特許 7473279 ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体及びそのウイルス蛋白質との結合体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】

(24)【登録日】2024-04-15

(45)【発行日】2024-04-23

(54)【発明の名称】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体及びそのウイルス蛋白質との結合体

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20240416BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 14/155 20060101ALI20240416BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20240416BHJP

   C12N 15/49 20060101ALN20240416BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240416BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C07K19/00 ZNA

C07K14/155

C07K14/435

C12N9/14

C12N15/49

C12N15/62 Z

【請求項の数】 6

(21)【出願番号】P 2021519919

(86)(22)【出願日】2019-05-20

(86)【国際出願番号】 JP2019019938

(87)【国際公開番号】W WO2020234975

(87)【国際公開日】2020-11-26

【審査請求日】2022-05-19

(73)【特許権者】

【識別番号】521422743

【氏名又は名称】河野 隆英

(74)【代理人】

【識別番号】100151390

【弁理士】

【氏名又は名称】中川 淨宗

(72)【発明者】

【氏名】河野 隆英

【審査官】野村 英雄

(56)【参考文献】

【文献】米国特許第０７９８１６５５（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】米国特許出願公開第２００９／０２６９８３１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】BULLIARD, Y., et al.，"Functional analysis and structural modeling of human APOBEC3G reveal the role of evolutionarily conserved elements in the inhibition of human immunodeficiency virus type 1 infection and Alu transposition."，J. VIROL.，2009年12月，Vol.83，pp.12611-12621，doi: 10.1128/JVI.01491-09

【文献】JIANG, Z.-Q., et al.，"Polymorphisms in the APOBEC3G gene of Chinese rhesus macaques affect resistance to ubiquitination and degradation mediated by HIV-2 Vif."，ARCH. VIROL.，2019年03月11日，Vol.164，pp.1353-1360，doi: 10.1007/s00705-019-04194-0

【文献】KOUNO, T., et al.，"Structure of the Vif-binding domain of the antiviral enzyme APOBEC3G."，[online], PUBMED CENTRAL，NIH，2015年12月01日，PMC4456288，NAT. STRUCT. MOL. BIOL. 2015, Vol.22, No.6, pp.485-491, DOI: 10.1038/nsmb.3033

【文献】LI, L., et al.，"APOBEC3G-UBA2 fusion as a potential strategy for stable expression of APOBEC3G and inhibition of HIV-1 replication."，RETROVIROL.，2008年，Vol.5，72(pp.1-13)，doi: 10.1186/1742-4690-5-72

【文献】WANG, Y., et al.，"N-terminal hemagglutinin tag renders lysine-deficient APOBEC3G resistant to HIV-1 Vif-induced degradation by reduced polyubiquitination."，J. VIROL.，2011年05月，Vol.85, No.9，pp.4510-4519，doi: 10.1128/JVI.01925-10

【文献】POLEVODA, B., et al.，"RNA binding to APOBEC3G induces the disassembly of functional deaminase complexes by displacing single-stranded DNA substrates."，NUC. ACIDS RES.，2015年09月30日，Vol.43, No.19，pp.9434-9445，doi: 10.1093/nar/gkv970

(58)【調査した分野】(Int.Cl.，ＤＢ名)

Ｃ１２Ｎ １５／００－１５／９０

Ｃ０７Ｋ １／００－１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合する機能を有するＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中の４０番から５４番まで、即ち、４０番リジン、４１番スレオニン、４２番リジン、４３番グリシン、４４番プロリン、４５番セリン、４６番アルギニン、４７番プロリン、４８番プロリン、４９番ロイシン、５０番アスパラギン酸、５１番アラニン、５２番リジン、５３番イソロイシン、５４番フェニルアラニンの１５のアミノ酸からなる配列につき、これをＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３ＢのＣ末端ドメイン部分、又はＡＰＯＢＥＣ３ＧのＣ末端ドメイン部分の相応する配列に置換することでＡＰＯＢＥＣ３Ｇの二次構造を安定化し、可溶化したことを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体。

【請求項2】

ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合する機能を有するＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中の４０番から５４番まで、即ち、４０番リジン、４１番スレオニン、４２番リジン、４３番グリシン、４４番プロリン、４５番セリン、４６番アルギニン、４７番プロリン、４８番プロリン、４９番ロイシン、５０番アスパラギン酸、５１番アラニン、５２番リジン、５３番イソロイシン、５４番フェニルアラニンの１５アミノ酸からなる配列につき、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番リジン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４のアミノ酸からなる配列、又は、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番セリン、４８番バリン、４９番リジン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４のアミノ酸からなる配列、又は、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番ロイシン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４のアミノ酸からなる配列に置換し、又は、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番メチオニン、４３番ヒスチジン、４４番アスパラギン、４５番アスパラギン酸、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番ロイシン、５０番ロイシン、５１番アスパラギン、５２番グルタミン、５３番アルギニンの１４のアミノ酸からなる配列に置換し、１アミノ酸を欠損することで可溶化したことを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体。

【請求項3】

ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合する機能を有するＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中、４４番、４７番、及び４８番のプロリンが、プロリン以外のＡＰＯＢＥＣ３Ｇを形成するアミノ酸に置換されており、又は欠損させられていることで可溶化したことを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体。

【請求項4】

請求項１から３までの何れかに記載したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、そのアミノ酸配列中、配列番号１に示した野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの配列でいう１８１番に相当するアミノ酸がチロシンであるとともに、同１８８番に相当するアミノ酸がメチオニンであることを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体。

【請求項5】

請求項１から４までの何れかに記載したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に、その配列番号１に示した野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの配列でいうアミノ酸配列の１９７番から３８４番までを遺伝子工学的に選択し、かつ２３４番ロイシンをリジンに、２４３番システインをアラニンに、３１０番フェニルアラニンをリジンに、３２１番システインをアラニンに、３５６番システインをアラニンにそれぞれ置換したＡＰＯＢＥＣ３ＧのＣ末端部分を結合したことを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体。

【請求項6】

請求項１から５までの何れかに記載したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質を結合させたことを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とウイルス蛋白質との結合体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体及びそのウイルス蛋白質との結合体に関し、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を阻害し得る化合物を探索し創製するためのＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体及びそのウイルス蛋白質との結合体に関する。

【背景技術】

【0002】

後天性免疫不全症候群（Ａｃｑｕｉｒｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＩＤＳ［エイズ］）は、１９８０年代にアメリカ合衆国において罹患者が報告されて以降、世界的に流行した感染症（Ｐａｎｄｅｍｉｃ［パンデミック］）である。エイズは、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ－１）が免疫を受け持つＴ細胞やマクロファージといったヒト免疫細胞に感染し増殖することによって、人の免疫機能が低下することにより引き起こされるものである。

【0003】

エイズは、これまでに様々な治療薬や治療法が研究開発されて来ている。その結果、現在では、核酸系逆転写酵素阻害剤と、非核酸系逆転写酵素阻害剤と、プロテアーゼ阻害剤とからなる３剤の併用療法が、ＨＩＶ－１の増殖を抑制してＨＩＶ－１の感染者がエイズを発症するのを抑制するのに最も有効な手段であるとされ、標準的な保存療法として採用されている。

【0004】

しかしながら、本発明の発明者がこれまでに得ている知見によれば、今日に至るまでエイズを根本的に治療する方法や医薬品が各国保健当局に承認されたことは未だない。また、既存の抗ＨＩＶ－１薬に耐性のあるウイルスが出現することも懸念されている。そのため、ＨＩＶ－１の感染やエイズを根本的に治療するための方法の開発ないし新たな抗ＨＩＶ－１薬の創薬が切望されている。そのためには、ＨＩＶ－１の感染やエイズの発症が起きるメカニズムの分子機構を解明することが不可欠であるとされているが、そのメカニズムの解明は途上であり、なお不明な点が多いのが現状である。

【0005】

ここで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用が、ＨＩＶ－１がヒト細胞において増殖するのかあるいは抑制されるのかを決定するための重要な決定因子であることが既に明らかにされている。

【0006】

ヒトのＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（Ａ３Ｇ）とは、３８４のアミノ酸からなる蛋白質であって、ヒト抗ＨＩＶ－１蛋白質として同定されている。ここで、ヒトの野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列は配列番号１に示した通りである。ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、１番から１９６番までのアミノ酸からなるＮ末端ドメインと１９７番から３８４番までのアミノ酸からなるＣ末端ドメインとに大きく分けることができる。Ｎ末端ドメインとＣ末端ドメインとは、以下のようにそれぞれ異なる機能を有しているものの、抗ＨＩＶ－１活性には双方のドメインが必要であるとされている。即ち、Ｎ末端ドメインは、Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ Ｆａｃｔｏｒ（Ｖｉｆ）やウイルス蛋白質Ｇａｇ（ＧＲＯＵＰ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ）といった他の蛋白質やＲＮＡと結合する部分であり、Ｃ末端ドメインは、ＤＮＡと結合したり、特定の配列について脱アミノ化を図ったりする部分である。ここで、ＨＩＶ－１Ｖｉｆのアミノ酸配列の一例は、配列番号２に示した通りである。尚、ＨＩＶ－１Ｖｉｆには種々の変異体が存するところ、配列番号２に示したアミノ酸配列はあくまでもＨＩＶ－１Ｖｉｆのアミノ酸配列の一例に過ぎず、本発明の実施が配列番号２に示したアミノ酸配列を有するＨＩＶ－１Ｖｉｆに限定されるものではない。

【0007】

尚、本件出願では、Ａはアラニン、Ｃはシステイン、Ｄはアスパラギン酸、Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、Ｉはイソロイシン、Ｋはリジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギン、Ｐはプロリン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔはスレオニン、Ｖはバリン、Ｗはトリプトファン、Ｙはチロシンをそれぞれ示すものとして、アミノ酸を略記することがある。

【0008】

まず、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用とＨＩＶ－１が増殖するメカニズムについて簡潔に説明する。ＨＩＶ－１に感染したヒト細胞では、新たなウイルス粒子が産生される。このとき産生されたＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに結合し、ヒト細胞の蛋白質消化機構に連関させることによって、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの分解消化を促し、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇを含まないウイルス粒子を完成させる。この完成したウイルス粒子は新たなヒト細胞に融合し、該ウイルス粒子の内容物が該ヒト細胞内に放出される。そして、その放出されたウイルス遺伝子は同じく放出されたウイルス蛋白質の作用によって、該ヒト細胞に含まれるヒト遺伝子に組み込まれて感染が成立する。更に、このようなライフサイクルを繰り返すことによって、ヒトの体内におけるウイルスの量が増加し、エイズの発症をもたらすのである。尚、上記のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用には、その仲介因子（媒介因子）として、リボ核酸（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＲＮＡ）が必要であるともされている。

【0009】

次に、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用とＡＰＯＢＥＣ３ＧがＨＩＶ－１を抑制するメカニズムについて簡単に説明する。Ｖｉｆ蛋白質を欠損しているＨＩＶ－１あるいは何らかのアミノ酸配列の変異を含んでいて機能不全を示しているＶｉｆを有するＨＩＶ－１に感染したヒト細胞では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは分解消化されることなく、ウイルス遺伝子やウイルス蛋白質Ｇａｇと相互作用することでウイルス粒子に取り込まれる。この完成したウイルス粒子は、新たなヒト細胞に融合し、該ウイルス粒子の内容物はＡＰＯＢＥＣ３Ｇとともに細胞内に放出される。そして、このときに放出されたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの作用によって、ウイルス遺伝子にはシトシンからウラシルへの脱アミノ化といった多数の変異が導入され、もはや該ウイルス遺伝子はウイルスを増殖させる機能を失ってしまう。そうすると、ヒトの体内におけるＨＩＶ－１の増殖は抑制され、エイズの発症は回避されるのである。

【0010】

上記のようなＨＩＶ－１の増殖ないし抑制のメカニズムから、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を阻害する化合物ないし抗体等の何らかの因子を導入することで、Ｖｉｆを有するＨＩＶ－１の感染においてもＡＰＯＢＥＣ３Ｇの分解消化を抑制し、産生ウイルス粒子へのＡＰＯＢＥＣ３Ｇの取り込みを促進することにより、ＨＩＶ－１の増殖を阻害してエイズの発症を抑えることが期待されている。つまり、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を特異的に阻害する方法が、新たなエイズの治療法になり得ると考えられている。

【0011】

上記のような考えに基づき、ＨＩＶ－１に感染したヒト細胞においてＡＰＯＢＥＣ３Ｇを保護するような効果を発揮する化合物、即ちヒト細胞内におけるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの消化を抑制するような効果を発揮する化合物の探索が行われているところである。このような化合物は、実験的には、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの消化分解を抑えるとともに、ウイルスの増殖を阻害する作用のあることが報告されており、新たな抗ＨＩＶ－１薬の候補として注目されている。しかしながら、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇは極めて不溶で調製が困難なことから、該化合物がいずれの蛋白質のいずれの部位に結合して、そのような作用をもたらすのかといった該化合物の作用点は未だに解明されていない。

【0012】

そこで、以下に示すように、上記のようなＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を実験的に再現することができるとともに、該相互作用を分子生物学的手法、生物物理学的手法、及び構造生物学的手法を用いて解析することで、該相互作用を阻害することができる化合物を合理的に探索し創製することができる手段について鋭意研究が行われている。

【0013】

まず、配列番号１に示したＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中、１９８番から３８４番のみを遺伝子工学的に選択するとともに、２３４番ロイシンをリジンに、２４３番システインをアラニンに、３１０番フェニルアラニンをリジンに、３２１番システインをアラニンに、３５６番システインをアラニンにそれぞれ遺伝子工学的に変換したもの（以下、便宜的にＡＰＯＢＥＣ３ＧＣＴＤ－１９８－２Ｋ３Ａ変異体とも呼称する）は、核磁気共鳴法による分子構造研究を可能にしている（例えば、下記の非特許文献１及び特許文献１を参照）。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３ＧＣＴＤ－１９８－２Ｋ３Ａ変異体のアミノ酸配列は、配列番号３に示した通りである。

【0014】

また、配列番号１に示したＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中、１９１番から３８４番までを遺伝子工学的に選択し、かつ２３４番ロイシンをリジンに、２４３番システインをアラニンに、３１０番フェニルアラニンをリジンに、３２１番システインをアラニンに、３５６番システインをアラニンにそれぞれ遺伝子工学的に変換したもの（以下、便宜的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＣＴＤ－１９１－２Ｋ３Ａ変異体とも呼称する）は、核磁気共鳴法又はＸ線結晶回折法による観測を可能にし、その分子構造研究を可能にしている（例えば、下記の非特許文献２及び３を参照）。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＣＴＤ－１９１－２Ｋ３Ａ変異体のアミノ酸配列は、配列番号４に示した通りである。

【0015】

更に、配列番号１に示したＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中、Ｎ末端ドメインにつき、１２番から７７番までと、７９番から１４２番までと、１４７番から１９６番までとを遺伝子工学的に選択し、１３番チロシンをアスパラギン酸に、１４番アルギニンをプロリンに、２２番チロシンをアスパラギンに、６２番ロイシンをアスパラギン酸に、７１番フェニルアラニンをロイシンに、７２番ヒスチジンをセリンに、７３番トリプトファンをロイシンに、７４番フェニルアラニンをバリンに、１０１番スレオニンをアラニンに、１０９番アラニンをグルタミンに、１１１番アスパラギン酸をアスパラギンに、１１２番プロリンをスレオニンに、１１３番リジンをヒスチジンに、１２６番フェニルアラニンをアラニンに、１３９番システインをアラニンに、１４１番リジンをアラニンに、１４２番アルギニンをグリシンに、１４９番メチオニンをイソロイシンに、１６９番アルギニンをグリシンに、１７０番グルタミン酸をアラニンに、１７１番ロイシンをプロリンに、１７３番グルタミン酸をグルタミンに、１７６番アスパラギンをアスパラギン酸に、１７７番アスパラギンをグリシンに、１７９番プロリンをアスパラギン酸に、１８０番リジンをグルタミン酸に、１８１番チロシンをヒスチジンに、１８２番チロシンをセリンに、１８３番イソロイシンをグルタミンに、１８４番ロイシンをアラニンに、１８６番ヒスチジンをセリンに、１８７番イソロイシンをグリシンに、１８８番メチオニンをアルギニンにそれぞれ遺伝子工学的に変換したもの（以下、便宜的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体とも呼称する）は、核磁気共鳴法による観測を可能にし、その分子構造研究を可能にしている（例えば、下記の非特許文献４を参照）。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体のアミノ酸配列は、配列番号５に示した通りである。

【0016】

また、上記のようなＡＰＯＢＥＣ３Ｇの抗ＨＩＶ－１活性がＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質によって阻害されることに着目して、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと被験物質とを接触させ、抗ウイルス薬のスクリーニングを行う方法も提案されている（例えば、下記の特許文献２及び３を参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0017】

【文献】米国特許第７９８１６５５号

【文献】特開２０１１－１４４１２２号公報

【文献】特表２００７－５０２６２４号公報

【非特許文献】

【0018】

【文献】Ｃｈｅｎ, Ｋ., ｅｔ ａｌ. “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ－１ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ”，Ｎａｔｕｒｅ，ＵＫ，２００８，４５２，１１６．

【文献】Ｈａｒｊｅｓ, Ｅ., ｅｔ ａｌ. “Ａｎ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｈｏｌｏｅｎｚｙｍｅ ｍｏｄｅｌ”，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＳ，２００９，３８９，８１９.

【文献】Ｓｈａｎｄｉｌｙａ, Ｓ.Ｍ., ｅｔ ａｌ. “Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｖｅａｌｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ”，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＵＳ，２０１０，１８，２８．

【文献】Ｋｏｕｎｏ, Ｔ., ｅｔ ａｌ. “Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｆ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｅｎｚｙｍｅ ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＵＫ，２０１５，２２，４８５．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0019】

上記のようにＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用は、ヒトの体内におけるＨＩＶ－１が増殖するのかそれとも抑制されるのかを決定する重要な要素である。しかしながら、そもそもＡＰＯＢＥＣ３Ｇは不溶な物質である。そのため、上記の従来技術に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの可溶化を図り、その構造生物学的な研究の適用範囲を拡大させてきたところである。しかしなから、上記の従来技術に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体の内、ＡＰＯＢＥＣ３ＧＣＴＤ－１９８－２Ｋ３Ａ変異体及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＣＴＤ－１９１－２Ｋ３Ａ変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＣ末端ドメインに係る変異体であり、そもそもＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に結合するものではなかった（特に、上記の特許文献１、及び非特許文献１ないし３を参照。）。一方、上記の従来技術に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体の内、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体は、Ｎ末端ドメインに係る変異体であり、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に結合するものである。しかしながら、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用の研究をｉｎ－ｖｉｔｒｏ（イン・ビトロ）で 可能にする程度に可溶性や安定性が実現されていなかったため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用の分子構造の研究は不可能であった（特に、上記の非特許文献４を参照）。そこで、本発明の第１の課題は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体につき、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を研究するために必要な可溶性を具備することで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用の分子構造の研究を行えるようにしたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供することである。

【0020】

また、上記の従来技術に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、例えば、生理食塩水と同等の塩濃度や中性ないしそれに近い水素イオン濃度といった通常の生理学的な条件の下で、別途精製ないし調製されたＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質とｉｎ－ｖｉｔｒｏで特異的に結合させ、その結合体の分子構造の知見を得ることは、その結合量の少なさ及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ結合体の不安定さから、不可能であった（特に、非特許文献４を参照）。そこで、本発明の第２の課題は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体につき、上記のような通常の生理学的な条件の下で、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と特異的に結合させ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ結合体を観測し得るようにしたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供することにある。

【0021】

また、上記の従来技術に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、大腸菌もしくは他の培養細胞あるいは無細胞蛋白質発現系を用いた分子生物学的な手法を用いて、これを十分に量産することが必ずしも容易ではなかった（特に、上記の非特許文献４を参照）。そこで、本発明の第３の課題は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体につき、その量産性を向上させたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供することにある。

【0022】

そして、上記の従来技術に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで安定した溶液の状態を保つことが困難であるため、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質との複合体を形成する前後で、特に核磁気共鳴法、Ｘ線結晶回折法もしくは電子顕微鏡法といった構造生物学的手法を用いて十分に観測し、その観測結果を合理的に解釈することが不可能であった。特に、上記のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体についていえば、その沈殿を抑制して安定的な溶液の状態を保つべく、該溶液に界面活性剤ないしスルフォベタインといった界面活性剤様添加剤（以下、あわせて界面活性剤類とも呼称する。）を添加しなければならず、またこのような界面活性剤類を添加したとしても１週間以内に沈殿を生じてしまっていた（特に、上記の非特許文献４を参照）。そこで、本発明の第４の課題は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体につき、安定した溶液の状態を保つことによって、構造生物学的手法による十分な観察を行うことができるようにしたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0023】

本発明は、上記の各課題を解決するために提案されたものであり、以下の構成を有するものである。

【0024】

請求項１に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合する機能を有するＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中の４０番から５４番まで、即ち、４０番リジン、４１番スレオニン、４２番リジン、４３番グリシン、４４番プロリン、４５番セリン、４６番アルギニン、４７番プロリン、４８番プロリン、４９番ロイシン、５０番アスパラギン酸、５１番アラニン、５２番リジン、５３番イソロイシン、５４番フェニルアラニンの１５のアミノ酸からなる配列につき、これをＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３ＢのＣ末端ドメイン部分、又はＡＰＯＢＥＣ３ＧのＣ末端ドメイン部分の相応する配列に置換することでＡＰＯＢＥＣ３Ｇの二次構造を安定化し、可溶化したことを特徴とするＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0025】

請求項２に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合する機能を有するＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中の４０番から５４番まで、即ち、４０番リジン、４１番スレオニン、４２番リジン、４３番グリシン、４４番プロリン、４５番セリン、４６番アルギニン、４７番プロリン、４８番プロリン、４９番ロイシン、５０番アスパラギン酸、５１番アラニン、５２番リジン、５３番イソロイシン、５４番フェニルアラニンの１５アミノ酸からなる配列につき、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番リジン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４のアミノ酸からなる配列、又は、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番セリン、４８番バリン、４９番リジン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４のアミノ酸からなる配列、又は、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番ロイシン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４のアミノ酸からなる配列に置換し、又は、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番メチオニン、４３番ヒスチジン、４４番アスパラギン、４５番アスパラギン酸、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番ロイシン、５０番ロイシン、５１番アスパラギン、５２番グルタミン、５３番アルギニンの１４のアミノ酸からなる配列に置換し、１アミノ酸を欠損することで可溶化したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0026】

請求項３に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合する機能を有するＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中、４４番、４７番、及び４８番のプロリンが、プロリン以外のＡＰＯＢＥＣ３Ｇを形成するアミノ酸に置換されており、又は欠損させられていることで可溶化したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0027】

請求項４に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、請求項１から３までの何れかに記載したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、そのアミノ酸配列中、配列番号１に示した野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの配列でいう１８１番に相当するアミノ酸がチロシンであるとともに、同１８８番に相当するアミノ酸がメチオニンであるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0028】

請求項５に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、請求項１から４までの何れかに記載したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に、その配列番号１に示した野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの配列でいう１９７番から３８４番までを遺伝子工学的に選択し、かつ同２３４番ロイシンをリジンに、同２４３番システインをアラニンに、同３１０番フェニルアラニンをリジンに、同３２１番システインをアラニンに、同３５６番システインをアラニンにそれぞれ置換したＡＰＯＢＥＣ３ＧのＣ末端部分を結合したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0029】

請求項６に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とウイルス蛋白質との結合体は、請求項１から５までの何れかに記載したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質とを結合させたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とウイルス蛋白質との結合体である。

【発明の効果】

【0030】

本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体及びそのウイルス蛋白質との結合体は、上記の通りの構成であるから、以下のような効果を得ることができる。

【0031】

まず、請求項１又は２に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体によれば、蛋白質の局所構造の安定化を図ることができる。また、請求項３に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、蛋白質の構造を不安定にする要因の１つになっているプロリンにつき、これをプロリン以外のＡＰＯＢＥＣ３Ｇを形成するアミノ酸に置換し、又は欠損させることにより、蛋白質の分子構造の安定化を図ることができる。

【0032】

本発明の発明者は、本発明の効果を実証すべく、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中、４４番、４７番、及び４８番のプロリンを高頻度で含む領域において、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの二次構造を安定させるための遺伝子工学的なアミノ酸の変換及び欠損を施したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体（以下、便宜的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ変異体とも呼称する）を作成した。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬのアミノ酸配列は、配列番号１０に示した通りである。本発明の発明者は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ変異体が、蛋白質を安定化させるとともに、大腸菌による蛋白質の調製量を有意に増加させ、その精製した蛋白質の溶液は、界面活性剤類を添加しなくても、最低１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保つことができ、核磁気共鳴法による観測が可能であることを確認している。

【0033】

次に、本発明の発明者は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ変異体について、そのアミノ酸配列中、配列番号１に示した野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの配列でいう１８１番に相当するアミノ酸がチロシンであるとともに、同１８８番に相当するアミノ酸がメチオニンであるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を作成した（以下、便宜的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体とも呼称する）。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体の配列は、配列番号１１に示した通りである。本発明の発明者は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体が、別途調製したＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に結合し、また、その溶液の状態における安定性が更に増大しているため、界面活性剤類を添加しなくても、最低１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保つことができ、少なくとも電子顕微鏡法による観測が可能であることを確認している。

【0034】

更に、本発明の発明者は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体とＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＣＴＤ－１９１－２Ｋ３Ａ変異体とを結合させ、請求項５に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体（以下、便宜的にＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体とも呼称する）を作成した。ここで、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体のアミノ酸配列は、配列番号１２に示した通りである。請求項５に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、上記の様な構成であるから、天然に存在するＡＰＯＢＥＣ３Ｇに構造的にも機能的にも近似する存在であるため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を実験的に再現し得るとともに、該相互作用を分子生物学的手法、生物物理学的手法、及び構造生物学的手法を用いて解析し、該相互作用を阻害し得る化合物を合理的に探索し創製し得る試料とするにはより適切であると考えられる。

【0035】

ここで、本発明の発明者は、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体が、界面活性剤類を添加しなくても、最低１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保つことができ、Ｘ線結晶回析法及び電子顕微鏡法による観測が可能であり、観測結果を合理的に解釈しその分子構造研究が可能であることを確認している。

【0036】

また、本発明の発明者は、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体を別途調整したＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に結合させた結合体について、少なくとも１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保てることを確認するとともに、電子顕微鏡による観測が可能であり、観測される蛋白質粒子像のサイズがＸ線結晶回析法に基づく分子構造解析から予測される大きさと同程度であることを確認している。

【0037】

以上のことから、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体につき、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を研究するために必要な可溶性を具備し、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用の分子構造の研究を行えるようにしたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供するとの本発明の第１の課題、通常の生理学的な条件の下、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と特異的に結合し、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ結合体を観測し得るようにしたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供するとの本発明の第２の課題、その量産性を向上させたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を提供するとの本発明の第３の課題、そして安定した溶液の状態を保つことで構造生物学的な手法による十分な観察を行えるようにするとの本発明の第４の課題を解決することができる。

【0038】

上記のような本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を用いることにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を実験的に再現することができるとともに、該相互作用を分子生物学的手法、生物物理学的手法、及び構造生物学的手法を用いて解析することで、該相互作用を阻害することができる化合物を合理的に探索し創製することができるのである。

【図面の簡単な説明】

【0039】

【図1】ヒトの野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列と本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体のアミノ酸配列のアライメントを示した図である。

【図2(a)】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体に係るアミノ酸配列の４０番から５３番までの領域に係る分子構造を示した図である。

【図2(b)】本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に係るアミノ酸配列の４０番から５３番までの領域に係る分子構造を示した図である。

【図3(a)】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体に係る核磁気共鳴スペクトルを示した図である。

【図3(b)】本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に係る核磁気共鳴スペクトルを示した図である。

【図4(a)】ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体に係る蛋白質の精製に関するプロファイルを示した図である。

【図4(b)】本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体に係る蛋白質の精製に関するプロファイルを示した図である。

【図5(a)】本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を示した電子顕微鏡像である。

【図5(b)】本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とＨＩＶ－１Ｖｉｆとの結合体を示した電子顕微鏡像である。

【図6】本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とＨＩＶ－１Ｖｉｆとが結合する量を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0040】

まず、本発明の第１実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中の４０番から５４番までに係るアミノ酸につき、遺伝子工学的な手法を用いて、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの二次構造を安定化し得るアミノ酸に置換したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。具体的には、本発明の発明者は、配列番号６に示した通り、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中の４０番から５４番まで、即ち、４０番リジン、４１番スレオニン、４２番リジン、４３番グリシン、４４番プロリン、４５番セリン、４６番アルギニン、４７番プロリン、４８番プロリン、４９番ロイシン、５０番アスパラギン酸、５１番アラニン、５２番リジン、５３番イソロイシン、５４番フェニルアラニンの１５個のアミノ酸からなる配列について、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番リジン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４個のアミノ酸からなる配列へと遺伝子工学的に置換した。但し、ここでは１アミノ酸を欠損している。

【0041】

ここで、本発明の発明者は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中の４０番から５４番までに係るアミノ酸配列との配列類似性及びその分子構造の類似性から考察するに、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに類似する蛋白質であるＡＰＯＢＥＣ３Ａ及びＡＰＯＢＥＣ３ＢのＣ末端ドメイン、並びにＡＰＯＢＥＣ３ＧのＣ末端ドメインにおいて上記に相応するアミノ酸配列、即ち、配列番号７に示した通り、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番セリン、４８番バリン、４９番リジン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４個のアミノ酸からなる配列、又は、配列番号８に示した通り、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番ロイシン、４３番アスパラギン酸、４４番アスパラギン、４５番グリシン、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番ロイシン、５０番メチオニン、５１番アスパラギン酸、５２番グルタミン、５３番ヒスチジンの１４個のアミノ酸からなる配列、又は、配列番号９に示した通り、４０番グルタミン酸、４１番アルギニン、４２番メチオニン、４３番ヒスチジン、４４番アスパラギン、４５番アスパラギン酸、４６番スレオニン、４７番トリプトファン、４８番バリン、４９番ロイシン、５０番ロイシン、５１番アスパラギン、５２番グルタミン、５３番アルギニンの１４個のアミノ酸からなる配列に置換した場合にも、上記の配列に置換した場合と同等の効果が得られるとの知見を得ている。

【0042】

尚、本件出願におけるＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸を置換するための遺伝子工学的な手法としては、例えば、部位特異的変異導入法（Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ＳＤＭ）といった各種の公知の手法を用いることができる。

【0043】

ここで、図１に、ヒトの野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列と本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体のアミノ酸配列のアライメントを示す。図１において、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡ（上段）にはヒトの野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列を示しており、ＳｅｑｕｅｎｃｅＢ（下段）にはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体のアミノ酸配列を示している。図１におけるアミノ酸の配列の番号は、ヒトの野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇに係るアミノ酸の配列に従っている。また、各配列の最下段に記載されている「★」の記号は、ＳｅｑｕｅｎｃｅＡとＳｅｑｕｅｎｃｅＢとが完全に一致していることを示している。更に、ＳｅｑｕｅｎｃｅＢに記載されている「－」の記号はアミノ酸が欠損していることを示している。もっとも、アミノ酸が欠損する位置は、アライメントのアルゴリズムによるものであるから、図１に示した位置と必ずしも一致するものではない。

【0044】

図２に、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体におけるアミノ酸配列中４０番から５３番までの領域に係る分子構造について、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体におけるアミノ酸配列中４０番から５４番までの領域に係る分子構造と対比させて、Ｘ線結晶回析法によるデータを図示する。図２（ａ）は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体におけるアミノ酸配列中４０番から５４番までの領域をスティック表示している。図２（ｂ）は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体におけるアミノ酸配列中４０番から５３番までの領域をスティック表示している。図２において、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体では、そのアミノ酸配列中４０番から５４番までの領域が二次構造を形成していないのに対して、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体では、そのアミノ酸配列中４０番から５４番までの領域において新たな二次構造を形成していることが示されている。

【0045】

上記のような本発明の第１実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体によれば、蛋白質の局所構造の安定化を図ることができる。

【0046】

次に、本発明の第２実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３ＧのＮ末端ドメイン部分に係るものであり、そのアミノ酸配列中、４４番、４７番、及び４８番のプロリンが、遺伝子工学的にプロリン以外のＡＰＯＢＥＣ３Ｇを形成するアミノ酸に置換、又は欠損させられているＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0047】

尚、本件出願におけるＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸を欠損するための遺伝子工学的な手法としては、例えば、上記の部位特異的変異導入法といった各種の公知の手法を用いることができる。

【0048】

本発明の第２実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、プロリンを遺伝子工学的に欠損させることにより、蛋白質の分子構造の安定化を図ることができる。即ち、プロリンは、上記の二次構造を不安定にする性質を有しており、とりわけＡＰＯＢＥＣ３Ｇのアミノ酸配列中、４４番、４７番、及び４８番を含む５つのアミノ酸からなる領域は、５つのアミノ酸の内の３つがプロリンであって、高い割合でプロリンを含んでいるため、二次構造の著しい不安定化が懸念されるところ、これらのプロリンを遺伝子工学的に別のアミノ酸に置換され、又は欠損させられることにより、蛋白質の分子構造の安定化を図ることができるのである。

【0049】

本発明の発明者は、本発明の効果を実証すべく、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ変異体を作成し、これが、蛋白質を安定化させるとともに、大腸菌による蛋白質の調製量を有意に増加させ、その精製した蛋白質の溶液は、界面活性剤類を添加しなくても、最低１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保つことができ、核磁気共鳴法による観測が可能であることを確認した。

【0050】

更に、本発明の発明者は、前述のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体と本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ変異体のそれぞれについて、核磁気共鳴（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ， ＮＭＲ）スペクトルの比較観察を行った。そうしたところ、図３に図示するように、図３（ａ）に示されるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体のＮＭＲスペクトルに対して、図３（ｂ）に示されるＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ変異体のＮＭＲスペクトルは、シグナルとノイズの比率が改善され、シグナルが従前より明瞭に示されるようになり、より均質で円状に近似する等高線を示すようなかたちでシグナルの形状が改善されるとともに、観測し解析できるシグナルの数が３０ないし４０％増加することが確認された。

【0051】

本発明の第３実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、前述の本発明の第１実施形態又は第２実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体であって、そのアミノ酸配列中、配列番号１に示した野生型ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの配列でいう１８１番に相当するアミノ酸がチロシンであるとともに、同１８８番に相当するアミノ酸がメチオニンであるＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体である。

【0052】

本発明の発明者は、上記の本発明の第３実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体、即ち、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体を作製し、これが、別途調製したＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に結合し、また、その溶液の状態における安定性が更に増大しているため、界面活性剤類を添加しなくても、最低１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保つことができ、少なくとも電子顕微鏡法による観測が可能であることを確認した。

【0053】

更に、本発明の発明者は、本発明の効果を実証すべく、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭと前述のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体との比較観察を行った。そうしたところ、単位実験スケール当たりの蛋白質精製（サイズ排除クロマトグラフィー）プロファイルに係る図４に図示するように、図４（ａ）に示すＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ変異体のプロファイルと比較して、図４（ｂ）に示すＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体は、凝集蛋白質や夾雑蛋白質の生じる割合が５０％程度減少するとともに、精製の目的となる蛋白質の生じる割合が５０％程度上昇することが確認された。

【0054】

本発明の第４実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６－ｄＬ－ＹＭ変異体とＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＣＴＤ－１９１－２Ｋ３Ａ変異体とを結合させたＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体、即ち、前述のＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体である。この変異体は、上記の様な構成であるから、天然に存在するＡＰＯＢＥＣ３Ｇに構造的にも機能的にも近似する存在であるため、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を実験的に再現し得るとともに、該相互作用を分子生物学的手法、生物物理学的手法、及び構造生物学的手法を用いて解析し、該相互作用を阻害し得る化合物を合理的に探索し創製し得る試料とするには、より適切であると考えられる。

【0055】

ここで、本発明の発明者は、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体が、界面活性剤類を添加しなくても、最低１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保つことができ、Ｘ線結晶回析法及び電子顕微鏡法による観測が可能であり、その分子構造研究が可能であることを確認している。

【0056】

本発明の発明者は、本発明の効果を実証すべく、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体がＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と結合するか否かについて、その観察を行った。ここで、図５は、蛋白質のネガティブ染色電子顕微鏡像であり、図中のスケールバーは５ナノメートル（ｎｍ）を示している。また、図５（ａ）に挿入した図はスケールを調整したＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体の結晶構造を示しているとともに、５（ｂ）に挿入した図はＨＩＶ－１Ｖｉｆの結晶構造を示している。図５（ａ）に示すＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体の電子顕微鏡像と、図５（ｂ）に示すＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体の電子顕微鏡像とＨＩＶ－１ＶｉＦ蛋白質とを結合させた結合体とでは、それらの形状及び大きさが異なっていることが確認された。また、本発明の発明者は、上記の非結合体と結合体のそれぞれの大きさが、Ｘ線結晶回析法に基づく分子構造解析から予測される大きさと同程度であることを確認した。尚、上記のようにＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質とを結合させるに際しては、それぞれの溶液を混合させることによってこれを行い、その必要に応じて、リボ核酸をその仲介因子（媒介因子）として適宜用いる。

【0057】

更に、本発明の発明者は、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体につき、そのアミノ酸配列中、１９番チロシンをアラニン又はアスパラギン酸に、あるいは２７番ロイシンをアラニン又はアスパラギン酸に、又は１２４番チロシンをアラニンに、又は１２５番チロシンをアラニンに、又は１２６番フェニルアラニンをアラニンに、又は１２７番トリプトファンをアラニンに、又は１２８番アスパラギン酸をリジンに、又は１２９番プロリンをアラニンにそれぞれ遺伝子工学的に変換した公知のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を作成し、該ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体がＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質との結合を著しく阻害するものであるとの知見を得ている。

【0058】

ここで、図６に、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体及び上記のＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質とが結合する量を比較したグラフを示す。図６では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体とＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質とが結合する量を１００とした場合に、上記のようにして作製したＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体とＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質とが結合する量と比較するグラフを示している。そのアミノ酸配列の内、１２８番アスパラギン酸をリジンに置換したＡＰＯＢＥＣ３Ｇは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－Ｖｉｆ相互作用を著しく減弱させるものであることが知られているところ、それとの比較を行うことにしたものである。また、図６では、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａと、配列番号２に示したアミノ酸配列を有するＨＩＶ－１Ｖｉｆにつき、その４３番ヒスチジンをアラニンに置換するとともに、４４番チロシンをアラニンに置換したＶｉｆ変異体とが結合する量を比較したグラフを示している。該Ｖｉｆ変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－Ｖｉｆ相互作用を著しく減弱させるものであることが知られているところ、それとの比較を行うことにしたものである。即ち、図６は、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体が、ＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に特異的に結合することの証左である。

【0059】

最後に、本発明の発明者は、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇ－ＦＬ－ｓＮＴＤ－Ａ１２６Ｆ－ｄＬ－ＹＭ－ＣＴＤ－２Ｋ３Ａ変異体を別途調整したＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に結合させた結合体について、少なくとも１週間は沈殿を生じることなく溶液の状態を保てることを確認するとともに、電子顕微鏡による観測が可能であることを確認している。

【0060】

以下に、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体の使用態様について簡潔に説明する。例えば、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を阻害する化合物Ｘがあったとする。もし、化合物Ｘが直接的にＡＰＯＢＥＣ３ＧもしくはＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質に作用するならば、化合物ＸはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ結合体の結合面において、ＡＰＯＢＥＣ３ＧもしくはＨＩＶ－１Ｖｉｆに結合するものと考えられる。

【0061】

本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、上述の通り、ｉｎ－ｖｉｔｒｏで各種分子構造の研究に用いることができる。例えば、図３に図示するように、核磁気共鳴法で得られるスペクトルでは、１つのシグナルが蛋白質に含まれる特定の１つのアミノ酸に由来する。ここで、化合物Ｘが蛋白質に結合するとき、その近傍の蛋白質の化学的環境を変化させるため、スペクトル中の当該アミノ酸に由来するシグナルもその強度や位置が変化する。この変化を観測することによって、化合物ＸがＡＰＯＢＥＣ３Ｇのいずれの部位に結合したのかを特定することができるのである。また、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇと化合物Ｘとの結合体に係る結晶を調製し、Ｘ線結晶回折法によって該結合体の分子構造を明らかにすることも可能である。

【0062】

更に、例えば、化合物Ｘと同様に、化合物ＹもＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を阻害し、化合物Ｘと同じ部位においてＡＰＯＢＥＣ３Ｇに結合するとした場合、化合物ＸとＹのＡＰＯＢＥＣ３Ｇに対する親和性及び分子構造を比較して、より親和性の高い新たな別個の化合物を創成することも可能である。また、例えば、化合物Ｘと同様に、化合物ＺはＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を阻害するものの、化合物Ｘとは異なる部位においてＡＰＯＢＥＣ３Ｇに結合する場合、化合物Ｘと化合物Ｚの結合部位が近い位置にあれば、適切に設計された化学連結構造により化合物ＸとＺとを連結させることにより、より親和性の高い新たな別個の化合物を創成することも可能である。

【0063】

尚、このような阻害化合物とターゲット蛋白質とを結合させ、分子構造と結合親和性の関係（構造活性相関）を研究し、新たな候補化合物を創成することは広く一般に行われているところである。よって、本件出願は、その手法を特定するものではなく、本発明に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体の使用態様は、上記のような使用態様に限定されるものでもない。

【0064】

以上のことから、本発明の各種の実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体は、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体につき、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を研究するために必要な可溶性を具備し、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用の分子構造の研究を行えるようにし、通常の生理学的な条件の下、ｉｎ－ｖｉｔｒｏでＨＩＶ－１Ｖｉｆ蛋白質と特異的に結合され、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ結合体を観測し得るようにし、その量産性を向上させるとともに、安定した溶液の状態を保って構造生物学的な手法による十分な観察を行えるようにすることができる。

【0065】

上記のような本発明の各種の実施形態に係るＡＰＯＢＥＣ３Ｇの変異体を用いることにより、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ／Ｖｉｆ相互作用を実験的に再現することができるとともに、該相互作用を分子生物学的手法、生物物理学的手法、及び構造生物学的手法を用いて解析することで、該相互作用を阻害することができる化合物を合理的に探索し創製することができるのである。

【図1】

【図2(a)】

【図2(b)】

【図3(a)】

【図3(b)】

【図4(a)】

【図4(b)】

【図5(a)】

【図5(b)】

【図6】

【配列表】

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