細胞の早期発育、リンパ細胞個体の発育、成熟Ｂ細胞の機能発揮に重要な役割を果たしている。これらのプロセスにおいて、それは多種のシグナル伝達経路に関与し、しかもＳｒｃキナーゼのリン酸化を介さずに作用を発揮することができる。Ｓｙｋは造血幹細胞に一般的に発現することに加えて、非造血細胞、例えば上皮細胞、肝細胞、線維芽細胞、神経細胞や乳腺組織のいずれにも発現し、且つ多種の機能を備えている。
【0004】
ヒトの多くの疾患、例えばアレルギー反応、喘息、炎症や自己免疫性疾患にＳｙｋ ＰＴＫの機能障害が認められ、多くの研究により、Ｓｙｋは急性又は慢性炎症の重要な媒体であることを示した。いくつかのよく見られるＢ細胞悪性腫瘍にＳｙｋの活性化が存在し、例えば濾胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫やＢ細胞慢性リンパ球性白血病のいずれでも、抗原非依存性リン酸化Ｓｙｋが検出される。研究者は、濾胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫細胞中のＳｙｋを阻害することにより、下流シグナル伝達分子のリン酸化レベルを下げ、それによって腫瘍細胞の増殖と生存を阻害できることを発見した。また、骨髄異形成症候群や末梢Ｔ細胞リンパ腫においてＳｙｋの転座が認められ、このキナーゼが原癌遺伝子として機能することがさらに示唆された。したがって、Ｓｙｋ活性の阻害は、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病を含む特定の種類の癌の治療に使用できる。
【発明の概要】
【0005】
式Ｉに示される化合物は、化学名が、５－フルオロ－１－メチル－３－（（５－（４－（オキセタン－３－イル）ピペラジン－１－イル）ピリジン－２－イル）アミノ）－６－（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）キノリン－２（１Ｈ）－オンである。
【化1】
【0006】
本願の一態様は、式Ｉ化合物の塩酸塩を提供する。
【0007】
いくつかの実施態様では、式Ｉ化合物の塩酸塩は、式Ｉ化合物の１：１塩酸塩（式ＩＩ）である。
【化2】
【0008】
本願の前記式Ｉ化合物塩酸塩は、結晶形態又はアモルファス形態、好適には結晶形態である。
【0009】
前記式Ｉ化合物塩酸塩の結晶形態は、安定性が高く、吸湿性が低く、優れたインビボ代謝レベル、長い半減期を有し、且つ、脾臓チロシンキナーゼに対する阻害活性に優れ、物理的性質、安全性及び代謝安定性のいずれにおいても優れた性質を有し、医薬品としての価値が高い。
【0010】
いくつかの実施態様では、本願の式Ｉ化合物の塩酸塩は、Ａ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約４．９°、１０．１°、１２．２°、１５．５°、１９．６°及び２３．８°に回折ピークを有することを特徴とし、代表例として、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約４．９°、１０．１°、１２．２°、１５．５°、１７．８°、１９．２°、１９．６°、２２．９°、２３．８°及び２５．６°に回折ピークを有し、代表例として、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約４．９°、９．６°、１０．１°、１２．２°、１５．５°、１６．３°、１７．８°、１９．２°、１９．６°、２０．４°、２２．９°、２３．３°、２３．８°、２５．６°、２６．８°、２７．４°、２９．０°及び３６．８°に回折ピークを有し、代表例として、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約４．９°、９．６°、１０．１°、１２．２°、１４．４°、１５．５°、１６．３°、１７．３°、１７．８°、１９．２°、１９．６°、２０．４°、２２．９°、２３．３°、２３．８°、２５．６°、２６．８°、２７．４°、２８．３°、２９．０°、３１．２°、３１．６°、３１．９°、３２．３°、３３．０°、３４．３°及び３６．８°に回折ピークを有する。
【0011】
本願の一実施態様として、本願の式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶のＸ－線粉末回折スペクトルにおける特徴ピークのピーク位置及び強度を表１に示す。
【0012】
【表1】
【0013】
本願の一実施態様では、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶のＸ－線粉末回折パターンが図１に示される。
【0014】
本願の一実施態様では、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）チャートにおいて約２７２℃に吸収ピークを有する。
【0015】
本願の一実施態様では、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）チャートが図２に示される。
【0016】
本願の一実施態様では、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の熱重量分析（ＴＧＡ）図が図３に示される。
【0017】
いくつかの実施態様では、本願の式Ｉ化合物の塩酸塩はＢ型結晶であり、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約５．２°、１０．４°、１４．７°、１５．５°及び２５．３°に回折ピークを有することを特徴とし、代表例として、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約５．２°、１０．４°、１４．７°、１５．５°、１６．５°、２０．７°、２１．５°、２２．８°、２５．３°及び２７．９°に回折ピークを有し、代表例として、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約５．２°、１０．４°、１４．７°、１５．５°、１６．５°、１７．１°、１７．５°、２０．３°、２０．７°、２１．５°、２２．８°、２３．８°、２４．７°、２５．３°、２７．５°、２７．９°及び３１．２°に回折ピークを有し、代表例として、Ｘ－線粉末回折スペクトルにおいて、２θ値で表わされると、約５．２°、１０．４°、１３．１°、１４．７°、１５．５°、１６．５°、１７．１°、１７．５°、２０．０°、２０．３°、２０．７°、２１．５°、２２．８°、２３．２°、２３．８°、２４．７°、２５．３°、２５．９°、２６．２°、２７．５°、２７．９°、２８．２°、２９．７°、３０．０°、３０．３°、３１．２°、３１．７°、３２．３°、３４．５°、３４．９°及び３６．６°に回折ピークを有する。
【0018】
本願の一実施態様として、本願の式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶のＸ－線粉末回折スペクトルにおける特徴ピークのピーク位置及び強度を表２に示す。
【0019】
【表2】
【0020】
本願の一実施態様では、式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶のＸ－線粉末回折パターンが図４に示される。
【0021】
別の態様によれば、本願は、式Ｉ化合物を予熱された溶媒に加えて、次に、溶液が澄明となるまで別の溶媒を滴下し、保温しながら撹拌するステップ（１）と、ステップ（１）の溶液に希塩酸を滴下し、保温しながら一晩撹拌するステップ（２）と、ステップ（２）の溶液に溶媒を緩やかに滴下し、撹拌して固体を析出させ、ろ過して乾燥させ、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶を得るステップ（３）とを含む、式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造方法を提供する。
【0022】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（１）の前記予熱された溶媒は、水、酢酸エチル、ジクロロメタン、エタノール、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン又はメチルｔ－ブチルエーテルから選ばれ、好ましくは水又は酢酸エチルである。
【0023】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（１）の前記予熱された溶媒の温度は、３０～４０℃、好ましくは３５～３８℃である。
【0024】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（１）の前記別の溶媒は、ギ酸、酢酸、プロピオン酸又はシュウ酸から選ばれ、好ましくはギ酸である。
【0025】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（１）の前記式Ｉ化合物と別の溶媒とのモル体積比は１ｍｍｏｌ：０．８～１．５ｍＬ、好ましくは１ｍｍｏｌ：０．８～１．２ｍＬ、より好ましくは１ｍｍｏｌ：０．８～１．０ｍＬである。
【0026】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（１）の前記予熱された溶媒と別の溶媒との体積比は、（０．５～３）：１、好ましくは（０．５～２）：１である。
【0027】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（２）の前記希塩酸中の塩酸とステップ（１）における式Ｉ化合物とのモル比は、（１～３）：１、好ましくは（１～２）：１である。
【0028】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（２）の前記希塩酸の濃度は、１～２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１～１．２ｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸は市販濃塩酸を水で希釈したものであるか、又は市販濃塩酸と他の溶媒との混合溶液であり、前記別の溶媒はステップ（１）で予熱された溶媒と同種類である。
【0029】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（３）の前記溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノール、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、エチレングリコール又はプロピレングリコールから選ばれ、好ましくはエタノールである。
【0030】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（３）の前記溶媒とステップ（１）における式Ｉ化合物との体積モル比は、２～１０ｍＬ：１ｍｍｏｌ、好ましくは４～９ｍＬ：１ｍｍｏｌである。
【0031】
上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶の製造において、ステップ（１）とステップ（２）の前記「保温する」とは、撹拌温度がステップ（１）で予熱された溶媒と同じ温度に保持されることを意味する。
【0032】
別の態様によれば、本願は、溶媒に式Ｉ化合物を加えて、撹拌して溶解させるステップ（１）と、ステップ（１）溶液に希塩酸を加え、一晩撹拌するステップ（２）と、ステップ（２）の溶液を遠心分離し、固体を乾燥させ、式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶を得るステップ（３）とを含む、式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶の製造方法をさらに提供する。
【0033】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶の製造において、ステップ（１）の前記溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸、アセトン、アセトニトリルから選ばれるか、又は上記任意の２種の混合溶媒であり、好ましくはエタノール、酢酸、アセトン又はこれらの任意の２種の混合溶媒であり、さらに好ましくはエタノール、エタノールと酢酸の混合溶媒又はアセトンと酢酸の混合溶媒である。
【0034】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶の製造において、ステップ（１）における式Ｉ化合物と溶媒とのモル体積比は、１ｍｍｏｌ：１０～４０ｍＬ、好ましくは１ｍｍｏｌ：２０～３５ｍＬである。
【0035】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶の製造において、ステップ（１）の溶媒は、酢酸とエタノールの混合溶媒又は酢酸とアセトンの混合溶媒であり、ここで、酢酸とエタノールの体積比又は酢酸とアセトンの体積比は１：（５～１０）、好ましくは１：（５～８）である。
【0036】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶の製造において、ステップ（１）における式Ｉ化合物とステップ（２）における塩酸とのモル比は、１：（１～５）、好ましくは１：（１～３．５）である。
【0037】
本願の一実施態様では、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶の製造において、ステップ（２）の前記希塩酸の濃度は１～２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは１～１．２ｍｏｌ／Ｌであり、前記希塩酸は市販濃塩酸を水で希釈したものである。
【0038】
別の態様によれば、本願は式Ｉ化合物の塩酸塩を提供し、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＡ型結晶は前記式Ｉ化合物の塩酸塩の重量の５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める。前記式Ｉ化合物の塩酸塩には、式Ｉ化合物の塩酸塩の他の結晶又は非結晶形態がさらに少量含有されてもよく、例えば、少量の式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶が含有される。
【0039】
別の態様によれば、本願は式Ｉ化合物の塩酸塩を提供し、上記式Ｉ化合物の塩酸塩のＢ型結晶は前記式Ｉ化合物の塩酸塩の重量の５０％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上を占める。
【0040】
別の態様によれば、本願は、治療有効量の上記式Ｉ化合物の塩酸塩を含む医薬組成物を提供し、前記医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体又は他の賦形剤を含んでもよい。
【0041】
別の態様によれば、本願は、上記式Ｉ化合物の塩酸塩、又は上記医薬組成物の、Ｓｙｋ受容体関連疾患を治療する医薬品の製造における使用を提供する。
【0042】
別の態様によれば、本願は、治療有効量の上記式Ｉ化合物の塩酸塩、又は上記医薬組成物を必要とする哺乳動物に投与することを含むＳｙｋ受容体関連疾患の治療方法を提供する。
【0043】
別の態様によれば、本願は、哺乳動物におけるＳｙｋ受容体関連疾患を治療する上記式Ｉ化合物の塩酸塩、又は上記医薬組成物を提供する。
【0044】
本願のいくつかの実施態様では、前記哺乳動物はヒトである。
【0045】
本願において、医薬組成物は一定の剤形に作製することができ、投与経路は経口投与、胃腸外投与（皮下、筋肉内及び静脈内を含む）、直腸投与などが好ましい。例えば、経口投与に適した剤形には、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸薬、粉剤、タブレット剤、シロップ剤又は懸濁剤が含まれ、胃腸外投与に適した剤形には、水性又は非水性の注射用溶液又はエマルジョンが含まれ、直腸投与に適した剤形には、親水性又は疎水性担体を用いた座薬が含まれる。必要に応じて、上記の剤形は活性成分の迅速放出、遅延放出又は調節放出に適した剤形に作製することもできる。
【0046】
本願のいくつかの実施態様では、前記Ｓｙｋ受容体関連疾患は、癌又は炎症性疾患から選ばれる。
【0047】
本願のいくつかの実施態様では、前記Ｓｙｋ受容体関連疾患はＢ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、関節リウマチ、アレルギー性鼻炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤｓ）、アレルギー誘発性炎症性疾患、多発性硬化症、自己免疫疾患、急性炎症反応、アレルギー性疾患又は多嚢胞性腎症から選ばれる。
【0048】
本願において、サンプルのＸ－線粉末回折スペクトルは、以下の条件で測定される。器具：Ｂｒｕｋｅｒ Ｄ８ ＡＤＶＡＮＣＥ Ｘ線回折装置；ターゲット：Ｃｕ：Ｋα；波長λ＝１．５４０５６Å；２θ角範囲：４～４０°；スキャン速度１０°／ｍｉｎ；サンプル回転速度：１５ｒｐｍ；Ｃｕターゲット管電圧及び管電流：４０ＫＶ、４０ｍＡ。
【0049】
本願において、ＤＳＣスペクトルは、以下の条件で測定される。器具：ＴＡ Ｑ２０００示差走査熱量計；温度範囲：３０～３００℃；昇温速度：１０℃／ｍｉｎ。
【0050】
本願において、ＴＧＡ熱重量分析は、以下の条件で測定される。器具：ＴＡ Ｑ５０００熱重量分析装置；温度範囲：２５～３００℃；昇温速度：１０℃／ｍｉｎ。
【0051】
なお、Ｘ－線粉末回折スペクトルでは、結晶性化合物から得られる回折パターンは、特定の結晶に対して特徴的であることが多く、（特に低角度における）スペクトルバンドの相対強度は、結晶化条件、粒子径や他の測定条件の違いによって生じる有利な配向効果によって変化する可能性がある。したがって、回折ピークの相対強度は、対象となる結晶に対して特徴的なものではなく、既知の結晶と同一であるか否かを判断する際には、ピークの相対強度よりも相対的な位置に注目すべきである。さらに、任意の所定の結晶について、ピークの位置にわずかな誤差が存在する可能性があり、これは結晶学の分野においても公知なことである。例えば、サンプル分析時の温度変化、サンプル移動や器具のキャリブレーションなどにより、ピークの位置が移動し、２θ値の測定誤差が約±０．２°となることがある。したがって、各結晶構造を決定する際には、この誤差を考慮に入れるべきである。ＸＲＤパターンでは、通常２θ角又は結晶面距離ｄでピーク位置を表し、両者の間には簡単な換算関係ｄ＝λ／２ｓｉｎθがあり、ここでｄは結晶面距離、λは入射Ｘ線の波長、θは回折角を表す。同種化合物の同種結晶に対しては、そのＸＲＤスペクトルのピーク位置が全体的に類似しており、相対強度の誤差が大きい可能性がある。なお、混合物の同定において、含有量の低下などの要因により回折線の一部が欠落することがあり、この場合、高純度サンプルで観察された全スペクトルバンドに依存する必要はなく、１つのスペクトルバンドであっても所定の結晶に特徴的である可能性がある。
【0052】
ＤＳＣは、結晶構造の変化や結晶の融解により結晶が熱を吸収又は放出したときの転移温度を測定する。同種化合物の同種結晶に対しては、連続分析において、熱転移温度と融点の誤差は典型的には約５℃以内、通常は約３℃以内、又は約２℃以内であり、化合物が所定のＤＳＣピーク又は融点を有するとすると、ＤＳＣピーク又は融点±５℃を意味する。ＤＳＣは、異なる結晶を識別するための補助的な方法を提供する。異なる結晶形態はその異なる転移温度特徴によって識別することができる。なお、混合物の場合、そのＤＳＣピーク又は融点はより広い範囲で変動する可能性がある。さらに、溶融温度は昇温速度と相関関係がある。
【0053】
定義及び説明
本願の明細書及び特許請求の範囲に記載されている場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下の意味を有する。
本願の明細書及び特許請求の範囲に記載されている場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下の意味を有する。
【0054】
「哺乳動物」は、実験室哺乳動物や家庭ペット（例えば猫、犬、豚、羊、牛、ヒツジ、ヤギ、馬、家兎）などの人や家畜、野生哺乳動物などの非飼養哺乳動物を含む。
【0055】
「医薬組成物」という用語は、本願の化合物と、当分野で一般的に受け入れられている、生物学的に活性な化合物をヒトなどの哺乳動物に送達するための媒体との製剤を意味する。前記媒体は、その使用のための薬剤として許容される全ての担体を含む。医薬組成物は、化合物の生物への投与に有利である。
【0056】
「治療有効量」という用語は、無毒であるが所期の効果を達成するのに十分な医薬物又は薬剤の量をいう。有効量の決定は人によって異なり、受けるものの年齢や一般的な状況により決まり、また、特定の活性物質にも決まり、具体的には、適切な有効量は、当業者が通常の試験に基づいて決定することができる。
【0057】
本願において、「薬学的に許容される担体」とは、活性成分とともに投与され、生体に対して明らかな刺激作用がなく、かつ該活性化合物の生物活性及び性能を損なわない担体をいう。担体に関する他の情報については、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,Lippincott,Williams&Wilkins(2005)を参照することができ、この文献の内容は、引用によってここに組み込まれる。
【0058】
本明細書において、特に断らない限り、用語「含む、含み、及び含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は同等物は、オープンな表現であり、挙げられた要素、成分及びステップに加えて、明記されていない他の要素、成分及びステップをカバーすることができることを意味する。
【0059】
説明及び開示の目的のために、全ての特許、特許出願、及び他の特定された刊行物は、引用により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、それらの開示が本願の出願日より前であることのみを理由として提供されるものとする。これらの書類の日付に関する全ての声明又はこれらの書類の内容の記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの書類の日付又はこれらの書類の内容の正確性に関する承認とならない。且つ、如何なる国においても、本明細書におけるこれらの刊行物への引用は、該刊行物がその分野における公知の常識の一部であることについての承認とならない。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】実施例２の式ＩＩの塩酸塩のＡ型結晶のＸ－線粉末回折図（ＸＲＰＤ）である。
【図2】実施例２の式ＩＩの塩酸塩のＡ型結晶の示差走査熱量（ＤＳＣ）図である。
【図3】実施例２の式ＩＩの塩酸塩のＡ型結晶の熱重量分析（ＴＧＡ）図である。
【図4】実施例６の式ＩＩの塩酸塩のＢ型結晶のＸ－線粉末回折図（ＸＲＰＤ）である。
【図5】実験例２式ＩＩの塩酸塩のＡ型結晶の動的水蒸気吸着（ＤＶＳ）図である。
【発明を実施するための形態】
【0061】
以下の具体的な実施例は、当業者が本願をより明確に理解して実施することを可能にすることを目的としている。これらは、本願の範囲を限定するものではなく、本願の例示的な説明及び代表的なものにすぎないと考えるべきである。
【0062】
酸化又は加水分解しやすい原料に関連する全ての操作は、窒素ガス保護下で行われる。特に断らない限り、本願で使用されている原料は、市場で直接購入されたものであり、さらに精製されずに直接使用される。本願で使用されている溶媒は、直接市販されており、特別な処理をせずに直接使用される。化合物は手動又はＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）ソフトウェアによって命名され、市販の化合物にはベンダーカタログ名が使用される。
【0063】
本願は下記略語を使用する。ＤＭＡＰは４－ジメチルアミノピリジンを表し、Ｐｄ２（ｄｂａ）３はトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウムを表し、Ｘａｎｔｐｈｏｓは４，５－ビス（ジフェニルホスフィノ）－９，９－ジメチルキサンテンを表し、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２は［１，１’－ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］パラジウムジクロリドを表す。
【0064】
実施例１：式Ｉ化合物の製造
ステップ１
窒素ガス保護下、０℃で１ａ（５９．００ｇ、４３６．５９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６００ｍＬ）溶液に水素化ナトリウム（１９．２４ｇ、４８０．９９ｍｍｏｌ、６０％純度）を加え、反応液を３０分間撹拌した後、トリフルオロメタンスルホン酸メチル（９３．１４ｇ、５６７．５７ｍｍｏｌ、６２．０９ｍＬ）を加え、１５℃で２時間撹拌し続けた。反応終了後、反応液を飽和塩化アンモニウム（１Ｌ）でクエンチングし、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で３回抽出した。有機相を飽和塩化アンモニウム食塩水（１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過して濃縮させた後、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけて、１ｂを得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.22 - 7.08 (m, 2H), 7.03 (br d, J=3.0 Hz, 1H), 6.86 - 6.73 (m, 1H), 6.58 (d, J=2.5 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H)。
ステップ２
窒素ガス保護下、１ｂ（５５．００ｇ、３６８．７２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（４００ｍＬ）溶液にＮ－ブロモスクシンイミド（６５．６３ｇ、３６８．７２ｍｍｏｌ）を加え、２０℃で１時間撹拌した。上記反応液にＮ－ブロモスクシンイミド（６５．６３ｇ、３６８．７２ｍｍｏｌ）をさらに加え、反応液を６０℃に昇温して１０時間撹拌し続けた。反応終了後、反応液を水（６Ｌ）に注入してろ過し、ろ過ケーキをアセトン（２Ｌ）に溶解してろ過し、ろ過ケーキをアセトン（５００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮させた後、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけて、１ｃを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.72 (dt, J=5.8, 8.2 Hz, 1H), 6.99 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.93 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.15 (s, 3H)。
ステップ３
窒素ガス保護下、１ｃ（３１．０ｇ、１７３．０４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３００ｍＬ）及び水（６００ｍＬ）にＮ－ブロモスクシンイミド（４０．０４ｇ、２２４．９５ｍｍｏｌ）を加え、反応液を１５℃で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液をろ過し、ろ過ケーキを水（３００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて１ｄを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.99 (dd, J=7.3, 8.3 Hz, 1H), 6.98 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.14 (s, 3H)。
ステップ４
窒素ガス保護下、１ｄ（３２．００ｇ、１２４．０１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２５．１ｇ、２４８．０２ｍｍｏｌ）のエタノール（３００ｍＬ）の溶液に、０℃でトリメチルシリルジアゾメタン（２ｍｏｌ／Ｌ、６５．１１ｍＬ）を滴下し、０～１５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を濃縮させ、残留物を酢酸エチル（５００ｍＬ）でスラリー化し、ろ過して、ろ過ケーキを乾燥させ、１ｅを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ= 10.17 (br s, 1H), 7.65 (dd, J=7.5, 9.0 Hz, 1H), 7.30 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 3.69 (s, 3H)。
ステップ５
窒素ガス保護下、０℃でトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１３．４８ｇ、４７．７８ｍｍｏｌ）を１ｅ（１０．０ｇ、３６．７６ｍｍｏｌ）、ピリジン（８．７２ｇ、１１０．２７ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（４４９．０４ｍｇ、３．６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に滴下し、１５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を水（３００ｍＬ）でクエンチングし、１Ｎ塩酸でｐＨを５に調整した。有機相を飽和塩化アンモニウム塩化ナトリウム（２５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮させ、１ｆを得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.93 (s, 1H), 7.82 - 7.75 (m, 1H), 7.11 (d, J=9.0 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H)。
ステップ６
窒素ガス保護下、テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に１ｆ（１０．００ｇ、２４．７４ｍｍｏｌ）、１ｇ（６．３８ｇ、２７．２１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２．２７ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（２．１５ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム（１６．１２ｇ、４９．４８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液を水（２００ｍＬ）に加え、ろ過して、ろ過ケーキを酢酸エチル（１００ｍＬ）でスラリー化した。ろ過して、固体を乾燥させ、１ｈを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 9.07 - 8.76 (m, 2H), 8.00 (br d, J=2.3 Hz, 1H), 7.68 - 7.40 (m, 2H), 7.32 (br dd, J=9.0, 13.3 Hz, 2H), 4.71 - 4.39 (m, 4H), 3.75 (s, 3H), 3.52 - 3.39 (m, 1H), 3.14 (br s, 4H), 2.42 (br s, 4H)。
ステップ７
窒素ガス保護下、１，４－ジオキサン（１６０ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）に１ｈ（９．００ｇ、１８．４３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６．３７ｇ、４６．０７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１．０８ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）、及び１ｉ（５．３６ｇ、２７．６４ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液が冷却すると固体が析出され、ろ過して、ろ過ケーキを水（２００ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄し、ろ過ケーキを乾燥させ、式Ｉ化合物を得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 13.08 (br s, 1H), 9.04 (br s, 1H), 8.78 (br s, 1H), 8.16 - 7.70 (m, 3H), 7.57 - 7.23 (m, 3H), 6.73 (br s, 1H), 4.74 - 4.37 (m, 4H), 3.79 (br s, 3H), 3.56 (br s, 2H), 3.14 (br s, 3H), 2.42 (br s, 4H)。
【化3】
窒素ガス保護下、０℃で１ａ（５９．００ｇ、４３６．５９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（６００ｍＬ）溶液に水素化ナトリウム（１９．２４ｇ、４８０．９９ｍｍｏｌ、６０％純度）を加え、反応液を３０分間撹拌した後、トリフルオロメタンスルホン酸メチル（９３．１４ｇ、５６７．５７ｍｍｏｌ、６２．０９ｍＬ）を加え、１５℃で２時間撹拌し続けた。反応終了後、反応液を飽和塩化アンモニウム（１Ｌ）でクエンチングし、酢酸エチル（３×５００ｍＬ）で３回抽出した。有機相を飽和塩化アンモニウム食塩水（１Ｌ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。ろ過して濃縮させた後、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけて、１ｂを得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.22 - 7.08 (m, 2H), 7.03 (br d, J=3.0 Hz, 1H), 6.86 - 6.73 (m, 1H), 6.58 (d, J=2.5 Hz, 1H), 3.81 (s, 3H)。
ステップ２
窒素ガス保護下、１ｂ（５５．００ｇ、３６８．７２ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（４００ｍＬ）溶液にＮ－ブロモスクシンイミド（６５．６３ｇ、３６８．７２ｍｍｏｌ）を加え、２０℃で１時間撹拌した。上記反応液にＮ－ブロモスクシンイミド（６５．６３ｇ、３６８．７２ｍｍｏｌ）をさらに加え、反応液を６０℃に昇温して１０時間撹拌し続けた。反応終了後、反応液を水（６Ｌ）に注入してろ過し、ろ過ケーキをアセトン（２Ｌ）に溶解してろ過し、ろ過ケーキをアセトン（５００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を濃縮させた後、残留物をカラムクロマトグラフィーにかけて、１ｃを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.72 (dt, J=5.8, 8.2 Hz, 1H), 6.99 (d, J=7.8 Hz, 1H), 6.93 (t, J=8.8 Hz, 1H), 3.15 (s, 3H)。
ステップ３
窒素ガス保護下、１ｃ（３１．０ｇ、１７３．０４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３００ｍＬ）及び水（６００ｍＬ）にＮ－ブロモスクシンイミド（４０．０４ｇ、２２４．９５ｍｍｏｌ）を加え、反応液を１５℃で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液をろ過し、ろ過ケーキを水（３００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させて１ｄを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 7.99 (dd, J=7.3, 8.3 Hz, 1H), 6.98 (d, J=8.5 Hz, 1H), 3.14 (s, 3H)。
ステップ４
窒素ガス保護下、１ｄ（３２．００ｇ、１２４．０１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２５．１ｇ、２４８．０２ｍｍｏｌ）のエタノール（３００ｍＬ）の溶液に、０℃でトリメチルシリルジアゾメタン（２ｍｏｌ／Ｌ、６５．１１ｍＬ）を滴下し、０～１５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を濃縮させ、残留物を酢酸エチル（５００ｍＬ）でスラリー化し、ろ過して、ろ過ケーキを乾燥させ、１ｅを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ= 10.17 (br s, 1H), 7.65 (dd, J=7.5, 9.0 Hz, 1H), 7.30 (d, J=9.0 Hz, 1H), 7.11 (s, 1H), 3.69 (s, 3H)。
ステップ５
窒素ガス保護下、０℃でトリフルオロメタンスルホン酸無水物（１３．４８ｇ、４７．７８ｍｍｏｌ）を１ｅ（１０．０ｇ、３６．７６ｍｍｏｌ）、ピリジン（８．７２ｇ、１１０．２７ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（４４９．０４ｍｇ、３．６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に滴下し、１５℃で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を水（３００ｍＬ）でクエンチングし、１Ｎ塩酸でｐＨを５に調整した。有機相を飽和塩化アンモニウム塩化ナトリウム（２５０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過して濃縮させ、１ｆを得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3) δ = 7.93 (s, 1H), 7.82 - 7.75 (m, 1H), 7.11 (d, J=9.0 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H)。
ステップ６
窒素ガス保護下、テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）に１ｆ（１０．００ｇ、２４．７４ｍｍｏｌ）、１ｇ（６．３８ｇ、２７．２１ｍｍｏｌ）、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（２．２７ｇ、２．４７ｍｍｏｌ）、Ｘａｎｔｐｈｏｓ（２．１５ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）及び炭酸セシウム（１６．１２ｇ、４９．４８ｍｍｏｌ）を加え、５０℃で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液を水（２００ｍＬ）に加え、ろ過して、ろ過ケーキを酢酸エチル（１００ｍＬ）でスラリー化した。ろ過して、固体を乾燥させ、１ｈを得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 9.07 - 8.76 (m, 2H), 8.00 (br d, J=2.3 Hz, 1H), 7.68 - 7.40 (m, 2H), 7.32 (br dd, J=9.0, 13.3 Hz, 2H), 4.71 - 4.39 (m, 4H), 3.75 (s, 3H), 3.52 - 3.39 (m, 1H), 3.14 (br s, 4H), 2.42 (br s, 4H)。
ステップ７
窒素ガス保護下、１，４－ジオキサン（１６０ｍＬ）及び水（４０ｍＬ）に１ｈ（９．００ｇ、１８．４３ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（６．３７ｇ、４６．０７ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（１．０８ｇ、１．４７ｍｍｏｌ）、及び１ｉ（５．３６ｇ、２７．６４ｍｍｏｌ）を加え、１１０℃で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液が冷却すると固体が析出され、ろ過して、ろ過ケーキを水（２００ｍＬ）及び酢酸エチル（１００ｍＬ）で洗浄し、ろ過ケーキを乾燥させ、式Ｉ化合物を得た。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ = 13.08 (br s, 1H), 9.04 (br s, 1H), 8.78 (br s, 1H), 8.16 - 7.70 (m, 3H), 7.57 - 7.23 (m, 3H), 6.73 (br s, 1H), 4.74 - 4.37 (m, 4H), 3.79 (br s, 3H), 3.56 (br s, 2H), 3.14 (br s, 3H), 2.42 (br s, 4H)。
【0065】
実施例２：式ＩＩの塩酸塩のＡ型結晶の製造
５０Ｌ反応釜に脱イオン水５４４０ｍＬを加え、回転数２００ｒｐｍで機械的に撹拌し、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物１３６０ｇをバッチ式で加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応釜にギ酸２７２０ｍＬを約１時間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応釜に調製済みの１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液４２９０ｍＬを約２時間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応釜にエタノール２４９００ｍＬを約５時間かけて滴下し、エタノールが約７０００ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、純度９９．７９％の式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶１２２０ｇを得た。
５０Ｌ反応釜に脱イオン水５４４０ｍＬを加え、回転数２００ｒｐｍで機械的に撹拌し、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物１３６０ｇをバッチ式で加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応釜にギ酸２７２０ｍＬを約１時間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応釜に調製済みの１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液４２９０ｍＬを約２時間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応釜にエタノール２４９００ｍＬを約５時間かけて滴下し、エタノールが約７０００ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、純度９９．７９％の式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶１２２０ｇを得た。
【0066】
実施例３：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の製造
１００ｍＬ反応フラスコに脱イオン水２ｍＬを加え、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物０．６ｇを加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応フラスコにギ酸１ｍＬを約５分間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応フラスコに調製済みの１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液１．２６ｍＬを約５分間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応フラスコにエタノール８ｍＬを約１５分間かけて滴下し、エタノールが約５ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持して４時間撹拌し続けた。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶０．５５ｇを得た。
１００ｍＬ反応フラスコに脱イオン水２ｍＬを加え、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物０．６ｇを加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応フラスコにギ酸１ｍＬを約５分間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応フラスコに調製済みの１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液１．２６ｍＬを約５分間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応フラスコにエタノール８ｍＬを約１５分間かけて滴下し、エタノールが約５ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持して４時間撹拌し続けた。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶０．５５ｇを得た。
【0067】
実施例４：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の製造
１００ｍＬ反応フラスコに脱イオン水２ｍＬを加え、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物０．６ｇを加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応フラスコにギ酸１ｍＬを約５分間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応フラスコに調製済みの１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液２．５２ｍＬを約５分間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応フラスコにエタノール８ｍＬを約１５分間かけて滴下し、エタノールが約５ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持して４時間撹拌し続けた。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶０．５５ｇを得た。
１００ｍＬ反応フラスコに脱イオン水２ｍＬを加え、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物０．６ｇを加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応フラスコにギ酸１ｍＬを約５分間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応フラスコに調製済みの１ｍｏｌ／Ｌの塩酸水溶液２．５２ｍＬを約５分間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応フラスコにエタノール８ｍＬを約１５分間かけて滴下し、エタノールが約５ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持して４時間撹拌し続けた。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶０．５５ｇを得た。
【0068】
実施例５：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の製造
１００ｍＬ反応フラスコに酢酸エチル２ｍＬを加え、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物１．０ｇを加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応フラスコにギ酸３ｍＬを約１５分間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応フラスコに３５％塩酸水溶液０．２６ｍＬと酢酸エチル２．０ｍＬを約５分間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応フラスコにエタノール２０ｍＬを約１５分間かけて滴下し、エタノールが約１５ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持して４時間撹拌し続けた。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶０．９５ｇを得た。
１００ｍＬ反応フラスコに酢酸エチル２ｍＬを加え、内温が３５～３８℃となるまで加熱し、その後、式Ｉ化合物１．０ｇを加え、０．５時間撹拌し、溶液が黄色懸濁液となった。反応フラスコにギ酸３ｍＬを約１５分間かけて滴下し、溶液が完全に澄明になると、１時間撹拌し続けた。その後、反応フラスコに３５％塩酸水溶液０．２６ｍＬと酢酸エチル２．０ｍＬを約５分間かけて滴下し、反応系が黄色澄明液のままであり、この条件を維持してさらに一晩撹拌した。反応フラスコにエタノール２０ｍＬを約１５分間かけて滴下し、エタノールが約１５ｍＬ添加されると、明るい黄色の固体が析出され始め、固体が完全に析出されるまで滴下し続け、この条件を維持して４時間撹拌し続けた。ろ過してろ過ケーキを所定重量まで真空乾燥させ、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶０．９５ｇを得た。
【0069】
実施例６：式Ｉ化合物塩酸塩のＢ型結晶の製造
式Ｉ化合物５００ｍｇを４０ｍＬガラスバイアルに加え、エタノール３５ｍＬを加え、反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で２時間撹拌し、その後、水で１０倍希釈した１．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸３ｍＬを加え、上記反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で一晩撹拌した。反応液を遠心分離して、固体を真空オーブンに入れて一晩乾燥させて、式ＩＩに示される塩酸塩のＢ型結晶を得た。
式Ｉ化合物５００ｍｇを４０ｍＬガラスバイアルに加え、エタノール３５ｍＬを加え、反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で２時間撹拌し、その後、水で１０倍希釈した１．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸３ｍＬを加え、上記反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で一晩撹拌した。反応液を遠心分離して、固体を真空オーブンに入れて一晩乾燥させて、式ＩＩに示される塩酸塩のＢ型結晶を得た。
【0070】
実施例７：式Ｉ化合物塩酸塩のＢ型結晶の製造
式Ｉ化合物５００ｍｇを４０ｍＬガラスバイアルに加え、エタノール２９．２ｍＬと酢酸５．８ｍＬの混合溶液を加え、反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で２時間撹拌し、その後、水で１０倍希釈した１．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸３ｍＬを加え、上記反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で一晩撹拌した。反応液を遠心分離して、固体を真空オーブンに入れて一晩乾燥させて、式ＩＩに示される塩酸塩のＢ型結晶を得た。
式Ｉ化合物５００ｍｇを４０ｍＬガラスバイアルに加え、エタノール２９．２ｍＬと酢酸５．８ｍＬの混合溶液を加え、反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で２時間撹拌し、その後、水で１０倍希釈した１．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸３ｍＬを加え、上記反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で一晩撹拌した。反応液を遠心分離して、固体を真空オーブンに入れて一晩乾燥させて、式ＩＩに示される塩酸塩のＢ型結晶を得た。
【0071】
実施例８：式Ｉ化合物塩酸塩のＢ型結晶の製造
式Ｉ化合物５００ｍｇを４０ｍＬガラスバイアルに加え、アセトン２９．２ｍＬと酢酸５．８ｍＬの混合溶液を加え、反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で２時間撹拌し、その後、水で１０倍希釈した１．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸３ｍＬを加え、上記反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で一晩撹拌した。反応液を遠心分離して、固体を真空オーブンに入れて一晩乾燥させて、式ＩＩに示される塩酸塩のＢ型結晶を得た。
式Ｉ化合物５００ｍｇを４０ｍＬガラスバイアルに加え、アセトン２９．２ｍＬと酢酸５．８ｍＬの混合溶液を加え、反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で２時間撹拌し、その後、水で１０倍希釈した１．２ｍｏｌ／Ｌの希塩酸３ｍＬを加え、上記反応液をマグネチックスターラーにセットして４０℃で一晩撹拌した。反応液を遠心分離して、固体を真空オーブンに入れて一晩乾燥させて、式ＩＩに示される塩酸塩のＢ型結晶を得た。
【0072】
実験例１：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の安定性の検討
『原薬及び製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬局方２０１５版四部通則９００１）に準じて、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の、高温（６０℃、開放）、高湿（室温／相対湿度９２．５％、開放）及び光照射（総照度１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外線２００ｗ・ｈｒ／ｍ２、開放）の条件での安定性をそれぞれ調べた。
式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶５ｍｇを秤量して、ガラス製サンプル瓶の底部に薄く敷いた。高温及び高湿の条件下で放置したサンプルについてアルミホイルで開口部を密閉し、アルミホイルに孔を空け、サンプルを環境中の空気と十分に接触させた。強光照射条件でサンプルをアルミホイルで密閉させずに開放したまま放置した。異なる条件で放置したサンプルについて、５日目、１０日目にサンプリングしてそのＸ－線粉末回折スペクトルを検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、実験結果を表３に示す。
結果から明らかなように、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶は、高温、高湿及び光照射の条件で、良好な安定性を有する。
『原薬及び製剤の安定性試験の指導原則』（中国薬局方２０１５版四部通則９００１）に準じて、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の、高温（６０℃、開放）、高湿（室温／相対湿度９２．５％、開放）及び光照射（総照度１．２×１０６Ｌｕｘ・ｈｒ／近紫外線２００ｗ・ｈｒ／ｍ２、開放）の条件での安定性をそれぞれ調べた。
式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶５ｍｇを秤量して、ガラス製サンプル瓶の底部に薄く敷いた。高温及び高湿の条件下で放置したサンプルについてアルミホイルで開口部を密閉し、アルミホイルに孔を空け、サンプルを環境中の空気と十分に接触させた。強光照射条件でサンプルをアルミホイルで密閉させずに開放したまま放置した。異なる条件で放置したサンプルについて、５日目、１０日目にサンプリングしてそのＸ－線粉末回折スペクトルを検出し、検出結果を０日目の初期検出結果と比較し、実験結果を表３に示す。
【表3】
【0073】
実験例２：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の吸湿性の検討
器具：ＳＭＳ ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的蒸気吸着装置
方法：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶１０～１５ｍｇをＤＶＳサンプルトレイに取り、テストを行った。
ＤＶＳパラメータは以下のとおりである。
温度：２５℃
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／ｍｉｎ（最短：１０ｍｉｎ、最長：１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ ＲＨで１２０ｍｉｎ乾燥
ＲＨ（％）テスト勾配：１０％
ＲＨ（％）テスト勾配範囲：０％～９０％～０％
結果：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶のＤＶＳパターンは図５に示され、△Ｗ＝１．３７１％である。
結論：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶は、２５±１℃、８０±２％ ＲＨの条件で、吸湿性が低い。
器具：ＳＭＳ ＤＶＳ Ａｄｖａｎｔａｇｅ動的蒸気吸着装置
方法：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶１０～１５ｍｇをＤＶＳサンプルトレイに取り、テストを行った。
ＤＶＳパラメータは以下のとおりである。
温度：２５℃
平衡：ｄｍ／ｄｔ＝０．０１％／ｍｉｎ（最短：１０ｍｉｎ、最長：１８０ｍｉｎ）
乾燥：０％ ＲＨで１２０ｍｉｎ乾燥
ＲＨ（％）テスト勾配：１０％
ＲＨ（％）テスト勾配範囲：０％～９０％～０％
結果：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶のＤＶＳパターンは図５に示され、△Ｗ＝１．３７１％である。
結論：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶は、２５±１℃、８０±２％ ＲＨの条件で、吸湿性が低い。
【0074】
実験例３：式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶の有機溶媒での安定性の検討
式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶６０ｍｇを秤量して、８ｍＬガラスバイアルに入れ、メタノール４ｍＬを加え、ガラスバイアルをマグネチックスターラーにセットし、それぞれ２０℃及び５０℃で２４時間撹拌した後、懸濁液を遠心分離して、有機溶媒を除去し、得た固体を真空乾燥させ、そのＸ－線粉末回折スペクトルを検出し、結果を式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶のＸ－線粉末回折スペクトル図と比較した。
上記方法に従って、エタノール、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン及びｎ－ヘキサンを溶媒として、平行試験を行った。
結果から、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶が上記溶媒に２４時間懸濁した後、そのＸ－線粉末回折スペクトルが式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶のスペクトルと一致していることを示し、このことから、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶は、調べる対象となる溶媒系のいずれにおいても結晶形変換が起っておらず、結晶形が安定的であることを示している。
式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶６０ｍｇを秤量して、８ｍＬガラスバイアルに入れ、メタノール４ｍＬを加え、ガラスバイアルをマグネチックスターラーにセットし、それぞれ２０℃及び５０℃で２４時間撹拌した後、懸濁液を遠心分離して、有機溶媒を除去し、得た固体を真空乾燥させ、そのＸ－線粉末回折スペクトルを検出し、結果を式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶のＸ－線粉末回折スペクトル図と比較した。
上記方法に従って、エタノール、酢酸エチル、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、１，４－ジオキサン及びｎ－ヘキサンを溶媒として、平行試験を行った。
結果から、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶が上記溶媒に２４時間懸濁した後、そのＸ－線粉末回折スペクトルが式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶のスペクトルと一致していることを示し、このことから、式ＩＩに示される塩酸塩のＡ型結晶は、調べる対象となる溶媒系のいずれにおいても結晶形変換が起っておらず、結晶形が安定的であることを示している。
【0075】
実験例４：ＳＹＫキナーゼに対する式Ｉ化合物の阻害作用のインビトロテスト
４．１ 実験目的：均一時間分解蛍光技術（ＨＴＲＦ）により基質と酵素の相互作用を検出し、化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を指標として、チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）に対する化合物の阻害作用を評価した。
４．２ 実験材料：
チロシンキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３８５７）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ＃４３８１５）
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７６９９）
塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）（Ｓｉｇｍａ＃６３０２０）
塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ１７８７）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５５７５－０２０）
４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５６３０－０８０）
ＨＴＲＦ（登録商標） ＫｉｎＥＡＳＥ（商標）チロシンキナーゼキット（Ｃｉｓｂｉｏ＃６２ＴＫ０ＰＥＣ、２００００ ｔｅｓｔｓ）
低容量、３８４ウェル、白色ポリスチレン板（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８４０７５）
３８４マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１９４６）
遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ＃５８１０Ｒ）
ピペット装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ピペット管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
ピペットガン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分液器
ＰＯＤ ８１０ Ｐｌａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ 全自動マイクロプレート前処理システム
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ多機能マイクロプレートリーダー
４．３ 実験のステップ及び方法：
ａ）化合物の希釈及びサンプル注入
１）式Ｉ化合物粉末を秤量して、初期濃度が１０ｍＭとなるように一定量のジメチルスルホキシドに溶解した。
２）化合物を濃度０．７４ｍＭに希釈し、全自動マイクロプレート前処理システムを用いてサンプルを１ウェルあたり１３５ｎＬ注入し、化合物の初期濃度を１０μＭとして、１１個の濃度点で、３倍で逓減するように勾配希釈を行った。
ｂ）酵素と基質の反応段階
１）希釈実験緩衝液を準備して、キット内の５×ＨＴＲＦ緩衝液を１×に希釈し、キットの取扱書に従って、所定量のジチオスレイトール及び塩化マグネシウム溶液を加えて使用に備えた。
２）１×ＨＴＲＦ緩衝液を用いてチロシナーゼ反応溶液を調製し、チロシンキナーゼの最終反応濃度を０．０１５６ｎｇ／μＬとした。
３）チロシンキナーゼ－基質－ビオチン／アデノシン三リン酸混合液を調製し、最終基質濃度を０．２μＭ、アデノシン三リン酸濃度を２μＭに制御した。
４）Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分液器を用いてサンプルを注入し、式Ｉ化合物を加えたマイクロプレートにチロシナーゼ溶液とチロシンキナーゼ－基質－ビオチン／アデノシン三リン酸混合液を１ウェルあたり５μｌ加え、２３℃で１時間インキュベートした。
ｃ）検出段階
１）キット内の検出緩衝液（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）にエチレンジアミン四酢酸溶液１３．３３ｍＬを加え、キット取扱書に従って、所定量のウラン（Ｅｕ）で標識された抗体及びストレプトアビジンＸＬ－６６５を加えて、検出液を調製した。
２）Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分液器を用いて上記のマイクロプレートにサンプルを注入し、１ウェルあたり検出液１０μＬとし、２３℃で１時間インキュベートし、酵素と基質の混合液の反応を停止した。
３）遠心分離後、得た上清液を多機能マイクロプレートリーダーにて値を読み取った。
ｄ）データ分析
ＸＬ－Ｆｉｔでデータを分析し、式Ｉ化合物のＩＣ５０値を算出した。
４．１ 実験目的：均一時間分解蛍光技術（ＨＴＲＦ）により基質と酵素の相互作用を検出し、化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を指標として、チロシンキナーゼ（ＳＹＫ）に対する化合物の阻害作用を評価した。
４．２ 実験材料：
チロシンキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＶ３８５７）
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（Ｓｉｇｍａ＃４３８１５）
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）（Ｓｉｇｍａ＃Ａ７６９９）
塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）（Ｓｉｇｍａ＃６３０２０）
塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）（Ｓｉｇｍａ＃Ｍ１７８７）
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５５７５－０２０）
４－ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１５６３０－０８０）
ＨＴＲＦ（登録商標） ＫｉｎＥＡＳＥ（商標）チロシンキナーゼキット（Ｃｉｓｂｉｏ＃６２ＴＫ０ＰＥＣ、２００００ ｔｅｓｔｓ）
低容量、３８４ウェル、白色ポリスチレン板（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８４０７５）
３８４マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ＃７８１９４６）
遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ＃５８１０Ｒ）
ピペット装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ピペット管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
ピペットガン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分液器
ＰＯＤ ８１０ Ｐｌａｔｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ 全自動マイクロプレート前処理システム
Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ多機能マイクロプレートリーダー
４．３ 実験のステップ及び方法：
ａ）化合物の希釈及びサンプル注入
１）式Ｉ化合物粉末を秤量して、初期濃度が１０ｍＭとなるように一定量のジメチルスルホキシドに溶解した。
２）化合物を濃度０．７４ｍＭに希釈し、全自動マイクロプレート前処理システムを用いてサンプルを１ウェルあたり１３５ｎＬ注入し、化合物の初期濃度を１０μＭとして、１１個の濃度点で、３倍で逓減するように勾配希釈を行った。
ｂ）酵素と基質の反応段階
１）希釈実験緩衝液を準備して、キット内の５×ＨＴＲＦ緩衝液を１×に希釈し、キットの取扱書に従って、所定量のジチオスレイトール及び塩化マグネシウム溶液を加えて使用に備えた。
２）１×ＨＴＲＦ緩衝液を用いてチロシナーゼ反応溶液を調製し、チロシンキナーゼの最終反応濃度を０．０１５６ｎｇ／μＬとした。
３）チロシンキナーゼ－基質－ビオチン／アデノシン三リン酸混合液を調製し、最終基質濃度を０．２μＭ、アデノシン三リン酸濃度を２μＭに制御した。
４）Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分液器を用いてサンプルを注入し、式Ｉ化合物を加えたマイクロプレートにチロシナーゼ溶液とチロシンキナーゼ－基質－ビオチン／アデノシン三リン酸混合液を１ウェルあたり５μｌ加え、２３℃で１時間インキュベートした。
ｃ）検出段階
１）キット内の検出緩衝液（Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ）にエチレンジアミン四酢酸溶液１３．３３ｍＬを加え、キット取扱書に従って、所定量のウラン（Ｅｕ）で標識された抗体及びストレプトアビジンＸＬ－６６５を加えて、検出液を調製した。
２）Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ自動分液器を用いて上記のマイクロプレートにサンプルを注入し、１ウェルあたり検出液１０μＬとし、２３℃で１時間インキュベートし、酵素と基質の混合液の反応を停止した。
３）遠心分離後、得た上清液を多機能マイクロプレートリーダーにて値を読み取った。
ｄ）データ分析
ＸＬ－Ｆｉｔでデータを分析し、式Ｉ化合物のＩＣ５０値を算出した。
【0076】
実験例５：ＡＫＴリン酸化に対する式Ｉ化合物の阻害作用のインビトロテスト
５．１ 実験目的：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）実験によって細胞内のプロテインキナーゼＡＫＴリン酸化作用を検出し、化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を指標として、プロテインキナーゼＡＫＴリン酸化に対する化合物の阻害作用を評価した。
５．２ 実験材料
細胞系：Ｒａｍｏｓ細胞系
細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００－１０５；１０％ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ＃１００９９－１４１；Ｌ－グルタミン１×、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０－０８１）
実験用培地（血清不含、ＲＰＭＩ １６４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００－１０５；Ｌ－グルタミン１×、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０）
溶解緩衝液（トリメチロールアミノメタン塩酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５５６７－１０００ｍｌ；塩化ナトリウム、中国製；デオキシコール酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ ３０９７０－２５Ｇ；ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、Ｓｉｇｍａ Ｔ９２８４－１００ｍｌ；ドデシル硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ Ｌ３７７１；エチレンジアミン四酢酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５５７５－０３８－１００ｍｌ；超純水、ＭｉｌｌｉＱ）
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、４６９３１５９００１－３０／ＢＯＸ）
ホスファターゼ阻害剤混合物２（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６－５ＭＬ）
ホスファターゼ阻害剤混合物３（Ｓｉｇｍａ、Ｐ００４４－５ＭＬ）
ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＭ（Ｆ（ａｂ’）２ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ－１０９－００６－１２９）
リン酸化ＡＫＴ検出キット（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ １／２／３（ｓｅｒ４７３））（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＥＫＴ００２）
１０×平衡塩溶液（１０×Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｇｉｂｃｏ＃１４０６５－０５６）
９６ウェル細胞板（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃ ６５５０９０）
化合物Ｖウェル希釈板（Ａｘｙｇｅｎ＃ＷＩＴＰ０２２８０）
ＣＯ２インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７１）
遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＃５８１０Ｒ）
Ｖｉ－ｃｅｌｌ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）
ピペット装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ピペット管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
ピペットガン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ）
５．３ 実験ステップ及び方法
ａ）細胞接種（Ｒａｍｏｓ細胞）
１）３７℃の水浴で細胞培地を予熱し、別にＲａｍｏｓ懸濁細胞培養液を吸い取り、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
２）遠心分離後の上清液を捨てて、予熱済みの細胞培地を遠心分離管に加え、再懸濁細胞をピペッティングし、Ｒａｍｏｓ細胞再懸濁液１ｍＬを吸い取って、Ｖｉ－ｃｅｌｌでカウントした。
３）細胞培地でＲａｍｏｓ細胞再懸濁液を希釈して、細胞密度を５×１０６個細胞／ｍＬとし、マルチチャンネルピペットを用いて、希釈済みの細胞を９６ウェル細胞培養板（１００μＬ／ウェル）に加え、細胞培養板を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに入れて一晩放置した。
ｂ）細胞飢餓
接種した細胞を一晩培養した後、翌日、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、マルチチャンネルピペットを用いて元の細胞培地を吸い取り、血清不含の実験用培地を加えて、細胞培養板を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに入れて、一晩飢餓した。
ｃ）測定対象サンプルの準備及びサンプル注入
１）測定対象サンプルである式Ｉ化合物をジメチルスルホキシドで溶解し、初期濃度５ｍＭの式Ｉ化合物の溶液を得て、化合物Ｖウェル希釈板でこの式Ｉ化合物の溶液を３倍勾配希釈し、１０個の濃度点とした。
２）別の新しい化合物Ｖウェル希釈板を準備し、１ウェルあたり１９８μＬの血清不含実験用培地を加えた後、前のステップの初期濃度の溶液及び３倍勾配希釈後の化合物溶液を１ウェルあたり２μｌ加え、マルチチャンネルピペットを用いて均一に混合し、このとき、化合物は１００倍希釈され、ここで、前記ウェルにて希釈された式Ｉ化合物の最大濃度は５０μＭであった。
３）ｂ）において一晩飢餓した細胞培養板に、ステップ２）で得た希釈後の各化合物溶液を１ウェルあたり２５μＬ加え、各ウェル中の細胞培地を１００μＬとし、各化合物溶液を再度５倍希釈し、このとき、前記ウェルにおける希釈後の式Ｉ化合物の最大濃度は１０μＭであり、残りのウェルには３倍勾配希釈により得られた１０個の濃度点の式Ｉ化合物の希釈液がある。
４）ステップ３）の細胞培養板を１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、その後、細胞培養板を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに入れて、化合物を１時間作用させた。
ｄ）刺激因子による刺激
１）２本の１×平衡塩溶液を調製し、１０×平衡塩溶液を再蒸留水で１×平衡塩溶液となるまで希釈し、それぞれ３７℃恒温箱及び４℃冷蔵庫に入れて使用に備えた。
２）１本の溶解混合液を調製して、４℃冷蔵庫に入れて使用に備えた。その処方は、プロテアーゼ阻害剤錠剤１錠＋ホスファターゼ阻害剤混合物２ １００μＬ＋ホスファターゼ阻害剤混合物３ １００μＬ＋溶解緩衝液１０ｍＬであった。
３）ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＭ（Ｆ（ａｂ’）２ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）（１．２ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で予熱された１×平衡塩溶液で６０μｇ／ｍＬに希釈した。
４）化合物でＲａｍｏｓ細胞を１時間処理した後、希釈されたヤギ抗ヒト免疫グロブリンＭ（Ｆ（ａｂ’）２ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）を１ウェルあたり２５μＬ加え、このとき、前記ＩｇＭの作用濃度は１０μｇ／ｍＬであった。
５）前記ＩｇＭを用いて細胞を１０分間刺激し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、懸濁細胞を９６ウェル板の底部に沈殿させ、懸濁細胞を保留して９６ウェル板中の液体を慎重に排出し、ペーパータオルで残りの液体を吸い取った。
６）予冷した（４℃）１×平衡塩溶液を１ウェルあたり２５０μＬ加えて、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞に対する前記ＩｇＭの刺激を停止した。
ｅ）細胞溶解液の製造
１）９６ウェル板中の液体を慎重に排出し、ペーパータオルで残りの液体を吸い取り、溶解混合液を１ウェルあたり１００μＬ加え、４℃でシェーカーにて１時間振とうさせ、細胞を溶解した。
２）細胞を１時間溶解した後、４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を軽く吸い取り、細胞溶解液を得た。
ｆ）酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）実験
１）リン酸化ＡＫＴ検出キットにおける９６ウェルＥｌｉｓａ板を取り出し、室温となるまで平衡し、細胞溶解液を１ウェルあたり５０μＬ加えた。
２）キット中の捕捉抗体試薬（Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）と検出抗体試薬（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）を１：１で均一に混合し、その後、９６ウェルＥｌｉｓａ板に１ウェルあたり５０μＬ加え、細胞溶解液と上記抗体試薬との混合液を室温でシェーカーにて１時間振とうさせた。
３）キット中の洗浄液（１０×）を再蒸留水で１×に希釈し、Ｅｌｉｓａ板中の液体を捨てて、吸収紙で水分を吸い尽くし、１×洗浄液を１ウェルあたり２００μＬ加え、板を洗浄した後、水分を吸い尽くし、これを４回繰り返した。
４）１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）（１００×）基質をＡＤＨＰ希釈液で１×に希釈し、９６ウェルＥｌｉｓａ板に１ウェルあたり１００μＬ加え、室温でシェーカーにて１０分間振とうさせた。
５）停止液を１ウェルあたり１０μＬ加えて、瞬間遠心分離を行い、室温でシェーカーにて５分間振とうさせ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ多機能マイクロプレートリーダーにより値を読み取った。
ｇ）データ分析
ＸＬ－Ｆｉｔによりデータを分析し、化合物のＩＣ５０値を算出した。
実験例４及び実験例５の結果を表４に示す。
５．１ 実験目的：酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）実験によって細胞内のプロテインキナーゼＡＫＴリン酸化作用を検出し、化合物の半数阻害濃度（ＩＣ５０）値を指標として、プロテインキナーゼＡＫＴリン酸化に対する化合物の阻害作用を評価した。
５．２ 実験材料
細胞系：Ｒａｍｏｓ細胞系
細胞培地（ＲＰＭＩ１６４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００－１０５；１０％ウシ胎児血清、Ｇｉｂｃｏ＃１００９９－１４１；Ｌ－グルタミン１×、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０－０８１）
実験用培地（血清不含、ＲＰＭＩ １６４０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃２２４００－１０５；Ｌ－グルタミン１×、Ｇｉｂｃｏ＃２５０３０）
溶解緩衝液（トリメチロールアミノメタン塩酸塩、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５５６７－１０００ｍｌ；塩化ナトリウム、中国製；デオキシコール酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ ３０９７０－２５Ｇ；ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル、Ｓｉｇｍａ Ｔ９２８４－１００ｍｌ；ドデシル硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ Ｌ３７７１；エチレンジアミン四酢酸、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １５５７５－０３８－１００ｍｌ；超純水、ＭｉｌｌｉＱ）
プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、４６９３１５９００１－３０／ＢＯＸ）
ホスファターゼ阻害剤混合物２（Ｓｉｇｍａ、Ｐ５７２６－５ＭＬ）
ホスファターゼ阻害剤混合物３（Ｓｉｇｍａ、Ｐ００４４－５ＭＬ）
ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＭ（Ｆ（ａｂ’）２ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ－１０９－００６－１２９）
リン酸化ＡＫＴ検出キット（Ｐｈｏｓｐｈｏ－ＡＫＴ １／２／３（ｓｅｒ４７３））（ＴＧＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＥＫＴ００２）
１０×平衡塩溶液（１０×Ｈａｎｋ’ｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｇｉｂｃｏ＃１４０６５－０５６）
９６ウェル細胞板（Ｇｒｅｉｎｅｒ ＃ ６５５０９０）
化合物Ｖウェル希釈板（Ａｘｙｇｅｎ＃ＷＩＴＰ０２２８０）
ＣＯ２インキュベータ（Ｔｈｅｒｍｏ＃３７１）
遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＃５８１０Ｒ）
Ｖｉ－ｃｅｌｌ細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）
ピペット装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
ピペット管（Ｇｒｅｉｎｅｒ）
ピペットガン（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）
多機能マイクロプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ）
５．３ 実験ステップ及び方法
ａ）細胞接種（Ｒａｍｏｓ細胞）
１）３７℃の水浴で細胞培地を予熱し、別にＲａｍｏｓ懸濁細胞培養液を吸い取り、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
２）遠心分離後の上清液を捨てて、予熱済みの細胞培地を遠心分離管に加え、再懸濁細胞をピペッティングし、Ｒａｍｏｓ細胞再懸濁液１ｍＬを吸い取って、Ｖｉ－ｃｅｌｌでカウントした。
３）細胞培地でＲａｍｏｓ細胞再懸濁液を希釈して、細胞密度を５×１０６個細胞／ｍＬとし、マルチチャンネルピペットを用いて、希釈済みの細胞を９６ウェル細胞培養板（１００μＬ／ウェル）に加え、細胞培養板を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに入れて一晩放置した。
ｂ）細胞飢餓
接種した細胞を一晩培養した後、翌日、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、マルチチャンネルピペットを用いて元の細胞培地を吸い取り、血清不含の実験用培地を加えて、細胞培養板を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに入れて、一晩飢餓した。
ｃ）測定対象サンプルの準備及びサンプル注入
１）測定対象サンプルである式Ｉ化合物をジメチルスルホキシドで溶解し、初期濃度５ｍＭの式Ｉ化合物の溶液を得て、化合物Ｖウェル希釈板でこの式Ｉ化合物の溶液を３倍勾配希釈し、１０個の濃度点とした。
２）別の新しい化合物Ｖウェル希釈板を準備し、１ウェルあたり１９８μＬの血清不含実験用培地を加えた後、前のステップの初期濃度の溶液及び３倍勾配希釈後の化合物溶液を１ウェルあたり２μｌ加え、マルチチャンネルピペットを用いて均一に混合し、このとき、化合物は１００倍希釈され、ここで、前記ウェルにて希釈された式Ｉ化合物の最大濃度は５０μＭであった。
３）ｂ）において一晩飢餓した細胞培養板に、ステップ２）で得た希釈後の各化合物溶液を１ウェルあたり２５μＬ加え、各ウェル中の細胞培地を１００μＬとし、各化合物溶液を再度５倍希釈し、このとき、前記ウェルにおける希釈後の式Ｉ化合物の最大濃度は１０μＭであり、残りのウェルには３倍勾配希釈により得られた１０個の濃度点の式Ｉ化合物の希釈液がある。
４）ステップ３）の細胞培養板を１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、その後、細胞培養板を３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに入れて、化合物を１時間作用させた。
ｄ）刺激因子による刺激
１）２本の１×平衡塩溶液を調製し、１０×平衡塩溶液を再蒸留水で１×平衡塩溶液となるまで希釈し、それぞれ３７℃恒温箱及び４℃冷蔵庫に入れて使用に備えた。
２）１本の溶解混合液を調製して、４℃冷蔵庫に入れて使用に備えた。その処方は、プロテアーゼ阻害剤錠剤１錠＋ホスファターゼ阻害剤混合物２ １００μＬ＋ホスファターゼ阻害剤混合物３ １００μＬ＋溶解緩衝液１０ｍＬであった。
３）ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＭ（Ｆ（ａｂ’）２ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）（１．２ｍｇ／ｍＬ）を、３７℃で予熱された１×平衡塩溶液で６０μｇ／ｍＬに希釈した。
４）化合物でＲａｍｏｓ細胞を１時間処理した後、希釈されたヤギ抗ヒト免疫グロブリンＭ（Ｆ（ａｂ’）２ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＭ）を１ウェルあたり２５μＬ加え、このとき、前記ＩｇＭの作用濃度は１０μｇ／ｍＬであった。
５）前記ＩｇＭを用いて細胞を１０分間刺激し、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、懸濁細胞を９６ウェル板の底部に沈殿させ、懸濁細胞を保留して９６ウェル板中の液体を慎重に排出し、ペーパータオルで残りの液体を吸い取った。
６）予冷した（４℃）１×平衡塩溶液を１ウェルあたり２５０μＬ加えて、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞に対する前記ＩｇＭの刺激を停止した。
ｅ）細胞溶解液の製造
１）９６ウェル板中の液体を慎重に排出し、ペーパータオルで残りの液体を吸い取り、溶解混合液を１ウェルあたり１００μＬ加え、４℃でシェーカーにて１時間振とうさせ、細胞を溶解した。
２）細胞を１時間溶解した後、４℃、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を軽く吸い取り、細胞溶解液を得た。
ｆ）酵素結合免疫吸着アッセイ（Ｅｌｉｓａ）実験
１）リン酸化ＡＫＴ検出キットにおける９６ウェルＥｌｉｓａ板を取り出し、室温となるまで平衡し、細胞溶解液を１ウェルあたり５０μＬ加えた。
２）キット中の捕捉抗体試薬（Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）と検出抗体試薬（ＤｅｔｅｃｔｉｏｎＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅａｇｅｎｔ）を１：１で均一に混合し、その後、９６ウェルＥｌｉｓａ板に１ウェルあたり５０μＬ加え、細胞溶解液と上記抗体試薬との混合液を室温でシェーカーにて１時間振とうさせた。
３）キット中の洗浄液（１０×）を再蒸留水で１×に希釈し、Ｅｌｉｓａ板中の液体を捨てて、吸収紙で水分を吸い尽くし、１×洗浄液を１ウェルあたり２００μＬ加え、板を洗浄した後、水分を吸い尽くし、これを４回繰り返した。
４）１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン（ＡＤＨＰ）（１００×）基質をＡＤＨＰ希釈液で１×に希釈し、９６ウェルＥｌｉｓａ板に１ウェルあたり１００μＬ加え、室温でシェーカーにて１０分間振とうさせた。
５）停止液を１ウェルあたり１０μＬ加えて、瞬間遠心分離を行い、室温でシェーカーにて５分間振とうさせ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ多機能マイクロプレートリーダーにより値を読み取った。
ｇ）データ分析
ＸＬ－Ｆｉｔによりデータを分析し、化合物のＩＣ５０値を算出した。
実験例４及び実験例５の結果を表４に示す。
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】