特許 7472427 レチノイドの生合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-15

(45)【発行日】2024-04-23

(54)【発明の名称】レチノイドの生合成

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/15 20060101AFI20240416BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240416BHJP

   C12P 7/04 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12P7/04

C12N15/54

C12N15/53

【請求項の数】 8

(21)【出願番号】P 2020512740

(86)(22)【出願日】2018-09-25

(65)【公表番号】

(43)【公表日】2020-12-10

(86)【国際出願番号】 EP2018076033

(87)【国際公開番号】W WO2019058000

(87)【国際公開日】2019-03-28

【審査請求日】2021-09-27

(31)【優先権主張番号】62/562,712

(32)【優先日】2017-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】00715/18

(32)【優先日】2018-06-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CH

(31)【優先権主張番号】62/562,699

(32)【優先日】2017-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】18168564.5

(32)【優先日】2018-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】62/562,672

(32)【優先日】2017-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/562,602

(32)【優先日】2017-09-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】503220392

【氏名又は名称】ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ．

【氏名又は名称原語表記】ＤＳＭ ＩＰ ＡＳＳＥＴＳ Ｂ．Ｖ．

【住所又は居所原語表記】Ｈｅｔ Ｏｖｅｒｌｏｏｎ １， ＮＬ－６４１１ ＴＥ Ｈｅｅｒｌｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100206944

【弁理士】

【氏名又は名称】吉川 絵美

(74)【代理人】

【識別番号】100223424

【弁理士】

【氏名又は名称】和田 雄二

(72)【発明者】

【氏名】バルチ， ナタリー

(72)【発明者】

【氏名】ブロムクィスト， ポール

(72)【発明者】

【氏名】ドーテン， リード

(72)【発明者】

【氏名】ヒューストン， ピーター

(72)【発明者】

【氏名】ラム， イーサン

(72)【発明者】

【氏名】マクマホン， ジェナ

(72)【発明者】

【氏名】トゥルーハート， ジョシュア

(72)【発明者】

【氏名】ヴィアルージュ， セリーヌ

【審査官】伊達 利奈

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１６－５０１５４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】Biotechnology and Bioengineering, 2015, Vol. 112, No. 8, pp.1604-1612

【文献】EUKARYOTIC CELL, 2007, Vol.6, No.4, p.650-657

【文献】Molecular Genetics and Genomics, 2005, Vol.274, pp.217-228

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

全レチノイドに対して少なくとも４０％の割合で酢酸レチニルを含むレチノイドの生合成のために使用されるカロテノイド産生真菌宿主細胞であって、
（ａ）前記宿主細胞が産生するシス－及びトランス－レチナールを含むレチナール混合物中のトランス－レチナールの割合が、全レチナールに対して少なくとも６５％となるように、ベータ－カロテンからトランス－レチナールへの変換を触媒する、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７に従うポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される立体選択的ベータ－カロテン酸化酵素（ＢＣＯ）と、
（ｃ）レチノールの生成に対して少なくとも９０％の全変換率でレチナールをレチノールに変換することができ、配列番号１９に従うポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから選択されるレチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）［ＥＣ１．１．１．１０５］と、
（ｂ）アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）［ＥＣ２．３．１．８４］であって、レチノールから、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも４０％のアセチル化レチノール、すなわち酢酸レチニルの割合で、酢酸レチニルへの変換を触媒し、配列番号３３に従うポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される酵素と
を含み、
（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の全ての酵素が前記宿主細胞に導入され、異種発現している、カロテノイド産生真菌宿主細胞。

【請求項2】

前記アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］がレチノールから酢酸レチニル混合物への変換を触媒し、前記混合物が、少なくとも６５～９０％のトランス－アイソフォームの酢酸レチニルを含む、請求項１に記載のカロテノイド産生真菌宿主細胞。

【請求項3】

前記レチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）［ＥＣ１．１．１．１０５］がフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から選択される、請求項１又は２に記載のカロテノイド産生真菌宿主細胞。

【請求項4】

内在性アシルトランスフェラーゼ活性の改変をさらに含み、前記内在性アシルトランスフェラーゼ活性が低減又は消失されている、請求項１～３のいずれか一項に記載のカロテノイド産生真菌宿主細胞。

【請求項5】

前記宿主細胞がサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）及びヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のカロテノイド産生真菌宿主細胞。

【請求項6】

ベータ－カロテンを、レチナール、レチノール、及び／又は酢酸レチニルに変換するためのプロセスにおける、請求項１～５のいずれか一項に記載のカロテノイド産生真菌宿主細胞の使用。

【請求項7】

請求項１～５のいずれか一項に記載のカロテノイド産生真菌宿主細胞を適切な培養条件下、水性培地中で培養することと、前記培地及び／又は宿主細胞からトランス－酢酸レチニルを単離し、さらに精製することとを含む、トランス－酢酸レチニルの生産プロセス。

【請求項8】

（ａ）ベータ－カロテンからシス－及びトランス－レチナールを含むレチナール混合物への変換を触媒することのできる立体選択的ＢＣＯ、トランス－レチノールから酢酸レチニルへの変換を触媒することのできる真菌アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）［ＥＣ２．３．１．８４］、レチナールをレチノールに変換することのできるレチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）［ＥＣ１．１．１．１０５］をコードする核酸分子を適切な真菌宿主細胞に導入し、発現するステップと、
（ｂ）ベータ－カロテンを、シス－及びトランス－レチナールを含むレチナール混合物に酵素変換するステップであって、前記混合物におけるトランス－レチナールの割合が少なくとも６５％であるステップと、
（ｃ）前記レチナール混合物を、レチノールの生成に対して少なくとも９０％の全変換率でレチノールに酵素変換するステップと、
（ｄ）レチノールを酢酸レチニルに酵素変換するステップであって、前記宿主細胞により生成されたレチノイドの全量の少なくとも４０％が酢酸レチニルであるステップと
を含み、
導入された前記立体選択的ＢＣＯが、配列番号１、３、５、９、１１、１３、１５、１７に従うポリペプチドとの配列同一性が少なくとも９０％であるポリペプチドから選択され、導入された前記ＲＤＨが、配列番号１９に従うポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから選択され、導入された前記ＡＴＦが、配列番号３３に従うポリペプチドに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される、レチナール、レチノール、及び／又は酢酸レチニルの生産プロセス。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、多段階プロセスによってレチノイドを生産するための新規の酵素プロセスに関し、本プロセスは、カロテン産生宿主細胞における活性を有する異種酵素の使用を含み、特に、このようなプロセスは高い割合のトランス－アイソフォームのレチノイドをもたらす。

【0002】

ビタミンＡを含むレチノイドは、栄養による供給を受けなければならないヒトにとって非常に重要で不可欠な栄養素の１つである。レチノイドは、特に視覚、免疫系及び成長に関して、ヒトの健康な状態を促進する。

【0003】

ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドの現在の化学的生産方法は、例えば、高エネルギー消費、複雑な精製工程及び／又は望ましくない副産物などのいくつかの望ましくない特徴を有する。したがって、過去数十年間にわたって、ビタミンＡ及びその前駆体を含むレチノイドを製造するために、より経済的且つ生態学的であり得る、微生物変換工程を含む他のアプローチが研究されている。

【0004】

一般に、レチノイドを産生する生物系は産業的に扱いが困難であり、且つ／或いは非常に低レベルの化合物を生じるので、商業規模の単離が実用的でない。これには、このような生物系におけるレチノイドの不安定性、又は比較的高い副産物の生成を含むいくつかの理由がある。

【0005】

したがって、ベータ－カロテンからビタミンＡへの酵素変換の産物特異性及び／又は生産性を改善することが継続中の課題である。特に、前駆体及び／又は中間体の変換に関与する酵素の生産性及び選択性を最適化することが望ましい。

【0006】

驚くことに、我々は今回、レチノールの生成に対して少なくとも約１０％の全変換率で、且つ少なくとも６５％の割合がトランス－酢酸レチニルで、ベータ－カロテンから酢酸レチニルへの変換に関与する遺伝子を含み、且つそれを発現する改変宿主生物、例えば、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いて、レチニルエステル、特に酢酸レチニルを生産するためのプロセスを特定することができた。

【0007】

特に、本発明は、（１）ベータ－カロテンから、少なくとも６５％の割合でトランス－レチナールとして存在するレチナール混合物への変換を触媒する立体選択的／トランス選択的ベータ－カロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）と、（２）レチニルエステル、特に酢酸レチニルにアセチル化されるレチノールの全変換率が少なくとも１０％で、レチノールから酢酸レチニル混合物への変換を触媒するアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）であって、トランス－レチノールのアセチル化に対する優先性を有するＡＴＦとを含む宿主細胞、特にカロテノイド産生宿主細胞、例えば真菌宿主細胞に関する。好ましくは、少なくとも８０％のレチニルエステルは、好ましくはトランス－酢酸レチニルとしての酢酸レチニルの形態である。

【0008】

本発明に従うカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、任意選択的にさらに、（３）特にレチノールの生成に対して少なくとも約９０％の全変換率で、レチナールをレチノールに変換することができる（好ましくは、異種）レチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）を含む。

【0009】

本発明に従うカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、任意選択的にさらに、（４）内在性アシルトランスフェラーゼ活性、すなわちレチノールの長鎖レチニルエステルへのアシル化に対する活性の改変を含み、前記改変は、前記内在性アシルトランスフェラーゼ活性の低減又は消失をもたらす。

【0010】

本明細書で使用される場合、「真菌宿主細胞」という用語は、特に、宿主細胞としての酵母、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などを含む。

【0011】

本明細書で使用される場合、ＢＣＯに関して「立体選択的」、「選択的」、「トランス選択的」又は「トランス異性体選択的」酵素という用語は、本明細書において互換的に使用される。これらは、トランス異性体に対する触媒活性が増大された、すなわちベータ－カロテンからトランス－レチナールへの触媒作用に対する活性が増大された酵素、すなわち本明細書に開示されるＢＣＯを指す。本発明に従う酵素は、例えばトランス－レチナールなどのトランス－アイソフォームの割合が、このような酵素又はこのような酵素を含む／発現するようなカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約６５％の範囲であればトランス特異的である。

【0012】

本明細書で使用される場合、「ベータ－カロテン酸化酵素」、「ベータ－カロテンオキシゲナーゼ」、「ベータ－カロテン酸化活性を有する酵素」又は「ＢＣＯ」という用語は本明細書において互換的に使用され、トランス異性体選択的な方法でベータ－カロテンからレチナールへの変換を触媒することができ、前記宿主細胞によって産生されるレチナールを含むレチノイドの総量を基準として少なくとも約６５％、例えば、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までのトランス－アイソフォームのレチナールを有するレチナール混合物をもたらす酵素を指す。

【0013】

本明細書で定義されるトランス選択的ＢＣＯは、例えば、植物、動物、細菌、真菌、藻類などの任意の供給源から得ることができる。特に有用な立体選択的ＢＣＯは、子嚢菌門又は担子菌門から選択される真菌を含むがこれらに限定されない真菌、特にディカリアから得られ、好ましくは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）又はウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）から得られ、より好ましくは、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）又はＵ．マイディス（Ｕ．ｍａｙｄｉｓ）から単離され、例えば、ＦｆＣａｒＸ（ＡＪ８５４２５２に由来するポリペプチド配列）、ＵｍＣＣＯ１（ＥＡＫ８１７２６に由来するポリペプチド配列）などである。さらに、特に有用な立体選択的ＢＣＯは昆虫、特に双翅目から得られ、好ましくはドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）から、より好ましくはＤ．メラノガスター（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）から得られ、例えば、ＤｍＮｉｎａＢ又はＤｍＢＣＯ（ＮＰ＿６５０３０７．２に由来するポリペプチド配列）などである。さらに、特に有用な立体選択的ＢＣＯは植物、特に被子植物から得られ、好ましくはクロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）から、より好ましくはＣ．サティブス（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ）から得られ、例えば、ＣｓＺＣＯ（Ｑ８４Ｋ９６．１に由来するポリペプチド配列）などである。さらに、特に有用な立体選択的ＢＣＯは真核生物、特に魚綱（ｐｅｓｃｅｓ）から得られ、好ましくはダニオ属（Ｄａｎｉｏ）又はイクタルルス属（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）から、より好ましくはＤ．レリオ（Ｄ．ｒｅｒｉｏ）又はＩ．プンクタトゥス（Ｉ．ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）から得られ、例えば、ＤｒＢＣＯ１、ＩｐＢＣＯ（ＸＰ＿０１７３３３６３４に由来するポリペプチド配列）などである。

【0014】

したがって、１つの態様では、本発明は、ビタミンＡを含むレチノイドの生合成のために使用されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、配列番号１、３、５、７からなる群から選択されるデータベースから知られているポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチド又はこのような配列をコードするポリヌクレオチド、或いは配列番号９、１１、１３、１５、１７に従うポリペプチドに対して少なくとも５０％、例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチド又はこのような配列をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0015】

好ましくは、本明細書で定義されるカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞において異種発現される上記の立体選択的ＢＣＯに加えて、宿主細胞はさらに、（２）レチニルエステル、特に酢酸レチニルにアセチル化されるレチノールの全変換率が少なくとも１０％で、レチノールから酢酸レチニル混合物への変換を触媒するアセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）であって、トランス－レチノールのアセチル化に対する優先性を有するＡＴＦを含む。

【0016】

本明細書で使用される場合、「アセチルトランスフェラーゼ」、「レチノールアセチル化酵素」、「レチノールアセチル化活性を有する酵素」又は「ＡＴＦ」という用語は本明細書において互換的に使用され、トランス－アイソフォームで産生される酢酸レチニルが少なくとも８０％、約８７、９０、９２、９５、９７、９９又は最大１００％までの量で、レチノールから酢酸レチニルへの変換を触媒することができる酵素［ＥＣ２．３．１．８４］を指す。前記ＡＴＦは、レチニルエステル、例えば酢酸レチニルの生成に対して少なくとも約１０％、好ましくは１２、１５、２０、３０、４０、５０、８０、９０又はさらに１００％（前記宿主細胞により産生されるレチノイド混合物内のレチノイドの総量を基準として）の全変換率で、レチノール、好ましくはトランス－レチノールをレチニルエステル、特に酢酸レチニルに変換することができる。好ましいアイソフォームはＡＴＦ１である。

【0017】

本明細書で定義されるＡＴＦは、例えば、植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌などの任意の供給源から得ることができる。特に有用なＡＴＦ、好ましくはＡＴＦ１酵素は、酵母、特にサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）又はラカンケア属（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）から得られ、好ましくは、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、例えば、ＳｂＡＴＦ１（ＡＨＸ２３９５８．１に由来するポリペプチド配列）など、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｍｉｒａｎｔｉｎａ）（ＬｍＡＴＦ１；配列番号３３）、又はラカンケア・フェルメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）、例えばＬｆＡＴＦ１（ＳＣＷ０２９６４．１に由来するポリペプチド配列）若しくはＬｆｆＡＴＦ１（ＬＴ５９８４８７に由来するポリペプチド配列）などから得られる。さらに、特に有用なＡＴＦ１酵素は、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、エウオニムス属（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ）、マルス属（Ｍａｌｕｓ）、又はフラガリア属（Ｆｒａｇａｒｉａ）から選択される植物を含むがこれらに限定されない植物から得られ、好ましくは、Ｐ．ヒブリダ（Ｐ．ｈｙｂｒｉｄａ）、例えばＰｈＡＴＦ（ＡＢＧ７５９４２．１に由来するポリペプチド配列）、Ｅ．アラトゥス（Ｅ．ａｌａｔｕｓ）、例えばＥａＣＡｃＴ（ＡＤＦ５７３２７．１に由来するポリペプチド配列）、Ｍ．ドメスティカ（Ｍ．ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（ＡＹ５１７４９１に由来するポリペプチド配列）、又はＦ．アナナッサ（Ｆ．ａｎａｎａｓｓａ）（ＡＥＭ４３８３０．１に由来するポリペプチド配列）から得られる。さらに、特に有用なＡＴＦ１酵素は、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、好ましくは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られ、例えば、ＥｃＣＡＴ（ＥＤＳ０５５６３．１に由来するポリペプチド配列）などである。

【0018】

したがって、１つの態様では、本発明は、ビタミンＡを含むレチノイドの生合成のために使用されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、
（１）配列番号１、３、５及び７からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％、例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと、
（２）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３７又は３９に従うヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるような、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３６、又は３８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと
を含む。

【0019】

本発明の態様によると、カロテノイド産生宿主細胞は、（１）本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯと、（２）酢酸レチニル混合物中に少なくとも８０％の割合でトランス－アイソフォームとして存在する酢酸レチニルを生産するためのプロセスにおいて使用されるトランス作用性ＡＴＦ、好ましくはＡＴＦ１酵素とを含み、前記宿主細胞はさらに、レチノールの産生に対して少なくとも９０％の全変換率で、レチナールからレチノールへの還元を触媒する選択的レチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）を含む。

【0020】

本明細書で使用される場合、「レチナールレダクターゼ」、「レチノールデヒドロゲナーゼ」、「レチナール還元活性を有する酵素」又は「ＲＤＨ」という用語は本明細書において互換的に使用され、ほぼ独占的に（９０％以上）レチナールからレチノールへの変換を触媒することができる、すなわち、レチノールの形成に対して少なくとも約９０％、好ましくは９２、９５、９７、９８、９９又はさらに１００％の全変換率で、レチナールからレチノールへの変換を触媒することができる酵素［ＥＣ１．１．１．１０５］を指す。

【0021】

本発明の目的で、レチノールの形成に対して少なくとも約１８％、例えば、少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の増大をもたらす任意のレチナール還元酵素を本明細書で定義されるプロセスにおいて使用することができ、このような増大は、適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）菌株又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）菌株などに存在する内在性ＲＤＨを用いてレチノール形成において計算される。

【0022】

本明細書で定義されるような、レチノール形成、すなわちレチナール還元反応に対する活性を有するＲＤＨは、例えば、植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌などの任意の供給源から得ることができる。特に有用なＲＤＨは、子嚢菌門から選択される真菌を含むがこれらに限定されない真菌、特にディカリアから得られ、好ましくはフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から得られ、より好ましくはＦ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）から単離され、例えば、ＦｆＲＤＨ１２（配列番号１９）などである。

【0023】

したがって、さらなる態様では、本発明は、ビタミンＡを含むレチノイドの生合成のために使用されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、
（１）配列番号１、３、５及び７からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％、例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと、
（２）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３７又は３９に従うヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるような配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３６、又は３８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと、
（３）配列番号２０に従う核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号１９に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと
を含む。

【0024】

本発明の別の態様によると、本発明に従うカロテノイド産生宿主細胞は、少なくとも６５％の割合でトランス－アイソフォームとして存在する酢酸レチニルを生産するためのプロセスにおいて使用され、前記宿主細胞は、（１）本明細書で定義される立体選択的又はトランス選択的ＢＣＯと、（２）トランス－レチノールのアセチル化に対して優先性を有する、本明細書で定義されるＡＴＦ、例えばＡＴＦ１と、（３）レチナールの還元によるレチノールの形成に対して約９０％以上の活性を有するＲＤＨとを含み、任意選択的にさらに、内在性アシルトランスフェラーゼ活性の改変、例えば、レチノールから長鎖レチニルエステルへのアシル化に対する内在性活性の低減又は消失を含む。

【0025】

本明細書で使用される場合、「アシルトランスフェラーゼ」、「レチノールアシル化酵素」、「レチノールアシル化活性を有する酵素」という用語は本明細書では互換的に使用され、レチノールから長鎖レチニルエステルへの変換を触媒することができる酵素を指す。適切なアシル化酵素は、ＤＧＡＴ［ＥＣ２．３．１．２０］、例えば、ＤＧＡＴ１又はＤＧＡＴ２、ＡＲＡＴ、ｍｄｙを含むが、これらに限定されないアシル－ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼファミリーメンバー［ＥＣ２．３．１］から選択され得る。

【0026】

したがって、一実施形態では、本発明は、ビタミンＡを含むレチノイドの生合成のために使用されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、
（１）配列番号１、３、５及び７からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチド、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７から選択されるポリペプチドに対して少なくとも５０％、例えば、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９３、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと、
（２）配列番号２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３５、３７又は３９に従うヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるような配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３６、又は３８からなる群から選択されるポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと、
（３）配列番号２０に従う核酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる配列番号１９に従うポリペプチドに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９％又は最大１００％までの同一性を有するポリペプチドと、
（４）ＤＧＡＴ［ＥＣ２．３．１．２０］などの、レチノールから長鎖レチニルエステルへのアセチル化を触媒するアシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドの活性の低減又は消失と
を含む。

【0027】

本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を用いてレチノイドを生産するためのプロセスにおけるアシル化活性に関する改変は、アシルトランスフェラーゼ活性をコードする内在性遺伝子を低減又は消失させることを意味し、したがって、宿主細胞の改変前にそれぞれの内在性アシルトランスフェラーゼを発現する宿主細胞、すなわち内在性アシルトランスフェラーゼがまだ活性である宿主細胞と比較して、内在性アシルトランスフェラーゼの活性が低減又は消失、好ましくは消失されており、前記宿主細胞は、少なくとも約６５％をトランス－アイソフォームで含む酢酸レチニル混合物を産生することができるか、又は産生するために使用される。前記宿主細胞をビタミンＡの生産プロセスにおいて使用する場合、トランス－酢酸レチニルなどのトランス－アイソフォームの割合は、レチニルエステルの総量を基準として、約６５％以上、好ましくは、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８又は最大１００％まで増大され得る。

【0028】

レチノールアシルトランスフェラーゼ活性などの内在性遺伝子／タンパク質活性の低減又は消失は、例えば、アシルトランスフェラーゼ活性などの前記活性を有する酵素をコードする内在性遺伝子に突然変異を導入することによって達成され得る。当業者には、本明細書で定義される宿主細胞を遺伝子操作して、このような活性、例えばアシルトランスフェラーゼ活性の低減又は消失をもたらす方法が分かる。これらの遺伝子操作には、例えば、プラスミド、ウィルス、又は他のベクターを用いる遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、トランスフェクション、形質転換が含まれるが、これらに限定されない。

【0029】

核酸又はアミノ酸への突然変異の発生、すなわち突然変異誘発は、例えば、ランダム又は部位特異的（ｓｉｄｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発、例えば放射線などの作用物質によって生じる物理的損傷、化学的処理、又は遺伝因子の挿入などによる種々の方法で実施され得る。当業者には、突然変異を導入する方法が分かる。

【0030】

本明細書で定義される宿主細胞に、遺伝子及び／又はタンパク質、例えば、本明細書で定義されるアシル化酵素などのコピーを少ししか又は全く生じさせないため、すなわち、アシルトランスフェラーゼ活性を少ししか又は全く有さないようにするための改変は、弱いプロモーターの使用、又はそれぞれの酵素（本明細書に記載される）（の部分）、特にその調節要素の突然変異（例えば、挿入、欠失又は点突然変異）を含み得る。このような遺伝子操作の一例は、例えば、本明細書で定義される酵素のＮ末端領域により媒介されるＤＮＡとの相互作用、又は他のエフェクター分子との相互作用に影響を与え得る。特に、特異的な酵素活性の低減又は消失をもたらす改変は、タンパク質の機能性部分、例えば、触媒活性に対する機能性部分において実行され得る。さらに、酵素比活性の低減又は消失は、前記酵素を、特異的な阻害物質又はそれらと特異的に相互作用する他の物質と接触させることによって達成され得る。このような阻害物質を同定するために、それぞれの酵素、例えば、本明細書で定義されるアシル化酵素などは、その活性を阻害することが疑われる化合物の存在下で発現され、活性について試験され得る。

【0031】

本明細書で定義される宿主細胞に、遺伝子及び／又はタンパク質、例えば、本明細書で定義されるレチノールの形成に対する選択性を有する立体選択的ＢＣＯ、（トランス作用性）ＡＴＦ及び／又はＲＤＨなどのコピーをより多く生じさせるための改変は、強力なプロモーター、適切な転写及び／若しくは翻訳エンハンサーの使用、又はカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞への１つ若しくは複数の遺伝子コピーの導入を含み、所与の時間におけるそれぞれの酵素の蓄積の増大をもたらし得る。当業者には、宿主細胞に基づいてどの技術を使用するかが分かる。遺伝子発現の増大又は低減は、例えば、ノーザン、サザン又はウエスタンブロット技術などの当該技術分野で知られている種々の方法によって測定することができる。

【0032】

本明細書で定義される酵素の酵素触媒作用に関連する「変換」、「酸化」、「還元」、「アシル化」、「アセチル化」という用語は当該技術分野で認識されており、レチノイド、特に酢酸レチニルの形成／産生に対する酵素の作用を指す。

【0033】

好ましくは、本明細書で定義されるレチノイド、特に酢酸レチニルの生産プロセスにおいて使用される酵素は、異種酵素として発現される。これらは、適切な発現ベクターに組み込まれてもよいし、又は染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。レチノイドの産生、特に本明細書に記載される酢酸レチニルの産生に関与する酵素をコードする、発現ベクター上の又は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた異種ポリヌクレオチドを含むこのようなカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、組換え宿主細胞と呼ばれる。

【0034】

１つの特定の態様では、本発明は、レチノイド、特に、少なくとも約６５～９０％のトランス－アイソフォームの酢酸レチニルを有する酢酸レチニルを生産するためのプロセスにおいて使用される、本明細書で定義される１つ又は複数の（遺伝子）改変を保有するカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、アセチル化レチノール形態、すなわちレチニルエステル、例えば酢酸レチニルの割合は、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも約１０％である。

【0035】

本発明の別の態様によると、本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞で産生される細胞外レチノイドの量は、特に、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母を含む真菌から選択されるカロテノイド産生宿主細胞を用いて増大させることができる。したがって、本明細書に記載されるプロセスは、少なくとも８０％のレチノイド、例えば、８５、９０、９２、９５、９８、９９又は最大１００％までのレチノイド、特に、好ましくは少なくとも約８０％の割合でトランス－アイソフォームの酢酸レチニルを細胞外に排出させる。これは、特に、さらなる単離及び精製工程に関して有用である。

【0036】

本明細書に記載されるプロセスのために使用される適切なカロテノイド産生宿主細胞は、カロテノイド／レチノイドの産生に適しており、且つ本明細書に記載される機能的等価物又は誘導体を含む本明細書で開示される酵素の１つをコードする核酸の発現を可能にする任意の（微）生物から選択され得る。適切なカロテノイド／レチノイド産生宿主（微）生物の例は、細菌、藻類、酵母を含む真菌、植物又は動物細胞である。好ましい細菌は、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などのエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）（エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ））、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、例えばパラコックス・ゼアキサンチニファキエンス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｚｅａｘａｎｔｈｉｎｉｆａｃｉｅｎｓ）などのパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）のものである。好ましい真核微生物、特に酵母を含む真菌は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などのサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などのハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス・ブラケスレアヌス（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ ｂｌａｋｅｓｌｅａｎｕｓ）などのフィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、例えばブラケスレア・トリスポラ（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ ｔｒｉｓｐｏｒａ）などのブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）、又はヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。特に好ましいのは、例えば、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）若しくはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの真菌宿主細胞における発現、又はエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）における発現、より好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現である。

【0037】

本発明に関して、例えば、微生物、真菌、藻類、又は植物などの生物は、原核生物の国際命名規約（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）又は藻類、真菌、及び植物の国際命名規約（メルボルン規約（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ Ｃｏｄｅ））によって定義されるように、同じ生理学的特性を有するこのような種の同義語又はバソニムも含むことが理解される。したがって、例えば、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｍｉｒａｎｔｉｎａ）菌株は、日本由来のジゴサッカロミケス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種ＩＦＯ１１０６６菌株の同義語である。

【0038】

宿主細胞に応じて、本明細書で定義されるポリヌクレオチド、例えば、本明細書で定義されるＢＣＯ、ＲＤＨ、ＡＴＦをコードするポリヌクレオチドなどは、それぞれの宿主細胞における発現のために最適化され得る。当業者には、このような改変ポリヌクレオチドを作成する方法が分かる。本明細書で定義されるポリヌクレオチドは、このような宿主最適化核酸分子が本明細書で定義されるそれぞれの活性を有するポリペプチドを依然として発現する限り、これらも包含することが理解される。

【0039】

したがって、一実施形態では、本発明は、本明細書で定義されるＢＣＯ、ＡＴＦ、及び／又はＲＤＨをコードするポリヌクレオチドを含むカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に関し、これは、宿主細胞又は酵素の成長又は発現パターンに影響を与えずに、前記宿主細胞における発現のために最適化されている。特に、カロテノイド産生宿主細胞は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３５、３７及び３９からなる群から選択される最適化ポリヌクレオチド配列、又はそれに対して少なくとも６０％、例えば、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９％若しくは最大１００％までの同一性を有する配列を含む、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）などのヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択される。

【0040】

本発明は、（１）本明細書で定義される立体特異的ＢＣＯであって、ベータ－カロテンを前記ＢＣＯと接触させて、少なくとも６５％、例えば、少なくとも６５～９０％の割合のトランス－レチナールを有するレチナール混合物をもたらすことを含む、立体特異的ＢＣＯと、（２）本明細書で定義されるＡｔｆ１酵素の１つであって、レチノール、好ましくはトランス－レチノール、又は少なくとも６５～９０％がトランス－アイソフォームのレチノール混合物を、前記Ａｔｆ１酵素と接触させることを含む、Ａｔｆ１酵素の１つとの酵素活性によって、好ましくは少なくとも６５％の割合のトランス－酢酸レチニルを有する、酢酸レチニルを含むレチニルエステル混合物を生産するためのプロセスに関する。特に、本発明は、ビタミンＡの生産プロセスに関し、前記プロセスは、（ａ）（１）本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ酵素の１つ、及び（２）本明細書で定義されるＡｔｆ１酵素の１つをコードする核酸分子を、本明細書で定義される適切なカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入することと、（ｂ）ベータ－カロテンを、少なくとも約６５％のトランス－レチナールを有するレチナールに酵素変換すること、好ましくは少なくとも６５～９０％の割合のトランス－レチノールを有するレチノールを、前記発現されたＡｔｆ１の作用によって、トランス－及びシス－酢酸レチニルの混合物に酵素変換、すなわちアセチル化することと、（３）当業者に知られている適切な条件下で前記酢酸レチニルをビタミンＡに変換することとを含む。

【0041】

「配列同一性」、「同一性％」又は「配列相同性」という用語は、本明細書において互換的に使用される。本発明の目的で、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列相同性又は配列同一性の割合を決定するために、配列は最適な比較を目的として整列されることが本明細書において定義される。２つの配列間のアライメントを最適化するために、比較される２つの配列のいずれかにギャップが導入され得る。このようなアライメントは、比較されている配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アライメントは、より短い長さ、例えば約２０、約５０、約１００又はそれ以上の核酸／塩基又はアミノ酸にわたって行われてもよい。配列同一性は、報告された整列領域にわたる２つの配列間の同一マッチの割合である。２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、２つの配列のアライメントのためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３）を用いて決定され得る。アミノ酸配列及びヌクレオチド配列はいずれも、このアルゴリズムによって整列され得る。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－ＷｕｎｓｃｈアルゴリズムはコンピュータプログラムＮＥＥＤＬＥに実装されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージからのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｌｏｎｇｄｅｎ ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ２７６－２７７、ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列については、置換マトリックスのためにＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列につては、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択的パラメータは、１０のギャップ－オープンペナルティ及び０．５のギャップ伸長ペナルティである。当業者は、これらの異なるパラメータ全てがわずかに異なる結果をもたらし得るが、異なるアルゴリズムを用いたときに２つの配列の全体の同一性の割合は有意に変化されないことを認識するであろう。

【0042】

上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアライメントの後、クエリー配列と本発明の配列との間の配列同一性の割合は、以下のように計算される：両方の配列内の同一アミノ酸又は同一ヌクレオチドを示すアライメント内の対応する位置の数を、アライメント内のギャップの総数を差し引いた後のアライメントの全長で除する。本明細書で定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用することによってＮＥＥＤＬＥから得ることができ、プログラムの出力において「最長同一性」として標識される。比較される両方のアミノ酸配列が、そのアミノ酸のいずれにおいても違いがない場合、これらは同一である、すなわち１００％の同一性を有する。本明細書で定義される植物に由来する酵素に関して、当業者には、植物由来の酵素が例えば葉緑体プロセシング酵素（ＣＰＥ）などの特異的酵素により切断され得る葉緑体標的シグナルを含有し得ることが分かる。

【0043】

本明細書で定義される酵素は、酵素活性を変更しないアミノ酸置換を保有する酵素も包含し、すなわちこれらは野生型酵素に関して同じ特性を示し、特に、酢酸レチニルのトランス－アイソフォームの産生に対して少なくとも約６５％、例えば、少なくとも約６５～９０％の全変換率で、ベータ－カロテンからレチナール、レチナールからレチノール、レチノールから酢酸レチニルへの変換を触媒する。このような突然変異は「サイレント変異」とも呼ばれ、本明細書に記載される酵素の（酵素）活性を変更しない。

【0044】

本発明に従う核酸分子は、本発明により提供される核酸配列の一部のみ又は断片、例えば、プローブ若しくはプライマーとして使用され得る断片、又は本明細書で定義される酵素の一部をコードする断片を含み得る。本明細書で定義されるＢＣＯ、ＡＴＦ及び／又はＲＤＨをコードする遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他の種からの他の相同体の同定及び／又はクローニングにおいて使用するために設計されるプローブ及びプライマーの作成を可能にする。プローブ／プライマーは、通常、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含み、これは通常、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の少なくとも約１２又は１５、好ましくは約１８又は２０、より好ましくは約２２又は２５、さらにより好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、又は７５以上の連続ヌクレオチドに対して好ましくは高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。

【0045】

このようなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的な例は、約４５℃における６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のハイブリダイゼーションと、その後の、５０℃、好ましくは５５℃、より好ましくは６０℃、さらにより好ましくは６５℃における１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中の１回又は複数回の洗浄である。

【0046】

高ストリンジェント条件には、例えば、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むか又は含まないＤｉｇＥａｓｙＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）、又は５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、０．０２％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％Ｎ－ラウロイルサルコシン、及び２％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）を含む溶液などの溶液中でジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブ（ＤＩＧ標識化系；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，６８２９８ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙを用いて調製）を用いた４２℃における２時間～４日間のインキュベーションと、その後、室温において２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で５～１５分間フィルターを２回洗浄し、次に、６５～６８℃において０．５ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ又は０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５～３０分間２回洗浄することが含まれる。

【0047】

ベータ－カロテン産生遺伝子、本明細書に記載されるベータ－カロテンオキシダーゼ、本明細書で定義されるレチノールアセチル化酵素、本明細書で定義されるレチナール還元酵素、及び／又は任意選択的に、ビタミンＡの生合成に必要とされる更なる遺伝子を発現することができる、本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、好気性又は嫌気性条件下で適切な栄養分が補充された、種々の宿主細胞のために当業者により知られている水性培地中で培養され得る。任意選択的に、このような培養は、本明細書で定義される電子の移動に関与するタンパク質及び／又は補助因子の存在下で行われる。宿主細胞の培養／成長は、バッチ、流加バッチ（ｆｅｄ－ｂａｔｃｈ）、半連続又は連続モードで行うことができる。宿主細胞に応じて、好ましくは、例えば、ビタミンＡ及び前駆体（レチナール、レチノールなど）などのレチノイドの産生は、当業者に知られているように異なり得る。ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から選択されるベータ－カロテン及びレチノイド産生宿主細胞の培養及び単離は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から選択される宿主細胞におけるレチノイドの産生に関して、方法は、例えば、Ｊａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，１０：９５（２０１１）に記載されている。例えば、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母宿主細胞においてベータ－カロテン及びレチノイドを生産するための特定の方法は、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットに開示されている。

【0048】

本発明は、本明細書に記載される条件下でカロテノイド産生宿主細胞において、それぞれの宿主細胞によって産生されるレチノイドの総量を基準として、少なくとも約６５％がトランス－アイソフォームで存在し、且つ少なくとも約１０％の割合がアセチル化形態、すなわち酢酸レチニルであるレチノイド、特に酢酸レチニルを生産するためのプロセスに関する。産生されるレチノイド、特に酢酸レチニルは培地及び／又は宿主細胞から単離され、任意選択的にさらに精製され得る。

【0049】

本明細書で使用される場合、酵素に関して「比活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、すなわち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。比活性は、規定温度において所与の期間に規定量のタンパク質によって消費される基質及び／又は産生される産物の量を定義する。通常、比活性は、タンパク質１ｍｇ当たり１分間に消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）で略される。したがって、μｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）という比活性の単位の定義は、本文書を通して互換的に使用される。酵素は、インビボで、すなわち本明細書で定義される宿主細胞内、又は適切な基質が存在する系内でその触媒活性を実施すれば活性である。当業者には、酵素活性、特に、本明細書で定義されるＢＣＯ、ＲＤＨ又はＡＴＦの活性の測定方法が分かる。レチノイド産生について本明細書で定義される適切な酵素の能力を評価するための分析方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの実施例４などに記載されている。簡単には、産物のレチノイド及びカロテノイドなどの力価は、ＨＰＬＣによって測定することができる。

【0050】

本明細書で使用される場合、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、カロテノイド、例えばベータ－カロテンの産生をもたらす宿主細胞である。カロテノイド産生宿主細胞を作成するための遺伝子及び方法は当該技術分野において知られており、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットが参照される。産生されるカロテノイドに応じて、異なる遺伝子が関与し得る。

【0051】

本明細書で使用される場合、レチノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞は、それぞれのポリペプチドがインビボで発現され且つ活性であり、ベータ－カロテンからレチナール、レチノール及び酢酸レチニルへの酵素変換によって、レチノイド、例えば、ビタミンＡ及びその前駆体の産生をもたらす宿主細胞である。これらのポリペプチドは、本明細書で定義されるＢＣＯ、ＲＤＨ及びＡＴＦを含む。ビタミンＡ経路の遺伝子、及びレチノイド産生宿主細胞の作成方法は、当該技術分野において知られている。好ましくは、ベータ－カロテンはベータ－カロテン酸化酵素の作用によってレチナールに変換され、レチナールは本明細書で定義されるＲＤＨの作用によってさらにレチノールに変換され、レチノール、好ましくはトランス－レチノールは、アセチル－トランスフェラーゼ酵素、例えばＡＴＦ１などの作用によって酢酸レチノールに変換される。酢酸レチノールは、宿主細胞から単離される最適なレチノイドであり得る。

【0052】

本明細書で使用されるレチノイドは、レチナール、レチノール酸、レチノール、レチノイン酸メトキシド（ｒｅｔｉｎｏｉｃ ｍｅｔｈｏｘｉｄｅ）、酢酸レチニル、レチニルエステル、４－ケト－レチノイド、３ヒドロキシ－レチノイド又はこれらの組合せを含むが、これらに限定されないアポカロテノイドとしても知られているベータカロテン切断産物を含む。本明細書で使用される長鎖レチニルエステルは、少なくとも約８個、例えば、９、１０、１２、１３、１５又は２０個の炭素原子及び最大約２６個まで、例えば、２５、２２、２１個又はそれより少ない炭素原子からなり、好ましくは最大約６個までの不飽和結合、例えば、０、１、２、４、５、６個の不飽和結合を有する炭化水素エステルを定義する。長鎖レチニルエステルは、リノール酸、オレイン酸又はパルミチン酸を含むが、これらに限定されない。レチノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレットに記載されている。

【0053】

本明細書で使用されるレチナールは、ＩＵＰＡＣ名（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）－３，７－ジメチル－９－（２，６，６－トリメチルシクロヘキセン－１－イル）ノナ－２，４，６，８－テトラエナールで知られている。これは、本明細書では互換的にレチンアルデヒド又はビタミンＡアルデヒドと称され、シス－及びトランス－アイソフォームの両方、例えば、１１－シスレチナール、１３－シスレチナール、トランス－レチナール及び全トランスレチナールなどが含まれる。

【0054】

本明細書で使用される「カロテノイド」という用語は、当該技術分野においてよく知られている。これは、２つの２０炭素ゲラニルゲラニルピロリン酸分子の連結により天然で形成される長い４０炭素の結合イソプレノイドポリエンを含む。これらには、４－ケト位置又は３－ヒドロキシ位置で酸化されてカンタキサンチン、ゼアキサンチン、又はアスタキサンチンをもたらし得る、フィトエン、リコペン、及び例えばベータ－カロテンなどのカロテンが含まれるが、これらに限定されない。カロテノイドの生合成は、例えば、国際公開第２００６１０２３４２号パンフレットに記載される。

【0055】

本明細書で使用されるビタミンＡは、水溶液中に見られるビタミンＡの任意の化学形態（例えば、その遊離酸形態で非解離、又はアニオンとして解離）であり得る。本明細書で使用される用語は、生物工学的ビタミンＡ経路における全ての前駆体又は中間体を含む。また、酢酸ビタミンＡも含む。

【0056】

特に、本発明は、本実施形態を特徴とする：

【0057】

－ カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞であって、（ａ）立体選択的ベータ－カロテン酸化酵素（ＢＣＯ）であって、前記宿主細胞がシス－及びトランス－レチナールを含むレチナール混合物を産生し、前記宿主細胞によって産生される混合物中のトランス－レチナールの割合が少なくとも約６５％、好ましくは、６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までである、立体選択的ベータ－カロテン酸化酵素（ＢＣＯ）と、（ｂ）アセチルトランスフェラーゼ（ＡＴＦ）［ＥＣ２．３．１．８４］、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１（Ａｔｆ１）活性を有する酵素であって、レチノール、好ましくはトランス－レチノールから、前記宿主細胞により産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも１０％の割合のアセチル化レチノール、すなわち酢酸レチニルを有する酢酸レチニル混合物への変換を触媒する酵素とを含む、カロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0058】

－ アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］、好ましくはアセチルトランスフェラーゼ１活性を有する酵素がレチノールから酢酸レチニル混合物への変換を触媒し、混合物が、少なくとも約６５％、好ましくは６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までの酢酸レチニル、例えば、少なくとも６５～９０％のトランス－アイソフォームの酢酸レチニルを含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0059】

－ レチノールの生成に対して少なくとも約９０％の全変換率でレチナールをレチノールに変換することができる（好ましくは異種）レチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）［ＥＣ１．１．１．１０５］、好ましくは、子嚢菌門から選択される真菌を含むがこれらに限定されない真菌、特にディカリアから得られ、より好ましくは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）から得られ、さらにより好ましくは、Ｆ．フジクロイ（Ｆ．ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）から単離されるＲＤＨ、例えば、ＦｆＲＤＨ１２（配列番号１９）に対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドをさらに含む、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0060】

－ 内在性アシルトランスフェラーゼ活性の改変をさらに含み、内在性アシルトランスフェラーゼ活性、好ましくは［ＥＣ２．３．１］活性、より好ましくはアシルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．２０］活性が低減又は消失されている、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0061】

－ ＢＣＯが真菌、植物又は動物から選択され、好ましくは、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ダニオ属（Ｄａｎｉｏ）、イクタルルス属（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ）、エソックス属（Ｅｓｏｘ）、ラティメリア属（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ）から選択され、より好ましくは、フザリウム・フジクロイ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）、ウスチラゴ・マイディス（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）、クロクス・サティブス（Ｃｒｏｃｕｓ ｓａｔｉｖｕｓ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、イクタルルス・プンクタトゥス（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）、エソックス・ルキウス（Ｅｓｏｘ ｌｕｃｉｕｓ）、ラティメリア・カルムナエ（Ｌａｔｉｍｅｒｉａ ｃｈａｌｕｍｎａｅ）から選択され、さらにより好ましくは、配列番号１、３、５若しくは７に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチド、又は配列番号９、１１、１３、１５若しくは１７に従うポリペプチド配列に対して少なくとも約５０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0062】

－ アセチルトランスフェラーゼ、好ましくはＡｔｆ１が植物、ヒトを含む動物、藻類、酵母を含む真菌、又は細菌から選択され、好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、フラガリア属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エウオニムス属（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ）、マルス属（Ｍａｌｕｓ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、又はラカンケア属（Ｌａｃｈａｎｃｅａ）から選択され、より好ましくは、サッカロミケス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ）、フラガリア・アナナッサ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エウオニムス・アラトゥス（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ ａｌａｔｕｓ）、マルス・ドメスティカ（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）、ペチュニア・ヒブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）、ラカンケア・ミランティナ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｍｉｒａｎｔｉｎａ）又はラカンケア・フェルメンタティ（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ）から選択され、さらにより好ましくは、配列番号２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３６、又は３８に従うポリペプチドに対して少なくとも約６０％の同一性を有するポリペプチドから選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0063】

－ 少なくとも約６５％、好ましくは６８、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は最大１００％までのトランス－酢酸レチニルアイソフォーム、例えば、少なくとも６５～９０％のトランス－酢酸レチニルアイソフォームを含む酢酸レチニル混合物を産生する、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0064】

－ 宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、酵母を含む真菌から、より好ましくは、サッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、フィコミケス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、スポロボロミケス属（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、キサントフィロミセス属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、ブラケスレア属（Ｂｌａｋｅｓｌｅａ）又はヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）から、さらにより好ましくは、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はサッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。

【0065】

－ 宿主細胞が、植物、真菌、藻類又は微生物から選択され、好ましくは、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ストレプトミケス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シネココックス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ミクロコックス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ミクソコックス属（Ｍｉｘｏｃｏｃｃｕｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ゴルドニア属（Ｇｏｒｄｏｎｉａ）、ディエトジア属（Ｄｉｅｔｚｉａ）、ムリカウダ属（Ｍｕｒｉｃａｕｄａ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シノコキスティス属（Ｓｙｎｏｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）又はパラコックス属（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）から選択される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞。

【0066】

－ ベータ－カロテンをビタミンＡに変換するためのプロセスにおいて使用される、上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞。

【0067】

－ 上記の及び本明細書で定義されるカロテノイド産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞を適切な培養条件下、水性培地中で培養することと、培地及び／又は宿主細胞から前記トランス－酢酸レチニルを単離し、任意選択的にさらに精製することとを含む、トランス－酢酸レチニルの生産プロセス。

【0068】

－ （ａ）本明細書で定義される立体選択的ＢＣＯ、本明細書で定義されるアセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］、任意選択的に、本明細書で定義されるレチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］をコードする核酸分子を、適切なカロテン産生宿主細胞、特に真菌宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の細胞の本明細書で定義される内在性アシルトランスフェラーゼ活性［ＥＣ２．３．１］を低減又は消失させるステップと、
（ｃ）ベータ－カロテンを、トランス対シス比が４の酢酸レチニルを含む酢酸レチニル混合物に酵素変換するステップと、
（ｄ）適切な培養条件下で酢酸レチニルをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。

【0069】

－ （ａ）立体選択的ＢＣＯ、アセチルトランスフェラーゼ［ＥＣ２．３．１．８４］、任意選択的にレチノールデヒドロゲナーゼ［ＥＣ１．１．１．１０５］をコードする核酸分子を適切な宿主細胞に導入するステップと、
（ｂ）任意選択的に、ステップ（ａ）の細胞の内在性アシルトランスフェラーゼ活性［ＥＣ２．３．１］を低減又は消失させるステップと、
（ｃ）ベータ－カロテンを、少なくとも１０％の割合の酢酸レチニルを含むレチノイドに酵素変換するステップであって、前記酢酸レチニルが、産生されるレチノイドの総量を基準として少なくとも６５％の割合のトランスアイソフォームを含む、ステップと、
（ｄ）適切な培養条件下で酢酸レチニルをビタミンＡに変換するステップと
を含む、ビタミンＡの生産プロセス。

【0070】

以下の実施例は説明のためだけのものであって、本発明の範囲を限定することは全く意図されない。本出願全体を通して引用される全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に国際公開第２００６１０２３４２号パンフレット、国際公開第２００８０４２３３８号パンフレット又は国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットの内容は、参照によって本明細書に援用される。

【0071】

［実施例］
［実施例１：一般的な方法、菌株、及びプラスミド］
本明細書に記載される全ての基本的な分子生物学及びＤＮＡ操作手順は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９８）に従って実施される。

【0072】

［振とうプレートアッセイ］
通常、８００μｌの０．０７５％酵母抽出物、０．２５％ペプトン（０．２５Ｘ ＹＰ）に、１０μｌの新たに成長させたヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）を播種し、８００μｌの鉱油（Ｄｒａｋｅｏｌ５、Ｐｅｎｒｅｃｏ Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋａｒｎｓ Ｃｉｔｙ，ＰＡ，ＵＳＡ）でオーバーレイし、炭素源として鉱油中５％のコーン油及び／又は水相中５％のグルコースを用いた。２４ウェルプレート（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｄｅｖｉｃｅｓ ２４ Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｐｌａｔｅｓ Ｗｈａｔｍａｎ ７７０１－５１０２）において形質転換体を成長させ、マットシール（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓａｌｅｓ ａｎｄ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ．Ｐｌａｔｅ Ｍａｔｓ ２４０１０ＣＭ）で被覆し、Ｑｉａｇｅｎ Ａｉｒｐｏｒｅ Ｔａｐｅ Ｓｈｅｅｔｓ（１９５７１）で無菌密封し、Ｉｎｆｏｒｓマルチプレートシェーカー（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ）においてＹＰＤ培地中３０℃、８００ＲＰＭで４日間振とうさせた。鉱油画分を振とうプレートウェルから取り出し、フォトダイオードアレイ検出器を用いて、順相カラムでＨＰＬＣにより分析した。この方法は実施例２、３、４において使用される。

【0073】

［ＤＮＡ形質転換］
菌株をＹＰＤプレート培地上で一晩成長させることにより形質転換させる。５０μｌの細胞をプレートからこすり取り、１μｇの形質転換ＤＮＡ、通常は組込み形質転換のための直鎖ＤＮＡ、４０％のＰＥＧ ３５５０ＭＷ、１００ｍＭの酢酸リチウム、５０ｍＭのジチオスレイトール、５ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ（ｐＨ８．０）、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む５００μｌ中、４０℃で６０分間のインキュベーションにより形質転換させ、選択培地に直接プレーティングするか、或いは優性抗生物質マーカー選択の場合は、細胞をＹＰＤ液体培地において３０℃で４時間増殖させた後、選択培地にプレーティングする。

【0074】

［ＤＮＡ分子生物学］
ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）においてＮｈｅｌ及びＭｌｕｌ末端を用いて遺伝子を合成した。国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットの場合のように、通常、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）形質転換におけるマーカー選択のために、遺伝子をＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」、ＭＢ６１５７ＨｙｇＲ、及びＭＢ８３２７ＮａｔＲベクターにサブクローニングした。遺伝子及びマーカーＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａｌ（ＭＢ５０８２）又はＰｖｕｌｌ（ＭＢ６１５７及びＭＢ８３２７）のランダム非相同末端結合によるクリーンな遺伝子挿入のために、それぞれゲル電気泳動及びＱｉａｇｅｎゲル精製カラムにより精製した。ＭＢ５０８２「ＵＲＡ３」マーカーは、ＦＯＡにおけるＵＲＡ３カセットの環状切除（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｅｘｃｉｓａｎｔ）の選択を可能にする無償性の反復隣接配列のために再使用が可能であった。ＮａｔＲ及びＨｙｇＲマーカーは、隣接Ｌｏｘ部位のために切除をもたらすＣｒｅリコンビナーゼの一過性発現によって除去することができる。

【0075】

［プラスミドのリスト］
使用するプラスミド、菌株、ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、表１、２及び配列表に記載される。ヌクレオチド配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３５、３７、及び３９は、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における発現に対してコドン最適化される。

【0076】

【表1】

【0077】

【表2】

【0078】

［順相レチノール法］
Ｗａｔｅｒｓ ７１７オートサンプラーに取り付けたＷａｔｅｒｓ １５２５バイナリーポンプを用いて、サンプルを注入した。安全シリカガードカラムキットを有するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ ３μ Ｓｉｌｉｃａ（２），１５０ｘ４．６ｍｍを使用して、レチノイドを分離した。移動相は、アスタキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、３０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸、又はゼアキサンチン関連化合物に対する１０００ｍＬのヘキサン、６０ｍＬのイソプロパノール、及び０．１ｍＬの酢酸のいずれかからなる。それぞれの流速は、０．６ｍＬ／分である。カラム温度は周囲温度である。注入容積は２０μＬである。検出器は、２１０ｎｍから６００ｎｍまでを収集するフォトダイオードアレイ検出器である。表３に従って分析物を検出した。

【0079】

【表3】

【0080】

［サンプル調製］
条件に応じて種々の方法によりサンプルを調製した。全培養液又は洗浄培養液サンプルのために、培養液を秤量したＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）管に入れ、移動相を添加した。製造指示書に従って最高設定３ＸにおいてＰｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ホモジナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ Ｃｏｒｐ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）内でサンプルを処理した。洗浄培養液中、サンプルを微量遠心管において１００００ｒｐｍで１分間、１．７ｍｌ管内で回転させ、培養液をデカントし、１ｍｌの水を添加し、混合し、ペレットにし、デカントして、元の容積にした。混合物を再度ペレットにし、適切な量の移動相中に入れ、Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）ビーズビーティングにより処理した。鉱油画分の分析のために、サンプルを４０００ＲＰＭで１０分間回転させ、ポジティブディスプレイスメントピペット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｕｐｐａｕｇｅ，ＮＹ，ＵＳＡ）により油を上部からデカントして除去し、移動相中に希釈し、ボルテックスにより混合し、ＨＰＬＣ分析によりレチノイド濃度を測定した。

【0081】

［発酵条件］
発酵は既に記載された条件と同一であり、好ましくはシリコーン油又は鉱油のオーバーレイと、好ましくは、０．５Ｌ～５Ｌの全容積のベンチトップ反応器内に供給されたグルコース又はコーン油である攪拌槽とを用いた（国際公開第２０１６１７２２８２号パンフレットを参照）。一般的に、生産性が増大された流加バッチ攪拌漕反応器を用いて同じ結果が観察され、レチノイドの生産のためのシステムの有用性が実証された。好ましくは、５％のグルコースを用いて発酵をバッチ処理し、溶解酸素が急落した後に２０％のシリコーン油を添加し、供給を再開して、供給プログラムを通して２０％の溶解酸素を達成した。或いは、供給物としてコーン油を使用し、脂肪族レチノイドを捕集するための第２の相として鉱油を使用した。

【0082】

［実施例２：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるベータ－カロテンからレチナールへの変換］
異種ＢＣＯの発現のために、Ｈｉｎｄｌｌ及びＸｂａｌ媒介による制限エンドヌクレオチド切断と、ＵＲＡ３栄養マーカーに連結されたコドン最適化断片を含有するベータカロテンオキシダーゼ（ＢＣＯ）のゲル精製とにより、ベータカロテン菌株ＭＬ１７５４４を精製直鎖ＤＮＡ断片で形質転換した。形質転換ＤＮＡは、ＭＢ６７０２ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＮｉｎａＢ ＢＣＯ遺伝子、ＭＢ６７０３クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）ＢＣＯ遺伝子、ＭＢ８４５６フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＢＣＯ遺伝子、及びＭＢ８４５７ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）ＢＣＯ遺伝子及びＭＢ６０９８ダリオ属（Ｄａｒｉｏ）ＢＣＯ遺伝子に由来し、それにより、コドン最適化配列（配列番号２、４、６、８、１０、１２）が使用された。次に、遺伝子を成長させ、振とうプレート分析において６～８の単離株をスクリーニングし、うまく機能する単離株を流加バッチ攪拌漕反応器において８～１０日間実行させた。国際公開第２０１４０９６９９２号パンフレットに記載されるような標準パラメータを用いるが、レチノイド分析物の精製標準物を用いて較正して、ＨＰＬＣによりシス－及びトランス－レチナールの検出を行った。レチナール混合物中のトランス－レチナールの量は、それぞれ、９０％（クロクス属（Ｃｒｏｃｕｓ）ＢＣＯを使用）、９５％（フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＢＣＯを使用）、９８％（ウスチラゴ属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）ＢＣＯを使用）及び９８％（ダリオ属（Ｄａｒｉｏ）ＢＣＯを使用）まで増大させることができた。ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（配列番号７）からのＢＣＯとの比較では、レチナールの総量を基準として６１％のトランス－レチナールが得られた（表４を参照）。

【0083】

【表4】

【0084】

［実施例３：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチナールからレチノールへの変換］
異種ＲＤＨの発現のために、ベータカロテン菌株ＭＬ１７７６７を、ＵＲＡ３プロモーターへのレチノールデヒドロゲナーゼ（ＲＤＨ）遺伝子断片リンカーを含有するプラスミド由来の精製ＨｉｎＤＩＩＩ／Ｘｂａｌ断片で形質転換した。６～８の単離株を振とうプレートアッセイレチノール：レチナール比の低下についてスクリーニングし、成功した単離株を流加バッチ攪拌漕反応器において８日間実行させ、プロセスの生産性の一桁の増大が示され、大規模生産における有用性が示された。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）ＲＤＨ１２相同体を用いて最良の結果が得られ、上記のような８日間の振とうフラスコインキュベーションの後に維持された残留レチナールはわずか２％であった。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）配列に由来する単離株は、レチノールの還元の増大を実証した。

【0085】

［実施例４：ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）におけるレチノールから酢酸レチニルへの変換］
異種ＡＴＦ１の発現のために、トランスレチノール産生菌株ＭＬ１７９６８を、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）での選択のためにハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＲ）に連結されたアセチルトランスフェラーゼ遺伝子断片を含有する精製Ｐｖｕｌｌ遺伝子断片で形質転換した。プレーティングの前に培養物をＹＰＤ中で４時間増殖させて、抗生物質耐性遺伝子を合成した。振とうプレートアッセイにおいてアシル化について単離株をスクリーニングし、成功した単離株を流加バッチ攪拌漕反応器においてスクリーニングし、生産性の一桁の増大が示され、レチノイドの生産における有用性が示された。分析からのデータは表５に示される。

【0086】

【表5】

【0087】

［実施例５：ＡＴＦ１活性アッセイ］
異種ＡＴＦ１の発現のために、トランスレチノール産生菌株ＭＬ１７９６８を、１００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンを含有するリッチ培地（ＹＰＤ）における選択のためにハイグロマイシン耐性マーカー（ＨｙｇＲ）に連結されたアセチルトランスフェラーゼ遺伝子断片を含有する精製Ｐｖｕｌｌ遺伝子断片で形質転換した。プレーティングの前に培養物をＹＰＤ中で４時間増殖させて、抗生物質耐性遺伝子を合成した。特に、オーバーレイとしてのシリコーン油と共に０．２５Ｘ ＹＰ中の炭素源として１０％のグルコースを用いて、振とうプレートアッセイにおいてアシル化について単離株をスクリーニングし、成功した単離株をグルコース供給物及びシリコーン油オーバーレイと共に流加バッチ攪拌漕反応器においてさらにスクリーニングし、生産性の一桁の増大が示され、レチノイドの生産における有用性が示された。分析からのデータは表５に示される。

【0088】

［実施例６：サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるベータ－カロテンから酢酸レチニルへの変換］
通常、ベータカロテン菌株は、当該技術分野において知られている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０１３０６２８号明細書又は国際公開第２００９１２６８９０号パンフレットに記載される）ような標準的方法に従って、ベータカロテンを産生している構築されたゲラニルゲラニルシンターゼ、フィトエンシンターゼ、リコペンシンターゼ、リコペンシクラーゼなどの酵素をコードする異種遺伝子で形質転換される。さらに、ベータカロテンオキシダーゼ遺伝子で形質転換される場合、レチナールを産生することができる。さらに、レチノールデヒドロゲナーゼで形質転換されると、レチノールを産生することができる。レチノールは、アルコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子による形質転換によってアセチル化され得る。任意選択的に、内在性レチノールアシル化遺伝子を欠失させることができる。さらに、酵素は、レチノールのトランス形態を産生及びアシル化して、それぞれ、全トランス酢酸レチニル及びトランスレチノールの長鎖エステルをもたらすように選択することができる。このアプローチを用いて、トランス－アイソフォームに対する特異性、又は酢酸レチニルに対する生産性に関して同様の結果が得られる。

【配列表】

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