特許 7473251 ゲノム解析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-15

(45)【発行日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ゲノム解析方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6869 20180101AFI20240416BHJP

   C12Q 1/6806 20180101ALI20240416BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20240416BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240416BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6869 Z

C12Q1/6806 Z

C12Q1/6844 Z

G01N33/50 P

G01N33/50 F

G01N33/50 G

G01N33/50 X

G01N33/50 Z

【請求項の数】 11

(21)【出願番号】P 2022569943

(86)(22)【出願日】2021-12-10

(86)【国際出願番号】 JP2021045487

(87)【国際公開番号】W WO2022131150

(87)【国際公開日】2022-06-23

【審査請求日】2023-01-20

(31)【優先権主張番号】P 2020208026

(32)【優先日】2020-12-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和元年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、戦略的創造研究推進事業、「レドックス環境応答能を持つ歯周病細菌由来の膜小胞」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

(73)【特許権者】

【識別番号】301023238

【氏名又は名称】国立研究開発法人物質・材料研究機構

(72)【発明者】

【氏名】岡本 章玄

【審査官】白井 美香保

(56)【参考文献】

【文献】特表２０１９－５３５３０７（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２０１５／００６６８２４（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２０１７－５０９３２４（ＪＰ，Ａ）

【文献】国際公開第２０１９／２１６２７１（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｑ １／００－３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡＰＬＵＳ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞と、前記細胞で産生され、前記細胞外に放出された膜小胞と、を含む懸濁液から、前記細胞と前記膜小胞とを分離し、前記細胞を含む第１試料と、前記膜小胞を含む第２試料とを調製することと、
前記第１試料に含まれる前記細胞に由来する塩基配列である、第１塩基配列を決定することと、
前記第２試料に含まれる前記膜小胞に由来する塩基配列である、第２塩基配列を決定することと、
前記第２塩基配列を用いて、前記第１塩基配列を補完することと、を含む、ゲノム解析方法。

【請求項2】

前記第１塩基配列の決定が、前記第１試料の単一細胞解析によって行われる、請求項１に記載のゲノム解析方法。

【請求項3】

前記第１塩基配列の決定が、前記第１試料のメタゲノム解析によって行われる、請求項１に記載のゲノム解析方法。

【請求項4】

前記第２塩基配列を決定することが、
前記第２試料を用い、前記膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入することと、
前記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、
前記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、前記膜小胞を溶解させ、前記膜小胞中のポリヌクレオチドが前記ゲルカプセルに溶出し、前記ゲルカプセル内に保持させることと、
前記ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させて、前記ポリヌクレオチドを前記ゲルカプセル内で増幅することと、
前記増幅したポリヌクレオチドから、前記膜小胞に由来する前記ポリヌクレオチドの塩基配列である第２塩基配列を決定することと、を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のゲノム解析方法。

【請求項5】

前記第２塩基配列を決定することが、
更に、前記第２試料を核酸分解酵素で処理することを含む、請求項４に記載のゲノム解析方法。

【請求項6】

前記第２塩基配列を決定することが、
前記処理を経た前記第２試料と、前記処理を経ない前記第２試料のそれぞれを用いて行われる、請求項５に記載のゲノム解析方法。

【請求項7】

前記補完することが、前記第２塩基配列を前記第１塩基配列の断片として用いることである、請求項１～６のいずれか１項に記載のゲノム解析方法。

【請求項8】

前記補完することが、前記第１塩基配列のカバー率を向上させることである、請求項１～７のいずれか１項に記載のゲノム解析方法。

【請求項9】

前記懸濁液が、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、並びに、皮膚又は身体粘膜の拭い液、及び、スワブからなる群より選択される少なくとも１種の採取試料である、請求項１～８のいずれか１項に記載のゲノム解析方法。

【請求項10】

前記細胞が、細菌である、請求項１～９のいずれか１項に記載のゲノム解析方法。

【請求項11】

前記細菌が、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、フソバクテリウム属、パルビモナス属、アグリゲイティバクター属、アクチノマイセス属、アクチノバチルス属、バクテロイデス属、タンネレラ属、トレポネーマ属、カンピロバクター属、エイケネラ属、及び、カプノサイトファーガ属からなる群より選択される少なくとも１種の細菌である、請求項１０に記載のゲノム解析方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ゲノム解析方法に関する。

【背景技術】

【0002】

単一細胞解析を行う方法、及び、そのための装置が知られている。
特許文献１には「２つ以上の細胞または細胞様構造物を含む試料を用い、該細胞または細胞様構造物を１細胞または構造物単位ずつ液滴中に封入する工程と、該液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程と、該ゲルカプセルを１種以上の溶解用試薬に浸漬して前記細胞または細胞様構造物を溶解する工程であって、該細胞中のポリヌクレオチドが該ゲルカプセル内に溶出し該ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態で前記ゲルカプセル内に保持される、工程と、該ポリヌクレオチドを増幅用試薬に接触させて該ポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅する工程とを含む、細胞または細胞様構造物中のポリヌクレオチドを増幅する方法。」が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【文献】国際公開第２０１９／２１６２７１号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

多様な細胞を含む生物学的サンプルに難培養性細胞が含まれる場合、その難培養性細胞の機能解析のためには、その生物学的サンプルの全ゲノム解析が不可欠とされてきた。特許文献１に記載されるような単一細胞解析は、１細胞を分離し、その細胞中のポリヌクレオチドを増幅して読み取ることができるため、特に難培養性細胞の全ゲノム解析に大きく貢献している。また、個々の細胞に分離せずに行う、従来公知の全ゲノム（メタゲノム）解析も、依然として上記のような目的には有用である。

【0005】

しかし、特許文献１に記載された単一細胞解析においては、各細胞由来のポリヌクレオチドを増幅してシークエンスするため、増幅過程に問題があると、配列カバー率が不十分になることがあった。また、メタゲノム解析においては、十分な品質のドラフトゲノムを得ようとすることは原理的に難しい場合が多い。

【0006】

そこで本発明は、より簡便に、高品質な全ゲノム解析結果を得ることができる、ゲノム解析方法を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

【0008】

［１］ 細胞と、上記細胞で産生され、上記細胞外に放出された膜小胞と、を含む懸濁液から、上記細胞と上記膜小胞とを分離し、上記細胞を含む第１試料と、上記膜小胞を含む第２試料とを調製することと、上記第１試料に含まれる上記細胞に由来する塩基配列である、第１塩基配列を決定することと、上記第２試料に含まれる上記膜小胞に由来する塩基配列である、第２塩基配列を決定することと、上記第２塩基配列を用いて、上記第１塩基配列を補完することと、を含む、ゲノム解析方法。
［２］ 上記第１塩基配列の決定が、上記第１試料の単一細胞解析によって行われる、［１］に記載のゲノム解析方法。
［３］ 上記第１塩基配列の決定が、上記第１試料のメタゲノム解析によって行われる、［１］に記載のゲノム解析方法。
［４］ 上記第２塩基配列を決定することが、上記第２試料を用い、上記膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入することと、上記液滴をゲル化してゲルカプセルを生成することと、上記ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、上記膜小胞を溶解させ、上記膜小胞中のポリヌクレオチドが上記ゲルカプセルに溶出し、上記ゲルカプセル内に保持させることと、上記ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させて、上記ポリヌクレオチドを上記ゲルカプセル内で増幅することと、上記増幅したポリヌクレオチドから、上記膜小胞に由来する上記ポリヌクレオチドの塩基配列である第２塩基配列を決定することと、を含む、［１］～［３］のいずれかに記載のゲノム解析方法。
［５］ 上記第２塩基配列を決定することが、更に、上記第２試料を核酸分解酵素で処理することを含む、［４］に記載のゲノム解析方法。
［６］ 上記第２塩基配列を決定することが、上記処理を経た上記第２試料と、上記処理を経ない上記第２試料のそれぞれを用いて行われる、［５］に記載のゲノム解析方法。
［７］ 上記補完することが、上記第２塩基配列を上記第１塩基配列の断片として用いることである、［１］～［６］のいずれかに記載のゲノム解析方法。
［８］ 上記補完することが、上記第１塩基配列のカバー率を向上させることである、［１］～［７］のいずれかに記載のゲノム解析方法。
［９］ 上記懸濁液が、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、並びに、皮膚又は身体粘膜の拭い液、及び、スワブからなる群より選択される少なくとも１種の採取試料である、［１］～［８］のいずれかに記載のゲノム解析方法。
［１０］ 上記細胞が、細菌である、［１］～［９］のいずれかに記載のゲノム解析方法。
［１１］ 上記細菌が、ポルフィロモナス属、プレボテラ属、ベイヨネラ属、フソバクテリウム属、パルビモナス属、アグリゲイティバクター属、アクチノマイセス属、アクチノバチルス属、バクテロイデス属、タンネレラ属、トレポネーマ属、カンピロバクター属、エイケネラ属、及び、カプノサイトファーガ属からなる群より選択される少なくとも１種の細菌である、［１０］に記載のゲノム解析方法。

【発明の効果】

【0009】

本発明によれば、より簡便に、高品質な全ゲノム解析結果を得ることができる、ゲノム解析方法が提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】本発明の実施形態に係るゲノム解析方法のフロー図である。

【図2】単一細胞解析による第１塩基配列の決定方法のフロー図である。

【図3】単一細胞解析に用いることができるフローセルの模式図である。

【図4】本発明の他の実施形態に係るゲノム解析方法のフロー図である。

【図5】唾液から採取した、膜小胞サンプル、及び、細菌サンプルのそれぞれにおけるＡｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ４１－２８（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８）由来と判断された粒子の割合（Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）を表す図である。

【図6】上記各サンプルにおけるＴＭ７ｘ由来と判断された粒子の割合を表す図である。

【図7】膜小胞サンプル（Ｈｅａｌｔｈｙ）から得られた粒子（ＭＶ）のうち、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８由来と判断された粒子（５２粒子分）の配列を、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８のゲノムＤＮＡにマップした結果を表す図である。

【図8】膜小胞サンプル（Ｐａｔｉｅｎｔ）から得られた粒子（ＭＶ）のうち、ＴＭ７ｘ由来と判断された粒子（８６粒子）の配列を、ＴＭ７ｘのゲノムＤＮＡにマップした結果を表す図である。

【図9】膜小胞サンプルから得られた配列によって構築された各微生物のゲノムＤＮＡ長の割合を表す図である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値、及び、上限値として含む範囲を意味する。

【0012】

（用語の定義）
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、又は、デオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は上記分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は二本鎖と一本鎖のＤＮＡ、及び、ＲＮＡを含む。

【0013】

本明細書において、「単一細胞解析」とは、「シングルセル解析」と同義であり、複数種類、及び／又は、複数個の細胞が含まれる検体（試料）から、一細胞を分取しゲノム解析する方法を意味する。
単一細胞解析は、例えば、平面上に配列した多数のマイクロウェルのそれぞれに細胞を一つずつ分取し、その細胞の個々について、ゲノム解析を行う方法である。単一細胞解析には、例えば、特許文献１に記載された装置、国際公開第２０１７／０９４１０１号に記載された装置、及び、国際公開第２０１６／０３８６７０号に記載された装置等のような公知の装置、及び／又は、方法を使用するものが挙げられる。

【0014】

また、本明細書において、「単一粒子解析」とは、細胞由来の粒子（細胞自体を除く）を分取し、一粒子毎にゲノム解析する方法を意味する。単一粒子解析の方法としては、上記「単一細胞解析」と同様の方法が使用できる。

【0015】

本明細書における、「膜小胞」には、細菌等により産生される外膜小胞、動物細胞等により、エンドサイトーシス経路により産生、放出される「エクソソーム」、及び、アポトーシスによって生ずる「アポトーシス小体」も含まれるものとし、なかでも、膜小胞としては、外膜小胞（ＯＭＶ）が好ましい。

【0016】

細菌により産生される（「細菌に由来する」、又は、「細菌の」ということがある）膜小胞としては、細菌の細胞膜の一部が菌体外にくびり取られるようにして産生されたマイクロベシクルである「外膜小胞（ＯＭＶ；ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）」が挙げられ、その大きさは、特に制限されないが、１０～１０００ｎｍである場合が多く、グラム陰性細菌では１０～３００ｎｍであることが多く、グラム陽性細菌では５０～１５０ｎｍであることが多い。

【0017】

［ゲノム解析方法］
以下では、本発明のゲノム解析方法について詳述する。なお、本発明のゲノム解析方法は、細胞と、上記細胞で産生され、上記細胞外に放出された膜小胞を含む懸濁液を用いるものであり、上記「細胞」は、多細胞生物のもの、及び、単細胞生物のもののいずれも含まれる。以下の説明では、そのうち、細胞が細菌である場合を例に説明する。なお、以下の方法は、動物細胞等にも同様に適用可能である。

【0018】

図１は、本発明の実施形態に係るゲノム解析方法（以下「本方法」ともいう。）のフローチャートである。
本方法は、細菌と、上記細菌で産生され、上記細菌外に放出された膜小胞を含む懸濁液から、上記細菌と上記膜小胞とを分離し、上記細菌を含む第１試料と、上記膜小胞を含む第２試料とを調製すること（試料調製工程、ステップＳ１０１）と、
第１試料に含まれる上記細菌に由来する塩基配列である、第１塩基配列を決定すること（第１塩基配列決定工程、ステップＳ１０２）と、
第２試料に含まれる上記膜小胞に由来する塩基配列である、第２塩基配列を決定すること（第２塩基配列決定工程、Ｓ１０３）と、
第２塩基配列を用いて、第１塩基配列を補完すること（補完工程、Ｓ１０４）と、を含むゲノム解析方法である。

【0019】

・試料調製工程（ステップＳ１０１）
ステップＳ１０１は、細菌と膜小胞とを含む懸濁液から、細菌と膜小胞とを分離し、細菌を含む第１試料と、膜小胞を含む第２試料と、を調製する工程である。

【0020】

本工程で使用される懸濁液は、細菌と膜小胞とを含む。すなわち、懸濁液には、膜小胞と、その膜小胞を産生した細菌とが含まれている。この細菌は培養された単一の細菌株であってもよいし、複数種の細菌であってもよい（このうちの１種以上が難培養性細菌であってもよい）。

【0021】

懸濁液としては、例えば、ヒト又は動物から採取した、糞便、唾液、喀痰、手術洗浄液、血液、皮膚・身体粘膜の拭い液、及び、スワブ等の採取試料であってもよい。一般に、採取試料中には、細菌群と、それに含まれる細菌により産生された膜小胞とが含まれる場合がある。
このような採取試料から細菌群と膜小胞とを分離して、ぞれぞれを、第１試料と第２試料とにすればよい。

【0022】

懸濁液に含まれる細菌としては特に制限されないが、真正細菌、大腸菌、枯草菌、藍色細菌、球菌、桿菌、ラセン菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、古細菌、及び、真菌等が挙げられる。細菌としては、例えば、Ｎｅｇｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｉ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｌｅｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘａｌｅｓ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｇｅｍｍａｔｉｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｇｌｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｏｐｈｙｃｉｄａｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃｏｐｈｙｃｉｄａｅ、Ｃｈｒｏｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａｌｅｓ、Ｎｏｓｔｏｃａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄａｎａｂａｅｎａｌｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔｅｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｌｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉ、Ｃｈｌｏｒｏｂｅａ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｉａ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｌｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃｙｔｏｐｈａｇｉａ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｌｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌｅｓ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｏｐｉｔｕｔａｅ、Ｏｐｉｔｕｔａｌｅｓ、Ｐｕｎｉｃｅｉｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｓｐａｒｔｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｔｈｏｎｉｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｅ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒｉａ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｌｅｓ、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａｌｅｓ、Ｋｏｒｄｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｎｅａｔｈｉｅｌｌａｌｅｓ、Ｋｉｌｏｎｉｅｌｌａｌｅｓ、Ｂｅｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｌｅｓ、Ｐｒｏｃａｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃｈｒｏｍａｔｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｌｅｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｅｌｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌａｌｅｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｌｅｓ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｅｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎａｕｔｉｌｉａｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｅ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｌｅｓ、Ａｃａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｌｅｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒｅｓ、Ｇｅｏｖｉｂｒｉａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｌｅｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｅｔｅｓ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉａ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｌｅｓ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃｉａ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａｌｅｓ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄｉａ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄｅｔｅｓ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄｉａ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｐｏｓｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔａｇａｌｅｓ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｉ、Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌｅｓ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉａｌｅｓ、Ｎｅｇａｔｉｖｉｃｕｔｅｓ、Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｄａｌｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈｉａ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｌｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒａｌｅｓ、Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ、Ｍｏｌｌｉｃｕｔｅｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｆｒａｎｋｉａｌｅｓ、Ｇｌｙｃｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｊｉａｎｇｅｌｌａｌｅｓ、Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｌｅｓ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｌｅｓ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｌｅｓ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｉａ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍａｌｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎｅｔｅｓ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎａｌｅｓ、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａｔａｌｅｓ等が挙げられる。

【0023】

また、細菌は歯周病菌（歯周病の原因菌）が好ましい。歯周病菌としては、例えばポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、ベイヨネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）属、フソバクテリウム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パルビモナス（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ）属、アグリゲイティバクター（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｉｄｅｓ）属、タンネレラ（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ）属、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）属、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔａｒ）属、エイケネラ（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）属、及び、カプノサイトファーガ（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ）属等が挙げられる。

【0024】

より具体的には、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）又はバクテロイデス・ジンジバリス（Ｂａｃｔｅｒｉｏｒｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、プレボテラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、ベイヨネラ・パルブーラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ ｐａｒｖｕｌａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、パルビモナス・ミクラ（Ｐａｒｖｉｍｏｎａｓ ｍｉｃｒａ）、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）又はアクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）、アクチノマイセス・ネスランディ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）、タンネレラ・フォーサイセンシス（Ｔａｎｎｅｒｅｌｌａ ｆｏｒｓｙｔｈｅｎｓｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、カンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔａｒ ｒｅｃｔｕｓ）、エイケネラ・コローデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、及び、カプノサイトファーガ・オクラセア（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａ ｏｃｈｒａｃｅａ）等が挙げられる。

【0025】

なかでも、細菌としては、「レッドコンプレックス」と呼ばれる、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、トレポネーマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、及び、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ）からなる群より選択される少なくとも１種の細菌が好ましい。

【0026】

懸濁液中の細菌と膜小胞とを分離する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、単一の細胞株の液体培養液であれば、膜小胞は培養上清に含まれているため、遠心分離によって、培養液から菌体を取り除き、これを第１試料とし、上清を第２試料とすればよい。細菌株を固体培養した場合には、コロニーを緩衝液中に懸濁して、同様の方法で分離できる。

【0027】

分離した遠心上清をメンブランフィルター（例えば、孔径０．１～０．９μｍ）を用いてろ過すれば、遠心上清に残留する菌体を容易に分離することができる。
遠心上清には、菌体以外にもタンパク質等の夾雑物質が含まれている場合があるので、例えば、１００～２００ｋＤａカットオフフィルタで濃縮した後、超遠心によって膜小胞を沈殿させて回収する方法も使用できる。

【0028】

また、このようにして得られた沈殿物には、細菌由来の構造体（例えば、せん毛、及び、べん毛等）が含まれていることがあり、これらを除去するために、例えば、スクロース等を用いた密度勾配遠心法を用いて、更に精製する方法を用いてもよい。

【0029】

上記処理を含む試料の調製方法をより具体的に説明する。
まず、所定の条件で所望の増殖相が達成されたら、培養液を容量が１～１００ｍＬ（例えば５０ｍＬ）の遠心管に入れ、３０００～９０００ｒｐｍ（例えば７０００ｒｐｍ）、１～２０℃（例えば４℃）で、１～３０分間（例えば、１０分間）遠心する。

【0030】

上清と沈殿物とに分離できたら沈殿物には菌体が含まれているため、これを分離し（第１試料とし）、上清を０．１～０．９μｍ（例えば、０．２２μｍ）のフィルターに通し、別の遠心管に収容し、１～１０℃（例えば、４℃）で保存する。

【0031】

次に、上清を超遠心チューブに加え、例えば、遠心力として１５０，０００～３００，０００×ｇ（例えば、２１０，０００×ｇ）で、１～１０℃（例えば、４℃）で１～３時間（例えば、２時間）超遠心する。超遠心後、上清を破棄し、沈殿した外膜小胞（ＯＭＶ）を緩衝液（例えば、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファー）に再懸濁し、１～１０℃（例えば、４℃）で保存する。更に、この超遠心の工程を複数回繰り返してもよい。

【0032】

なお、第２試料の単位量あたりに含まれる膜小胞の数（濃度）を調整するために、得られた液を希釈してもよい。このようにすると、後述する単一粒子解析において、１個体ずつの膜小胞を分離取得しやすくなる。

【0033】

希釈の方法としては特に制限されないが、例えば、膜小胞の濃度を動的光散乱法等により液中の膜小胞の濃度を観察しながら、適当な濃度に希釈する方法が挙げられる。
膜小胞の濃度の観察方法としては、粒子にレーザを照射し、その散乱光から各粒子のブラウン運動を追跡し（トラッキング法）、その拡散速度から、Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎの式に基づき粒子の径と個数とを計算する方法が好ましい。

【0034】

＜第１塩基配列決定工程（ステップＳ１０２）＞
第１試料には、１種又は複数種の細菌が含まれており、本工程は、これ（ら）に由来するゲノム配列である第１塩基配列を決定する工程である。
第１塩基配列の決定方法としては、例えば、１６ＳリボソームＲＮＡ解析、メタゲノム解析、及び、単一細胞解析等が挙げられ、いずれも公知の技術が特に制限なく適用可能である。なかでも、個々の細菌のより正確なゲノム配列が得られやすい点で、単一細胞解析が好ましい。

【0035】

本工程における第１塩基配列の決定を単一細胞解析で行う場合、その方法としては特に制限されないが、以下の各工程を含む単一細胞解析が好ましい。

【0036】

・第１試料に含まれる細菌の１個体ずつを液滴中に封入すること（封入工程）
・液滴をゲル化してゲルカプセルを生成すること（ゲル化工程）
・ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、細菌を溶解させ、ポリヌクレオチドを溶出させ、ゲルカプセル内に保持すること（溶解工程）
・ゲルカプセル内の夾雑物質を除去すること（精製工程）
・ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅させること（増幅工程）
・増幅したポリヌクレオチドから、第１塩基配列を決定すること（シークエンス工程）

【0037】

図２は、上記各工程を含む単一細胞解析のフローである。図１のステップＳ１０２で表される「第１塩基配列決定工程」は、図２の単一細胞解析を含むことが好ましい。

【0038】

・封入工程（ステップＳ２０１）
ステップＳ２０１は、細菌の１個体ずつを液滴中に封入する工程である。封入工程で用いられる第１試料は、細菌を含む。試料に含まれる細菌は、１種でも２種以上でもよい。第１試料の細菌のうち少なくともいずれかは、懸濁液に含まれる膜小胞を産生し、菌体外に放出したものである。

【0039】

第１試料を用いて、第１試料に含まれる細菌の１個体ずつを液滴中に封入する方法としては特に制限されず、例えば、特許文献１等に記載された公知の方法が使用できる。

【0040】

液滴の作製は、例えば、マイクロ流路を用いて行うことができる。上述した懸濁液をマイクロ流路中に流動させ、懸濁液の流れをせん断することにより、１個体ずつの細菌を封入した液滴を作製できる。せん断は、一定間隔で行うことができる。懸濁液のせん断の方法としては、例えば、オイルを用いればよい。オイルとしては、例えば、鉱物油、植物油、シリコーンオイル、及び、フッ素化オイル等が挙げられる。懸濁液中の細菌の量（濃度）、流路中の流速、せん断の間隔を調整し、当業者は、液滴あたり１個体の個体が封入されるように液滴作製を行うことが可能である。
液滴の直径は、１～２５０μｍが好ましく、１０～２００μｍがより好ましい。

【0041】

図３は、本工程で使用できるマイクロ流路の模式的な断面図である。マイクロ流路３０１は、液滴を作製し、液滴中に細菌の１個体ずつを封入することができるデバイスである。
マイクロ流路３０１は、２本の流路が略直交して形成された十字型の流路から構成されている。図面の、上から下方向に延びる流路には、細菌３０３を含む第１試料３０２が図面上から下に流れており、これと略直交する方向の流路には、図面の左右から中央に向けてオイル３０４が流れている。

【0042】

この流路の直径としては特に制限されず、目的に応じて適宜選択されればよいが、一般に、１０～６０μｍが好ましい。
細菌３０３を含む第１試料３０２は、図面の左右から中央に流れるオイル３０４により剪断を受け、細菌３０３を含む液滴３０５となる。
第１試料３０２中の細菌３０３の含有量を調整することで、液滴３０５に細菌３０３の１個体が封入されるよう、調整することができ、この場合、細菌３０３が封入されていない液滴３０６も生成される場合があってもよい。

【0043】

・ゲル化工程（ステップＳ２０２）
ステップＳ２０２は、液滴をゲル化してゲルカプセルを生成する工程である。ゲル化方法としては特に制限されない。液滴のゲル化は、液滴にゲルカプセルの材料が含まれるように構成し、作製した液滴を冷却することによって行うことができる。あるいは、液滴に対して光等の刺激を与えることによってゲル化を行うこともできる。液滴にゲルカプセルの材料が含まれるようにするには、例えば、第１試料にゲルカプセルの材料を含めておくことによって行うことができる。

【0044】

ゲルカプセルの直径としては、１～２５０μｍが好ましく、１０～２００μｍがより好ましい。ゲルカプセルの直径は、作製する液滴と同じであってもよいが、ゲル化に際して直径が変化してもよい。ゲル化の温度としては特に制限されないが、４～１０℃が好ましい。

【0045】

ゲルカプセルの材料は、アガロース、アクリルアミド、光硬化性樹脂（例えば、ＰＥＧ-ＤＡ）、ＰＥＧ、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、マトリゲル、及び、コラーゲン等を含んでもよい。

【0046】

ゲルカプセルは、ヒドロゲルカプセルであってよい。「ヒドロゲル」とは、高分子物質またはコロイド粒子の網目構造によって保持されている溶媒あるいは分散媒が水であるものを意味する。

【0047】

・溶解工程（ステップＳ２０３）
ステップＳ２０３は、ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、細菌を溶解させ、ポリヌクレオチドを溶出させ、ゲルカプセル内に保持する工程である。細菌を溶解することで、細菌中のポリヌクレオチドがゲルカプセル内に溶出し、ポリヌクレオチドに結合する物質が除去された状態でゲルカプセル内に保持され得る。溶解試薬としては、酵素、界面活性剤、その他変性剤、還元剤、及び、ｐＨ調製剤、並びに、これらの組合せ等が使用できる。

【0048】

溶解試薬は、リゾチーム、ラビアーゼ、ヤタラーゼ、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ザイモリアーゼ、キチナーゼ、リソスタフィン、ムタノライシン、ドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、フェノール、クロロホルム、グアニジン塩酸塩、尿素、２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、「ＴＣＥＰ－ＨＣｌ」、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００」、「Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４」、「ＮＰ－４０」、「Ｂｒｉｊ－３５」、「Ｂｒｉｊ－５８」、「Ｔｗｅｅｎ ２０」、「Ｔｗｅｅｎ ８０」、オクチルグルコシド、オクチルチオグルコシド、「ＣＨＡＰＳ」、「ＣＨＡＰＳＯ」、ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、「Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０」、及び、「Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ ３－１２」等が挙げられる。
また、溶解試薬は、リゾチーム、アクロモペプチダーゼ、プロテアーゼ、ドデシル硫酸ナトリウム、及び、水酸化カリウム等を含むことが好ましい。

【0049】

ゲルカプセルを溶解試薬と接触させる方法は特に制限されないが、例えば、容器（例えば、マイクロチューブ、及び、マイクロプレートの各ウェル）に保持されたゲルカプセルに対して溶解試薬を自動マイクロシリンジ等で吐出すればよい。自動マイクロシリンジは、典型的には、溶解試薬を流通する流路、及び、液体流通のためのポンプ、弁等から構成されていてよい。

【0050】

・精製工程（ステップＳ２０４）
ステップＳ２０４は、ゲルカプセル内の夾雑物質を除去する工程である。本方法では、細菌の１個体を封入したゲルカプセルを用いるため、精製した遺伝物質（例えば、ＤＮＡ）をゲルカプセル内に保持することができ、また、外部からの分子の夾雑の可能性を排除することができる。

【0051】

また、操作面でも非常に簡単な操作で、１単位ごとの大量の細菌を並列処理することができる。ゲル化した液滴を含む試験管を遠心し、上清を除去し、洗浄液に置換するというステップを行うことができる。あるいは、ゲル化した液滴をフィルターでろ過し、上清を除去したのち、洗浄液を通液させ、最後にゲルカプセルを回収するというステップでも行うことができる。ゲルカプセルを用いることにより、遺伝物質を保持したまま、残留試薬を希薄化することができる。このステップは繰り返すことも可能である。阻害が出ないレベルにまで試薬を希薄化することで、下流の操作、例えば、増幅反応をスムーズに行うことができる。

【0052】

溶解試薬が下流の反応の前に十分に除去されると、ＤＮＡ増幅等の反応が阻害されにくい点で好ましい。ゲルカプセルを用いる場合、ゲルカプセルによって解析又は増幅の対象となる遺伝物質が保持されるため、遺伝物質が少量である細胞１つあたりの解析においても溶解試薬の除去を行うことができ、そのため、強力な溶解試薬または溶解試薬の組合せを用いることが可能である。
そして、強力な溶解試薬または溶解試薬の組合せを用いることは、より確実な核酸の増幅、及び、塩基配列の解析を可能にし得る。

【0053】

・増幅工程（ステップＳ２０５）
ステップＳ２０５は、ポリヌクレオチドを増幅試薬に接触させてポリヌクレオチドをゲルカプセル内で増幅させる工程である。増幅試薬に浸漬した後、必要に応じて、ゲルカプセルの温度を調整してもよい。

【0054】

加熱は、ゲル（例えば、アガロースゲル）が溶解しにくい観点で、６０℃以下が好ましい。この範囲内での加熱は、ＤＮＡの増幅をより促進する点で好ましい。
増幅に用いる酵素としては、例えば、ｐｈｉ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ａａｃポリメラーゼ、及び、リコンビナーゼポリメラーゼが挙げられる。
本方法では、ゲル内の全ＤＮＡの増幅を行うために、ランダムプライマーを用いることが好ましい。

【0055】

・シークエンス工程（ステップＳ２０６）
ステップＳ２０６は、増幅したポリヌクレオチドから、第１塩基配列を決定する工程である。増幅したポリヌクレオチドからその塩基配列を決定する方法としては、ライブラリー調製、シークエンス、及び、アセンブリ等のいずれも市販の試薬キット、装置、及び、アプリケーションソフトウェア等を特に制限なく使用できる。

【0056】

＜第２塩基配列決定工程（ステップＳ１０３）＞
図１に戻り、第２塩基配列決定工程（ステップＳ１０３）について説明する。本工程は、ステップＳ１０１で調製した第２試料を用いて、第２塩基配列を決定する工程である。

【0057】

本工程で使用する試料は、試料調製工程（ステップＳ１０１）で調製された第２試料であればよいが、上記試料を前処理して得られる処理済みの第２試料であってもよい。

【0058】

第２塩基配列の決定方法としては特に制限されず、メタゲノム解析でも、単一粒子解析でもよいが、必要な膜小胞の量がより少なくて済む観点では、単一粒子解析が好ましい。単一粒子解析の方法としては特に制限されず、ステップＳ１０２の第１塩基配列決定工程において第１試料を単一細胞解析する方法としてすでに説明したのと同様の方法が使用できる。

【0059】

ここで、本発明者は、膜小胞の表面には、核酸成分が付着している場合が多いことを知見している。この核酸成分は、例えば菌体が破裂した断片や共存する細菌由来等様々な由来を持つと推測される。

【0060】

本発明者は、膜小胞の表面に付着している核酸成分は、膜小胞を産生した細菌（以下、「宿主」ともいう。）に由来する可能性が高いことを知見している。
例えば、全ゲノムショットガン方式等、一般のメタゲノム解析では、試料に含まれる核酸成分を網羅的に分析することになるが、その場合、網羅的に分析される核酸成分のうち、特定の膜小胞を産生した細菌に由来する配列を得られる確率は非常に低い。

【0061】

一方で、膜小胞の表面に付着している核酸成分は、例えば、その膜小胞の産生過程で付着した成分等であったりして、宿主に由来する可能性が高い。
すなわち、第１試料を網羅解析して得られる断片から、特定の膜小胞の宿主に由来する断片（ポリヌクレオチド）を得られる可能性は低いが、第２試料に含まれる核酸成分は、宿主に由来する断片である可能性がより高いと言える。

【0062】

このような第２試料を単一細胞解析すると、膜小胞に由来する配列と、宿主に由来する可能性の高い配列の両方を含む第２塩基配列が得られる。この配列を用いれば、膜小胞の配列だけを用いた場合によりもより長い塩基長で、第１塩基配列を補完することができる可能性が高い。

【0063】

第２試料を単一粒子解析する方法としては特に制限されないが、より高品質な第２塩基配列が得られる点で、図２で説明した単一細胞解析と同様の方法、すなわち、下記工程をこの順に含む単一粒子解析が好ましい。
・第２試料を用い、膜小胞の１個体ずつを液滴中に封入すること
・液滴をゲル化して、ゲルカプセルを生成すること
・ゲルカプセルを溶解試薬と接触させて、膜小胞を溶解させ、ポリヌクレオチドを溶出させ、ゲルカプセル内に保持すること
・ゲルカプセル内の夾雑物質を除去すること
・ポリヌクレオチドを増幅試薬と接触させて、ゲルカプセル内で増幅させること
・増幅したポリヌクレオチドから、第２塩基配列を決定すること

【0064】

＜補完工程（ステップＳ１０４）＞
ステップＳ１０４は、第２塩基配列を用いて、第１塩基配列を補完する工程である。補完とは、典型的には、第２塩基配列を断片として用いて、上記第１塩基配列のカバー率を向上させることが挙げられる。

【0065】

第２塩基配列は、膜小胞に由来する塩基配列と、膜小胞の表面に付着していた核酸成分に由来する塩基配列とを含んでいる。
第２塩基配列の一部が第１塩基配列にマップする場合、その第２塩基配列は、第１塩基配列の一部と考えられる。すなわち、第２塩基配列の膜小胞は、第１塩基配列の細菌により産生されたと考えられる。

【0066】

特に、第１塩基配列を図２に示すような単一細胞解析によって得た場合、その工程中には、ゲルカプセル内でポリヌクレオチドを増幅する工程が含まれている。従って、使用するプライマー同士が結合したり、キメラ配列が生成したりして本来増幅されるべき細菌に由来するポリヌクレオチド以外のヌクレオチドが増幅される場合がある。また、何らかの原因で増幅が不十分となり、結果として、得られるポリヌクレオチドによるカバー率が十分高まらない（例えば、４０～８０％程度になる）場合がある。このような場合には、本解析方法はより有用である。

【0067】

また、補完としては、例えば、第１塩基配列の取得をメタゲノム解析で実施した場合に得られるドラフトゲノムの品質を向上するために第２塩基配列を使用する方法も挙げられる。

【0068】

典型的な全ゲノムショットガン方式のメタゲノム解析では、全ゲノムを所定の塩基長を有する断片（リード）に分割し、それぞれの断片をシークエンスして、それらを組み合わせること（アセンブリ、ビニング）で行われる。なお、メタゲノム解析を行う方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、特開２００５－２１８４２１号公報等に記載の全ゲノムショットガン方式による解析方法を使用でき、その方法は当業者にとって公知である。

【0069】

本ゲノム解析方法における「補完」には上記断片の一つ（特定断片）として、第２塩基配列を用いることが含まれる。第２塩基配列は、膜小胞から得られた塩基配列を含み、その膜小胞を産生した細菌のゲノム配列の一部である。特に、第２塩基配列が単一細胞解析により得られたものである場合、特定断片は、個々の膜小胞を分離し、その塩基配列を解析したものであるため、典型的には、メタゲノム解析で用いられる断片よりも塩基長がより長く、更に配列もより正確である。

【0070】

ここで、特定断片を全ゲノムの断片として用いる、とは、例えば、第２塩基配列を、全ゲノムショットガン方式によるメタゲノム解析における断片の一つとして用いることが挙げられる。特定断片は、生成した単一の膜小胞に由来する配列であり、より正確性の高い配列であるため、得られる全ゲノム配列がより品質の高いものになりやすい。
また、特定断片は、典型的には他の断片よりも塩基長が長いため、配列カバー率をより高めることが多い。

【0071】

また、特定断片を全ゲノムの断片として用いる方法は、上記以外の方法であってもよい。例えば、特定断片を全ゲノム配列にマップすることであってもよい。ここで、全ゲノム配列に「マップする」とは、特定断片が、全ゲノム配列の一部の領域と一致することを意味する。一致とは、配列の９０％以上が同一であることを意味し、９５％以上が好ましく、９９％以上がより好ましく、完全に同一であることが更に好ましい。

【0072】

特定断片を全ゲノム配列にマップすることにより、全ゲノム配列の品質をチェックすることができる。すなわち、特定断片を全ゲノムの断片として用いることは、全ゲノム配列にマップされる場合、その領域の全ゲノム配列が正確であると判断するための情報を提供することであってもよい。

【0073】

＜本発明の他の実施形態＞
本発明の他の実施形態に係るゲノム解析方法は、以下の工程を含むゲノム解析方法である。
・細菌と膜小胞とを含む懸濁液から、細菌を含む第１試料と、膜小胞を含む第２試料とを調製する（ステップＳ４０１、試料調製工程）。
・第１試料を用いて、第１塩基配列を決定する（ステップＳ４０２、第１塩基配列決定工程）。
・第２試料を核酸分解酵素で処理して、処理済み第２試料を調製する（ステップＳ４０３、処理工程）。
・処理済み第２試料を用いて、第２塩基配列を決定する（ステップＳ４０４、第２塩基配列決定工程）。
・第２塩基配列を用いて、第１塩基配列を補完する（ステップＳ４０５、補完工程）。

【0074】

図４は、本実施形態に係るゲノム解析方法のフローである。本ゲノム解析方法は、処理工程を有すること以外は、図１に示されたゲノム解析方法と同様である。すなわち、ステップＳ４０１は、ステップＳ１０１と同様であり、ステップＳ４０２は、ステップＳ１０２と同様であり、ステップＳ４０４は、ステップＳ１０３と同様であり、ステップＳ４０５は、ステップＳ１０４と同様であり、公的形態も同様である。これらの「同様である部分」の説明は省略し、図１に示されたゲノム解析方法と異なる部分を主に説明する。

【0075】

本ゲノム解析方法は、第２試料を核酸分解酵素で処理して、処理済み第２試料を調製する工程（処理工程、ステップＳ４０３）を有する。

【0076】

すでに説明したとおり、第２試料に含まれる膜小胞には、その宿主に由来する可能性が高い核酸成分が付着している。本実施形態に係るゲノム解析方法では、その核酸成分を分解除去する点に特徴の一つがある。
本実施形態に係るゲノム解析方法では、第２塩基配列が、確実に膜小胞に由来する配列であることを保証することができるため、第１塩基配列の補完がより容易になる。

【0077】

処理工程で使用する核酸分解酵素としては特に制限されず、デオキシリボヌクレアーゼ等が使用できる。具体的には、第２試料の１０μＬを１０倍希釈して、そこへ２μＬのＤＮａｓｅ（２０００Ｕ）を添加する方法等が挙げられる。これにより処理済み第２試料が得られる。

【0078】

ステップＳ４０４は、処理済み第２試料を用いて、第２塩基配列を決定する工程である。本工程で使用する配列決定方法は、使用する試料の量がより少量である点で、すでに説明した単一粒子解析が好ましい。
なお、本工程は、上記に加えて更に、未処理の第２試料を用いて、単一粒子解析で第２塩基配列を決定することを含むことが好ましい。

【0079】

これにより、処理済み第２試料から、個々の膜小胞の塩基配列が得られて、未処理の第２試料からは、個々の膜小胞の塩基配列に加えて、膜小胞の表面に付着していた核酸成分の塩基配列が得られる。

【0080】

すなわち、第２試料から得られる塩基配列と、処理済み第２試料の塩基配列との差分には、膜小胞の表面に付着していた核酸成分に由来する塩基配列が含まれる可能性が高い。すでに説明したとおり、上記「差分」は、宿主に由来する可能性が高い。本工程を有することで、得られる第２塩基配列による第１塩基配列のカバー範囲がより広くなる可能性がある。また、「差分」を利用すれば、得られた配列が膜小胞に由来するのか、表面に付着していた核酸成分に由来するのかを判断できる場合があり、より効率的にゲノム解析が可能になる。

【0081】

なお、上記では、第２試料の解析方法として単一細胞解析を用いる方法を主に記載したが、本発明の実施形態に係るゲノム解析方法としては上記に制限されず、他の方法によって第２試料の塩基配列を解析してもよい。そのような方法としては例えば、メタゲノム解析が使用できる。

【実施例】

【0082】

以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【0083】

[実施例：膜小胞由来ＤＮＡを用いた希少微生物種のゲノム再構築]
唾液採取キットを用いて、健常者（Ｈｅａｌｔｈｙ）、及び、歯周病患者（Ｐａｔｉｅｎｔｓ）の唾液を採取した。採取した唾液から、膜小胞と細菌とを分離して、それぞれ、膜小胞サンプル（ＭＶｓ）と細菌細胞のサンプル（Ｂａｃｔｅｒｉａ）とした。

【0084】

具体的な手順は以下のとおりである。まず、唾液を遠心分離して、菌体と、膜小胞とを粗分離した。次に、分離した遠心上清について、メンブランフィルターを用いてろ過し、ろ過後の遠心上清と、菌体とを分離した。
ろ過後の遠心上清には、細菌体以外にもタンパク質等の夾雑物質が含まれている場合があるので、１００～２００ｋＤａカットオフフィルタで濃縮した後、超遠心によって膜小胞を沈殿させて回収した。このようにして得られた沈殿物には、細菌群等の構造体（例えば、せん毛、及び、べん毛等）が含まれていることがあるため、これらを除去するために、スクロースを用いた密度勾配遠心法を用いて、更に精製した。

【0085】

このようにして得られた膜小胞の表面には、膜小胞に由来しない核酸成分が付着している場合があるため、分離取得された膜小胞に更にデオキシリボヌクレアーゼを作用させ、これらの核酸成分を分解した。

【0086】

次に、得られた膜小胞サンプル、及び、細菌細胞のサンプルについて、単一粒子解析により、両サンプルの１９２個の粒子について、ＤＮＡ配列をプロファイリングした。プロファイリングにあたっては、各粒子ごとに得られたｆａｓｔｑファイルを「ＳＰＡＤＥＳ」等のソフトウェアによってアセンブリし、得られたアセンブリに対しゲノムアノテーションのためのソフトウェアツールである「ｐｒｏｋｋａ」等を用いてタンパク質コード領域を予測・検出し、各領域について、公共データベース等（例えばＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ）に収録されたゲノムの塩基配列をリファレンスとして相同性検索を行い、マップされた（一形態として、一致度の最も高い）配列領域をゲノム中に最も多く有する細胞がその粒子の宿主細胞であると判断した。

【0087】

図５は、各サンプルにおけるＡｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ４１－２８（Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８）が宿主細胞と判定された粒子の割合、すなわち、全粒子１９２個に対して、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ４１－２８由来と判断された粒子の割合（Ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）を表す図である。
また、図６は、上記と同様に計算された、各サンプルにおけるＴＭ７ｘ由来と判断された粒子の割合を表す図である。

【0088】

図７は、膜小胞サンプル（Ｈｅａｌｔｈｙ）から得られた粒子（ＭＶ）のうち、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８由来と判断された粒子（５２粒子分）の配列を、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８のゲノムＤＮＡにマップした結果を表す図である。
横軸は、Ａｌｐｈａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ ４１－２８のゲノムＤＮＡの領域を表しており、５２個の各粒子から検出された領域が黒く示されている。図７では、縦軸に沿って５２個の粒子の結果が並べて示されている。

【0089】

なお、マッピングにあたっては、宿主細胞であると判定された細胞のゲノムに対し、ｂｏｗｔｉｅ２、ＢＷＡ等のマッピングソフトウェアを用いて、各粒子から取得された塩基配列をマッピングすることで、その細胞のゲノム配列のどれだけの領域をカバーできているかを評価した。

【0090】

図８は、膜小胞サンプル（Ｐａｔｉｅｎｔ）から得られた粒子（ＭＶ）のうち、ＴＭ７ｘ由来と判断された粒子（８６粒子）の配列を、ＴＭ７ｘのゲノムＤＮＡにマップした結果を表す図である。横軸は、ＴＭ７ｘのゲノムＤＮＡの領域を表しており、８６個の各粒子から検出された領域が黒く示されている。図８では、縦軸に沿って８６個の粒子の結果が並べて示されている。

【0091】

図９は、膜小胞サンプルから得られた配列によって構築された各微生物のゲノムＤＮＡ長の割合を表す図である。横軸は、全ゲノム配列に対して、膜小胞由来のＤＮＡで検出された領域（カバー領域）が占める割合を示している。

【0092】

上記の結果から、細菌自体が希少で、ショットガンメタゲノム解析や細菌サンプルの１細胞ゲノム解析では、ゲノムＤＮＡを正しく得ることが難しい場合であっても、膜小胞を使うと、例えば、８０％以上の領域が検出（再構築）できる。ショットガンメタゲノム解析等で再構築された細菌のゲノムＤＮＡを、膜小胞のＤＮＡ解析結果により補完すれば、より正しく、簡便に、希少細菌のゲノムＤＮＡの解析が行える。

【産業上の利用可能性】

【0093】

本ゲノム解析方法によれば、膜小胞の塩基配列を、その産生元である細胞を含む全ゲノム解析に用いることで、従来の方法と比較してより迅速に正確な全ゲノム配列を得ることができる。本ゲノム解析方法は、複雑な細菌叢等の全体像をより正確により迅速に把握することができ、医療、環境、及び、食品産業等において、細菌叢の包括的なデータ取得に役立つものである。

【符号の説明】

【0094】

３０１ ：マイクロ流路
３０２ ：第１試料
３０３ ：細菌
３０４ ：オイル
３０５、３０６ ：液滴

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】